KR100669305B1

KR100669305B1 - Ｒｎａ 분해효소 및 유기용매의 작용없이 접선 흐름여과를 이용한 플라스미드 ｄｎａ 정제법

Info

Publication number: KR100669305B1
Application number: KR1020027000915A
Authority: KR
Inventors: 미쉘리 디. 버틀러; 다린 엘. 코헨; 데이비드 칸; 마조리 이. 윈클러
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2007-01-17
Also published as: JP2003505077A; ATE264386T1; US6313285B1; WO2001007599A1; PT1200578E; ES2218185T3; NZ516641A; HK1048829A1; DE60009912D1; HUP0202295A2; HUP0202295A3; PL364816A1; DE60009912T2; DK1200578T3; BR0012627A; KR20020019123A; IL147644A0; EP1200578A1; CA2378944A1; CN1378592A

Abstract

플라스미드 DNA를 함유하는 원핵세포로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 공정에 대한 설명이다. 이 공정은 다음과 같은 단계를 거친다:

(a)세포를 분해하는 단계; (b) RNA의 효소적 분해 없이, 세포를 약 4 내지 24 시간 동안 인큐베이션하여 세포를 용해 및 가용화시키는 단계; (c)세포에서 용해 불순물을 제거하여 플라스미드 DNA용액을 제공하는 단계; (d)접선 흐름 여과 장치를 통과하여 상기 용액을 여과시켜 플라스미드 DNA를 함유하는 잔류물을 얻는 단계; 및 (e)잔류물을 수거하는 단계

플라스미드 DNA의 정제, 접선 흐름 여과, 크로스 플로우 여과

Description

ＲＮＡ 분해효소 및 유기용매의 작용없이 접선 흐름 여과를 이용한 플라스미드 ＤＮＡ 정제법{METHOD FOR RNASE- AND ORGANIC SOLVENT-FREE PLASMID DNA PURIFICATION USING TANGENTIAL FLOW FILTRATION}

본 발명은 플라스미드(plasmid) DNA의 정제 공정에 관한 발명이다. 구체적으로는 단순하고, 스케일-업 가능하며 접선 흐름 여과(Tangential Flow Filtration)를 이용하는 방법으로, 종래의 염기성-용해 기초한 방법에 비해 고순도의 플라스미드의 높은 수득율을 가져오는 방법이다.

세포 배양액으로부터 플라스미드 DNA의 정제는 다수의 연구 및 제약 용도에 있어 전제조건이다. 일반적으로, 플라스미드 정제법은 세포 파괴/플라스미드 단리 과정 및 그에 이어지는 1 회 이상의 후속 정제 과정으로 구성되는 2 단계공정으로 간주될 수 있다. 초기 단리화의 가장 일반적인 방법은 두가지 접근법이 변형된 것들이다. 그 중 하나는 비등에 의한 플라스미드의 유출[Holmes and Quigley, Anal. Biochem., 114: 193-197 (1981)]에 기초를 둔 방법이고, 두번째는 염기성 pH 및 박테리아 세포막의 계면활성제 매개 용해법[Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res., 7: 1513-1523 (1979)]에 기초한 방법이다. 이 두가지 방법은 모두 세포질로부터 플라스미드 DNA를 유출시킨다.

세슘 클로라이드 구배를 통한 초원심분리의 일반적 방법에 추가하여[Clewell and Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 62: 1150-1152 (1969)], 다운스트림(downstream) 정제는 전형적으로 불순물로부터 플라스미드의 선택적 침전[Lis and Schleif, Nucleic Acids Res., 2: 383-389 (1975); Ishaq et al., Biotechniques, 9: 19-24 (1990); Kondo et al., Anal. Biochem., 198: 30-35 (1991); Chakrabarti et al., Biotech. Appl. Biochem., 16: 211-215 (1992)] 및(또는) 컬럼 크로마토그래피의 이용[Horn et al., Human Gene Ther., 6: 565-573 (1995); 미국 특허 제5,707,812호; Chandra et al., Anal. Biochem., 203: 169-172 (1992); Marquet et al., BioPharm: 26-37 (1995); Johnson and Ilan, Anal. Biochem., 132: 20-25 (1983); Vincent and Goldstein, Anal. Biochem., 110: 123-127 (1981)]을 수반한다. 컬럼 크로마토그래피 프로토콜은 역상방법[Edwardson et al., Anal. Biochem., 152: 215-220 (1986); Johnson et al., Biotechniques, 4: 64-70 (1986); van Helden and Hoal in New Nucleic Acid Techniques, Walker, Ed. (Humana Press: Clifton, NJ, 1988), pp.61-74)], 정상상 방법[Marko et al., Anal. Biochem., 121: 382-387 (1982)], 이온 교환 방법[Perbal in A Practical Guide to Molecular Cloning (Wiley: New York, 1984), pp. 165-175 ; Colman et al., Eur. J. Biochem., 91: 303-310 (1978); Garon and Petersen, Gene Anal. Tech., 4: 5-8 (1987); Kim and Rha, Biotech. Bioeng.,33: 1205-1209 (1989); Ohmiya et al., Anal.Biochem., 189 : 126-130 (1990)], 크기 배제 방법[van Helden and Hoal, 상기참조; Perbal, 상기참조; Cornelis et al., Plasmid, 5: 221-223 (1981), Micard et al., Anal. Biochem., 148: 121-126 (1985); Moreau et al., Anal. Biochem., 166: 188-193 (1987); Raymond et al., Anal. Biochem., 173: 125-133 (1988); Hansen and Rickett, Anal. Biochem., 179: 167-170 (1989)] 및 복합 모드 방법[Flanagan et, Anal. Biochem., 153: 299-304(1986)]의 방법들에 의존한다.

이러한 접근에 대한 별법으로는 플라스미드 정제를 위해, 96-웰 플레이트 포맷내에서 염기성 용해동안 원심분리 단계를 대체한 0.2-마이크론 막의 이용[Ruppert et al., Anal. Biochem., 230: 130-134 (1995)], 수성의 2상 분리의 이용[Cole, Biotechniques, 11: 18-24 (1991)] 및 이온 교환막의 이용[van Huynh et al., Anal. Biochem., 211: 61-65(1993)]이 포함된다. 전형적으로, 이러한 방법은 적절한 순도의 플라스미드를 제조하기 위해 외부 효소(예를 들어 RNase, 단백질분해효소 K)의 추가와 함께, 유기용매-기초한 추출(예를들어 페놀/클로로폼) 또는 침전(예를 들어 이소프로판올, 에탄올) 단계를 수반하는 추가 정제 단계가 요구된다.

플라스미드 DNA의 정제를 위한 추가적 기술에는 폴리에틸렌-글리콜 기초한 DNA 정제법[Lis and Schleif, 상기참조; 단쇄 고분자 알콜을 용해물에 첨가하여 용해물이 정제를 위해 사용되는 컬럼 또는 막에 결합된다는 내용의 미국 특허 제5,707,812호]; 플라스미드 DNA의 산-페놀 정제[Zasloff et al., Nucleic Acids Res., 5: 1139-1153 (1978)]; 및 연구용도의 플라스미드 DNA의 상대적 소량 정제를 위한 상이한 방법들[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, 1989); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons: New York, 1989)]이 포함된다. DNA-RNA 분리 기술은 Roman and Brown, J. Chromatogr., 592: 3-12 (1992)에서 개관된다.

접선 흐름 여과(TFF) 또는 크로스 플로우 여과는 스위핑 모션으로 플로우(flow)가 막표면을 지나게 되는 분리 기술이다[Gabler, ASM News, 50: 299 (1984)]. 이 스위핑 모션으로 농도 분극이라 알려진 상태인 막에 의해 잔류된 물질이 여과막 표면상에 층을 형성하는 것을 막는 것을 도와준다. TFF는 막에 의해 잔류된 용액(잔류물)의 농축화 및(또는) 탈염화를 위해, 또는 막 통과 물질(여과물)의 수거를 위해 사용된다. 세공경(또는 명목분자량(NMWC) 컷오프)보다 작은 물질은 막을 통과할 수 있어서 큰 분자량 또는 세공경보다 큰 물질로부터 발열원제거화, 정화 또는 분리될 수 있다. 세공경 또는 NMWC보다 큰 물질은 막에 의해 잔류되고 작은 분자량 물질로부터 농축, 정화 또는 분리된다. TFF에 이용된 원리, 이론 및 장치에 대해서는 마이클(Michaels)등이 저술한 분리 기술, 약학 및 생물공학에의 응용,의 "접선 흐름 여과"[W. P. Olson, ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, 1995]에 설명되어 있다. 진보된 TFF를 대표하는 고성능 접선 흐름 여과(HP-TFF)에 관해서는 미국 특허 제5,256,294호 및 제5,490,937호를 참조하고, 정제시키는 물질에 선택적으로 결합되는 친화성 겔을 정제될 용액과 혼합한 후, 그 액체를 TFF 통과시켜, 결합된 물질을 제외한 모든 성분들이 여과막을 통과하도록 하는 것을 포함하는 접선 흐름 친화성 한외여과에 관한 설명으로는 WO 87/04169를 참조하라.

TFF 또는 다른 크로스 플로우 여과 기술같은 물리적 분리를 이용하여, 바이러스, 핵산, 박테리오파지 및 기타 생물학적 물질을 정제하는 추가적인 방법은 다수의 간행물에서 설명된다[Richards and Goldmintz, J.Virol. Methods, 4: 147-153 (1982); Fernandez et al., Acta Biotechnol., 12: 49-56 (1992); Matsushita et al., Kagaku Kogaku Ronbunshu, 20: 725-728 (1994); Rembhotkar and Khatri, Anal. Biochem., 176: 373-374 (1989); 1998.2.12 공개된 WO 98/05673; EP 307,373; Sekhar et al., Hum. Gene Ther., 7: 33-38 (1996)].

클로닝 벡터로서 보다 유전자 치료 용도의 생물학적 제재로서의 플라스미드 DNA의 이용이 증가하는 추세에서, 형질전환된 원핵생물로부터 플라스미드 DNA 분자의 중간정도 및 다량 모두를 단리하는데 이용할 수 있는 단순, 강건, 스케일-업 가능한 정제 공정에 대한 필요성이 증가하고 있다. 연구 물질의 대량 생산 목적 또는 임상시험 공급을 위해 현재 이용가능한 플라스미드 정제 방법은 다수의 이유로 이용이 제한된다. 가연성 유기용매(예를 들어 에탄올 및 이소 프로판올), 독성 화학약품(예를 들어 에튬 브로마이드, 페놀, 클로로포름)의 대량 사용을 수반하는 정제법이 구상된다. 초원심분리 및 "스핀-컬럼(spin-column)"은 소량의 연구물질의 생산에는 적당한 반면, 생물학적 제약용도 필요량의 생산에서의 이용에는 적당하지 않다.

게다가 다수의 현행 플라스미드 정제 과정에는 보통 소 기원의 RNase의 추가가 수반된다. 소 기원으로부터 얻은 물질은 소해면양뇌증(BSE)[Hill et al., Nature, 389: 448-450 (1997)]에 대한 우려때문에 제약제조에 있어서 바람직하지 않다. 일반적으로, 플라스미드 조제에 효소를 추가하는 것은 이 효소 분자를 제거하는 정제가 추가적으로 필요하기 때문에 기피하는 것이 바람직하다.

겔-여과 크로마토그래피를 이용한 정제 프로토콜은 작동에 있어 낮은 적재 용량에 의해 제한을 받는다; 한 보고서에 따르면, 적재량이 그 컬럼 부피의 약 2%로 제한된다[McClung and Gonzales, Anal. Biochem., 177: 378-382 (1989)].

[발명의 요약]

따라서 본원 발명은,

(a) 세포를 분해시키는 단계,

(b) RNA의 효소적 분해 없이, 세포를 약 4 내지 24 시간 동안 인큐베이션하여 세포를 용해 및 가용화시키는 단계,

(c) 세포에서 용해 불순물을 제거하여 플라스미드 DNA 용액을 제공하는 단계,

(d) 접선 흐름 여과 장치를 통과하여 상기 용액을 여과시켜 플라스미드 DNA를 함유하는 잔류물을 얻는 단계, 및

(e) 잔류물을 수거하는 단계를 포함하는, 플라스미드 DNA를 함유하는 원핵세포로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 공정을 제공한다.

세포는 박테리아 세포가 바람직하다. 또한, (c)단계는 세포 용해물 중의 플라스미드 DNA로부터 용해 불순물을 원심분리시켜 플라스미드 DNA를 함유하는 상청 용액을 제공하는 것이 바람직하다.

다른 실시예에서, 본 발명은 위와 같은 공정을 따라 준비된 플라스미드 DNA를 함유하는 조성물을 제공한다.

본원에서 제공되는 단순하고, 스케일-업 가능한, 여과에 기초한 플라스미드 정제방법은 매우 높은 수득률로 고순도 플라스미드를 생산한다. 이 방법은 가용화 단계를 약 30분 미만에서 약 4 내지 24시간으로 연장함으로써 종래의 염기성 용해 기초의 플라스미드 추출 방법의 개질에 속한다. 이 추출에 이어서 잔류 불순물의 정제를 위해 새롭게 TFF를 이용한다. 본원의 방법은 유기용매, RNase, 단백질 분해효소 K, 고속 원심분리, 또는 컬럼 크로마토그래피 단계의 이용을 포함하지 않는다. 유기용매의 사용은 최종 산물에 미량이 남아있을 수 있다는 점에서 안전성 및 규제적 우려를 제기한다. 또한, 이런 용매는 독성 및 가연성이어서, 다량 정제에 필요한 양으로 사용될 경우 심각한 위험 및 폐기/환경 문제를 제기한다. 이 방법은 전형적으로 박테리아 배양액 1리터당 15-20 mg의 플라스미드 DNA를 생산하고, 개질된 염기성 용해 과정 후에 잔류하는 RNA의 99% 이상 및 단백질의 95% 이상을 제거한다. 이 과정에 의해 단리된 플라스미드는 종래 세슘 클로라이드 구배법을 이용하여 단리된 플라스미드와 비교하여 상당한 정도의 트랜스팩션 능력을 가진다.

본원에서는 플라스미드 DNA가 높은 순도로 정제되기 때문에 유전자 치료 및 기타 예를 들어 지질 담체를 수반하는 유전자 전달 기술에 유용하게 사용될 수 있고, 이에 의해 재현가능하고도 고효율의 트랜스팩션이 얻어진다. 설명된 방법은 필요하면 대용량에서의 작동을 위해 즉시 스케일업(scale-up) 가능하다.

도 1A 및 도 1B는 크기배제 크로마토그래피에 의해 평가된 바에 따라 RNA에서 플라스미드 DNA의 정제를 도시한다. 도 1A는 TFF에 의한 정제에 앞서 아세트산 칼륨 상청액의 분석이다. 도 1B는 최종 TFF 풀(pool)의 분석을 나타낸다. 수치들은 260nm에서 전체 흡광 퍼센트를 나타내는 것이다.

정의

본원에서 사용된 "여과물"이란 용어는 시료중 여과막을 통과한 부분을 의미한다.

본원에서 사용된 "잔류물"이란 용어는 시료중 여과막을 통과하지 못한 부분을 의미한다.

"접선 흐름 여과" 또는 "TFF" 또는 "크로스 플로우 여과"이란 용어는 가해진 압력이 용질 및 작은 분자가 막을 통과하도록 하면서 시료 혼합물이 막의 윗면를 횡단하여 순환하는 여과 공정을 의미한다. 유체흐름이 필터 표면을 연속적으로 깨끗하게 하고 여과불가능 용질에 의해 필터가 막히는 것을 방지할 수 있도록 용액은 전형적으로 여과막과 평행하게 흐른다. 유체와 여과가능한 용질은 막사이의 압력차에 의해 필터를 통과하여 흐른다. 이는 필터를 통과한 유체가 연속적으로 별도 순환으로 배출되면서 용액이 반복적으로 막을 통과하므로, 연속흐름공정으로서 수 행될수 있다.

본원에서 사용된 "용해 불순물"이란 용어는 목적하는 플라스미드 DNA가 포함된 혼합물에서 염색체 DNA, 숙주 단백질, 세포 파편(세포막파편, 탄수화물, 작은 분해된 핵산, 숙주 RNA, 당지방질 등을 포함)을 포함한 원하지 않는 모든 성분을 의미한다.

"RNA의 효소적 분해 작용없이"라는 표현은 RNA(세포상의 또는 숙주 RNA 포함)를 분해하는 RNase와 같은 효소의 부재를 의미한다.

본원에서 사용된 "분자량 컷오프"라는 용어는 막에 의해 90%가 잔류되는 구상용질의 분자량을 의미한다. Filtron 카달로그, 1995/96, 5 면 참고. 막을 통과하거나 또는 잔류한 입자의 실제 분자량은 해당 분자의 크기, 형태, 및 전하량, 막세공 또는 기질의 성질, 용액의 전도성 및 pH 에 의존한다.

본원에서 사용된 "정제된"이란 용어는 260 nm 흡광도에서 크기배제 크로마토그래피에 의해 측정시 엔도톡신, 단백질 및 RNA와 같은 불순물로부터 분리되고, 바람직하게는 약 95% 이상의 플라스미드 및 약 5%의 RNA, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 플라스미드 및 약 2%의 RNA로 구성되는 플라스미드를 말한다. 이러한 정제 플라스미드 제조에서 엔도톡신 수준은 300,000 EU/ml미만이 바람직하고 , 30,000 EU/ml미만이 더욱 바람직하다.

본 발명의 수행모드

RNase없이 TFF를 이용하여 플라스미드 DNA를 포함하는 원핵생물 세포로부터 플라스미드 DNA를 높은 수득률로 고순도 정제할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본원에서 플라스미드 DNA 크기는 약 2 Kb 내지 50 Kb 범위가 바람직하고, 2 내지 15 Kb의 범위가 더 바람직하고, TFF는 500 kD보다 큰, 바람직하게는 약 500 kD내지 1000 kD의 선택적 분자량 컷오프를 사용한다.

본원에서 플라스미드 DNA는 원핵생물 세포배양(바람직하게는 박테리아 배양, 특히 E. coli)의 성분으로부터 단리되거나 추출된다. 원핵생물 세포로부터 단리된 플라스미드 DNA에는 예를들어 마커 유전자 또는 치료 유전자를 포함한 관심 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 뿐만아니라 천연 플라스미드가 포함된다. 배양은 사용된 세포의 성장에 적합한 임의의 액체 배지에서 수행될 수도 있다.

본원에서 정제될 DNA 플라스미드는 상기 특정된 크기 범위내라는 조건이라면 임의의 성질을 갖는 임의의 염색체외의 DNA 분자일 수도 있다. 플라스미드는 높은 복제수, 낮은 복제수, 또는 도피 플라스미드일 수도 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, 수퍼코일된 플라스미드 DNA, 또는 DNA단편일 수도 있다. 그들은 선택가능한 유전자, 폴리링커, 복제 기원, 프로모터, 인핸서, 리더 서열, 폴리아데닐레이션 부위 및 정지 서열을 포함하는 일군의 유전적 구성요소를 포함할 수 있다. 플라스미드는 기본적으로는 임의 기원의 포유류 유전자, 바람직하게는 치료 유전자, 더 바람직하게는 관심있는 인간 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 그러한 치료 유전자는, 적합한 숙주내에서 발현되어 결함 또는 불충분 발현되는 유전자를 보충할 수 있는 기능적 유전자 또는 유전자단편 및 발현되었을때 숙주세포내에서 유전자의 기능을 방해 또는 억제하는 유전자 또는 유전자단편(예를 들어 안티 센스 서열, 리보자임, 트랜스도미넌트 억제제, 및 그 유사한 것을 포함)을 포함한다.

플라스미드 DNA를 추출하는 세포의 분해 또는 용해 전에, 세포는 일반적으로 배양 배지로부터 먼저 수확된다. 원심분리, 여과 및 침전을 포함하여 액체 배지로부터 세포를 수확하는 임의의 종래방법이 적합하다.

본원 공정의 첫번째 단계는 세포 분해를 포함한다. 분해는 임의의 종래의 공정(예를 들어 Birnboim 및 Doly의 기술, 상기 참조)에 의해서도 가능할 수 있지만, 리소자임과 같은 분해효소의 추가, 혼합 및 실온미만, 바람직하게는 얼음상에서 혼합물 인큐베이팅에 의하는 것이 바람직하다.

본원 공정의 두번째 단계는 RNA의 화학적 분해를 가져오는 세포의 용해 및 가용화를 포함한다. 이 단계는 약 4 내지 24 시간, 바람직하게는 6 내지 24시간, 더바람직하게는 10 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 15 내지 24시간, 가장 바람직하게는 20 내지 24시간의 범위의 시간 동안 수행된다. 전형적으로, 수확후에 세포를 완충액내에서 재현탁시키고, 지정된 시간동안 세포를 용해, 가용화하는 1 이상의 물질로 처리한다. 이러한 물질의 예로는 알칼리(예를 들어 수산화나트륨 같은 희석 염기) 및(또는) 계면활성제 등이 있다. 알칼리 및 계면활성제 모두를 이용하는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시예에서는, 엔도톡신을 최대로 제거하기 위해, 계면활성제로는 예를 들어 소듐 도데실 설페이트(SDS), 콜린산, 데옥시콜린산, 또는 TRITON X-114^TM, 가장 바람직하게는 SDS, 데옥시콜린산을 사용한다. 플라 스미드의 유출 및 불순한 게놈 DNA를 최대로 제거하기위해, 계면활성제로는 음이온성이 바람직하며, SDS, 콜린산 또는 데옥시콜린산이 더욱 바람직하며, SDS 또는 데옥시콜린산이 가장 바람직하다.

용해/가용화 단계는 RNase와 같은 RNA 분해효소없이 수행된다. 또는, 상기공정은 동물성 바이러스 오염가능성 때문에, 세포막을 약화시키는 임의의 효소처리없이 수행하는 것이 바람직하다. 또한 염색체 DNA의 제거를 용이하게 하고, 최종 플라스미드 DNA 산물과의 오염을 피하기 위하여, 염색체 DNA를 절단하지 않는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 박테리아 세포의 가용화 과정은 번보임(Birnboim) 및 돌리(Doly)(상기참조)에 기재된 염기성 용해 또는 본원 실시예 1에서 보고하고 있는 바와 같은 변형을 포함한다.

용해 및 가용화 후에, 세포는 단백질, 세포벽, 또는 세포막등의 세포파편, 염색체 DNA 및 숙주 단백질을 포함하는 용해 불순물이 제거되도록 세포를 처리한다. 이런 제거 단계는 전형적으로 세포타입 및 이용된 용해타입에 의존하여 침전, 원심분리, 여과 및(또는) 침강이 수반된다. 염기성 용해가 이용되는 경우, 바람직하게는 생산된 용해물을 산화시켜 염색체 DNA와 숙주 단백질을 침전시킨다. 그리고나서 세포 파편 및 기타 불순물은 원심분리, 여과, 또는 침강(원심분리가 바람직)과 같은 일반적 방법에 의해 제거시키는 것이 바람직하다. 생산된 상청액은 임의로 그것을 정화시키고 상청액에 대해 숙주 RNA의 농도를 감소시키기 위해 규조토와 함께 여과시킨다. 플라스미드 DNA는 적절한 조건하에서 침전제를 사용하여 정화된 여과물로부터 침전시키고, 수거하여, 완충액 내에서 재현탁시킬 수 있다. 이 어서, 플라스미드 DNA와는 대조적으로, 숙주 RNA, 단백질 및 당지방질은 바람직하게는 이 목적에 적절한 조건하에서 침전제를 사용하여 완충액으로부터 침전시킬 수 있다. 마지막으로, 바람직하게는 여과물을 수거하고, 적당한 조건하에서 침전제를 사용하여 플라스미드 DNA를 재침전시키고, 침전된 플라스미드 DNA를 TFF 여과 단계에 사용하기 위해 재현탁시킨다.

이 공정의 다음 단계는 상기 용액을 TFF 장치를 통해 여과하는 것이다. 이런 여과에 앞서, 플라스미드 DNA를 단쇄 고분자 알콜로 처리해서 TFF 막에 결합되지 않도록 처리할 수도 있다. TFF 공정의 도식적 다이아그램은 WO 98/05673의 도1에 있다. HP-TFF를 수행하는 시료 장치는 미국특허 출원번호 제5,256,294호의 도2, 도3 및 도4에 나타난다. 여과막은 예를들어 정화될 플라스미드 DNA의 크기와 형태에 기초하여 선택되고, 약 500 킬로 달튼(kD)보다 큰, 바람직하게는 약 500내지 1000 kD의 분자량 컷오프를 가질 것이다. 일반적으로, 본원의 TFF에 유용한 막은 가블러(Gabler)(상기참조)에 의해 설명된 바와 같다. 이 막은 전형적으로 세공여과(MF) 또는 한외여과(UF) 타입중 하나의 합성막이고, 역삼투압(RO) 타입은 보통 세공경범위의 협소함 때문에 적당치 않다.

MF 타입은 세공경이 보통 0.1 내지 10 마이크로미터이고, 평가된 크기보다 큰 모든 입자가 잔류되도록 할 수 있다. UF 막은 더 작은 세공을 가지며, 잔류할 구형 단백질의 크기에 의해 특성화된다. 그들은 약 0.001 내지 0.05 마이크로미터에 대응되는 1,000 내지 1,000,000 명목 분자량(달튼) 한계에서 증가적으로 이용가능하다. 보통 비대칭적이고 분리력을 감당하는 상류표면 위의 얇은 막 또는 외피 를 가진 UF 막이 본원 발명에서의 이용에 가장 적절하다.

본원 발명의 공정은 상업적 또는 반상업적 규모에서의 용도로서 응용될 수 있다. 이는 반-연속적으로 운영될 수 있는데, 즉, 목적하는 플라스미드 DNA를 포함하는 용액의 연속 흐름을 기초로 하여, 전체 대량 배치가 여과될 때까지 접선 흐름 필터를 통과하고, 목적하는 플라스미드 DNA로부터 오염물을 연속 흐름 분리하는 단계가 뒤따른다. 세척 단계가 여과 단계들 사이에 위치할 수 있다. 이어서 용액의 새로운 배치가 처리될 수 있다. 이러한 방법으로, 연속적 순환 공정을 수행하여 목적하는 생산물의 대량 생산을, 허용 가능한 순수한 형태로, 상대적으로 짧은 시간 안에 얻을 수 있다.

이러한 조건 하에서, 다량의 단백질, 세포막 파편, 탄수화물, 작게 분해된 뉴클레오티드 등을 포함하는 오염 물질들이 막을 통과하여 여과물에 존재하는 반면, 플라스미드 DNA는 잔류물 내에 남을 것이다. 여과 장치의 상업적 공급원으로는 팔-필트론(Pall-Filtron) (Northborough, MA), 밀리포어(Millipore) (Bedford, MA), 및 아미콘(Amicon) (Danvers, MA) 등이 있다. TFF를 수행하기에 유용한, 예를 들어, 평판 장치 (flat plate device), 나선 감김 카트리지 (spiral wound cartridge), 중공 섬유 (hollow fiber), 관형 또는 단일 시트 장치, 개방-채널 장치 등을 포함하는 임의의 여과 장치라도 본원에 적합하다.

사용되는 여과 막의 표면적은 정제될 DNA 플라스미드의 양에 의존할 것이다. 막은 흡착 손실을 최소화하기 위하여 저-결합성 물질 중의 하나이어야 하고, 바람직하게는 내구성, 세척성이 있고, 사용되는 완충액과 화학적으로 양립가능해야 한 다. 수많은 적합한 막이 상업적으로 이용 가능하고, 예로는, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 및 폴리비닐리덴 디플루오라이드를 포함한다. 바람직하게는, 막 재료는 폴리설폰 또는 폴리에테르설폰이다.

여과는 시료 완충액이 막 표면을 통과할 때 순환시키기 위하여 접선 흐름을 사용하여 수행된다. TFF 동안에, 막을 통하여 압력을 가하여, 잔류물은 재순환되는 반면, 더 작은 분자들은 막을 통과하는 것을 가능하게 한다. 통상적으로, 일정한 막횡단 압력을 유지하기 위하여 유속을 조절할 수 있다. 일반적으로, 더 높은 압력과 더 빠른 유속에서 여과가 더 빨리 진행될 것이지만, 빠른 유속은 핵산의 절단 또는 막 통과로 인한 손실을 야기할 수 있다. 또한, 다양한 TFF 장치는 그 작동에 있어서 어떠한 압력 한계를 갖을 수 있다. 그러므로 압력은 제조자의 설명에 따라 조정될 수 있다. 평판 장치에서는, 압력은 바람직하게는 약 5 내지 30 psi, 더욱 바람직하게는 10 내지 15 psi이다. 순환 펌프는 핵산의 최소 절단을 확보하도록 선택되어진다. 통상적으로, 순환 펌프는 공급 채널에서는 연동 펌프 또는 격막 펌프이고 압력은 잔류물 밸브를 조정함으로써 조절된다.

여과는 디아필트레이션 (diafiltration) 모드에서 행해진다. 임의로, 처음에 상기 시료 용액을 목적하는 부피로 농축될 때까지 완충액의 첨가 없이 여과시킬 수도 있다. 일단 농축되면, 디아필트레이션 완충액을 첨가하고, 여과를 계속하여 불순물인 작은 분자의 잔류물을 세척하고 목적하지 않는 용매와 염을 제거한다. 바람직하게는, 디아필트레이션을 계속하여, 약 5 내지 500 부피 당량이 교환될 때까지 수행한다. 일반적으로, 필요한 순도에 따라, 핵산에 결합한 증가된 불순물에 대해서 더 많은 디아필트레이션이 수행될 것이다.

TFF 후의 정제된 플라스미드 DNA의 산출량을 더욱 향상시키기 위하여, 임의로 수 분 동안 투과 밸브를 잠근 채로 여과 기기를 통하여 잔류물 용액을 재순환시켜 잔류하는 플라스미드 DNA를 제거할 수 있다. 잔류물을 수거하고 막 필터를 세척하기 위하여 추가적으로 디아필트레이션 완충액을 첨가한다. 잔류물을 다시 수거하여 정제된 플라스미드 DNA를 포함하는 처음의 잔류물과 합한다. 그 후, 공급 용액을 농축하고 TRIS^TM과 같은 완충액에 대하여 투석시켜 정제된 플라스미드 DNA를 얻을 수 있다.

본원에서 TFF 공정을 통해 정제된 플라스미드 DNA는 직접 사용하거나, 출발 시료의 오염의 정도 및 형태, 및 목적하는 용도에 따라 더욱 정제할 수 있다. 이렇게 정제된 플라스미드 DNA는 여러가지로 응용되어 사용되어질 수 있는데, 예를 들어, 클로닝 또는 유전자 발현과 같은 분자생물학적 응용, 또는 예를 들어, PCR, RT-PCR, 덴드로머(dendromer) 형성 등을 이용하는 진단적 응용이 있다. 치료적 용도, 예를 들어 유전자 치료에서, 또는 백신으로서 또는 유전자 면역법에 있어서의 용도를 위해서는, TFF 단계로부터 얻어진 플라스미드 DNA를 더욱 정제하는 것이 바람직할 것이다. 플라스미드 DNA를 더욱 정제하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

플라스미드 DNA가 컬럼으로부터 용출되는 농도 미만의 염 농도를 포함하는 로딩 완충액 중에서 플라스미드 DNA 시료를 컬럼에 로딩한다. 통상적으로, 염농도 는 사용된 수지에 따라 약 10 내지 50mS이다. 강한 음이온 교환 수지의 경우에는 높은 전도율의 용액이 사용되는 반면, 약한 음이온 교환 수지의 경우에는 낮은 전도율의 용액이 사용된다. 그 후 수지에 약하게 결합된 물질들을 제거하기 위하여 컬럼 부피의 수 배의 완충액으로 컬럼을 세척한다. 그 후, 예를 들어, 1.5M 이하의 NaCl Tris-HCl 완충액을 사용하는 것과 같은 전통적인 방법에 따라 낮은 연속적 식염수 농도구배를 이용하여 컬럼으로부터 분획을 용출시킨다. 컬럼으로부터 시료 분획을 수거한다. 중간-규모의 제조(예를 들어, 약 100 mg 내지 약 3 g의 플라스미드 DNA)를 위하여는, 분획은 플라스미드 DNA 피크가 기대될 때에는 통상적으로 최소 50 ml 내지 2 리터로 하고, 기대되는 피크 후에는 양을 늘린다. 각 분획마다 플리스미드 DNA 산출량 및 순도의 분석적 측정을 수행한다. 또한, 각 분획에 잔류하는 엔도톡신 수준을 결정하기 위하여 각 분획마다 리물루스 아메보사이트 용해물(Limulus ameobocyte lysate, LAL) 분석을 실시할 수 있다. 높은 수준의 플라스미드 DNA와 낮은 엔도톡신을 포함하는 분획들을 합한다.

상기 프로토콜을 따라 정제된 플라스미드 DNA를 유전자 치료에 사용하기 위하여 지질 담체와 복합하고자 하는 경우, 바람직하게는 디아필트레이션에 의해, 플라스미드 DNA를 낮은 전도율의 완충액으로 교환하는 것이 바람직하다. 낮은 전도율의 완충액은 약 10 mS 미만, 바람직하게는 약 1 mS 미만의 완충액을 포함하는 것을 의미한다.

상기 프로토콜의 다양한 시점에서, 플리스미드 DNA 산출량과 순도의 분석적 측정이 유리하게 실시된다. 통상적으로, 예를 들어, 조제용 이온 교환 크로마토그 래피로부터의 각 핵산 포함 분획에 대해서는 물론 각 정제 단계의 이전 및 이후에 그러한 분석이 실시된다. 이러한 분석적 측정을 실시하는 바람직한 방법은, 순도에 대해서는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 크기-배제 크로마토그래피(SEC), 산출량에 대해서는 분광학적 측정법, 단백질 분석을 위해서는 실버 스테이닝(silver staining) 및 SDS-PAGE, DNA 분석을 위하여는 아가로스 겔 전기영동법 및 서던 블로팅(Southern blotting)을 포함한다. 본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나, 그것이 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 언급된 모든 문헌과 특허는 명시적으로 참고로 삽입되었다.

[실시예 1]

재료 및 방법

팩터(factor) VIII 세포 페이스트의 생성

팩터 VIII 플라스미드의 정제를 위하여, 팩터 VIII (미국 특허 번호 제5,618,788호 및 제5,633,150호)에 대한 유전자로 형질전환된 E. coli를 10 L 배양기 내에서 배양하고 플라스미드 DNA의 생산을 최대화하기 위하여 시클로헥시미드(cycloheximide)로 처리하였다.

E.coli 의 형질전환 및 밤샘 배양

팩터 VIII 이외의 플라스미드의 정제를 위해서는, 형질전환 가능한 E. coli (DH5a) 세포 (Gibco-BRL)를 앰피실린-내성 (Amp^R) 플라스미드의 증폭에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 밤샘 배양된 콜로니를 카베니실린 (50 mg/mL)을 첨가한 LB 배지에서 증식시켰다.

E. coli 의 염기성 용해

E. coli의 염기성 용해는 번보임(Birnboim) 및 돌리(Doly) [상기참조]의 방법에 기초하여 하기에 명시된 대로 개조하여 실시하였다. E. coli 세포를 세포 그램당(습윤 중량) pH 8의 50 mM 글루코오스/25 mM Tris-HCl/10 mM EDTA (GTE) 8 mL에 현탁시켰다. 이어서, 리소자임 용액 (2 mg/mL in GTE) (Canadian Lysozyme Company, Abbotsford, British Columbia) 총 0.8 mL를 첨가하였고, 섞은 후에 세포를 30 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 세포 그램당 0.2 M NaOH 및 1 % SDS (또는 표시된 바와 같은 다른 계면활성제)를 포함하는 용액 총 16 mL를 혼합액에 첨가하였고, 상온에서, 천천히 연속 교반하면서 밤새 (또는 표시된 바와 같이) 인큐베이션하였다. 세포 그램당 pH 4.8인 5 M 아세트산 칼륨 총 12 mL를 첨가하였고, 섞은 후, 혼합액을 얼음조에 두었다. 인큐베이션 10 분 후, 혼합액을 13,000 x g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상층을 수거하고 수 층의 MIRACLOTH^TM재료 (Calbiochem-Novabiochem Corporation, San Diego, CA)를 통과하도록 부음으로써 정화하였다.

TFF를 사용한 플라스미드 정제

상기에 기재된 E. coli로부터 단리된 플라스미드 DNA를 처리될 세포 10-15 g 당 0.5 평방 피트 (464.5 ㎠)의 폴리에테르설폰 막을 사용하는 TFF 장치 (TFF 막 카세트 및 카세트 홀더는 메릴랜드주, Northborough의 Pall Filtron Corporation으로부터 구입하였음) 내에서 정제하였다. 막의 명목 분자량 컷오프는 500 또는 1000 kDa이었다. TFF 장치 내로의 공급 속도는 0.5 리터/분/제곱피트 막 (0.0005 리터/분/㎠ 막)으로 맞추었다. 실험에 의하면 여과물에 있어서의 처음의 산출량 손실을 최소화하기 위하여, 한외여과 막은 한외여과를 시작하기 전에 정상 작동 상태 하에서 정화된 상청액과 15-20분의 평형을 필요로 한다는 것을 알 수 있었다. 모든 실험은 일정한 막횡단 압력 (TMP)를 유지하면서 수행되었다. 수개의 실험에서, 바람직한 TMP는 대략 10-15 psi라는 것이 결정되었다. 이러한 상태 하에서는, 여과 유속은 대략 1.5 리터/시간/제곱피트 막 (0.0016 리터/시간/㎠ 막)이었다. 플라스미드의 정제를 위하여, 공급용액을 두배로 농축하였고, 이어서 8-10 디아볼륨(diavolume)의 pH 7.6인 20 mM Tris-HCl에 대하여 투석시켰다.

염화세슘 밀도 구배 원심분리

염화세슘 구배를 사용한 플라스미드의 단리는 클레웰(Clewell) 및 헬린스키(Helinski) [상기참조], 및 밀러(Miler) [Meth. Enzymol., 152: 145-170 (Berger and Kimmel, eds) (Academic Press: San Diego, CA, 1987)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

크기-배제 분석 (Size-Exclusion Assay)

pH 7.5의 20 mM Tris-HCl로 평형화시킨 TSK-G5000PW^TM 컬럼 (7.5 x 300 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA)에 시료 100 ㎕를 주입하여 분석하였다. 컬럼은 1 ml/min의 유속으로 작동시켰다. 컬럼 용출액은 206 nm에서의 흡광도로 모니터하였다. 플라스미드에 대한 용출 부피는 염화세슘 법에 의해 단리된 표준시료의 용출 부피와 비교하였다.

293 세포의 트랜스팩션 및 팩터 VIII 활성에 대한 분석

본원에서 정제된 플라스미드를 10 % 열-불활성화된 소 태아 혈청을 함유하는 PS19 배지에서 유지된 293 사람 배아 신장 세포 내로 트랜스팩트시켰다. 리포펙틴 (lipofectin) 시약 (BRL, Gaithersburg, MD) 및 제조자의 지시에 따라 복합체당 1 ㎍의 플라스미드 DNA를 사용하여 지질/DNA 트랜스팩션 복합체를 형성하였다. 이어서 이 혼합액을 35-mm 웰 (6-웰 플레이트) 내의 세포에 첨가하고 배지를 첨가하였다. 트랜스팩션 24 시간 후에, 배지를 수거하여, 제조자의 지시에 따라, 팩터 VIII에 대하여는 ELISA 분석에 의하여, 팩터 VIII 활성에 대하여는 COATEST VIII:C/4^TM 키트 (Chromogenix AB, Moelndal, Sweden)를 사용하여 분석하였다.

단백질 측정

단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준시료로 사용하는 브래드포드 법 (Bradford, Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976))에 의하여 측정하였다.

결과:

플라스미드 분리 및 정제에 영향을 미치는 인자들

수개의 다른 형태의 음이온, 양이온, 및 비이온 계면활성제를 리소자임 분해 후에 가용성 플라스미드를 생성하는 능력에 대하여 분석하였다. 하나의 분류로서, 음이온 계면활성제는 플라스미드 방출에 가장 효과적이었다. 또한, 음이온 계면활성제로 제조한 플라스미드 제조물의 EcoR1 (New England Biolabs, Beverly, MA)을 이용한 제한효소 절단실험은 오염된 게놈 DNA가 존재하지 않음을 나타냈다. 최종적으로, 하나의 분류로서, 음이온 계면활성제는 엔도톡신이 훨씬 적은 용해된 플라스미드 제조물을 생산하는 것으로 밝혀졌다 (표1).

팩터 VIII 플라스미드의 가용화에 사용된 상이한 계면활성제가 엔도톡신 수준에 미치는 효과

계면활성제	엔도톡신 (EU/ml)	n
음이온성:
SDS	28,000	5
콜린산	220,000	3
데옥시콜린산	18,000	2
비이온성, 양성이온성:
TRITON X-100^TM	2,600,000	3
TRITON X-114^TM	100,000	1
TWEEN 20^TM	600,000	1
TWEEN 80^TM	140,000	3
BRIJ 35^TM	1,000,000	1
NONIDET NP-40^TM	840,000	3
W-1^TM	2,700,000	2
ZWITTERGENT 3-14^TM	3,000,000	1
양이온성:
염화벤질알코늄	2,500,000	2
브롬화도데실트리메칠암모늄	1,300,000	2
브롬화테드라데실트리메칠암모늄	1,000,000	1
브롬화헥사데실트리메칠암모늄	1,000,000	1

2 개의 상이한 음이온 계면활성제의 존재 하에서 수산화나트륨에 노출시키는 시간 증가의 효과를 조사하였다. 인큐베이션 시간의 증가는 불순물인 RNA의 전체 크기 및 양 모두에 있어서 명백한 시간 의존적 감소를 나타내었다. 인큐베이션 24 시간 경과 후에 SDS-가용화 및 콜린산-가용화된 제조물에서 RNA는 거의 발견되지 않았다. 하나의 이론에 국한되지 않고, 염기성 상태에의 노출을 연장한 후에는, TFF에 의하여 RNA 및 다른 저분자량 불순물 (예를 들어, 단백질, 엔도톡신)로부터 플라스미드 DNA의 정제가 가능할 수 있도록 불순물인 RNA가 충분히 분해될 것이라고 믿어진다. 정제의 최대화를 위해서는, 플라스미드가 여전히 잔류하는 최대 막 세공경을 선택한다. 500,000 및 1,000,000 Da 명목 분자량 컷오프 막 둘다는 이 요구를 만족한다. 수산화나트륨 및 SDS에 4 시간 및 24 시간 동안 노출시킨 플라스미드를 사용하는 최초의 실험에서 TFF에 의한 RNA의 제거를 위하여는 24 시간 노출이 더 적합하다는 것을 알 수 있었다.

정제된 팩터 VIII 플라스미드의 특성 조사

4 시간 또는 24 시간 수산화나트륨/SDS 인큐베이션 후 UF/DF 정제를 거쳐 상기한 바와 같이 분리된 플라스미드는, 아가로스 겔 상에서 비교될 때 표준 CsCl 농도구배 기술을 사용하여 제조된 플라스미드와 비교할 수 있었다. 플라스미드 제조에서 공동-정제하는 RNA의 양은 크기-배제 크로마토그래피 분석법을 사용하여 평가되었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 99 % 이상의 불순물 RNA가 여과 단계에 의해 제거되었다. 결과적인 TFF 풀에서 단백질 농도는 10 내지 30 ㎍/ml의 범위였고, 이는 아세트산 칼륨 상청액 내에 존재하는 총 단백질의 95 % 이상의 감소를 구성한다. 5 개의 분리 제조물 중에서, 팩터 VIII 플라스미드의 산출량은 2.2 ±0.8 mg 플라스미드/g 세포 (습윤 중량)였다. 엔도톡신 수준은 평균하여 2400 ±1700 EU/ml (n=3)였다.

TFF 방법에 의하여 정제된 플라스미드의 활성

팩터 VIII에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 TFF 방법에 의하여 단리하였고, 239-HEK 세포를 트랜스팩트시키는 활성에 대하여 전통적인 CsCl 과정 (Miller, 상기참조)에 의하여 단리된 동일한 플라스미드와 비교하였다. 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이, 개질된 염기성-용해 및 본원의 TFF 과정을 사용하여 단리된 플라스미드 DNA는 CsCl 농도구배를 사용하여 단리된 플라스미드에 필적하는 활성을 보였다.

TFF 및 CsCl로 정제된 팩터 VIII 플라스미드의 발현 수준 비교

플라스미드	팩터 VIII (ELISA) (mU/ml)	팩터 VIII 활성 (mU/ml)
TFF로 정제된 것 (NaOH 인큐베이션 4 시간)	4.0	11.1
TFF로 정제된 것 (NaOH 인큐베이션 24 시간)	3.8	9.9
CsCl (발효기)	2.6	6.3
CsCl (교반 플라스크)	8.6	14.7

다양한 플라스미드에 본원 공정의 적용

TFF 방법의 유용성은, E.coli 내로 형질도입 되었고 교반 플라스크 내에서 밤새 배양된 6 개의 다양한 크기의 상이한 플라스미드에 대한 과정을 사용하여 평가되었다. 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 회수되는 플라스미드의 크기에 관계없이, 각 제조물은 세포 그램 당 (습윤 중량) 최소 2 mg의 정제된 플라스미드를 나타내었다.

상이한 플라스미드를 사용한 TFF에 기초한 플라스미드 단리

플라스미드 크기 (kb)	질량 (kDa)	회수 (mg 플라스미드)	수득량 (mg 플라스미드/g 세포 펠렛)
5.6	3,600	31	2.8
5.8	3,700	29	2.6
6.0	3,900	20	2.0
6.2	4,000	22	2.2
7.9	5,100	72	7.3
10.0	10,000	측정되지 않음	2.2

결론

본원에 기재된 것은 연장된 (약 4 - 24 시간) 용해/가용화 단계에 이어 TFF 를 사용한 정제 단계에 기초를 둔, 대량의 트랜스팩션 가능한 플라스미드를 정제하는 간단하고, 스케일-업 가능한 방법이다. 이 방법은 밤샘 배양물 리터당 7 - 20 mg의 플라스미드를 생산하는데, 이는 과거에 보고된 값보다 (Ishaq et al., 상기참조; Kondo et al., 상기참조; Chakrabarti et al., 상기참조; Chandra et al., 상기참조; Miller, 상기참조) 수 배 더 높은 것이다. 또한, 이 과정을 사용하여 단리된 플라스미드는 세포 트랜스팩션 분석에서 고전적인 방법을 사용하여 단리된 플라스미드에 필적할 만한 활성을 보였다.

TFF 방법을 사용하여 관찰된 엔도톡신의 수준은 다른 별도 정제 방법 (Miller, 상기참조)을 사용하여 보고된 수준보다 더 높았다. 그러나, 과거의 관찰과는 반대로 (Cotten et al., Gene Ther., 1:239-246 (1994); Weber et al., Biotechniques, 19: 930-940 (1995)), 이러한 엔도톡신의 수준은 플라스미드가 세포를 트랜스팩트시키고 단백질을 발현시키는 능력에 불리하게 영향을 미치지는 않았다. 더욱이, 이러한 엔도톡신의 수준은 이온-교환 크로마토그래피 같은 추가적 정제에 의하여 필요하다면 충분히 제거될 수 있다.

본원에 기재된 TFF에 기초한 정제 방법은 TFF 스케일-업의 표준 원리를 이용 하여 쉽게 스케일-업 가능하다. 최종적으로, 이 방법의 광범위 응용가능성은 다양한 분자량의 수개의 상이한 플라스미드에 대한 효과적인 수행에 의하여 증명되었다.

Claims

(a) 세포를 분해하는 단계;

(b) 세포를 염기 및 계면활성제의 존재 하에서 4 내지 24 시간 동안 인큐베이션하여 세포를 용해 및 가용화시키는 단계;

(c) 용해 불순물을 세포로부터 제거하여 플라스미드 DNA 용액을 제공하는 단계;

(d) 접선 흐름 여과 장치를 통과하여 상기 용액을 여과시켜 플라스미드 DNA를 함유하는 잔류물을 얻는 단계; 및

(e) 잔류물을 수거하는 단계를 포함하며, 상기 어떠한 단계에서도 RNA를 분해하기 위하여 효소가 사용되지 않는, 플라스미드 DNA를 이를 포함하는 원핵세포로부터 정제하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 E. coli 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 2 내지 50 킬로베이스의 크기 범위인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계는 리소자임을 사용하여 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계는 10 내지 24 시간 동안 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계는 20 내지 24 시간 동안 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 계면활성제는 이온성인 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 계면활성제는 음이온성인 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트, 콜린산, 또는 데옥시콜린산인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계는 용해 불순물을 플라스미드 DNA로부터 원심분리시켜, 상청액으로서 플라스미드 DNA 용액을 제공함으로써 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 여과 장치는 500 kD 초과의 분자량 컷오프인 막을 갖는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 잔류물로부터 플라스미드 DNA를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 잔류물을 완충액에 대하여 투석하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 잔류물을 이온-교환 크로마토그래피시키는 단계를 더 포함하는 방법.
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