JPH09500961A

JPH09500961A - 同時免疫分析のための方法と装置

Info

Publication number: JPH09500961A
Application number: JP7501257A
Authority: JP
Inventors: カルロガッティ，ガイド; アルシオーニ，ローラ
Original assignee: ベーリンガーマンハイムイタリアエス．ピー．エイ．
Priority date: 1993-06-07
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1997-01-28
Also published as: DK0702794T3; US5731162A; ATE158656T1; IT1270951B; CA2164600A1; WO1994029729A1; ITMI931197A0; ZA943950B; DE69405866D1; ITMI931197A1; EP0702794B1; GR3025007T3; EP0702794A1; NZ267622A; ES2107835T3; DE69405866T2; AU6997494A; AU686177B2

Abstract

(57)【要約】本発明は。トラコーマクラミジア（ＣＴ）、淋菌（ＮＧ）およびマイコプラズマ（Ｍ）をただ１つの標本から同時に検出するための方法および分析装置に関する。

Description

【発明の詳細な説明】同時免疫分析のための方法と装置発明の背景本発明は、１つの標本からトラコーマクラミジア（ＣＴ）、淋菌（ＮＧ）およびマイコプラズマ（Ｍ）を同時に検出する方法および装置に関する。性行為によって伝播される疾患（ＳＴＤ）（例えば淋病、尿道炎および同様な疾患）の原因となる病原体の診断は、今日、感染部位から採取された標本の他、各病原体の存在を証明するそれぞれ別個の分析が必要とされる。この分析のための材料採取は、膣または尿道部を拭うことによって実施される。反復される場合には、このような実施方法は、綿棒が接触する粘膜の炎症や刺激というような不都合をもたらし、患者にとって不快である。上記の病原体は同じ器官に感染し、さらに付随性を有する（同時感染）ので、１つの子宮頸管内膜標本または尿道標本でＣＴ、ＮＧ、Ｍを同時に検出することを可能にする方法および分析装置が利用できるようになれば、好ましい改善であることは明瞭である。これによって、また同じ患者から数回拭い液を採取するという不快は避けられる。従来技術欧州特許出願第264036号(アボット、1988/4/20)は、ＣＴおよびＮＧを別々に検出する装置および免疫学的方法を開示する。欧州特許出願第444303号Ａ２（ベクトンディッキンソン、1991/9/4）は、抽出剤としてプロテイナーゼＫを用いる抽出工程を伴うフロースルーシステムによってトラコーマクラミジアを検出する免疫学的方法を開示する。国際特許出願87/6620号(1987/11/5)は、性交感染疾患の原因となる異なる病原体の同時検出キットを開示するが、このキットは、検出されるべき各病原体について選択性を有する少なくとも１種のモノクローナル抗体を、一定の間隔をおいて配置した反応帯に吸着させた装置を含む。先行技術文献にしたがえば、伝染性病原体を含む生体標本は、種々のモノクローナル抗体が固定された（そのために全体的な診断感度が減少した）装置と直接に接触させられる。実際、細胞表面抗原のみが検出可能で、これらの抗原は、種々の条状に応答して容易に実質的な変異を受けやすく、その結果、分析に用いられる抗体との結合親和性に変化を生じることが知られている。さらにまた、一般に、分析感度を高めるために微生物から抗原を抽出するのが望ましいこととされている。（例えば、米国特許第5089389号を参照のこと）。このような理由並びに、性交感染疾患の原因となる微生物の抗原の化学的および構造的特性における顕著な相違のために、従来の方法では、ただ１回のサンプリング実施で多数の抗原について鋭敏で信頼に足る診断を実施することができない。発明の要旨驚くべきことに、生体標本（例えば、性器部分をこするかまたは拭って得られる）をプロテアーゼＫおよびリパーゼを含む適切な反応媒体中で保温工程に付し、続いて固相免疫分析に付すことによって、当該サンプルで同時に、遺伝的および免疫学的に異なる微生物（例えば、トラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマ）に由来する抗原を検出することができることが分かった。プロテアーゼＫおよびリパーゼを含む抽出媒体は、ＣＴ−ＮＧ−Ｍのような異なる微生物の抗原をそれぞれ対応する膜から、それらの構造を変化させること無く効果的に分離させる。したがって、それぞれ対応する抗体によるこれら化学的に異なる抗原の認識と抗体による結合を可能にさせる。抽出液のｐＨは7.5から9 .0の範囲で適切に緩衝される。発明の詳細な説明本発明は、したがって、トラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマの抗原を、プロテイナーゼＫ、リパーゼおよび緩衝剤を含む生体標本から抽出するための抽出試薬を提供する。さらに、本発明は、以下の工程を含むトラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを同時に検出する方法を提供する：ａ）プロテイナーゼＫおよびリパーゼを含む反応液中で生体標本をインキュベートする；ｂ）場合によって特定のろ過工程の後で、上記ａ）の反応混合物を３種の抗体共役物（その各々は、検査を実施している３種の病原体の１種に特異的な抗原の１つに対して特異的である）を含む溶液とともにインキュベートし；ｃ）検査を実施している抗原について特異的な３種の抗体の各々が固定されている固相支持体と上記ｂ）のサンプルを接触させる。工程ａ）では、典型的には、Ca⁺⁺イオンおよび約7.5から約９の範囲のpH値を維持するための緩衝剤（例えばトリス、pH8）を含む0.9％NaCl食塩水に酵素が懸濁される。酵素の量と濃度は特に重要というわけではないが、0.5から10mcgの酵素が一般に十分であろう。インキュベーションは、20から50℃、好ましくは室温で、約５から30分、好ましくは約10分実施されるであろう。工程ｂ）では、酵素、クロモフォー、着色粒子または重金属と共役させたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が、試薬として用いられる。金粒子と共役させたモノクローナル抗体は、展開工程を必要としないので好ましい。陽性例では、免疫複合体（Ａｂ結合Ａｇ）の存在は、特異的な固定抗体に応答する赤色で示される（図３参照）。コロイド性金粒子との共役は、今日では慣用的な技術であり、市販されている多くの免疫アッセーがそれを利用している。ＣＴ、ＮＧ、Ｍの特異抗原に対する抗体は、交叉反応による干渉を避けるように選択するのは当然である。工程ｃ）の抗体は、同じ抗原またはエピトープに対するものでもよい。本発明にしたがえば、二義的な他の病原体((化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸菌(Escherichia coli ))および尿生殖管で通常集落を形成する細菌株に対して交叉反応性を持たないことを酵素免疫アッセーまたは蛍光免疫アッセーで検査してから、市販の抗ＮＧ、ＣＴ、Ｍ抗体を使用してもよい。抗体によって認識されるエピトープはウェスタンブロットで同定された。本発明の方法は、工程ｂ）で得られる液体を吸い取る芯部材、および、主要捕捉抗ＮＧ、ＣＴ、Ｍ抗体を境界が明瞭な異なる領域に予め固定した、芯部分を覆う反応膜を含む装置によって都合よく実施できる。本発明にしたがえば、この方法は、免疫濾過システムまたは免疫クロマトグラフィーシステムのいずれかを用いることができる。本発明を以下の図面とともにこれから詳述する：図１は、本装置の断面図である。図２は、図１の装置を上から見た図である。図３は、分析中の１種または２種以上の病原体が陽性の場合の、図１の装置の判定ゾーンを示す。図４は、免疫クロマトグラフィーアッセーの検査細片の断面図である。図５は、図４の検査細片を上から見た図である。図６は、分析中の１種または２種以上の病原体が陽性の場合の、図４の検査細片の判定バンドを示す。図１で、番号１は、半硬質可撓性構造物（一般にはプラスチック材）を示し、これは内部に厚い濾過層（２）を有し、その上面にはニトロセルロース膜（３）または他の同様な素材が配置されている。このフレームの上方部分（４）は、漏斗（６）の形状をした被覆壁を有し、円形の中心開口部（５）には反応膜を露出し判定窓の境界を画する。図２では、番号７、８、９は、抗ＣＴ、ＮＧ、Ｍ抗体が固定されている領域を示す。使用が容易なように、病原体を明示するために、イニシャルを装置の上の対応する領域の隣に直接書き込むことができる。番号１０は内蔵コントロールを示し、その中に抗Ｆｃ抗体が固定されている。これは、この方法の工程ｂ）で用いられ全トレーサーのＦｃフラグメントに結合することができる。この領域は、検査が正しく実施されていれば常に着色反応を示すであろう（金粒子と共役させた抗体を用いる場合は赤色）。図４では、番号１はプラスチックの粘着性支持体を示すが、その上には、それぞれの先端で重なり合う３種の異なる固相が糊付けされる。番号２は金共役物を示し、番号３−４−５は固定された３種の捕捉抗ＣＴ−ＮＧ−Ｍ抗体を示す。図５では、番号６は、膜の下方（７）に可逆的に吸着させた３種の共役物の混合物で構成されている乾燥試薬を示す。中央の判定窓（８）は反応性ニトロセルロース膜で作成されており、バンド(10-11-12)として吸着されている。膜の上塗りと同様、各々の抗体を採種する化学的条件は、実施例１の（１）で記述したものと同じである。膜の上部（９）は通常の濾紙であり、極めてつよい吸収能力を有し、流れを速めさせる。同じ分析装置で２種の変型が可能である：垂直細片型および水平細片型である。第一の例では、サンプル中（実施例１の（２）で記載するように予め抽出が実施されている）に細片を入れると、垂直な流れが毛細管作用によって発生する。第二の例では、サンプルを、細片の特定のゾーン上におとす。抗原の１つがサンプル中に存在するならば、その抗原はまず対応する共役物と結合し、続いてこの免疫複合体は移動しながら関連するバンド上で捕捉されるであろう。図６は、１つまたは２つ以上の病原体について陽性の場合に、金標識抗体を使用したとき、１つまたは２つ以上の赤色ライン(13-14-15)が判定窓に出現するのを示している。これは、Ａｂ−Ａｇ−Ａｂ＊のサンドイッチが形成され、したがって、感染または同時感染状態にあることを示している。図６ａ−６ｂ−６ｃは、ＣＴ−ＮＧ−Ｍについてそれぞれ陽性を示し、一方、図６ｄ−６ｅは２例の同時感染を示しているが、他の多くの複合感染の組み合わせも、ＣＴ−ＮＧおよびＣＴ−Ｍについてそれぞれ見出されるであろう。陰性結果の場合には、ラインは完全に無色であろう。明らかに、上記の態様は、当業者が具体化できる種々の変型の単なる１つの例示である。本発明の装置は、好ましくは、検査をより容易に実施する目的をもつ診断キットの原理の１つを構成するであろう。ＣＴ、ＮＧ、Ｍの同時検出用診断キットは、上記のような装置とともに、３種の共役抗体の混合物、ぬぐい液から抗原を抽出する１種または２種以上の酵素試薬、さらに必要な場合には、緩衝溶液と他の試薬、または検査の実施を容易にする適切な装置を含むであろう。キット中の試薬は、液体かまたはいわゆる“乾燥薬品”形（すなわち適切な単体に吸収され、または固定されている）のいずれかである。以下の実施例はさらに本発明を詳述する。実施例（免疫濾過系）（１）分析装置の調製 −抗ＣＴ、ＮＧ、Ｍモノクローナル抗体および抗Ｆｃモノクローナル抗体（コントロール）溶液の負荷。ニトロセルロース膜反応ゾーンに一致するように、適切な分注器を用いて表題の捕捉モノクローナル抗体を、境界が明瞭な円形スポット状に負荷する。蛋白Ａとの親和性によって精製した、リン酸緩衝液(ｐＨ7.2) 中のこれらの抗体は、正常な微生物叢に属する微生物株と同様、他の二義的な病原体の不活化懸濁液に対しても交叉反応性をもたないことをコーティング前に酵素免疫アッセーによって調べた。 0.03Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ4-5)中で濃度が0.8-1.2mgAb/mlの抗体約1.5-2mcl を、各抗体溶液として滴下する。分注器として、毛細管または目盛り付きピペットを用いることができる。抗体溶液が放射状に拡散してから、この膜を孵卵器または熱風で乾燥させる。 −上塗り続いて、露出固相の全表面の上塗りを、ＢＳＡ１％、蔗糖５％、0.3％のトゥイーン20、0.05％のアジ化ナトリウムを含む0.02Mトリス(pH8.2)溶液を添加して実施し、続いて前述のように乾燥させる。この上塗りは非特異的な交叉反応を回避させる。（２）検査の実施 −まず、生殖部（膣または尿道）から採取した綿棒を、生理的食塩水(0.9％ NaCl)、0.005MのCaCl₂、CaCl₂(0.005M)を含むトリス(0.05M、pH 8)で予め希釈したプロテイナーゼ K(1mcg/検査)およびリパーゼ（10U/検査）を含む抽出試薬で室温で10分間適切な試験管中でインキュベートする。この酵素は細菌の膜を破壊し、特定の化学的に異なる抗原を遊離させて抗体と反応させる。続いて、この懸濁液にNaCl溶液を最終濃度が1.5％になるように加えて中和する。これはＡｂ−Ａｇ反応に最適である。このようにして綿棒を試験管の壁に押しつけて絞る；試験管の壁が可撓性のプラスチックであるので、この操作は、綿棒の端の綿に染み込んだ液体を遊離させやすくする。綿棒を捨て、サンプルは検査工程に向けて準備が完了する。検査で干渉する可能性がある細胞性凝塊を留めておくために、濾紙（多孔度１ミクロン）がセットされているドロッパーを、抽出サンプルを含む試験管の上端に設置する。 −濾過した懸濁液を、金粒子と共役させた３種の抗ＣＴ、ＮＧ、Ｍ抗体の混合溶液と５分間室温でインキュベートする。この３種のトレーサーは、ＢＳＡ１％、蔗糖５％、0.3％のトゥイーン20、アジ化ナトリウム0.05％を含むトリス(0.02 M、pH8.2)で最終容積0.1-0.2mlに希釈される。これらは全て、520ナノメートルの波長で光学密度を読んで測定した場合、同じ濃度を有する。５分後、この溶液を直接膜に滴下し、膜を通過する垂直な流れを調べる。抗原の存在下（３種の検出可能な病原体のうち１種について陽性）では、予備工程で特異的なトレーサーに結合した抗原は、特異的な主要捕捉抗体が固定されたスポットに一致してブロックされ、赤色シグナルを生じる。抗原が存在しない場合は、免疫複合体は形成されず、共役物は膜を通過し、スポットは完全に無色のままである。抗Ｆｃ抗体は３種の金共役物のＦｃフラグメントと結合することができるので、内蔵コントロールは常に赤色を生じ、検査の操作が正確であることを確認できる。（３）結果の判定１つまたは２つ以上のスポットに桃色−赤色が生じた場合は、対応する病原体について陽性を示し、したがって、感染または複合感染を示唆する（図３−ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ参照）。色の濃度はバクテリアの量に比例する。陰性結果は無色の白色スポットとして見ることができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月５日【補正内容】請求の範囲１．生体標本からトラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマの抗原を抽出するための、プロテイナーゼＫ、リパーゼおよび緩衝剤を含む抽出試薬。２．該生体標本が請求の範囲第１項の試薬によって抽出工程に付され、当該工程の後に固相免疫アッセー工程が続くことを特徴とする、トラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを同時に検出する方法。３．ａ）プロテイナーゼＫおよびリパーゼを含む反応媒体中で該生体標本をインキュベートし；ｂ）場合によって特定の濾過工程の後で、工程ａ）の反応混合物を、３種の抗体共役物であって、その各々が検査を実施している３種の病原体の１種について特異的な抗原の１つに対して特異的である抗体共役物を含む溶液とインキュベートし；ｃ）工程ｂ）のサンプルを、検査を実施している抗原に対して特異的な３種の抗体の各々が固定されている固相支持体と接触させるという工程を含む、トラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを同時に検出する方法。４．該検出が免疫濾過によって実施される、請求の範囲第３項に記載の方法。５．該検出が免疫クロマトグラフィーによって実施される、請求の範囲第３項に記載の方法。６．該検出が酵素免疫アッセーによって実施される、請求の範囲第３項に記載の方法。７．該抗体共役物が、金粒子または他の重金属で標識されている、先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。８．該抗体共役物がクロモフォーで標識されている、請求の範囲第３項から６項のいずれかに記載の方法。９．該抗体共役物が酵素と共役されている、請求の範囲第３項から６項のいずれかに記載の方法。 10．抗Ｆｃ抗体が固定されている内蔵コントロールを含む、先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 11．抽出工程から生じる液体サンプルを吸い取る構成部分および、該吸い取り構成部材に隣接し、その上に分析されるべき微生物に対して選択性を有する主要捕捉抗体が境界が明らかな限定的部分として固定されている反応膜を含む装置で該検出が実施される、請求の範囲第５項に記載の方法。 12．該装置が、免疫クロマトグラフィー分析用細片の形状を有する、請求の範囲第11項に記載の方法。 13．該細片が、液体サンプルの垂直な流れまたは水平な流れのいずれかを許容する、請求の範囲第12項に記載の方法。 14．請求の範囲第11項−13項の装置、プロテイナーゼＫおよびリパーゼを含む抽出試薬、並びにそれぞれトラコーマクラミジア、淋菌、およびマイコプラズマに対する共役抗体を含む、ただ１つの生物学的標本からトラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを同時に検出する診断キット。 15．該共役抗体が金粒子と共役した抗体である、請求の範囲第14項に記載のキット。 16．該試薬が液体または乾燥薬品形である、請求の範囲第14項または15項に記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．生体標本からトラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマの抗原を抽出するための、プロテイナーゼＫ、リパーゼおよび緩衝剤を含む抽出試薬。２．該生体標本が請求の範囲第１項の試薬によって抽出工程に付されることを特徴とする、トラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを同時に検出する方法。３．ａ）プロテイナーゼＫおよびリパーゼを含む反応媒体中で該生体標本をインキュベートし；ｂ）場合によって特定の濾過工程の後で、工程ａ）の反応混合物を、３種の抗体共役物であって、その各々が検査を実施している３種の病原体の１種について特異的な抗原の１つに対して特異的である抗体共役物を含む溶液とインキュベートし；ｃ）工程ｂ）のサンプルを、検査を実施している抗原に対して特異的な３種の抗体の各々が固定されている固相支持体と接触させるという工程を含む、トラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを同時に検出する方法。４．該検出が免疫濾過によって実施される、請求の範囲第３項に記載の方法。５．該検出が免疫クロマトグラフィーによって実施される、請求の範囲第３項に記載の方法。６．該検出が酵素免疫アッセーによって実施される、請求の範囲第３項に記載の方法。７．該抗体共役物が、金粒子または他の重金属で標識されている、先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。８．該抗体共役物がクロモフォーで標識されている、請求の範囲第３項から６項のいずれかに記載の方法。９．該抗体共役物が酵素と共役されている、請求の範囲第３項から６項のいずれかに記載の方法。 10．抗Ｆｃ抗体が固定されている内蔵コントロールを含む、先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 11．抽出工程から生じる液体サンプルを吸い取る構成部分および、該吸い取り構成部材に隣接し、その上に分析されるべき微生物に対して選択性を有する主要捕捉抗体が境界が明らかな限定的部分として固定されている反応膜を含む、ただ１つの生物学的標本からトラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを検出する装置。 12．免疫クロマトグラフィー分析用細片の形状を有する、請求の範囲第11項に記載の装置。 13．該細片が、液体サンプルの垂直な流れまたは水平な流れのいずれかを許容する、請求の範囲第12項に記載の装置。 14．請求の範囲第11項−13項の装置、プロテイナーゼＫおよびリパーゼを含む抽出試薬、並びにそれぞれトラコーマクラミジア、淋菌、およびマイコプラズマに対する共役抗体を含む、ただ１つの生物学的標本からトラコーマクラミジア、淋菌およびマイコプラズマを同時に検出する診断キット。 15．該共役抗体が金粒子と共役した抗体である、請求の範囲第14項に記載のキット。 16．該試薬が液体または乾燥薬品形である、請求の範囲第14項または15項に記載のキット。