ES2750661T3 - Métodos para la purificación de ARN mensajero - Google Patents
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Abstract
Un método para purificar ARN mensajero (ARNm), que comprende (a) precipitar ARNm de una preparación impura; y (b) someter la preparación impura que comprende ARNm precipitado a un proceso de purificación que implica filtración por membrana de tal manera que el ARNm precipitado sea capturado por una membrana; y (c) lavar el ARNm precipitado capturado; y (d) eluir el ARNm precipitado capturado de la membrana volviendo a solubilizar el ARNm, dando como resultado una solución de ARNm purificada.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para la purificación de ARN mensajero
ANTECEDENTES
[0001] La terapia con ARN mensajero se está convirtiendo en un enfoque cada vez más importante para el tratamiento de una variedad de enfermedades. La terapia con ARN mensajero implica la administración de ARN mensajero (ARNm) a un paciente que necesita la terapia y la producción de la proteína codificada por el ARNm dentro del cuerpo del paciente. Por lo tanto, existe una gran necesidad de producción a gran escala de productos de ARNm altamente puros y seguros adecuados para uso terapéutico. Bhaduri et al., (1972) J. Virol., 10 (6), 1126-1129 describe un método para la purificación de ARNm que comprende la unión selectiva de los tractos de poliA.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0002] La presente invención proporciona métodos mejorados para la purificación eficaz del ARN mensajero (ARNm), en particular, el ARNm sintetizado in vitro adecuado para uso terapéutico. La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la precipitación de ARNm seguida de filtración por membrana, una combinación altamente inusual, dio como resultado una producción inesperadamente exitosa a gran escala de ARNm de alta calidad.
[0003] Específicamente, la presente invención proporciona un método de purificación de ARN mensajero (ARNm) que comprende (a) la precipitación de ARNm a partir de una preparación impura; (b) someter la preparación impura que comprende ARNm precipitado a un proceso de purificación que implica filtración por membrana de manera que el ARNm precipitado sea capturado por una membrana; (c) lavar el ARNm precipitado capturado; y (d) eluir el ARNm precipitado capturado de la membrana resolubilizando el ARNm, dando como resultado una solución de ARNm purificada. En algunas realizaciones, un proceso de purificación que implica filtración de membrana adecuada para la presente invención es filtración de flujo tangencial. En algunas realizaciones, un proceso de purificación que implica filtración de membrana adecuada para la presente invención es filtración de flujo directo.
[0004] En algunas realizaciones, la etapa de precipitar ARNm comprende tratar la preparación impuro con una solución que comprende un reactivo seleccionado del grupo que consiste de cloruro de litio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, acetato de amonio y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un reactivo adecuado es el tiocianato de guanidinio.
[0005] En algunas realizaciones, una solución adecuada para la precipitación de ARNm comprende tiocianato de guanidinio en una concentración de aproximadamente 1 M o mayor, de aproximadamente 2 M o mayor, de aproximadamente de 3 M o mayor, de aproximadamente 4 M o mayor, de aproximadamente 5 M o mayor, de aproximadamente 6 M o mayor, de aproximadamente 7 M o mayor, de aproximadamente 8 M o mayor, de aproximadamente 9 M o mayor, o de aproximadamente 10 M o mayor. En algunas realizaciones, una solución adecuada para la precipitación de ARNm comprende tiocianato de guanidinio a una concentración de aproximadamente 4M. En algunas de tales realizaciones, una solución adecuada incluye además lauril sarcosilo de sodio y/o citrato de sodio. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una solución adecuada para la precipitación de ARNm comprende tiocianato de guanidinio 4 M, lauril sarcosilo sódico al 0,5% y citrato sódico 25 mM. En ciertas realizaciones, una solución adecuada para la precipitación de ARNm comprende tiocianato de guanidinio 4 M y lauril sarcosilo de sodio al 0,5%. En ciertas realizaciones, una solución adecuada para la precipitación de ARNm comprende tiocianato de guanidinio 4 M y citrato de sodio 25 mM.
[0006] En algunas realizaciones, la etapa de precipitar ARNm comprende además una etapa de tratar la preparación impura con etanol absoluto.
[0007] En algunas realizaciones, la etapa de precipitar ARNm comprende además una etapa de tratar la preparación impura con alcohol isopropílico.
[0008] En algunas realizaciones, una membrana adecuada para la presente invención es de un material seleccionado de entre el grupo que consiste en polietersulfona (mPES) (no modificado), membrana de fibra hueca de polietersulfona (mPES), fluoruro de polivinilideno (PVDF), acetato de celulosa, nitrocelulosa, MCE (ésteres mixtos de celulosa), polietileno de peso molecular ultra alto (UPE), polifluorotetraetileno (PTFE), nylon y una combinación de los mismos.
[0009] En algunas realizaciones, la etapa de lavado comprende múltiples ciclos de aclarado usando una solución de lavado que comprende un tampón de guanidinio y etanol, seguido por alrededor de 70-80% de etanol (por ejemplo, aproximadamente 70%, 75%, o 80% de etanol). En algunas realizaciones, los ciclos de enjuague múltiples adecuados para la presente invención son al menos 5 o más de 5 ciclos (por ejemplo, aproximadamente 5 a 10 ciclos o aproximadamente 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 ciclos).
[0010] En algunas realizaciones, la etapa de elución comprende volver a solubilizar el ARNm precipitado capturado con agua libre de ARNasa. En algunas realizaciones, el agua libre de ARNasa se recircula durante aproximadamente 5-10 minutos (por ejemplo, durante aproximadamente 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 minutos).
[0011] En algunas realizaciones, un método de acuerdo con la presente invención comprende además una etapa de dializar la solución de ARNm purificada. En algunas realizaciones, la solución de ARNm purificada se dializa con citrato de sodio 1 mM usando una membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa.
[0012] En diversas realizaciones, la presente invención puede usarse para purificar ARNm in vitro sintetizado a partir de un preparación impura que contiene una mezcla in vitro de reacción de síntesis de ARNm. En algunas realizaciones, la preparación impura comprende secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro.
[0013] En algunas realizaciones, la solución de ARNm purificado contiene menos de aproximadamente 5% (por ejemplo, menos de aproximadamente 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,5%, 0,1%) de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En ciertas realizaciones, la solución de ARNm purificado contiene menos de aproximadamente 1% (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%) de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En ciertas realizaciones, la solución de ARNm purificado contiene menos de aproximadamente 0,5% (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,4%, 0,3%, 0,2% o 0,1%) de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En algunas realizaciones, el proceso de purificación que implica filtración por membrana es filtración de flujo tangencial y la solución de ARNm purificada contiene menos de aproximadamente el 0,1% de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En algunas realizaciones, la solución de ARNm purificada está sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro.
[0014] En algunas realizaciones, la secuencia de ARN prematuramente abortada y/o reactivos de enzima usados en síntesis in vitro se miden a través de tinción con plata, electroforesis en gel, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), y/o electroforesis capilar.
[0015] En algunas realizaciones, las secuencias de ARN abortadas prematuramente contienen menos de 15 bases (por ejemplo, menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4 o 3 bases). En algunas realizaciones, las secuencias de ARN abortadas prematuramente contienen aproximadamente 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11 u 8-10 bases.
[0016] En algunas realizaciones, los reactivos enzimáticos utilizados en la síntesis in vitro comprenden ARN polimerasa T7, ADNsa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa.
[0017] En algunas realizaciones, el ARNm se purifica a una escala de 1 gramo, 5 gramos, 10 gramos, 15 gramos, 20 gramos, 25 gramos, 30 gramos, 35 gramos, 40 gramos, 45 gramos, 50 gramos, 75 gramos, 100 gramos, 150 gramos, 200 gramos, 250 gramos, 300 gramos, 350 gramos, 400 gramos, 450 gramos, 500 gramos, 550 gramos, 600 gramos, 650 gramos, 700 gramos, 750 gramos, 800 gramos, 850 gramos, 900 gramos, 950 gramos, 1 kg, 2,5 kg, 5 kg, 7,5 kg, 10 kg, 25 kg, 50 kg, 75 kg o 100 kg por lote. Como se muestra en los ejemplos a continuación, un lote que comprende ARNm purificado en la cantidad de 10 gramos o más (25 gramos o más) se puede lograr fácilmente con los métodos de la invención.
[0018] En algunas realizaciones, el ARNm se purifica antes de una tapa y/o la cola se añaden al ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm se purifica después de que se agrega una tapa y/o cola al ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm se purifica después de que se agrega una tapa. En algunas realizaciones, el ARNm se purifica tanto antes como después de que se agregue una tapa y/o cola al ARNm.
[0019] En algunas realizaciones, el ARNm es o es mayor que aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb o 20 kb de longitud.
[0020] En algunas realizaciones, el ARNm comprende una o más modificaciones para mejorar la estabilidad. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones comprenden nucleótidos modificados y/o esqueletos de fosfato de azúcar modificados. En algunas realizaciones, el ARNm no está modificado.
[0021] En algunas realizaciones, el ARNm purificado tiene una integridad de o mayor que aproximadamente 95% (por ejemplo, de o mayor que aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99%). En algunas realizaciones, el ARNm purificado tiene una integridad igual o superior a aproximadamente el 98%. En algunas realizaciones, el ARNm purificado tiene una integridad igual o superior a aproximadamente el 99%.
[0022] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un método de purificación de ARN mensajero (ARNm), que comprende (a) la precipitación de ARNm a partir de una preparación impura; (b) someter la preparación impura que comprende ARNm precipitado a filtración de flujo tangencial de modo que el ARNm precipitado sea capturado por una membrana de filtración mientras las impurezas se descartan por permeación; y (c) eluir el ARNm
precipitado capturado volviendo a solubilizar el ARNm precipitado, dando como resultado una solución de ARNm purificada.
[0023] En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el ARN mensajero de fabricación (ARNm) que comprende la síntesis de ARNm in vitro; y purificar el ARNm sintetizado in vitro usando un método descrito aquí.
[0024] La presente invención se puede utilizar para proporcionar un ARN mensajero purificado (ARNm).
[0025] En otro aspecto, la presente invención también se puede usar para proporcionar un lote de ARNm purificado que comprendE5 gramos o más de una sola especie de ARNm adecuadas para la administración a un sujeto humano. En algunas realizaciones, el lote comprende 10 gramos de más de una sola especie de ARNm. En algunas realizaciones, el lote comprende 25 gramos de más de una sola especie de ARNm. En algunas realizaciones, el lote está sustancialmente libre de impurezas de un proceso de síntesis de ARNm. En algunas realizaciones, el lote está sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente, plantillas de ADN y/o reactivos enzimáticos utilizados en la síntesis in vitro de las especies de ARNm individuales. En algunas realizaciones, el ARNm purificado contiene menos de aproximadamente 5% de reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En algunas realizaciones, el ARNm purificado tiene una integridad mayor de aproximadamente el 95%.
[0026] En otro aspecto, la presente invención también puede usarse para proporcionar una composición que comprende ARN mensajero.
[0027] En otro aspecto, la presente invención también se puede usar para proporcionar una composición que comprende síntesis in vitro a Rn mensajero de tamaño, en el que la composición contiene menos del 1% de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro.
[0028] En otro aspecto, la presente invención también se puede usar para proporcionar una composición que comprende síntesis in vitro ARN mensajero de tamaño (ARNm), en el que el ARNm tiene una integridad igual o superior al 95%.
[0029] Como se usa en esta solicitud, los términos "sobre" y "aproximadamente" se utilizan como equivalentes. Todos los números utilizados en esta aplicación con o sin aproximadamente/alrededor de están destinados a cubrir cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica relevante.
[0030] Otras características, objetos, y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada que sigue. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada, aunque indica realizaciones de la presente invención, se proporciona solo a modo de ilustración, no de limitación.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO
[0031] Las siguientes figuras son solo para fines ilustrativos y no limitativos.
La Figura 1 representa un proceso ejemplar para la purificación a gran escala de ARNm que implica etapas de carga, lavado y elución. Por ejemplo, el ARNm precipitado puede cargarse en membranas de manera que el ARNm precipitado puede capturarse como retenido mientras que las impurezas solubles, así como las insolubles menores de 0,22 um se descartan a través del permeado. Después de la captura, el precipitado sólido se lava con varios tampones seguido de una nueva solubilización y elución para un producto de ARN mensajero puro.
La Figura 2 muestra un gel de proteína teñido con plata ejemplar de ARNm de regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística modificada (CFTR) de una reacción de transcripción in vitro (IVT) inicial de 1 gramo de acuerdo con los métodos proporcionados (con tres eluciones) y enzimas de control presentes en la reacción de IVT.
La Figura 3 muestra un ejemplo de gel de proteína teñido con plata de ARNm de CFTR modificado a partir de una reacción de transcripción in vitro (IVT) inicial de 1,5 gramos según los métodos proporcionados (con seis eluciones) y enzimas de control presentes en la reacción de IVT.
La Figura 4 muestra la longitud de ARNm ejemplar en muestras de transcripción in vitro (IVT) de ARNm de CFTR modificado purificado y filtrado de acuerdo con los métodos proporcionados como se muestra por electroforesis en gel de agarosa. Se mantuvo la integridad total para el ARNm de CFTR modificado después de la precipitación a gran escala.
La Figura 5 muestra un gel de proteína teñido con plata ejemplar de ARNm argininosuccinato sintetasa (ASS1) de una reacción de transcripción in vitro (IVT) inicial de 1 gramo de acuerdo con los métodos proporcionados (con cinco eluciones) y enzimas de control presentes en la reacción de IVT.
La Figura 6 muestra un gel de proteína teñido con SYPRO a modo de ejemplo de ARNm de argininosuccinato sintetasa (ASS1) a partir de una reacción inicial de transcripción in vitro (IVT) de 1 gramo de acuerdo con los métodos proporcionados (con cinco eluciones) y enzimas de control presentes en la reacción IVT.
La Figura 7 muestra la longitud de ARNm ejemplar en muestras de transcripción in vitro (IVT) de ARNm de ASS1 purificado y filtrado de acuerdo con los métodos proporcionados como se muestra por electroforesis en gel de agarosa. La integridad total permaneció para el ARNm de ASS1 después de la precipitación a gran escala.
La Figura 8 muestra un gel de proteína teñido con plata ejemplar de ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) a partir de una reacción de transcripción in vitro inicial (IVT) según los métodos proporcionados (con una precipitación simple o doble) y enzimas de control presentes en la reacción IVT.
La Figura 9 muestra un gel de proteína teñido con SYPRO a modo de ejemplo de ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) a partir de una reacción de transcripción in vitro inicial (IVT) según los métodos proporcionados (con una precipitación simple o doble) y enzimas de control presentes en la reacción IVT.
La Figura 10 muestra la longitud de ARNm ejemplar en muestras de transcripción in vitro (IVT) de ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) purificada y filtrada según los métodos proporcionados como se muestra por electroforesis en gel de agarosa. La integridad total permaneció para el ARNm de FFL después de la precipitación y reprecipitación a gran escala.
La Figura 11 muestra un ejemplo de gel de proteína teñido con plata de ARNm de sintetasa de argininosuccinato (ASS1) de una reacción final de taponado y colas (con tres eluciones) y enzimas de control presentes en las reacciones de taponado y colas.
La Figura 12 muestra la longitud del ARNm de ASS1 final ejemplar purificado y filtrado de acuerdo con los métodos proporcionados como se muestra por electroforesis en gel de agarosa. La integridad total permaneció para ASS1 ARNm después de la precipitación a gran escala y reprecipitación.
La Figura 13 muestra la luminiscencia ejemplar observada dentro de los lisados celulares de células HEK293T tratadas con ARNm de FFL. Las células se cosecharon 24 horas después de la transfección. Se representa una comparación del ARNm derivado del vendedor frente al ARNm purificado en columna giratoria (kit comercial) frente a la capacidad de traducción del ARNm de FFL purificado por precipitación-TFF. La Figura 14 muestra niveles de proteína CFTR ejemplares observados dentro de lisados celulares de células HEK293T transfectadas con ARNm de hCFTR. Las células se cosecharon 24 horas después de la transfección. Se representa una comparación de la capacidad de traducción de ARNm de hCFTR de ARNm purificado con TFF frente a columna giratoria (kit comercial).
La Figura 15 muestra la longitud de un ARNm ejemplar de una muestra de transcripción in vitro (IVT) de ARNm sintetizado por argininosuccinato (ASS1) purificado y filtrado de acuerdo con los métodos proporcionados. Se mantuvo la integridad total para la precipitación de ARNm de ASS1 a gran escala (5G).
La Figura 16 muestra la longitud de un ARNm ejemplar a partir de una muestra de transcripción in vitro (IVT) de ARNm sintetasa de argininosuccinato (ASS1) (pre y post-tapado/cola) purificado y filtrado de acuerdo con los métodos proporcionados. La integridad total permaneció para la ARNm de ASS1 después de la precipitación a gran escala (5G).
La Figura 17 muestra un ejemplo de gel de proteína teñida con plata de ARNm sintetasa de argininosuccinato (ASS1) después de la purificación final (5G) de acuerdo con los métodos proporcionados, así como las enzimas de control presentes en la reacción.
La Figura 18 muestra la producción de proteína ASS1 humana ejemplar observada dentro de los lisados celulares de las células HEK293T tratadas con ARNm de ASS1. Las células se cosecharon 24 horas después de la transfección. Se representa una comparación del ARNm purificado en columna giratoria (kit comercial) frente a la capacidad de traducción del ARNm de ASS1 (5G) purificado por precipitación-TFF.
La Figura 19 muestra la longitud de un ejemplo de ARNm en muestra de transcripción in vitro (IVT) de ARNm regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) (pre y post-tapado/cola) purificado y filtrado de acuerdo con los métodos proporcionados como se muestra por electroforesis en gel de agarosa. Se mantuvo la integridad total para la precipitación de ARNm de CFTR después de una precipitación a gran escala (10G).
La Figura 20 muestra un ejemplo de gel de proteína teñida con plata de ARNm de regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) después de la purificación final (10G) según los métodos proporcionados, así como las enzimas de control presentes en la reacción.
La Figura 21 muestra niveles de proteína CFTR ejemplares observados dentro de los lisados celulares de células HEK293T transfectadas con ARNm de hCFTR a partir de una producción y purificación a gran escala. Las células se cosecharon 24 horas después de la transfección.
La Figura 22 muestra la longitud de un ejemplo de ARNm en una muestra de transcripción in vitro (IVT) de ARNm sintetasa argininosuccinato (ASS1) a una producción a escala 25G. La integridad total permaneció para el aislamiento de ARNm de ASS1 a gran escala (25G).
DEFINICIONES
[0032] A fin de que la presente invención se comprenda más fácilmente, ciertos términos se definen primero a continuación. Las definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la especificación.
Animal: como se usa en el presente documento, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado, un primate y/o un cerdo) En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal genéticamente modificado y/o un clon. Aproximadamente o alrededor de: como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" o "alrededor de", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a una gama de valores que caen dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del indicado valor de referencia a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto donde dicho número exceda el 100% de un valor posible).
Biológicamente activo: como se usa en el presente documento, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activo.
Expresión: como se usa en el presente documento, "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a la traducción de un ARNm en un polipéptido, el ensamblaje de múltiples polipéptidos en una proteína intacta y/o la modificación postraduccional de un polipéptido o proteína completamente ensamblada. En esta aplicación, los términos "expresión" y "producción", y su equivalente gramatical, se usan de manera intercambiable.
Funcional: como se usa en el presente documento, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la cual se caracteriza.
Mejorar, aumentar o reducir: como se usa en el presente documento, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores relativos a una medición de referencia, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito aquí, o una medición en un sujeto de control (o sujeto de control múltiple) en ausencia del tratamiento descrito aquí. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que está siendo tratado, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que está siendo tratado.
Impurezas: como se usa en el presente documento, el término "impurezas" se refiere a sustancias dentro de una cantidad confinada de líquido, gas o sólido, que difieren de la composición química del material o compuesto diana. Las impurezas también se conocen como contaminantes.
In Vitro: como se usa en el presente documento, el término "in vitro" se refiere a eventos que ocurren en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.
In Vivo: como se usa en el presente documento, el término "in vivo" se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, tal como un animal humano y no humano. En el contexto de los sistemas
basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que ocurren dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemas in vitro).
Aislado: como se usa en el presente documento, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que se ha (1) separado de al menos algunos de los componentes con los que se asoció cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un escenario experimental), y/o (2) producidos, preparados y/o fabricados por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o más de aproximadamente 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o más de aproximadamente 99% puro. Como se usa en el presente documento, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se usa en este documento, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (p. ej., tampón, disolvente, agua, etc.).
ARN mensajero (ARNm): como se usa en el presente documento, el término "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido. El ARNm tal como se usa en el presente documento abarca tanto el ARN modificado como el no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes.
Integridad del ARNm: como se usa en el presente documento, el término "integridad del ARNm" generalmente se refiere a la calidad del ARNm. En algunas realizaciones, la integridad del ARNm se refiere al porcentaje de ARNm que no se degrada después de un proceso de purificación (por ejemplo, filtración de flujo tangencial). La integridad del ARNm puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de ARN agarosa (por ejemplo, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology).
Ácido nucleico: como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpore o pueda incorporarse a una cadena polinucleotídica. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse a una cadena polinucleotídica mediante un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena polinucleotídica que comprende residuos de ácido nucleico individuales. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" abarca ARN, así como ADN y/o ADNc de cadena sencilla y/o bicatenaria. Además, los términos "ácido nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que tienen otros que una columna vertebral de fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que son conocidos en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal, se consideran dentro del alcance de la presente descripción. El término "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y/o ARN pueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producidos usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificados, sintetizados químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos tales como análogos que tienen bases químicamente modificadas o azúcares, modificaciones del esqueleto, etc. Se presenta una secuencia de ácido nucleico en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos de nucleósidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O (6)metilguanina, y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente; bases biológicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2 '-fluororibosa, ribosa, 2 '-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (p. ej., fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invención está dirigida específicamente a "ácidos nucleicos no modificados", es decir, ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, incluidos nucleótidos y/o nucleósidos) que no se han modificado químicamente para facilitar o lograr el suministro.
Paciente: como se usa en el presente documento, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición proporcionada, por ejemplo, con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano. Un humano incluye formas pre y postnatales.
Farmacéuticamente aceptable: el término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.
Secuencias de ARN abortadas prematuramente: El término "secuencias de ARN abortadas prematuramente", como se usa en el presente documento, se refiere a productos incompletos de una reacción de síntesis de ARNm (por ejemplo, una reacción de síntesis in vitro). Por una variedad de razones, las ARN polimerasas no siempre completan la transcripción de una plantilla de ADN; es decir, la síntesis de ARN termina prematuramente. Las posibles causas de la terminación prematura de la síntesis de ARN incluyen la calidad de la plantilla de ADN, las secuencias de terminación de la polimerasa para una polimerasa particular presente en la plantilla, los tampones degradados, la temperatura, el agotamiento de los ribonucleótidos y las estructuras secundarias de ARNm. Las secuencias de ARN abortadas prematuramente pueden tener cualquier longitud que sea menor que la longitud prevista del producto transcripcional deseado. Por ejemplo, las secuencias de ARNm abortadas prematuramente pueden tener menos de 1000 bases, menos de 500 bases, menos de 100 bases, menos de 50 bases, menos de 40 bases, menos de 30 bases, menos de 20 bases, menos de 15 bases, menos de 10 bases o menos.
Sal: como se usa en el presente documento, el término "sal" se refiere a un compuesto iónico que produce o puede resultar de una reacción de neutralización entre un ácido y una base.
Sujeto: tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un humano o cualquier animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdos, ovejas, caballos o primates). Un ser humano incluye formas pre y postnatales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se usa aquí de manera intercambiable con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede estar afectado o es susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede mostrar o no síntomas de la enfermedad o trastorno.
Sustancialmente: como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de exhibir la extensión o grado total o neartotal de una característica o propiedad de interés. Una persona con habilidades ordinarias en las artes biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, si alguna vez, se completan y/o se completan o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en el presente documento para capturar la posible falta de integridad inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Sustancialmente libre: como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente libre" se refiere a un estado en el que se elimina una cantidad relativamente pequeña o nula de una sustancia (por ejemplo, secuencias de ARN abortadas prematuramente) están presentes. Por ejemplo, "sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente" significa que las secuencias de ARN abortadas prematuramente están presentes en un nivel inferior a aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% o menos (p/p) de la impureza. Alternativamente, "sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente" significa que las secuencias de ARN abortadas prematuramente están presentes en un nivel inferior a aproximadamente 100 ng, 90 ng, 80 ng, 70 ng, 60 ng, 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 500 pg, 100 pg, 50 pg, 10 pg o menos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0033] La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos mejorados para purificar ARNm a partir de un impuro preparado (por ejemplo, in vitro en la síntesis de mezcla de reacción), basado en un proceso que implica ARNm precipitantes seguido de filtración de membrana (por ejemplo, filtración de flujo tangencial).
[0034] Se describen varios aspectos de la invención en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta aplicación, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.
Síntesis de ARNm
[0035] La presente invención puede utilizarse para purificar cualquier ARNm. El ARNm generalmente se considera el tipo de ARN que transporta información desde el a Dn al ribosoma. La existencia de ARNm es típicamente muy breve
e incluye procesamiento y traducción, seguido de degradación. Típicamente, en organismos eucariotas, el procesamiento de ARNm comprende la adición de una "tapa" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). Una tapa típica es una tapa de 7-metilguanosina, que es una guanosina que está unida a través de un enlace 5'-5'-trifosfato al primer nucleótido transcrito. La presencia de la tapa es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La cola es típicamente un evento de poliadenilación por el cual se agrega un resto de poliadenilo al extremo 3' de la molécula de ARNm. La presencia de esta "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación de exonucleasa. Los ribosomas traducen el ARN mensajero en una serie de aminoácidos que forman una proteína.
[0036] Los ARNm pueden sintetizarse de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm pueden sintetizarse mediante transcripción in vitro (IVT). Brevemente, la IVT se realiza típicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, un conjunto de ribonucleótidos trifosfatos, un sistema tampón que puede incluir DTT e iones de magnesio, y una ARN polimerasa apropiada (p. ej., ARN polimerasa de T3, T7 o SP6), ADNsa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán según la aplicación específica. La presencia de estos reactivos no es deseable en el producto final de acuerdo con varias realizaciones y, por lo tanto, puede denominarse impurezas y una preparación que contiene una o más de estas impurezas puede denominarse una preparación impura.
[0037] De acuerdo con diversas realizaciones, la presente invención puede usarse para purificar in vitro ARNm sintetizado de una variedad de longitudes. En algunas realizaciones, la presente invención puede usarse para purificar in vitro ARNm sintetizado de o mayor que aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb o 20 kb de longitud. En algunas realizaciones, la presente invención puede usarse para purificar ARNm sintetizado in vitro que varía de aproximadamente 1-20 kb, aproximadamente 1-15 kb, aproximadamente 1-10 kb, aproximadamente 5-20 kb, aproximadamente 5-15 kb, aproximadamente 5-12 kb, aproximadamente 5-10 kb, aproximadamente 8-20 kb, o aproximadamente 8-15 kb de longitud. Por ejemplo, los ARNm típicos pueden tener una longitud de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 5 kb. Más típicamente, el ARNm tendrá una longitud de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 3 kb. Sin embargo, en algunas realizaciones, el ARNm en la composición es mucho más largo (mayor que aproximadamente 20 kb). En algunas realizaciones, la presente invención puede usarse para purificar ARNm que contiene una o más modificaciones que típicamente mejoran la estabilidad. En algunas realizaciones, se seleccionan una o más modificaciones entre nucleótidos modificados, esqueletos de fosfato de azúcar modificados, región no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, la presente invención puede usarse para purificar ARNm sintetizado in vitro que no está modificado.
[0038] Típicamente, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones del ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del a Rn . Por lo tanto, un ARNm modificado puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la cadena principal, modificaciones del azúcar o modificaciones de la base. En algunas realizaciones, los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) se pueden sintetizar a partir de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos naturales (nucleótidos modificados) que incluyen, entre otros, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como análogos de nucleótidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, como por ejemplo 1-metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio -N-6-isopentenil-adenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tiocitosina, 3-metil-citosina, 4-acetil-citosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1 -metil-guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metilguanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tiouracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, N-uracilo-5ácido oxiacético éster metílico, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tio-uracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxiuracilo, uracilo éster metílico del ácido 5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, .beta.-D-manosilqueosina, wyutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida por un experto en la materia, por ejemplo, de la patente de EE.UU. N° 4,373,071, la patente de EE.UU. N° 4,401,796, la patente de EE.UU. N° 4,415,732, la patente de EE.UU. N° 4,458,066, la patente de EE.UU. N° 4,500,707, la patente de EE.UU. N° 4,668,777, la patente de EE.UU. N° 4,973,679, la patente de EE.UU. N° 5,047,524, la patente de EE.UU. N° 5,132,418, la patente de EE.UU. N° 5,153,319, la patente de EE.UU. Nos 5,262,530 y 5,700,642.
[0039] Típicamente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una "tapa" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la tapa es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación de exonucleasa.
[0040] Por lo tanto, en algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de tapa 5'. Una tapa 5' se agrega típicamente de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales; luego se agrega trifosfato de guanosina (GTP) a los fosfatos terminales a través de una transferasa de guanilil, produciendo un enlace trifosfato 5'5'5; y el 7-nitrógeno de
guanina es luego metilado por una metiltransferasa. Ejemplos de estructuras de tapa incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.
[0041] Mientras ARNm, proporcionados desde reacciones de transcripción in vitro, pueden ser deseables en algunas realizaciones, otras fuentes de ARNm se contemplan como dentro del alcance de la invención, incluyendo ARNm de tipo salvaje producido a partir de bacterias, hongos, plantas y/o animales.
[0042] En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' incluye uno o más elementos que afectan la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región 5' no traducida puede estar entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos de longitud.
[0043] En algunas realizaciones, una región 3' no traducida incluye uno o más de una señal de poliadenilación, una unión sitio para las proteínas que afectan la estabilidad de la ubicación de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para ARNmi. En algunas realizaciones, una región 3' no traducida puede estar entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más.
[0044] La presente invención puede usarse para purificar los ARNm que codifican una variedad de proteínas. Los ejemplos no limitativos de purificación de ARNm que codifican luciferasa de luciérnaga, sintetasa de argininosuccinato, Factor IX y CFTR, se describen en detalle en la sección de Ejemplos.
[0045] Típicamente, la presente invención se utiliza para purificar una sola especie de ARNm, es decir, la preparación de ARNm a purificar contiene ARNm derivado de un único gen o de una sola síntesis o construcción de expresión. Por el contrario, el ARNm total purificado de una célula contiene múltiples especies de ARNm.
[0046] Un proceso de purificación de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo durante o después de la síntesis. Por ejemplo, el ARNm puede purificarse como se describe en el presente documento antes de que se agregue una tapa y/o cola al ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm se purifica después de que se agrega una tapa y/o cola al ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm se purifica después de que se agrega una tapa. En algunas realizaciones, el ARNm se purifica tanto antes como después de que se agregue una tapa y/o cola al ARNm. En general, una etapa de purificación como se describe en el presente documento puede realizarse después de cada etapa de síntesis de ARNm, opcionalmente junto con otros procesos de purificación, tales como diálisis. Por ejemplo, el ARNm puede someterse a diálisis para eliminar los manteca después de la síntesis inicial (p. ej., con o sin cola) y luego ser sometido a precipitación y purificación como se describe aquí, luego, después de la adición de la tapa y/o la cola, purificarse nuevamente por precipitación y purificación
La precipitación de ARNm
[0047] Según la presente invención, el ARNm se puede precipitar a partir de una preparación impura, tal como una mezcla de reacción de síntesis in vitro, utilizando diversos métodos de precipitación conocidos en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término "precipitación" (o cualquier equivalente gramatical del mismo) se refiere a la formación de un sólido en una solución. Cuando se usa en conexión con ARNm, el término "precipitación" se refiere a la formación de una forma insoluble o sólida de ARNm en un líquido.
[0048] Cualquiera y todos los métodos adecuados para la precipitación de ARNm se puede utilizar para practicar la presente invención. Típicamente, la precipitación de ARNm implica una condición desnaturalizante. Como se usa en el presente documento, el término "condición desnaturalizante" se refiere a cualquier condición química o física que pueda causar la interrupción de la confirmación nativa del ARNm. Dado que la conformación nativa de una molécula suele ser la más soluble en agua, la alteración de las estructuras secundarias y terciarias de una molécula puede causar cambios en la solubilidad y puede provocar la precipitación de ARNm de la solución.
[0049] Por ejemplo, un método adecuado de precipitar ARNm a partir de una preparación impura implica el tratamiento de la preparación impura con un reactivo desnaturalizante de modo que precipita el ARNm. Los reactivos desnaturalizantes ejemplares adecuados para la invención incluyen, pero sin limitación, cloruro de litio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, acetato de amonio y combinaciones de los mismos. El reactivo adecuado se puede proporcionar en forma sólida o en solución.
[0050] Como un ejemplo no limitativo, tiocianato de guanidina se puede usar para precipitar ARNm. Típicamente, el tiocianato de guanidinio se puede proporcionar en una solución a una concentración de aproximadamente 1 M o mayor, de aproximadamente 2 M o más, de aproximadamente 3 M o más, de aproximadamente 4 M o más, de aproximadamente 5 M o más, de aproximadamente 6 M o más, de aproximadamente 7 M o más, de aproximadamente 8 M o más, de aproximadamente 9 M o más, o de aproximadamente 10 M o más. En algunas realizaciones, una solución adecuada para la precipitación de ARNm contiene tiocianato de guanidinio a una concentración de aproximadamente 4M.
[0051] Además de reactivo desnaturalizante, una solución adecuada para la precipitación de ARNm puede incluir sal adicional, tensioactivo y/o agente tampón. Por ejemplo, una solución adecuada puede incluir además lauril sarcosilo de sodio y/o citrato de sodio. Como ejemplos no limitantes, una solución adecuada para la precipitación de ARNm puede contener tiocianato de guanidinio 4 M, lauril sarcosilo sódico al 0,5% y citrato sódico 25 mM; o tiocianato de guanidinio 4 M y lauril sarcosilo de sodio al 0,5%; o tiocianato de guanidinio 4 M y citrato de sodio 25 mM.
[0052] Típicamente, es deseable incubar la preparación impura con uno o más reactivos de desnaturalización descritas en el presente documento durante un periodo de tiempo a una temperatura deseada que permita la precipitación de cantidad sustancial de ARNm. Por ejemplo, la mezcla de una preparación impura y un agente desnaturalizante puede incubarse a temperatura ambiente o temperatura ambiente durante un período de tiempo. Típicamente, un tiempo de incubación adecuado es un período de más de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 minutos. En algunas realizaciones, un tiempo de incubación adecuado es un período de aproximadamente 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 minutos. En algunas realizaciones, la mezcla se incuba durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. Típicamente, "temperatura ambiente" se refiere a una temperatura con el intervalo de aproximadamente 20-25°C, por ejemplo, aproximadamente 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, o 25°C. En algunas realizaciones, la mezcla de una preparación impura y un agente desnaturalizante también puede incubarse por encima de la temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 30-37°C o en particular, a aproximadamente 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C o 37°C) o por debajo de la temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 15-20°C o, en particular, a aproximadamente 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C o 20°C). El período de incubación puede ajustarse en función de la temperatura de incubación. Típicamente, una temperatura de incubación más alta requiere un tiempo de incubación más corto.
[0053] Alternativamente o adicionalmente, un disolvente puede usarse para facilitar la precipitación de ARNm. El disolvente ejemplar adecuado incluye, pero sin limitación, alcohol isopropílico, acetona, metil etil cetona, metil isobutil cetona, etanol, metanol, denatonio y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se puede agregar un solvente (p. ej., etanol absoluto) a una preparación impura junto con un reactivo desnaturalizante o después de la adición de un reactivo desnaturalizante y la incubación como se describe en el presente documento, para mejorar y/o acelerar aún más la precipitación de ARNm. Típicamente, después de la adición de un disolvente adecuado (p. ej., etanol absoluto), la mezcla puede incubarse a temperatura ambiente durante otro período de tiempo. Típicamente, un período adecuado de tiempo de incubación es o mayor de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 minutos. En algunas realizaciones, un período de incubación adecuado es un período de aproximadamente 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 minutos aproximadamente. Típicamente, la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante otros aproximadamente 5 minutos. La temperatura por encima o por debajo de la habitación se puede usar con el ajuste adecuado del tiempo de incubación. Alternativamente, la incubación podría ocurrir a 4°C o -20°C para la precipitación.
[0054] Típicamente, los métodos descritos en este documento como resultado la precipitación de una cantidad sustancial de ARNm a partir de una preparación impura. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento dan como resultado la precipitación de al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del ARNm total de una preparación impura. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento dan como resultado la precipitación de sustancialmente el 100% del ARNm total de una preparación impura.
Filtración por membrana
[0055] Según la presente invención, una preparación impura que contiene el ARNm precipitado se somete a un proceso de purificación que implica filtración de membrana de tal manera que el ARNm precipitado se captura o se retiene por una membrana. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una preparación impura se somete a filtración de membrana después de precipitación sin pretratamiento para eliminar los insolubles.
[0056] Varios tipos de filtración de membrana se pueden utilizar para capturar o retener ARNm precipitado. Típicamente, la filtración por membrana implica separar sólidos de fluidos usando una o más membranas permeables interpuestas. La filtración por membrana también se puede usar para filtrar partículas de una muestra gaseosa. En términos generales, hay dos formas principales de filtración de membrana, la filtración pasiva, que se produce únicamente debido a la difusión de la solución, y la filtración activa, que utiliza presión positiva o presión negativa (es decir, vacío) para forzar el líquido o el gas a través de la membrana.
[0057] Un proceso ejemplar que implica la filtración por membrana para la purificación de ARNm se muestra en la Figura 1. Típicamente, tal proceso implica los pasos de carga, lavado y elución.
Carga
[0058] Típicamente, el paso de carga implica la carga de la alimentación (por ejemplo, una preparación impura que contiene ARNm precipitado) a una membrana y forzarlo por presión positiva o negativa, dejando retenido capturado o retenido en la membrana. Como se usa en el presente documento, el término "retenido" se refiere a cualquier soluto no permeante y/o insoluble que es retenido por una membrana. Según la presente invención, el ARNm precipitado es
capturado por una membrana como retenido. Como se usa en este documento, el término "membrana" se refiere a cualquier capa porosa u hoja de material. En esta aplicación, el término "membrana" se usa de manera intercambiable con filtro.
[0059] En algunas realizaciones, una membrana adecuada tiene un tamaño de poro apropiado para la captura o de retención precipitó ARNm, mientras que deja las impurezas (incluyendo impurezas solubles y/o insolubles con un tamaño menor que el tamaño de poro) pasan como permeado. En algunas realizaciones, una membrana adecuada tiene un tamaño de poro promedio o mayor que aproximadamente 0,10 pm, 0,20 pm, 0,22 pm, 0,24 pm, 0,26 pm, 0,28 |jm, 0,30 pm, 0,40 pm, 0,5 pm, o 1,0 pm. En una realización particular, una membrana adecuada tiene un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0,22 pm. En algunas realizaciones, el tamaño de poro apropiado para retener el ARNm precipitado puede determinarse por los límites de peso molecular nominal (NMWL) del ARNm precipitado, también denominado corte de peso molecular (MWCO). Típicamente, se usa una membrana con un tamaño de poro menor que el NMWL o MWCO del ARNm precipitado. En algunas realizaciones, se usa una membrana con un tamaño de poro de dos a seis (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) por debajo de NMWL o MWCO del ARNm precipitado. En algunas realizaciones, una membrana adecuada para la presente invención puede tener un tamaño de poro de más de aproximadamente 100 kilodaltons (kDa), 300 kDa, 500 kDa, 1.000 kDa, 1.500 kDa, 2.000 kDa, 2.500 kDa, 3.000 kDa, 3.500 kDa, 4.000 kDa, 4.500 kDa, 5.000 kDa, 5.500 kDa, 6.000 kDa, 6.500 kDa, 7.000 kDa, 7.500 kDa, 8.000 kDa, 8.500 kDa, 9.000 kDa, 9.500 kDa, o 10.000 kDa.
[0060] Una membrana adecuada para la presente invención puede estar hecha de cualquier material. Los materiales de membrana ejemplares incluyen, pero no se limitan a, polietersulfona (mPES) (no modificada), membrana de fibra hueca de polietersulfona (mPES), fluoruro de polivinilideno (PVDF), acetato de celulosa, nitrocelulosa, MCE (ésteres de celulosa mixta), polietileno MW ultra alto (UPE), polifluorotetraetileno (PTFE), nylon, polisulfona, polietersulfona, poliacrilonitrilo, polipropileno, cloruro de polivinilo y sus combinaciones.
[0061] Una membrana adecuada para la presente invención pueden tener diversas área de superficie. En algunas realizaciones, una membrana adecuada tiene un área superficial suficientemente grande para facilitar la producción a gran escala de ARNm. Por ejemplo, una membrana adecuada puede tener una superficie de más de 2.000 cm2, 2.500 cm2, 3.000 cm2, 3.500 cm2, 4.000 cm2, 4.000 cm2, 4.500 cm2, 5.000 cm2, 7.500 cm2, 10.000 cm2, 5 m2, 10 m2, 12 m2, 15 m2, 20 m2, 24 m2, 25 m2, 30 m2 o 50 m2.
[0062] La filtración por membrana se puede realizar en varios formatos para capturar ARNm precipitado. En algunas realizaciones, la filtración por membrana se realiza como parte de la filtración de flujo tangencial (TFF).
[0063] La filtración de flujo tangencial (TFF), también conocida como filtración de flujo cruzado, es un tipo de filtración en donde el material a filtrar se pasa tangencialmente a través de un filtro en lugar de a través de él. En TFF, el permeado no deseado pasa a través del filtro, mientras que el retenido deseado (por ejemplo, ARNm precipitado) pasa a lo largo del filtro y es capturado o retenido en el filtro o la membrana aguas abajo.
[0064] Una ventaja principal de filtración de flujo tangencial es que retentato no permeable que puede agregarse en y bloquear el filtro (a veces referido como "torta de filtro") durante la filtración tradicional de "punto muerto", se llevan a cabo a lo largo de la superficie del filtro. Esta ventaja permite que la filtración de flujo tangencial sea particularmente adecuada para la purificación a gran escala de ARNm precipitado. En algunas realizaciones, una carga de ARNm de o mayor que aproximadamente 1 gramo, 10 gramos, 50 gramos, 100 gramos, 200 gramos, 300 gramos, 400 gramos, 500 gramos, 600 gramos, 700 gramos, 800 gramos, 900 gramos, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg o 100 kg se pueden aplicar por lote.
[0065] Al menos tres variables de proceso que son importantes en un proceso TFF típico: la presión transmembrana, la velocidad de alimentación y la velocidad de flujo del permeado. La presión transmembrana es la fuerza que impulsa el fluido a través del filtro, llevando consigo moléculas permeables. En algunas realizaciones, la presión transmembrana está entre 1 y 30 libras por pulgada cuadrada (psi), inclusive.
[0066] La velocidad de alimentación (también conocida como la velocidad de flujo transversal) es la tasa del flujo de solución a través del canal de alimentación y a través del filtro. La velocidad de alimentación determina la fuerza que barre las moléculas que de otro modo podrían obstruir o ensuciar el filtro y, por lo tanto, restringir el flujo de filtrado. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 1 y 500 l/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 50 y 800 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 50 y 750 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 50 y 300 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 50 y 200 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 75 y 200 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 100 y 200 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 125 y 175 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación es de 130 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación está entre 60 ml/min y 220 ml/min. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación es de 60 ml/min o mayor. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación es de 100 ml/min o mayor. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación es de 150 ml/min o mayor. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación es de 200 ml/min o mayor. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentación es de 220 ml/min o mayor.
[0067] La velocidad de flujo del permeado es la velocidad a la que se retira el perneado del sistema. Para una velocidad de alimentación constante, el aumento de las tasas de flujo de permeado puede aumentar la presión a través del filtro, lo que lleva a tasas de filtración mejoradas y al mismo tiempo aumenta el riesgo de obstrucción o ensuciamiento del filtro. Los principios, la teoría y los dispositivos utilizados para TFF se describen en Michaels et al., "Filtración de flujo tangencial" en Aplicaciones de tecnología de separación, farmacéutica y biotecnología (WP Olson, ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, Ill. 1995). Ver también la patente de EE.UU. Nos 5,256,294 y 5,490,937 para una descripción de la filtración de flujo tangencial de alto rendimiento (HP-TFF), que representa una mejora de TFF. En algunas realizaciones, el caudal es de entre 1 y 100 l/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo está entre 10 y 100 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo está entre 10 y 90 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo está entre 10 y 80 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo está entre 10 y 70 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo está entre 10 y 60 ml/minuto. En algunas realizaciones, el caudal está entre 10 y 50 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo está entre 10 y 40 ml/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo está entre 20 y 40 ml/minuto. En algunas realizaciones, el caudal es de 30 ml/minuto.
[0068] Se puede usar cualquier combinación de diversas variables de proceso descritas en este documento. En algunas realizaciones, la filtración de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentación de aproximadamente 100-200 ml/minuto (por ejemplo, aproximadamente 100-180 ml/minuto, 100-160 ml/minuto, 100-140 ml/minuto, 110 190 ml/minuto, 110-170 ml/minuto, o 110-150 ml/minuto) y/o un caudal de aproximadamente 10-50 ml/minuto (p. ej., aproximadamente 10-40 ml/minuto, 10-30 ml/minuto, 20-50 ml/minuto, o 20-40 ml/minuto). En algunas realizaciones, la filtración de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentación de aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 ml/minuto y/o una velocidad de flujo de aproximadamente 10, 20, 30, 40 o 50 ml/minuto. En otras realizaciones, la filtración de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentación de aproximadamente 500, 750 ml/minuto, 1, 2, 3, 4 o 5 l/min y/o una velocidad de flujo de aproximadamente 100, 200, 250, 500, 750 ml/minuto o 1 l/min.
Lavado
[0069] El ARNm insoluble capturado se lava antes de eluirde deshacerse de las impurezas retenidas en la membrana. En algunas realizaciones, una etapa de lavado comprende múltiples ciclos de enjuague usando una o más soluciones de lavado. Por ejemplo, una etapa de lavado puede llevarse a cabo mediante múltiples ciclos de enjuague utilizando un tampón de guanidinio y etanol, seguido de 70-80% de etanol (por ejemplo, aproximadamente 70%, 75% u 80% de etanol). En ciertas realizaciones, los ciclos de enjuague múltiples son más de 2, más de 3, más de 4, más de 5, más de 6 , más de 7, más de 8, más de 9 o más de 10 ciclos.
Eluir
[0070] ARNm capturado o retenido se eluye al re-solubilizar el ARNm precipitado en una solución. Por ejemplo, el ARNm capturado puede eluirse con agua libre de ARNasa. En ciertas realizaciones, eluir el ARNm capturado implica recircular el agua libre de ARNasa. Por ejemplo, el agua libre de ARNasa puede circular durante aproximadamente 5 30 minutos (por ejemplo, aproximadamente 5-25 minutos, aproximadamente 5-20 minutos o aproximadamente 5-15 minutos). En realizaciones particulares, el agua libre de ARNasa se recircula durante aproximadamente 5-10 minutos (por ejemplo, durante aproximadamente 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 minutos).
[0071] En algunas realizaciones, el ARNm re-solubilizado puede ser dializado en una formulación deseada a una concentración deseada. Se pueden usar varias formulaciones para diálisis. En algunas realizaciones, la solución de ARNm purificada se dializa con citrato de sodio 1 mM. En algunas realizaciones, la solución de ARNm purificada se dializa con acetato de sodio, carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, acetato de piridinio, formiato de piridinio, acetato de amonio, urea, cloruro de potasio, etc. Dependiendo del tamaño de ARNm de interés, membranas de diálisis con moléculas moleculares apropiadas. Se puede utilizar el límite de peso (MWCO). Por ejemplo, las membranas de diálisis adecuadas pueden tener un MWCO de aproximadamente 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa o 500 kDa.
Caracterización de ARNm purificado
[0072] Una ventaja particular proporcionada por la presente invención es la capacidad para purificar ARNm, en particular, el ARNm sintetizado in vitro, a una escala grande o comercial. Por ejemplo, el ARNm sintetizado in vitro puede purificarse a una escala de más de aproximadamente 1 gramo, 10 gramos, 50 gramos, 100 gramos, 200 gramos, 300 gramos, 400 gramos, 500 gramos, 600 gramos, 700 gramos, 800 gramos., 900 gramos, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg o 100 kg por lote. En una realización particular, el ARNm sintetizado in vitro puede purificarse a una escala de 10 gramos por lote. En otra realización particular, el ARNm sintetizado in vitro puede purificarse a una escala de 100 gramos por lote. En otra realización particular más, el ARNm sintetizado in vitro puede purificarse a una escala de 1 kg por lote.
[0073] En diversas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención está sustancialmente libre de impurezas de proceso de la síntesis de ARNm, incluyendo, pero no limitado a, las secuencias prematuramente abortadas de ARN, las plantillas de ADN, y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro.
[0074] En particular, la presente invención remueve o elimina un alto grado de secuencias de ARN prematuramente abortadas (también conocidas como "shortmers"). En algunas realizaciones, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o sustancialmente todas las secuencias de ARN abortadas prematuramente. En algunas realizaciones, el ARNm purificado según la presente invención está sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente. En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos del 5% (por ejemplo, menos del 4%, 3%, 2% o 1%) de secuencias de ARN abortadas prematuramente. En algunas realizaciones, el ARNm purificado según la presente invención contiene menos de aproximadamente 1% (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% o 0,1%) de secuencias de a Rn abortadas prematuramente. En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene secuencias de ARN abortadas prematuramente indetectables como se determina, por ejemplo, mediante tinción con bromuro de eitidio y/o Coomassie. En algunas realizaciones, las secuencias de ARN abortadas prematuramente comprenden menos de 15 bases (por ejemplo, menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4 o 3 bases). En algunas realizaciones, las secuencias de ARN abortadas prematuramente contienen aproximadamente 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11 u 8-10 bases.
[0075] En algunas realizaciones, un método de acuerdo con la presente invención remueve o elimina un alto grado de reactivos de enzima usado en síntesis in vitro incluyendo, pero no limitado a, ARN polimerasa de T7, ADNasa I, pirofosfatasa, y/o el inhibidor de ARNasa. En algunas realizaciones, la presente invención es particularmente efectiva para eliminar la ARN polimerasa de T7. En algunas realizaciones, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o sustancialmente todos los reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro incluyendo. En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención está sustancialmente libre de reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5% (por ejemplo, menos de aproximadamente 4%, 3%, 2% o 1%) de reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En algunas realizaciones, el ARNm purificado según la presente invención contiene menos de aproximadamente 1% (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% o 0,1%) de reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro. En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene reactivos enzimáticos indetectables utilizados en síntesis in vitro, que se determinan, por ejemplo, mediante tinción con bromuro de etidio y/o Coomassie.
[0076] El nivel de secuencias de ARN prematuramente abortadas y/o reactivos de enzimas en el ARNm purificado se puede medir usando diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o los reactivos enzimáticos utilizados en la síntesis in vitro pueden medirse mediante tinción con plata, electroforesis en gel, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía líquida de alta resolución (UPLC) y/o electroforesis capilar.
[0077] En diversas realizaciones, el ARNm se purificó utilizando un método descrito en el presente documento manteniendo un alto grado de integridad. Como se usa en el presente documento, el término "integridad de ARNm" generalmente se refiere a la calidad del ARNm después de la purificación. En algunas realizaciones, la integridad del ARNm se refiere al porcentaje de ARNm que no se degrada después de la filtración de flujo tangencial. La integridad del ARNm puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de ARN agarosa (por ejemplo, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology). En algunas realizaciones, el ARNm purificado según la presente invención tiene una integridad mayor que aproximadamente 95% (por ejemplo, mayor que aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más). En algunas realizaciones, el ARNm purificado según la presente invención tiene una integridad superior al 98%. En algunas realizaciones, el ARNm purificado según la presente invención tiene una integridad superior al 99%. En algunas realizaciones, el ARNm purificado según la presente invención tiene una integridad de aproximadamente el 100%.
La producción de lotes a gran escala de ARNm para aplicaciones terapéuticas
[0078] La presente invención aborda una necesidad urgente para la producción a gran escala de ARNm purificadas que tienen el alto grado de pureza y la integridad requerida para aplicaciones terapéuticas. Los métodos existentes son típicamente de pequeña escala y no se pueden ampliar en la medida necesaria para que la producción comercial de ARNm que sea adecuada para la administración a un sujeto humano sea lo suficientemente rentable. Por el contrario, los métodos de la invención son totalmente escalables como se demuestra en los ejemplos y permiten la producción rentable a gran escala de ARNm de grado farmacéutico.
[0079] Cada lote de ARNm purificado producido de acuerdo con la invención comprende de 5 gramos o más de una sola especie de ARNm adecuadas para la administración a un sujeto humano. En algunas realizaciones, un único lote comprende 10 gramos o más de una sola especie de ARNm. En una realización particular, un único lote comprende 25 gramos o más de una sola especie de ARNm.
[0080] El método de la invención produce lotes de ARNm purificados que están sustancialmente libres de impurezas a partir de un proceso de síntesis de ARNm. En particular, los lotes están sustancialmente libres de secuencias de a Rn abortadas prematuramente, plantillas de ADN y/o reactivos enzimáticos utilizados en la síntesis in vitro de las especies de ARNm individuales. Por ejemplo, un lote de ARNm purificado producido de acuerdo con la invención contiene menos del 5% de los reactivos enzimáticos utilizados en la síntesis in vitro. El ARNm purificado en cada lote típicamente tiene una integridad mayor de aproximadamente el 95%.
[0081] Los lotes de ARNm producidos de acuerdo con los métodos de la invención se puede utilizar para preparar un agente terapéutico, que requieren una o más etapa(s) de procesamiento aguas abajo. Típicamente, cada lote de ARNm se formulará, por ejemplo, encapsulando el ARNm en nanopartículas lipídicas, liposomas, polipéptidos a base de polímeros, etc. que se pueden administrar a un paciente. Las vías de administración típicas, pero no exclusivamente, implican la administración intravenosa o pulmonar del ARNm purificado.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Generación y purificación de ARN mensajero (ARNm)
Síntesis de ARN mensajero
[0082] Luciferasa de luciérnaga (FFL), sintetasa de argininosuccinato (ASS1), y ARN mensajeros reguladores de la conductancia transmembrana de fibrosis quística humana (CFTR) se sintetizaron mediante transcripción in vitro a partir de un molde de ADN plasmídico que codifica el gen, seguido de la adición de una estructura de tapa 5' (Tapa 1) (Fechter, P.; Brownlee, GG "Reconocimiento de estructuras de tapa de ARNm por proteínas virales y celulares" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola 3' poli(A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud según lo determinado por electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen como se indica (véase más adelante). La síntesis de la construcción del ARN mensajero diana implicó un proceso de dos pasos en el que se sintetiza la cadena inicial que consiste en la secuencia de codificación flanqueada por regiones no traducidas 5' y 3'. Esta construcción sin tapar y sin cola se purificó y procesó adicionalmente mediante un paso de tapado, seguido de un paso de adición de poli-A. Un segundo paso de purificación al final de la reacción de colas se realizó de manera similar al proceso de purificación inicial.
Ejemplo de diseño de construcción de ARNm de regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística codificada optimizada por codón:
[0083] Xi -SEQ ID NO: 1 - Yi
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAU GGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACA UCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACG GGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUG AGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGG GAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACG ACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUG UUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAU CACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACA CUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCC CUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUC GUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUG UUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUU CAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAA AUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCA AAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAA
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GAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA [SEQ ID NO: 1]
Ejemplo de ARNm de luciferasa de luciérnaga optimizada por codón (FFL):
Diseño de construcción
[0084] Xi - SEQ ID NO: 2 - Yi
AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAG ACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCC CGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAG UACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAU ACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCG UGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAA CGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUG AGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUA CAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGU ACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCC CGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGU ACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCA GUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCU CAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUG AUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGC GCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAG CUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAG AUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAAC GCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGC
CAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUG CCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUG AACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUA ACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGG CGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAG AGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCC UGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGA UGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACC GAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUG CGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUG GACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCG CCGUGUAA |SEQ ID NO: 2|
Ejemplo de ARNm sintetasa de argininosuccinato humano optimizado con codón (ASS1)
Diseño de construcción:
[0085] Xi -SEQ ID No: 3- Y2
AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCU
GCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAA CAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGC
GCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUC
UGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCA
GCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGG
CGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUC
GAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCA
UGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAA
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AACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGG
CCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCC
GACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUG
AAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGG
UGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGG
CAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCC
CACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGG
GCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGA
GUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAG
GUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCC
UGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGC
CCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCA
CCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA [SEQ ID NO: 3|
Secuencias UTR de 5’ y 3'
[0086]
X 1 =
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG [SEQ ID NO: 4|
Y1 =
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU |SEQ ID NO: 5]
V
GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCA CUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU |SEQ ID NO: 6|
Síntesis de ARNm
[0087] En cada uno de los ejemplos siguientes, la síntesis de ARNm se llevó a cabo bajo condiciones libres de RNasa completas. Se requería que todos los tubos, viales, puntas de pipeta, pipetas, tampones, etc., estuvieran libres de nucleasas, a menos que se indique explícitamente lo contrario.
[0088] En los siguientes ejemplos, a menos que se describa lo contrario, el ARNm se sintetizó a través de transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN linealizado. Para producir la construcción de precursor de ARNm (IVT) deseada, una mezcla de <8 mg de ADN linealizado, rNTP (7,25 mM), DTT (10 mM), ARN polimerasa T7, inhibidor de ARNasa, pirofosfatasa y tampón de reacción (10x, 800mM Hepes (pH 8,0), espermidina 20 mM, MgCl2250 mM, pH 7,7) se preparó con agua libre de ARNasa a un volumen final de 180 ml. La mezcla de reacción se incuba a 37°C durante un intervalo de tiempo entre 20 minutos y 60 minutos. Una vez completada, la mezcla se trata con DNasa I durante 15 minutos adicionales y se apaga en consecuencia.
Adición de tapa 5 y cola 3'
[0089] El producto de ARNm purificado de la etapa de IVT mencionada (y filtración TFF posiblemente inicial también) se desnaturalizó a 65°C durante 10 minutos. Por separado, porciones de GTP (1,0 mM), S-adenosil metionina, inhibidor de ARNasa, 2'-O-Metiltransferasa y guanilil transferasa se mezclan con tampón de reacción (10x, Tris-HCl 500 mM (pH 8,0), KCl 60 mM, MgCl212,5 mM) hasta una concentración final de 1,6 L. Tras la desnaturalización, el ARNm se enfrió en hielo y luego se añadió a la mezcla de reacción. La solución combinada se incubó durante un intervalo de tiempo a 37°C durante 25-90 minutos. Tras la finalización, alícuotas de ATP (2,0 mM), poliA polimerasa y tizón de tampón de reacción (10x, 500 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2,5 M NaCl, 100 mM MgCl2 se añadieron) y la mezcla de reacción total se incubó adicionalmente a 37°C durante un rango de tiempo de 20 a 45 minutos. Al finalizar, la mezcla de reacción final se inactivó y se purificó en consecuencia.
Purificación de ARNm
Precipitación de ARNm
[0090] El ARN mensajero se puede precipitar usando una variedad de métodos. Por ejemplo, el uso de cloruro de litio, cloruro de potasio, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, acetato de amonio y otras sales permiten una precipitación eficiente de ARNm de la mezcla de reacción.
Filtración de flujo tangencial
[0091] En los siguientes ejemplos, a menos que se describa lo contrario, el sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) consistía en una membrana de filtración y una bomba peristáltica (sistema Spectrum) con la circulación tangencial del fluido a través de la membrana a una velocidad de alimentación de <130 ml/min con un caudal de 30 ml/min para el permeado. La membrana TFF empleada fue una MidiKros 500 kDa mPES 115cm2 (Spectrum Labs). Antes de su uso, el cartucho del filtro se lavó con agua libre de nucleasas y se limpió adicionalmente con NaOH 0,2 N. Finalmente, el sistema se limpió con agua libre de nucleasas hasta que el pH del permeado y el retenido alcanzó un pH < 6. El aislamiento del ARNm a través de TFF se puede lograr como se muestra en la Figura 1.
Purificación de luciferasa de luciérnaga ARNm
[0092] En un ejemplo representativo de purificación de ARNm, un lote de ARNm de luciferasa de luciérnaga de 1 gramo (FFL) se transcribe a través de métodos in vitro para producir la construcción intermedia antes mencionada sin tapa y sin cola poliA. Esta reacción mantuvo un volumen total de ~ 180 ml y se inactivó una vez completada mediante la adición de ADNsa I (~9,0 KU). La solución resultante se trató con una solución homogénea de tiocianato de guanidinio 4 M, lauril sarcosilo sódico al 0,5% y citrato sódico 25 mM (1500 ml), llevando el volumen total a 1,68 L. La mezcla resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante <5 minutos seguidos de un tratamiento adicional de 1,1 L de etanol absoluto. El ARNm precipitó lentamente y la suspensión se mantuvo a temperatura ambiente durante
~5 minutos. Al finalizar, la suspensión heterogénea completa se bombeó a través de una membrana de filtración usando filtración de flujo tangencial (TFF).
[0093] En este ejemplo, membranas de fibra hueca de polietersulfona modificada (mPES) fueron empleadas con una superficie de 2600 cm2 La mezcla heterogénea resultante (posprecipitación) se bombeó a través del sistema de filtro a una velocidad de flujo de 750 ml/min durante aproximadamente 8 minutos en porciones. Una vez completado, el precipitado capturado resultante se enjuagó con la solución de tampón combinada de etanol/tampón de guanidinio seguido de etanol al 80% (500 ml, 750 ml/min) y se repitió varias veces (>5x). Una vez completamente lavado, el ARNm sólido distribuido a través de la membrana se trató con agua libre de ARNasa (250 ml) y se recirculó durante 5-10 minutos para asegurar la disolución. Este proceso se repitió hasta que no hubo más ARNm recuperado. Una vez completada, la solución de ARNm resultante se dializó adicionalmente con citrato de sodio 1 mM (pH 6,4) usando una membrana MWCO de 100 KDa para eliminar cualquier etanol residual y se obtuvo un producto de ARNm final en la solución de almacenamiento adecuada. La concentración final se determinó mediante absorción a 260 nm (Xmax). La pureza del ARN mensajero se determinó mediante absorción UV (relación 260/280) así como geles de proteínas (tinción de plata, tinción de SYPRO, coomassie, etc.). La integridad del ARN mensajero se determinó mediante electroforesis en gel, así como análisis in vitro/in vivo de la producción de proteínas.
Purificación de ASS1 ARNm
[0094] En un segundo ejemplo representativo de purificación de ARNm, un lote de ASS1 ARNm de 1 gramo se transcribe a través de métodos in vitro para producir la construcción intermedia antes mencionada sin tapa y sin cola poliA. Esta reacción mantuvo un volumen total de ~ 180 ml y se inactivó una vez completada mediante la adición de ADNsa I (~ 9,0 KU). La solución resultante se trató con una solución homogénea de tiocianato de guanidinio 4 M, lauril sarcosilo sódico al 0,5% y citrato sódico 25 mM (1500 ml), llevando el volumen total a 1,68 L. La mezcla resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante < 5 minutos seguidos de un tratamiento adicional de 1,1 L de etanol absoluto. El ARN mensajero precipitó lentamente y la suspensión se mantuvo a temperatura ambiente durante ~ 5 minutos. Al finalizar, la suspensión heterogénea completa se bombeó a través de una membrana de filtración usando filtración de flujo tangencial (TFF) y se aisló como se describió anteriormente.
Purificación de CFTR ARNm
[0095] En un tercer ejemplo representativo de purificación de ARNm, un lote de 1,5 gramo de ARNm de CFTR modificado se transcribe a través de métodos in vitro para producir la construcción intermedia antes mencionada sin tapa y sin cola poliA. Esta reacción mantiene un volumen total de < 270 ml y se apaga al finalizar mediante la adición de ADNsa I (< 13,5 KU). La solución resultante se trató con una solución homogénea de tiocianato de guanidinio 4 M, lauril sarcosilo sódico al 0,5% y citrato sódico 25 mM (1500 ml), llevando el volumen total a 1,77 L. La mezcla resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante < 5 minutos seguidos de un tratamiento adicional de 1,1 L de etanol absoluto. El ARNm precipitó lentamente y la suspensión se mantuvo a temperatura ambiente durante ~ 5 minutos. Al finalizar, la suspensión heterogénea completa se bombeó a través de una membrana de filtración usando filtración de flujo tangencial (TFF) y se aisló como se describió anteriormente.
Ejemplo 2. Análisis de ARNm purificado
Prueba de la presencia de enzimas en purificadas de ARNm
Geles de tinción SYPRO
[0096] Se realizaron geles de proteínas teñidas con SYPRO estándar para determinar la presencia de cualquier reactivo residual enzimas presentes antes y después de purificaciones. Los geles se corrieron a 200 V durante 35 minutos.
Geles de tinción de plata
[0097] Manchas de plata de todos los lotes y fracciones de ARNm se realizaron utilizando SilverQuest® (Life Technologies, catálogo n° LC6070) usando el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras se cargaron (con y sin tratamiento de RNAsa) y se monitorizaron en comparación con los carriles de control de enzimas cargados. Los geles se corrieron a 200 V durante 35 minutos. El tiempo de exposición se asignó durante 8 minutos.
Evaluación de Integridad de ARNm a través de ensayos de electroforesis de gel de agarosa
[0098] A menos que se describa lo contrario, el tamaño y la integridad del ARNm se evaluó mediante electroforesis en gel. Se emplearon geles de agarosa al 1,0% auto vertidos o geles de agarosa prefabricados Invitrogen E-Gel al 1,2%. El ARN mensajero se cargó a cantidades de 1,0-1,5 |jg por pocillo. Al finalizar, las bandas de ARNm se visualizaron usando bromuro de etidio.
Ensayos de integridad de ARNm in vitro
[0099] A menos que se describa lo contrario, las transfecciones in vitro de luciferasa de luciérnaga (FFL), ARNm sintetasa de argininosuccinato (ASS1) y ARNm de CFTR se realizaron utilizando células HEK293T. Las transfecciones de un microgramo de cada construcción de ARNm se realizaron en pocillos separados usando lipofectamina. Las células se cosecharon en puntos de tiempo seleccionados (por ejemplo, 4 horas, 8 horas, etc.) y se analizó la producción de proteínas respectiva. Para el ARNm de FFL, los lisados celulares se analizaron para determinar la producción de luciferasa mediante ensayos de bioluminiscencia. Para el ARNm de ASS1, se analizaron los lisados celulares para la producción de ASS1 mediante ensayos ELISA. Para el ARNm de CFTR, los lisados celulares se analizaron para la producción de CFTR mediante procedimientos de transferencia de Western
Ensayo de luciferasa
[0100] El ensayo de bioluminiscencia se realizó usando un Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega (Artículo n° E1500). El reactivo de ensayo de luciferasa se preparó añadiendo 10 ml de tampón de ensayo de luciferasa al sustrato de ensayo de luciferasa y mezclar mediante vórtice. Se cargaron 20 pl de muestras de homogeneizado en una placa de 96 pocillos, seguido de 20 pl de control de placa en cada muestra. Por separado, se cargaron 120 pl de reactivo de ensayo de luciferasa (preparado como se describe anteriormente) en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Cada placa se insertó en las cámaras apropiadas usando un instrumento Molecular Device Flex Station y la luminiscencia se midió en unidades de luz relativa (RLU).
Ensayo ELISA ASS1
[0101] Se siguieron los procedimientos ELISA estándar empleando IgG anti-ASS1 2D1-2E12 de ratón como anticuerpo de captura con IgG anti-ASS1 n° 3285 de conejo como anticuerpo secundario (detección) (Shire Human Genetic Therapies). Se usó IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la activación de la solución de sustrato 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La reacción se inactivó usando 2N H2SO4 después de 20 minutos. La detección se controló mediante absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device SpectraMax. El suero y los órganos de ratón sin tratar y la proteína ASS1 humana se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente.
Análisis de transferencia Western CFTR
[0102] Las transferencias Western se realizaron en muestras de proteínas obtenidas usando métodos de inmunoprecipitación (Dynabeads G). En general, las células o los tejidos homogeneizados se procesaron y trataron con Dynabead G previamente unido al anticuerpo anti-CFTR humano (R&D Systems, MAB25031). La detección de la proteína CFTR humana se realizó utilizando Ab570.
Ejemplo 3. Resultados de purificación
[0103] Este ejemplo demuestra que el ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL), el ARNm de sintetasa de argininosuccinato (ASS1) y el ARNm del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) se han purificado con éxito usando precipitación seguido de filtración de flujo tangencial con eliminación de enzimas. reactivos y cortadores. Muchas condiciones caotrópicas típicas se emplearon con éxito para precipitar el ARNm como se enumeró anteriormente.
[0104] Para demostrar este éxito, una producción a gran escala (< 1 gramo) de la mezcla de reacción de CFTR ARNm IVT modificada se sometió a solución de tampón de guanidinio 4 M (descrita anteriormente). La mezcla resultante se trató luego con etanol absoluto y se incubó durante cinco minutos a temperatura ambiente. El aislamiento del ARNm precipitado se logró mediante TFF como se describió anteriormente. La Figura 2 representa un gel de proteína teñido con plata que muestra el ARNm resultante aislado después de TFF empleando las condiciones mencionadas anteriormente. No hay enzima detectable presente al finalizar (polimerasa T7, ADNsa I, pirofosfatasa, inhibidor de ARNasa). Los carriles 1-3 contenían CFTR modificado después de la elución 1 (E1), elución 2 (E2) y elución 3 (E3). Los carriles 4-7 contenían enzimas de control presentes en la reacción IVT. La Figura 3 representa un gel de proteína teñido con plata que muestra ARNm puro resultante de un proceso de precipitación y filtración a mayor escala (lote de 1,5 gramos) que no muestra enzima residual. Los carriles 1-6 contenían ARNm después de las eluciones 1-6. Los carriles 7-10 contenían enzimas de control presentes en la reacción IVT (polimerasa T7, ADNsa I, inhibidor de ARNasa y pirofosfatasa). La Figura 4 demuestra que el ARNm de CFTR modificado está completamente intacto después de dicha purificación. Muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa (1,0%) del ARNm de CFTR modificado después de la purificación mediante precipitación y filtración. El carril 1 contenía una escalera RiboRuler HR. El carril 2-7 contenía ARNm de CFTR modificado purificado por filtración después de la precipitación.
[0105] Este proceso es ampliamente aplicable a múltiples construcciones de ARNm diferentes. Por ejemplo, se sintetizó y purificó una segunda construcción de ARNm usando este método. En este caso, se produjo y precipitó el ARNm de sintetasa de argininosuccinato (ASS1) usando los métodos descritos anteriormente. El precipitado sólido se cargó en el sistema TFF y se aisló de acuerdo con el proceso descrito. La Figura 5 representa un análisis de tinción
de plata del ARNm de ASS1 aislado resultante que no muestra enzima residual presente (polimerasa T7, ADNsa I, inhibidor de ARNasa, pirofosfatasa). Los carriles 1-5 contenían ARNm después de las eluciones 1-5. Los carriles 6-9 contenían enzimas de control presentes en la reacción IVT. El carril 10 contenía RNasa A como control porque las muestras de ARNm se pretrataron con ARNasa A antes de la carga. Como se demostró en la Figura 5, no había enzimas presentes después de una exposición extensa al desarrollo de manchas de plata. Esto se confirmó adicionalmente usando tinción SYPRO para enzimas residuales como se muestra en la Figura 6. Usando este método, uno puede demostrar nuevamente la pureza del ARNm de ASS1 como aislado usando este proceso. Los carriles 1-5 contenían ARNm después de las eluciones 1-5. Los carriles 6-9 contenían enzimas de control presentes en la reacción IVT. Además de esto, la electroforesis en gel de ARN mostró que la integridad del ARNm de ASS1 se mantuvo con ARNm de ASS1 de longitud completa completamente intacto después de este proceso (Figura 7). En la Figura 7, el Carril 1 contenía una escalera RiboRuler HR y los carriles 2-6 contenían ARNm de ASS1 después de las eluciones 1 5.
[0106] Para demostrar aún más que esta técnica de purificación es ampliamente aplicable a múltiples construcciones de ARNm diferentes, se sintetizó y purificó ARNm de FFL usando este método. El ARNm se precipitó usando un sistema de tampón de guanidinio 4 M y se filtró. La Figura 8 representa un análisis de tinción de plata del ARNm de FFL aislado resultante que no muestra enzima residual presente. Los carriles 1-4 contenían ARNm de FFL purificado mediante una precipitación única (XL1) o una precipitación doble (XL2), con los carriles 2-4 que contienen diferentes eluciones de la segunda recuperación de precipitación. Los carriles 6-9 contenían enzimas de control presentes en la reacción IVT. Como se demostró en la Figura 8, no había enzimas presentes después de una exposición extensa al desarrollo de manchas de plata. Además, se puede ver que una sola precipitación parece ser suficiente para eliminar toda la enzima residual no deseada. Esto se confirmó adicionalmente usando tinción SYPRO para enzimas residuales como se muestra en la Figura 9. Usando este método, uno puede demostrar nuevamente la pureza del ARNm de FFL aislado usando este proceso. En la Figura 9, los carriles 1-4 contenían ARNm de FFL purificado mediante una precipitación única (XL1) o una precipitación doble (XL2), con los carriles 2-4 que contenían diferentes eluciones de la segunda recuperación de precipitación. Los carriles 6-9 contenían enzimas de control presentes en la reacción IVT. Además de esto, la electroforesis en gel de ARN mostró que la integridad del ARNm de FFL se mantuvo con ARNm de FFL de longitud completa completamente intacto después de este proceso (Figura 10). Además, el ARNm no muestra diferencias después de múltiples precipitaciones. En la Figura 10, el carril 1 contenía una escalera RiboRuler HR y los carriles 2-5 contenían ARNm de FFL purificado mediante una precipitación única (XL1) o una precipitación doble (XL2).
[0107] Al someter este ARNm aislado adicionalmente para proporcionar un producto final con tapa y cola, los métodos TFF se emplearon adicionalmente para purificar el ARNm diana final. La Figura 11 demuestra que la precipitación, seguida de la captura y elución mediante filtración de flujo tangencial, dio como resultado un producto de ARNm final puro con éxito. En la Figura 11, los carriles 1-3 contenían ARNm de ASS1 de una reacción tapa/cola purificada mediante una única precipitación (E1-3 = elución 1-3). Los carriles 4-6 contenían enzimas de control clave presentes en ambos pasos de reacción. El carril 7 contenía un control de ARNasa I porque las muestras de ARNm se pretrataron con ARNasa I antes de la carga. Además de esto, la electroforesis en gel de ARN mostró que la integridad del ARNm de FFL se mantuvo con el ARNm de FFL de longitud completa completamente intacto después de este proceso (Figura 12). En la Figura 12, los carriles 1-3 contenían ARNm de ASS1 con tapa y cola.
[0108] Si bien dicha caracterización proporciona información con respecto a la pureza y el tamaño/integridad del ARNm, una verdadera medida de la calidad del ARNm reside además en su capacidad para producir la proteína deseada. Por lo tanto, se realizó una comparación de cada una de las construcciones de ARNm de FFL aisladas (TFF frente a columna de rotación). Cada una de las tres construcciones enumeradas a continuación se transfectó en células HEK293T y la producción de proteína FFL correspondiente se evaluó mediante la actividad de la proteína FFL en forma de luminiscencia FFL tras la exposición a luciferina (vida supra). Las células se cosecharon 24 horas después de la transfección.
Construcciones de FFL:
[0109]
1. ARNm de FFL adquirido de un proveedor externo
2. ARNm de FFL purificado mediante un kit comercial
3. ARNm de FFL purificado mediante el método de precipitación-TFF.
[0110] Una comparación de la producción de luminiscencia de la proteína FFL producida a partir de cada una se representa en la Figura 13. La integridad del ARNm de FFL purificado con TFF se mantuvo durante todo el proceso de precipitación y filtración de flujo tangencial en las condiciones descritas.
[0111] Además, se logró la detección exitosa de la proteína CFTR humana a partir de la transfección de ARNm de hCFTR aislado usando el proceso mencionado anteriormente. La Figura 14 muestra la producción exitosa de proteína
Claims (15)
1. Un método para purificar ARN mensajero (ARNm), que comprende
(a) precipitar ARNm de una preparación impura; y
(b) someter la preparación impura que comprende ARNm precipitado a un proceso de purificación que implica filtración por membrana de tal manera que el ARNm precipitado sea capturado por una membrana; y (c) lavar el ARNm precipitado capturado; y (d) eluir el ARNm precipitado capturado de la membrana volviendo a solubilizar el ARNm, dando como resultado una solución de ARNm purificada.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el proceso de purificación que implica filtración de membrana es (i) filtración de flujo tangencial, o (ii) filtración de flujo directo.
3. El método de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la etapa de precipitación de ARNm comprende tratar la preparación impura con una solución que comprende un reactivo seleccionado del grupo que consiste en cloruro de litio, cloruro de potasio, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, acetato de amonio y combinaciones de los mismos, opcionalmente en donde el reactivo es tiocianato de guanidinio.
4. El método de la reivindicación 3, en el que la solución comprende:
(i) tiocianato de guanidinio 4M, lauril sarcosilo sódico al 0,5% y citrato sódico 25 mM;
(ii) tiocianato de guanidinio 4M, y 0,5% de lauril sarcosilo de sodio; o
(iii) tiocianato de guanidinio 4M y citrato de sodio 25 mM.
5. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa de precipitar ARNm comprende una etapa de tratar la preparación impura con etanol absoluto.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana se selecciona del grupo que consiste en polietersulfona (mPES) (no modificada), membrana de fibra hueca de polietersulfona (mPES), fluoruro de polivinilideno (PVDF), acetato de celulosa, nitrocelulosa, MCE (ésteres mixtos de celulosa), polietileno de MW ultra alto (UPE), polifluorotetraetileno (PTFE), nylon, y una combinación de los mismos.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de lavado comprende múltiples ciclos de enjuague usando una solución de lavado que comprende un tampón de guanidinio y etanol, seguido de aproximadamente 70-80% de etanol, opcionalmente en donde los ciclos de enjuague múltiples son más de 5 ciclos.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de elución comprende volver a solubilizar el ARNm precipitado capturado con agua libre de ARNasa, opcionalmente en donde el agua libre de ARNasa se recircula durante 5-10 minutos.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además una etapa de dializar la solución de ARNm purificado, opcionalmente en el que la solución de ARNm purificado se dializa con citrato de sodio 1 mM usando una membrana de límite de peso molecular de 100 kDa (MWCO).
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ARNm se sintetiza in vitro y la preparación impura comprende una mezcla de reacción de síntesis de ARNm in vitro, opcionalmente en donde la preparación impura comprende secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos utilizados en síntesis in vitro.
11. El método de la reivindicación 10, en donde el proceso de purificación que involucra filtración de membrana es filtración de flujo tangencial y en donde la solución de ARNm purificada contiene menos del 1%, menos del 0,5%, menos del 0,1% de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en síntesis in vitro, opcionalmente en donde las secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en síntesis in vitro se miden mediante tinción con plata, electroforesis en gel, HPLC, UPLC y/o electroforesis capilar, opcionalmente en donde (i) las secuencias de ARN abortadas prematuramente comprenden menos de 15 bases, por ejemplo, aproximadamente 8-12 bases, o (ii) los reactivos enzimáticos utilizados en la síntesis in vitro comprenden ARN polimerasa T7, ADNsa I, pirofosfatasa e/o inhibidor de ARNasa.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNm se purifica:
(a) en una escala de 1 gramo, 10 gramo, 100 gramo, 1 kg, 10 kg o 100 kg por lote, y/o
(b)
(i) antes de agregar una tapa y cola al ARNm,
(ii) después de agregar una tapa y cola al ARNm,
(iii) después de agregar una tapa, o
(iv) tanto antes como después de agregarse una tapa y/o cola al ARNm.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNm:
(a) es, o es mayor que, aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb o 20 kb de longitud, y/o
(b) comprende una o más modificaciones para mejorar la estabilidad, opcionalmente en donde la una o más modificaciones comprenden nucleótidos modificados y/o esqueletos de fosfato de azúcar modificados, o no están modificados.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el 95%, 98%, 99% o más del ARNm purificado no se degrada, según lo determinado por electroforesis en gel de agarosa de ARN con respecto al ARNm antes de la purificación.
15. Un método para fabricar ARN mensajero (ARNm) que comprende:
sintetizar ARNm in vitro; y
purificar el ARNm sintetizado in vitro usando un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
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---|---|---|---|---|
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EP2970955B1 (en) * | 2013-03-14 | 2018-11-14 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
US10077439B2 (en) * | 2013-03-15 | 2018-09-18 | Modernatx, Inc. | Removal of DNA fragments in mRNA production process |
SG11201608725YA (en) * | 2014-04-25 | 2016-11-29 | Shire Human Genetic Therapies | Methods for purification of messenger rna |
EP3294885B1 (en) | 2015-05-08 | 2020-07-01 | CureVac Real Estate GmbH | Method for producing rna |
EP3744843A1 (en) | 2015-05-29 | 2020-12-02 | CureVac Real Estate GmbH | A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration |
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DK3585886T3 (da) | 2017-02-27 | 2024-02-19 | Translate Bio Inc | Storskalasyntese af messenger-rna |
EP3658672A1 (en) * | 2017-07-24 | 2020-06-03 | Modernatx, Inc. | Modified mrna encoding a glucose-6-phosphatase and uses thereof |
MA49922A (fr) | 2017-08-18 | 2021-06-02 | Modernatx Inc | Procédés pour analyse par clhp |
CN108486098B (zh) * | 2018-03-06 | 2021-07-06 | 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所) | 一种用SLFN13从总RNA中纯化总mRNA的方法 |
AU2019325702A1 (en) * | 2018-08-24 | 2021-02-25 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger RNA |
MA53609A (fr) * | 2018-09-13 | 2021-07-21 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant la glucose-6-phosphatase pour le traitement de la glycogénose |
CA3105153A1 (en) * | 2018-10-24 | 2020-04-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for the purification of oligonucleotides |
EP3877538A1 (en) | 2018-11-08 | 2021-09-15 | Translate Bio, Inc. | Methods and compositions for messenger rna purification |
WO2020160087A1 (en) * | 2019-01-29 | 2020-08-06 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of separating long polynucleotides from a composition |
CN113396219A (zh) * | 2019-02-11 | 2021-09-14 | 埃泽瑞斯公司 | 通过切向流过滤纯化mRNA |
WO2020168466A1 (en) | 2019-02-19 | 2020-08-27 | Stemirna Therapeutics Co., Ltd. | Modified nucleoside and synthetic methods thereof |
KR20220029556A (ko) | 2019-05-15 | 2022-03-08 | 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 | 전령 rna의 정제 방법 |
US20210009987A1 (en) * | 2019-07-10 | 2021-01-14 | Locana, Inc. | Rna-targeting knockdown and replacement compositions and methods for use |
KR20220038365A (ko) | 2019-07-23 | 2022-03-28 | 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 | Mrna-로딩된 지질 나노입자의 안정한 조성물 및 제조 방법 |
CN214973877U (zh) | 2019-08-09 | 2021-12-03 | 胡桃钳医疗公司 | 用于形成治疗性多核苷酸的微流体设备及微流体路径装置 |
CA3155003A1 (en) | 2019-09-20 | 2021-03-25 | Translate Bio, Inc. | Mrna encoding engineered cftr |
JP2022552286A (ja) | 2019-10-09 | 2022-12-15 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | メッセンジャーrnaの組成物、方法および使用 |
EP4048316A1 (en) | 2019-10-21 | 2022-08-31 | Translate Bio, Inc. | Compositions, methods and uses of messenger rna |
CN115461042A (zh) | 2019-12-20 | 2022-12-09 | 翻译生物公司 | 制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法 |
US20230051811A1 (en) | 2019-12-20 | 2023-02-16 | Translate Bio, Inc | Rectal delivery of messenger rna |
US11576966B2 (en) | 2020-02-04 | 2023-02-14 | CureVac SE | Coronavirus vaccine |
CN115443338A (zh) | 2020-02-10 | 2022-12-06 | 翻译生物公司 | 用于信使rna纯化的方法和组合物 |
AU2021224892A1 (en) | 2020-02-18 | 2022-10-13 | Translate Bio, Inc. | Improved processes for in vitro transcription of messenger RNA |
JP2023514450A (ja) | 2020-02-25 | 2023-04-05 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | Mrna担持脂質ナノ粒子を調製する改善された方法 |
CN113521268A (zh) | 2020-04-22 | 2021-10-22 | 生物技术Rna制药有限公司 | 冠状病毒疫苗 |
CA3177940A1 (en) | 2020-05-07 | 2021-11-11 | Anusha DIAS | Optimized nucleotide sequences encoding sars-cov-2 antigens |
WO2021226463A1 (en) | 2020-05-07 | 2021-11-11 | Translate Bio, Inc. | Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia |
EP4146342A1 (en) | 2020-05-07 | 2023-03-15 | Translate Bio, Inc. | Improved compositions for cftr mrna therapy |
JP2023528586A (ja) * | 2020-05-12 | 2023-07-05 | クランフィールド ユニヴァーシティー | Rnaを用いた治療薬の合成方法及び合成モジュール式装置 |
AU2021273502A1 (en) | 2020-05-15 | 2023-02-02 | Translate Bio, Inc. | Lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery |
JP2023544167A (ja) * | 2020-10-01 | 2023-10-20 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | メッセンジャーrnaの精製のための方法 |
EP4225268A1 (en) | 2020-10-06 | 2023-08-16 | Translate Bio, Inc. | Improved process and formulation of lipid nanoparticles |
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JP2023545128A (ja) | 2020-10-12 | 2023-10-26 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | mRNA搭載脂質ナノ粒子を製造する改善された方法 |
WO2022082001A1 (en) | 2020-10-15 | 2022-04-21 | Translate Bio, Inc. | Large scale synthesis of messenger rna |
EP4240326A1 (en) | 2020-11-09 | 2023-09-13 | Translate Bio, Inc. | Improved compositions for delivery of codon-optimized mrna |
IL303165A (en) | 2020-11-25 | 2023-07-01 | Translate Bio Inc | Stable liquid formulations of lipid nanoparticles |
AU2021405281A1 (en) | 2020-12-22 | 2023-07-06 | CureVac SE | Rna vaccine against sars-cov-2 variants |
EP4277929A1 (en) | 2021-01-14 | 2023-11-22 | Translate Bio, Inc. | Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies |
EP4313115A1 (en) | 2021-03-25 | 2024-02-07 | Translate Bio, Inc. | Optimized nucleotide sequences encoding the extracellular domain of human ace2 protein or a portion thereof |
EP4326338A1 (en) | 2021-04-19 | 2024-02-28 | Translate Bio, Inc. | Improved compositions for delivery of mrna |
EP4330427A1 (en) | 2021-04-29 | 2024-03-06 | Translate Bio, Inc. | Methods for measuring poly a tail length |
KR20240021170A (ko) | 2021-05-12 | 2024-02-16 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 변형된 mRNA, 변형된 비-코딩 RNA, 및 그의 용도 |
WO2023278754A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-05 | Translate Bio, Inc. | Compositions for delivery of mrna |
WO2023086893A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Translate Bio, Inc. | Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia |
WO2023150256A1 (en) * | 2022-02-03 | 2023-08-10 | Modernatx, Inc. | Continuous precipitation for mrna purification |
JP2023181989A (ja) | 2022-06-13 | 2023-12-25 | 上海臻上医薬科技有限公司 | マイクロニードル注射製剤およびその使用 |
US11878055B1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-23 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
Family Cites Families (493)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2647121A (en) | 1951-02-02 | 1953-07-28 | Ruth P Jacoby | Diamine-bis-acetamides |
US2819718A (en) | 1953-07-16 | 1958-01-14 | Isidore H Goldman | Drainage tube |
US2717909A (en) | 1953-09-24 | 1955-09-13 | Monsanto Chemicals | Hydroxyethyl-keryl-alkylene-ammonium compounds |
US2844629A (en) | 1956-04-25 | 1958-07-22 | American Home Prod | Fatty acid amides and derivatives thereof |
US3096560A (en) | 1958-11-21 | 1963-07-09 | William J Liebig | Process for synthetic vascular implants |
FR1378382A (fr) | 1962-12-01 | 1964-11-13 | Sandoz Sa | Amides de l'acide amino-propionique, utilisables en particulier pour le traitement des fibres textiles |
GB1072118A (en) | 1962-12-01 | 1967-06-14 | Sandoz Ag | Amides of aminopropionic acid |
JPS5141663B1 (es) | 1966-03-12 | 1976-11-11 | ||
JPS4822365B1 (es) | 1968-10-25 | 1973-07-05 | ||
NL143127B (nl) | 1969-02-04 | 1974-09-16 | Rhone Poulenc Sa | Versterkingsorgaan voor een defecte hartklep. |
US3614955A (en) | 1970-02-09 | 1971-10-26 | Medtronic Inc | Standby defibrillator and method of operation |
US3614954A (en) | 1970-02-09 | 1971-10-26 | Medtronic Inc | Electronic standby defibrillator |
JPS5024216B1 (es) | 1970-12-29 | 1975-08-14 | ||
JPS5012146Y2 (es) | 1971-07-27 | 1975-04-15 | ||
US3945052A (en) | 1972-05-01 | 1976-03-23 | Meadox Medicals, Inc. | Synthetic vascular graft and method for manufacturing the same |
US3805301A (en) | 1972-07-28 | 1974-04-23 | Meadox Medicals Inc | Tubular grafts having indicia thereon |
JPS49127908A (es) | 1973-04-20 | 1974-12-07 | ||
JPS5624664B2 (es) | 1973-06-28 | 1981-06-08 | ||
US4013507A (en) | 1973-09-18 | 1977-03-22 | California Institute Of Technology | Ionene polymers for selectively inhibiting the vitro growth of malignant cells |
JPS5123537A (ja) | 1974-04-26 | 1976-02-25 | Adeka Argus Chemical Co Ltd | Kasozaisoseibutsu |
GB1527592A (en) | 1974-08-05 | 1978-10-04 | Ici Ltd | Wound dressing |
US3995623A (en) | 1974-12-23 | 1976-12-07 | American Hospital Supply Corporation | Multipurpose flow-directed catheter |
JPS5813576B2 (ja) | 1974-12-27 | 1983-03-14 | アデカ ア−ガスカガク カブシキガイシヤ | 安定化された合成高分子組成物 |
DE2520814A1 (de) | 1975-05-09 | 1976-11-18 | Bayer Ag | Lichtstabilisierung von polyurethanen |
US4281669A (en) | 1975-05-09 | 1981-08-04 | Macgregor David C | Pacemaker electrode with porous system |
JPS5210847A (en) | 1975-07-16 | 1977-01-27 | Nippon Steel Corp | Pinch roll |
US4096860A (en) | 1975-10-08 | 1978-06-27 | Mclaughlin William F | Dual flow encatheter |
CA1069652A (en) | 1976-01-09 | 1980-01-15 | Alain F. Carpentier | Supported bioprosthetic heart valve with compliant orifice ring |
US4134402A (en) | 1976-02-11 | 1979-01-16 | Mahurkar Sakharam D | Double lumen hemodialysis catheter |
US4072146A (en) | 1976-09-08 | 1978-02-07 | Howes Randolph M | Venous catheter device |
US4335723A (en) | 1976-11-26 | 1982-06-22 | The Kendall Company | Catheter having inflatable retention means |
US4099528A (en) | 1977-02-17 | 1978-07-11 | Sorenson Research Co., Inc. | Double lumen cannula |
US4140126A (en) | 1977-02-18 | 1979-02-20 | Choudhury M Hasan | Method for performing aneurysm repair |
US4265745A (en) | 1977-05-25 | 1981-05-05 | Teijin Limited | Permselective membrane |
US4182833A (en) | 1977-12-07 | 1980-01-08 | Celanese Polymer Specialties Company | Cationic epoxide-amine reaction products |
US4180068A (en) | 1978-04-13 | 1979-12-25 | Motion Control, Incorporated | Bi-directional flow catheter with retractable trocar/valve structure |
DE2960875D1 (en) | 1978-04-19 | 1981-12-10 | Ici Plc | A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning |
US4284459A (en) | 1978-07-03 | 1981-08-18 | The Kendall Company | Method for making a molded catheter |
US4227533A (en) | 1978-11-03 | 1980-10-14 | Bristol-Myers Company | Flushable urinary catheter |
US4375817A (en) | 1979-07-19 | 1983-03-08 | Medtronic, Inc. | Implantable cardioverter |
US4500707A (en) | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
US5132418A (en) | 1980-02-29 | 1992-07-21 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
DE3010841A1 (de) | 1980-03-21 | 1981-10-08 | Ulrich Dr.med. 6936 Haag Uthmann | Katheder |
US4308085A (en) | 1980-07-28 | 1981-12-29 | Jenoptik Jena Gmbh | Process for the preparation of high molecular thermoplastic epoxide-amine-polyadducts |
US4973679A (en) | 1981-03-27 | 1990-11-27 | University Patents, Inc. | Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates |
US4668777A (en) | 1981-03-27 | 1987-05-26 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite nucleoside compounds |
US4415732A (en) | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
US4339369A (en) | 1981-04-23 | 1982-07-13 | Celanese Corporation | Cationic epoxide-amine reaction products |
US4401796A (en) | 1981-04-30 | 1983-08-30 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
US4373071A (en) | 1981-04-30 | 1983-02-08 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
US4406656A (en) | 1981-06-01 | 1983-09-27 | Brack Gillium Hattler | Venous catheter having collapsible multi-lumens |
US4475972A (en) | 1981-10-01 | 1984-10-09 | Ontario Research Foundation | Implantable material |
US4401472A (en) | 1982-02-26 | 1983-08-30 | Martin Marietta Corporation | Hydraulic cement mixes and processes for improving hydraulic cement mixes |
US4568329A (en) | 1982-03-08 | 1986-02-04 | Mahurkar Sakharam D | Double lumen catheter |
US4546499A (en) | 1982-12-13 | 1985-10-15 | Possis Medical, Inc. | Method of supplying blood to blood receiving vessels |
US4530113A (en) | 1983-05-20 | 1985-07-23 | Intervascular, Inc. | Vascular grafts with cross-weave patterns |
US4550447A (en) | 1983-08-03 | 1985-11-05 | Shiley Incorporated | Vascular graft prosthesis |
US4647416A (en) | 1983-08-03 | 1987-03-03 | Shiley Incorporated | Method of preparing a vascular graft prosthesis |
US5104399A (en) | 1986-12-10 | 1992-04-14 | Endovascular Technologies, Inc. | Artificial graft and implantation method |
US4710169A (en) | 1983-12-16 | 1987-12-01 | Christopher T Graham | Urinary catheter with collapsible urethral tube |
US4571241A (en) | 1983-12-16 | 1986-02-18 | Christopher T Graham | Urinary catheter with collapsible urethral tube |
US4737518A (en) | 1984-04-03 | 1988-04-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Lipid derivatives, their production and use |
US4562596A (en) | 1984-04-25 | 1986-01-07 | Elliot Kornberg | Aortic graft, device and method for performing an intraluminal abdominal aortic aneurysm repair |
US4782836A (en) | 1984-05-24 | 1988-11-08 | Intermedics, Inc. | Rate adaptive cardiac pacemaker responsive to patient activity and temperature |
US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4662382A (en) | 1985-01-16 | 1987-05-05 | Intermedics, Inc. | Pacemaker lead with enhanced sensitivity |
US4762915A (en) | 1985-01-18 | 1988-08-09 | Liposome Technology, Inc. | Protein-liposome conjugates |
US4860751A (en) | 1985-02-04 | 1989-08-29 | Cordis Corporation | Activity sensor for pacemaker control |
US5223263A (en) | 1988-07-07 | 1993-06-29 | Vical, Inc. | Liponucleotide-containing liposomes |
CA1320724C (en) | 1985-07-19 | 1993-07-27 | Koichi Kanehira | Terpene amino alcohols and medicinal uses thereof |
US4701162A (en) | 1985-09-24 | 1987-10-20 | The Kendall Company | Foley catheter assembly |
US4737323A (en) | 1986-02-13 | 1988-04-12 | Liposome Technology, Inc. | Liposome extrusion method |
US5153319A (en) | 1986-03-31 | 1992-10-06 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
DE3616824A1 (de) | 1986-05-17 | 1987-11-19 | Schering Ag | Verwendung von haertbaren kunstharzmischungen fuer oberflaechenbeschichtungen und druckfarben und verfahren zu ihrer herstellung |
EP0255899B1 (de) | 1986-07-31 | 1992-07-15 | Werner Prof. Dr.-Ing. Irnich | Frequenzadaptierender Herzschrittmacher |
US4960409A (en) | 1986-09-11 | 1990-10-02 | Catalano Marc L | Method of using bilumen peripheral venous catheter with adapter |
JPH0829776B2 (ja) | 1986-10-29 | 1996-03-27 | 東燃化学株式会社 | 合成樹脂製容器及びその製造用金型 |
US4720517A (en) | 1986-11-24 | 1988-01-19 | Ciba-Geigy Corporation | Compositions stabilized with N-hydroxyiminodiacetic and dipropionic acids and esters thereof |
US4920016A (en) | 1986-12-24 | 1990-04-24 | Linear Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
DE3728917A1 (de) | 1987-08-29 | 1989-03-09 | Roth Hermann J | Neue lipide mit unsymmetrisch substituierter disulfidbruecke |
US4946683A (en) | 1987-11-18 | 1990-08-07 | Vestar, Inc. | Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes |
US4843155A (en) | 1987-11-19 | 1989-06-27 | Piotr Chomczynski | Product and process for isolating RNA |
US5138067A (en) | 1987-12-17 | 1992-08-11 | Shionogi & Co. Ltd. | Lipid derivatives |
US5047540A (en) | 1987-12-17 | 1991-09-10 | Shionogi & Co., Ltd. | Lipid derivatives |
US4892540A (en) | 1988-04-21 | 1990-01-09 | Sorin Biomedica S.P.A. | Two-leaflet prosthetic heart valve |
US5176661A (en) | 1988-09-06 | 1993-01-05 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Composite vascular catheter |
US5024671A (en) | 1988-09-19 | 1991-06-18 | Baxter International Inc. | Microporous vascular graft |
US5200395A (en) | 1988-10-18 | 1993-04-06 | Ajinomoto Company, Inc. | Pharmaceutical composition of BUF-5 for treating anemia |
CA2001401A1 (en) | 1988-10-25 | 1990-04-25 | Claude Piantadosi | Quaternary amine containing ether or ester lipid derivatives and therapeutic compositions |
US5262530A (en) | 1988-12-21 | 1993-11-16 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
US5047524A (en) | 1988-12-21 | 1991-09-10 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US6214804B1 (en) | 1989-03-21 | 2001-04-10 | Vical Incorporated | Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence |
NL8900725A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
FR2645866B1 (fr) | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
US5194654A (en) | 1989-11-22 | 1993-03-16 | Vical, Inc. | Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use |
US5863770A (en) * | 1989-08-22 | 1999-01-26 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Stable meterologous propagation of CFTR protein variant cDNA |
US5279833A (en) | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
US5101824A (en) | 1990-04-16 | 1992-04-07 | Siemens-Pacesetter, Inc. | Rate-responsive pacemaker with circuitry for processing multiple sensor inputs |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
US5405379A (en) | 1990-07-26 | 1995-04-11 | Lane; Rodney J. | Self expanding vascular endoprosthesis for aneurysms |
US5693338A (en) | 1994-09-29 | 1997-12-02 | Emisphere Technologies, Inc. | Diketopiperazine-based delivery systems |
JPH0765267B2 (ja) | 1990-08-22 | 1995-07-12 | 花王株式会社 | 柔軟仕上剤 |
US5256294A (en) | 1990-09-17 | 1993-10-26 | Genentech, Inc. | Tangential flow filtration process and apparatus |
DE9117152U1 (de) | 1990-10-09 | 1996-07-11 | Cook Inc | Stent |
ATE120971T1 (de) | 1990-12-19 | 1995-04-15 | Osypka Peter | Herzschrittmacherleitung mit einem inneren kanal und mit einem elektrodenkopf. |
US5116360A (en) | 1990-12-27 | 1992-05-26 | Corvita Corporation | Mesh composite graft |
JP2547524Y2 (ja) | 1991-01-22 | 1997-09-10 | 東洋ラジエーター株式会社 | オイルクーラ |
US5405363A (en) | 1991-03-15 | 1995-04-11 | Angelon Corporation | Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume |
US5330768A (en) | 1991-07-05 | 1994-07-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends |
US5545449A (en) | 1991-10-02 | 1996-08-13 | Weyerhaeuser Company | Polyether-reinforced fiber-based materials |
US5151105A (en) | 1991-10-07 | 1992-09-29 | Kwan Gett Clifford | Collapsible vessel sleeve implant |
US5284491A (en) | 1992-02-27 | 1994-02-08 | Medtronic, Inc. | Cardiac pacemaker with hysteresis behavior |
US5352461A (en) | 1992-03-11 | 1994-10-04 | Pharmaceutical Discovery Corporation | Self assembling diketopiperazine drug delivery system |
SE9200951D0 (sv) | 1992-03-27 | 1992-03-27 | Kabi Pharmacia Ab | Pharmaceutical composition containing a defined lipid system |
CA2132342A1 (en) | 1992-04-06 | 1993-10-14 | Kenneth F. Buechler | Novel opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels |
US6670178B1 (en) | 1992-07-10 | 2003-12-30 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy |
KR950702628A (ko) | 1992-08-01 | 1995-07-29 | 치세이 라 | 항알레르기 조성물(Antiallergic agent) |
US5334761A (en) | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
US5461223A (en) | 1992-10-09 | 1995-10-24 | Eastman Kodak Company | Bar code detecting circuitry |
US5300022A (en) | 1992-11-12 | 1994-04-05 | Martin Klapper | Urinary catheter and bladder irrigation system |
US5496362A (en) | 1992-11-24 | 1996-03-05 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Implantable conformal coil patch electrode with multiple conductive elements for cardioversion and defibrillation |
US5552155A (en) | 1992-12-04 | 1996-09-03 | The Liposome Company, Inc. | Fusogenic lipsomes and methods for making and using same |
US5716395A (en) | 1992-12-11 | 1998-02-10 | W.L. Gore & Associates, Inc. | Prosthetic vascular graft |
WO1994018987A1 (en) | 1993-02-19 | 1994-09-01 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Drug composition containing nucleic acid copolymer |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
US5697953A (en) | 1993-03-13 | 1997-12-16 | Angeion Corporation | Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume |
US5624976A (en) | 1994-03-25 | 1997-04-29 | Dentsply Gmbh | Dental filling composition and method |
US5314430A (en) | 1993-06-24 | 1994-05-24 | Medtronic, Inc. | Atrial defibrillator employing transvenous and subcutaneous electrodes and method of use |
DE4321904B4 (de) | 1993-07-01 | 2013-05-16 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen |
DE4325848A1 (de) | 1993-07-31 | 1995-02-02 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin |
EP0875280B1 (en) | 1993-10-06 | 2001-08-22 | The Kansai Electric Power Co., Inc. | Method for removing carbon dioxide from combustion exhaust gas |
US5609624A (en) | 1993-10-08 | 1997-03-11 | Impra, Inc. | Reinforced vascular graft and method of making same |
SE9303481L (sv) | 1993-10-22 | 1995-04-23 | Berol Nobel Ab | Hygienkomposition |
AU1091095A (en) | 1993-11-08 | 1995-05-29 | Harrison M. Lazarus | Intraluminal vascular graft and method |
JPH09505593A (ja) | 1993-11-24 | 1997-06-03 | メガバイオス・コーポレイション | ピペラジンの両親媒性誘導体 |
US5595756A (en) | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
US5464924A (en) | 1994-01-07 | 1995-11-07 | The Dow Chemical Company | Flexible poly(amino ethers) for barrier packaging |
ATE302208T1 (de) * | 1994-02-11 | 2005-09-15 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur trennung von doppelstrang/einzelstrangnukleinsäurestrukturen |
US5844107A (en) | 1994-03-23 | 1998-12-01 | Case Western Reserve University | Compacted nucleic acids and their delivery to cells |
WO1995027478A1 (en) | 1994-04-12 | 1995-10-19 | The Liposome Company, Inc. | Fusogenic liposomes and methods of making and using same |
US5776747A (en) | 1994-07-20 | 1998-07-07 | Cytotherapeutics, Inc. | Method for controlling the distribution of cells within a bioartificial organ using polycthylene oxide-poly (dimethylsiloxane) copolymer |
US5820873A (en) | 1994-09-30 | 1998-10-13 | The University Of British Columbia | Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof |
US5885613A (en) | 1994-09-30 | 1999-03-23 | The University Of British Columbia | Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes |
US5641665A (en) | 1994-11-28 | 1997-06-24 | Vical Incorporated | Plasmids suitable for IL-2 expression |
US6071890A (en) | 1994-12-09 | 2000-06-06 | Genzyme Corporation | Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy |
US5965434A (en) | 1994-12-29 | 1999-10-12 | Wolff; Jon A. | Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds |
US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US5830430A (en) | 1995-02-21 | 1998-11-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Cationic lipids and the use thereof |
EP0822835A1 (en) | 1995-04-17 | 1998-02-11 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Hybrid magnetic resonance contrast agents |
US20010047091A1 (en) * | 1998-09-09 | 2001-11-29 | Brian Miki | Cryptic regulatory elements obtained from plants |
US5772694A (en) | 1995-05-16 | 1998-06-30 | Medical Carbon Research Institute L.L.C. | Prosthetic heart valve with improved blood flow |
US5700642A (en) | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
US5783383A (en) | 1995-05-23 | 1998-07-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method of detecting cytomegalovirus (CMV) |
US5705385A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5609629A (en) | 1995-06-07 | 1997-03-11 | Med Institute, Inc. | Coated implantable medical device |
US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
JP4335310B2 (ja) | 1995-06-07 | 2009-09-30 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用 |
US5981501A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
US5607385A (en) | 1995-08-17 | 1997-03-04 | Medtronic, Inc. | Device and algorithm for a combined cardiomyostimulator and a cardiac pacer-carioverter-defibrillator |
US5744335A (en) | 1995-09-19 | 1998-04-28 | Mirus Corporation | Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein |
FR2740978B1 (fr) | 1995-11-10 | 1998-01-02 | Ela Medical Sa | Dispositif medical actif du type defibrillateur/cardioverteur implantable |
US5874105A (en) | 1996-01-31 | 1999-02-23 | Collaborative Laboratories, Inc. | Lipid vesicles formed with alkylammonium fatty acid salts |
US6417326B1 (en) | 1996-04-11 | 2002-07-09 | The University Of British Columbia | Fusogenic liposomes |
US5935936A (en) | 1996-06-03 | 1999-08-10 | Genzyme Corporation | Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules |
US5913848A (en) | 1996-06-06 | 1999-06-22 | Luther Medical Products, Inc. | Hard tip over-the-needle catheter and method of manufacturing the same |
US5677124A (en) | 1996-07-03 | 1997-10-14 | Ambion, Inc. | Ribonuclease resistant viral RNA standards |
JP3734189B2 (ja) | 1996-07-19 | 2006-01-11 | 株式会社小松製作所 | 2ピースブーム型建設機械のストロークエンドショック低減装置 |
EP0921780A1 (en) | 1996-07-23 | 1999-06-16 | Raymond L. Mitchell | Wheelchair propulsion kit |
US5736573A (en) | 1996-07-31 | 1998-04-07 | Galat; Alexander | Lipid and water soluble derivatives of drugs |
US6011148A (en) * | 1996-08-01 | 2000-01-04 | Megabios Corporation | Methods for purifying nucleic acids |
US7288266B2 (en) | 1996-08-19 | 2007-10-30 | United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Liposome complexes for increased systemic delivery |
CA2264140A1 (en) | 1996-08-26 | 1998-03-05 | Transgene S.A. | Cationic lipid-nucleic acid complexes |
ES2305157T3 (es) | 1996-09-13 | 2008-11-01 | Lipoxen Technologies Limited | Liposomas. |
TW520297B (en) | 1996-10-11 | 2003-02-11 | Sequus Pharm Inc | Fusogenic liposome composition and method |
WO1998019709A2 (en) | 1996-11-04 | 1998-05-14 | Qiagen Gmbh | Cationic reagents for transfection |
US6887665B2 (en) | 1996-11-14 | 2005-05-03 | Affymetrix, Inc. | Methods of array synthesis |
CN1244215B (zh) | 1996-11-20 | 2010-11-03 | 荷兰克鲁塞尔公司 | 改进的腺病毒载体生产和纯化方法 |
US5985930A (en) * | 1996-11-21 | 1999-11-16 | Pasinetti; Giulio M. | Treatment of neurodegenerative conditions with nimesulide |
US6204297B1 (en) | 1996-11-26 | 2001-03-20 | Rhodia Inc. | Nonionic gemini surfactants |
JPH10197978A (ja) | 1997-01-09 | 1998-07-31 | Mitsubishi Paper Mills Ltd | ハロゲン化銀写真感光材料 |
EP0853123A1 (de) | 1997-01-10 | 1998-07-15 | Roche Diagnostics GmbH | Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration |
FR2760193B1 (fr) | 1997-02-28 | 1999-05-28 | Transgene Sa | Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules |
US5837283A (en) | 1997-03-12 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells |
US5945326A (en) | 1997-03-20 | 1999-08-31 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease |
US6835395B1 (en) | 1997-05-14 | 2004-12-28 | The University Of British Columbia | Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles |
DE69841002D1 (de) | 1997-05-14 | 2009-09-03 | Univ British Columbia | Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln |
US20030104044A1 (en) | 1997-05-14 | 2003-06-05 | Semple Sean C. | Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response |
JPH115786A (ja) | 1997-06-13 | 1999-01-12 | Pola Chem Ind Inc | 新規アミノヒドロキシプロピルピペラジン誘導体 |
WO1998059076A1 (en) | 1997-06-25 | 1998-12-30 | Promega Corporation | Method of isolating rna |
EP1007683A1 (en) * | 1997-07-12 | 2000-06-14 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Coffee storage proteins |
US6067471A (en) | 1998-08-07 | 2000-05-23 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Atrial and ventricular implantable cardioverter-defibrillator and lead system |
JPH1180142A (ja) | 1997-09-05 | 1999-03-26 | Pola Chem Ind Inc | ジフェニルアルキル化合物の製造法 |
AU9319398A (en) | 1997-09-19 | 1999-04-05 | Sequitur, Inc. | Sense mrna therapy |
DE19746874A1 (de) | 1997-10-23 | 1999-04-29 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen |
US6165763A (en) | 1997-10-30 | 2000-12-26 | Smithkline Beecham Corporation | Ornithine carbamoyltransferase |
US5972613A (en) | 1997-12-09 | 1999-10-26 | The Perkin-Elmer Corporation | Methods of nucleic acid isolation |
US6096075A (en) | 1998-01-22 | 2000-08-01 | Medical Carbon Research Institute, Llc | Prosthetic heart valve |
US6617171B2 (en) | 1998-02-27 | 2003-09-09 | The General Hospital Corporation | Methods for diagnosing and treating autoimmune disease |
US20020115135A1 (en) * | 1998-03-06 | 2002-08-22 | Henry Yue | Synapse related glycoproteins |
US6271209B1 (en) | 1998-04-03 | 2001-08-07 | Valentis, Inc. | Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors |
US6176877B1 (en) | 1998-04-20 | 2001-01-23 | St. Jude Medical, Inc. | Two piece prosthetic heart valve |
US6986902B1 (en) | 1998-04-28 | 2006-01-17 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Polyanionic polymers which enhance fusogenicity |
DE19822602A1 (de) | 1998-05-20 | 1999-11-25 | Goldschmidt Ag Th | Verfahren zur Herstellung von Polyaminosäureestern durch Veresterung von sauren Polyaminosäuren oder Umesterung von Polyaminosäureestern |
NO313244B1 (no) | 1998-07-08 | 2002-09-02 | Crew Dev Corp | Fremgangsmåte for isolering og produksjon av magnesitt eller magnesiumklorid |
US6055454A (en) | 1998-07-27 | 2000-04-25 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Cardiac pacemaker with automatic response optimization of a physiologic sensor based on a second sensor |
US6299604B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-10-09 | Cook Incorporated | Coated implantable medical device |
US6210892B1 (en) | 1998-10-07 | 2001-04-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing |
US20030064951A1 (en) * | 1998-11-12 | 2003-04-03 | Valentis, Inc. | Methods for purifying nucleic acids |
WO2000030444A1 (en) | 1998-11-25 | 2000-06-02 | Vanderbilt University | Cationic liposomes for gene transfer |
US6248725B1 (en) | 1999-02-23 | 2001-06-19 | Amgen, Inc. | Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction |
US6379698B1 (en) | 1999-04-06 | 2002-04-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Fusogenic lipids and vesicles |
WO2000062813A2 (en) | 1999-04-20 | 2000-10-26 | The University Of British Columbia | Cationic peg-lipids and methods of use |
CN1244376C (zh) | 1999-04-23 | 2006-03-08 | 阿尔萨公司 | 可释放的键和含有该键的组合物 |
US6169923B1 (en) | 1999-04-23 | 2001-01-02 | Pacesetter, Inc. | Implantable cardioverter-defibrillator with automatic arrhythmia detection criteria adjustment |
US6794140B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-09-21 | Andrew Simon Goldsborough | Isolation of nucleic acid |
ATE369384T1 (de) | 1999-05-19 | 2007-08-15 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine |
US6696424B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-02-24 | Vical Incorporated | Cytofectin dimers and methods of use thereof |
US6346382B1 (en) | 1999-06-01 | 2002-02-12 | Vanderbilt University | Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto |
US20020010145A1 (en) | 1999-07-12 | 2002-01-24 | Willson Richard C. | Apparatus, methods and compositions for biotechnical separations |
EP1202714A1 (en) | 1999-07-16 | 2002-05-08 | Purdue Research Foundation | Vinyl ether lipids with cleavable hydrophilic headgroups |
US6313285B1 (en) | 1999-07-23 | 2001-11-06 | Genentech, Inc. | Purification of plasmid DNA |
US6358278B1 (en) | 1999-09-24 | 2002-03-19 | St. Jude Medical, Inc. | Heart valve prosthesis with rotatable cuff |
US6371983B1 (en) | 1999-10-04 | 2002-04-16 | Ernest Lane | Bioprosthetic heart valve |
US7060291B1 (en) | 1999-11-24 | 2006-06-13 | Transave, Inc. | Modular targeted liposomal delivery system |
CN1433478A (zh) | 1999-12-30 | 2003-07-30 | 诺瓦提斯公司 | 用于基因治疗的新的胶体合成载体 |
JP3460673B2 (ja) * | 2000-02-04 | 2003-10-27 | 浜松ホトニクス株式会社 | 特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法 |
EP1261379A2 (en) | 2000-02-17 | 2002-12-04 | Genzyme Corporation | Genetic modification of the lung as a portal for gene delivery |
US6370434B1 (en) | 2000-02-28 | 2002-04-09 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Cardiac lead and method for lead implantation |
US6565960B2 (en) | 2000-06-01 | 2003-05-20 | Shriners Hospital Of Children | Polymer composite compositions |
IL138474A0 (en) | 2000-09-14 | 2001-10-31 | Epox Ltd | Highly branched water-soluble polyamine oligomers, process for their preparation and applications thereof |
USRE43612E1 (en) | 2000-10-10 | 2012-08-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof |
US7427394B2 (en) | 2000-10-10 | 2008-09-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof |
US6998115B2 (en) | 2000-10-10 | 2006-02-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof |
CA2426244A1 (en) | 2000-10-25 | 2002-05-02 | The University Of British Columbia | Lipid formulations for target delivery |
GB0028361D0 (en) | 2000-11-21 | 2001-01-03 | Glaxo Group Ltd | Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components |
US20020094528A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-07-18 | Salafsky Joshua S. | Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interations |
JP2002167368A (ja) | 2000-12-01 | 2002-06-11 | Nitto Denko Corp | アルキル置換デンドリマーおよびその製造法 |
US20050004058A1 (en) | 2000-12-07 | 2005-01-06 | Patrick Benoit | Sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses thereof |
JP2004527236A (ja) * | 2001-02-14 | 2004-09-09 | ベイラー カレッジ オブ メディスン | Rna増幅の方法及び組成物 |
DE10109897A1 (de) | 2001-02-21 | 2002-11-07 | Novosom Ag | Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser |
US20020192721A1 (en) | 2001-03-28 | 2002-12-19 | Engeneos, Inc. | Modular molecular clasps and uses thereof |
KR100823815B1 (ko) | 2001-04-23 | 2008-04-21 | 신에쓰 가가꾸 고교 가부시끼가이샤 | 에스테르 구조를 갖는 신규 3급 아민 화합물 및 그 제조방법 |
US6585410B1 (en) | 2001-05-03 | 2003-07-01 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Radiant temperature nulling radiometer |
ES2340532T3 (es) | 2001-06-05 | 2010-06-04 | Curevac Gmbh | Arnm con un contenido g/c aumentado que codifica para un antigeno bacteriano y utilizacion del mismo. |
US7124372B2 (en) | 2001-06-13 | 2006-10-17 | Glen David Brin | Interactive communication between a plurality of users |
US20030044771A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-06 | Anderson Norman G. | Method for discovering new infectious particles |
EP2428571B1 (en) | 2001-09-28 | 2018-07-18 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | MicroRNA molecules |
CA2463317A1 (en) | 2001-10-12 | 2003-04-24 | Gentra Systems, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify rna |
CA2466328A1 (en) | 2001-11-09 | 2003-05-15 | Bayer Healthcare Ag | Isotopically coded affinity markers 3 |
DE10162480A1 (de) | 2001-12-19 | 2003-08-07 | Ingmar Hoerr | Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen |
DE10207178A1 (de) | 2002-02-19 | 2003-09-04 | Novosom Ag | Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen |
US20030170637A1 (en) * | 2002-03-06 | 2003-09-11 | Pirrung Michael C. | Method of analyzing mRNA splice variants |
AU2003220249A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-29 | Arcturus Bioscience, Inc. | Improved nucleic acid amplification |
DE10214983A1 (de) | 2002-04-04 | 2004-04-08 | TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH | Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen |
GB0208390D0 (en) * | 2002-04-11 | 2002-05-22 | Univ London | Adeno-associated virus producer system |
US20060217535A1 (en) * | 2002-05-09 | 2006-09-28 | Debra Yuhas | Hemipteran muscarinic receptor |
US20030215395A1 (en) | 2002-05-14 | 2003-11-20 | Lei Yu | Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier |
US7601367B2 (en) | 2002-05-28 | 2009-10-13 | Mirus Bio Llc | Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations |
DE60230071D1 (de) * | 2002-06-14 | 2009-01-08 | Monier Tadros | Methode für die herstellung von protamin |
WO2004002453A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Protiva Biotherapeutics Ltd. | Method and apparatus for producing liposomes |
DE10229872A1 (de) | 2002-07-03 | 2004-01-29 | Curevac Gmbh | Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA |
US20040028804A1 (en) | 2002-08-07 | 2004-02-12 | Anderson Daniel G. | Production of polymeric microarrays |
EP1539936A2 (en) | 2002-08-22 | 2005-06-15 | Celltran Limited | Cell culture surface |
US20060160759A1 (en) * | 2002-09-28 | 2006-07-20 | Jianzhu Chen | Influenza therapeutic |
JP2006505644A (ja) | 2002-11-04 | 2006-02-16 | ジーイー・バイエル・シリコーンズ・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング・ウント・コンパニー・コマンジツトゲゼルシヤフト | 線状ポリアミノおよび/またはポリアンモニウムポリシロキサン共重合体i |
JP2006515574A (ja) | 2002-11-22 | 2006-06-01 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | 肥満症の治療に使用される化合物 |
US7169892B2 (en) | 2003-01-10 | 2007-01-30 | Astellas Pharma Inc. | Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems |
KR100774067B1 (ko) | 2003-01-20 | 2007-11-06 | 아사히 가세이 일렉트로닉스 가부시끼가이샤 | 포인팅 디바이스 |
AU2004217437B2 (en) | 2003-03-05 | 2009-11-19 | Senesco Technologies, Inc. | Use of antisense oligonucleotides or siRNA to suppress expression of eIF-5A1 |
US7267950B2 (en) | 2003-05-01 | 2007-09-11 | Veridex, Lcc | Rapid extraction of RNA from cells and tissues |
US20040224912A1 (en) | 2003-05-07 | 2004-11-11 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of PAI-1 mRNA-binding protein expression |
US7619017B2 (en) | 2003-05-19 | 2009-11-17 | Wacker Chemical Corporation | Polymer emulsions resistant to biodeterioration |
WO2005007810A2 (en) | 2003-06-16 | 2005-01-27 | Grinstaff Mark W | Functional synthetic molecules and macromolecules for gene delivery |
US20050059024A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for isolating small RNA molecules |
US20050042660A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Hall Gerald Edward | Devices and methods for isolating RNA |
NZ592917A (en) | 2003-09-15 | 2012-12-21 | Protiva Biotherapeutics Inc | Stable polyethyleneglycol (PEG) dialkyloxypropyl (DAA) lipid conjugates |
WO2005028619A2 (en) | 2003-09-15 | 2005-03-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and screening thereof |
US20050069590A1 (en) | 2003-09-30 | 2005-03-31 | Buehler Gail K. | Stable suspensions for medicinal dosages |
AU2004279991B2 (en) | 2003-10-10 | 2010-11-25 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid constructs |
WO2005037226A2 (en) | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Georgia Tech Research Corporation | Genetically engineered enteroendocrine cells for treating glucose-related metabolic disorders |
EP1683784A4 (en) | 2003-11-10 | 2007-08-22 | Nippon Kayaku Kk | DIIMONIUM SALT CONNECTION AND ITS USE |
US7318898B2 (en) * | 2003-11-18 | 2008-01-15 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Polymeric membrane wafer assembly and method |
US8075780B2 (en) | 2003-11-24 | 2011-12-13 | Millipore Corporation | Purification and concentration of synthetic biological molecules |
ATE466080T1 (de) | 2003-12-16 | 2010-05-15 | Qiagen North American Holdings | Formulierungen und verfahren zum denaturieren von proteinen |
US7022214B2 (en) | 2004-01-21 | 2006-04-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Carrier ampholytes of high pH range |
ITMI20040167A1 (it) | 2004-02-04 | 2004-05-04 | Univ Padova | Metodo per l'estrazione simultanea di acidi nucleici da un campione biologico |
US7556684B2 (en) | 2004-02-26 | 2009-07-07 | Construction Research & Technology Gmbh | Amine containing strength improvement admixture |
US20060228404A1 (en) | 2004-03-04 | 2006-10-12 | Anderson Daniel G | Compositions and methods for treatment of hypertrophic tissues |
WO2005093052A1 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-06 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for selectively separating and purifying rna and method for separating and purifying nucleic acid |
US7794932B2 (en) | 2004-04-16 | 2010-09-14 | Piotr Chomczynski | Reagents and methods for isolation of purified RNA |
EP1781593B1 (en) | 2004-06-07 | 2011-12-14 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Cationic lipids and methods of use |
ATE536418T1 (de) | 2004-06-07 | 2011-12-15 | Protiva Biotherapeutics Inc | Lipidverkapselte interferenz-rna |
US7670595B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
US20060099605A1 (en) | 2004-11-11 | 2006-05-11 | Hall Gerald E Jr | Devices and methods for isolating RNA |
GB0418172D0 (en) | 2004-08-13 | 2004-09-15 | Ic Vec Ltd | Vector |
US7361465B2 (en) * | 2004-09-07 | 2008-04-22 | Applera Corporation | Methods and compositions for tailing and amplifying RNA |
DE102004043342A1 (de) | 2004-09-08 | 2006-03-09 | Bayer Materialscience Ag | Blockierte Polyurethan-Prepolymere als Klebstoffe |
AU2005300638A1 (en) | 2004-11-05 | 2006-05-11 | Novosom Ag | Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent |
EP1856262B1 (en) | 2005-01-31 | 2012-08-15 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Upstream and a downstream purification process for large scale production of plasmid dna |
GB0502482D0 (en) | 2005-02-07 | 2005-03-16 | Glaxo Group Ltd | Novel compounds |
WO2007086883A2 (en) | 2005-02-14 | 2007-08-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them |
WO2006105043A2 (en) | 2005-03-28 | 2006-10-05 | Dendritic Nanotechnologies, Inc. | Janus dendrimers and dendrons |
CA2611944A1 (en) | 2005-06-15 | 2006-12-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Amine-containing lipids and uses thereof |
ES2937245T3 (es) | 2005-08-23 | 2023-03-27 | Univ Pennsylvania | ARN que contiene nucleósidos modificados y métodos de uso del mismo |
US9012219B2 (en) | 2005-08-23 | 2015-04-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells |
WO2007031091A2 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Santaris Pharma A/S | Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression |
EP1948674A4 (en) | 2005-11-02 | 2009-02-04 | Protiva Biotherapeutics Inc | MODIFIED SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF |
US7238791B1 (en) | 2005-12-16 | 2007-07-03 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | 6-monoacetylmorphine derivatives useful in immunoassay |
US20090221684A1 (en) | 2005-12-22 | 2009-09-03 | Trustees Of Boston University | Molecules for Gene Delivery and Gene Therapy, and Methods of Use Thereof |
CN100569877C (zh) | 2005-12-30 | 2009-12-16 | 财团法人工业技术研究院 | 含多uv交联反应基的分枝状结构化合物及其应用 |
US20070281336A1 (en) | 2006-04-14 | 2007-12-06 | Epicentre Technologies | Kits and methods for generating 5' capped RNA |
US9085778B2 (en) | 2006-05-03 | 2015-07-21 | VL27, Inc. | Exosome transfer of nucleic acids to cells |
US20070275923A1 (en) | 2006-05-25 | 2007-11-29 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | CATIONIC PEPTIDES FOR siRNA INTRACELLULAR DELIVERY |
US8808681B2 (en) | 2006-06-05 | 2014-08-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Crosslinked, degradable polymers and uses thereof |
US20080113357A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-05-15 | Millipore Corporation | Filter device for the isolation of a nucleic acid |
US20090186805A1 (en) | 2006-07-06 | 2009-07-23 | Aaron Thomas Tabor | Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance |
ES2293834B1 (es) | 2006-07-20 | 2009-02-16 | Consejo Superior Investig. Cientificas | Compuesto con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmaceuticas que lo comprenden y sus aplicaciones terapeuticas. |
EP2046266A4 (en) | 2006-07-21 | 2009-11-04 | Massachusetts Inst Technology | ENDMODICIFIED POLY (BETA AMINO ESTER) AND ITS USE |
DK2068886T3 (da) | 2006-10-03 | 2013-11-18 | Tekmira Pharmaceuticals Corp | Lipidholdige præparater |
DE102006051516A1 (de) | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Curevac Gmbh | (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins |
DK2104739T3 (da) | 2006-12-21 | 2013-10-07 | Novozymes Inc | Modificerede messenger-RNA-stabiliseringssekvenser til ekspression af gener i bakterieceller |
DE102007001370A1 (de) | 2007-01-09 | 2008-07-10 | Curevac Gmbh | RNA-kodierte Antikörper |
US20100092572A1 (en) * | 2007-01-29 | 2010-04-15 | Peter Kaeuper | Chitosan-based colloidal particles for rna delivery |
US8859229B2 (en) | 2007-02-02 | 2014-10-14 | Yale University | Transient transfection with RNA |
WO2008113364A2 (en) | 2007-03-20 | 2008-09-25 | Recepticon Aps | Amino derivatives to prevent nephrotoxicity and cancer |
JP5186126B2 (ja) | 2007-03-29 | 2013-04-17 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | 新規トリアジン誘導体ならびにその製法およびそのガス分離膜としての用途 |
MX2009011165A (es) | 2007-04-18 | 2009-12-09 | Cornerstone Pharmaceuticals In | Formulaciones farmaceuticas que contienen derivados del acido lipoico. |
WO2008137470A1 (en) | 2007-05-01 | 2008-11-13 | Pgr-Solutions | Multi-chain lipophilic polyamines |
US20090163705A1 (en) | 2007-05-21 | 2009-06-25 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cationic lipids |
EP2197495A2 (en) | 2007-10-02 | 2010-06-23 | MDRNA, Inc. | Lipopeptides for delivery of nucleic acids |
AU2008333811B2 (en) | 2007-12-04 | 2014-05-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
WO2009120247A2 (en) | 2007-12-27 | 2009-10-01 | The Ohio State University Research Foundation | Lipid nanoparticle compositions and methods of making and using the same |
WO2009082817A1 (en) | 2007-12-27 | 2009-07-09 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna |
US20110097720A1 (en) | 2008-01-02 | 2011-04-28 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Screening method for selected amino lipid-containing compositions |
FR2926560A1 (fr) * | 2008-01-21 | 2009-07-24 | Millipore Corp | Procede d'extraction et de purification d'acides nucleiques sur membrane |
WO2009100254A2 (en) * | 2008-02-05 | 2009-08-13 | Brent Townshend | Protein tyrosine phosphatase inhibitors |
EP2274425A2 (en) | 2008-04-11 | 2011-01-19 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components |
AU2009238175C1 (en) | 2008-04-15 | 2023-11-30 | Arbutus Biopharma Corporation | Novel lipid formulations for nucleic acid delivery |
US20090263407A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Abbott Laboratories | Cationic Lipids and Uses Thereof |
WO2009127230A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Curevac Gmbh | MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION |
EP2297322A1 (en) | 2008-06-04 | 2011-03-23 | The Board of Regents of The University of Texas System | Modulation of gene expression through endogenous small rna targeting of gene promoters |
US20100029501A1 (en) | 2008-07-09 | 2010-02-04 | Eva Samal | Method of identifying micro-rna targets |
US20100035249A1 (en) | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Rna sequencing and analysis using solid support |
JP5492207B2 (ja) * | 2008-08-27 | 2014-05-14 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 生物学的サンプルの処理装置および処理方法 |
JP2010053108A (ja) | 2008-08-29 | 2010-03-11 | Asahi Kasei Corp | 荷電を有する限外濾過膜を用いた生体成分の分離方法およびモジュール、装置 |
AU2009303345B2 (en) | 2008-10-09 | 2015-08-20 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids |
CN104382853A (zh) | 2008-10-16 | 2015-03-04 | 玛瑞纳生物技术有限公司 | 基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物 |
US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
WO2010062322A2 (en) | 2008-10-27 | 2010-06-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Modulation of the immune response |
JP6087504B2 (ja) | 2008-11-07 | 2017-03-01 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | アミノアルコールリピドイドおよびその使用 |
HUE037082T2 (hu) | 2008-11-10 | 2018-08-28 | Arbutus Biopharma Corp | Új lipidek és készítmények terápiás hatóanyagok szállítására |
CA2742689A1 (en) | 2008-11-17 | 2010-05-20 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system |
EP3156494B8 (en) * | 2008-12-04 | 2018-09-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
CA2744510A1 (en) * | 2008-12-09 | 2010-06-17 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Method for obtaining an excipient-free antibody solution |
WO2010083615A1 (en) | 2009-01-26 | 2010-07-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression |
WO2010088517A1 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-05 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and systems for purifying transferring and/or manipulating nucleic acids |
US20100222489A1 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Jiang Dayue D | Copolymer composition, membrane article, and methods thereof |
US20100267806A1 (en) | 2009-03-12 | 2010-10-21 | David Bumcrot | LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF Eg5 AND VEGF GENES |
EP2415124B1 (en) | 2009-04-02 | 2017-02-15 | The Siemon Company | Telecommunications patch panel |
JP5713325B2 (ja) | 2009-04-17 | 2015-05-07 | アイシス イノヴェイション リミテッド | 遺伝物質の送達用の組成物 |
JP5769701B2 (ja) | 2009-05-05 | 2015-08-26 | テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイションTekmira Pharmaceuticals Corporation | 脂質組成物 |
DK2440183T3 (en) | 2009-06-10 | 2018-10-01 | Arbutus Biopharma Corp | Improved lipid formulation |
US9051567B2 (en) | 2009-06-15 | 2015-06-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA |
EA201270019A1 (ru) | 2009-06-15 | 2012-06-29 | Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. | Двуцепочечная рнк, включенная в липидный состав и мишенью которой является ген pcsk9 |
US9018187B2 (en) | 2009-07-01 | 2015-04-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
WO2011000106A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
EP2449106B1 (en) | 2009-07-01 | 2015-04-08 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein b |
US8716464B2 (en) | 2009-07-20 | 2014-05-06 | Thomas W. Geisbert | Compositions and methods for silencing Ebola virus gene expression |
MX2012001339A (es) | 2009-07-30 | 2012-03-07 | Salvat Lab Sa | Compuestos inhibidores de apaf-1. |
EP2459231B1 (de) | 2009-07-31 | 2016-06-08 | Ethris Gmbh | Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression |
WO2011021666A1 (ja) * | 2009-08-19 | 2011-02-24 | 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学 | 環境ストレス下の翻訳抑制を回避する5'utrをコードする組換えdna分子 |
DE102009043342A1 (de) | 2009-09-29 | 2011-03-31 | Bayer Technology Services Gmbh | Stoffe für selbstorganisierte Träger zur kontrollierten Freisetzung eines Wirkstoffs |
US8470585B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-06-25 | Crucell Holland B.V. | Process for adenovirus purification from high cell density cultures |
US20130224730A1 (en) * | 2009-11-18 | 2013-08-29 | Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Peptide ligands |
PL3338765T3 (pl) | 2009-12-01 | 2019-06-28 | Translate Bio, Inc. | Pochodna steroidowa dla dostarczania mrna w ludzkich chorobach genetycznych |
KR102505097B1 (ko) | 2009-12-07 | 2023-03-02 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | 세포 리프로그래밍을 위한 정제된 변형 rna를 포함하는 rna 제제 |
ES2749426T3 (es) | 2009-12-18 | 2020-03-20 | Univ British Columbia | Métodos y composiciones para administración de ácidos nucleicos |
EP2516010A2 (en) | 2009-12-23 | 2012-10-31 | Novartis AG | Lipids, lipid compositions, and methods of using them |
US9315802B2 (en) * | 2009-12-30 | 2016-04-19 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | RNA isolation from soluble urine fractions |
JP2012246222A (ja) * | 2010-01-29 | 2012-12-13 | Axis Inc | 変形性関節症治療剤または予防剤を製造するための使用 |
JP2013527856A (ja) | 2010-05-12 | 2013-07-04 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | 陽イオン性脂質およびその使用方法 |
NZ605079A (en) | 2010-06-03 | 2015-08-28 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Biodegradable lipids for the delivery of active agents |
CN101863544B (zh) | 2010-06-29 | 2011-09-28 | 湖南科技大学 | 一种氰尿酸基重金属螯合絮凝剂及其制备方法 |
WO2012000104A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
WO2012016184A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
EP3578205A1 (en) | 2010-08-06 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
WO2012019630A1 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Curevac Gmbh | Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein |
DK2607482T3 (en) | 2010-08-18 | 2017-07-03 | Toray Industries | Solution for extraction of RNA |
JP5740754B2 (ja) * | 2010-08-26 | 2015-07-01 | アイシン精機株式会社 | 酵素結晶固定化電極及び酵素結晶固定化電極の製造方法、並びに酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池及びバイオセンサー |
EP2609135A4 (en) | 2010-08-26 | 2015-05-20 | Massachusetts Inst Technology | POLY (BETA-AMINO ALCOHOLS), THEIR PREPARATION AND USES THEREOF |
WO2012031294A2 (en) * | 2010-09-03 | 2012-03-08 | University Of Maryland, College Park | Methods for determining protein ligand binding |
US20120237975A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-09-20 | Jason Schrum | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
WO2012075040A2 (en) | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES |
KR20140092227A (ko) * | 2010-12-10 | 2014-07-23 | 트레이시 톰슨 | 분리 방법용 조성물 |
PL2691443T3 (pl) | 2011-03-28 | 2021-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Sprzężone lipomery i ich zastosowania |
EP2691101A2 (en) | 2011-03-31 | 2014-02-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
WO2012133737A1 (ja) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | 架橋性アミン化合物、該化合物を用いた高分子膜及びその製造方法 |
US11767534B2 (en) | 2011-05-04 | 2023-09-26 | The Broad Institute, Inc. | Multiplexed genetic reporter assays and compositions |
CA2835428A1 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-22 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates |
EP2532649B1 (en) | 2011-06-07 | 2015-04-08 | Incella GmbH | Amino lipids, their synthesis and uses thereof |
CN103748078B (zh) | 2011-06-08 | 2016-11-09 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 可裂解脂质 |
EP4043025A1 (en) | 2011-06-08 | 2022-08-17 | Translate Bio, Inc. | Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery |
WO2013003475A1 (en) | 2011-06-27 | 2013-01-03 | Cellscript, Inc. | Inhibition of innate immune response |
KR20140045398A (ko) | 2011-06-30 | 2014-04-16 | 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 | Cmp-n-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제가 결핍된 세포 |
WO2013039861A2 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | modeRNA Therapeutics | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
WO2013039857A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | modeRNA Therapeutics | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
RU2014117690A (ru) | 2011-10-05 | 2015-11-10 | Протива Байотерапьютикс Инк. | Композиции и способы для сайленсинга альдегид-дегидрогеназы |
AU2012328570B2 (en) | 2011-10-27 | 2017-08-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Amino acid derivatives functionalized on the n-terminus capable of forming drug encapsulating microspheres and uses thereof |
US20140343129A1 (en) | 2011-12-14 | 2014-11-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleic acids, and acute care uses thereof |
US20140378538A1 (en) | 2011-12-14 | 2014-12-25 | Moderma Therapeutics, Inc. | Methods of responding to a biothreat |
WO2013090814A2 (en) * | 2011-12-16 | 2013-06-20 | Board Of Trustees Of Michigan State University | p-Coumaroyl-CoA:Monolignol Transferase |
KR20140102759A (ko) | 2011-12-16 | 2014-08-22 | 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물 |
AU2012358384A1 (en) | 2011-12-21 | 2014-07-31 | Moderna Therapeutics, Inc. | Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant |
US20140371302A1 (en) | 2011-12-29 | 2014-12-18 | Modema Therapeutics, Inc. | Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides |
PL3421601T3 (pl) | 2011-12-30 | 2020-06-01 | Cellscript, Llc | Wytwarzanie i stosowanie zsyntetyzowanego in vitro ssRNA do wprowadzania do ssaczych komórek w celu indukcji efektu biologicznego lub biochemicznego |
US9352042B2 (en) | 2012-02-24 | 2016-05-31 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof |
CN104334161A (zh) | 2012-03-29 | 2015-02-04 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 可电离的阳离子脂质 |
CN104487055A (zh) | 2012-03-29 | 2015-04-01 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 脂质衍生的中性纳米颗粒 |
US20150050354A1 (en) | 2012-04-02 | 2015-02-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions |
US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
AU2013243949A1 (en) | 2012-04-02 | 2014-10-30 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease |
US20140275229A1 (en) | 2012-04-02 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1 |
CA2868398A1 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
EP3884949A1 (en) | 2012-06-08 | 2021-09-29 | Translate Bio, Inc. | Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells |
CA2873274C (en) * | 2012-06-08 | 2021-06-01 | Ethris Gmbh | Pulmonary delivery of messenger rna |
EP2859102A4 (en) | 2012-06-08 | 2016-05-11 | Shire Human Genetic Therapies | NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF |
EP2674167A1 (en) * | 2012-06-14 | 2013-12-18 | PLS-Design GmbH | Controlled activation of complement components for use as endogenous adjuvant |
WO2014028487A1 (en) | 2012-08-13 | 2014-02-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Amine-containing lipidoids and uses thereof |
CN104995311A (zh) | 2012-08-30 | 2015-10-21 | 外来体诊断公司 | 用于核酸测定的对照 |
US20140093952A1 (en) * | 2012-10-02 | 2014-04-03 | David Serway | Bioreactor Tangential Flow Perfusion Filter System |
US20150307542A1 (en) | 2012-10-03 | 2015-10-29 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleic acid molecules and uses thereof |
CA2892035C (en) | 2012-11-21 | 2019-11-05 | Serum Institute Of India Ltd. | Production of neisseria meningitidis x capsular polysaccharide |
JP6144355B2 (ja) | 2012-11-26 | 2017-06-07 | モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX,Inc. | 化学修飾mRNA |
WO2014089486A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Lipidic nanoparticles for mrna delivering |
WO2014093574A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for altering cell phenotype |
CA2897941A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes |
WO2014158795A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Diagnosis and treatment of fibrosis |
US20160024181A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-28 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
ES2680595T3 (es) | 2013-03-14 | 2018-09-10 | Translate Bio, Inc. | Evaluación cuantitativa para eficacia de ARN mensajero para tapar |
KR20150127582A (ko) | 2013-03-14 | 2015-11-17 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | 4''-티오 개질된 뉴클레오티드를 갖는 리보핵산 및 관련 방법 |
ES2708562T3 (es) | 2013-03-14 | 2019-04-10 | Translate Bio Inc | Evaluación cuantitativa de la eficacidad de tapa de ARN mensajero |
HUE055044T2 (hu) | 2013-03-14 | 2021-10-28 | Translate Bio Inc | MRNS-kódolt ellenanyagok bejuttatására szolgáló eljárások és készítmények |
PT2968586T (pt) | 2013-03-14 | 2018-11-13 | Ethris Gmbh | Composições de arnm de cftr e métodos e utilizações relacionados |
US10258698B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-04-16 | Modernatx, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
EP2970955B1 (en) | 2013-03-14 | 2018-11-14 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
WO2014152940A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders |
WO2014144711A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Analysis of mrna heterogeneity and stability |
US20160032273A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Characterization of mrna molecules |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
ES2923018T3 (es) | 2013-03-15 | 2022-09-22 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Métodos de purificación de ARN |
US10077439B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-18 | Modernatx, Inc. | Removal of DNA fragments in mRNA production process |
US11377470B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-07-05 | Modernatx, Inc. | Ribonucleic acid purification |
EP2983804A4 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-01 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
EP3388834B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-04-15 | Translate Bio, Inc. | Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations |
US10138507B2 (en) * | 2013-03-15 | 2018-11-27 | Modernatx, Inc. | Manufacturing methods for production of RNA transcripts |
US9315472B2 (en) | 2013-05-01 | 2016-04-19 | Massachusetts Institute Of Technology | 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof |
US9895443B2 (en) | 2013-06-26 | 2018-02-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Multi-tailed lipids and uses thereof |
DK3019619T3 (da) | 2013-07-11 | 2021-10-11 | Modernatx Inc | Sammensætninger, der omfatter syntetiske polynukleotider, som koder for crispr-beslægtede proteiner, og syntetiske sgrna'er, og anvendelsesfremgangsmåder |
JP6620093B2 (ja) | 2013-07-23 | 2019-12-11 | アービュートゥス バイオファーマ コーポレイションArbutus Biopharma Corporation | メッセンジャーrnaを送達するための組成物及び方法 |
US20160194368A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-07 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
WO2015034928A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
WO2015051173A2 (en) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc | Polynucleotide molecules and uses thereof |
US10385088B2 (en) | 2013-10-02 | 2019-08-20 | Modernatx, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
EP3058082A4 (en) | 2013-10-18 | 2017-04-26 | ModernaTX, Inc. | Compositions and methods for tolerizing cellular systems |
AU2014340092B2 (en) | 2013-10-22 | 2019-09-19 | Translate Bio, Inc. | mRNA therapy for Argininosuccinate Synthetase Deficiency |
WO2015061491A1 (en) | 2013-10-22 | 2015-04-30 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mrna therapy for phenylketonuria |
WO2015061461A1 (en) | 2013-10-22 | 2015-04-30 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cns delivery of mrna and uses thereof |
US20170173128A1 (en) | 2013-12-06 | 2017-06-22 | Moderna TX, Inc. | Targeted adaptive vaccines |
EP2918275B1 (en) | 2013-12-13 | 2016-05-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
EP3083579B1 (en) * | 2013-12-19 | 2022-01-26 | Novartis AG | Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents |
US20170002060A1 (en) | 2014-01-08 | 2017-01-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for the in vivo production of antibodies |
CA2946751A1 (en) | 2014-04-23 | 2015-10-29 | Modernatx, Inc. | Nucleic acid vaccines |
SG11201608725YA (en) | 2014-04-25 | 2016-11-29 | Shire Human Genetic Therapies | Methods for purification of messenger rna |
JP2017536092A (ja) | 2014-10-02 | 2017-12-07 | プロティバ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド | B型肝炎ウイルスの遺伝子発現をサイレンシングするための組成物及び方法 |
WO2016071857A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing ebola virus expression |
EP3461904A1 (en) | 2014-11-10 | 2019-04-03 | ModernaTX, Inc. | Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof |
EP3218508A4 (en) | 2014-11-10 | 2018-04-18 | Modernatx, Inc. | Multiparametric nucleic acid optimization |
US20180000953A1 (en) | 2015-01-21 | 2018-01-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
EP3247398A4 (en) | 2015-01-23 | 2018-09-26 | Moderna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
US20180245077A1 (en) | 2015-03-20 | 2018-08-30 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia |
WO2016164762A1 (en) | 2015-04-08 | 2016-10-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same |
WO2016183366A2 (en) | 2015-05-12 | 2016-11-17 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing expression of hepatitis d virus rna |
EP3744843A1 (en) | 2015-05-29 | 2020-12-02 | CureVac Real Estate GmbH | A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration |
US20180245074A1 (en) | 2015-06-04 | 2018-08-30 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Treating hepatitis b virus infection using crispr |
US10626393B2 (en) | 2015-06-04 | 2020-04-21 | Arbutus Biopharma Corporation | Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles |
WO2016201377A1 (en) | 2015-06-10 | 2016-12-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Targeted adaptive vaccines |
US11920174B2 (en) | 2016-03-03 | 2024-03-05 | CureVac SE | RNA analysis by total hydrolysis and quantification of released nucleosides |
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