JP2004504006A - プラスミドｄｎａの大規模化可能な精製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、臨床等級のプラスミドＤＮＡを細菌細胞から単離するための非クロマトグラフィーに基づく方法に関する。本明細書に記載の例示方法は、珪酸カルシウムに対する不純物の吸着と組合せたＣＴＡＢに基づくＤＮＡ沈殿を含む、臨床等級のプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製するための大規模化可能な経済的に有利なプロトコールを概説する。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、臨床等級（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ）のプラスミドＤＮＡを微生物細胞から単離する大規模化可能（ｓｃａｌｅａｂｌｅ；規模調節可能）な方法に関する。本明細書に記載の例示されている方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から臨床等級のプラスミドＤＮＡを精製するための大規模化可能で経済的に有利なプロトコールを概説するものであり、これは、プラスミドの製造の下流加工中に、高価なクロマトグラフィー工程に依存しないため、この方法は、大規模な工業的プラスミド精製方法に特になじみやすいものとなる。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子治療およびＤＮＡワクチン接種の領域の進展は、臨床等級のプラスミドＤＮＡの大規模な製造および精製の需要を生み出している。最近の総説において指摘されているとおり（Ｐｒａｚｅｒｅｓら，１９９９，ＴＩＢＴｅｃｈ １７：１６９−１７４）、小規模なプラスミドＤＮＡ精製方法に関するこれまでの研究にもかかわらず、臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造および精製を大規模化することは依然として困難である。特に問題なのは下流加工工程であり、これは大抵の場合、集められた細胞のアルカリ細胞溶解およびそれに続く酢酸アンモニウム沈殿に基づくものであり、更なる下流加工工程は、サイズ排除、陰イオン交換および逆相クロマトグラフィー工程に大きく依存する。また、複数のクロマトグラフィー工程のための樹脂およびバッファーのような原料の費用が、高い単価および大ＤＮＡ分子に関する低い容量のため、法外なものとなることに注目すべきである。陽イオン界面活性剤ＣＴＡＢおよび種々の形態のシリカは、小規模なプラスミドＤＮＡの製造に使用されており、臨床等級のプラスミドワクチンの製造を意図していないことが公知である。ある種の不純物に関するこれらの工程の除去能力は確認されておらず、また、大規模化可能な方法の設計のためのそれらの有用性も確認されていない。Ｄｅｌ Ｓａｌら（１９８９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７（５）：５１４−５１９）およびＧｕｓｔｉｎｃｉｃｈ（１９９１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１（３）：２８９−３０１）は、それぞれ、清澄化された小規模な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートからプラスミドＤＮＡを沈殿させるために、およびヒト全血の小規模調製物からゲノムＤＮＡを沈殿させるために、ＣＴＡＢを使用している。Ｉｓｈａｑら（１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（１）：１９−２４）は、ＣＴＡＢで沈殿させた小規模なプラスミドＤＮＡをＰＺ５２３遠心カラムにアプライして、少なくともサブクローニングおよびジデオキシ配列決定のための鋳型には適した精製された産物を得ることを開示している。この技術は、臨床等級ロットのＤＮＡプラスミドを得るために、界面活性剤に基づく沈殿工程を利用することを何ら開示も示唆もしていない。
【０００３】
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ＆ Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ（１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７６（２）：６１５−６１９）は、ＤＮＡの制限酵素消化物をアガロースゲルから分離するための技術を開示しており、この場合、濃ヨウ化ナトリウムの存在下でＤＮＡをガラス（シリカ）に結合させ、エタノールで洗浄し、低い塩濃度で溶出する。Ｂｏｏｍら（１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（３）：４９５−５０３）およびＣａｒｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｔｏｎ（１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（４）：１０４４）は、ＤＮＡ配列決定に適したプラスミドＤＮＡの単離方法を開示している。カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤であるグアニジニウムチオシアナートの存在下でプラスミドＤＮＡを、珪藻土の形態のシリカに結合させる。該固定化プラスミドＤＮＡをエタノールで洗浄し、低い塩濃度で溶出する。この技術の微妙な変法が、（１）ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／１０３３１；（２）ＰＣＴ公開ＷＯ ９８／０４７３０および（３）１９９９年１２月２４日付けでＬｉｔｔｌｅに発行された米国特許第５，０７５，４３０号（これは、カオトロピック剤の存在下での珪藻土上へのＤＮＡの吸着ならびにそれに続くＤＮＡの分離および溶出に基づくプラスミドＤＮＡの単離方法を開示している）；ならびに（４）１９９８年９月１５日付でＰａｄｈｙｅらに発行された米国特許第５，８０８，０４１号（これは、カオトロピック剤の存在下でシリカゲルとガラス粒子とを含む組成物を使用する核酸の単離方法を開示している）に開示されている。そのような場合もまた、これらの技術は、ヒトおよび他の潜在的宿主に投与する臨床等級の製剤のためのグラム量のプラスミドＤＮＡを得るための大規模なＤＮＡプラスミド製造方法に巧くは適用されていない。
【０００４】
１９９０年５月８日付けでＭｃＣｏｒｍｉｃｋに発行された米国特許第４，９２３，９７８号は、タンパク質性物質を優先的に結合させることによるＤＮＡの精製のための、シリカの使用を開示している。
【０００５】
１９９６年１１月１９日付けでＨｏｒｎらに発行された米国特許第５，５７６，１９６号は、ＲＮＡを優先的に結合させることによるＤＮＡの精製のための、シリカの使用を開示している。
【０００６】
それぞれ１９９６年６月４日付け及び１９９６年６月１１日付けでＷｏｏｄａｒｄらに発行された米国特許第５，５２３，３９２号および第５，５２５，３１９号は、ＤＮＡ精製のための結合表面として用いられうるボロンシリカート、ホスホシリカートおよびアルミニウムシリカートを開示している。
【０００７】
ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／２００３４（国際公開第ＷＯ ９８／０１４６４号）は、血液のような生物学的流体から有機化合物を選択的に分離するための、水和珪酸カルシウムの使用を開示している。
【０００８】
ここでもまた、前記で挙げた参照文献はいずれも、宿主細胞タンパク質、宿主細胞内毒素、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡおよびプラスミド分解物（例えば、直鎖状および開環形態）を実質的に含有しない大規模化可能な臨床等級のＤＮＡプラスミドロットを製造するための当業者に対する適当な指針を示していない。この目的には、法外に高価なクロマトグラフィー工程の必要性を排除する一方で、少なくともヒトワクチン接種およびヒト遺伝子治療用途に使用するための臨床等級のグラム量のＤＮＡプラスミド調製物を提供する大規模化可能なプラスミド精製方法を同定することが非常に有用であろう。本発明は、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、タンパク質、宿主内毒素およびタンパク質分解物（例えば、直鎖状および開環形態）のような残留混入物を除去するために結晶性水和珪酸カルシウム（本発明では「ｈｃＣａＳｉＯ３」と称される）またはいずれかの同様の作用性化合物を使用する下流の大規模バッチ吸着工程と共に、上流工程においてプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させるために好ましくはＣＴＡＢのような陽イオン界面活性剤を利用する大規模化可能なプラスミド精製方法を開示することにより、これらの要求について検討し、それらを満足させるものである。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、大規模な臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造および精製のための大規模化可能な経済的な製造方法を代表する方法である、臨床等級のプラスミドＤＮＡを微生物細胞から単離する方法に関する。本発明は更に、該ＤＮＡプラスミド精製方法の大規模化可能な経済的な特質に寄与する幾つかの細胞溶解後の中心的（ｃｏｒｅ）方法に関する。より詳しくは、細胞溶解後の工程は、以下のものを含む（それらに限定されるものではない）：（１）２つの部分を含む沈殿／溶解工程における、単一または段階的様態での界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）によるプラスミドＤＮＡの沈殿、ならびにこれと組合せた、該ＣＴＡＢ沈殿プラスミドＤＮＡの濃縮および塩溶液での選択的溶解；（２）同様に単一または段階的様態での水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）上への吸着による内毒素および他の残存不純物の除去；および（３）アルコール沈殿（エタノール、メタノールおよびイソプロパノールを含むが、これらに限定されるものではない）または別の濃縮方法（限外濾過を含むが、これに限定されるものではない）による、該精製プラスミドＤＮＡの濃縮。これらの工程を組合せて用いたり、当技術分野で公知の追加的な精製工程と更に組合せて用いたり、および／または、前記工程の少なくとも１つを省略することが可能であり、好ましくは、ＤＮＡプラスミドの精製技術に関連した当技術分野で公知の他の方法と組合せる。
【００１０】
本発明の方法は、微生物細胞（細菌細胞、植物細胞、酵母、バキュロウイルスを含むが、これらに限定されるものではなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が好ましい微生物宿主である）からの臨床等級のＤＮＡプラスミドの精製を可能にする。本明細書に記載の方法により精製された臨床等級のプラスミドＤＮＡは、ワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしてのヒトへの投与に非常に有用である。
【００１１】
本発明のプラスミドの精製方法の利点は、１つには、ＣＴＡＢでのＤＮＡの段階的沈殿およびそれと組合せた、ｈｃＣａＳｉＯ３上への吸着による残存不純物の除去が、これまでに認識されていない選択性を有する問題となる不純物（ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ分解物、例えば直鎖状ＤＮＡを含む）を除去するという知見によるものである。これらの沈殿／精製工程を含む完全な方法の設計が、本明細書に開示する本発明の核心である。また、開示されている方法は大規模化可能である。
【００１２】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、大規模なプラスミド製造のための選択的な沈殿および吸着の別のアプローチにより、重合体に基づく高価なクロマトグラフィー樹脂が必要とされないことである。
【００１３】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、それが、基本的に製造大規模化操作になじみやすいことである。該単位操作は、沈殿、濾過、吸着および乾燥よりなる。珪藻土の使用は、発酵産物にしばしば伴う汚れの問題を回避すると同時に、非圧縮性濾過ケークを与える。
【００１４】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、それが、該方法中の更なる工程におけるＲＮＡの除去のための高価な酵素である組換えＲＮアーゼの添加の必要性を回避していることである。
【００１５】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、ＣＴＡＢのような長鎖界面活性剤での沈殿が、製造規模での溶媒含有廃棄流の処分において重要である下流加工容積の減少をもたらすことである。
【００１６】
本発明の精製方法の更にもう１つの利点は、アルコール（例えば、エタノール）沈殿が、膜に基づく濃縮中に生じる予期されるせん断損傷を伴わずに高濃度で再懸濁されうる安定なバルク産物を得るための理想的な方法であることである。
【００１７】
本発明の１つの目的は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核性宿主からの臨床等級のプラスミドＤＮＡの大規模な精製のための費用効果的な方法を提供することである。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、プラスミドＤＮＡの大規模（すなわち、大規模化可能な）精製のための大規模化可能な経済的な方法を与える細胞溶解後工程を提供することであり、該工程は、（ｉ）単一または段階的様態での界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）によるプラスミドＤＮＡの沈殿、ならびにこれと組合せた、該ＣＴＡＢ沈殿プラスミドＤＮＡの濃縮および塩溶液での選択的溶解、（ｉｉ）単一または段階的様態での水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）上への吸着による内毒素および他の残存不純物の除去、および／または（ｉｉｉ）アルコール（例えば、エタノール沈殿）または他の濃縮方法（限外濾過を含むが、これに限定されるものではない）による該精製プラスミドＤＮＡの濃縮の細胞溶解後工程を含むが、これに限定されるものではない。これらの工程は、組合せて用いたり、当技術分野で公知の追加的な精製工程と更に組合せて用いたり、および／または、前記工程の少なくとも１つを省略することが可能であり、好ましくは、ＤＮＡプラスミドの精製技術に関連した当技術分野で公知の他の方法と組合せる。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、原核性宿主からの臨床等級のプラスミドＤＮＡの大規模（すなわち、大規模化可能）な精製のための費用効果的な方法であって、（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）珪藻土に補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉｉ）セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的沈殿、ついでプラスミドＤＮＡ含有濾過ケークを回収するための濾過、（ｉｖ）塩溶液での該プラスミドＤＮＡ含有濾過ケークの選択的溶解、（ｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着およびそれに続く濾過、および（ｖｉ）アルコール（アルコールを含むがこれに限定されるものではない）を使用する精製プラスミドＤＮＡの沈殿の工程を含んでなる方法を提供する。
【００２０】
本発明において互換的に用いる「臨床等級のプラスミド」および「医薬等級のプラスミド」なる語は、遺伝子治療用途およびＤＮＡワクチン接種用途を含む（これらに限定されるものではない）公知の任意の予防的または治療的適応のためのヒトへの投与に関して許容される純度レベルの、原核細胞から単離されたプラスミドＤＮＡの調製物を意味する。
【００２１】
本発明で用いる「非スーパーコイルプラスミドＤＮＡ」は、スーパーコイルプラスミドＤＮＡではない任意のＤＮＡ、例えば、他の任意の形態のプラスミドＤＮＡ、例えばニック開環状および直鎖状ならびに宿主ゲノムＤＮＡを意味する。
【００２２】
本発明で用いる「ＣＴＡＢ」は、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはセチルトリメチルアンモニウムブロミドを意味する。
【００２３】
本発明で用いる「ｈｃＣａＳｉＯ３」は、水和結晶性珪酸カルシウムを意味する。
【００２４】
本発明で用いる「ＳＴＥＴバッファー」は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（〜ｐＨ７．０−９．０）、約５０〜１００ｍＭ ＥＤＴＡ、約８％ スクロースおよび約２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００を含むバッファーを意味する。
【００２５】
本発明で用いる「ＩＰＡ」は、イソプロパノールを意味する。
【００２６】
本発明で用いる「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールを意味する。
【００２７】
本発明で用いる「ｇＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡを意味する。
【００２８】
本発明で用いる「ｇＲＮＡ」は、ゲノムＲＮＡを意味する。
【００２９】
本発明で用いる「ＬＲＡ（商標）」は、脂質除去剤（ｌｉｐｉｄ ｒｅｍｏｖａｌ ａｇｅｎｔ（商標））を意味する。
【００３０】
本発明で用いる「ＥＤＴＡ」なる語は、エチレンジアミン四酢酸を意味する。
【００３１】
本発明で用いる「ＳＣ」は、「スーパーコイル」を意味する。
【００３２】
本発明で用いる「ＯＣ」は、「開環状」を意味する。
【００３３】
本発明で用いる「ＮＴＵ」は、「正規化濁度単位」を意味する。
【００３４】
本発明で用いる「Ｌ」は、「リットル」を意味する。
【００３５】
本発明で用いる「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味する。
【００３６】
（図面の簡単な記載）
図１は、清澄化により細胞残渣を除去する中心的な４つの工程プロセスを含むプロセスの流れ図を示す。ＣＴＡＢでの段階的沈殿および珪酸カルシウム吸着は、宿主ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質および内毒素ならびにプラスミド分解物、開環状および直鎖状ＤＮＡを除去する。エタノール沈殿により、安定なバルク粉末が得られる。
【００３７】
図２は、ＣＴＡＢでの段階的沈殿中の濃度プロフィールを示す。プラスミドＤＮＡが、小刻みな界面活性剤の増加量に対して沈殿している。該工程は、可溶性のままのタンパク質、ＲＮＡおよび内毒素の除去に関して選択的である。
【００３８】
図３は、アガロースゲル電気泳動による０．２Ｍ ＮａＣｌによるプラスミドＤＮＡの選択的溶解を示す。宿主、ゲノムＤＮＡは、部分的に可溶性であるに過ぎず、０．２Ｍ ＮａＣｌでの溶解後の濾過により除去される。１．２Ｍ ＮａＣｌで、ｇＤＮＡは可溶性である。
【００３９】
図４Ａ〜Ｄは、ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。（Ａ）．塩化ナトリウム濃度に対するプラスミドＤＮＡの平衡吸着。（Ｂ）．ｑＰＣＲにより測定されたゲノムまたは宿主ＤＮＡの吸着。ＬＲＡ（商標）は、１．２Ｍ ＮａＣｌでの５時間の混合接触の後にＤＮＡを選択的に除去する。プラスミド収率は約６０％である。（Ｃ）．１．２Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。ｈｃＣａＳｉＯ３濃度に応じた、ｈｃＣａＳｉＯ３と接触した液相サンプルのアガロースゲル電気泳動（レーン１：３２ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン２：３５ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン３：４０ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン４：４２ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン５：４５ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ）。直鎖状、弛緩型開環状および多量体（Ｍ）が除去される。（Ｄ）０．５Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。時間に応じた、全ＤＮＡ １ｇ当たり３２ｇのｈｃＣａＳｉＯ３と接触した液相サンプルのアガロースゲル電気泳動（レーン１：３．３時間、レーン２：６．２時間、レーン３：１０．８時間、レーン４：２１．５時間）。直鎖状、弛緩型開環状および多量体（Ｍ）が除去される。
【００４０】
図５は、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用する０．２５％〜０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢによる不純物の沈殿を示す。粒子計数の急激な変化に基づき、ＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートへの４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの添加を１００分の時点で停止する。沈殿不純物は濾過により除去する。該スーパーコイルプラスミドを沈殿させるために、追加的なＣＴＡＢを加える。
【００４１】
図６は、実施例１に開示する加工工程からのサンプルのＤＮＡ組成物を示す。スーパーコイルプラスミドは最下バンドに可視化されている。それより上方のバンドは、開環状および直鎖状プラスミド、プラスミド多量体ならびにゲノムＤＮＡを含む種々のＤＮＡ不純物を表す。示されているのは、珪藻土で清澄化されたライセート（左からレーン１）；０．２３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける低カット（ｃｕｔ）濾液（レーン２）；ＤＮＡを含有しない０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける高カット濾液（レーン３）；０．４Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン４）；０．４７５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン５）；０．５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン６）；ｈｃＣａＳｉＯ３吸着工程後の０．８ミクロン濾液（レーン７）；エタノール沈殿および無菌水中の再溶解に付されたｈｃＣａＳｉＯ３産物（レーン８）である。
【００４２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造のための経済的な代替的製造方法を代表する大規模化可能な方法に関する。より詳しくは、本発明の核心は、以下を含む幾つかの下流（すなわち、細胞溶解後）工程に関する：（１）２つの部分を含む沈殿／溶解工程における、単一または段階的様態での界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）によるプラスミドＤＮＡの沈殿、ならびにこれと組合せた、該ＣＴＡＢ沈殿プラスミドＤＮＡの濃縮および塩溶液での選択的溶解；（２）同様に単一または段階的様態での水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）上への吸着による内毒素および他の残存不純物の除去；および（３）アルコール（エタノール、メタノールおよびイソプロパノールを含むが、これらに限定されるものではない）に基づく沈殿または別の濃縮方法（限外濾過を含むが、これに限定されるものではない）による、該精製プラスミドＤＮＡの濃縮。本明細書に例示するとおり、工程（１）および（２）は、該精製方法の対象であるスーパーコイルプラスミドＤＮＡから種々の細胞ライセート不純物を物理的に分離するための後続の濾過工程と結びついている。
【００４３】
臨床等級のプラスミドＤＮＡの回収をもたらす全体的な大規模化可能な精製方法を体系化するために、これらの３つの中心的工程に追加または省略を行うことは、本発明の範囲内である。したがって、前記の界面活性剤に基づくプラスミドＤＮＡ沈殿工程または該ｈｃＣａＳｉＯ３吸着工程は省略されうると意図される。この簡素化方法は、全体的な精製スキームを補完する追加的な「非中心的」工程を含みうる。例えば、本発明の好ましい方法においては、界面活性剤に基づく初期沈殿工程は、エタノール沈殿により該プラスミドＤＮＡを濃縮する最終工程と合体しうる。ついで、これらの２つの中心的工程を、臨床等級ロットのプラスミドＤＮＡを得るために当技術分野で公知の他の精製工程（例えば、カラムクロマトグラフィー）と組合せることが可能である。しかし、（１）界面活性剤沈殿および選択的塩溶解、（２）ｈｃＣａＳｉＯ３への吸着、および（３）プラスミドＤＮＡ濃縮の中心的工程は、追加的な補完工程を含む全体的な大規模化可能な方法を与える該精製方法を拡張する基礎となる可能性が高いであろう。これらの補完工程は、特定のロットに必要なプラスミドＤＮＡの全量に応じて、当業者の判断で加えることが可能である。この目的において、全体的な大規模化可能な方法の基礎としてこれらの３つの中心的工程を用いる種々の具体例が、本発明を例示するために本明細書に記載されているが、これらは本発明を何ら限定するものではない。当業者は、適当な等級のＤＮＡプラスミド純度をもたらすスキーム（体系）を与える公知プラスミド精製工程を考慮することが可能である。例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７４９（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）は、有効な精製プロトコールを得るためにこの段落に記載の中心的精製工程と組合せて使用されうる代替的なクロマトグラフィーに基づく下流工程に関する指針を示している。どちらの開示も、清澄化、ＤＮＡおよびタンパク質の除去のためのベンゾナーゼでの限外濾過、更なるタンパク質に関するイオン交換、および内毒素、Ｌｉｎ／ＯＣ不純物逆相クロマトグラフィー、および濃縮のための最終的限外濾過を含む下流事象（熱交換工程後）を示している。したがって、ＣＴＡＢを単独で使用する場合には、それは限外濾過およびイオン交換の代わりに使用されうるが、それは、ＣＴＡＢにより除去されていない不純物を除去するために最終的な逆相クロマトグラフィー工程と共に使用されるであろう。一方、ｈｃＣａＳｉＯ３だけを使用する場合には、そのようなプロトコールを、ＷＯ９６／０２６５８およびＷＯ９６／３６７０６に記載の清澄化、限外濾過およびイオン交換クロマトグラフィーの後に行うことが可能であろう。
【００４４】
