WO2015093545A1 - 乳汁中の大腸菌群を検出する方法 - Google Patents

乳汁中の大腸菌群を検出する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015093545A1
WO2015093545A1 PCT/JP2014/083460 JP2014083460W WO2015093545A1 WO 2015093545 A1 WO2015093545 A1 WO 2015093545A1 JP 2014083460 W JP2014083460 W JP 2014083460W WO 2015093545 A1 WO2015093545 A1 WO 2015093545A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
milk
lysis
specific substance
lysing
antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/083460
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浩志 前花
松山　健二
Original Assignee
旭化成株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 旭化成株式会社 filed Critical 旭化成株式会社
Priority to US15/105,420 priority Critical patent/US10345299B2/en
Priority to EP14870998.3A priority patent/EP3085769B1/en
Priority to ES14870998T priority patent/ES2787174T3/es
Priority to JP2015553591A priority patent/JP6280567B2/ja
Priority to NZ721261A priority patent/NZ721261A/en
Priority to DK14870998.3T priority patent/DK3085769T3/da
Publication of WO2015093545A1 publication Critical patent/WO2015093545A1/ja
Priority to US16/430,037 priority patent/US11567076B2/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a lysis method and a detection method for detecting coliform bacteria which are mastitis-causing bacteria from the milk of livestock.
  • Livestock milk represented by cows, sheep and goats is not aseptic and may contain some microorganisms due to disease or the environment. In particular, it is known that many microorganisms are eradicated in milk in diseases caused by infection of microorganisms in the breast. Mastitis is a typical livestock disease caused by microbial infection.
  • Mastitis is inflammation of the ductal system and mammary gland tissue, and is mainly caused by microorganisms invading, colonizing and proliferating in the breast. Mastitis affects many animals, but bovine mastitis, particularly in dairy cows, is said to affect 15-40% of all dairy cows and is one of the most important diseases for dairymen.
  • milk synthesis functions are inhibited, resulting in not only a decrease in milk production and, in some cases, halting lactation, but also significant economic losses such as treatment costs and milk price penalties due to reduced milk quality.
  • labor burdens on dairy farmers will increase, such as individually milking mastitis-affected quarters to prevent infection.
  • Mastitis is caused by infection with various microorganisms.
  • coliforms represented by Escherichia coli and Klebsiella cause systemic symptoms such as fever and local symptoms such as fever of the breast, swelling and induration.
  • Culture methods are widely used as methods for detecting coliforms from milk. The culture method takes several days to obtain results, and is not suitable for rapid identification of causative bacteria.
  • identification methods based on antigen-antibody reactions using antibodies against components specific to the causative bacteria, especially immunochromatography can determine the results in tens of minutes, so it is widely used as a quick and simple test method at home and in the examination room.
  • Patent Document 1 The present inventors have also examined the immunochromatographic method as a method for detecting substances in the milk of livestock (Patent Document 2).
  • Patent Document 4 a method of treating with a lytic enzyme and / or bacteriocin having a lytic activity, a surfactant and a protein denaturant (Patent Document 4) is known.
  • Patent Document 3 a supernatant obtained by centrifuging a homogenized food sample is used.
  • Patent Document 4 uses a cultured bacterial solution and does not describe that a lysis effect can be obtained in a high protein, high fat solution such as milk.
  • Mastitis is caused by infection with various microorganisms such as bacteria, but the antibiotics that are effective depend on the causative bacteria. Therefore, early diagnosis and treatment of mastitis is very important.
  • a specific bacterium causes mastitis, it is very important to identify causative bacteria present in milk quickly, simply, and with high sensitivity because it may be transmitted between other quarters or between individuals.
  • Escherichia coli which has a faster growth rate than gram-positive bacteria and is likely to become severe, causing acute mastitis and often leading to death, it is discovered early in infection to prevent mastitis damage, It is very important to treat.
  • the culture method widely used as a method for detecting bacteria has a problem that it takes several days to obtain a result.
  • immunological measurement methods based on antigen-antibody reactions such as immunochromatography have the advantage that causative bacteria can be detected quickly and easily compared to culture methods.
  • the present invention solves the problem of providing a detection method and detection kit comprising a lysis method, a lysis treatment solution and an immunochromatography apparatus for detecting whether or not the causative bacterium of mastitis is coliform using livestock milk. It was an issue that should be done.
  • the present inventor believes that in order to detect coliforms with high sensitivity from milk with high protein, high fat and individual differences, it is necessary to extract target antigens in the cells with high efficiency, and Escherichia coli in milk It was found that the lysis efficiency was improved by simultaneously using a lytic enzyme and a plurality of surfactants to lyse the group with high efficiency, and the coliform group in the milk could be detected with high sensitivity.
  • a method for lysing coliforms comprising mixing milk obtained from a large livestock and a lytic agent containing a lytic enzyme and at least one anionic surfactant to lyse coliforms present in the milk.
  • a method comprising the steps of: [2] The lysis method according to [1], wherein the lytic enzyme is lysozyme.
  • the immunochromatographic method comprises: (1) a milk containing a specific substance, a first antibody labeled with the specific substance or a first part retaining the labeled specific substance; A second part linked downstream and immobilized with a second antibody against the specific substance, and linked to the first part or upstream of the second part and capable of removing milk fat globules in the milk Contacting the milk to the third part or upstream thereof with respect to a test piece having a third part having a void; and (2) flowing the milk to the second part or downstream thereof. Obtaining a detectable signal with the label in the second part or downstream thereof, the method according to [11]. [13] The method according to [12], wherein the first part retains a labeled first antibody against the specific substance.
  • kits for detecting coliforms in livestock milk comprising an immunochromatograph device for detecting a specific substance in milk, which comprises a test piece having a third part having a void from which water can be removed.
  • the present invention also provides the following.
  • [1] A method for lysing coliforms in milk, wherein lysozyme, an ionic surfactant, and a nonionic surfactant are mixed with milk to lyse coliforms present in milk
  • a lysis method comprising: [2] The lysis method according to [1], wherein the ionic surfactant is an anionic surfactant.
  • the anionic surfactant contains an alkyl sulfate; and / or the nonionic surfactant contains a polyoxyethylene alkylphenyl ether.
  • the final concentration of the anionic surfactant is 0.01% or more and 0.15% or less, [2] or [ 3].
  • the final concentration of the lysozyme is 0.1 mg / ml or more and 200 mg / ml or less; and / or the lysis agent in the milk.
  • the immunochromatographic method includes: (1) a milk containing a specific substance, a first antibody labeled with the specific substance or a first part in which the labeled specific substance is retained, and the first part And a second part to which a second antibody against the specific substance is immobilized, and a part connected to the first part or the upstream of the second part, and removing milk fat globules in the milk Contacting the milk with the third portion or upstream thereof to a test piece having a third portion having a void that can be formed; and (2) the milk to the second portion or downstream thereof
  • the method according to [7] comprising the step of sinking and obtaining a detectable signal by the label in the second part or downstream thereof.
  • kits for detecting coliform bacteria in milk comprising: an immunochromatograph device for detecting a specific substance in milk, comprising a test piece having a third part.
  • coliform bacteria in milk can be detected quickly, conveniently and with high sensitivity and on the spot.
  • an appropriate treatment policy such as selection of an appropriate antibiotic and measures for preventing the spread of infection at an early stage.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of a test piece of an immunochromatography apparatus used in Example 2.
  • FIG. 1 labeled antibody impregnated member (first part), 2: membrane support for chromatographic development (second part), 3: capture site, 4: sample addition member and fat globule removing member (third part), 5: Absorbing member, 6: base material, and 7: fat globule removing member (third part)
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • lytic enzymes and nonionic surfactants in the detection of Escherichia coli by immunochromatography
  • the present invention provides a lysing agent for lysing coliform bacteria in milk.
  • the lysing agent of the present invention includes a lytic enzyme and a specific surfactant.
  • the kind of lytic enzyme in the present invention is not particularly limited, and any two or more lytic enzymes may be used in appropriate combination. Escherichia coli , a bacterium belonging to the genus Klebsiella , or Staphylococcus aureus as a mastitis-causing fungus. It is also preferable to use one or a combination of two or more enzymes. For example, one or more lytic enzymes selected from lysozyme, lysostaphin, pepsin, glucosidase, galactosidase, achromopeptidase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase and the like can be used.
  • Lysozyme is a 14.6 kDa single peptide protein that lyses bacterial cells by cleaving the ⁇ (1-4) glycosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine in the peptidoglycan layer. can do. Lysozyme can be obtained by purchasing a commercial product.
  • the content of the lytic enzyme in the lytic agent (when using a plurality of lytic enzymes, the content as the total amount of lytic enzymes is not particularly limited as long as an effective lysis rate is ensured for detection,
  • the final concentration as lysozyme can be 0.1 mg / ml or more, preferably 0.2 mg / ml or more, more preferably 0.5 mg / ml or more, and still more preferably 1.0 mg / ml or more, particularly preferably 2.0 mg / ml or more.
  • the upper limit of the content of the lytic enzyme can be determined as appropriate from an economical viewpoint, and can be 200 mg / ml or less, preferably 100 mg / ml or less, regardless of the lower limit. More preferably, it is 75 mg / ml or less, more preferably 50 mg / ml or less, and particularly preferably 25 mg / ml or less.
  • ionic surfactants Surfactants that ionize when dissolved in water are called ionic surfactants or ionic surfactants, and surfactants that do not become ions are called nonionic surfactants. Ionic surfactants are further classified into anionic (anionic) surfactants, cationic (cationic) surfactants and amphoteric surfactants.
  • At least one amphoteric surfactant, at least one anionic surfactant, at least one cationic surfactant, or any combination thereof is used simultaneously with the lytic enzyme.
  • at least one nonionic surfactant or at least one anionic surfactant or a combination thereof is used simultaneously with the lytic enzyme. More preferably, at least one nonionic surfactant and an anionic surfactant are used in combination with the lytic enzyme.
  • the type of surfactant to be used is not particularly limited, but as the nonionic surfactant, any of ester ether type, ester type, and ether type can be suitably used. More specifically, polyoxyethylene alkyl ether, Examples thereof include oxyethylene alkyl phenyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, and alkyl monoglyceryl ether. One particularly preferred example is polyoxyethylene alkyl phenyl ether, more specifically polyoxyethylene (10) octyl phenyl ether. In the immunochromatography method, it has been confirmed that polyoxyethylene alkylphenyl ethers such as polyoxyethylene (10) octylphenyl ether can be used effectively.
  • the content of the nonionic surfactant in the lysis agent (when a plurality of nonionic surfactants are used, the content as the total amount of nonionic surfactants) is, for example, a developing solution when using an immunochromatographic method.
  • the lower limit can be such that the final concentration when mixed with milk is 0.03% or more, preferably 0.05% or more. More preferably, it is 0.075% or more, more preferably 0.1% or more, and particularly preferably 0.3% or more.
  • the upper limit of the content of the nonionic surfactant only needs to be a level that does not significantly inhibit the reaction by the lytic enzyme or the antigen-antibody reaction, and in any case, it can be 10% or less, preferably It is 7.5% or less, more preferably 5% or less, further preferably 3% or less, and particularly preferably 2% or less.
  • Anionic surfactants include sodium alkyl sulfates such as sodium dodecyl sulfate and sodium myristyl sulfate, sodium N-acyl sarcosinate such as sodium N-lauroyl sarcosinate, sodium N-myristoyl sarcosinate, sodium dodecylbenzene sulfonate, hydrogen Additional coconut fatty acid monoglyceride sodium monosulfate, sodium lauryl sulfoacetate, N-acyl glutamate such as sodium N-palmitoyl glutamate, sodium N-methyl-N-acylalanine, sodium ⁇ -olefin sulfonate, etc. are not particularly limited .
  • the content of anionic surfactant in the lysis agent ensures an effective lysis rate for detection.
  • the final concentration when mixed with milk can be 0.0001% or more, preferably regardless of the content of the lytic enzyme. It is 0.0002 or more, more preferably 0.0005% or more, further preferably 0.001% or more, further preferably 0.005% or more, and particularly preferably 0.01% or more.
  • the upper limit of the content of the anionic surfactant may be a level that does not significantly inhibit the reaction by the lytic enzyme or the antigen-antibody reaction, and in any case, it can be 1% or less, preferably It is 0.75% or less, more preferably 0.5% or less, further preferably 0.3% or less, further preferably 0.2% or less, and particularly preferably 0.15% or less.
  • amphoteric surfactants include amino acids (alkylamino fatty acid salts), betaines (alkylbetaines), amine oxides (alkylamine oxides), and the like, but are not particularly limited. More specific examples include dimethylammoniopropane sulfonate, dodecyldimethylammoniobutylate, betaine laurate, and amidopropyl betaine.
  • More specific examples include n-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Decyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Hexadecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, N- Dodecyl-N, N- (dimethylammonio) butyrate.
  • an amine salt type or a quaternary ammonium salt type can be suitably used as the cationic surfactant. More specific examples include distearyldimethylammonium chloride, benzalkonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride. Examples thereof include bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide, and myristyltrimethylammonium bromide.
  • the lysing agent contains lysozyme, an anionic surfactant, and a nonionic surfactant.
  • a particularly preferred example of the nonionic surfactant is polyoxyethylene alkylphenyl ether.
  • the concentration of each component in such a lysing agent is such that the final concentration of lysozyme is 0.1 mg / ml or more and 200 mg / ml or less in the step of mixing the lysing agent in milk and lysing the bacteria present in the milk.
  • the final concentration of the anionic surfactant is preferably 0.01% or more and 0.15% or less, and the final concentration of the nonionic surfactant is preferably 0.03% or more and 10% or less.
  • the lysis agent of the present invention can contain one or more other components in addition to the lytic enzyme and the surfactant as long as the intended effect is not significantly impaired.
  • a preferable example of components other than the lytic enzyme and the surfactant is a substance having an effect of promoting lysis.
  • glutaraldehyde, halogen compounds, chlorhexidine alcohols (eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl- 2-propanol), phenol, hydrogen peroxide, acrinol, guanidine and salts thereof, chelating agents, organic acids and salts thereof, polyhydric alcohols (eg, ethylene glycol, propylene glycol, diethylene glycol, glycerin), and 2-mercaptoethanol , Reducing agents such as, but not limited to, dithiothreitol, cystine and thiophenol.
  • alcohols eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl- 2-propanol
  • phenol e.g, hydrogen peroxide, acrinol,
  • the lysis agent can be used by mixing with milk.
  • the mixing ratio between the milk and the lysing agent is not particularly limited as long as the final concentration of the lytic enzyme or the like is appropriately maintained and a sufficient lysis rate can be secured. If a relatively small amount of lysing agent is used for the milk, the milk is not diluted. Therefore, it can be expected that the cells can be detected with higher sensitivity. Moreover, when using a comparatively large amount of lysing agent with respect to milk, the influence by the fat globule and protein in milk is reduced, and it can be anticipated that a microbial cell can be detected in a shorter time.
  • the ratio of milk in the mixture of milk and lysing agent (milk / (milk + lysing agent) x 100) is higher from the viewpoint that the detection sensitivity can be increased, and any other conditions are However, it can be, for example, 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, and further preferably 30% or more.
  • the upper limit can be set to 100% by using a lysis agent solidified by means such as drying, whatever the other conditions.
  • the ratio of milk can be 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less.
  • the upper limit value may be determined in consideration of easiness of mixing, stability as a solution of the lysis agent, and the like.
  • milk may be simply mixed with a lysing agent.
  • the temperature at the time of mixing and the treatment time for the subsequent enzyme to act are not particularly limited as long as the lytic enzyme to be used can exert its activity, and may usually be room temperature. Those skilled in the art can appropriately design the time required for the processing time after mixing in consideration of the lysis rate.
  • the treatment time can be significantly shortened compared to the case where only the lytic enzyme is used.
  • the treatment time in the present invention is generally from several tens of minutes to several hours, more specifically within 120 minutes, preferably within 60 minutes, and more preferably within 45 minutes.
  • the treatment time can also be set to substantially 0 (milk and a lysis agent are mixed and immediately subjected to measurement). Even in such a short time, according to the present invention, a lysis rate of 90% or more is secured, and highly sensitive coliforms can be detected.
  • 100% is obtained by treating milk containing E. coli at about 1 ⁇ 10 5 cells / ml with the lysing agent of the present invention for about 10 minutes. It has been confirmed that the lysis rate can be achieved. Note that the lysis rate is 100% after treating the liquid containing the target bacteria with a non-ionic surfactant at an appropriate concentration in advance, followed by further sonication and sufficient enzyme treatment as necessary. %.
  • the Escherichia coli group lysed according to the present invention can be detected by various immunological methods using components derived from bacterial cells as antigens.
  • immunological measurement methods include immunochromatography, agglutination, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), or fluorescence immunoassay (FIA). However, it is not limited to these.
  • a blocking substance for preventing non-specific adsorption or a substance for preventing a cross reaction with bacteria other than the target bacteria may be used.
  • a globulin that does not participate in the reaction with the antigen can be added.
  • the final concentration during the reaction can be 0.01 ug / ml or more, preferably 0.1 ug / ml or more, more preferably 1 ug / ml or more.
  • the target antigen-antibody reaction it can be 10 mg / ml or less, preferably 5 mg / ml or less, more preferably 1 mg / ml or less.
  • Such final concentration conditions are particularly suitable for immunochromatographic methods.
  • Antigen-antibody reaction is performed by sandwich assay using “labeled first antibody against specific substance” retained in the first part and “second antibody against specific substance” immobilized on the second part. It can be detected by the method. Alternatively, the antigen-antibody reaction may be detected by a competition method using a labeled specific substance held in the first part and an antibody against the specific substance immobilized in the second part. However, in the present invention, a sandwich assay method in which the detection sensitivity is high and the antibody detection line appears positive is preferable.
  • the immunochromatography apparatus is an apparatus for detecting a specific substance in milk by an immunochromatography method, and includes a first antibody labeled against the specific substance or a first part in which the labeled specific substance is retained. A second part linked downstream of the first part and immobilized with a second antibody against the specific substance, and linked to the first part or upstream of the second part, and in the milk A device comprising a test piece having a third portion with a void from which milk fat globules can be removed.
  • the fat globule removing member (third portion) 7 is installed downstream of the sample addition member 4 and upstream of the labeled antibody-impregnated member (first portion) 1.
  • the immunochromatography apparatus can be manufactured using a commercially available material by a known method.
  • the material used for the first part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton, or the like.
  • the material used for the second part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably nitrocellulose, mixed nitrocellulose ester, polyvinylidene fluoride, nylon or the like.
  • the material used for the third part preferably has voids that can remove milk fat globules with a diameter of 1 to 10 ⁇ m contained in the milk.
  • the third part needs to be arranged upstream of the second part made of a porous membrane having a pore diameter of several tens to several hundreds of nanometers, and is a position where the sample solution can first contact and pass. It is preferable that the first portion is disposed on the upstream side.
  • the gap of the third part is not limited as long as milk fat globules can be separated, and the retained particle size is preferably 0.1 to 10 ⁇ m, more preferably 1 to 3.5 ⁇ m.
  • the material is not particularly limited as long as it has voids in the above range, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton or the like.
  • Retained particle size is the particle size of milk fat globules that are retained in the third portion without allowing milk fat globules having a particle size larger than that size to pass through the void, and the average pore size of the void in the third portion
  • milk fat globules having a particle size equal to or larger than 50%, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more. % Or more, and most preferably 98% or more is retained in the third portion without passing through the gap.
  • the percentage of milk fat globules retained can be measured by methods well known to those skilled in the art.
  • the GF / B provided by GE Healthcare Biosciences is the retention particle size (the particle diameter with a retention efficiency of 98%.
  • the retention particle size refers to this unless otherwise specified.
  • the product catalog it is possible to confirm the above particle size by methods well known to those skilled in the art.
  • the third part may use only a material having a specific holding particle size, and may be used by stepping together ones having a larger holding particle size in order to increase the separation efficiency of milk fat globules. .
  • the third part is composed of two or more members having voids capable of removing milk fat globules having different particle sizes, it is a preferred aspect of the present invention, and the third part is a first part disposed downstream. It is a further preferred embodiment of the present invention when it is constituted by a member and a second member disposed upstream, and the retained particle size of the second member is larger than the retained particle size of the first member.
  • the retained particle size of the first member disposed downstream is 1.0 to 2.0 ⁇ m
  • the retained particle size of the second member disposed upstream is It is preferably 3.0 to 3.5 ⁇ m.
  • the third part is a member having a small retained particle size and retained particles. It is preferable to configure a combination with a member having a large size.
  • the first part holds the labeled first antibody against the specific substance or the labeled specific substance.
  • the specific substance can be detected by a sandwich assay method.
  • the specific substance labeled in the first part can be detected by the competition method.
  • the sandwich assay method in which detection sensitivity is high, positive and an antibody detection line appears is preferable, the first part should retain the first antibody labeled with a specific substance. Is preferred.
  • first antibody labeled with a specific substance When the first antibody labeled with a specific substance is held in the first part, two types of antibodies are used: a first antibody against the specific substance and a second antibody against the specific substance.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that can simultaneously bind to the specific substance so that the specific substance can be detected by sandwich assay, and the first antibody recognizes the first antibody.
  • the epitope of the specific substance is preferably different from the epitope of the specific substance recognized by the second antibody.
  • the first antibody or specific substance held in the first portion is labeled.
  • the label used in the present invention include colored particles, enzymes, radioisotopes, and the like, but it is preferable to use colored particles that can be detected visually without the need for special equipment.
  • the colored particles include metal fine particles such as gold and platinum, non-metal particles, and latex particles, but are not limited thereto.
  • the colored particles may be any size as long as they can be transported downstream through the voids of the test piece, but a diameter of 1 nm to 10 ⁇ m is preferable. More preferably, it is 5 nm to 1 ⁇ m, and further preferably 10 nm to 100 nm.
  • coliform bacteria in milk can be detected.
  • E. coli Esscherichia coli
  • Klebsiella Klebsiella bacteria
  • Citrobacter Citrobacter
  • Enterobacter Enterobacter
  • Proteus Proteus
  • Klebsiella bacteria include Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca .
  • a lysing agent in which a lytic enzyme and a surfactant are appropriately mixed, E. coli contained in milk itself containing milk fat globule and high concentration protein obtained from livestock such as cattle. Groups can be detected.
  • the specific substance to be measured in the present invention can be any substance that can be measured by immunochromatography, but is preferably a bacterial component or a substance secreted by bacteria. More preferably, it is a bacterial L7 / L12 ribosomal protein. L7 / L12 ribosomal proteins have high detection sensitivity due to the presence of multiple copies in the cell. Further, as shown in the following examples, an antibody capable of distinguishing a specific bacterium causing mastitis from another bacterium by species or genus can be actually obtained by a known method described below.
  • the kind of bacteria is not particularly limited, and may be either a gram positive bacterium or a gram negative bacterium.
  • staphylococci bacteria belonging to the genus Staphylococcus
  • Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus
  • bacteria belonging to the genus Escherichia coli or Klebsiella are not limited thereto.
  • the above antibody can be prepared by the method described in International Publication No. 00/06603 pamphlet.
  • the bacterial ribosomal protein L7 / L12 can be prepared using the full-length protein of the bacterial ribosomal protein L7 / L12 or a partial peptide thereof as the antigen, but it is preferable to prepare the full-length protein as the antigen.
  • This partial peptide or full-length protein is directly or after cross-linking with a carrier protein, and then inoculated into an animal together with an adjuvant as necessary, and an antibody (polyclonal antibody) that recognizes the L7 / L12 ribosomal protein by recovering the serum. Serum can be obtained.
  • the antibody can be purified from the antiserum and used.
  • the animals to be inoculated include sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and sheep, rabbits and the like are particularly preferable for producing polyclonal antibodies.
  • the antibody it is more preferable to apply a monoclonal antibody obtained by a known method for producing a hybridoma cell. In this case, a mouse is preferable.
  • the monoclonal antibody a monoclonal antibody that reacts with ribosomal protein L7 / L12 of a specific bacterium that causes mastitis and does not react with ribosomal protein L7 / L12 of a bacterium that causes mastitis other than the specific bacteria. By screening, it can be used for diagnosis of whether or not the bacterium has an infection.
  • the antibody reacts with a component of a specific bacterium causing mastitis or a substance secreted by the bacterium, and does not react with a component of a bacterium causing mastitis other than the specific bacterium or a substance secreted by the bacterium.
  • a monoclonal antibody an antibody that recognizes other than ribosomal protein L7 / L12 as an antigen can be used.
  • the monoclonal antibody it is preferable to use a monoclonal antibody whose antigen-antibody reaction is not inhibited by contaminants other than the specific substance contained in the milk.
  • milk contains a large amount of protein such as casein, which may inhibit the reaction between a specific substance and a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody against a specific substance is produced by a conventional method, for example, it may be preferable to appropriately select and use a monoclonal antibody in which the antigen-antibody reaction is not inhibited by casein or the like, or a monoclonal antibody that has little influence on the antigen-antibody reaction. is there.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen After manufacturing a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen according to a conventional method, such a monoclonal antibody is examined whether the antigen-antibody reaction is inhibited in the presence of contaminants such as casein, It can be easily obtained by selecting a monoclonal antibody that does not substantially inhibit the reaction.
  • the immunochromatography apparatus of the present invention is a combination of a container, for example, a microtube, and an additive solution, for example, an additive solution containing a lytic enzyme or a surfactant for lysing bacteria to elute the ribosomal protein L7 / L12 into the solution. It can also be provided as a kit.
  • Example 1 Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) in the presence of lysozyme and nonionic surfactant in the detection of E. coli by immunochromatography
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • L7 / L12 Used Escherichia coli ribosomal protein L7 / L12 monoclonal antibody.
  • L7 / L12 ribosomal protein of Escherichia coli was obtained, and a monoclonal antibody was produced using the protein.
  • the monoclonal antibody a combination of two species (EC-1 and EC-2) capable of simultaneously binding to another site of the L7 / L12 ribosomal protein of the above and other coliform strains was selected.
  • the immunochromatography apparatus was produced as follows.
  • BSA bovine serum albumin
  • colloidal gold-labeled monoclonal antibody EC-2 (hereinafter referred to as “gold colloid-labeled antibody”) solution.
  • This solution was centrifuged (15000 ⁇ rpm, 5 minutes) to precipitate the colloidal gold labeled antibody, and the supernatant was removed to obtain a colloidal gold labeled antibody.
  • the colloidal gold labeled antibody was suspended in a 20 mm Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing 0.25% BSA, 2.5% sucrose and 35 mm NaCl to obtain a colloidal gold labeled antibody solution.
  • a 10 mm ⁇ 300 mm belt-shaped glass fiber pad was impregnated with 2 mL of the colloidal gold labeled antibody solution and dried under reduced pressure at room temperature to obtain a colloidal gold labeled antibody impregnated member 1 (first part).
  • FIG. 1 shows a cross-sectional view of the immunochromatograph device.
  • 25 mm GF / DVA manufactured by GE Healthcare Biosciences
  • Filter member 4 consisting of glass fiber with a thickness of 776 ⁇ m and a retention particle size of 3.5 ⁇ m
  • 20 mm GF / AVA GE Healthcare Biosciences
  • Filter member 7 consisting of glass fiber with a thickness of 299 ⁇ m and a retention particle size of 1.7 ⁇ m
  • filter paper was prepared as the absorbing member 5.
  • Test Milk milk was measured with an immunochromatograph apparatus as follows. 100 microliters of milk containing microbelubilized E. coli (ATCC 25922 strain) or Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883 strain), which is a strain of coliforms, in a final concentration of 1 ⁇ 10 5 (cfu / ml) (Final concentration 1% TritonX-100, 2.2 mg / ml lysozyme (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, titer 0.8 mg lysozyme / mg dry matter equivalent), 0.1M MOPSO pH 7.5), add 150 ⁇ l, mix at room temperature, 10 Let stand for a minute.
  • E. coli ATCC 25922 strain
  • Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 strain
  • the immunochromatograph device is immersed in the mixed solution from the sample addition member 4 and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for development, and then the ribosomal protein L7 / L12 antigen and gold colloid-labeled antibody captured at the supplemental site 3 A red-purple line that increases or decreases the capture of the complex in proportion to the capture amount was measured with an apparatus C10066 (manufactured by Hamamatsu Photonics).
  • the bacterial solution that had been pre-stirred overnight with a final concentration of 1.0% TritonX-100 and then sonicated (output 10, 1 min x 10 times) was mixed with 2.2 mg / ml lysozyme, 0.1M MOPSO pH7.5 at 37 °C for 60 minutes.
  • the lysis rate under each condition was calculated with the lysis rate of the lysed bacterial solution as 100%.
  • a comparison was made for the case (condition 1) where the final concentration of 0.01% sodium dodecyl sulfate (SDS) was not added (condition 2).
  • Example 2 Effect of Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) in the Presence of Lytic Enzyme and Nonionic Surfactant in Detection of Escherichia coli by Immunochromatography
  • SDS Sodium Dodecyl Sulfate
  • the immunochromatograph device is immersed in the mixed solution from the sample addition member 4 and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for development, and then the ribosomal protein L7 / L12 antigen and gold colloid-labeled antibody captured at the supplemental site 3
  • a red-purple line that increases or decreases the capture of the complex in proportion to the capture amount was measured with an apparatus C10066 (manufactured by Hamamatsu Photonics).
  • SDS was added to the above lysis solution at different concentrations, and each concentration of SDS (final concentration 0.01 to 0.15) was defined as 100% lysis when using a lysate treated in advance in the same manner as in Example 1. %) was calculated.
  • Example 3 Measurement of milk sample by immunochromatography The immunochromatography method was performed on milk samples from cattle with mastitis. The measurement was performed according to Example 2, and the reddish purple line that appeared was visually judged (positive +, negative-). The lysis treatment solution was compared with the case where 2.2 mg / ml lysozyme and 0.01% SDS (both values as final concentrations) were not added to a final concentration of 1% TritonX-100 and 0.1M MOPSO pH 7.5. On the other hand, in order to confirm the number of E. coli in milk, quantification was performed by quantitative PCR. Genomic DNA was extracted from 100 ⁇ l of milk using a DNA mini kit (Qiagen), followed by PCR using Quantification of Escherichia coli (all strains) (PrimerDesign) to quantify the amount of E. coli in the milk.
  • Table 1 shows the number of E. coli calculated by PCR and the results of determination by immunochromatography.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌が大腸菌群であるか否かを検出するための溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法および検出キットを提供することを課題とする。大腸菌群の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、溶菌酵素および少なくとも一の陰イオン界面活性剤、好ましくはさらに少なくとも一の非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する大腸菌群を溶菌する工程を含む方法を提供する。溶菌酵素は、好ましくはリゾチームである。

Description

乳汁中の大腸菌群を検出する方法
　本発明は、家畜の乳汁中から乳房炎原因菌である大腸菌群を検出するための溶菌方法および検出方法に関するものである。
　牛、羊、ヤギに代表される家畜の乳汁は無菌的なものではなく、疾患や環境が原因で何らかの微生物が混入している場合がある。特に乳房への微生物の感染による疾患ではしばしば乳汁中に多くの微生物を排菌することが知られている。微生物の感染が原因で引き起こされる代表的な家畜の疾患に乳房炎がある。
　乳房炎とは、乳管系、乳腺組織の炎症であり、主に微生物が乳房内に侵入・定着し、増殖することによって引き起こされる。乳房炎は多くの動物が罹患するが、特に乳牛における牛乳房炎は乳牛全体の15～40％が罹患すると言われ、酪農家にとって極めて重要な疾患の一つである。乳牛が乳房炎に罹患すると、乳汁の合成機能が阻害され、泌乳量の減少や場合によっては泌乳の停止が起こるだけでなく、治療費や、乳質低下による乳価のペナルティーなど多大な経済的損失を酪農家に与える。さらには、伝染防止のために乳房炎罹患分房を個別に搾乳するなど、酪農家にかかる労働負担も増加する。
　乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされる。原因菌のなかでも大腸菌やクレブシエラに代表される大腸菌群は、発熱などの全身症状、乳房の熱感、腫脹および硬結などの局所症状を引き起こす。　乳汁からの大腸菌群の検出方法としては培養法が広く用いられている。培養法は結果が得られるのに数日間を要し迅速な原因菌特定には適さない。一方、原因菌に特異的な成分に対する抗体を用いる抗原抗体反応による同定法、特にイムノクロマトグラフ法は数10分で結果を判定できるため、迅速・簡便な検査方法として家庭や診察室等で広く用いられている（例えば特許文献1）。本発明者らは、イムノクロマトグラフ法を、家畜の乳汁中の物質を検出するための方法としても検討してきた（特許文献2）。
　細菌の抗原抗体反応による検出に際しては、菌体内成分が検出対象となる場合は菌体を溶菌し、その成分を検出することによる方法も検討されてきた。例えば、微生物を非蛍光物質に対し、微生物の持つ酵素を作用させて、蛍光物質を生成せしめ、この蛍光物質を測定することにより、微生物菌数を測定する方法において、該微生物の細胞膜溶解剤単独またはリゾチームと細胞膜溶解剤を添加することを特徴とする、微生物菌数測定方法が開示されている（特許文献3）。また、微生物の多重検出方法として、溶菌酵素および/または溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理する方法（特許文献4）が知られている。特許文献3では、均質化した食品サンプルを遠心分離した上澄み液を使用している。特許文献4では、培養した菌液を用いており、乳汁のような高タンパク、高脂肪の溶液中で溶菌効果が得られることは記載されていない。
特開平1-244370号公報 特開2012-122921号公報 特開昭63-167799号公報 国際公開WO2005/064016（特許第4621919号公報） 特開平7-196463号公報
Comp. lmmun. Microbiol. infect. Dis., Vol. 6, No. 3, pp. 235-245, 1983
　乳房炎は細菌など様々な微生物の感染によって引き起こされるが、原因菌によって効果を示す抗生物質が異なる。したがって乳房炎の早期診断、治療は大変重要となる。また、特定の細菌が乳房炎を起こした場合では個体の他の分房や個体間に伝染することもあり乳汁中に存在する原因菌を迅速・簡便・高感度に同定することが極めて重要となる。特に、グラム陽性菌と比べて増殖スピードが速く重篤化しやすく、甚急性の乳房炎を引き起こし、死に至ることも多い大腸菌群に関しては、乳房炎の被害を防ぐには、感染早期に発見し、治療することが非常に重要となる。
　菌の検出方法として広く用いられている培養法は、結果が得られるのに数日間を要するという問題がある。一方、イムノクロマトグラフ法などの抗原抗体反応に基づく免疫学的測定方法は、培養法と比べると迅速・簡便に原因菌を検出することが可能となる利点がある。
　免疫学的測定方法にて原因菌の菌体内の特定物質を高感度に検出するには、特に菌体内成分が抗原の場合、菌体を高効率に溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。しかしながら、乳汁を検体として用いた場合、乳汁中に多量に含まれるカゼインなどのタンパク質や乳脂肪球などの影響により従来技術では溶菌が十分に行われないことが判明している。したがって、乳房炎原因菌の高感度な検出のために乳汁中で高効率に大腸菌群を溶菌する方法が望まれていた。しかしながら、乳汁中の大腸菌群を検出のための有効な溶菌方法は知られていない。
　本発明は、家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌が大腸菌群であるか否かを検出するための溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法および検出キットを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は、高タンパク、高脂肪かつ個体差のある乳汁から高感度に大腸菌群を検出するためには、菌体内の対象抗原を高効率に抽出する必要があると考え、乳汁中の大腸菌群を高効率に溶菌するために溶菌酵素および複数の界面活性剤を同時に用いることで溶菌の効率が向上し、乳汁中の大腸菌群を高感度に検出できることを見出した。特に、溶菌酵素としてリゾチームを用いた場合に、陰イオン界面活性剤、特にラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム）を組み合わせて用いるとリゾチームが持っている酵素活性が失われることが知られているが（前掲特許文献5）、発明者らが検討した結果、陰イオン界面活性剤を適当な濃度範囲で用いることにより、溶菌率が逆に大幅に向上し、乳汁中の大腸菌群を高感度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
[1]  大腸菌群の溶菌方法であって、大家畜から得た乳汁と、溶菌酵素および少なくとも一の陰イオン界面活性剤を含有する溶菌剤とを混合して乳汁中に存在する大腸菌群を溶菌する工程を含む、方法。
[2]  溶菌酵素がリゾチームであることを特徴とする[1]に記載の溶菌方法。
[3]  陰イオン界面活性剤が、終濃度が0.01～0.15％となるように乳汁と溶菌剤とが混合される、[1]または[2]に記載の溶菌方法。
[4]  溶菌剤が、さらに少なくとも一の非イオン界面活性剤を含む、[1]～[3]のいずれか一に記載の方法。
[5]  陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩を含有する、[4]に記載の方法。
[6]  非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを含有する、[1]～[5]のいずれか一に記載の方法。
[7]  家畜乳汁中の大腸菌群の溶菌のために用いる、溶菌酵素および少なくとも一の陰イオン界面活性剤を含有する溶菌剤。
[8]  家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、[7]に記載の溶菌剤。
[9]  陰イオン界面活性剤が、乳汁と溶菌剤とが混合されたときに終濃度が0.01～0.15％となる濃度である、[7]または[8]に記載の溶菌剤。
[10]　 [1]～[6]のいずれか一に記載の方法を含み、溶菌により放出された大腸菌群の菌体内由来の特定物質を検出する工程をさらに含む、家畜乳汁中の大腸菌群の検出方法。
[11]　特定物質の検出工程が、イムノクロマトグラフ方法により実施される、[10]に記載の方法。
[12]　イムノクロマトグラフ方法が、（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、[11]に記載の方法。
[13]　該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、[12]に記載の方法。
[14]　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される、[12]または[13]に記載の方法。
[15]　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、[14]に記載の方法。
[16]　[7]～[9]のいずれか一に記載の溶菌剤と、　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置とからなる、家畜乳汁中の大腸菌群検出用キット。
 本発明は、以下も提供する。
［1］　乳汁中の大腸菌群の溶菌方法であって　乳汁に、リゾチーム、イオン界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する大腸菌群を溶菌する工程を含む、溶菌方法。
［2］　該イオン界面活性剤が陰イオン界面活性剤である［1］に記載の溶菌方法。
［3］　該陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩を含有し；および／または該非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを含有する、［2］に記載の溶菌方法。
［4］　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該陰イオン性界面活性剤の終濃度が、0.01％以上0.15％以下である、［2］または［3］に記載の溶菌方法。
［5］　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該リゾチームの終濃度が、0.1mg/ml以上200mg/ml以下であり；および／または
　　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下である、［4］に記載の溶菌方法。
［6］　［1］～［5］のいずれか一に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する大腸菌群を溶菌する工程
を含み、
　溶菌により放出された菌体内由来の特定物質を検出する工程
をさらに含む、乳汁中の大腸菌群の検出方法。
［7］　検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される［6］に記載の方法。
［8］　該イムノクロマトグラフ方法が、（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、［7］に記載の方法。
［9］　該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、［8］に記載の方法。
［10］　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている［8］または［9］に記載の方法。
［11］　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、［10］に記載の方法。
［12］　［1］～［5］のいずれか一に記載の溶菌剤。
［13］　家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、［11］に記載の溶菌剤。
［14］　［12］または［13］に記載の溶菌剤と、　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置とを含む、乳汁中の大腸菌群の検出用キット。
　本発明によれば、乳汁中の大腸菌群を迅速・簡便・高感度に、かつその場で検出することができる。特に、牛乳房炎を診断する場合において、標識が視認できるものである場合には装置等を用いずに酪農場で実施することができ、病状の更なる悪化の前に迅速に原因菌を特定し、適切な抗生物質の選択などの的確な治療方針や、感染拡大防止のための措置を早期に決定することができる。
実施例2で用いたイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。1：標識抗体含浸部材（第1部分）、2：クロマト展開用膜担体（第2部分）、3：捕捉部位、4：試料添加用部材かつ脂肪球除去用部材（第3部分）、5：吸収用部材、6：基材、および7：脂肪球除去用部材（第3部分） イムノクロマトグラフ法による大腸菌の検出におけるリゾチームおよび非イオン界面活性剤存在下でのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の効果 イムノクロマトグラフ法による大腸菌の検出における溶菌酵素および非イオン界面活性剤存在下でのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の効果
　以下、本発明について更に詳細に説明する。なお、本発明において、数値範囲を「X～Y」で表すときは、両端の値を含む。「％」は、特に記載した場合を除き、質量に基づく割合を示す。「Aおよび（ならびに）／またはB」は、AとBの少なくとも一方の意であり、Aのみである場合、Bのみである場合、並びにAおよびBである場合がある。
　本発明は、乳汁中の大腸菌群を溶菌するための溶菌剤を提供する。本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および特定の界面活性剤を含む。
［溶菌酵素］
　本発明における溶菌酵素の種類は特に限定されず、任意の2種以上の溶菌酵素を適宜組み合わせて用いてもよい。乳房炎の起炎菌として大腸菌(Escherichia coli)、クレブシエラ(Klebsiella)属に属する細菌、または黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による感染が多発することから、これらの微生物に対して溶菌作用を発揮できる溶菌酵素を1種または2種以上組み合わせて用いることも好ましい。例えばリゾチーム、リゾスタフィン、ペプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アクロモペプチダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼなどから選ばれる1種または2種以上の溶菌酵素を用いることができる。
　乳房炎の起炎菌として大腸菌群の存在が特に疑われる場合には、大腸菌群に対して特異的に溶菌作用を発揮する酵素を単独で、または他の溶菌酵素と組み合わせて用いることが好ましい場合がある。例えば、溶菌酵素としてリゾチームと細胞膜溶解剤とを用いる方法が提案されている（特開昭63-167799号公報）。
　リゾチームは、14.6kDaの単一ペプチドのタンパク質であり、ペプチドグリカン層でN-アセチルムラミン酸とN-アセチルグルコサミンとの間のβ（1-4）グリコシド結合を切断することによりバクテリアの細胞を溶解することができる。リゾチームは市販品の購入により入手することが可能である。
　溶菌剤中での溶菌酵素の含量（複数の溶菌酵素を用いる場合は、溶菌酵素総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、乳汁と混合した場合の終濃度がリゾチームとして、0.1 mg/ml以上となるようにすることができ、好ましくは0.2 mg/ml以上であり、より好ましくは0.5 mg/ml以上であり、さらに好ましくは1.0 mg/ml以上であり、特に好ましくは　2.0 mg/ml以上である。また溶菌酵素の含量の上限は、経済的な観点等から適宜定けることができ、下限がいずれの場合であっても、200 mg/ml以下とすることができ、好ましくは100 mg/ml以下であり、より好ましくは75 mg/ml以下であり、さらに好ましくは50 mg/ml以下であり、特に好ましくは25 mg/ml以下である。
［界面活性剤］
　水に溶かしたときに、電離してイオンとなる界面活性剤をイオン界面活性剤またはイオン性界面活性剤といい、イオンにならない界面活性剤を非イオン（ノニオン）界面活性剤という。イオン界面活性剤はさらに、陰イオン（アニオン）界面活性剤、陽イオン（カチオン）界面活性剤および両性界面活性剤に分類される。
　本発明においては、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の両性界面活性剤、少なくとも一の陰イオン界面活性剤、もしくは少なくとも一の陽イオン界面活性剤、またはこれらのいずれかの組み合わせを用いる。好ましくは、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の非イオン界面活性剤もしくは少なくとも一の陰イオン性界面活性剤、またはこれらの組み合わせを用いる。さらに好ましくは、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の非イオン界面活性剤および陰イオン界面活性剤を組み合わせて用いる。
　用いる界面活性剤の種類は特に限定されないが、非イオン界面活性剤としてはエステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどがあげられる。特に好ましい例の一つは、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、より特定するとポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等である。イムノクロマトグラフ法においても、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルのようなポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが有効に使用できることが確認されている。
　溶菌剤中での非イオン界面活性剤の含量（複数の非イオン界面活性剤を用いる場合は、非イオン界面活性剤総量としての含量を指す。）は、例えばイムノクロマトグラフ法を用いる場合は展開液の流れが確保される限り、特に限定されないが、いずれの場合であっても、下限は、乳汁と混合した場合の終濃度が0.03％以上となるようにすることができ、好ましくは0.05％以上であり、より好ましくは0.075％以上であり、さらに好ましくは0.1％以上であり、特に好ましくは0.3％以上である。また非イオン界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、10％以下とすることができ、好ましくは7.5％以下であり、より好ましくは5％以下であり、さらに好ましくは3％以下であり、特に好ましくは2％以下である。
　陰イオン界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、N-ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、N-ミリストイルザルコシン酸ナトリウム等のN-アシルザルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、N-パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のN-アシルグルタミン酸塩、N-メチル-N-アシルアラニンナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウムなどがあげられるが特に限定されない。
　溶菌剤中での陰イオン界面活性剤の含量（複数の陰イオン界面活性剤を用いる場合は、陰イオン界面活性剤総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、下限値に関しては、溶菌酵素の含量がいずれの場合であっても、乳汁と混合した場合の終濃度が0.0001％以上となるようにすることができ、好ましくは0.0002以上であり、より好ましくは0.0005％以上であり、さらに好ましくは0.001％以上であり、さらに好ましくは0.005％以上であり、特に好ましくは0.01％以上である。また陰イオン界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、1％以下とすることができ、好ましくは0.75％以下であり、より好ましくは0.5％以下であり、さらに好ましくは0.3％以下であり、さらに好ましくは0.2％以下であり、特に好ましくは0.15％以下である。
　両性界面活性剤としては、アミノ酸系（アルキルアミノ脂肪酸塩）、ベタイン系 （アルキルベタイン）、アミンオキシド系（アルキルアミンオキシド）等があげられるが、特に限定されない。より特定された例としては、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインがあげられる。より具体的な例としては、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、N-Dodecyl-N,N-(dimethylammonio)butyrateがあげられる。
　陽イオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型のいずれも好適に用いることができ、より具体的な例として、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等をあげることができる。
［配合例］
　特に好ましい態様においては、溶菌剤は、リゾチーム、陰イオン性界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する。リゾチーム、陰イオン性界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤において、非イオン界面活性剤の特に好ましい例は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。このような溶菌剤における各成分の濃度は、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、リゾチームの終濃度が、0.1mg/ml以上200mg/ml以下であり、陰イオン性界面活性剤の終濃度が、0.01％以上0.15％以下であり、かつ非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下であるようにするとよい。
［その他の成分］
　本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および界面活性剤以外に、意図した効果を著しく損なわない限り、一種またはそれ以上の他の成分を含むことができる。溶菌酵素および界面活性剤以外の成分の好ましい例は、溶菌を促進する効果を有する物質である。具体的には、グルタルアルデヒド、ハロゲン化合物、クロルヘキシジン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノール）、フェノール、過酸化水素、アクリノール、グアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸およびその塩、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン）、ならびに２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンおよびチオフェノールなどの還元剤をあげることができるが、これらに限定されない。
［溶菌条件、溶菌率］
　本発明においては、溶菌剤は、乳汁に混合して用いることができる。乳汁と溶菌剤との混合比は、溶菌酵素等の終濃度が適切に維持され、十分な溶菌率が確保できる限り、特に限定されない。乳汁に対して比較的少量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁が希釈されない。したがって、より高い感度で菌体を検出できると期待できる。また乳汁に対して比較的大量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁中の脂肪球やタンパク質による影響が減じられ、より短時間で菌体を検出できると期待できる。乳汁と溶菌剤との混合物における乳汁の割合（乳汁／（乳汁＋溶菌剤）×100）は、高いほど検出感度を上げることができるとの観点からは、他の条件がいずれの場合であっても、例えば5％以上とすることができ、10％以上とすることが好ましく、20％以上とすることがより好ましく、30％以上とすることがさらに好ましい。上限値は、他の条件がいずれの場合であっても、乾燥等の手段によって固形化した溶菌剤を用いることにより、乳汁の割合を100％とすることができる。また、他の条件がいずれの場合であっても、乳汁の割合は90％以下とすることができ、80％以下、70％以下、60％以下、または50％以下とすることができる。上限値は、混合の容易さ、溶菌剤の溶液としての安定性等を考慮して決定してもよい。
　本発明においては、乳汁は溶菌剤と単に混合すればよい。混合する際の温度、およびそれに続く酵素が作用するための処理時間は、用いる溶菌酵素が活性を発揮できる温度であれば特に限定されず、通常、室温でよい。混合後の処理時間のために必要な時間は、当業者であれば、溶菌率を考慮して、適宜設計することができる。本発明においては、大腸菌群に対して適切な組み合わせおよび濃度の溶菌酵素および界面活性剤を用いているので、処理時間を、溶菌酵素のみを用いる場合よりも大幅に短くすることができる。本発明における処理時間は、概ね数十分間～数時間以内であり、より具体的には120分間以内とすることができ、60分以内とすることが好ましく、45分以内とすることがさらに好ましく、25分間以内とすることがさらに好ましく、20分以内とすることがさらに好ましく、15分以内とすることがさらに好ましい。処理時間を、実質0とする（乳汁と溶菌剤を混合して、直ちに測定に供する）こともできる。このような短時間であっても、本発明に依れば90％以上の溶菌率が確保され、高感度の大腸菌群の検出が実施できる。
　本発明者らの検討によると、本明細書の実施例に記載した条件では、大腸菌を約1×105 cells/mlで含む牛乳を本発明の溶菌剤により約10分間処理することにより100％の溶菌率を達成できることが確認できている。なお溶菌率は、対象となる菌を含む液を、あらかじめ適切な濃度の非イオン界面活性剤で処理した後、さらに超音波処理し、必要に応じ十分な酵素処理を行ったものの溶菌率を100％とすることができる。
［検出手段］
　本発明により溶菌された大腸菌群は、菌体由来の成分を抗原として、各種の免疫学的方法により検出することができる。免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフグラフ法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ELISA法）、放射能免疫測定法（RIA法）、または蛍光免疫測定法（FIA法）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　免疫学的方法の実施に際し、非特異吸着を防ぐためのブロッキングのための物質や、対象菌以外の菌との交差反応を防ぐための物質を用いてもよい。特に、用いる抗体と黄色ブドウ球菌が保有するプロテインＡとの反応を防ぐために、抗原との反応に関与しないグロブリンを添加することができる。グロブリンを用いる場合、偽陽性を抑制するという観点からは、反応時の終濃度として、0.01ug/ml以上、好ましくは0.1ug/ml以上、より好ましくは1ug/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、対象の抗原抗体反応を阻害しないという観点から、10mg/ml以下、好ましくは5mg/ml以下、より好ましくは1mg/ml以下とすることができる。このような終濃度の条件は、イムノクロマトグラフ法に特に適する。
　イムノクロマトグラフ法を用いる場合、典型的には、次のように実施することができる。
［イムノクロマトグラフ法、イムノクロマトグラフ装置］
　抗原抗体反応は、第1部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第2部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第1部分に保持されている標識された特定物質と、第2部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
　イムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するための装置であって、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図2に断面模式図を示した試験片が挙げられる。図2においては、脂肪球除去用部材（第3部分）7は、試料添加用部材4の下流、かつ標識抗体含浸部材（第1部分）1の上流に設置されている。
　イムノクロマトグラフ装置は公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。
　第1部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
　第2部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
　第3部分に使用する材料は、乳汁中に含まれる直径1～10数μmの乳脂肪球を除去できる空隙を有していることが好ましい。第3部分は、試料溶液が孔径数10～数100nmの多孔性のメンブレンからなる上記第2部分の上流側に配置されている必要があり、試料溶液が最初に接触・通過できる位置である、上記第1部分の上流側に配置されていることが好ましい。
　第3部分が有する空隙は乳脂肪球を分離できる大きさであればよく、保持粒子サイズは好ましくは0.1から10μmであり、より好ましくは1から3.5μmである。材料は上記の範囲の空隙を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはセルロース誘導体等繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。保持粒子サイズとは、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球が空隙を通過できずに第3部分に保持される乳脂肪球の粒子サイズのことであり、第3部分の空隙の平均ポアサイズに実質的に対応しているが、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球の50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは98％以上が空隙を通過できずに第3部分に保持される。保持される乳脂肪球の割合は当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社から提供されているGF/Bは保持粒子サイズ（保持効率98％の粒子直径のこと。本明細書で保持粒子サイズというときは、特に記載した場合を除き、この意味である。）が1.0μmであることが同製品カタログにおいて明らかにされているが、当業者に周知の方法で上記の粒子サイズを確認することが可能である。
　上記第3部分は、特定の保持粒子サイズを有する材料のみを用いてもよく、乳脂肪球の分離効率を高めるために保持粒子サイズが大きいものから小さいものを段階的に張り合わせて用いてもよい。上記第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される場合は本発明の好ましい態様であり、第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい場合は本発明のさらに好ましい態様である。第3部分を2種の部材により構成する場合には、下流に配置された第一の部材の保持粒子サイズが1.0～2.0μmであり、上流に配置された第二の部材の保持粒子サイズが3.0～3.5μmであることが好ましい。高濃度で広い粒径分布を有する乳脂肪球を含む乳汁、好ましくは搾乳後の未希釈の乳汁から特定物質を高感度に検出するためは、第3部分を保持粒子サイズの小さな部材と保持粒子サイズの大きな部材との組み合わせにより構成することが好ましい。
　上記第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体、または標識された特定物質が保持されている。第1部分に、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができる。また、第1部分に標識された特定物質が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されていることが好ましい。
　第1部分に特定物質に対する標識された第一の抗体を保持させる場合には、特定物質に対する第一の抗体と、特定物質に対する第二の抗体の、2種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができるように、上記第一の抗体と上記第二の抗体は、当該特定物質に同時に結合できることができる抗体であり、上記第一の抗体が認識する当該特定物質のエピトープは、上記第二の抗体が認識する当該特定物質のエピトープとは異なることが好ましい。
　本発明において、検出可能な信号を得るために、第1部分に保持される第一の抗体または特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が1nmから10μmが好ましい。より好ましくは、5nmから1μmであり、さらに好ましくは10nmから100nmである。
［検出対象］
　本発明により、乳汁中の大腸菌群を検出できる。本発明で「大腸菌群」というときは、特に記載した場合を除き、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、サイトロバクター（Citrobacter）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌およびプロテウス（Proteus）属細菌が含まれる。クレブシエラ属細菌には、Klebsiella pneumoniaeおよびKlebsiella oxytocaが含まれる。本発明においては、溶菌酵素と界面活性剤が適切に配合された溶菌剤を用いることにより、牛等の家畜から得られた、乳脂肪球と高濃度のタンパク質を含有する乳汁そのものに含まれ大腸菌群を検出することができる。
　本発明で測定される特定物質は、イムノクロマトグラフ法で測定できる物質であれば何れでも可能であるが、細菌の成分または細菌が分泌する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、細菌のL7/L12リボゾームタンパク質である。L7/L12リボソームタンパク質は、細胞内に多コピー存在するために検出感度が高い。また、後の実施例で示すように、以下に記載の公知の方法により、乳房炎の原因となる特定の細菌を他の細菌と種または属で識別可能な抗体を実際に取得可能である。細菌の種類は特に限定されず、グラム陽性菌またはグラム陰性菌のいずれであってもよい。例えば、ブドウ球菌（スタフィロコッカス属に属する細菌）、好ましくは黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌、または大腸菌やクレブシエラ属に属する細菌などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
［抗体］
　上記の抗体は、国際公開第00/06603号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L7/L12を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質L7/L12の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでL7/L12リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L7/L12と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L7/L12とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
　抗体が乳房炎の原因となる特定の細菌の成分または該細菌が分泌する物質と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌の成分または該細菌が分泌する物質とは反応しないモノクローナル抗体であれば、リボゾームタンパク質L7/L12以外を抗原として認識する抗体であっても使用することができる。
　また、モノクローナル抗体としては、乳汁中に含まれる特定物質以外の夾雑物により抗原抗体反応が阻害されないモノクローナル抗体を用いることが好ましい。例えば、乳汁中にはカゼインなどのタンパク質が大量に含まれており、特定物質とモノクローナル抗体との反応を阻害する場合がある。特定物質に対するモノクローナル抗体を常法により製造するにあたり、例えばカゼインなどにより抗原抗体反応が阻害を受けないモノクローナル抗体や、抗原抗体反応への影響が少ないモノクローナル抗体を適宜選択して用いることが好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、通常の方法に従って抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造した後に、カゼインなどの夾雑物の存在下で抗原抗体反応が阻害されるか否かを調べて、実質的に反応の阻害を受けないモノクローナル抗体を選択することにより容易に取得することができる。
［その他］
　本発明においては、上述した試験片をそのまま使用してイムノクロマトグラフ装置としてもよいし、ケースに収納して、イムノクロマトグラフ装置としてもよい。前者の場合は、試料となる乳汁の量が多い場合に、容器に入った試料に直接試験片の一端を浸して使用することが好ましい。また、後者の場合は、試料となる乳汁の量が少ない場合に、ピペット等で所定量を計量して試験片に滴下して使用することが好ましい。後者の場合のケースの形状は、試験片を収納できればいかなる形状でもよい。ケースの材料はいかなる材料でもよく、ポリプロピレンやポリカーボネートなどが好ましいものとしてあげられる。
　本発明のイムノクロマトグラフ装置は、容器、たとえばマイクロチューブ、および添加液、例えば細菌を溶菌させてリボゾームタンパク質L7/L12を溶液内に溶出させるための、溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液を組合せたキットとして提供することもできる。
実施例1：イムノクロマトグラフ法による大腸菌の検出におけるリゾチームおよび非イオン界面活性剤存在下でのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の効果
（1）リボゾームタンパク質L7/L12に対するモノクローナル抗体の作製　金コロイド標識する抗体には、Escherichia coli（大腸菌）リボソームタンパク質L7/L12モノクローナル抗体を使用した。国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例5に記載の方法に準じて、大腸菌Escherichia coliのL7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記およびその他の大腸菌群の菌種のL7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種（EC-1およびEC-2）の組合せを選択した。
（2）イムノクロマトグラフ装置の作製　イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製した。（a）金コロイド標識含浸部材　BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mLに0.1M リン酸カリウム pH7.0を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体EC-2を100μg/mL加え室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体EC-2（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15000×rpm、5分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mm NaClを含有する20mmトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1（第1部分）とした。
（b）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位　幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2（第2部分）として用意した。　モノクローナル抗体EC-1 1.5mg/mLが含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体2におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/cmでライン状に塗布して、これを50℃で30分間乾燥し、その後、0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。Escherichia coliリボソームタンパク質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位3とした。
（c）イムノクロマトグラフ装置の作製　イムノクロマトグラフ装置断面図を図1に示す。上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材と脂肪球除去用部材（第3部分）とを兼ねる部材として25mmのGF/DVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み776μm、保持粒子サイズ3.5μmのフィルター部材4）および20mmのGF/AVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み299μm、保持粒子サイズ1.7μmのフィルター部材7）を貼り合わせ、さらに、吸収用部材5として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材6（厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、5mm幅に切断し、イムノクロマトグラフ装置を作製した。
（3）試験　イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。　マイクロチューブに終濃度1×105（cfu/ml）の大腸菌（ATCC 25922株）または大腸菌群の一菌種であるKlebsiella pneumoniae（ATCC 13883株）を添加した乳汁を100μl分取し、溶菌処理液（終濃度1％　TritonX-100、2.2 mg/mlリゾチーム（和光純薬製、力価0.8mgリゾチーム/mg乾燥物換算）、0.1M　MOPSO  pH7.5、）150μlを加えて室温で混合し、10分間静置した。
　牛乳汁は市販の飲用品を用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインを装置C10066（浜松ホトニクス製）にて測定した。あらかじめ終濃度1.0％TritonX-100にて終夜撹拌後、超音波処理（出力10、1min×10回）した菌液を、2.2 mg/mlリゾチーム、0.1M　MOPSO  pH7.5にて37℃、60分間溶菌処理した菌液の溶菌率を100％として各条件における溶菌率を算出した。上記溶菌処理液に終濃度0.01％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加した場合（条件2）としていない場合（条件1）について比較を行った。
　結果を図2に示す。SDSを添加した場合、溶菌率が大きく向上していることが明らかとなった。
実施例2：イムノクロマトグラフ法による大腸菌の検出における溶菌酵素および非イオン界面活性剤存在下でのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の効果
　イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。
　マイクロチューブに終濃度1×105（cfu/ml）の大腸菌を添加した乳汁を100μl分取し、溶菌処理液（終濃度1％　TritonX-100、2.2 mg/mlリゾチーム、0.1M　MOPSO  pH7.5）150μlを加えて室温で混合し、10分間静置した。牛乳汁は市販の飲用品を用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインを装置C10066（浜松ホトニクス製）にて測定した。上記溶菌処理液にSDSを濃度を変えて添加し、実施例1と同様の方法にてあらかじめ溶菌処理した菌液を用いた場合の溶菌率を100％としてSDSの各濃度（終濃度0.01～0.15％）における溶菌率を算出した。
　結果を図3に示す。特定の濃度範囲においては、SDSの濃度の増加に伴い、溶菌率が大きく向上することが明らかとなった。
実施例3：イムノクロマトグラフ法による乳汁サンプルの測定
　乳房炎の牛からの乳汁サンプルを対象としてイムノクロマトグラフ法を実施した。測定は実施例2に準じて行い、出現した赤紫色のラインを目視により判定した（陽性+、陰性-）。溶菌処理液は、終濃度1％　TritonX-100、0.1M　MOPSO  pH7.5に、2.2 mg/mlリゾチーム　および0.01％　SDS（いずれも終濃度としての値）を添加した場合としていない場合について比較した。一方、乳汁中の大腸菌の数を確認するために、定量PCR法により定量を行った。乳汁100μlからDNA mini kit（Qiagen社製）を用いてゲノムDNAを抽出後、Quantification of Escherichia coli (all strains) （PrimerDesign社製）を用いてPCRを実施し、乳汁中の大腸菌量を定量した。
　PCRによって算出した大腸菌の数およびイムノクロマト法による判定結果を表1に示す。リゾチームおよびSDSを含む溶菌処理液を用いることで、これまで測定できなかった乳汁中の大腸菌を検出できるようになった。乳汁中の大腸菌の菌量は106(cells/ml)以上が大部分であるため、本溶菌処理液を用いることで診断感度が大きく向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (14)

