DE60036226T2

DE60036226T2 - Verfahren zur skalierbaren reinigung von plasmid-dns

Info

Publication number: DE60036226T2
Application number: DE60036226T
Authority: DE
Inventors: Russel J. Rahway LANDER; Michael Rahway WINTERS; Francis Rahway MEACLE
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: EP1242442A4; CA2393479A1; CA2393479C; EP1242442A1; JP2004504006A; DK1242442T3; PT1242442E; JP4856833B2; AU2585901A; EP1242442B1; CY1107777T1; WO2001046215A1; AU781200B2; ATE371731T1; DE60036226D1; ES2291233T3; US20010044136A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft skalierbare Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades aus mikrobiellen Zellen. Die hier beschriebenen beispielhaft dargestellten Verfahren erläutern ein skalierbares, wirtschaftlich günstiges Protokoll zur Reinigung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades aus E. coli, welches nicht auf kostspieligen Chromatographieschritten während der nachgelagerten Aufarbeitung der Plasmidpräparation beruht und somit diese Methodik besonders geeignet für kommerzielle Plasmidreinigungsverfahren in großem Maßstab macht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fortschritte auf den Gebieten der Gentherapie und DNA-Vakzinierung haben einen Bedarf für die Herstellung und Reinigung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades in großem Maßstab geschaffen. Wie in einem kürzlichen Überblick (Prazeres et al., 1999, TIBTech 17: 169-174) ausgeführt, war es trotz früherer Arbeiten bezüglich Plasmid-DNA-Reinigungsmethoden in kleinem Maßstab schwierig, die Herstellung und Reinigung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades nach oben zu skalieren. Besonders problematisch waren die nachgelagerten Aufarbeitungsschritte, die größtenteils auf der alkalischen Lyse der geernteten Zellen, gefolgt von Ammoniumacetatfällung, beruhten, und weiteren anschließenden Aufarbeitungsschritte, die weitgehend auf Größenausschluss-, Anionenaustausch- und Umkehrphasen-Chromatographieschritten beruhten. Darüber hinaus sollte beachtet werden, dass die Kosten der Rohmaterialien, wie z.B. Harze und Puffer, für mehrfache Chromatographieschritte aufgrund der hohen Einheitskosten und geringen Kapazität für große DNA-Moleküle limitierend werden. Es ist bekannt, dass das kationische Detergens CTAB und verschiedene Formen von Silica für Plasmid-DNA-Präparationen in kleinem Maßstab verwendet wurden und nicht zur Herstellung von Plasmid-Vakzinen klinischen Reinheitsgrades bestimmt waren. Weder das Vermögen dieser Schritte zur Entfernung bestimmter Verunreinigungen noch deren Einsetzbarkeit für eine skalierbare Verfahrensgestaltung wurden erkannt. Jones (1963, Nature, 199: 280-2) offenbart die Verwendung von CTAB zur Isolierung von DNA. Del Sal et al. (1989, BioTechniques 7(5): 514-519) und Gustincich et al. (1991, BioTechniques 11(3): 298-301) verwenden CTAB zur Präzipitation von Plasmid-DNA aus geklärten E. coli-Lysaten in kleinem Maßstab bzw. von genomischer DNA aus kleinmaßstäblichen Präparationen von humanem Vollblut. Ishaq et al. (1990, Biotechniques 9(1): 19-24) offenbaren die Aufbringung von CTAB-gefällter Plasmid-DNA in kleinem Maßstab auf eine PZ523-Schleudersäule, welches ein gereinigtes Produkt ergibt, das mindestens als Matrize für die Subklonierung und Didesoxysequenzierung geeignet ist. Nichts von diesem Stand der Technik lehrt die Verwendung von detergens-basierten Präzipitationsschritten oder legt diese nahe, um Chargen von DNA-Plasmid klinischen Reinheitsgrades herzustellen.
Vogelstein & Gillespie (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76(2): 615-619) offenbaren eine Technik zur Abtrennung von Restriktionsenzymverdauungen von DNA aus Agarosegelen, wobei DNA in Gegenwart von konzentriertem Natriumiodid an Glas (Silica) gebunden, mit Ethanol gewaschen und bei einer niedrigen Salzkonzentration eluiert wird. Boom et al. (1990, J. Clin. Microbiol. 28(3): 495-503) und Carter & Milton (1993, Nucleic Acids Res. 21(4): 1044) offenbaren Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA, welche für die DNA-Sequenzierung geeignet ist. Plasmid-DNA in Gegenwart des chaotropen Agens Guanidinthiocyanat wird an Silica in Form von Diatomeenerde gebunden. Die immobilisierte Plasmid-DNA wird mit Ethanol gewaschen und bei niedrigen Salzkonzentrationen eluiert. Subtile Variationen dieser Technik sind offenbart in (1), PCT-Veröffentlichung WO 91/10331 ; (2) PCT-Veröffentlichung WO 98/04730 sowie (3) US-Patent Nr. 5,075,430 , erteilt an Little am 24. Dezember 1999, das ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA offenbart, welches auf der Adsorption der DNA auf Diatomeenerde in Gegenwart eines chaotropen Agens, gefolgt von Abtrennung und Elution der DNA, beruht; und (4) US-Patent Nr. 5,808,041 , erteilt an Padhye et al. am 15. September 1998, das ein Verfahren zur Nukleinsäureisolierung unter Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend Silicagel und Glaspartikel, in Gegenwart eines chaotropen Agens umfasst. Wiederum wurden diese Techniken nicht erfolgreich bei einer Methodik für großmaßstäbliche DNA-Plasmidpräparationen angewandt, welche für die Herstellung von Grammmengen von Plasmid-DNA für Formulierungen klinischen Reinheitsgrades zur Verabreichung an Menschen und andere potentielle Empfänger erforderlich sind.
US-Patent Nr. 4,923,978 , erteilt an McCormick am 8. Mai 1990, offenbart die Verwendung von Silica zur Reinigung von DNA durch die bevorzugte Bindung von proteinhaltigen Materialien.
US-Patent Nr. 5,576,196 , erteilt an Horn et al. am 19. November 1996, offenbart die Verwendung von Silica zur Reinigung von DNA durch die bevorzugte Bindung von RNA.
Die US-Patente Nr. 5,523,392 und 5,525,319 , erteilt an Woodard et al. am 4. Juni 1996 bzw. 11. Juni 1996, offenbaren Borsilikate, Phosphosilikate und Aluminiumsilikate, welche als bindende Oberflächen für die DNA-Reinigung verwendet werden können.
Die Internationale PCT-Anmeldung PCT/US96/20034 (Internationale Veröffentlichungsnummer WO 98/01464 ) offenbart die Verwendung von hydratisiertem Calciumsilicat, um selektiv organische Verbindungen von biologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Blut, zu trennen.
EP 0832 897 offenbart eine hydratisierte Zirkoniumsilikat-Zusammensetzung zur Reinigung von Nukleinsäuren.
Wiederum liefert keine der oben identifizierten Referenzen eine adäquate Anleitung für den Durchschnittsfachmann zur Bereitstellung einer Methodik für die Herstellung skalierbarer DNA-Plasmidchargen klinischen Reinheitsgrades, welche im Wesentlichen frei von Wirtszellprotein, Wirtszellendotoxin, genomischer DNA, genomischer RNA und Plasmidabbauprodukten, wie z.B. linearen und offen zirkulären Formen, sind. Diesbezüglich wäre es äußerst nützlich, ein skalierbares Plasmidreinigungsverfahren zu identifizieren, welches der Notwendigkeit von limitierend kostspieligen Chromatographieschritten enthebt, während es auch Grammmengen einer DNA-Plasmidpräparation, die von klinischem Reinheitsgrad ist, zur Verwendung bei mindestens humaner Vakzinierung und humanen Gentherapie-Anwendungen bereitstellt. Die vorliegende Erfindung betrifft und erfüllt diese Bedürfnisse durch Offenbarung eines skalierbaren Plasmidreinigungsverfahrens, welches vorzugsweise ein kationisches Detergens, wie z.B. CTAB, verwendet, um selektiv Plasmid-DNA in einem vorgelagerten Schritt zu präzipitieren, in Kombination mit nachgelagerten diskontinuierlichen Adsorptionsschritten in großem Maßstab unter Verwendung von hydratisiertem, kristallinem Calciumsilicat (hier "hcCaSiO₃") oder irgendeiner ähnlich wirkenden Verbindung zur Entfernung restlicher Verunreinigungen, wie z.B. genomische DNA, genomische RNA, Protein, Wirts-Endotoxin und Plasmidabbauprodukte wie lineare und offen zirkuläre Formen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades aus mikrobiellen Zellen, welche Verfahren ein skalierbares, wirtschaftliches Herstellungsverfahren repräsentieren, das Alternativen zur Herstellung und Reinigung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades in großem Maßstab bietet. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner mehrere Post-Lyse-Kernprozesse, welche zu der skalierbaren wirtschaftlichen Natur des DNA-Plasmidreinigungsverfahrens beitragen. Spezieller umfassen Post-Lyse-Schritte, sind jedoch nicht beschränkt auf, (1) einen zweiteiligen Präzipitations/Lösungsschritt, worin Plasmid-DNA mit einem Detergens (wie z.B. CTAB) entweder in einer einmaligen oder stufenweisen Weise präzipitiert wird, gekoppelt mit Konzentration und selektiver Lösung der CTAB-Präzipitat-Plasmid-DNA mit einer Salzlösung; (2) Entfernung von Endotoxin und anderen verbleibenden Verunreinigungen durch Adsorption auf hydratisiertem, kristallisiertem Calciumsilicat, (hcCaSiO₃), wiederum entweder in einer einmaligen oder stufenweisen Weise; und (3) Konzentration der gereinigten Plasmid-DNA durch alkoholische Präzipitation (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ethanol, Methanol und Isopropanol) oder ein anderes Konzentrationsverfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ultrafiltration. Diese Schritte können in Kombination eingesetzt werden, in weiterer Kombination mit zusätzlichen Reinigungsschritten, die im Stand der Technik bekannt sind, und/oder wobei mindestens einer der obigen Schritte weggelassen ist, vorzugsweise in Kombination mit anderen Methoden, die im Stand der Technik in Zusammenhang mit DNA-Plasmidreinigungstechniken bekannt sind.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erlauben eine Reinigung von DNA-Plasmid klinischen Reinheitsgrades aus mikrobiellen Zellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterienzellen, Pflanzenzellen, Hefe, Baculovirus, wobei E. coli der bevorzugte mikrobielle Wirt ist. Die Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades, welche mit den hier beschriebenen Verfahren gereinigt wurde, ist von großem Nutzen für die Verabreichung an Menschen als Vakzin oder Gentherapie-Vehikel.
Ein Vorteil des Plasmidreinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung beruht teilweise auf dem Befund, dass die stufenweise Präzipitation von DNA mit CTAB in Verbindung mit der Entfernung von verbleibenden Verunreinigungen durch Adsorption auf hcCaSiO₃ problematische Verunreinigungen, einschließlich genomischer DNA, RNA und DNA-Abbauprodukten, wie z.B. lineare DNA, mit einer bisher nicht bekannten Selektivität entfernt. Eine vollständige Verfahrensgestaltung, welches diese Präzipitations/Reinigungsschritte inkorporiert, ist der Kern der hier offenbarten Erfindung. Das offenbarte Verfahren ist auch skalierbar.
Ein weiterer Vorteil des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ist der Wegfall des Bedarfs für kostspielige Chromatographieharze auf Polymerbasis durch den alternativen Ansatz der selektiven Präzipitation und Adsorption für großmaßstäbliche Plasmidpräparationen.
Ein weiterer Vorteil des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es grundsätzlich für einen Betrieb im Produktionsmaßstab geeignet ist. Die Einheitsvorgänge bestehen aus Präzipitation, Filtration, Adsorption und Trocknung. Die Verwendung von Diatomeenerde liefert einen nicht komprimierbaren Filterkuchen und vermeidet Verstopfungsprobleme, die oft mit Fermentationsprodukten assoziiert sind.
Ein weiterer Vorteil des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es der Notwendigkeit der Zugabe von rekombinanter RNase, einem teuren Enzym, für die Entfernung von RNA bei einem oder mehreren Schritten während des Verfahrens enthebt.
Ein weiterer Vorteil des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass eine Präzipitation mit einem langkettigen Detergens, wie z.B. CTAB, zu Verringerungen der nachgelagerten Aufarbeitungsvolumina führt, welche bei der Entsorgung von lösungsmittel-enthaltenden Abwasserströmen im Produktionsmaßstab von Bedeutung sind.
Ein noch weiterer Vorteil des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass alkoholische (wie z.B. ethanolische) Präzipitation eine ideale Weise ist, um ein stabiles Massenprodukt zu erhalten, das bei hohen Konzentrationen resuspendiert werden kann, ohne die erwartete Scher-Schädigung, welche bei einer auf Membranen basierenden Konzentration auftritt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines kosteneffektiven Verfahrens für die großmaßstäbliche Reinigung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades aus prokaryotischen Wirten wie z.B. E. coli.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Post-Lyse-Schritten, welche zu einem skalierbaren wirtschaftlichen Verfahren für die großmaßstäbliche (d.h. skalierbare) Reinigung von Plasmid-DNA führen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die Post-Lyse-Schritte von (i) Präzipitation von Plasmid-DNA mit einem Detergens (wie z.B. CTAB) entweder in einer einmaligen oder stufenweisen Weise, gekoppelt mit der Konzentration und selektiven Lösung der CTAB-Präzipitat-Plasmid-DNA mit einer Salzlösung; (ii) Entfernung von Endotoxin und anderen verbleibenden Verunreinigungen durch Adsorption auf hydratisiertem, kristallisiertem Calciumsilicat (hcCaSiO₃) in einer einmaligen oder stufenweise Weise; und (iii) Konzentration der gereinigten Plasmid-DNA durch Alkohol (wie z.B. Ethanolpräzipitation) oder ein anderes Reinigungsverfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ultrafiltration. Diese Schritte können, in Kombination eingesetzt werden, in weiterer Kombination mit zusätzlichen Reinigungsschritten, die im Stand der Technik bekannt sind, und/oder wobei der erste der obigen Schritte weggelassen wird, vorzugsweise in Kombination mit anderen Methoden, die im Stand der Technik in Zusammenhang mit DNA-Plasmidreinigungstechniken bekannt sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren für ein kosteneffektives Verfahren für die großmaßstäbliche (d.h. skalierbare) Reinigung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades aus prokaryotischen Wirten, welches die Schritte umfasst: (i) Zelllyse; (ii) Lysatklärung mit diatomeenerde-gestützter Filtration; (iii) selektive Präzipitation von Plasmid-DNA unter Verwendung von Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), gefolgt von Filtration, um einen Plasmid-DNA enthaltenden Filterkuchen zu gewinnen; (iv) selektive Lösung des Plasmid-DNA enthaltenden Filterkuchens mit Salzlösung; (v) Adsorption von restlichen Verunreinigungen auf Calciumsilicat-Hydrat, gefolgt von Filtration; und (vi) Präzipitation von gereinigter Plasmid-DNA unter Verwendung von Alkohol (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Alkohol).
Wie hier austauschbar verwendet, beziehen sich die Begriffe "Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades" und "Plasmid-DNA pharmazeutischen Grades" auf eine Präparation von Plasmid-DNA, isoliert aus prokaryotischen Zellen, welche einen Reinheitsgrad aufweist, der für die Verabreichung an Menschen für irgendeine bekannte prophylaktische oder therapeutische Indikation annehmbar ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Gentherapie-Anwendungen und DNA-Vakzinierungs-Anwendungen.
Wie hier verwendet, bezieht sich "nicht-superspiralisierte Plasmid-DNA" auf jede DNA, die keine superspiralisierte Plasmid-DNA ist, einschließlich irgendeiner anderen Form von Plasmid-DNA, wie z.B. einfach gespaltener („nicked"), offen zirkulärer und linearer sowie genomischer Wirts-DNA.
Wie hier verwendet, bezieht sich "CTAB" auf – Hexadecyltrimethylammoniumbromid – oder – Cetyltrimethylammoniumbromid –.
Wie hier verwendet bezieht sich "hcCaSiO₃” auf – hydratisiertes, kristallines Calciumsilicat –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "STET-Puffer" auf einen Puffer, der etwa 50 mM Tris-HCl (~ H 7,0-9,0), etwa 50-100 mM EDTA, etwa 8 % Sucrose und etwa 2 % Triton^®-X100 umfasst.
Wie hier verwendet, bezieht sich "IPA" auf – Isopropanol –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "PEG" auf – Polyethylenglycol –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "gDNA" auf – genomische DNA –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "gRNA" auf – genomische RNA –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "LRA^TM" auf – Lipid removal agent^TM –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "EDTA" auf – Ethylendiamintetraessigsäure –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "SC" auf – superspiralisiert („supercoiled") –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "OC" auf – offen zirkulär –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "NTE” auf – normalisierte Trübungseinheiten –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "L" auf – Liter –.
Wie hier verwendet, bezieht sich "HPLC" auf – Hochleistungsflüssigkeitschromatographie –.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Verfahrens-Fließdiagramm, welches ein vierstufiges Kernverfahren umfasst, das die Zelldebris durch Klärung entfernt. Stufenweise CTAB-Präzipitation und Calciumsilicat-Adsorption entfernen Wirts-RNA, -DNA, -Protein und -Endotoxin sowie Plasmidabbauprodukte von offen zirkulärer und linearer DNA. Eine stabile Pulvermasse wird durch ethanolische Präzipitation gebildet.
2 zeigt ein Konzentrationsprofil während der Stufenpräzipitation mit CTAB. Plasmid-DNA wird über ein enges Detergens-Inkrement präzipitiert. Der Schritt ist selektiv für die Entfernung von Protein, RNA und Endotoxin, welche löslich bleiben.
3 zeigt eine selektive Lösung von Plasmid-DNA mit 0,2 M NaCl mit Agarosegelektrophorese. Genomische Wirts-DNA ist nur teilweise löslich und wird durch Filtration nach Lösung mit 0,2 M NaCl entfernt. Bei 1,2 M NaCl ist gDNA löslich.
4A-D zeigt eine Reinigung durch Adsorption von Verunreinigungen auf hcCaSiO₃ (LRA^TM). (A). Gleichgewichtsadsorption von Plasmid-DNA gegen die Natriumchloridkonzentration. (B). Adsorption von genomischer oder Wirts-DNA, wie gemessen durch qPCR. LRA^TM entfernt selektiv DNA nach 5 h gemischter Kontaktierung bei einer Konzentration von 1,2 M NaCl. Die Plasmidausbeute beträgt ca. 60 %. (C). Selektive Adsorption von Plasmidabbauprodukten auf hcCaSiO₃ in 1,2 M NaCl. Agarosegelelektrophorese von Flüssigphasen-Proben in Kontakt mit hcCaSiO₃ als Funktion der hcCaSiO₃-Konzentration (Spur 1: 32 g hcCaSiO₃/g DNA; Spur 2: 35 g hcCaSiO₃/g DNA; Spur 3: 40 g hcCaSiO₃/g DNA; Spur 4: 42 g hcCaSiO₃/g DNA; Spur 5: 45 g hcCaSiO₃/g DNA). Lineare, relaxierte offen zirkuläre Formen und Multimere (M) werden entfernt. (D). Selektive Adsorption von Plasmidabbauprodukten auf hcCaSiO₃ in 0,5 M NaCl. Agarosegelelektrophorese von Flüssigphasen-Proben in Kontakt mit 32 g hcCaSiO₃ pro g Gesamt-DNA als Funktion der Zeit (Spur 1: 3,3 h, Spur 2: 6,2 h, Spur 3: 10,8 h, Spur 4: 21,5 h). Lineare, relaxierte offen zirkuläre Formen und Multimere (M) werden entfernt.
5 zeigt die Präzipitation von Verunreinigungen durch 0,25-0,30 % Gew./Vol. CTAB unter Verwendung eines Lasentec^®-Partikelgrößen-Analysators. Die Zugabe von 1 %igem Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl zu gereinigtem Lysat in STET-Puffer wird nach 100 Minuten gestoppt, basierend auf einer abrupten Veränderung der Partikelzahlen. Präzipitierte Verunreinigungen werden durch Filtration entfernt. Zusätzliches CTAB wird zugegeben, um das superspiralisierte Plasmid zu fällen.
6 zeigt die DNA-Zusammensetzung von Proben aus Verfahrenssschritten, die im Beispielsabschnitt 1 offenbart sind. Superspiralisiertes Plasmid wird in der niedrigsten Bande sichtbar gemacht. Die höheren Banden repräsentieren verschiedene DNA-Verunreinigungen, einschließlich offen zirkuläres und lineares Plasmid, Plasmid-Multimere und genomische DNA. Dargestellt ist diatomeenerde-geklärtes Lysat (Spur 1; von links); Filtrat mit niedrigem Ausschluss bei 0,23 % Gew./Vol. CTAB (Spur 2); Filtrat mit hohem Ausschluss bei 0,30 % Gew./Vol. CTAB, enthaltend keine DNA (Spur 3); Präzipitat mit hohem Ausschluss in 0,4 M NaCl (Spur 4); Präzipitat mit hohem Ausschluss in 0,475 M NaCl (Spur 5); Präzipitat mit hohem Ausschluss in 0,5 M NaCl (Spur 6); 0,8-Mikron-Filtrat nach einem hcCaSiO₃-Adsorptionsschritt (Spur 7); hcCaSiO₃-Produkt, das einer Ethanolpräzipitation und erneuten Lösung in sterilem Wasser unterworfen wurde (Spur 8).
DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine skalierbare Methodik, die kostengünstige Herstellungsalternativen zur Herstellung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades repräsentiert. Spezieller betrifft ein Kern der Erfindung mehrere nachgelagerte (d.h. Post-Lyse-)Schritte, welche einschließen (1) einen zweiteiligen Präzipitations/Lösungsschritt, worin Plasmid-DNA mit einem Detergens (wie z.B. CTAB) entweder in einer einstufigen oder stufenweise Weise präzipitiert wird, gekoppelt mit der Konzentration und selektiven Lösung der CTAB-Präzipitat-Plasmid-DNA mit einer Salzlösung; (2) Entfernung von Endotoxin und anderen verbleibenden Verunreinigungen durch Adsorption auf hydratisiertem, kristallisiertem Calciumsilicat (hcCaSiO₃), wiederum entweder in einer einmaligen oder stufenweisen Weise; und (3) Konzentration der gereinigten Plasmid-DNA durch Alkohol (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, ethanol-, methanol- oder isopropanol-basierte Präzipitation) oder ein anderes Konzentrationsverfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt, auf Ultrafiltration. Wie hier beispielhaft dargestellt, sind die Schritte (1) und (2) mit nachfolgenden Filtrationsschritten assoziiert, um physikalisch verschiedene Zelllysat-Verunreinigungen von dem Gegenstand des Reinigungsverfahrens, der superspiralisierten Plasmid-DNA, zu trennen.
Es liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, bei diesen drei Kernschritten Schritte hinzuzufügen oder wegzulassen, um ein skalierbares Gesamtreinigungsverfahren zu formulieren, welches zur Gewinnung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades führt. Deshalb ist vorgesehen, dass der detergens-basierte Plasmid-DNA-Präzipitationsschritt weggelassen werden kann. Dieses angepasste Verfahren kann zusätzliche "Nicht-Kern"-Schritte einschließen, um das gesamte Reinigungsschema zu komplettieren. Jedoch werden die Kernschritte von (1) Detergens-Präzipitation und selektiver Salzlösung, (2) Adsorption an hcCaSiO₃ und (3) Plasmid-DNA-Konzentration, wahrscheinlicher die Basis bilden, von der aus die Reinigungsverfahren erweitert werden können, um zu einem skalierbaren Gesamtverfahren zu führen, das zusätzliche komplementäre Schritte inkorporiert. Diese komplementären Schritte können nach dem Ermessen des geschulten Fachmanns hinzugefügt werden, in Abhängigkeit von der Gesamtqualität von Plasmid-DNA, welche für eine spezielle Charge erforderlich ist. Diesbezüglich werden verschiedene Beispiele der Verwendung dieser drei Kernschritte als Basis für ein skalierbares Gesamtverfahren hier präsentiert, um die vorliegende Erfindung beispielhaft darzustellen, jedoch keineswegs zu beschränken. Der geschulte Fachmann kann sich nach bekannten Plasmidreinigungsschritten umsehen, um ein Schema bereitzustellen, das zu einem geeigneten Reinheitsgrad des DNA-Plasmids führt. Beispielsweise bieten die Internationalen PCT-Anmeldungen Nr. PCT/US95/09749 ( WO96/02658 ) und PCT/US96/07083 ( WO96/36706 ) eine Anleitung für alternative, chromatographie-basierte nachgelagerte Schritte, welche in Kombination mit den in diesem Absatz erwähnten Kernreinigungsschritten eingesetzt werden können, um ein effektives Reinigungsprotokoll zu ergeben. Beide Offenbarungen zeigen nachgelagerte Ereignisse (nach einem Wärmeaustauschschritt), welche Klärung, Ultrafiltration mit Benzonase für DNA- und Proteinentfernung, Zonenaustausch für weitere Proteinentfernung und Umkehrphasenchromatographie für Endotoxin, Lin/OC-Verunreinigungen und eine letzte Ultrafiltration zur Konzentration einschließen. Dementsprechend könnte, wenn nur hcCaSiO₃ eingesetzt wird, einem solchen Protokoll eine Klärung, Ultrafiltration und Ionenaustauschchromatographie wie in WO96/02658 und WO96/36706 beschrieben vorangehen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von superspiralisierter Plasmid-DNA aus einem Zelllysat einer mikrobiellen Fermentation, welches umfasst, dass superspiralisierte Plasmid-DNA durch eine detergens-induzierte Präzipitation präzipitiert wird. Dieser Teil der Erfindung wird beispielhaft dargestellt durch, jedoch nicht beschränkt auf, die Verwendung des Detergens Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Das Detergens von Interesse kann in einer einmaligen oder stufenweisen Weise zugegeben werden. Ein Beispiel einer stufenweisen Zugabe des Detergens ist die stufenweise Zugabe von CTAB (in diesem Fall, Zugabe einer 1 %igen Gew./Vol. CTAB-Lösung zu geklärtem Lysat in STET-Puffer) mit einer ersten CTAB-induzierten Präzipitation von etwa 0,25 % bis etwa 0,28 %, um Debris und nicht-superspiralisierte Plasmid-DNA herauszupräzipitieren, gefolgt von einer zweiten CTAB-induzierten Präzipitation von etwa 0,30 % bis etwa 0,33 %, um die superspiralisierte Plasmid-DNA zu präzipitieren, wobei diese Bereiche am besten in Einklang stehen mit der Verwendung eines Standard-STET-Lysepuffers (etwa 50 mM Tris-HCl (~ pH 7,0-9,0), etwa 50-100 mM EDTA, etwa 8 % Sucrose und etwa 2 % Triton^®-X100). Es wird im Rahmen des Vermögens des geschulten Fachmanns liegen, stufenweise Präzipitationsbereiche zu verändern, um sie an irgendwelche Besonderheiten verschiedener Puffersysteme anzupassen, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, den Einschluss eines triton^®-basierten Detergens oder des zweivalenten Kations EDTA in dem Lysepuffer, so dass eine geeignete Menge von Verunreinigungen zuerst von der verbleibenden Pufferlösung wegpräzipiert wird, die superspiralisierte Plasmid-DNA umfasst, welche dann mit einer zusätzlichen CTAB-induzierten Präzipitation präzipitiert wird. Wie oben in Bezug auf die Verwendung eines Standard-STET-Puffers festgestellt, wird es auch von Nutzen sein, Verbindungen wie EDTA und/oder triton^®-basierte Detergenzien in geeigneten Konzentrationen den verschiedenen Puffern zuzugeben, um zur Förderung der Präzipitation von Plasmid-DNA beizutragen. Diesbezüglich ist ein STET-Puffer von Nutzen als Zelllyse-Puffer, da er effektive Mengen an Triton^® und EDTA enthält. Diese Verbindungen liegen somit während des Lyseschritts vor, wobei EDTA die DNAse-Aktivität durch die Assoziation mit zweiwertigen Metallionen inhibiert, welche ansonsten DNAse aktivieren. Darüber hinaus löst Triton^® die E. coli-Zellmembran auf. Beide Komponenten werden zu dem/n CTAB-Schritt(en) weiter getragen. EDTA spielt weiterhin eine vorteilhafte Rolle, da die zweiwertigen Metallionen eine Komplexierung von Plasmid mit CTAB verhindern werden. Wichtiger ist die Wirkung von Triton^® bei der Wahl einer wirksamen CTAB-Konzentration für entweder einen einmaligen oder stufenweisen Ausschluss, um superspiralisierte Plasmid-DNA zu präzipitieren. Triton^® wechselwirkt mit CTAB und macht es erforderlich, CTAB bei einem gewissen Schwellenwert zuzugeben (z.B. 0,23 %, 0,25 %, 0,30 % etc., basierend auf einer 1 %igen CTAB-Beschickungslösung, die einem geklärten Lysat in STET- Puffer zugegeben wird), bevor superspiralisierte Plasmid-DNA präzipitieren kann. Deswegen ist der CTAB-Konzentrationsbereich sowohl von der Triton^®- als auch DNA-Konzentration abhängig. Diesbezüglich basiert ein Stufenbereich von beispielsweise 0,25-0,28 % CTAB und 0,28-0,33 % CTAB (wiederum basierend auf einer Beschickung von 1 %igem Gew./Vol. CTAB) auf dem Folgenden: die Menge für niedrigen Ausschluss ist eine Funktion der Triton^®-Konzentration, da Triton^® 22 Moleküle CTAB pro Triton^®-Mizelle bindet, wobei angenommen wird, dass jede Mizelle 140 Triton-Moleküle enthält, während die Menge für hohen Ausschluss eine Funktion der Konzentration der DNA-Konzentration ist, da jedes Plasmidmolekül 0,9 Äquivalente CTAB pro DNA-Nukleotid-Wiederholungseinheit bindet. In diesem speziellen Fall, der in Beispiel 1 ausgeführt ist, entspricht der zitierte Bereich von 0,25-0,28 % CTAB für eine Präzipitation mit niedrigem Ausschluss der Zugabe einer 1 %igen CTAB-Lösung zu einem Lysat-STET-Puffer, der 1 % Triton enthält. Der Bereich mit hohem Ausschluss von 0,28-0,33 % entspricht der Zugabe einer 1 %igen CTAB-Lösung zu der filtrierten Lösung mit niedrigem Ausschuss, welche von einer ursprünglichen geklärten Lysatlösung erhalten wurde, die 0,34 mg/ml Plasmid-DNA von etwa 84 %iger Reinheit enthielt. Der geschulte Fachmann kann die Menge an CTAB (für entweder eine einmalige oder stufenweise Präzipitation von superspiralisierter Plasmid-DNA) an einen speziellen Puffer am besten anpassen wie in Beispielsabschnitt 1 (visuelle Inspektion der DNA-Präzipitation) oder Beispielsabschnitt 2 (unter Verwendung eines Partikelgrößen-Analysators, um die DNA-Präzipitation zu inspizieren) beschrieben. Im letzteren Beispiel wird bei Verwendung eines Standard-STET-Puffers der geschulte Fachmann die Präzipitation mit einer Lasentec^®-Echtzeit-Trübungssonde beobachten, im Wissen, dass sie bei etwa 0,25 % beendet ist, durch Korrelation dieser CTAB-Konzentration mit der Triton^®-Konzentration, welche von Charge zu Charge konstant ist (etabliert bei der Lyse). Dieselbe Prozedur wird dann mit Lasentec^® bei der DNA-Präzipitation komplettiert, im Wissen, dass es etwa 1 mg/ml DNA ist, die dem Inkrement von 0,03 % (Differenz von 0,25 bis 0,28) entspricht, welches zur Präzipitation erforderlich ist. Der Fachmann wird sich dieser Zahlen bewusst sein in Fällen ohne Triton^® (oder Triton^®-Konzentrationen, die sich von einem Standard-STET-Puffer unterscheiden), wie z.B. bei einem Ansatz mit NaOH/KOAc-Lyse, oder falls die Fermentation zu einer sehr unterschiedlichen Plasmidkonzentration führt. Deshalb beeinflusst die erstere die Menge an CTAB für niedrigen Ausschluss und die letztere die Menge für hohen Ausschluss. Es ist bevorzugt, dass ein niedriger und hoher Ausschlussbereich durch einen Partikelgrößen-Analysator, wie z.B. einen Lasentec^®-Partikelgrößen-Analysator, bestimmt wird. Dieses Verfahren erhöht die Genauigkeit, um niedrige Ausschluss- und hohe Ausschlussbereiche genauer zu definieren, da die CTAB-Präzipitation von Plasmid über einen engen CTAB-Bereich geschieht. Deshalb können diese Bereiche näherungsmäßig bestimmt werden durch Messen wichtiger Variablen (wie z.B. die Triton^®- und Plasmid-DNA-Konzentration) und können auch spezifisch identifiziert werden durch entweder visuelle oder vorzugsweise instrumentell-gestützte Analyse von Partikeln in Lösung bei verschiedenen CTAB-Konzentrationen. Es wird hier beispielhaft dargestellt, dass die Verwendung eines Standard-STET-Puffers und einer 1 %igen Gew./Vol. CTAB-Lösung (in 40 mM NaCl) zu optimalen niedrigen und hohen CTAB-Ausschlüssen von etwa 0,25-0,28 % Gew./Vol. (niedrig) und 0,30-0,33 % (hoch) führen. Es versteht sich, dass solche Werte für Situationen gelten, in denen CTAB dem geklärten Lysat in STET-Puffer unter Verwendung einer 1 %igen Gew./Vol. CTAB-Zugabelösung zugegeben wird. Es ist annehmbar, nur als Beispiel, die Konzentration der CTAB-Zugabelösung zu verdoppeln (z.B. eine Zugabe von 2 %igem Gew./Vol. CTAB) und die Hälfte des Volumens (für dieselbe Masse an CTAB) zuzugeben. In diesem Fall würden die niedrigen und hohen Ausschlusskonzentrationen grob 0,29-0,33 % bzw. 0,35-0,40 % betragen. Diese Zahlen werden leicht normalisiert durch Umrechnung von einem numerischen Wert, der auf einem Gewicht/Volumen-Prozentsatz (% w/v) basiert, auf ein einfaches Verfahren, das auf der CTAB-Masse basiert, die pro Liter geklärten Lysats zugegeben wird. Beispielweise würde im selben Szenario wie im Beispielsabschnitt 1 beispielhaft dargestellt (ein Standard-STET-Puffer) eine CTAB-Konzentration für niedrigen Ausschluss erreicht werden durch Zugabe von 3,3 bis 3,9 g CTAB pro Liter geklärten Lysats, während eine Hochausschluss-CTAB-Konzentration erreicht würde durch Zugabe (über die erste Niederausschluss-Zugabe hinaus) von CTAB auf eine endgültige Menge von 4,3 bis 5,0 g CTAB pro Liter geklärten Lysats. Ein einmaliger oder stufenweiser CTAB-basierter Detergensschritt wird mit einem Filtrationsschritt verbunden sein, um ein Filterkuchen-Präzipitat (enthaltend superspiralisierte Plasmid-DNA) für die nachfolgende Salzlösung zu bilden. Darüber hinaus bleibt ein bevorzugter nachgelagerter Schritt die Konzentration von superspiralisierter Plasmid-DNA durch Ethanolpräzipitation oder Ultrafiltration. Die Verwendung einer alkohol-basierten (wie z.B. ethanol-basierten) Präzipitation ist insofern bevorzugt, als es möglich ist, wie hier gezeigt, superspiralisierte DNA durch Ethanolpräzipitation endgültig zu präzipitieren und weiter zu konzentrieren, was zu einem Pulverpräzipitat führt, das die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält. Es wird ersichtlich sein, dass dieser nachgelagerte Schritt mit irgendeiner der verschiedenen Kombinationen früherer Schritte angewandt werden kann, um superspiralisierte Plasmid-DNA endgültig von verbleibenden Verunreinigungen wegzureinigen, während auch die Plasmid-DNA konzentriert und eine Resuspension in einem besser verarbeitbaren Puffervolumen ermöglicht wird. Diese Ausführungsform beinhaltet auch (ein) Verfahren, das/die in diesem Absatz beschrieben wird/werden, in Kombination mit mindestens der Hinzufügung eines Schritts, welcher umfasst, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt ist auf, Klärung des Zelllysats vor der Zugabe von CTAB. Diatomeenerde (DE) wird zur beispielhaften Darstellung dieses Schritts verwendet, jedoch können andere Komponenten DE ersetzen, um das Zelllysat zu klären, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, andere cellulose-basierte Filterhilfen wie Solka Floc und Esosorb (Grauer). Die DE oder das andere Material, das zur Klärung des Zelllysats verwendet wird, kann durch irgendeine Flüssigkeit-Feststoff-Trennungstechnik, die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich, jedoch keineswegs beschränkt auf, Filtration und Zentrifugation, entfernt werden. Jedes Verfahren, das einen Lysat-Klärungsschritt inkorporiert, kann auch die hier offenbarten Konzentrationsschritte inkorporieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ethanolpräzipitation oder Ultrafiltration, wie hier erörtert.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit ein Verfahren zur Reinigung von superspiralisierter Plasmid-DNA aus einem Zelllysat einer mikrobiellen Fermentation, wobei ein Kernschritt die Zugabe von hydratisiertem, kristallisiertem Calciumsilicat (hcCaSiO₃) zu dem Zelllysat ist. Es wird hier gezeigt, dass entweder eine einmalige oder stufenweise Zugabe von hcCaSiO₃ zu dem Zelllysat zur Adsorption von restlichen Verunreinigungen weg von der superspiralisierten DNA führt. Wie oben festgestellt, betrifft ein weiterer Aspekt dieses Teils der Erfindung den/die Adsorptionsschritt(e) im vorherigen Absatz in Verbindung mit mindestens der Hinzufügung eines Schritts, welcher einschließt, jedoch nicht notwendiger Weise beschränkt ist auf, die Klärung des Zelllysats vor der Zugabe von CTAB. Wiederum ist DE ein Beispiel dieses zusätzlichen Schritts, beschränkt ihn jedoch nicht. Jede Kombination der Verfahrensschritte, die in diesem Absatz angegeben wurden, könnte auch einen Schritt der Konzentration der superspiralisierten Plasmid-DNA inkorporieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ethanolpräzipitation oder Ultrafiltration wie hier beschrieben. Die Hinzufügung eines oder mehrerer Schritte über einen hcCaSiO₃-Adsorptionsschritte hinaus (wie z.B. Lysatklärung und/oder ein Konzentrationsschritt mit Ethanol oder Ultrafiltration) kann erfolgen, ob einmalige oder stufenweise Adsorptionsschritte eingesetzt werden. Bei diesem Stadium eines Kernreinigungsschemas sind die primären Verunreinigungen CTAB, Endotoxin, genomische DNA und Plasmidabbauprodukte. Andere restliche Verunreinigungen (in niedrigeren Konzentrationen anwesend) umfassen Proteine, RNA, und möglicherweise Triton^®. Hydratisiertes Calciumsilikat wird all diese Verunreinigungen binden. Die genaue Menge an hcCaSiO₃, die für die Zugabe erforderlich ist, wird bestimmt durch (1) die Menge an vorhandener Verunreinigung; (2) die Pufferbedingungen (d.h. Salzkonzentration) und (3) möglicherweise andere Variablen, welche die Temperatur und den eingesetzten Salztyp bei dem Reinigungsverfahren einschließen. Die vorhandene Menge an Verunreinigungen kann abhängen von, ist jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, (i) wieviel CTAB zugesetzt wurde, falls überhaupt eingesetzt, (ii) Unterschiede von Charge zu Charge in der Fermentationsbouillon, welche die Masse an genomischer DNA, Plasmidabbauprodukten und Endotoxin beeinflussen könnten, und (iii) das eingesetzte Lyseverfahren, welches ebenfalls die Menge der genomischen DNA, Plasmidabbauprodukte und Endotoxin beeinflussen könnte. In Anbetracht dieser Variablen wird ersichtlich sein, dass die Menge an hcCaSiO₃, die während eines spezifischen Laufs zuzusetzen ist, variieren kann. Es wird erwartet, dass eine zuzusetzende Menge an hcCaSiO₃ im Bereich von bis zu etwa 200 g/l liegen würde, in Abhängigkeit von den oben beschriebenen Bedingungen sowie potentiellen Unterschieden in Abhängigkeit von der Charge von hcCaSiO₃, die während dieses spezifischen Laufs zur Verfügung gestellt wurde. Beispielsabschnitt 1 bietet eine Richtlinie in einem Bereich von etwa 25 g/l bis etwa 75 g/l. Wiederum können jedoch die Bedingungen für die hcCaSiO₃-Adsorption nach oben oder unten skaliert werden, in Abhängigkeit von den oben erläuterten Bedingungen, und somit möglicherweise die Zugabe von hcCaSiO₃ am oberen Ende des Bereichs hin zu 200 g/l erforderlich machen. Darüber hinaus wird hier gezeigt, dass eine höhere Konzentration an NaCl die Kapazität von LRA^TM für DNA und andere Verunreinigungen erhöht. Die Wirkung von LRA^TM für lediglich Plasmid-DNA ist in 4A gezeigt, jedoch scheint eine hohe Salzkonzentration die Kapazität von LRA^TM für die Bindung von genomischer DNA und anderen Verunreinigungen ebenfalls zu erhöhen. Somit wird es in einigen Fällen nützlich sein, höhere Salzkonzentrationen in Betracht zu ziehen, welche die Verwendung einer geringeren Menge des jeweiligen hcCaSiO₃ erlauben sollten. Es wird erwartet, dass geeignete Salzkonzentrationen in einem Bereich von, beispielsweise mit NaCl, bis zu etwa 5 M NaCl liegen können.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Reinigung von superspiralisierter Plasmid-DNA aus einem Zelllysat einer mikrobiellen Fermentation, welches die Inkorporation dreier unterschiedlicher Verfahrensschritte umfasst, nämlich (i) Präzipitieren der superspiralisierten Plasmid-DNA mit einer detergens-induzierten Präzipitation und erneutes Lösen des resultierenden Filterkuchens in einer Salzlösung; (ii) Zugeben von hcCaSiO₃ zu dem erneut aufgelösten superspiralisierten Plasmid, um restliche Verunreinigungen von der superspiralisierten Plasmid-DNA weg zu adsorbieren, resultierend in einer Lösung, welche die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält; und (iii) Konzentration der superspiralisierten Plasmid-DNA. Wiederum ist ein beispielhaftes Detergens CTAB, welches in einer einmaligen oder stufenweisen Weise zugegeben werden kann, hier teilweise beispielhaft dargestellt durch eine stufenweise Zugabe des Detergens (CTAB, als 1 %ige Gew./Vol. Beschickung) in einem auf STET basierenden Lysatpuffer mit einem ersten Ausschluss bei einer [CTAB] von etwa 0,25 % bis etwa 0,28 % und einem zweiten Ausschluss bei einer [CTAB] von etwa 0,30 % bis etwa 0,33 %. Wie in dieser Patentbeschreibung durchgehend angegeben (und im Beispielabschnitt 1 (visuelle Anzeige) und Beispielsabschnitt 2 beispielhaft dargestellt) liegt es im Rahmen des Vermögens des geschulten Fachmanns, anhand dieser Patentbeschreibung stufenweise Präzipitationsbereiche zu verändern, um sie an etwaige Besonderheiten verschiedener Puffersysteme anzupassen, so dass eine geeignete Menge an Verunreinigungen zuerst von der verbleibenden Pufferlösung wegpräzipitiert wird, die superspiralisierte Plasmid-DNA umfasst, welche dann mit einer zusätzlichen CTAB-induzierten Präzipitation präzipitiert wird. Wiederum wird es auch von Nutzen sein, Pufferkomponenten, wie z.B. EDTA und/oder triton-basierte Detergenzien, in geeigneten Konzentrationen zu den verschiedenen Puffern zuzugeben, um zur Förderung der Präzipitation von Plasmid-DNA beizutragen. Eine Salzlösung des gewonnen Filterkuchens (umfassend superspiralisierte Plasmid-DNA) wird in einer Pufferlösung von optimaler Ionenstärke und Zusammensetzung durchgeführt. Salz wird bis zu einer optimalen Konzentration zugegeben, um Plasmid zu lösen, während genomische DNA und andere Verunreinigungen nicht gelöst werden. Diese Konzentration wird bestimmt durch Messen der Konzentration an superspiralisiertem Plasmid in Lösung bei verschiedenen Salzinkrementen oder indirekt durch Messung der Lösungsviskosität. Zusätzliche Schritte (einer oder irgendeine Kombination) neben den oben genannten Kernschritten können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Lysatklärung und/oder einen Konzentrationsschritt mit Ethanol oder Ultrafiltration wie hier erörtert.
Eine weitere Ausführungsform umfasst die Inkorporation zusätzlicher Schritte, nämlich eine anfängliche Klärung des Zelllysats, in das Kernverfahren, um ein verbessertes Reinigungsschema zu ergeben. Diese spezielle Ausführungsform der Erfindung umfasst nachgelagerte Verfahrensschritte, welche umfassen (i) Lysatklärung, vorzugsweise mit diatomeenerde-gestützter Filtration oder Zentrifugation; (ii) einmalige oder stufenweise Präzipitation von Plasmid-DNA mit einem Detergens, wie z.B. CTAB, Salzlösung des resultierenden Filterkuchens; (iii) Entfernung verbleibender Verunreinigungen durch einmalige oder stufenweise Adsorption auf hcCaSiO₃; und (iv) anschließende alkoholische (z.B. ethanolische) Präzipitation der gereinigten Plasmid-DNA, welche ein stabiles Massenprodukt liefert, aus dem konzentrierte Formulierungslösungen unschwer hergestellt werden können.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche auf weiteren Schritten zusätzlich zu dem Kernverfahren beruht, umfasst einen vorgelagerten Schritt der Zelllyse, welcher durch irgendeine Anzahl von Verfahren durchgeführt werden kann, die derzeit dem Fachmann zur Verfügung stehen. Deshalb kann eine Kombination von Verfahrensschritten einen vorgelagerten Zelllyseschritt einschließen, um beispielsweise das folgende Verfahren einzuschließen: (i) Zelllyse; (ii) Lysatklärung wie hier erörtert; (iii) einmalige oder stufenweise Präzipitation von Plasmid-DNA mit einem Detergens, wie z.B. CTAB; (iv) selektive Lösung von Plasmid mit Salzlösung; (v) Entfernung verbleibender Verunreinigungen durch einmalige oder stufenweise Adsorption auf hcCaSiO₃; und (vi) anschließende alkoholische (z.B. ethanolische) Präzipitation der gereinigten Plasmid-DNA, welches ein stabiles Massenprodukt liefert, aus dem konzentrierte Formulierungslösungen unschwer hergestellt werden können. Irgendwelche bekannte Verfahren der Zelllyse werden für diesen vorgelagerten Schritt in Betracht gezogen. Eine bevorzugte Zelllyse-Methodik ist hier offenbart.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem ein zusätzlicher Schritt der Lysatklärung mit den Kernverfahrensschritten, Zelllyse und ein Salzlösungsschritt, kombiniert wird, was zu dem folgenden stufenweisen Verfahren führt, das einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf, die Schritte von (i) Zelllyse; (ii) Lysatklärung, vorzugsweise mit diatomeenerde-gestützter Filtration oder Zentrifugation; (iii) selektive Präzipitation von Plasmid-DNA mit einem Detergens, wie z.B. CTAB; (iv) selektive Lösung der Plasmid-DNA mit Salzlösung; (v) Adsorption restlicher Verunreinigungen auf hcCaSiO₃; und (vi) Präzipitation von gereinigter Plasmid-DNA unter Verwendung von Alkohol (wie z.B. Ethanol). Alternativen zur Verwendung von CTAB für die Plasmidpräzipitation, alkoholische Präzipitation und Klärungsmaterialien werden hier erörtert.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erlauben die Reinigung von DNA-Plasmid klinischen Reinheitsgrades aus mikrobiellen Zellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterienzellen, Pflanzenzellen, Hefe, Baculovirus, wobei E. coli der bevorzugte mikrobielle Wirt ist. Die Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades, welche mit den hier beschriebenen Verfahren gereinigt wurde, ist sehr nützlich zur Verabreichung an Menschen als Vakzin oder Gentherapie-Vehikel.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methodik im großen Maßstab, welche kostengünstige Herstellungsalternativen zur Herstellung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades repräsentiert. Das Wesen der Erfindung konzentriert sich auf mehrere nachgelagerte Aufarbeitungsschritte, welche einschließen (i) stufenweise Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB; (ii) selektive Lösung von Plasmid mit Salzlösung; (iii) Entfernung restlicher Verunreinigungen durch Adsorption auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat; gefolgt von Konzentration des Endprodukts. Der Kern der vorliegenden Erfindung umfasst die obigen Schritte in einem skalierbar gestalteten Verfahren, um DNA-Plasmidpräparationen herzustellen, welche für die Verabreichung an Menschen geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades aus mikrobiellen Zellen. Die Plasmidreinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung basieren zum Teil auf Vorgängen, welche einschließen, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt sind auf: (i) Zelllyse; (ii) Lysatklärung mit diatomeenerde-gestützter Filtration; (iii) stufenweise Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB in Anwesenheit einer geeigneten Menge an Diatomeenerde; (iv) selektive Lösung des CTAB-Pellets mit einer Salzlösung; (v) Entfernung restlicher Verunreinigungen durch Adsorption auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat; und (vi) anschließende alkoholische Präzipitation der gereinigten Plasmid-DNA, welche ein stabiles Massenprodukt liefert, aus dem konzentrierte Formulierungslösungen unschwer hergestellt werden können.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst eine großmaßstäbliche Plasmidpräparation mehrere nachgelagerte Aufarbeitungsschritte, welche einschließen (i) stufenweise Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB; (ii) selektive Lösung von Plasmid mit Salzlösung; (iii) Entfernung restlicher Verunreinigungen durch Adsorption auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat; und (iv), vorzugsweise, die anschließende alkoholische (wie z.B. ethanolische) Präzipitation der gereinigten Plasmid-DNA, welche ein stabiles Massenprodukt liefert, aus dem konzentrierte Formulierungslösungen unschwer hergestellt werden können. Für den Fachmann wird ersichtlich sein, dass Aspekte des gestalteten Verfahrens austauschbar sind, einschließlich Schritt (iv), wie hier offenbart.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung folgt der Zelllyse eine Filtration mit Diatomeenerde in einer Menge, welche das Zelllysat effektiv klärt. Diesem Anfangsschritt folgen mindestens die zusätzlichen nachgelagerten Schritte wie oben angegeben, nämlich (i) stufenweise Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB; (ii) selektive Lösung von Plasmid mit Salzlösung; (iii) Entfernung restlicher Verunreinigungen durch Adsorption auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat; und (iv) vorzugsweise eine ethanolische Präzipitation der gereinigten Plasmid-DNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine vollständige Zelllyse vor der Lysatklärung die Leitung von Zellen, die aus der Fermentationsbouillon geerntet wurden, oder der Fermentationsbouillon direkt, entweder mit oder ohne Lysozymbehandlung, vorzugsweise mit einer Lysozymbehandlung, durch eine Wärmeaustauschvorrichtung wie offenbart in den Internationalen PCT-Anmeldungen Nr. PCT/US95/09749 ( WO96/02658 ) und PCT/US96/07083 ( WO96/36706 ). Diesem Lyseschritt folgt der Einschluss der folgenden Schritte nach der Zelllyse, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, (i) eine selektive zweistufige Präzipitation von Plasmid-DNA unter Verwendung eines kationischen Detergens, vorzugsweise CTAB; (ii) selektive Lösung von Plasmid mit einer Salzlösung; (iii) Adsorption restlicher Verunreinigungen auf Calciumsilicat-Hydrat; und (iv) Präzipitation von gereinigter Plasmid-DNA unter Verwendung eines Alkohols (einschließlich jedoch nicht beschränkt auf, Ethanol, Methanol oder Isopropanol) vor der endgültigen Formulierung der Plasmidpräparation klinischen Reinheitsgrades. Diesbezüglich betrifft dieser Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von superspiralisierter Plasmid-DNA aus einer mikrobiellen Fermentation, welches umfasst (a) Ernten von mikrobiellen Zellen aus einer Fermentationsbouillon; (b) Resuspendieren der geernteten Zellen in einem Standard-STET-Puffer und Zugeben einer ausreichenden Menge einer Lyse-Lösung zu den geernteten mikrobiellen Zellen; (c) Erwärmen der mikrobiellen Zellen von Schritt (b) auf eine Temperatur zwischen von etwa 60°C bis etwa 70°C bis zu etwa 100°C in einem Durchfloss-Wärmetauscher, um ein Zelllysat zu bilden; (d) Kühlen des Zelllysats; (e) Klären des Zelllysats unter Einsatz von Filtration mit Diatomeenerde; (f) Präzipitieren von restlicher Zelldebris und Verunreinigungen mit einer ersten durch Cetyltrimethylammonium induzierten Präzipitation; (g) selektives Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit einer zweiten durch Cetyltrimethylammonium induzierten Präzipitation; (h) erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M umfasst; (i) Adsorbieren restlicher Verunreinigungen auf hydratisiertem, kristallisiertem Calciumsilicat in dem Puffer von Schritt (h); (j) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol; (k) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats; (I) Trocknen zur Entfernung von Ethanol; (m) erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und (n) Sterilisieren mittels Filtration durch ein 0,22 μm-Filter. Im Rahmen dieses Teils der Erfindung liegt es auch, die Schritte (j)-(n) wegzulassen, während der Puffer von Schritt (i) sterilisiert wird, gefolgt von DNA-Konzentration durch Ethanolpräzipitation, was zu einem Pulverpräzipitat führt, welches die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält. Wie hier beschrieben, können die ersten und zweiten CTAB-induzierten Präzipitationsschritte (über eine 1 %ige Gew./Vol. CTAB-Beschickung in einem Standard-STET-Puffer) effektiv in einem Bereich von etwa 0,25 % bis etwa 0,28 % beim ersten Ausschluss und von etwa 0,30 % bis etwa 0,33 % für einen zweiten Ausschluss legen. Es wird wiederum festgestellt, dass es innerhalb des Vermögens des geschulten Fachmanns liegt, anhand dieser Patentbeschreibung stufenweise Präzipitationsbereiche an irgendwelche Besonderheiten verschiedener Puffersysteme anzupassen, so dass eine geeignete Menge an Verunreinigungen zuerst von der verbleibenden Pufferlösung weg präzipitiert wird, die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält, welche dann mit einer zusätzlichen CTAB-induzierten Präzipitation präzipitiert wird. Es können Komponenten, wie z.B. EDTA und/oder triton-basierte Detergenzien wie hier erörtert, zugegeben werden, die in biologisch effektiven Konzentrationen innerhalb der verschiedenen Puffer von Nutzen sind, um zur Förderung der Präzipitation von Plasmid-DNA beizutragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine vollständige Zelllyse vor der Lysatklärung die Leitung von Zellen, die aus der Fermentationsbouillon geerntet wurden, oder der Fermentationsbouillon direkt, entweder mit oder ohne Lysozym, vorzugsweise in Anwesenheit von Lysozym, durch eine Wärmeaustauschvorrichtung wie offenbart in den Internationalen PCT-Anmeldungen Nr. PCT/US95/09749 ( WO96/02658 ) und PCT/US96/07083 ( WO96/36706 ). Diese Zelllyse-Prozedur initiiert das Protokoll, welches einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf, (i) Lysatklärung mit diatomeenerde-gestützter Filtration; (ii) eine selektive einstufige Präzipitation von Plasmid-DNA unter Verwendung eines kationischen Detergens, vorzugsweise CTAB; (iii) selektive Lösung von Plasmid mit einer Salzlösung; (iv) Adsorption restlicher Verunreinigungen auf Calciumsilicat-Hydrat; und (v) Präzipitation von gereinigter Plasmid-DNA unter Verwendung eines Alkohols vor der endgültigen Formulierung der Plasmidpräparation klinischen Reinheitsgrades. Diesbezüglich betrifft dieser Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von superspiralisierter Plasmid-DNA aus einem Zelllysat einer großmaßstäblichen mikrobiellen Fermentation, welches umfasst:

(a) Ernten mikrobieller Zellen aus einer Fermentationsbouillon;
(b) Resuspendieren der geernteten Zellen in einem Standard-STET-Puffer und Zugeben einer ausreichenden Menge einer Lyse-Lösung zu den geernteten mikrobiellen Zellen;
(c) Erwärmen der mikrobiellen Zellen von Schritt (b) auf eine Temperatur von zwischen 60°C und 70°C bis etwa 100°C in einem Durchlauf-Wärmetauscher, um ein Zelllysat zu bilden;
(d) Kühlen des Zelllysats;
(e) Klären des Zelllysats mittels Filtration mit Diatomeenerde;
(f) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Cetyltrimethylammoniumbromid;
(g) erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M umfasst;
(h) Adsorbieren von restlichen Verunreinigungen auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat in dem Puffer von Schritt (g);
(i) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol;
(j) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats;
(k) Trocknen zur Entfernung von Ethanol;
(l) erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und
(m) Sterilisieren mittels Filtration durch ein 0,22-μm-Filter.

Es liegt auch im Rahmen dieses Teils der Erfindung, die Schritte (i)-(m) wegzulassen, während der Puffer von Schritt (h) sterilisiert wird, gefolgt von DNA-Konzentration durch Ethanolpräzipitation, was in einem Pulverpräzipitat resultiert, welches die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält. Eine bevorzugte Lyse-Temperatur von Schritt (b) beträgt etwa 70°C bis etwa 80°C, während ein einziger CTAB-Ausschluss vorzugsweise bei einer Konzentration von CTAB von etwa 0,30 % bis etwa 0,33 % stattfinden kann (über eine Beschickung von 1 %igem Gew./Vol. CTAB in einem Standard-STET-Puffer), wiederum möglicherweise durch die Pufferbedingungen beeinflusst. Pufferkomponenten wie EDTA und Triton sind, wie an anderer Stelle festgestellt, für die Zugabe zu Puffern verfügbar, um den Plasmid-DNA-Ertrag zu steigern.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zelllyse durch eine Modifikation der Techniken wie von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acid Res. 7: 1513-1523) beschrieben durchgeführt, wobei die Modifikation darin besteht, dass die Zellen unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxid, gefolgt von KOAc-Neutralisation, lysiert werden. Diesem Zelllyse-Schritt folgt dann der Einschluss der folgenden Schritte nach der Zelllyse, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, (i) Lysatklärung mit diatomeenerde-gestützter Filtration, (ii) selektive Präzipitation von Plasmid-DNA unter Verwendung eines kationischen Detergens, vorzugsweise CTAB, (iii) selektive Lösung von Plasmid mit einer Salzlösung und (iv) Adsorption restlicher Verunreinigungen auf Calciumsilicat-Hydrat vor der endgültigen Formulierung der Plasmidpräparation klinischen Reinheitsgrades. Diesbezüglich betrifft ein Aspekt dieses Teils der Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von superspiralisierter Plasmid-DNA aus einem Zelllysat einer großmaßstäblichen mikrobiellen Fermentation, welches umfasst:

(a) Ernten mikrobieller Zellen aus einer Fermentationsbouillon;
(b) erneutes Suspendieren der geernteten Zellen in einem Standard-STET-Puffer und Zugeben einer ausreichenden Menge von Lysozym/Alkali/KOAc zur Förderung von Zelllyse zu den geernteten mikrobiellen Zellen, um ein Zelllysat zu bilden;
(c) Klären des Zelllysats mittels Filtration mit Diatomeenerde;
(d) Präzipitieren von restlicher Zelldebris und Verunreinigungen mit einer ersten durch Cetyltrimethylammonium induzierten Präzipitation;
(e) selektives Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit einer zweiten durch Cetyltrimethylammonium induzierten Präzipitation;
(f) erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M enthält;
(g) Adsorbieren restlicher Verunreinigungen auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat in dem Puffer von Schritt (f);
(h) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol;
(i) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats;
(j) Trocknen zur Entfernung von Ethanol;
(k) erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und
(l) Sterilisieren mittels Filtration durch ein 0,22-μm-Filter.

Es liegt auch im Rahmen dieses Teils der Erfindung, die Schritte (h)-(l) wegzulassen, während der Puffer von Schritt (g) sterilisiert wird, gefolgt von DNA-Konzentration durch Ethanolpräzipitation, was zu einem Pulverpräzipitat führt, das die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält. Wie hier beschrieben, können die ersten und zweiten CTAB-induzierten Präzipitationsschritte (über eine Beschickung von 1 %igem Gew.Vol. CTAB in einem Standard-STET-Puffer) effektiv in einem Bereich von etwa 0,25 % bis etwa 0,28 % für den ersten Ausschluss und von etwa 0,30 % bis etwa 0,33 % für einen zweiten Ausschluss liegen. Es wird wiederum festgestellt, dass es innerhalb des Vermögens des geschulten Fachmanns liegt, anhand dieser Patentbeschreibung stufenweise Präzipitationsbereiche zu verändern, um sie an irgendwelche Besonderheiten verschiedener Puffersysteme anzupassen, so dass eine geeignete Menge von Verunreinigungen zuerst von der verbleibenden Pufferlösung weg präzipitiert wird, die superspiralisierte Plasmid-DNA umfasst, welche dann mit einer zusätzlichen CTAB-induzierten Präzipitation präzipitiert wird. Pufferkomponenten, wie z.B. EDTA und/oder triton-basierte Detergenzien, können zugegeben werden, wobei solche Komponenten in biologisch effektiven Konzentrationen in den verschiedenen Puffern von Nutzen sind, um zur Förderung der Präzipitation von Plasmid-DNA beizutragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zelllyse mit dem modifizierten Verfahren von Birnboim & Doly durchgeführt, wobei, wie oben festgestellt, Zellen unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxid, gefolgt von KOAc-Neutralisation, lysiert werden. Diesem Zelllyse-Schritt folgt dann der Einschluss der folgenden Schritte nach der Zelllyse, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, (i) Lysatklärung mit diatomeenerde-gestützter Filtration, (ii) selektive Präzipitation von Plasmid-DNA unter Verwendung eines kationischen Detergens, vorzugsweise CTAB, (iii) selektive Lösung von Plasmid mit einer Salzlösung und (iv) Adsorption von restlichen Verunreinigungen auf Calciumsilicat-Hydrat, und (v) Präzipitation von gereinigter Plasmid-DNA unter Verwendung von Ethanol vor der endgültigen Formulierung der Plasmidpräparation klinischen Reinheitsgrades. Ein Aspekt dieses Teils der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von superspiralisierter Plasmid-DNA aus einem Zelllysat einer großmaßstäblichen mikrobiellen Fermentation, welches umfasst

(a) Ernten von mikrobiellen Zellen aus einer großmaßstäblichen Fermentation;
(b) erneutes Suspendieren der geernteten Zellen in einem Standard-STET-Puffer und Zugeben einer ausreichenden Menge an Lysozym/Alkali/KOAc, um die Zelllyse zu fördern, zu den geernteten mikrobiellen Zellen, wobei ein Zelllysat gebildet wird;
(c) Klären des Zelllysats mittels Filtration mit Diatomeenerde;
(d) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Cetyltrimethylammoniumbromid;
(e) erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M umfasst;
(f) Adsorbieren von restlichen Verunreinigungen auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat;
(g) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol;
(h) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats;
(i) Trocknen zur Entfernung von Ethanol;
(j) erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und
(k) Sterilisieren mittels Filtration durch ein 0,22-μm-Filter.

Es liegt auch im Rahmen dieses Teils der Erfindung, die Schritte (g) – (k) wegzulassen, während der Puffer von Schritt (f) sterilisiert wird, gefolgt von DNA-Konzentration mittels Ethanolpräzipitation, was zu einem Pulverpräzipitat führt, welches die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält. Eine bevorzugte Lyse-Temperatur von Schritt (b) beträgt etwa 70°C bis etwa 80°C, während ein einzelner CTAB-Ausschluss (über eine Beschickung von 1 %igem Gew./Vol. CTAB in einem Standard-STET-Puffer) vorzugsweise bei einer CTAB-Konzentration von etwa 0,30 % bis etwa 0,33 % stattfinden kann, wiederum möglicherweise beeinflusst durch die Pufferbedingungen. Pufferkomponenten wie EDTA und Triton sind, wie an anderer Stelle festgestellt, für die Zugabe zu Puffern verfügbar, um den Plasmid-DNA-Ertrag zu steigern.
Die geernteten mikrobiellen Zellen werden in STET-Puffer gelöst und Lysozym wird wie oben beschrieben zugegeben. Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, dass Modifizierungen dieser Grundpufferformulierung vorgenommen werden können und zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Modifizierungen dieser Grundpuffer formulierung, die das Ergebnis des vorliegenden Verfahrens nicht wesentlich beeinflussen oder verändern, sind als im Rahmen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung anzusehen. Jedoch wird in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die selektive Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB wie in dieser Patentbeschreibung durchgehend beschrieben in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers durchgeführt, der einen Chelator umfasst, welcher effektiv zweiwertige Kationen wie Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺ entfernt. Magnesium ist ein essentieller Cofaktor für DNAse und Calcium komplexiert mit Plasmid-DNA und verhindert die Präzipitation durch CTAB. Es ist hier beispielhaft dargestellt und bevorzugt, dass der Chelator EDTA ist. Jedoch könnte irgendein Chelator, der zweiwertige Kationen wie Mg⁺⁺ und Ca den Puffern zugegeben werden, welche zur Ausführung der hier offenbarten Plasmid-DNA-Reinigungsverfahren verwendet werden. Es wurde von den Erfindern gezeigt, dass EDTA-Konzentrationen von 1 mM, 5 mM, 10 mM und 100 mM effektiv sind bei der Förderung der CTAB-induzierten Plasmid-DNA-Präzipitation. Deshalb kann jede physiologisch annehmbare Konzentration eines Chelators der Wahl, einschließlich EDTA, welche die CTAB-induzierte Plasmid-DNA-Präzipitation fördert, bei den anfänglichen stufenweisen Plasmid-DNA-Präzipitationsschritten verwendet werden.
Diatomeenerde (DE) ist ein locker zusammenhängendes pulveriges Material, das fast vollständig aus den Hüllfragmenten von Wasserdiatomeen gebildet ist. Gewöhnlich von feiner Textur und grauer oder weißer Farbe, besteht Diatomeenerde hauptsächlich aus Siliciumdioxid oder Silica in seiner reinen Form, mit einem Silicagehalt von so hoch wie 94 %. Diatomeenerde ist im Handel in drei Formen erhältlich: natürlich, calciniert und fluss-calciniert. Die calcinierte Form von DE wird durch Calcinierung bei hohen Temperaturen erzeugt, wohingegen fluss-calciniertes DE durch Calcinierung in Gegenwart eines Flussmittels, wie z.B. wasserfreies Natriumcarbonat oder Natriumchlorid, hergestellt wird. Diatomeenerde ist aus mehreren kommerziellen Quellen erhältlich und irgendeine und alle verfügbaren Formen werden für die Praktizierung der Verfahren der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Celpure 65, Celpure 100, Celpure 300, Celpure 100 und LRA^TM (alle von Advanced Minerals) sowie Cellulose-Filterhilfen wie Solka Floc. Wie oben festgestellt und hier beispielsweise dargestellt, ist die Klärung des Zelllysats mittels diatomeenerde-gestützter Filtration ein bevorzugter nachgelagerter Aufarbeitungssschritt, da dieser Schritt skalierbarer zu sein scheint und die Plasmid-DNA weniger Schereffekten als in einer großmaßstäblichen Zentrifugation ausgesetzt. Jedoch können andere Alternativen eingesetzt werden, um Wirtszelldebris und genomische DNA zu entfernen, beispielsweise Zentrifugation.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die selektive Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB, die in dieser Beschreibung durchgehend beschrieben wird, in einer stufenweisen Weise durchgeführt, wobei selektiv Zelldebris, gDNA und einige DNA-Abbauprodukte bei einer CTAB-Konzentration für niedrigen Ausschluss präzipitiert werden, gefolgt von einer zweiten CTAB-induzierten Hochausschluss-Präzipitation von Plasmid-DNA. Während CTAB für die stufenweise selektive Präzipitation von Plasmid-DNA bevorzugt ist, umfassen andere Verbindungen, welche von Nutzen sein können, C16: Cetyltrimethylammonium chlorid; C16: Cetyldimethylethylammoniumbromid oder -chlorid; C16: Cetylpyridiniumbromid oder -chlorid; C14: Tetradecyltrimethylammoniumbromid oder -chlorid; C12: Dodecyltrimethylammoniumbromid oder -chlorid; C12: Dodecyldimethyl-2-phenoxyethylammoniumbromid; C16; Hexadecylamin: Chlorid- oder Bromidsalz; C16: Hexadecylpyridiniumbromid oder -chlorid; und C12: Dodecylamin oder -Chloridsalz, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Es wird innerhalb des Vermögens des Fachmanns liegen, potentielle Ersatzstoffe für das hier beispielhaft dargestellte Detergens zu testen, um eine Verbindung zu identifizieren, welche effektiv superspiralisierte Plasmid-DNA von den verschiedenen Zelllysat-Verunreinigungen weg präzipitiert.
In der vorliegenden Erfindung wird die nachgelagerte diskontinuierliche Adsorption von Verunreinigungen in Gegenwart eines hydratisierten Calciumsilicats (hcCaSiO₃) durchgeführt, wie z.B. des synthetischen hydratisierten Calciumsilicats LRA^TM (Advanced Minerals Corporation, Lompoc, CA 93438). Es ist auch möglich, eine Adsorption im Säulenmodus ersatzweise für den Adsorptionsschritt mit hydratisiertem Calciumsilicat (hcCaSiO₃) einzusetzen. Beispielsweise wird bei Verwendung von LRA^TM zuerst eine Absetz-Dekantierung durchgeführt, um LRA^TM-Feinstoffe zu entfernen, gefolgt von Packen des LRA^TM in eine Säule. 10 Säulenvolumina an NaCl (bei derselben NaCl-Konzentration wie in der Plasmid-Beschickungslösung) werden auf die Säule aufgebracht, gefolgt von Aufbringen der Plasmidlösung. Superspiralisierte Plasmid-DNA ist die erste Form von DNA, die im Eluat eluiert. Spätere Fraktionen werden Plasmid-Abbauprodukte und genomische DNA enthalten. Endotoxin und CTAB werden ebenfalls durch feste Bindung an die Säule eliminiert. Fraktionen, die Nukleinsäureverunreinigungen enthalten, werden nicht gepoolt. Ein hydratisiertes Calciumsilicat-Material wird beschrieben in der Internationalen PCT-Anmeldung PCT/US96/20034 ( WO 98/01464 ). Wie in WO 98/01464 ausgeführt, sind viele Verfahren im Stand der Technik zur Herstellung von hcCaSiO₃-Verbindungen bekannt (siehe beispielsweise Taylor, 1964, Hrsg., The Chemistry of Cements, Academic Press). Wie weiter festgestellt in WO 98/01464 , kann die Partikelgröße von hcCaSiO₃ im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,10 Mikron liegen, wie bestimmt mit bekannten Verfahren, wie z.B. Röntgenstrahlmessung und/oder Elektronenmikroskopie. Von diesen kleinen Partikeln können Aggregate in einer Größe bis etwa 100 Mikron vorliegen. Wie im folgenden festgestellt, zeigt eine bevorzugte Ausführungsform das hcCaSiO₃ mit einer Retention auf einem 325-Mesh-Sieb von weniger als etwa 10 Gewichtsprozent, bevorzugter weniger als etwa 8 Gewichtsprozent. In vielen bevorzugten Ausführungsformen liegt das hcCaSiO₃ in Pulverform vor, mit einer Oberfläche von mehr als etwa 75 m²/g und vorzugsweise zwischen etwa 75 m²/g bis etwa 200 m²/g. Ein bevorzugtes hydratisiertes Calciumsilicat-Material, das hier verwendet wird, ist ein feines Pulver, hergestellt durch hydrothermale Reaktion von Diatomeenerde, hydratisiertem Calciumoxid (Calciumhydroxid) und Wasser. Das Endprodukt liegt in einer kristallinen Form vor, welche etwa 47 % Silicium (SiO₂) nach Gewicht, eine stöchiometrische Menge von Calcium (CaO) bei etwa 32 Gewichtsprozent, etwa 2,5 % Aluminium nach Gewicht (Al₂O₃), etwa 1,2 % kombiniertes Natrium (Na₂O) und Kalium (K₂O) nach Gewicht; etwa 0,7 % Eisen nach Gewicht (angegeben als Fe₂O₃); etwa 0,6 % Magnesium nach Gewicht (MgO) mit dem Rest (ungefähr 16,6 % H₂O) umfasst. Diese bevorzugte Form besitzt eine Retention auf einem 325-Mesh-Sieb von etwa 6 Gewichtsprozent und eine Oberfläche von etwa 120 m²/g (wie mittels Anwendung des B.E.T.-Verfahrens bestimmt). Die Prozentbereiche nach Gewicht der obigen Komponenten von CaSiO₃ können einschließen, sind jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf: SiO₂ (45-95 %); CaO (5-35 %); H₂O (1-20 %) und in einigen Fällen von etwa 1 % bis etwa 10 % verschiedener Verunreinigungen, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Al₂O₃, Oxide von Alkalimetallen wie Natrium (Na₂O) und Kalium (K₂O), Eisenoxid (Fe₂O₃) und Magnesiumoxid (MgO), sowie kleine Mengen an löslichem Aluminium. Es wird innerhalb des Vermögens des geschulten Fachmanns liegen, ersatzweise alternative Formen von auf hydratisierten Calcium basierenden Materialien zur Verwendung in dem Adsorptionsschritt einzusetzen, die selektiv größere DNA-Fragmente binden könnten, wie beispielhaft erläutert mit LRA^TM, Matrex^TM (Amicon) und Hydroxylapatit [zweibasisches Calciumphosphat]. Unabhängig davon ist ein synthetisches hydratisiertes Calciumsilicat mit ähnlichen Charakteristiken wie LRA^TM (wie offenbart in WO 98/01464 ) ein bevorzugtes Adsorptionsmaterial zur Entfernung von restlichen DNA-Abbauprodukten, wie z.B. offen relaxierten und linearen Formen, Wirts-DNA und -RNA, Endotoxin, Proteinen, und zur Klärung von Detergens-Additiven wie CTAB.
Deshalb resultieren die hier beschriebenen Verfahren in der Erreichung einer Trennung zwischen verschiedenen Formen von Plasmid (superspiralisierte Plasmid-DNA [das vorgesehene Produkt zur Verwendung als DNA-Vakzin oder Gentherapie-Vehikel], offen relaxierte Plasmid-DNA, lineare Plasmid-DNA und Plasmid-DNA-Concatamere) und zur Entfernung von Wirts-Verunreinigungen, wie z.B. LPS (Endotoxin), gRNA, gDNA und restliche Proteine.
Das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu isolierende und zu reinigende Plasmid kann irgendein extrachromosomales DNA-Molekül sein. Die Plasmide können in einer hohen Kopienzahl pro Zelle oder niedrigen Kopienzahl pro Zelle vorliegen. Die Plasmide können auch von praktisch jeder Größe sein. Es ist für Fachleute unschwer ersichtlich, dass praktisch jedes Plasmid in den mikrobiellen Zellen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert werden kann.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet sich zur Anwendung mit mikrobiellen Fermentationen allgemein. Es ist für Fachleute unschwer ersichtlich, dass eine breite Vielfalt von mikrobiellen Zellen zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterienzellen, Pflanzenzellen, Pilzzellen, einschließlich Hefe, und Baculovirus. Eine bevorzugte mikrobielle Fermentation ist eine bakterielle Fermentation von Zellen, welche das zu isolierende und zu reinigende Plasmid enthalten. Eine bevorzugte bakterielle Fermentation ist eine Fermentation von E. coli, welche das zu isolierende und reinigende Plasmid enthalten. Für Fachleute ist unschwer ersichtlich, dass andere bakterielle Fermentationen als E. coli-Fermenitationen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Die großmaßstäblichen mikrobiellen Fermentationen der vorliegenden Erfindung können in irgendeinem flüssigen Medium gezüchtet werden, welches für das Wachstum der verwendeten Bakterien geeignet ist. Während die offenbarte Methodik auf kleinere Fermentationsvolumina anwendbar ist, betrifft ein besonders nützlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung die Skalierbarkeit auf großmaßstäbliche mikrobielle Fermentationen. Der Begriff "großer Maßstab" wie hier verwendet, meint Gesamtzellfermentationsvolumina von mehr als etwa fünf Litern oder dass die Zellen von einem Fermentationsvolumen von mehr als etwa fünf Litern geerntet werden. Die großmaßstäbliche Fermentationsmethodik der vorliegenden Erfindung ist anwendbar auf Chargen klinischer Größe, welche repräsentieren, jedoch nicht beschränkt sind auf, etwa 100-200-Liter-Fermentationen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche jeden dieser oben identifizierten Schritte umfasst, besteht aus den folgenden Schritten: (i) Tangentialstromfiltration von Fermentationsbouillon, um Zellen, die Plasmid-DNA enthalten, zu konzentrieren und zu diafiltrieren, (ii) Resuspension von Zellen, (iii) Inkubation einer Zellaufschlämmung bei 37°C mit rekombinantem Lysozym, (iv) Zelllyse durch schnelles Erwärmen, gefolgt von Kühlen des Lysats, (vi) Klärung von Lysat mittels Filtration mit Diatomeenerde, (v) Präzipitation von restlicher Zelldebris und Verunreinigungen wie genomischer DNA durch die Zugabe von CTAB, (vi) selektive Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB, (vii) selektive erneute Lösung von Plasmid-DNA, (viii) diskontinuierliche Adsorption von restlichem Endotoxin und CTAB auf Calciumsilicat, (ix) diskontinuierliche Adsorption von restlichem Protein, Nukleinsäure und anderen Verunreinigungen auf hydratisiertem, kristallisiertem Calciumsilicat, (x) Präzipitation von Plasmid-DNA mit Ethanol, (xi) Filtration zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats, (xii) Vakuumtrocknung zur Entfernung von Ethanol, (xii) erneute Lösung von gereinigter Plasmid-DNA in Formulierungspuffer, und (xiii) 0,22-μm-Sterilfiltration.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden ungeerntete Zellen aus der Fermentationsbouillon mit Lysozym bei 37°C für etwa 1 h inkubiert und die Zellaufschlämmung wird durch einen Wärmetauscher gepumpt, der eine Austrittstemperatur von 75-80°C erreicht. Dem folgt das Pumpen durch einen zweiten Wärmetauscher, um das Lysat auf 20-25°C zu kühlen. Das Lysatmaterial wird (i) Klärung von Lysat mittels Filtration mit Diatomeenerde, (ii) Präzipitation von restlicher Zelldebris und Verunreinigungen wie genomischer DNA durch die Zugabe von CTAB, (iii) selektive Präzipitation von Plasmid-DNA mit CTAB, (iv) selektive Lösung von Plasmid-DNA, (v) diskontinuierliche Adsorption von restlichem Endotoxin und CTAB auf hydratisiertem, kristallinem Calciumsilicat, (vi) diskontinuierliche Adsorption von restlichem Protein, Nukleinsäure und anderen Verunreinigungen auf Calciumsilicat, (vii) Präzipitation von Plasmid-DNA mit Ethanol, (viii) Filtration zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats, (ix) Vakuumtrocknung zur Entfernung von Ethanol, (x) Lösung von gereinigter Plasmid-DNA in Formulierungspuffer, und (xi) 0,22-μm-Sterilfiltration unterworfen.
Mikrobielle Zellen, die das Plasmid enthalten, werden aus dem Fermentationsmedium geerntet, um eine Zellpaste oder Aufschlämmung zu ergeben. Jedes herkömmliche Mittel zum Ernten von Zellen aus einem flüssigen Medium ist geeignet, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zentrifugation oder Mikrofiltration. Eine Zellpaste wird erzeugt durch Ernten von mikrobiellen Zellen, welche die Plasmid-DNA enthalten, aus der Fermentationsbouillon. Die Ernte besteht aus (i) Konzentrieren der Zellen um einen Faktor 4 unter Anwendung von Tangentialstromfiltration über eine A/G Tech-Membran mit 500-kD-Nennmolekulargewicht und (ii) Diafiltrieren der konzentrierten Zellen mit drei äquivalenten Volumina von sterilisierter 120 mM Salzlösung. Die geernteten Zellen werden in sterilisiertem STET-Puffer (8 % Gew./Vol. Sucrose, 50 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 2 % Vol./Vol. Triton X-100, pH 8,5) auf eine Verdünnung resuspendiert, die einer optischen Dichte von 30 bei 600 nm entspricht. Die Suspension wird auf 37°C erwärmt und Ready-Lyse^TM-Lysozym von Epicentre Technologies wird bis zu einer . Konzentration von 500 kE/l zugegeben. Nach 45 Min. bei 37°C wird die Zellaufschlämmung durch eine Wärmetransferwendel gepumpt, die in siedendem Wasser eingetaucht ist, so dass deren Temperatur 70°C nach Austritt aus der Wendel erreicht. Das Lysat wird dann auf etwa 20°C gekühlt, indem es durch eine Wärmeübertragungswendel fließt, die in ein Eiswasserbad eingetaucht ist. Der Lyseschritt umfasst das Leiten der Zellaufschlämmung durch eine Wärmeaustauschvorrichtung wie offenbart in den Internationalen PCT-Anmeldungen Nr. PCT/US95/09749 ( WO96/02658 ) und PCT/US96/07083 ( WO96/36706 ). In Kürze, die geernteten mikrobiellen Zellen werden in STET-Puffer resuspendiert und Lysozym wird zugegeben wie oben beschrieben. Für Fachleute ist unschwer ersichtlich, dass Modifizierungen dieser Grundpufferformulierung vorgenommen werden können und zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Modifizierungen dieser Grundpufferformulierung, welche das Ergebnis des vorliegenden Verfahrens nicht wesentlich beeinflussen oder verändern, sind als im Rahmen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung anzusehen. Es ist jedoch besonders bevorzugt, dass dieser Schritt in Anwesenheit eines physiologisch annehmbaren Puffers stattfindet, der einen Chelator umfasst, welcher effektiv zweiwertige Kationen wie z.B. Mg⁺⁺ und Ca wie z.B. EDTA. Wie oben festgestellt, kann jede Chelatorkonzentration, welche die CTAB-induzierte Plasmid-DNA-Präzipitation fördert, eingesetzt werden, welches über einen weiten Konzentrationsbereich von etwa 1 mM bis mehr als 100 mM EDTA beispielhaft belegt wurde. Diese EDTA-Konzentrationsbereiche führen zu einer optimalen CTAB-induzierten Präzipitation von superspiralisierter Plasmid-DNA, während auch die DNAse-Aktivität inhibiert wird. Der pH-Bereich des Puffers kann entsprechend den besten erhaltenen Ergebnissen für den verwendeten speziellen Bakterienstamm eingestellt werden. Der bevorzugte pH-Bereich beträgt etwa 8,0-8,5. Die Suspension wird dann in einem Durchlauf-Wärmetauscher auf etwa 60-100°C erwärmt, wobei etwa 70-80°C bevorzugt sind. Diesem folgt ein Kühlen auf 20-25°C in einem zweiten Wärmetauscher. Ein alternatives Lyseverfahren von Birnboim und Doly (1979, Nucleic Acid Res. 7: 1513-1523) wird ebenfalls in Betracht gezogen. Bei diesem Verfahren werden Zellen unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxid, gefolgt von KOAc-Neutralisation, lysiert. SDS wird bei dem alkalischen Schritt weggelassen, um eine Störung der CTAb-induzierten DNA-Präzipitation zu verhindern. Die Lyseausbeute war durch das Weglassen von SDS nicht beeinflusst.
Diatomeenerde (Celpure^TM; Advanced Minerals) wird dann zu dem gekühlten Lysat in einer Konzentration von 30 g/l zugegeben. Die resultierende Aufschlämmung wird filtriert und der Kuchen gewaschen, um Produktflüssigkeit zu gewinnen. Celpure^TM wird dann in das gemischte Lysat mit etwa 10 g/l eingemischt. Restliche feinteilige Zelldebris und andere Verunreinigungen, einschließlich genomischer DNA und relaxierter zirkulärer und linearer DNA-Abbauprodukte, werden aus dem geklärten Lysat durch Zugabe von einer Lösung von 1,0 % Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl auf eine Endkonzentration von 0,1-0,3 % Gew./Vol. CTAB präzipitiert. Die resultierende Aufschlämmung wird filtriert, nach dem Vorsehen einer anfänglichen Rezirkulation bis die Trübung weniger als 10 NTE beträgt. Celpure^TM wird dem Filtrat mit einer Massenzugabekonzentration von etwa 10 g/l zugegeben. Dies ergibt eine Matrix, auf der die Plasmid-DNA nach Erhöhung der CTAB-Konzentration auf 0,25 %-0,45 % Gew./Vol. unter Verwendung von 1,0 %igem Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl präzipitiert. Die Aufschlämmung wird filtriert und das Filtrat wird rezirkuliert, bis dessen Trübung weniger als 10 NTE beträgt. In Beispiel 1 wurde der resultierende, mit Plasmid-DNA imprägnierte Filterkuchen mit 0,30-0,33 % Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl gewaschen. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass die CTAB-Bereiche für niedrigen Ausschluss und hohen Ausschluss entsprechend den Variationen in der Plasmid-DNA-Konzentration, Ionenstärke und/oder Temperatur manipuliert werden können. Der Filterkuchen wird dann in etwa 0,2 M bis etwa 2,0 M NaCl mit 100 mM Tris (pH 8,2) gelöst. Plasmid-DNA löst sich wieder auf, wenn das NaCl gegen CTAB ausgetauscht wird. Wiederum kann der geschulte Fachmann verschiedene Salzkonzentrationen wählen, um den Filterkuchen zu waschen und/oder erneut zu lösen. Die Suspension wird über eine Membran aus rostfreiem Stahl filtriert, um Celpure^TM zu entfernen, nachdem eine anfängliche Rezirkulation vorgesehen wird, um eine niedrige Trübung zu erreichen. Das Filtrat wird zwei diskontinuierlichen Adsorptionsschritten unter Verwendung von hcCaSiO₃ (z.B. LRA^TM von Advanced Minerals) unterworfen. Der erste Adsorptionsschritt entfernt restliches Endotoxin und CTAB; der zweite entfernt restliche Proteine, relaxierte zirkuläre und lineare DNA-Abbauprodukte sowie Wirts-DNA und -RNA. LRA^TM wird mit 45 Gramm pro Gramm DNA im ersten Adsorptionsschritt zugegeben. Die resultierende Aufschlämmung wird bei 20°C für 1 h inkubiert und filtriert. Der Filterkuchen wird mit 1,2 M NaCl gewaschen oder einer sinnvollen Salzkonzentration, wie oben festgestellt. Frisches LRA^TM wird dem Filtrat und der Waschlösung mit 50 Gramm pro Gramm DNA zugegeben und die resultierende Aufschlämmung wird bei 20°C für etwa 5 h inkubiert. Die Aufschlämmung wird dann filtriert, um LRA^TM zu entfernen, und der resultierende Filterkuchen wird mit 1,2 M NaCl gewaschen. Für den Durchschnittsfachmann wird ersichtlich sein, dass die obigen diskontinuierlichen Adsorptionsschritte durchgeführt werden können, indem das Calciumsilicat in die Lösung aufgeschlämmt wird, welche das rekonstruierte CTAB-Präzipitat enthält, oder die diskontinuierlichen Adsorptionsschritte können komplettiert werden unter Verwendung einer gepackten Säule, die hcCaSiO₃ umfasst, wie oben festgestellt bezüglich der Verwendung einer hcCaSiO₃-Säule zur Verwendung bei der Behandlung des gelösten CTAB-Zwischenprodukts. Ein äquivalentes Volumen an absolutem Ethanol wird dem Filtrat und der Waschlösung von dem zweiten hcCaSiO₃-Schritt zugegeben, um die gereinigte Plasmid-DNA zu präzipitieren. Das resultierende Präzipitat wird mittels Filtration gewonnen und sofort mit absolutem Ethanol gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wird mittels Vakuum bei 20°C getrocknet, um Ethanol zu entfernen, und wird anschließend bei 4°C bis zur erneuten Formulierung gelagert. Nach der Reformulierung in einem Puffer, der zur Injektion geeignet ist, wird die gereinigte Plasmid-DNA-Lösung einer 0,22-μm-Sterilfiltration unterworfen. Alternativ kann die Produktpulvermasse aus dem ethanolischen Präzipitat isoliert werden, wenn ein Präzipitat eine nicht-filtrierbare Paste bildet. Die präzipitierte Paste wird zentrifugiert und die Paste zu 100 %igem Ethanol zugegeben, das mit einem Hoch geschwindigkeitshomogenisator, wie z.B. einem Rotor-Stator, gemischt wird. Die Paste wird gleichzeitig dehydriert und nass zu harten Partikeln gemahlen. Diese Partikel sind einer Filtration und Trocknung zugänglich.
Wie oben festgestellt, kann statt der Präzipitierung einer Pulvermasse die gereinigte Plasmid-DNA-Präzipitation in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder eine Pufferlösung überführt werden. Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Pufferlösungen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen diejenigen, die in einer Vielfalt von Texten, wie z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben sind. Jedes geeignete Verfahren zur Konzentration einer DNA-Probe ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Solche Verfahren umfassen Ultrafiltration, Alkoholpräzipitation, Lyophilisierung und dgl., wobei die Ethanolreinigung bevorzugt ist. Die gereinigte Plasmidpräparation kann mit irgendeinem Sterilisationsverfahren sterilisiert werden, welches die Einsetzbarkeit des DNA-Produkts nicht beeinflusst, wie z.B. Sterilisation mittels Passage durch eine Membran mit einer ausreichend kleinen Porengröße, beispielsweise 0,22 Mikron und kleiner.
Das Endprodukt enthält Calcium, welches von einem lose gebundenen Zustand auf hcCaSiO₃ abgelöst wird. Eine typische Präparation könnte etwa 1,6 % Gew./Gew. in dem präzipitierten Produkt enthalten. Für die Präparation klinischer Formulierungen kann das restliche Calcium durch herkömmliche Verfahren, die EDTA beinhalten, entfernt werden. Beispielsweise kann eine Komplexierung von Calcium durch Zugabe von EDTA in Verbindung mit entweder Ultrafiltration oder Präzipitation durchgeführt werden und der Calcium-EDTA-Komplex mit den Präzipitationslaugen oder den Ultrafiltrationspermeatströmen ausgespült werden. Alternativ würde eine kleine chelierende Säule, die EDTA enthält, das Calcium effizienter entfernen, ohne EDTA in den Prozessstrom einzuführen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erlauben die Reinigung von DNA-Plasmid klinischen Reinheitsgrades aus Organismen, die Hefe und E. coli einschließen, jedoch in keiner Weise darauf beschränkt sind. Die Plasmid-DNA klinischen Reinheitsgrades, welche mit den hier beschriebenen Verfahren gereinigt wurde, ist äußerst nützlich zur Verabreichung an Menschen als Vakzin oder Gentherapie-Vehikel. Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der vorliegenden Erfindung erläutern.
BEISPIEL 1
Reinigung von Plasmid-DNA
Das folgende Protokoll für die Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli resultierte in der Isolierung von etwa 730 mg gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA. Ein Schema des hier offenbarten Kern-Plasmidreinigungsverfahrens ist in 1 gezeigt.
Celllyse – 600 ml Zellpaste wurden mittels warmem Leitungswasser aufgetaut und in 5,4 l STET-Puffer resuspendiert. Die 10fache Verdünnung ergab eine Aufschlämmung mit einer optischen Dichte von 30 bei 600 nm. 40 μl Ready-Lyse-Lysozyme (Epicentre, 30 kE/μl) wurden dann der Zellaufschlämmung zugegeben. Die Temperatur der verdünnten Zellaufschlämmung wurde auf etwa 40°C erhöht. Nach 45 Minuten Mischen wurden die Zellen wärme-lysiert unter Verwendung einer elektropolierten Wendel aus rostfreiem Stahl, die in ein siedendes Wasserbad eingetaucht war. Die Durchflussrate wurde so eingestellt, dass die Temperatur der Flüssigkeit, welche aus dem Wärmetauscher austrat, etwa 70°C betrug. Die Lyse-Wendel wurde dann mit pyrogen-freiem Wasser gereinigt, in ein Eiswasserbad eingetaucht und zur Kühlung des heißen Lysats auf 30°C verwendet. Das Lysat wurde innerhalb von 30 Min. nach Beendigung der Wärme-Lyse abgekühlt. Das gesamte Lysatvolumen betrug 5,6 l.
Klärung – Celpure P300 (Advanced Minerals) bei einer Massenzugabekonzentration von 30 g/l wurde zur Klärung des abgekühlten Lysats verwendet. Celpure P300 wurde in das Lysat gemischt und die resultierende Aufschlämmung wurde in vier Portionen aufgeteilt. Die Menge an Celpure kann über ein großes Spektrum variiert werden, in Abhängigkeit von dem endgültigen Maßstab der Operation, der erwünschten Filtergröße und -konfiguration und der erwünschten Produktionsrate der Herstellungsanlage. Ähnliche Erwägungen bestimmen die Mengen an Diatomeenerde in den hier beschriebenen Filtrationsschritten mit niedrigem Ausschluss und hohem Ausschluss. Jede Portion wurde separat durch ein 25-Mikron-Sieb aus rostfreiem Stahl filtriert, das in einem Filtergehäuse von 6 Zoll Durchmesser enthalten war. Das Filtrat wurde zunächst rezirkuliert, bis dessen Trübung auf etwa 10 NTE abnahm. Nach jeder Filtration wurde Druckluft dazu eingesetzt, eingeschlossene Flüssigkeit innerhalb des Filterkuchens zu verdrängen. Das Gesamtvolumen an geklärtem Lysat betrug 5,05 l. Die Gesamt-DNA-Konzentration und Reinheit von superspiralisierter Plasmid-DNA, wie gemessen durch einen analytischen HPLC-Assay, betrug 0,338 g/l bzw. 83,6 %.
CTAB-Sonde – Eine schnelle CTAB-Sondierung wurde zur Bestimmung der ungefähren CTAB-Konzentrationen für niedrigen und hohen Ausschluss eingesetzt. Inkrementelle Mengen an 1,0 %igem Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl wurden zu 500-μl-Aliquots von geklärtem Lysat in 1,5-ml-Glasgefäßen zugegeben. Die Gefäße wurden mechanisch verwirbelt ("gevortext"), und visuell hinsichtlich der Anwesenheit von DNA-Präzipitaten inspiziert. Auf Grundlage der Sondierungsergebnisse wurden CTAB-Konzentrationen für niedrigen und hohen Ausschluss von 0,23 bzw. 0,30 % Gew./Vol. bestimmt.
Niederausschluss-CTAB-Schritt – Zu 5,05 l geklärtem Lysat wurde eine 1,5-l-Lösung von 1,0 %igem Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 43 Minuten zugegeben. 34,2 g Celpure 300 wurden dann zugegeben. Die Aufschlämmung wurde dann durch ein 25-Mikron-Sieb aus rostfreiem Stahl, das in einem Filtergehäuse von 6 Zoll Durchmesser enthalten war, filtriert. Das Filtrat wurde zunächst rezirkuliert, bis dessen Trübung konstant war. Der Filterkuchen wurde nicht gewaschen, sondern unter Verwendung von Druckluft getrocknet. Das Endvolumen des Produkt-enthaltenden Filtrats betrug 6,44 l.
Hochausschluss-CTAB-Schritt – 29,3 g Celpure P300 wurde dem Niederausschluss-Filtrat zugegeben. Unter Rühren wurden dann 650 ml von 1,0 %igem Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl zu der Aufschlämmung über einen Zeitraum von etwa 30 Min. zugegeben. Analytische HPLC-Analysen offenbarten, dass die gesamte DNA präzipitiert war. Die Hochausschluss-Aufschlämmung wurde dann durch ein 25-Mikron-Sieb aus rostfreiem Stahl filtriert, das in einem Filtergehäuse von 6 Zoll Durchmesser enthalten war. Das Filtrat wurde rezirkuliert, bis eine konstante Trübung beobachtet wurde. Der Filterkuchen wurde mit 1 l einer Lösung von 0,3 % Gew./Vol. CTAB in 12 mM NaCl gewaschen, nachdem die Filtration der Hochausschluss-Aufschlämmung beendet war. Zwei 500-ml-Waschfraktionen wurden gewonnen. Der gewaschene Kuchen wurde dann partiell mit Hilfe von Druckluft getrocknet, aus dem Filtergehäuse gewonnen und gewogen, um die Masse an restlicher Flüssigkeit innerhalb des Kuchens zu bestimmen. Die Gesamtmasse des Kuchens betrug 113 g. Celpure und präzipitierte DNA trugen etwa 29 bzw. 2 g bei, was anzeigt, dass sich etwa 82 ml Restflüssigkeit in dem gewaschenen Kuchen befanden. 2 zeigt ein Konzentrationsprofil während der stufenweisen Präzipitation mit CTAB. Diese Daten zeigen, dass Plasmid-DNA über ein schmales Detergens-Inkrement präzipitiert. Dieser CTAB-Präzipitationsschritt ist selektiv für die Entfernung von Protein, RNA und Endotoxin, welche löslich bleiben.
Selektive erneute Lösung von gewaschenem Hochausschluss-Kuchen – 700 ml steriles Wasser wurden zu dem gewaschenen Hochausschluss-Kuchen zugegeben, was das Gesamtvolumen an Flüssigkeit auf etwa 782 ml brachte. Etwa 86 ml 5 M NaCl wurden der Aufschlämmung zugegeben, was eine NaCl-Konzentration von etwa 0,5 M ergab und die superspiralisierte Plasmid-DNA erneut löste. Restliche Diatomeenerde wurde durch ein 25-Mikros-Sieb aus rostfreiem Stahl gefiltert, das in einem Filtergehäuse von 6 Zoll Durchmesser enthalten war, um das Celpure von der erneut gelösten superspiralisierten Plasmid-DNA zu trennen. Das Filtrat wurde rezirkuliert, bis ein klares Filtrat erhalten wurde. Der Filterkuchen wurde mit etwa 1 10,5 M NaCl gewaschen, um eingelagerte Produkt-enthaltende Flüssigkeit zu gewinnen. Die 0,5 M NaCl-Waschlösung wurde in vier Fraktionen gewonnen. Ein analytischer HPLC-Assay wurde dazu verwendet, um das Produktfiltrat und die vier Waschfraktionen hinsichtlich Gesamt-DNA-Konzentration und Reinheit von superspiralisierter Plasmid-DNA zu untersuchen. Das Volumen, die Gesamt-DNA-Konzentration und die Zusammensetzung an superspiralisierter DNA aus dem Produktfiltrat und den 0,5 M NaCl-Waschlösungen waren wie folgt: (i) Produktfiltrat: 800 ml, 1,933 g/l, 93,0 %, (ii) Waschfraktion 1: 200 ml, 0,203 g/l, 89,1 %, (iii) Waschfraktion 2: 200 ml, 0,047 g/l, 70,3 %, (iv) Waschfraktion 3: 300 ml, 0,018 g/l, 61,4 % und (v) Waschfraktion 4: 300 ml, 0,015 g/l, 63,3 %. Die Waschfraktionen wurden dem Produktfiltrat aufgrund ihrer niedrigen Reinheit und Konzentration nicht hinzugefügt.
3 zeigt die selektive Lösung von Plasmid-DNA mit 0,2 M NaCl mit Agarosegelelektrophorese. Genomische Wirts-DNA ist nur teilweise löslich und wird durch Filtration nach Lösen mit 0,2 M NaCl entfernt. Bei 1,2 M NaCl ist gDNA löslich. Ein Bereich von mindestens etwa 0,2 M NaCl bis mindestens etwa 2 M NaCl wird für die selektive Lösung des CTAB-Präzipitats geeignet sein.
Behandlung des Ansatzes mit inkrementellen Mengen an LRA^TM – 735 ml von erneut gelöstem Präzipitat in 0,5 M NaCl wurden bei Raumtemperatur zu 45 g LRA^TM (Advanced Minerals) zugegeben. 500-μl-Proben wurden nach 4,8, 9,9, 19,1 und 19,6 h genommen. Tabelle 1 stellt die Gesamt-DNA-Konzentrationen und die Zusammensetzung an superspiralisierter Plasmid-DNA, wie gemessen mit einem analytischen HPLC-Assay, dar.
Periodisch wurden inkrementelle Mengen an frischem LRA^TM zu der Aufschlämmung zugegeben und Proben wurden zu den folgenden Zeiten genommen:

(i) 4,6 g LRA^TM wurden nach 19,9 h zugegeben (für 35 g LRA^TM/g DNA). Proben wurden nach 21,6, 23,8 und 25,4 h genommen;
(ii) 6,6 g LRA^TM wurden nach 25,8 h zugegeben (für 39,5 g LRA^TM/g DNA). Proben wurden nach 26,8, 27,8, 28,8 und 30,9 h genommen;
(iii) 3,7 g LRA^TM wurden nach 32,2 h zugegeben (für 42 g LRA^TM/g DNA). Proben wurden nach 32,4, 34,4 und 40,8 h genommen;
(iv) 3,98 g LRA^TM wurden nach 41 h zugegeben (für 45 g LRA^TM/g DNA). Proben wurden nach 41,8 und 42,6 h zugenommen; Wie in Tabelle 1 dargestellt, können weitere Erhöhungen der Plasmid-Reinheit (wie gemessen mit einem HPLC-Assay) mit den periodischen Zugaben von LRA^TM korreliert werden.

^TM

Zeit (h)	G LRA^TM/g DNA	Gesamt-DNA-Konzentration (g/l)	Zusammensetzung von superspiralisierter Plasmid-DNA (%)	Superspiralisierte Plasmid-DNA Ausbeute (%)
0	0	1,93	93,0	100
4,8	31,7	1,93	93,5	100
9,9	31,7	1,81	92,6	93,4
19,1	31,7	1,89	96,3	102
19,6	31,7	1,89	91,9	96,5
21,6	35	1,97	93,7	103
23,8	35	1,96	95,6	104
25,4	35	1,96	94,0	102
26,8	39,5	1,80	93,9	94,1
27,8	39,5	1,83	95,5	97,6
28,8	39,5	1,68	95,2	89,4
30,9	39,5	1,91	95,8	102
32,4	42	1,86	96,2	99,5
34,4	42	1,82	96,3	97,6
40,8	42	1,83	96,3	98,2
41,8	45	1,68	97,9	91,9
42,6	45	1,64	97,1	88,7

4A zeigt, dass die optimale Plasmid-Adsorption an Calciumsilicat bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,6 M im Vergleich zu höheren NaCl-Konzentrationen stattfindet. Es wird innerhalb des Vermögens des geschulten Fachmanns liegen, die NaCl-Konzentration innerhalb dieses angegebenen Bereichs zu manipulieren, ohne das Vermögen von LRA^TM zur Adsorption von superspiralisierter Plasmid-DNA zu beeinflussen. Die Optimierung dieses Schritts würde eine Untersuchung aller Faktoren beinhalten, welche das zugrunde liegende Phänomen von Wasserstoffbrückenbindung, hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen betrifft. Unter solchen Variablen sind Salzkonzentration, Salztyp, Temperatur, pH-Wert und Typ des Adsorbens. Beispielsweise könnte erwartet werden, dass andere Adsorbentien auf Calciumbasis, welche DNA binden, eine Trennung unter einem Optimierungsschema bieten, welches die obigen Lösungsphasenvariablen beinhaltet.

Entfernung und Waschen des LRA^TM – Nach 42,9 h wurde die LRA^TM-Aufschlämmung bei 19°C und 8 kUpM für 25 Min. zentrifugiert. Die resultierenden 400 ml Überstand wurden gewonnen. 200 ml frische 0,5 M NaCl wurden zu dem LRA^TM-Pellet zugegeben. Ein steriler Spatel und heftiges Schütteln für 10 Sek. wurde dazu verwendet, das LRA^TM-Pellet zu resuspendieren. Das resuspendierte LRA^TM wurde einer Zentrifugation für 10 Min. bei 8 kUpM unterworfen. Die Überstände wurden gewonnen und das LRA^TM-Pellet wurde zwei weitere Male auf diese Weise gewaschen. Der erste Überstand (400 ml) und die drei Waschlösungen (3 × 200 ml) wurden hinsichtlich Gesamt-DNA-Konzentration und Zusammensetzung an superspiralisierter Plasmid-DNA untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Waschlösungen wurden dem Produkt-Überstand nicht hinzugefügt. Der Produkt-Überstand wurde dann durch eine 0,8-Mikron-Einmal-Vakuumfiltereinheit steril filtriert, um restliches LRA^TM zu entfernen. TABELLE 2 Überstand der zentrifugierten LRA^TM-Aufschlämmung und Waschlösungen

Probe	Volumen (ml)	Gesamt-DNA-Konz. (mg/ml)	Zusammensetzung an superspiralisierter Plasmid-DNA (%)	Superspiralisierte Plasmid-DNA Masse (g)
Rekonst. CTAB-Präzip.	735	1,93	93,0	1,32
Überstand	400	1,80	97,1	0,70
Waschlösung 1	200	0,89	92,6	0,16
Waschlösung 2	200	0,55	84,1	0,09
Waschlösung 3	200	0,36	72,5	0,05

4B zeigt die Adsorption von genomischer oder Wirts-DNA über die Zeit. Spezieller zeigen diese Daten, dass LRA^TM selektiv DNA nach 5 h gemischter Kontaktierung bei einer Konzentration von 1,2 M NaCl entfernt, was zu einer Plasmid-Ausbeute von etwa 60 % führt. 4C ist eine Agarosegelelektrophorese von Flüssigkeitsphasen-Proben während LRA^TM-Kontaktierung bei 1,2 M NaCl. Diese Daten zeigen die Entfernung von linearen (Lin), relaxierten offen zirkulären (OC) Formen und Multimeren (M), während superspiralisierte Plasmid-DNA (SC) verbleibt. Die Spuren 1-5 repräsentieren zunehmende Zeiten und die Spuren 6-8 repräsentieren Waschlösungen von filtriertem LRA^TM. 4D zeigt die selektive Adsorption von Plasmid-Abbauprodukten auf hcCaSiO₃ in 0,5 M NaCl. Eine Agarosegelelektrophorese von Flüssigphasen-Proben in Kontakt mit 32 g hcCaSiO₃ pro g Gesamt-DNA als Funktion der Zeit ist gezeigt.
Ethanolpräzipitation von LRA^TM-Produkt – 400 ml absolutes Ethanol wurden langsam zu 400 ml Post-LRA^TM-Filtrat zugegeben. Die Zugabe von Ethanol wurde über einen Zeitraum von 2 h komplettiert, was eine endgültige Ethanolkonzentration von 50 % Vol./Vol. ergab. Die Lösung wurde im Bereich von 36 bis 38 % Vol./Vol. Ethanol sehr trüb. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Ethanolzugabe für 30 Min. gestoppt, um ein Partikelwachstum zu erlauben. Eine nähere Inspektion offenbarte feine filtrierbare Partikel. Nach 30 Minuten gemischter Alterung wurde die Suspension über ein steriles 0,22-Mikron-Filter (Millipore, GP-Expressmembran, 50 cm²) filtriert.
Etwa 500 ml absolutes Ethanol wurden zum Waschen des Kuchens verwendet. Die Filtereinheit wurde dann in einen Vakuumofen überführt und 2 h lang bei 27°C und 29 Hg getrocknet. 730 mg getrocknetes Pulver wurden gewonnen und in einem sterilen getönten Glasgefäß bei -20°C gelagert.
Tabelle 3 fasst die Reinheit und Ausbeute (wie gemessen durch einen analytischen HPLC-Assay) bei jedem Schritt des Verfahrens zusammen. Ausbeuten von etwa 100 % wurden über Niederausschluss-CTAB, Hochausschluss-CTAB und erneute Lösung von Hochausschluss-Präzipitat erreicht.

Tabelle 4 fasst die Clearance von Protein und Endotoxin zusammen. Das endgültige ethanolpräzipitierte Produkt wurde hinsichtlich Clearance von restlicher RNA, genomischer DNA, Endotoxin, Protein, CTAB, Lysozym, LRA^TM und Celpure P300 einem Assay unterworfen. TABELLE 3 Reinheit und Ausbeute bei jedem Schritt des Verfahrens

Probe	Volumen (ml)	DNA-Konz. (mg/ml)	SC-Reinheit (%)	SC-Konz. (mg/ml)	SC-Masse (mg)	Schrittausbeute (%)	Kumulative Ausbeute (%)
UCL	5600	-	-	-	-	-	-
CL	5050	0,338	83,6	0,283	1429	100,0	100,0
LCF	6440	0,265	83,6	0,222	1429	100,0	100,0
HCF	7100	0,0	-	0,0	0,0	-	-
RHCP	800	1,933	93,0	1,798	1438	100,6	100,6
RHCP*	735	1,933	93,0	1,798	1322	92,5	92,5
Post-LRA^TM	400	1,800	97,1	1,748	699	52,8	48,9

UCL: Ungeklärtes Lysat. CL: diatomeenerde-geklärtes Lysat. LCF: CTAB-Niederausschluss-Filtrat. HCF: CTAB-Hochausschluss-Filtrat, enthält wie erwartet keine DNA. RHCP: erneut gelöstes Hochausschluss-Präzipitat in 0,5 M NaCl. RHCP*: 735 ml Zugabe zu dem LRA^TM-Schritt, etwa 65 ml wurden in LRA^TM-Sondierungsstudien verwendet. Post-LRA^TM: 0,8-Mikron-Filtrat nach dem LRA^TM-Adsorptionsschritt. Ein analytischer HPLC-Assay wurde zur Messung der DNA-Konz., SC-Reinheit und SC-Konz. verwendet. TABELLE 4 Clearance von Protein, Endotoxin und RNA

Probe	Protein		Endotoxin		RNA
	(mg/ml)	(mg/mg SC)	(EU/ml)	(EU/mg SC)	(mg/ml)	(mg/mg SC)
CL	0,937	3,311	1,2e5	4,2e5	1,00	3,55
LCF	0,709	3,193	9,2e6	4,1e7	0,714	3,22
HCF	0,625	-	KA	-	0,647	-
RHCP	0,049	0,027	1,1e5	6,1e4	0,093	0,052*
Post-LRA^TM	NG	-	0,05	0,03	0,075	0,043*

Probenbeschreibungen sind in Tabelle 3 aufgeführt. NG: Nachweisgrenze. KA: Kein Assay. Der Proteingehalt wurde unter Anwendung des Lowry-Verfahrens gemessen. Der Endotoxin-Gehalt wurde unter Anwendung des LAL-Assays gemessen. *RNA-Konzentration wurde unter Anwendung des Orcinol-Assays gemessen. Hohe Konzentrationen an Plasmid-DNA stören den Orcinol-Assay: diese Störung wird in den für die RHCP- und Post-LRA^TM-Proben aufgelisteten RNA-Konzentrationen reflektiert. Das A260/A280-Verhältnis des Endprodukts war 1,9, ein Anzeichen eines niedrigen RNA-Anteils.
6 illustriert die DNA-Zusammensetzung von Proben aus den in diesem Beispielabschnitt beschriebenen Verfahrensschritten. Superspiralisiertes Plasmid wird in der niedrigsten Bande sichtbar gemacht. Die höheren Banden repräsentieren verschiedene DNA-Verunreinigungen, einschließlich offen zirkuläres und lineares Plasmid, Plasmid-Multimere und genomische DNA.
Dargestellt ist diatomeenerde-geklärtes Lysat (Spur 1, von links); Niederausschluss-Filtrat bei 0,23 % Gew./Vol. CTAB (Spur 2); Hochausschluss-Filtrat bei 0,30 % Gew.Vol. CTAB, enthaltend keine DNA (Spur 3); Hochausschluss-Präzipitat in 0,4 M NaCl (Spur 4); Hochausschluss-Präzipitat in 0,475 M NaCl (Spur 5); Hochausschluss-Präzipitat in 0,5 M NaCl (Spur 6); 0,8- Mikron-Filtrat nach einem LRA-Adsorptionsschritt (Spur 7); LRA-Produkt, das einer Ethanolpräzipitation und erneuten Lösung in sterilem Wasser unterworfen wurde (Spur 8). Ein Vergleich der Spuren 1 und 8 offenbart, dass es eine substantielle Verringerung an Verunreinigungen vom DNA-Abbauprodukt-Typ gibt.
BEISPIEL 2
Verwendung eines Partikelgrößen-Analysators zur Überwachung der CTAB-Präzipitation
Die CTAB-Präzipitation kann unter Verwendung von beispielsweise einem Lasentec^®-Partikelgrößen-Analysator genau überwacht werden. Restliche feinteilige Zelldebris und andere Verunreinigungen, einschließlich genomische DNA und relaxierte zirkuläre und lineare DNA-Abbauprodukte, werden aus dem geklärten Lysat präzipitiert durch Zugabe einer Lösung von 1,0 % Gew./Vol. CTAB in 40 mM NaCl auf eine Endkonzentration von 0,25-0,28 % Gew./Vol. CTAB. Die Präzipitation der Verunreinigungen wird in Echtzeit unter Verwendung eines Lasentec^®-Partikelgrößen-Analysators überwacht. Die Zugabe von CTAB wird beendet, nachdem die Gesamtpartikelzahlen scharf abfallen. Dies ist gerade genug CTAB, um lineare und relaxierte zirkuläre DNA zu präzipitieren, während die superspiralisierte DNA in Lösung belassen wird. Der Ansatz wird dann filtriert, um die präzipitierten Verunreinigungen zu entfernen. CTAB wird dem Ansatz in einer Endkonzentration von 0,30-33 % Gew./Vol. CTAB zugegeben, um die superspiralisierte DNA zu präzipitieren. 5 zeigt die Präzipitation von Verunreinigungen durch 0,25-0,30 % Gew./Vol. CTAB unter Verwendung eines Lasentec^®-Partikelgrößen-Analysators. Die CTAB-Zugabe wird nach 100 Min. gestoppt, basierend auf einer abrupten Veränderung der Partikelzahlen. Präzipitierte Verunreinigungen werden durch Filtration entfernt. Zusätzliches CTAB wird zugegeben, um das superspiralisierte Plasmid zu präzipitieren.
Die vorliegende Erfindung soll nicht auf die hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen beschränkt sein.

Claims

Verfahren zur Reinigung von superspiralisierter ("supercoiled") Plasmid-DNA aus einem Zelllysat einer mikrobiellen Fermentation, welches umfasst, dass dem Zelllysat hydratisiertes kristallisiertes Calciumsilicat zugegeben wird, um restliche Verunreinigungen von der superspiralisierten Plasmid-DNA weg zu adsorbieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zelllysat vor der Zugabe des hydratisierten kristallisierten Calciumsilicats geklärt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, welches umfasst: (a) Präzipitieren der superspiralisierten Plasmid-DNA durch eine detergens-induzierte Präzipitation; (b) Erneutes Lösen der präzipitierten superspiralisierten Plasmid-DNA in einer Salzlösung; (c) Zugeben von hydratisiertem kristallisierten Calciumsilicat zu dem resuspendierten superspiralisierten Plasmid, um restliche Verunreinigungen von der superspiralisierten Plasmid-DNA weg zu adsorbieren, was zu einer Lösung führt, welche die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält; und (d) Konzentrieren der superspiralisierten Plasmid-DNA.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Detergens aus Schritt (a) Hexadecyltrimethylammoniumbromid ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierte Präzipitationsschritt in einem Standard-STET-Puffer erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei Hexadecyltrimethylammoniumbromid in einem zweistufigen Prozess zugegeben wird, wobei eine erste durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierte Präzipitation erfolgt, um Debris und nicht-superspiralisierte Plasmid-DNA heraus zu präzipitieren, und eine zweite durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierte Präzipitation erfolgt, um die superspiralisierte Plasmid-DNA zu präzipitieren.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Zelllysat vor der detergens-induzierten Präzipitation geklärt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 7, wobei das Zelllysat durch Zugabe von Diatomeenerde geklärt wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die superspiralisierte Plasmid-DNA durch einen Prozess konzentriert wird, welcher aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkoholpräzipitation und Ultrafiltration besteht.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die superspiralisierte Plasmid-DNA durch Ethanolpräzipitation konzentriert wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das hydratisierte kristallisierte Calciumsilicat schrittweise zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 6, welches umfasst: (a) Ernten von mikrobiellen Zellen aus einer Fermentationsbouillon; (b) Zugeben einer ausreichenden Menge einer Lyse-Lösung zu den geernteten mikrobiellen Zellen; (c) Erwärmen der mikrobiellen Zellen von Schritt (b) auf eine Temperatur zwischen 70°C und 100°C in einem Durchlauf-Wärmetauscher, um ein Zelllysat zu bilden; (d) Kühlen des Zelllysats; (e) Klären des Zelllysats mittels Filtration mit Diatomeenerde; (f) Präzipitieren von restlicher Zelldebris und Verunreinigungen mit einer ersten durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierten Präzipitation; (g) Selektives Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit einer zweiten durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierten Präzipitation; (h) Erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M umfasst, zur selektiven Lösung von Plasmid-DNA; (i) Adsorbieren von restlichen Verunreinigungen auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat in dem Puffer von Schritt (h); (j) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol; (k) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats (l) Trocknen zur Entfernung von Ethanol; (m) Erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und (n) Sterilisieren der gepufferten Lösung von Schritt (m), welche die gereinigte superspiralisierte Plasmid-DNA enthält, mittels Filtration durch ein 0,22-μm-Filter.
Verfahren nach Anspruch 6, umfassend die Schritte (a) bis (i) von Anspruch 12, wobei der Puffer von Schritt (i) sterilisiert wird und die DNA durch Ethanolpräzipitation konzentriert wird, was in einem Pulver-Präzipitat resultiert, das die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, welches umfasst: (a) Ernten von mikrobiellen Zellen aus einer Fermentationsbouillon; (b) Zugeben einer ausreichenden Menge einer Lyse-Lösung zu den geernteten mikrobiellen Zellen; (c) Erwärmen der mikrobiellen Zellen von Schritt (b) auf eine Temperatur zwischen 70°C und 100°C in einem Durchlauf-Wärmetauscher, um ein Zelllysat zu bilden; (d) Kühlen des Zelllysats; (e) Klären des Zelllysats mittels Filtration mit Diatomeenerde; (f) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid; (g) Erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M umfasst, zur selektiven Lösung von Plasmid-DNA; (h) Adsorbieren von restlichen Verunreinigungen auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat in dem Puffer von Schritt (g); (i) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol; (j) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats; (k) Trocknen zur Entfernung von Ethanol; (l) Erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und (m) Sterilisieren der gepufferten Lösung von Schritt (l), welche die gereinigte superspiralisierte Plasmid-DNA enthält, mittels Filtration durch ein 0,22-μm-Filter.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, umfassend die Schritte (a) bis (h) von Anspruch 14, wobei der Puffer von Schritt (h) sterilisiert wird und die DNA durch Ethanolpräzipitation konzentriert wird, was in einem Pulver-Präzipitat resultiert, das die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die mikrobiellen Zellen von Schritt (b) in Schritt (c) auf eine Temperatur von etwa 70°C bis etwa 80°C erwärmt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, welches umfasst: (a) Ernten von mikrobiellen Zellen aus einer Fermentationsbouillon; (b) Zugeben einer ausreichenden Menge von Lysozym/Alkali/KOAc zur Förderung von Zell-Lyse zu den geernteten mikrobiellen Zellen, um ein Zellysat zu bilden; (c) Klären des Zelllysats mittels Filtration mit Diatomeenerde; (d) Präzipitieren von restlicher Zelldebris und Verunreinigungen mit einer ersten durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierten Präzipitation; (e) Selektives Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit einer zweiten durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierten Präzipitation; (f) Erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M umfasst, zur selektiven Lösung von Plasmid-DNA; (g) Adsorbieren von restlichen Verunreinigungen auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat in dem Puffer von Schritt (f); (h) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol; (i) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats; (j) Trocknen zur Entfernung von Ethanol; (k) Erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und (l) Sterilisieren der gepufferten Lösung von Schritt (k), welche die gereinigte superspiralisierte Plasmid-DNA enthält, mittels Filtration durch ein 0,22-μm-Filter.
Verfahren nach Anspruch 6, umfassend die Schritte (a) bis (g) von Anspruch 17, wobei der verbleibende Puffer von Schritt (g) sterilisiert wird und die superspiralisierte Plasmid-DNA durch Ethanolpräzipitation konzentriert wird, was in einem Pulver-Präzipitat resultiert, das die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, welches umfasst: (a) Ernten von mikrobiellen Zellen aus einem Fermentationsvolumen von mehr als 5 Litern; (b) Zugeben einer ausreichenden Menge von Lysozym/Alkali/KOAc zur Förderung von Zell-Lyse zu den geernteten mikrobiellen Zellen, um ein Zellysat zu bilden; (c) Klären des Zelllysats mittels Filtration mit Diatomeenerde; (d) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid; (e) Erneutes Lösen der superspiralisierten Plasmid-DNA in einem Puffer, der NaCl im Bereich von 0,2 M bis 2 M umfasst, zur selektiven Lösung von Plasmid-DNA; (f) Adsorbieren von restlichen Verunreinigungen auf hydratisiertem kristallisiertem Calciumsilicat in dem Puffer von Schritt (e); (g) Präzipitieren von superspiralisierter Plasmid-DNA mit Ethanol; (h) Filtrieren zum Gewinnen und Waschen des Präzipitats; (i) Trocknen zur Entfernung von Ethanol; (j) Erneutes Lösen von gereinigter superspiralisierter Plasmid-DNA in einem physiologisch annehmbaren Formulierungspuffer; und (k) Sterilisieren der gepufferten Lösung von Schritt (j), welche die gereinigte superspiralisierte Plasmid-DNA enthält, mittels Filtration durch ein 0,22-μm-Filter.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, umfassend die Schritte (a) bis (f) von Anspruch 19, wobei der Puffer von Schritt (f) sterilisiert wird und die DNA durch Ethanolpräzipitation konzentriert wird, was in einem Pulver-Präzipitat resultiert, das die superspiralisierte Plasmid-DNA enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 20, wobei der/die durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid induzierte Präzipitationsschritt(e) in einem Standard-STET-Puffer erfolgt/erfolgen.