本発明の１つの実施形態は、界面活性剤により誘発される沈殿（すなわち、界面活性剤誘発性沈殿）によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させることを含む、微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明のこの態様は、界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）の使用に関して例示されているが、これに限定されるものではない。関心のある界面活性剤は、単一または段階的様態で加えることが可能である。該界面活性剤の段階的添加の具体例としては、ＣＴＡＢの段階的添加（この場合、ＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートに１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ溶液を供給する）が挙げられ、この場合、残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させるために約０．２５％〜約０．２８％の第１ＣＴＡＢ誘発性沈殿を行い、ついで該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させるために約０．３０％〜約０．３３％の第２ＣＴＡＢ誘発性沈殿を行う。これらの範囲は、標準ＳＴＥＴ細胞溶解バッファー（約５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（〜ｐＨ７．０−９．０），約５０〜１０００ｍＭ ＥＤＴＡ，約８％ スクロースおよび約２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）の使用に最も良く適合する。段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）に基づく界面活性剤または二価カチオンＥＤＴＡを該細胞溶解バッファー中に含有させることを含む（これに限定されるものではない））、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで該ＤＮＡを追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内であろう。標準ＳＴＥＴバッファーの使用に関して前記したとおり、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助けるために種々のバッファーに有用な濃度のＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）に基づく界面活性剤のような化合物を加えることも有用であろう。この目的には、有効量のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）およびＥＤＴＡを含有させることによる細胞溶解バッファーとして、ＳＴＥＴバッファーが有用である。したがって、これらの化合物は、ＥＤＴＡ（これは、ＥＤＴＡが存在しなければＤＮアーゼを活性化する二価金属イオンと会合することによりＤＮアーゼ活性を阻害する）と共に該細胞溶解工程中に存在する。また、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞膜を溶解する。両成分はＣＴＡＢ工程に運ばれる。ＥＤＴＡは、有利な役割を果たし続ける。なぜなら、該二価金属イオンは、プラスミドとＣＴＡＢとの複合体形成を妨げるからである。より重要なのは、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させるための単一または段階的カット（ｃｕｔ）のための有効ＣＴＡＢ濃度の選択におけるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）の影響である。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）はＣＴＡＢと相互作用し、そのため、スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿しうる前に、ある閾値レベル（例えば、ＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートに加える１％ ＣＴＡＢ供給溶液に対して０．２３％、０．２５％、０．３０％など）までＣＴＡＢを添加することが必要となる。したがって、該ＣＴＡＢ濃度範囲は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）およびＤＮＡ濃度の両方に左右される。この目的には、例えば、０．２５％〜．２８％および０．２８％〜０．３３％ ＣＴＡＢ（この場合も、１％ ｗ／ｖのＣＴＡＢの供給に対するものである）の段階的範囲が、以下に基づいて定められる。低カット量は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）濃度の関数である。なぜなら、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ミセル（各ミセルは１４０個のＴｒｉｔｏｎ分子を含有すると考えられる）１個当たり２２分子のＣＴＡＢに結合するからである。一方、高カット量は、ＤＮＡ濃度の関数である。なぜなら、各プラスミド分子は、ＤＮＡヌクレオチド反復単位１個当たり０．９当量のＣＴＡＢに結合するからである。実施例１に概説するこの特定の場合には、低カット沈殿に関する０．２５〜０．２８％ ＣＴＡＢの列挙範囲は、１％ Ｔｒｉｔｏｎを含有するライセートＳＴＥＴバッファーへの１％ ＣＴＡＢ溶液の添加に対応する。０．２８〜０．３３％の高カット範囲は、純度約８４％の０．３４ｍｇ／ｍｌ プラスミドＤＮＡを含有していた元の清澄化ライセート溶液に由来する濾過された低カット溶液への１％ ＣＴＡＢ溶液の添加に対応する。当業者は、ＣＴＡＢの量（スーパーコイルプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿の場合）を、実施例１（ＤＮＡ沈殿の視覚的検査）または実施例２（粒径分析器を使用するＤＮＡ沈殿の検査）に記載のとおりに、特定のバッファーに最良に適合させることが可能である。標準ＳＴＥＴバッファーを使用する場合の後者の実施例では、当業者は、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）濁度リアルタイムプローブにより沈殿を観察するであろう。そして、バッチごとに一定であるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）濃度（細胞溶解時に確立されたもの）にこのＣＴＡＢ濃度を相関させることにより約０．２５％で終了することが判明するであろう。ついで、ＤＮＡが沈殿するにつれて、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）での同じ方法が完了し、そして、沈殿に要する０．０３％の増加量（０．２５から０．２８の差）に対応する約１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡが存在することが判明するであろう。ＮａＯＨ／ＫＯＡｃ細胞溶解アプローチの場合と同様にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）が存在しない（または、標準ＳＴＥＴバッファーとは異なるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）濃度が存在する）場合、あるいは該発酵が、非常に異なる濃度のプラスミドを与える場合、当業者はこれらの数値を認識するであろう。したがって、前者は低カット量、そして後者は高カット量のＣＴＡＢに影響を及ぼす。Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器のような粒径分析器により、低および高カット範囲を決定するのが好ましい。この方法は、低および高カット範囲をより厳密に定めるために精度を増加させる。なぜなら、プラスミドのＣＴＡＢ沈殿が、小刻みなＣＴＡＢ範囲にわたり生じるからである。したがって、これらの範囲を、重要な変数（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）およびプラスミドＤＮＡ濃度）を測定することにより近似することが可能であり、種々のＣＴＡＢ濃度の溶液中の粒子の視覚的な又は好ましくは機械により導かれる分析により特異的に同定することも可能である。本発明では、標準ＳＴＥＴバッファーおよび１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ溶液（４０ｍＭ ＮａＣｌ中）の使用が、約０．２５〜０．２８％ ｗ／ｖ（低）および０．３０〜０．３３％（高）の最適な低および高ＣＴＡＢカットを与えると例示される。そのような値は、１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ供給溶液を使用してＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートにＣＴＡＢを供給する場合に当てはまると理解されるであろう。単なる例示として挙げると、該ＣＴＡＢ供給溶液の濃度を２倍にし（例えば、２％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ供給）、半分の容積（同じＣＴＡＢ量の場合）を加えることが許容される。この場合、該低カットおよび高カット濃度は、それぞれ約０．２９〜０．３３％および０．３５〜０．４０％であろう。これらの数値は、重量／容積比率（％ ｗ／ｖ）に基づく数値を、清澄化ライセート１リットル当たりの添加ＣＴＡＢ質量に基づく単純な過程（ｐｒｏｃｅｓｓ）に変換することにより、容易に正規化される。例えば、実施例１（標準ＳＴＥＴバッファー）に例示されているのと同様にして、清澄化ライセート１リットル当たり３．３〜３．９ｇのＣＴＡＢを加えることにより、低カットＣＴＡＢ濃度に達するであろう。一方、（該初期低カット添加を超えて）ＣＴＡＢを清澄化ライセート１リットル当たり４．３〜５．０ｇの最終量まで加えることにより、高カットＣＴＡＢ濃度に達するであろう。単一または段階的なＣＴＡＢに基づく界面活性剤工程は、後続の塩溶解のための濾過ケーク沈殿物（スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有）を得るための濾過工程と結び付けられるであろう。また、好ましい下流工程は、エタノール沈殿または限外濾過によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡの濃縮を維持する。本明細書に示すとおり、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得るために、エタノール沈殿によりスーパーコイルＤＮＡを最終的に沈殿させ更には濃縮することが可能な点で、アルコール（例えば、エタノール）に基づく沈殿の利用が好ましい。スーパーコイルプラスミドＤＮＡをいずれかの残存不純物から最終的に精製する一方で、該プラスミドＤＮＡを濃縮し、より実施可能なバッファー容積内への再懸濁を可能にするために、この下流工程を、より初期の工程の種々の組合せのいずれかと共に用いうることが明らかであろう。この実施形態はまた、少なくとも、ＣＴＡＢの添加前の該細胞ライセートの清澄化を含む（必ずしもこれに限定されるものではない）工程の追加と組合せたこの段落に記載の方法を含む。この工程を例示するために珪藻土（ＤＥ）を用いているが、該細胞ライセートを清澄化するためには、ＤＥの代わりに他の成分（Ｓｏｌｋａ ＦｌｏｃおよびＥｓｏｓｏｒｂ（Ｇｒａｖｅｒ）のようなセルロースに基づく他の濾過助剤を含むがこれらに限定されるものではない）を用いることが可能である。該細胞ライセートを清澄化するために使用するＤＥまたは他の物質は、濾過および遠心分離を含む（決してこれらに限定されるものではない）当技術分野で公知のいずれかの液体固体分離技術により除去することができる。細胞清澄化工程を含むいずれかの方法は、本明細書に記載のエタノール沈殿または限外濾過を含む（これらに限定されるものではない）本明細書に開示する濃縮工程をも含みうる。
【００４５】
本発明のもう１つの実施形態は、微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、中心的工程が該細胞ライセートへの水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）の添加である方法に関する。該細胞ライセートへのｈｃＣａＳｉＯ３の単一または段階的添加は、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡからの残留不純物の吸着を引き起こすことが、本発明で示される。前記のとおり、本発明のこの形態のもう１つの態様は、少なくとも、ＣＴＡＢの添加前の該細胞ライセートの清澄化を含む（必ずしもこれに限定されるものではない）工程の追加と組合される前段落における吸着工程に関する。この場合もまた、ＤＥが例示されているが、これはこの追加的工程を限定するものではない。この段落で言及している加工工程の組合せのいずれかはまた、本明細書に記載のエタノール沈殿または限外濾過を含む（これらに限定されるものではない）、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを濃縮する工程を含みうる。単一吸着工程を用いるのか段階的吸着工程を用いるのかどうかにかかわらず、ｈｃＣａＳｉＯ３吸着工程に加えて、１以上の工程（例えば、ライセートの清澄化および／またはエタノールまたは限外濾過での濃縮工程）の追加を行うことができる。中心的精製方法のこの段階においては、主要な不純物はＣＴＡＢ、内毒素、ゲノムＤＮＡおよびプラスミド分解物である。他の残留不純物（より低い濃度で存在するもの）は、タンパク質、ＲＮＡ、そして恐らくはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）を含む。水和珪酸カルシウムはこれらの不純物のすべてに結合するであろう。添加に要するｈｃＣａＳｉＯ３の厳密な量は、（１）存在する不純物の量、（２）バッファー条件（すなわち、塩濃度）および（３）恐らくは、該精製方法の全体にわたり用いる温度および塩のタイプを含む他の変数に左右される。存在する不純物の量は、（ｉ）ＣＴＡＢを加えた場合のその添加量、（ｉｉ）ゲノムＤＮＡ、プラスミド分解物および内毒素の量に影響を及ぼしうる発酵ブロスにおけるロット間の相違、および（ｉｉｉ）同様にゲノムＤＮＡ、プラスミド分解物および内毒素の量に影響を及ぼしうる用いる細胞溶解方法に左右されうるが、必ずしもそれらに限定されるものではない。これらの変数を考慮して、特定の実施中に加えるｈｃＣａＳｉＯ３の量は様々となりうることが明らかであろう。加えるｈｃＣａＳｉＯ３の量は、前記の条件に応じて、およびその特定の実施中に入手可能となるｈｃＣａＳｉＯ３のロットによる潜在的な相違に応じて、約２００グラム／リットルまでの範囲になると予想される。実施例１は、約２５グラム／リットル〜約７５グラム／リットルの範囲の指針を与える。しかし、この場合もまた、ｈｃＣａＳｉＯ３吸着のための条件は、前記の条件に関して大規模化または小規模化することが可能であり、したがって、２００グラム／リットルまでの該範囲の高い方の末端におけるｈｃＣａＳｉＯ３の添加が潜在的に必要となる。また、より高濃度のＮａＣｌはＤＮＡおよび他の不純物に関するＬＲＡ（商標）の容量を増加させることが本発明で示される。プラスミドＤＮＡのみに関するＬＲＡ（商標）の効果が図４Ａに示されているが、高い塩濃度も、結合性ゲノムＤＮＡおよび他の不純物に関するＬＲＡ（商標）の容量を増加させるらしい。したがって、いくつかの場合には、より少量の対応ｈｃＣａＳｉＯ３の使用を可能にするはずである、より高い塩濃度を考慮することが有用であろう。有用な塩濃度は、例えば、ＮａＣｌでは約５Ｍ ＮａＣｌまでの範囲でありうると予想される。
【００４６】
本発明のもう１つの実施形態は、微生物発酵の細胞ライセートからのスーパーコイルプラスミドＤＮＡの精製に関する。これは、３つの異なる加工工程、すなわち、（ｉ）界面活性剤誘発性沈殿により該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、得られた濾過ケークを塩溶液に再溶解し、（ｉｉ）該スーパーコイルプラスミドＤＮＡから残留不純物を吸着除去するために該再溶解スーパーコイルプラスミドに水和結晶性珪酸カルシウムを加えて、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する溶液を得、（ｉｉｉ）該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを濃縮する工程の組み込みを含む。この場合も、例示している界面活性剤はＣＴＡＢであり、これは単一または段階的様態で加えることが可能であり、ここでは一例として、約０．２５〜約０．２８％の［ＣＴＡＢ］での第１カットおよび約０．３０％〜約０．３３％の［ＣＴＡＢ］での第２カットを伴うＳＴＥＴに基づくライセートバッファー中の該界面活性剤（ＣＴＡＢ、１％ ｗ／ｖで供給）の段階的添加により例示される。本明細書中の全体に記載するとおり（ならびに実施例１（視覚的証明）および実施例２に例示されているとおり）、本明細書を参照すれば、段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで該ＤＮＡを追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内である。この場合も、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助けるために、有用な濃度のバッファー成分、例えばＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎに基づく界面活性剤を種々のバッファーに加えることが有用であろう。回収された濾過ケーク（スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む）の塩溶解は、最適なイオン強度および組成のバッファー溶液中で行う。塩は、プラスミドを溶解するがゲノムＤＮＡおよび他の不純物を溶解しない最適な濃度にまで加える。この濃度は、種々の塩増加量において溶液中のスーパーコイルプラスミドの濃度を測定することにより測定され、あるいは、該溶液粘度を測定することにより間接的に測定される。前記中心的工程に対する追加的工程（１つまたはいずれかの組合せ）は、本明細書に記載のとおり、ライセート清澄化および／または濃縮工程（エタノールまたは限外濾過によるもの）を含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
もう１つの実施形態は、改善された精製方法を得るために、該中心的方法への追加的工程（すなわち、該細胞ライセートの初期清澄化）の組み込みを含む。本発明のこの特定の実施形態は、（ｉ）好ましくは珪藻土に補助される濾過または遠心分離によるライセートの清澄化、（ｉｉ）ＣＴＡＢのような界面活性剤でのプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿、得られた濾過ケークの塩溶解、（ｉｉｉ）ｈｃＣａＳｉＯ３上への単一または段階的吸着による残存不純物の除去、および（ｉｖ）安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える、精製されたプラスミドＤＮＡの、後続のアルコール（例えば、エタノール）沈殿を含む下流加工工程を含む。
【００４８】
該中心的プロセスに加える追加的工程に基づく本発明のもう１つの実施形態は、細胞溶解の上流工程を含み、これは、当業者に現在利用可能な多数の方法により行うことができる。したがって、プロセス工程の組合せは、例えば、以下のプロセスを含むように、上流細胞溶解工程を含みうる：（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）本明細書に記載のライセートの清澄化、（ｉｉｉ）ＣＴＡＢのような界面活性剤でのプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｖ）ｈｃＣａＳｉＯ３上への単一または段階的吸着による残存不純物の除去、および（ｖｉ）安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える、精製されたプラスミドＤＮＡの、後続のアルコール（例えば、エタノール）沈殿。細胞溶解の任意の公知方法が、この上流工程に意図される。好ましい細胞溶解法が本明細書に記載されている。
【００４９】
本発明の追加的な実施形態は、ライセートの清澄化の追加的工程が、以下の段階的方法を与えるように該中心的加工工程、細胞溶解および塩溶解工程と組合された方法に関する。該段階的方法は、（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）好ましくは珪藻土に補助される濾過または遠心分離によるライセートの清澄化、（ｉｉｉ）ＣＴＡＢのような界面活性剤でのプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液での該プラスミドＤＮＡの選択的溶解、（ｖ）ｈｃＣａＳｉＯ３上への残留不純物の吸着、および（ｖｉ）アルコール（例えば、エタノール）を使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿の工程を含むが、これらに限定されるものではない。プラスミド沈殿、アルコール沈殿および清澄化物質のためのＣＴＡＢの使用の代替法が、本明細書に記載されている。
【００５０】
本発明の方法は、細菌細胞、植物細胞、酵母、バキュロウイルスを含む（これらに限定されるものではなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、好ましい微生物宿主である）微生物細胞からの臨床等級のＤＮＡプラスミドの精製を可能にする。本明細書に記載の方法により精製された臨床等級のプラスミドＤＮＡは、ワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしてのヒトへの投与に非常に有用である。
【００５１】
本発明は、臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造のための経済的な代替的製造方法を代表する大規模方法に関する。本発明の核心は、（ｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、およびそれに続く、最終産物の濃縮を含むいくつかの下流加工工程の周辺に集中する。本発明の核心は、ヒトへの投与に適したＤＮＡプラスミド調製物を得るための、大規模化可能な設計プロセス（ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）における前記工程を含む。
【００５２】
本発明は、臨床等級のプラスミドＤＮＡを微生物細胞から単離する方法に関する。本発明のプラスミド精製方法は、１つには、（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）珪藻土に補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉｉ）有用な量の珪藻土の存在下でのＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液での該ＣＴＡＢペレットの選択的溶解、（ｖ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、および（ｖｉ）安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える、該精製プラスミドＤＮＡの、後続のアルコール沈殿を含む（これらに限定されるものではない）操作に基づく。
【００５３】
本発明の好ましい態様においては、大規模なプラスミドの製造は、（ｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、および（ｉｖ）好ましくは、安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える該精製プラスミドＤＮＡの後続のアルコール（例えば、エタノール）沈殿を含む幾つかの下流加工工程を含む。本明細書に開示するとおり、工程（ｉｖ）を含む該設計プロセスの態様は互換性があることが、当業者に公知であろう。
【００５４】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、細胞溶解の後に、該細胞ライセートを有効に清澄化する量の珪藻土で濾過を行う。この初期工程の後、少なくとも、前記の追加的な下流工程、すなわち、（ｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、および（ｉｖ）好ましくは、該精製プラスミドＤＮＡのエタノール沈殿を行う
【００５５】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ライセートの清澄化の前の完全な細胞溶解は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７９４（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）に開示されている熱交換装置による、リゾチーム処理を伴う又は伴わない（好ましくは、リゾチーム処理を伴う）、該発酵ブロスから集めた細胞または直接的に該発酵ブロスの移動を含む。この細胞溶解工程の後、以下を含む（それらに限定されるものではない）細胞溶解後工程を加える：（ｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくは、ＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な二段階沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｉｖ）臨床等級のプラスミド調製物の最終的な製剤化の前の、アルコール（エタノール、メタノールまたはイソプロパノールを含むが、これらに限定されるものではない）を使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿。この目的において、本発明のこの態様は、微生物発酵からスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法に関する。該方法は、（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量の細胞溶解溶液を該回収微生物細胞に加え、（ｃ）フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）熱交換器中で工程ｂ）の微生物細胞を約６０℃〜約７０℃から約１００℃までの温度に加熱して、細胞ライセートを形成させ、（ｄ）該細胞ライセートを冷却し、（ｅ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｆ）第１セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿により残留細胞残渣および不純物を沈殿させ、（ｇ）第２セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させ、（ｈ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｉ）工程（ｈ）のバッファー内の珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｊ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｋ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｌ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｍ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｎ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む。また、工程（ｊ）〜（ｎ）を省略する一方で、工程（ｉ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。本明細書に記載のとおり、該第１および第２ＣＴＡＢ誘発性沈殿工程（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）は、効果的には、第１カットについては約０．２５％〜約０．２８％および第２カットについては約３０％〜約０．３３％の範囲となりうる。この場合にも、本明細書を参照すれば、段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内である。本明細書に記載のＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎに基づく界面活性剤のような成分を加えることが可能であり、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助ける種々のバッファー内の生物学的に有効な濃度で有用でありうる。
【００５６】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ライセートの清澄化の前の完全な細胞溶解は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７９４（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）に開示されている熱交換装置による、リゾチーム処理を伴う又は伴わない（好ましくは、リゾチームの存在下）、該発酵ブロスから集めた細胞または直接的に該発酵ブロスの移動を含む。この細胞溶解法は、以下を含む（これらに限定されるものではない）プロトコールを開始させる：（ｉ）珪藻土により補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくはＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な一工程沈殿、（ｉｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｖ）臨床等級のプラスミド製剤の最終的な製剤化の前の、アルコールを使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿。この目的において、本発明のこの態様は、大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量の細胞溶解溶液を該回収微生物細胞に加え、（ｃ）フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）熱交換器中で工程ｂ）の微生物細胞を６０℃〜７０℃から約１００℃までの温度に加熱して、細胞ライセートを形成させ、（ｄ）該細胞ライセートを冷却し、（ｅ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｆ）セチルトリメチルアンモニウムで、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、（ｇ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｈ）工程（ｇ）のバッファー内の珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｉ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｊ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｋ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｌ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｍ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む方法に関する。また、工程（ｊ）〜（ｍ）を省略する一方で、工程（ｈ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。工程（ｂ）の好ましい細胞溶解温度は約７０℃〜約８０℃であり、一方、単一ＣＴＡＢカットは、好ましくは、約０．３０〜約０．３３％（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）のＣＴＡＢ濃度におけるものであることが可能であり、この場合も、それは恐らく、バッファー条件により影響される。ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎのようなバッファー成分は、他の箇所に記載されているとおり、プラスミドＤＮＡの回収を増加させるためのバッファーの添加に利用可能である。
【００５７】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、細胞溶解を、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ（１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）に記載の技術の変法により行い、該変法においては、希水酸化ナトリウムを使用して細胞を細胞溶解し、ついでＫＯＡｃで中和する。ついでこの細胞溶解工程の後、以下を含む（それらに限定されるものではない）細胞溶解後工程を加える：（ｉ）珪藻土により補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくはＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な沈殿、（ｉｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｖ）臨床等級のプラスミド製剤の最終的な製剤化の前の、珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着。この目的において、本発明のこの形態の態様は、大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量のリゾチーム／アルカリ／ＫＯＡｃを該回収微生物細胞に加えて、細胞溶解を促進し、細胞ライセートを形成させ、（ｃ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｄ）第１セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿により残留細胞残渣および不純物を沈殿させ、（ｅ）第２セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させ、（ｆ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｇ）工程（ｆ）のバッファーを伴う珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｈ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｉ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｊ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｋ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｌ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む方法に関する。また、工程（ｊ）〜（ｎ）を省略する一方で、工程（ｉ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。本明細書に記載のとおり、該第１および第２ＣＴＡＢ誘発性沈殿工程（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）は、効果的には、第１カットについては約０．２５％〜約０．２８％および第２カットについては約３０％〜約０．３３％の範囲となりうる。この場合にも、本明細書を参照すれば、段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで該ＤＮＡを追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内である。バッファー成分、例えばＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎに基づく界面活性剤を加えることが可能であり、そのような成分は、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助ける種々のバッファー内の生物学的に有効な濃度で有用でありうる。
【００５８】
もう１つの好ましい実施形態においては、細胞溶解を、修飾されたＢｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ法により行い、この場合、前記のとおり、希水酸化ナトリウムを使用して細胞を細胞溶解し、ついでＫＯＡｃで中和する。ついでこの細胞溶解工程の後、以下を含む（それらに限定されるものではない）細胞溶解後工程を加える：（ｉ）珪藻土により補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくはＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な沈殿、（ｉｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｖ）臨床等級のプラスミド製剤の最終的な製剤化の前の、エタノールを使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿。本発明のこの形態の態様は、大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、（ａ）大規模な発酵から微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量のリゾチーム／アルカリ／ＫＯＡｃを該回収微生物細胞に加えて細胞溶解を促進し、細胞ライセートを形成させ、（ｃ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｄ）セチルトリメチルアンモニウムで、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、（ｅ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｆ）水和結晶性珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｈ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｉ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｊ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｋ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｌ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む方法に関する。また、工程（ｉ）〜（ｍ）を省略する一方で、工程（ｈ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。工程（ｂ）の好ましい細胞溶解温度は約７０℃〜約８０℃であり、一方、単一ＣＴＡＢカット（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）は、好ましくは、約０．３０〜約０．３３％のＣＴＡＢ濃度におけるものであることが可能であり、この場合も、それは恐らく、バッファー条件により影響される。ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎのようなバッファー成分は、他の箇所に記載されているとおり、プラスミドＤＮＡの回収を増加させるためのバッファーの添加に利用可能である。
【００５９】
前記のとおり、該回収微生物細胞をＳＴＥＴバッファーに溶解し、リゾチームを加える。この塩基性バッファー組成の修飾が施されることが可能であり、本発明での使用に適していると当業者に容易に理解される。本方法の結果に実質的に影響を及ぼさず改変もしないこの塩基性バッファー組成に対する修飾は、本発明の方法の範囲内であると意図される。しかし、本発明の好ましい実施形態においては、本明細書の全体にわたり記載されているＣＴＡＢのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿は、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋のような二価陽イオンを有効に除去するキレート剤を含む生理的に許容されるバッファーの存在下で行う。マグネシウムは、ＤＮＡアーゼおよびプラスミドＤＮＡとのカルシウム複合体の必須補因子であり、ＣＴＡＢによる沈殿を妨げる。該キレート剤はＥＤＴＡであることが本明細書で例示されており好ましい。しかし、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋のような二価陽イオンを除去する任意のキレート剤を、本明細書に開示するプラスミドＤＮＡ精製方法の実施に使用するバッファーに加えることができる。１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭおよび１００ｍＭのＥＤＴＡ濃度がＣＴＡＢ誘発性プラスミドＤＮＡ沈殿の促進に有効であることが、本発明者により示されている。したがって、ＣＴＡＢ誘発性プラスミドＤＮＡ沈殿を促進する、ＥＤＴＡを含む選択されたキレート剤の生理的に許容される任意の濃度を、初期段階的プラスミドＤＮＡ沈殿工程の全体にわたり用いることが可能である。
【００６０】
珪藻土（ＤＥ）は、ほぼすべてが含水珪藻の殻断片から形成される低密着性（ｌｏｏｓｅｌｙ ｃｏｈｅｒｅｎｔ）粉末物質である。通常は細やかなテクスチャーであり灰色または白色である珪藻土は、大部分が、純粋な形態の二酸化ケイ素またはシリカから構成され、９４％ものシリカ含量を有する。珪藻土は、天然、焼成および融剤焼成の３つの形態で商業的に入手可能である。ＤＥの焼成形態は、高温での焼成により得られ、一方、融剤焼成ＤＥは、ソーダ灰または塩化ナトリウムのような融剤の存在下での焼成により製造される。珪藻土は多数の商業的入手源から入手可能であり、Ｃｅｌｐｕｒｅ６５、Ｃｅｌｐｕｒｅ １００、Ｃｅｌｐｕｒｅ３００、Ｃｅｌｐｕｒｅ １００およびＬＲＡ（商標）（すべて、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓから入手可能）ならびにＳｏｌｋａ ＦｌｏｃのようなＣｅｌｌｕｌｏｓｉｃ濾過助剤を含む（これらに限定されるものではない）すべての入手可能形態が本発明の方法の実施に使用されると意図される。前記および本明細書に記載のとおり、珪藻土に補助された濾過による該細胞ライセートの清澄化は、好ましい下流加工工程である。なぜなら、この工程は、より大規模化が可能であり、該プラスミドＤＮＡは、大規模な遠心分離のせん断効果を受ける傾向がより低いらしいからである。しかし、宿主細胞残渣およびゲノムＤＮＡを除去するために、遠心分離のような他の代替的手段を用いることも可能である。
【００６１】
本発明の特に好ましい実施形態においては、本明細書の全体にわたり記載されているＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿は段階的な様態で達成され、細胞残渣、ｇＤＮＡおよび幾つかのＤＮＡ分解物が低カットＣＴＡＢ濃度で選択的に沈殿し、ついでプラスミドＤＮＡの第２の高カットＣＴＡＢ誘発性沈殿が生じる。ＣＴＡＢはプラスミドＤＮＡの段階的選択的沈殿に好ましいが、他の化合物も有用である可能性があり、それらには、Ｃ１６：セチルトリメチルアンモニウム；Ｃ１６：セチルジメチルエチルアンモニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１６：セチルピリジニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１４：テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１２：ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１２：ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド；Ｃ１６：ヘキサデシルアミン：クロリドまたはブロミド塩；Ｃ１６：ヘキサデシルピリジニウムブロミドまたはクロリド；およびＣ１２ドデシルアミンまたはクロリド塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。種々の細胞ライセート不純物からスーパーコイルプラスミドＤＮＡを有効に沈殿させる化合物を同定するために、本明細書に例示されている界面活性剤の潜在的代替物を試験することは、当業者の認識範囲内であろう。
【００６２】
本発明のもう１つの実施形態においては、不純物の下流バッチ吸着を、合成水和珪酸カルシウムＬＲＡ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｍｐｏｃ，ＣＡ ９３４３８）のような水和珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）の存在下で行う。該水和珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）吸着工程の代わりにカラム形態の吸着を用いることも可能である。例えば、ＬＲＡ（商標）を使用する場合には、まず、ＬＲＡ（商標）細粒を除去するために沈降（ｓｅｔｔｌｅ）デカントを行い、ついで該ＬＲＡ（商標）をカラム内に充填する。１０カラム容積のＮａＣｌ（該プラスミド供給溶液と同じＮａＣｌ濃度）を該カラムにアプライし、ついで該プラスミド溶液をアプライする。スーパーコイルプラスミドＤＮＡは、流出液内に溶出する最初の形態のＤＮＡである。より後の画分は、プラスミド分解物およびゲノムＤＮＡを含有するであろう。内毒素およびＣＴＡＢも、該カラムに強固に結合することにより除去される。核酸不純物を含有する画分はプールしない。水和珪酸カルシウム物質はＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／２００３４（ＷＯ９８／０１４６４）（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。ＷＯ ９８／０１４６４において指摘されているとおり、ｈｃＣａＳｉＯ３化合物を製造するための多数の方法が当技術分野で公知である（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，１９６４，Ｅｄ．，Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｅｍｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。さらにＷＯ ９８／０１４６４に記載されているとおり、ｈｃＣａＳｉＯ３の粒径は、ｘ線測定および／または電子顕微鏡検査のような公知方法による測定で約０．０１ミクロン〜約０．１０ミクロンでありうる。これらの小粒子のなかには、約１００ミクロンもの大きさの凝集体が存在しうる。後記のとおり、好ましい実施形態は、約１０重量％未満、より好ましくは約８重量％未満の約３２５メッシュシーブ上での保持率を有するｈｃＣａＳｉＯ３を示す。好ましい多数の実施形態においては、該ｈｃＣａＳｉＯ３は、約７５ｍ２／ｇ以上、好ましくは約７５ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇの表面積を有する粉末形態である。本発明で使用する好ましい水和珪酸カルシウム物質は、珪藻土、水和酸化カルシウム（水酸化カルシウム）および水の水熱反応により製造された微粉末である。該最終産物は、約４７重量％のケイ素（ＳｉＯ２）、約３２重量％の化学量論的量のカルシウム（ＣａＯ）、約２．５重量％のアルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、約１．２重量％のナトリウム（Ｎａ２Ｏ）およびカリウム（Ｋ２Ｏ）複合体、約０．７重量％の鉄（Ｆｅ２Ｏ３と報告されている）、約０．６重量％のマグネシウム（ＭｇＯ）およびその他（約１６．６％のＨ２Ｏ）を含む結晶形態である。この好ましい形態は、３２５メッシュシーブ上での約６重量％の保持率および約１２０ｍ２／ｇ（Ｂ．Ｅ．Ｔ．法を用いて測定した場合）の表面積を有する。ＣａＳｉＯ３の前記成分の該重量％範囲は、ＳｉＯ２（４５〜９５％）、ＣａＯ（５〜３５％）、Ｈ２Ｏ（１〜２０％）、そして幾つかの場合には、約１％〜約１０％の種々の不純物、例えば（必ずしも以下に限定されるものではない）Ａｌ２Ｏ３、アルカリ金属、例えば酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ）および酸化カリウム（Ｋ２Ｏ）、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）および酸化マグネシウム（ＭｇＯ）ならびに少量の可溶性アルミニウムを含みうるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。より大きなＤＮＡ断片に選択的に結合しうる、該吸着工程に使用する水和カルシウムに基づく物質の代替的形態（ＬＲＡ（商標）、Ｍａｔｒｅｘ（商標）（Ａｍｉｃｏｎ）およびヒドロキシアパタイト（（二塩基）リン酸カルシウム）で例示される）で代用することは、当業者の認識範囲内であろう。それとは無関係に、ＬＲＡ（商標）に類似した特性を有する合成水和珪酸カルシウム（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２００３４に開示されている）は、残留ＤＮＡ分解物、例えば開環弛緩型および直鎖状形態、宿主ＤＮＡおよびＲＮＡ、内毒素、タンパク質および界面活性剤添加物（例えばＣＴＡＢ）を除去するための好ましい吸着物質である。
【００６３】
したがって、本明細書に記載の方法は、種々の形態のプラスミド（スーパーコイルプラスミドＤＮＡ［ＤＮＡワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしての使用が意図される産物］）、開環弛緩型プラスミドＤＮＡ、直鎖状プラスミドＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡコンカテマー）間の分離の達成、ならびに宿主混入物、例えばＬＰＳ（内毒素）、ｇＲＮＡ、ｇＤＮＡおよび残留タンパク質の除去をもたらす。
【００６４】
本発明の方法により単離および精製されるプラスミドは、任意の染色体外ＤＮＡ分子でありうる。該プラスミドは、高コピー数／細胞または低コピー数／細胞でありうる。該プラスミドはまた、実質的に任意のサイズのものでありうる。該微生物細胞内の実質的に任意のプラスミドが本発明の方法により単離されうると当業者に容易に理解される。
【００６５】
本発明の方法は、一般には微生物発酵との併用に適している。細菌細胞、植物細胞、真菌細胞（酵母を含む）およびバキュロウイルスを含む（これらに限定されるものではない）多種多様な微生物細胞が本発明の方法での使用に適していると当業者に容易に理解される。好ましい微生物発酵は、単離および精製するプラスミドを含有する細胞の細菌発酵である。好ましい細菌発酵は、単離および精製するプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵以外の細菌発酵も本発明での使用に適していると当業者に容易に理解される。本発明の大規模微生物発酵を、使用する細菌の成長に適した任意の液体培地内で成長させることができる。開示している方法は、より小さな発酵容積に適用可能であるが、本発明の特に有用な態様は、大規模な微生物細胞発酵に大規模化されうることである。本発明で用いる「大規模」なる語は、約５リットルを超える全細胞発酵容積、または約５リットルを超える発酵容積から回収された細胞とみなされる。本発明の大規模発酵法は、典型的には約１００〜２００リットルの発酵である（これに限定されるものではない）臨床規模のロットに適用可能である。
【００６６】
これらの前記工程のそれぞれを含む本発明の１つの実施形態は、以下の工程よりなる：（ｉ）プラスミドＤＮＡを含有する細胞を濃縮しダイアフィルトレーションするための発酵ブロスの接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）流動濾過、（ｉｉ）細胞の再懸濁、（ｉｉｉ）組換えリゾチームの存在下での細胞スラリーの３７℃でのインキュベーション、（ｉｖ）急速加熱による細胞溶解およびそれに続くライセートの冷却、（ｖｉ）珪藻土での濾過を用いるライセートの清澄化、（ｖ）ＣＴＡＢの添加による残留細胞残渣および不純物（例えばゲノムＤＮＡ）の沈殿、（ｖｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿、（ｖｉｉ）プラスミドＤＮＡの選択的再溶解、（ｖｉｉｉ）珪酸カルシウム上への残留内毒素およびＣＴＡＢのバッチ吸着、（ｉｘ）珪酸カルシウム上への残留タンパク質、核酸および他の不純物のバッチ吸着、（ｘ）エタノールでのプラスミドＤＮＡの沈殿、（ｘｉ）該沈殿物を集め洗浄するための濾過、（ｘｉｉ）エタノールを除去するための真空乾燥、（ｘｉｉ）製剤化バッファー中への、精製されたプラスミドＤＮＡの再溶解、および（ｘｉｉｉ）０．２２μｍの滅菌濾過。
【００６７】
本発明のもう１つの実施形態においては、該発酵ブロスからの未回収細胞をリゾチームと共に３７℃で約１時間インキュベートし、該細胞スラリーを、７５〜８０℃の出口温度をもたらす熱交換器を介して送り出す。この後、該ライセートを２０〜２５℃に冷却するために第２熱交換器を介した送り出しを行う。該ライセート物質を、（ｉ）珪藻土での濾過を用いるライセートの清澄化、（ｉｉ）ＣＴＡＢの添加による残留細胞残渣および不純物（例えばゲノムＤＮＡ）の沈殿、（ｉｉｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿、（ｉｖ）プラスミドＤＮＡの選択的再溶解、（ｖ）珪酸カルシウム上への残留内毒素およびＣＴＡＢのバッチ吸着、（ｖｉ）珪酸カルシウム上への残留タンパク質、核酸および他の不純物のバッチ吸着、（ｖｉｉ）エタノールでのプラスミドＤＮＡの沈殿、（ｖｉｉｉ）該沈殿物を集め洗浄するための濾過、（ｉｘ）エタノールを除去するための真空乾燥、（ｘ）製剤化バッファー中への、精製されたプラスミドＤＮＡの再溶解、および（ｘｉ）０．２２μｍの滅菌濾過に付す。
【００６８】
該プラスミドを含有する微生物細胞を該発酵培地から回収して、細胞ペーストまたはスラリーを得る。遠心分離または精密濾過を含む（これに限定されるものではない）、液体培地から細胞を回収するための通常の任意の手段が適している。細胞ペーストは、該プラスミドＤＮＡを含有する微生物細胞を該発酵ブロスから回収することにより得られる。該回収は、（ｉ）５００ｋＤａの公称分子量のＡ／Ｇ Ｔｅｃｈ膜による接線流動濾過を用いて該細胞を３倍濃縮し、（ｉｉ）３倍等価容積の滅菌された１２０ｍＭ 食塩水で該濃縮細胞をダイアフィルトレーションすることよりなる。該回収細胞を、６００ｎｍで３０の光学濃度に対応する希釈度になるまで、滅菌ＳＴＥＴバッファー（８％ ｗ／ｖ スクロース，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，ｐＨ８．５）に再懸濁する。該懸濁液を３７℃に加熱し、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ（商標）リゾチームを５００ｋＵ／Ｌの濃度になるまで加えた。３７℃で４５分後、該細胞スラリーを、沸騰水中に沈められた熱伝達コイルを介して送り出して、該コイルから出る際にその温度が７０℃に達するようにした。ついで該ライセートを、氷水浴中に沈めた熱伝導コイルを介した流動により約２０℃に冷却した。熱交換装置を介する該細胞スラリーの移動を含む細胞溶解工程は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７４９（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。簡単に説明すると、前記のとおり、該回収微生物細胞をＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、リゾチームを加える。この塩基性バッファー組成の修飾が施されることが可能であり、本発明での使用に適していると当業者に容易に理解される。本方法の結果に実質的に影響を及ぼさず改変もしないこの塩基性バッファー組成に対する修飾は、本発明の方法の範囲内であると意図される。しかし、この工程は、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋のような二価陽イオンを有効に除去するキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含む生理的に許容されるバッファーの存在下で行うことが特に好ましい。前記のとおり、ＣＴＡＢ誘発性プラスミドＤＮＡ沈殿を促進する任意のキレート剤濃度を用いることが可能であり、それは、約１ｍＭ〜１００ｍＭ ＥＤＴＡを超える広い濃度範囲にわたり例示される。これらのＥＤＴＡ濃度範囲は、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの最適なＣＴＡＢ誘発性沈殿をもたらす一方、ＤＮアーゼ活性を阻害もする。該バッファーｐＨ範囲は、使用している特定の微生物株に関して得られた最良の結果に従い調節することができる。好ましいｐＨ範囲は約８．０〜８．５である。ついで該懸濁液を約６０〜１００℃（約７０〜８０℃が好ましい）にフロースルー熱交換器中で加熱する。この後、第２熱交換器中で２０〜２５℃に冷却する。ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ（１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）のもう１つの細胞溶解方法も意図される。この方法では、細胞を、希水酸化ナトリウムを使用して細胞溶解し、ついでＫＯＡｃで中和する。ＣＴＡＢ誘発性ＤＮＡ沈殿の妨害を防ぐために、アルカリ工程にＳＤＳは加えない。細胞溶解収率は、ＳＤＳの不存在による影響を受けなかった。
【００６９】
ついで珪藻土（Ｃｅｌｐｕｒｅ（商標）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）を３０ｇ／Ｌの濃度で該冷却ライセートに加える。該残存スラリーを濾過し、該ケークを洗浄して生成液体を回収する。ついでＣｅｌｐｕｒｅ（商標）を約１０ｇ／Ｌで該清澄化ライセート内に混合する。４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの溶液を０．１〜０．３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの最終濃度にまで加えることにより、残留微粉砕細胞残渣および他の不純物（ゲノムＤＮＡならびに弛緩型環状および直鎖状ＤＮＡ分解物を含む）を該清澄化ライセートから沈殿させる。該残存スラリーを、その濁度が１０ ＮＴＵ未満になるまで初期再循環を得た後で濾過する。Ｃｅｌｐｕｒｅ（商標）を１０ｇ／Ｌのボディ供給（ｂｏｄｙ ｆｅｅｄ）濃度で該濾液に加える。これは或るマトリックスを与え、４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢを使用して該ＣＴＡＢ濃度を０．２５％〜０．４５％ ｗ／ｖに増加させると該マトリックス上でプラスミドＤＮＡが沈殿する。該スラリーを濾過し、該濾液を、その濁度が１０ＮＴＵ未満になるまで再循環させる。実施例１においては、得られたプラスミドＤＮＡ含浸濾過ケークを４０ｍＭ ＮａＣｌ中の０．３０％〜０．３３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢで洗浄した。該低および高カットＣＴＡＢ範囲はプラスミドＤＮＡ濃度、イオン強度および／または温度の変化に応じて操作されうると当業者は認識するであろう。ついで該濾過ケークを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）を含有する約０．２Ｍ〜約２．０Ｍ ＮａＣｌに溶解する。ＮａＣｌがＣＴＡＢと置き換わるにつれて、プラスミドＤＮＡが再溶解する。この場合も、当業者は、該濾過ケークを洗浄および／または再溶解するために種々の塩濃度を選択することが可能である。低い濁度を得るために初期再循環を得た後、該懸濁液をステンレス鋼膜上で濾過してＣｅｌｐｕｒｅ（商標）を除去する。該濾液を、ｈｃＣａＳｉＯ３（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｎｅｒａｌｓからのＬＲＡ（商標））を使用する２つのバッチ吸着工程に付す。該第１吸着工程は残留内毒素およびＣＴＡＢを除去し、該第２吸着工程は残留タンパク質、弛緩型環状および直鎖状ＤＮＡ分解物ならびに宿主ＤＮＡおよびＲＮＡを除去する。該第１吸着工程では、ＤＮＡ １グラム当たり４５グラムのＬＲＡ（商標）を加える。得られたスラリーを２０℃で１時間インキュベートし、濾過する。該濾過ケークを１．２Ｍ ＮａＣｌまたは前記の合理的な塩濃度で洗浄する。新鮮なＬＲＡ（商標）をＤＮＡ １グラム当たり５０グラムで該濾液および洗浄溶液に加え、得られたスラリーを２０℃で約５時間インキュベートする。ついで該スラリーを濾過してＬＲＡ（商標）を除去し、得られた濾過ケークを１．２Ｍ ＮａＣｌで洗浄する。前記のバッチ吸着工程は、該再構成ＣＴＡＢ沈殿物を含有する溶液中に該珪酸カルシウムがスラリー化されるように行うことが可能であり、あるいは、該バッチ吸着工程は、該溶解ＣＴＡＢ中間体の処理に使用するｈｃＣａＳｉＯ３カラムの使用に関して前記したとおりにｈｃＣａＳｉＯ３を含む充填カラムを使用して完了させることが可能であることが当業者に明らかであろう。１等価容積の無水エタノールを、該第２ ｈｃＣａＳｉＯ３工程からの濾液および洗浄液に加えて、該精製プラスミドＤＮＡを沈殿させる。得られた沈殿物を濾過により回収し、直ちに無水エタノールで洗浄する。該洗浄沈殿物を２０℃で真空乾燥してエタノールを除去し、ついで、再構成させるまで４℃で保存する。注射に適したバッファー中での再構成に際しては、該精製プラスミドＤＮＡ溶液を０．２２μｍ濾過滅菌に付す。あるいは、濾過不可能なペーストを沈殿物が形成する場合には、該バルク産物粉末をエタノール性沈殿物から単離することができる。該沈殿ペーストを遠心分離し、該ペーストを１００％ ＥｔＯＨに加え、それをローターステータのような高速ホモジナイザーで混合する。該ペーストの脱水および硬粒子中への湿式粉砕を同時に行う。これらの粒子は濾過および乾燥になじみやすい。
【００７０】
前記のとおり、バルク粉末を沈殿させる代わりに、該精製プラスミドＤＮＡ調製物を、医薬上許容される担体またはバッファー溶液中に移すことができる。医薬上許容される担体またはバッファー溶液は当技術分野で公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような種々のテキストに記載されているものを含む。ＤＮＡサンプルの濃縮に適した任意の方法が、本発明での使用に適している。そのような方法は、限外濾過、アルコール沈殿、凍結乾燥などを含むが、エタノール沈殿が好ましい。該精製プラスミド調製物は、該ＤＮＡ産物の有用性に影響を及ぼさない任意の滅菌方法、例えば、十分に小さな孔径（例えば、０．２２ミクロン以下）を有する膜に通過させることによる滅菌により滅菌することができる。
【００７１】
該最終産物は、ｈｃＣａＳｉＯ３上の緩く結合した状態から放出したカルシウムを含有する。典型的な調製物は、該沈殿産物中で約１．６％ ｗ／ｗを有しうる。臨床製剤の製造では、ＥＤＴＡを使用する通常の方法により該残留カルシウムを回収することができる。例えば、ＥＤＴＡの添加によるカルシウムの錯体形成は、限外濾過または沈殿と共に行うことが可能であり、該カルシウム−ＥＤＴＡ錯体は、該沈殿液または限外濾過浸透流で流出しうる。あるいは、ＥＤＴＡを含有する小さなキレートカラムは、ＥＤＴＡを該プロセスの流れに導入しなくても、より効率的に該カルシウムを除去するであろう。
【００７２】
本発明の方法は、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む（決してこれらに限定されるものではない）生物からの臨床等級のＤＮＡプラスミド精製を可能にする。本明細書に記載の方法により精製された臨床等級のプラスミドＤＮＡは、ワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしてのヒトへの投与に非常に有用である。
【００７３】
以下の実施例は本発明の方法を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【００７４】
実施例１
プラスミドＤＮＡの精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドＤＮＡの精製のための以下のプロトコールは、約７３０ｍｇの精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡの単離をもたらした。本明細書に開示する中心的なプラスミド精製方法の概要を図１に示す。
【００７５】
細胞溶解
６００ｍＬの細胞ペーストを、温かい水道水を使用して融解し、５．４ＬのＳＴＥＴバッファーに再懸濁させた。該１０倍希釈は、６００ｎｍで３０の光学濃度を有するスラリーを与えた。ついで４０ｍｃＬのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，３０ｋＵ／ｍｃＬ）を該細胞スラリーに加えた。該希釈細胞スラリーの温度を約４０℃に上昇させた。４５分間の混合後、該細胞を、沸騰水浴中に沈めた電解研磨ステンレス鋼コイルにより熱細胞溶解した。該熱交換器を出る流体の温度が約７０℃となるように、該流速を調節した。ついで該細胞溶解コイルを、発熱物質を含まない水できれいにし、氷水浴中に沈め、その温かいライセートを３０℃に冷却するのに使用した。ライセートは、熱細胞溶解の完了の３０分以内に冷却した。全ライセート容積は５．６Ｌであった。
【００７６】
清澄化
該冷却ライセートを清澄化するために、３０ｇ／Ｌのボディ供給濃度のＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）を使用した。Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００を該ライセート内に混合し、得られたスラリーを４つの部分に分割した。Ｃｅｌｐｕｒｅの量は、操作の最終規模、所望のフィルターサイズおよび形状ならびに製造施設の意図される生産速度に応じて広範囲にわたり様々となりうる。同様の考慮事項により、本明細書に記載の低および高カット濾過工程における珪藻土の量が決定される。各部分を、６インチ径のフィルターケース内に含有される２５ミクロンのステンレス鋼メッシュで別々に濾過した。該濾液を、まず、その濁度が約１０ＮＴＵに減少するまで再循環させた。各濾過後、加圧空気を使用して、該濾過ケーク内の間隙流体を置換した。分析用ＨＰＬＣアッセイにより測定したスーパーコイルプラスミドＤＮＡの純度および全ＤＮＡ濃度は、それぞれ、８３．６％および０．３３８ｇ／Ｌであった。
【００７７】
ＣＴＡＢプローブ
迅速（ｒａｐｉｄ）ＣＴＡＢプローブを使用して、およその低および高カットＣＴＡＢ濃度を測定した。４０ｍＭ ＮａＣｌ中の次第に増加する量の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢを、１．５ｍＬガラスバイアル内の清澄化ライセートの５００ｍｃＬ アリコートに加えた。バイアルをボルテックスし、ＤＮＡ沈殿物の存在に関して視覚的に検査した。該プローブの結果に基づき、それぞれ０．２３および０．３０％ｗ／ｖの低および高カットＣＴＡＢ濃度が割り当てられた。
【００７８】
低カットＣＴＡＢ工程
５．０５Ｌの清澄化ライセートに、４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの１．５Ｌ 溶液を室温で４３分間にわたって加えた。ついて３４．２ｇのＣｅｌｐｕｒｅ ３００を加えた。ついで該スラリーを、６インチ径のフィルターケース内に含まれる２５ミクロンのステンレス鋼メッシュで濾過した。濾液を、まず、その濁度が一定になるまで再循環させた。該濾過ケークは洗浄しなかったが、加圧空気を使用して乾燥した。産物含有濾液の最終容積は６．４４Ｌであった。
【００７９】
高カットＣＴＡＢ工程
２９．３ｇのＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００を該低カット濾液に加えた。ついで、攪拌しながら、４０ｍＭ ＮａＣｌ中の６５０ｍＬの１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢを該スラリーに約３０分間にわたって加えた。分析用ＨＰＬＣ分析は、該ＤＮＡのすべてが沈殿していることを示した。ついで該高カットスラリーを、６インチ径フィルターケース内に含まれる２５ミクロンステンレス鋼メッシュで濾過した。一定の濁度が観察されるまで、該濾液を再循環させた。該高カットスラリーの濾過が完了した後、該濾過ケークを１２ｍＭ ＮａＣｌ中の０．３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの１Ｌ 溶液で洗浄した。２つの５００ｍＬ洗浄画分を集めた。ついで該洗浄ケークを、加圧空気を使用して部分乾燥し、該フィルターケースから集め、秤量して、該ケーク内の残留液体の質量を測定した。ケークの総質量は１１３ｇであった。Ｃｅｌｐｕｒｅおよび沈殿ＤＮＡは、それぞれ約２９および２ｇに相当した。このことは、該洗浄ケーク中に約８２ｍＬの残留液体が存在したことを示している。図２は、ＣＴＡＢでの段階沈殿中の濃度プロフィールを示している。これらのデータは、プラスミドＤＮＡが、小刻みな界面活性剤の増加量にわたって沈殿することを示している。このＣＴＡＢ−沈殿工程は、可溶性のままであるタンパク質、ＲＮＡおよび内毒素の除去に選択的である。
【００８０】
洗浄した高カットケークの選択的再溶解
７００ｍＬの無菌水を該洗浄高カットケークに加え、液体の総容積を約７８２ｍＬとした。約８６ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌを該スラリーに加えて約０．５ＭのＮａＣｌ濃度を得、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解した。残留珪藻土を、６インチ径フィルターケース内に含まれる２５ミクロンのステンレス鋼メッシュで濾過して、該再溶解スーパーコイルプラスミドＤＮＡから該Ｃｅｌｐｕｒｅを分離した。透明な濾液が観察されるまで、該濾液を再循環させた。該濾過ケークを約１Ｌの０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄して、産物含有間隙液を回収した。該０．５Ｍ ＮａＣｌ 洗浄液を４つの画分内に集めた。分析用ＨＰＬＣアッセイを用いて、該産物濾液および前記の４つの洗浄画分を全ＤＮＡ濃度およびスーパーコイルプラスミドＤＮＡ純度に関してアッセイした。該産物濾液および０．５Ｍ ＮａＣｌ洗浄液の容積、全ＤＮＡ濃度、およびスーパーコイルＤＮＡの組成率は以下のとおりであった：（ｉ）産物濾液：８０ｍＬ、１．９３３ｇ／Ｌ、９３．０％、（ｉｉ）洗浄画分１：２００ｍＬ、０．２０３ｇ／Ｌ、８９．１％、（ｉｉｉ）洗浄画分２：２００ｍＬ、０．０４７ｇ／Ｌ、７０．３％、（ｉｖ）洗浄画分３：３００ｍＬ、０．０１８ｇ／Ｌ、６１．４％、および（ｖ）洗浄画分４：３００ｍＬ、０．０１５ｇ／Ｌ、６３．３％。該洗浄画分は該産物濾液に加えなかった。なぜなら、その純度および濃度が低かったからである。
【００８１】
図３は、アガロースゲル電気泳動による０．２Ｍ ＮａＣｌによるプラスミドＤＮＡの選択的溶解を示している。宿主、ゲノムＤＮＡは部分的に可溶性であるに過ぎず、０．２Ｍ ＮａＣｌでの溶解後に濾過により除去される。１．２Ｍ ＮａＣｌでは、ｇＤＮＡは可溶性である。少なくとも約０．２Ｍ ＮａＣｌ〜少なくとも約２Ｍ ＮａＣｌの範囲が、該ＣＴＡＢ沈殿物の選択的溶解に有用であろう。
【００８２】
増加量のＬＲＡ（商標）での該バッチの処理
０．５Ｍ ＮａＣｌ中の７３５ｍＬの再溶解沈殿物を室温で４５ｇのＬＲＡ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）に加えた。５００ｍｃＬのサンプルを４．８、９．９、１９．１および１９．６時間の時点で採取した。表１は、分析用ＨＰＬＣアッセイにより測定した全ＤＮＡ濃度およびスーパーコイルプラスミドＤＮＡの組成率を示す。
【００８３】
定期的に、漸増量の新鮮なＬＲＡ（商標）を該スラリーに加え、サンプルを以下の時点で採取した：
（ｉ）４．６ｇのＬＲＡ（商標）を１９．９時間の時点で加えた（３５ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを２１．６、２３．８および２５．４時間の時点で採取した。
【００８４】
（ｉｉ）６．６ｇのＬＲＡ（商標）を２５．８時間の時点で加えた（３９．５ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを２６．８、２７．８、２８．８および３０．９時間の時点で採取した。
【００８５】
（ｉｉｉ）３．７ｇのＬＲＡ（商標）を３２．２時間の時点で加えた（４２ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを３２．４、３４．４および４０．８時間の時点で採取した。
【００８６】
（ｉｖ）３．９８ｇのＬＲＡ（商標）を４１時間の時点で加えた（４５ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを４１．８および４２．６時間の時点で採取した。
【００８７】
表１に示すとおり、プラスミド純度の更なる増加（ＨＰＬＣアッセイにより測定したもの）は、ＬＲＡ（商標）の定期的添加に対して補正されうる。
【００８８】
【表１】
【００８９】
図４Ａは、珪酸カルシウム上への最適なプラスミド吸着が約０．６ＭのＮａＣｌ濃度で生じることを、より高濃度のＮａＣｌとの比較により示している。ＬＲＡ（商標）がスーパーコイルプラスミドＤＮＡを吸着する能力に影響を及ぼすことなく、この示されている範囲内でＮａＣｌ濃度を操作することは、当業者の認識範囲内であろう。この工程の最適化は、水素結合、疎水性および静電的相互作用の基礎となる現象に関する全ての因子の検討を伴うであろう。そのような変数としては、塩濃度、塩のタイプ、温度、ｐＨおよび吸着剤のタイプが挙げられる。例えば、ＤＮＡに結合する、カルシウムに基づく他の吸着剤は、前記溶液相変数が関与する最適な設計下で分離をもたらすと予想されうるであろう。
【００９０】
ＬＲＡ（商標）の除去および洗浄
４２．９時間後、該ＬＲＡ（商標）スラリーを１９℃で、ｋＲＰＭで２５分間にわたり遠心分離した。得られた４００ｍＬの上清を集めた。２００ｍＬの新鮮な０．５Ｍ ＮａＣｌをＬＲＡ（商標）ペレットに加えた。無菌スパーテルおよび１０秒間の激しい攪拌を用いて、該ＬＲＡ（商標）ペレットを再懸濁した。該再懸濁ＬＲＡ（商標）を８ｋＲＰＭで１０分間の遠心分離に付した。該上清を集め、このようにしてＬＲＡ（商標）ペレットを更に２回洗浄した。該最終上清（４００ｍＬ）およびそれらの３回の洗浄液（３×２００ｍＬ）を、全ＤＮＡ濃度およびスーパーコイルプラスミドＤＮＡの組成に関してアッセイした。結果を表２に示す。洗浄液は該産物上清に加えなかった。ついで該産物上清を０．８ミクロンの使い捨て真空フィルターで滅菌濾過して、残留ＬＲＡ（商標）を除去した。
【００９１】
【表２】
【００９２】
図４Ｂは、時間に対するゲノムまたは宿主ＤＮＡの吸着を示している。より詳しくは、このデータは、ＬＲＡ（商標）が、１．２Ｍ ＮａＣｌ濃度での混合接触の５時間後にＤＮＡを選択的に除去して、約６０％のプラスミド収率を与えることを示している。図４Ｃは、１．２Ｍ ＮａＣｌでのＬＲＡ（商標）接触中の液相サンプルのアガロースゲル電気泳動である。このデータは、直鎖状（Ｌｉｎ）、弛緩型開環状（ＯＣ）および多量体（Ｍ）が除去され、一方、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ＳＣ）が残存していることを示している。レーン１〜５は、次第に遅くなる時点を表し、レーン６〜８は、濾過されたＬＲＡ（商標）の洗浄液を表す。図４Ｄは、０．５Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着を示す。全ＤＮＡ １ｇ当たり３２ｇのｈｃＣａＳｉＯ３と接触している液相サンプルの、時間の関数としてのアガロースゲル電気泳動が示されている。
【００９３】
ＬＲＡ（商標）製品のエタノール沈殿
４００ｍＬの無水エタノールを４００ｍＬのＬＲＡ（商標）後濾液にゆっくりと加えた。エタノールの添加は２時間で完了して、５０％ ｖ／ｖの最終エタノール濃度を得た。該溶液は３６〜３８％ ｖ／ｖの範囲のエタノールで非常に濁った。この時点で、エタノール添加を３０分間停止して、粒子を成長させた。厳密な検査は、細かい濾過されうる粒子を示した。３０分間の混合熟成（ｍｉｘｅｄ ａｇｅ）後、該懸濁液を無菌０．２２ミクロンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＧＰエクスプレスメンブレン，５０ｃｍ２）で濾過した。約５００ｍＬの無水エタノールを使用して該ケークを洗浄した。ついで該フィルター単位を真空オーブンに移し、２７℃、２９（Ｈｇ）で２時間乾燥した。７３０ｍｇの乾燥粉末を集め、無菌着色ガラスバイアル中、−２０℃で保存した。
【００９４】
表３には、該方法の各工程における純度および収率（分析用ＨＰＬＣアッセイにより測定したもの）が要約されている。低カットＣＴＡＢ、高カットＣＴＡＢおよび高カット沈殿物の再溶解にわたり約１００％の収率が達成された。
【００９５】
表４には、タンパク質および内毒素の除去が要約されている。最終的エタノール沈殿産物を、残留ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、内毒素、タンパク質、ＣＴＡＢ、リゾチーム、ＬＲＡ（商標）およびＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００の除去に関してアッセイする。
【００９６】
【表３】
【００９７】
ＵＣＬ：未清澄化ライセート。ＣＬ：珪藻土清澄化ライセート。ＬＣＦ：ＣＴＡＢ低カット濾液。ＨＣＦ：ＣＴＡＢ高カット濾液（予想どおり、ＤＮＡは含有しない）。ＲＨＣＰ：０．５Ｍ ＮａＣｌ中の再溶解高カット沈殿物。ＲＨＣＰ＊：ＬＲＡ（商標）工程への７３５ｍＬの供給。約６５ｍＬをＬＲＡ（商標）プローブ研究において使用した。ＬＲＡ（商標）後：ＬＲＡ（商標）吸着工程後の０．８ミクロン濾液。分析用ＨＰＬＣアッセイを用いてＤＮＡ濃度、ＳＣ純度およびＳＣ濃度を測定した。
【００９８】
【表４】
【００９９】
サンプルの表示は表３に列挙されている。ＬＯＤ：検出限界。ＮＡ：アッセイせず。タンパク質含量は、ローリー法を用いて測定した。内毒素含量は、ＬＡＬアッセイを用いて測定した。＊ＲＮＡ濃度は、オルシノールアッセイを用いて測定した。高濃度のプラスミドＤＮＡは該オルシノールアッセイを阻害する。この阻害は、ＲＨＣＰおよびＬＲＡ（商標）後サンプルに関して列挙されているＲＮＡ濃度において反映される。最終産物Ａ２６０／Ａ２８０比率は１．９であったが、これは、低いＲＮＡ含有分率を示している。
【０１００】
図６は、実施例に記載の加工工程からのサンプルのＤＮＡ組成を示す。スーパーコイルプラスミドは最下バンドにおいて可視化されている。それより上方のバンドは、開環状および直鎖状プラスミド、プラスミド多量体ならびにゲノムＤＮＡを含む種々のＤＮＡ不純物を表す。示されているのは、珪藻土で清澄化されたライセート（左からレーン１）；０．２３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける低カット（ｃｕｔ）濾液（レーン２）；ＤＮＡを含有しない０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける高カット濾液（レーン３）；０．４Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン４）；０．４７５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン５）；０．５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン６）；ＬＲＡ吸着工程後の０．８ミクロン濾液（レーン７）；エタノール沈殿および無菌水中の再溶解に付されたＬＲＡ産物（レーン８）。レーン１および８の比較は、ＤＮＡ分解型不純物においては実質的な減少が存在することを示している。
【０１０１】
実施例２
ＣＴＡＢ沈殿をモニターするための粒径分析器の使用
ＣＴＡＢ沈殿は、例えばＬａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用して厳密にモニターすることができる。４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの溶液を０．２５〜０．２８％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの最終濃度にまで加えることにより、残留微細細胞残渣および他の不純物（ゲノムＤＮＡならびに弛緩型環状および直鎖状ＤＮＡ分解物を含む）を該清澄化ライセートから沈殿させる。該不純物の沈殿を、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用して、リアルタイムでモニターする。該全粒子計数が急激に低下した後、ＣＴＡＢの添加を停止する。これは、該スーパーコイルＤＮＡを溶液中に残す一方で直鎖状および弛緩型環状ＤＮＡを沈殿させるのに十分なＣＴＡＢであるに過ぎない。ついで該バッチを濾過して該沈殿不純物を除去する。ＣＴＡＢを該バッチに０．３０〜３３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの最終濃度で加えて、該スーパーコイルＤＮＡを沈殿させる。図５は、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用した場合の０．２５〜０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢによる不純物の沈殿を示す。ＣＴＡＢ添加は、粒子計数の急激な変化に基づき、１００分の時点で停止する。沈殿不純物を濾過により除去する。追加的なＣＴＡＢを加えて該スーパーコイルＤＮＡを沈殿させる。
【０１０２】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前記の説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１０３】
本明細書中には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】清澄化により細胞残渣を除去する中心的な４つの工程プロセスを含むプロセスの流れ図を示す。
【図２】ＣＴＡＢでの段階的沈殿中の濃度プロフィールを示す。
【図３】アガロースゲル電気泳動による０．２Ｍ ＮａＣｌによるプラスミドＤＮＡの選択的溶解を示す。
【図４Ａ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。塩化ナトリウム濃度に対するプラスミドＤＮＡの平衡吸着。
【図４Ｂ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。ｑＰＣＲにより測定されたゲノムまたは宿主ＤＮＡの吸着。
【図４Ｃ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。１．２Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。
【図４Ｄ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。を示す。０．５Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。
【図５】Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用する０．２５％〜０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢによる不純物の沈殿を示す。
【図６】
実施例１に開示する加工工程からのサンプルのＤＮＡ組成物を示す。
（発明の分野）
本発明は、臨床等級（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ）のプラスミドＤＮＡを微生物細胞から単離する大規模化可能（ｓｃａｌｅａｂｌｅ；規模調節可能）な方法に関する。本明細書に記載の例示されている方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から臨床等級のプラスミドＤＮＡを精製するための大規模化可能で経済的に有利なプロトコールを概説するものであり、これは、プラスミドの製造の下流加工中に、高価なクロマトグラフィー工程に依存しないため、この方法は、大規模な工業的プラスミド精製方法に特になじみやすいものとなる。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子治療およびＤＮＡワクチン接種の領域の進展は、臨床等級のプラスミドＤＮＡの大規模な製造および精製の需要を生み出している。最近の総説において指摘されているとおり（Ｐｒａｚｅｒｅｓら，１９９９，ＴＩＢＴｅｃｈ １７：１６９−１７４）、小規模なプラスミドＤＮＡ精製方法に関するこれまでの研究にもかかわらず、臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造および精製を大規模化することは依然として困難である。特に問題なのは下流加工工程であり、これは大抵の場合、集められた細胞のアルカリ細胞溶解およびそれに続く酢酸アンモニウム沈殿に基づくものであり、更なる下流加工工程は、サイズ排除、陰イオン交換および逆相クロマトグラフィー工程に大きく依存する。また、複数のクロマトグラフィー工程のための樹脂およびバッファーのような原料の費用が、高い単価および大ＤＮＡ分子に関する低い容量のため、法外なものとなることに注目すべきである。陽イオン界面活性剤ＣＴＡＢおよび種々の形態のシリカは、小規模なプラスミドＤＮＡの製造に使用されており、臨床等級のプラスミドワクチンの製造を意図していないことが公知である。ある種の不純物に関するこれらの工程の除去能力は確認されておらず、また、大規模化可能な方法の設計のためのそれらの有用性も確認されていない。Ｄｅｌ Ｓａｌら（１９８９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７（５）：５１４−５１９）およびＧｕｓｔｉｎｃｉｃｈ（１９９１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１（３）：２８９−３０１）は、それぞれ、清澄化された小規模な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートからプラスミドＤＮＡを沈殿させるために、およびヒト全血の小規模調製物からゲノムＤＮＡを沈殿させるために、ＣＴＡＢを使用している。Ｉｓｈａｑら（１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（１）：１９−２４）は、ＣＴＡＢで沈殿させた小規模なプラスミドＤＮＡをＰＺ５２３遠心カラムにアプライして、少なくともサブクローニングおよびジデオキシ配列決定のための鋳型には適した精製された産物を得ることを開示している。この技術は、臨床等級ロットのＤＮＡプラスミドを得るために、界面活性剤に基づく沈殿工程を利用することを何ら開示も示唆もしていない。
【０００３】
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ＆ Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ（１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７６（２）：６１５−６１９）は、ＤＮＡの制限酵素消化物をアガロースゲルから分離するための技術を開示しており、この場合、濃ヨウ化ナトリウムの存在下でＤＮＡをガラス（シリカ）に結合させ、エタノールで洗浄し、低い塩濃度で溶出する。Ｂｏｏｍら（１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（３）：４９５−５０３）およびＣａｒｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｔｏｎ（１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（４）：１０４４）は、ＤＮＡ配列決定に適したプラスミドＤＮＡの単離方法を開示している。カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤であるグアニジニウムチオシアナートの存在下でプラスミドＤＮＡを、珪藻土の形態のシリカに結合させる。該固定化プラスミドＤＮＡをエタノールで洗浄し、低い塩濃度で溶出する。この技術の微妙な変法が、（１）ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／１０３３１；（２）ＰＣＴ公開ＷＯ ９８／０４７３０および（３）１９９９年１２月２４日付けでＬｉｔｔｌｅに発行された米国特許第５，０７５，４３０号（これは、カオトロピック剤の存在下での珪藻土上へのＤＮＡの吸着ならびにそれに続くＤＮＡの分離および溶出に基づくプラスミドＤＮＡの単離方法を開示している）；ならびに（４）１９９８年９月１５日付でＰａｄｈｙｅらに発行された米国特許第５，８０８，０４１号（これは、カオトロピック剤の存在下でシリカゲルとガラス粒子とを含む組成物を使用する核酸の単離方法を開示している）に開示されている。そのような場合もまた、これらの技術は、ヒトおよび他の潜在的宿主に投与する臨床等級の製剤のためのグラム量のプラスミドＤＮＡを得るための大規模なＤＮＡプラスミド製造方法に巧くは適用されていない。
【０００４】
１９９０年５月８日付けでＭｃＣｏｒｍｉｃｋに発行された米国特許第４，９２３，９７８号は、タンパク質性物質を優先的に結合させることによるＤＮＡの精製のための、シリカの使用を開示している。
【０００５】
１９９６年１１月１９日付けでＨｏｒｎらに発行された米国特許第５，５７６，１９６号は、ＲＮＡを優先的に結合させることによるＤＮＡの精製のための、シリカの使用を開示している。
【０００６】
それぞれ１９９６年６月４日付け及び１９９６年６月１１日付けでＷｏｏｄａｒｄらに発行された米国特許第５，５２３，３９２号および第５，５２５，３１９号は、ＤＮＡ精製のための結合表面として用いられうるボロンシリカート、ホスホシリカートおよびアルミニウムシリカートを開示している。
【０００７】
ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／２００３４（国際公開第ＷＯ ９８／０１４６４号）は、血液のような生物学的流体から有機化合物を選択的に分離するための、水和珪酸カルシウムの使用を開示している。
【０００８】
ここでもまた、前記で挙げた参照文献はいずれも、宿主細胞タンパク質、宿主細胞内毒素、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡおよびプラスミド分解物（例えば、直鎖状および開環形態）を実質的に含有しない大規模化可能な臨床等級のＤＮＡプラスミドロットを製造するための当業者に対する適当な指針を示していない。この目的には、法外に高価なクロマトグラフィー工程の必要性を排除する一方で、少なくともヒトワクチン接種およびヒト遺伝子治療用途に使用するための臨床等級のグラム量のＤＮＡプラスミド調製物を提供する大規模化可能なプラスミド精製方法を同定することが非常に有用であろう。本発明は、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、タンパク質、宿主内毒素およびタンパク質分解物（例えば、直鎖状および開環形態）のような残留混入物を除去するために結晶性水和珪酸カルシウム（本発明では「ｈｃＣａＳｉＯ３」と称される）またはいずれかの同様の作用性化合物を使用する下流の大規模バッチ吸着工程と共に、上流工程においてプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させるために好ましくはＣＴＡＢのような陽イオン界面活性剤を利用する大規模化可能なプラスミド精製方法を開示することにより、これらの要求について検討し、それらを満足させるものである。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、大規模な臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造および精製のための大規模化可能な経済的な製造方法を代表する方法である、臨床等級のプラスミドＤＮＡを微生物細胞から単離する方法に関する。本発明は更に、該ＤＮＡプラスミド精製方法の大規模化可能な経済的な特質に寄与する幾つかの細胞溶解後の中心的（ｃｏｒｅ）方法に関する。より詳しくは、細胞溶解後の工程は、以下のものを含む（それらに限定されるものではない）：（１）２つの部分を含む沈殿／溶解工程における、単一または段階的様態での界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）によるプラスミドＤＮＡの沈殿、ならびにこれと組合せた、該ＣＴＡＢ沈殿プラスミドＤＮＡの濃縮および塩溶液での選択的溶解；（２）同様に単一または段階的様態での水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）上への吸着による内毒素および他の残存不純物の除去；および（３）アルコール沈殿（エタノール、メタノールおよびイソプロパノールを含むが、これらに限定されるものではない）または別の濃縮方法（限外濾過を含むが、これに限定されるものではない）による、該精製プラスミドＤＮＡの濃縮。これらの工程を組合せて用いたり、当技術分野で公知の追加的な精製工程と更に組合せて用いたり、および／または、前記工程の少なくとも１つを省略することが可能であり、好ましくは、ＤＮＡプラスミドの精製技術に関連した当技術分野で公知の他の方法と組合せる。
【００１０】
本発明の方法は、微生物細胞（細菌細胞、植物細胞、酵母、バキュロウイルスを含むが、これらに限定されるものではなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が好ましい微生物宿主である）からの臨床等級のＤＮＡプラスミドの精製を可能にする。本明細書に記載の方法により精製された臨床等級のプラスミドＤＮＡは、ワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしてのヒトへの投与に非常に有用である。
【００１１】
本発明のプラスミドの精製方法の利点は、１つには、ＣＴＡＢでのＤＮＡの段階的沈殿およびそれと組合せた、ｈｃＣａＳｉＯ３上への吸着による残存不純物の除去が、これまでに認識されていない選択性を有する問題となる不純物（ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ分解物、例えば直鎖状ＤＮＡを含む）を除去するという知見によるものである。これらの沈殿／精製工程を含む完全な方法の設計が、本明細書に開示する本発明の核心である。また、開示されている方法は大規模化可能である。
【００１２】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、大規模なプラスミド製造のための選択的な沈殿および吸着の別のアプローチにより、重合体に基づく高価なクロマトグラフィー樹脂が必要とされないことである。
【００１３】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、それが、基本的に製造大規模化操作になじみやすいことである。該単位操作は、沈殿、濾過、吸着および乾燥よりなる。珪藻土の使用は、発酵産物にしばしば伴う汚れの問題を回避すると同時に、非圧縮性濾過ケークを与える。
【００１４】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、それが、該方法中の更なる工程におけるＲＮＡの除去のための高価な酵素である組換えＲＮアーゼの添加の必要性を回避していることである。
【００１５】
本発明の精製方法のもう１つの利点は、ＣＴＡＢのような長鎖界面活性剤での沈殿が、製造規模での溶媒含有廃棄流の処分において重要である下流加工容積の減少をもたらすことである。
【００１６】
本発明の精製方法の更にもう１つの利点は、アルコール（例えば、エタノール）沈殿が、膜に基づく濃縮中に生じる予期されるせん断損傷を伴わずに高濃度で再懸濁されうる安定なバルク産物を得るための理想的な方法であることである。
【００１７】
本発明の１つの目的は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核性宿主からの臨床等級のプラスミドＤＮＡの大規模な精製のための費用効果的な方法を提供することである。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、プラスミドＤＮＡの大規模（すなわち、大規模化可能な）精製のための大規模化可能な経済的な方法を与える細胞溶解後工程を提供することであり、該工程は、（ｉ）単一または段階的様態での界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）によるプラスミドＤＮＡの沈殿、ならびにこれと組合せた、該ＣＴＡＢ沈殿プラスミドＤＮＡの濃縮および塩溶液での選択的溶解、（ｉｉ）単一または段階的様態での水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）上への吸着による内毒素および他の残存不純物の除去、および／または（ｉｉｉ）アルコール（例えば、エタノール沈殿）または他の濃縮方法（限外濾過を含むが、これに限定されるものではない）による該精製プラスミドＤＮＡの濃縮の細胞溶解後工程を含むが、これに限定されるものではない。これらの工程は、組合せて用いたり、当技術分野で公知の追加的な精製工程と更に組合せて用いたり、および／または、前記工程の少なくとも１つを省略することが可能であり、好ましくは、ＤＮＡプラスミドの精製技術に関連した当技術分野で公知の他の方法と組合せる。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、原核性宿主からの臨床等級のプラスミドＤＮＡの大規模（すなわち、大規模化可能）な精製のための費用効果的な方法であって、（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）珪藻土に補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉｉ）セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的沈殿、ついでプラスミドＤＮＡ含有濾過ケークを回収するための濾過、（ｉｖ）塩溶液での該プラスミドＤＮＡ含有濾過ケークの選択的溶解、（ｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着およびそれに続く濾過、および（ｖｉ）アルコール（アルコールを含むがこれに限定されるものではない）を使用する精製プラスミドＤＮＡの沈殿の工程を含んでなる方法を提供する。
【００２０】
本発明において互換的に用いる「臨床等級のプラスミド」および「医薬等級のプラスミド」なる語は、遺伝子治療用途およびＤＮＡワクチン接種用途を含む（これらに限定されるものではない）公知の任意の予防的または治療的適応のためのヒトへの投与に関して許容される純度レベルの、原核細胞から単離されたプラスミドＤＮＡの調製物を意味する。
【００２１】
本発明で用いる「非スーパーコイルプラスミドＤＮＡ」は、スーパーコイルプラスミドＤＮＡではない任意のＤＮＡ、例えば、他の任意の形態のプラスミドＤＮＡ、例えばニック開環状および直鎖状ならびに宿主ゲノムＤＮＡを意味する。
【００２２】
本発明で用いる「ＣＴＡＢ」は、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはセチルトリメチルアンモニウムブロミドを意味する。
【００２３】
本発明で用いる「ｈｃＣａＳｉＯ３」は、水和結晶性珪酸カルシウムを意味する。
【００２４】
本発明で用いる「ＳＴＥＴバッファー」は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（〜ｐＨ７．０−９．０）、約５０〜１００ｍＭ ＥＤＴＡ、約８％ スクロースおよび約２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００を含むバッファーを意味する。
【００２５】
本発明で用いる「ＩＰＡ」は、イソプロパノールを意味する。
【００２６】
本発明で用いる「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールを意味する。
【００２７】
本発明で用いる「ｇＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡを意味する。
【００２８】
本発明で用いる「ｇＲＮＡ」は、ゲノムＲＮＡを意味する。
【００２９】
本発明で用いる「ＬＲＡ（商標）」は、脂質除去剤（ｌｉｐｉｄ ｒｅｍｏｖａｌ ａｇｅｎｔ（商標））を意味する。
【００３０】
本発明で用いる「ＥＤＴＡ」なる語は、エチレンジアミン四酢酸を意味する。
【００３１】
本発明で用いる「ＳＣ」は、「スーパーコイル」を意味する。
【００３２】
本発明で用いる「ＯＣ」は、「開環状」を意味する。
【００３３】
本発明で用いる「ＮＴＵ」は、「正規化濁度単位」を意味する。
【００３４】
本発明で用いる「Ｌ」は、「リットル」を意味する。
【００３５】
本発明で用いる「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味する。
【００３６】
（図面の簡単な記載）
図１は、清澄化により細胞残渣を除去する中心的な４つの工程プロセスを含むプロセスの流れ図を示す。ＣＴＡＢでの段階的沈殿および珪酸カルシウム吸着は、宿主ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質および内毒素ならびにプラスミド分解物、開環状および直鎖状ＤＮＡを除去する。エタノール沈殿により、安定なバルク粉末が得られる。
【００３７】
図２は、ＣＴＡＢでの段階的沈殿中の濃度プロフィールを示す。プラスミドＤＮＡが、小刻みな界面活性剤の増加量に対して沈殿している。該工程は、可溶性のままのタンパク質、ＲＮＡおよび内毒素の除去に関して選択的である。
【００３８】
図３は、アガロースゲル電気泳動による０．２Ｍ ＮａＣｌによるプラスミドＤＮＡの選択的溶解を示す。宿主、ゲノムＤＮＡは、部分的に可溶性であるに過ぎず、０．２Ｍ ＮａＣｌでの溶解後の濾過により除去される。１．２Ｍ ＮａＣｌで、ｇＤＮＡは可溶性である。
【００３９】
図４Ａ〜Ｄは、ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。（Ａ）．塩化ナトリウム濃度に対するプラスミドＤＮＡの平衡吸着。（Ｂ）．ｑＰＣＲにより測定されたゲノムまたは宿主ＤＮＡの吸着。ＬＲＡ（商標）は、１．２Ｍ ＮａＣｌでの５時間の混合接触の後にＤＮＡを選択的に除去する。プラスミド収率は約６０％である。（Ｃ）．１．２Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。ｈｃＣａＳｉＯ３濃度に応じた、ｈｃＣａＳｉＯ３と接触した液相サンプルのアガロースゲル電気泳動（レーン１：３２ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン２：３５ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン３：４０ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン４：４２ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ；レーン５：４５ｇ ｈｃＣａＳｉＯ３／ｇ ＤＮＡ）。直鎖状、弛緩型開環状および多量体（Ｍ）が除去される。（Ｄ）０．５Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。時間に応じた、全ＤＮＡ １ｇ当たり３２ｇのｈｃＣａＳｉＯ３と接触した液相サンプルのアガロースゲル電気泳動（レーン１：３．３時間、レーン２：６．２時間、レーン３：１０．８時間、レーン４：２１．５時間）。直鎖状、弛緩型開環状および多量体（Ｍ）が除去される。
【００４０】
図５は、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用する０．２５％〜０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢによる不純物の沈殿を示す。粒子計数の急激な変化に基づき、ＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートへの４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの添加を１００分の時点で停止する。沈殿不純物は濾過により除去する。該スーパーコイルプラスミドを沈殿させるために、追加的なＣＴＡＢを加える。
【００４１】
図６は、実施例１に開示する加工工程からのサンプルのＤＮＡ組成物を示す。スーパーコイルプラスミドは最下バンドに可視化されている。それより上方のバンドは、開環状および直鎖状プラスミド、プラスミド多量体ならびにゲノムＤＮＡを含む種々のＤＮＡ不純物を表す。示されているのは、珪藻土で清澄化されたライセート（左からレーン１）；０．２３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける低カット（ｃｕｔ）濾液（レーン２）；ＤＮＡを含有しない０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける高カット濾液（レーン３）；０．４Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン４）；０．４７５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン５）；０．５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン６）；ｈｃＣａＳｉＯ３吸着工程後の０．８ミクロン濾液（レーン７）；エタノール沈殿および無菌水中の再溶解に付されたｈｃＣａＳｉＯ３産物（レーン８）である。
【００４２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造のための経済的な代替的製造方法を代表する大規模化可能な方法に関する。より詳しくは、本発明の核心は、以下を含む幾つかの下流（すなわち、細胞溶解後）工程に関する：（１）２つの部分を含む沈殿／溶解工程における、単一または段階的様態での界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）によるプラスミドＤＮＡの沈殿、ならびにこれと組合せた、該ＣＴＡＢ沈殿プラスミドＤＮＡの濃縮および塩溶液での選択的溶解；（２）同様に単一または段階的様態での水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）上への吸着による内毒素および他の残存不純物の除去；および（３）アルコール（エタノール、メタノールおよびイソプロパノールを含むが、これらに限定されるものではない）に基づく沈殿または別の濃縮方法（限外濾過を含むが、これに限定されるものではない）による、該精製プラスミドＤＮＡの濃縮。本明細書に例示するとおり、工程（１）および（２）は、該精製方法の対象であるスーパーコイルプラスミドＤＮＡから種々の細胞ライセート不純物を物理的に分離するための後続の濾過工程と結びついている。
【００４３】
臨床等級のプラスミドＤＮＡの回収をもたらす全体的な大規模化可能な精製方法を体系化するために、これらの３つの中心的工程に追加または省略を行うことは、本発明の範囲内である。したがって、前記の界面活性剤に基づくプラスミドＤＮＡ沈殿工程または該ｈｃＣａＳｉＯ３吸着工程は省略されうると意図される。この簡素化方法は、全体的な精製スキームを補完する追加的な「非中心的」工程を含みうる。例えば、本発明の好ましい方法においては、界面活性剤に基づく初期沈殿工程は、エタノール沈殿により該プラスミドＤＮＡを濃縮する最終工程と合体しうる。ついで、これらの２つの中心的工程を、臨床等級ロットのプラスミドＤＮＡを得るために当技術分野で公知の他の精製工程（例えば、カラムクロマトグラフィー）と組合せることが可能である。しかし、（１）界面活性剤沈殿および選択的塩溶解、（２）ｈｃＣａＳｉＯ３への吸着、および（３）プラスミドＤＮＡ濃縮の中心的工程は、追加的な補完工程を含む全体的な大規模化可能な方法を与える該精製方法を拡張する基礎となる可能性が高いであろう。これらの補完工程は、特定のロットに必要なプラスミドＤＮＡの全量に応じて、当業者の判断で加えることが可能である。この目的において、全体的な大規模化可能な方法の基礎としてこれらの３つの中心的工程を用いる種々の具体例が、本発明を例示するために本明細書に記載されているが、これらは本発明を何ら限定するものではない。当業者は、適当な等級のＤＮＡプラスミド純度をもたらすスキーム（体系）を与える公知プラスミド精製工程を考慮することが可能である。例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７４９（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）は、有効な精製プロトコールを得るためにこの段落に記載の中心的精製工程と組合せて使用されうる代替的なクロマトグラフィーに基づく下流工程に関する指針を示している。どちらの開示も、清澄化、ＤＮＡおよびタンパク質の除去のためのベンゾナーゼでの限外濾過、更なるタンパク質に関するイオン交換、および内毒素、Ｌｉｎ／ＯＣ不純物逆相クロマトグラフィー、および濃縮のための最終的限外濾過を含む下流事象（熱交換工程後）を示している。したがって、ＣＴＡＢを単独で使用する場合には、それは限外濾過およびイオン交換の代わりに使用されうるが、それは、ＣＴＡＢにより除去されていない不純物を除去するために最終的な逆相クロマトグラフィー工程と共に使用されるであろう。一方、ｈｃＣａＳｉＯ３だけを使用する場合には、そのようなプロトコールを、ＷＯ９６／０２６５８およびＷＯ９６／３６７０６に記載の清澄化、限外濾過およびイオン交換クロマトグラフィーの後に行うことが可能であろう。
【００４４】
本発明の１つの実施形態は、界面活性剤により誘発される沈殿（すなわち、界面活性剤誘発性沈殿）によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させることを含む、微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明のこの態様は、界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）の使用に関して例示されているが、これに限定されるものではない。関心のある界面活性剤は、単一または段階的様態で加えることが可能である。該界面活性剤の段階的添加の具体例としては、ＣＴＡＢの段階的添加（この場合、ＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートに１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ溶液を供給する）が挙げられ、この場合、残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させるために約０．２５％〜約０．２８％の第１ＣＴＡＢ誘発性沈殿を行い、ついで該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させるために約０．３０％〜約０．３３％の第２ＣＴＡＢ誘発性沈殿を行う。これらの範囲は、標準ＳＴＥＴ細胞溶解バッファー（約５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（〜ｐＨ７．０−９．０），約５０〜１０００ｍＭ ＥＤＴＡ，約８％ スクロースおよび約２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）の使用に最も良く適合する。段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）に基づく界面活性剤または二価カチオンＥＤＴＡを該細胞溶解バッファー中に含有させることを含む（これに限定されるものではない））、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで該ＤＮＡを追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内であろう。標準ＳＴＥＴバッファーの使用に関して前記したとおり、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助けるために種々のバッファーに有用な濃度のＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）に基づく界面活性剤のような化合物を加えることも有用であろう。この目的には、有効量のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）およびＥＤＴＡを含有させることによる細胞溶解バッファーとして、ＳＴＥＴバッファーが有用である。したがって、これらの化合物は、ＥＤＴＡ（これは、ＥＤＴＡが存在しなければＤＮアーゼを活性化する二価金属イオンと会合することによりＤＮアーゼ活性を阻害する）と共に該細胞溶解工程中に存在する。また、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞膜を溶解する。両成分はＣＴＡＢ工程に運ばれる。ＥＤＴＡは、有利な役割を果たし続ける。なぜなら、該二価金属イオンは、プラスミドとＣＴＡＢとの複合体形成を妨げるからである。より重要なのは、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させるための単一または段階的カット（ｃｕｔ）のための有効ＣＴＡＢ濃度の選択におけるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）の影響である。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）はＣＴＡＢと相互作用し、そのため、スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿しうる前に、ある閾値レベル（例えば、ＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートに加える１％ ＣＴＡＢ供給溶液に対して０．２３％、０．２５％、０．３０％など）までＣＴＡＢを添加することが必要となる。したがって、該ＣＴＡＢ濃度範囲は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）およびＤＮＡ濃度の両方に左右される。この目的には、例えば、０．２５％〜．２８％および０．２８％〜０．３３％ ＣＴＡＢ（この場合も、１％ ｗ／ｖのＣＴＡＢの供給に対するものである）の段階的範囲が、以下に基づいて定められる。低カット量は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）濃度の関数である。なぜなら、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ミセル（各ミセルは１４０個のＴｒｉｔｏｎ分子を含有すると考えられる）１個当たり２２分子のＣＴＡＢに結合するからである。一方、高カット量は、ＤＮＡ濃度の関数である。なぜなら、各プラスミド分子は、ＤＮＡヌクレオチド反復単位１個当たり０．９当量のＣＴＡＢに結合するからである。実施例１に概説するこの特定の場合には、低カット沈殿に関する０．２５〜０．２８％ ＣＴＡＢの列挙範囲は、１％ Ｔｒｉｔｏｎを含有するライセートＳＴＥＴバッファーへの１％ ＣＴＡＢ溶液の添加に対応する。０．２８〜０．３３％の高カット範囲は、純度約８４％の０．３４ｍｇ／ｍｌ プラスミドＤＮＡを含有していた元の清澄化ライセート溶液に由来する濾過された低カット溶液への１％ ＣＴＡＢ溶液の添加に対応する。当業者は、ＣＴＡＢの量（スーパーコイルプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿の場合）を、実施例１（ＤＮＡ沈殿の視覚的検査）または実施例２（粒径分析器を使用するＤＮＡ沈殿の検査）に記載のとおりに、特定のバッファーに最良に適合させることが可能である。標準ＳＴＥＴバッファーを使用する場合の後者の実施例では、当業者は、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）濁度リアルタイムプローブにより沈殿を観察するであろう。そして、バッチごとに一定であるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）濃度（細胞溶解時に確立されたもの）にこのＣＴＡＢ濃度を相関させることにより約０．２５％で終了することが判明するであろう。ついで、ＤＮＡが沈殿するにつれて、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）での同じ方法が完了し、そして、沈殿に要する０．０３％の増加量（０．２５から０．２８の差）に対応する約１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡが存在することが判明するであろう。ＮａＯＨ／ＫＯＡｃ細胞溶解アプローチの場合と同様にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）が存在しない（または、標準ＳＴＥＴバッファーとは異なるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）濃度が存在する）場合、あるいは該発酵が、非常に異なる濃度のプラスミドを与える場合、当業者はこれらの数値を認識するであろう。したがって、前者は低カット量、そして後者は高カット量のＣＴＡＢに影響を及ぼす。Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器のような粒径分析器により、低および高カット範囲を決定するのが好ましい。この方法は、低および高カット範囲をより厳密に定めるために精度を増加させる。なぜなら、プラスミドのＣＴＡＢ沈殿が、小刻みなＣＴＡＢ範囲にわたり生じるからである。したがって、これらの範囲を、重要な変数（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）およびプラスミドＤＮＡ濃度）を測定することにより近似することが可能であり、種々のＣＴＡＢ濃度の溶液中の粒子の視覚的な又は好ましくは機械により導かれる分析により特異的に同定することも可能である。本発明では、標準ＳＴＥＴバッファーおよび１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ溶液（４０ｍＭ ＮａＣｌ中）の使用が、約０．２５〜０．２８％ ｗ／ｖ（低）および０．３０〜０．３３％（高）の最適な低および高ＣＴＡＢカットを与えると例示される。そのような値は、１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ供給溶液を使用してＳＴＥＴバッファー中の清澄化ライセートにＣＴＡＢを供給する場合に当てはまると理解されるであろう。単なる例示として挙げると、該ＣＴＡＢ供給溶液の濃度を２倍にし（例えば、２％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢ供給）、半分の容積（同じＣＴＡＢ量の場合）を加えることが許容される。この場合、該低カットおよび高カット濃度は、それぞれ約０．２９〜０．３３％および０．３５〜０．４０％であろう。これらの数値は、重量／容積比率（％ ｗ／ｖ）に基づく数値を、清澄化ライセート１リットル当たりの添加ＣＴＡＢ質量に基づく単純な過程（ｐｒｏｃｅｓｓ）に変換することにより、容易に正規化される。例えば、実施例１（標準ＳＴＥＴバッファー）に例示されているのと同様にして、清澄化ライセート１リットル当たり３．３〜３．９ｇのＣＴＡＢを加えることにより、低カットＣＴＡＢ濃度に達するであろう。一方、（該初期低カット添加を超えて）ＣＴＡＢを清澄化ライセート１リットル当たり４．３〜５．０ｇの最終量まで加えることにより、高カットＣＴＡＢ濃度に達するであろう。単一または段階的なＣＴＡＢに基づく界面活性剤工程は、後続の塩溶解のための濾過ケーク沈殿物（スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有）を得るための濾過工程と結び付けられるであろう。また、好ましい下流工程は、エタノール沈殿または限外濾過によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡの濃縮を維持する。本明細書に示すとおり、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得るために、エタノール沈殿によりスーパーコイルＤＮＡを最終的に沈殿させ更には濃縮することが可能な点で、アルコール（例えば、エタノール）に基づく沈殿の利用が好ましい。スーパーコイルプラスミドＤＮＡをいずれかの残存不純物から最終的に精製する一方で、該プラスミドＤＮＡを濃縮し、より実施可能なバッファー容積内への再懸濁を可能にするために、この下流工程を、より初期の工程の種々の組合せのいずれかと共に用いうることが明らかであろう。この実施形態はまた、少なくとも、ＣＴＡＢの添加前の該細胞ライセートの清澄化を含む（必ずしもこれに限定されるものではない）工程の追加と組合せたこの段落に記載の方法を含む。この工程を例示するために珪藻土（ＤＥ）を用いているが、該細胞ライセートを清澄化するためには、ＤＥの代わりに他の成分（Ｓｏｌｋａ ＦｌｏｃおよびＥｓｏｓｏｒｂ（Ｇｒａｖｅｒ）のようなセルロースに基づく他の濾過助剤を含むがこれらに限定されるものではない）を用いることが可能である。該細胞ライセートを清澄化するために使用するＤＥまたは他の物質は、濾過および遠心分離を含む（決してこれらに限定されるものではない）当技術分野で公知のいずれかの液体固体分離技術により除去することができる。細胞清澄化工程を含むいずれかの方法は、本明細書に記載のエタノール沈殿または限外濾過を含む（これらに限定されるものではない）本明細書に開示する濃縮工程をも含みうる。
【００４５】
本発明のもう１つの実施形態は、微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、中心的工程が該細胞ライセートへの水和結晶性珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）の添加である方法に関する。該細胞ライセートへのｈｃＣａＳｉＯ３の単一または段階的添加は、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡからの残留不純物の吸着を引き起こすことが、本発明で示される。前記のとおり、本発明のこの形態のもう１つの態様は、少なくとも、ＣＴＡＢの添加前の該細胞ライセートの清澄化を含む（必ずしもこれに限定されるものではない）工程の追加と組合される前段落における吸着工程に関する。この場合もまた、ＤＥが例示されているが、これはこの追加的工程を限定するものではない。この段落で言及している加工工程の組合せのいずれかはまた、本明細書に記載のエタノール沈殿または限外濾過を含む（これらに限定されるものではない）、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを濃縮する工程を含みうる。単一吸着工程を用いるのか段階的吸着工程を用いるのかどうかにかかわらず、ｈｃＣａＳｉＯ３吸着工程に加えて、１以上の工程（例えば、ライセートの清澄化および／またはエタノールまたは限外濾過での濃縮工程）の追加を行うことができる。中心的精製方法のこの段階においては、主要な不純物はＣＴＡＢ、内毒素、ゲノムＤＮＡおよびプラスミド分解物である。他の残留不純物（より低い濃度で存在するもの）は、タンパク質、ＲＮＡ、そして恐らくはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）を含む。水和珪酸カルシウムはこれらの不純物のすべてに結合するであろう。添加に要するｈｃＣａＳｉＯ３の厳密な量は、（１）存在する不純物の量、（２）バッファー条件（すなわち、塩濃度）および（３）恐らくは、該精製方法の全体にわたり用いる温度および塩のタイプを含む他の変数に左右される。存在する不純物の量は、（ｉ）ＣＴＡＢを加えた場合のその添加量、（ｉｉ）ゲノムＤＮＡ、プラスミド分解物および内毒素の量に影響を及ぼしうる発酵ブロスにおけるロット間の相違、および（ｉｉｉ）同様にゲノムＤＮＡ、プラスミド分解物および内毒素の量に影響を及ぼしうる用いる細胞溶解方法に左右されうるが、必ずしもそれらに限定されるものではない。これらの変数を考慮して、特定の実施中に加えるｈｃＣａＳｉＯ３の量は様々となりうることが明らかであろう。加えるｈｃＣａＳｉＯ３の量は、前記の条件に応じて、およびその特定の実施中に入手可能となるｈｃＣａＳｉＯ３のロットによる潜在的な相違に応じて、約２００グラム／リットルまでの範囲になると予想される。実施例１は、約２５グラム／リットル〜約７５グラム／リットルの範囲の指針を与える。しかし、この場合もまた、ｈｃＣａＳｉＯ３吸着のための条件は、前記の条件に関して大規模化または小規模化することが可能であり、したがって、２００グラム／リットルまでの該範囲の高い方の末端におけるｈｃＣａＳｉＯ３の添加が潜在的に必要となる。また、より高濃度のＮａＣｌはＤＮＡおよび他の不純物に関するＬＲＡ（商標）の容量を増加させることが本発明で示される。プラスミドＤＮＡのみに関するＬＲＡ（商標）の効果が図４Ａに示されているが、高い塩濃度も、結合性ゲノムＤＮＡおよび他の不純物に関するＬＲＡ（商標）の容量を増加させるらしい。したがって、いくつかの場合には、より少量の対応ｈｃＣａＳｉＯ３の使用を可能にするはずである、より高い塩濃度を考慮することが有用であろう。有用な塩濃度は、例えば、ＮａＣｌでは約５Ｍ ＮａＣｌまでの範囲でありうると予想される。
【００４６】
本発明のもう１つの実施形態は、微生物発酵の細胞ライセートからのスーパーコイルプラスミドＤＮＡの精製に関する。これは、３つの異なる加工工程、すなわち、（ｉ）界面活性剤誘発性沈殿により該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、得られた濾過ケークを塩溶液に再溶解し、（ｉｉ）該スーパーコイルプラスミドＤＮＡから残留不純物を吸着除去するために該再溶解スーパーコイルプラスミドに水和結晶性珪酸カルシウムを加えて、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する溶液を得、（ｉｉｉ）該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを濃縮する工程の組み込みを含む。この場合も、例示している界面活性剤はＣＴＡＢであり、これは単一または段階的様態で加えることが可能であり、ここでは一例として、約０．２５〜約０．２８％の［ＣＴＡＢ］での第１カットおよび約０．３０％〜約０．３３％の［ＣＴＡＢ］での第２カットを伴うＳＴＥＴに基づくライセートバッファー中の該界面活性剤（ＣＴＡＢ、１％ ｗ／ｖで供給）の段階的添加により例示される。本明細書中の全体に記載するとおり（ならびに実施例１（視覚的証明）および実施例２に例示されているとおり）、本明細書を参照すれば、段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで該ＤＮＡを追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内である。この場合も、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助けるために、有用な濃度のバッファー成分、例えばＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎに基づく界面活性剤を種々のバッファーに加えることが有用であろう。回収された濾過ケーク（スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む）の塩溶解は、最適なイオン強度および組成のバッファー溶液中で行う。塩は、プラスミドを溶解するがゲノムＤＮＡおよび他の不純物を溶解しない最適な濃度にまで加える。この濃度は、種々の塩増加量において溶液中のスーパーコイルプラスミドの濃度を測定することにより測定され、あるいは、該溶液粘度を測定することにより間接的に測定される。前記中心的工程に対する追加的工程（１つまたはいずれかの組合せ）は、本明細書に記載のとおり、ライセート清澄化および／または濃縮工程（エタノールまたは限外濾過によるもの）を含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
もう１つの実施形態は、改善された精製方法を得るために、該中心的方法への追加的工程（すなわち、該細胞ライセートの初期清澄化）の組み込みを含む。本発明のこの特定の実施形態は、（ｉ）好ましくは珪藻土に補助される濾過または遠心分離によるライセートの清澄化、（ｉｉ）ＣＴＡＢのような界面活性剤でのプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿、得られた濾過ケークの塩溶解、（ｉｉｉ）ｈｃＣａＳｉＯ３上への単一または段階的吸着による残存不純物の除去、および（ｉｖ）安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える、精製されたプラスミドＤＮＡの、後続のアルコール（例えば、エタノール）沈殿を含む下流加工工程を含む。
【００４８】
該中心的プロセスに加える追加的工程に基づく本発明のもう１つの実施形態は、細胞溶解の上流工程を含み、これは、当業者に現在利用可能な多数の方法により行うことができる。したがって、プロセス工程の組合せは、例えば、以下のプロセスを含むように、上流細胞溶解工程を含みうる：（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）本明細書に記載のライセートの清澄化、（ｉｉｉ）ＣＴＡＢのような界面活性剤でのプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｖ）ｈｃＣａＳｉＯ３上への単一または段階的吸着による残存不純物の除去、および（ｖｉ）安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える、精製されたプラスミドＤＮＡの、後続のアルコール（例えば、エタノール）沈殿。細胞溶解の任意の公知方法が、この上流工程に意図される。好ましい細胞溶解法が本明細書に記載されている。
【００４９】
本発明の追加的な実施形態は、ライセートの清澄化の追加的工程が、以下の段階的方法を与えるように該中心的加工工程、細胞溶解および塩溶解工程と組合された方法に関する。該段階的方法は、（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）好ましくは珪藻土に補助される濾過または遠心分離によるライセートの清澄化、（ｉｉｉ）ＣＴＡＢのような界面活性剤でのプラスミドＤＮＡの単一または段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液での該プラスミドＤＮＡの選択的溶解、（ｖ）ｈｃＣａＳｉＯ３上への残留不純物の吸着、および（ｖｉ）アルコール（例えば、エタノール）を使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿の工程を含むが、これらに限定されるものではない。プラスミド沈殿、アルコール沈殿および清澄化物質のためのＣＴＡＢの使用の代替法が、本明細書に記載されている。
【００５０】
本発明の方法は、細菌細胞、植物細胞、酵母、バキュロウイルスを含む（これらに限定されるものではなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、好ましい微生物宿主である）微生物細胞からの臨床等級のＤＮＡプラスミドの精製を可能にする。本明細書に記載の方法により精製された臨床等級のプラスミドＤＮＡは、ワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしてのヒトへの投与に非常に有用である。
【００５１】
本発明は、臨床等級のプラスミドＤＮＡの製造のための経済的な代替的製造方法を代表する大規模方法に関する。本発明の核心は、（ｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、およびそれに続く、最終産物の濃縮を含むいくつかの下流加工工程の周辺に集中する。本発明の核心は、ヒトへの投与に適したＤＮＡプラスミド調製物を得るための、大規模化可能な設計プロセス（ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）における前記工程を含む。
【００５２】
本発明は、臨床等級のプラスミドＤＮＡを微生物細胞から単離する方法に関する。本発明のプラスミド精製方法は、１つには、（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）珪藻土に補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉｉ）有用な量の珪藻土の存在下でのＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液での該ＣＴＡＢペレットの選択的溶解、（ｖ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、および（ｖｉ）安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える、該精製プラスミドＤＮＡの、後続のアルコール沈殿を含む（これらに限定されるものではない）操作に基づく。
【００５３】
本発明の好ましい態様においては、大規模なプラスミドの製造は、（ｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、および（ｉｖ）好ましくは、安定なバルク産物（これより、濃縮製剤溶液が容易に製造されうる）を与える該精製プラスミドＤＮＡの後続のアルコール（例えば、エタノール）沈殿を含む幾つかの下流加工工程を含む。本明細書に開示するとおり、工程（ｉｖ）を含む該設計プロセスの態様は互換性があることが、当業者に公知であろう。
【００５４】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、細胞溶解の後に、該細胞ライセートを有効に清澄化する量の珪藻土で濾過を行う。この初期工程の後、少なくとも、前記の追加的な下流工程、すなわち、（ｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの段階的沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）結晶化珪酸カルシウム上への吸着による残存不純物の除去、および（ｉｖ）好ましくは、該精製プラスミドＤＮＡのエタノール沈殿を行う
【００５５】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ライセートの清澄化の前の完全な細胞溶解は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７９４（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）に開示されている熱交換装置による、リゾチーム処理を伴う又は伴わない（好ましくは、リゾチーム処理を伴う）、該発酵ブロスから集めた細胞または直接的に該発酵ブロスの移動を含む。この細胞溶解工程の後、以下を含む（それらに限定されるものではない）細胞溶解後工程を加える：（ｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくは、ＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な二段階沈殿、（ｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｉｉ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｉｖ）臨床等級のプラスミド調製物の最終的な製剤化の前の、アルコール（エタノール、メタノールまたはイソプロパノールを含むが、これらに限定されるものではない）を使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿。この目的において、本発明のこの態様は、微生物発酵からスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法に関する。該方法は、（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量の細胞溶解溶液を該回収微生物細胞に加え、（ｃ）フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）熱交換器中で工程ｂ）の微生物細胞を約６０℃〜約７０℃から約１００℃までの温度に加熱して、細胞ライセートを形成させ、（ｄ）該細胞ライセートを冷却し、（ｅ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｆ）第１セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿により残留細胞残渣および不純物を沈殿させ、（ｇ）第２セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させ、（ｈ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｉ）工程（ｈ）のバッファー内の珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｊ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｋ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｌ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｍ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｎ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む。また、工程（ｊ）〜（ｎ）を省略する一方で、工程（ｉ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。本明細書に記載のとおり、該第１および第２ＣＴＡＢ誘発性沈殿工程（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）は、効果的には、第１カットについては約０．２５％〜約０．２８％および第２カットについては約３０％〜約０．３３％の範囲となりうる。この場合にも、本明細書を参照すれば、段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内である。本明細書に記載のＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎに基づく界面活性剤のような成分を加えることが可能であり、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助ける種々のバッファー内の生物学的に有効な濃度で有用でありうる。
【００５６】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ライセートの清澄化の前の完全な細胞溶解は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７９４（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）に開示されている熱交換装置による、リゾチーム処理を伴う又は伴わない（好ましくは、リゾチームの存在下）、該発酵ブロスから集めた細胞または直接的に該発酵ブロスの移動を含む。この細胞溶解法は、以下を含む（これらに限定されるものではない）プロトコールを開始させる：（ｉ）珪藻土により補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくはＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な一工程沈殿、（ｉｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｖ）臨床等級のプラスミド製剤の最終的な製剤化の前の、アルコールを使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿。この目的において、本発明のこの態様は、大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量の細胞溶解溶液を該回収微生物細胞に加え、（ｃ）フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）熱交換器中で工程ｂ）の微生物細胞を６０℃〜７０℃から約１００℃までの温度に加熱して、細胞ライセートを形成させ、（ｄ）該細胞ライセートを冷却し、（ｅ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｆ）セチルトリメチルアンモニウムで、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、（ｇ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｈ）工程（ｇ）のバッファー内の珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｉ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｊ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｋ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｌ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｍ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む方法に関する。また、工程（ｊ）〜（ｍ）を省略する一方で、工程（ｈ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。工程（ｂ）の好ましい細胞溶解温度は約７０℃〜約８０℃であり、一方、単一ＣＴＡＢカットは、好ましくは、約０．３０〜約０．３３％（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）のＣＴＡＢ濃度におけるものであることが可能であり、この場合も、それは恐らく、バッファー条件により影響される。ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎのようなバッファー成分は、他の箇所に記載されているとおり、プラスミドＤＮＡの回収を増加させるためのバッファーの添加に利用可能である。
【００５７】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、細胞溶解を、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ（１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）に記載の技術の変法により行い、該変法においては、希水酸化ナトリウムを使用して細胞を細胞溶解し、ついでＫＯＡｃで中和する。ついでこの細胞溶解工程の後、以下を含む（それらに限定されるものではない）細胞溶解後工程を加える：（ｉ）珪藻土により補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくはＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な沈殿、（ｉｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｖ）臨床等級のプラスミド製剤の最終的な製剤化の前の、珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着。この目的において、本発明のこの形態の態様は、大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量のリゾチーム／アルカリ／ＫＯＡｃを該回収微生物細胞に加えて、細胞溶解を促進し、細胞ライセートを形成させ、（ｃ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｄ）第１セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿により残留細胞残渣および不純物を沈殿させ、（ｅ）第２セチルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させ、（ｆ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｇ）工程（ｆ）のバッファーを伴う珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｈ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｉ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｊ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｋ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｌ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む方法に関する。また、工程（ｊ）〜（ｎ）を省略する一方で、工程（ｉ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。本明細書に記載のとおり、該第１および第２ＣＴＡＢ誘発性沈殿工程（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）は、効果的には、第１カットについては約０．２５％〜約０．２８％および第２カットについては約３０％〜約０．３３％の範囲となりうる。この場合にも、本明細書を参照すれば、段階的沈殿範囲を改変して種々のバッファー系の任意の特性に合致させ、それにより、まず、実施可能な不純物量を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む残存バッファー溶液から沈殿させ、ついで該ＤＮＡを追加的ＣＴＡＢ誘発性沈殿で沈殿させることは、当業者の認識範囲内である。バッファー成分、例えばＥＤＴＡおよび／またはＴｒｉｔｏｎに基づく界面活性剤を加えることが可能であり、そのような成分は、プラスミドＤＮＡの沈殿の促進を助ける種々のバッファー内の生物学的に有効な濃度で有用でありうる。
【００５８】
もう１つの好ましい実施形態においては、細胞溶解を、修飾されたＢｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ法により行い、この場合、前記のとおり、希水酸化ナトリウムを使用して細胞を細胞溶解し、ついでＫＯＡｃで中和する。ついでこの細胞溶解工程の後、以下を含む（それらに限定されるものではない）細胞溶解後工程を加える：（ｉ）珪藻土により補助された濾過によるライセートの清澄化、（ｉｉ）陽イオン界面活性剤（好ましくはＣＴＡＢ）を使用するプラスミドＤＮＡの選択的な沈殿、（ｉｉｉ）塩溶液でのプラスミドの選択的溶解、（ｉｖ）珪酸カルシウム水和物上への残留不純物の吸着、および（ｖ）臨床等級のプラスミド製剤の最終的な製剤化の前の、エタノールを使用する、精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿。本発明のこの形態の態様は、大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、（ａ）大規模な発酵から微生物細胞を回収し、（ｂ）該回収細胞を標準ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、十分な量のリゾチーム／アルカリ／ＫＯＡｃを該回収微生物細胞に加えて細胞溶解を促進し、細胞ライセートを形成させ、（ｃ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、（ｄ）セチルトリメチルアンモニウムで、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、（ｅ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｆ）水和結晶性珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、（ｈ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、（ｉ）該沈殿物を濾取し洗浄し、（ｊ）エタノールを除去するために乾燥し、（ｋ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、（ｌ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含む方法に関する。また、工程（ｉ）〜（ｍ）を省略する一方で、工程（ｈ）のバッファーを洗浄し滅菌し、ついでエタノール沈殿によりＤＮＡ濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得ることも、本発明のこの形態の範囲内である。工程（ｂ）の好ましい細胞溶解温度は約７０℃〜約８０℃であり、一方、単一ＣＴＡＢカット（標準ＳＴＥＴバッファー中の１％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの供給による）は、好ましくは、約０．３０〜約０．３３％のＣＴＡＢ濃度におけるものであることが可能であり、この場合も、それは恐らく、バッファー条件により影響される。ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎのようなバッファー成分は、他の箇所に記載されているとおり、プラスミドＤＮＡの回収を増加させるためのバッファーの添加に利用可能である。
【００５９】
前記のとおり、該回収微生物細胞をＳＴＥＴバッファーに溶解し、リゾチームを加える。この塩基性バッファー組成の修飾が施されることが可能であり、本発明での使用に適していると当業者に容易に理解される。本方法の結果に実質的に影響を及ぼさず改変もしないこの塩基性バッファー組成に対する修飾は、本発明の方法の範囲内であると意図される。しかし、本発明の好ましい実施形態においては、本明細書の全体にわたり記載されているＣＴＡＢのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿は、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋のような二価陽イオンを有効に除去するキレート剤を含む生理的に許容されるバッファーの存在下で行う。マグネシウムは、ＤＮＡアーゼおよびプラスミドＤＮＡとのカルシウム複合体の必須補因子であり、ＣＴＡＢによる沈殿を妨げる。該キレート剤はＥＤＴＡであることが本明細書で例示されており好ましい。しかし、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋のような二価陽イオンを除去する任意のキレート剤を、本明細書に開示するプラスミドＤＮＡ精製方法の実施に使用するバッファーに加えることができる。１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭおよび１００ｍＭのＥＤＴＡ濃度がＣＴＡＢ誘発性プラスミドＤＮＡ沈殿の促進に有効であることが、本発明者により示されている。したがって、ＣＴＡＢ誘発性プラスミドＤＮＡ沈殿を促進する、ＥＤＴＡを含む選択されたキレート剤の生理的に許容される任意の濃度を、初期段階的プラスミドＤＮＡ沈殿工程の全体にわたり用いることが可能である。
【００６０】
珪藻土（ＤＥ）は、ほぼすべてが含水珪藻の殻断片から形成される低密着性（ｌｏｏｓｅｌｙ ｃｏｈｅｒｅｎｔ）粉末物質である。通常は細やかなテクスチャーであり灰色または白色である珪藻土は、大部分が、純粋な形態の二酸化ケイ素またはシリカから構成され、９４％ものシリカ含量を有する。珪藻土は、天然、焼成および融剤焼成の３つの形態で商業的に入手可能である。ＤＥの焼成形態は、高温での焼成により得られ、一方、融剤焼成ＤＥは、ソーダ灰または塩化ナトリウムのような融剤の存在下での焼成により製造される。珪藻土は多数の商業的入手源から入手可能であり、Ｃｅｌｐｕｒｅ６５、Ｃｅｌｐｕｒｅ １００、Ｃｅｌｐｕｒｅ３００、Ｃｅｌｐｕｒｅ １００およびＬＲＡ（商標）（すべて、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓから入手可能）ならびにＳｏｌｋａ ＦｌｏｃのようなＣｅｌｌｕｌｏｓｉｃ濾過助剤を含む（これらに限定されるものではない）すべての入手可能形態が本発明の方法の実施に使用されると意図される。前記および本明細書に記載のとおり、珪藻土に補助された濾過による該細胞ライセートの清澄化は、好ましい下流加工工程である。なぜなら、この工程は、より大規模化が可能であり、該プラスミドＤＮＡは、大規模な遠心分離のせん断効果を受ける傾向がより低いらしいからである。しかし、宿主細胞残渣およびゲノムＤＮＡを除去するために、遠心分離のような他の代替的手段を用いることも可能である。
【００６１】
本発明の特に好ましい実施形態においては、本明細書の全体にわたり記載されているＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿は段階的な様態で達成され、細胞残渣、ｇＤＮＡおよび幾つかのＤＮＡ分解物が低カットＣＴＡＢ濃度で選択的に沈殿し、ついでプラスミドＤＮＡの第２の高カットＣＴＡＢ誘発性沈殿が生じる。ＣＴＡＢはプラスミドＤＮＡの段階的選択的沈殿に好ましいが、他の化合物も有用である可能性があり、それらには、Ｃ１６：セチルトリメチルアンモニウム；Ｃ１６：セチルジメチルエチルアンモニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１６：セチルピリジニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１４：テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１２：ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド；Ｃ１２：ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド；Ｃ１６：ヘキサデシルアミン：クロリドまたはブロミド塩；Ｃ１６：ヘキサデシルピリジニウムブロミドまたはクロリド；およびＣ１２ドデシルアミンまたはクロリド塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。種々の細胞ライセート不純物からスーパーコイルプラスミドＤＮＡを有効に沈殿させる化合物を同定するために、本明細書に例示されている界面活性剤の潜在的代替物を試験することは、当業者の認識範囲内であろう。
【００６２】
本発明のもう１つの実施形態においては、不純物の下流バッチ吸着を、合成水和珪酸カルシウムＬＲＡ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｍｐｏｃ，ＣＡ ９３４３８）のような水和珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）の存在下で行う。該水和珪酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ３）吸着工程の代わりにカラム形態の吸着を用いることも可能である。例えば、ＬＲＡ（商標）を使用する場合には、まず、ＬＲＡ（商標）細粒を除去するために沈降（ｓｅｔｔｌｅ）デカントを行い、ついで該ＬＲＡ（商標）をカラム内に充填する。１０カラム容積のＮａＣｌ（該プラスミド供給溶液と同じＮａＣｌ濃度）を該カラムにアプライし、ついで該プラスミド溶液をアプライする。スーパーコイルプラスミドＤＮＡは、流出液内に溶出する最初の形態のＤＮＡである。より後の画分は、プラスミド分解物およびゲノムＤＮＡを含有するであろう。内毒素およびＣＴＡＢも、該カラムに強固に結合することにより除去される。核酸不純物を含有する画分はプールしない。水和珪酸カルシウム物質はＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／２００３４（ＷＯ９８／０１４６４）（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。ＷＯ ９８／０１４６４において指摘されているとおり、ｈｃＣａＳｉＯ３化合物を製造するための多数の方法が当技術分野で公知である（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，１９６４，Ｅｄ．，Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｅｍｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。さらにＷＯ ９８／０１４６４に記載されているとおり、ｈｃＣａＳｉＯ３の粒径は、ｘ線測定および／または電子顕微鏡検査のような公知方法による測定で約０．０１ミクロン〜約０．１０ミクロンでありうる。これらの小粒子のなかには、約１００ミクロンもの大きさの凝集体が存在しうる。後記のとおり、好ましい実施形態は、約１０重量％未満、より好ましくは約８重量％未満の約３２５メッシュシーブ上での保持率を有するｈｃＣａＳｉＯ３を示す。好ましい多数の実施形態においては、該ｈｃＣａＳｉＯ３は、約７５ｍ２／ｇ以上、好ましくは約７５ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇの表面積を有する粉末形態である。本発明で使用する好ましい水和珪酸カルシウム物質は、珪藻土、水和酸化カルシウム（水酸化カルシウム）および水の水熱反応により製造された微粉末である。該最終産物は、約４７重量％のケイ素（ＳｉＯ２）、約３２重量％の化学量論的量のカルシウム（ＣａＯ）、約２．５重量％のアルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、約１．２重量％のナトリウム（Ｎａ２Ｏ）およびカリウム（Ｋ２Ｏ）複合体、約０．７重量％の鉄（Ｆｅ２Ｏ３と報告されている）、約０．６重量％のマグネシウム（ＭｇＯ）およびその他（約１６．６％のＨ２Ｏ）を含む結晶形態である。この好ましい形態は、３２５メッシュシーブ上での約６重量％の保持率および約１２０ｍ２／ｇ（Ｂ．Ｅ．Ｔ．法を用いて測定した場合）の表面積を有する。ＣａＳｉＯ３の前記成分の該重量％範囲は、ＳｉＯ２（４５〜９５％）、ＣａＯ（５〜３５％）、Ｈ２Ｏ（１〜２０％）、そして幾つかの場合には、約１％〜約１０％の種々の不純物、例えば（必ずしも以下に限定されるものではない）Ａｌ２Ｏ３、アルカリ金属、例えば酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ）および酸化カリウム（Ｋ２Ｏ）、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）および酸化マグネシウム（ＭｇＯ）ならびに少量の可溶性アルミニウムを含みうるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。より大きなＤＮＡ断片に選択的に結合しうる、該吸着工程に使用する水和カルシウムに基づく物質の代替的形態（ＬＲＡ（商標）、Ｍａｔｒｅｘ（商標）（Ａｍｉｃｏｎ）およびヒドロキシアパタイト（（二塩基）リン酸カルシウム）で例示される）で代用することは、当業者の認識範囲内であろう。それとは無関係に、ＬＲＡ（商標）に類似した特性を有する合成水和珪酸カルシウム（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２００３４に開示されている）は、残留ＤＮＡ分解物、例えば開環弛緩型および直鎖状形態、宿主ＤＮＡおよびＲＮＡ、内毒素、タンパク質および界面活性剤添加物（例えばＣＴＡＢ）を除去するための好ましい吸着物質である。
【００６３】
したがって、本明細書に記載の方法は、種々の形態のプラスミド（スーパーコイルプラスミドＤＮＡ［ＤＮＡワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしての使用が意図される産物］）、開環弛緩型プラスミドＤＮＡ、直鎖状プラスミドＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡコンカテマー）間の分離の達成、ならびに宿主混入物、例えばＬＰＳ（内毒素）、ｇＲＮＡ、ｇＤＮＡおよび残留タンパク質の除去をもたらす。
【００６４】
本発明の方法により単離および精製されるプラスミドは、任意の染色体外ＤＮＡ分子でありうる。該プラスミドは、高コピー数／細胞または低コピー数／細胞でありうる。該プラスミドはまた、実質的に任意のサイズのものでありうる。該微生物細胞内の実質的に任意のプラスミドが本発明の方法により単離されうると当業者に容易に理解される。
【００６５】
本発明の方法は、一般には微生物発酵との併用に適している。細菌細胞、植物細胞、真菌細胞（酵母を含む）およびバキュロウイルスを含む（これらに限定されるものではない）多種多様な微生物細胞が本発明の方法での使用に適していると当業者に容易に理解される。好ましい微生物発酵は、単離および精製するプラスミドを含有する細胞の細菌発酵である。好ましい細菌発酵は、単離および精製するプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵以外の細菌発酵も本発明での使用に適していると当業者に容易に理解される。本発明の大規模微生物発酵を、使用する細菌の成長に適した任意の液体培地内で成長させることができる。開示している方法は、より小さな発酵容積に適用可能であるが、本発明の特に有用な態様は、大規模な微生物細胞発酵に大規模化されうることである。本発明で用いる「大規模」なる語は、約５リットルを超える全細胞発酵容積、または約５リットルを超える発酵容積から回収された細胞とみなされる。本発明の大規模発酵法は、典型的には約１００〜２００リットルの発酵である（これに限定されるものではない）臨床規模のロットに適用可能である。
【００６６】
これらの前記工程のそれぞれを含む本発明の１つの実施形態は、以下の工程よりなる：（ｉ）プラスミドＤＮＡを含有する細胞を濃縮しダイアフィルトレーションするための発酵ブロスの接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）流動濾過、（ｉｉ）細胞の再懸濁、（ｉｉｉ）組換えリゾチームの存在下での細胞スラリーの３７℃でのインキュベーション、（ｉｖ）急速加熱による細胞溶解およびそれに続くライセートの冷却、（ｖｉ）珪藻土での濾過を用いるライセートの清澄化、（ｖ）ＣＴＡＢの添加による残留細胞残渣および不純物（例えばゲノムＤＮＡ）の沈殿、（ｖｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿、（ｖｉｉ）プラスミドＤＮＡの選択的再溶解、（ｖｉｉｉ）珪酸カルシウム上への残留内毒素およびＣＴＡＢのバッチ吸着、（ｉｘ）珪酸カルシウム上への残留タンパク質、核酸および他の不純物のバッチ吸着、（ｘ）エタノールでのプラスミドＤＮＡの沈殿、（ｘｉ）該沈殿物を集め洗浄するための濾過、（ｘｉｉ）エタノールを除去するための真空乾燥、（ｘｉｉ）製剤化バッファー中への、精製されたプラスミドＤＮＡの再溶解、および（ｘｉｉｉ）０．２２μｍの滅菌濾過。
【００６７】
本発明のもう１つの実施形態においては、該発酵ブロスからの未回収細胞をリゾチームと共に３７℃で約１時間インキュベートし、該細胞スラリーを、７５〜８０℃の出口温度をもたらす熱交換器を介して送り出す。この後、該ライセートを２０〜２５℃に冷却するために第２熱交換器を介した送り出しを行う。該ライセート物質を、（ｉ）珪藻土での濾過を用いるライセートの清澄化、（ｉｉ）ＣＴＡＢの添加による残留細胞残渣および不純物（例えばゲノムＤＮＡ）の沈殿、（ｉｉｉ）ＣＴＡＢでのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿、（ｉｖ）プラスミドＤＮＡの選択的再溶解、（ｖ）珪酸カルシウム上への残留内毒素およびＣＴＡＢのバッチ吸着、（ｖｉ）珪酸カルシウム上への残留タンパク質、核酸および他の不純物のバッチ吸着、（ｖｉｉ）エタノールでのプラスミドＤＮＡの沈殿、（ｖｉｉｉ）該沈殿物を集め洗浄するための濾過、（ｉｘ）エタノールを除去するための真空乾燥、（ｘ）製剤化バッファー中への、精製されたプラスミドＤＮＡの再溶解、および（ｘｉ）０．２２μｍの滅菌濾過に付す。
【００６８】
該プラスミドを含有する微生物細胞を該発酵培地から回収して、細胞ペーストまたはスラリーを得る。遠心分離または精密濾過を含む（これに限定されるものではない）、液体培地から細胞を回収するための通常の任意の手段が適している。細胞ペーストは、該プラスミドＤＮＡを含有する微生物細胞を該発酵ブロスから回収することにより得られる。該回収は、（ｉ）５００ｋＤａの公称分子量のＡ／Ｇ Ｔｅｃｈ膜による接線流動濾過を用いて該細胞を３倍濃縮し、（ｉｉ）３倍等価容積の滅菌された１２０ｍＭ 食塩水で該濃縮細胞をダイアフィルトレーションすることよりなる。該回収細胞を、６００ｎｍで３０の光学濃度に対応する希釈度になるまで、滅菌ＳＴＥＴバッファー（８％ ｗ／ｖ スクロース，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，ｐＨ８．５）に再懸濁する。該懸濁液を３７℃に加熱し、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ（商標）リゾチームを５００ｋＵ／Ｌの濃度になるまで加えた。３７℃で４５分後、該細胞スラリーを、沸騰水中に沈められた熱伝達コイルを介して送り出して、該コイルから出る際にその温度が７０℃に達するようにした。ついで該ライセートを、氷水浴中に沈めた熱伝導コイルを介した流動により約２０℃に冷却した。熱交換装置を介する該細胞スラリーの移動を含む細胞溶解工程は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７４９（ＷＯ９６／０２６５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。簡単に説明すると、前記のとおり、該回収微生物細胞をＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、リゾチームを加える。この塩基性バッファー組成の修飾が施されることが可能であり、本発明での使用に適していると当業者に容易に理解される。本方法の結果に実質的に影響を及ぼさず改変もしないこの塩基性バッファー組成に対する修飾は、本発明の方法の範囲内であると意図される。しかし、この工程は、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋のような二価陽イオンを有効に除去するキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含む生理的に許容されるバッファーの存在下で行うことが特に好ましい。前記のとおり、ＣＴＡＢ誘発性プラスミドＤＮＡ沈殿を促進する任意のキレート剤濃度を用いることが可能であり、それは、約１ｍＭ〜１００ｍＭ ＥＤＴＡを超える広い濃度範囲にわたり例示される。これらのＥＤＴＡ濃度範囲は、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの最適なＣＴＡＢ誘発性沈殿をもたらす一方、ＤＮアーゼ活性を阻害もする。該バッファーｐＨ範囲は、使用している特定の微生物株に関して得られた最良の結果に従い調節することができる。好ましいｐＨ範囲は約８．０〜８．５である。ついで該懸濁液を約６０〜１００℃（約７０〜８０℃が好ましい）にフロースルー熱交換器中で加熱する。この後、第２熱交換器中で２０〜２５℃に冷却する。ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ（１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）のもう１つの細胞溶解方法も意図される。この方法では、細胞を、希水酸化ナトリウムを使用して細胞溶解し、ついでＫＯＡｃで中和する。ＣＴＡＢ誘発性ＤＮＡ沈殿の妨害を防ぐために、アルカリ工程にＳＤＳは加えない。細胞溶解収率は、ＳＤＳの不存在による影響を受けなかった。
【００６９】
ついで珪藻土（Ｃｅｌｐｕｒｅ（商標）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）を３０ｇ／Ｌの濃度で該冷却ライセートに加える。該残存スラリーを濾過し、該ケークを洗浄して生成液体を回収する。ついでＣｅｌｐｕｒｅ（商標）を約１０ｇ／Ｌで該清澄化ライセート内に混合する。４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの溶液を０．１〜０．３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの最終濃度にまで加えることにより、残留微粉砕細胞残渣および他の不純物（ゲノムＤＮＡならびに弛緩型環状および直鎖状ＤＮＡ分解物を含む）を該清澄化ライセートから沈殿させる。該残存スラリーを、その濁度が１０ ＮＴＵ未満になるまで初期再循環を得た後で濾過する。Ｃｅｌｐｕｒｅ（商標）を１０ｇ／Ｌのボディ供給（ｂｏｄｙ ｆｅｅｄ）濃度で該濾液に加える。これは或るマトリックスを与え、４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢを使用して該ＣＴＡＢ濃度を０．２５％〜０．４５％ ｗ／ｖに増加させると該マトリックス上でプラスミドＤＮＡが沈殿する。該スラリーを濾過し、該濾液を、その濁度が１０ＮＴＵ未満になるまで再循環させる。実施例１においては、得られたプラスミドＤＮＡ含浸濾過ケークを４０ｍＭ ＮａＣｌ中の０．３０％〜０．３３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢで洗浄した。該低および高カットＣＴＡＢ範囲はプラスミドＤＮＡ濃度、イオン強度および／または温度の変化に応じて操作されうると当業者は認識するであろう。ついで該濾過ケークを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）を含有する約０．２Ｍ〜約２．０Ｍ ＮａＣｌに溶解する。ＮａＣｌがＣＴＡＢと置き換わるにつれて、プラスミドＤＮＡが再溶解する。この場合も、当業者は、該濾過ケークを洗浄および／または再溶解するために種々の塩濃度を選択することが可能である。低い濁度を得るために初期再循環を得た後、該懸濁液をステンレス鋼膜上で濾過してＣｅｌｐｕｒｅ（商標）を除去する。該濾液を、ｈｃＣａＳｉＯ３（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｎｅｒａｌｓからのＬＲＡ（商標））を使用する２つのバッチ吸着工程に付す。該第１吸着工程は残留内毒素およびＣＴＡＢを除去し、該第２吸着工程は残留タンパク質、弛緩型環状および直鎖状ＤＮＡ分解物ならびに宿主ＤＮＡおよびＲＮＡを除去する。該第１吸着工程では、ＤＮＡ １グラム当たり４５グラムのＬＲＡ（商標）を加える。得られたスラリーを２０℃で１時間インキュベートし、濾過する。該濾過ケークを１．２Ｍ ＮａＣｌまたは前記の合理的な塩濃度で洗浄する。新鮮なＬＲＡ（商標）をＤＮＡ １グラム当たり５０グラムで該濾液および洗浄溶液に加え、得られたスラリーを２０℃で約５時間インキュベートする。ついで該スラリーを濾過してＬＲＡ（商標）を除去し、得られた濾過ケークを１．２Ｍ ＮａＣｌで洗浄する。前記のバッチ吸着工程は、該再構成ＣＴＡＢ沈殿物を含有する溶液中に該珪酸カルシウムがスラリー化されるように行うことが可能であり、あるいは、該バッチ吸着工程は、該溶解ＣＴＡＢ中間体の処理に使用するｈｃＣａＳｉＯ３カラムの使用に関して前記したとおりにｈｃＣａＳｉＯ３を含む充填カラムを使用して完了させることが可能であることが当業者に明らかであろう。１等価容積の無水エタノールを、該第２ ｈｃＣａＳｉＯ３工程からの濾液および洗浄液に加えて、該精製プラスミドＤＮＡを沈殿させる。得られた沈殿物を濾過により回収し、直ちに無水エタノールで洗浄する。該洗浄沈殿物を２０℃で真空乾燥してエタノールを除去し、ついで、再構成させるまで４℃で保存する。注射に適したバッファー中での再構成に際しては、該精製プラスミドＤＮＡ溶液を０．２２μｍ濾過滅菌に付す。あるいは、濾過不可能なペーストを沈殿物が形成する場合には、該バルク産物粉末をエタノール性沈殿物から単離することができる。該沈殿ペーストを遠心分離し、該ペーストを１００％ ＥｔＯＨに加え、それをローターステータのような高速ホモジナイザーで混合する。該ペーストの脱水および硬粒子中への湿式粉砕を同時に行う。これらの粒子は濾過および乾燥になじみやすい。
【００７０】
前記のとおり、バルク粉末を沈殿させる代わりに、該精製プラスミドＤＮＡ調製物を、医薬上許容される担体またはバッファー溶液中に移すことができる。医薬上許容される担体またはバッファー溶液は当技術分野で公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような種々のテキストに記載されているものを含む。ＤＮＡサンプルの濃縮に適した任意の方法が、本発明での使用に適している。そのような方法は、限外濾過、アルコール沈殿、凍結乾燥などを含むが、エタノール沈殿が好ましい。該精製プラスミド調製物は、該ＤＮＡ産物の有用性に影響を及ぼさない任意の滅菌方法、例えば、十分に小さな孔径（例えば、０．２２ミクロン以下）を有する膜に通過させることによる滅菌により滅菌することができる。
【００７１】
該最終産物は、ｈｃＣａＳｉＯ３上の緩く結合した状態から放出したカルシウムを含有する。典型的な調製物は、該沈殿産物中で約１．６％ ｗ／ｗを有しうる。臨床製剤の製造では、ＥＤＴＡを使用する通常の方法により該残留カルシウムを回収することができる。例えば、ＥＤＴＡの添加によるカルシウムの錯体形成は、限外濾過または沈殿と共に行うことが可能であり、該カルシウム−ＥＤＴＡ錯体は、該沈殿液または限外濾過浸透流で流出しうる。あるいは、ＥＤＴＡを含有する小さなキレートカラムは、ＥＤＴＡを該プロセスの流れに導入しなくても、より効率的に該カルシウムを除去するであろう。
【００７２】
本発明の方法は、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む（決してこれらに限定されるものではない）生物からの臨床等級のＤＮＡプラスミド精製を可能にする。本明細書に記載の方法により精製された臨床等級のプラスミドＤＮＡは、ワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルとしてのヒトへの投与に非常に有用である。
【００７３】
以下の実施例は本発明の方法を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【００７４】
実施例１
プラスミドＤＮＡの精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドＤＮＡの精製のための以下のプロトコールは、約７３０ｍｇの精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡの単離をもたらした。本明細書に開示する中心的なプラスミド精製方法の概要を図１に示す。
【００７５】
細胞溶解
６００ｍＬの細胞ペーストを、温かい水道水を使用して融解し、５．４ＬのＳＴＥＴバッファーに再懸濁させた。該１０倍希釈は、６００ｎｍで３０の光学濃度を有するスラリーを与えた。ついで４０ｍｃＬのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，３０ｋＵ／ｍｃＬ）を該細胞スラリーに加えた。該希釈細胞スラリーの温度を約４０℃に上昇させた。４５分間の混合後、該細胞を、沸騰水浴中に沈めた電解研磨ステンレス鋼コイルにより熱細胞溶解した。該熱交換器を出る流体の温度が約７０℃となるように、該流速を調節した。ついで該細胞溶解コイルを、発熱物質を含まない水できれいにし、氷水浴中に沈め、その温かいライセートを３０℃に冷却するのに使用した。ライセートは、熱細胞溶解の完了の３０分以内に冷却した。全ライセート容積は５．６Ｌであった。
【００７６】
清澄化
該冷却ライセートを清澄化するために、３０ｇ／Ｌのボディ供給濃度のＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）を使用した。Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００を該ライセート内に混合し、得られたスラリーを４つの部分に分割した。Ｃｅｌｐｕｒｅの量は、操作の最終規模、所望のフィルターサイズおよび形状ならびに製造施設の意図される生産速度に応じて広範囲にわたり様々となりうる。同様の考慮事項により、本明細書に記載の低および高カット濾過工程における珪藻土の量が決定される。各部分を、６インチ径のフィルターケース内に含有される２５ミクロンのステンレス鋼メッシュで別々に濾過した。該濾液を、まず、その濁度が約１０ＮＴＵに減少するまで再循環させた。各濾過後、加圧空気を使用して、該濾過ケーク内の間隙流体を置換した。分析用ＨＰＬＣアッセイにより測定したスーパーコイルプラスミドＤＮＡの純度および全ＤＮＡ濃度は、それぞれ、８３．６％および０．３３８ｇ／Ｌであった。
【００７７】
ＣＴＡＢプローブ
迅速（ｒａｐｉｄ）ＣＴＡＢプローブを使用して、およその低および高カットＣＴＡＢ濃度を測定した。４０ｍＭ ＮａＣｌ中の次第に増加する量の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢを、１．５ｍＬガラスバイアル内の清澄化ライセートの５００ｍｃＬ アリコートに加えた。バイアルをボルテックスし、ＤＮＡ沈殿物の存在に関して視覚的に検査した。該プローブの結果に基づき、それぞれ０．２３および０．３０％ｗ／ｖの低および高カットＣＴＡＢ濃度が割り当てられた。
【００７８】
低カットＣＴＡＢ工程
５．０５Ｌの清澄化ライセートに、４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの１．５Ｌ 溶液を室温で４３分間にわたって加えた。ついて３４．２ｇのＣｅｌｐｕｒｅ ３００を加えた。ついで該スラリーを、６インチ径のフィルターケース内に含まれる２５ミクロンのステンレス鋼メッシュで濾過した。濾液を、まず、その濁度が一定になるまで再循環させた。該濾過ケークは洗浄しなかったが、加圧空気を使用して乾燥した。産物含有濾液の最終容積は６．４４Ｌであった。
【００７９】
高カットＣＴＡＢ工程
２９．３ｇのＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００を該低カット濾液に加えた。ついで、攪拌しながら、４０ｍＭ ＮａＣｌ中の６５０ｍＬの１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢを該スラリーに約３０分間にわたって加えた。分析用ＨＰＬＣ分析は、該ＤＮＡのすべてが沈殿していることを示した。ついで該高カットスラリーを、６インチ径フィルターケース内に含まれる２５ミクロンステンレス鋼メッシュで濾過した。一定の濁度が観察されるまで、該濾液を再循環させた。該高カットスラリーの濾過が完了した後、該濾過ケークを１２ｍＭ ＮａＣｌ中の０．３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの１Ｌ 溶液で洗浄した。２つの５００ｍＬ洗浄画分を集めた。ついで該洗浄ケークを、加圧空気を使用して部分乾燥し、該フィルターケースから集め、秤量して、該ケーク内の残留液体の質量を測定した。ケークの総質量は１１３ｇであった。Ｃｅｌｐｕｒｅおよび沈殿ＤＮＡは、それぞれ約２９および２ｇに相当した。このことは、該洗浄ケーク中に約８２ｍＬの残留液体が存在したことを示している。図２は、ＣＴＡＢでの段階沈殿中の濃度プロフィールを示している。これらのデータは、プラスミドＤＮＡが、小刻みな界面活性剤の増加量にわたって沈殿することを示している。このＣＴＡＢ−沈殿工程は、可溶性のままであるタンパク質、ＲＮＡおよび内毒素の除去に選択的である。
【００８０】
洗浄した高カットケークの選択的再溶解
７００ｍＬの無菌水を該洗浄高カットケークに加え、液体の総容積を約７８２ｍＬとした。約８６ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌを該スラリーに加えて約０．５ＭのＮａＣｌ濃度を得、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解した。残留珪藻土を、６インチ径フィルターケース内に含まれる２５ミクロンのステンレス鋼メッシュで濾過して、該再溶解スーパーコイルプラスミドＤＮＡから該Ｃｅｌｐｕｒｅを分離した。透明な濾液が観察されるまで、該濾液を再循環させた。該濾過ケークを約１Ｌの０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄して、産物含有間隙液を回収した。該０．５Ｍ ＮａＣｌ 洗浄液を４つの画分内に集めた。分析用ＨＰＬＣアッセイを用いて、該産物濾液および前記の４つの洗浄画分を全ＤＮＡ濃度およびスーパーコイルプラスミドＤＮＡ純度に関してアッセイした。該産物濾液および０．５Ｍ ＮａＣｌ洗浄液の容積、全ＤＮＡ濃度、およびスーパーコイルＤＮＡの組成率は以下のとおりであった：（ｉ）産物濾液：８０ｍＬ、１．９３３ｇ／Ｌ、９３．０％、（ｉｉ）洗浄画分１：２００ｍＬ、０．２０３ｇ／Ｌ、８９．１％、（ｉｉｉ）洗浄画分２：２００ｍＬ、０．０４７ｇ／Ｌ、７０．３％、（ｉｖ）洗浄画分３：３００ｍＬ、０．０１８ｇ／Ｌ、６１．４％、および（ｖ）洗浄画分４：３００ｍＬ、０．０１５ｇ／Ｌ、６３．３％。該洗浄画分は該産物濾液に加えなかった。なぜなら、その純度および濃度が低かったからである。
【００８１】
図３は、アガロースゲル電気泳動による０．２Ｍ ＮａＣｌによるプラスミドＤＮＡの選択的溶解を示している。宿主、ゲノムＤＮＡは部分的に可溶性であるに過ぎず、０．２Ｍ ＮａＣｌでの溶解後に濾過により除去される。１．２Ｍ ＮａＣｌでは、ｇＤＮＡは可溶性である。少なくとも約０．２Ｍ ＮａＣｌ〜少なくとも約２Ｍ ＮａＣｌの範囲が、該ＣＴＡＢ沈殿物の選択的溶解に有用であろう。
【００８２】
増加量のＬＲＡ（商標）での該バッチの処理
０．５Ｍ ＮａＣｌ中の７３５ｍＬの再溶解沈殿物を室温で４５ｇのＬＲＡ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）に加えた。５００ｍｃＬのサンプルを４．８、９．９、１９．１および１９．６時間の時点で採取した。表１は、分析用ＨＰＬＣアッセイにより測定した全ＤＮＡ濃度およびスーパーコイルプラスミドＤＮＡの組成率を示す。
【００８３】
定期的に、漸増量の新鮮なＬＲＡ（商標）を該スラリーに加え、サンプルを以下の時点で採取した：
（ｉ）４．６ｇのＬＲＡ（商標）を１９．９時間の時点で加えた（３５ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを２１．６、２３．８および２５．４時間の時点で採取した。
【００８４】
（ｉｉ）６．６ｇのＬＲＡ（商標）を２５．８時間の時点で加えた（３９．５ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを２６．８、２７．８、２８．８および３０．９時間の時点で採取した。
【００８５】
（ｉｉｉ）３．７ｇのＬＲＡ（商標）を３２．２時間の時点で加えた（４２ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを３２．４、３４．４および４０．８時間の時点で採取した。
【００８６】
（ｉｖ）３．９８ｇのＬＲＡ（商標）を４１時間の時点で加えた（４５ｇ ＬＲＡ（商標）／ｇ ＤＮＡに対して）。サンプルを４１．８および４２．６時間の時点で採取した。
【００８７】
表１に示すとおり、プラスミド純度の更なる増加（ＨＰＬＣアッセイにより測定したもの）は、ＬＲＡ（商標）の定期的添加に対して補正されうる。
【００８８】
【表１】
図４Ａは、珪酸カルシウム上への最適なプラスミド吸着が約０．６ＭのＮａＣｌ濃度で生じることを、より高濃度のＮａＣｌとの比較により示している。ＬＲＡ（商標）がスーパーコイルプラスミドＤＮＡを吸着する能力に影響を及ぼすことなく、この示されている範囲内でＮａＣｌ濃度を操作することは、当業者の認識範囲内であろう。この工程の最適化は、水素結合、疎水性および静電的相互作用の基礎となる現象に関する全ての因子の検討を伴うであろう。そのような変数としては、塩濃度、塩のタイプ、温度、ｐＨおよび吸着剤のタイプが挙げられる。例えば、ＤＮＡに結合する、カルシウムに基づく他の吸着剤は、前記溶液相変数が関与する最適な設計下で分離をもたらすと予想されうるであろう。
【００９０】
ＬＲＡ（商標）の除去および洗浄
４２．９時間後、該ＬＲＡ（商標）スラリーを１９℃で、ｋＲＰＭで２５分間にわたり遠心分離した。得られた４００ｍＬの上清を集めた。２００ｍＬの新鮮な０．５Ｍ ＮａＣｌをＬＲＡ（商標）ペレットに加えた。無菌スパーテルおよび１０秒間の激しい攪拌を用いて、該ＬＲＡ（商標）ペレットを再懸濁した。該再懸濁ＬＲＡ（商標）を８ｋＲＰＭで１０分間の遠心分離に付した。該上清を集め、このようにしてＬＲＡ（商標）ペレットを更に２回洗浄した。該最終上清（４００ｍＬ）およびそれらの３回の洗浄液（３×２００ｍＬ）を、全ＤＮＡ濃度およびスーパーコイルプラスミドＤＮＡの組成に関してアッセイした。結果を表２に示す。洗浄液は該産物上清に加えなかった。ついで該産物上清を０．８ミクロンの使い捨て真空フィルターで滅菌濾過して、残留ＬＲＡ（商標）を除去した。
【００９１】
【表２】
図４Ｂは、時間に対するゲノムまたは宿主ＤＮＡの吸着を示している。より詳しくは、このデータは、ＬＲＡ（商標）が、１．２Ｍ ＮａＣｌ濃度での混合接触の５時間後にＤＮＡを選択的に除去して、約６０％のプラスミド収率を与えることを示している。図４Ｃは、１．２Ｍ ＮａＣｌでのＬＲＡ（商標）接触中の液相サンプルのアガロースゲル電気泳動である。このデータは、直鎖状（Ｌｉｎ）、弛緩型開環状（ＯＣ）および多量体（Ｍ）が除去され、一方、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ＳＣ）が残存していることを示している。レーン１〜５は、次第に遅くなる時点を表し、レーン６〜８は、濾過されたＬＲＡ（商標）の洗浄液を表す。図４Ｄは、０．５Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着を示す。全ＤＮＡ １ｇ当たり３２ｇのｈｃＣａＳｉＯ３と接触している液相サンプルの、時間の関数としてのアガロースゲル電気泳動が示されている。
【００９３】
ＬＲＡ（商標）製品のエタノール沈殿
４００ｍＬの無水エタノールを４００ｍＬのＬＲＡ（商標）後濾液にゆっくりと加えた。エタノールの添加は２時間で完了して、５０％ ｖ／ｖの最終エタノール濃度を得た。該溶液は３６〜３８％ ｖ／ｖの範囲のエタノールで非常に濁った。この時点で、エタノール添加を３０分間停止して、粒子を成長させた。厳密な検査は、細かい濾過されうる粒子を示した。３０分間の混合熟成（ｍｉｘｅｄ ａｇｅ）後、該懸濁液を無菌０．２２ミクロンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＧＰエクスプレスメンブレン，５０ｃｍ２）で濾過した。約５００ｍＬの無水エタノールを使用して該ケークを洗浄した。ついで該フィルター単位を真空オーブンに移し、２７℃、２９（Ｈｇ）で２時間乾燥した。７３０ｍｇの乾燥粉末を集め、無菌着色ガラスバイアル中、−２０℃で保存した。
【００９４】
表３には、該方法の各工程における純度および収率（分析用ＨＰＬＣアッセイにより測定したもの）が要約されている。低カットＣＴＡＢ、高カットＣＴＡＢおよび高カット沈殿物の再溶解にわたり約１００％の収率が達成された。
【００９５】
表４には、タンパク質および内毒素の除去が要約されている。最終的エタノール沈殿産物を、残留ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、内毒素、タンパク質、ＣＴＡＢ、リゾチーム、ＬＲＡ（商標）およびＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００の除去に関してアッセイする。
【００９６】
【表３】
ＵＣＬ：未清澄化ライセート。ＣＬ：珪藻土清澄化ライセート。ＬＣＦ：ＣＴＡＢ低カット濾液。ＨＣＦ：ＣＴＡＢ高カット濾液（予想どおり、ＤＮＡは含有しない）。ＲＨＣＰ：０．５Ｍ ＮａＣｌ中の再溶解高カット沈殿物。ＲＨＣＰ＊：ＬＲＡ（商標）工程への７３５ｍＬの供給。約６５ｍＬをＬＲＡ（商標）プローブ研究において使用した。ＬＲＡ（商標）後：ＬＲＡ（商標）吸着工程後の０．８ミクロン濾液。分析用ＨＰＬＣアッセイを用いてＤＮＡ濃度、ＳＣ純度およびＳＣ濃度を測定した。
【００９８】
【表４】
サンプルの表示は表３に列挙されている。ＬＯＤ：検出限界。ＮＡ：アッセイせず。タンパク質含量は、ローリー法を用いて測定した。内毒素含量は、ＬＡＬアッセイを用いて測定した。＊ＲＮＡ濃度は、オルシノールアッセイを用いて測定した。高濃度のプラスミドＤＮＡは該オルシノールアッセイを阻害する。この阻害は、ＲＨＣＰおよびＬＲＡ（商標）後サンプルに関して列挙されているＲＮＡ濃度において反映される。最終産物Ａ２６０／Ａ２８０比率は１．９であったが、これは、低いＲＮＡ含有分率を示している。
【０１００】
図６は、実施例に記載の加工工程からのサンプルのＤＮＡ組成を示す。スーパーコイルプラスミドは最下バンドにおいて可視化されている。それより上方のバンドは、開環状および直鎖状プラスミド、プラスミド多量体ならびにゲノムＤＮＡを含む種々のＤＮＡ不純物を表す。示されているのは、珪藻土で清澄化されたライセート（左からレーン１）；０．２３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける低カット（ｃｕｔ）濾液（レーン２）；ＤＮＡを含有しない０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢにおける高カット濾液（レーン３）；０．４Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン４）；０．４７５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン５）；０．５Ｍ ＮａＣｌ中の高カット沈殿物（レーン６）；ＬＲＡ吸着工程後の０．８ミクロン濾液（レーン７）；エタノール沈殿および無菌水中の再溶解に付されたＬＲＡ産物（レーン８）。レーン１および８の比較は、ＤＮＡ分解型不純物においては実質的な減少が存在することを示している。
【０１０１】
実施例２
ＣＴＡＢ沈殿をモニターするための粒径分析器の使用
ＣＴＡＢ沈殿は、例えばＬａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用して厳密にモニターすることができる。４０ｍＭ ＮａＣｌ中の１．０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの溶液を０．２５〜０．２８％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの最終濃度にまで加えることにより、残留微細細胞残渣および他の不純物（ゲノムＤＮＡならびに弛緩型環状および直鎖状ＤＮＡ分解物を含む）を該清澄化ライセートから沈殿させる。該不純物の沈殿を、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用して、リアルタイムでモニターする。該全粒子計数が急激に低下した後、ＣＴＡＢの添加を停止する。これは、該スーパーコイルＤＮＡを溶液中に残す一方で直鎖状および弛緩型環状ＤＮＡを沈殿させるのに十分なＣＴＡＢであるに過ぎない。ついで該バッチを濾過して該沈殿不純物を除去する。ＣＴＡＢを該バッチに０．３０〜３３％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢの最終濃度で加えて、該スーパーコイルＤＮＡを沈殿させる。図５は、Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用した場合の０．２５〜０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢによる不純物の沈殿を示す。ＣＴＡＢ添加は、粒子計数の急激な変化に基づき、１００分の時点で停止する。沈殿不純物を濾過により除去する。追加的なＣＴＡＢを加えて該スーパーコイルＤＮＡを沈殿させる。
【０１０２】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前記の説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１０３】
本明細書中には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】清澄化により細胞残渣を除去する中心的な４つの工程プロセスを含むプロセスの流れ図を示す。
【図２】ＣＴＡＢでの段階的沈殿中の濃度プロフィールを示す。
【図３】アガロースゲル電気泳動による０．２Ｍ ＮａＣｌによるプラスミドＤＮＡの選択的溶解を示す。
【図４Ａ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。塩化ナトリウム濃度に対するプラスミドＤＮＡの平衡吸着。
【図４Ｂ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。ｑＰＣＲにより測定されたゲノムまたは宿主ＤＮＡの吸着。
【図４Ｃ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。１．２Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。
【図４Ｄ】ｈｃＣａＳｉＯ３（ＬＲＡ（商標））への不純物の吸着による精製を示す。を示す。０．５Ｍ ＮａＣｌ中のｈｃＣａＳｉＯ３上へのプラスミド分解物の選択的吸着。
【図５】Ｌａｓｅｎｔｅｃ（登録商標）粒径分析器を使用する０．２５％〜０．３０％ ｗ／ｖ ＣＴＡＢによる不純物の沈殿を示す。
【図６】
実施例１に開示する加工工程からのサンプルのＤＮＡ組成物を示す。
Claims (63)
- 大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、
（ａ）界面活性剤誘発性沈殿によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、
（ｂ）該沈殿物を塩溶液に再溶解することを含んでなる方法。 - 工程（ａ）の界面活性剤がヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）である、請求項１記載の方法。
- ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを２工程法で加え、第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿が生じて残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿し、第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿が生じて該スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿する、請求項２記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項３記載の方法。
- 沈殿したスーパーコイルＤＮＡをバッファー溶液に再懸濁させ、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項４記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項５記載の方法。
- 沈殿したスーパーコイルＤＮＡをバッファー溶液に再懸濁させ、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項３記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項７記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項２記載の方法。
- 該ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）の添加前に該細胞ライセートを清澄化する、請求項２記載の方法。
- 該細胞ライセートを珪藻土の添加により清澄化する、請求項１０記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡを、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項１１記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項１２記載の方法。
- 微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、残留不純物を該スーパーコイルプラスミドＤＮＡから吸着除去するために水和結晶性珪酸カルシウムを該細胞ライセートに加えることを含んでなる方法。
- 該水和結晶性珪酸カルシウムの添加前に該細胞ライセートを清澄化する、請求項１４記載の方法。
- 該細胞ライセートを珪藻土の添加により清澄化する、請求項１５記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡを、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項１６記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項１７記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡを、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項１４記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項１９記載の方法。
- 該水和結晶性珪酸カルシウムを段階的に加える、請求項１４記載の方法。
- 該水和結晶性珪酸カルシウムの添加前に該細胞ライセートを清澄化する、請求項２１記載の方法。
- 該細胞ライセートを珪藻土の添加により清澄化する、請求項２２記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡを、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項２３記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項２４記載の方法。
- 微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、
（ａ）界面活性剤誘発性沈殿により該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、
（ｂ）該沈殿物を塩溶液に再溶解し、
（ｃ）該スーパーコイルプラスミドＤＮＡから残留不純物を吸着除去するために該再懸濁スーパーコイルプラスミドに水和結晶性珪酸カルシウムを加えて、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する溶液を得、
（ｄ）該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを濃縮することを含んでなる方法。 - 工程（ａ）の界面活性剤がヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドである、請求項２６記載の方法。
- ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを２工程法で加え、第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿が生じて残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿し、第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿が生じて該スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿する、請求項２７記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項２８記載の方法。
- 工程（ｄ）において、該スーパーコイルＤＮＡを、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により濃縮する、請求項２９記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項３０記載の方法。
- 該水和結晶性珪酸カルシウムの添加前に該細胞ライセートを清澄化する、請求項２８記載の方法。
- 該細胞ライセートを珪藻土の添加により清澄化する、請求項３２記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡを、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項３３記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項３４記載の方法。
- 該水和結晶性珪酸カルシウムの添加前に該細胞ライセートを清澄化する、請求項２６記載の方法。
- 該細胞ライセートを珪藻土の添加により清澄化する、請求項３６記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡを、アルコール沈殿および限外濾過よりなる群から選ばれる方法により更に濃縮する、請求項３７記載の方法。
- 該スーパーコイルＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮する、請求項３８記載の方法。
- 微生物発酵からスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、
（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、
（ｂ）十分な量の細胞溶解溶液を該回収微生物細胞に加え、
（ｃ）フロースルー熱交換器中で工程ｂ）の微生物細胞を７０℃〜１００℃の温度に加熱して、細胞ライセートを形成させ、
（ｄ）該細胞ライセートを冷却し、
（ｅ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、
（ｆ）第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿により残留細胞残渣および不純物を沈殿させ、
（ｇ）第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させ、
（ｈ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｉ）工程（ｈ）のバッファー内の珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、
（ｊ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
（ｋ）該沈殿物を濾取し洗浄し、
（ｌ）エタノールを除去するために乾燥し、
（ｍ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｎ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含んでなる方法。 - 工程（ｊ）〜（ｎ）を省略し、工程（ｉ）のバッファーを洗浄し、滅菌し、該ＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得る、請求項４０記載の方法。
- 工程（ｃ）において、工程（ｂ）の微生物細胞を約７０℃〜約８０℃の温度に加熱する、請求項４０記載の方法。
- ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを２工程法で加え、第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿が生じて残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿し、第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿が生じて該スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿する、請求項４２記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項４３記載の方法。
- 工程（ｃ）において、工程（ｂ）の微生物細胞を約７０℃〜約８０℃の温度に加熱する、請求項４１記載の方法。
- ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを２工程法で加え、第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿が生じて残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿し、第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿が生じて該スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿する、請求項４５記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項４６記載の方法。
- 大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、
（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、
（ｂ）十分な量の細胞溶解溶液を該回収微生物細胞に加え、
（ｃ）フロースルー熱交換器中で工程ｂ）の微生物細胞を７０℃〜１００℃の温度に加熱して、細胞ライセートを形成させ、
（ｄ）該細胞ライセートを冷却し、
（ｅ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、
（ｆ）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムでスーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、
（ｇ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｈ）工程（ｇ）のバッファー内の珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、
（ｉ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
（ｊ）該沈殿物を濾取し洗浄し、
（ｋ）エタノールを除去するために乾燥し、
（ｌ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｍ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含んでなる方法。 - 工程（ｊ）〜（ｎ）を省略し、工程（ｉ）のバッファーを洗浄し、滅菌し、該ＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得る、請求項４８記載の方法。
- 工程（ｃ）において、工程（ｂ）の微生物細胞を約７０℃〜約８０℃の温度に加熱する、請求項４８記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項５０記載の方法。
- 工程（ｃ）において、工程（ｂ）の微生物細胞を約７０℃〜約８０℃の温度に加熱する、請求項４９記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項５２記載の方法。
- 大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、
（ａ）発酵ブロスから微生物細胞を回収し、
（ｂ）十分な量のリゾチーム／アルカリ／ＫＯＡｃを該回収微生物細胞に加えて、細胞溶解を促進し、細胞ライセートを形成させ、
（ｃ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、
（ｄ）第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿により残留細胞残渣および不純物を沈殿させ、
（ｅ）第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿によりスーパーコイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させ、
（ｆ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｇ）工程（ｆ）のバッファーを伴う珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、
（ｈ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
（ｉ）該沈殿物を濾取し洗浄し、
（ｊ）エタノールを除去するために乾燥し、
（ｋ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｌ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含んでなる方法。 - 工程（ｈ）〜（ｌ）を省略し、工程（ｉ）の残存バッファーを洗浄し、滅菌し、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得る、請求項５４記載の方法。
- ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを２工程法で加え、第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿が生じて残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿し、第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿が生じて該スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿する、請求項５３記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項５６記載の方法。
- ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを２工程法で加え、第１ヘキサデシルトリメチルアンモニウム誘発性沈殿が生じて残渣および非スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿し、第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿が生じて該スーパーコイルプラスミドＤＮＡが沈殿する、請求項５５記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項５８記載の方法。
- 大規模な微生物発酵の細胞ライセートからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、
（ａ）大規模な発酵から微生物細胞を回収し、
（ｂ）十分な量のリゾチーム／アルカリ／ＫＯＡｃを該回収微生物細胞に加えて、細胞溶解を促進し、細胞ライセートを形成させ、
（ｃ）珪藻土での濾過を用いて、該細胞ライセートを清澄化し、
（ｄ）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムでスーパーコイルプラスミドＤＮＡを沈殿させ、
（ｅ）最適化されたイオン強度および塩組成の、十分に規定されたバッファーに、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｆ）水和結晶性珪酸カルシウム上に残留不純物を吸着させ、
（ｈ）スーパーコイルプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
（ｉ）該沈殿物を濾取し洗浄し、
（ｊ）エタノールを除去するために乾燥し、
（ｋ）生理的に許容される製剤化バッファーに、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、
（ｌ）０．２２μｍフィルターで濾過滅菌することを含んでなる方法。 - 工程（ｊ）〜（ｎ）を省略し、工程（ｉ）のバッファーを洗浄し、滅菌し、該ＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮して、該スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含有する粉末沈殿物を得る、請求項６０記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項６０記載の方法。
- 該第１および該第２ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド誘発性沈殿工程が標準ＳＴＥＴバッファー中で生じる、請求項６１記載の方法。
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