JPWO2002088737A1 - イムノクロマトグラフィー試験片及び診断キット - Google Patents

Abstract

本発明は、糞便を検体として用い、感度よくヘリコバクター・ピロリへの感染を判定することができるイムノクロマトグラフィー試験片及び診断キットを提供する。短冊形状の抗体固相化支持体の下端上に下から順に着色ラテックス標識物保持担体、及び、濾紙からなる液体試料吸収用担体が積層され、一方、前記抗体固相化支持体の上端上に濾紙よりなる吸水性担体が積層されてなる積層体からなるイムノクロマトグラフィー試験片であって、前記抗体固相化支持体は、ニトロセルロースシート上にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体が固相化されてなり、前記着色ラテックス粒子標識物保持担体は、着色ラテックス粒子にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体を固定化してなる着色ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗体が不織布に含浸されてなるイムノクロマトグラフィー試験片である。

Description

技術分野
本発明は、イムノクロマトグラフィー試験片及び診断キットに関する。
背景技術
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｌｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）はヒトの胃粘膜に見られる細菌である。ヘリコバクター・ピロリへの感染率は、社会経済状態と密接に関連しており、発展途上国ほど感染率が高く、先進国ほど感染率が低くなる傾向があるが、日本人の感染率は先進国の中でも際立って高く、４０歳以上では８０％の人が感染しているとも言われている。近年、ヘリコバクター・ピロリが胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、更には胃癌等のさまざまな胃、十二指腸疾患の原因となりうることが明らかになってきた。
ヘリコバクター・ピロリを除菌することにより、これらの疾患に罹患する可能性を低減できることが明らかになったために、ヘリコバクター・ピロリの除菌対象疾患について国際的な議論がなされ、現在では胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃悪性リンパ腫、早期胃癌切除後胃等が除菌の適応対象疾患として認知されている。
ヘリコバクター・ピロリの除菌療法が胃、十二指腸疾患の新しい治療法として認知されるのに伴い、我が国でも日本消化器病学会により治験ガイドラインが作成され、ヘリコバクター・ピロリ感染の存在診断と除菌判定法が示された（日本消化器病学会雑誌、９６巻、１９９−２０７、１９９９年）。上記治験ガイドラインでは、存在診断は侵襲的検査法である胃部生検組織の培養、鏡検、ウレアーゼ試験にて行い、除菌判定は胃部生検組織の培養と鏡検及び非侵襲的検査法である尿素呼気試験を必須とすることが示されている。また、被験者が小児である等の特殊な場合、血中抗ヘリコバクター・ピロリ抗体検査と存在診断とを併用して判定を行うことが示されている。
しかし、これらのヘリコバクター・ピロリ感染の検査法には以下の問題点がある。侵襲的検査法は、胃内視鏡の挿入及び生検等により被験者が多大な苦痛を強いられることとなる。非侵襲的検査法では、被験者の苦痛は大幅に改善されるが、尿素呼気試験では、検査前の絶食が必要である。また、尿素呼気試験は、マススペクトルや赤外分光高度計等の装置が必要であり、特定の施設でしか実施できず、コストも高くなるという欠点がある。抗体検査は、除菌後も血中抗体価が長期にわたり高値であるので、除菌判定には適さない。従ってこれらの検査に代わる、非侵襲的で且つヘリコバクター・ピロリ感染を直接、特異的に精度良く検出できる検査方法が望まれている。
従来、消化管感染菌の直接検査法として消化管排泄物、特に糞便からの感染菌の選択培地を用いた分離培養が行われてきた。しかし、ヘリコバクター・ピロリに関しては数多くの試みにも拘らず、糞便から分離培養された報告はほとんどない。その理由として、ヘリコバクター・ピロリはｉｎ ｖｉｔｒｏで、低温、栄養欠乏、酸素欠乏等のように環境条件が悪化すると、通常のらせん状体から培養不能な球状体へ形態変化することから、下部消化管においても分離培養不能な球状体に変化していることが考えられる。
一方、抗原抗体反応に基づく免疫学的方法による糞便からのヘリコバクター・ピロリの直接検出に関して、ヘリコバクター・ピロリに対するポリクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより糞便等の排泄物検体中のヘリコバクター・ピロリを検出する方法が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３巻、２１６２−２１６５、１９９５年、特開平１０−１０１２８号公報（特許第３０４３９９９号））。
しかし、ポリクローナル抗体は、一般に交差反応性があり、特異性が劣るうえ、抗血清のロット毎に抗体価や特異性が変動する欠点があるので、ポリクローナル抗体を用いた診断薬の製造は、本質的に品質管理が難しいという問題点がある。現実に、特許第３０４３９９９号の特許権者であるメリディアン社により製造されたポリクローナル抗体を用いた糞便中ヘリコバクター・ピロリ抗原検出キット「ＨｐＳＡ」に関しては、偽陰性の出現や特異性の低さが問題となっている（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｒｉｂｕｎｅ、４−５、１９９９年６月３日号；Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９４巻、１８３０−１８３３、１９９９年）。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、糞便を検体として用い、感度よくヘリコバクター・ピロリへの感染を判定することができるイムノクロマトグラフィー試験片及び診断キットを提供することを目的とするものである。
