SK281395B6 - Biosenzor, spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou, spôsob detekcie a rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom - Google Patents

Biosenzor, spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou, spôsob detekcie a rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom Download PDF

Info

Publication number
SK281395B6
SK281395B6 SK2735-92A SK273592A SK281395B6 SK 281395 B6 SK281395 B6 SK 281395B6 SK 273592 A SK273592 A SK 273592A SK 281395 B6 SK281395 B6 SK 281395B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cholinesterase
immobilized
fabric
zone
biosensor
Prior art date
Application number
SK2735-92A
Other languages
English (en)
Other versions
SK273592A3 (en
Inventor
Ivana Tušarová
Emil Halámek
Original Assignee
Oritest, Spol. S R. O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oritest, Spol. S R. O. filed Critical Oritest, Spol. S R. O.
Publication of SK273592A3 publication Critical patent/SK273592A3/sk
Publication of SK281395B6 publication Critical patent/SK281395B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Biosenzor na detekciu a rozlíšenie inhibítorov cholínesteráz vo forme testovacích pásikov zložených zo zóny s imobilizovanou cholínesterázou, farebného etanolu a zóny nosiča s chromogénnym činidlom, v ktorom zónou s imobilizovanou cholínesterázou je bielená celulózová tkanina, výhodne z bavlnených vlákien, na ktoré je imobilizovaná cholínesteráza. Spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou spočíva v tom, že sa na bielenú bavlnenú tkaninu imobilizuje cholínesteráza ponorením tkaniny do vodného roztoku cholínesterázy, výhodne mozgovej acetylcholínesterázy alebo plazmovej butyrylcholínesterázy. Je opísaný aj spôsob detekcie inhibítorov cholínesteráz a spôsob rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom, pri ktorom sa typ inhibítora zistí zo zmeny aktivity inhibovanej imobilizovanej cholínesterázy po reaktivácii inhibovanej cholínesterázy činidlami, najmä kvartérnymi aldoxímami alebo vodou, alebo iónmi alkalických kovov a zemín a následne sa vyhodnotí, ktorým z uvedených činidiel sa aktivita cholínesterázy obnoví.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka biosenzora, spôsobu prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou a spôsobu detekcie a rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom. Ide najmä o analýzu biologicky silne účinných organofosforových a karbamátových inhibítorov cholínesteráz jednoduchým biosenzorom. Vynález umožňuje použitie citlivej biochemickej cholínesterázovej reakcie na detekciu a rozlíšenie extrémne biologicky účinných organofosfátov a karbamátov trvalo využívaných v oblasti priemyselnej chémie, agrochémie a vo vojenstve.
Doterajší stav techniky
Biochemická cholínesterová reakcia ako veľmi citlivá a selektívna metóda je veľmi využívaná už dlhý čas v celom rade modifikácií a aplikácií na detekciu a stanovenie početného súboru inhibítorov cholínesteráz (Ammon, R., Voss, G., Pfliigers, Árch. Ges. Physiol., 235 (1935), s. 393; Michel, O. H., J. Lab. Clin. Med., 34 (1949), s. 1564). Na cholínesterázovej reakcii sú založené rôzne typy technických prostriedkov na detekciu a stanovenie inhibítorov cholínesteráz od komplikovaných automatických analyzátorov ovzdušia a vody cez jednoduchšie uskutočnenia, ako sú rúrkové detektory až po najjednoduchšie, ale o to viac používané detekčné papiere (Franke, S.: Lehrbuch der Militärcheinie, Militärverlag, diel II, Berlín 1977, s. 481; US patent č. 4 324 858; WO 8504424). Bez ohľadu na celkovú komplikovanosť konštrukčného riešenia a výšku ekonomických nákladov si všetky kategórie prostriedkov zachovávajú v dôsledku rovnakého reakčného princípu podobnú citlivosť a selektivitu, čo má za následok, že v úplnej väčšine sa dáva prednosť najjednoduchšiemu a tým i najlacnejšiemu uskutočneniu - detekčným papierom. Rozdiely medzi jednotlivými druhmi detekčných papierov sú dvojakého druhu. V prvom rade použitý substrát a s tým súvisiaca indikačná reakcia. Táto časť uskutočnenia cholínesterázovej reakcie na detekčnom papieri nie je podstatná, pretože nemôže ovplyvniť použiteľnosť na stanovenie vo vode a v ovzduší, hoci sa môže prejaviť na citlivosti stanovenia. Zásadným problémom je spôsob fixácie enzýmu a jeho stabilizácia. Niektoré doterajšie spôsoby sú založené na adsorpcii enzýmu na filtračnom papieri (AO CS 269 267). Iným riešením tohto problému je imobilizácia cholínesterázy na nosič chemickou väzbou, čo je sprevádzané výraznou stratou hydrolytickej aktivity enzýmu a navyše si to vyžaduje na imobilizáciu použiť vysoko čistý a teda i veľmi drahý enzým, pričom predĺženie exspirácie pripraveného enzýmu nie je dostačujúce (RO 105190).
