JPS61501817A - コリンエステラーゼ抑制剤の表示のための酵素紙、その製造方法および、酵素反応を抑制する物質の表示方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コリンエステラーゼ　の　二の 本発明は１例えは空気または水中でのコリンエステラーゼ抑制剤の表示に使用す るための、他のものに比べて優れた感度と貯蔵安定性および濡れ易さを示す酵素 紙ならびにこの酵素紙を製造する方法に関する。この酵素紙は、神経ガスまたは 除草剤のよりな植物制御手段および植物保護剤物の表示に適する。

神経ガスの表示用の装置に、コリンエステラーゼ酸の酵素で浸漬した紙を使用す ることは既に知られている。神経ガスはこの種の酵素を不活性化し、それは、適 切な基体と接触した酵素によって通常発色する呈色反応によって示される。神経 ガスの存在は、普通酵素によって起こされろ４体の変色が神経ガスのコリンエス テラーゼ抑制作用のために、起こらないという事実によって示される。すなわち 。

米国特許第８０４９４１１号には酵素コリンエステラーゼで予め浸漬した一紙の 使用を述べておシ、これはｍ水分解によって、２．６−シクロロイントア二二ル アセテートまたはインドキシルアセテートのような基本を分解し、その結果１色 に変色する。コリンエステラーゼで前処理しｐＨ６，４〜８．６に緩衝した一紙 を湿めらせて、試験すべき雰囲気にさらし、つぎにｐｕ約６．４〜８．５に緩衝 した水溶液中で基体に接触させる。神経ガスを含む空記をさらすと、酵素はホス ホリル化され、この場合はつぎに基体と接触しても置きへの変色は起こらない。

しかし、酵素で予め浸漬し、あとの使用のために乾燥した公知の酵素紙には１紙 の貯蔵安定性と、使用前に濡らすときのぬれやすさについて問題があることがわ かっている。

スエーデン特許第８１４０４１号によると、ぬらさない酵素紙を使う試みがなさ れている。しかし、コリンエステラーゼは、糊の性質をもち、乾いた浸漬層は、 試料空気によって、徐々にしか影響されない。

この種の酵素紙のその他の問題は、水と接触すると酵素が紙から簡単に溶出して しまい、水中のコリンエステラーゼ抑制剤の指示釦酵素紙を使うのが不可能にな ることである。同じ理由から１着色した基体紙はしばしばまだらに着色し、空気 の表示において、満足に働くためには使用前に酵素紙をぬらさねばならないので 、表示結果の評価が不明確になることがらシ得る。

勿論、臨界的な因子は、低濃度のコリンエステラーゼ抑制剤への酵素の感度であ る。現存の酵素紙は１例えば神経ガスｖｘ　への低検知限界を完全に満足させな い。この限界は、とシわけ、酵素の選択に左右され、この場合、伝統的に使われ るコウシ血清または電気ウナギまたはひれ骨の類の酵素源に比べてデフイス（か れいやひらめ類）からのコリンエステラーゼは特に良い感度特性をもっている。

しかし、デライヌ酵素は、普通完全に満足な安定性をもっておらず、そのため、 従来の酵素紙に使うのは困難である。

上記の問題のいずれかを克服する可能性の方法としては。

には公知であるが、プライスからのコリンエステラーゼについては公知でない。

酵幸の固定化は、普通、酵素活性をかなり失うことを意味し、常に、酵素の安定 化には程遠い結果をもたらすことは当業者に公知である。このことは、例えば第 ５表から明らかである。酵素の感度特性が変らないままということは期待できな い。一部は、酵素のミクロの環境での立体障害が起こるため、また一部は、比活 性を低くする固定化から多量の酵素が普通不活性化されるという事実のためすぐ に感度が低下することが予期される。普通、酵素の固定はまた、最終製品の製造 コストの相当な上昇を意味する。

製品のぬれやすさを、又善するために、他の関係ではしばしば湿潤剤が使われる 。しかし、多くの湿潤剤は、普通酵素の活性に対し、不活性化および／または不 安定化の作用がある。その上、湿潤剤を不適切に選ぶと、酵素の固定を、よシ困 難にすることがある。

本発明は、好ましくはプライスからのコリンエステラーゼである酵素を静電気的 吸着によってイオン交換紙に固定した酵素紙に関する。これは、当業者の期待に 比べて意外なほど種々の点で極めてすぐれた独特の性質をもった製品を提供する 。独特なのは、なかでも、上述の種類の良い性質のすべての組み合わせが、同時 に−りの同一の紙の上で得られることである。

この良い性質の組み、合わせは公知ではなく、この酵素紙は従来知られている該 当製品に比べて、明らかに優れている。

得られる顕著な性質の組み合わせは下記のように要約される： ａ）この製品は、空気の表示と水の表示の両方に問題なしに使用出来る。

ｂ）この酵素紙は基体紙上に、加水分解された基体の平均に着色した表面を与え る。すなわち誤った解釈のできない明確な表示を与える。

Ｃ）感度特性は、相当する既存の製品よ）良い。

ｄ）との紙のぬれやすさは、相応して、壷知の酵素紙よシかなシすぐれている。

ｅ）酵素の安定性は、プライスからの遊離の水溶性コリンエステラーゼに比べて かなシ改善され、大てぃの市販の相当する酵素紙よシも製品の安定性を良くする 。

ｆ）使用した固定法によって酵素活性が極めて少ししか低下せず、これは感度の 点とコストの点で重要でちる。

ｇ）酵素紙の製造に使用される方法は極めて簡単で、製造コストは充分低く保つ ことが出来る。

本発明の＃徴は、後述の請求の範囲から明白である。

酵素紙の製造に、イオン交換能好ましくはアニオン交換能と良好な湿潤強度をも ったクロアトグラフィー紙の種類の紙を、酵素の他に、界面活性剤および好まし くは炭水化物型の安定化成分を含む酵素溶液と組み合わせて使うことによって、 酵素紙の酵素活性は変らないかまたは極めてわずかしか減少しない。この場合、 固定化された酵素の意外に高い結合収率が得られ、かつ固定化された酵素の意外 に高い比活性が得られるので、酵素は同時に固定化される。

上述のように固定化方法は普通、酵素活性をかなシ低下させるので、このことは 極めて意外である（第５表参照）。

固定化酵素の感度特性は変化せず、同時に酵素紙のぬれやすさは大きく改善され る。湿潤剤は大なり小なり酵素を不活性化するのが普通でちるので、酵素活性、 酵素の安定性。

結合収率または感度の低下を伴なわずにぬれやすさが向上するのは極めて意外な ことである。固定化方法の選択と安定化成分の添加によって、最終製品の意外に 良好な酵素の安定性が達成される。大ていの他のそのような組合わせは。

どんな改善も与えず、しばしば不安定化をもたらす。

本発明の特別に適した実施態様では、ワットマンＤＥ８１の型のＤＥＡＥ−セル ロース紙のクロマトグラフィー紙が使われ、湿潤剤としては、非ろオン活性剤例 えばツイーン８０が使われる。酵素は、好ましくはプライスからのコリンエステ ラーゼでちシ、安定化成分としては、好ましくは、ショ糖および低分子量のデキ ストラン、例えばデキストランＴＩＯ（ファーマシア、ファインケミカルス）が 使われる。

酵素溶液は、好ましくは燐酸壇緩衝液で緩衝してもよい。

記述された種類の酵素呈色反応について最良の性質をもっていることがわかって いる基体は、２，６−ジクロロインドフェニル、アセテート（ＤＣＩＰＡ）　で ある。この基体は、吸収性の紙１例えば、クロマトグラフィー紙または濾紙の上 に適切に歿される。

本発明は、多数の実施例によって、例示ではあるが限定しない目的において以下 にさらに詳細に記述される。

酵素紙の製造 実施例１：　ＤＥＡＥ−セルロース紙に固定した酵素ワットマンＤＥ８１タイプ のクロマトグラフィー紙ヲ。

約８０分間、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ溶液で平衡化し、蒸溜水で注意深く洗い、室温で 乾燥する。この紙から切シ取るが、打ち抜シヨ糖（１６０ｍｙ／ｍｘ）　デキス トランＴ１ｏ（１６０ｍｇ／ｍ１）および湿潤剤ツイーン８ｏ（４μｍ／７７Ｆ ｌ）　から成る０、１Ｍシん酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）　中の酵素溶液５μｌを 塗布する。こうして製造された酵素紙を室温で風乾し、ついで真空デシケータ− 中で乾燥する。

実施例２　：　酵素紙の貯蔵安定性 貯蔵中、酵素紙は密閉した包装材料中に適切に封入される。この試験では溶着し たポリプロピレン袋を用いたが。

受は容れ得る貯蔵期間は下表から明らかである。

第１表 貯蔵温度　貯蔵期間 ２０−２５℃　〉３年 ４０℃　〉１．５年 ６２−６８°ｃ　４ケ月 て（適用可能な部分で）製造し、結果は第２表から明らかである。たソし Ｅ＝ニブライス素（０−２”Ｐ　）　；　１−４６　ｕ　／　”Ｓ’　；　１− ６２　ｕ／キ蛋白質 ８２７３Ｍ（０，８■） Ｄ＝ＦキヌトランＴ１０（０，８”？）Ｔ＝フイーン８０（０−０２／’１） 第２表から、濾紙タイプのワットマン１１３ｕ、イオン交換能をもったクロマト グラフィー紙タイプの紙であるワットマン８１よシも貯蔵安定性が劣ることが明 らかである。

ワットマン１１３タイプの紙では、酵素の固定化は起こらない。第２表の結果は 、酵素の固定化が貯蔵安定性を改善することを示している。さらに安定化成分で あるショ糖とデキストランのプラヌ効来がわかる。

基体紙の製造 ２．６−ジクロロインドフェノールを大過剰の無水酢酸でアセチル化シて２．６ −ジクロルインドフエニルアセテー）　（ＤＣＩＰＡ）　とし、これを水で沈澱 させ、ｎ−ヘキサン：ジエチルエーテルで再結晶する。

ワットマン１１８紙を、ＤＣＩＰＡの飽和ベンジン溶液（５０μＩ　ＤＣＩＰＡ 量ｌ”紙）に浸し、ついでこの基体紙を室温で風乾する。この基体紙の適切な大 きさの紙片を打ち抜く。

ＤＣＩＰＡの担体としては１次の種類の紙も適当であることがわかった：クロマ トグラフィー紙ワットマン黒１および濾紙ムンクテルＯＯＭ、ＯＯＭおよびＩＦ 。

ベンジンの他、ＤＣＩＰＡは、アセトン、Ｖ！ｊ塩化炭素、クロロホルム、ジク ロルメタンまたは１．２−ジクロルエタンのような他の溶剤に溶かすことが出来 １紙全体が均一にぬれるように多量の溶液を紙に滴加する。表面濃度すなわち１ ２尚たシのＤＣＩＰＡ量は、溶液中のＤＣＩＰＡの濃度を変えることによって変 化できる。酵素呈色反応中に明確な変化を与えるためには、充分多量の基体が存 在する限シ、表面濃度は臨界的ではないことがわかった。貯蔵中に見込まれるべ き基体の分解および多分昇華の形での損失を補償するためには、比較的高い表面 濃度たとえば８０−１００μｆ　／　Ｏｆ！　”を用いるのが好ましい。

上記のように製造された基体紙の長期間の貯蔵山のＤＣＩＰＡの安定性を改善す るには、乾燥剤例えば、シリカゲ／Ｉ／ｌたはモンキュラーシーグ（４Ａ）と− しよに貯蔵すべきである。

表示 実施例１に述べたようにして製造した酵素紙を、約４滴の蒸溜水でぬらし、つい で、コリンエステラーゼ抑制剤ヲ含むか、それから成ると思われるガスにこの紙 を２分間さらす。基体紙をこの紙２分間圧しつけて、この紙を発色させ、その結 果を評価する。着色がないか、ピンク色かまたは極めてうすい灰色の場合は、試 験ガス中にコリンエステラーゼ抑制剤が存在することを示し、青色かまたはうす い青色の着色はコリンエステラーゼ抑制剤が存在しないことを示す、サリンすな わち、イソプロビルメチルホヌホノフルオリデート、および略記し、神経ガスと 呼ばれる他の有機シん化合物の表示における酵素紙の感度は下表から明らかであ る。

第３表 コリンエステラーゼ抑制剤 、１ｏａａμ！で１工 実施例５　：　液体中の吋ンエステラーゼ抑制剤の表示実施例１によって製造し た酵素紙を、始めにぬらすことなく、実際の抑制剤を含む水溶液中に攪拌下に２ 分間浸漬する。紙の発色は、実施例４に述べたと同様に実施した。

酵素紙の感度は第４表から明らかである。

第４表 ７１　０．０５ 比較の目的で、担体に酵素を固定する他の方法を実施し発明による方法（約６０ ％）で意外に良好な結果が得られることがわかった。その結果を下表に示す。

第５表 下記に吸着 ７）ｚ＜−’）イ）ＸＡＤ７　２９　．２　０．２　０．７ＸＡＤ２　２９．２ 　０　０ ＩＲ１２０−ＡＩ”　２９．２　０−Ｉ　Ｑ−：３下記に吸着 ヘキシルセファロース６Ｂ　２９．２　ｏ、ｇ　ａ、ｔ＋ ”ｅ’Ｍｙｙａ−７６Ｂ　２９　、２　ｏ　、　ｓ　２　、１基体 ヘキシルセルロース　２９・２　０．５　１７特殊の方法で下記に吸着 ワットＹ：／　５Ｇ８１　５．８４　０．４　６．８ワツトマン４ＣＨＲ５，８ ４０，２８・４グルタ〒ルアルデヒドで下？ツー喬 ワットマン５Ｇ８１　５８．４　１．６　２・７７ｙｓｑｙＧＦ／Ｂ　５８．４ 　０．８　”４特殊の方法でゲルタールアルデヒドで下記に架橋ワットマン５０ ８１　５．８４　０．１３　２・２ワツトマン４ｃＨＲ５，８４０，０６”２− アミノ−４，６−ジクロルトリアジンにょシ下記に共有結合ワラ””　４ｃＨＲ ２９，２０，１０，３ワットマン４ＣＨＲ４＃２ｇ　、２　０．３　１．０第５ 表（つソき） ＣＮＢｒによシ下記に共有結合 ワットマン　４ＣＨＲ２９，２０，３１，０グρタルアルデヒドによシ下記に共 有固定化７７１”？：／ＧＦ／Ｃ２９，２０，８１，０ワツトマンＧＦ／Ｃ 十基体　２９．２　０．８　１．０ カルボジイミドによシ下記に共有結合 ７７）マンＧＦ／Ｃ２Ｂ、０　０．６２　２．７ワツトマンＧＦ／Ｃ 十基体　、　２１０　Ｑ、４０　１．７７”／）マンｃＭ８２　２８．０　０． ４７　２．０下記に吸着 実施例７ 実施例１によフ、たｙし湿潤剤の添加なしに酵素紙を製造して表示能力すなわち 酵素紙感度を評価した。第６表から、湿潤剤（ツイーン８０）あシまたはなしの 場合の、紙上のガスおよび液中のコリンエステラーゼ抑制剤の表示における表示 限界値がわかる。

第６表 コリンエステラーゼ抑制剤　表示限界値サリン；湿潤剤あシ　０．θ４　０．６ ｖｘ　；湿潤剤４ｊ５　０．０４　０．０５サリン；湿潤剤なし　０．０４　０ ．６ＶＸ　；湿潤剤なし　０．０４　０．０５この表から、湿潤剤の添加が酵素 紙の感度を低下させないことが明らかである。

安定性も、湿潤剤の添加で悪くならないととが試験でわかった。（第７表参照） 。比活性は、０月の活性に対する酵素活性を愛で表わしたものである。

第７表 ツイーン８０なし　４０℃　５ケ月　６７ツイーン８０あシ　６２〜６８℃　０ ．５ケ月　６０．７１ツイーン８０なし　６２〜６８°ＣＯ１５ケ月　６５ツイ ーン８０あシ　６２〜６８℃　５．５ケ月　２７．２０ツイーン８０なし　６２ 〜６８℃　５，５ケ月　２９第８表から、湿潤剤の添加が、結合収率の点から、 添加なしのときに起こシ得る酵素活性の低下を起こさなくすることが明らかであ る。

第８表 ツイーンあシ　５７、　４８．　４５ ツイーンなし　４１．　４４ 湿潤剤ツイーン８０の添加は、活性または感度の点から見て、酵素紙にマイナス の影響を及ぼさず、また同時に。

酵素紙は、殆んど完全なぬれやすさを示し、数秒以内に浸み込ませ得ることが試 験報告でわかる。

手続補正書動式） ％式％ １、事件の表示　ＰＣＴ／５Ｅ８５１００１５７３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日付　昭和６１年６月５日６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容 別紙の通り 国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．イオン交換能をもつクロマトグラフィー紙のタイプの酵素担体、担体上に固 定化されたコリンエステラーゼ酵素、少くとも一つのコリンエステラーゼ酵素安 定化物質および湿潤剤としての界面活性剤から成ることを特徴とする、ガスまた は液体状のコリンエステラーゼ抑制剤の表示に使用される酵素紙。 ２コリンエスデラーゼ酵素がプライスから単離されたものであることを特徴とす る請求の範囲第１項による酵素紙。 ３酵素担体が、アニオン交換能をもつたクロマトグラフィー紙から成ることを特 徴とする請求の範囲第１項または第２項による酵素紙。 ４酵素担体が、好ましくは良好な機械的湿潤強度をもつたＤＥＡＥ−セルロース 紙から成ることを特徴とする請求の範囲第３項による酵素紙。 ５湿潤剤が非イオン活性剤、好ましくはツイーン８０であることを特徴とする請 求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項による酵素紙。 ６安定化物質または物質群が、炭水化物タイプのもの、好ましくはシヨ糖および デキストランであることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか １項による酵素紙。 ７緩行液好ましくはりん酸塩緩衝液を含むことを特徴とする請求の範囲第１項な いし第６項のいずれか１項に上る酵素紙。 ８酵素コリンエステラーゼ，界面活性剤および少くとも一つの安定剤を含む溶液 を、イオン交換能をもつたクロマトグラフィー紙に施こし、ついでこの紙を乾燥 することを特徴とする請求の範囲第１項による酵素紙を製造する方法。 ９ＤＥＡＥ−セルロースのクロマトグラフィー紙を塩化ナトリウム溶液で平衡化 し、洗浄し、乾燥し、プライスからの酵素コリンエステラーゼ、炭水化物型の安 定剤、好ましくはシヨ糖およびデキストラン、および非イオン湿潤剤、好ましく は、ツイーン８０から成る緩衝剤入り溶液に浸漬し、ついでこの紙を乾燥するこ とを特徴とする請求の範囲第８項による方法。 １０酵素反応を抑制する物質の、ガスまたは液体中、好ましくは空気または水中 での表示のために、酵素により影響され、その結果変色する基体、例えば２，６ −ジクロルインドフエニルアセテートまたはインドキシルアセテートと共に使用 することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかによる酵素紙の 使用。 １１基体が紙、好ましくはクロマトグラフィー紙または濾紙のタイプの多孔性担 体上に吸着されることを特徴とする請求の範囲第１０項による使用。 １２空気または水中の神経ガスまたは他のコリンエステラーゼ抑制剤の存在を酵 素紙およびそれと相互作用する基体によつて表示することを特徴とする請求の範 囲第１項または第１１項による使用。