JP7237985B2 - 乳房炎の原因菌の検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、乳汁中から乳房炎の原因となる菌を検出する方法に関するものである。
牛、羊、ヤギに代表される家畜の乳汁は無菌的なものではなく、疾患や環境が原因で何らかの微生物が混入している場合がある。特に乳房への微生物の感染による疾患ではしばしば乳汁中に多くの微生物を排菌することが知られている。微生物の感染が原因で引き起こされる代表的な家畜の疾患に乳房炎がある。
乳房炎とは、乳管系、乳腺組織の炎症であり、主に微生物が乳房内に侵入・定着し、増殖することによって引き起こされる。乳房炎は多くの動物が罹患するが、特に乳牛における牛乳房炎は乳牛全体の15～40％が罹患すると言われ、酪農家にとって極めて重要な疾患の一つである。乳牛が乳房炎に罹患すると、乳汁の合成機能が阻害され、泌乳量の減少や場合によっては泌乳の停止が起こるだけでなく、治療費や、乳質低下による乳価のペナルティーなど多大な経済的損失を酪農家に与える。さらには、伝染防止のために乳房炎罹患分房を個別に搾乳するなど、酪農家にかかる労働負担も増加する。
乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされる。乳汁からの原因菌の検出方法としては培養法が広く用いられている。しかしながら、培養法は結果が得られるのに数日間を要し迅速な原因菌特定には適さないため、乳房炎の原因菌を酪農現場で迅速に診断できる技術が強く求められている。
一方、原因菌に特異的な成分に対する抗体を用いる抗原抗体反応による同定法、特にイムノクロマトグラフ法は数十分で結果を判定できるため、迅速・簡便な検査方法として家庭や診察室等で広く用いられている（例えば特許文献１）。イムノクロマトグラフ法は、本発明者らにより、家畜の乳汁中の物質を検出するための方法としても知られるようになっている（特許文献２～３）。しかしながら当分野では、感染症診断の最終判断は上記の培養法で行われることが一般的である。
特開2016-31353号公報 国際公開WO2013/186885 特開2012-122921号公報
培養法による感染症診断においては、乳房炎の診断・治療ために乳汁中に存在する細菌、特に大腸菌、クレブシエラ、レンサ球菌、CNSなどの環境性乳房炎の原因菌を検出する際、陽性と判定された場合でも実際は陰性であったというケースが散見され、判定結果の信頼性が必ずしも高くないという問題が生じている。そして、このような問題は、イムノクロマトグラフ法を用いた場合であっても生じうると考えられる。
本発明は大腸菌、クレブシエラ、レンサ球菌、CNSなどの環境性乳房炎の原因菌を検出する場合の信頼性低下の原因を究明し、信頼性の高い検出手段を提供することを目的とする。
本発明はまた、培養法よりも迅速判定が可能なイムノクロマトグラフ法による信頼性の高い検出手段、それを用いた診断キットを提供することを目的とする。
前述した培養法の信頼性が低いという課題の要因について様々な検討を行ったところ、この信頼性の低い傾向が原因菌の濃度が低い場合により発現しやすいことに着目した。そこで、信頼性の低下は、採材した検体中に原因菌と環境からの混入菌が存在するためと推定した。即ち、乳腺組織から排菌された乳房炎の原因菌以外に、糞便や敷料等の環境中から乳房内に混入した細菌を検出していることが信頼性の低下の要因ではないかと推定した。しかしながら、原因菌と混入菌との関係において境界が存在するか否かは確認されておらず、また、境界の存在を前提に検討するには多様な検出限界を有する感度の診断キットを準備する必要がある。
そこで本発明者らは、鋭意検討した結果、乳房炎乳汁および正常乳汁を採材し、乳汁中に存在する細菌量を定量的に解析することで、信頼性を確保できる混入菌と乳房炎原因菌の境界の菌量を見出し、カットオフ値と設定し、さらに、乳房炎を診断するために原因菌をイムノクロマトグラフ法により検出するにあたり、該境界の菌量を検出限界とするようにイムノクロマトグラフの構成部材である金コロイドの保持量を限定することで上記カットオフ値に対応させて、原因菌の検出性能を制御せしめた。その結果、環境中からの混入菌は検出せずに、乳房炎の原因菌のみを検出するイムノクロマトグラフ法を開発し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］ 大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法であって：
被検体家畜の乳汁中の原因菌の数が、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値以上であるか否かを判定する免疫学的検査法による工程を含み、かつ、
免疫学的検査法が、０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下の金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）を用いるイムノクロマトグラフ法である
家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法。
［２］ 判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、１に記載の方法。
［３］ 原因菌が、大腸菌、ブドウ球菌、およびクレブシエラ属菌からなる群より選択されるいずれかである、１または２に記載の方法。
［４］ 被検体家畜が、臨床型の乳房炎に罹患している家畜である、１から３のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の乳房炎の環境性の原因菌に由来する特定物質に対する第一の抗体であって、
保持量０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下の金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）が、保持された第１部分、および
第１部分の下流に連結され、かつ特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分を備える、イムノクロマトグラフ装置。
［６］ 原因菌の判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
［７］ 該金コロイド粒子の保持量が、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布に基づき予め定めた３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下の判定値を下限値とする保持量である、５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
［８］ ５～７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフ装置を含む、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断するための、キット。
また、本発明は以下を提供する。
［１］ 家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法であって：
被検体家畜の乳汁中の原因菌の数が、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値以上であるか否かを判定する工程を含む、方法。
［２］ 原因菌が、大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかである、１に記載の方法。
［３］ 原因菌が、大腸菌、およびクレブシエラ属菌からなる群より選択されるいずれかである、１または２に記載の方法。
［４］ 判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、１から３のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 判定が、原因菌に由来する特定物質を抗原とする抗体を用いる免疫学的検査法により行われる、１から４のいずれか１項に記載の方法。
［６］ 免疫学的検査法が、粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）を用いるイムノクロマトグラフ法である、５に記載の方法。
［７］ 粒子標識抗体を、判定値を検出下限値とする量で用いる、６に記載の方法。
［８］ 粒子標識抗体が、金コロイド粒子標識抗体である、６または７に記載の方法。
［９］ 金コロイド粒子標識抗体が、イムノクロマトグラフ法を実施するための装置において０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下で用いられる、８に記載の方法。
［１０］ 被検体家畜が、臨床型の乳房炎に罹患している家畜である、１から９のいずれか１項に記載の方法。
［１１］ 家畜の乳房炎の環境性の原因菌に由来する特定物質に対する第一の抗体であって粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）が、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布に基づき予め定めた判定値を下限値とする量で保持された第１部分、および
第１部分の下流に連結され、かつ特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分を備える、イムノクロマトグラフ装置。
［１２］ 原因菌が大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかであり、粒子標識抗体が金コロイド粒子標識抗体であり、金コロイド粒子標識抗体が、イムノクロマトグラフ法を実施するための装置において０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下で保持された、１１に記載のイムノクロマトグラフ装置。
［１３］ １０または１１に記載のイムノクロマトグラフ装置を含む、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断するための、キット。
本発明によれば、混入菌の影響を抑制しうる方法、またはそのための装置（例えば、イムノクロマトグラフ装置）により、環境からの混入菌の影響を抑制し、乳房炎の原因菌を迅速・簡便かつその場で検出することができる。病状の更なる悪化の前に迅速に原因菌を特定し、適切な抗生物質の選択などの的確な治療方針や、感染拡大防止のための措置を早期に決定することができる。
正常牛群（左）と乳房炎群（右）における乳汁中の大腸菌数。なお、１．０Ｅ＋００」のカラムは、菌数が１．０×１０0ｃｆｕ／ｍｌ以上１．０×１０1ｃｆｕ／ｍｌ未満であったサンプル数を表す。他のカラムについても同様である。 原因菌が大腸菌である場合について、乳房炎ROC曲線（上）と、乳房炎について求めた、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を示したグラフ（下）。 実施例で用いたイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。 正常牛群（左）と乳房炎群（右）における乳汁中のブドウ球菌数。なお、１．０Ｅ＋００」のカラムは、菌数が１．０×１０0ｃｆｕ／ｍｌ以上１．０×１０1ｃｆｕ／ｍｌ未満であったサンプル数を表す。他のカラムについても同様である。 原因菌がブドウ球菌である場合について、乳房炎ROC曲線（上）と、乳房炎について求めた、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を示したグラフ（下）。 臨床型乳房炎を引き起こした牛個体の乳汁中の黄色ブドウ球菌の菌数。
本発明は、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断する方法に関する。本発明の方法は、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき判定値を定めておき、被検体家畜の乳汁中の環境性の原因菌の数が、その判定値以上であるか否かを判定する工程を含む。
[検出対象]
本発明は、環境性乳房炎の原因菌を検出するためのものである。乳房炎の原因菌は、伝染性のものと環境性のものとに大別できる。環境性（乳房炎の）原因菌には、大腸菌群、環境性ブドウ球菌属菌（黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌）、環境性レンサ球菌属菌（無乳性レンサ球菌以外の連鎖球菌）が含まれる。大腸菌群には、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）属菌、サイトロバクター（Citrobacter）属菌、エンテロバクター（Enterobacter）属菌およびプロテウス（Proteus）属菌が含まれる。クレブシエラ属菌には、Klebsiella pneumoniaeおよびKlebsiella oxytocaが含まれる。環境性ブドウ球菌属菌には、CNS（Coagulase Negative Staphylococcus、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）が含まれる。CNSには、Staphylococcus intermedius、Staphylococcus hyicus、Staphylococcus xylosus、Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ球菌）等が含まれる。なお、本明細書で単に「ブドウ球菌」というときは、環境性ブドウ球菌属菌のうちのいずれかの菌の意味で用いている。環境性レンサ球菌属菌としては、Streptococcus uberis、Streptpcoccus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equinus、Streptococcus canis、Streptococcus bovis、Streptococcus porcinus、Streptococcus pluranimalium、Streptococccus parauberis、Streptococcus mutans、Streptococcus acidominimusが含まれる。本発明は特に、大腸菌、またはブドウ球菌に好適である。
[判定値]
本発明においては、乳房炎の原因菌の検出に際し、予め定めた判定値が使用される。判定値は、乳房炎に罹患した群（罹患群）と乳房炎に罹患していない群（非罹患群）とを分ける値である。一般に、定量的検査において陽性、陰性を分ける値をカットオフ値といい、カットオフ値は特定の疾患に罹患した患者群の検査値分布と非患者群の検査値分布から設定されるが、本発明でいう判定値は、カットオフ値と称してもよい。
本発明の判定値は、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき求められたものである。具体的には、大腸菌による乳房炎の牛の場合を例に説明すると、判定値は次のように求めることができる：
大腸菌による乳房炎を発症した群（乳房炎群）から得られた複数の乳汁サンプルと、乳房炎を発症していない群（正常群）から得られた複数の乳汁サンプルとについて、培養法により各々の菌量を求める。このとき、環境性の原因菌である大腸菌は元来、糞便や敷料の環境中に多数存在しているため、搾乳中に環境中から混入しやすく、サンプル中に検出されることがしばしば起こる。そのため、正常群から得られたサンプルにおいても、ある程度の頻度である程度の菌量が検出される。得られたそれぞれの菌量の分布に基づき、正常群と乳房炎群とを分ける乳汁中の菌量を判定値とすることができる。有効な判定値を設定するためには、ROC解析を実施するとよい。
ROC解析とは、ROC 曲線（Receiver Operating Characteristic 曲線）を用いた解析方法であり、一般に、ある検査値について適切なカットオフ値を検索するのに使われている。詳細には、１つのスクリーニング方法について陽性・陰性のカットオフ値を最小値から最大値まで段階的に変えると、偽陽性率（= 1－特異度）も感度も0 から1 まで変わる。偽陽性率を横軸に、感度を縦軸にとって線で結ぶと、カットオフ値の変化に対応する曲線（POC曲線）を引くことができる。曲線の最も左上の点（グラフ上の（0, 1）に最も近い点。理想は偽陽性率0 で感度1）を与えるカットオフ値が、陽性・陰性を分けるポイントとして最も有効性が高いと判断されるため、ある検査値について適切なカットオフ値を検索できる。なお、感度は、陽性と判定されるべきものを正しく陽性と判定する確率をいい、真陽性の数／本当に陽性である対象の合計数（すなわち、真陽性の数＋偽陰性の数）で表される。特異度は、陰性と判定されるべきものを正しく陰性と判定する確率をいい、真陰性の数／本当に陰性である対象の合計数（すなわち、真陰性の数＋偽陽性の数）で表される。本発明における判定値は、このようなROC解析により、最も有効性が高いカットオフ値として求めた値を採用することができる。
本発明者らの検討によると、環境性乳房炎の場合の乳汁中サンプル中の菌量の判定値は、原因菌がいずれの場合であっても、３００ｃｆｕ／ｍｌ以上３０００ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることができ、３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることが好ましい。原因菌が大腸菌群の菌、例えば大腸菌である場合、６６０ｃｆｕ／ｍｌ以上１３６０ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがより好ましく、７００ｃｆｕ／ｍｌ以上９００ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがさらに好ましい。原因菌が環境性ブドウ球菌属菌、例えばブドウ球菌である場合、３７５ｃｆｕ／ｍｌ以上１５９５ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがより好ましく、８７５ｃｆｕ／ｍｌ以上１１４５ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがさらに好ましい。本発明において、判定値は菌種毎に定めることができ、またサンプルを採取する環境毎に定めてもよい。
このようにして求めた判定値は、後述するイムノクロマトグラフ装置などの具体的な検出手段の設計に際しては、検出下限（検出可能な菌数の下限値）とすることができる。検出下限とすることにより、その装置で検出されたか否かにより、陽性・陰性の判定が直ちにできるからである。
本発明においては、環境性乳房炎の診断に際し、非罹患群に由来する乳汁中において検出される量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値を用いるため、環境から混入する菌の影響を排除することができる。このように環境の影響を考慮して最適化された検出手段はこれまでになく、本願が初めて提案するものである。
[免疫学的方法、イムノクロマトグラフ法、イムノクロマトグラフ装置]
本発明の判定値を用いる方法は、家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法として実施することができ、また、家畜の環境性乳房炎の診断方法として実施することができる。これらの方法は、家畜から乳汁を採取する工程を含んでもよい。本発明の判定値を用いる方法はまた、原因菌に由来する特定物質を抗原とする抗体を用いる各種の免疫学的方法により実施することができる。免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフグラフ法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ELISA法）、放射能免疫測定法（RIA法）、または蛍光免疫測定法（FIA法）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。イムノクロマトグラフ法を用いる場合、典型的には、次のように実施することができる。
抗原抗体反応は、第1部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第2部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第1部分に保持されている標識された特定物質と、第2部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
イムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するためのもの、または家畜の乳房炎を診断するためのものである。イムノクロマトグラフ装置は、具体的には、例えば、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図3に断面模式図を示した試験片が挙げられる。図3においては、脂肪球除去用部材（第3部分）7は、試料添加用のフィルター部材4の下流、かつ標識抗体含浸部材（第1部分）1の下流、かつクロマト展開用膜担体（第2部分）2の上流に設置されている。また図3においては、第2部分には特定物質に対する第二の抗体が固定化され、標識された第一の抗体が結合した特定物質を補足する補足部位3（テストライン）と、装置上で反応が正常に進んだことを確認するための、対照となる物質を補足する補足部位8（コントロールライン）を備えている。
イムノクロマトグラフ装置は公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。
第1部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
第2部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
第3部分に使用する材料は、乳汁中に含まれる直径1～10数μmの乳脂肪球を除去できる空隙を有していることが好ましい。第3部分は、試料溶液が孔径数10～数100nmの多孔性のメンブレンからなる上記第2部分の上流側に配置されている必要があり、試料溶液が最初に接触・通過できる位置である、上記第1部分の上流側に配置されていることが好ましい。
第3部分が有する空隙は乳脂肪球を分離できる大きさであればよく、保持粒子サイズは好ましくは0.1から10μmであり、より好ましくは1から3.5μmである。材料は上記の範囲の空隙を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはセルロース誘導体等繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。保持粒子サイズとは、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球が空隙を通過できずに第3部分に保持される乳脂肪球の粒子サイズのことであり、第3部分の空隙の平均ポアサイズに実質的に対応しているが、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球の50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは98％以上が空隙を通過できずに第3部分に保持される。保持される乳脂肪球の割合は当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社から提供されているGF/Bは保持粒子サイズ（保持効率98％の粒子直径のこと。本明細書で保持粒子サイズというときは、特に記載した場合を除き、この意味である。）が1.0μmであることが同製品カタログにおいて明らかにされているが、当業者に周知の方法で上記の粒子サイズを確認することが可能である。
上記第3部分は、特定の保持粒子サイズを有する材料のみを用いてもよく、乳脂肪球の分離効率を高めるために保持粒子サイズが大きいものから小さいものを段階的に張り合わせて用いてもよい。上記第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される場合は本発明の好ましい態様であり、第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい場合は本発明のさらに好ましい態様である。第3部分を2種の部材により構成する場合には、下流に配置された第一の部材の保持粒子サイズが1.0～2.0μmであり、上流に配置された第二の部材の保持粒子サイズが3.0～3.5μmであることが好ましい。高濃度で広い粒径分布を有する乳脂肪球を含む乳汁、好ましくは搾乳後の未希釈の乳汁から特定物質を高感度に検出するためは、第3部分を保持粒子サイズの小さな部材と保持粒子サイズの大きな部材との組み合わせにより構成することが好ましい。
上記第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体、または標識された特定物質が保持されている。第1部分に、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができる。また、第1部分に標識された特定物質が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されていることが好ましい。
第1部分に特定物質に対する標識された第一の抗体を保持させる場合には、特定物質に対する第一の抗体と、特定物質に対する第二の抗体の、2種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができるように、上記第一の抗体と上記第二の抗体は、当該特定物質に同時に結合できることができる抗体であり、上記第一の抗体が認識する当該特定物質のエピトープは、上記第二の抗体が認識する当該特定物質のエピトープとは異なることが好ましい。
本発明において、検出可能な信号を得るために、第1部分に保持される第一の抗体または特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が1nmから10μmが好ましい。より好ましくは、5nmから1μmであり、さらに好ましくは10nmから100nmである。
また、この粒子濃度を変更させることによりイムノクロマトの検出下限を調整することが可能である。粒子濃度は５００～６００ｎｍにおける最大吸光度をもとに測定することができる。その後、粒子を基材に含侵させ乾燥することにより得ることができる。該コンジュゲートパッドに適した材料として、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維（グラスファイバー）またはレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、グラスファイバー製パッドが用いられる。
粒子濃度は最大吸光度の値として、検体中での反応性を保持できる点から０．１／ｃｍ2以上であることが望ましく、より好ましくは０．３／ｃｍ2以上、さらに好ましくは０．６／ｃｍ2以上であることが望ましい。また、イムノクロマトの液流れやニトロセルロース上の視認性の点から、１０／ｃｍ2以下であることが望ましく、より好ましくは５／ｃｍ2以下、さらに好ましくは4／ｃｍ2以下であることが望ましい。
本発明においては、上述した試験片をそのまま使用してイムノクロマトグラフ装置としてもよいし、ケースに収納して、イムノクロマトグラフ装置としてもよい。前者の場合は、試料となる乳汁の量が多い場合に、容器に入った試料に直接試験片の一端を浸して使用することが好ましい。また、後者の場合は、試料となる乳汁の量が少ない場合に、ピペット等で所定量を計量して試験片に滴下して使用することが好ましい。後者の場合のケースの形状は、試験片を収納できればいかなる形状でもよい。ケースの材料はいかなる材料でもよく、ポリプロピレンやポリカーボネートなどが好ましいものとしてあげられる。
本発明のイムノクロマトグラフ装置は、容器、たとえばマイクロチューブ、および添加液、例えば細菌を溶菌させてリボゾームタンパク質L7/L12を溶液内に溶出させるための、溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液を組合せたキットとして提供することもできる。本発明により提供されるキットは、乳汁中の特定物質を検出するためのものであり、または家畜の乳房炎を診断するためのものである。
[特定物質、特定物質を抗原とする抗体]
本発明の方法を、原因菌に由来する特定物質を抗原とする抗体を用いる免疫学的方法により実施する場合、特定物質は、免疫学的方法で測定できる物質であれば何れでも可能であるが、細菌の成分または細菌が分泌する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、細菌のL7/L12リボゾームタンパク質である。L7/L12リボソームタンパク質は、細胞内に多コピー存在するために検出感度が高い。また、以下に記載の公知の方法により、乳房炎の原因となる特定の細菌を他の細菌と種または属で識別可能な抗体を実際に取得可能である。細菌の種類は特に限定されず、グラム陽性菌またはグラム陰性菌のいずれであってもよい。例えば、ブドウ球菌（スタフィロコッカス属に属する細菌）、好ましくは黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌、または大腸菌やクレブシエラ属に属する細菌などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
上記の抗体は、国際公開第00/06603号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L7/L12を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質L7/L12の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでL7/L12リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L7/L12と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L7/L12とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
抗体が乳房炎の原因となる特定の細菌の成分または該細菌が分泌する物質と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌の成分または該細菌が分泌する物質とは反応しないモノクローナル抗体であれば、リボゾームタンパク質L7/L12以外を抗原として認識する抗体であっても使用することができる。
また、モノクローナル抗体としては、乳汁中に含まれる特定物質以外の夾雑物により抗原抗体反応が阻害されないモノクローナル抗体を用いることが好ましい。例えば、乳汁中にはカゼインなどのタンパク質が大量に含まれており、特定物質とモノクローナル抗体との反応を阻害する場合がある。特定物質に対するモノクローナル抗体を常法により製造するにあたり、例えばカゼインなどにより抗原抗体反応が阻害を受けないモノクローナル抗体や、抗原抗体反応への影響が少ないモノクローナル抗体を適宜選択して用いることが好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、通常の方法に従って抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造した後に、カゼインなどの夾雑物の存在下で抗原抗体反応が阻害されるか否かを調べて、実質的に反応の阻害を受けないモノクローナル抗体を選択することにより容易に取得することができる。
[第一の抗体の標識、金コロイド粒子]
本発明において、検出可能な信号を得るために、第１部分に保持される第一の抗体又は特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が１ｎｍから１０μｍが好ましい。より好ましくは、５ｎｍから１μｍであり、さらに好ましくは１０ｎｍから１００ｎｍである。着色粒子の好ましい例は、金コロイド粒子である。
本発明の好ましい態様においては、上述した予め定めた判定値が装置の検出限界となるように設計されたイムノクロマトグラフ装置が用いられる。このとき、標識抗体含侵部材（第1部分）に保持される標識された第一の抗体としては金コロイド粒子標識抗体が使用される。この場合、検出限界は、金コロイド粒子標識抗体の保持量（以下、単に「金コロイド保持量」ということもある。）によって調整することができる。金コロイド保持量を多くすることにより、検出限界をより低くでき、金コロイド保持量を少なくすることにより、検出限界をより高くできる。
イムノクロマトグラフ装置の標識抗体含侵部材に含まれる金コロイド保持量はAmax／cm2で表すことができる。具体的には、装置中の金コロイドが保持された標識抗体含侵部材をを切り出し、水または緩衝溶液0.2mlが入ったチューブに添加することにより、金コロイドを溶出する。得られた溶液について、光路長1cmのセルを用いて、500～600nm、例えば540nmにおける最大吸光度Amaxを測定する。得られた測定値は、溶出に用いたグラスファイバーの面積で除すことにより、Amax／cm2の値が算出される。
本発明者らの検討によると、イムノクロマトグラフ装置の標識抗体含侵部材に含まれる金コロイド保持量は、A540 max／cm2の値として、例えば0.3以上6.0以下とすることができ、0.6以上3.8以下とすることができ、0.8以上3.5以下とすることが好ましく、1.0以上3.0以下または1.0以上2.0以下とすることがより好ましく、1.5以上2.5以下とすることがさらに好ましい。このような判定値は、原因菌が大腸菌群またはブドウ球菌である場合に好ましく用いることができ、また原因菌が大腸菌である場合に、より好ましく用いることができると考えられる。
[サンプルの溶菌]
本発明において原因菌を検出するに際し、原因菌に由来する特定物質を抗原とする免疫学的方法を用いる場合、菌体を高効率に溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。しかしながら、乳汁を検体として用いた場合、乳汁中に多量に含まれるカゼインなどのタンパク質や乳脂肪球などの影響により従来技術では溶菌が十分に行われないことが多い。そのため必要に応じて、酵素や界面活性剤を含む溶菌剤を用いることができる。
溶菌剤
溶菌剤に含まれる酵素としては、リゾチーム、リゾスタフィン、ラビアーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼなどが挙げられる。溶菌剤中での溶菌酵素の含量（複数の溶菌酵素を用いる場合は、溶菌酵素総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されない。
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、のいずれかもしくはその組み合わせを用いることができ、必要に応じて陽イオン性界面活性剤、良性界面活性剤、を用いることもできる。
非イオン性界面活性剤としては、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリソルベート類（脂肪酸ソルビタンエステルにエチレンオキシドが数十分子縮合したもの）などがあげられるが、特に限定されない。特に好ましい例の一つは、ポリソルベート類、より特定すると、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(60)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(65)ソルビタントリステアレート、およびポリオキシエチレン(80)ソルビタンモノオレエート等、ならびにポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、より特定するとポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等である。
陰イオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、その他のいずれも好適に用いることができる。より具体的な例として、アルキルエーテルカルボン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、α－オレフィンスルホン酸塩（AOS）、ジアルキルスルホコハク酸塩、ナフタレンスルホン酸塩のホルムアルデヒド縮合物、アルキル硫酸エステル塩（AS）、高級アルコールにエチレンオキシドを付加して硫酸化したポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩（AES）、高級アルコールやそのエチレンオキシド付加物などのリン酸エステル塩等をあげることができる。さらに具体的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、N-ミリストイルザルコシン酸ナトリウム等のN-アシルザルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、N-パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のN-アシルグルタミン酸塩、N-メチル-N-アシルアラニンナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウムをあげることができる。
陽イオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型のいずれも好適に用いることができ、より具体的な例として、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等をあげることができる。
両性界面活性剤としては、アミノ酸系（アルキルアミノ脂肪酸塩）、ベタイン系 （アルキルベタイン）、アミンオキシド系（アルキルアミンオキシド）等があげられるが、特に限定されない。より特定された例としては、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインがあげられる。より具体的な例としては、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、N-Dodecyl-N,N-(dimethylammonio)butyrateがあげられる。
溶菌剤には反応性を向上するなどの目的で、緩衝剤を含んでいてもよい。前記緩衝材としては特に制限されず、例えば、グッド系緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。前記緩衝液のｐＨは、特に限定されないが、例えば、ｐＨ４～１０の範囲であり、好ましくは、ｐＨ６～９の範囲である。
溶菌酵素および界面活性剤以外に、意図した効果を著しく損なわない限り、一種またはそれ以上の他の成分を含むことができる。溶菌酵素および界面活性剤以外の成分の好ましい例は、溶菌を促進する効果あるいは非特異反応を抑制する効果を有する物質である。
溶菌を促進する効果を有する物質としては、グルタルアルデヒド、ハロゲン化合物、クロルヘキシジン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノール）、フェノール、過酸化水素、アクリノール、グアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸（例えば、デカン酸）およびその塩、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン、モノカプリリン）、ならびに２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンおよびチオフェノールなどの還元剤をあげることができるが、これらに限定されない。
例えばグアニジンおよびその塩（例えば、グアニジンチオシアン酸塩）のいずれかを用いる場合、乳汁と混合した場合の終濃度の下限値（複数種類を用いる場合は、総量としての濃度を指す。上限値についても同じ。）は、0.1mM以上とすることができ、好ましくは1mM以上とすることができ、より好ましくは1mM以上とすることができる。いずれの場合も、乳汁と混合した場合の終濃度の上限値は、500mM以下とすることができ、好ましくは200mM以下とすることができ、より好ましくは100mM以下とすることができる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびその塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）およびその塩、ポリリン酸およびその塩、並びにメタリン酸およびその塩が挙げられる。乳汁と混合した場合の終濃度の下限値（複数のキレート剤を用いる場合は、キレート剤総量としての濃度を指す。上限値についても同じ。）は、0.001mM以上とすることができ、好ましくは0.01mM以上とすることができ、より好ましくは0.1mM以上とすることができる。いずれの場合も乳汁と混合した場合の終濃度の上限値は、抗原抗体反応の阻害抑制の観点から、100mM以下とすることができ、好ましくは10mM以下とすることができ、より好ましくは5mM以下とすることができる。
さらに添加剤としては、塩やタンパク質、高分子化合物、抗菌剤などを用いることも可能である。
前記タンパク質としては、特に用いる抗体と黄色ブドウ球菌が保有するプロテインＡとの反応を防ぐために、抗原との反応に関与しないグロブリンを添加することができる。γ－グロブリンとしては、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。γ－グロブリン濃度は、特に限定されないが、偽陽性を抑制するという観点からは、反応時の終濃度として、0.01μg/ml以上、好ましくは0.1μg/ml以上、より好ましくは1μg/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、対象の抗原抗体反応を阻害しないという観点から、10mg/ml以下、好ましくは5mg/ml以下、より好ましくは1mg/ml以下とすることができる。このような終濃度の条件は、イムノクロマトグラフ法に特に適する。
溶菌条件
乳汁と溶菌剤との混合比は、溶菌酵素等の終濃度が適切に維持され、十分な溶菌率が確保できる限り、特に限定されない。乳汁に対して比較的少量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁が希釈されない。したがって、より高い感度で菌体を検出できると期待できる。また乳汁に対して比較的大量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁中の脂肪球やタンパク質による影響が減じられ、より短時間で菌体を検出できると期待できる。乳汁と溶菌剤との混合物における乳汁の割合（乳汁／（乳汁＋溶菌剤）×100）は、高いほど検出感度を上げることができるとの観点からは、他の条件がいずれの場合であっても、例えば5％以上とすることができ、10％以上とすることが好ましく、20％以上とすることがより好ましく、30％以上とすることがさらに好ましい。上限値は、他の条件がいずれの場合であっても、乾燥等の手段によって固形化した溶菌剤を用いることにより、乳汁の割合を100％とすることができる。また、他の条件がいずれの場合であっても、乳汁の割合は90％以下とすることができ、80％以下、70％以下、60％以下、または50％以下とすることができる。上限値は、混合の容易さ、溶菌剤の溶液としての安定性等を考慮して決定してもよい。
溶菌のための処理温度および時間は、用いる溶菌酵素が活性を発揮できる温度であれば特に限定されず、通常、室温でよい。溶菌剤混合後の必要な時間は、当業者であれば、溶菌率を考慮して、適宜設計することができる。
[カットオフ値の検討]
大腸菌培養陽性サンプルについて、乳房炎を発症した乳牛群（獣医師が診断し、乳汁異常、乳房異常、全身症状などの臨床症状を確認した個体群）から得られたサンプルと乳房炎を発症していない正常乳牛群から得られたサンプルに分け、培養から得られた菌量を比較した。なお、乳汁中の大腸菌量は以下のように求めた。乳汁を必要に応じ段階希釈し、10ul～1mlを血液寒天培地または培養フィルムに播種し、37℃にて終夜培養を行った。生じたコロニー数を計数し、乳汁中の大腸菌量を算出した。以下の実験での乳汁中の細菌の量は、特に記載した場合を除き、この方法で測定した。
乳房炎群および正常群における大腸菌量に対するサンプル数を表記した図１を示す。乳房炎に罹患していない正常牛においても、乳汁中から100～103 (cfu/ml)の菌量で大腸菌が検出されていることが分かった。大腸菌は糞便や敷料の環境中に多数存在しているため、搾乳中に環境中から混入しやすく、培養により検出されることがしばしばおこる。一方、大腸菌性乳房炎に罹患した乳汁では乳汁中から103～109 (cfu/ml)の菌数で大腸菌が検出されており、正常群の菌数とは菌数の分布が大きく異なっていることが分かった。
正常群と乳房炎群の境界の乳汁中菌数（カットオフ値）を算出するために、これら正常分と乳房炎群の乳汁中菌数に対してROC解析を実施した。
正常群および乳房炎群の乳汁中の菌量を変化させ、ROC解析により感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を算出した。
感度＝判定値に基づく陽性／真陽性
特異度＝判定値に基づく陰性／真陰性
陽性的中率＝真陽性／判定値に基づく陽性
陰性的中率＝真陰性／判定値に基づく陰性
ROC曲線を図２の上段に示した。感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率がいずれも90％以上を示す乳汁中の菌量を正常群および乳房炎群の判定値とする場合、その範囲は660～1360 (cfu/ml)となった（図２、下段）。なお、計算には統計ソフトStatFlex(株式会社アーテック)を使用した。
[リボゾームタンパク質L7/L12抗体の作製]
国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例に記載の方法に準じて、L7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。以下の実験で用いるモノクローナル抗体として、上記L7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種の組合せを選択した。
[イムノクロマトグラフ装置の作製]
イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製できる。イムノクロマトグラフ装置断面図を図３に示す。
金コロイド粒子標識抗体の含浸部材
BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm) 9mlに0.1M リン酸カリウム pH7.0を混合し、金コロイド粒子で標識するモノクローナル抗体-1(100μg/ml)を1ml加え、室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。その後、金コロイド粒子溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド粒子により標識したモノクローナル抗体-1（以下、「金コロイド粒子標識抗体」と記す）溶液を調製する。この溶液を遠心分離（7600×rpm、15分間）して金コロイド粒子標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド粒子標識抗体を得る。この金コロイド粒子標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mM NaClを含有する20mMトリス塩酸緩衝液（pH7）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得る。
濃度を調整した抗体溶液を帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド粒子標識抗体溶液を含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1（第1部分）とする。
抗原および金コロイド粒子標識抗体との複合体の捕捉部位
幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2（第2部分）として用意する。モノクローナル抗体-2（1.5mg/ml）が含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体2におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μl/cmでライン状に塗布して、これを50℃で乾燥し、その後、0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。リボソームタンパク質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位3とする。
イムノクロマトグラフ装置の作製
上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材と脂肪球除去用部材（第3部分）とを兼ねる部材として25mmのGF/DVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み776μm、保持粒子サイズ3.5μmのフィルター部材4）、および20mmのGF/AVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み299μm、保持粒子サイズ1.7μmのフィルター部材7）を用意する。さらに、吸収用部材5として濾紙を用意する。そして、これらの部材を図3に示した順に基材6（厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、5mm幅に切断し、イムノクロマトグラフ装置を作製する。
[イムノクロマト装置における検出限界の調整]
金コロイド保持量を変更して製造することにより条件1～5のイムノクロマトグラフ装置を得た。
培養菌を段階希釈してスパイクした乳汁を検体として、条件1～5の各イムノクロマトグラフ装置で検出した。具体的には、マイクロチューブに溶菌処理液（終濃度1％ TritonX-100、0.3% Ｎ－ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、2.2 mg/mlリゾチーム、0.1M MOPSO pH7.5）0.5mlと乳汁0.3mlを分取し、30分間静置した。同混合溶液にイムノクロマトグラフ装置を浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を、捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインの有無として目視により確認した。
その検出限界を下表に示す。金コロイドの保持量に従って、検出限界を調整できることがわかった。なお、金コロイドの保持量は以下のように求めた。含侵部材であるグラスファイバーを切り出し、水または緩衝溶液0.2ml蒸留水の入ったマイクロチューブに添加し、ボルテックスミキサーを用いて撹拌混合することにより、金コロイドを溶出し、540nmにおける最大吸光度Amaxを測定した。グラスファイバーのサイズを測定し、Amax／cm2の値を算出して、金コロイド保持量とした。
Figure 0007237985000001
[実施例１：大腸菌による乳房炎に罹患した牛の診断]
条件1～5のイムノクロマトグラフ装置を用いて、酪農場で採材された乳汁検体を用いて評価した。検体の乳汁中に含まれる大腸菌群の菌数を下表に示した。
Figure 0007237985000002
下表に示したように、条件2から4の場合では感度および特異度ともに80%を超え、乳房炎を適切に診断できていることが分かった。一方で検出限界の低い条件1の場合では、環境からのコンタミによる大腸菌をも検出してしまい、非発症牛での偽陽性を生じる結果となり特異度が低下する結果であった。一方で、検出限界の高い条件5を用いた場合、特異度は良いが、大腸菌の保菌量の少ない陽性牛からの検体で検出することができず、臨床感度が低い結果となった。
Figure 0007237985000003
[実施例２：ブドウ球菌による乳房炎罹患牛についてのカットオフ値の検討、および診断]
酪農場より臨床型乳房炎を引き起こした個体について乳汁中のブドウ球菌の菌数を評価したところ、図４のようになった。
上述の大腸菌の場合と同様に、ROC解析を実施し、また、正常群および乳房炎群の乳汁中の菌量を変化させ、ROC解析により感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を算出した。
ROC曲線を図５の上段に示した。感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率がすべて50％以上になる乳汁中の菌量を正常群および乳房炎群の判定値とする場合、その範囲は375～1595 (cfu/ml)であった（図５、下段）。感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率がすべて55％になる乳汁中の菌量を正常群および乳房炎群の判定値とする場合、その範囲は875～1145(cfu/ml)となった。
[参考例１：黄色ブドウ球菌による乳房炎罹患牛検査]
酪農場より臨床型乳房炎を引き起こした個体について乳汁中の黄色ブドウ球菌の菌数を評価したところ、図６のようになった。
環境性細菌である大腸菌とは異なり、伝染性乳房炎を引き起こす黄色ブドウ球菌の場合は、細菌が検出されれば感染とみなすため、イムノクロマトグラフ装置の検出限界を向上するほど（すなわち、検出限界となる菌数を低く設定するほど）臨床感度が高められることになる。
本発明は、乳房炎の適切な診断のために利用することができる。
１．標識抗体含浸部材
２．展開用膜担体
３．補足部位（テストライン）
４．フィルター部材
５．吸収用部材
６．基材
７．フィルター部材
８．補足部位（コントロールライン）

Claims (8)

  1. 大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法であって：
    被検体家畜の乳汁中の原因菌の数が、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値以上であるか否かを判定する免疫学的検査法による工程を含み、かつ、
    免疫学的検査法が、金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）が保持された標識抗体含侵部材を用いるイムノクロマトグラフ法であり、標識抗体含侵部材の金コロイド粒子の保持量Ａｍａｘ／ｃｍ2（標識抗体含侵部材の一部から水または緩衝溶液０．２ｍｌで金コロイド粒子を溶出した液について光路長１ｃｍのセルを用いて測定した場合の５００～６００ｎｍにおける最大吸光度（Ａｍａｘ）を、溶出に用いた標識抗体含侵部材の一部の面積（ｃｍ2）で除した値）が、０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2 以下である、家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法。
  2. 判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 原因菌が、大腸菌、ブドウ球菌、およびクレブシエラ属菌からなる群より選択されるいずれかである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 被検体家畜が、臨床型の乳房炎に罹患している家畜である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の乳房炎の環境性の原因菌に由来する特定物質に対する第一の抗体であって金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）が保持された第１部分、および
    第１部分の下流に連結され、かつ前記特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分を備える、イムノクロマトグラフ装置であって、
    第１部分の金コロイド粒子の保持量Ａｍａｘ／ｃｍ2（第１部分の一部から水または緩衝溶液０．２ｍｌで金コロイド粒子を溶出した液について光路長１ｃｍのセルを用いて測定した場合の５００～６００ｎｍにおける最大吸光度（Ａｍａｘ）を、溶出に用いた第１部分の一部の面積（ｃｍ2）で除した値）が０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下である、イムノクロマトグラフ装置。
  6. イムノクロマトグラフ装置が、家畜が、大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれが原因菌である乳房炎に罹患しているか否かを、家畜の乳汁中の原因菌の数に基づき判定するためのものであり、
    判定が、予め定めた判定値に基づいて行われ、
    予め定めた判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、請求項５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
  7. 該金コロイド粒子の保持量が、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布に基づき予め定めた３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である判定値を検出下限とする保持量である、請求項５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
  8. 請求項５～７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフ装置を含む、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断するための、キット。
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