Najbližším známym riešením podľa vynálezu je príprava enzýmového detekčného papiera imobilizáciou cholínesterázy na špeciálnom chromatografickom papieri s ionexovou funkciou v zmesi s dextránovým gélom a indikáciou chromogénnym substrátom (WO 85/04423), keď pri predĺžení skladovateľnosti detekčného papiera nebola dosiahnutá potrebná citlivosť. Podľa veľkého množstva najrôznejších modifikácií vychádzajúcich zo spôsobu vyhodnotenia použitého enzýmu, substrátu, rôznych prostredí alebo ďalších podmienok uskutočnenia, všetky tieto varianty determinuje skutočnosť, že cholínesterázová biochemická reakcia je skupinová pre veľmi početný súbor inhibítorov cholínesteráz, z ktorých najvýznamnejšími sú organofosforové zlúčeniny a karbamáty. Aby bolo možné určiť o aký inhibítor ide, je nevyhnutné uskutočniť niektoré detekčné reakcie alebo fyzikálnochemické merania. Na to je však potrebné veľké množstvo inhibítorov alebo o niekoľko rádov koncentrovanejších roztokov vzoriek ako na vysoko citlivú biochemickú cholínesterázovú metódu. V takomto prípade je nevyhnutné uskutočňovať náročné, zložité a zdĺhavé koncentrovanie vzorky predchádzajúce vlastnej chemickej alebo fyzikálnochemickej identifikácii. Tieto postupy s výnimkou niektorých jednoduchších separačných a identifikačných techník, akou je tenkovrstevná chromatografia, sú nielen časovo náročné, ale vyžadujú ďalšie operácie spojené s uskutočňovaním analytických detekčných reakcií alebo prevádzkou drahej prístrojovej techniky, ktorú prakticky nie je možné uskutočňovať v teréne. Navyše rad organofosforových a karbamátových inhibítorov cholínesteráz v dôsledku svojej extrémnej biologickej účinnosti predstavuje i značné riziko z hľadiska bezpečnosti práce s prihliadnutím na čas trvania nutných operácii s koncentrovaným roztokom stanovovanej látky. Najbližším známym riešením spôsobu analýzy podľa vynálezu je postup na rozlíšenie organofosforových inhibítorov založený na tvorbe komplexov dvoch typov s kovovými iónmi a detekcii cholínesterázovou reakciou (Čebotarjov, O. V.: Voskovaja indikacija, Izdatelstvo akadémii Moskva 1978) a spôsob rozlíšenia organických inhibítorov cholínesterázovou reakciou po modifikácii cholínesterázy kovovými iónmi (AO ČSFR 2699). Uvedené nedostatky, spočívajúce v skupinovom charaktere biochemickej cholínesterázovej reakcie vyvolávajú tak nevyhnutnosť prácneho a zdĺhavého koncentrovania vzorky inhibítora a vyžadujú na identifikáciu ďalšie reagencie a použitie drahej a zložitej prístrojovej techniky, sú odstránené stanovením organofosforových a karbamátových inhibítorov cholínesteráz postupom podľa vynálezu.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je biosenzor na detekciu a rozlíšenie inhibítorov cholínesteráz vo forme testovaných pásikov zložených zo zóny s imobilizovanou cholínesterázou, farebného etanolu a zóny nosiča s chromogénnym činidlom, v ktorom zónou s imobilizovanou cholínesterázou je bielená celulózová tkanina, výhodne z bavlnených vlákien, na ktoré je imobilizovaná cholínesteráza.
Spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou na detekciu a rozlíšenie inhibítorov cholínesteráz spočíva v tom, že sa na bielenú bavlnenú tkaninu imobilizuje cholínesteráza ponorením tkaniny do vodného roztoku cholínesterázy, výhodne mozgovej acetylcholínesterázy alebo plazmovej butyrylcholínesterázy.
Spôsob detekcie inhibítorov cholínesteráz biosenzorom spočíva v tom, že sa na mokrú tkaninu s imobilizovanou cholínesterázou exponovanou v kontrolovanom prostredí nanesie chromogénne činidlo pritlačením zóny nosiča s chromogénnym činidlom, výhodne acetylcholínom alebo butyryltiocholínom a kyselinou a kyselinou 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoovou) a vizuálne sa podľa farebného etanolu hodnotí aktivita cholínesterázy imobilizovanej na tkanine podľa zmeny sfarbenia tkaniny.
Spôsob rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom podľa vynálezu spočíva v tom, že sa typ inhibítora zistí zo zmeny aktivity inhibovanej imobilizovanej cholínesterázy po reaktivácii inhibovanej cholínesterázy činidlami, najmä kvartémymi aldoximami alebo vodou, alebo iónmi alkalických kovov a zemín a následne sa vyhodnotí, ktorým z uvedených činidiel sa aktivita cholínesterázy obnoví.
Použitie biosenzora na rozlíšenie inhibítorov spočíva v tom, že v cholínesteráze imobilizovanej na celulózovej tka2 nine sa po inhibícii organofosforovým alebo karbamátovým inhibítorom obnovuje hydrolytická aktivita indukovanou reaktiváciou kvartémymi aldoxítnami, napríklad l-(2-hydroxyiminometylpyridín)-3-(4-karbamoylpyridín-2-oxopropán)dichloridom a N,N'-trimetylénbis(4-pyridínaldoxím) dichloridom alebo spontánnou reaktiváciou vodou.
Paralelne sa vzorky cholínesterázy imobilizovanej na celulózovej tkanine biosenzora exponujú vo vodnom roztoku inhibítora a v roztoku inhibítora s pridaním iónových zlúčenín, napríklad chloridu sodného, vápenatého alebo amónneho. Vyhodnotením hydrolytickej aktivity reaktivovanej cholínesterázy a aktivity cholínesterázy exponovanej v roztoku inhibítora a v roztoku inhibítora s pridaným chloridom sodným, vápenatým alebo amónnym vznikne charakteristický rozdiel aktivity umožňujúci určenie, o ktorý inhibítor ide.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava roztoku acetylcholínesterázy
Z preparátu acetylcholínesterázy sa pripraví roztok so špecifickou aktivitou 0,5 až 1 U/ml (definícia jednotky U: 1 jednotka zodpovedá hydrolýze 1 gmol acetylcholínu na cholín a kyselinu za 1 minútu pri pH 8,0 a pri teplote 37 °C) rozpustením preparátu v tlmivom roztoku pH 7,5.
Priklad 2
Úprava celulózovej tkaniny
Celulózová tkanina z bavlníkových vlákien sa upraví alkalickým oxidačným bielením varom tkaniny v roztoku obsahujúcom 7,9 g/1 peroxidu vodíka (35 %), 0,2 g/1 chloridu horečnatého, 0,2 g/1 neionogénneho tenzidu (Slovasolu SF-10), 2,1 g/I hydroxidu sodného a 2,5 g/I vodného skla.
Príklad 3
Imobilizácia acetylcholínesterázy na bielenej celulózovej tkanine
Tkanina upravená podľa príkladu 2 po premytí vodou a vysušení pri 50 °C sa na 30 minút vloží do roztoku pripraveného podľa príkladu 1. Potom sa z roztoku vyberie a vysuší pri teplote 20 °C.
Príklad 4
Príprava nosiča so substrátom a chromatogénnym činidlom
Filtračný papier sa na 10 minút vloží do roztoku 0,5 % acetyltiocholínjodidu a 0,15 % kyseliny 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzoovej) v etanole a potom sa papier pri 20 °C vysuší.
Príklad 5
Detekcia inhibítorov vo vode a vo vzorkách získaných homogenizáciou kontrolovanej matrice s vodou
Detekčná tkanina s imobilizovanou acetylcholínesterázou pripravená podľa príkladu 3 sa na 30 minút ponorí do vody alebo vodného extraktu potravín. Potom sa tkanina vyberie a priloží sa na 1 minútu filtračný papier so substrátom a chromogénnym činidlom pripravený podľa príkladu 4. Po odstránení filtračného papiera je v neprítomnosti inhibítorov acetylcholínesterázy tkanina zafarbená na žlto, dôkazom prítomnosti inhibítorov je nezmenená farba tkaniny.
Citlivosť detekcie organofosforových a karbamátových insekticídov vo vode a vodných extraktoch potravín
Insekticíd detekčný limit (mg/1)
CARBOFURAN 2.10’2
METOMYL 1 .10’1
DICHLORVOS 1 .10’1
MEVINYPHOS 1 . 10‘2
PARATION 2 . 10’2
METYLPARA-
TION 4.10
Príklad 6 Detekcia inhibítorov vo vzduchu
Detekčná tkanina s imobilizovanou cholínesterázou pripravená podľa príkladu 3 sa zvlhčí vodou a ponechá v kontrolovanej atmosfére minimálne 1 minútu. Potom sa na tkaninu priloží filtračný papier so substrátom a chromogénnym činidlom pripravený podľa príkladu 4. Po odstránení papiera je v neprítomnosti inhibítorov cholínesteráz tkanina zafarbená na žlto, dôkazom prítomnosti inhibítorov je nezmenená farba tkaniny.
Citlivosť detekcie nervovo paralytických otravných látok vo vzduchu
Nervová látka detekčný limit (mg/1) po expozícii
2 min. 20-min.
izopropylmetylfluórfosfonát (SARIN GB) 1.10’5 4.10‘7
pinakolylmetylfluórfosfonát (SOMAN GD) 8. 10‘6 2 . ÍO’7
0-etyl-s-(2-diizopropylaminoetyl)metyltio- s iír5 S 1ÍY7
fosfonát (LÁTKA VX)
2-dimetylaminoetyldimetylamidofluórfosfát s ίο-6 2 10'7
(LÁTKA GP)
etyldimetylamidokyanofosfát (TABUN GA) 8. 10’5 i. ío·6
cyklohexylmetylfluórfosfonát (CYKLOSIN 3 10’6 1 10’7
GF)
Príklad 7
Použitie biosenzora pri rozlíšení GD a GF
Vzorky detekčnej tkaniny s imobilizovanou acetylcholinesterázou inhibovanou 2- až 5-minútovou inkubáciou v roztoku obsahujúcom organofosforový inhibítor tak, že tkanina ostane po odstránení filtračného papiera so substrátom a chromogénnym činidlom priloženým na tkaninu na 1 min. biela, sa reaktivujú 5 minút v 0,02 mg/ml l-(2-hydroxyiminometylpyridín)-3-(4-karbamoylpyridín)-2-oxapropandichloride (HI-6) a 0,05 mg/ml Ν,Ν'-trimetylénbis(4-pyridínaldoxím)dichloride(TMB-4).
