JP2010154851A - タンパク質抽出薬剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 従来のタンパク質抽出薬剤よりも、さらに高いレベルの溶菌力を持ち、かつタンパク質を変性させずに抽出し、そのうえ、精製工程を簡略化できるタンパク質抽出薬剤を提供することを課題とする。
【解決手段】 微生物からタンパク質を抽出するための溶菌剤であって、対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢが９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）とを含有することを特徴とするタンパク質抽出薬剤、及び対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢが９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）との存在下で、微生物からタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【選択図】なし
【解決手段】 微生物からタンパク質を抽出するための溶菌剤であって、対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢが９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）とを含有することを特徴とするタンパク質抽出薬剤、及び対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢが９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）との存在下で、微生物からタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、微生物（タンパク質生産菌等）からタンパク質を抽出する際に使用されるタンパク質抽出薬剤及びこのタンパク質抽出薬剤を使用して製造するタンパク質の製造方法に関する。
微生物は、アミノ酸、タンパク質等の有用物質を生産するための宿主として広く利用されている。特に近年は、遺伝子工学技術を活用して、産業上有用なタンパク質の遺伝子を導入した形質転換された微生物を使用し、有用物質を効率的に製造する技術が知られるようになっている。
有用物質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌やシュードモナス属菌等のグラム陰性菌、バチルス属菌や乳酸菌等のグラム陽性菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等の酵母、アスペルギウス属やペニシリウム属等の糸状菌、ストレプトマイセス属やロドコッカス属等の放線菌を挙げることができる。
微生物を使用して有用物質を生産する場合に、タンパク質等の有用物質を精製する必要があるが、この精製における第１の段階は、有用物質を生産する微生物の細胞を溶解して、細胞成分を遊離させる段階である。
細胞の溶解方法には、物理的方法と化学的方法がある。このうち化学的細胞溶解法としては、界面活性剤を用いて細胞膜又は細胞壁の完全性を破壊する方法がある。
提案されている界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としては、糖鎖を有する非イオン性界面活性剤、アルキルアミンエチレンオキサイド付加物及びソルビタン脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物等がある。
イオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド及び塩化ベンザルコニウム等のカチオン性界面活性剤（例えば特許文献１）、ラウロイルザルコシネート等のアニオン性界面活性剤、コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）等の両性界面活性剤（例えば特許文献２、３）が提案されている。
しかしながら、従来の非イオン性界面活性剤を用いる方法では溶菌力が不十分であるため大量合成には適さず、また、従来のイオン性界面活性剤を用いた方法では抽出されたタンパク質等の有用物質が変性してしまい、３次元コンホメーションを崩してしまうという問題点がある。
このような問題を解決するために本発明者らは既に、特定のアニオンを対イオンに有するカチオン性界面活性剤を使用することで、タンパク質を変性させずにタンパク質を抽出する技術を見いだしている（例えば特許文献４）。
有用物質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌やシュードモナス属菌等のグラム陰性菌、バチルス属菌や乳酸菌等のグラム陽性菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等の酵母、アスペルギウス属やペニシリウム属等の糸状菌、ストレプトマイセス属やロドコッカス属等の放線菌を挙げることができる。
微生物を使用して有用物質を生産する場合に、タンパク質等の有用物質を精製する必要があるが、この精製における第１の段階は、有用物質を生産する微生物の細胞を溶解して、細胞成分を遊離させる段階である。
細胞の溶解方法には、物理的方法と化学的方法がある。このうち化学的細胞溶解法としては、界面活性剤を用いて細胞膜又は細胞壁の完全性を破壊する方法がある。
提案されている界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としては、糖鎖を有する非イオン性界面活性剤、アルキルアミンエチレンオキサイド付加物及びソルビタン脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物等がある。
イオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド及び塩化ベンザルコニウム等のカチオン性界面活性剤（例えば特許文献１）、ラウロイルザルコシネート等のアニオン性界面活性剤、コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）等の両性界面活性剤（例えば特許文献２、３）が提案されている。
しかしながら、従来の非イオン性界面活性剤を用いる方法では溶菌力が不十分であるため大量合成には適さず、また、従来のイオン性界面活性剤を用いた方法では抽出されたタンパク質等の有用物質が変性してしまい、３次元コンホメーションを崩してしまうという問題点がある。
このような問題を解決するために本発明者らは既に、特定のアニオンを対イオンに有するカチオン性界面活性剤を使用することで、タンパク質を変性させずにタンパク質を抽出する技術を見いだしている（例えば特許文献４）。
タンパク質の変性の低減に加えて、一方ではタンパク質の製造コストを低減する検討が活発に行われてきている。タンパク質製造工程にはさまざまな工程があり、これら一連の製造工程に長時間を要することが課題であり、製造現場では製造工程の短縮が望まれている。発明者らの製造工程の短縮検討の中で、上記のカチオン性界面活性剤では溶菌時間の大幅な短縮が実現できないことが判明している。
すなわち、高いレベルの溶菌力を持ち、かつタンパク質を変性させずに抽出でき、さらに溶菌時間を短縮できるタンパク質抽出薬剤を提供することが課題である。
すなわち、高いレベルの溶菌力を持ち、かつタンパク質を変性させずに抽出でき、さらに溶菌時間を短縮できるタンパク質抽出薬剤を提供することが課題である。
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、対イオンがカルボキシレートアニオンであるカチオン性界面活性剤とＨＬＢ値が９〜１３．５である非イオン性界面活性剤とを含むタンパク質抽出薬剤をタンパク質抽出工程において使用することにより、溶菌力が高く、タンパク質を変性させずに抽出でき、さらに、はるかに溶菌時間を短縮できることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明のタンパク質抽出薬剤は、微生物からタンパク質を抽出する薬剤であって、対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）とＨＬＢ値が９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）とを含むことを要旨とする。
また本発明のタンパク質の製造方法は、上記のタンパク質抽出薬剤を使用することを要旨とする。
すなわち本発明のタンパク質抽出薬剤は、微生物からタンパク質を抽出する薬剤であって、対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）とＨＬＢ値が９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）とを含むことを要旨とする。
また本発明のタンパク質の製造方法は、上記のタンパク質抽出薬剤を使用することを要旨とする。
本発明のタンパク質抽出薬剤は、微生物（特に大腸菌等のタンパク質生産菌）からタンパク質を抽出するためのタンパク質抽出薬剤として、従来の薬剤よりも溶菌力が高く、タンパク質を変性させない。
さらに本発明のタンパク質抽出薬剤を使用すると、従来よりもはるかに溶菌時間が短縮できる。
また、本発明のタンパク質の製造方法は、高品質のタンパク質（例えば、変性の程度が少なくて活性の高い酵素）を短時間で得ることができる。
さらに本発明のタンパク質抽出薬剤を使用すると、従来よりもはるかに溶菌時間が短縮できる。
また、本発明のタンパク質の製造方法は、高品質のタンパク質（例えば、変性の程度が少なくて活性の高い酵素）を短時間で得ることができる。
本発明のタンパク質抽出薬剤は、対イオンがカルボキシレートアニオンであるカチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢ値が９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）の２つを必須成分として含有する。
カチオン性界面活性剤（Ａ）中の対イオンは、カルボキシレートアニオンであり、１価カルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオン及び多価カルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンが含まれる。このカルボキシレートアニオンは、カルボン酸からプロトンを除いた−ＣＯＯ-基を有するイオンである。
カルボキシレートアニオンを構成するカルボン酸としては、以下の１価カルボン酸及び多価カルボン酸が挙げられる。
１価カルボン酸
脂肪族飽和モノカルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸及び２−エチルヘキサン酸等）；脂肪族不飽和モノカルボン酸（オレイン酸等）；脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸及びグルコン酸等）；アミノ酸（グリシン、アラニン及びロイシン等）；芳香族モノカルボン酸（安息香酸、サリチル酸等）等が挙げられる。
脂肪族飽和モノカルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸及び２−エチルヘキサン酸等）；脂肪族不飽和モノカルボン酸（オレイン酸等）；脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸及びグルコン酸等）；アミノ酸（グリシン、アラニン及びロイシン等）；芳香族モノカルボン酸（安息香酸、サリチル酸等）等が挙げられる。
多価カルボン酸
脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸及びセバシン酸等）；脂肪族オキシジカルボン酸（ｄ−酒石酸等）；アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸等）；脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸及びイタコン酸等）；芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸及びテレフタル酸等）；トリカルボン酸（トリメリット酸及びクエン酸等）；テトラカルボン酸（ピロメリット酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸及びエチレンジアミン四酢酸等）；ペンタカルボン酸（ジエチレントリアミン五酢酸等）等が挙げられる。
脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸及びセバシン酸等）；脂肪族オキシジカルボン酸（ｄ−酒石酸等）；アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸等）；脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸及びイタコン酸等）；芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸及びテレフタル酸等）；トリカルボン酸（トリメリット酸及びクエン酸等）；テトラカルボン酸（ピロメリット酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸及びエチレンジアミン四酢酸等）；ペンタカルボン酸（ジエチレントリアミン五酢酸等）等が挙げられる。
これらのうち、タンパク質の変性されにくさの観点から、多価カルボン酸が好ましく、さらに好ましくは２〜８価の多価カルボン酸、次にさらに好ましくは２〜５価の多価カルボン酸、特に好ましくはトリカルボン酸及びテトラカルボン酸、最も好ましくはテトラカルボン酸である。
カチオン性界面活性剤（Ａ）のカチオン部分としては以下の第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）及びアミン塩型カチオン（ｑ２）が挙げられる。
（Ａ）としては、溶菌力の観点から、このカチオン部分に疎水性基を有することが好ましい。
（Ａ）としては、溶菌力の観点から、このカチオン部分に疎水性基を有することが好ましい。
第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）としては、例えば、一般式（１）で示される化合物が挙げられる。
一般式（１）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、炭素数が１〜２２の直鎖又は分岐の１価の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６〜２２の１価の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
式中のＲ1〜Ｒ4で示される１価の炭化水素基としては、脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基が挙げられる。
脂肪族炭化水素基としては、直鎖又は分岐のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、ｉ−、ｓｅｃ−及びｔ−ブチル基、２−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、３−メチルブチル基並びに２−エチルヘキシル基等）及び直鎖又は分岐のアルケニル基（ビニル基、アリル基及びメタリル基等）が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、アリールアルキル基（ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基及びフェニルブチル基等）及びアルキルアリール基（メチルフェニル基、エチルフェニル基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、デシルフェニル基及びドデシルフェニル基等）が挙げられる。
Ｒ1〜Ｒ4の炭化水素基の好ましい組み合わせとしては、以下の（ｑ１１）〜（ｑ１４）が挙げられる。
（ｑ１１）Ｒ1〜Ｒ4の１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ドデシルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、オクタデシルジメチルエチルアンモニウム、ドデシルメチルジエチルアンモニウム、テトラデシルメチルジエチルアンモニウム、ヘキサデシルメチルジエチルアンモニウム及びオクタデシルメチルジエチルアンモニウム等。
（ｑ１１）Ｒ1〜Ｒ4の１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ドデシルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、オクタデシルジメチルエチルアンモニウム、ドデシルメチルジエチルアンモニウム、テトラデシルメチルジエチルアンモニウム、ヘキサデシルメチルジエチルアンモニウム及びオクタデシルメチルジエチルアンモニウム等。
（ｑ１２）Ｒ1〜Ｒ4の２個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
オクチルデシルジメチルアンモニウム、ジオクチルジメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、デシルドデシルジメチルアンモニウム、ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム、ジオクチルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルエチルアンモニウム、ジドデシルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルプロピルアンモニウム、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム及びジステアリルジメチルアンモニウム等。
オクチルデシルジメチルアンモニウム、ジオクチルジメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、デシルドデシルジメチルアンモニウム、ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム、ジオクチルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルエチルアンモニウム、ジドデシルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルプロピルアンモニウム、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム及びジステアリルジメチルアンモニウム等。
（ｑ１３）Ｒ1〜Ｒ4の１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、ベンジルトリプロピルアンモニウム及びベンジルエチルジメチルアンモニウム等。
ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、ベンジルトリプロピルアンモニウム及びベンジルエチルジメチルアンモニウム等。
（ｑ１４）Ｒ1〜Ｒ4の１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基、１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基かつ、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
デシルジメチルベンジルアンモニウム、ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルベンジルアンモニウム及びヤシ油アルキルジメチルベンジルアンモニウム等。
デシルジメチルベンジルアンモニウム、ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルベンジルアンモニウム及びヤシ油アルキルジメチルベンジルアンモニウム等。
これらの（ｑ１１）〜（ｑ１４）のうち、溶菌力の観点から、（ｑ１２）が好ましく、さらに好ましくはＲ1〜Ｒ4のうちの２個のみが炭素数８〜１４のアルキル基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基であるものであり、次にさらに好ましくはＲ1〜Ｒ4のうちの２個のみが炭素数８〜１０のアルキル基であって、他は炭素数１〜２のアルキル基であるものであり、特に好ましくはジデシルジメチルアンモニウム、ジオクチルジメチルアンモニウム及びジデシルメチルエチルアンモニウムである。
一方、アミン塩型カチオン（ｑ２）としては、１〜３級アミン塩型カチオンが挙げられる。なお、アミン塩型カチオンとは、アミンとプロトンから構成される１価のカチオンの意味であり、１級アミン塩型カチオンは１級アミンとプロトンから構成される１価のカチオン、２級アミン塩型カチオンは２級アミンとプロトンから構成される１価のカチオン、３級アミン塩型カチオンは３級アミンとプロトンから構成される１価のカチオンである。
１級アミン塩型カチオンを構成する１級アミンとしては、炭素数６〜１８のモノアルキル及び炭素数６〜１８のシクロアルキルアミン（モノヘキシルアミン、モノシクロヘキシルアミン、モノオクチルアミン及びモノドデシルアミン等）が挙げられる。
２級アミン塩型カチオンを構成する２級アミンとしては、少なくとも１個のアルキル基の炭素数が６〜１８のジアルキルアミン（ヘキシルメチルアミン、オクチルエチルアミン及びメチルドデシルアミン等）が挙げられる。
３級アミン塩型カチオンを構成する３級アミンとしては、少なくとも１個のアルキル基の炭素数が８〜１８のトリアルキルアミン（ジメチルドデシルアミン等）が挙げられる。
２級アミン塩型カチオンを構成する２級アミンとしては、少なくとも１個のアルキル基の炭素数が６〜１８のジアルキルアミン（ヘキシルメチルアミン、オクチルエチルアミン及びメチルドデシルアミン等）が挙げられる。
３級アミン塩型カチオンを構成する３級アミンとしては、少なくとも１個のアルキル基の炭素数が８〜１８のトリアルキルアミン（ジメチルドデシルアミン等）が挙げられる。
カチオン性界面活性剤（Ａ）のカチオン部分としては、溶菌力の観点から、第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）が好ましい。
カチオン性界面活性剤（Ａ）としては、タンパク質の変性されにくさの観点及び溶菌力の観点から、多価カルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンと第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）とからなるものが好ましく、さらに好ましくは２〜８価の多価カルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンと（ｑ１）とからなるもの、次にさらに好ましくはトリカルボン酸又はテトラカルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンと（ｑ１２）からなるもの、特に好ましくはテトラカルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンと（ｑ１２）とからなるもの、最も好ましくはブタンテトラカルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンとジデシルジメチルアンモニウムからなるもの及びシクロペンタンテトラカルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンとジデシルジメチルアンモニウムからなるものである。
また、２種以上の（Ａ）を併用してもよい。
カチオン性界面活性剤（Ａ）の製造方法は、例えば、以下の４つの方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）第４級アンモニウムカチオンのアルキル炭酸塩とカルボキシル基がアンモニウムと当量になるようにカルボン酸を加えて、６０〜１００℃で３〜２０時間撹拌して反応させて塩交換し、その後、必要により減圧条件下でメタノールと二酸化炭素を除去して精製する方法。アルキル炭酸塩のアルキル基は炭素数１〜４のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基が挙げられる。
（２）４級アンモニウムハロゲン化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、必要によりエタノール抽出等で精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アンモニウム塩及びアミン塩等が挙げられる。
（３）４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、必要により精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アンモニウム塩及びアミン塩等が挙げられる。
（４）４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸で中和し、その後、必要により精製する方法。
（１）第４級アンモニウムカチオンのアルキル炭酸塩とカルボキシル基がアンモニウムと当量になるようにカルボン酸を加えて、６０〜１００℃で３〜２０時間撹拌して反応させて塩交換し、その後、必要により減圧条件下でメタノールと二酸化炭素を除去して精製する方法。アルキル炭酸塩のアルキル基は炭素数１〜４のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基が挙げられる。
（２）４級アンモニウムハロゲン化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、必要によりエタノール抽出等で精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アンモニウム塩及びアミン塩等が挙げられる。
（３）４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、必要により精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アンモニウム塩及びアミン塩等が挙げられる。
（４）４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸で中和し、その後、必要により精製する方法。
本発明のカチオン性界面活性剤（Ａ）の添加量は、対象となる微生物、生産される有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、溶菌性及びタンパク質の変性のさせにくさの観点から、作用させる微生物懸濁液の重量に対して１００ｐｐｍ〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１重量％〜２重量％である。
本発明のもう１つの必須成分であるＨＬＢ値が９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）としては、高級アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ｂ１）、アルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物（Ｂ２）、脂肪酸アルキレンオキサイド付加物（Ｂ３）及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ４）が挙げられる。
ここでＨＬＢとは界面活性剤の親水性及び疎水性を示す尺度として用いられており、ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは一般式（１）で計算される数値である。（界面活性剤入門、１４２頁、藤本武彦著、三洋化成工業株式会社発行）
ＨＬＢ＝２０×｛親水基の分子量／界面活性剤の分子量｝ （１）
ここでＨＬＢとは界面活性剤の親水性及び疎水性を示す尺度として用いられており、ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは一般式（１）で計算される数値である。（界面活性剤入門、１４２頁、藤本武彦著、三洋化成工業株式会社発行）
ＨＬＢ＝２０×｛親水基の分子量／界面活性剤の分子量｝ （１）
（Ｂ１）高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）［例えば、デシルアルコールのＥＯ８モル／ＰＯ７モルブロック付加物］のうち、ＨＬＢが９〜１３．５のものが挙げられ、具体的にはラウリルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、オレイルアルコールＥＯ５モル付加物（ＨＬＢ＝９．０）、オレイルアルコールＥＯ６モル付加物（ＨＬＢ＝１０．２）、オレイルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１１．０）及びオレイルアルコールＥＯ１０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）等が挙げられる。
（Ｂ２）アルキルフェノールのＡＯ付加物としては、炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物のＨＬＢが９〜１３．５のものが挙げられ、具体的にはオクチルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物並びにノニルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物が挙げられる。入手しやすさの観点からＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＨＬＢ＝１３．５）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４（ＨＬＢ＝１２．４）、ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−５２０（ＨＬＢ＝１０．０）及びｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０（ＨＬＢ＝１３．０）等が挙げられる。
（Ｂ３）脂肪酸ＡＯ付加物としては、炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物のうち、ＨＬＢが９〜１３．５のものが挙げられ、具体的にはオレイン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．８）、ジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物（ＨＬＢ＝１０．４）、ジオレイン酸ＥＯ２０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．９）及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．９）等が挙げられる。
（Ｂ４）多価アルコール型非イオン性界面活性剤としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物；並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物；が挙げられ、具体的には、ソルビタンテトラオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１１．４）及びソルビタンヘキサオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１０．２）が挙げられる。
これらのうち、タンパク質の抽出効率の観点から（Ｂ１）、（Ｂ２）及び（Ｂ３）が好ましく、さらに好ましくは、ラウリルアルコールＥＯ７モル付加物、オレイルアルコールＥＯ５モル付加物、オレイルアルコールＥＯ６モル付加物、オレイルアルコールＥＯ７モル付加物、オレイルアルコールＥＯ１０モル付加物、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４、ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−５２０及びｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０、オレイン酸ＥＯ９モル付加物、ジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物、ジオレイン酸ＥＯ２０モル付加物及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物であり、次に好ましくはオレイルアルコールＥＯ７モル付加物、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００及びオレイン酸ＥＯ９モル付加物である。
また、２種以上の（Ｂ）を併用してもよい。
（Ｂ）の添加量は対象となる微生物、目的タンパク質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、タンパク質の抽出効率の観点から作用させる微生物懸濁液の重量に対し１００ｐｐｍ〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１重量％〜２重量％である。
本発明のタンパク質抽出薬剤における（Ａ）と（Ｂ）の重量比｛（Ａ）の重量／（Ｂ）の重量｝は、タンパク質の変性させにくさの観点から、０．０１〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２０である。
本発明のタンパク質抽出薬剤は、使用に当たっては、必須成分である上記のカチオン性界面活性剤（Ａ）及び非イオン性界面活性剤（Ｂ）をそのまま使用してもよいし、必要により水と混合して、水性希釈液（水溶液状又は水分散液状）として用いることができる。
水性希釈液における、（Ａ）及び（Ｂ）の合計濃度は、対象となる微生物、有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、溶菌性及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、０．０１〜９９重量％が好ましく、好ましくは０．１〜５０重量％である。
水性希釈液における、（Ａ）及び（Ｂ）の合計濃度は、対象となる微生物、有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、溶菌性及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、０．０１〜９９重量％が好ましく、好ましくは０．１〜５０重量％である。
本発明のタンパク質抽出薬剤は、カチオン性界面活性剤（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）とを混合することで容易に製造できる。
本発明のタンパク質の製造方法は、微生物からタンパク質を抽出する工程において、対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢが９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）とを含むタンパク質抽出薬剤を使用するタンパク質の製造方法である。
微生物は、アミノ酸及びタンパク質等の有用物質を生産するための宿主として利用されるものであれば、特に制限は無い。
タンパク質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌、シュードモナス属菌等のグラム陰性菌、バチルス属菌、乳酸菌等のグラム陽性菌、サッカロマイセス属、キャンディダ属等の酵母、アスペルギウス属、ペニシリウム属等の糸状菌、ストレプトマイセス属、ロドコッカス属等の放線菌、後述するタンパク質生産体等を挙げることができる。
タンパク質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌、シュードモナス属菌等のグラム陰性菌、バチルス属菌、乳酸菌等のグラム陽性菌、サッカロマイセス属、キャンディダ属等の酵母、アスペルギウス属、ペニシリウム属等の糸状菌、ストレプトマイセス属、ロドコッカス属等の放線菌、後述するタンパク質生産体等を挙げることができる。
本発明の製造方法においては、カチオン性界面活性剤（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）との存在下で微生物からタンパク質を抽出すればよく、（Ａ）と（Ｂ）とを含有する本発明のタンパク質抽出薬剤を微生物に添加しても、（Ａ）と（Ｂ）を別々に微生物に添加｛（Ａ）若しくは（Ａ）を含む水性希釈液を微生物に添加し、その後（Ｂ）若しくは（Ｂ）を含む水性希釈液を添加する、又は（Ｂ）若しくは（Ｂ）を含む水性希釈液を微生物に添加し、その後（Ａ）若しくは（Ａ）を含む水性希釈液を添加する｝してもどちらでも良く、作業性の観点から（Ａ）と（Ｂ）とを含有する本発明のタンパク質抽出薬剤を添加する方法が好ましい。
本発明のタンパク質の生産方法において、カチオン性界面活性剤（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）との存在下で行う微生物の処理に当たっては、必須成分である上記のカチオン性界面活性剤（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）以外に、本発明の効果を阻害しない範囲において、必要によりさらに、有機溶剤（Ｃ）、他の界面活性剤（Ｄ）及び／又は溶解性安定化剤（Ｅ）の存在下で行ってもよい。これら（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）は、これらの一部又は全部を（Ａ）及び／又は（Ｂ）に予め含有させていてもよいし、微生物の処理時に別途これらを適宜配合して添加して使用してもよい。
有機溶剤（Ｃ）は、カチオン性界面活性剤（Ａ）の水への溶解性を上げるため、必要により加える、水と相溶性のある有機溶剤である。
ここで、水と相溶性のある有機溶剤とは、分配係数ｌｏｇＰｏｗが２以下である有機溶剤であり、具体的には、脂肪族アルコール（メタノール及びエタノール等）、ケトン（アセトン及びメチルエチルケトン等）及びカルボン酸エステル（酢酸エチル、酢酸プロピル及びギ酸メチル等）等が挙げられる。
有機溶剤（Ｃ）の使用量（重量％）は、（Ａ）と（Ｂ）との合計重量に基づいて、好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下、特に好ましくは３以下である。
ここで、水と相溶性のある有機溶剤とは、分配係数ｌｏｇＰｏｗが２以下である有機溶剤であり、具体的には、脂肪族アルコール（メタノール及びエタノール等）、ケトン（アセトン及びメチルエチルケトン等）及びカルボン酸エステル（酢酸エチル、酢酸プロピル及びギ酸メチル等）等が挙げられる。
有機溶剤（Ｃ）の使用量（重量％）は、（Ａ）と（Ｂ）との合計重量に基づいて、好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下、特に好ましくは３以下である。
他の界面活性剤（Ｄ）は、本発明の生産方法において、溶菌性をさらに上げるために、必須成分のカチオン性界面活性剤（Ａ）とＨＬＢが９〜１３．５の非イオン性界面活性剤（Ｂ）以外に使用する、他の界面活性剤である。
この目的で使用する他の界面活性剤（Ｄ）としては、（Ｂ）以外の非イオン性界面活性剤（Ｄ１）、（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｄ２）、アニオン性界面活性剤（Ｄ３）、及び両性界面活性剤（Ｄ４）からなる群から選ばれる１種以上が挙げられる。
この目的で使用する他の界面活性剤（Ｄ）としては、（Ｂ）以外の非イオン性界面活性剤（Ｄ１）、（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｄ２）、アニオン性界面活性剤（Ｄ３）、及び両性界面活性剤（Ｄ４）からなる群から選ばれる１種以上が挙げられる。
非イオン性界面活性剤（Ｄ１）としては、以下の（Ｄ１１）〜（Ｄ１５）が挙げられる。
（Ｄ１１）高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物：
炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
（Ｄ１１）高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物：
炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
（Ｄ１２）炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物：
オクチル又はノニルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
オクチル又はノニルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
（Ｄ１３）ポリプロピレングリコールＥＯ付加物及びポリエチレングリコールＰＯ付加物：プルロニック型界面活性剤等が挙げられる。
（Ｄ１４）脂肪酸ＡＯ付加物：
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物等のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物等のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
（Ｄ１５）多価アルコール型非イオン性界面活性剤：
炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等）；アルキルグルコシド（Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等）；並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド等）；のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等）；アルキルグルコシド（Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等）；並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド等）；のうち（Ｂ）に含まれないものが挙げられる。
（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｄ２）としては、対イオンとしてハロゲンアニオン、ヒドロキシアニオン、アルキル硫酸アニオン及び超強酸アニオンからなる群より選ばれる少なくとも１種の対イオンを有するカチオン性界面活性剤が挙げられる。
ハロゲンアニオンとしては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等、アルキル硫酸アニオンとしてはメチル硫酸イオン、エチル硫酸イオン等、超強酸アニオンとしてはテトラフルオロホウ素酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン等が挙げられる。
なお、（Ｄ２）を構成するカチオン部分は、（Ａ）で挙げたものと同様のカチオン部分が挙げられる。
（Ｄ２）の具体例として、塩化ベンザルコニウム及び臭化セチルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。
ハロゲンアニオンとしては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等、アルキル硫酸アニオンとしてはメチル硫酸イオン、エチル硫酸イオン等、超強酸アニオンとしてはテトラフルオロホウ素酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン等が挙げられる。
なお、（Ｄ２）を構成するカチオン部分は、（Ａ）で挙げたものと同様のカチオン部分が挙げられる。
（Ｄ２）の具体例として、塩化ベンザルコニウム及び臭化セチルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。
アニオン性界面活性剤（Ｄ３）としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有するエーテルカルボン酸及びその塩、硫酸エステル及びエーテル硫酸エステル及びそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、リン酸エステル及びエーテルリン酸エステル及びそれらの塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩並びに天然由来のカルボン酸及びその塩（ケノデオキシコール酸、コール酸及びデオキシコール酸等）が挙げられる。
両性界面活性剤（Ｄ４）としては、ベタイン型両性界面活性剤及びアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
具体的には、アミドスルホベタイン、コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、カルボキシベタイン、ラウロイルサルコシン及びメチルベタインが挙げられる。
具体的には、アミドスルホベタイン、コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、カルボキシベタイン、ラウロイルサルコシン及びメチルベタインが挙げられる。
これらの他の界面活性剤（Ｄ）のうち、必須成分のカチオン性界面活性剤（Ａ）と併用して溶菌性が向上する点で好ましいのは、非イオン性界面活性剤（Ｄ１）である。さらに多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｄ１５）が好ましく、多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物が特に好ましく、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０が最も好ましい。
他の界面活性剤（Ｄ）の使用量（重量％）は、タンパク質の変性されにくさの観点から、（Ａ）と（Ｂ）の合計重量に基づいて、６０以下が好ましく、さらに好ましくは５０以下、特に好ましくは４０以下である。
溶解性安定化剤（Ｅ）としてはキレート剤、有機酸及びその塩、多価アルコールが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、ポリリン酸及びその塩、メタリン酸及びその塩があげられる。
有機酸及びその塩としては、乳酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩等が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩が挙げられ、入手のしやすさの観点でナトリウム塩が好ましい。
多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ペンタエリスリトール、キシリトール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコール等があげられる。
これらの中で、（Ａ）の水への溶解性の向上の観点から、多価アルコールが好ましく、さらに好ましくはグリセリンである。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、ポリリン酸及びその塩、メタリン酸及びその塩があげられる。
有機酸及びその塩としては、乳酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩等が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩が挙げられ、入手のしやすさの観点でナトリウム塩が好ましい。
多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ペンタエリスリトール、キシリトール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコール等があげられる。
これらの中で、（Ａ）の水への溶解性の向上の観点から、多価アルコールが好ましく、さらに好ましくはグリセリンである。
本発明のタンパク質の生産方法における各成分の重量比｛（Ａ）／（Ｂ）／（Ｃ）／（Ｄ）／（Ｅ）｝は、タンパク質の変性のしにくさの観点から、２０〜９９／１〜１０／０〜１０／０〜６０／０〜６０が好ましく、さらに好ましくは２５〜９９／１〜１０／０〜５／０〜５０／０〜５０である。
下記にタンパク質の生産方法の一例を示す。この例において、本発明のタンパク質の生産方法におけるタンパク質抽出薬剤を使用する工程は、下記の工程中（ｉｉ）である。
（ｉ）微生物の培養
微生物の培養は一般的な方法と同様で、例えば大腸菌を培地中（ＬＢ培地等）で３７℃で振とう培養し、ＯＤ600が２〜３程度になるまでおこなう。
（ｉｉ）タンパク質抽出剤を作用させる
（ｉ）の大腸菌懸濁液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、集菌する。集菌後の大腸菌にタンパク質抽出剤を所定量加え、常温で振とう又は撹拌して溶菌する。
（ｉｉｉ）分離精製
分離精製は一般的な方法と同様で、（ｉｉ）の溶液を例えば遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した後に、適宜イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、アフィニティカラム等を使用して目的タンパク質を精製する。
（ｉ）微生物の培養
微生物の培養は一般的な方法と同様で、例えば大腸菌を培地中（ＬＢ培地等）で３７℃で振とう培養し、ＯＤ600が２〜３程度になるまでおこなう。
（ｉｉ）タンパク質抽出剤を作用させる
（ｉ）の大腸菌懸濁液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、集菌する。集菌後の大腸菌にタンパク質抽出剤を所定量加え、常温で振とう又は撹拌して溶菌する。
（ｉｉｉ）分離精製
分離精製は一般的な方法と同様で、（ｉｉ）の溶液を例えば遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した後に、適宜イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、アフィニティカラム等を使用して目的タンパク質を精製する。
本発明のタンパク質の製造方法において、微生物からタンパク質を抽出する際、前記のタンパク質抽出薬剤を使用した後に、さらに加水分解酵素を使用することが溶菌性の観点から好ましい。
加水分解酵素としては、ペプチドグリカンを分解する酵素及びリン脂質を分解する酵素が挙げられる。
ペプチドグリカンを分解する酵素としては、細胞壁を分解する酵素であれば特に限定するものではないが、タンパク質の抽出率の観点でリゾチームが好ましい。
リゾチームとして具体的には、ニワトリ卵白リゾチーム及びヒトリゾチーム等が挙げられ、入手のしやすさの観点で、ニワトリ卵白リゾチームが好ましい。
リゾチームとして具体的には、ニワトリ卵白リゾチーム及びヒトリゾチーム等が挙げられ、入手のしやすさの観点で、ニワトリ卵白リゾチームが好ましい。
リン脂質を分解する酵素としては、リン脂質を分解する酵素であれば特に限定するものではないが、タンパク質の抽出の観点でホスホリパーゼが好ましい。
ホスホリパーゼとして具体的には、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ及びホスホリパーゼＤ等が挙げられ、入手のしやすさの観点で、ホスホリパーゼＡ２が好ましい。
ホスホリパーゼとして具体的には、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ及びホスホリパーゼＤ等が挙げられ、入手のしやすさの観点で、ホスホリパーゼＡ２が好ましい。
加水分解酵素の添加量は、溶菌性の観点から微生物懸濁液に対して０．０１〜５．０ｍｇ／ｍＬが好ましく、次に好ましくは０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬである。加水分解酵素は粉末で添加しても水等の適当な希釈溶媒で希釈した溶液で添加しても良いが、ハンドリング性の観点から水で希釈した水溶液で添加するのが好ましい。
加水分解酵素を使用する場合は、タンパク質抽出剤を作用させる工程（上記では（ｉｉ）の工程）が終了した後に使用することが溶菌性の観点から好ましい。具体的には、タンパク質抽出剤を作用させる工程（上記では（ｉｉ）の工程）が終了した液に対し、加水分解酵素を所定量加え、２５℃〜３７℃で３０分〜３時間、振とう又は軽く撹拌をおこなうことが好ましい。加水分解酵素で処理した液は通常通り上記（ｉｉｉ）の様に分離精製をおこなう。
本発明の製造方法は、例えば、目的タンパク質が組み換えタンパク質の場合は、以下のような順序の工程による生産方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：
大腸菌等の微生物を培養し、組み換えタンパク質を発現させる。
（２）タンパク質の取り出し工程：
カチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢが９〜１３．５の非イオン性界面活性剤（Ｂ）との存在下で、タンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。必要に応じ、加水分解酵素を添加して効率よくタンパク質の抽出をおこなう。
（３）アンフォールディング工程：
インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：
アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるようにリフォールディング剤を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置する。又はまたはリフォールディングバッファーで大希釈することによりリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：
懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィー等によって分離して取り出す。
（１）タンパク質の培養工程：
大腸菌等の微生物を培養し、組み換えタンパク質を発現させる。
（２）タンパク質の取り出し工程：
カチオン性界面活性剤（Ａ）と、ＨＬＢが９〜１３．５の非イオン性界面活性剤（Ｂ）との存在下で、タンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。必要に応じ、加水分解酵素を添加して効率よくタンパク質の抽出をおこなう。
（３）アンフォールディング工程：
インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：
アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるようにリフォールディング剤を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置する。又はまたはリフォールディングバッファーで大希釈することによりリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：
懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィー等によって分離して取り出す。
本発明で使用できる微生物としては、以下の細菌細胞等が挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞等が挙げられる。真菌細胞としては、酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞等が挙げられる。昆虫細胞としては、ドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）及びスポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞等が挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞等が挙げられる。真菌細胞としては、酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞等が挙げられる。昆虫細胞としては、ドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）及びスポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の具体例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕等が挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の具体例としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕等が挙げられる。
組み換えタンパク質の生産方法としては、具体的に次の方法がある。
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージ又はプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージ又はプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
上記の（２）のタンパク質の取り出し工程では、例えば大腸菌の場合、本発明の製造方法を用いて、外膜のリン脂質層や内膜のペプチドグリカン層を溶解する又は一部破壊することによって菌体内に生産されたインクルージョンボディを取り出す。
この工程の処理条件としては、公知の溶菌剤の処理条件（特開２００６−３２０３１３号公報等）が適用でき、タンパク質の変性防止の観点から、温度は４０℃以下で行うことが好ましい。
この工程の処理条件としては、公知の溶菌剤の処理条件（特開２００６−３２０３１３号公報等）が適用でき、タンパク質の変性防止の観点から、温度は４０℃以下で行うことが好ましい。
上記の（３）のアンフォールディング工程では、本発明のタンパク質抽出薬剤を用いたあとに、アンフォールディング剤でタンパクの３次元構造を崩してアンフォールディング）を行うアンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素及びこれらの併用等が挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジン及び／又は尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン又はチオフェノール等を加えてもよい。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジン及び／又は尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン又はチオフェノール等を加えてもよい。
上記の（４）のリフォールディング工程におけるタンパク質のリフォールディング方法は、希釈法、透析法、界面活性剤利用法、人工シャペロン利用法及び特開２００７−１４５８０１号公報記載の方法いずれの方法でもリフォールディングすることができる。特に特開２００７−１４５８０１号公報記載の方法は生産性・汎用性の観点から好ましい。
上記の（５）のタンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
本発明の製造方法で製造されるタンパク質としては、酵素（Ｐ１）、組み換えタンパク質（Ｐ２）及びペプチド（Ｐ３）が挙げられる。
酵素（Ｐ１）としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素及び脱離酵素等が挙げられる。
加水分解酵素としては、セルラーゼ、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及びグルコアミラーゼ等が挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、コレステロールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等が挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等が挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等が挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼ等が挙げられる。
加水分解酵素としては、セルラーゼ、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及びグルコアミラーゼ等が挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、コレステロールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等が挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等が挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等が挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼ等が挙げられる。
組み換えタンパク質（Ｐ２）としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
ペプチド（Ｐ３）としては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
タンパク製剤としては、骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
ペプチド（Ｐ３）としては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
これらのうち本発明のタンパク質の製造方法は、（Ｐ１）及び（Ｐ２）、特に（Ｐ１）の生産に適している。
本発明の微生物によるタンパク質の製造方法で得られるタンパク質は、上記の方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また溶菌力に優れているので高い収量を得ることができる。
以下の製造例、実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り、部は重量部を意味する。
実施例１
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩１６．０４ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、ブタンテトラカルボン酸２．３４ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素及びメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩１５．４９ｇ（収率９９．９％）を得た。
さらに、得られたカチオン活性剤（ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩）２５部に、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部、ＴＷＥＥＮ８０を３０部、グリセリン２０部及び水１５部を加えて混合し、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩１６．０４ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、ブタンテトラカルボン酸２．３４ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素及びメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩１５．４９ｇ（収率９９．９％）を得た。
さらに、得られたカチオン活性剤（ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩）２５部に、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部、ＴＷＥＥＮ８０を３０部、グリセリン２０部及び水１５部を加えて混合し、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例２
実施例１において、ブタンテトラカルボン酸をクエン酸２．９１ｇに変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムのクエン酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ブタンテトラカルボン酸をクエン酸２．９１ｇに変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムのクエン酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例３
実施例１において、ブタンテトラカルボン酸をアジピン酸２．３２ｇに変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムのアジピン酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ブタンテトラカルボン酸をアジピン酸２．３２ｇに変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムのアジピン酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例４
実施例１において、ブタンテトラカルボン酸を酢酸２．４０ｇに変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムの酢酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ブタンテトラカルボン酸を酢酸２．４０ｇに変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムの酢酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例５
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩をジステアリルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩２４．６８ｇに変更する以外は同様にして、ジステアリルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩をジステアリルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩２４．６８ｇに変更する以外は同様にして、ジステアリルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通りに混合して、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例６
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をオレイルアルコールＥＯ１１モル付加物（三洋化成工業製「エマルミン１１０」、ＨＬＢ＝１３．２）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をオレイルアルコールＥＯ１１モル付加物（三洋化成工業製「エマルミン１１０」、ＨＬＢ＝１３．２）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例７
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をオレイルアルコールＥＯ５モル付加物（三洋化成工業製「エマルミンＣＯ−５０」、ＨＬＢ＝９．０）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をオレイルアルコールＥＯ５モル付加物（三洋化成工業製「エマルミンＣＯ−５０」、ＨＬＢ＝９．０）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例８
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をオクチルフェノールＥＯ１０モル付加物（和光純薬工業製、ＨＬＢ＝１３．５）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をオクチルフェノールＥＯ１０モル付加物（和光純薬工業製、ＨＬＢ＝１３．５）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例９
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＤＯ−６００」、ＨＬＢ＝１０．４）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＭＯ−４００」、ＨＬＢ＝１１．８）１０部をジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物（三洋化成工業製「イオネットＤＯ−６００」、ＨＬＢ＝１０．４）１０部に変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１０
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１１
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１２
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１３
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
実施例１において、ジデシルジメチルアンモニウムのブタンテトラカルボン酸塩を得た後、表１の通り配合量を変更する以外は実施例１と同様に行い、本発明のタンパク質抽出薬剤を作製した。
比較例１〜７
表１に記載の通りに混合して、比較例１〜５のタンパク質抽出薬剤を作製した。
なお、比較例１の塩化ベンザルコニウムは市販品（和光純薬工業製）を使用した。比較例２のラウリルアミンＥＯ２モル付加物は市販品（ライオンアクゾ社製、エソミンＣ／１２）を使用した。
表１に記載の通りに混合して、比較例１〜５のタンパク質抽出薬剤を作製した。
なお、比較例１の塩化ベンザルコニウムは市販品（和光純薬工業製）を使用した。比較例２のラウリルアミンＥＯ２モル付加物は市販品（ライオンアクゾ社製、エソミンＣ／１２）を使用した。
実施例１４〜２９
実施例１〜１３で作製したタンパク質抽出薬剤を使用して、（１）大腸菌に対する溶菌力、（２）タンパク質（セルラーゼ酵素、リパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、骨形成因子、エリスロポエチン、トリペプチド）の変性のされにくさを評価した結果を表２に示した。
実施例１〜１３で作製したタンパク質抽出薬剤を使用して、（１）大腸菌に対する溶菌力、（２）タンパク質（セルラーゼ酵素、リパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、骨形成因子、エリスロポエチン、トリペプチド）の変性のされにくさを評価した結果を表２に示した。
比較例８〜１４
比較例１〜７で作製したタンパク質抽出薬剤を使用して、比較の性能評価をおこなった結果を表２に示した。
比較例１〜７で作製したタンパク質抽出薬剤を使用して、比較の性能評価をおこなった結果を表２に示した。
（１）大腸菌に対する溶菌力、（２）タンパク質（セルラーゼ酵素、リパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、骨形成因子、エリスロポエチン、トリペプチド）の変性のされにくさの評価方法は以下の通りである。
＜大腸菌に対する溶菌力の評価方法＞
大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ／Ｋ株）をＬＢ培地中で３７℃振とう培養し、ＯＤ600が２．５になるまでおこなった。この大腸菌懸濁液３ｍＬを１５ｍＬ容のプラスチック製遠心チューブに入れ、遠心分離器（トミー精工製「ＧＲＸ−２２０」）で遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を除去した。実施例１〜１３及び比較例１〜７で製造したタンパク質抽出薬剤４０μｌを５０ｍＭＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．３、５ｍＭのＥＤＴＡを含む）２ｍＬで希釈し、遠心後のチューブ内に加えよく混合した。その後、２０℃で３０分振とうしたものを試料として、顕微鏡（オリンパス社製、ＴＨ４−１００）で生菌数を測定した。あわせて、溶菌剤を加えないブランクの生菌数も、３０分放置した大腸菌懸濁溶液を試料として測定した。
なお、実施例２７〜２９については、それぞれ実施例１、６、８のタンパク質抽出薬剤を加えて２０℃で３０分振とう後、リゾチーム水溶液（和光純薬製リゾチームを１．０ｍｇ／ｍＬとなるように予めイオン交換水で溶解した水溶液）を２ｍＬ加えて常温でさらに１時間振とうをおこなった後に生菌数を測定した。
また、実施例３０〜３２については、それぞれ実施例１、６、８のタンパク質抽出薬剤を加えて２０℃で３０分振とう後、ホスホリパーゼＡ２水溶液（和光純薬製ホスホリパーゼＡ２を１．０ｍｇ／ｍＬとなるように予めイオン交換水で溶解した水溶液）を２ｍＬ加えて常温でさらに１時間振とうをおこなった後に生菌数を測定した。
大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ／Ｋ株）をＬＢ培地中で３７℃振とう培養し、ＯＤ600が２．５になるまでおこなった。この大腸菌懸濁液３ｍＬを１５ｍＬ容のプラスチック製遠心チューブに入れ、遠心分離器（トミー精工製「ＧＲＸ−２２０」）で遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を除去した。実施例１〜１３及び比較例１〜７で製造したタンパク質抽出薬剤４０μｌを５０ｍＭＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．３、５ｍＭのＥＤＴＡを含む）２ｍＬで希釈し、遠心後のチューブ内に加えよく混合した。その後、２０℃で３０分振とうしたものを試料として、顕微鏡（オリンパス社製、ＴＨ４−１００）で生菌数を測定した。あわせて、溶菌剤を加えないブランクの生菌数も、３０分放置した大腸菌懸濁溶液を試料として測定した。
なお、実施例２７〜２９については、それぞれ実施例１、６、８のタンパク質抽出薬剤を加えて２０℃で３０分振とう後、リゾチーム水溶液（和光純薬製リゾチームを１．０ｍｇ／ｍＬとなるように予めイオン交換水で溶解した水溶液）を２ｍＬ加えて常温でさらに１時間振とうをおこなった後に生菌数を測定した。
また、実施例３０〜３２については、それぞれ実施例１、６、８のタンパク質抽出薬剤を加えて２０℃で３０分振とう後、ホスホリパーゼＡ２水溶液（和光純薬製ホスホリパーゼＡ２を１．０ｍｇ／ｍＬとなるように予めイオン交換水で溶解した水溶液）を２ｍＬ加えて常温でさらに１時間振とうをおこなった後に生菌数を測定した。
測定した結果から、溶菌力を以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、通常の溶菌時間としては、上記の評価方法において「２０℃で３０分振とう」の条件が、「２０℃で１時間振とう」であり、本評価は短時間での溶菌力の評価である。
その結果を表２に示す。
なお、通常の溶菌時間としては、上記の評価方法において「２０℃で３０分振とう」の条件が、「２０℃で１時間振とう」であり、本評価は短時間での溶菌力の評価である。
溶菌力（％）＝［１−（３０分後の試料中の生菌数／ブランクの生菌数）］×１００
判定基準：
溶菌力：９０％以上・・・・・・・・・５点
：８０％以上、９０％未満・・・４点
：６０％以上、８０％未満・・・３点
：４０％以上、６０％未満・・・２点
：４０％未満・・・・・・・・・１点
溶菌力：９０％以上・・・・・・・・・５点
：８０％以上、９０％未満・・・４点
：６０％以上、８０％未満・・・３点
：４０％以上、６０％未満・・・２点
：４０％未満・・・・・・・・・１点
＜タンパク質の変性されにくさの評価方法＞
（ａ）セルラーゼの場合
タンパク質の変性されにくさをセルラーゼ酵素の変性度として評価した。
２ｍｌの遠心分離用チューブに、１重量％セチルメチルセルロース水分散液０．６ｍｌと、５０ｍＭＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．３）で７５倍（重量基準）に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤の水性希釈液０．６ｍｌと、セルラーゼ（ナガセ社製、セルライザーＨＴ）の１００ｐｐｍ水溶液１０μｌとを加え、手振り混合した。
３７℃で５分間静置後、遠心分離機（ベックマン社製Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ．１１）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×３分）し、上層を分離して回収した。２０ｍｌ試験管に、上層０．２５ｍｌ、イオン交換水０．２５ｍｌ及び５重量％フェノール水溶液０．５ｍｌを入れて、混合した。
さらに９５重量％濃硫酸を２．５ｍｌ加え、室温で１０分間静置後、混合し、その後２０分間２０℃で静置して試料溶液を得た。この試料溶液の４９０ｎｍにおける吸光度（セチルメチルセルロースが酵素で分解された生成物の吸収）を紫外可視分光光度計で測定した。ブランクには溶菌剤の代わりにイオン交換水０．６ｍｌを用いた。
セルラーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、セチルメチルセルロースが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
（ａ）セルラーゼの場合
タンパク質の変性されにくさをセルラーゼ酵素の変性度として評価した。
２ｍｌの遠心分離用チューブに、１重量％セチルメチルセルロース水分散液０．６ｍｌと、５０ｍＭＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．３）で７５倍（重量基準）に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤の水性希釈液０．６ｍｌと、セルラーゼ（ナガセ社製、セルライザーＨＴ）の１００ｐｐｍ水溶液１０μｌとを加え、手振り混合した。
３７℃で５分間静置後、遠心分離機（ベックマン社製Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ．１１）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×３分）し、上層を分離して回収した。２０ｍｌ試験管に、上層０．２５ｍｌ、イオン交換水０．２５ｍｌ及び５重量％フェノール水溶液０．５ｍｌを入れて、混合した。
さらに９５重量％濃硫酸を２．５ｍｌ加え、室温で１０分間静置後、混合し、その後２０分間２０℃で静置して試料溶液を得た。この試料溶液の４９０ｎｍにおける吸光度（セチルメチルセルロースが酵素で分解された生成物の吸収）を紫外可視分光光度計で測定した。ブランクには溶菌剤の代わりにイオン交換水０．６ｍｌを用いた。
セルラーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、セチルメチルセルロースが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
タンパク質の変性されにくさ（％）＝（試料溶液の吸光度／ブランクの吸光度）×１００
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
（ｂ）リパーゼの場合
タンパク質の変性されにくさをリパーゼの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、リパーゼ（ナガセ社製、「リリパーゼ」）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。このリパーゼ溶液１００μＬを５ｍＬ容の試験管にはかりとり、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．０）２ｍＬを加え、さらに５μＭのｐ−ニトロフェニルアセテート（和光純薬製）１ｍＬを加えた。
この試料溶液の４００ｎｍにおける吸光度（トリニトロフェニルアセテートが酵素で分解された生成物の吸収）を紫外可視分光光度計で測定した。ブランクにはタンパク質抽出薬剤の代わりにイオン交換水を用いた。
リパーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、ｐ−ニトリフェニルアセテートが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
タンパク質の変性されにくさをリパーゼの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、リパーゼ（ナガセ社製、「リリパーゼ」）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。このリパーゼ溶液１００μＬを５ｍＬ容の試験管にはかりとり、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．０）２ｍＬを加え、さらに５μＭのｐ−ニトロフェニルアセテート（和光純薬製）１ｍＬを加えた。
この試料溶液の４００ｎｍにおける吸光度（トリニトロフェニルアセテートが酵素で分解された生成物の吸収）を紫外可視分光光度計で測定した。ブランクにはタンパク質抽出薬剤の代わりにイオン交換水を用いた。
リパーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、ｐ−ニトリフェニルアセテートが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
タンパク質の変性されにくさ（％）＝（試料溶液の吸光度／ブランクの吸光度）×１００
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
（ｃ）コレステロールオキシダーゼの場合
タンパク質の変性されにくさをコレステロールオキシダーゼの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、コレステロールオキシダーゼ（和光純薬工業製）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。
一方、コール酸ナトリウム７８ｍｇ、ノニルフェノールエチレンオキシド付加物｛ユニオンカーバイドアンドプラスチック社製、商品名：トライトンＸ−１００｝９ｍｇ、アミノアンチピリン０．８５ｍｇ、フェノール５．９ｍｇ、ペルオキシダーゼ｛東洋紡社製｝１５ｕｎｉｔｓ、コレステロール１．０ｍｇ及び５０ミリモル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）３ｍＬを均一混合して、基質溶液を調製した。
タンパク質の変性されにくさをコレステロールオキシダーゼの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、コレステロールオキシダーゼ（和光純薬工業製）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。
一方、コール酸ナトリウム７８ｍｇ、ノニルフェノールエチレンオキシド付加物｛ユニオンカーバイドアンドプラスチック社製、商品名：トライトンＸ−１００｝９ｍｇ、アミノアンチピリン０．８５ｍｇ、フェノール５．９ｍｇ、ペルオキシダーゼ｛東洋紡社製｝１５ｕｎｉｔｓ、コレステロール１．０ｍｇ及び５０ミリモル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）３ｍＬを均一混合して、基質溶液を調製した。
ついで、酵素水溶液１０μＬを基質溶液３ｍＬに加えて、測定液を得た。直ちに、この測定液について、３０℃で、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で５００ｎｍにおける吸光度（Ｂ0）を測定し、さらに３０℃で５分間放置後にもう一度、３０℃で吸光度（Ｂ5）を測定し、これらの差（Ｂ5−Ｂ0）（ΔＢ）を算出した。
一方、タンパク質抽出薬剤をイオン交換水に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｂ5−Ｂ0）（ΔＢｂ）を算出し、次式から酵素活性保持率を算出し、タンパク質の変性されにくさとして、下記判断基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
酵素活性保持率（％）＝（ΔＢ／ΔＢｂ） ×１００
判定基準
酵素活性保持率（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
判定基準
酵素活性保持率（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
（ｄ）グルコースイソメラーゼの場合
タンパク質の変性されにくさをグルコースイソメラーゼの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、グルコースイソメラーゼ（和光純薬工業製）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。
グルコースイソメラーゼ溶液１ｍＬを５０ｍＭトリエタノールアミンバッファー（１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．１Ｍキシロースを含有。ｐＨ＝７．５）９ｍＬに加え、３５℃で３時間反応させた。反応開始直後の２７８ｎｍにおける吸光度（Ｂ0）を測定し、さらに３５℃で３時間放置後にもう一度、３５℃で吸光度（Ｂ3）を測定し、これらの差（Ｂ3−Ｂ0）（ΔＢ）を算出した。異性化によりキシルロースが生成すると、２７８ｎｍの吸収が増大する。
タンパク質の変性されにくさをグルコースイソメラーゼの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、グルコースイソメラーゼ（和光純薬工業製）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。
グルコースイソメラーゼ溶液１ｍＬを５０ｍＭトリエタノールアミンバッファー（１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．１Ｍキシロースを含有。ｐＨ＝７．５）９ｍＬに加え、３５℃で３時間反応させた。反応開始直後の２７８ｎｍにおける吸光度（Ｂ0）を測定し、さらに３５℃で３時間放置後にもう一度、３５℃で吸光度（Ｂ3）を測定し、これらの差（Ｂ3−Ｂ0）（ΔＢ）を算出した。異性化によりキシルロースが生成すると、２７８ｎｍの吸収が増大する。
一方、タンパク質抽出薬剤をイオン交換水に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｂ3−Ｂ0）（ΔＢｂ）を算出し、次式から酵素活性保持率を算出し、タンパク質の変性されにくさとして、下記判断基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１，６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１，６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
酵素活性保持率（％）＝（ΔＢ／ΔＢｂ） ×１００
判定基準
酵素活性保持率（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
判定基準
酵素活性保持率（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
（ｅ）骨形成因子（ＢＭＰ）の場合
タンパク質の変性されにくさを骨形成因子の活性として評価した。
骨形成因子（Ｒ＆Ｄ社製「ＢＭＰ−２」）１０μｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１ｍＬに溶解させ、１時間放置した。その後、透析チューブ（分画分子量４０００）で１晩放置し、タンパク質抽出薬剤を除去した。
骨形成因子（ＢＭＰ）の活性測定は公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２（１９９０）２９５−２９９）と同様に下記の通り行った。
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ品）を２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０重量％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）中で３７℃、１０重量％二酸化炭素条件下培養した。２４穴プレートに１×１０5個のＣ２Ｃ１２細胞を含む培地を注ぎ培養し、３７℃、２４時間後に骨形成因子溶液を含む新しい前述の培地（骨形成因子の濃度：０．００１重量％）で培地交換した。４日後、細胞処理溶液（０．１Ｍのグリセロール、ｐＨ９．６、１重量％のＮＰ−４０、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化亜鉛を含む）０．２ｍＬをプレートに加え１時間静置した。静置後プレート上の抽出液５０μＬを０．３ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォスフェート（シグマ社製）を細胞処理溶液に溶解させた溶液１５０μＬに加え、９６穴プレートで３７℃、放置した。マイクロリーダー（和光純薬工業製、サンライズサーモ）で加えた直後の４０５ｎｍにおける吸光度（Ｃ0）を測定し、さらに３７℃で３０分間放置後にもう一度、３７℃で吸光度（Ｃ30）を測定し、これらの差（Ｃ30−Ｃ0）（ΔＣ）を算出した。
タンパク質の変性されにくさを骨形成因子の活性として評価した。
骨形成因子（Ｒ＆Ｄ社製「ＢＭＰ−２」）１０μｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１ｍＬに溶解させ、１時間放置した。その後、透析チューブ（分画分子量４０００）で１晩放置し、タンパク質抽出薬剤を除去した。
骨形成因子（ＢＭＰ）の活性測定は公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２（１９９０）２９５−２９９）と同様に下記の通り行った。
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ品）を２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０重量％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）中で３７℃、１０重量％二酸化炭素条件下培養した。２４穴プレートに１×１０5個のＣ２Ｃ１２細胞を含む培地を注ぎ培養し、３７℃、２４時間後に骨形成因子溶液を含む新しい前述の培地（骨形成因子の濃度：０．００１重量％）で培地交換した。４日後、細胞処理溶液（０．１Ｍのグリセロール、ｐＨ９．６、１重量％のＮＰ−４０、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化亜鉛を含む）０．２ｍＬをプレートに加え１時間静置した。静置後プレート上の抽出液５０μＬを０．３ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォスフェート（シグマ社製）を細胞処理溶液に溶解させた溶液１５０μＬに加え、９６穴プレートで３７℃、放置した。マイクロリーダー（和光純薬工業製、サンライズサーモ）で加えた直後の４０５ｎｍにおける吸光度（Ｃ0）を測定し、さらに３７℃で３０分間放置後にもう一度、３７℃で吸光度（Ｃ30）を測定し、これらの差（Ｃ30−Ｃ0）（ΔＣ）を算出した。
一方、ブランクとして、タンパク質抽出薬剤をイオン交換水に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｃ30−Ｃ0）（ΔＣｂ）を算出し、次式から活性保持率を算出し、タンパク質の変性されにくさとして、下記判断基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
活性保持率（％）＝（ΔＣ／ΔＣｂ） ×１００
判定基準
活性保持率（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
判定基準
活性保持率（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・・・１点
（ｆ）エリスロポエチンの場合、
タンパク質の変性されにくさをエリスロポエチンの残存率として評価した。
エリスロポエチン １５００国際単位を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝６．０）で２０倍希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１ｍＬに添加し、溶解させ、１日放置した。ブランクにはタンパク質抽出薬剤の代わりにイオン交換水を用いた。残存率の評価は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析法（ＷＡＴＥＲＳ社製）により算出した。
エリスロポエチンが変性されない場合は、ピーク面積が大きくなる（ブランクに近い面積になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
タンパク質の変性されにくさをエリスロポエチンの残存率として評価した。
エリスロポエチン １５００国際単位を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝６．０）で２０倍希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１ｍＬに添加し、溶解させ、１日放置した。ブランクにはタンパク質抽出薬剤の代わりにイオン交換水を用いた。残存率の評価は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析法（ＷＡＴＥＲＳ社製）により算出した。
エリスロポエチンが変性されない場合は、ピーク面積が大きくなる（ブランクに近い面積になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
タンパク質の変性されにくさ（％）＝（試料溶液のピーク面積／ブランクのピーク面積）×１００
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
８０％以上、９０％未満・・・４点
７０％以上、８０％未満・・・３点
６０％以上、７０％未満・・・２点
６０％未満・・・・・・・・・１点
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
８０％以上、９０％未満・・・４点
７０％以上、８０％未満・・・３点
６０％以上、７０％未満・・・２点
６０％未満・・・・・・・・・１点
（ｇ）トリペプチドの場合、
タンパク質の変性されにくさをトリペプチドの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、メチオニン−リシン−メチオニン（和光純薬工業製）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。
ウミホタル−ルシフェリン誘導体（ＣＬＡ）は一重項酸素（1Ｏ2・）、スーパーオキシドアニオン（-Ｏ2・）を特異的に検出する有効な化学発光試薬であり、公知［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，１５７−１６０（１９９１）］の方法によりスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）を消光剤に用いた消光実験によりＣＬＡと-Ｏ2・との反応速度が求められ、この速度定数からタンパク質の変性されにくさを算出した。
ＣＬＡ（Ｃ13Ｈ11ＯＮ3、東京化成社製、最終濃度１．３９×１０-7〜４．６４×１０-8）溶液１０μＬ、上記のトリペプチド溶液１０μＬ、アルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ、シグマ化学社製）５００μＬ、キサンチンオキシダーゼ（１．４５ｕｎｉｔ／ｍｌ、シグマ化学社製）５０μＬを順に円筒方石英セル（内径１４ｍｍ、高さ６０ｍｍ）に入れ、ルミノメーター（Ａｌｏｋａ ＢＬＲ−１０２Ｂ型、浜松ホトニクス社製）の試料室内に移し、３ｍＭヒポキサンチン溶液２００μＬを注入して、セル底面から化学発光を単一光量子計数により測定した。消光剤が存在する場合並びに存在しない場合の-Ｏ2・の発光強度の比率（Ｉ0／Ｉ）はＩ0／Ｉ＝１＋［ｋ3／（ｋ1＋ｋ2〔ＣＬＡ〕）］×［Ｑ］で表される。ここでＱは活性化酸素阻害剤を、ｋ1は-Ｏ2・の消光速度定数、ｋ2は-Ｏ2・とＣＬＡとの反応速度定数、ｋ3は-Ｏ2・とＱとの反応速度定数を示す。なお［ＣＬＡ］及び［Ｑ］はそれぞれの濃度を表す。
活性化酸素フリーラジカル消去作用を示す活性化酸素阻害活性（消光速度）ｋ3を、タンパク質抽出薬剤の代わりにイオン交換水を加える以外は上記と同様にしたブランクの活性化酸素阻害活性ｋ3 0と比較した。タンパク質の変性されにくさは以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
タンパク質の変性されにくさをトリペプチドの変性度として評価した。
２０ｍＬ容のスクリュー管に、メチオニン−リシン−メチオニン（和光純薬工業製）１０ｍｇを、イオン交換水で２０倍に希釈した実施例１〜１３又は比較例１〜７のタンパク質抽出薬剤１０ｍＬに添加し、溶解させ、１時間放置した。
ウミホタル−ルシフェリン誘導体（ＣＬＡ）は一重項酸素（1Ｏ2・）、スーパーオキシドアニオン（-Ｏ2・）を特異的に検出する有効な化学発光試薬であり、公知［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，１５７−１６０（１９９１）］の方法によりスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）を消光剤に用いた消光実験によりＣＬＡと-Ｏ2・との反応速度が求められ、この速度定数からタンパク質の変性されにくさを算出した。
ＣＬＡ（Ｃ13Ｈ11ＯＮ3、東京化成社製、最終濃度１．３９×１０-7〜４．６４×１０-8）溶液１０μＬ、上記のトリペプチド溶液１０μＬ、アルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ、シグマ化学社製）５００μＬ、キサンチンオキシダーゼ（１．４５ｕｎｉｔ／ｍｌ、シグマ化学社製）５０μＬを順に円筒方石英セル（内径１４ｍｍ、高さ６０ｍｍ）に入れ、ルミノメーター（Ａｌｏｋａ ＢＬＲ−１０２Ｂ型、浜松ホトニクス社製）の試料室内に移し、３ｍＭヒポキサンチン溶液２００μＬを注入して、セル底面から化学発光を単一光量子計数により測定した。消光剤が存在する場合並びに存在しない場合の-Ｏ2・の発光強度の比率（Ｉ0／Ｉ）はＩ0／Ｉ＝１＋［ｋ3／（ｋ1＋ｋ2〔ＣＬＡ〕）］×［Ｑ］で表される。ここでＱは活性化酸素阻害剤を、ｋ1は-Ｏ2・の消光速度定数、ｋ2は-Ｏ2・とＣＬＡとの反応速度定数、ｋ3は-Ｏ2・とＱとの反応速度定数を示す。なお［ＣＬＡ］及び［Ｑ］はそれぞれの濃度を表す。
活性化酸素フリーラジカル消去作用を示す活性化酸素阻害活性（消光速度）ｋ3を、タンパク質抽出薬剤の代わりにイオン交換水を加える以外は上記と同様にしたブランクの活性化酸素阻害活性ｋ3 0と比較した。タンパク質の変性されにくさは以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
その結果を表２に示す。
なお、実施例２７〜３２については、それぞれ実施例１、６、８、１、６、８のタンパク質抽出薬剤を用いてタンパク質の変性されにくさを評価した結果を表２に記載した。
タンパク質の変性されにくさ（％）＝（ｋ3／ｋ3 0）×１００
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
８０％以上、９０％未満・・・４点
７０％以上、８０％未満・・・３点
６０％以上、７０％未満・・・２点
６０％未満・・・・・・・・・１点
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・・・５点
８０％以上、９０％未満・・・４点
７０％以上、８０％未満・・・３点
６０％以上、７０％未満・・・２点
６０％未満・・・・・・・・・１点
表２の大腸菌に対する溶菌力の評価結果及びタンパク質の変性されにくさの評価結果より、従来のタンパク質抽出薬剤は比較例１のように溶菌力が高いタンパク質抽出薬剤はタンパク質を変性させやすく、比較例２及び比較例３のようにタンパク質の変性が少ない溶菌剤は十分に溶菌できない。比較例と比較して、本発明の実施例は、溶菌力に優れ、かつタンパク質を変性させにくいことがわかる。さらに実施例２７〜３２のように加水分解酵素を併用するとさらに溶菌力が向上することがわかる。
なお、比較例１１、１２（比較例４、５のタンパク質抽出薬剤）の結果から、溶菌性とタンパク質の変性されにくさは、界面活性剤（Ａ）単独の使用では十分な効果が得られず、本発明の（Ａ）と特定の非イオン性界面活性剤（Ｂ）を併用して初めて得ることができることがわかる。
なお、比較例１１、１２（比較例４、５のタンパク質抽出薬剤）の結果から、溶菌性とタンパク質の変性されにくさは、界面活性剤（Ａ）単独の使用では十分な効果が得られず、本発明の（Ａ）と特定の非イオン性界面活性剤（Ｂ）を併用して初めて得ることができることがわかる。
本発明のタンパク質抽出薬剤及びタンパク質の生産方法は、タンパク質等の有用物質を生産菌から抽出する工程において使用できる。タンパク質としては酵素、組換えタンパク質及びペプチド挙げられる。
Claims (7)
- 微生物からタンパク質を抽出する薬剤であって、対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）とＨＬＢ値が９〜１３．５である非イオン性界面活性剤（Ｂ）とを含むタンパク質抽出薬剤。
- カチオン性界面活性剤（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）の重量比｛（Ａ）の重量／（Ｂ）の重量｝が、０．０１〜１００である請求項１に記載のタンパク質抽出薬剤。
- 非イオン性界面活性剤（Ｂ）が高級アルコールアルキレンオキサイド付加物、アルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物及び脂肪酸アルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載のタンパク質抽出薬剤。
- タンパク質が酵素である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質抽出薬剤。
- 微生物からタンパク質を抽出する工程において、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質抽出薬剤を使用するタンパク質の製造方法。
- 微生物からタンパク質を抽出する工程において、タンパク質抽出薬剤を使用した後にさらに加水分解酵素を使用する請求項５に記載のタンパク質の製造方法。
- 加水分解酵素がリゾチームである請求項６に記載のタンパク質の製造方法。
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