  1. 　乳汁中の大腸菌群の溶菌方法であって　乳汁に、リゾチーム、イオン界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する大腸菌群を溶菌する工程を含む、溶菌方法。
  2. 　該イオン界面活性剤が陰イオン界面活性剤である請求項１に記載の溶菌方法。
  3. 　該陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩を含有し；および／または
    　該非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを含有する、請求項２に記載の溶菌方法。
  4. 　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該陰イオン性界面活性剤の終濃度が、0.01％以上0.15％以下である、請求項２または３に記載の溶菌方法。
  5. 　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該リゾチームの終濃度が、0.1mg/ml以上200mg/ml以下であり；および／または
    　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下である、請求項４に記載の溶菌方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する大腸菌群を溶菌する工程
    を含み、
    　溶菌により放出された菌体内由来の特定物質を検出する工程
    をさらに含む、乳汁中の大腸菌群の検出方法。
  7. 　検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される請求項６に記載の方法。
  8. 　該イムノクロマトグラフ方法が、（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、請求項８に記載の方法。
  10. 　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている請求項８または９に記載の方法。
  11. 　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の溶菌剤。
  13. 　家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、請求項１２に記載の溶菌剤。
  14. 　請求項１２または１３に記載の溶菌剤と、　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置とを含む、乳汁中の大腸菌群の検出用キット。
PCT/JP2014/083460 2013-12-18 2014-12-17 乳汁中の大腸菌群を検出する方法 WO2015093545A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/105,420 US10345299B2 (en) 2013-12-18 2014-12-17 Method for detecting coliform bacteria contained in milk
EP14870998.3A EP3085769B1 (en) 2013-12-18 2014-12-17 Method for detecting coliform bacteria contained in milk
ES14870998T ES2787174T3 (es) 2013-12-18 2014-12-17 Procedimiento para detectar bacterias coliformes contenidas en la leche
JP2015553591A JP6280567B2 (ja) 2013-12-18 2014-12-17 乳汁中の大腸菌群を検出する方法
NZ721261A NZ721261A (en) 2013-12-18 2014-12-17 Method for detecting coliform bacteria contained in milk
DK14870998.3T DK3085769T3 (da) 2013-12-18 2014-12-17 Fremgangsmåde til detektering af coliforme bakterier indeholdt i mælk
US16/430,037 US11567076B2 (en) 2013-12-18 2019-06-03 Method for detecting coliform bacteria contained in milk