Po reaktivácii sa vyhodnotí hydrolytická aktivita enzýmu oboch vzoriek inhibovanej cholínesterázy. Pokiaľ došlo k obnoveniu hydrolytickej aktivity inhibovaného enzýmu iba pri reaktivácii v 0,02 mg/ml (Hl-6) obsahuje roztok GD alebo GF. Reakcia sa opakuje po inhibícii vzorky imobilizovanej acetylcholínesterázy 30-minútovou inkubáciou. Pri obnovení hydrolytickej aktivity enzýmu reaktiváciou obsahuje roztok GF.
Príklad 8
Použitie biosenzora na rozlíšenie látky VX a GB
Vzorky detekčnej tkaniny s imobilizovanou acetylcholínesterázou inhibovanou tak, že tkanina ostane po odstránení filtračného papiera so substrátom a chromogénnym činidlom priloženým na tkaninu na 1 min. biela, 2- až 5-minútovou inkubáciou v roztoku obsahujúcom organofosforový inhibítor sa reaktivujú 5 minút v 0,02 mg/ml HI-6 a
0,05 mg/ml TMB-4. Po reaktivácii sa vyhodnotí hydrolytická aktivita enzýmu oboch vzoriek inhibovanej cholínesterázy. Pokiaľ došlo k obnoveniu hydrolytickej aktivity inhibovaného enzýmu v oboch reaktivátoroch, obsahuje roztok látku VX alebo GB. Roztok sa lOx zriedi a rozdelí na dve časti. Do jednej časti zriedeného roztoku sa pridá chlorid sodný v nadbytku a v oboch roztokoch sa paralelne inkubujú vzorky imobilizovanej acetylcholínesterázy 2, 5,10, 15 minút do dosiahnutia rozdielnej hydrolytickej aktivity vzoriek. Pri zvýšení hydrolytickej aktivity vzorky inkubovanej v roztoku s chloridom sodným v porovnaní s aktivitou vzorky inkubovanej v roztoku bez chloridu sodného obsahuje analyzovaný roztok látku VX.
Príklad 9
Použitie biosenzora na rozlíšenie GA a látky GP
Vzorky detekčnej tkaniny s imobilizovanou acetylcholínesterázou inhibovanou tak, že tkanina ostane po odstránení filtračného papiera so substrátom a chromogénnym činidlom priloženým na tkaninu na 1 min. biela, 2- až 5-minútovou inkubáciou v roztoku obsahujúcom organofosforový inhibítor sa reaktivujú 5 minút v 0,02 mg/ml HI-6 a 0,05 mg/ml TMB-4. Po reaktivácii sa vyhodnotí hydrolytická aktivita enzýmu oboch vzoriek inhibovanej cholínesterázy. Pokiaľ nedošlo k obnoveniu hydrolytickej aktivity inhibovaného enzýmu v oboch reaktivátoroch, obsahuje roztok látku GA alebo látku GP. Roztok sa lOx zriedi a rozdelí na dve časti. Do jednej časti zriedeného roztoku sa pridá chlorid sodný v nadbytku a v oboch roztokoch sa paralelne inkubujú vzorky imobilizovanej acetylcholínesterázy 2, 5, 10, 15 minút do dosiahnutia rozdielnej hydrolytickej aktivity vzoriek. Pri zvýšení hydrolytickej aktivity vzorky inkubovanej v roztoku s chloridom sodným v porovnaní s aktivitou vzorky inkubovanej v roztoku bez chloridu sodného obsahuje analyzovaný roztok látku GP.
Príklad 10
Použitie biosenzora pri rozlíšení organofosforových a karbamátových insekticídov
Vzorky detekčnej tkaniny s imobilizovanou acetylcholínesterázou inhibované tak, že tkanina ostane po odstránení filtračného papiera so substrátom a chromogénnym činidlom priloženým na tkaninu na 1 min. biela, 2- až 5-minútovou inkubáciou v roztoku obsahujúcom organofosforový inhibítor sa reaktivujú 5 minút v 0,02 mg/ml HI-6 a 0,05 mg/ml TMB-4. Po reaktivácii sa vyhodnotí hydrolytická aktivita enzýmu oboch vzoriek inhibovanej cholínesterázy. Pokiaľ nedošlo k obnoveniu hydrolytickej aktivity inhibovaného enzýmu pri 5-minútovej reaktivácii v oboch reaktivátoroch, vzorka sa vloží na 30 až 120 minút do destilovanej vody. Pri obnovení hydrolytickej aktivity po 120 minútach reaktivácie vo vode obsahuje analyzovaný roztok 2,3-dihydro-2,2-dimetylbenzofiiran-7-yl-N-metyikarbamát.
Príklad 11
Použitie biosenzora na identifikáciu nervových paralytických látok
Do analyzovaného roztoku, ktorý obsahuje bližšie nešpecifikovaný nervový plyn, v ktorom ostala vzorka detekčnej tkaniny s imobilizovanou acetylcholínesterázou po 2-minútovej expozícii pri detekcii biela, sa znova vložia dve vzorky detekčnej tkaniny a potom sa tieto vzorky na 5 minút ponoria do roztoku reaktivátora, jedna vzorka do 0,05 mg . mľ1 roztoku TMB-4, druhá do 0,02 mg . ml'1 roztoku HI-6. Po vybratí z roztokov reaktivátorov a kontrole aktivity tkaniny môžu nastať tri varianty:
a) obidve tkaniny ostanú biele a potom roztok obsahuje GA alebo GP,
b) obe tkaninu zožltnú, roztok obsahuje látku VX alebo GP,
c) tkanina reaktivovaná v TMB-4 ostane biela, tkanina po reaktivácii v HI-6 zožltne a potom roztok obsahuje GF alebo GD.
Identifikácia jednotlivých látok z variantu a) alebo b) sa uskutoční tým, že sa roztok zriedi 1 : 1 vodou a rozdelí sa. Do jedného dielu sa pridá NaCl tak, aby vznikol nasýtený roztok alebo roztok s nadbytkom nerozpusteného NaCl a porovná sa inhibícia v oboch roztokoch. Pokiaľ je tkanina v roztoku s NaCl inhibovaná menej, žltne, a tkanina z roztoku bez NaCl ostane biela, je v roztoku VX alebo GP. Pri variante c) je možné GF a GD rozlíšiť tak, že v pôvodnom roztoku sa exponuje vzorka detekčnej tkaniny 30 minút. Po skončení expozície sa vloží na 5 minút do roztoku HI-6 a pokiaľ po reaktivácii tkanina pri kontrole aktivity žltne, je v roztoku GF, v prípade, že ostane tkanina inhibovaná i po reaktivácii, je v roztoku GD.
Priemyselná využiteľnosť
Vynález môže byť využitý na kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie organofosforových a karbamátových inhibítorov cholínesteráz. Toto stanovenie sa uskutočňuje v mnohých odvetviach národného hospodárstva, priemyslu a poľnohospodárstva, ale i v zdravotníckych a veterinárnych zariadeniach. Ako metóda detekcie a stanovenia organofosforových a karbamátových jedov môže byť modifikovaná cholínesterázová reakcia podľa vynálezu použitá i vo vojenskej chémii pri uskutočňovaní chemického prieskumu a kontroly, na potreby civilnej obrany a bezpečnosti a pri monitorovaní životného prostredia z hľadiska kontaminácie inhibítormi cholínesteráz. Riešenie je použiteľné na kontaminované vzorky rôznej etiológie a zloženia a umožňuje uskutočňovať rýchlu kontrolu priamo v teréne bez laboratórneho vybavenia.

Claims (4)

1. Biosenzor na detekciu a rozlíšenie inhibítorov cholínesteráz vo forme testovacích pásikov zložených zo zóny s imobilizovanou cholínesterázou, farebného etanolu a zóny nosiča s chromogénnym činidlom, vyznačuj ú c i sa tým, že zónou s imobilizovanou cholínesterázou je bielená celulózová tkanina, výhodne z bavlnených vlákien, na ktoré je imobilizovaná cholínesteráza.
2. Spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou na detekciu a rozlíšenie inhibítorov cholínesteráz podľa nároku 1, vyznaéujúci sa tým, že sa na bielenú bavlnenú tkaninu imobilizuje cholínesteráza ponorením tkaniny do vodného roztoku cholínesterázy, výhodne mozgovej acetylcholínesterázy alebo plazmovej butyrylcholínesterázy.
3. Spôsob detekcie inhibítorov cholínesteráz biosenzorom podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa na mokrú tkaninu s imobilizovanou cholínesterázou exponovanou v kontrolovanom prostredí nanesie chromogénne činidlo pritlačením zóny nosiča s chromogénnym činidlom, výhodne acetylcholínom alebo butyryltiocholínom a kyselinou 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoovou) a vizuálne sa podľa farebného etanolu hodnotí aktivita cholínesterázy imobilizovanej na tkanine podľa zmeny sfarbenia tkaniny.
SK 281395 Β6
4. Spôsob rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom podľa nároku la 2, vyznačujúci sa tým, že sa typ inhibítora zistí zo zmeny aktivity inhibovanej imobilizovanej cholínesterázy po reaktivácii inhibovanej cholínesterázy činidlami, najmä kvartémymi aldoxímami alebo vodou, alebo iónmi alkalických kovov a zemín a následne sa vyhodnotí, ktorým z uvedených činidiel sa aktivita cholínesterázy obnoví.
SK2735-92A 1992-09-01 1992-09-01 Biosenzor, spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou, spôsob detekcie a rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom SK281395B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS19922735A CZ288576B6 (cs) 1992-09-01 1992-09-01 Biosenzor pro detekci a rozlišení inhibitorů cholinesteráz, způsob přípravy zóny biosenzoru s imobilizovanou cholinesterázou, způsob detekce inhibitorů cholinesteráz a způsob rozlišení inhibitorů cholinesteráz

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK273592A3 SK273592A3 (en) 1995-05-10
SK281395B6 true SK281395B6 (sk) 2001-03-12

Family

ID=5365284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK2735-92A SK281395B6 (sk) 1992-09-01 1992-09-01 Biosenzor, spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou, spôsob detekcie a rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0672169A1 (sk)
AU (1) AU4941393A (sk)
CA (1) CA2143618A1 (sk)
CZ (1) CZ288576B6 (sk)
SK (1) SK281395B6 (sk)
WO (1) WO1994005808A1 (sk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4660800A (en) * 1999-04-26 2000-11-10 U.S. Army Medical Research And Materiel Command Immobilized enzymes as biosensors for chemical toxins
SG143093A1 (en) * 2006-11-27 2008-06-27 Dso Nat Lab Rapid detection of cholinesterase inhibitors
PL3196315T3 (pl) 2016-01-19 2020-07-13 Oritest Spol. S R.O. Kuliste pelety, proces produkcyjny takich peletów, zastosowanie oraz rurka detekcyjna zawierająca takie pelety
CN109187386A (zh) * 2018-08-23 2019-01-11 成都众粒生物科技有限公司 用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药含量的凝胶及其应用
CN112816592B (zh) * 2020-12-31 2023-03-24 兰州大学 固定化乙酰胆碱酯酶的制备及其在筛选和鉴定酶抑制剂中的应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3624095A (en) * 1962-09-11 1971-11-30 Us Army 4-cyanoformyl-1-alkyl pyridinium halide oxime and its derivatives
NL7013950A (sk) * 1970-09-21 1972-03-23
US4324858A (en) * 1980-06-16 1982-04-13 Midwest Research Institute Stabilization of cholinesterase, detector kit using stabilized cholinesterase, and methods of making and using the same
SE454597B (sv) * 1984-04-02 1988-05-16 Erik Dahlgren Enzympapper for indikering av kolinesterashemmare der enzymet immobiliserats av en anjonbytare, forfarande for dess framstellning samt anvendning av pappret med ett substrat
DD301358A7 (de) * 1985-12-19 1992-12-10 Bundesamt Fuer Sicherheit In D Semiquantitatives schnellnachweismittel fuer cholinesteraseaktivitaet im serum und vollblut
FR2677373B1 (fr) * 1991-06-07 1995-10-06 Anadiag Detection de pesticides de la famille des organophosphores et/ou des carbamates, en milieu aqueux.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0672169A1 (en) 1995-09-20
CA2143618A1 (en) 1994-03-17
CZ288576B6 (cs) 2001-07-11
AU4941393A (en) 1994-03-29
CZ273592A3 (en) 1994-03-16
SK273592A3 (en) 1995-05-10
WO1994005808A1 (en) 1994-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Andreou et al. A portable fiber-optic pesticide biosensor based on immobilized cholinesterase and sol–gel entrapped bromcresol purple for in-field use
DE3855790T2 (de) Nachweis von Ionen in Flüssigkeiten
Moris et al. Chemiluminescence assays of organophosphorus and carbamate pesticides
US5935862A (en) Microspot test methods and field test kit for on-site inspections of chemical agents
Fernando et al. Rapid detection of anticholinesterase insecticides by a reusable light addressable potentiometric biosensor
FI77896C (fi) Komposition foer bestaemning av urinsyra eller kolesterol i ett vaetskeprov.
Pohanka et al. Preparation and performance of a colorimetric biosensor using acetylcholinesterase and indoxylacetate for assay of nerve agents and drugs
SK281395B6 (sk) Biosenzor, spôsob prípravy zóny s imobilizovanou cholínesterázou, spôsob detekcie a rozlíšenia inhibítorov cholínesteráz biosenzorom
US4120754A (en) Detection of alkylating compounds
US2850359A (en) Testing unit and method of testing for glucose
Alfthan et al. Characterization and semiquantitative estimation of organophosphorus compounds based on inhibition of cholinesterases
US5846753A (en) Chemiluminescence-based method for rapid and sensitive in-situ detection of organophosphorus compounds and metal ions
WO2014116727A1 (en) One-step rapid assay for the detection of inhibitors of enzymes
Deshpande et al. Determination of methyl parathion in water and its removal on zirconia using optical enzyme assay
US5939328A (en) Method for the determination of iodide
Pitschmann et al. Cholinesterase inhibitor biosensors
Tsai et al. Optimization of sol-gel based fibre-optic cholinesterase biosensor for the determination of organophosphorus pesticides
US20050054025A1 (en) Stabilized enzymes for detecting and monitoring chemical toxins
Bu et al. An in situ assay of nerve agents enabled by a self-assembled bienzymatic electrochemical biosensor
CZ30670U1 (cs) Osobní detektor nervově paralytických látek a jiných inhibitorů cholinesteráz
JPS60210998A (ja) 無機リン酸塩の酵素学的測定用試験組成物、試験具及び試験方法
CZ285242B6 (cs) Detekční trubička inhibitorů cholinesteras ve vzduchu a vodě
Arufe et al. Oxidation of cholinesterase‐inhibiting pesticides: A simple experiment to illustrate the role of bioactivation in the toxicity of chemicals
SU1701749A1 (ru) Матрица дл обнаружени пестицидов, обладающих антиэстеразным действием
CZ284970B6 (cs) Biosensor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu