JP2021012197A - 呼吸器感染症の起因菌を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌から抗原を効率よく抽出し、抽出した抗原を免疫測定により検出するための検査方法（診断方法）を提供することを課題とする。【解決手段】検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、（ａ）該検体を、イオン性界面活性剤を含むがアルカリを含まない第一の試薬に接触させ、中間組成物を得る工程、（ｂ）前記中間組成物を、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び（ｃ）前記反応液を、前記起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程を含む、方法とする。【選択図】図１
Description
本発明は、検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌から抗原を抽出し、免疫測定にて抗原を検出する方法に関する。
呼吸器感染症は様々な原因微生物により引き起こされる疾患であり、インフルエンザウイルス、アデノウイルスなどが原因となるウイルス性呼吸器感染症と、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）、百日咳菌（Bordetella pertussis）を含むBordetella属菌（Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii）などが原因となる細菌性呼吸器感染症に大別される。
近年注目されている細菌性呼吸器感染症として百日咳が挙げられる。百日咳は、遷延性の咳嗽を主症状とし、主に百日咳菌（Bordetella pertussis）により引き起こされる細菌性呼吸器感染症である。乳幼児では咳嗽に加え、発作性の咳込み、吸気性笛声、咳込み後の嘔吐といった典型的な症状を伴うことが多い。一方、青年・成人患者の臨床像は非典型的であり、遷延性の咳嗽のみのことが多い。百日咳菌は、患者の上気道分泌物の飛沫や直接接触により感染し、経気道的に伝播される。その感染力は非常に高いため、学校や職場などでの集団感染が報告されている。ワクチン未接種の乳幼児への感染は、呼吸不全などの重篤化や死亡につながる恐れがある。また百日咳の起因菌としては百日咳菌（Bordetella pertussis）だけではなく、百日咳属菌（Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii）も知られており、その症状は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する百日咳菌特有の外毒素で百日咳菌毒素（pertussis toxin、PT）や細胞壁外膜に存在する内毒素であるリポ多糖（Lipopolysaccharide、LPS）により引き起こされる。
呼吸器感染症の診断のためには、病原体を検出し特定することが、患者への迅速な治療を行うためにも非常に重要である。病原体を検出し、特定する方法としては、(1)患者咽頭拭い液などからの培養・同定検査、(2)患者血清を用いた抗体検査、(3)遺伝子検査、(4)抗原検査などが知られている。これらのうち、培養・同定検査は、呼吸器感染症診断のゴールドスタンダードとして欠かせない検査として位置づけられている。しかし結果が判明するまで数日を要するため、迅速性という点では劣っている。抗体検査は、血清抗体価による診断として利用されているが、基本的に急性期と回復期のペア血清を測定して抗体価の推移をみる必要があり、感染から抗体価の上昇に時間を要するため、感染から判定までに日数を要する。そのため簡便かつ迅速に結果が得られる診断法が望まれている。遺伝子検査は、例えばPolymerase chain reaction（PCR）検査、Loop-Mediated Isothermal Amplication（LAMP）法などが実用化されており、感度や迅速性に優れた検査として評価が高い。しかし一方、検体からの遺伝子の抽出・精製工程を要し、さらに高価な装置が必要なため、限られた施設でしか検査できないなどの課題も残る。
抗原検査は、測定対象とする抗原に特異的に反応する抗体を用いた抗原抗体反応に基づく方法（免疫測定法）がよく知られており、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、免疫濁度アッセイ、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫クロマトグラフィーアッセイ、又はフローサイトメトリーアッセイが挙げられる。抗原検査では、測定対象となる抗原に対する抗体の特異性の高さはもちろんであるが、検体中の対象となる病原体から効率よく簡便に抗原を抽出することも重要である。抗原抽出のためには界面活性剤が用いられることがある。
例えば、特許文献１、２は、ウイルスないしＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の測定方法において、炭素原子数１０個以上のアルキル基と第２、第３もしくは第４級アミンとを有する界面活性剤又は非イオン性界面活性剤、あるいはこの両者の存在下で、ウイルス抗原を、そのプローブとの結合により測定することを特徴とする方法が開示されている。特許文献３は、イオン性界面活性剤を含む、免疫測定に供する検体浮遊液調製用媒体組成物を開示する。
一方、測定対象を細菌とするものとして、特許文献４は、ウシの乳房炎の起因菌の一つであり、乳汁中に存在するブドウ球菌に対して、リゾスタフィン、イオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して溶菌することを開示する。また特許文献５は、クラミジア生菌体に対して、少なくともｐＨ８を有し、そして少なくとも１ｍｇ／ｍｌで存在するカチオン界面活性剤を含む抽出組成物と接触させて、クラミジア主要外層膜タンパク抗原を抽出することを開示する。さらに特許文献６は、検体に含まれる細菌を検出する方法であって、該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、を含み、該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む方法を開示する。
本発明は、検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌から抗原を効率よく抽出するための検体の処理方法、抽出した抗原を免疫測定により検出するための検査方法（診断方法）を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために、検体中の呼吸器感染症の起因菌を、イオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ、次いで非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させることにより、検体中の呼吸器感染症の起因菌を簡便・迅速に、かつ高感度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］ 検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、
（ａ）該検体を、イオン性界面活性剤を含むがアルカリを含まない第一の試薬に接触させ、中間組成物を得る工程、
（ｂ）前記中間組成物を、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び
（ｃ）前記反応液を、前記起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程
を含む、方法。
［２］前記起因菌が、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ホルメシイ（Bordetella holmesii）、及びレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）からなる群から選択されるいずれかである、［１］に記載の方法。
［３］検体に含まれるボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ホルメシイ（Bordetella holmesii）、及びレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）からなる群から選択されるいずれかの呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、
（ａ）該検体を、イオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ、中間組成物を得る工程、
（ｂ）前記中間組成物を、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び
（ｃ）前記反応液を、前記起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程
を含む、方法。
［４］イオン性界面活性剤が、陽イオン性界面活性剤である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］陽イオン性界面活性剤が、第４級アンモニウム塩である、［４］に記載の方法。
［６］第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択されるいずれかである、［５］に記載の方法。
［７］第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択されるいずれかである、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペートである、［５］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］イオン性界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］陰イオン性界面活性剤が、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、又はドデシル硫酸ナトリウムである、［９］に記載の方法。
［１１］イオン性界面活性剤が、両性界面活性剤である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］両性界面活性剤が、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシプロパンスルホネート、及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインである、［１１］に記載の方法。
［１３］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択されるいずれかである、［１］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］非イオン性界面活性剤が、そのＨＬＢが１０．０〜１８．５である非イオン性界面活性剤である、［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］非イオン性界面活性剤が、そのＨＬＢが１２．５〜１６．７である非イオン性界面活性剤である、［１］から［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（９）アルキル（ｓｅｃ−Ｃ１１−１５）エーテル、ｐ−第三級−オクチルフェノキシポリエチルアルコール、ポリオキシエチレン（１３）オレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、及びポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートからなる群から選択されるいずれかである、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］非イオン性界面活性剤が、ポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートである、［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］下記のいずれかを満たす、［１］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
・第一の試薬中におけるイオン性界面活性剤の濃度が、０．０１〜０．１（ｗ／ｖ）％である
・前記反応液中におけるイオン性界面活性剤の濃度が、０．００６７〜０．０６７（ｗ／ｖ）％である
［１９］下記のいずれかを満たす、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
・第二の試薬中における非イオン性界面活性剤の濃度が、０．５〜３（ｗ／ｖ）％である
・前記反応液中における非イオン性界面活性剤の濃度が、０．１６７〜１（ｗ／ｖ）％である
［２０］前記第二の試薬を浸漬させた試料添加用部材または滴下ノズルに備わっているフィルター中に、前記中間組成物を透過させることにより、前記中間組成物と第二の試薬を接触させる、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］前記抗原が、リボソームタンパク質L7/L12である、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］前記起因菌がBordetella属菌であって、前記抗原が、リボソームタンパク質L7/L12、リポ多糖、及び百日咳菌毒素からなる群から選択されるいずれかである、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］前記起因菌が、Bordetella pertussisである、［２２］に記載の方法。
［２４］前記免疫測定が、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、免疫濁度アッセイ、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫クロマトグラフィーアッセイ、又はフローサイトメトリーアッセイである、［１］から［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］前記免疫測定が、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）である、［１］から［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］前記免疫測定法が、免疫クロマトグラフィーアッセイである、［１］から［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］前記検体が、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、又は喀痰である、［１］から［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］ヒトの呼吸器感染症の診断又は診断の補助のための、［１］から［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］以下を含む、［１］から［２８］のいずれか一項に記載の方法を実施するための、キット。
・イオン性界面活性剤を含む、第一の試薬
・非イオン性界面活性剤を含む、第二の試薬
（ａ）該検体を、イオン性界面活性剤を含むがアルカリを含まない第一の試薬に接触させ、中間組成物を得る工程、
（ｂ）前記中間組成物を、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び
（ｃ）前記反応液を、前記起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程
を含む、方法。
［２］前記起因菌が、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ホルメシイ（Bordetella holmesii）、及びレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）からなる群から選択されるいずれかである、［１］に記載の方法。
［３］検体に含まれるボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ホルメシイ（Bordetella holmesii）、及びレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）からなる群から選択されるいずれかの呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、
（ａ）該検体を、イオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ、中間組成物を得る工程、
（ｂ）前記中間組成物を、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び
（ｃ）前記反応液を、前記起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程
を含む、方法。
［４］イオン性界面活性剤が、陽イオン性界面活性剤である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］陽イオン性界面活性剤が、第４級アンモニウム塩である、［４］に記載の方法。
［６］第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択されるいずれかである、［５］に記載の方法。
［７］第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択されるいずれかである、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペートである、［５］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］イオン性界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］陰イオン性界面活性剤が、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、又はドデシル硫酸ナトリウムである、［９］に記載の方法。
［１１］イオン性界面活性剤が、両性界面活性剤である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］両性界面活性剤が、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシプロパンスルホネート、及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインである、［１１］に記載の方法。
［１３］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択されるいずれかである、［１］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］非イオン性界面活性剤が、そのＨＬＢが１０．０〜１８．５である非イオン性界面活性剤である、［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］非イオン性界面活性剤が、そのＨＬＢが１２．５〜１６．７である非イオン性界面活性剤である、［１］から［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（９）アルキル（ｓｅｃ−Ｃ１１−１５）エーテル、ｐ−第三級−オクチルフェノキシポリエチルアルコール、ポリオキシエチレン（１３）オレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、及びポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートからなる群から選択されるいずれかである、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］非イオン性界面活性剤が、ポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートである、［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］下記のいずれかを満たす、［１］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
・第一の試薬中におけるイオン性界面活性剤の濃度が、０．０１〜０．１（ｗ／ｖ）％である
・前記反応液中におけるイオン性界面活性剤の濃度が、０．００６７〜０．０６７（ｗ／ｖ）％である
［１９］下記のいずれかを満たす、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
・第二の試薬中における非イオン性界面活性剤の濃度が、０．５〜３（ｗ／ｖ）％である
・前記反応液中における非イオン性界面活性剤の濃度が、０．１６７〜１（ｗ／ｖ）％である
［２０］前記第二の試薬を浸漬させた試料添加用部材または滴下ノズルに備わっているフィルター中に、前記中間組成物を透過させることにより、前記中間組成物と第二の試薬を接触させる、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］前記抗原が、リボソームタンパク質L7/L12である、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］前記起因菌がBordetella属菌であって、前記抗原が、リボソームタンパク質L7/L12、リポ多糖、及び百日咳菌毒素からなる群から選択されるいずれかである、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］前記起因菌が、Bordetella pertussisである、［２２］に記載の方法。
［２４］前記免疫測定が、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、免疫濁度アッセイ、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫クロマトグラフィーアッセイ、又はフローサイトメトリーアッセイである、［１］から［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］前記免疫測定が、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）である、［１］から［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］前記免疫測定法が、免疫クロマトグラフィーアッセイである、［１］から［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］前記検体が、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、又は喀痰である、［１］から［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］ヒトの呼吸器感染症の診断又は診断の補助のための、［１］から［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］以下を含む、［１］から［２８］のいずれか一項に記載の方法を実施するための、キット。
・イオン性界面活性剤を含む、第一の試薬
・非イオン性界面活性剤を含む、第二の試薬
本発明によれば、検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌から抗原を抽出し、迅速・簡便・高感度に免疫測定にて抗原を検出する方法を提供できる。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、（ａ）該検体をイオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ中間組成物を得る工程、（ｂ）前記中間組成物を非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び（ｃ）前記反応液を、呼吸器感染症の起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程を含む検出方法を提供する。
本発明は検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、（ａ）該検体をイオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ中間組成物を得る工程、（ｂ）前記中間組成物を非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び（ｃ）前記反応液を、呼吸器感染症の起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程を含む検出方法を提供する。
(1)抗原の抽出：工程（ａ）および（ｂ）
〔検出対象菌〕
本発明は、呼吸器感染症の起因菌を検出するために用いられる。呼吸器感染症はウイルスが原因であるウイルス性呼吸器感染症と、細菌が原因である細菌性呼吸器感染症に大別されるが、本発明における呼吸器感染症とは細菌性呼吸器感染症を意味する。細菌性呼吸器感染症の起因菌には、例えば肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）、百日咳菌（Bordetella pertussis）を含むBordetella属菌（Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii）が含まれる。
〔検出対象菌〕
本発明は、呼吸器感染症の起因菌を検出するために用いられる。呼吸器感染症はウイルスが原因であるウイルス性呼吸器感染症と、細菌が原因である細菌性呼吸器感染症に大別されるが、本発明における呼吸器感染症とは細菌性呼吸器感染症を意味する。細菌性呼吸器感染症の起因菌には、例えば肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）、百日咳菌（Bordetella pertussis）を含むBordetella属菌（Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii）が含まれる。
細菌はグラム染色によって紫色に染まるグラム陽性菌と、紫色に染まらず赤く見えるグラム陰性菌に大別される。細菌性呼吸器感染症の起因菌である肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）や肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）はグラム陽性菌であるが一般的には相対的にそれほど危険ではない。これは人体がペプチドグリカンを持たず、従ってグラム陽性菌のペプチドグリカン層にダメージを与える酵素を作る能力を持っているからである。また、グラム陽性菌はペニシリンなどのβ-ラクタム系抗生物質に対する感受性が高いことが多い。ただし肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）は細胞壁を有しない。一方肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）や百日咳菌（Bordetella pertussis）を含むBordetella属菌（Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii）はグラム陰性菌である。グラム陰性菌はその外膜が莢膜や粘液層で覆われた構造となっているものが多く、例外はあるものの、一般的な傾向としては相対的に病原性が高い。このような構造は細菌細胞の抗原を隠しカモフラージュするように働く。人間の免疫系は異物を抗原により認識するため、抗原が隠されると、侵入してきたものを人体が探知するのが難しくなる。莢膜の存在はしばしば病原菌の毒性を高める。さらに、グラム陰性菌は外膜にリポ多糖類である内毒素を持っているが、これが炎症を悪化させ、ひどい場合には敗血症性ショックを引き起こすこともある。
本発明は、検出対象菌が、グラム陽性菌である場合も、グラム陰性菌である場合にも、好適に用いることができる。
本発明を好ましく適用できる検出対象菌は、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii、Legionella pneumophilaであり、より好ましくは、Bordetella pertussisである。
〔抗原〕
本発明では、検出対象菌に由来する抗原を検出する。抗原は、検出対象菌に由来する様々なもの、例えば、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に代表されるような細胞内物質、検出対象菌が産生する物質（例えば、毒素）、検出対象菌の外膜を構成する成分（例えば、リポ多糖（Lipopolysaccharide、LPS））でありうる。抗原は、検出のための抗体が得られやすいことから、タンパク質性のもの（例えば、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２、百日咳菌毒素（pertussis toxin、PT））であることが好ましい。また、起因菌を特定するとの観点からは、種あるいは属に特異的なものであることがより好ましい。ここで、「種あるいは属に特異的」とは、検出対象菌が保有している抗原が、該細菌が属する属以外の、他の属に属する細菌、又は該細菌が属する属の、上記特定の種以外の種の細菌が保有する抗原とは異なる固有のアミノ酸配列等の構造部分を持つことを意味する。種あるいは属に特異的な抗原の例は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である。
本発明では、検出対象菌に由来する抗原を検出する。抗原は、検出対象菌に由来する様々なもの、例えば、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に代表されるような細胞内物質、検出対象菌が産生する物質（例えば、毒素）、検出対象菌の外膜を構成する成分（例えば、リポ多糖（Lipopolysaccharide、LPS））でありうる。抗原は、検出のための抗体が得られやすいことから、タンパク質性のもの（例えば、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２、百日咳菌毒素（pertussis toxin、PT））であることが好ましい。また、起因菌を特定するとの観点からは、種あるいは属に特異的なものであることがより好ましい。ここで、「種あるいは属に特異的」とは、検出対象菌が保有している抗原が、該細菌が属する属以外の、他の属に属する細菌、又は該細菌が属する属の、上記特定の種以外の種の細菌が保有する抗原とは異なる固有のアミノ酸配列等の構造部分を持つことを意味する。種あるいは属に特異的な抗原の例は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である。
なお、検出とは、検出対象菌又はそれに由来する抗原の存在の有無、又はその量を分析することをいう。したがって、検出の結果、検出対象菌又は抗原が検出されなかった場合も、検出された場合と同様、本発明の方法の実施に該当する。
〔検体〕
本発明における検体とは、ヒトの生体の任意の場所から採取することができ、百日咳菌を含む可能性があるものであればよい。好ましくは鼻、鼻腔、鼻咽腔、咽頭などの上気道より採取することが可能な鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、喀痰などに加え、血液や尿などが含まれる。より好ましくは鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、又は喀痰であり、特に好ましい例は鼻腔ぬぐい液である。
本発明における検体とは、ヒトの生体の任意の場所から採取することができ、百日咳菌を含む可能性があるものであればよい。好ましくは鼻、鼻腔、鼻咽腔、咽頭などの上気道より採取することが可能な鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、喀痰などに加え、血液や尿などが含まれる。より好ましくは鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、又は喀痰であり、特に好ましい例は鼻腔ぬぐい液である。
〔第一の試薬、第二の試薬〕
抗原の抽出は、２段階で行う。すなわち、（ａ）綿棒などにて採取された検体をイオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ、中間生成物を得、次いで（ｂ）非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得たのち、呼吸器感染症の起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する。
抗原の抽出は、２段階で行う。すなわち、（ａ）綿棒などにて採取された検体をイオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ、中間生成物を得、次いで（ｂ）非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得たのち、呼吸器感染症の起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する。
〔界面活性剤〕
本発明の工程（ａ）で用いる第一の試薬は、イオン性界面活性剤を含有する。
界面活性剤とは、界面に作用して性質を変化させる物質のことをいい、構造としては分子中に親水性を示す親水基と親油性を示す疎水基を持つ。電離してイオンとなる界面活性剤をイオン性界面活性剤といい、イオンにならない界面活性剤を非イオン性界面活性剤という。イオン性界面活性剤はさらに、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤に分類される。
本発明の工程（ａ）で用いる第一の試薬は、イオン性界面活性剤を含有する。
界面活性剤とは、界面に作用して性質を変化させる物質のことをいい、構造としては分子中に親水性を示す親水基と親油性を示す疎水基を持つ。電離してイオンとなる界面活性剤をイオン性界面活性剤といい、イオンにならない界面活性剤を非イオン性界面活性剤という。イオン性界面活性剤はさらに、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤に分類される。
第一の試薬に用いることができる陽イオン性界面活性剤は、水に溶けたとき、疎水基のついている部分がプラス（正）イオンに電離する界面活性剤であればよく、構造的には第４級アンモニウム塩型（塩化アルキルトリメチルアンモニウム、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、よう化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、臭化ジアルキルジメチルアンモニウム、よう化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化アルキルベンザルコニウムなど）とアルキルアミン塩型（モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩など）に分類される。本発明には、いずれも好適に用いることができる。好ましい例は、第４級アンモニウム塩型では、ジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、又は塩化ベンザルコニウムであり、好ましくはジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、又は塩化ベンザルコニウムであり、より好ましくはジデシルジメチルアンモニウムアジペートである。
第一の試薬には、陽イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。本発明者らの検討によると、陽イオン性界面活性剤は、本発明の検出対象菌から抗原を効率的に抽出するのに適している。
第一の試薬に、陽イオン性界面活性剤を用いる場合、その第一の試薬中の濃度は、検出のために有効な抽出率が確保される限り特に限定されない。例えば、下限としては、０．００１（ｗ／ｖ）％以上とすることができ、０．００２５（ｗ／ｖ）％以上が好ましく、０．０１（ｗ／ｖ）％以上がより好ましい。また、上限としては、０．５（ｗ／ｖ）％以下とすることができ、０．２５（ｗ／ｖ）％以下が好ましく、０．１（ｗ／ｖ）％以下がより好ましい。範囲としては、例えば、０．００１〜０．５（ｗ／ｖ）％とすることができ、０．００２５〜０．２５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．０１〜０．１（ｗ／ｖ）％がより好ましい。
第一の試薬に用いることのできる陰イオン性界面活性剤は、水に溶けたときに、疎水基のついている部分がマイナス（負）イオンに電離する界面活性剤であればよく、構造的にはカルボン酸型（脂肪族モノカルボン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩、N-アシルサルコシン塩、N-アシルグルタミン酸塩など）、スルホン酸型（ジアルキルスルホこはく酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩-ホルムアルデヒド縮合物、アルキルナフタレンスルホン酸塩、N-メチル-N-アシルタウリン塩など）、硫酸エステル型（アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、油脂硫酸エステル塩など）、リン酸エステル型（アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸塩など）に分類される。本発明には、いずれも好適に用いることができる。好ましい例は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、又はドデシル硫酸ナトリウムである。
第一の試薬には、陰イオン性界面活性剤を用いることが好ましいこともある。本発明者らの検討によると、陰イオン性界面活性剤は、本発明の検出対象菌から抗原を効率的に抽出するのに適している。
第一の試薬に陰イオン性界面活性剤を用いる場合、その第一の試薬中の濃度は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り特に限定はされないが、例えば、０．０１〜０．１（ｗ／ｖ）％である。
第一の試薬に用いることのできる両性界面活性剤は、水に溶けたとき、アルカリ性領域では陰性界面活性剤の性質を、酸性領域では陽性界面活性剤の性質を示す界面活性剤であればよく、構造的にはカルボキシベタイン型（アルキルベタイン、脂肪酸アミドプロピルベタインなど）、2-アルキルイミダゾリンの誘導型（2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインなど）、グリシン型（アルキルジエチレントリアミン酢酸、ジアルキルジエチレントリアミン酢酸など）、アミンオキシド型（アルキルアミンオキシドなど）とに分類される。本発明には、いずれも好適に用いることができる。好ましい例は、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシプロパンスルホネート、及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインである。
第一の試薬に両性界面活性剤を用いる場合、その第一の試薬中の濃度は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り特に限定はされないが、例えば０．０１〜０．１（ｗ／ｖ）％である。
本発明の工程（ｂ）で用いる第二の試薬は、非イオン性界面活性剤を含有する。
第二の試薬に用いることのできる非イオン性界面活性剤は、水に溶けたとき、イオン化しない親水基をもっている界面活性剤であればよく、構造的にはエステル型（グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、しょ糖脂肪酸エステルなど）、エーテル型（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなど）、エステルエーテル型（脂肪酸ポリエチレングリコール、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンなど）、アルカノールアミド型（脂肪酸アルカノールアミドなど）に分類される。本発明には、いずれも好適に用いることができる。好ましい例は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。より特定すると、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（９）アルキル（ｓｅｃ−Ｃ１１−１５）エーテル、ｐ−第三級−オクチルフェノキシポリエチルアルコール、ポリオキシエチレン（１３）オレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、又はポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートである。好ましくは、ポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートである。
第二の試薬に用いることのできる非イオン性界面活性剤は、水に溶けたとき、イオン化しない親水基をもっている界面活性剤であればよく、構造的にはエステル型（グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、しょ糖脂肪酸エステルなど）、エーテル型（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなど）、エステルエーテル型（脂肪酸ポリエチレングリコール、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンなど）、アルカノールアミド型（脂肪酸アルカノールアミドなど）に分類される。本発明には、いずれも好適に用いることができる。好ましい例は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。より特定すると、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（９）アルキル（ｓｅｃ−Ｃ１１−１５）エーテル、ｐ−第三級−オクチルフェノキシポリエチルアルコール、ポリオキシエチレン（１３）オレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、又はポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートである。好ましくは、ポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートである。
また第二の試薬に用いる非イオン性界面活性剤の選択に際しては、親水基と疎水基のバランスを表すｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ（ＨＬＢ）値を指標とすることができる。ＨＬＢ値の算出方法としてはグリフィン法、アトラス法、デイビス法、及び川上法などが知られている。本発明の第二の試薬に用いる非イオン性界面活性剤としては、グリフィン法に基づくＨＬＢ値が、水中油型（ｏｉｌ ｉｎ ｗａｔｅｒ Ｏ／Ｗ）エマルジョンの調製に適しているとされる８．０〜１８．５までのものを用いることができ、１０．０〜１８．５のものが好ましく、１２．５〜１６．７のものがより好ましい。グリフィン法に基づくＨＬＢ値は、２０×親水基の式量の総和／分子量で求めることができる。
非イオン性界面活性剤の第二の試薬中の濃度は、下限として例えば免疫クロマトグラフィーアッセイを用いる場合は展開液の流れが確保される限り特に限定はされない。例えば、下限としては、０．１（ｗ／ｖ）％以上とすることができ、０．２５（ｗ／ｖ）％以上が好ましく、０．５（ｗ／ｖ）％以上がより好ましい。また濃度の上限は、イオン性界面活性剤を含む第一の試薬による可溶化や、免疫反応における抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよい。例えば、上限としては、１０（ｗ／ｖ）％以下とすることができ、５（ｗ／ｖ）％以下が好ましく、３（ｗ／ｖ）％以下がより好ましい。範囲としては、例えば、０．１〜１０（ｗ／ｖ）％とすることができ、０．２５〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．５〜３（ｗ／ｖ）％、あるいは０．２５〜１．５（ｗ／ｖ）％がより好ましい。
〔アルカリについて〕
本発明の第一の試薬は、アルカリを含まないように構成することができる。本発明に関し、アルカリを含まないとは、液性がアルカリ性（ｐＨが１１を超えること）とはならないようにすることを指す。アルカリを含まない第一の試薬の液性は、弱アルカリ性（ｐＨが８．０を超えて１１．０以下であること）、又は中性（ｐＨが、６．０〜８．０であること）である場合がある。第一の試薬がアルカリを含まないことにより、作業がより安全となる、中和の手間が不要である、第一の試薬のための容器の材質が限定されない（耐アルカリ性であることを要さない。）、第一の試薬中で抽出される抗原の安定性を気にしなくてよい（変性などの問題を避けられる。）等のメリットがある。
本発明の第一の試薬は、アルカリを含まないように構成することができる。本発明に関し、アルカリを含まないとは、液性がアルカリ性（ｐＨが１１を超えること）とはならないようにすることを指す。アルカリを含まない第一の試薬の液性は、弱アルカリ性（ｐＨが８．０を超えて１１．０以下であること）、又は中性（ｐＨが、６．０〜８．０であること）である場合がある。第一の試薬がアルカリを含まないことにより、作業がより安全となる、中和の手間が不要である、第一の試薬のための容器の材質が限定されない（耐アルカリ性であることを要さない。）、第一の試薬中で抽出される抗原の安定性を気にしなくてよい（変性などの問題を避けられる。）等のメリットがある。
第一の試薬、第二の試薬とも、目的の作用を発揮する限り、界面活性剤以外の他の物質を含んでいてもよい。
〔２段階操作〕
２段階操作は、第一の試薬と第二の試薬を、この順に、別々に（混合してではなく）用いる。
２段階操作は、第一の試薬と第二の試薬を、この順に、別々に（混合してではなく）用いる。
本発明の２段階の操作は、具体的には次のように実施することができる。検体が鼻腔ぬぐい液の場合は、検体の付着した綿棒をイオン性界面活性剤を含む第一の試薬の入ったチューブに浸し、次いで非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬を添加することができる。また、第二の試薬は、免疫クロマトグラフィー装置を用いる場合は、予め滴下ノズルに備わっているフィルターや、装置の試料添加用部材（図９の例では５）や標識抗体含浸部材（図９の例では２）に浸漬したものを調製しておき、検体の付着した綿棒を浸した第一の試薬を、直接試料添加用部材に滴下してもよい。第二の試薬を滴下ノズルに備わっているフィルターや試料添加用部材に予め浸漬したものを用いることにより、操作性の向上（第二の試薬を滴下する手間が省略でき、操作ミスが低減される）や抗原量の濃縮（反応液量を減らすことが可能となる）等のメリットがある。
必要に応じ第一の試薬と検体との接触は、環境温度において行うことができ、必要に応じ、タンパク質などの成分の劣化がより生じにくい冷却条件下で行ってもよい。接触は、細胞内抗原が十分抽出できる時間、例えば数秒〜数時間行うことができ、接触の際には必要に応じ、撹拌、振とうを行ってもよい。
また本発明者らの検討に拠ると、第一の試薬と第二の試薬は順に用いればよく、間隔は特に限定されない。第一の試薬添加から第二の試薬添加の間の時間は、短くてよい。すなわち、迅速に検査できることも、本発明の方法のメリットである。
２段階操作により、高効率の溶菌と正確な免疫測定を両立できる。イオン性界面活性剤は電荷を帯びているため、同じく電荷を帯びているタンパク質との結合性が高いといえる。したがって、溶菌の観点からはイオン性界面活性剤を選択することは理にかなっているが、免疫測定の場合、イオン性界面活性剤は測定に用いる抗体とも結合性が高く、結果として抗原抗体反応を阻害する可能性が高くなる。本発明者らは、この問題に対して、特定の非イオン性界面活性剤を一定比率で加えることにより、イオン性界面活性剤による免疫反応阻害を抑制できることを見出した。その一方で、非イオン性界面活性剤の一定比率での添加操作は、原理的にイオン性界面活性剤の溶菌作用も低減させうるため、予め２種類の界面活性剤を混合すると溶菌が不十分となりうる。したがって溶菌時はイオン性界面活性剤単独で作用させることが重要である。
(2)抽出した抗原の免疫測定：工程（ｃ）
〔測定法の種類〕
本発明における抽出した抗原の測定方法としては特に限定されないが、抗原と抗体との分子間の結合反応を利用した抗原抗体反応を用いた免疫測定が望ましい。免疫測定方法としては、抗原抗体反応を酵素を利用して定量的に追跡し、抗原あるいは抗体を測定する酵素免疫定量法（enzyme immunoassay、EIA）や、抗原抗体反応を放射線同位体の助けで定量的に追跡し抗原あるいは抗体を測定する放射線免疫検定法（radioimmunoassay、RIA）がある。抗原と抗体の結合反応は一般的に特異性が高く、低濃度でも比較的容易に結合し、いったん結合すると比較的解離しにくい。このため何らかの方法で抗原抗体反応を定量化すると微量の抗原あるいは抗体を測定することができる。
〔測定法の種類〕
本発明における抽出した抗原の測定方法としては特に限定されないが、抗原と抗体との分子間の結合反応を利用した抗原抗体反応を用いた免疫測定が望ましい。免疫測定方法としては、抗原抗体反応を酵素を利用して定量的に追跡し、抗原あるいは抗体を測定する酵素免疫定量法（enzyme immunoassay、EIA）や、抗原抗体反応を放射線同位体の助けで定量的に追跡し抗原あるいは抗体を測定する放射線免疫検定法（radioimmunoassay、RIA）がある。抗原と抗体の結合反応は一般的に特異性が高く、低濃度でも比較的容易に結合し、いったん結合すると比較的解離しにくい。このため何らかの方法で抗原抗体反応を定量化すると微量の抗原あるいは抗体を測定することができる。
本発明における免疫測定とは、各種の免疫学的測定方法のことであり、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、免疫濁度アッセイ、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫クロマトグラフィーアッセイ又はフローサイトメトリーアッセイなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。免疫学的測定方法の実施に際し、非特異的な吸着を防ぐためのブロッキングのための物質や、対象菌種以外の菌との交差反応を防ぐための物質を用いてもよい。
〔ELISA法〕
本発明における酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）とは抗原抗体反応を利用したタンパク質などの物質測定法であり、固相に予め結合させておいた一次抗体に、抗原を含む試料を反応させた後、さらに酵素で標識した二次抗体を反応させて、結合しているかどうかを酵素活性を利用して測定する方法である。本方法は検出感度が高く、測定目的に合わせた数種類の方法があり、生化学・生物学的検査に幅広く用いられている。
本発明における酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）とは抗原抗体反応を利用したタンパク質などの物質測定法であり、固相に予め結合させておいた一次抗体に、抗原を含む試料を反応させた後、さらに酵素で標識した二次抗体を反応させて、結合しているかどうかを酵素活性を利用して測定する方法である。本方法は検出感度が高く、測定目的に合わせた数種類の方法があり、生化学・生物学的検査に幅広く用いられている。
以下にELISAによる抗原の検出方法の一例を示す。
(1)一次抗体の生理食塩水溶液を96穴プラスチックプレートのウェルに加えて静置しウェルの表面に一次抗体を吸着させる、(2)過剰の遊離一次抗体を洗い流し、さらにプラスチック表面を無関係の過剰量のタンパク質など（BSAやカゼイン）で処理し、以降の各種タンパク質の非特異的結合を防ぐためにブロッキングする、(3)測定したい抗原を含む被験体を加え一次抗体と反応させ、抗原抗体複合体を形成させる、(4)夾雑物を洗浄にて除去した後、ペルオキシダーゼ（HRP）で標識された二次抗体を添加し反応させる、(5)過剰のHRP標識二次抗体を洗浄にて除去し、(6)発色性の酵素基質であるTMBを添加し、(7)抗体に結合したHRPと反応させ有色の最終産物を形成し、(8)最終産物の特異的な吸収波長である450nmの吸光度を測定し、(8)予め検量物質の吸光度より作成している検量線より、目的とする抗原の濃度を算出する。
(1)一次抗体の生理食塩水溶液を96穴プラスチックプレートのウェルに加えて静置しウェルの表面に一次抗体を吸着させる、(2)過剰の遊離一次抗体を洗い流し、さらにプラスチック表面を無関係の過剰量のタンパク質など（BSAやカゼイン）で処理し、以降の各種タンパク質の非特異的結合を防ぐためにブロッキングする、(3)測定したい抗原を含む被験体を加え一次抗体と反応させ、抗原抗体複合体を形成させる、(4)夾雑物を洗浄にて除去した後、ペルオキシダーゼ（HRP）で標識された二次抗体を添加し反応させる、(5)過剰のHRP標識二次抗体を洗浄にて除去し、(6)発色性の酵素基質であるTMBを添加し、(7)抗体に結合したHRPと反応させ有色の最終産物を形成し、(8)最終産物の特異的な吸収波長である450nmの吸光度を測定し、(8)予め検量物質の吸光度より作成している検量線より、目的とする抗原の濃度を算出する。
〔免疫クロマトグラフィー〕
本発明は、好ましい態様の一つにおいて、免疫クロマトグラフィー法（「免疫クロマト法」ということもある。）を利用した装置又はキットを用いる。キットは、免疫クロマトグラフィー装置を含み、それ以外に、上述の第一の試薬及び／又は第二の試薬を含んでいてもよい。キットはさらに、検体を採取するための用具、例えば綿棒、及び／又は吸引カテーテルを含んでいてもよい。
本発明は、好ましい態様の一つにおいて、免疫クロマトグラフィー法（「免疫クロマト法」ということもある。）を利用した装置又はキットを用いる。キットは、免疫クロマトグラフィー装置を含み、それ以外に、上述の第一の試薬及び／又は第二の試薬を含んでいてもよい。キットはさらに、検体を採取するための用具、例えば綿棒、及び／又は吸引カテーテルを含んでいてもよい。
免疫クロマトグラフィー装置は、細菌の有無を判定するための判定部を有し、判定部上には抗原、例えばリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体が固定される。キット又は免疫クロマトグラフィー装置は、固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を用いるサンドイッチアッセイ（「サンドイッチ免疫アッセイ」ということもある。）を利用したものでもよい。
図９に、免疫クロマトグラフィー装置の断面模式図を示した。１は基材、２は標識抗体含浸部材、３はクロマト展開用膜担体、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示す。６は細菌に含まれる抗原と反応する抗体が固定された判定部、又は捕捉部位である。
標識抗体含浸部材には、好ましくは、検出対象となる抗原に対する抗体であって固定化された抗体とは異なる部位と結合する標識された抗体、又は抗原が保持されている。ここに、固定化された抗体とは異なる部位と結合する標識された抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により抗原を検出することができる。また、ここに標識された抗原が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、ここには、固定化された抗体とは異なる部位と結合する標識された抗体が保持されていることが好ましい。
固定化された抗体とは異なる部位と結合する標識された抗体を保持させる場合には、それぞれの抗原に対し、判定部に固定化される抗体と、固定化された抗体とは異なる部位と結合する標識された抗体の、２種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により抗原を検出することができるように、２種類の抗体は、一つの抗原に同時に結合できることができる抗体であり、一方の抗体のエピトープは、他方の抗体が認識する抗原のエピトープとは異なることが好ましい。
標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子（金コロイド粒子、白金コロイド粒子ということもある。）、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が１ｎｍから１０μｍが好ましい。より好ましくは、５ｎｍから１μｍであり、さらに好ましくは１０ｎｍから１００ｎｍである。
免疫クロマト装置は、公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。装置の基材（図９の例では１）としては、入手のしやすさや安定性、安全性、成形性、及び滅菌性に優れるという点でポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタンなどの合成高分子、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩などの天然高分子自体ならびにそれを架橋した構造体や改質した構造体、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニアなどの無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウムなどの金属を用いることができる。中でも合成高分子や天然高分子誘導体が好ましい。また基材の形状としては平板、メッシュ、織布、不織布、スポンジ状構造体、３次元成型体（ブロック状）などで用いることができる。
標識抗体含浸部材（図９の例では２）に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体などの繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿などである。
判定部（図９の例では６）を含むクロマト展開用膜担体（図９の例では３）に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロンなどである。
標識抗体含浸部材（図９の例では２）に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体などの繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿などである。
判定部（図９の例では６）を含むクロマト展開用膜担体（図９の例では３）に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロンなどである。
本発明において、クロマト展開用膜担体の判定部への抗体の固定化においては、膜担体表面に抗体分子が直接結合していてもよいし、又は活性基を介して結合していてもよい。膜担体から抗体分子又は活性基が膜担体表面に固定化された状態であれば、いずれの結合状態であってもよい。結合状態としては、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、水素結合、又は疎水結合の単独、又はこれら複数の合力があげられる。特に抗体溶液と膜担体表面との単純な接触による物理的な吸着法は、簡便で本発明に特に好適に用いられる。また抗体の吸着後に膜担体表面を洗浄や乾燥させること、あるいは膜担体表面に抗体溶液を塗布後に水分を蒸発せしめて膜担体表面に抗体を固定化する方法も、本発明に極めて好適に使用することができる。
〔抗体の作製方法〕
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが好ましくはモノクローナル抗体である。
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが好ましくはモノクローナル抗体である。
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体は、国際公開第００／０６６０３号公報に記載の方法で作製することができる。抗体は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、又はキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラットなどであり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、特定の細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と反応し、特定の細菌とは異なる種に属する細菌、又は異なる属に属する細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原以外の細胞内抗原を抗原として用いる場合も、同様に抗体を作成することができる。なお以下では、本発明を、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を検出する態様を例に説明することがあるが、その説明は、当業者であれば、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２以外の細胞内抗原を抗原として用いる場合にも適宜あてはめて理解することができる。
(3)本発明の利点
本発明を用いることにより、被験者より一度の検体採取で複数の呼吸器感染症の起因菌を同定することができる。具体的には呼吸器感染症状を呈する患者から鼻腔ぬぐい液を綿棒にて１回採取し、検体の付着した綿棒をイオン性界面活性剤を含む第一の試薬の入ったチューブに浸し、次いで非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬を添加して検査用のサンプルとし、例えば肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）、百日咳菌（Bordetella pertussis）の免疫検出試薬にて複数種類の呼吸器感染症の起因菌の有無を一度に調べることができる。また例えば百日咳が疑われる場合には、同様に調整した検査用のサンプルを、百日咳菌（Bordetella pertussis）、Bordetella属菌（Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii）、百日咳菌毒素（pertussis toxin、PT）や百日咳菌特有の内毒素であるリポ多糖（Lipopolysaccharide、LPS）の免疫検出試薬にて測定すれば百日咳感染の有無をより詳細に調べることが可能となる。
本発明を用いることにより、被験者より一度の検体採取で複数の呼吸器感染症の起因菌を同定することができる。具体的には呼吸器感染症状を呈する患者から鼻腔ぬぐい液を綿棒にて１回採取し、検体の付着した綿棒をイオン性界面活性剤を含む第一の試薬の入ったチューブに浸し、次いで非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬を添加して検査用のサンプルとし、例えば肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）、百日咳菌（Bordetella pertussis）の免疫検出試薬にて複数種類の呼吸器感染症の起因菌の有無を一度に調べることができる。また例えば百日咳が疑われる場合には、同様に調整した検査用のサンプルを、百日咳菌（Bordetella pertussis）、Bordetella属菌（Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii）、百日咳菌毒素（pertussis toxin、PT）や百日咳菌特有の内毒素であるリポ多糖（Lipopolysaccharide、LPS）の免疫検出試薬にて測定すれば百日咳感染の有無をより詳細に調べることが可能となる。
本発明の実施例を以下に詳細に述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
〔実施例１：菌体の調製〕
［Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii菌液調製方法］
Bordetella pertussis (ATCC No. BAA-589)、Bordetella parapertussis (ATCC No. BAA-587)、及びBordetella holmesii (ATCC No. 700053)は、以下に示す方法で試験菌液を調製した。ボルデテラCFDN寒天培地(日研生物医学研究所社製)に接種し、37℃、3日間好気条件下で培養し、培地上のコロニーを生理食塩水(日本薬局方生理食塩液)に懸濁したものを試験菌液として用いた。
［Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii菌液調製方法］
Bordetella pertussis (ATCC No. BAA-589)、Bordetella parapertussis (ATCC No. BAA-587)、及びBordetella holmesii (ATCC No. 700053)は、以下に示す方法で試験菌液を調製した。ボルデテラCFDN寒天培地(日研生物医学研究所社製)に接種し、37℃、3日間好気条件下で培養し、培地上のコロニーを生理食塩水(日本薬局方生理食塩液)に懸濁したものを試験菌液として用いた。
［Legionella pneumophila菌液調製方法]
Legionella pneumophila（ATCC No.33152）をBCYE寒天培地で37℃、4日間培養した後、単一コロニーを3mlのBYE培地に添加し、攪拌しながら37℃で一晩培養した菌を、再び新しいBYE培地3mlに添加し、攪拌しながら37℃で培養したものを試験菌液として用いた。
Legionella pneumophila（ATCC No.33152）をBCYE寒天培地で37℃、4日間培養した後、単一コロニーを3mlのBYE培地に添加し、攪拌しながら37℃で一晩培養した菌を、再び新しいBYE培地3mlに添加し、攪拌しながら37℃で培養したものを試験菌液として用いた。
〔実施例２：Bordetella pertussis Ribosomal Protein L7/L12に対するモノクローナル抗体の作製〕
（１）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ ＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング
精製されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓゲノムDNA５０ｎｇを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μＬ、添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μＬと合成オリゴヌクレオチドＡ（catggatccatggcacttagcaaagctgaa 配列番号：１）、及び配列オリゴヌクレオチドＢ（gtagaattcttattacttgacttcgaccttgg 配列番号：２）をそれぞれ２６０ｐｍｏｌ加え、最終容量５０μＬとした。
（１）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ ＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング
精製されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓゲノムDNA５０ｎｇを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μＬ、添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μＬと合成オリゴヌクレオチドＡ（catggatccatggcacttagcaaagctgaa 配列番号：１）、及び配列オリゴヌクレオチドＢ（gtagaattcttattacttgacttcgaccttgg 配列番号：２）をそれぞれ２６０ｐｍｏｌ加え、最終容量５０μＬとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９４℃ ２分を１サイクル行った後、９８℃ １０秒、５５℃ ３０秒、６８℃ １分を３０サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。得られたＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔをＺｅｒｏ ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の手順に従ってプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯにインサートした。さらに制限酵素ＢａｍＨＩ、及びＥｃｏＲＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−６P−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。
具体的には、ベクターｐＧＥＸ−６P−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−６P−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍＬ含むＬＬＢ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬＬＢ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍＬに植え付け、８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
得られたクローンはＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性があり、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と一致したＤＮＡ配列が明白であった。その構造遺伝子部分の全塩基配列、及び対応するアミノ酸配列は下記の配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の遺伝子をコードするものである。
atggcacttagcaaagctgaaatccttgacgccatcgctggcatgtccgtgctcgagctgtccgagctgatcaaggaaatggaagaaaagtttggcgtgtcggctgctgccgccgccgtggccgtggccgccccggccgctggtggcgctggcgccgctgctgctgaagagcagaccgagttcaccgttgtgctgctggaagccggcgcgaacaaggtcagcgtcatcaaggccgtgcgcgagctgaccggtctgggtctgaaggaagccaaggacctggttgacggcgctccgaagcccgtcaaggaagcgctgcccaaggctgacgccgaagccgccaagaagaagctggaagaagctggcgccaaggtcgaagtcaagtaa（配列番号：３）
MALSKAEILDAIAGMSVLELSELIKEMEEKFGVSAAAAAVAVAAPAAGGAGAAAAEEQTEFTVVLLEAGANKVSVIKAVRELTGLGLKEAKDLVDGAPKPVKEALPKADAEAAKKKLEEAGAKVEVK（配列番号：４）
（２）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の大腸菌での大量発現と精製
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をＬＢ培地中で５０ｍＬ ３７℃１晩培養した。１晩培養した大腸菌液５０ｍＬを５００ｍＬのTB培地に入れた。１時間後、１００ｍＭイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を５５０μＬ入れ４時間培養後回収し、1/100量のBugBuster(Merck社製)を加えて室温で20分間振とう後、１０，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上澄みを回収した。
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をＬＢ培地中で５０ｍＬ ３７℃１晩培養した。１晩培養した大腸菌液５０ｍＬを５００ｍＬのTB培地に入れた。１時間後、１００ｍＭイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を５５０μＬ入れ４時間培養後回収し、1/100量のBugBuster(Merck社製)を加えて室温で20分間振とう後、１０，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上澄みを回収した。
次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。次に、２０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．４、４．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む洗浄液でカラムを２ベッドボリューム分洗浄した。その後５ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ９．６で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；Ｂｉｏｒａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。得られた精製ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の純度は電気泳動法により確認したところ約７５％であり免疫原として充分な純度を確保できた。
（３）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体の作製
まずマウスの免疫についてはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗原１００μｇを２００μＬのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μＬ加え混合、エマルジョン化した後２００μＬを腹腔内に注射した。
まずマウスの免疫についてはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗原１００μｇを２００μＬのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μＬ加え混合、エマルジョン化した後２００μＬを腹腔内に注射した。
さらに、２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１，５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、ＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍＬのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍＬ加え１，５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍＬ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１，０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍＬのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍＬになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍＬずつ分注し７％ＣＯ２条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間日、２週間目にＨＡＴ培地を０.１ｍＬずつ加えた。
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ナトリウム含むＰＢＳ中に溶解したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２及びＧＳＴ蛋白質をそれぞれ１０μｇ／ｍＬ濃度で希釈した液を１００μＬずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（ＰＢＳ中）２００μＬ添加し室温で１時間反応してブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％，ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μＬを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した。これに、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μＬ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社製）を１００μＬずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μＬ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果、ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２にのみ反応しＧＳＴ蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスチックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍＬになるようにＨＴ培地で希釈し５０μＬを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２との反応陽性の細胞を回収した。
さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＢＰＲＢ−５、−７、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４の計７株を取得した。
（４）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２と反応するモノクローナル抗体の選択
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法に従ってモノクローナル抗体を生産回収した。
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法に従ってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞をあらかじめ２週間前に０．５ｍＬのプリスタンを腹腔内に注射したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に５×１０6個（ＰＢＳ中）注射し、３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。
取得した抗体含有液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（５ｍＬベッド，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を取得した。
この７株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を１次あるいは２次抗体として用いて４２組の組み合わせのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの検出性能をＥＬＩＳＡ法により評価した。抗体の評価にはサンドイッチアッセイ法を用い、ＥＬＩＳＡ法の２次抗体としては作製したモノクローナル抗体をペルオキシダーゼと化学的に結合させることにより酵素標識抗体として使用した。すなわち酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。ＥＬＩＳＡ反応においては０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に溶解したモノクローナル抗体を１次抗体とし１０μｇ／ｍＬ濃度で希釈した液を１００μＬずつ９６穴プレートへ別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中）２００μＬを添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの培養液に０．３％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液（６×１０5個／ｍＬ）１００μＬを加え室温で２時間反応後上澄みを除去し、さらに洗浄液で洗浄後、５μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗体液を１００μＬ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社製）を１００μＬずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μＬ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定し、陰性コントロールシグナルとの差によりＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを検出可能なＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗体の組み合わせを評価した。また併せてそれぞれの抗体の組み合わせについてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ以外の主要な細菌３１菌種との反応性を評価した。ＥＬＩＳＡ法の条件は前述の方法と同一の方法に従い、抗原のみＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの代わりにそのほかの主要な細菌はそれぞれ１×１０8個／ｍＬ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰＢＳ中に調整したサンプルを供して試験を実施した。
その結果、上記のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを検出可能でかつ他の主要な細菌とは反応しない抗体の組み合わせ１０組が得られた。
これら１０組のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを検出可能でかつＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ以外の細菌３１種と反応しないハイブリドーマＢＰＲＢ−５、−７、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４由来の１０組のモノクローナル抗体組合せについてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとの反応を確認したＥＬＩＳＡ吸光度データを表１に示す。またＥＬＩＳＡ法で交差反応をしないことを確認した他の細菌の一覧を表２に示す。表１における数値はそれぞれの抗体の組み合わせで陽性サンプルの測定値から陰性コントロールの測定値を差し引いた値を示した。
〔実施例３：Legionella pneumophila Ribosomal Protein L7/L12に対するモノクローナル抗体の作製〕
特開2004-201605に示す方法と同様に、Legionella pneumophila Ribosomal Protein L7/L12との反応陽性を示すハイブリドーマLEG-1細胞とハイブリドーマLEG-2細胞の２クローンを取得し、定法に従ってモノクローナル抗体LEG-1とLEG-2を生産回収した。LEG-1抗体とLEG-2抗体は、Legionella pneumophila Ribosomal Protein L7/L12中の抗体認識部位が異なる独立した抗体であり、Legionella pneumophila Ribosomal Protein L7/L12を抗原としたサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて該抗原が存在した場合に検出することができる組合せの抗体群である。
特開2004-201605に示す方法と同様に、Legionella pneumophila Ribosomal Protein L7/L12との反応陽性を示すハイブリドーマLEG-1細胞とハイブリドーマLEG-2細胞の２クローンを取得し、定法に従ってモノクローナル抗体LEG-1とLEG-2を生産回収した。LEG-1抗体とLEG-2抗体は、Legionella pneumophila Ribosomal Protein L7/L12中の抗体認識部位が異なる独立した抗体であり、Legionella pneumophila Ribosomal Protein L7/L12を抗原としたサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて該抗原が存在した場合に検出することができる組合せの抗体群である。
〔実施例４：免疫クロマトグラフィー装置の作製〕
例としてBordetella pertussis用免疫クロマトグラフィー装置の作製手順を下記に述べる。なお他の細菌についても同様の手順で免疫クロマトグラフィー装置を作製することが可能である。
例としてBordetella pertussis用免疫クロマトグラフィー装置の作製手順を下記に述べる。なお他の細菌についても同様の手順で免疫クロマトグラフィー装置を作製することが可能である。
（１）標識抗体含浸部材
金コロイド溶液(粒径60nm、田中貴金属社製)0.9mLに0.05M TAPS 緩衝液 pH8.0を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＢＰＲＢ−７を100μg/mL加え室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン（BSA）（メルク社製）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＢＰＲＢ−７（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15,000g、10分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mM NaClを含有する20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。17mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。
金コロイド溶液(粒径60nm、田中貴金属社製)0.9mLに0.05M TAPS 緩衝液 pH8.0を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＢＰＲＢ−７を100μg/mL加え室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン（BSA）（メルク社製）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＢＰＲＢ−７（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15,000g、10分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mM NaClを含有する20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。17mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。
（２）クロマト展開用膜担体
25mm×300mmのニトロセルロース膜（Sartorius社、商品名：UniSart CN140）をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体として用意した。金コロイド標識抗体と抗原の複合体を捕捉するためのモノクローナル抗体ＢＰＲＢ−５を、3%トレハロース（富士フイルム和光純薬社製）、０．０１M TAPS 緩衝液 (pH 9.0)にて希釈し2.0 mg/mLに調製した。調製した抗体溶液を、このクロマト展開用膜担体におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/cmでライン状に塗布して、これを55℃で一晩乾燥させた。
25mm×300mmのニトロセルロース膜（Sartorius社、商品名：UniSart CN140）をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体として用意した。金コロイド標識抗体と抗原の複合体を捕捉するためのモノクローナル抗体ＢＰＲＢ−５を、3%トレハロース（富士フイルム和光純薬社製）、０．０１M TAPS 緩衝液 (pH 9.0)にて希釈し2.0 mg/mLに調製した。調製した抗体溶液を、このクロマト展開用膜担体におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/cmでライン状に塗布して、これを55℃で一晩乾燥させた。
（３）免疫クロマトグラフィー装置の作製
接着層を持つバッキングシート（Adhesives Research Inc.製）からなる基材に上記作製した標識抗体含浸部材、上記クロマト展開用膜担体の他に、試料を添加する部分に用いる試料添加用部材（旭化成社製、商品名：NE107）、展開した試料や余剰金コロイド標識抗体を吸収するための吸収用部材（日本製紙クレシア株式会社、商品名：CRクッション）を貼り合わせた。そして、裁断機を用いて5mmの幅になるように裁断し、免疫クロマトグラフィー装置を作製した。
接着層を持つバッキングシート（Adhesives Research Inc.製）からなる基材に上記作製した標識抗体含浸部材、上記クロマト展開用膜担体の他に、試料を添加する部分に用いる試料添加用部材（旭化成社製、商品名：NE107）、展開した試料や余剰金コロイド標識抗体を吸収するための吸収用部材（日本製紙クレシア株式会社、商品名：CRクッション）を貼り合わせた。そして、裁断機を用いて5mmの幅になるように裁断し、免疫クロマトグラフィー装置を作製した。
〔実施例５：免疫クロマトグラフィー法による百日咳菌の検出におけるイオン性界面活性剤の効果〕
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における最適な界面活性剤を探索するために、イオン性界面活性剤の性能を比較した。また、対照として第一の試薬に非イオン性界面活性剤を使用した場合の効果も比較した。
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における最適な界面活性剤を探索するために、イオン性界面活性剤の性能を比較した。また、対照として第一の試薬に非イオン性界面活性剤を使用した場合の効果も比較した。
［第一の試薬の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表３に示す各イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表３に示す各イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤
［第二の試薬の調製］
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
0.15M リン酸緩衝液（ｐH７．５）
2(w/v)% BSA（メルク社製）
0.05(w/v)% アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
3(w/v)% ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
0.15M リン酸緩衝液（ｐH７．５）
2(w/v)% BSA（メルク社製）
0.05(w/v)% アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
3(w/v)% ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
［陽性検体液の調製］
実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液５μＬを、最終的な容量が1mLになるようにPBS（富士フイルム和光純薬社製）で希釈し、陽性検体液を調製した。
実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液５μＬを、最終的な容量が1mLになるようにPBS（富士フイルム和光純薬社製）で希釈し、陽性検体液を調製した。
［測定試料の調製］
陽性検体液を、下記の工程１から４のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
≪工程１：検体を第一の試薬で処理した後に第二の試薬を添加する工程≫
陽性検体液20μLを第一の試薬300μLに添加し、混合後第二の試薬150μLをさらに添加して混合したものを工程１の測定試料とした。
≪工程２：検体を第一の試薬と第二の試薬の混合溶液で処理する工程≫
第一の試薬300μLと第二の試薬150μLを混合し混合溶液を調製し、混合溶液に対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程２の測定試料とした。
≪工程３：検体を第一の試薬のみで処理する工程≫
第一の試薬450μLに対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程３の測定試料とした。
≪工程４：検体を第二の試薬のみで処理する工程≫
第二の試薬450μLに対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程４の測定試料とした。
陽性検体液を、下記の工程１から４のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
≪工程１：検体を第一の試薬で処理した後に第二の試薬を添加する工程≫
陽性検体液20μLを第一の試薬300μLに添加し、混合後第二の試薬150μLをさらに添加して混合したものを工程１の測定試料とした。
≪工程２：検体を第一の試薬と第二の試薬の混合溶液で処理する工程≫
第一の試薬300μLと第二の試薬150μLを混合し混合溶液を調製し、混合溶液に対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程２の測定試料とした。
≪工程３：検体を第一の試薬のみで処理する工程≫
第一の試薬450μLに対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程３の測定試料とした。
≪工程４：検体を第二の試薬のみで処理する工程≫
第二の試薬450μLに対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程４の測定試料とした。
［測定］
各測定試料120μLを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、15分後に目視判定を行った。
各測定試料120μLを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、15分後に目視判定を行った。
［結果］
表３に結果を記載した。判定部上にシグナルが確認できなかったものを−とし、弱いシグナルを確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋、よりシグナルが強いものに関しては＋＋とした。
表３に結果を記載した。判定部上にシグナルが確認できなかったものを−とし、弱いシグナルを確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋、よりシグナルが強いものに関しては＋＋とした。
工程１で処理した測定試料は高いシグナル強度を示したのに対し、工程２および工程４で処理した測定試料ではシグナルが観測されなかったことから、検体とイオン性界面活性剤を含む第一の試薬が接触した後に、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬を添加することが重要であることが推測された。また、工程３で処理した測定試料では免疫クロマトグラフィー装置上を液が展開せず測定不能であったことから、免疫クロマトグラフィー装置上を展開し、抗原抗体反応を進行させるためには、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬を添加することが重要であると推測された。
また、工程１で処理した測定試料については、表３に示す全てのイオン性界面活性剤で判定部上にシグナルを確認することができた。特にジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、及び塩化ベンザルコニウムを使用した検体処理方法において高いシグナル強度を示すことが判明した。表３に示す通り、第一の試薬に非イオン性界面活性剤を使用した場合判定部上にシグナルを確認することができなかったことから、第一の試薬にイオン性界面活性剤を用いることが重要であると推測された。
〔実施例６：イオン性界面活性剤の使用濃度について〕
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における、イオン性界面活性剤の濃度の影響を検討した。第一の試薬中のイオン性界面活性剤の濃度を表４に示す濃度に変更した以外は、実施例５と同様の方法で測定を行った。
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における、イオン性界面活性剤の濃度の影響を検討した。第一の試薬中のイオン性界面活性剤の濃度を表４に示す濃度に変更した以外は、実施例５と同様の方法で測定を行った。
［結果］
表４に結果を示す。判定部上にシグナルが確認できなかったものを−とし、弱いシグナルを確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋、よりシグナルが強いものに関しては++とした。表４に示す全てのイオン性界面活性剤について、0.01〜0.1(w/v)%の濃度範囲において、判定部上にシグナルを確認することができた。
表４に結果を示す。判定部上にシグナルが確認できなかったものを−とし、弱いシグナルを確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋、よりシグナルが強いものに関しては++とした。表４に示す全てのイオン性界面活性剤について、0.01〜0.1(w/v)%の濃度範囲において、判定部上にシグナルを確認することができた。
〔実施例７：イオン性界面活性剤による抽出時間に関する検討〕
イオン性界面活性剤を添加後、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２を抽出するために必要な抽出時間に関して検討した。
イオン性界面活性剤を添加後、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２を抽出するために必要な抽出時間に関して検討した。
［第一の試薬の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表５に示す各イオン性界面活性剤
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表５に示す各イオン性界面活性剤
［第二の試薬の調製］
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
０．１５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２（ｗ／ｖ）％ ＢＳＡ（メルク社製）
０．０５（ｗ／ｖ）％ アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
３（ｗ／ｖ）％ ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
０．１５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２（ｗ／ｖ）％ ＢＳＡ（メルク社製）
０．０５（ｗ／ｖ）％ アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
３（ｗ／ｖ）％ ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
［陽性検体液の調製］
実施例１にて作成したBordetella pertussis試験菌液５μＬを、最終的な容量が１ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、陽性検体液を調製した。
実施例１にて作成したBordetella pertussis試験菌液５μＬを、最終的な容量が１ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、陽性検体液を調製した。
［測定試料の調製］
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、直ちに第二の試薬１５０μＬをさらに添加して混合したものと、１分間、２分間、５分間、１５分間静置したのち、第二の試薬１５０μＬをさらに添加して混合したものをそれぞれ測定試料とした。
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、直ちに第二の試薬１５０μＬをさらに添加して混合したものと、１分間、２分間、５分間、１５分間静置したのち、第二の試薬１５０μＬをさらに添加して混合したものをそれぞれ測定試料とした。
［測定］
各測定試料１２０μＬを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、１５分後に目視判定を行った。
各測定試料１２０μＬを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、１５分後に目視判定を行った。
［結果］
表５に結果を記載した。表５に示す通り、本発明の方法は抽出時間を必要とせず、イオン性界面活性剤を含む第一の試薬を添加後、ただちに抽出が可能であることが判明した。
表５に結果を記載した。表５に示す通り、本発明の方法は抽出時間を必要とせず、イオン性界面活性剤を含む第一の試薬を添加後、ただちに抽出が可能であることが判明した。
〔実施例８：免疫クロマトグラフィー法による百日咳菌の検出における非イオン性界面活性剤の効果〕
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における最適な界面活性剤を探索するために、非イオン性界面活性剤の性能を比較した。
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における最適な界面活性剤を探索するために、非イオン性界面活性剤の性能を比較した。
［第一の試薬の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表６に示す各イオン性界面活性剤
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表６に示す各イオン性界面活性剤
［第二の試薬の調製］
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
0.15M リン酸緩衝液（ｐH７．５）
2(w/v)% BSA（メルク社製）
0.05(w/v)% アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
3(w/v)% 表６に示す各非イオン性界面活性剤
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
0.15M リン酸緩衝液（ｐH７．５）
2(w/v)% BSA（メルク社製）
0.05(w/v)% アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
3(w/v)% 表６に示す各非イオン性界面活性剤
［陽性検体液の調製］
実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液２０μＬを、最終的な容量が1mLになるようにPBSで希釈し、陽性検体液を調製した。
実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液２０μＬを、最終的な容量が1mLになるようにPBSで希釈し、陽性検体液を調製した。
［測定試料の調製］
陽性検体液20μLを第一の試薬300μLに添加し混合後、第二の試薬150μLをさらに添加して混合したものを測定試料とした。
陽性検体液20μLを第一の試薬300μLに添加し混合後、第二の試薬150μLをさらに添加して混合したものを測定試料とした。
［測定］
各測定試料120μLを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、15分後に目視判定を行った。
各測定試料120μLを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、15分後に目視判定を行った。
［結果］
表６に結果を記載した。判定部上に弱いシグナルが確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが強くなるに従い++、+++とした。表６には非イオン性界面活性剤のHLB値も併せて示す。
表６に結果を記載した。判定部上に弱いシグナルが確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが強くなるに従い++、+++とした。表６には非イオン性界面活性剤のHLB値も併せて示す。
表６に示すように、HLB値10〜18.5の非イオン性界面活性剤のいずれかを第二の試薬として用いることで、判定部上にシグナルを確認することができた。
〔実施例９：非イオン性界面活性剤の使用濃度について〕
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における、非イオン性界面活性剤の濃度の影響について調査した。第二の試薬中に含まれる非イオン性界面活性剤の濃度を表７に示すとおりに変更した以外は、実施例８と同様にして測定を行った。
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における、非イオン性界面活性剤の濃度の影響について調査した。第二の試薬中に含まれる非イオン性界面活性剤の濃度を表７に示すとおりに変更した以外は、実施例８と同様にして測定を行った。
［結果］
表７に結果を示す。判定部上に弱いシグナルが確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが強くなるに従い++、+++とした。
表７に結果を示す。判定部上に弱いシグナルが確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが強くなるに従い++、+++とした。
表７から明らかな通り、HLB値が10〜18.5の範囲にある非イオン性界面活性剤について、0.5〜3(w/v)%の濃度範囲において、判定部上にシグナルを確認することができた。また、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートについては、確認したいずれの濃度においても判定部上にシグナルを確認することができたが、特に０．５〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲において強いシグナルを確認できた。
〔実施例１０：免疫クロマトグラフィー法による呼吸器感染症起因菌の検出〕
呼吸器感染症の起因菌となるBordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii 、又はLegionella pneumophilaについて、それぞれのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置を用いて、最適なイオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の組み合わせにてそれぞれの抗原が検出可能であるか否かを検証した。
呼吸器感染症の起因菌となるBordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella holmesii 、又はLegionella pneumophilaについて、それぞれのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置を用いて、最適なイオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の組み合わせにてそれぞれの抗原が検出可能であるか否かを検証した。
［第一の試薬の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表８に示す各イオン性界面活性剤
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表８に示す各イオン性界面活性剤
［第二の試薬の調製］
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
0.15M リン酸緩衝液（ｐH７．５）
2(w/v)% BSA（メルク社製）
0.05(w/v)% アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
3(w/v)% ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
0.15M リン酸緩衝液（ｐH７．５）
2(w/v)% BSA（メルク社製）
0.05(w/v)% アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
3(w/v)% ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
［陽性検体液の調製］
（Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii の陽性検体液の調製）
実施例1にて作成したBordetella pertussis、Bordetella parapertussis、又はBordetella holmesii の試験菌液５μＬを最終的な容量が1mLになるようにPBS（富士フイルム和光純薬社製）で希釈し、各菌について陽性検体液を調製した。
（Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii の陽性検体液の調製）
実施例1にて作成したBordetella pertussis、Bordetella parapertussis、又はBordetella holmesii の試験菌液５μＬを最終的な容量が1mLになるようにPBS（富士フイルム和光純薬社製）で希釈し、各菌について陽性検体液を調製した。
（Legionella pneumophilaの陽性検体液の調製）
実施例1にて作成したLegionella pneumophilaの試験菌液１０μＬを最終的な容量が1mLになるように生理食塩水(日本薬局方生理食塩液)で希釈し、陽性検体液を調製した。
実施例1にて作成したLegionella pneumophilaの試験菌液１０μＬを最終的な容量が1mLになるように生理食塩水(日本薬局方生理食塩液)で希釈し、陽性検体液を調製した。
［測定試料の調製］
（Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii の測定試料の調製）
陽性検体液を、下記の工程１又は２のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
≪工程１：検体を第一の試薬で処理した後に第二の試薬を添加する工程≫
陽性検体液20μLを第一の試薬300μLに添加し、混合後第二の試薬150μLをさらに添加して混合したものを工程１の測定試料とした。
≪工程２：検体を第一の試薬と第二の試薬の混合溶液で処理する工程≫
第一の試薬300μLと第二の試薬150μLを混合し混合溶液を調製し、混合溶液に対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程２の測定試料とした。
（Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii の測定試料の調製）
陽性検体液を、下記の工程１又は２のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
≪工程１：検体を第一の試薬で処理した後に第二の試薬を添加する工程≫
陽性検体液20μLを第一の試薬300μLに添加し、混合後第二の試薬150μLをさらに添加して混合したものを工程１の測定試料とした。
≪工程２：検体を第一の試薬と第二の試薬の混合溶液で処理する工程≫
第一の試薬300μLと第二の試薬150μLを混合し混合溶液を調製し、混合溶液に対して陽性検体液20μLを添加して混合したものを工程２の測定試料とした。
（Legionella pneumophilaの測定試料の調製）
使用する陽性検体液の量を３μL、第一の試薬を100μL、第二の試薬を50μLとした以外は、上述のBordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii の測定試料の調製と同様の方法で、工程１又は２のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
使用する陽性検体液の量を３μL、第一の試薬を100μL、第二の試薬を50μLとした以外は、上述のBordetella pertussis、Bordetella parapertussis、及びBordetella holmesii の測定試料の調製と同様の方法で、工程１又は２のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
［測定］
各測定試料120μLを各菌用の免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、１５分後に目視判定を行った。判定部上にシグナルを確認できなかったものを―、シグナルを確認できたものを＋とし、よりシグナルが強いものに関しては++とした。
各測定試料120μLを各菌用の免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、１５分後に目視判定を行った。判定部上にシグナルを確認できなかったものを―、シグナルを確認できたものを＋とし、よりシグナルが強いものに関しては++とした。
［結果］
表８に結果を記載した。表８から明らかなように、本発明の方法によって、全ての呼吸器感染症起因菌を検出することができた。またBordetella pertussis に関しては、実施例１のBordetella pertussis (ATCC No. BAA-589)と同様に試験菌液を調製したATCC No. 8467、 9797、及び 9340株についても同様に検出できた。
表８に結果を記載した。表８から明らかなように、本発明の方法によって、全ての呼吸器感染症起因菌を検出することができた。またBordetella pertussis に関しては、実施例１のBordetella pertussis (ATCC No. BAA-589)と同様に試験菌液を調製したATCC No. 8467、 9797、及び 9340株についても同様に検出できた。
〔実施例１１：呼吸器感染症状を呈する患者から採取した検体を用いた免疫クロマトグラフィー法による百日咳感染症の診断〕
［検体の採取］
呼吸器感染症状を呈する患者から検体を採取した。鼻腔ぬぐい液は滅菌綿棒を患者の鼻腔から挿入し、鼻腔の奥に到達したところで綿棒を回転させて採取した。
［検体の採取］
呼吸器感染症状を呈する患者から検体を採取した。鼻腔ぬぐい液は滅菌綿棒を患者の鼻腔から挿入し、鼻腔の奥に到達したところで綿棒を回転させて採取した。
［測定試料の調製］
ポリエチレン製のチューブの中に0.03(w/v)% オスモリンＤＡ−５０（三洋化成工業社製）を含む第一の試薬300μLを入れ、この中に検体を採取した綿棒を差し込んで、チューブの外側から５〜２０回よく揉んだ後、綿棒を取り出した。ここに0.15M リン酸緩衝液(pH7.5)、2(w/v)%BSA（メルク社製）、0.05(w/v)%アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）、3(w/v)% ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）を含む第二の試薬150μLを添加した。得られた溶液を測定試料とした。
ポリエチレン製のチューブの中に0.03(w/v)% オスモリンＤＡ−５０（三洋化成工業社製）を含む第一の試薬300μLを入れ、この中に検体を採取した綿棒を差し込んで、チューブの外側から５〜２０回よく揉んだ後、綿棒を取り出した。ここに0.15M リン酸緩衝液(pH7.5)、2(w/v)%BSA（メルク社製）、0.05(w/v)%アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）、3(w/v)% ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）を含む第二の試薬150μLを添加した。得られた溶液を測定試料とした。
［免疫クロマトグラフィー装置での測定］
測定試料が入ったポリエチレン製チューブに、PVAフィルターを備えた滴下ノズルを装着して、免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材に測定試料４滴（容量としておおよそ120μL）を滴下した。15分後に目視で判定を行った。
測定試料が入ったポリエチレン製チューブに、PVAフィルターを備えた滴下ノズルを装着して、免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材に測定試料４滴（容量としておおよそ120μL）を滴下した。15分後に目視で判定を行った。
［測定試料の残液を用いたＰＣＲ］
測定試料からDNAを抽出し、Bordetella pertussisのIS481を標的としたプライマーを用いたPCRを行い、IS481のコピー数を定量化した。手順を下記に示す。
DNAの抽出にはQIAamp DNA Micro kit（QIAGEN社）を用いた。抽出・精製の手順はキット付属のプロトコールに従って行った。得られたDNA抽出液をテンプレートとしてPCRを行った。PCRの条件は、国立感染症研究所. 病原体検査マニュアル 百日咳. 2011年10月.を参考にした。
測定試料からDNAを抽出し、Bordetella pertussisのIS481を標的としたプライマーを用いたPCRを行い、IS481のコピー数を定量化した。手順を下記に示す。
DNAの抽出にはQIAamp DNA Micro kit（QIAGEN社）を用いた。抽出・精製の手順はキット付属のプロトコールに従って行った。得られたDNA抽出液をテンプレートとしてPCRを行った。PCRの条件は、国立感染症研究所. 病原体検査マニュアル 百日咳. 2011年10月.を参考にした。
［結果］
免疫クロマトグラフィー装置での目視判定の結果と、PCRの結果を表９、表１０に示す。表９に示すとおり、測定試料を用いたPCR法を標準とした場合、免疫クロマトグラフィー装置での目視判定の結果は、感度85.7%（12/14）、特異度92.8%（141/152）であった。呼吸器感染症状を呈する患者から採取した鼻腔ぬぐい液を用いた場合でも本処理方法を用いることで、百日咳菌感染症患者を検出することができた。表１０にPCR法で陽性となった測定試料に含まれるIS481のコピー数と目視判定の結果を示す。表１０から明らかなとおり、IS481のコピー数が8.9×105（copies/swab）以上で含まれる測定試料について、目視判定において、すべて陽性と判定することができた。
免疫クロマトグラフィー装置での目視判定の結果と、PCRの結果を表９、表１０に示す。表９に示すとおり、測定試料を用いたPCR法を標準とした場合、免疫クロマトグラフィー装置での目視判定の結果は、感度85.7%（12/14）、特異度92.8%（141/152）であった。呼吸器感染症状を呈する患者から採取した鼻腔ぬぐい液を用いた場合でも本処理方法を用いることで、百日咳菌感染症患者を検出することができた。表１０にPCR法で陽性となった測定試料に含まれるIS481のコピー数と目視判定の結果を示す。表１０から明らかなとおり、IS481のコピー数が8.9×105（copies/swab）以上で含まれる測定試料について、目視判定において、すべて陽性と判定することができた。
〔実施例１２：酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によるBordetella pertussis菌の各種抗原の検出〕
本検体処理方法を用いてBordetella pertussisに含まれるRibosomal Protein L7/L12、リポ多糖（LPS）、及び百日咳菌毒素（PT）を検出可能か否かを調べた。
本検体処理方法を用いてBordetella pertussisに含まれるRibosomal Protein L7/L12、リポ多糖（LPS）、及び百日咳菌毒素（PT）を検出可能か否かを調べた。
[検出用抗体のペルオキシダーゼ標識工程]
以下記載の検出に用いるペルオキシダーゼ標識抗体は、Peroxidase Labeling Kit-NH2 (同仁化学社製)を用いて作製した。ペルオキシダーゼ標識を行う抗体としては、ＢＰＲＢ−７抗体、又はモノクローナル抗体（Bordetella pertussis LOS-A Monoclonal Antibody（D26E）、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製）を使用し、標識の手順はキット付属のプロトコールに従って行った。
以下記載の検出に用いるペルオキシダーゼ標識抗体は、Peroxidase Labeling Kit-NH2 (同仁化学社製)を用いて作製した。ペルオキシダーゼ標識を行う抗体としては、ＢＰＲＢ−７抗体、又はモノクローナル抗体（Bordetella pertussis LOS-A Monoclonal Antibody（D26E）、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製）を使用し、標識の手順はキット付属のプロトコールに従って行った。
[検出工程]
(1)Ribosomal Protein L7/L12の検出
実施例２で作製した2.5μg/mLのＢＰＲＢ−５抗体とPBS溶液50μLを96穴ELISAプレート（Nunc社MaxiSorp ELISAプレート）に分注し4℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%BSA溶液（PBS中）200μLを添加し、室温で2時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.05％Tween20、PBS）で数回洗浄した。ＰＢＳ（コントロール用）又は実施例1にて作成したBordetella pertussisの試験菌液（本試験用）を表１１に記載の溶液で処理したものを50μL添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、ペルオキシダーゼ標識したＢＰＲＢ−７抗体を0.05% Tween20、PBSにて最終濃度2μg/mLになるように希釈してそれぞれ50μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μLずつ加え室温で10分間反応させた後１Ｎの 塩酸を100μL添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定した。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図１に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図２に示す。
(1)Ribosomal Protein L7/L12の検出
実施例２で作製した2.5μg/mLのＢＰＲＢ−５抗体とPBS溶液50μLを96穴ELISAプレート（Nunc社MaxiSorp ELISAプレート）に分注し4℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%BSA溶液（PBS中）200μLを添加し、室温で2時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.05％Tween20、PBS）で数回洗浄した。ＰＢＳ（コントロール用）又は実施例1にて作成したBordetella pertussisの試験菌液（本試験用）を表１１に記載の溶液で処理したものを50μL添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、ペルオキシダーゼ標識したＢＰＲＢ−７抗体を0.05% Tween20、PBSにて最終濃度2μg/mLになるように希釈してそれぞれ50μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μLずつ加え室温で10分間反応させた後１Ｎの 塩酸を100μL添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定した。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図１に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図２に示す。
(2)リポ多糖（LPS）の検出
抗体を30μg/mLのモノクローナル抗体（Bordetella pertussis LOS-A Monoclonal Antibody（D26E）、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製）、最終濃度5μg/mLのペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体（Bordetella pertussis LOS-A Monoclonal Antibody（D26E）、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製）を使用し、ブロッキングを5%スキムミルク溶液（PBS中）で実施したこと以外は、上記(1)と同様の手順で測定を行った。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図３に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図４に示す。
抗体を30μg/mLのモノクローナル抗体（Bordetella pertussis LOS-A Monoclonal Antibody（D26E）、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製）、最終濃度5μg/mLのペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体（Bordetella pertussis LOS-A Monoclonal Antibody（D26E）、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製）を使用し、ブロッキングを5%スキムミルク溶液（PBS中）で実施したこと以外は、上記(1)と同様の手順で測定を行った。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図３に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図４に示す。
(3)百日咳菌毒素（PT）の検出
2500倍希釈したポリクローナル抗体（Bordetella pertussis Toxin antibody、GeneTex社製）とPBS溶液50μLを96穴ELISAプレート（Nunc社MaxiSorp ELISAプレート）に分注し4℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%BSA溶液（PBS中）200μLを添加し、室温で2時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.05％Tween20、PBS）で数回洗浄した。ＰＢＳ（コントロール用）又は実施例1にて作成したBordetella pertussisの試験菌液（本試験用）を表１１に記載の溶液で処理したものを50μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後、モノクローナル抗体（Bordetella Pertussis Toxin antibody [1280/204]、GeneTex社製）を0.05% Tween20、PBSにて最終濃度2μg/mLになるように希釈してそれぞれ50μL添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体（Anti mouse IgG (Fc specific) Peroxidase, antibody (goat)、SIGMA-ALDRICH製）を0.05% Tween20、PBSにて4000倍希釈したものをそれぞれ50μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μLずつ加え室温10分間反応させた後１Ｎの塩酸を100μL添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定した。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図５に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図６に示す。
2500倍希釈したポリクローナル抗体（Bordetella pertussis Toxin antibody、GeneTex社製）とPBS溶液50μLを96穴ELISAプレート（Nunc社MaxiSorp ELISAプレート）に分注し4℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%BSA溶液（PBS中）200μLを添加し、室温で2時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.05％Tween20、PBS）で数回洗浄した。ＰＢＳ（コントロール用）又は実施例1にて作成したBordetella pertussisの試験菌液（本試験用）を表１１に記載の溶液で処理したものを50μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後、モノクローナル抗体（Bordetella Pertussis Toxin antibody [1280/204]、GeneTex社製）を0.05% Tween20、PBSにて最終濃度2μg/mLになるように希釈してそれぞれ50μL添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体（Anti mouse IgG (Fc specific) Peroxidase, antibody (goat)、SIGMA-ALDRICH製）を0.05% Tween20、PBSにて4000倍希釈したものをそれぞれ50μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μLずつ加え室温10分間反応させた後１Ｎの塩酸を100μL添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定した。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図５に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図６に示す。
［結果］
イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を用いた本検体処理方法（処理B、C、D）を用いることで、Bordetella pertussis由来のいずれの抗原も検出することができた。特に、Ribosomal Protein L7/L12や百日咳菌毒素（PT）など細菌の内部に含まれる抗原を検出する系においては、本処理方法は対照処理方法（処理A）、及び処理なしと比較して高い処理効果を示した。
イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を用いた本検体処理方法（処理B、C、D）を用いることで、Bordetella pertussis由来のいずれの抗原も検出することができた。特に、Ribosomal Protein L7/L12や百日咳菌毒素（PT）など細菌の内部に含まれる抗原を検出する系においては、本処理方法は対照処理方法（処理A）、及び処理なしと比較して高い処理効果を示した。
〔実施例１３：酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によるBordetella pertussis菌百日咳菌毒素(PT)の検出〕
本検体処理方法を用いてBordetella pertussisの菌体内部に含まれる百日咳菌毒素（PT）を検出可能か否かを調べた。使用するBordetella pertussisの試験菌液（本試験用）を実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液500μLを10℃、10,000rpmで10分間遠心し、上清を全て取り除き、500μLのPBS（富士フイルム和光純薬社製）で沈殿物を懸濁し調製したこと以外は、実施例１２に記載と同様の方法で実施した。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図７に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図８に示す。
本検体処理方法を用いてBordetella pertussisの菌体内部に含まれる百日咳菌毒素（PT）を検出可能か否かを調べた。使用するBordetella pertussisの試験菌液（本試験用）を実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液500μLを10℃、10,000rpmで10分間遠心し、上清を全て取り除き、500μLのPBS（富士フイルム和光純薬社製）で沈殿物を懸濁し調製したこと以外は、実施例１２に記載と同様の方法で実施した。処理なし、処理Ａと比較した処理Ｂの結果を図７に、処理なし、処理Ａと比較した処理Ｃ、及び処理Ｄの結果を図８に示す。
［結果］
イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を用いた本検体処理方法（処理B、C、D）を用いることで、Bordetella pertussis菌体内部に含まれている百日咳菌毒素（PT）を検出することができた。本処理方法は対照処理方法（処理A）、及び処理なしと比較して高い処理効果を示した。
イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を用いた本検体処理方法（処理B、C、D）を用いることで、Bordetella pertussis菌体内部に含まれている百日咳菌毒素（PT）を検出することができた。本処理方法は対照処理方法（処理A）、及び処理なしと比較して高い処理効果を示した。
〔実施例１４：第一の試薬と第二の試薬の混合方法について〕
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における、第一の試薬と第二の試薬の混合方法を検討した。
Bordetella pertussisのRibosomal Protein L7/L12検出免疫クロマトグラフィー装置における、第一の試薬と第二の試薬の混合方法を検討した。
[第一の試薬の調製]
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表１２に示す各イオン性界面活性剤
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、第一の試薬を調製した。
０．０３（ｗ／ｖ）％ 表１２に示す各イオン性界面活性剤
[第二の試薬の調製]
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
０．１５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２（ｗ／ｖ）％ ＢＳＡ（メルク社製）
０．０５（ｗ／ｖ）％ アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
３（ｗ／ｖ）％ ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
下記の組成となるように第二の試薬を調製した。
０．１５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２（ｗ／ｖ）％ ＢＳＡ（メルク社製）
０．０５（ｗ／ｖ）％ アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）
３（ｗ／ｖ）％ ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート（富士フイルム和光純薬社製）
［陽性検体液の調製］
実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液５μＬを、最終的な容量が１ｍＬになるようにPBS（富士フイルム和光純薬社製）で希釈し、陽性検体液を調製した。
実施例1にて作成したBordetella pertussis試験菌液５μＬを、最終的な容量が１ｍＬになるようにPBS（富士フイルム和光純薬社製）で希釈し、陽性検体液を調製した。
[測定試料の調製]
陽性検体液を、下記の工程１から３のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
陽性検体液を、下記の工程１から３のいずれかの工程で処理し、測定試料を調製した。
≪工程１：第二の試薬を溶液として混合する工程≫
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、第二の試薬１５０μＬをさらに添加して混合したものを工程１の測定試料とした。
測定に使用する免疫クロマトグラフィー装置は、実施例４と同様の方法で作製したものを使用した。
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、第二の試薬１５０μＬをさらに添加して混合したものを工程１の測定試料とした。
測定に使用する免疫クロマトグラフィー装置は、実施例４と同様の方法で作製したものを使用した。
≪工程２：第二の試薬を免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材に浸漬する工程≫
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、精製水を１５０μＬさらに添加して混合したものを工程２の測定試料とした。
第二の試薬を含む試料添加用部材は、１７ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに第二の試薬１．５ｍＬを浸漬せしめ、これを室温で真空乾燥させることにより作製した。工程２においては、この第二の試薬を含む試料添加用部材を使用するほかは実施例４と同様の方法で免疫クロマトグラフィー装置を作製した。
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、精製水を１５０μＬさらに添加して混合したものを工程２の測定試料とした。
第二の試薬を含む試料添加用部材は、１７ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに第二の試薬１．５ｍＬを浸漬せしめ、これを室温で真空乾燥させることにより作製した。工程２においては、この第二の試薬を含む試料添加用部材を使用するほかは実施例４と同様の方法で免疫クロマトグラフィー装置を作製した。
≪工程３：第二の試薬を免疫クロマトグラフィー装置の検体濾過部に浸漬する工程≫
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、精製水を１５０μＬさらに添加して混合し、第二の試薬を含む滴下ノズルを透過させたものを工程３の測定試料とした。
陽性検体液２０μＬを第一の試薬３００μＬに添加し混合後、精製水を１５０μＬさらに添加して混合し、第二の試薬を含む滴下ノズルを透過させたものを工程３の測定試料とした。
第二の試薬を含む滴下ノズルは、滴下ノズルに装着している直径７ｍｍのＰＶＡスポンジフィルターに第二の試薬０．１５ｍＬを含浸せしめ、作製した。
測定に使用する免疫クロマトグラフィー装置は、実施例４と同様の方法で作製したものを使用した。
測定に使用する免疫クロマトグラフィー装置は、実施例４と同様の方法で作製したものを使用した。
［測定］
各測定試料１２０μＬを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、１５分後に目視判定を行った。
各測定試料１２０μＬを免疫クロマトグラフィー装置の試料添加用部材上に滴下し、１５分後に目視判定を行った。
［結果］
表１２に結果を記載した。判定部上に弱いシグナルが確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋とし、より強いシグナルが確認できたものを++とした。
表１２に示すように、工程１、工程２、工程３のいずれの場合においても、判定部上にシグナルを確認することができた。
表１２に結果を記載した。判定部上に弱いシグナルが確認できたものを±、シグナルを確認できたものを＋とし、より強いシグナルが確認できたものを++とした。
表１２に示すように、工程１、工程２、工程３のいずれの場合においても、判定部上にシグナルを確認することができた。
本発明は、百日咳菌などによる呼吸器感染症の診断において利用することができる。
１ 基材
２ 標識抗体含浸部材
３ クロマト展開用膜担体
４ 吸収用部材
５ 試料添加用部材
６ 判定部、又は捕捉部位
２ 標識抗体含浸部材
３ クロマト展開用膜担体
４ 吸収用部材
５ 試料添加用部材
６ 判定部、又は捕捉部位
Claims (21)
- 検体に含まれる呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、
（ａ）該検体を、イオン性界面活性剤を含むがアルカリを含まない第一の試薬に接触させ、中間組成物を得る工程、
（ｂ）前記中間組成物を、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び
（ｃ）前記反応液を、前記起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程
を含む、方法。 - 前記起因菌が、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ホルメシイ（Bordetella holmesii）、及びレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載の方法。
- 検体に含まれるボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ホルメシイ（Bordetella holmesii）、及びレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）からなる群から選択されるいずれかの呼吸器感染症の起因菌を検出する方法であって、
（ａ）該検体を、イオン性界面活性剤を含む第一の試薬に接触させ、中間組成物を得る工程、
（ｂ）前記中間組成物を、非イオン性界面活性剤を含む第二の試薬に接触させ、反応液を得る工程、及び
（ｃ）前記反応液を、前記起因菌の抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該抗原を検出する検出工程
を含む、方法。 - イオン性界面活性剤が、陽イオン性界面活性剤である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 陽イオン性界面活性剤が、第４級アンモニウム塩である、請求項４に記載の方法。
- 第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペート、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択されるいずれかである、請求項５に記載の方法。
- 第４級アンモニウム塩が、ジデシルジメチルアンモニウムアジペートである、請求項５又は６に記載の方法。
- イオン性界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン性界面活性剤が、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、又はドデシル硫酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択されるいずれかである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、そのＨＬＢが１０．０〜１８．５である非イオン性界面活性剤である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、そのＨＬＢが１２．５〜１６．７である非イオン性界面活性剤である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（９）アルキル（ｓｅｃ−Ｃ１１−１５）エーテル、ｐ−第三級−オクチルフェノキシポリエチルアルコール、ポリオキシエチレン（１３）オレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、及びポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートからなる群から選択されるいずれかである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、ポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノラウラートである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二の試薬を浸漬させた試料添加用部材または滴下ノズルに備わっているフィルター中に、前記中間組成物を透過させることにより、前記中間組成物と第二の試薬を接触させる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が、リボソームタンパク質L7/L12である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記起因菌がBordetella属菌であって、前記抗原が、リボソームタンパク質L7/L12、リポ多糖、及び百日咳菌毒素からなる群から選択されるいずれかである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫測定法が、免疫クロマトグラフィーアッセイである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検体が、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、又は喀痰である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトの呼吸器感染症の診断又は診断の補助のための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法を実施するための、キット。
・イオン性界面活性剤を含む、第一の試薬
・非イオン性界面活性剤を含む、第二の試薬
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019125736 | 2019-07-05 | ||
| JP2019125736 | 2019-07-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021012197A true JP2021012197A (ja) | 2021-02-04 |
Family
ID=74226091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020115519A Pending JP2021012197A (ja) | 2019-07-05 | 2020-07-03 | 呼吸器感染症の起因菌を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2021012197A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022211084A1 (ja) * | 2021-04-01 | 2022-10-06 | 富士レビオ株式会社 | 生物学的サンプルの処理方法 |
-
2020
- 2020-07-03 JP JP2020115519A patent/JP2021012197A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022211084A1 (ja) * | 2021-04-01 | 2022-10-06 | 富士レビオ株式会社 | 生物学的サンプルの処理方法 |
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