本発明は、短冊形状の抗体固相化支持体の下端上に下から順に着色ラテックス標識物保持担体、及び、濾紙からなる液体試料吸収用担体が積層され、一方、前記抗体固相化支持体の上端上に濾紙よりなる吸水性担体が積層されてなる積層体からなるイムノクロマトグラフィー試験片であって、前記抗体固相化支持体は、ニトロセルロースシート上にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体が固相化されてなり、前記着色ラテックス粒子標識物保持担体は、着色ラテックス粒子にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体を固定化してなる着色ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗体が不織布に含浸されてなるイムノクロマトグラフィー試験片である。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片は、短冊形状の抗体固相化支持体の下端上に下から順に着色ラテックス標識物保持担体、及び、濾紙からなる液体試料吸収用担体が積層され、一方、前記抗体固相化支持体の上端上に濾紙よりなる吸水性担体が積層されてなる積層体からなるものである。
上記抗体固相化支持体は、ニトロセルロースシート上にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体（以下、抗Ｈｐモノクローナル抗体ともいう）が固相化されているものである。
上記抗Ｈｐモノクローナル抗体としては、例えば、ハイブリドーマ２１Ｇ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３６）、４１Ａ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３７）、又は、８２Ｂ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３８）、３１Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２９）、又は、８２Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）から産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。
固相化された抗Ｈｐモノクローナル抗体は、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを認識し、カタラーゼと着色ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗体との複合体を捕捉することができる。従って、抗Ｈｐモノクローナル抗体が抗体固相化支持体上に線上に固相化されていれば、そのラインが着色ラテックス粒子により浮かび上がることとなる。
上記抗体固相化支持体は、抗Ｈｐモノクローナル抗体を分散させた緩衝液を、ニトロセルロースシートに塗布し、乾燥することにより得ることができる。
上記緩衝液としては特に限定されないが、得られたイムノクロマトグラフィー試験片のヘリコバクター・ピロリの検出感度の点から、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等が好ましい。
上記抗体固相化支持体には、更に、抗Ｈｐモノクローナル抗体に対する抗体、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ、コントロールライン用着色ラテックス粒子標識物に対して特異的に結合する物質が固相化されていてもよい。これにより、イムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定することができる。
上記着色ラテックス粒子標識物保持担体は、着色ラテックス粒子にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体を固定化してなる着色ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗体が不織布に含浸されているものである。
上記不織布としては特に限定されず、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン、セルロース、パルプ等からなるものを挙げることができる。
上記ラテックス粒子としては特に限定されず、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなる微粒子を挙げることができる。これらのうち、抗体又は抗原の吸着性に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、ポリスチレン系のラテックス粒子が好適に用いられる。
抗Ｈｐモノクローナル抗体を上記着色ラテックス粒子に担持する方法としては特に限定されず、例えば、物理的又は化学的に吸着させる方法等により行うことができる。
上記着色ラテックス粒子標識物保持担体には、更に、異なる色に着色された着色ラテックスに抗体等を固定した第２着色ラテックス粒子標識物が含浸されていてもよい。このような第２着色ラテックス粒子標識物はコントロールライン用マーカーとして用いることができる。
上記着色ラテックス粒子標識物保持担体は、スキムミルク又はウシ血清アルブミンでブロッキングされていることが好ましい。これにより、非特異的な反応を抑制することができ、陰性の検体を陽性と判定する偽陽性をなくすことができる。
上記液体試料吸収用担体は、酸性物質吸着能を保持していることが好ましい。糞便中の色素や夾雑物は酸性物質が多い。酸性物質吸着能が保持されていることにより、ヘリコバクター・ピロリに対して優れた検出感度・特異度を発現することができる。このような酸性物質吸着能が保持されている液体試料吸収用担体としては、市販品を用いることができ、例えば、ＤＥ８１（ワットマン社製）等を挙げることができる。
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片は、更に、プラスチック等よりなる基体に固定されて強度が付与されていてもよく、また、保護のために表面に透明なテープ等が貼られていてもよい。
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片の製造方法としては特に限定されず、例えば、以下の方法により得ることができる。
（１）抗体固相化支持体の作製
抗Ｈｐモノクローナル抗体及び抗ウサギＩｇＧ抗体を線状に固相化した抗体固相化支持体を作製するために、ニトロセルロースシート（ワットマン社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端より１０ｍｍの位置にモノクローナル抗体２１Ｇ２の溶液、１５ｍｍの位置に抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナル抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）の溶液をバイオジェットＱ３０００（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて塗布した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥した。
（２）着色ラテックス粒子標識物保持担体の調製
ａ．赤色ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗体
赤色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０％、４５０ｎｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）３００μＬにＰＢＳ１．２ｍＬを加え、１３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。沈渣にモノクローナル抗体２１Ｇ２溶液（５ｍｇ／ｍＬ）１．５ｍＬを加え、充分混和して、室温、１時間反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去するため、１３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣をＰＢＳ１．５ｍＬに懸濁し、再度遠心分離を行った。１％スキムミルク１ｍＬを加え、室温、１時間反応させてマスキングを行った。その後、１３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣を１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１．５ｍＬに懸濁した。
ｂ．青色ラテックス粒子標識ウサギＩｇＧ
青色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０％、４５０ｎｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及びウサギＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｃａｐｐｅｌ社製）を用いて上記と同様な操作で青色ラテックス粒子標識ウサギＩｇＧを調製した。
ｃ．着色ラテックス粒子標識物保持担体
上記２種類の着色ラテックス粒子標識抗体を等量混和し、ベンリーゼ（商標登録）不織布（旭化成社製）５ｍｍ×５ｍｍに１０μＬ含浸させ、通風乾燥した。
（３）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
抗体固相化支持体の下端から２．５ｍｍの位置まで着色ラテックス標識物保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス標識物保持担体上に液体試料吸収用担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片が含まれている診断キットもまた、本発明の１つである。
上記診断キットには、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片以外に、例えば、ウェル、陽性コントロール、陰性コントロール、便懸濁用緩衝液、濃縮洗浄液等が含まれていてもよい。
上記便懸濁用緩衝液としては特に限定されないが、検出感度に優れる点より、ＰＢＳ及び／又はホウ酸ナトリウム緩衝液が好ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）抗体固相化用緩衝液の検討
（１）抗体固相化支持体の作製
３％メタノールを含む１０ｍＭの各緩衝液（リン酸ナトリウム（ｐＨ５〜８）、酢酸ナトリウム（ｐＨ４〜６）、酢酸アンモニウム（ｐＨ４〜６）、クエン酸ナトリウム（ｐＨ４〜６）、トリス塩酸（ｐＨ７〜９）、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８〜１０）、塩化アンモニウム（ｐＨ８〜１１）、炭酸アンモニウム（ｐＨ８〜１０））を調製し、抗ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）モノクローナル抗体２１Ｇ２を１ｍｇ／ｍＬの濃度に添加した。ニトロセルロースシート（ワットマン社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端から１０ｍｍの位置にテストライン用として各緩衝液で調製した抗Ｈｐモノクローナル抗体２１Ｇ２溶液を、１５ｍｍの位置にコントロールライン用として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）（１ｍｇ／ｍＬ）を、バイオジェットＱ３０００（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて線状に塗布して固相化した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥した。
（２）着色ラテックス粒子標識抗体の作製
赤色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０％、粒子径４５０ｎｍ、ポリマーラボトリーズ社製）１００μＬを、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。沈渣に抗Ｈｐモノクローナル抗体２１Ｇ２溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬ加え、充分混和して、室温、１時間反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去するため、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣をＰＢＳ１ｍＬに懸濁し、再度遠心分離を行った。１％スキムミルク１ｍＬを加え、室温、１時間反応させてマスキングを行った。その後、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１ｍＬに沈渣を懸濁した。
（３）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）で作製したそれぞれの抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで５ｍｍ×１０ｍｍに裁断したグラスフィルター（ワットマン社製）を重ねた。更に、グラスフィルター上に液体試料吸収用担体（Ｃ／Ｐ−３０、ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（４）Ｈｐ標準抗原の調製
５％ウマ脱繊血を含むブレイン ハート インヒュージョン寒天培地（ディフコ社製）１５０枚にヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ４３５０４株を３７℃、４日間、微好気培養した。培養後、菌体を集め、ＰＢＳ ４０ｍＬで懸濁後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。沈渣を０．５％ホルマリン含有ＰＢＳ ４０ｍＬに懸濁し、４℃、１晩放置して不活化した。不活化した菌体は、ＰＢＳ ４０ｍＬにて３回洗浄し、ホルマリンを除去した後、同量のＰＢＳに再懸濁した。菌液の濁度（５４０ｎｍでの吸光度）及び総菌数（計算盤を用いた顕微鏡観察）を確認した後、超音波処理により破砕した。菌体破砕物は、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、その上清を更に３００００ｒｐｍ、３０分間超遠心した。この上清を０．２μｍのフィルターにてろ過してＨｐ標準抗原とした。
（５）Ｈｐ抗原標準液の測定
０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０−ＰＢＳで希釈したＨｐ抗原標準液５０μＬと、（２）で作製した着色ラテックス粒子標識抗体液１０μＬとを混合した液に（３）で得られたイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部を浸漬して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表１に示した。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「±」はテストラインの赤い色が確認できるが非常に色が薄いこと、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないことを示す。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）及び酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）を用いてテストラインを固相化することで、Ｈｐ抗原標準液０．５μｇ／ｍＬまで判定可能であった。

（実施例２）着色ラテックス標識物保持担体のブロッキング溶液の比較
（１）抗体固相化支持体の作製
ニトロセルロースシート（ワットマン社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端から１０ｍｍの位置にテストライン用として３％メタノールを含む１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）緩衝液で調製した抗Ｈｐモノクローナル抗体溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１５ｍｍの位置にコントロールライン用として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）（１ｍｇ／ｍＬ）をバイオジェットＱ３０００（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて線状に塗布して固相化した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥した。
（２）着色ラテックス標識物保持担体作製時のブロッキング溶液の比較
ポリビニルアルコール（以下ＰＶＡとする、和光純薬社製）、ポリビニルピロリドンＫ１５（以下ＰＶＰとする、東京化成社製）、ツィーン２０、トライトンＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳとする）、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡとする）を用いて、着色ラテックス標識物保持用担体であるグラスファイバーフィルターのブロッキングに及ぼす影響を調べた。５ｍｍ×１０ｍｍに裁断したグラスフィルターを、１％濃度に調製したＰＶＡ、ＰＶＰ、ツィーン２０、トライトンＸ−１００、ＳＤＳ、スキムミルク、ＢＳＡにそれぞれ５分間浸漬し、ブロッキングを行った。室温、２時間乾燥後、実施例１で作製した着色ラテックス粒子標識抗体を１０μＬ塗布した。その後、充分に乾燥し着色ラテックス標識物保持担体とした。
（３）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）で作製した抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで（２）で作製したそれぞれの着色ラテックス標識抗体保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス保持担体上に液体試料吸収用担体（Ｃ／Ｐ−３０、ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（４）糞便検体中ヘリコバクター・ピロリの検出
Ｈｐ陽性５名、Ｈｐ陰性５名の糞便検体０．１ｇを０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０−ＰＢＳ ２ｍＬに懸濁した。３０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して夾雑物を除去し、上清５０μＬを（４）で作製したイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部に滴下した。１０分後に目視判定した。その結果を表２に示した。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「±」はテストラインの赤い色が確認できるが非常に色が薄いこと、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないこと、「＊」は、ラテックス標識抗体が凝集し、テストラインまで展開できないことを示す。ＢＳＡ又はスキムミルクによってブロッキングしたグラスファイバーフィルターが、陽性検体では全例陽性、陰性検体では全例陰性と判定できた。

（実施例３）液体試料吸収用担体の比較
（１）着色ラテックス標識物保持担体の作製
５ｍｍ×１０ｍｍに裁断したグラスフィルターを、１％濃度に調製したスキムミルクに５分間浸漬し、ブロッキングを行った。室温、２時間乾燥後、実施例１で作製した着色ラテックス粒子標識抗体を１０μＬ塗布した。その後、充分に乾燥し着色ラテックス標識物保持担体とした。
（２）液体試料吸収用担体の比較
実施例２で作製した抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで（１）で作製した着色ラテックス標識物保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス標識物保持担体上に液体試料吸収用担体としてＣ／Ｐ−３０（ワットマン社製）、Ｐ８１（ワットマン社製）、Ｃ／ＤＥ３０（ワットマン社製）、ＤＥ８１（ワットマン社製）、ＧＦ／ＱＡ３０（ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（３）Ｈｐ抗原標準液の測定
０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０−ＰＢＳで希釈したＨｐ抗原標準液５０μＬを上記で得られたイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部に滴下して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表３に示した。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「±」はテストラインの赤い色が確認できるが非常に色が薄いこと、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないことを示す。液体試料吸収用担体としてＤＥ８１を用いるとＨｐ抗原濃度０．１μｇ／ｍＬまで判定可能であった。

（実施例４）Ｈｐ検出に及ぼす便懸濁用緩衝液の組成の影響
（１）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
実施例２で作製した抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで実施例３で作製した着色ラテックス標識物保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス標識物保持担体上に液体試料吸収用担体としてＤＥ８１（ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（２）Ｈｐ標準抗原検出に及ぼす便懸濁用緩衝液の組成の影響
０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０−ＰＢＳ及び０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０を含む１５０ｍＭの各緩衝液（リン酸ナトリウム（ｐＨ５〜８）、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８〜１０））で希釈したＨｐ抗原標準液５０μＬを上記で得られたイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部に滴下して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表４に示した。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「±」はテストラインの赤い色が確認できるが非常に色が薄いこと、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないことを示す。便懸濁用緩衝液にＰＢＳ及びホウ酸ナトリウム緩衝液を用いるとＨｐ抗原濃度０．１μｇ／ｍＬまで正確に判定可能であった。

（実施例５）抗Ｈｐモノクローナル抗体８２Ｂ９を用いたイムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）抗体固相化支持体の作製
３％メタノールを含む１０ｍＭの各緩衝液（リン酸ナトリウム（ｐＨ５〜８）、酢酸アンモニウム（ｐＨ４〜６）、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８〜１０））を調製し、抗ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）モノクローナル抗体８２Ｂ９を１ｍｇ／ｍＬの濃度に添加した。ニトロセルロースシート（ワットマン社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端から１０ｍｍの位置にテストライン用として各緩衝液で調製した抗Ｈｐモノクローナル抗体８２Ｂ９溶液を、１５ｍｍの位置にコントロールライン用として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）（１ｍｇ／ｍＬ）を、バイオジェットＱ３０００（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて線状に塗布して固相化した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥した。
（２）着色ラテックス粒子標識抗体の作製
赤色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０％、粒子径４５０ｎｍ、ポリマーラボトリーズ社製）１００μＬを、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。沈渣に抗Ｈｐモノクローナル抗体８２Ｂ９溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬ加え、充分混和して、室温、１時間反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去するため、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣をＰＢＳ１ｍＬに懸濁し、再度遠心分離を行った。１％スキムミルク１ｍＬを加え、室温、１時間反応させてマスキングを行った。その後、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１ｍＬに沈渣を懸濁した。
（３）着色ラテックス標識物保持担体の作製
５ｍｍ×１０ｍｍに裁断したグラスフィルターを、１％濃度に調製したスキムミルクに５分間浸漬し、ブロッキングを行った。室温、２時間乾燥後、（２）で作製した着色ラテックス粒子標識抗体を１０μＬ塗布した。その後、充分に乾燥し着色ラテックス標識物保持担体とした。
（４）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）で作製したそれぞれの抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで（３）で作製した着色ラテックス標識物保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス標識物保持担体上に液体試料吸収用担体としてＤＥ８１（ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（５）Ｈｐ抗原標準液の測定
０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０を含む１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で希釈したＨｐ抗原標準液５０μＬを上記で得られたイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部に滴下して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表５に示す。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「±」はテストラインの赤い色が確認できるが非常に色が薄いこと、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないことを示す。リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）を用いてテストラインを固相化することで、Ｈｐ抗原濃度０．２５μｇ／ｍＬまで正確に判定可能であった。

（実施例６）抗Ｈｐモノクローナル抗体４１Ａ５を用いたイムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）抗体固相化支持体の作製
３％メタノールを含む１０ｍＭの各緩衝液（リン酸ナトリウム（ｐＨ５〜８）、酢酸アンモニウム（ｐＨ４〜６）、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８〜１０））を調製し、抗ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）モノクローナル抗体４１Ａ５を１ｍｇ／ｍＬの濃度に添加した。ニトロセルロースシート（ワットマン社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端から１０ｍｍの位置にテストライン用として各緩衝液で調製した抗Ｈｐモノクローナル抗体４１Ａ５溶液を、１５ｍｍの位置にコントロールライン用として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）（１ｍｇ／ｍＬ）を、バイオジェットＱ３０００（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて線状に塗布して固相化した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥した。
（２）着色ラテックス粒子標識抗体の作製
赤色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０％、粒子径４５０ｎｍ、ポリマーラボトリーズ社製）１００μＬを、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。沈渣に抗Ｈｐモノクローナル抗体４１Ａ５溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬ加え、充分混和して、室温、１時間反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去するため、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣をＰＢＳ１ｍＬに懸濁し、再度遠心分離を行った。１％スキムミルク１ｍＬを加え、室温、１時間反応させてマスキングを行った。その後、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１ｍＬに沈渣を懸濁した。
（３）着色ラテックス標識物保持担体の作製
５ｍｍ×１０ｍｍに裁断したグラスフィルターを、１％濃度に調製したスキムミルクに５分間浸漬し、ブロッキングを行った。室温、２時間乾燥後、（２）で作製した着色ラテックス粒子標識抗体を１０μＬ塗布した。その後、充分に乾燥し着色ラテックス標識物保持担体とした。
（４）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）で作製したそれぞれの抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで（３）で作製した着色ラテックス標識物保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス標識物保持担体上に液体試料吸収用担体としてＤＥ８１（ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（５）Ｈｐ抗原標準液の測定
０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０を含む１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で希釈したＨｐ抗原標準液５０μＬを上記で得られたイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部に滴下して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表５に示す。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないことを示す。酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４及びｐＨ５）を用いてテストラインを固相化することで、Ｈｐ抗原濃度０．２５μｇ／ｍＬまで正確に判定可能であった。

（実施例７）抗Ｈｐモノクローナル抗体３１Ａ３および抗体２１Ｇ２を用いたイムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）抗体固相化支持体の作製
３％メタノールを含む１０ｍＭの各緩衝液（リン酸ナトリウム（ｐＨ５〜８）、酢酸アンモニウム（ｐＨ４〜６）、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８〜１０））を調製し、抗ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）モノクローナル抗体３１Ａ３を１ｍｇ／ｍｌの濃度に添加した。ニトロセルロースシート（ワットマン社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端から１０ｍｍの位置にテストライン用として各緩衝液で調製した抗Ｈｐモノクローナル抗体溶液を、１５ｍｍの位置にコントロールライン用として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）（１ｍｇ／ｍｌ）を、バイオジェットＱ３０００（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて線状に塗布して固相化した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥した。
（２）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）で作製したそれぞれの抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで実施例３（１）で作製した抗体２１Ｇ２着色ラテックス標識物保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス標識物保持担体上に液体試料吸収用担体としてＤＥ８１（ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（３）Ｈｐ抗原標準液の測定
０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０を含む１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で希釈したＨｐ抗原標準液５０μＬを上記で得られたイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部に滴下して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表７に示す。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「±」はテストラインの赤い色が確認できるが非常に色が薄いこと、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないことを示す。リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いてテストラインを固相化することで、Ｈｐ抗原濃度０．２５μｇ／ｍｌまで正確に判定可能であった。

（実施例８）抗Ｈｐモノクローナル抗体８２Ａ３を用いたイムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）抗体固相化支持体の作製
３％メタノールを含む１０ｍＭの各緩衝液（リン酸ナトリウム（ｐＨ５〜８）、酢酸アンモニウム（ｐＨ４〜６）、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８〜１０））を調製し、抗ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）モノクローナル抗体８２Ａ３を１ｍｇ／ｍｌの濃度に添加した。ニトロセルロースシート（ワットマン社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端から１０ｍｍの位置にテストライン用として各緩衝液で調製した抗Ｈｐモノクローナル抗体溶液を、１５ｍｍの位置にコントロールライン用として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）（１ｍｇ／ｍｌ）を、バイオジェットＱ３０００（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて線状に塗布して固相化した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥した。
（２）着色ラテックス粒子標識抗体の作製
赤色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０％、粒子径４５０ｎｍ、ポリマーラボトリーズ社製）１００μＬを、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。沈渣に抗Ｈｐモノクローナル抗体８２Ａ３溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ加え、充分混和して、室温、１時間反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去するため、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣をＰＢＳ１ｍｌに懸濁し、再度遠心分離を行った。１％スキムミルク１ｍｌを加え、室温、１時間反応させてマスキングを行った。その後、１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１ｍｌに沈渣を懸濁した。
（３）着色ラテックス標識物保持担体の作製
５ｍｍ×１０ｍｍに裁断したグラスフィルターを、１％濃度に調製したスキムミルクに５分間浸漬し、ブロッキングを行った。室温、２時間乾燥後、（２）で作製した着色ラテックス粒子標識抗体を１０μＬ塗布した。その後、充分に乾燥し着色ラテックス標識物保持担体とした。
（４）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）で作製したそれぞれの抗体固相化支持体の下端から２ｍｍの位置まで（３）で作製した着色ラテックス標識物保持担体を重ねた。更に、着色ラテックス標識物保持担体上に液体試料吸収用担体としてＤＥ８１（ワットマン社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
（５）Ｈｐ抗原標準液の測定
０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０を含む１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で希釈したＨｐ抗原標準液５０μＬを上記で得られたイムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体部に滴下して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表８に示す。「＋」はテストラインの赤いラインを確認できること、「±」はテストラインの赤い色が確認できるが非常に色が薄いこと、「−」はテストラインの赤いラインを確認できないことを示す。酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４）を用いてテストラインを固相化することで、Ｈｐ抗原濃度０．５μｇ／ｍｌまで正確に判定可能であった。

（実施例９）イムノクロマトグラフィーによる糞便検体中Ｈｐの検出
尿素呼気試験によりＨｐ陽性者及び陰性者と判定された各１０名の糞便検体５０ｍｇを実施例４で示した１５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８）を用いる便懸濁用緩衝液１ｍＬに懸濁した。便懸濁液５０μＬを、実施例３（液体試料吸収用担体としてＤＥ８１を使用）、実施例５、実施例６、実施例７（実施例８で作製した各イムノクロマトグラフィー試験片の液体試料吸収用担体に滴下した。１０分後にテストラインの赤いラインの有無を目視判定した。その結果、いずれの試験片においても、陽性検体では、全１０例とも赤いラインが確認でき、陽性と判定された。一方、陰性検体では、全１０例とも赤いラインは確認できず、陰性と判定された。なお、コントロールラインは全検体で確認できた。これらの検体をメリディアン社製のＨｐＳＡ ＥＬＩＳＡ（ポリクローナル抗体を使用した糞便中Ｈｐ抗原検出酵素免疫測定キット）を用いて、添付文書に従って試験した結果、陽性検体は全て陽性と判定された。しかし、陰性検体１０例の内、２例は陽性と判定され、偽陽性率が２０％であった。
実施例１０ イムノクロマトグラフィーによる糞便検体中Ｈｐの検出
尿素呼気試験により判定されたＨｐ陽性者６６名及び陰性者１２名の糞便検体５０ｍｇを実施例４で示したＰＢＳを用いる便懸濁用緩衝液１ｍＬに懸濁した。便懸濁液５０μＬを、実施例３で作製したイムノクロマトグラフィー試験片（液体試料吸収用担体としてＤＥ８１を使用）の液体試料吸収用担体に滴下した。１０分後にテストラインの赤いラインの有無を目視判定した。その結果、陽性検体全６６例とも赤いラインが確認でき、陽性と判定された。一方、陰性検体では、全１２例とも赤いラインは確認できず、陰性と判定され、一致率１００％であった。なお、コントロールラインは全検体で確認できた。
実施例１１ 臨床分離Ｈｐ株に対する反応性の検討
臨床から分離したＨｐ株１２０株に対する反応性を検討した。実施例１に記載したのと同様の方法により各菌株を培養して菌体を集め、菌体を超音波処理することでＨｐ抗原を調製した。０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０を含む１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で０．２５μｇ／ｍＬに希釈したＨｐ抗原液５０μＬを実施例３で作製したイムノクロマトグラフィー試験片（液体試料吸収用担体としてＤＥ８１を使用）の液体試料吸収用担体に滴下した。１０分後にテストラインの赤いラインの有無を目視判定した。その結果、臨床分離Ｈｐ株全１２０株とも赤いラインを確認でき、陽性と判定した。なお、コントロールラインは全検体で確認できた。
実施例１２ 他の菌株に対する反応性
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ５１４４８株、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ ＡＴＣＣ４９１７９株、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ ＡＴＣＣ４３７７２株、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ ＡＴＣＣ３５６８３株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２株、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ＡＴＣＣ２９４２８株、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ ＩＦＯ１４２９１株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＪＣＭ１２２２株およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＪＣＭ１１９２株に対する反応性を検討した。菌体を超音波処理することで菌体破砕物を得た。０．５％ＢＳＡ−０．０２％ツィーン２０を含む１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）でタンパク質濃度１０μｇ／ｍＬに希釈した各菌体破砕物５０μＬを実施例３で作製したイムノクロマトグラフィー試験片（液体試料吸収用担体としてＤＥ８１を使用）の液体試料吸収用担体に滴下した。１０分後にテストラインの赤いラインの有無を目視判定した。その結果、全ての菌株で赤いラインを確認せず、陰性と判定した。なお、コントロールラインは全検体で確認できた。
産業上の利用可能性
本発明は、上述の構成よりなるので、糞便を検体として用い、感度よくヘリコバクター・ピロリへの感染を判定することができるイムノクロマトグラフィー試験片及び診断キットを提供することができる。

Claims (6)

1. 短冊形状の抗体固相化支持体の下端上に下から順に着色ラテックス標識物保持担体、及び、濾紙からなる液体試料吸収用担体が積層され、一方、前記抗体固相化支持体の上端上に濾紙よりなる吸水性担体が積層されてなる積層体からなるイムノクロマトグラフィー試験片であって、
   前記抗体固相化支持体は、ニトロセルロースシート上にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体が固相化されてなり、
   前記着色ラテックス粒子標識物保持担体は、着色ラテックス粒子にヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体を固定化してなる着色ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗体が不織布に含浸されてなる
   ことを特徴とするイムノクロマトグラフィー試験片。
2. 抗体固相化支持体へのヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体の固相化は、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液及びリン酸ナトリウム緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種の緩衝液に、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼと抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体を分散させ、得られた分散液をニトロセルロースシートに塗布することによることを特徴とする請求の範囲第１項記載のイムノクロマトグラフィー試験片。
3. 着色ラテックス粒子標識物保持担体は、スキムミルク又はウシ血清アルブミンでブロッキングされてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー試験片。
4. 液体試料吸収用担体は、酸性物質吸着能を保持していることを特徴とするイムノクロマトグラフィー試験片。
5. 請求の範囲第１、２、３又は４項記載のイムノクロマトグラフィー試験片を含むことを特徴とする診断キット。
6. 更に、ＰＢＳ及び／又はホウ酸ナトリウム緩衝液よりなる便懸濁用緩衝液を含むことを特徴とする請求の範囲第５項記載の診断キット。