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013261824 2013-12-18
JP2013-261824 2013-12-18

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/105,420 A-371-Of-International US10345299B2 (en) 2013-12-18 2014-12-17 Method for detecting coliform bacteria contained in milk
US16/430,037 Division US11567076B2 (en) 2013-12-18 2019-06-03 Method for detecting coliform bacteria contained in milk

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015093545A1 true WO2015093545A1 (ja) 2015-06-25

Family

ID=53402889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/083460 WO2015093545A1 (ja) 2013-12-18 2014-12-17 乳汁中の大腸菌群を検出する方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10345299B2 (ja)
EP (1) EP3085769B1 (ja)
JP (1) JP6280567B2 (ja)
DK (1) DK3085769T3 (ja)
ES (1) ES2787174T3 (ja)
NZ (1) NZ721261A (ja)
WO (1) WO2015093545A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111223A1 (ja) * 2018-11-30 2020-06-04 旭化成株式会社 乳房炎の原因菌の検出方法
WO2023095845A1 (ja) 2021-11-24 2023-06-01 旭化成株式会社 溶菌方法、及び細菌検出方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015093545A1 (ja) * 2013-12-18 2015-06-25 旭化成株式会社 乳汁中の大腸菌群を検出する方法
US11650213B2 (en) * 2015-03-30 2023-05-16 Entvantage Diagnostics, Inc. Devices and assays for diagnosis of viral and bacterial infections
US20180128828A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-10 James W. Stave Direct detection of microorganisms in patient samples by immunoassay
JPWO2023095843A1 (ja) 2021-11-24 2023-06-01

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63167799A (ja) 1986-12-29 1988-07-11 Ajinomoto Co Inc 微生物菌数測定法
JPH01244370A (ja) 1987-12-21 1989-09-28 Abbott Lab クロマトブラフ結合アッセイ装置および方法
JPH07196463A (ja) 1993-12-28 1995-08-01 Lion Corp 口腔用組成物
JPH09505479A (ja) * 1993-11-29 1997-06-03 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 広範な生物からの核酸抽出法
WO2000006603A1 (fr) 1998-07-31 2000-02-10 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Anticorps pour la detection de micro-organismes
JP2003505077A (ja) * 1999-07-23 2003-02-12 ジェネンテック・インコーポレーテッド 平行流ろ過法を用いるｒｎａｓｅ−及び有機溶媒−非含有プラスミドｄｎａの精製方法
JP2003171291A (ja) * 1999-10-29 2003-06-17 Takeda Schering-Plough Animal Health Kk 乳房炎用粘膜予防剤
WO2005064016A1 (ja) 2003-12-26 2005-07-14 Prima Meat Packers, Ltd. 微生物の多重検出方法
JP2010154851A (ja) * 2008-12-01 2010-07-15 Sanyo Chem Ind Ltd タンパク質抽出薬剤
WO2010137624A1 (ja) * 2009-05-29 2010-12-02 三洋化成工業株式会社 有用物質生産方法及びこの生産方法で使用される界面活性剤
JP2012122921A (ja) 2010-12-10 2012-06-28 Asahi Kasei Corp 乳汁中の特定物質を検出する方法
JP2014066641A (ja) * 2012-09-26 2014-04-17 Prima Meat Packers Ltd 大腸菌ｏ１５７の検出方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4711846B2 (ja) 2005-02-18 2011-06-29 達也 宗島 甚急性乳房炎の判定方法
EP2049677B1 (en) * 2006-08-10 2011-07-20 Merck Patent GmbH Method for isolating cells
JP2010510524A (ja) 2006-11-22 2010-04-02 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 試料を調製及び分析するシステム並びに方法
WO2011018858A1 (ja) 2009-08-14 2011-02-17 エヌエーアイ株式会社 新規乳房炎ワクチン
EP2863223B1 (en) * 2012-06-13 2018-07-25 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method for detecting specific substances in milk
WO2015093545A1 (ja) * 2013-12-18 2015-06-25 旭化成株式会社 乳汁中の大腸菌群を検出する方法
EP3085771B1 (en) * 2013-12-18 2020-01-22 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method for detecting bacteria of the genus streptococcus in milk

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63167799A (ja) 1986-12-29 1988-07-11 Ajinomoto Co Inc 微生物菌数測定法
JPH01244370A (ja) 1987-12-21 1989-09-28 Abbott Lab クロマトブラフ結合アッセイ装置および方法
JPH09505479A (ja) * 1993-11-29 1997-06-03 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 広範な生物からの核酸抽出法
JPH07196463A (ja) 1993-12-28 1995-08-01 Lion Corp 口腔用組成物
WO2000006603A1 (fr) 1998-07-31 2000-02-10 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Anticorps pour la detection de micro-organismes
JP2003505077A (ja) * 1999-07-23 2003-02-12 ジェネンテック・インコーポレーテッド 平行流ろ過法を用いるｒｎａｓｅ−及び有機溶媒−非含有プラスミドｄｎａの精製方法
JP2003171291A (ja) * 1999-10-29 2003-06-17 Takeda Schering-Plough Animal Health Kk 乳房炎用粘膜予防剤
WO2005064016A1 (ja) 2003-12-26 2005-07-14 Prima Meat Packers, Ltd. 微生物の多重検出方法
JP4621919B2 (ja) 2003-12-26 2011-02-02 プリマハム株式会社 微生物の多重検出方法
JP2010154851A (ja) * 2008-12-01 2010-07-15 Sanyo Chem Ind Ltd タンパク質抽出薬剤
WO2010137624A1 (ja) * 2009-05-29 2010-12-02 三洋化成工業株式会社 有用物質生産方法及びこの生産方法で使用される界面活性剤
JP2012122921A (ja) 2010-12-10 2012-06-28 Asahi Kasei Corp 乳汁中の特定物質を検出する方法
JP2014066641A (ja) * 2012-09-26 2014-04-17 Prima Meat Packers Ltd 大腸菌ｏ１５７の検出方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COMP. LMMUN. MICROBIOL. INFECT. DIS., vol. 6, no. 3, 1983, pages 235 - 245
See also references of EP3085769A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111223A1 (ja) * 2018-11-30 2020-06-04 旭化成株式会社 乳房炎の原因菌の検出方法
JPWO2020111223A1 (ja) * 2018-11-30 2021-09-30 旭化成株式会社 乳房炎の原因菌の検出方法
JP7237985B2 (ja) 2018-11-30 2023-03-13 旭化成株式会社 乳房炎の原因菌の検出方法
WO2023095845A1 (ja) 2021-11-24 2023-06-01 旭化成株式会社 溶菌方法、及び細菌検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3085769A1 (en) 2016-10-26
US20190317093A1 (en) 2019-10-17
EP3085769B1 (en) 2020-04-15
US20160320387A1 (en) 2016-11-03
US11567076B2 (en) 2023-01-31
EP3085769A4 (en) 2017-07-19
JP6280567B2 (ja) 2018-02-14
NZ721261A (en) 2017-09-29
ES2787174T3 (es) 2020-10-15
US10345299B2 (en) 2019-07-09
JPWO2015093545A1 (ja) 2017-03-23
DK3085769T3 (da) 2020-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6314156B2 (ja) 乳汁中のブドウ球菌を検出する方法
JP6280567B2 (ja) 乳汁中の大腸菌群を検出する方法
US10545146B2 (en) Method for detecting specific substance in milk
JP6735315B2 (ja) 乳汁中のストレプトコッカス属の菌を検出する方法
JP7237985B2 (ja) 乳房炎の原因菌の検出方法
JP6387063B2 (ja) 乳汁中の特定物質を検出する方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14870998

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014870998

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15105420

Country of ref document: US

Ref document number: 2014870998

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015553591

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE