WO2015093544A1 - 乳汁中のブドウ球菌を検出する方法 - Google Patents

乳汁中のブドウ球菌を検出する方法 Download PDF

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浩志 前花
松山　健二
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    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Definitions

  • the present invention relates to a lysis method and a detection method for detecting staphylococci that are mastitis-causing bacteria from the milk of livestock.
  • Livestock milk represented by cows, sheep and goats is not aseptic and may contain some microorganisms due to disease or the environment. In particular, it is known that many microorganisms are eradicated in milk in diseases caused by infection of microorganisms in the breast. Mastitis is a typical livestock disease caused by microbial infection.
  • Mastitis is inflammation of the ductal system and mammary gland tissue, and is mainly caused by microorganisms invading, colonizing and proliferating in the breast. Mastitis affects many animals, but bovine mastitis, particularly in dairy cows, is said to affect 15-40% of all dairy cows and is one of the most important diseases for dairymen.
  • milk synthesis functions are inhibited, resulting in not only a decrease in milk production and, in some cases, halting lactation, but also significant economic losses such as treatment costs and milk price penalties due to reduced milk quality.
  • labor burdens on dairy farmers will increase, such as individually milking mastitis-affected quarters to prevent infection.
  • Mastitis is caused by infection with various microorganisms.
  • staphylococci particularly Staphylococcus aureus
  • Causative bacteria for intractable mastitis are known to be transmitted to other dairy cows via a milking machine or the like.
  • Culture methods are widely used as a method for detecting staphylococci from milk.
  • the culture method is not suitable for rapid identification of causative bacteria because it takes several days to obtain results.
  • an identification method by an antigen-antibody reaction using an antibody against a component specific to a causative bacterium, particularly an immunochromatographic method can determine the result in several tens of minutes, and is widely used as a rapid and simple test method (for example Patent Document 1).
  • Patent Document 2 The present inventors have also examined the immunochromatographic method as a method for detecting substances in the milk of livestock (Patent Document 2).
  • Mastitis is caused by infection with various microorganisms, but the antibiotics that are effective depend on the causative bacteria.
  • certain microorganisms are transmitted to the other quarter or individual, and their properties and subsequent responses differ, it is extremely important to identify causative bacteria present in milk quickly, easily, and with high sensitivity.
  • infectious Staphylococcus aureus which is a cause of refractory mastitis
  • the number of Staphylococcus aureus bacteria in milk is often small, and a method that can be detected quickly and with high sensitivity is required.
  • the culture method widely used as a method for detecting bacteria has a problem that it takes several days to obtain a result.
  • an immunoassay method based on an antigen-antibody reaction such as an immunochromatography method has an advantage that a causative bacterium can be detected quickly and easily, and early antimicrobial treatment is possible.
  • the present invention solves the problem of providing a lysis method, a lysis solution and an immunochromatography apparatus for detecting whether or not the causative bacterium of mastitis is staphylococci using livestock milk. It was an issue that should be done.
  • the present inventor believes that in order to detect staphylococci in milk, it is necessary to extract the target antigen in the bacterial body with high efficiency, and in order to lyse staphylococci in milk with high efficiency, It was found that the efficiency of lysis was improved by simultaneously using a plurality of surfactants, and staphylococci in milk could be detected with high sensitivity, and the present invention was completed.
  • the present invention provides the following.
  • a method for lysis of staphylococci comprising a step of lysing staphylococci present in milk by mixing a lytic enzyme and a lytic agent containing at least one amphoteric surfactant with milk obtained from livestock. Including.
  • the lytic enzyme is lysostaphin.
  • the lysis agent further comprises at least one nonionic surfactant.
  • the amphoteric surfactant is any one selected from the group consisting of dimethylammoniopropane sulfonate, dodecyldimethylammoniobutylate, betaine laurate, and amidopropyl betaine.
  • the method as described in any one.
  • the nonionic surfactant is any selected from the group consisting of a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and a polyoxyethylene alkylphenyl ether.
  • the lysing agent according to [6] for use in a method for diagnosing mastitis in livestock.
  • the immunochromatographic method is (1) A milk containing a specific substance is connected to the first antibody labeled with the specific substance or the first part in which the labeled specific substance is retained, downstream of the first part, and the specific A second part on which a second antibody against the substance is immobilized; and a third part connected to the first part or upstream of the second part and having a void capable of removing milk fat globules in the milk. Bringing the milk into contact with the third portion or an upstream portion thereof with respect to the test piece having; and (2) flowing the milk to the second portion or the downstream portion thereof; and The method according to [9], comprising the step of obtaining a signal detectable by the label in the downstream portion.
  • the present invention also provides the following.
  • a method for lysis of staphylococci in milk comprising lysing lysostaphin, an ionic surfactant, and a nonionic surfactant in milk and lysing staphylococci present in the milk
  • a lysis method comprising: [2] The lysis method according to [1], wherein the ionic surfactant is an amphoteric surfactant.
  • the amphoteric surfactant is dimethylammoniopropane sulfonate, dodecyldimethylammoniotilite, betaine laurate.
  • nonionic surfactant is any one selected from polyoxyethylene alkylphenyl ether and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester in [2]
  • the lysis method as described.
  • the final concentration of the amphoteric surfactant is 0.03% or more and 0.2% or less, [2] or [3] The lysis method according to 1.
  • the final concentration of the lysostaphin is 0.1 mg / ⁇ l or more and 200 mg / ⁇ l or less; and / or the lysing agent in the milk
  • the lysis method according to [4] wherein the final concentration of the nonionic surfactant is 0.03% or more and 10% or less.
  • [6] As defined in any one of [1] to [5], comprising a step of lysing staphylococci present in the milk by mixing a lysis agent in the milk, A method for detecting staphylococci in milk, further comprising a step of detecting a specific substance derived from microbial cells of staphylococci released by lysis. [7] The method according to [6], wherein the detection method is performed by an immunochromatographic method.
  • the immunochromatographic method comprises: (1) A milk containing a specific substance is connected to the first antibody labeled with the specific substance or the first part in which the labeled specific substance is retained, downstream of the first part, and the specific A second part on which a second antibody against the substance is immobilized; and a third part connected to the first part or upstream of the second part and having a void capable of removing milk fat globules in the milk. Bringing the milk into contact with the third portion or an upstream portion thereof with respect to the test piece having; and (2) flowing the milk to the second portion or the downstream portion thereof; and The detection method according to [7], comprising a step of obtaining a signal detectable by the label in the downstream portion.
  • the lysing agent according to [12] or [13], The first antibody labeled with the specific substance or the first part holding the labeled specific substance and the second antibody linked to the downstream of the first part and the second antibody against the specific substance are immobilized.
  • a test piece having a second part and a third part connected upstream of the first part or the second part and having a cavity capable of removing milk fat globules in the milk.
  • staphylococci in milk can be detected quickly, conveniently and with high sensitivity and on the spot.
  • an appropriate treatment policy such as selection of an appropriate antibiotic and measures for preventing the spread of infection at an early stage.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of a test piece of an immunochromatography apparatus used in Example 2.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a test piece of an immunochromatography apparatus used in Example 2.
  • the present invention provides a lysing agent for lysing bacteria in milk.
  • the lysing agent of the present invention includes a lytic enzyme and a specific surfactant.
  • the kind of lytic enzyme in the present invention is not particularly limited, and any two or more lytic enzymes may be used in appropriate combination. Escherichia coli , a bacterium belonging to the genus Klebsiella, or Staphylococcus aureus as a mastitis-causing fungus. It is also preferable to use one or a combination of two or more enzymes.
  • one or more lytic enzymes selected from lysozyme, lysostaphin, pepsin, glucosidase, galactosidase, achromopeptidase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase and the like can be used.
  • a method using lysozyme and a cell membrane lysing agent as a lytic enzyme has been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 63-167799).
  • lysostaphin that exhibits a specific lytic action against staphylococci alone or in combination with other lytic enzymes
  • a method for lysing Staphylococcus aureus with lysostaphin is disclosed in JP-A-11-28099, and those skilled in the art can easily obtain lysostaphin as a lytic enzyme.
  • JP-A-11-28099 JP-A-11-28099
  • Natural lysostaphin is a zinc protease produced by Staphylococcus simulans and is known to lyse these bacteria by hydrolyzing the glycylglycine bond in the glycopeptide chain of the cell wall peptidoglycan of Staphylococcus aureus or its congeners. It has been.
  • lysostaphin includes, in addition to the above natural lysostaphin, addition, deletion, and / or addition to one or more amino acids in the amino acid sequence of natural lysostaphin, as long as the hydrolysis activity is not lost. Mutant lysostaphin into which mutations such as substitution have been introduced is included.
  • modified lysostaphin in which other compounds such as saccharides and polyethylene glycol are bound to the natural lysostaphin or mutant lysostaphin is also included as long as the hydrolysis activity is not lost.
  • lysostaphins can be obtained by the culture method or genetic engineering method described in JP-A No. 11-28099, or can be obtained by purchasing commercially available products.
  • the content of the lytic enzyme in the lytic agent (when using a plurality of lytic enzymes, the content as the total amount of lytic enzymes is not particularly limited as long as an effective lysis rate is ensured for detection,
  • the lower limit is that when an enzyme (or enzyme protein) with an activity of 3500 units / mg or more is used, the final concentration of the enzyme (or enzyme protein) when mixed with milk is 0.03 ⁇ g / ml or more. It is preferably 0.15 ⁇ g / ml or more, more preferably 0.3 ⁇ g / ml or more, further preferably 1.5 ⁇ g / ml or more, and particularly preferably 1 ⁇ g / ml or more.
  • the upper limit of the content of the lytic enzyme can be appropriately determined from an economic viewpoint, and can be 200 ⁇ g / ml or less, preferably 100 ⁇ g / ml or less, regardless of the lower limit. More preferably, it is 75 ⁇ g / ml or less, more preferably 50 ⁇ g / ml or less, and particularly preferably 25 ⁇ g / ml or less.
  • the lower limit can be such that the final concentration when mixed with milk is 0.105 units / ml or more, preferably 0.525 units / ml or more, more preferably 1.05 units / ml or more.
  • the upper limit can be 700 units / ml or less, preferably 350 units / ml or less, more preferably 262.5 units / ml or less, and even more preferably 175, regardless of the lower limit.
  • Units / ml or less particularly preferably 87.5 units / ml or less.
  • an enzyme activity in this specification it is based on the following definition.
  • 1 unit is 0.01 OD / min at 25 ° C., pH 8.0, 600 nm for a suspension using a heat-treated target bacterium (preferably Staphylococcus aureus , more preferably Staphylococcus aureus 8325-4) as a substrate.
  • a heat-treated target bacterium preferably Staphylococcus aureus , more preferably Staphylococcus aureus 8325-4
  • turbidity pH 8.0, 25 ° C., initial turbidity 1.0 in 1.0 mL of 0.2 mol / L Tris buffer.
  • ionic surfactants Surfactants that ionize when dissolved in water are called ionic surfactants or ionic surfactants, and surfactants that do not become ions are called nonionic surfactants. Ionic surfactants are further classified into anionic (anionic) surfactants, cationic (cationic) surfactants and amphoteric surfactants.
  • At least one amphoteric surfactant, at least one anionic surfactant, at least one cationic surfactant, or any combination thereof is used simultaneously with the lytic enzyme.
  • at least one amphoteric surfactant or at least one nonionic surfactant or a combination thereof is used simultaneously with the lytic enzyme.
  • at least one amphoteric surfactant and a nonionic surfactant are used in combination with the lytic enzyme.
  • amphoteric surfactants include amino acids (alkylamino fatty acid salts), betaines (alkylbetaines), amine oxides (alkylamine oxides), and the like, but are not particularly limited. More specific examples include dimethylammoniopropane sulfonate, dodecyldimethylammoniobutylate, betaine laurate, and amidopropyl betaine.
  • More specific examples include n-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Decyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Hexadecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, N- Dodecyl-N, N- (dimethylammonio) butyrate.
  • the content of amphoteric surfactant in the lysis agent is as long as an effective lysis rate is ensured.
  • the final concentration when mixed with milk can be 0.03% or more, preferably 0.05 or more, regardless of the content of the lytic enzyme. More preferably 0.06% or more, still more preferably 0.07% or more, and particularly preferably 0.08% or more.
  • the upper limit of the amphoteric surfactant content is not limited so long as it does not significantly inhibit the reaction by the lytic enzyme or the antigen-antibody reaction. In any case, it can be 1% or less, preferably 0.75. % Or less, more preferably 0.5% or less, still more preferably 0.3% or less, and particularly preferably 0.2% or less.
  • any of ester ether type, ester type, and ether type can be suitably used. More specifically, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl Polyglucosides, fatty acid diethanolamides, alkyl monoglyceryl ethers, polysorbates (those obtained by condensing a few tens of ethylene oxides with a fatty acid sorbitan ester), and the like, are not particularly limited.
  • polysorbates more specifically polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, polyoxyethylene (60) sorbitan monostearate, polyoxyethylene (65) sorbitan tristearate, and polyoxyethylene (20)
  • examples thereof include oxyethylene (80) sorbitan monooleate and the like, and polyoxyethylene alkylphenyl ether, more specifically polyoxyethylene (10) octylphenyl ether.
  • the content of the nonionic surfactant in the lysis agent (when a plurality of nonionic surfactants are used, the content as the total amount of nonionic surfactants) is, for example, a developing solution when using an immunochromatographic method.
  • the lower limit can be such that the final concentration when mixed with milk is 0.03% or more, preferably 0.05% or more. More preferably, it is 0.075% or more, more preferably 0.1% or more, and particularly preferably 0.3% or more.
  • the upper limit of the content of the nonionic surfactant only needs to be a level that does not significantly inhibit the reaction by the lytic enzyme or the antigen-antibody reaction, and in any case, it can be 10% or less, preferably It is 7.5% or less, more preferably 5% or less, further preferably 3% or less, and particularly preferably 2% or less.
  • any of carboxylate, sulfonate, sulfate ester, and the like can be suitably used. More specific examples include alkyl ether carboxylates, linear alkylbenzene sulfonates (LAS), ⁇ -olefin sulfonates (AOS), dialkyl sulfosuccinates, formaldehyde condensates of naphthalene sulfonates, alkyl sulfates Examples thereof include salts (AS), polyoxyethylene alkyl sulfates (AES) sulfated by adding ethylene oxide to higher alcohols, and phosphate esters such as higher alcohols and ethylene oxide adducts thereof.
  • AS salts
  • AES polyoxyethylene alkyl sulfates
  • phosphate esters such as higher alcohols and ethylene oxide adducts thereof.
  • sodium alkyl sulfates such as sodium dodecyl sulfate and sodium myristyl sulfate
  • sodium N-acyl sarcosine such as sodium N-lauroyl sarcosinate, sodium N-myristoyl sarcosinate, sodium dodecylbenzene sulfonate
  • hydrogen Examples thereof include sodium coconut fatty acid monoglyceride monosulfate, sodium lauryl sulfoacetate, N-acyl glutamate such as sodium N-palmitoyl glutamate, sodium N-methyl-N-acylalanine, and sodium ⁇ -olefin sulfonate.
  • an amine salt type or a quaternary ammonium salt type can be suitably used as the cationic surfactant. More specific examples include distearyldimethylammonium chloride, benzalkonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride. Examples thereof include bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide, and myristyltrimethylammonium bromide.
  • the lysing agent contains lysostaphin, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant.
  • the preferred amphoteric surfactant is selected from dimethylammoniopropane sulfonate, dodecyl dimethylammoniobutylite, betaine laurate, and amidopropyl betaine
  • Preferred nonionic surfactants are polyoxyethylene alkylphenyl ethers and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • the concentration of each component in such a lysis agent is such that the final concentration of lysostaphin is 0.1 mg / ⁇ l or more and 200 mg / ⁇ l or less in the step of mixing the lysis agent in milk and lysing the bacteria present in the milk.
  • the final concentration of the amphoteric surfactant is preferably 0.03% or more and 0.2% or less, and the final concentration of the nonionic surfactant is preferably 0.03% or more and 10% or less.
  • the lysis agent of the present invention can contain one or more other components in addition to the lytic enzyme and the surfactant as long as the intended effect is not significantly impaired.
  • a preferable example of components other than the lytic enzyme and the surfactant is a substance having an effect of promoting lysis.
  • glutaraldehyde, halogen compounds, chlorhexidine alcohols (eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl- 2-propanol), phenol, hydrogen peroxide, acrinol, guanidine and salts thereof, chelating agents, organic acids and salts thereof, polyhydric alcohols (eg, ethylene glycol, propylene glycol, diethylene glycol, glycerin), and 2-mercaptoethanol , Reducing agents such as, but not limited to, dithiothreitol, cystine and thiophenol.
  • alcohols eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl- 2-propanol
  • phenol e.g, hydrogen peroxide, acrinol,
  • the lysis agent can be used by mixing with milk.
  • the mixing ratio between the milk and the lysing agent is not particularly limited as long as the final concentration of the lytic enzyme or the like is appropriately maintained and a sufficient lysis rate can be secured. If a relatively small amount of lysing agent is used for the milk, the milk is not diluted. Therefore, it can be expected that the cells can be detected with higher sensitivity. Moreover, when using a comparatively large amount of lysing agent with respect to milk, the influence by the fat globule and protein in milk is reduced, and it can be anticipated that a microbial cell can be detected in a shorter time.
  • the ratio of milk in the mixture of milk and lysing agent (milk / (milk + lysing agent) x 100) is higher from the viewpoint that the detection sensitivity can be increased, and any other conditions are However, it can be, for example, 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, and further preferably 30% or more.
  • the upper limit can be set to 100% by using a lysis agent solidified by means such as drying, whatever the other conditions.
  • the ratio of milk can be 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less.
  • the upper limit value may be determined in consideration of easiness of mixing, stability as a solution of the lysis agent, and the like.
  • milk may be simply mixed with a lysing agent.
  • the temperature at the time of mixing and the treatment time for the subsequent enzyme to act are not particularly limited as long as the lytic enzyme to be used can exert its activity, and may usually be room temperature. Those skilled in the art can appropriately design the time required for the processing time after mixing in consideration of the lysis rate.
  • the treatment time can be significantly shortened compared with the case where only the lytic enzyme is used.
  • the treatment time in the present invention is generally from several tens of minutes to several hours, more specifically within 120 minutes, preferably within 60 minutes, and more preferably within 45 minutes.
  • the treatment time can also be set to substantially 0 (milk and a lysis agent are mixed and immediately subjected to measurement). Even in such a short time, according to the present invention, a lysis rate of 90% or more is ensured, and highly sensitive detection of staphylococci can be performed.
  • milk containing S. aureus at about 5 ⁇ 10 8 cells / ml is treated with the lysis agent of the present invention for about 30 minutes. It has been confirmed that a lysis rate of 100% can be achieved.
  • the lysis rate is the lysis rate of the target staphylococci containing the lysate after treatment with an appropriate concentration of nonionic surfactant in advance, followed by sonication and sufficient enzyme treatment as necessary. 100%.
  • the staphylococci lysed according to the present invention can be detected by various immunological methods using components derived from bacterial cells as antigens.
  • immunological measurement methods include immunochromatography, aggregation reaction, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), or fluorescence immunoassay (FIA).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FFA fluorescence immunoassay
  • a blocking substance for preventing non-specific adsorption or a substance for preventing a cross reaction with bacteria other than the target bacteria may be used.
  • Antigen-antibody reaction is performed by sandwich assay using “labeled first antibody against specific substance” retained in the first part and “second antibody against specific substance” immobilized on the second part. It can be detected by the method. Alternatively, the antigen-antibody reaction may be detected by a competition method using a labeled specific substance held in the first part and an antibody against the specific substance immobilized in the second part. However, in the present invention, a sandwich assay method in which the detection sensitivity is high and the antibody detection line appears positive is preferable.
  • the immunochromatography apparatus is an apparatus for detecting a specific substance in milk by an immunochromatography method, and includes a first antibody labeled against the specific substance or a first part in which the labeled specific substance is retained. A second part linked downstream of the first part and immobilized with a second antibody against the specific substance, and linked to the first part or upstream of the second part, and in the milk A device comprising a test piece having a third portion with a void from which milk fat globules can be removed.
  • the fat globule removing member (third portion) 7 is installed downstream of the sample addition member 4 and upstream of the labeled antibody-impregnated member (first portion) 1.
  • the immunochromatography apparatus can be manufactured using a commercially available material by a known method.
  • the material used for the first part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton, or the like.
  • the material used for the second part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably nitrocellulose, mixed nitrocellulose ester, polyvinylidene fluoride, nylon or the like.
  • the material used for the third part preferably has voids that can remove milk fat globules with a diameter of 1 to 10 ⁇ m contained in the milk.
  • the third part needs to be arranged upstream of the second part made of a porous membrane having a pore diameter of several tens to several hundreds of nanometers, and is a position where the sample solution can first contact and pass. It is preferable that the first portion is disposed on the upstream side.
  • the gap of the third part is not limited as long as milk fat globules can be separated, and the retained particle size is preferably 0.1 to 10 ⁇ m, more preferably 1 to 3.5 ⁇ m.
  • the material is not particularly limited as long as it has voids in the above range, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton or the like.
  • Retained particle size is the particle size of milk fat globules that are retained in the third portion without allowing milk fat globules having a particle size larger than that size to pass through the void, and the average pore size of the void in the third portion
  • milk fat globules having a particle size equal to or larger than 50%, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more. % Or more, and most preferably 98% or more is retained in the third portion without passing through the gap.
  • the percentage of milk fat globules retained can be measured by methods well known to those skilled in the art.
  • the GF / B provided by GE Healthcare Biosciences is the retention particle size (the particle diameter with a retention efficiency of 98%.
  • the retention particle size refers to this unless otherwise specified.
  • the product catalog it is possible to confirm the above particle size by methods well known to those skilled in the art.
  • the third part may use only a material having a specific holding particle size, and may be used by stepping together ones having a larger holding particle size in order to increase the separation efficiency of milk fat globules. .
  • the third part is composed of two or more members having voids capable of removing milk fat globules having different particle sizes, it is a preferred aspect of the present invention, and the third part is a first part disposed downstream. It is a further preferred embodiment of the present invention when it is constituted by a member and a second member disposed upstream, and the retained particle size of the second member is larger than the retained particle size of the first member.
  • the retained particle size of the first member disposed downstream is 1.0 to 2.0 ⁇ m
  • the retained particle size of the second member disposed upstream is It is preferably 3.0 to 3.5 ⁇ m.
  • the third part is a member having a small retained particle size and retained particles. It is preferable to configure a combination with a member having a large size.
  • the first part holds the labeled first antibody against the specific substance or the labeled specific substance.
  • the specific substance can be detected by a sandwich assay method.
  • the specific substance labeled in the first part can be detected by the competition method.
  • the sandwich assay method in which detection sensitivity is high, positive and an antibody detection line appears is preferable, the first part should retain the first antibody labeled with a specific substance. Is preferred.
  • first antibody labeled with a specific substance When the first antibody labeled with a specific substance is held in the first part, two types of antibodies are used: a first antibody against the specific substance and a second antibody against the specific substance.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that can simultaneously bind to the specific substance so that the specific substance can be detected by sandwich assay, and the first antibody recognizes the first antibody.
  • the epitope of the specific substance is preferably different from the epitope of the specific substance recognized by the second antibody.
  • the first antibody or specific substance held in the first portion is labeled.
  • the label used in the present invention include colored particles, enzymes, radioisotopes, and the like, but it is preferable to use colored particles that can be detected visually without the need for special equipment.
  • the colored particles include, but are not limited to, metal fine particles such as gold and platinum, non-metal particles, and latex particles.
  • the colored particles may be any size as long as they can be transported downstream through the voids of the test piece, but a diameter of 1 nm to 10 ⁇ m is preferable. More preferably, it is 5 nm to 1 ⁇ m, and further preferably 10 nm to 100 nm.
  • staphylococci in milk can be detected.
  • Staphylococcus aureus refers to Staphylococcus (Staphylococcus) bacteria belonging to the genus, including Staphylococcus aureus (S. aureus), of the other Staphylococcus spp. Bacteria, and CNS (Coagulase Negative Staphylococcus ) are included.
  • CNS includes Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus epidermidis) and the like.
  • staphylococci contained in milk itself containing fat globules and high-concentration proteins obtained from livestock such as cattle by using a lytic agent in which a lytic enzyme and a surfactant are appropriately mixed. can be detected.
  • the specific substance to be measured in the present invention can be any substance that can be measured by an immunological method such as immunochromatography, but is preferably a bacterial component or a substance secreted by bacteria. More preferably, it is a bacterial L7 / L12 ribosomal protein. L7 / L12 ribosomal proteins have high detection sensitivity due to the presence of multiple copies in the cell.
  • the antibody used in the present invention can be prepared by the method described in WO 00/06603 pamphlet.
  • the bacterial ribosomal protein L7 / L12 can be prepared using the full-length protein of the bacterial ribosomal protein L7 / L12 or a partial peptide thereof as the antigen, but it is preferable to prepare the full-length protein as the antigen.
  • This partial peptide or full-length protein is directly or after cross-linking with a carrier protein, and then inoculated into an animal together with an adjuvant as necessary, and an antibody (polyclonal antibody) that recognizes the L7 / L12 ribosomal protein by recovering the serum. Serum can be obtained.
  • the antibody can be purified from the antiserum and used.
  • the animals to be inoculated include sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and sheep, rabbits and the like are particularly preferable for producing polyclonal antibodies.
  • the antibody it is more preferable to apply a monoclonal antibody obtained by a known method for producing a hybridoma cell. In this case, a mouse is preferable.
  • the monoclonal antibody a monoclonal antibody that reacts with ribosomal protein L7 / L12 of a specific bacterium that causes mastitis and does not react with ribosomal protein L7 / L12 of a bacterium that causes mastitis other than the specific bacteria. By screening, it can be used for diagnosis of whether or not the bacterium has an infection.
  • the antibody reacts with a component of a specific bacterium causing mastitis or a substance secreted by the bacterium, and does not react with a component of a bacterium causing mastitis other than the specific bacterium or a substance secreted by the bacterium.
  • a monoclonal antibody an antibody that recognizes other than ribosomal protein L7 / L12 as an antigen can be used.
  • the monoclonal antibody it is preferable to use a monoclonal antibody whose antigen-antibody reaction is not inhibited by contaminants other than the specific substance contained in the milk.
  • milk contains a large amount of protein such as casein, which may inhibit the reaction between a specific substance and a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody against a specific substance is produced by a conventional method, for example, it may be preferable to appropriately select and use a monoclonal antibody in which the antigen-antibody reaction is not inhibited by casein or the like, or a monoclonal antibody that has little influence on the antigen-antibody reaction. is there.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen After manufacturing a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen according to a conventional method, such a monoclonal antibody is examined whether the antigen-antibody reaction is inhibited in the presence of contaminants such as casein, It can be easily obtained by selecting a monoclonal antibody that does not substantially inhibit the reaction.
  • the immunochromatography apparatus of the present invention is a combination of a container, for example, a microtube, and an additive solution, for example, an additive solution containing a lytic enzyme or a surfactant for lysing bacteria to elute the ribosomal protein L7 / L12 into the solution. It can also be provided as a kit.
  • Example 1 Effect of amphoteric surfactant in the presence of lytic enzyme and nonionic surfactant in the detection of Staphylococcus aureus by enzyme immunoassay (ELISA)
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Example 2 Effect of amphoteric surfactants in the presence of lytic enzymes and nonionic surfactants in the detection of Staphylococcus aureus by immunochromatographic method (1) Preparation of immunochromatographic device The immunochromatographic device was prepared as follows did. (A) Gold colloid-labeled impregnated material Mix BBInternational's gold colloid solution (particle size 60nm) 0.9mL with 0.1M potassium phosphate pH7.0, add gold antibody colloid-labeled monoclonal antibody SA-2 at 100 ⁇ g / mL at room temperature.
  • gold colloid labeled antibody a colloidal gold labeled monoclonal antibody SA-2 (hereinafter referred to as “gold colloid labeled antibody”) solution. This solution was centrifuged (15000 ⁇ rpm, 5 minutes) to precipitate the colloidal gold labeled antibody, and the supernatant was removed to obtain a colloidal gold labeled antibody.
  • the colloidal gold labeled antibody was suspended in 20 mm Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing 0.25% BSA, 2.5% sucrose and 35 mm NaCl to obtain a colloidal gold labeled antibody solution.
  • a 10 mm ⁇ 300 mm belt-shaped glass fiber pad was impregnated with 2 mL of the colloidal gold labeled antibody solution and dried under reduced pressure at room temperature to obtain a colloidal gold labeled antibody impregnated member 1 (first part).
  • Capture site of complex of antigen and colloidal gold labeled antibody A nitrocellulose membrane having a width of 25 mm and a length of 300 mm was prepared as a membrane carrier 2 (second part) for chromatographic development of a chromatographic medium. A solution containing 1.5 mg / mL of the monoclonal antibody SA-1 was applied in a line at 1 ⁇ L / cm at a position 10 mm from the end of the chromatographic development start side in the membrane carrier 2 for chromatographic development, It was dried at 50 ° C. for 30 minutes, then immersed in 0.5% sucrose solution for 30 minutes and dried overnight at room temperature. Staphylococcus aureus ribosomal protein It was designated as capture site 3 for the complex of L7 / L12 antigen and colloidal gold-labeled antibody.
  • FIG. 2 shows a cross-sectional view of the immunochromatograph device.
  • 25 mm GF / DVA manufactured by GE Healthcare Biosciences
  • Filter member 4 consisting of glass fiber with a thickness of 776 ⁇ m and a retention particle size of 3.5 ⁇ m
  • 20 mm GF / AVA GE Healthcare Biosciences
  • Filter member 7 consisting of glass fiber with a thickness of 299 ⁇ m and a retention particle size of 1.7 ⁇ m
  • filter paper was prepared as the absorbing member 5.
  • Test Milk milk was measured with an immunochromatograph apparatus as follows. Take 100 ⁇ l of milk with a final concentration of 1 ⁇ 10 5 (cfu / ml) Staphylococcus aureus in a microtube and prepare a lysis solution (final concentration 1% Tween20, 10 ⁇ g / ml (35 units / ml) lysostaphin, 0.1 M MOPSO pH 7.5, Zwettergent 3-12 with different concentrations, or DDMAB) (150 ⁇ l) was added and mixed for 30 minutes at room temperature. Commercial milk drinks were used for milk juice.
  • the immunochromatograph device is immersed in the mixed solution from the sample addition member 4 and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for development, and then the ribosomal protein L7 / L12 antigen and gold colloid-labeled antibody captured at the supplemental site 3
  • a red-purple line that increases or decreases the capture of the complex in proportion to the capture amount was measured with an apparatus C10066 (manufactured by Hamamatsu Photonics).
  • Amphoteric surfactants were added at different concentrations, and the lysis rate at each concentration was calculated with the lysis rate of the bacterial solution preliminarily treated by the same method as in Example 1 as 100%. The results are shown in Figure 3. It was revealed that the lysis rate was greatly improved depending on the concentration when any amphoteric surfactant was used.
  • Example 3 Measurement of milk sample by immunochromatography The immunochromatography method was performed on milk samples from cattle with mastitis. The measurement was performed according to Example 2 (Bacterial treatment solution: final concentration 1% Tween 20, 10 ⁇ g / ml (35 units / ml) lysostaphin, 0.1 M MOPSO pH 7.5, final concentration 0.1% Zwettergent 3-12, 30 at room temperature. After the minute treatment, it was developed at room temperature for 30 minutes.) The reddish purple line that appeared was visually judged (positive +, negative-). On the other hand, in order to confirm the number of Staphylococcus aureus in milk, it quantified by the culture method.

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Abstract

　家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを検出するための溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法および検出キットを提供することを課題とする。ブドウ球菌の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、溶菌酵素および少なくとも一の両性界面活性剤、好ましくはさらに少なくとも一の非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む方法を提供する。溶菌酵素は、好ましくはリゾスタフィンである。

Description

乳汁中のブドウ球菌を検出する方法
　本発明は、家畜の乳汁中から乳房炎原因菌であるブドウ球菌を検出するための溶菌方法および検出方法に関するものである。
　牛、羊、ヤギに代表される家畜の乳汁は無菌的なものではなく、疾患や環境が原因で何らかの微生物が混入している場合がある。特に乳房への微生物の感染による疾患ではしばしば乳汁中に多くの微生物を排菌することが知られている。微生物の感染が原因で引き起こされる代表的な家畜の疾患に乳房炎がある。
　乳房炎とは、乳管系、乳腺組織の炎症であり、主に微生物が乳房内に侵入・定着し、増殖することによって引き起こされる。乳房炎は多くの動物が罹患するが、特に乳牛における牛乳房炎は乳牛全体の15～40％が罹患すると言われ、酪農家にとって極めて重要な疾患の一つである。乳牛が乳房炎に罹患すると、乳汁の合成機能が阻害され、泌乳量の減少や場合によっては泌乳の停止が起こるだけでなく、治療費や、乳質低下による乳価のペナルティーなど多大な経済的損失を酪農家に与える。さらには、伝染防止のために乳房炎罹患分房を個別に搾乳するなど、酪農家にかかる労働負担も増加する。
　乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされる。原因菌のなかでもブドウ球菌、特に黄色ブドウ球菌は難治性の乳房炎の原因菌として知られ、搾乳機等を介して他の乳牛に伝染することが知られている。
　乳汁からブドウ球菌の検出方法としては培養法が広く用いられている。培養法は結果がでるまでに数日間を要するため迅速な原因菌特定には適さない。一方、原因菌に特異的な成分に対する抗体を用いる抗原抗体反応による同定法、特にイムノクロマトグラフ法が、数10分で結果を判定できるため、迅速・簡便な検査方法として広く用いられている（例えば特許文献1）。本発明者らは、イムノクロマトグラフ法を、家畜の乳汁中の物質を検出するための方法としても検討してきた（特許文献2）。
　イムノクロマトグラフ法などの免疫測定法では、菌体を溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。他方、黄色ブドウ球菌を溶菌する方法としては溶菌酵素リゾスタフィンを用いる方法（特許文献1および特許文献3）、溶菌酵素および/または溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理する方法（特許文献4）、ならびに溶菌酵素、非イオン界面活性剤、およびキレート剤を含む溶菌試薬により処理する方法（特許文献5）が知られている。しかしながら、上記特許文献ではいずれも培養した菌液を用いており、乳汁のような高タンパク、高脂肪の溶液中で溶菌効果については記載されていない。
特開平1-244370号公報 特開2012-122921号公報 特開平11-28099号公報 国際公開WO2005/064016 特開2006-246792号公報
Journal of Dairy Research (1997) 64 253-260
　乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされるが、原因菌によって効果を示す抗生物質が異なる。また、特定の微生物では他方の分房や個体に伝染するなど、性質やその後の対応が異なることから、乳汁中に存在する原因菌を迅速・簡便・高感度に同定することが極めて重要となる。特に難治性の乳房炎の原因となり、伝染性のある黄色ブドウ球菌に関しては、感染早期に発見することが乳房炎の被害拡大を防ぐために非常に重要となる。しかしながら感染早期の場合、乳汁中の黄色ブドウ球菌の菌数が少ない場合も多く、迅速にまた、高感度に検出できる方法が求められる。
　菌の検出方法として広く用いられている培養法は、結果が得られるのに数日間を要するという問題がある。一方、イムノクロマトグラフ法などの抗原抗体反応に基づく免疫測定法は、迅速・簡便に原因菌を検出することが可能となり早期の抗菌薬治療が可能となる利点がある。
　免疫測定法にて原因菌の菌体内の特定物質を高感度に検出するには、菌体を高効率に溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。しかしながら、乳汁を検体として用いた場合、乳汁中に多量に含まれるカゼインなどのタンパク質や乳脂肪球などの影響により従来技術では溶菌が十分に行われないことが多い。また黄色ブドウ球菌は乳汁中の乳脂肪球に吸着することが知られており（非特許文献１）、通常の手法による溶菌率がさらに低下しやすいことが分かっている。このように乳汁中のブドウ球菌を高効率に検出するための有効な溶菌方法は知られていなかった。
　本発明は、家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを検出するための溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法および検出キットを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は、乳汁中のブドウ球菌を検出するためには、高効率に菌体内の対象抗原を抽出する必要があると考え、乳汁中のブドウ球菌を高効率に溶菌するために溶菌酵素および複数の界面活性剤を同時に用いることで溶菌の効率が向上し、乳汁中のブドウ球菌を高感度に検出できることを見出し、本発明を完成するにいたった。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
[1]  ブドウ球菌の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、溶菌酵素および少なくとも一の両性界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む、方法。
[2]  該溶菌酵素が、リゾスタフィンである、[1]に記載の方法。
[3]  溶菌剤が、さらに少なくとも一の非イオン界面活性剤を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]  両性界面活性剤が、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインからなる群より選択されるいずれかである、[1]～[3]のいずれか一に記載の方法。
[5]  非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択されるいずれかである、[1]～[4]のいずれか一に記載の方法。
[6]  家畜乳汁中のブドウ球菌の溶菌のために用いる、溶菌酵素および少なくとも一の両性界面活性剤を含有する溶菌剤。
[7]  家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、[6]に記載の溶菌剤。
[8]  [1]～[5]のいずれか一に記載の方法を含み、溶菌により放出されたブドウ球菌の菌体内由来の特定物質を検出する工程をさらに含む、家畜乳汁中のブドウ球菌の検出方法。
[9]  特定物質の検出工程が、イムノクロマトグラフ方法により実施される、[8]に記載の方法。
[10]　イムノクロマトグラフ方法が、
（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および
（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、[9]に記載の方法。
[11]　該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、[10]に記載の方法。
[12]　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される、[10]または[11]に記載の方法。
[13]　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、[12]に記載の方法。
[14]　 [6]または[7]に記載の溶菌剤と、　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置とからなる、家畜乳汁中のブドウ球菌検出用キット。
　本発明は、以下も提供する。
［1］　乳汁中のブドウ球菌の溶菌方法であって
　乳汁に、リゾスタフィン、イオン界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む、溶菌方法。
［2］　該イオン界面活性剤が両性界面活性剤である、［1］に記載の溶菌方法
［3］　該両性界面活性剤が、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチライト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインから選択されるいずれかであり；ならびに／または
　該非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択されるいずれかである、［2］に記載の溶菌方法。
［4］　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該両性界面活性剤の終濃度が、0.03％以上0.2％以下である、［2］または［3］に記載の溶菌方法。
［5］　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該リゾスタフィンの終濃度が、0.1mg/μl以上200mg/μl以下であり；および／または
　　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下である、［4］に記載の溶菌方法。
［6］　［1］～［5］のいずれか一に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程
を含み、
　溶菌により放出されたブドウ球菌の菌体内由来の特定物質を検出する工程
をさらに含む、乳汁中のブドウ球菌の検出方法。
［7］　検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される［6］に記載の方法。
［8］　該イムノクロマトグラフ方法が、
（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および
（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程
を含む、［7］に記載の検出方法。
［9］　該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、［8］に記載の検出方法。
［10］　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、［8］または［9］に記載の検出方法。
［11］　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、［10］に記載の検出方法。
［12］　［1］～［5］のいずれか一に定義された、溶菌剤。
［13］　家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、［12］に記載の溶菌剤。
［14］　［12］または［13］に記載の溶菌剤と、
　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
を含む、乳汁中のブドウ球菌の検出用キット。
　本発明によれば、乳汁中のブドウ球菌を迅速・簡便・高感度に、かつその場で検出することができる。特に、牛乳房炎を診断する場合において、標識が視認できるものである場合には装置等を用いずに酪農場で実施することができ、病状の更なる悪化の前に迅速に原因菌を特定し、適切な抗生物質の選択などの的確な治療方針や、感染拡大防止のための措置を早期に決定することができる。
酵素免疫測定法（ELISA）による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果を示す。 実施例2で用いたイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。1：標識抗体含浸部材（第1部分）、2：クロマト展開用膜担体（第2部分）、3：捕捉部位、4：試料添加用部材かつ脂肪球除去用部材（第3部分）、5：吸収用部材、6：基材、および7：脂肪球除去用部材（第3部分） イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン性界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。なお、本発明において、数値範囲を「X～Y」で表すときは、両端の値を含む。「％」は、特に記載した場合を除き、質量に基づく割合を示す。「Aおよび（ならびに）／またはB」は、AとBの少なくとも一方の意であり、Aのみである場合、Bのみである場合、並びにAおよびBである場合がある。
　本発明は、乳汁中の細菌を溶菌するための溶菌剤を提供する。本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および特定の界面活性剤を含む。
［溶菌酵素］
　本発明における溶菌酵素の種類は特に限定されず、任意の2種以上の溶菌酵素を適宜組み合わせて用いてもよい。乳房炎の起炎菌として大腸菌(Escherichia coli)、クレブシエラ(Klebsiella)属に属する細菌、または黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による感染が多発することから、これらの微生物に対して溶菌作用を発揮できる溶菌酵素を1種または2種以上組み合わせて用いることも好ましい。例えばリゾチーム、リゾスタフィン、ペプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アクロモペプチダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼなどから選ばれる1種または2種以上の溶菌酵素を用いることができる。例えば、溶菌酵素としてリゾチームと細胞膜溶解剤とを用いる方法が提案されている（特開昭63-167799号公報）。
　乳房炎の起炎菌としてブドウ球菌の存在が特に疑われる場合には、ブドウ球菌に対して特異的に溶菌作用を発揮するリゾスタフィンを単独で、または他の溶菌酵素と組み合わせて用いることが好ましい場合がある。リゾスタフィンにより黄色ブドウ球菌を溶菌する方法については特開平11-28099号公報に開示があり、当業者は溶菌酵素としてリゾスタフィンを容易に入手することができる。上記特許公報の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。
　天然型リゾスタフィンは、Staphylococcus simulansが生産する亜鉛プロテアーゼであり、黄色ブドウ球菌またはその同属菌の細胞壁ペプチドグリカンのグリコペプチド鎖中のグリシルグリシン結合を加水分解することによりこれらの菌を溶菌することが知られている。本明細書において、リゾスタフィンの用語には、上記天然型リゾスタフィン以外に、上記加水分解活性を失わない範囲で、天然型リゾスタフィンのアミノ酸配列中の1または複数のアミノ酸に付加、欠失、および/または置換等の変異が導入された変異型リゾスタフィンが包含される。また、加水分解活性を失わない範囲で、該天然型リゾスタフィンまたは変異型リゾスタフィンに他の化合物、例えば、糖類やポリエチレングリコール等を結合させた修飾型リゾスタフィンも包含される。これらのリゾスタフィンは、特開平11-28099号公報に記載された培養方法または遺伝子工学的手法で得るか、市販品の購入により入手することが可能である。
　溶菌剤中での溶菌酵素の含量（複数の溶菌酵素を用いる場合は、溶菌酵素総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、下限は、3500 units/mg以上の活性の酵素剤（または酵素タンパク質）を用いた場合は、乳汁と混合した場合の酵素剤（または酵素タンパク質）の終濃度が0.03μg/ml以上となるようにすることができ、好ましくは0.15μg/ml以上であり、より好ましくは0.3μg/ml以上であり、さらに好ましくは1.5μg/ml以上であり、特に好ましくは1μg/ml以上である。また溶菌酵素の含量の上限は、経済的な観点等から適宜定けることができ、下限がいずれの場合であっても、200μg/ml以下とすることができ、好ましくは100μg/ml以下であり、より好ましくは75μg/ml以下であり、さらに好ましくは50μg/ml以下であり、特に好ましくは25μg/ml以下である。酵素活性では、下限は、乳汁と混合した場合の終濃度が0.105 units/ml以上となるようにすることができ、好ましくは0.525 units/ml以上であり、より好ましくは1.05 units/ml以上であり、さらに好ましくは5.25 units/ml以上であり、特に好ましくは10.5 units/ml以上である。また上限は、下限がいずれの場合であっても、700 units/ml以下とすることができ、好ましくは350 units/ml以下であり、より好ましくは262.5 units/ml以下であり、さらに好ましくは175 units/ml以下であり、特に好ましくは87.5 units/ml以下である。なお、本明細書で酵素活性をいうときは、次の定義による。
　酵素活性の定義：　1 unitは、熱処理した対象菌（好ましくはStaphylococcus aureus、より好ましくはStaphylococcus aureus 8325-4）を基質とした懸濁液について、25℃、pH8.0、600nmで0.01 OD/minの濁度における減少を生じさせる量である（0.2 mol/Lトリス緩衝液1.0mL中、pH8.0、25℃、初期濁度1.0）。
［界面活性剤］
　水に溶かしたときに、電離してイオンとなる界面活性剤をイオン界面活性剤またはイオン性界面活性剤といい、イオンにならない界面活性剤を非イオン（ノニオン）界面活性剤という。イオン界面活性剤はさらに、陰イオン（アニオン）界面活性剤、陽イオン（カチオン）界面活性剤および両性界面活性剤に分類される。
　本発明においては、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の両性界面活性剤、少なくとも一の陰イオン界面活性剤、もしくは少なくとも一の陽イオン界面活性剤、またはこれらのいずれかの組み合わせを用いる。好ましくは、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の両性界面活性剤もしくは少なくとも一の非イオン界面活性剤、またはこれらの組み合わせを用いる。さらに好ましくは、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の両性界面活性剤および非イオン界面活性剤を組み合わせて用いる。
　両性界面活性剤としては、アミノ酸系（アルキルアミノ脂肪酸塩）、ベタイン系 （アルキルベタイン）、アミンオキシド系（アルキルアミンオキシド）等があげられるが、特に限定されない。より特定された例としては、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインがあげられる。より具体的な例としては、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、N-Dodecyl-N,N-(dimethylammonio)butyrateがあげられる。
　溶菌剤中での両性界面活性剤の含量（複数の両性界面活性剤を用いる場合は、両性界面活性剤総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、下限値に関しては、溶菌酵素の含量がいずれの場合であっても、乳汁と混合した場合の終濃度が0.03％以上となるようにすることができ、好ましくは0.05以上であり、より好ましくは0.06％以上であり、さらに好ましくは0.07％以上であり、特に好ましくは0.08％以上である。また両性界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、1％以下とすることができ、好ましくは0.75％以下であり、より好ましくは0.5％以下であり、さらに好ましくは0.3％以下であり、特に好ましくは0.2％以下である。
　非イオン界面活性剤としては、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリソルベート類（脂肪酸ソルビタンエステルにエチレンオキシドが数十分子縮合したもの）などがあげられるが、特に限定されない。特に好ましい例の一つは、ポリソルベート類、より特定すると、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(60)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(65)ソルビタントリステアレート、およびポリオキシエチレン(80)ソルビタンモノオレエート等、ならびにポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、より特定するとポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等である。
　溶菌剤中での非イオン界面活性剤の含量（複数の非イオン界面活性剤を用いる場合は、非イオン界面活性剤総量としての含量を指す。）は、例えばイムノクロマトグラフ法を用いる場合は展開液の流れが確保される限り、特に限定されないが、いずれの場合であっても、下限は、乳汁と混合した場合の終濃度が0.03％以上となるようにすることができ、好ましくは0.05％以上であり、より好ましくは0.075％以上であり、さらに好ましくは0.1％以上であり、特に好ましくは0.3％以上である。また非イオン界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、10％以下とすることができ、好ましくは7.5％以下であり、より好ましくは5％以下であり、さらに好ましくは3％以下であり、特に好ましくは2％以下である。
　陰イオン界面活性剤としては、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、その他のいずれも好適に用いることができる。より具体的な例として、アルキルエーテルカルボン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、α－オレフィンスルホン酸塩（AOS）、ジアルキルスルホコハク酸塩、ナフタレンスルホン酸塩のホルムアルデヒド縮合物、アルキル硫酸エステル塩（AS）、高級アルコールにエチレンオキシドを付加して硫酸化したポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩（AES）、高級アルコールやそのエチレンオキシド付加物などのリン酸エステル塩等をあげることができる。さらに具体的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、N-ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、N-ミリストイルザルコシン酸ナトリウム等のN-アシルザルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、N-パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のN-アシルグルタミン酸塩、N-メチル-N-アシルアラニンナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウムをあげることができる。
　陽イオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型のいずれも好適に用いることができ、より具体的な例として、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等をあげることができる。
［配合例］
　特に好ましい態様の一つにおいては、溶菌剤は、リゾスタフィン、両性界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する。リゾスタフィン、両性界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤において、好ましい両性界面活性剤は、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチライト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインから選択されるいずれかであり；好ましい非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。このような溶菌剤における各成分の濃度は、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、リゾスタフィンの終濃度が、0.1mg/μl以上200mg/μl以下であり、両性界面活性剤の終濃度が、0.03％以上0.2％以下であり、かつ非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下であるようにするとよい。
［その他の成分］
　本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および界面活性剤以外に、意図した効果を著しく損なわない限り、一種またはそれ以上の他の成分を含むことができる。溶菌酵素および界面活性剤以外の成分の好ましい例は、溶菌を促進する効果を有する物質である。具体的には、グルタルアルデヒド、ハロゲン化合物、クロルヘキシジン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノール）、フェノール、過酸化水素、アクリノール、グアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸およびその塩、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン）、ならびに２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンおよびチオフェノールなどの還元剤をあげることができるが、これらに限定されない。
［溶菌条件、溶菌率］
　本発明においては、溶菌剤は、乳汁に混合して用いることができる。乳汁と溶菌剤との混合比は、溶菌酵素等の終濃度が適切に維持され、十分な溶菌率が確保できる限り、特に限定されない。乳汁に対して比較的少量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁が希釈されない。したがって、より高い感度で菌体を検出できると期待できる。また乳汁に対して比較的大量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁中の脂肪球やタンパク質による影響が減じられ、より短時間で菌体を検出できると期待できる。乳汁と溶菌剤との混合物における乳汁の割合（乳汁／（乳汁＋溶菌剤）×100）は、高いほど検出感度を上げることができるとの観点からは、他の条件がいずれの場合であっても、例えば5％以上とすることができ、10％以上とすることが好ましく、20％以上とすることがより好ましく、30％以上とすることがさらに好ましい。上限値は、他の条件がいずれの場合であっても、乾燥等の手段によって固形化した溶菌剤を用いることにより、乳汁の割合を100％とすることができる。また、他の条件がいずれの場合であっても、乳汁の割合は90％以下とすることができ、80％以下、70％以下、60％以下、または50％以下とすることができる。上限値は、混合の容易さ、溶菌剤の溶液としての安定性等を考慮して決定してもよい。
　本発明においては、乳汁は溶菌剤と単に混合すればよい。混合する際の温度、およびそれに続く酵素が作用するための処理時間は、用いる溶菌酵素が活性を発揮できる温度であれば特に限定されず、通常、室温でよい。混合後の処理時間のために必要な時間は、当業者であれば、溶菌率を考慮して、適宜設計することができる。本発明においては、ブドウ球菌に対して適切な組み合わせおよび濃度の溶菌酵素および界面活性剤を用いているので、処理時間を、溶菌酵素のみを用いる場合よりも大幅に短くすることができる。本発明における処理時間は、概ね数十分間～数時間以内であり、より具体的には120分間以内とすることができ、60分以内とすることが好ましく、45分以内とすることがさらに好ましく、25分間以内とすることがさらに好ましく、20分以内とすることがさらに好ましく、15分以内とすることがさらに好ましい。処理時間を、実質0とする（乳汁と溶菌剤を混合して、直ちに測定に供する）こともできる。このような短時間であっても、本発明に依れば90%以上の溶菌率が確保され、高感度のブドウ球菌の検出が実施できる。
　本発明者らの検討によると、本明細書の実施例に記載した条件では、黄色ブドウ球菌を約5×108 cells/mlで含む牛乳を本発明の溶菌剤により約30分間処理することにより100％の溶菌率を達成できることが確認できている。なお溶菌率は、対象となるブドウ球菌を含む液を、あらかじめ適切な濃度の非イオン界面活性剤で処理した後、さらに超音波処理し、必要に応じ十分な酵素処理を行ったものの溶菌率を100％とすることができる。
［検出手段］
　本発明により溶菌されたブドウ球菌は、菌体由来の成分を抗原として、各種の免疫学的方法により検出することができる。免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフ法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ELISA法）、放射能免疫測定法（RIA法）、または蛍光免疫測定法（FIA法）などをあげることができるが、これらに限定されることはない。免疫学的方法の実施に際し、非特異吸着を防ぐためのブロッキングのための物質や、対象菌以外の菌との交差反応を防ぐための物質を用いてもよい。
　イムノクロマトグラフ法を用いる場合、典型的には、次のように実施することができる。
［イムノクロマトグラフ法、イムノクロマトグラフ装置］
　抗原抗体反応は、第1部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第2部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第1部分に保持されている標識された特定物質と、第2部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
　イムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するための装置であって、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図2に断面模式図を示した試験片があげられる。図2においては、脂肪球除去用部材（第3部分）7は、試料添加用部材4の下流、かつ標識抗体含浸部材（第1部分）1の上流に設置されている。
　イムノクロマトグラフ装置は公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。　第1部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
　第2部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
　第3部分に使用する材料は、乳汁中に含まれる直径1～10数μmの乳脂肪球を除去できる空隙を有していることが好ましい。第3部分は、試料溶液が孔径数10～数100nmの多孔性のメンブレンからなる上記第2部分の上流側に配置されている必要があり、試料溶液が最初に接触・通過できる位置である、上記第1部分の上流側に配置されていることが好ましい。
　第3部分が有する空隙は乳脂肪球を分離できる大きさであればよく、保持粒子サイズは好ましくは0.1から10μmであり、より好ましくは1から3.5μmである。材料は上記の範囲の空隙を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはセルロース誘導体等繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。保持粒子サイズとは、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球が空隙を通過できずに第3部分に保持される乳脂肪球の粒子サイズのことであり、第3部分の空隙の平均ポアサイズに実質的に対応しているが、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球の50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは98％以上が空隙を通過できずに第3部分に保持される。保持される乳脂肪球の割合は当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社から提供されているGF/Bは保持粒子サイズ（保持効率98％の粒子直径のこと。本明細書で保持粒子サイズというときは、特に記載した場合を除き、この意味である。）が1.0μmであることが同製品カタログにおいて明らかにされているが、当業者に周知の方法で上記の粒子サイズを確認することが可能である。
　上記第3部分は、特定の保持粒子サイズを有する材料のみを用いてもよく、乳脂肪球の分離効率を高めるために保持粒子サイズが大きいものから小さいものを段階的に張り合わせて用いてもよい。上記第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される場合は本発明の好ましい態様であり、第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい場合は本発明のさらに好ましい態様である。第3部分を2種の部材により構成する場合には、下流に配置された第一の部材の保持粒子サイズが1.0～2.0μmであり、上流に配置された第二の部材の保持粒子サイズが3.0～3.5μmであることが好ましい。高濃度で広い粒径分布を有する乳脂肪球を含む乳汁、好ましくは搾乳後の未希釈の乳汁から特定物質を高感度に検出するためは、第3部分を保持粒子サイズの小さな部材と保持粒子サイズの大きな部材との組み合わせにより構成することが好ましい。
　上記第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体、または標識された特定物質が保持されている。第1部分に、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができる。また、第1部分に標識された特定物質が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されていることが好ましい。
　第1部分に特定物質に対する標識された第一の抗体を保持させる場合には、特定物質に対する第一の抗体と、特定物質に対する第二の抗体の、2種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができるように、上記第一の抗体と上記第二の抗体は、当該特定物質に同時に結合できることができる抗体であり、上記第一の抗体が認識する当該特定物質のエピトープは、上記第二の抗体が認識する当該特定物質のエピトープとは異なることが好ましい。
　本発明において、検出可能な信号を得るために、第1部分に保持される第一の抗体または特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどがあげられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などがあげられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が1nmから10μmが好ましい。より好ましくは、5nmから1μmであり、さらに好ましくは10nmから100nmである。
［検出対象］
　本発明により、乳汁中のブドウ球菌を検出できる。本発明で「ブドウ球菌」というときは、特に記載した場合を除き、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属に属する細菌をいい、これにはStaphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、それ以外のスタフィロコッカス属の細菌、およびCNS（Coagulase Negative Staphylococcus、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）が含まれる。CNSには、Staphylococcus intermedius、Staphylococcus hyicus、Staphylococcus xylosus、Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ球菌）等が含まれる。本発明においては、溶菌酵素と界面活性剤が適切に配合された溶菌剤を用いることにより、牛等の家畜から得られた、脂肪球と高濃度のタンパク質を含有する乳汁そのものに含まれるブドウ球菌を検出することができる。
　本発明で測定される特定物質は、イムノクロマトグラフ法等の免疫学的な方法で測定できる物質であれば何れでも可能であるが、細菌の成分または細菌が分泌する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、細菌のL7/L12リボゾームタンパク質である。L7/L12リボソームタンパク質は、細胞内に多コピー存在するために検出感度が高い。
［抗体］
　本発明に用いる抗体は、国際公開第00/06603号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L7/L12を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質L7/L12の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでL7/L12リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L7/L12と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L7/L12とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
　抗体が乳房炎の原因となる特定の細菌の成分または該細菌が分泌する物質と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌の成分または該細菌が分泌する物質とは反応しないモノクローナル抗体であれば、リボゾームタンパク質L7/L12以外を抗原として認識する抗体であっても使用することができる。
　また、モノクローナル抗体としては、乳汁中に含まれる特定物質以外の夾雑物により抗原抗体反応が阻害されないモノクローナル抗体を用いることが好ましい。例えば、乳汁中にはカゼインなどのタンパク質が大量に含まれており、特定物質とモノクローナル抗体との反応を阻害する場合がある。特定物質に対するモノクローナル抗体を常法により製造するにあたり、例えばカゼインなどにより抗原抗体反応が阻害を受けないモノクローナル抗体や、抗原抗体反応への影響が少ないモノクローナル抗体を適宜選択して用いることが好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、通常の方法に従って抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造した後に、カゼインなどの夾雑物の存在下で抗原抗体反応が阻害されるか否かを調べて、実質的に反応の阻害を受けないモノクローナル抗体を選択することにより容易に取得することができる。
［その他］
　本発明においては、上述した試験片をそのまま使用してイムノクロマトグラフ装置としてもよいし、ケースに収納して、イムノクロマトグラフ装置としてもよい。前者の場合は、試料となる乳汁の量が多い場合に、容器に入った試料に直接試験片の一端を浸して使用することが好ましい。また、後者の場合は、試料となる乳汁の量が少ない場合に、ピペット等で所定量を計量して試験片に滴下して使用することが好ましい。後者の場合のケースの形状は、試験片を収納できればいかなる形状でもよい。ケースの材料はいかなる材料でもよく、ポリプロピレンやポリカーボネートなどが好ましいものとしてあげられる。
　本発明のイムノクロマトグラフ装置は、容器、たとえばマイクロチューブ、および添加液、例えば細菌を溶菌させてリボゾームタンパク質L7/L12を溶液内に溶出させるための、溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液を組合せたキットとして提供することもできる。
実施例1：酵素免疫測定法（ELISA）による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン性界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果
（a）リボゾームタンパク質L7/L12に対するモノクローナル抗体の作製
　金コロイド標識する抗体には、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）リボソームタンパク質L7/L12モノクローナル抗体を使用した。国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例5に記載の方法に準じて、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのL7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記L7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種（SA-1およびSA-2）の組合せを選択した。
（b）ELISAによる溶菌酵素の効果の確認　溶菌酵素の効果については以下のように確認した。
　10μg/mlのモノクローナル抗体SA-1とPBS溶液100μlを96穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp ELISAプレート）に分注し4℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μlを添加し、室温で1時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.02％Tween20、PBS）で数回洗浄した。市販の牛乳に懸濁した黄色ブドウ球菌（約5×108cells/ml）を表1に記載の溶液で室温にて30分処理後、同牛乳にて100倍に希釈したものを100μl添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、パーオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体SA-2を0.02% Tween20、PBSにて最終濃度1μg/mlになるように希釈してそれぞれ100μl添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μlずつ加え室温10分間反応させた後1 mol/lの塩酸を100μl添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定した。
　上記黄色ブドウ球菌を、あらかじめ終濃度1.0％TritonX-100にて終夜撹拌後、超音波処理（出力10、1min×10回）した菌液を、10（μg/ml）(35 units/ml)リゾスタフィン（和光純薬、3500 unit/mg。以下の実施例において、特に記載した場合を除き、同じ。）にて37℃にて60分間溶菌処理した菌液を用いた場合の溶菌率を100％とし、それぞれの条件における溶菌率を算出した。
　結果を図1に示す。両性界面活性剤を添加していない条件1の場合は溶菌率が55％であったのに対し、両性界面活性剤を添加した場合は、いずれも添加しない場合と比べて溶菌率が増大することが明らかとなった。さらに、非イオン性界面活性剤の種類を変えた条件10～12においても同様に溶菌率が増大することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例2：イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン性界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果
（1）イムノクロマトグラフ装置の作製
　イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製した。
（a）金コロイド標識含浸部材　BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mLに0.1M リン酸カリウム pH7.0を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体SA-2を100μg/mL加え室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体SA-2（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15000×rpm、5分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mm NaClを含有する20mmトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1（第1部分）とした。
（b）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
　幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2（第2部分）として用意した。　モノクローナル抗体SA-1 1.5mg/mLが含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体2におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/cmでライン状に塗布して、これを50℃で30分間乾燥し、その後、0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。Staphylococcus aureusリボソームタンパク質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位3とした。
（c）イムノクロマトグラフ装置の作製　イムノクロマトグラフ装置断面図を図2に示す。上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材と脂肪球除去用部材（第3部分）とを兼ねる部材として25mmのGF/DVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み776μm、保持粒子サイズ3.5μmのフィルター部材4）および20mmのGF/AVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み299μm、保持粒子サイズ1.7μmのフィルター部材7）を貼り合わせ、さらに、吸収用部材5として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材6（厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、5mm幅に切断し、イムノクロマトグラフ装置を作製した。
（2）試験　イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。
　マイクロチューブに終濃度1×105（cfu/ml）の黄色ブドウ球菌を添加した乳汁を100μl分取し、溶菌処理液（終濃度1％　Tween20、10μg/ml(35 units/ml)  リゾスタフィン、0.1M　MOPSO  pH7.5、濃度の異なるZwettergent 3-12、またはDDMAB）150μlを加えて混合し室温で30分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品を用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインを装置C10066（浜松ホトニクス製）にて測定した。両性界面活性剤を濃度を変えて添加し、実施例1と同様の方法にてあらかじめ溶菌処理した菌液の溶菌率を100％として各濃度における溶菌率を算出した。結果を図3に示す。いずれの両性界面活性剤を用いた場合においても濃度に依存して溶菌率が大きく向上していることが明らかとなった。
実施例3：イムノクロマトグラフ法による乳汁サンプルの測定
　乳房炎の牛からの乳汁サンプルを対象としてイムノクロマトグラフ法を実施した。測定は実施例2に準じて行い（溶菌処理液：終濃度1％　Tween20、10μg/ml(35 units/ml)  リゾスタフィン、0.1M　MOPSO  pH7.5、終濃度0.1％　Zwettergent 3-12。室温で30分処理の後、室温で30分間展開。）、出現した赤紫色のラインを目視により判定した（陽性+、陰性-）。一方、乳汁中の黄色ブドウ球菌の数を確認するために、培養法にて定量を行った。トリプチケースソイII5％ヒツジ血液寒天培地（日本ベクトンデッキンソン社製）に乳汁を100μl播種後、37℃で24時間培養し、出現したコロニーを計数した。培養法によって算出した黄色ブドウ球菌の数およびイムノクロマト法による判定結果を表2に示す。Zettergent 3-12を添加することによって103 (cfu/ml)オーダーの場合も検出することが可能となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (14)

  1. 　乳汁中のブドウ球菌の溶菌方法であって
    　乳汁に、リゾスタフィン、イオン界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む、溶菌方法。
  2. 　該イオン界面活性剤が両性界面活性剤である、請求項１に記載の溶菌方法
  3. 　該両性界面活性剤が、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチライト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインから選択されるいずれかであり；ならびに／または
    　該非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択されるいずれかである、請求項２に記載の溶菌方法。
  4. 　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該両性界面活性剤の終濃度が、0.03％以上0.2％以下である、請求項２または３に記載の溶菌方法。
  5. 　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該リゾスタフィンの終濃度が、0.1mg/μl以上200mg/μl以下であり；および／または
    　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下である、請求項４に記載の溶菌方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程
    を含み、
    　溶菌により放出されたブドウ球菌の菌体内由来の特定物質を検出する工程
    をさらに含む、乳汁中のブドウ球菌の検出方法。
  7. 　検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される請求項６に記載の方法。
  8. 　該イムノクロマトグラフ方法が、
    （1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および
    （2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程
    を含む、請求項７に記載の検出方法。
  9. 　該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、請求項８に記載の検出方法。
  10. 　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、請求項８または９に記載の検出方法。
  11. 　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、請求項１０に記載の検出方法。
  12. 　請求項１～５のいずれか１項に定義された、溶菌剤。
  13. 　家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、請求項１２に記載の溶菌剤。
  14. 　請求項１２または１３に記載の溶菌剤と、
    　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
    を含む、乳汁中のブドウ球菌の検出用キット。
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