JP2003505077A

JP2003505077A - 平行流ろ過法を用いるｒｎａｓｅ−及び有機溶媒−非含有プラスミドｄｎａの精製方法

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Publication number: JP2003505077A
Application number: JP2001512868A
Authority: JP
Inventors: バトラー，ミシェル，ディー．; コーエン，ダリアン，エル．; カーン，デービッド; ウィンクラー，マジョリー，イー．
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2003-02-12
Also published as: NZ516641A; DK1200578T3; ES2218185T3; HK1048829A1; EP1200578B1; KR20020019123A; PT1200578E; EP1200578A1; HUP0202295A3; DE60009912D1; IL147644A0; BR0012627A; ATE264386T1; KR100669305B1; PL364816A1; DE60009912T2; CA2378944A1; HUP0202295A2; WO2001007599A1; CN1378592A

Abstract

(57)【要約】プラスミドＤＮＡをそれからなる原核細胞から精製する方法が記載される。この方法は、（ａ）細胞を消化し；（ｂ）約４から２４時間、細胞をインキュベートし、ＲＮＡの酵素的消化を生じさせないで、その溶解と可溶化を行わせ；（ｃ）細胞からのライセート夾雑物を除去してプラスミドＤＮＡ溶液を提供し；（ｄ）平行流ろ過装置によって該溶液をろ過して、プラスミドＤＮＡを含む未透過物を取得し；（ｅ）未透過物を回収する、工程を含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明はプラスミドＤＮＡの精製方法に関する。より詳細には、簡単でスケー
ルアップ可能であり、平行流ろ過（タンジェンシャルフローろ過）を利用し、古
典的なアルカリ溶解法に基づく方法よりも非常に純粋なプラスミドをより高い収
率で得られる方法が提供される。

【０００２】細胞培養物からのプラスミドＤＮＡの精製は多くの研究と医薬用途のために必
須である。一般に、プラスミドの精製方法は最初の細胞破壊／プラスミド単離工
程に一又は複数の次の精製工程が続く二段階方法と考えることができる。最初の
単離のための最も一般的な方法は、煮沸によるプラスミドの放出に基づくもの（
Holmes及びQuigley, Anal. Biochem., 114:193-197 (1981)）と細菌細胞膜のア
ルカリｐＨ及び界面活性剤媒介可溶化に基づく第二のもの（Birnboim及びDoly,
Nucleic Acids Res., 7: 1513-1523 (1979)）の二つのアプローチの修正バージ
ョンである。これらの方法の両方ともプラスミドＤＮＡがその細胞質ゾル位置か
ら放出される。

【０００３】塩化セシウム勾配による超遠心分離法の一般的な使用に加えて（Clewell及びH
elinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 62:1150-1152 (1969)）、下流の精製に
は、典型的には夾雑物からのプラスミドの選択的沈降法（Lis及びSchleif, Nucl
eic Acids Res., 2: 383-389 (1975); Ishaq等, Biotechniques, 9: 19-24 (199
0); Kondo等, Anal. Biochem., 198: 30-35 (1991); Chakrabarti等, Biotech.
Appl. Biochem., 16: 211-215 (1992)）及び／又はカラムクロマトグラフィーの
使用（Horn等, Human Gene Ther., 6: 565-573 (1995); 米国特許第５７０７８
１２号; Chandra等, Anal. Biochem., 203: 169-172 (1992); Marquet等, BioPh
arm: 26-37 (1995); Johnson及びIlan, Anal. Biochem., 132: 20-25 (1983); V
incent及びGoldstein, Anal. Biochem., 110: 123-127 (1981)）の何れかが含ま
れる。カラムクロマトグラフィープロトコールは、逆相（Edwardson等, Anal. B
iochem., 152: 215-220 (1986); Johnson等, Biotechniques, 4: 64-70 (1986);
van Helden及びHoal, New Nucleic Acid Techniques, Walker編 (Humana Press
: Clifton, NJ, 1988), pp. 61-74）、通常相（Marko等, Anal. Biochem., 121:
382-387 (1982)）、イオン交換（Perbal in A Practical Guide to Molecular
Cloning (Wiley: New York, 1984), pp. 165-175; Colman等, Eur. J. Biochem.
, 91: 303-310 (1978); Garon及びPetersen, Gene Anal. Tech., 4: 5-8 (1987)
; Kim及びRha, Biotech. Bioeng., 33: 1205-1209 (1989); Ohmiya等, Anal. Bi
ochem., 189: 126-130 (1990)）、サイズ排除（上掲のvan Helden及びHoal; 上
掲のPerbal; Cornelis等, Plasmid, 5: 221-223 (1981), Micard等, Anal. Bioc
hem., 148: 121-126 (1985); Moreau等, Anal. Biochem., 166: 188-193 (1987)
; Raymond等, Anal. Biochem., 173: 125-133 (1988); Hansen及びRickett, Ana
l. Biochem., 179: 167-170 (1989)）、及びミックストモード（Flanagan等, An
al. Biochem., 153: 299-304 (1986)）方法に基づいている。

【０００４】これらのアプローチに対する代替法には、９６ウェルプレート形態でのアルカ
リ溶解中の遠心分離工程の代替としての０．２ミクロンのメンブレンの使用（Ru
ppert等, Anal. Biochem., 230: 130-134 (1995)）、水性二相分離法の使用（Co
le, Biotechniques, 11: 18-24 (1991)）、及びプラスミドの精製のためのイオ
ン交換膜の使用（van Huynh等, Anal. Biochem., 211: 61-65 (1993)）が含まれ
る。典型的には、これらの方法は、有機溶媒に基づく抽出（例えばフェノール／
クロロホルム）又は沈殿（例えばイソプロパノール、エタノール）の何れかの工
程並びに十分な純度のプラスミドを生産するための外来性酵素（例えばＲＮａｓ
ｅ、プロテイナーゼＫ）の添加を含む更なる精製工程を必要としている。

【０００５】プラスミドＤＮＡ精製のための更なる方法には、ポリエチレングリコールに基
づくＤＮＡ精製法（上掲のLis及びSchleif；米国特許第５７０７８１２号で、短
鎖ポリマーアルコールがライセートに添加されてライセートが精製に使用される
カラム又は膜に結合する）；プラスミドＤＮＡの酸-フェノール精製（Zasloff等
, Nucleic Acids Res., 5: 1139-1153 (1978)）；及び研究用途のためのプラス
ミドＤＮＡの比較的小規模な様々な精製法（Sambrook等, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, ２版(Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York,
1989); Ausubel等編, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley
& Sons: New York, 1989））が含まれる。ＤＮＡ-ＲＮＡ分離法はRoman及びBrow
n, J. Chromatogr., 592: 3-12 (1992)に概説されている。

【０００６】平行流（ＴＦＦ）又はクロスフローろ過は、フローがスイーピング動作で膜表
面を横切って通過させられる分離方法である（Gabler, ASM News, 50: 299 (198
4)）。このスイーピング作用は膜に捕捉された物質がフィルター表面に層を作り
、濃度分極と言われる状態をつくることを防止する。ＴＦＦは膜により捕捉され
た溶液（未透過物）を濃縮及び／又は脱塩し、あるいは膜を通過する物質（透過
物）を回収するために使用される。ポアサイズ（又は公称分画分子量（ＮＭＷＣ
））よりも小さい物質は膜を通過することができ、脱発熱化され（depyrogenate
d）、清澄化され、又は高分子量又はより大きな種から分離されうる。ポアサイ
ズ又はＮＭＷＣよりも大きな物質は膜に捕捉され、濃縮され、洗浄され、又は低
分子量種から分離される。ＴＦＦに使用される原理、理論及び装置はMichaels等
の「Tangential Flow Filtration」, Separations Technology, Pharmaceutical
and Biotechnology Applications (W.P. Olson編, Interpharm Press, Inc., B
uffalo Grove, IL, 1995）に記載されている。またＴＦＦの改良型を示す高性能
平行流ろ過（ＨＰ−ＴＦＦ）の説明については米国特許第５２５６２９４号及び
同第５４９０９３７号を、精製される物質に選択的に結合するアフィニティーゲ
ルと精製される溶液を混合し、ついで液体をＴＦＦにかけ、結合した物質以外の
全成分をフィルターを通過させる平行流アフィニティー限外ろ過の説明について
は国際公開第８７／０４１６９号を参照されたい。ウイルス、核酸、バクテリオファージ、及びＴＦＦ又は他のクロスフローろ過
法のような物理的分離を使用する他の生物材料の精製のための更なる方法は様々
な刊行物に記載されている（Richards及びGoldmintz, J. Virol. Methods, 4: 1
47-153 (1982); Fernandez等, Acta Biotechnil., 12: 49-56 (1992); Matsushi
ta等, Kagaku Kogaku Ronbunsyu, 20: 725-728 (1994); Rembhotkar及びKhatri,
Anal. Biochem., 176: 373-374 (1989);１９９８年２月１２日公開の国際公開
第９８／０５６７３号；欧州特許第３０７３７３号；Sekhar等, Hum. Gene Ther
., 7: 33-38 (1996)）。

【０００７】クローニングベクターとしてよりもむしろ遺伝子療法の用途でのバイオ医薬品
としてのプラスミドＤＮＡの利用が増大しているので、形質転換された原核生物
から中程度及び多量と双方の量でこの分子を単離する際に使用できる簡単で信頼
性があり、スケールアップ可能な精製法に対する必要性がますます増加している
。多量の研究材料を産生するために又は臨床実験への使用に供するために現在利
用できるプラスミド精製法を使用するには多くの理由から制約がある。該精製法
では多量の引火性有機溶媒（例えばエタノール及びイソプロパノール）、有毒薬
品（例えば臭化エチジウム、フェノール及びクロロホルム）が使用される。超遠
心分離及び「スピンカラム」は、少量の研究材料を生産するために使用するには
適しているが、バイオ医薬品用途に必要な量の材料を生産する際に使用するには
適していない。また、多くの現在のプラスミド精製法は、典型的にはウシ由来のＲＮａｓｅの
添加を含む。ウシ供給源から由来する材料は、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）に関する
問題のため医薬の製造においてますます望ましくないものになっている（Hill等
, Nature, 389: 448-450 (1997)）。一般に、プラスミド調製物への酵素の添加
は、これらの分子を後で精製により除去しなければならないので、避けることが
望ましい。ゲルろ過クロマトグラフィーの使用を含む精製プロトコールは、その操作に本
来的に伴う低負荷容量が障害となる；ある報告では、負荷はカラムの容積のおよ
そ２％に限られている（McClung及びGonzales, Anal. Biochem., 177: 378-382
(1989)）。

【０００８】（発明の概要）従って、本発明は、プラスミドＤＮＡをそれを含む原核細胞から精製する方法
において、（ａ）細胞を消化させ；（ｂ）約４から２４時間、細胞をインキュベートして、ＲＮＡの酵素的消化を行
わせないで、その溶解と可溶化を行わせ；（ｃ）細胞からのライセート夾雑物を除去してプラスミドＤＮＡ溶液を提供し；（ｄ）平行流ろ過装置によって該溶液をろ過して、プラスミドＤＮＡを含む未透
過物を取得し；（ｅ）未透過物を回収する、工程を含んでなる方法を提供する。細胞は好ましくは細菌細胞である。また好ましいのは、工程（ｃ）が、プラス
ミドＤＮＡからライセート夾雑物を遠心分離することにより実施されて、プラス
ミドＤＮＡを含む上清溶液として提供することである。他の実施態様では、本発明は、上記の方法により調製されたプラスミドＤＮＡ
を含んでなる組成物を提供する。

【０００９】非常に高収率で高純度のプラスミドを生産できるプラスミドＤＮＡの簡単でス
ケールアップ可能なろ過に基づく精製方法が提供される。この方法は、３０分未
満から、約４から２４時間まで可溶化工程を延ばすことによってアルカリ溶解法
に基づく古典的なプラスミド抽出方法を変更することを含む。抽出には、残って
いる夾雑物の精製のためのＴＦＦの新規な使用が続く。ここでの方法は有機溶媒
、ＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、高速遠心分離、又はカラムクロマトグラフィ
ー工程の使用を含んでいない。有機溶媒の使用は、最終製品に微量で残るかもし
れないという点で安全性と法規制の問題を生じる；またそのような溶媒は毒性が
あり引火性であり、深刻な危険性と、大規模な精製に対して必要な量が使用され
る場合は、廃棄／環境問題を提起する。その方法は典型的には細菌培養１リット
ル当たり１５−２０ｍｇのプラスミドＤＮＡを生じ、修正アルカリ溶解法の後に
残るタンパク質の９５％以上、ＲＮＡの９９％以上が除去される。この方法を使
用して単離されたプラスミドは古典的な塩化セシウム勾配に基づく方法を使用し
て単離されたプラスミドと比較して同等の形質移入能力を有していた。ここでのプラスミドＤＮＡは高い度合いまで精製されるので、遺伝子療法とそ
の他の遺伝子送達法、例えば再生可能な高形質移入効率が得られる脂質担体を含
むものに対して有利に使用できる。記載された方法は必要に応じて大規模な容量
での操作に対して容易にスケールアップされる。

【００１０】（好適な実施態様の詳細な説明）定義：ここで用いられるところの「通過物」とはろ過膜を通過する試料の部分を意味
する。ここで用いられるところの「未透過物」とはろ過膜を通過しない試料の部分を
意味する。「平行流ろ過」又は「ＴＦＴ」又は「クロスフローろ過」とは、試料混合物が
膜の上部を横切って循環し、加えられる圧力によって溶質と小分子が膜を通過さ
せられるろ過方法を意味する。典型的には、溶液はフィルター膜と平行に流れ、
流体流れがフィルター表面を連続して清浄化し、非ろ過性溶質による詰まりを防
止する。膜に対する圧力差により、流体とろ過可能溶質がフィルターを通過して
流れるようになる。これは、溶液が膜に対して反復して通過させられ、フィルタ
ーを通過する流体が別の回路に連続的に流されるので連続流プロセスとして実施できる。

【００１１】ここで使用される「ライセート夾雑物」とは、染色体ＤＮＡ、宿主タンパク質
、細胞膜組織片を含む細胞組織片、炭水化物、小分解ヌクレオチド、宿主ＲＮＡ
、リポポリサッカライド等々を含む、所望のプラスミドＤＮＡが含まれる混合物
のあらゆる望まれない成分を意味する。「ＲＮＡの酵素的消化を行わない」という表現はＲＮＡ（細胞又は宿主ＲＮＡ
を含む）を消化するＲＮａｓｅのような酵素が存在しないことを意味する。ここで使用されるところの「分子量分画（分子量カットオフ）」とは膜により
９０％捕捉される球状溶質の分子量を意味する。Filtron Catalog, 1995/96, p.
5を参照されたい。膜を通過するか又は膜により捕捉される粒子の実際の分子量
は、所定の分子のサイズ並びに高次構造及びチャージ、膜孔又はマトリックスの
性質、及び溶液の伝導性とｐＨに依存する。ここで使用される「精製された」プラスミドは、エンドトキシン、タンパク質
及びＲＮＡのような夾雑物から分離され、２６０ｎｍ吸光度でサイズ排除クロマ
トグラフィーにより測定して、好ましくは少なくとも約９５％のプラスミドと約
５％のＲＮＡ、より好ましくは約９８％のプラスミドと約２％のＲＮＡからなる
ものである。好ましくは、そのような精製プラスミド調製物中のエンドトキシン
レベルは３０００００ＥＵ／ｍｌ未満、より好ましくは３００００ＥＵ／ｍｌ未
満である。

【００１２】発明の実施の形態プラスミドＤＮＡは、ＲＮａｓｅによらず、ＴＦＦを用いることで、それを含
む原核細胞から高収率にて高度に精製することが可能であることが分かった。好
ましくは、ここでのプラスミドＤＮＡは、そのサイズが約２Ｋｂから５０ｋｂ、
さらに好ましくは約２Ｋｂから１５Ｋｂであり、ＴＦＦには、約５００ｋＤ、好
ましくは約５００ｋＤから１０００ｋＤ以上の選択的な分子量排除を利用する。ここでのプラスミドＤＮＡは、原核細胞培養、好ましくはバクテリア発酵、最
も好ましくは、大腸菌から単離され、抽出される。原核細胞から単離されるプラ
スミドＤＮＡには、天然に生じるプラスミド及び対象の遺伝子を包含する組換え
プラスミド、例えば、マーカー遺伝子又は治療用の遺伝子を含むものが含まれる
。発酵は、利用される細胞の生育に適した任意の液体培地中で実施されうる。ここで精製されるＤＮＡプラスミドは、上記で特定されたサイズの範囲内であ
れば、如何なる性質を持つ如何なる染色体外ＤＮＡであってもよい。プラスミド
は、ハイコピー数でも、ローコピー数でも、ラナウェイプラスミドであってもよ
く、また一本鎖又は二重鎖ＤＮＡ、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ、又はＤＮ
Ａ断片であってもよい。それらは、選択可能遺伝子、ポリリンカー、複製オリジ
ン、プロモーター、エンハンサー、リーダー配列、ポリアデニル化サイト、及び
終止配列を含むある範囲の遺伝的成分を含み得る。プラスミドには、基本的に、
任意の起源の哺乳類遺伝子、好ましくは治療的遺伝子、さらに好ましくは、対象
のヒトポリペプチドをコードする遺伝子が含まれうる。このような治療的遺伝子
には、宿主細胞中の欠損又は発現抑制された遺伝子、並びに発現されたとき、宿
主細胞中にて遺伝子の機能を阻害又は抑制する遺伝子又は遺伝子断片、例えば、
アンチセンス配列、リボザイム、トランスドミナントな阻害物質等々を相補する
ために適切な宿主中にて発現され得る機能的遺伝子又は遺伝子断片が含まれる。プラスミドＤＮＡを抽出するための細胞の消化及び溶解の前に、細胞は、一般
には最初に発酵培地から回収される。液体培地から細胞を回収するための任意の
常法が適当であり、遠心、ろ過、及び沈殿法が含まれる。

【００１３】ここに開示の方法の第一の工程は、細胞を消化することを含む。消化は、任意
の常法（例えば、Birnboim及びDoly, 上掲）により実施し得るが、好ましくは、
リゾチームのような消化酵素を添加し、混合し、室温以下の温度で、好ましくは
氷上にてその混合物をインキュベートすることにより達成される。ここに開示の方法の第二の工程は、細胞の溶解及び可溶化を含み、その結果Ｒ
ＮＡが化学的に消化される。この工程は、約４から２４時間、好ましくは、約６
から２４時間、さらに好ましくは、約１０から２４時間、さらにより好ましくは
、約１５から２４時間、及び最も好ましくは、約２０から２４時間までの範囲の
一定時間実施される。典型的には、細胞は、収集後、緩衝液に再懸濁させ、細胞
を溶解し可溶化させるように機能する一又は複数の試薬で、示された時間処理さ
れる。そのような試薬の例として、アルカリ（例えば、水酸化ナトリウムのよう
な塩基を希釈したもの）、及び／又は、界面活性剤が含まれる。好ましくは、ア
ルカリと界面活性剤の両方が用いられる。他の好ましい実施態様では、エンドト
キシンを最大限除去するためには、例えば、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、コリン酸、デオキシコール酸又は、トリトンＸ-１１４^TM、最
も好ましくは、ＳＤＳ又はデオキシコール酸である。最大限のプラスミドの遊離
及び夾雑するゲノムＤＮＡの除去のためには、界面活性剤は、好ましくは陰イオ
ン性、より好ましくは、ＳＤＳ又はコリン酸、又はデオキシコール酸、最も好ま
しくは、ＳＤＳ又はデオキシコール酸である。

【００１４】溶解／可溶化の工程は、ＲＮａｓｅのようなＲＮＡ分解酵素の非存在下にて実
施される。何らかの動物性ウィルスの夾雑の可能性があるため、好ましくは、こ
の過程も、細胞壁を弱くする酵素処理を行わない条件下にて実施される。また、
染色体ＤＮＡの除去を促進し、最終プラスミドＤＮＡ製品への混入が回避される
ように、染色体ＤＮＡを切断しない方法を使用することが望まれる。細菌細胞の
好ましい溶解方法は、上掲のBirnboim及びDolyに記載されているアルカリ溶解、
又はここで示される実施例１で報告されるその変法である。溶解及び可溶化の後、細胞は、タンパク質、細胞壁又は膜、染色体ＤＮＡ及び
宿主タンパク質などの細胞組織片を含む、細胞溶解物の混入を除去するために処
理される。かかる除去の工程は、典型的には、沈殿、遠心、ろ過、及び／又は用
いられる細胞型及び溶解のタイプに依存する沈降に関与する。アルカリ溶解が用
いられる場合、好ましくは、得られるライセートは、染色体ＤＮＡ及び宿主タン
パク質を沈殿させるために酸性化される。その後、細胞組織片及び他の不純物は
、好ましくは、標準的な方法により除去されるが、そのような方法には、遠心、
ろ過、又は沈降、好ましくは遠心法が含まれる。得られた上清は、その後、状況
に応じて、清浄化のために、珪藻土でろ過され、宿主ＲＮＡの濃度を減少させる
。プラスミドＤＮＡは、清澄化された透過物から、適切な条件下にて沈殿化試薬
を用いて沈殿化され、緩衝液中に回収され、再懸濁される。次いで、プラスミド
ＤＮＡに対し、宿主ＲＮＡ、タンパク質及びリポポリサッカライドは、好ましく
は、この目的に適切な条件下にて、沈殿試薬により緩衝液から沈殿される。最後
に、透過物は、好ましくは、回収され、プラスミドＤＮＡは適切な条件下にて沈
殿試薬を用いて再沈殿され、沈殿されたプラスミドＤＮＡはＴＦＦのろ過工程の
ために再懸濁される。

【００１５】本方法の次の工程は、ＴＦＦ装置を通して溶液をろ過することを含む。このよ
うなろ過に先立ち、プラスミドＤＮＡは、適正にＴＦＦ膜に結合しないように、
短鎖ポリアルコールで処理してもよい。ＴＦＦの過程の模式図が、国際公開第９
８／０５６７３号の図１に示されている。ＨＰ-ＴＦＦを実施するためのサンプ
ル装置は、米国特許第５２５６２９４号の図２、図３、図４に示されている。ろ
過膜は、例えば、精製されるプラスミドＤＮＡのサイズ及び形態に基づいて選択
され、約５００Ｋダルトン（kD）を越え、好ましくは、約５００から１０００ｋ
Ｄの分子量分画を行う。一般に、ここで示すＴＦＦに有用な膜は、上掲のGabler
に記載されている。それらは、典型的には、マイクロポーラス（ＭＦ）又は限
外ろ過（ＵＦ）タイプのいずれかの合成膜で、逆浸透膜（ＲＯ）タイプはそのポ
アサイズが小さい範囲であるため、普通は適当ではない。ＭＦタイプは、典型的には、０．１から１０マイクロメーターのポアサイズを
持ち、定格サイズよりも大きな粒子の全てを捕捉するように製作され得る。ＵＦ
膜は、より小さなポアを持ち、捕捉される球状タンパク質のサイズにより特徴付
けられる。それらは、１０００から１００００００の見かけの分子量（ダルトン
）限界の増加割合で入手可能であり、これはおよそ０．００１から０．０５マイ
クロメーターに相当する。ＵＦ膜は、その分離能の原因となる上流表面側に、薄
いフィルム又はスキンを有する通常非対称な形態をしており、本発明における使
用に対して最も適当である。

【００１６】本発明の方法は、商業的又は準商業的なスケールでの使用によく適応する。そ
れは、半連続的に、すなわち、平行流フィルターを通過して、全ての多量のバッ
チがこのようにしてろ過されるまでの所望のプラスミドＤＮＡを含む溶液の連続
流れに、所望のプラスミドＤＮＡからの夾雑物の連続流分離の段階が続く形で、
操業できる。洗浄過程を、ろ過段階の間に介在させることができる。ついで溶液
のフレッシュなバッチが処理されうる。このようにして、容認でき得る純粋な形
態にて、比較的短時間に、所望の産物の高い収率を実現するために、連続的で、
周期的な過程が実行されうる。このような条件下にて、多くのタンパク質、細胞膜組織片、炭水化物、小分解
ヌクレオチド等々を含む夾雑物質が、膜を通過して透過物中へ入っていく一方、
プラスミドＤＮＡは、未透過物中に捕捉される。ろ過装置の市販先には、Pall-F
iltron（Northborough, MA）、Millipore（Bedford, MA）、及びAmicon（Danver
s, MA）が含まれる。ＴＦＦを実施するために有用なろ過装置の任意のものがこ
こでの実施に適しており、例えば、平坦プレート装置、螺旋状ワウンドカートリ
ッジ、中空ファイバー、管状又は単一シート状装置、開放チャンネル装置などが
含まれる。用いられるろ過膜の表面積は、精製されるプラスミドＤＮＡの量に依存する。
膜は、吸着による損失を最小にするような低結合性の材質であり、好ましくは、
耐久性があり、クリーニングが可能で、用いられる緩衝液に化学的に適合性があ
る。多くの適当な膜が、商業的に入手可能であり、例えば、セルロースアセテー
ト、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、及びポリビニリデンジフルオリ
ドなどが含まれる。好ましくは、膜の材質は、ポリスルフォン又はポリエーテル
スルフォンである。

【００１７】ろ過は、サンプル緩衝液が膜表面を通過する時、サンプル緩衝液を循環させる
ように接線方向の流れを用いて実施される。ＴＦＦの期間中、圧力は、膜を横切
って加えられ、これにより、未透過物が再度循環される間、小分子が膜を通過す
ることを可能ならしめる。典型的には、流速は、一定の膜透過圧を維持するため
に調整される。一般には、ろ過は、より高い圧力、より速い流速によって、より
速く処理されるが、速い流速は、核酸の切断又は膜を通過することによる損失を
引き起こしがちである。さらに、種々のＴＦＦ装置には、操作に対して所定の圧
力限界が存在する。従って、圧力は、製造者の説明書に従って、調整される。平
坦プレート装置については、圧力は、好ましくは、約５から３０ｐｓｉ、最も好
ましくは、１０から１５ｐｓｉである。循環ポンプは、核酸の切断を確実に最小
にするために選択される。典型的には、循環ポンプは、供給流路側での蠕動ポン
プ又はダイアフラムポンプであり、圧力は、未透過物バルブ（retentate valve
）を調整することにより調節される。一般に、ろ過は、ダイアフィルトレーション様式にて実施される。場合によっ
ては、サンプル溶液は、所望の容積に濃縮されるまで最初は緩衝液を添加するこ
となくろ過される。濃縮された後、ダイアフィルトレーション緩衝液が添加され
、夾雑小分子の未透過物を洗浄し、不要な溶媒及び塩を除去するためにろ過が継
続する。ダイアフィルトレーションは、連続的又は不連続的でありうる。好まし
くは、ダイアフィルトレーションは、連続的であって、約５から５００容積当量
が交換されるまで実施される。一般に、より多くのダイアフィルトレーションが
、要求される純度に応じて、核酸に結合した夾雑物が増加する場合に、実施され
る。ＴＦＦに続く精製されたプラスミドＤＮＡの収率をさらに改善するために、未
透過溶液は場合によっては数分間透過バルブを閉止してろ過ユニットを再循環さ
せ、残留プラスミドＤＮＡを除去する。未透過物を収集し、更なるヂアフィルト
レーション緩衝液を加えて膜フィルターを洗浄する。未透過物を再び収集し、精
製したプラスミドＤＮＡを含む元の未透過物と組み合わせる。供給溶液をついで
濃縮し、ついでトリス^ＴＭのような緩衝液で透析して精製プラスミドＤＮＡを得
ることができる。

【００１８】ここでのＴＦＦ法により精製されたプラスミドＤＮＡは直接に使用されるか、
又は出発試料中の汚染のレベルとタイプ及び所望される用途に応じて更に精製さ
れる。このようにして精製されたプラスミドＤＮＡは多くの用途、例えばクロー
ニング又は遺伝子発現のような分子生物学的用途、又は例えばＰＣＲ、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ、デンドロマー生成等々を使用する診断用途に対して使用することができる
。治療用途に対して、例えば遺伝子療法での、ワクチンとしての又は遺伝子免疫
化への使用に対しては、ＴＦＦ工程から得られたプラスミドＤＮＡを更に精製す
ることが望ましい。プラスミドＤＮＡを更に精製するにはイオン交換クロマトグ
ラフィーが使用されうる。プラスミドＤＮＡ試料は、カラムから溶出するプラスミドＤＮＡの濃度以下の
塩濃度を含む負荷バッファーでカラムに充填される。典型的には、塩濃度は使用
される樹脂に応じて、約１０から５０ｍＳである。より弱い陰イオン交換樹脂に
対しては、低伝導率溶液が使用される一方、より強い陰イオン交換樹脂に対して
は、より強い伝導率溶液が使用される。ついで、カラムを数カラム容量のバッフ
ァーで洗浄し、樹脂に弱く結合する物質を除去する。ついで、一般的な方法に従
って、例えばトリス-ＨＣｌバッファー中の１．５ＭまでのＮａＣｌを使用して
、浅い連続生理食塩水勾配で画分をカラムから溶出させる。試料画分をカラムか
ら収集する。中規模な（例えば約１００ｍｇから約３ｇのプラスミドＤＮＡ）調
製のためには、画分は典型的には少なくとも５０ｍＬから２リットルであり、そ
こでは、プラスミドＤＮＡのピークが予想され、ついで予想されたピークを越え
て容量が増加される。プラスミドＤＮＡ収率と純度の分析的測定は各画分につい
て実施される。また、カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）分析を各画分について実
施して各画分中の残留エンドトキシンレベルを測定する。高レベルのプラスミド
ＤＮＡと低いエンドトキシンを含む画分がプールされる。

【００１９】上記のプロトコールに従って精製されたプラスミドＤＮＡは遺伝子療法での使
用のために脂質担体と複合化されることになる場合には、プラスミドＤＮＡを、
好ましくはダイアフィルトレーションによって低伝導性バッファー中に交換する
ことが望ましい。低伝導性バッファーは約１０ｍＳ未満、好ましくは約１ｍＳ未
満の任意のバッファーを含むことを意味する。上記のプロトコールの様々な箇所で、プラスミドＤＮＡの収率と純度の分析測
定が好適に実施される。典型的には、そのようなアッセイは各精製工程の前後、
また例えば分取用イオン交換クロマトグラフィーから各核酸含有画分まで、実施
される。これらの分析測定を実施するための好適な手段には、純度の高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分
析、収率の分光光度的推定、タンパク質分析のための銀染色及びＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、及びＤＮＡ解析のためのアガロースゲル電気泳動法及びサザンブロッティン
グが含まれる。本発明は次の実施例を参照することにより更に十分に理解される。しかし、実
施例は発明を限定するものと見なされてはならない。ここで述べられる全ての文
献と特許文献は出典明示により明示的に取り込まれる。

【００２０】実施例１材料及び方法第ＶＩＩＩ因子の細胞ペーストの生産第ＶＩＩＩ因子のプラスミドを精製において、第ＶＩＩＩ因子（米国特許第５
６１８７８８号及び同第５６３３１５０号）に対する遺伝子で形質転換された大
腸菌を、１０-Lの発酵槽で培養し、プラスミドＤＮＡの量を最大にするために、
シクロヘキシミドで処理した。

【００２１】大腸菌の形質転換と一晩の発酵第ＶＩＩＩ因子のため以外のプラスミドの精製のために、形質転換-コンピテ
ント大腸菌（ＤＨ５α）細胞（Gibco-BRL）が、アンピシリン耐性（Amp^R）プラ
スミドの増幅のための製造者によるプロトコールに従って、形質転換された。一
晩培養したコロニーは、カルベニシリン（50 mg/mL）を添加したＬＢ培地中で増
殖させた。

【００２２】大腸菌のアルカリ溶解大腸菌のアルカリ溶解は、上掲のBirnboim及びDolyの方法に基づき、上述した
ような変更を加えて行った。大腸菌は、１グラム（ウェット容量）あたり、８ｍ
Ｌの５０ｍＭグルコース／２５ｍＭトリス-ＨＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ(GTE)、
ｐＨ８、に懸濁した。全部で０．８ｍＬのリゾチーム（GTE中2 mg/mL）（Canadi
an Lysozyme Company, Abbotsford, British Columbia）溶液が添加され、混合
したのち、細胞を氷上にて３０分間インキュベートした。１グラムの細胞混合物
に対し、０．２ｍＭＮａＯＨと１%ＳＤＳ（又は、示されるような他の界面活性
剤）を含む溶液を全部で１６ｍＬ加え、一晩（又は、示した通り）、室温にて、
ゆっくりと連続的に撹拌しながらインキュベートした。全部で１２ mLの５Ｍ酢
酸カリウム、ｐＨ４．８、を細胞１グラムあたりに添加し、混合の後、混合物は
氷浴上に静置した。１０分のインキュベーションの後、混合物は、１３０００ｘ
ｇで３０分間遠心した。上清を回収し、数層のＭＩＲＡＣＬＯＴＨ^ＴＭ材（Calb
iochem-Novabiochem Corporation, San Diego, CA）を通して上清を注ぐことに
より、透明にした。

【００２３】ＴＦＦを用いたプラスミドの精製上述のようにして大腸菌から単離されたプラスミドＤＮＡは、１０−１５ｇの
処理細胞あたり０．５平方フィートのポリエーテルスルフォン膜を用いて、ＴＦ
Ｆ装置中（ＴＦＦ膜カセット及びカセットホルダーは、Pall Filtron Corporati
on, Northborough, MAより入手）で精製した。（この量は、一晩の振盪培養の後
、通常得られる）。膜の公称分画分子量は、５００又は１０００ｋＤａであった
。ＴＦＦ装置への供給速度は、０．５リットル／分／平方フィート膜に設定され
た。限外ろ過膜では、透過物における初期収量の損失を最小限にするためには、
限外ろ過を行う前に、通常の操作条件で、透明化した上清により１５−２０分間
の平衡化を行う必要があることが、実験より示された。全ての実験は、膜透過圧
（TMP）を一定に保つように行われた。幾つかの実験において、好適なＴＭＰは
、およそ１０−１５ｐｓｉであることが分かった。これらの条件下にて、ろ過流
動速度は、およそ１．５リットル／時間／平方フィート膜であった。プラスミド
の精製のためには、注入液は、２倍に濃縮され、８−１０の透析容量の２０ｍＭ
トリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．６に対して透析された。

【００２４】塩化セシウム密度勾配遠心塩化セシウムの密度勾配を用いたプラスミドの単離は、上掲のClewell及びHel
inski及びMiller, Meth. Enzymol., 152:145-170（Berger及びKimmel編集）（Ac
ademic Press:San Diego, CA, 1987）による記述に従って行った。

【００２５】サイズ排除アッセイサンプルは、１００μLを２０ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化された
TSK-G5000PW^TMカラム（7.5 x 300 mm）（Tosohaas, Montgomeryville, PA）にイ
ンジェクトすることで解析した。カラムは１ｍｌ／分の流速で操作した。カラム
溶出液は、２６０ｎｍの吸収によりモニターした。プラスミドの溶出容積を、塩
化セシウム法により単離された標準物の容積と対比させた。

【００２６】２９３細胞への形質移入及び第ＶＩＩＩ因子活性のアッセイここで精製されたプラスミドは、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含むＰＳ１
９培地中で維持されている２９３ヒト胎児腎臓細胞へ形質移入された。脂質／Ｄ
ＮＡ形質移入複合体は、リポフェクチン試薬（BRL, Gaithersburg, MD）により
、説明書に示される複合体あたり1μgのプラスミドＤＮＡを用いて行った。その
後、この混合物は、３５-ｍｍウェル（６ウェルプレート）に添加し、培地を加
えた。形質転換後２４時間で、培地を回収し、エライザアッセイにより第ＶＩＩ
Ｉ因子をアッセイし、第ＶＩＩＩ因子の活性を、COATEST VIII：C/4^TMキット（C
hromogenix AB, Moelndal, Sweden）を用い、製造者の指示に従ってアッセイし
た。

【００２７】タンパク質濃度決定タンパク質の濃度は、標準にウシ血清アルブミンを用い、ブラッドフォード法
（Bradford, Anal.Biochem., 72:248-254(1976)）により決定した。

【００２８】結果プラスミドの単離及び精製への因子の影響リゾチーム消化後の可溶性プラスミドを生産する能力について、幾つかの異な
るタイプの陰イオン性、陽イオン性、非イオン性の界面活性剤が解析された。ク
ラスとして、陰イオン性界面活性剤は、プラスミドの溶出に最も効果的であった
。さらに、陰イオン性界面活性剤から得られるプラスミド標品のEcoRI（New Eng
land Biolabs, Beverly, MA）による制限酵素消化によると、夾雑ゲノムＤＮＡ
の存在は、確認されなかった。最後に、クラスとして陰イオン性界面活性剤は、
エンドトキシン含量が非常に低い可溶化されたプラスミド標品を生産することが
見いだされた（表1）。

【００２９】

【００３０】二つの異なる陰イオン性界面活性剤の存在下において、水酸化ナトリウムに接
触させる時間を増加させた場合の影響について調べた。インキュベーション時間
を増加させた結果、夾雑ＲＮＡの全体の大きさ及び量において、明らかな時間依
存的な減少が認められた。インキュベーション２４時間後、ＳＤＳ-可溶化産物
及びコリン酸-可溶化産物の両方においてＲＮＡがほとんど検出されなかった。
如何なる理論にも限定するものではないが、アルカリ条件に長く曝した後、夾雑
ＲＮＡは十分に分解される結果、ＴＦＦによりＲＮＡ及び他の低分子量夾雑物（
例えば、タンパク質、エンドトキシン）からプラスミドＤＮＡを精製することが
可能となると考えられる。精製を最大にするために、プラスミドの保持を示すな
かで、最も大きいポアサイズの膜が選択された。５０００００及び１０００００
０ダルトンの見かけの分子量排除膜が、この要求を満たした。水酸化ナトリウム
及びＳＤＳに対して４-、又は２４時間曝されたプラスミドを用いた最初の実験
により、２４時間曝すことがＴＦＦによるＲＮＡの除去にとって好ましいことが
示された。

【００３１】精製された第ＶＩＩＩ因子プラスミドの性質決定４時間又は２４時間の水酸化ナトリウム／ＳＤＳインキュベーション後、ＵＦ
／ＤＦ精製を行って、上述のように単離されたプラスミドは、アガロースゲルで
比較した場合、標準的なＣｓＣｌ濃度勾配技術を用いて精製されたプラスミドと
同等であった。プラスミド標品中に共精製されてきたＲＮＡの量は、サイズ排除
クロマトグラフィーアッセイを用いて評価した。図１に示すように、夾雑ＲＮＡ
の９９％以上がろ過の工程において除去された。得られたＴＦＦプール中のタン
パク質濃度は、１０から３０μｇ／ｍｌの範囲であって、酢酸カリウムの上清中
に存在する総タンパク質量の９５％以上減少した構成を示した。５つの別個の標
品において、第ＶＩＩＩ因子プラスミドの収率は、２．２±０．８ｍｇプラスミ
ド／ｇ細胞（ウェット重量）であった。エンドトキシンレベルは、平均して２４
００±１７００ＥＵ／ｍｌ（ｎ＝３）であった。

【００３２】ＴＦＦ法により精製されたプラスミド活性第ＶＩＩＩ因子の遺伝子を含むプラスミドは、ＴＦＦ法により単離され、通常
のＣｓＣｌ法（MIller、上掲）により単離された同じプラスミドと、２９３ＨＥ
Ｋ細胞への形質移入能に関し比較された。表２に示されるように、ここで示した
アルカリ溶解の変法とＴＦＦ法を用いて単離されたプラスミドＤＮＡは、ＣｓＣ
ｌ密度勾配にを用いて単離されたプラスミドと同等な活性を持っていた。

【００３３】

【００３４】複数のプラスミドに対する本方法の適用ＴＦＦ法の厳密性は、大腸菌に形質転換され、振盪フラスコに一晩増殖させた
様々なサイズの６つの異なるプラスミドについて本方法を用いることにより評価
された。表３に示されるように、回収されるプラスミドのサイズには無関係に、
各標品は１グラム細胞あたり（ウェット重量）最小で２ｍｇのプラスミドＤＮＡ
が生じた。

【００３５】

【００３６】結論ここに記載した方法は、簡便で、延長した（約４−２４時間）溶解／可溶化の
工程、それに続くＴＦＦを用いた工程に基づいた形質転換-コンピテントプラス
ミドの大量精製に対しスケールアップ可能な方法である。この方法は、１リット
ルの一晩培養あたり７−２０ｍｇのプラスミドを産生し、その量は、以前報告さ
れた量（Ishaq等, 上掲；Kondo等, 上掲；Chakrabarti等, 上掲；Chandra等, 上
掲；Miller, 上掲）よりも数倍高いものである。さらに、この方法を用いて単離
されたプラスミドは、細胞形質移入アッセイにおいて、古典的な方法を用いて単
離されたプラスミドと同等な活性を保持することが示された。ＴＦＦ法を用いて観察されるエンドトキシンのレベルは、これに代わる精製方
法（Miller, 上掲）を用いた場合に報告されるレベルよりも高かった。しかしな
がら、以前の観察（Cotten等, Gene Ther., 1:239-246 (1994)；Weber等, Biote
chniques, 19:930-940 (1995)）とは逆に、これらエンドトキシンのレベルは、
細胞に形質移入し、タンパク質を発現させるプラスミドの能力に対して悪い影響
を及ぼすことはなかった。さらに、エンドトキシンのレベルは、必要ならば、イ
オン交換クロマトグラフィーのような更なる精製により、十分に除くことが可能
である。ここに記載のＴＦＦに基づく精製法は、ＴＦＦスケールアップの標準的な方式
により、容易にスケールアップ可能である。最後に、本方法の広範にわたる適応
性は、様々な分子量の幾つか異なるプラスミドを用いた効果的な実施により実証
された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａと１Ｂはサイズ排除クロマトグラフィーにより放火したＲ
ＮＡからのプラスミドＤＮＡの精製を示している。図１ＡはＴＦＦ法による精製
の前の酢酸カリウム上清の分析である。図１Ｂは最終のＴＦＦプールの分析を示
す。数値は２６０ｎｍでの全吸光度のパーセントを示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年６月６日（２００１．６．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者バトラー，ミシェル，ディー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94110，サンフランシスコ，フロリダストリート 1629 (72)発明者コーエン，ダリアン，エル．アメリカ合衆国カリフォルニア 94606，オークランド，パークブールバード 2408 (72)発明者カーン，デービッドアメリカ合衆国カリフォルニア 94404，フォスターシティー，ゴールドハンターコート 109 (72)発明者ウィンクラー，マジョリー，イー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94010，バーリンゲーム，キャニオンロード 2884 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA05 EA04 HA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プラスミドＤＮＡをそれを含む原核細胞から精製する方法に
おいて、（ａ）細胞を消化させ；（ｂ）約４から２４時間、細胞をインキュベートして、ＲＮＡの酵素的消化を行
わせないで、その溶解と可溶化を行わせ；（ｃ）細胞からのライセート夾雑物を除去してプラスミドＤＮＡ溶液を提供し；（ｄ）平行流ろ過装置によって該溶液をろ過して、プラスミドＤＮＡを含む未透
過物を取得し；（ｅ）未透過物を回収する、工程を含んでなる方法。
【請求項２】細胞が細菌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】細胞が大腸菌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】プラスミドＤＮＡが約２から５０キロベースの範囲のサイズ
を有している請求項１に記載の方法。
【請求項５】工程（ａ）がリゾチームを使用して実施される請求項１に記
載の方法。
【請求項６】工程（ｂ）が、約１０から２４時間の間、実施される請求項
１に記載の方法。
【請求項７】工程（ｂ）が、約２０から２４時間の間、実施される請求項
１に記載の方法。
【請求項８】インキュベーション工程がアルカリの存在下で実施される請
求項１に記載の方法。
【請求項９】インキュベーション工程が界面活性剤の存在下で実施される
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】インキュベーション工程が界面活性剤の存在下で実施され
る請求項８に記載の方法。
【請求項１１】界面活性剤がイオン性である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】界面活性剤が陰イオン性である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、コール酸、又はデ
オキシコール酸である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】工程（ｃ）を、プラスミドＤＮＡからライセート夾雑物を
遠心分離することにより実施して、プラスミドＤＮＡ溶液を上清として提供する
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】ろ過装置が、約５００ｋＤを越える分子量分画を行う膜を
有している請求項１に記載の方法。
【請求項１６】未透過物からプラスミドＤＮＡを回収することを更に含む
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】緩衝液で未透過物を透析することを更に含む請求項１に記
載の方法。
【請求項１８】未透過物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることを
更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】請求項１に記載の方法により調製されたプラスミドＤＮＡ
を含んでなる組成物。