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Hintergrund der Erfindung
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Technisches Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung
von Plasmid-DNA. Genauer gesagt, wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt,
das einfach und skalierbar ist und Tangentialfluss-Filtration verwendet,
was in höheren
Erträgen
an hochreinem Plasmid als das klassische, alkalische-Lyse-basierte
Verfahren resultiert.
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Beschreibung von verwandten
Offenbarungen
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Die
Reinigung von Plasmid-DNA aus Kulturen von Zellen ist eine Voraussetzung
für viele
Studien und pharmazeutische Verwendungen. Im Allgemeinen kann man
Verfahren zur Plasmidreinigung als Zwei-Schritt-Prozesse ansehen,
die einen anfänglichen
Zelldisruptions-/Plasmidisolationsschritt, gefolgt von einem oder
mehreren folgenden Reinigungsschritten, beinhalten.
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Die üblichsten
Verfahren zur anfänglichen
Isolierung sind modifizierte Versionen von zwei Vorgehensweisen:
eine, basierend auf der Freisetzung von Plasmid durch Kochen (Holmes
und Quigley, "Anal.
Biochem.", 114:
S. 193–197
(1981)), und die zweite, basierend auf alkalischem pH und Detergens-vermittelter
Solubilisierung der bakteriellen Zellmembranen (Birnboim und Doly, "Nucleic Acids Res.", 7: S. 1513–1523 (1979)).
Diese beiden Verfahren resultieren in der Freisetzung von Plasmid-DNA
aus ihrem cytosolischen Ort.
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Zusätzlich zur üblichen
Verwendung von Ultrazentrifugation durch Cäsiumchloridgradienten (Clewell und
Helinski, "Proc.
Natl. Acad. Sci. USA",
62: S. 1150–1152
(1969)), schloss die anschließende
Reinigung typischerweise entweder selektive Fällung des Plasmids von Kontaminanten
(Lis und Schleif, "Nucleic
Acids Res.", 2: S.
383–389
(1975); Ishaq et al., "Biotechniques", 9: S. 19–24 (1990);
Kondo et al., "Anal.
Biochem.", 198:
S. 30–35
(1991); Chakrabarti et al., "Biotech.
Appl. Biochem.",
16: S. 211–215
(1992)) und/oder die Verwendung von Säulenchromatographie (Horn et
al., "Human Gene
Ther.", 6: S. 565–573 (1995);
US-Pat. Nr. 5,707,812; Chandra et al., Anal. Biochem., 203: S. 168–172 (1992);
Marquet et al., "BioPharm", S. 26–37 (1995);
Johnson und Ilan, "Anal.
Biochem.", 132:
S. 20–25
(1983); Vincent und Goldstein, "Anal.
Biochem.", 110:
S. 123–127
(1981)) mit ein. Protokolle für
die Säulenchromatographie
beruhen auf Umkehrphase (Edwardson et al., "Anal. Biochem.", 152: S. 215–220 (1986); Johnson et al., "Biotechniques", 4: S. 64–70 (1986); van
Helden und Hoal in "New
Nucleic Acid Techniques",
Walker, Hrsg. (Humana Press: Clifton, N.J., 1988), S. 61–74)); Normalphase
(Marko et al., "Anal.
Biochem.", 121:
S. 382–387
(1982)); Ionenaustausch (Perbal in "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Wiley: New York,
USA, 1984), S. 165–175;
Colman et al., "Eur.
J. Biochem.", 91:
S. 303–310
(1978); Garon und Petersen, "Gene
Anal. Tech.", 4:
S. 5–8
(1987); Kim und Rha, "Biotech.
Bioeng.", 33: S.
1205–1209
(1989); Ohmiya et al., "Anal.
Biochem.", 189:
S. 126–130
(1990)); Größenausschluss
(van Helden und Hoal, supra; Perbal, supra; Cornelis et al., "Plasmid", 5: S. 221–223 (1981),
Micard et al., "Anal.
Biochem.", 148:
S. 121–126
(1985); Moreau et al., "Anal.
Biochem.", 166:
S. 188–193
(1987); Raymond et al., "Anal.
Biochem", 173: S.
125–133
(1988); Hansen und Rickett, "Anal.
Biochem.", 179:
S. 167–170
(1989)), und Mischverfahren (Flanagan et al., "Anal. Biochem.", 153: S. 299–304 (1986)).
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Alternativen
zu diesen Vorgehensweisen schließen die Verwendung von 0,2-Mikron-Membranen
als Ersatz für
einen Zentrifugationsschritt während
der alkalischen Lyse in einem Plattenformat mit 96 Vertiefungen
(Ruppert et al., "Anal.
Biochem.", 230:
S. 130–134
(1995)); die Verwendung von wässriger
Zwei-Phasen-Trennung
(Cole, "Biotechniques", 11: S. 18–24 (1991)),
und die Verwendung von Ionenaustauschermembranen (van Huynh et al., "Anal. Biochem.", 211: S. 61–65 (1993))
zur Plasmidreinigung ein. Typischerweise haben diese Verfahren zusätzliche
Reinigungsschritte, die entweder auf organischen Lösungsmitteln
basierte Extraktionsschritte (z.B. Phenol/Chloroform) oder Fällungsschritte
(z.B. Isopropanol, Ethanol) einschlossen sowie die Zugabe von exogenen
Enzymen (z.B. RNase, Proteinase K) benötigt, um Plasmid von angemessener
Reinheit herzustellen.
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Zusätzliche
Techniken zur Reinigung von Plasmid-DNA schließen Polyethylen-Glycol-basierte DNA-Reinigungsverfahren
(Lis und Schleif, supra; US-Pat. Nr. 5,707,812, wobei ein kurzkettiger,
polymerer Alkohol dem Lysat zugegeben wird, so dass das Lysat an
die zur Reinigung verwendete Säule
oder Membran bindet); Säure-Phenol-Reinigung
von Plasmid-DNA (Zasloff et al., "Nucleic Acids Res.", 5: S. 1139–1153 (1978)), und verschiedene
Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA in relativ kleinem Maßstab für Forschungszwecke
(Sambrook et al., "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, USA, 1989);
Ausubel et al., Hrsg., "Current
Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons: New York,
USA, 1989)) ein. Techniken für
DNA-RNA-Trennungen
sind in Roman und Brown, "J. Chromatogr.", 592: S. 3–12 (1992) übersichtsartig
zusammengefaßt.
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Die
Tangentialflussfiltration (TFF) oder Kreuz-Fluss-Filtration ist
eine Trennungstechnik, bei der ein Fluss über die Membranoberfläche in einer
darüberstreichenden
Bewegung geleitet wird (Gabler, "ASM News", 50: S. 299 (1984)).
Diese darüberstreichende
Wirkung hilft dabei, das von der Membran zurückgehaltene Material an der
Ausbildung einer Schicht auf der Filteroberfläche zu hindern; ein Zustand,
der als Konzentrationspolarisation bekannt ist. TFF wird verwendet,
um Lösungen,
die von der Membran zurückgehalten werden
(Retentat) aufzukonzentrieren und/oder zu entsalzen oder um Material,
das die Membran passiert, zu sammeln (Filtrat). Materialien, die
kleiner als die Porengröße (oder
der nominale Molekulargewichts-Cutoff (NMWC)) sind, sind in der
Lage, die Membran zu passieren und können so depyrogenisiert, geklärt oder
von Spezies mit höherem
Molekulargewicht oder größeren Spezies
getrennt werden. Materialien, die größer als die Porengröße oder
der NMWC sind, werden von der Membran zurückgehalten und werden aufkonzentriert, gewaschen
oder von den Spezies mit niedrigem Molekulargewicht getrennt. Die
Prinzipien, die Theorie und die Geräte, die für TFF verwendet werden, sind
in Michaels et al., "Tangential
Flow Filtration" in "Separations Technology,
Pharmaceutical and Biotechnology Applications" (W.P. Olson, Hrsg., Interpharm. Press,
Inc., Buffalo Grove, IL, 1995) beschrieben. Siehe auch US-Pat. Nrn.
5,256,294 und 5,490,937 für
eine Beschreibung der Hochleistungs-Tangentialfluss-Filtration (HP-TFF),
welche eine Verbesserung der TFF darstellt, und WO 87/04169 für eine Beschreibung
der Tangentialfluss-Affinitätsultrafiltration,
welche das Mischen der zu reinigenden Lösung mit einem Affinitätsgel, welches
selektiv die zu reinigende Substanz bindet und dann die Durchführung einer
TFF mit der Flüssigkeit,
so dass alle Komponenten mit Ausnahme des gebundenen Materials den
Filter passieren, einschließt.
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Zusätzliche
Verfahren zur Reinigung von Viren, Nukleinsäure, Bakteriophage oder von
anderen biologischen Materialien unter Verwendung von physikalischen
Trennungen, wie TFF oder anderen Kreuzfluss-Filtrationstechniken,
sind in verschiedenen Veröffentlichungen
dargelegt (Richards und Goldmintz, "J. Virol. Methods", 4: S. 147–153 (1982); Fernandez et al., "Acta Biotechnol.", 12: S. 49–56 (1992);
Matsushita et al., "Kagaku
Kogaku Ronbunshu",
20: S. 725–728
(1994); Rembhotkar und Khatri, "Anal.
Biochem.", 176:
S. 373–374 (1989);
WO 98/05673, veröffentlicht
am 12. Februar 1998;
EP 307 373 ;
Sekhar et al., "Hum.
Gene Ther.", 7: S.
33–38
(1996)).
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Mit
der zunehmenden Verwendung von Plasmid-DNA als Biopharmazeutika
in Gentherapieanwendungen anstatt als Klonierungsvektor besteht
ein wachsender Bedarf an einfachen, robusten und skalierbaren Reinigungsverfahren,
die bei der Isolierung von sowohl mittleren als auch großen Mengen
dieses Moleküls
aus transformierten Prokaryoten verwendet werden können. Die
Verwendung von Plasmidreinigungsverfahren, die derzeit für den Zweck
der Erzeugung von großen
Mengen an Forschungsmaterial, oder um eine klinische Studie zu beliefern,
verfügbar
sind, ist aus vielen Gründen
begrenzt. Reinigungsschemata, die die Verwendung von großen Mengen
an entflammbaren, organischen Lösungsmitteln
(z.B. Ethanol und Isopropanol); toxischen Chemikalien (z.B. Ethidiumbromid, Phenol
und Chloroform) beinhalten. Ultrazentrifugen und "Spin-Säulen" sind, obwohl für die Erzeugung
von kleinen Mengen an Forschungsmaterial geeignet, nicht geeignet
zur Verwendung bei der Erzeugung derjenigen Mengen an Material,
die für
biopharmazeutische Anwendungen benötigt werden.
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Zusätzlich schließen viele
derzeitige Plasmidreinigungsverfahren die Zugabe von RNase, typischerweise
bovinen Ursprungs, ein. Materialien, die aus bovinen Quellen stammen,
sind bei der Herstellung von Pharmazeutika zunehmend unerwünscht wegen
der Bedenken in Bezug auf die bovine spongiforme Encephalopathie
(BSE) (Hill et al., "Nature", 389: S. 448–450 (1997)).
Im Allgemeinen ist es wünschenswert,
die Zugabe von Enzymen zu Plasmidzubereitungen zu vermeiden, da
diese Moleküle
nachfolgend abgereinigt werden müssen.
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Reinigungsprotokolle,
die die Verwendung von Gel-Filtrationschromatographie einschließen, werden durch
die geringen Ladekapazitäten,
die dem Vorgang inhärent
sind, behindert; in einem Bericht waren die Beladungen auf etwa
2 Volumenprozent der Säule
limitiert (McClung und Gonzales, "Anal. Biochem.", 177: S. 378–382 (1989)).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reinigen von
Plasmid-DNA aus prokaryotischen Zellen, von denen sie umfasst ist,
bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
- a)
Verdauen der Zellen;
- b) Inkubieren der Zellen in Gegenwart von Alkali und einem Detergens
etwa 4 bis 24 Stunden lang, um ihre Lyse und Solubilisierung zu
bewirken;
- c) Entfernen von Lysatkontaminanten von den Zellen, um eine
Plasmid-DNA-Lösung bereitzustellen;
- d) Filtrieren dieser Lösung
durch ein Tangentialfluss-Filtrationsgerät, um ein Retentat, welches
die Plasmid-DNA enthält,
zu erhalten, und
- e) Sammeln des Retentats,
wobei in keinem der obigen
Schritte Enzyme verwendet werden, um RNA zu verdauen.
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Die
Zellen sind vorzugsweise bakterielle Zellen. Es ist auch bevorzugt,
dass Schritt c) durchgeführt wird
durch Abzentrifugieren der Lysatkontaminanten von der Plasmid-DNA
im Zelllysat, um eine Überstandslösung, welche
die Plasmid-DNA umfasst, bereitzustellen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die Plasmid-DNA,
welche gemäß dem obigen
Verfahren hergestellt wurde, umfasst.
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Hier
wird ein einfaches, skalierbares, Filtrations-basiertes Verfahren
zur Reinigung von Plasmid-DNA zur Verfügung gestellt, welches in der
Herstellung von hochreinem Plasmid mit sehr hohem Ertrag resultiert. Dieses
Verfahren schließt
die Modifikation des klassischen, auf alkalischer Lyse basierenden
Plasmidextraktionsverfahrens durch Ausdehnen des Solubilisierungsschritts
von weniger als 30 Minuten auf von etwa 4 Stunden bis 24 Stunden
ein. Der Extraktion folgt die Verwendung von TFF zur Reinigung der
verbleibenden Kontaminanten. Dieses Verfahren schließt nicht
die Verwendung jeglicher, organischer Lösungsmittel, von RNase, von
Proteinase K, von Hochgeschwindigkeitszentrifugation oder von säulenchromatographischen
Schritten ein. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln gibt zu Sicherheits-
und regulatorischen Bedenken Anlass, insofern sie Spurenmengen im
Endprodukt zurücklassen
könnte;
auch sind solche Lösungsmittel
toxisch und entflammbar, was zu ernsthaften Risiken und Entsorgungs-/Umweltproblemen
Anlass gibt, wenn sie in den Mengen, die für die Reinigung im großen Maßstab benötigt sind,
verwendet werden. Das Verfahren ergibt typischerweise 15–20 mg Plasmid-DNA pro Liter bakterieller
Kultur und resultiert in der Entfernung von mehr als 99% der RNA
und mehr als 95% des Proteins, welches nach dem modifizierten, alkalischen
Lyseverfahren zurückbleibt.
Plasmid, das unter Verwendung dieses Verfahrens isoliert wurde,
hatte eine vergleichbare Transfektionsfähigkeit im Vergleich zu Plasmid,
das unter Verwendung des klassischen, auf einem Cäsium-Chlorid-Gradienten
basierenden Verfahrens isoliert wurde.
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Da
diese Plasmid-DNA in einem hohen Maße gereinigt ist, kann sie
nützlich
für die
Gentherapie und andere Genverabreichungstechniken verwendet werden,
zum Beispiel diejenigen, welche Lipidträger einschließen, wobei
reproduzierbare, hohe Transfektionseffizienzen erhalten werden.
Das beschriebene Verfahren ist leicht in seinem Maßstab für den Betrieb
bei höherer
Kapazität
zu vergrößern, sofern
benötigt.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1A und 1B zeigen die Reinigung von Plasmid-DNA
von RNA, wie durch Größenausschlusschromatographie
bestimmt. 1A ist eine
Analyse des Kaliumacetatüberstands
vor der Reinigung mit TFF. 1B stellt
die Analyse des endgültigen
TFF-Pools dar. Die Werte zeigen die Prozent an der Gesamtabsorption
bei 260 nm an.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Definitionen
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Wie
hier verwendet, bezieht sich "Filtrat" auf den Teil einer
Probe, der die Filtrationsmembran passiert.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich "Retentat" auf den Teil einer
Probe, der die Filtrationsmembran nicht passiert.
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"Tangentialflussfiltration" oder "TFF" oder "Kreuzflussfiltration" bezieht sich auf
ein Filtrationsverfahren, bei dem die Probenmischung über das
Oberteil der Membran zirkuliert, während ein angelegter Druck
gelöste
Stoffe und kleine Moleküle
dazu bringt, die Membran zu passieren. Typischerweise strömt die Lösung parallel
zur Filtermembran, sodass der Flüssigkeitsstrom
die Filteroberfläche
kontinuierlich reinigt und ein Verstopfen durch nicht-filtrierbare, gelöste Stoffe
verhindert. Ein Druckgefälle über die
Membran hinweg bringt Flüssigkeit
und filtrierbare, gelöste
Stoffe dazu, durch den Filter zu strömen. Das kann als Durchflussverfahren durchgeführt werden,
da die Lösung
wiederholt über
die Membran geschickt wird, während
die Flüssigkeit,
die den Filter passiert, kontinuierlich in einen separaten Kreislauf
abgezogen wird.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich "Lysatkontaminanten" auf alle unerwünschten
Komponenten einer Mischung, in der die erwünschte Plasmid-DNA enthalten
ist, einschließlich
chromosomaler DNA; Wirtsproteine; Zelldebris, einschließlich Zellmembrandebris;
Kohlenhydrate; kleine, abgebaute Nukleotide; Wirts-RNA; Lipopolysaccharide,
etc.
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Der
Ausdruck "ohne enzymatischen
Verdau von RNA zu bewirken" bezieht
sich auf die Abwesenheit eines Enzyms, wie einer RNase, welches
RNA verdaut (einschließlich
zellulärer
oder Wirts-RNA).
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Wie
hier verwendet, bezieht sich "Molekulargewichts-Cutoff" auf das Molekulargewicht
des globulären, gelösten Stoffes,
der zu 90% durch die besagte Membran zurückgehalten wird; siehe Filtron-Katalog,
1995/96, S. 5. Das tatsächliche
Molekulargewicht von Partikeln, die eine Membran passieren oder
durch sie zurückgehalten
werden, hängt
von der Größe wie auch
von der Konformation und Ladung eines gegebenen Moleküls ab, dem
Wesen der Membranpore oder Matrix und der Leitfähigkeit und dem pH der Lösung.
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Wie
hier verwendet, ist ein "gereinigtes" Plasmid ein solches,
das von Kontaminanten, wie Endotoxin, Protein und RNA, abgetrennt
ist und vorzugsweise zusammengesetzt ist aus zumindest etwa 95%
Plasmid und etwa 5% RNA; stärker
bevorzugt zumindest etwa 98% Plasmid und etwa 2% RNA, wie durch
Größenausschlusschromatographie
bei 260 nm Absorption gemessen. Vorzugsweise sind die Endotoxinspiegel
in derartigen, gereinigten Plasmidzubereitungen weniger als 300.000
EU/ml; stärker
bevorzugt weniger als 30.000 EU/ml.
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Durchführungsarten der Erfindung
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Man
fand, dass Plasmid-DNA in großen
Erträgen
aus prokaryotischen Zellen, in denen sie enthalten ist, unter Verwendung
von TFF, aber ohne RNase, hochgradig gereinigt werden kann. Vorzugsweise
hat diese Plasmid-DNA eine Größe, die
von etwa 2 kb bis 50 kb reicht; stärker bevorzugt von etwa 2 kb
bis 15 kb, und die TFF verwendet einen selektiven Molekulargewichts-Cutoff
von größer als
etwa 500 kD, bevorzugt von etwa 500 kD bis 1000 kD.
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Die
Plasmid-DNA wird von Komponenten der prokaryotischen Zellkulturen,
bevorzugt bakteriellen Fermentationen, und am meisten bevorzugt
E. coli, isoliert oder extrahiert. Plasmid-DNA, die aus prokaryotischen Zellen
isoliert wurde, schließt
natürlich
vorkommende Plasmide wie auch rekombinante Plasmide, die ein Gen von
Interesse enthalten, einschließlich
von z.B. Markergenen oder therapeutischen Genen, ein. Die Fermentation
kann in jedem Flüssigmedium,
das für
das Wachstum der verwendeten Zellen geeignet ist, durchgeführt werden.
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Das
hierin zu reinigende DNA-Plasmid kann jedes beliebige, extrachromosomale
DNA-Molekül
beliebigen Charakters sein; vorausgesetzt, dass es sich im oben
spezifizierten Größenbereich
befindet. Die Plasmide können
eine hohe Kopienzahl oder eine niedrige Kopienzahl haben, oder sie
können "runaway"- Plasmide sein, und sie können einzelsträngige oder
doppelsträngige
DNA sein, "supercoiled"-Plasmid-DNA oder DNA-Fragmente.
Sie können
eine Reihe von genetischen Elementen enthalten, welche selektierbare
Gene, Polylinker, Replikationsursprünge, Promotoren, Enhancer, "Leader"-Sequenzen, Polyadenylierungsstellen und
Terminationssequenzen einschließen.
Die Plasmide können
Säugergene
grundsätzlich
jeden beliebigen Ursprungs enthalten; vorzugsweise ein therapeutisches
Gen und stärker
bevorzugt ein solches, das für
ein humanes Polypeptid von Interesse kodiert. Derartige, therapeutische
Gene schließen
funktionale Gene ein oder Genfragmente, die in einem geeigneten
Wirt exprimiert werden können,
um ein defektes oder unterexprimiertes Gen in der Wirtszelle zu
komplementieren, sowie Gene oder Genfragmente, die, wenn sie exprimiert
werden, die Funktion eines Gens in der Wirtszelle inhibieren oder
supprimieren, einschließlich
z.B. Antisense-Sequenzen, Ribozyme, transdominante Inhibitoren und Ähnliches.
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Vor
dem Verdau und der Lyse der Zellen, um die Plasmid-DNA zu extrahieren,
werden die Zellen im Allgemeinen aus dem Fermentationsmedium geerntet.
Jede übliche
Art, um Zellen aus einem Flüssigmedium zu
ernten, ist geeignet, einschließlich
Zentrifugation, Filtration und Sedimentation.
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Der
erste Schritt dieses Verfahrens schließt den Verdau der Zellen ein.
Der Verdau kann durch jedes beliebige, übliche Verfahren erfolgen (z.B.
durch die Technik von Birnboim und Doly, supra), wird aber bevorzugt
durch Zugabe eines Verdauungsenzyms, wie Lysozym, Mischen und Inkubieren
der Mischung bei einer Temperatur unterhalb von Raumtemperatur,
vorzugsweise auf Eis, bewirkt.
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Der
zweite Schritt dieses Verfahrens schließt die Lyse und Solubilisierung
der Zellen ein, was im chemischen Verdau der RNA resultiert. Dieser
Schritt wird für
eine Zeitspanne, die von etwa 4 Stunden bis 24 Stunden reicht, durchgeführt, vorzugsweise
von etwa 6 Stunden bis 24 Stunden, stärker bevorzugt von etwa 10
Stunden bis 24 Stunden, noch stärker
bevorzugt von etwa 15 Stunden bis 24 Stunden und am stärksten bevorzugt
von etwa 20 Stunden bis 24 Stunden. Typischerweise werden die Zellen
nach der Ernte in einem Puffer resuspendiert und für die angegebene
Zeitdauer mit einem oder mehreren Mitteln, die die Lyse und Solubilisierung
der Zellen bewirken, behandelt. Beispiele derartiger Mittel schließen Alkali
(z.B. eine verdünnte Base,
wie Natriumhydroxid) und/oder ein Detergens ein. Vorzugsweise werden
sowohl Alkali als auch Detergens eingesetzt. In einer weiteren,
bevorzugten Ausführungsform,
für die
maximale Entfernung von Endotoxin, ist das Detergens zum Beispiel
Natriumdodecylsulfat (SDS), Cholsäure, Deoxycholsäure oder
TRITON X-114TM, am stärksten bevorzugt SDS oder Deoxycholsäure. Für eine maximale
Plasmidfreisetzung und Entfernung von kontaminierender, genomischer
DNA ist das Detergens bevorzugt anionisch, stärker bevorzugt SDS, Cholsäure oder
Deoxycholsäure,
und am stärksten
bevorzugt SDS oder Deoxycholsäure.
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Der
Lyse-/Solubilisierungsschritt wird in Abwesenheit von Enzymen, die
RNA verdauen, wie RNase, durchgeführt. Vorzugsweise wird das
Verfahren auch in Abwesenheit einer enzymatischen Behandlung, die
irgendeine Zellwand aufgrund von irgendeiner möglichen Kontamination mit einem
tierischen Virus schwächen würde, durchgeführt. Es
ist auch wünschenswert,
Verfahren zu benutzen, die die chromosomale DNA nicht scheren, sodass
ihre Entfernung erleichtert ist und eine Kontamination mit dem Plasmid-DNA-Endprodukt vermieden
wird. Das bevorzugte Lyseverfahren für bakterielle Zellen schließt die in
Birnboim und Doly, supra, beschriebene, alkalische Lyse oder Modifikationen
davon, wie hier in Beispiel 1 berichtet, ein.
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Nach
der Lyse und Solubilisierung werden die Zellen behandelt, um Lysatkontaminanten,
einschließlich
zellulärer
Debris, wie Proteine, Zellwände
oder Membranen, chromosomale DNA und Wirtsproteine zu entfernen.
Dieser Entfernungsschritt schließt typischerweise eine Fällung, eine
Zentrifugation, eine Filtration und/oder eine Sedimentation ein,
abhängig
vom Zelltyp und der ein gesetzten Lyseart. Falls die alkalische Lyse verwendet
wird, wird vorzugsweise das resultierende Lysat angesäuert, um
die chromosomale DNA und Wirtsproteine zu fällen. Dann werden Zelldebris
und andere Verunreinigungen vorzugsweise mit Standardmitteln entfernt,
wie Zentrifugation, Filtration oder Sedimentation, vorzugsweise
Zentrifugation. Der resultierende Überstand wird dann fakultativ
mit Kieselgur filtriert, um ihn zu klären und die Konzentration an
Wirts-RNA in Bezug auf den Überstand
zu reduzieren. Die Plasmid-DNA
kann aus dem geklärten
Filtrat unter Verwendung eines Fällungsmittels
unter geeigneten Bedingungen gefällt,
gesammelt und in einem Puffer resuspendiert werden. Darauf folgend
werden Wirts-RNA, Proteine und Lipopolysaccharide im Gegensatz zu
Plasmid-DNA bevorzugt aus dem Puffer mit einem Fällungsmittel unter Bedingungen,
die für
diesen Zweck geeignet sind, gefällt.
Schließlich
wird das Filtrat vorzugsweise gesammelt, die Plasmid-DNA wieder gefällt unter
Verwendung eines Fällungsmittels
unter dafür
geeigneten Bedingungen, und die gefällte Plasmid-DNA zur Verwendung
im TFF-Filtrationsschritt resuspendiert.
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Der
nächste
Schritt im Verfahren schließt
das Filtrieren der Lösung
durch ein TFF-Gerät
ein. Vor einem solchen Filtrieren kann die Plasmid-DNA mit einem
kurzkettigen, polymeren Alkohol behandelt werden, sodass sie nicht
an die TFF-Membran bindet, sofern dies angemessen ist. Ein schematisches
Diagramm eines TFF-Verfahrens ist in 1 von
WO 98/05673 gezeigt. Probeapparaturen zur Durchführung von HP-TFF sind in den 2, 3 und 4 von US-Pat. Nr. 5,256,294 gezeigt. Die
Filtrationsmembran wird, basierend auf z.B. der Größe und Konformation
der zu reinigenden Plasmid-DNA, ausgewählt und wird einen Molekulargewichts-Cutoff
von größer als
etwa 500 K Dalton (kD), bevorzugt etwa 500 kD bis 1000 kD, haben.
Im Allgemeinen sind die für
die TFF hierin geeigneten Membranen die von Gabler, supra, beschriebenen.
Sie sind typischerweise synthetische Membranen, entweder vom mikroporösen (MF)
oder Ultrafiltrations(UF)-Typ, wobei der Reverse- Osmose-(RO)-Typ normalerweise nicht
anwendbar ist aufgrund seiner kleinen Bereiche an Porengröße.
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Ein
MF-Typ hat Porengrößen typischerweise
von 0,1 Mikrometern bis 10 Mikrometern und kann so gefertigt werden,
dass er alle Partikel, die größer als
die eingestufte Größe sind,
zurückhält. UF-Membranen
haben kleinere Poren und werden durch die Größe des globulären Proteins,
das zurückgehalten
werden wird, charakterisiert. Sie sind erhältlich in Inkrementen von 1.000
bis 1.000.000 nominale Molekulargewichtsgrenzen (Dalton), was etwa
0,001 Mikrometern bis 0,05 Mikrometern entspricht. UF-Membranen,
die normalerweise asymmetrisch mit einem dünnen Film oder einer Haut auf
der oben liegenden Oberfläche,
die für
ihre Trennungskraft verantwortlich ist, sind, sind gewöhnlich am
meisten geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist für die Verwendung in kommerziellem
oder semi-kommerziellem Maßstab
gut angepasst. Es kann semi-kontinuierlich
durchgeführt
werden, d.h. auf Basis eines Durchflusses der Lösung, die die gewünschte Plasmid-DNA
enthält, über einen
Tangentialflussfilter hinweg, bis derartig eine gesamte, große Charge
filtriert worden ist, gefolgt von einer Stufe mit Durchflusstrennung
von Kontaminanten von der erwünschten
Plasmid-DNA. Waschstufen können
zwischen den Filtrationsstufen eingefügt werden. Die frischen Chargen
an Lösung
können
behandelt werden. Auf diese Art kann ein kontinuierlicher, zyklischer
Prozess durchgeführt
werden, um große
Erträge
an gewünschtem
Produkt in einer akzeptabel reinen Form und in relativ kurzen Zeiträumen zu
ergeben.
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Unter
diesen Bedingungen wird die Plasmid-DNA im Retentat zurückbehalten,
während
die kontaminierenden Substanzen, einschließlich vieler Proteine, Zellmembrandebris,
Kohlenhydrate, kleinen abgebauten Nukleotiden etc., durch die Membran
ins Filtrat passieren. Gewerbliche Quellen für Filtrationsgeräte schließen Pall-Filtron
(Northborough, MA), Millipore (Bedford, MA) und Amicon (Danvers,
MA) ein. Ein jedes Filtrationsgerät, das zur Durchführung von
TFF nützlich
ist, ist auch hier geeignet, einschließlich, z.B., ein Gerät mit flacher
Platte, eine spiralig gewundene Kartusche, eine Hohlfaser-, ein
Röhren-
oder Einzelblattgerät,
ein Offenkanalgerät
etc.
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Die
Oberflächenausdehnung
der verwendeten Filtrationsmembran wird von der Menge an zu reinigender
Plasmid-DNA abhängen.
Die Membran kann aus einem niedrig-bindenden Material sein, um Absorptionsverluste
zu minimieren und ist vorzugsweise haltbar, reinigbar und mit den
zu verwendenden Puffern chemisch kompatibel. Eine Anzahl an geeigneten
Membranen ist gewerblich erhältlich,
einschließlich
z.B. Zelluloseacetat, Polysulfon, Polyethersulfon und Polyvinylidendifluorid.
Vorzugsweise ist das Membranmaterial Polysulfon oder Polyethersulfon.
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Die
Filtration wird unter Verwendung von Tangentialstrom durchgeführt, um
den Probenpuffer zu zirkulieren, während er die Membranoberfläche kreuzt.
Während
der TFF wird ein Druck über
die Membran hinweg appliziert, welcher es kleineren Molekülen erlaubt,
die Membran zu passieren, während
das Retentat rezirkuliert wird. Typischerweise wird die Fließgeschwindigkeit
angepasst werden, um einen konstanten Transmembrandruck zu halten.
Im Allgemeinen wird die Filtration mit höheren Drücken und höheren Fließgeschwindigkeiten schneller
vorangehen, aber höhere
Fließgeschwindigkeiten
führen
wahrscheinlich zu einem Scheren der Nukleinsäure oder einem Verlust wegen
der Passage durch die Membran. Zusätzlich können verschiedene TFF-Geräte bestimmte
Begrenzungen für
den Druck bei ihrem Betrieb haben. Darum kann der Druck gemäß den Angaben
des Herstellers angepasst sein. Für Geräte mit einer flachen Platte
ist der Druck bevorzugt etwa 5 psi bis 30 psi, am stärksten bevorzugt
10 psi bis 15 psi. Die Zirkulationspumpe ist ausgewählt, um
minimales Scheren der Nukleinsäure
sicherzustellen. Typischerweise ist die Zirkulationspumpe eine peristaltische
Pumpe oder eine Diaphragmapumpe im Einspeisungskanal, und der Druck
wird kontrolliert, indem man das Retentat-Ventil einstellt.
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Die
Filtration wird im Allgemeinen im Diafiltrationsmodus durchgeführt. Fakultativ
kann die Probenlösung
anfangs ohne Pufferzugabe filtriert werden, bis sie auf ein erwünschtes
Volumen aufkonzentriert ist. Sobald sie aufkonzentriert ist, wird
Diafiltrationspuffer zugegeben, und die Filtration wäscht weiterhin
das Retentat frei von verunreinigenden, kleinen Molekülen und
entfernt unerwünschte
Lösungsmittel
und Salze. Die Diafiltration kann entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich
sein. Vorzugsweise ist die Diafiltration kontinuierlich und wird
durchgeführt,
bis etwa 5 bis 500 Volumenäquivalente
ausgetauscht worden sind. Im Allgemeinen wird, abhängig von
der erforderlichen Reinheit, mehr Diafiltration bei erhöhten, an
die Nukleinsäuren
gebundenen Kontaminanten durchgeführt.
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Um
folgend an die TFF den Ertrag der gereinigten Plasmid-DNA weiter
zu verbessern, kann die Retentatlösung fakultativ durch die Filtrationseinheit
rezirkuliert werden, wobei das Permeat-Ventil mehrere Minuten lang
geschlossen ist, um restliche Plasmid-DNA zu entfernen. Das Retentat
wird gesammelt, und zusätzlicher
Diafiltrationspuffer wird zugegeben, um den Membranfilter zu waschen.
Das Retentat wird wieder gesammelt und mit dem ursprünglichen
Retentat, das die gereinigte Plasmid-DNA enthält, vereinigt. Die Einspeisungslösung kann
dann aufkonzentriert werden und dann gegen einen Puffer, wie TRISTM, dialysiert werden, um gereinigte Plasmid-DNA
zu erhalten.
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Durch
das TFF-Verfahren hierin gereinigte Plasmid-DNA kann direkt verwendet
werden oder kann weiter gereinigt werden, abhängig vom Spiegel und von der
Art der Kontamination in der Ausgangsprobe und der gewünschten
Verwendung. Die derartig gereinigte Plasmid-DNA kann für eine Anzahl
von Anwendungen verwendet werden, z.B. molekularbiologische Anwendungen,
wie Klonierung oder Genexpression, oder für diagnostische Anwendungen
un ter Verwendung von z.B. PCR, RT-PCR, Dendromerbildung etc. Für therapeutische
Verwendungen, z.B. zur Verwendung in der Gentherapie oder als Impfstoff
oder in der Genimmunisierung, kann es wünschenswert sein, die aus dem
TFF-Schritt erhaltene Plasmid-DNA weiter zu reinigen. Ionenaustauscherchromatographie
kann verwendet werden, um die Plasmid-DNA weiter zu reinigen.
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Die
Plasmid-DNA-Probe wird in einem Ladepuffer, der eine Salzkonzentration
umfasst, die unterhalb der Konzentration liegt, bei der die Plasmid-DNA
von der Säule
eluieren würde,
auf die Säule
geladen. Typischerweise wird die Salzkonzentration etwa 10 mS bis
50 mS betragen, abhängig
vom verwendeten Harz. Für schwächere Anionenaustauscherharze
wird eine Lösung
mit niedrigerer Leitfähigkeit
verwendet werden, wogegen für
stärkere
Anionenaustauscherharze eine Lösung
mit höherer
Leitfähigkeit
verwendet werden wird. Die Säule
wird dann mit mehreren Säulenvolumen
an Puffer gewaschen werden, um diejenigen Substanzen, die schwach
an das Harz binden, zu entfernen. Unter Verwendung eines flachen,
kontinuierlichen Salzgradienten gemäß üblichen Verfahren, z.B. unter
Verwendung von bis zu 1,5 M NaCl in einem Tris-HCl-Puffer, werden dann Fraktionen von
der Säule
eluiert. Fraktionen der Probe werden von der Säule gesammelt. Für Präparationen
im mittleren Maßstab
(z.B. von etwa 100 mg bis etwa 3 Gramm Plasmid-DNA) werden Fraktionen typischerweise
mindestens 50 mL bis 2 Liter betragen, wo der Peak der Plasmid-DNA
erwartet wird, und dann nach dem erwarteten Peak dem Volumen nach
erhöht.
Analytische Bestimmungen von Plasmid-DNA-Ertrag und -Reinheit werden
an jeder Fraktion durchgeführt.
Zusätzlich
können
Analysen mit Limulus-Ameobocytenlysat (LAL) an jeder Fraktion durchgeführt werden,
um die restlichen Endotoxinspiegel in jeder Fraktion zu bestimmen.
Fraktionen, die hohe Spiegel an Plasmid-DNA und niedrige an Endotoxin
enthalten, werden gepoolt.
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Wo
die gemäß dem obigen
Protokoll gereinigte Plasmid-DNA mit einem Lipidträger zur
Verwendung in der Gentherapie komplexiert werden soll, ist es wünschenswert,
die Plasmid-DNA in einen Puffer mit niedriger Leitfähigkeit
zu wechseln, vorzugsweise durch Diafiltration. Unter einem Puffer
mit niedriger Leitfähigkeit versteht
man, daß er
jeden Puffer mit weniger als etwa 10 mS, vorzugsweise weniger als
etwa 1 mS, einschließt.
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An
einer Vielzahl von Stellen im obigen Protokoll werden vorteilhaft
analytische Bestimmung von Plasmid-DNA-Ertrag und -Reinheit durchgeführt. Typischerweise
werden solche Assays vor und nach jedem Reinigungsschritt durchgeführt sowie
bei jeder Nukleinsäure
enthaltenden Fraktion aus, z.B. einer präparativen Ionenaustauscherchromatographie.
Bevorzugte Mittel zur Durchführung
dieser analytischen Bestimmungen schließen Hochleistungs-Flüssigchromatographie
(HPLC) oder Größenausschluss-Chromatographie
(SEC) zur Analyse der Reinheit, spektrophotometrische Schätzung des
Ertrags, Silberfärbung
und SDS-PAGE zur Proteinanalyse, und Agarosegel-Elektrophorese und Southern-Blotting
zur DNA-Analyse ein.
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Die
Erfindung wird durch Bezug auf die folgenden Beispiele vollständiger verstanden
werden. Diese sollten allerdings nicht dahingehend ausgelegt werden,
dass sie für
den Umfang der Erfindung limitierend wären. Alle hier erwähnten Literatur-
und Patentzitierungen sind ausdrücklich
durch Bezugnahme aufgenommen.
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BEISPIEL 1
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Materialien und Methoden
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Erzeugung von Faktor-VIII-Zellpaste
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Zur
Reinigung des Faktor-VIII-Plasmids wurden E. coli, die mit dem Gen
für Faktor
VIII transformiert waren (US-Pat. Nrn. 5,618,788 und 5,633,150),
in einem 10-L-Fermenter kultiviert und mit Cycloheximid behandelt,
um die Herstellung von Plasmid-DNA zu maximieren.
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Transformation von E.
coli und Fermentation über
Nacht
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Für die Reinigung
von anderen Plasmiden als Faktor VIII wurden transformationskompetente
E.-coli(DHSa)-Zellen (Gibco-BRL) nach dem Protokoll des Herstellers
für die
Amplifikation von Ampicillin-resistenten (AmpR)
Plasmiden transformiert. Übernachtkulturen
von Kolonien wurden in LB-Medium, das mit Carbenicillin (50 mg/mL)
supplementiert war, wachsen gelassen.
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Alkalische Lyse von E.
coli
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Alkalische
Lyse von E. coli basierte auf dem Verfahren von Birnboim und Doly,
supra, mit den wie unten angedeuteten Modifikationen. Die E.-coli-Zellen wurden in
8 mL 50 mM Glukose/25 mM Tris-HCl/10 mM EDTA (GTE), pH 8, pro Gramm
(Nassgewicht) Zellen suspendiert. Dann wurde insgesamt 0,8 mL einer
Lysozymlösung
(2 mg/mL in GTE) (Canadian Lysozyme Company, Abbotsford, British
Columbia) zugegeben, und nach dem Mischen wurden die Zellen 30 Min.
lang auf Eis inkubiert. Pro Gramm Zellen wurden insgesamt 16 mL
einer Lösung,
enthaltend 0,2 M NaOH und 1% SDS (oder ein anderes Detergens, wie
angegeben) zur Mischung zugegeben und über Nacht (oder wie angegeben)
bei Raumtemperatur unter langsamem, kontinuierlichem Rühren inkubiert.
Pro Gramm Zellen wurden insgesamt 12 mL 5 M Kaliumacetat, pH 4,8,
zugegeben, und nach dem Mischen wurde die Mischung in ein Eisbad
platziert. Nach 10 Min. Inkubation wurde die Mischung bei 13.000 × g 30 Min.
lang zentrifugiert. Der Überstand
wurde gesammelt und geklärt,
indem man ihn durch mehrere Lagen MIRACLOTHTM-Material
(Calbiochem-Novabiochem
Corporation, San Diego, CA, USA) schüttete.
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Plasmidreinigung unter
Verwendung von TFF
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Die
wie oben beschrieben aus E. coli isolierte Plasmid-DNA wurde in
einem TFF-Gerät
(TFF-Membrancassetten und Cassettenhalter waren von Pall Filtron
Corporation, Northborough, MA) unter Verwendung von 0,5 Quadrat-fuß einer
Polyethersulfonmembran pro 10–15
g prozessierter Zellen gereinigt. (Diese Menge wurde nach einer Übernacht-Schüttelkultur
typischerweise beobachtet.) Der nominale Molekulargewichts-Cutoff
der Membran war 500 kDa oder 1000 kDa. Die Zufließgeschwindigkeit
in das TFF-Gerät
wurde auf 0,5 Liter/min/sq.ft. Membran gesetzt. Experimente zeigten
an, dass die Ultrafiltrationsmembranen 15–20 Minuten Equilibrierung
mit dem geklärten Überstand
unter normalen Betriebsbedingungen benötigten, bevor die Ultrafiltration
initiiert wurde, um anfängliche
Ertragsverluste im Filtrat zu minimieren. Alle Experimente wurden durchgeführt, indem
man einen konstanten Transmembrandruck (TMP) beibehielt. In mehreren
Experimenten wurde bestimmt, dass der bevorzugte TMP etwa 10–15 psi
war. Unter diesen Bedingungen war die Filtrationsfließgeschwindigkeit
etwa 1,5 Liter/Stunde/sq.ft. Membran. Für die Reinigung des Plasmids
wurde die Zuflusslösung
zweifach aufkonzentriert und dann gegen 8–10 Diavolumen an 20 mM Tris-HCl,
pH 7,6, dialysiert.
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Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation
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Die
Isolierung von Plasmid unter Verwendung von Cäsiumchloridgradienten wurde
wie in Clewell und Helinski, supra, und Miller, "Meth. Enzymol.", 152: S. 145–170 (Berger und Kimmel, Hrsg.)
(Academic Press: San Diego, CA, USA, 1987) beschrieben durchgeführt.
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Größenausschluss-Assay
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Proben
wurden analysiert, indem man 100 μL
auf eine TSK-G5000PWTM-Säule
(7,5 mm × 300
mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA), die in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, equilibriert
war, injizierte. Die Säule
wurde bei einer Fließgeschwindigkeit
von 1 ml/min gefahren. Der Säulenausfluss
wurde durch Absorption bei 260 nm überwacht. Elutionsvolumen für das Plasmid
wurden mit einem Standard verglichen, der durch das Cäsiumchloridverfahren
isoliert worden war.
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Transfektion von 293 Zellen
und Assay auf Faktor-VIII-Aktivität
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Die
hier gereinigten Plasmide wurden in 293 humane, embryonale Nierenzellen
transfiziert, die auf PS19-Medium, enthaltend 10% Hitze-inaktiviertes,
fötales
Rinderserum gehalten wurden. Lipid/DNA-Transfektionskomplexe wurden
unter Verwendung von Lipofektin-Reagens (BRL, Gaithersburg, MD)
und 1 μg
Plasmid-DNA pro Komplex gemäß den Anweisungen
des Herstellers gebildet. Diese Mischung wurde dann zu Zellen in
35-mm-Vertiefungen (Platten mit 6 Vertiefungen) gegeben, gefolgt
von der Zugabe von Medien. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion
wurden Medien geerntet und auf Faktor VIII hin unter Verwendung
eines ELISA-Assays und auf Faktor-VIII-Aktivität unter Verwendung des COATEST
VIII:C/4TM-Kits (Chromogenix AB, Moelndal,
Schweden) gemäß den Anweisungen
des Herstellers getestet.
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Proteinbestimmung
-
Die
Proteinkonzentration wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt
(Bradford, "Anal.
Biochem.", 72: S.
248–254
(1976)) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard.
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Ergebnisse
-
Faktoren, die sich auf
die Plasmidisolierung und -reinigung auswirken
-
Mehrere
verschiedene Arten von anionischen, kationischen und nicht-ionischen Detergenzien
wurden auf ihre Fähigkeit
hin analysiert, lösliches
Plasmid nach Lysozymverdau zu ergeben. Anionische Detergenzien waren
als Klasse am effektivsten bei der Plasmidfreisetzung. Zusätzlich zeigten
Restriktionsenzymverdaue mit EcoR1 (New England Biolabs, Beverly,
MA) der Plasmidzubereitungen, die sich mit anionischen Detergenzien ergaben,
nicht die Gegenwart von kontaminierender, genomischer DNA an. Schließlich fand
man, dass anionische Detergenzien als Klasse gelöste Plasmidzubereitungen ergaben,
die viel weniger Endotoxin enthielten (Tabelle 1). TABELLE
1 Der
Effekt von verschiedenen, bei der Solubilisierung des Faktor-VIII-Plasmids verwendeten
Detergenzien auf die sich ergebenden Endotoxinspiegel
-
Die
Wirkung einer Erhöhung
der Expositionsdauer gegenüber
Natriumhydroxid in Gegenwart von zwei verschiedenen, anionischen
Detergenzien wurde untersucht. Eine Erhöhung der Inkubationszeit resultierte
in einer offensichtlichen, zeitabhängigen Verringerung von sowohl
der allgemeinen Größe als auch
der Menge der kontaminierenden RNA. Nach 24-stündiger Inkubation war sowohl
bei den SDS-solubilisierten als auch den Cholat-solubilisierten
Zubereitungen wenig RNA detektierbar. Ohne dass man an eine bestimmte
Theorie gebunden ist, glaubt man, dass nach ausgedehnter Exposition
gegenüber alkalischen
Bedingungen kontaminierende RNA ausreichend abgebaut sein könnte, um
Reinigung von Plasmid-DNA von der RNA und anderen Kontaminanten
mit niederem Molekulargewicht (z.B. Protein, Endotoxin) durch TFF
zu erlauben. Zur Maximierung der Reinigung wurde die größte Membranporengröße ausgewählt, die
immer noch Retention des Plasmids aufzeigte. Sowohl 500.000 Da als
auch 1.000.000 Da nominaler Molekulargewichts-Cutoff-Membranen erfüllten diese
Bedingung. Ein anfängliches
Experiment unter Verwendung von Plasmid, das Natriumhydroxid und
SDS gegenüber
4 Stunden und 24 Stunden lang ausgesetzt war, zeigte an, dass eine
24-stündige
Exposition für
die Entfernung von RNA durch TFF bevorzugt war.
-
Charakterisierung des
gereinigten Faktor-VIII-Plasmids
-
Plasmid,
das wie oben beschrieben, isoliert worden war mit entweder einer
4- oder einer 24-stündigen Natriumhydroxid/SDS-Inkubation,
gefolgt von UF/DF-Reinigung, war mit Plasmid, das unter Verwendung
einer Standard-CsCl-Gradiententechnik
hergestellt worden war, vergleichbar, wenn auf Agarosegelen verglichen wurde.
Die Menge an mitaufreinigender RNA in der Plasmidzubereitung wurde
unter Verwendung eines Größenausschluss-Chromatographieassays
bewertet. Wie in 1 gezeigt,
wurde mehr als 99% der kontaminierenden RNA durch den Filtrationsschritt
entfernt. Die Proteinkonzentration in den resultierenden TFF-Pools reichte
von 10 μg/ml
bis 30 μg/ml,
was eine mehr als 95%-ige Reduktion des im Kaliumacetatüberstand
vorliegenden Gesamtproteins darstellt. In fünf getrennten Zubereitungen
war der Ertrag an Faktor-VIII-Plasmid 2,2 mg ± 0,8 mg Plasmid/g Zellen
(Nassgewicht). Endotoxinspiegel betrugen im Durchschnitt 2400 EU/ml ± 1700
EU/ml (n = 3).
-
Aktivität des mit
dem TFF-Verfahren gereinigten Plasmids
-
Plasmid-DNA,
enthaltend das Gen für
Faktor VIII, wurde durch das TFF-Verfahren
isoliert und mit dem gleichen Plasmid, das durch übliche CsCl-Verfahren (Miller,
supra) isoliert wurden war, auf die Fähigkeit, 293-HEK-Zellen zu transfizieren,
hin verglichen. Wie in Tabelle 2 zu sehen ist, hatte Plasmid-DNA,
die unter Verwendung der modifizierten, alkalischen Lyse und des
TFF-Verfahrens isoliert worden war, eine vergleichbare Aktivität mit Plasmid,
das unter Verwendung von CsCl-Gradienten isoliert worden war. TABELLE
2 Vergleich
von Expressionsspiegeln mit TFF- und CsCl-gereinigtem Faktor-VIII-Plasmid
-
Anwendung des Verfahrens
auf multiple Plasmide
-
Die
Robustheit des TFF-Verfahrens wurde bewertet durch Verwendung des
Verfahrens bei sechs verschiedenen Plasmiden mit verschiedener Größe, die
in E. coli transformiert worden waren und die man über Nacht
in Schüttelflaschen
wachsen ließ.
Wie man in Tabelle 3 sieht, ergab, unabhängig von der Größe des zu gewinnenden
Plasmids, jede Zubereitung ein Minimum an 2 mg gereinigter Plasmid-DNA
pro g Zellen (Nassgewicht). TABELLE
3 TFF-basierte
Plasmid-Isolierung unter Verwendung verschiedener Plasmide
-
Schlussfolgerungen
-
Hier
ist ein einfaches und skalierbares Verfahren zur Reinigung von großen Mengen
an transfektionskompetentem Plasmid beschrieben, das auf einem ausgedehnten
(etwa 4–24
Stunden) Lyse-/Solubilisierungsschritt basiert, gefolgt von Reinigung
unter Verwendung eines TFF-Schritts. Dieses Verfahren ergibt 7–20 mg Plasmid/Liter
an Übernachtkultur,
was um ein Mehrfaches höher
ist als zuvor berichtete Werte (Ishaq et al., supra; Kondo et al.,
supra; Chakrabarti et al., supra; Chandra et al., supra; Miller,
supra). Zusätzlich
zeigte man, dass unter Verwendung dieses Verfahrens isoliertes Plasmid
in einem Zelltransfektionsassay eine Aktivität hat, die mit unter Verwendung
von klassischen Verfahren isoliertem Plasmid vergleichbar ist.
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Die
unter Verwendung des TFF-Verfahrens beobachteten Spiegel an Endotoxin
waren höher
als die Spiegel, die bei Verwendung von alternativen Reinigungsverfahren
berichtet wurden (Miller, supra). Allerdings, entgegen vorherigen
Beobachtungen (Cotten et al., "Gene
Ther.", 1: S. 239–246 (1994);
Weber et al., "Biotechniques", 19: S. 930–940(1995)),
wirkten sich diese Spiegel an Endotoxin nicht nachteilig auf die
Fähigkeit
des Plasmids, Zellen zu transfizieren und Protein zu exprimieren,
aus. Weiter können
diese Spiegel an Endotoxin, soweit nötig, durch weitere Reinigung
im Wesentlichen entfernt werden, wie durch Ionenaustauscher-Chromatographie.
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Das
hier beschriebene, TFF-basierte Reinigungsverfahren ist leicht skalierbar
unter Verwendung der Standardprinzipien für das Vergrößern des Maßstabs von TFF. Schließlich wurde
die breite Anwendbarkeit dieses Verfahrens gezeigt durch seine wirksame
Implementierung bei mehreren verschiedenen Plasmiden mit unterschiedlichem
Molekulargewicht.
