SE454597B - Enzympapper for indikering av kolinesterashemmare der enzymet immobiliserats av en anjonbytare, forfarande for dess framstellning samt anvendning av pappret med ett substrat - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 454 597 och ett torkat impregneringsskikt kan endast långsamt pâverkas av prov- Luften.

Ett annat problem med enzympapper av detta slag år att enzymet Lätt lö- ses ut ur papperet vid vattenkontakt, vilket omöjliggör användning av enzympapperet vid indikering av kolinesterashämmare i vatten. Av samma skäl blir ofta det färgade substratpapperet ojämnt infärgat även vid luftindikering, vilket kanleda till oklara tolkningar av indikerings- resultatet, eftersom enzympapperet mäste fuktas före användningen för att fungera tillfredsställande.

En kritisk faktor är naturligtvis enzymets känslighet gentemot låga kon- centrationer av kolinesterashämmare. Existerande enzympapper har en icke helt tillfredsställande nedre detektionsgräns gentemot t ex nerv- gasen VX. Denna gräns bestäms framför allt genom valet av enzym, där kolinesteras frân rödspätta har speciellt goda känslighetsegenskaper jämfört med traditionellt använda enzymkällor av typen bovint serum el- ler elektrisk âl alternativt rocka. Rödspätteenzymet har emellertid nor- malt icke helt tillfredsställande stabilitetsegenskaper, vilket försvårar dess användning på konventionella enzympapper.

En möjlig teknik för att komma tillrätta med nâgra av ovanstående pro- blem är att immobilisera enzymet till papperet, dvs att kemiskt eller fysikaliskt binda enzymet till bärarmaterialet, kovalent, elektrostatiskt eller med hjälp av hydrofob interaktion. Denna teknik är tidigare känd för andra enzymer, dock inte för kolinesteras frân rödspätta.

Det är för fackmannen känt att immobilisering av ett enzym normalt inne- bär en väsentlig förlust av enzymaktivitet samt långt ifrån alltid med- för en stabilisering av enzymet. Detta framgår bland annat av tabell 5.

Ej heller är det att vänta att enzymets känslighetsegenskaper kvarstår utan snarast kan en försämrad känslighet förväntas, dels till följd av uppträdande steriska hinder i enzymets mikroomgivning, dels till följd av att en stor del enzym normalt inaktiveras vid immobiliseringen, var- vid en lägre specifik aktivitet erhålls. Vanligen innebär en enzymim- mobilisering ocksâ en väsentlig merkostnad vid framställningen av slut- Drodukten. 10 15 20 25 30 454 597 Våtmedel används ofta i andra sammanhang för att förbättra produkters vätbarhet. Flertalet vätmedel har emellertid normalt en inaktiverande Ett olämpligt valt vätmedel kan dessutom försvåra enzymets immobilisering. och/eller destabiliserande verkan på enzymers aktivitet.

Föreliggande uppfinning avser ett enzympapper där enzymet, företrädes- vis kolinesteras frân rödspätta, immobiliserats genom elektrostatisk adsorption till ett jonbytarpapper. Förfarandet ger en produkt med unika egenskaper som är oväntat mycket bättre i flera avseenden, jämfört med vad en fackman på området skulle förvänta sig. Det unika Ligger framför allt i att kombinationen av alla bra egenskaper av ovan nämnt slag kan erhållas samtidigt pâ ett och samma papper. Denna kombination av bra egenskaper är inte tidigare känd och enzympapperet är klart överlägset hittills kända motsvarande produkter.

Den uppnådda kombinationen av positiva egenskaper sammanfattas_i det följande: a) Produkten kan utan problem användas för både luft- och vattenindi- kering. b) Enzympapperet ger på substratpapperet en jämnt färgad yta av hydro- lyserat substrat, dvs ett tydligt utslag som inte kan misstolkas. c) Känslighetsegenskaperna är bättre än motsvarande existerande pro- dukters egenskaper. d) Papperets vätbarhet är på motsvarande sätt väsentligt bättre jäm- fört med tidigare kända enzympapper. e) Stabilitetsegenskaperna hos enzymet har förbättrats avsevärt i för- hållande till fritt vattenlösligt kolinesteras från rödspätta, så att produktens stabilitet är bättre än flertalet på marknaden be- _fintliga motsvarande enzympapper. f) En mycket liten förlust av enzymaktivitet sker genom det använda immobiliseringsförfarandet, vilket är väsentligt ur både känslig- hetssynpunkt och ur kostnadssynpunkt. g) Den använda tekniken vid enzympapperets framställning är mycket enkel, varför produktionskostnaden kan hållas tillräckligt låg. 10 15 20 25 30 35 454 597 Det för uppfinningen kännetecknande framgår av de efterföljande patent- kraven. , Genom att man vid framställningen av enzympapperet använder ett papper av typen kromatografipapper med jonbytesfunktion, företrädesvis med anjonbytesfunktion och god mekanisk våtstyrka, i kombination med en enzymlösning innehållande, förutom enzymet, ett ytaktivt ämne och en stabiliserande komponent, företrädesvis av kolhydrattyp, erhålles en bibehållen eller obetydligt reducerad enzymaktivitet hos enzympapperet.

Enzymet immobiliseras därvid, samtidigt som ett oväntat högt kopplings- utbyte av immobiliserat enzym och en oväntat hög specifik aktivitet hos det immobiliserade enzymet erhålles. Detta är mycket oväntat eftersom immobiliseringsförfaranden såsom tidigare påpekats normalt leder till en väsentlig försämring av enzymets aktivitetsegenskaper (se tabell S).

Känslighetsegenskaperna bibehålles hos det immobiliserade enzymet sam- Att vät- barheten förbättras utan att detta åtföljs av en nedgång i enzymaktivi- tidigt som vätbarheten av enzympapperet kraftigt förbättras. tet,' enzymstabilitet, kopplingsutbyte eller känslighet är mycket ovän~ tat, eftersom vätmedel normalt inaktiverar enzymer i större eller mindre grad. Genom valet av immobiliseringsförfarande samt tillsatsen av den stabiliserande komponenten erhålles därför en oväntat bra enzymstabili- sering hos den färdiga produkten. Flertalet andra sådana kombinationer ger ingen förbättring, utan ofta också en destabilisering.

I en speciellt lämplig utföringsform av uppfinningen används ett kromato~ grafipapper av DEAE-cellulosa av typen Whatman DE 81 och som vätmedel ett nonjoniskt sådant, t ex Tween 80. Enzymet utgörs företrädesvis av kolin- esteras från rödspätta, och som stabiliserande komponenter används företrädesvis sackaros och ett lågmolekylärt dextran, t ex dextran T10 (Pharmacia Fine Chemicals). Enzymlösningen kan vara buffrad, företrädes- vis med en fosfatbuffert.

Det substrat, som visat sig ha de bästa egenskaperna vid en enzymatisk färgreaktion av angiven typ, är 2,6-diklorindofenylacetat (DIFA).

Substratet anbringas med fördel på ett absorberande papper, t ex kroma- tografipapper eller filterpapper. 10 15 20 25 30 35 454 597 Uppfinningen skall nu närmare beskrivas i âskâdliggörande men ej be- gränsande syfte med hjälp av ett antal utföringsexempel.

FRAMSTÄLLNING AV ENZYMPAPPER §¿§mggl_1¿ Enzym immobiliserat till DEAE-cellulosapapper Kromatografipapper av typ whatman DE 81 jämviktas med en 1 M NaCl-lös- ning under ca 30 min, tvättas noga med destillerat vatten och torkas vid rumstemperatur. Pâ Lämpligt stora bitar av detta papper, som klipps eller stansas ut, t ex runda skivor med diametern 20 mm, appli- ceras 5 ul av en enzymlösning i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) bestående av kolinesteras frân rödspätta med en specifik aktivitet av 1,46 u/mg eller 0,83 umol/min/mg (40 mg/ml), sackaros (160 mg/ml), dextran T 10 (160 mg/ml) samt som vätmedel Tween 80 (4 ul/ml). De så tillverkade enzympapperen lufttorkas vid rumstemperatur och torkas därefter i exsickator under vakuum. §5g@pgL_§¿ Lagringsstabilitet för enzympapper vid förvaring av enzympapperen inneslutes de lämpligen i ett tätt för- packningsmaterial. I försöket har hopsvetsade polypropenpâsar använts, varvid acceptabla lagringstider framgår av följande tabell.

TABELL 1 Lagringstemperatur Laqrinqstid - 3o°c > s ar zo-zs°c > 3 ar 4o-°cf > 1,5 ar 62-6a°c 1. man I jämförande syfte har lagringsförsök utförts med nâgra alternativa kombinationer av enzympapper vid lagringstemperaturen 4006. Enzym- papperen har framställts enligt exempel 1 (i tillämpliga delar) och 454 597 10 15 20 25 30 35 resultaten framgår av tabell 2, varvid E = rödspätteenzym (0,2 mg); 1,46 u/mg; 1,62 u/mg protein S = sackaros (0,8 mg) D = dextran T 10 (0,8 mg) T = Tween 80 (0,02 pl) TABELL 2 Enzymets halveringstid (månä Papperskvalitet Komponenter Enzymutbyte (Z) dvs 50 Z kvarvarande aktivi- tet av initialt värde DEAE-cellulosa E, S, D, T 59 > 18 (Nhatman DE 81) (enligt upp- iinningen) " E, S, D 62 > 18 " E, T 20 < 1 Cellulosa E, S, D, T 45 ~ 5 (Nhatman 113) Av tabell 2 framgår att lagringsstabiliteten är sämre vid filterpappers- kvaliteten Whatman 113 än vid Whatman 81 som är ett papper av typen kro- matografipapper med jonbytesfunktion. Någon immobilisering av enzymet förekommer inte vid ett papper av typen Whatman 113. Resultaten i tabell 2 visar att immobilisering av enzymet ger förbättrad lagringsstabilitet.

Dessutom framgår den positiva effekten av de stabiliserande komponenterna sackaros och dextran.

FRAMSTÄLLNING AV SUBSTRATPAPPER 2,6-diklorindofenol acetyleras med ett stort överskott av ättiksyraan- hydrid till 2,6-diklorindofenylacetat (DIFA); som utfälls i vatten och m1 10 15 20 25 30 35 454 597 omkristalliseras ur n-hexan: dietyleter.

Hhatman 113-papper impregneras med en mättad Lösning av DIFA i bensin (50 pl DIFA/cmz papper), varefter substratpapperet Lufttorkas vid rums- temperatur. Lämpligt stora bitar av substratpapperet utstansas.

Som bärare för DIFA har även följande papperskvaliteter visat sig vara lämpliga: tell OOH, OOM och IF. kromatografipapperet whatman No 1 och filterpapperen Munk- Förutom i bensin kan DIFA lösas i andra lösningsmedel såsom aceton, kol- tetraklorid, kloroform, diklormetan eller 1,2-dikloretan, varefter sä smycket av Lösningen droppas pâ papperet att hela papperet blir jämnt fuktat. Ytkoncentrationen, dvs mängden DIFA/cmz, kan varieras genom att koncentrationen DIFA i Lösningen ändras. Det har visat sig att ytkon- centrationen inte är kritisk sä Länge tillräckligt stor mängd substrat finns tillgänglig för att ett tydligt omslag skall erhållas vid den en- zymatiska färgreaktionen. Företrädesvis används en relativt hög ytkon- centration, t ex 80-100 pg/cmä för att kompensera de förluster i form av sönderfall och eventuell sublimering av substratet, som man måste räkna med vid Lagring.

För förbättrad stabilitet av DIFA vid Längre tids Lagring av det sålunda framställda substratpapperet bör det förvaras tillsammans med torkmedel, t ex blâgel, silikagel eller molekylsikt (4 Ä).

INDIKERING §xgmggl_§¿ Indikering av kolinesterashämmarei gas Enligtfexempel 1 framställt enzympapper fuktas med ca 4 droppar destille- rat vatten, varefter papperet exponeras under 2 min för den gas, som miss- tänks innehålla eller utgöra kobinesterashämmare. Papperet framkallas genom att ett substratpapper pressas mot detsamma under 2 min, varefter utslaget avläses. Ett ofärgat, rosa eller mycket svagt grått utslag indikerar att kolinesterashämmare finns närvarande i den undersökta gasen, medan en blå eller svagt blå färgton indikerar att någon kolinesteras- 10 15 20 25 30 35 454 597 hämmare inte finns närvarande. Enzympapperets känslighet vid indike- ring av sarin, dvs isopropylmetylfosfonofluoridat, och andra organiska fosforföreningar vilka sammanfattningsvis betecknas nervgaser framgår av följande tabell.

TABELL 3 Kolinesterashämmare Papnerskëpsliqhet (mg/m3) Sarin 0,04 VX 0,04 §¿gmggl_§¿ indikering av kolinesterashämmare i vätska Enzympapper framställt enligt exempel 1 doppas utan föregående fukt- ning under omröring ned i en vattenlösning innehållande den aktuella inhibitorn under 2 min. Framkallning av papperet sker såsom beskrivits i exempel 4. Enzympapperets känslighet framgår av tabell 4.

TABELL 4 Inhibitor Papperskänslighet (mq/L) Sarin 0,6 VX 0,05 JÄMFÖRANDE FÖRSÖK šxsmesLé Andra metoder för immobilisering av enzymet till en bärare genom- förde§'i jämförande syfte, varvid det visade sig att oväntat bra resul- tat frân kopplingsutbytessynpunkt erhölls med förfarandet enligt uppfin- ningen (ca 60 Z) jämfört med andra tekniker (ca 0 - 7 Z), vilket fram- går av nedanstående tabell. 454 597 9 TABELL 5 Enzymaktivitet (u) Aktivitet hos immobi- Immobitiseringsmetod före immobitise- Liserad preparation ringen U Z Adsorption tilL Ambertite XAD 7 29,2 0,2 0,7 XAD 2 29,2 0 0 IR 120-103* 29,2 0,1 0,3 Adsorption tiLL Hexytsepharose 6 B 29,2 0,9 3,1 Hexytsepharose 6 B + substrat 29,2 0,6 2,1 HexyLceLLuLosa 29,2 0,5 1,7 Whatman 1 PS 29,2 O O \ Whatman 1 PS * C12H2S°S°3Na 29,2 0 o Adsorption med specieLL teknik tiLL whatman SG 81 5,84 0,4 6,8 Whatman 4 CHR 5,84 0,2 3,4 Tvärbindning med glutar- aLdehyd till wharman se 81 58,4 1,6 2,7 i whatman GF/B 58,4 0,8 1,4 Tvärbindning med gLutar- atdehyd, specielt teknik, tiLL _ wråaiman se 81 5,84 0,13 2,2 Whatman 4 CHR 5,84 0,06 1,0 KovaLent bindning med hjäLp av 2-amino-4,6- diktortriazin tiLL whatman 4 CHR 29,2 0,1 0,3 whatman 4 CHR _ + substrat 29,2 0,3 1,0 ._ 454 597 TABELL 5 førfs' Kovalent bindning med hjälp av CNBr till, 'Hhatman 4 CHR whaman 4 can + substrat Kovatent immøbíliseríng I med hjätp av gtutaratde- hyd till Whatman GF/C whatman eF/c + substrat Kovatent bindning med hjälp av karbodíímid tiLL whatman GF/C whatman GF/C + substrat Nhatman CM 82 Whatman CM 82 + substrat Adsorgtion tíLL whatman DE 81 + sackaros och dextran T 10 whatman DE 81 + sackaros och dextran Nhaçman DE 81 + sackaros, dextran och Tueen 80 Hhatman DE 81 + sackaros och dextran --; ImmobiLiseringsmetod_ _EnzymakÉiQitet'(u) I1o. 1 före immobitise- ringen 29,2 29,2 29,2 23,0 23,0 23,0 23,0 21%; .' 29,2' 29,2 Aktivjtèt hos immobi- Liserad'preparation U 0,3 0,4 0,3 0,3 0,62 0,40 0,47 17,5 16,5 17,2 18,1 Z 1,0 1,4 1,0 1,0 2,7 1,7 2,0 2,4 60 37 59 62 w 10 15 20 ZS 30 35 454 597 11 šz§m2sL_Z Enzympapper framstäLLdes enLigt exempet 1 men även utan tiLLsats av vätmedet, varefter indikeringsförmâgan, dvs enzympapperets känsLighet, utvärderades. Av tabeLL 6 framgår indikeringströsketn vid indikering av kotinesterashämmare i gas och vätska på papper med och utan vätmedeL (Tween 80).

TABELL 6 Indikeringströskel KoLinesterashàmmare Vätska (mg/L) gas (mg/ms) Sarin; med vätmedeL 0,04 0,6 VX; med vätmedel 0,04 0,05 Sarin; utan vätmedeL 0,04 0,6 VX; utan vätmedeL 0,04 0,05 Av tabetten framgår att tiLLsatsen av vätmedlet inte försämrar enzym- papperets känstighet.

Försök visar att inte heLLer stabititeten försämras av vätmedeLstiLL- satsen (se tabeLL 7). Med retativ aktivitet menas enzymaktiviteten i Zavdwiwdtwmiümh.

TABELL 7 Lagringstemp Lagringstid ReL. akt. (Z) Med Tween 80 4006 5 mån 68, 88 Utan Tween 80 40°C 5 män 67 med ivêen so 62-6s°c 0,5 man eo, 71 utan fween so 62-6a°c 0,5 man 65 med fween so 62-ós°c 5,5 man 27, 20 utan rveen so 62-6s°c 5,5 man 29 Av tabeLL 8 framgår att tiltsatsen av vätmedeL inte heLLer minskar enzym- aktiviteten frân koppLingsutbytessynpunkt, viLket man annars skulle kunna vänta sig. 454 597 12 TABELL 8 Enzymaktivitet i Z av påsatt enzymaktivitet 57, 48, 45 41, 44 5 Med Tween 80 Utan Tween 80 sar att tiLLsatsen av vätmedlet Tueen 80 inte pâ- eLLer känsLighetssynpunkt ätbarhet och är Redovisade försök vi verkar enzympapper negativt frân aktivitets- 1Û samtidigt som enzympapperet uppvisar närmast perfekt v genombLött inom Loppet av nâgra sekunder. :rzr~'..':';'.^.. i /F m M

Claims (10)

1: 10 15 20 25 30 35 454 597_ 13 Patentkrav:

1. Enzympapper för användning vid indikering av kolinesterashâmmare i gas eller vätska, k ä n n e t e c k n a t a v att det bestâr av en enzymbârare av typen kromatografipapper med anjonbytesfunktion samt im- mobiliserat på bäraren ett kolinsterasenzym som år isolerat från röd- spätta, minst en kolinesterasenzymet stabiliserande substans samt som vätmedel ett ytaktivt ämne.

2. Enzympapper enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att enzym- bäraren utgöres av ett papper av DEAE-cellulosa, företrädesvis med god mekanisk vâtstyrka.

3. Enzympapper enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t a v att vätmedlet är nonjoniskt, företrädesvis Tween 80.

4. Enzympapper enligt något av krav 1-3, k ä n n e t e c k n a t a v att den/de stabiliserande substansen/erna är av kolhydrattyp, företrä- desvis sackaros och dextran.

5. Enzympapper enligt något av krav 1-4, k ä n n e t e c k n a t a v att det innehåller en buffert, företrädesvis en fostfatbuffert.

6. Förfarande för framställning av ett enzympapper enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att en lösning av enzymet kolinesteras från rödspätta, ett ytaktivt ämne samt minst ett stabiliseringsmedel appliceras pâ ett kromatografipapper med anjonbytesfunktion, som därefter torkas.

7. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t a v att ett kro- matografåpapper av DEAE-cellulosa jämviktas med natriumkloridlösning, tvättas och torkas samt impregneras med en buffrad lösning innehållande enzymet kolinesteras från rödspätta, stabiliseringsmedel av kolhydrattyp, företrädesvis sackaros och dextran, samt ett nonjoniskt vätmedel, före- trädesvis Tween 80, varefter papperet torkas. 10 454 597 _ 14

8. Användning av enzympapperet enligt något av krav 1-5 tillsammans med ett substrat, vilket utgöres av ett av enzymet under färgförândring pâverkbart substrat, t ex 2,6-diklorindofenylacetat, för indikering av ett enzymreaktionen inhiberande ämne i en gas eller vätska, företrädesvis i luft eller vatten.

9. Användning enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a d a v att sub- stratet är adsorberat pâ en porös bärare av papper, företrädesvis av typen kromatografipapper eller filterpapper.

10. k ä n n e t e c k n a d a v att man med hjälp av enzympapperet och det därmed samverkande substra- Användning enligt krav 8 eller 9, tet indikerar närvaron av nervgas eller annan kolinesterashämmare i luft eller vatten.