CN107873055B - 包括至少一个切向流过滤步骤的产生和纯化rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及产生和纯化RNA的方法,包括以下步骤:提供编码RNA的DNA;将DNA转录成RNA;和通过一个或多个切向流过滤(TFF)步骤调节和/或纯化包含转录出的RNA的溶液。
Description
技术领域
本发明涉及用于产生和纯化RNA的切向流过滤(TFF)的方法。
背景技术
RNA正在成为各种制药应用的创新候选物,但高效纯化仍然是一个挑战。这部分是由于样品中不同类型的不需要的污染物及其组合,这些需要从所需的RNA物质中分离出来以获得纯的RNA样品。这样的污染物通常是任何上游过程例如RNA制造的成分和副产物。其中体外转录用于制造大RNA,在成功转录后,样品通常含有所需的RNA种类以及各种污染物,例如不需要的RNA种类、蛋白质、亚精胺、DNA或其片段、焦磷酸盐、游离的核苷酸、内毒素、洗涤剂和有机溶剂。
商业的下游应用(例如作为药物组合物和/或疫苗的制剂和用途)造成进一步对RNA的任何纯化方法的限制,RNA的纯化方法需要(i)高纯度同时保持RNA稳定性和功能性;(ii)与用于体内递送的RNA的任何制剂要求的相容性;和(iii)遵守良好的生产规范。此外,为了便于工业应用,任何RNA纯化方法必须能够实现一致的、成本和时间有效的操作(例如快速、简单、可重现、大规模高产量纯化)。
RNA沉淀允许样品浓缩以及污染的高分子量污染物和低分子量污染物(例如分别为蛋白质和亚精胺)的消耗。然而,沉淀不是大规模生产过程中选择的方法,因为核酸的沉淀和重新溶解是耗时的。此外,在大规模(良好)制造过程中应避免使用醇和其它有机溶剂。
用于纯化RNA的方法是本领域已知的。Pascolo等人(Methods Mol Med 2006;127:23-40)描述了用于以分析规模从体外转录反应样品中纯化mRNA的方法(在20μl样品体积中纯化25μg RNA)。该方法涉及DNA酶处理,然后用氯化锂沉淀更长的mRNA。然而,作者报告说,这种方法不提供高纯度的RNA,因为它不能完全除去例如DNA和蛋白质等的污染物。此外,该方法涉及使用有机溶剂,费时费力,涉及多达36个步骤,需要在不同条件下进行大量的手工样品处理,包括至少一个过夜孵育步骤。因此,虽然该方法可以满足研究和实验室规模的RNA纯化的要求,但RNA纯度低,重复性差,不适合在工业过程中实现商业规模的药物级RNA的纯化。
WO2008/077592公开了利用多孔反相固定相的离子对反相HPLC用于制备级规模纯化RNA的方法。据报道,利用特定的多孔固定相的一个特别的优点是可以避免过高的压力,促进RNA的制备级纯化。
WO2014/140211公开了用于从样品中纯化大RNA的方法,包括切向流过滤、羟基磷灰石色谱、芯珠流通色谱或其任何组合的步骤。还公开了优选的是,除了缓冲盐以外,没有将盐添加到用于切向流过滤的缓冲液中。切向流过滤利用中空纤维膜进行。然而,所描述的膜的核酸负载量非常低,因此需要巨大的膜面积用于mRNA的大规模生产(g至kg)。
WO2014/152966公开了用于纯化体外转录的RNA的方法,其中在RNA体外转录之后,反应混合物用蛋白质变性剂例如尿素处理,然后利用中空纤维膜进行切向流过滤。
仍然需要进一步的RNA纯化方法,特别是那些实现了以工业规模进行的具有高产量和药物级纯度、稳定性和/或保存期限的成本和时间有效的RNA纯化的方法。
因此,本发明的目的是提供适用于大规模RNA制备的进一步的RNA产生和纯化方法。
发明内容
该目的通过用于产生和纯化RNA的方法来解决,该方法包括以下步骤
A)提供编码RNA的DNA;
B)转录DNA以产生包含转录出的RNA的溶液;和
C)通过一个或多个切向流过滤(TFF)步骤调节和/或纯化包含转录出的RNA的溶液。
定义:
为了清楚性和可读性的目的,提供了以下定义。在本发明的各个和每个实施方案中可以阅读这些定义中提到的任何技术特征。附加定义和解释可以在这些实施方案的上下文中具体提供。
酶:酶是进行生物化学反应如DNA依赖性RNA转录(例如RNA聚合酶)或双链DNA消化(例如限制性核酸内切酶)的催化活性的生物分子。酶通常由氨基酸和/或RNA(核酶,snRNA)组成。
限制性核酸内切酶:限制性核酸内切酶或限制性内切酶是一类在细菌和一些病毒中天然存在的酶。限制性核酸内切酶可以在实验室中使用,用于将DNA分子切割成用于分子克隆和基因表征的更小的片段。限制酶特异性地结合并在被称为识别位点的特定序列内或附近的特定位点处切割双链DNA。大多数限制酶识别长度为四、五或六个核苷酸的特定核苷酸序列,并显示双重对称。有的完全在对称轴上切割两条链,产生带有平末端的DNA片段;其它在对称轴对侧的相似位置处切割每条链,产生携带单链末端(粘性末端)的DNA片段。基于它们的组成和酶辅因子要求、它们的靶序列的性质以及它们的DNA切割位点相对于靶序列的位置,将限制性核酸内切酶分为四类(I、II、III和IV类)。所有类型的酶识别特异性的短DNA序列并进行DNA的切割,产生具有末端5'-磷酸酯的特异性片段。限制性核酸内切酶识别和结合DNA分子上特定的核苷酸序列(“识别位点”)。一旦结合,它们在识别序列之内(例如BamHI)、在识别序列的一侧(例如SapI)或识别序列的两侧(例如TspRI)切割分子。特别优选的是使用以下的限制酶:BciVI(BfuI)、BcuI(SpeI)、EcoRI、AatII、AgeI(BshTI)、ApaI、BamHI、BglII、BlpI(Bpu1102I)、BsrGI(Bsp1407)、ClaI(Bsu15I)、EcoRI、EcoRV(Eco32I)、HindIII、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、Mph1103I)、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、ScaI、SpeI、XbaI、XhoI、SacII(Cfr421)、XbaI。限制酶识别短DNA序列并在这些序列内或附近的特定位点处切割双链DNA。已经发现了约3,000种限制酶,识别超过230种不同的DNA序列。它们大部分在细菌中被发现,但也已经从病毒、古细菌和真核生物中分离出来。已知的限制酶的列表可以在rebase数据库中找到:http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html。
限制性位点:限制性位点,也被称为限制酶识别位点,是由限制酶识别的核苷酸序列。限制性位点通常是短的、优选回文的核苷酸序列,例如包含4至8个核苷酸的序列。限制性位点优选被限制酶特异性识别。限制酶通常在该位点切割包含限制性位点的核苷酸序列。在双链核苷酸序列如双链DNA序列中,限制酶通常切割核苷酸序列的两条链。大多数限制性核酸内切酶识别回文的或部分回文的位点。回文被定义为围绕轴的双重对称。例如,EcoRI消化产生“粘性”末端,而SmaI限制酶切割产生“平”末端。对于每种限制酶,DNA中的识别序列是不同的,从而在限制酶的粘性末端“突出端”的长度、序列和链取向(5'末端或3'末端)上产生差异。识别相同序列的不同限制酶已知为新裂酶(neoschizomers)。这些通常在序列的不同区域切割。在同一位置识别和切割的不同酶被称为同裂酶。
蛋白质:蛋白质通常包括一种或多种肽或多肽。蛋白质通常被折叠成三维形式,这可能是蛋白质发挥其生物学功能所需要的。蛋白质或肽的序列通常被理解为顺序(即连续)的其氨基酸。
重组蛋白:术语“重组蛋白”是指在异源系统(即天然地不产生这种蛋白质或这种蛋白质的变体的生物体)中产生的蛋白质。或者,生物体可以天然地产生蛋白质,但量较低,从而重组表达增加了所述蛋白质的量。通常,本领域中用于产生重组蛋白的异源系统是细菌(例如,大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母(例如,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))或某些哺乳动物细胞培养系。
质粒DNA(载体):术语“质粒DNA”或“质粒DNA载体”是指环状核酸分子,优选指人工的核酸分子。本发明上下文中的质粒DNA适用于并入或携带所需的核酸序列,例如包含编码RNA的序列和/或编码至少一种肽或多肽的开放阅读框的核酸序列。这样的质粒DNA构建体/载体可以是存储载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。存储载体是允许方便地存储核酸分子例如RNA分子的载体。因此,质粒DNA可以包含对应于(编码)例如所需的RNA序列或其部分序列,例如对应于mRNA的开放阅读框和5'和/或3'UTR的序列。表达载体可用于在称为RNA体外转录的过程中产生表达产物,例如RNA,诸如mRNA。例如,表达载体可以包含对载体的序列片段进行RNA体外转录所需的序列,例如启动子序列,例如RNA启动子序列,优选T3、T7或SP6RNA启动子序列。克隆载体通常是含有可以用于将核酸序列并入(插入)载体中的克隆位点的载体。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合于将核酸分子转移到细胞或生物中的载体,例如病毒载体。优选地,本发明含义的质粒DNA载体包含多克隆位点、RNA启动子序列、任选的选择标记例如抗生素抗性因子、以及适合于载体复制的序列,例如复制起点。在本发明的上下文中特别优选的是质粒DNA载体或表达载体,包含DNA依赖性RNA聚合酶如T3、T7和Sp6的启动子。作为质粒骨架,特别优选的是pUC19和pBR322。
模板DNA:如本文所用,术语“模板DNA”(或“DNA模板”)通常涉及包含编码待体外转录的RNA序列的核酸序列的DNA分子。模板DNA被用作体外转录的模板以产生由模板DNA编码的RNA。因此,模板DNA包含体外转录所必需的所有元件,特别是用于结合DNA依赖性RNA聚合酶(例如T3、T7和SP6RNA聚合酶)的启动子元件,作为编码靶RNA序列的DNA序列的5'端。此外,模板DNA可以包含编码靶RNA序列的DNA序列的5'和/或3'的引物结合位点,以例如通过PCR或DNA测序确定编码靶RNA序列的DNA序列的同一性。如本文所用,术语“模板DNA”还可以指包含编码RNA序列的核酸序列的DNA载体,例如质粒DNA。此外,本发明上下文中的“模板DNA”可以是线性的或环状的DNA分子。
靶序列:本文使用的“靶序列”通常理解为由模板DNA中包含的核酸序列编码的RNA序列。靶序列因此是通过体外转录合成的序列,例如,蛋白质编码序列或本文定义的另一种RNA,如isRNA、反义RNA等
线性模板DNA质粒:通过在合适的条件下使质粒DNA与限制酶接触,使限制酶在其识别位点切割质粒DNA并破坏质粒结构而获得线性模板DNA质粒。这个反应被称为线性化反应。因此,线性模板DNA包含彼此不相连的游离5'末端和游离3'末端。如果质粒DNA仅含有一个限制酶的识别位点,则线性模板DNA与质粒DNA具有相同数量的核苷酸。如果质粒DNA含有多于一个限制酶的识别位点,则线性模板DNA具有比质粒DNA少的核苷酸数量。线性模板DNA是质粒DNA的片段,质粒DNA含有RNA体外转录所必需的元件,即RNA转录的启动子元件和模板DNA元件。编码线性模板DNA的靶RNA序列的DNA序列通过碱基配对的规则来确定转录出的RNA的序列。
5'-帽子:5'-帽子是实体,通常是经过修饰的核苷酸实体,其通常给成熟mRNA的5'末端“加帽”。5'-帽子通常可以由经过修饰的核苷酸(帽子类似物)形成,特别是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地,5'-帽子通过5'-5'-三磷酸键与5'-末端连接。5'-帽子可以是甲基化的,例如m7GpppN(例如m7G(5')ppp(5')G(m7G)),其中N是携带5'-帽子的核酸的末端5'核苷酸,通常是RNA的5'-末端。5'帽子结构的其它示例包括甘油基、反式脱氧脱碱残基(部分)、4',5'亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤式呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经过修饰的碱基核苷酸、苏式戊呋喃糖基核苷酸、非环3',4'-断核苷酸、非环3,4-二羟基丁基核苷酸、非环3,5-二羟基戊基核苷酸、3'-3'-反式核苷酸部分、3'-3'-反式脱碱基部分、3'-2'-反式核苷酸部分、3'-2'-反式脱碱基部分、1,4-丁二醇磷酸、3'-磷酰胺、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3'-磷酸、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或桥连或非桥连的甲基膦酸酯部分。可以在本发明上下文中使用的其它经过修饰的5'-帽子结构是CAP1(m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的甲基化)、CAP2(m7GpppN下游的第二个核苷酸的核糖的甲基化)、CAP3(m7GpppN下游的第三个核苷酸的核糖的甲基化)、CAP4(m7GpppN下游的第四个核苷酸的核糖的甲基化)、ARCA(抗反向CAP类似物)、经过修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮-鸟苷。
聚(A)序列:聚(A)序列,也称为聚(A)尾或3'-聚(A)尾,通常被理解为腺嘌呤核苷酸序列,例如多达约400个腺嘌呤核苷酸,例如约20个至约400个、优选约50个至约400个、更优选约50个至约300个,甚至更优选约50个至约250个、最优选约60个至约250个腺嘌呤核苷酸。聚(A)序列通常位于mRNA的3'末端。在本发明的上下文中,聚(A)序列可以位于mRNA或任何其它核酸分子内,例如,如位于载体中,诸如,位于用作为用于例如通过转录载体而产生RNA(优选mRNA)模板的载体中。
RNA,mRNA:RNA是核糖核酸的常规缩写。它是核酸分子,即由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是沿着所谓的骨架彼此连接的腺苷-单磷酸单体、尿苷-单磷酸单体、鸟苷-单磷酸单体和胞苷-单磷酸单体。骨架由第一单体的糖(即核糖)与第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。特定顺序的单体,即连接到糖/磷酸骨架上的碱基的顺序被称为RNA-序列。通常地,RNA是通过例如在细胞内转录DNA序列能够获得的。在真核细胞中,通常在细胞核或线粒体内进行转录。在体内,DNA的转录通常产生所谓的未成熟RNA,其需要被加工成所谓的信使-RNA,通常缩写为mRNA。对未成熟的RNA的加工(例如在真核生物中)包含多种不同的转录后修饰,例如剪接、5'-加帽、聚腺苷酸化、从细胞核或线粒体输出等。这些过程的总和也被称为RNA的成熟化。成熟的信使RNA通常提供可以被翻译成特定肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。通常,成熟的mRNA包含5'-帽子、任选的5'UTR、开放阅读框、任选的3'UTR和聚(A)序列。除了信使RNA之外,还存在可能参与转录和/或翻译的调节以及免疫刺激的几种非编码类型的RNA。术语“RNA”还包括其它编码RNA分子,例如病毒RNA、逆转录病毒RNA和复制子RNA、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、CRISPR RNA、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激RNA、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)和与Piwi相互作用的RNA(piRNA)。
5'-非翻译区(5'-UTR):如本文所用,术语“5'-UTR”通常指信使RNA(mRNA)的特定部分。它位于mRNA的开放阅读框的5'处。通常,5'-UTR从转录起始位点开始,并在开放阅读框的起始密码子之前的一个核苷酸处结束。5'-UTR可以包含用于控制基因表达的元件,也称为调控元件。这样的调控元件可以是,例如,核糖体结合位点或5'-末端寡聚嘧啶序列。5'-UTR可以是经过转录后修饰的,例如通过添加5'-帽子。在本发明的上下文中,5'-UTR对应于位于5'-帽子和起始密码子之间的成熟mRNA的序列。优选地,5'-UTR对应于从位于5'-帽子的3'的核苷酸(优选从位于5’-帽子的3'后紧接的核苷酸)延伸至位于蛋白编码区的起始密码子5'的核苷酸(优选延伸至蛋白编码区的起始密码子的5'后紧接的核苷酸)的序列。位于成熟mRNA的5'-帽子的3'后紧接的核苷酸通常对应于转录起始位点。术语“对应于”指的是5'-UTR序列可以是RNA序列(例如在用于定义5'-UTR序列的mRNA序列中),或者是对应于这种RNA序列的DNA序列。在本发明的上下文中,术语“基因的5'-UTR”,例如“TOP基因的5'-UTR”,是对应于来源于该基因的成熟mRNA(即通过基因的转录和未成熟mRNA的成熟化而获得的mRNA)的5'-UTR的序列。术语“基因的5'-UTR”包含5'-UTR的DNA序列和RNA序列。优选地,根据本发明使用的5'-UTR与mRNA序列的编码区是异源的。即使来自天然存在的基因的5'-UTR是优选的,但是在本发明的上下文中也可以使用合成的工程化UTR。
3'-非翻译区(3'-UTR):在本发明的上下文中,3'-UTR通常是mRNA的一部分,其位于蛋白编码区(即开放阅读框)和mRNA的3'-末端之间。mRNA的3'-UTR不被翻译成氨基酸序列。3'-UTR序列一般由基因编码,其在基因表达过程中被转录成各自的mRNA。在本发明的上下文中,3'-UTR对应于成熟mRNA的序列,其位于蛋白编码区的终止密码子的3'处,优选紧接蛋白编码区的终止密码子的3'处,并且其延伸至mRNA3'末端的5'侧或聚(A)序列3'末端的5'侧,优选延伸至紧接聚(A)序列3'末端的5'侧。术语“对应于”指的是3'-UTR序列可以是RNA序列(例如在用于定义3'-UTR序列的mRNA序列中),或者是对应于这种RNA序列的DNA序列。在本发明的上下文中,术语“基因的3'-UTR”,例如“白蛋白基因的3'-UTR”,是对应于来源于该基因的成熟mRNA(即通过基因的转录和未成熟mRNA的成熟化而获得的mRNA)的3'-UTR的序列。术语“基因的3'-UTR”包含3'-UTR的DNA序列和RNA序列。优选地,根据本发明使用的3'-UTR与mRNA序列的编码区是异源的。即使来自天然存在的基因的3'-UTR是优选的,但是在本发明的上下文中也可以使用合成的工程化UTR。
体外转录出的RNA:体外转录出的RNA是从模板DNA合成出的RNA分子,模板DNA通常是线性化且经过纯化的质粒模板DNA、PCR产物或寡核苷酸。RNA合成在由DNA依赖性RNA聚合酶催化的无细胞(“体外”)试验中发生。在称为RNA体外转录的过程中,实际上所有的核苷酸都类似于RNA。DNA依赖性RNA聚合酶的具体示例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。体外转录出的RNA可以包含诸如5'-帽子、任选的5'UTR、开放阅读框、任选的3'UTR和聚(A)序列的元件。除了蛋白质信使RNA之外,还存在可参与调控转录和/或翻译的几种非编码类型的RNA。本文所定义的这种所有RNA分子也可以通过RNA体外转录合成。
RNA种类:术语“RNA种类”表示在其RNA序列和/或其序列长度上相似的一组相同的RNA分子。因此,一个RNA种类内的RNA分子是由相同的模板DNA编码的。如果样品中存在的RNA是编码RNA,则一个RNA种类编码一个靶肽或蛋白质。
DNA:DNA是脱氧核糖核酸的常规缩写。它是核酸分子,即由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是脱氧-腺苷-单磷酸单体、脱氧-胸苷-单磷酸单体、脱氧-鸟苷-单磷酸单体和脱氧-胞苷-单磷酸单体,它们本身由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分和磷酸部分组成,并通过特有的骨架结构聚合。骨架结构通常由第一单体的核苷酸的糖部分(即脱氧核糖)与第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序,即连接到糖/磷酸骨架上的碱基的顺序被称为DNA序列。DNA可以是单链的或双链的。在双链形式中,第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交,例如,通过A/T碱基配对和G/C碱基配对。
克隆位点,多克隆位点:克隆位点通常被理解为核酸分子片段,其适于核酸分子例如包含开放阅读框的核酸序列分子的插入。可以通过本领域技术人员已知的任何分子生物学方法来插入核酸分子,例如通过限制和连接。克隆位点通常包含一个或多个限制酶识别位点(限制性位点)。这些一个或多个限制性位点可以被在这些位点切割DNA的限制酶识别。包含多于一个限制性位点的克隆位点也可以被称为多克隆位点(MCS)或多接头。
开放阅读框:在本发明上下文中的开放阅读框(ORF)通常可以是可以被翻译成肽或蛋白质的几个核苷酸三联体的序列。开放阅读框优选在其5'末端和随后的区域含有起始密码子,即通常编码氨基酸甲硫氨酸的三个紧接的核苷酸的组合(ATG),通常显示长度为3个核苷酸倍数的长度。ORF优选由终止密码子(例如TAA、TAG、TGA)终止。通常,这是开放阅读框的唯一终止密码子。因此,在本发明上下文中,开放阅读框优选为由以起始密码子(例如ATG)开始并且优选以终止密码子(例如TAA、TGA或TAG)终止的多个可被三整除的核苷酸组成的核苷酸序列。开放阅读框可以是单独的,或者可以并入在更长的核酸序列中,例如并入在载体或mRNA中。开放阅读框也可以被称为“蛋白编码区”。
RNA体外转录:术语“RNA体外转录”(或“体外转录”)涉及其中RNA(特别是mRNA)在无细胞系统(体外)中合成的过程。优选地,克隆载体DNA,特别是质粒DNA载体用作产生RNA转录物的模板。这些克隆载体通常被称为转录载体。RNA可以通过对适当的DNA模板进行DNA依赖性体外转录而获得,根据本发明DNA模板优选为线性化的质粒DNA模板。用于控制RNA体外转录的启动子可以是任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的具体示例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。用于RNA体外RNA转录的DNA模板可以通过对核酸(特别是对应于待体外转录的相应RNA的cDNA)的克隆并将其引入至用于RNA体外转录的适当载体(例如引入至质粒环形质粒DNA)而获得。cDNA可以通过mRNA的逆转录或化学合成获得。此外,用于体外RNA合成的DNA模板也可以通过基因合成获得。优选地,克隆载体用于RNA体外RNA转录,克隆载体通常被称为转录载体。
Kozak序列:如本文所用,术语“Kozak序列”通常是指mRNA分子上的序列,它被核糖体识别,作为由该mRNA分子编码的蛋白质的翻译起始位点。在优选的实施方案中,该序列可以与用于介导翻译起始的核苷酸序列的共有序列一致,优选与共有序列(gcc)gccRccAUGG一致,其中小写字母表示在碱基可以变化的位置上最常见的碱基;大写字母表示高度保守的碱基,“AUGG”;“R”表示嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤,优选腺嘌呤)存在于该位置;括号内的顺序意义不明确。
HPLC:高效液相色谱法(HPLC;以前称为高压液相色谱法)是分析化学中用于分离混合物中的组分、识别每种组分、并量化每种组分的技术。它依靠泵使含有样品混合物的加压液体溶剂通过填充有固体吸附材料的柱子。样品中的每个组分与吸附材料的相互作用略微不同,引起不同组分具有不同流速,并导致组分流出柱子时得以分离。HPLC与传统(“低压”)液相色谱不同,因为操作压力显著更高(50至350巴),而普通液相色谱法通常依靠重力使流动相通过色谱柱。由于分析型HPLC分离的样品量小,典型的色谱柱尺寸为直径2.1至4.6mm,长度30至250mm。此外,HPLC柱是用较小的吸附剂颗粒(平均粒度2至50微米)制成的。这使得HPLC在分离混合物时具有卓越的分离能力,这就是为什么它是一种流行的色谱技术。HPLC仪器的示意图通常包括采样器、泵和检测器。采样器将样品混合物带入流动相流中,将其输送到色谱柱中。泵将流动相所需的流量和组成输送通过色谱柱。检测器产生的信号与柱子中出现的样品成分的量成正比,因此可以对样品成分进行定量分析。数字微处理器和用户软件控制HPLC仪器并提供数据分析。HPLC仪器中的一些型号的机械泵可以将多种溶剂按随时间变化的比例混合在一起,在流动相中产生成分梯度。各种检测器是常用的,例如UV/Vis,光电二极管阵列(PDA)或基于质谱。大多数HPLC仪器也有一个柱温箱,可以调节执行分离的温度。
冻干(lyophilization):冷冻干燥(Freeze-drying),也称为冻干(lyophilization)或冷冻干燥(cryodesiccation),是通常用于保存易腐物质或使物料更方便运输的脱水方法。冻干通过冷冻材料,然后降低周围压力,使材料中的冷冻水直接从固相升华到气相而起作用。
调节(conditioning):术语“调节”包括以合适的形式(例如合适的缓冲液或溶剂、合适的浓度或合适的生化或生物物理性质)提供化合物(例如RNA或DNA)。该调节可以例如利用TFF来执行,例如,在浓缩和/或渗滤步骤中。因此,调节包括通过渗滤进行缓冲液或溶剂的浓缩和交换。
纯化(purification):如本文所用,术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”或“纯的(pure)”应理解为是指将样品中所需的RNA或DNA与其中存在的杂质、中间体、副产物和/或反应组分分离(separated)和/或分离(isolated)或者使杂质、中间体、副产物和/或反应组分至少从包含RNA或DNA的样品中耗尽。因此含RNA或DNA的样品中需要被耗尽的不需要的成分的非限制性示例可以包括由于转录的提前终止而产生的降解片段或片段,或者如果质粒没有完全线性化,则还包括过长的转录物。此外,中间体例如模板DNA可能从样品中被除去。另外,可能需要从RNA/DNA样品中除去反应组分如酶、蛋白质、细菌DNA和RNA,小分子如亚精胺、缓冲液等等。另外,可以分离杂质诸如有机溶剂、和核苷酸或其它小分子。理想地,RNA在纯化后具有比起始材料更高的纯度和/或完整性。纯度可以通过本领域技术人员通常已知的方法确定,例如,通过气相色谱法、定量PCR、分析型HPLC或凝胶电泳。
切向流过滤(TFF)或错流过滤:错流过滤(也称为切向流过滤)是一种过滤类型。错流过滤不同于使进料通过膜或床、使固体被截留在过滤器中、并且使滤液在另一端被释放的死端过滤。错流过滤的名称是因为大部分进料流沿切向流过过滤器表面,而不是进入过滤器。这样做的主要优点是在过滤过程中滤饼(其可以堵塞过滤器)基本上被冲走,增加了过滤器单元可操作的时间长度。它可以是一个连续的过程,不像分批式的死端过滤。通常选择这种类型的过滤用于含有高比例的小粒径固体(其中渗透物是最有价值的)的进料,因为通过死端过滤固体材料可以快速阻挡(阻塞)过滤器表面。所施加的压力导致一部分流动物流通过膜(滤液/渗透物),而剩余物(渗余物)被再循环回到进料库。TFF的一般工作原理可以在文献中找到,参见例如Fernandez等人(A BIOTECHNOLOGICA,Bd.12,1992,Berlin,第49至56页)或Rathore,AS等人(Prep Biochem Biotechnol.2011;41(4):第398至421页)。此外,TFF的原理如图1所示。TFF的主要应用是浓缩、渗滤(脱盐和缓冲液/溶剂交换)、以及将大的生物分子从小的生物分子中的分离。可以将具有不同截留分子量(MWCO)的膜用于TFF。在本发明的上下文中,超滤膜优选用于TFF。
TFF通常使用两个基本的过滤器配置。在筒式过滤器(通常称为中空纤维过滤器)中,膜形成一组平行的中空纤维。进料流穿过纤维的内腔,渗透物从纤维外部收集。根据纤维长度、内腔直径和纤维数量以及过滤器孔径来表征滤筒。在盒式过滤器中,几个平坦的薄膜片通过支撑屏彼此分离并且从盒壳体分离。进料流进入两片之间的空间,渗透物从片的相对侧收集。根据流路长度和通道高度以及膜孔径来表征盒。通道高度由支撑屏的厚度决定。滤筒和盒均选用机械强度、化学和物理相容性以及低含量的可萃取和/或有毒化合物的材料制成。
超滤:超滤是一种利用膜的过滤方法,其中诸如压力或浓度梯度的力导致通过半透膜的分离。悬浮固体和高分子量的溶质保留在所谓的渗余物中,而水和低分子量溶质通过渗透物中的膜。这种分离过程在工业和研究中用于纯化和浓缩大分子(103-106Da)溶液。超滤与微滤不是根本不同的。这两者都是基于尺寸排阻或粒子捕获进行分离。超滤膜由在2至100nm之间(其对应于1至1000kDa的MWCO)的膜的截留分子量(MWCO)来定义。超滤以错流或死端模式应用。
进料:进料至过滤器的材料或溶液,例如线性化反应物或RNA体外转录反应混合物。
转运RNA:转运RNA是由RNA组成的衔接分子,其长度通常为76至90个核苷酸,用作核酸(DNA和RNA)的核苷酸序列与蛋白质氨基酸序列之间的物理连接。它按照在信使RNA(mRNA)中的三核苷酸序列(密码子)的指导将氨基酸携带到细胞的蛋白质合成机构(核糖体)中来完成。因此,tRNA是蛋白质翻译(根据遗传密码生物合成新蛋白质)的必要组成部分。tRNA的结构可分解为它的一级结构、它的二级结构(通常可视为三叶草结构)及它的三级结构(所有tRNA具有类似的L形三维结构,使其能够纳入核糖体的P和A位点)。苜蓿叶片结构通过螺旋的同轴叠加而成为三维L形结构,这是一种常见的RNA三级结构基序。
核糖体RNA(rRNA):核糖体的RNA组分;rRNA对于所有生物体中的蛋白质合成是必要的。它构成了核糖体内的主要物质,核糖体是大约60重量%的rRNA和40重量%的蛋白质。核糖体含有两个主要的rRNA以及50个或更多的蛋白质。核糖体RNA形成两个亚基,大亚基(LSU)和小亚基(SSU)。LSU rRNA充当核酶,催化肽键形成,mRNA夹在小亚基和大亚基之间,核糖体催化rRNA中所含的两个氨基酸之间形成肽键。
病毒RNA:病毒RNA是来源于病毒例如逆转录病毒的RNA。它可以被直接翻译成所需的病毒蛋白。在翻译过程中可能会跳过部分病毒RNA。结果是可以从相同的mRNA链产生许多不同的蛋白质,具有相似的5'末端(在不同程度上)和相同的3'末端。或者,可以从阳性正义病毒RNA和阴性正义病毒RNA产生不同的蛋白质。
复制子:复制子是从单个复制起点复制的RNA分子或RNA区域。
反义RNA:反义RNA(asRNA)或mRNA干扰互补RNA(micRNA)是与细胞内转录出的部分mRNA链互补的单链RNA。反义RNA例如可以被引入细胞中通过碱基配对来抑制互补的mRNA的翻译并且物理地阻碍翻译机器。
免疫刺激RNA(isRNA):在本发明上下文中的免疫刺激RNA(isRNA)通常可以是能够自身诱导先天性免疫应答的RNA。它通常不具有开放阅读框,因此不提供肽-抗原或免疫原,但引发先天性免疫应答,例如通过与特定种类的Toll样受体(TLR)或其他合适的受体结合。然而,当然也具有开放阅读框并编码肽/蛋白(例如抗原功能)的mRNA可以诱导先天性免疫应答。
小干扰RNA(siRNA):也称为短干扰RNA或沉默RNA,是一类长度为20至25个碱基对的双链RNA分子。siRNA起着许多作用,但在RNA干扰(RNAi)通路中最为显著,其中它干扰了具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。siRNA通过在转录后引起mRNA分解而发挥功能,导致无法翻译。siRNA也在RNAi相关通路中起作用,例如作为抗病毒机制或在形成基因组的染色质结构中。siRNA具有明确的结构:具有磷酸化的5'末端和羟基化的3'末端并具有两个突出的核苷酸的短(通常20至24bp)的双链RNA(dsRNA)。Dicer酶催化来自长dsRNA和小发夹RNA的siRNA的产生。
核酶:核酶是核糖核酸酶,也称催化性RNA。核酶是能够催化特定生化反应的RNA分子,类似于蛋白质酶的作用。核酶有不同的结构和机制。核酶的示例包括锤头状核酶、VS核酶、Leadzyme和发夹状核酶。
适配体:适配体(来自拉丁语aptus–适,和希腊语meros-部分)是与特定的靶分子结合的基于RNA的寡核苷酸分子。适配体通常通过从大量随机序列库中选择它们而产生,但是核糖开关中也存在天然的适配体。适配体还包括与特定靶分子结合的基于RNA的寡核苷酸分子,适配体与核酶组合以在它们的靶分子存在下自我裂解。
CRISPR(成簇规则间隔的短回文重复序列):含有短重复碱基序列的原核DNA片段。每次重复接着是来自之前暴露于细菌病毒或质粒的“间隔DNA”的短片段。在约40%测序的细菌基因组和90%测序的古细菌中存在CRISPR。CRISPR通常与编码涉及CRISPR的蛋白质的cas基因相关联。CRISPR/Cas系统是一种原核生物免疫系统,赋予对诸如质粒和噬菌体等外源遗传元件的抗性,并提供一种获得性免疫的形式。CRISPR间隔区以类似于真核生物中的RNAi的方式识别和切割这些外源遗传元件。
与Piwi相互作用的RNA:在动物细胞中表达的最大类的小的非编码RNA分子。piRNA通过与piwi蛋白的相互作用形成RNA-蛋白质复合物。这些piRNA复合物已经与生殖细胞系中的反转录转座子和其它遗传元件的表观遗传学和转录后基因沉默相关联,特别是那些在精子发生中的遗传元件。它们与microRNA(miRNA)尺寸不同(26至31nt而不是21至24nt),缺乏序列保守性,复杂性增加。已经在脊椎动物和无脊椎动物中均鉴定出piRNA,尽管生物发生和作用方式在物种之间确实有所不同,但许多特征是保守的。piRNAs没有明确的二级结构基序,piRNA的长度在26到31个核苷酸之间,并且5'尿苷的偏倚对于脊椎动物和无脊椎动物中的piRNA是常见的。piRNAs存在于整个基因组的簇中;这些簇可含有少至十个或多达数千个piRNA,并且可以在一个到一百个kb的尺寸上变化。
RNA修饰:本文使用的术语“RNA修饰”可以指包含骨架修饰物以及糖修饰物或碱基修饰物的化学修饰物。
在本文中,如本文所定义的经过修饰的RNA分子可以含有核苷酸类似物/修饰物,例如,骨架修饰物、糖修饰物或碱基修饰物。与本发明相关的骨架修饰物是其中包含在本文所定义的RNA分子中的核苷酸骨架的磷酸被化学修饰的修饰物。与本发明相关的糖修饰物是如本文所定义的RNA分子的核苷酸的糖的化学修饰物。此外,与本发明有关的碱基修饰物是RNA分子的核苷酸的碱基部分的化学修饰物。在本文中,核苷酸类似物或修饰物优选选自可用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
糖修饰:可以对将如本文所述被并入到修饰的RNA分子中的经过修饰的核苷和核苷酸的糖部分进行修饰。例如,2'羟基(OH)可以被许多不同的“氧基”或“脱氧基”取代基修饰或替代。“氧基”-2'羟基基团修饰物的示例包括但不限于,烷氧基或芳氧基(-OR,例如R=H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖);聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR;将2'羟基通过亚甲基桥连接到相同核糖糖的4'碳上的“锁定”核酸(LNA);和氨基基团(-O-氨基,其中氨基基团例如NRR,可以是烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基。
“脱氧基”修饰物包括氢、氨基(例如NH2;烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸);或者氨基基团可以通过接头连接到糖上,其中接头包含一个或多个C、N和O原子。
糖基团也可以含有一个或多个具有与核糖中相应的碳相反的立体化学构型的碳。因此,经过修饰的核苷酸可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
骨架修饰:
磷酸骨架可以在经过修饰的核苷和核苷酸中进一步修饰,经过修饰的核苷和核苷酸可以如本文所述被并入到经过修饰的RNA分子中。骨架的磷酸基团可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子而被修饰。此外,经过修饰的核苷和核苷酸可以包括利用如本文所述的经过修饰的磷酸完全替代未经过修饰的磷酸部分。经过修饰的磷酸基团的示例包括但不限于,硫代磷酸盐、硒代磷酸盐、硼烷磷酸盐(borano phosphates)、硼烷磷酸酯(borano phosphate esters)、氢化膦酸盐、氨基磷酸盐、烷基或芳基膦酸盐和磷酸三酯。二硫代磷酸盐含有两个由硫替代的非连接氧。磷酸接头还可以通过用氮(桥连的氨基磷酸盐)、硫(桥连的硫代磷酸盐)和碳(桥连的亚甲基膦酸盐)替代连接氧而被修饰。
碱基修饰:
可以被并入到如本文所述的经过修饰的RNA分子中的经过修饰的核苷和核苷酸可以在核碱基部分中进一步修饰。在RNA中存在的核碱基的示例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如,本文所述的核苷和核苷酸可以在主沟表面上进行化学修饰。在一些实施方案中,主沟化学修饰物可以包括氨基团、硫醇基团、烷基基团或卤代基团。
在本发明的特别优选的实施方案中,核苷酸类似物/修饰物选自碱基修饰物,优选选自2-氨基-6-氯嘌呤苷-5'-三磷酸、2-氨基嘌呤-核糖苷-5'-三磷酸、2-氨基腺苷-5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧胞苷三磷酸、2-硫代胞苷-5'-三磷酸、2-硫尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-O-甲基肌苷-5'-三磷酸、4-硫尿苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮杂胞苷-5'-三磷酸、6-氮杂尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、7-脱氮腺苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、8-氮杂腺苷-5'-三磷酸、8-叠氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核糖核苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸,N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸或嘌呤霉素-5'-三磷酸、黄嘌呤核苷-5'-三磷酸。特别优选给出的是选自由5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸和假尿苷-5'-三磷酸组成的碱基修饰的核苷酸的组的碱基修饰物的核苷酸。
在一些实施方案中,经过修饰的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酰甲基尿苷(taurinomethyluridine)、1-牛磺酰甲基-假尿苷(1-taurinomethyl-pseudouridine)、5-牛磺酰甲基-2-硫代-尿苷(5-taurinomethyl-2-thio-uridine)、1-牛磺酰甲基-4-硫代-尿苷(l-taurinomethyl-4-thio-uridine)、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷(dihydropseudouridine)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷(2-thio-dihydropseudouridine)、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
在一些实施方案中,经过修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基1-脱氮-假异胞苷、4-脱氧尿苷、5-氮杂-4-脱氧尿苷、5-甲基-4-脱氧尿苷、5-氮杂-2-硫代-4-脱氧尿苷、2-硫代-4-脱氧尿苷、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。
在其它实施方案中,经过修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
在其它实施方案中,经过修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷(wyosine)、怀丁苷(wybutosine)、7-脱氮鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在一些实施方案中,所述核苷酸可以在主沟表面上进行修饰,并且可以包括用甲基基团或卤代基团替代尿嘧啶C-5上的氢。
在具体实施方案中,经过修饰的核苷是5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷。
在其它具体实施方案中,经过修饰的RNA可以包括选自6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷的核苷修饰物。
序列修饰:
如本文使用的术语“RNA修饰”还可以指与野生型序列相比就核苷酸序列而言被修饰的RNA。特别地,如果RNA是编码RNA,例如mRNA,RNA可以在编码区(开放阅读框)中被序列修饰。一方面,编码肽或多肽的经过修饰的RNA区域的G/C含量可以大于编码肽或多肽的野生型RNA编码区的G/C含量,编码的氨基酸序列相对于野生型不变。这种修饰是基于以下事实:待翻译的RNA结构域的序列顺序对于有效的RNA翻译是必要的。在这方面,各种核苷酸的组成和序列具有重要的作用。特别地,具有提高的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有提高的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。因此,根据本发明,在保留翻译的氨基酸序列的同时,密码子以使得它们相对于野生型RNA具有更高的G/C核苷酸含量的方式变化。由于几个密码子编码一个相同的氨基酸(遗传密码的简并性),所以可以确定对于稳定性最有利的密码子(替代密码子的使用)。另一方面,也可以通过序列修饰来提供翻译优化的RNA。
浓缩:浓缩是一个简单的过程,包括从溶液中去除流体,同时保留溶质分子。溶质的浓度与溶液体积的减少成正比地增加,即体积减半使溶质分子的浓度有效地增加一倍。
渗滤:渗滤是分离过程,它将较小的分子洗涤过膜,并在渗余物中留下较大的分子,而不会最终改变浓度。它可以用来去除盐或者交换缓冲液或溶剂以将产物输送到所需的缓冲液或溶剂中。在本发明的上下文中,为了除去LMWC和HMWC(例如盐、短的寡核苷酸、小的蛋白质、亚精胺和有机溶剂),进行相对于水(WFI)和/或NaCl溶液的渗滤。渗滤可以不连续地或可选地连续进行。在连续渗滤中,将渗滤溶液以与滤液产生的相同的速率加入到样品进料库中。以这种方式,样品库中的体积保持不变,但可以自由渗透过膜的小分子(例如盐)被冲走。以除盐作为示例,每个额外的渗滤体积(DV)进一步降低盐浓度。在不连续渗滤中,首先稀释溶液,然后浓缩回到起始体积。然后重复该过程直至库中剩余小分子(例如盐)达到所需的浓度。每个额外的渗滤体积(DV)进一步降低盐浓度。连续渗滤需要较少的渗滤体积以实现与不连续渗滤相同程度的盐减少。
渗滤体积(DV):单次渗滤体积是当渗滤开始时渗余物的体积。
ΔP(deltaP)(dp):描述TFF中进料压力(p1)和渗余压力(p2)的压力差。dp的值与膜上的流速成正比。
进料压力:在滤筒/中空纤维或盒的入口处测得的压力。
进料流速:给定时间内给定膜面积上装载在过滤膜上的进料溶液的体积。
跨膜压力(TMP):用于液体传输通过超滤膜的驱动力。计算为施加到膜的平均压力减去任何滤液压力。在大多数情况下,滤液口的压力等于零。
滤液或渗透物:流过膜的样品部分。
通量:通量表示在给定时间内流过给定膜面积的溶液的体积。表示为LMH(升每平方米每小时)。
渗透通量率:渗透流量除以有效膜面积(L/h/m2)。
渗透流量:渗透物的流速(L/h)。
膜负荷:每表面积的过滤膜的产物(线性化的质粒DNA或体外转录出的RNA)的量。
RNA完整性:相对RNA完整性优选地确定为全长RNA(即未降解的RNA)相对于RNA总量的百分比(即全长RNA和降解的RNA片段(其在凝胶电泳中显示为成片条带))。RNA完整性可以通过琼脂糖凝胶电泳(AGE)和/或分析型RP-HPLC来测量和定量。
截留分子量(MWCO):膜的截留分子量(有时称为标称分子量极限(NMWL))是由其保留给定百分比的确定分子量的球状溶质的能力定义的。然而,溶质保留可以由于分子形状、结构、溶质浓度、其它溶质的存在和离子条件而变化。
具体实施方式
本发明涉及产生和纯化RNA的方法,该方法包括以下步骤:
A)提供编码RNA的DNA;
B)转录DNA以产生包含转录出的RNA的溶液;和
C)通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化包含转录出的RNA的溶液。
根据本发明的方法的各个步骤可以连续地执行,或者它们可以至少部分重叠。
采用根据本发明的方法纯化的RNA是任何类型的核糖核酸,优选如本文所定义的。RNA特别优选选自mRNA、病毒RNA、逆转录病毒RNA和复制子RNA、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激RNA、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)和与Piwi相互作用的RNA(piRNA)或全细胞RNA(总RNA提取物)。待分离的RNA可以是单链的或双链的。单链RNA可以任选地通过重折叠形成二级结构,待分离的RNA通常是单链的。RNA可以是未标记的或也可以标记的(具有荧光标记或放射性标记或抗体表位)。标记的RNA的一个示例是地高辛标记的RNA。RNA也可以含有修饰物(经过修饰的核苷酸),优选如本文所定义的。
在根据本发明的方法的优选的实施方案中,待分离的RNA具有多达约15000个核苷酸(作为单链RNA分子)或碱基对(作为双链RNA分子)的尺寸,特别是100至10000个、更优选500至10000个核苷酸或碱基对,甚至更优选500至7000个核苷酸或碱基对,并且甚至更优选500至5000个核苷酸或碱基对。对于这种尺寸的RNA,已经证明可以在RNA的纯化方面取得非常好的结果,由于根据本发明的方法特别适合于这种尺寸的RNA。然而,任选地,较小的RNA片段,例如具有30至500、50至500或100至500或20至200、20至100、20至50或20至30个核苷酸的长度也可以以这种方式分离。
如果待分离的RNA是编码RNA,例如mRNA、病毒RNA或复制子RNA,它将优选编码肽或蛋白质。RNA可编码蛋白质序列或其片段或变体(例如融合蛋白),优选选自治疗活性的蛋白质或肽,包括佐剂蛋白、肿瘤抗原、癌抗原、致病性抗原(例如选自动物抗原、病毒抗原、原生动物的抗原、细菌抗原)、过敏性抗原、自身免疫抗原、或其它抗原、过敏原、抗体、免疫刺激蛋白或肽、抗原特异性T细胞受体、生物制剂、细胞穿透肽、分泌蛋白、质膜蛋白、细胞质或细胞骨架蛋白、细胞内膜结合蛋白、核内蛋白、与人类疾病相关的蛋白质、靶向部分或没有鉴定出治疗适应症但在研究和发现领域有实用性的由人类基因组编码的那些蛋白质。
在优选的实施方案中,根据本发明的方法获得的RNA可以用作药物组合物,或者可以是与其它组分一起的药物组合物的组分。
以下将更详细地描述根据本发明的方法的步骤。
步骤A:
在优选的实施方案中,步骤A)中提供的编码RNA的DNA可以是任何种类的DNA,包括质粒DNA、基因组DNA或例如通过聚合酶链式反应(PCR)获得的DNA片段的DNA片段。
在优选的实施方案中,步骤A)中提供的DNA是质粒DNA。质粒DNA可以以环状形式或线性化形式提供。线性化形式是优选的并且可以例如通过限制酶消化(线性化)而获得。优选的限制酶是BciVI(BfuI)、BcuI(SpeI)、EcoRI、AatII、AgeI(BshTI)、ApaI、BamHI、BglII、BlpI(Bpu1102I)、BsrGI(Bsp1407)、ClaI(Bsu15I)、EcoRI、EcoRV(Eco32I)、HindIII、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、Mph1103I)、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、ScaI、SpeI、XbaI、XhoI、SacII(Cfr42I)、XbaI。本领域技术人员知晓在什么条件下可以进行DNA的线性化,并且线性化条件取决于采用哪种限制酶。在一个实施方案中,质粒DNA可以在线性化之前通过利用一个或多个TFF步骤进行调节或纯化。
至少一个TFF步骤可以包括至少一个渗滤步骤和/或至少一个浓缩步骤。渗滤和浓缩步骤可以分开进行,但也可以至少部分重叠。至少一个或多个TFF步骤可以有效地除去污染物,例如HMWC和LMWC,诸如DNA片段、有机溶剂、缓冲组分如盐和洗涤剂。TFF的使用可因此减少或废除通过对核酸如RNA和DNA进行有机溶剂提取如苯酚/氯仿提取和/或醇沉淀(例如通过高盐/醇沉淀如NaCl/异丙醇沉淀)来纯化DNA的需要。此外,令人惊讶地发现,TFF的使用不会不利地影响DNA的稳定性,例如,由于泵送过程中的剪应力。
在优选的实施方案中,线性化之前的一个或多个TFF步骤按步骤A3)描述的通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化线性化的DNA。
在优选的实施方案中,线性化反应包括:
1μg质粒DNA;
0.5μl反应缓冲液;
3单位限制酶;
加入5μl WFI(注射用水)。
反应优选在37℃下孵育4至5小时。
在用于大规模生产的另一优选的实施方案中,线性化反应包括:
30mg质粒DNA;
15ml反应缓冲液(10x限制性缓冲液)
9ml限制酶[10U/μl]
利用WFI将反应物填充至150ml的最终体积,并在37℃下孵育4至5小时。
在优选的实施方案中,线性化反应,例如,采用限制酶的线性化反应,可以被终止。线性化的终止可以通过添加抑制限制酶活性的试剂来进行。在一个实施方案中,线性化的终止可以通过添加有效量的乙二胺四乙酸(EDTA)来进行。在另一优选的实施方案中,通过热灭活例如通过在65℃下孵育而使限制酶失活。
在一种实施方案中,质粒DNA包含至少一个终止子序列。该序列通过在新合成的RNA中提供信号来介导转录终止,该信号触发从转录复合物释放RNA的过程。
在优选的实施方案中,在线性化反应之后进行一个或多个TFF步骤。TFF的一个或多个步骤可以作为渗滤步骤进行,用于i)将线性化的DNA的溶剂交换至转录所需的条件和/或ii)纯化线性化的DNA;和/或作为浓缩线性化的DNA的浓缩步骤。调节可以通过将TFF应用至渗滤溶液或缓冲液的至少一个渗滤步骤来进行。
在根据本发明的方法的优选的实施方案中,步骤A)中提供的DNA是作为编码RNA的DNA的质粒DNA,并且该方法包括在上述步骤A)之后的步骤:
A1)在线性化反应中的质粒DNA的线性化;
A2)任选地终止线性化反应;和
A3)通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化包含线性化的质粒DNA的线性化反应物。
根据本发明的步骤A3包括通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化包含线性化的质粒DNA的线性化反应物。至少一个TFF的步骤可以包括至少一个利用TFF的渗滤步骤和/或至少一个利用TFF的浓缩步骤。渗滤和浓缩步骤可以分开进行,但也可以至少部分重叠。至少一个或多个TFF步骤可以有效地去除污染物,例如HMWC和LMWC,诸如DNA片段、有机溶剂、缓冲组分如盐和洗涤剂。TFF的使用可因此减少或废除通过对核酸如RNA和DNA进行有机溶剂提取如苯酚/氯仿提取和/或醇沉淀(例如通过高盐/醇沉淀如NaCl/异丙醇沉淀)来纯化DNA的需要。此外,令人惊讶地发现,TFF的使用不会不利地影响DNA的稳定性,例如,由于泵送过程中的剪应力。
因此,在优选的实施方案中,在步骤A3中根据本发明的方法,特别是在调节、和/或纯化线性化反应物期间,不包括酚/氯仿提取和/或DNA/和/或RNA沉淀的步骤。
在优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个TFF步骤包括至少一个浓缩步骤。在本发明中,特别优选的是将线性化反应物浓缩至原体积的至少90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%或至少13%。
在优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个TFF步骤包括至少一个浓缩步骤,其中将线性化的质粒DNA从约0.05g/l、0.1g/l、0.15g/l、0.2g/l、0.25g/l或0.3g/l的线性化质粒DNA的起始浓度浓缩至约0.8g/l、0.9g/l、1.0g/l、1.1g/l、1.2g/l、1.3g/1、1.4g/l或约1.5g/l的线性化的质粒DNA的终浓度。
在另一优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个TFF步骤包括至少一个浓缩步骤,其中线性化反应物从0.2g/l DNA浓缩至1.0g/l或1.5g/l DNA。
在进一步优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个TFF步骤包括至少一个渗滤步骤。
在优选的实施方案中,渗滤步骤采用水或盐水溶液作为渗滤溶液进行。特别优选的是采用水进行渗滤步骤。
在优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个TFF步骤采用约1至约20个渗滤体积(DV)的渗滤溶液或缓冲液、优选约1至约15DV的渗滤溶液或缓冲液、且更优选约5至约12DV的渗滤溶液或缓冲液、且甚至更优选约6至约10DV的渗滤溶液或缓冲液进行。在特别优选的实施方案中,至少一个TFF步骤采用约10DV的渗滤溶液或缓冲液、特别是水进行。
根据特别优选的实施方案,步骤A3中的至少一个TFF步骤包括至少一个浓缩步骤和至少一个渗滤步骤。优选地,至少一个渗滤步骤在步骤A3的浓缩步骤之后进行。
TFF可以利用任何合适的过滤膜进行。例如,TFF可以使用TFF中空纤维膜或TFF膜盒进行。利用TFF膜盒是优选的。过滤膜的截留分子量可以根据DNA、特别是质粒DNA的尺寸来选择。感兴趣的DNA分子越大,膜的截留分子量可被选择得越高。在优选的实施方案中,过滤膜的截留分子量为≤500kDa,更优选为≤200kDa,且最优选为≤100kDa。过滤膜可以包括任何合适的过滤材料,例如聚醚砜(PES)、改性聚醚砜(mPES)、聚砜(PS)、改性聚砜(mPS)、陶瓷、聚丙烯(PP)、纤维素、再生纤维素或纤维素衍生物例如醋酸纤维素或其组合。
在本文中特别优选的是基于纤维素的膜(纤维素、再生纤维素或纤维素衍生物)或基于PES或mPES的过滤膜,特别是具有100kDa的MWCO。
在优选的实施方案中,TFF膜的DNA膜负荷为约0.1至约10mg/cm2,且优选为约0.5至约2mg/cm2。
在优选的实施方案中,TFF膜的DNA膜负荷为约0.1至0.6mg/cm2。
在步骤A3中的至少一个TFF步骤中的进料流速为500至1.500l/h/m2,优选为600至1.200l/h/m2,更优选为700至1.000l/h/m2,且最优选为750至900l/h/m2。
在优选的实施方案中,在步骤A3中使用TFF膜盒进行至少一个TFF步骤。令人惊讶的是,发现TFF膜盒特别适合用于根据本发明的方法。TFF膜盒的示例是Sartocon Slice200 100kDa,PES(Sartorius);Sartcocon Slice 200 300kDa,PES(Sartorius);OmegaCentramate T OS300T02,PES 300kDa(PALL);Omega Centramate T OS100T02,PES 100kDa(PALL)或NovaSet-LS ProStream(低结合的mPES),100kDa(NovaSep)。另一个示例是Sartocon Slice200 100kDa,Hydrosart(Sartorius),它是稳定的基于纤维素的膜,即纤维素衍生物膜。
在本文中特别优选的是包含具有100kDa的MWCO的基于纤维素的膜或基于PES或mPES的过滤膜的TFF膜盒。
在本文中特别优选的是包含具有100kDa的MWCO的基于mPES过滤膜的TFF膜盒,例如商购可获得的TFF膜盒,如具有100kDa的MWCO的NovaSep mPES;或具有100kDa的基于纤维素的膜盒,例如商购可获得的TFF膜盒,如Hydrosart(Sartorius)。
与采用中空纤维膜相比,使用TFF膜盒提供了较高的渗透通量率的可能性。TFF步骤的较高渗透通量率可导致更快的处理时间并因此降低生产成本。
在本发明的优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个TFF步骤提供了至少30l/h/m2、50l/h/m2、70l/h/m2或90l/h/m2、优选至少100l/h/m2、更优选至少110l/h/m2、且甚至更优选至少120l/h/m2的渗透通量率。还优选地,步骤A3中的至少一个TFF步骤提供30l/h/m2至100l/h/m2的渗透通量率。
在另一优选的实施方案中,在该步骤中,在TFF膜盒上的跨膜压力(TMP)为约0.01(0.1巴)至约0.3MPa(3巴),且优选为约0.1(1巴)至约0.2MPa(2巴),且最优选为0.1MPa(1巴)。此外,约0.05(0.5巴)至约0.5MPa(5巴)、特别是约0.1MPa(1巴)的ΔP(dp)是优选的。分别为约0.1MPa(1巴)和约0.1MPa(1巴)的TMP和dp的值是特别优选的,因为在这些条件下该过程不是滤饼层驱动的。
在优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个或多个TFF步骤包括使用包含基于纤维素或纤维素衍生物的膜的TFF膜盒。在优选的实施方案中,步骤A3中TFF的浓缩和渗滤步骤均包括使用包含基于纤维素或纤维素衍生物的膜的TFF膜盒。在有机溶剂如乙腈存在下提供高渗透通量率并同时具有高稳定性的Hydrosart膜(Sartorius)是特别优选的。
在另一优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个或多个TFF步骤包括使用基于TFFPES或mPES的膜盒,例如来自Sartorius的基于PES的膜,更优选来自NovaSep的基于mPES的膜盒。
在又一优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个或多个TFF步骤包括使用具有约100kDa的截留分子量的TFF膜。
在又一优选的实施方案中,步骤A3中的至少一个或多个TFF步骤包括使用具有约300kDa的截留分子量的TFF膜。
步骤B:
在根据本发明的方法的步骤B中,DNA(模板)可以被体内或体外转录而产生包含RNA的溶液。
在优选的实施方案中,DNA模板被体外转录以在被称为DNA依赖性RNA体外转录的过程中产生包含RNA的溶液。DNA依赖性RNA体外转录可以在体外转录混合物(IVT-混合物)的存在下进行。IVT混合物是一些高分子量和低分子量化合物(HMWC/LMWC)的复杂混合物,例如线性模板DNA、三磷酸核苷(NTP)、蛋白质例如转录机器和/或酶的蛋白质、亚精胺和盐。
一般而言,使用DNA依赖性RNA聚合酶可以从基于PCR的DNA模板、或基于质粒DNA的线性化的DNA模板“体外”产生RNA。
特别优选的是利用线性化的质粒DNA模板的DNA依赖性RNA体外转录。
利用DNA依赖性RNA体外转录将模板DNA,优选线性化的模板DNA质粒转录成RNA。该反应通常包含转录缓冲液、三磷酸核苷(NTP),RNA酶抑制剂和DNA依赖性RNA聚合酶。NTP可以选自但不限于本文所述的那些,包括天然存在的和非天然存在的(经过修饰的)NTP。DNA依赖性RNA聚合酶可以选自但不限于,T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和突变的聚合酶,例如但不限于能够并入经过修饰的NTP的聚合酶。
在优选的实施方案中,采用病毒的DNA依赖性RNA聚合酶作为RNA聚合酶。更优选地,采用选自包括T3、T7和/或Sp6聚合酶的组的噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶作为RNA聚合酶。最优选地,采用T7RNA聚合酶作为用于DNA依赖性RNA体外转录的酶。
在优选的实施方案中,每μg DNA模板可以采用1至1000单位(U)DNA依赖性RNA聚合酶。甚至更优选的是每μg DNA模板100U/DNA依赖性RNA聚合酶的浓度。
在RNA聚合期间,RNA可以在5'末端用本文所定义的帽子类似物(例如N7-MeGpppG)以共转录的方式加帽。
作为转录缓冲液,下面的缓冲液是优选的:40mM Tris pH 7.5或80mM HEPES。80mMHEPES是特别优选的。
在另一优选的实施方案中,40mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5是优选的。
在优选的实施方案中,采用约10至约500μg/ml的模板DNA浓度。特别优选的是约50μg/ml的模板DNA浓度。
为了转录,使用所需的化学物质的核苷三磷酸,包括天然存在的核苷酸(例如核苷酸ATP、CTP、UTP和GTP中的至少一个)和/或经过修饰的核苷酸,优选如本文所述的经过修饰的核苷酸,或它们的任何组合。
ATP、CTP、UTP和GTP优选以0.5至10mM的浓度使用,优选以3至5mM的浓度,且最优选以4mM的浓度。
有用的帽子类似物包括但不限于N7-MeGpppG(=m7G(5')ppp(5')G)、m7G(5')ppp(5')A、ARCA(抗反向CAP类似物)、经过修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮-鸟苷。如果使用5'-帽子(帽子类似物),与其它使用的核苷酸相比GTP的浓度降低。优选地,与ATP、CTP和UTP的浓度相比,使用10至50%的GTP。最优选使用20至30%的GTP。
此外,帽子类似物优选以与ATP、CTP和UTP的浓度至少相同的浓度使用。
帽子类似物:核苷酸的比例和优选地帽子类似物:GTP的比例可以从10:1到1:1变化以平衡加帽产物的百分比与转录反应的效率,优选地采用4:1至5:1的帽子类似物:GTP的比例。本发明中,如果ATP、UTP和CTP以4mM的浓度使用,则特别优选使用5.8mM的帽子类似物和1.45mM的GTP。
可以任选将MgCl2加入转录反应中。优选的是1至100mM的浓度。特别优选的是5至30mM的浓度,最优选地采用24mM的MgCl2。
可以任选地将二硫苏糖醇(DTT)加入转录反应中,优选以1至100mM、更优选10至100mM、且最优选40mM的浓度。
可以任选地将RNA酶抑制剂加入转录反应中,优选0.1至1U/μl,最优选0.2U/μl。
可以任选地将大肠杆菌焦磷酸酶加入转录反应中,优选以1至10U/μg模板DNA的浓度,且更优选以5U/μg模板DNA的浓度。这确保了转录所必需的镁保留在溶液中而不以焦磷酸镁的形式沉淀。
牛血清白蛋白(BSA)可以任选地用于转录反应中,优选以1至1000μg/ml的浓度,更优选以100μg/ml的浓度。最优选地,BSA不存在于转录反应中。
在特别优选的实施方案中,IVT-混合物包含聚阳离子脂肪族胺,优选亚精胺。聚阳离子脂肪族胺可以与带负电荷的核酸相互作用。已知聚阳离子脂肪族胺、优选亚精胺的存在有助于RNA体外转录过程。但是,需要使残留的亚精胺从RNA溶液中耗尽,特别是如果RNA用于治疗目的的话。
鉴于上述情况,因此需要在随后的纯化步骤中从体外转录出的RNA溶液中去除亚精胺。
在优选的实施方案中,IVT-混合物包含约0.1mM至约10mM的亚精胺,优选约1mM至约5mM、且最优选约2mM的亚精胺。
在特别优选的实施方案中,RNA体外转录反应包含以下组分:
1μg线性化的质粒DNA,
4mM ATP、CTP和UTP,
1.45mM GTP,
5.8mM帽子类似物,
80mM HEPES,
24mM MgCl2,
2mM亚精胺,
40mM DTT,
5U焦磷酸酶,
4U RNA酶抑制剂,和
100U T7RNA聚合酶。
体外转录反应可以在37℃下孵育,优选至少4小时。
在另一特别优选的实施方案中,用于大规模反应的RNA体外转录包含以下组分:
25mg线性化的质粒DNA,
20mM ATP、CTP和UTP,
7.25mM GTP,
29mM帽子类似物,
80mM HEPES,
24mM MgCl2,
2mM亚精胺,
40mM DTT,和
酶类焦磷酸酶(5U/μg DNA)、RNA酶抑制剂(0.2U/μl)和T7RNA聚合酶(100U/μgDNA)。
RNA体外转录反应可以在37℃下孵育,优选至少4小时。
对DNA进行RNA体外转录后,转录出的RNA存在于溶液中。该溶液通常包含IVT混合物的组分,溶液通常仍然包含蛋白质如聚合酶和其它酶、BSA、HEPES、焦磷酸酶等、核苷酸、盐和亚精胺。
步骤C:
根据本发明的步骤C包括通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化包含转录出的RNA的溶液。至少一个TFF步骤可以包括至少一个渗滤步骤和/或至少一个浓缩步骤。渗滤和浓缩步骤可以分开进行,但也可以至少部分重叠。至少一个或多个TFF步骤可以有效地除去污染物,例如HMWC和LMWC,诸如RNA片段;DNA片段、蛋白质、有机溶剂、核苷三磷酸、亚精胺和缓冲组分如盐和洗涤剂。TFF的使用可因此减少或废除通过对核酸如RNA和DNA进行有机溶剂提取如苯酚/氯仿提取和/或醇沉淀(例如通过高盐/醇沉淀如NaCl/异丙醇沉淀)来纯化DNA的需要。此外,令人惊讶地发现,TFF的使用不会不利地影响RNA的稳定性,例如,由于泵送过程中的剪应力。
因此,在优选的实施方案中,根据本发明的方法不包括酚/氯仿提取和/或DNA和/或RNA沉淀的步骤。例如与IVT混合物中RNA的储存稳定性相比,根据本发明的方法的一个优点是在至少一个TFF步骤之后的经过纯化的RNA可以提供增加的储存稳定性。
此外,根据本发明的方法不包括向RNA体外转录反应混合物中加入蛋白质变性剂例如尿素、硫氰酸胍、KCl、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠或其它洗涤剂,然后使其经受切向流过滤。
在优选的实施方案中,步骤C中的至少一个TFF步骤包括至少一个渗滤步骤。
步骤C2中的TFF步骤优选为优选采用水进行的渗滤步骤。
在优选的实施方案中,步骤C2中的至少一个TFF步骤采用约1至约20个渗滤体积(DV)的渗滤溶液或缓冲液、优选约1至约15DV的渗滤溶液或缓冲液、且更优选约5至约12DV的渗滤溶液或缓冲液、且甚至更优选约5至约10DV的渗滤溶液或缓冲液进行。在特别优选的实施方案中,至少一个TFF步骤采用约10DV的渗滤溶液或缓冲液进行。
在优选的实施方案中,渗滤步骤采用水或盐水溶液作为渗滤溶液或缓冲液进行。在优选的实施方案中,盐水溶液的盐可以包含碱金属卤化物如NaCl、LiCl或KCl;有机盐如NaOAc,碱土金属卤化物如CaCl2;碱金属磷酸盐如Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4;或它们的组合。
在优选的实施方案中,盐水溶液的盐包含碱金属卤化物,例如NaCl、LiCl或KCl;碱土金属卤化物如CaCl2或它们的组合。
在更优选的实施方案中,盐水溶液包含约0.1M的碱金属卤化物至约1M的碱金属卤化物,更优选约0.2至约0.5M的碱金属卤化物。高于优选范围的浓度可能导致RNA沉淀,并因此阻塞TFF膜。
在另一优选的实施方案中,盐水溶液包含NaCl。在更优选的实施方案中,盐水溶液包含约0.1M的NaCl至约1M的NaCl,更优选约0.2至约0.5M的NaCl。
在另一优选的实施方案中,渗滤溶液不包含缓冲盐。
在另一优选的实施方案中,渗滤溶液是水,优选蒸馏水和无菌水,更优选注射用水。
在优选的实施方案中,至少一个TFF步骤采用约1至约20个渗滤体积(DV)的渗滤溶液或缓冲液、优选约1至约15DV的渗滤溶液或缓冲液、且更优选约5至约12DV的渗滤溶液或缓冲液、甚至更优选约5至约10DV的渗滤溶液或缓冲液进行。在特别优选的实施方案中,至少一个TFF步骤采用约10DV的渗滤溶液或缓冲液进行。
步骤C中的所有TFF步骤均可以使用任何合适的过滤膜进行。例如,TFF可以使用TFF中空纤维膜或TFF膜盒进行。使用TFF膜盒是优选的。过滤膜的截留分子量可以根据生成的所需的RNA分子的尺寸来选择。感兴趣的RNA分子越大,膜的截留分子量可被选择得越高。在优选的实施方案中,过滤膜的截留分子量为≤500kDa,更优选为≤200kDa,且最优选为≤100kDa。过滤膜可以包括任何合适的过滤材料,例如聚醚砜(PES)、改性聚醚砜(mPES)、聚砜(PS)、改性聚砜(mPS)、陶瓷、聚丙烯(PP)、纤维素、再生纤维素或纤维素衍生物例如醋酸纤维素或其组合。在本文中特别优选基于纤维素的膜(纤维素、再生纤维素或纤维素衍生物),基于PES或mPES的过滤膜,特别是具有100kDa的MWCO。
在优选的实施方案中,TFF膜的RNA膜负荷为约1至约10mg/cm2,且优选为约2至约6mg/cm2。
在特别优选的实施方案中,步骤C2中TFF膜的RNA膜负荷为约2.5至约6.5mg/cm2。
在步骤C2中的至少一个TFF步骤中的进料流速为100至1.500l/h/m2,优选为150至1.300l/h/m2,更优选为200至1.100l/h/m2,且最优选为300至1.050l/h/m2。
在优选的实施方案中,使用TFF膜盒。令人惊讶的是,发现TFF膜盒特别适合用于根据本发明的方法。TFF膜盒的示例是Sartocon Slice 200 100kDa,PES(Sartorius);Sartcocon Slice 200 300kDa,PES(Sartorius);Omega Ce ntramate T OS300T02,PES300kDa(PALL);Omega Ce ntramate T OS100T02,PES 100kDa(PALL)或NovaSet-LSProStream(低结合的mPES),100kDa(NovaSep)。另一个示例是Sartocon Slice 200100kDa,Hydrosart(Sartorius),它是稳定化的基于纤维素的膜,即纤维素衍生物膜。
在本文中特别优选的是包含具有100kDa的MWCO的基于mPES过滤膜的TFF膜盒,例如商购可获得的TFF膜盒,如具有100kDa的MWCO的NovaSep mPES;或具有100kDa的基于纤维素的膜盒,例如商购可获得的TFF膜盒,如Hydrosart(Sartorius)。
与采用中空纤维膜相比,使用TFF膜盒提供了较高的渗透通量率的可能性。TFF步骤的较高渗透通量率可能导致较高浓度的渗余物,并由此导致更浓缩的RNA产物和更快的处理时间,并因此降低生产成本。
在本发明的优选的实施方案中,步骤C2中的至少一个TFF步骤提供了至少20l/h/m2、40l/h/m2、60l/h/m2、80l/h/m2或90l/h/m2、优选至少100l/h/m2、更优选至少110l/h/m2、且甚至更优选至少120l/h/m2的渗透通量率。还优选地,步骤A3中的至少一个TFF步骤提供20l/h/m2至100l/h/m2的渗透通量率。
在另一优选的实施方案中,在步骤C2中,TFF膜盒上的跨膜压力(TMP)为约0.01(0.1巴)至约0.3MPa(3巴),且优选约0.05(0.5巴)至约0.2MPa(2巴),且最优选约0.075(0.75巴)至约0.15MPa(1.5巴)或约0.1MPa(1巴)至约0.15MPa(1.5巴)。此外,约0.05(0.5巴)至约0.5MPa(5巴)、更优选约0.05(0.5巴)至约0.1MPa(1巴)、且特别是约0.1MPa(1巴)的ΔP(dp)是优选的。分别为约0.15MPa(1.5巴)和约0.1MPa(1巴)的TMP和dp的值是特别优选的,因为在这些条件下该过程不是滤饼层驱动的。
在优选的实施方案中,TMP的值为约0.1至约0.15MPa,dp的值为约0.1MPa。
在优选的实施方案中,至少一个或多个TFF步骤包括使用包含基于纤维素的膜的TFF膜盒。在有机溶剂如乙腈的存在下提供高渗透通量率并同时具有高稳定性的Hydrosart膜(Sartorius)和NovaSep膜是特别优选的。
在另一优选的实施方案中,至少一个或多个TFF步骤包括使用基于TFF PES或mPES的膜盒,例如基于PES的膜,更优选来自NovaSep的基于mPES的膜盒。
在又一优选的实施方案中,至少一个或多个TFF步骤包括使用具有约100kDa的截留分子量的TFF膜。
在又一优选的实施方案中,至少一个或多个TFF步骤包括使用具有约50kDa的截留分子量的TFF膜。
在本发明方法的一个实施方案中,相同的TFF膜盒被用于多于一个甚至全部的TFF步骤。对于多于一个TFF步骤,使用相同的TFF膜是特别有利的,因为它减少了一次性废物的量,降低了本发明产生RNA方法的成本和时间。
在优选的实施方案中,根据本发明的方法不包括在任何TFF步骤中使用TFF中空纤维膜。
在另一优选的实施方案中,本发明方法的步骤C)在一个或多个TFF步骤之前或之后包含至少一种另外的纯化方法C3。在优选的实施方案中,进一步的纯化方法在第一TFF步骤C2之后并且在第二TFF步骤C4之前进行。在优选的实施方案中,所述至少一种另外的纯化方法选自由阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、膜吸收器(membrane absorbers)、反相色谱、正相色谱、尺寸排阻色谱、疏水作用色谱、混合模式色谱、亲和色谱、羟基磷灰石(HA)色谱或其组合组成的组。在另一实施方案中,所述至少一种另外的纯化方法不包含羟基磷灰石色谱和芯珠流通色谱中的任一种。
在优选的实施方案中,所述至少一种另外的纯化方法在至少一个TFF步骤之前进行。
在另外的优选的实施方案中,所述至少一种另外的纯化方法通过高效液相色谱法(HPLC)或低常压液相色谱法进行。HPLC法是特别优选的。
在另一优选的实施方案中,所述至少一种另外的纯化方法为反相色谱法,优选为反相HPLC(RP-HPLC)法。优选地,反相色谱包括使用多孔反相作为固定相。
在根据本发明方法的优选的实施方案中,多孔反相材料具有8.0μm至50μm、特别是8.0至30μm、还更优选约30μm的粒径。反相材料可以以小球的形式存在。根据本发明的方法可以特别有利地利用具有该粒度的多孔反相来进行,任选地以珠粒的形式,其中获得特别好的分离结果。
在另一优选的实施方案中,在根据本发明的方法中使用的反相可以是多孔的并且可以具有特定的粒径。由于具有稳定的反相(它不是多孔的),因此如由A.Azarani和K.H.Hecker(Nucleic Acids Research,第29卷,no.2e7)所描述的示例在粒径方面与本发明的主题完全不同,另一方面,建立了过高的压力,由此RNA的制备级纯化只有在极其困难的情况下才是可能的,如果能够的话。
在根据本发明的方法的优选的实施方案中,反相具有至的孔径,特别是至的孔径,更优选至 至或至的孔径。反相的特别优选的孔径为至更优选为至且最优选为至或至最优选的是的孔径。采用具有这些孔径的反相,在采用本发明的方法纯化RNA方面实现了特别好的结果,特别地因此避免了根据A.Azarani和K.H.Hecker的方法中建立的升高的压力,由此使得以特别有利的方式进行制备级分离变得可能。当孔径小于时,RNA分子的分离变差。
至的孔径,特别是至的孔径,更优选至 至或至的孔径可能适合于将RNA与混合物中的其它组分分离出来,RNA具有如上所述的多达约15000个核苷酸(作为单链RNA分子)或碱基对(作为双链RNA分子)的尺寸,特别是100至10000个、更优选500至10000个核苷酸或碱基对,甚至更优选800至5000个核苷酸或碱基对,且甚至更优选800至2000个核苷酸或碱基对。然而,也可以根据待分离的RNA的尺寸来选择反相的孔径,即如果要分离较大的RNA分子,则选择较大的孔径;如果选择较小的RNA分子,则选择较小的孔径。这是由于RNA分子的保留和分离效果不仅取决于(反)相的相互作用,还取决于分子进入基质孔内的可能性,从而提供进一步的保留效果。不受限于此,例如约至约更优选约 至约最优选约至约的反相孔径因此可以用于分离较大的RNA分子,例如100至10000个、更优选500至10000个核苷酸或碱基对、甚至更优选800至5000个核苷酸或碱基对、且甚至更优选800至2000个核苷酸或碱基对的RNA分子。或者,不限于此,约至约更优选约至约且最优选约至约 的反相孔径可以用于分离较小的RNA分子,例如约30至1000个、50至1000个或100至1000个或20至200个、2至100个、20至50个或20至30个核苷酸的RNA分子也可以以这种方式分离。
通常,如果可以以多孔形式提供该材料,那么已知用作反相固定相的任何材料,特别是任何聚合性材料都可以用于本发明的方法。固定相可以由有机和/或无机材料组成。用于本发明的聚合物的示例是(非烷基化的)聚苯乙烯、(非烷基化的)聚苯乙烯二乙烯基苯、单片材料、硅胶、用非极性残基改性的硅胶、特别是用含烷基的残基改性的硅胶、更优选用含有丁基、辛基和/或十八烷基的残基改性的硅胶、用苯基残基改性的硅胶、聚甲基丙烯酸酯等或适用于如上所述的凝胶色谱或其它色谱方法的其它材料,例如葡聚糖,包括例如和材料、琼脂糖、葡聚糖/琼脂糖混合物、聚丙烯酰胺等。
在特别优选的实施方案中,用于反相的材料是多孔聚苯乙烯聚合物、(非烷基化的)(多孔)聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物、多孔硅胶、用非极性残基改性的多孔硅胶、特别是用含有烷基残基的改性的多孔硅胶、更优选用含有丁基、辛基和/或十八烷基的残基改性的多孔硅胶、用苯基残基改性的多孔硅胶、多孔聚甲基丙烯酸酯,其中特别可以使用多孔聚苯乙烯聚合物或非烷基化的(多孔)聚苯乙烯二乙烯基苯。聚苯乙烯二乙烯苯的固定相本身是已知的。可商购获得的已经用于HPLC方法的本身已知的聚苯乙烯二乙烯基苯可用于根据本发明的方法。
对于根据本发明的方法非常特别优选的非烷基化的多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯是那些,不限于此,可具有8.0±1.5μm、特别是8.0±0.5μm的粒径和至特别是 至或至的孔径,且最优选的粒径。利用这种用于反相的材料,可以以特别有利的方式实现根据本发明的方法的上述优点。
以上更详细描述的这种固定相通常位于柱子中。V2A钢通常用作柱子的材料,但是其它材料也可以用于柱子,只要它们适用于HPLC期间的普遍条件。按照惯例,柱子是直的。HPLC柱具有5cm至100cm的长度和4mm至50cm的直径是有利的。用于根据本发明的方法的柱子尤其可以具有以下尺寸:长25cm、直径20mm,或长25cm、直径50mm,或长25cm、直径10cm,或者适合于RNA的制备级回收的其它任何关于长度和直径的尺寸,甚至可以在放大的情况下几米甚至更大的直径也是可行的。尺寸在这里是针对液相色谱在技术上可行的。
流动相的选择取决于所需的分离类型。这意味着,可以例如从现有技术知晓的为特定分离建立的流动相不能直接应用于具有足够的成功可能性的不同分离问题。对于每个分离问题,理想的洗脱条件,尤其是使用的流动相必须通过实验测试来确定。
在根据本发明的HPLC方法的优选的实施方案中,水性溶剂和有机溶剂的混合物用作洗脱RNA的流动相。用作水性溶剂的缓冲液具有特别是6.0至8.0、例如约7的pH是有利的,例如7.0;优选地,所述缓冲液是乙酸三乙铵(TEAA),特别优选0.02M至0.5M,特别是0.08M至0.12M,非常特别是约0.1M的TEAA缓冲液,如上所述,TEAA缓冲液在离子对方法中也作为RNA的抗衡离子。
在优选的实施方案中,用于流动相的有机溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和丙酮或它们的混合物,非常特别优选为乙腈。采用这些有机溶剂,特别是乙腈,RNA的纯化采用本发明的方法以特别有利的方式进行。
在根据本发明的方法的特别优选的实施方案中,流动相是0.1M乙酸三乙铵(pH 7)和乙腈的混合物。
已经证明对于根据本发明的方法,对于流动相,含有相对于流动相的5.0体积%至25.0体积%的有机溶剂,并且为此采用水性溶剂以达到100体积%是特别有利的。通常,在梯度分离的情况下,有机溶剂的比例是增加的,相对于在流动相中的初始体积%,特别是增加至少10%,更优选至少50%,且最优选至少100%,任选地至少200%。在优选的实施方案中,在根据本发明的方法中,在相对于流动相的各个情况下,在HPLC分离过程中流动相中的有机溶剂的比例为3至9体积%,优选4至7.5体积%,特别是5.0体积%。更优选地,在相对于流动相的各个情况下,在HPLC分离过程中流动相中的有机溶剂的比例从3增加至9体积%,特别是5.0体积%至多达20.0体积%。还更优选地,所述方法以这样的方式进行:在相对于流动相的各个情况下,在HPLC分离过程中流动相中的有机溶剂的比例从6.5增加至8.5体积%,特别是7.5体积%至多达17.5体积%。
已经证明对于根据本发明的方法,对于流动相,含有相对于流动相的7.5体积%至17.5体积%的有机溶剂,并且为此采用水性缓冲溶剂以达到100体积%是甚至更特别有利的。
在根据本发明的方法的情况下,可以等度洗脱或通过梯度分离的方式进行洗脱。在等度分离中,RNA的洗脱采用单一洗脱液或多种洗脱液的恒定混合物进行,其中上文详细描述的溶剂可用作洗脱液。
在根据本发明的方法的优选的实施方案中,进行梯度分离。在这方面,通过梯度程序的方式改变洗脱液的组成。梯度分离所需的设备是本领域技术人员已知的。梯度洗脱可以在低压侧通过混合室进行,或者在高压侧通过另外的泵进行。
优选地,在根据本发明的方法中,在梯度分离期间,相对于水性溶剂,有机溶剂的比例如上所述是增加的。上述试剂在此可以用作水性溶剂,同样上述试剂可以用作有机溶剂。
例如,在相对于流动相的各个情况下,在HPLC分离过程中流动相中有机溶剂的比例可以从5.0体积%增加到20.0体积%。特别地,在相对于流动相的各个情况下,在HPLC分离过程中流动相中的有机溶剂的比例可以从7.5体积%增加至17.5体积%,特别是9.5至14.5体积%。
下面的梯度程序已经证明对采用本发明的方法纯化RNA是特别有利的:
洗脱液A:0.1M乙酸三乙铵,pH 7
洗脱液B:0.1M乙酸三乙铵,pH 7,含有25体积%乙腈
洗脱液组成:
起始:62%A和38%B(第1至3分钟)
增加到58%B(B每分钟增加1.67%),(第3至15分钟)
100%B(第15至20分钟)
梯度程序的另一个示例如下所述,采用相同的洗脱液A和B:
洗脱液组成:
·起始水平:62%A和38%B(第1至3分钟)
·分离范围I:梯度38%至49.5%B(B每分钟增加5.75%)(第3至5分钟)
·分离范围II:梯度49.5%至57%B(B每分钟增加0.83%)(第5至14分钟)
·冲洗范围:100%B(第15至20分钟)
选择洗脱液的流速使得RNA与待研究的样品中所含的其它成分发生良好的分离。为本发明方法选择的洗脱液流速可以为1ml/min至数升/分钟(在放大的情况下),特别为约1至1000ml/min,更优选为5ml至500ml/min,甚至更优选大于100ml/min,这取决于放大的类型和范围。该流速可以由泵建立和调节。
检测可以利用UV检测器在254nm有利地进行,其中参考测量可以在600nm进行。然而,可以可选地采用任何其它检测方法,采用该检测方法可以以令人满意且可靠的方式检测上文更详细描述的RNA。
在优选的实施方案中,RP-HPLC如WO 2008/077592中所描述的进行。
如上所述,采用反相色谱法通常需要使用有机溶剂,例如乙腈(ACN)、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、三氟乙酸(TFA)、三氟乙醇(TFE)或其组合。然而,之后可能需要从含RNA的库中除去这些有机溶剂。此外,在RP-HPLC之后,来自先前生产或纯化步骤的其它污染物(例如亚精胺)可能仍存在于含RNA的库中,并且需要除去。
在优选的实施方案中,步骤C中的至少一个TFF步骤可以在进行了至少一种另外的纯化方法之后进行。在任选的至少一种纯化方法之后,至少一个TFF步骤可以包括至少第一渗滤步骤。优选地,第一渗滤步骤采用盐水溶液作为渗滤溶液进行。在优选的实施方案中,盐水溶液的盐可以包含碱金属卤化物如NaCl、LiCl或KCl;有机盐如NaOAc,碱土金属卤化物如CaCl2;碱金属磷酸盐如Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4;或它们的组合。在优选的实施方案中,盐水溶液的盐可以包含碱金属卤化物如NaCl、LiCl或KCl;碱土金属卤化物如CaCl2。在更优选的实施方案中,盐水溶液包含约0.1M的碱金属卤化物至约1M的碱金属卤化物,更优选约0.2至约0.5M的碱金属卤化物。在另一优选的实施方案中,盐水溶液包含NaCl。在更优选的实施方案中,盐水溶液包含约0.1M的NaCl至约1M的NaCl,更优选约0.2至约0.5M的NaCl。在特别优选的实施方案中,盐水溶液包含0.2M的NaCl。在另一优选的实施方案中,盐水溶液不包含缓冲盐。盐的存在对于从RNA库中除去污染的亚精胺可能是有利的。在优选的实施方案中,第一渗滤步骤采用约1至约20DV的渗滤溶液、优选约1至约15DV的渗滤溶液,且更优选约5至约12DV的渗滤溶液、且甚至更优选约7至约10DV的渗滤溶液进行。在特别优选的实施方案中,第一渗滤步骤采用约10DV的渗滤溶液进行。
在优选的实施方案中,在至少一个TFF膜步骤(在任选的至少一种纯化方法之后)中的RNA膜负荷为约1至约10mg/cm2,优选为约1至约5mg/cm2。
在特别优选的实施方案中,TFF膜的RNA膜负荷为约2mg/cm2至约2.5mg/cm2。
在本发明的优选的实施方案中,至少一个TFF步骤(在任选的至少一种纯化方法之后)提供500至2.000l/h/m2、优选600至1.800l/h/m2、更优选700至1.600l/h/m2、且最优选900至1.500l/h/m2的进料流速。
在本发明的优选的实施方案中,至少一个TFF步骤(在任选的至少一种纯化方法之后)提供至少20l/h/m2,优选至少50l/h/m2、更优选至少100l/h/m2、且甚至更优选至少150l/h/m2的渗透通量率。
在本发明的优选的实施方案中,至少一个TFF步骤(在任选的至少一种纯化方法之后)提供约25l/h/m2至约140l/h/m2的渗透通量率。
在另一优选的实施方案中,至少一个TFF步骤(在任选的至少一种纯化方法之后)的TFF膜盒上的跨膜压力(TMP)为约0.01(0.1巴)至约0.3MPa(3巴),且优选为约0.05(0.5巴)至约0.2MPa(2巴),且最优选为约0.075(0.75巴)至约0.15MPa(1.5巴)。此外,约0.05(0.5巴)至约0.5MPa(5巴)、更优选约0.05(0.5巴)至约0.1MPa(1巴)、且特别是约0.1MPa(1巴)的ΔP(dp)是优选的。分别为0.15MPa(1.5巴)和约0.1MPa(1巴)的TMP和dp的值是特别优选的,因为在这些条件下该过程不是滤饼层驱动的。
在优选的实施方案中,TMP值为约0.1(1巴)至约0.15(1.5巴),dp值为约0.1MPa(1巴)。
在另一优选的实施方案中,在任选的至少一种另外的纯化方法之后,至少一个TFF步骤包括至少一个浓缩RNA的步骤,至少一个浓缩RNA的步骤优选在上述第一渗滤步骤之前进行。在优选的实施方案中,由任选的至少一种另外的纯化方法产生的RNA库被浓缩至约0.1g/l至约10g/l的浓度,优选至约1g/l至约10g/l的浓度,且更优选至约2g/l至约5g/l的浓度。在特别优选的实施方案中,由任选的至少一种另外的纯化方法产生的RNA库被浓缩至约0.1g/l至约5g/l的浓度。通过TFF浓缩RNA可以缩短整个处理时间。
在又一优选的实施方案中,在任选的至少一种纯化方法之后的第一渗滤步骤之后是利用TFF的第二渗滤步骤。在甚至更优选的实施方案中,第二渗滤步骤采用水作为渗滤溶液来进行。在优选的实施方案中,第一次渗滤步骤采用约1至约20DV的渗滤溶液、优选约1至约15DV的渗滤溶液、且更优选约5至约12DV的渗滤溶液、且甚至更优选约6至约10DV的渗滤溶液进行。在特别优选的实施方案中,第二渗滤步骤采用约10DV的渗滤溶液进行。在优选的实施方案中,在第二渗滤步骤之后进行利用TFF浓缩RNA的步骤。
在特别优选的实施方案中,所述至少一种另外的纯化方法之后是至少一个浓缩RNA的步骤、利用如上所述的TFF的至少一个第一渗滤步骤和至少一个第二渗滤步骤。
在特别优选的实施方案中,在任选的至少一种另外的纯化方法之后的渗滤步骤以及在任选的至少一种利用TFF的另外的纯化方法之后的浓缩步骤在0℃至20℃、更优选在5℃至20℃、甚至更优选在10℃至20℃、甚至更优选在低于20℃、甚至更优选在低于17℃的温度下进行。
在又一特别优选的实施方案中,该方法在步骤C)中包括以下步骤:
C1)任选地终止转录;
C2)通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化包含体外转录出的RNA的溶液;
C3)通过如上所述的任何进一步的纯化方法纯化RNA,优选通过利用选自由阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、膜吸收器、反相色谱、正相色谱、尺寸排阻色谱、疏水作用色谱法、混合模式色谱、亲和色谱、羟基磷灰石(HA)色谱或其组合组成的组,且更优选利用反相色谱;和
C4)通过一个或多个TFF步骤调节和/或任选地纯化步骤C3)之后获得的包含转录出的RNA的溶液。
在优选的实施方案中,步骤C1)的任选的终止转录可以包括加入有效量的阳离子络合剂例如EDTA。EDTA可以有效地中止体外转录反应,并由于二价阳离子的耗尽而使核酸酶失活并稳定RNA。此外,向IVT混合物中加入EDTA导致可能出现的浊度的部分降低。还发现EDTA的加入在随后的TFF步骤中允许更高的流速。
在优选的实施方案中,加入约10至约100mM的EDTA,优选约10至约50mM的EDTA,且甚至更优选约20至约30mM的EDTA。在特别优选的实施方案中,加入25mM的EDTA。
令人惊讶地发现,与其它可选的调节方法例如利用快速高效液相色谱(FPLC)柱亲和色谱相比,TFF特别适合用于调节包含转录出的RNA的溶液,快速高效液相色谱(FPLC)柱亲和色谱显示RNA的不可逆结合,RNA洗脱只能是通过用NaOH洗柱来实现或者大部分RNA存在于流通物中。
在另一优选的实施方案中,步骤C4包含如上所述的利用TFF的至少第一渗滤步骤;更优选利用TFF的至少第一渗滤步骤和至少如上所述的第二渗滤步骤;且甚至更优选如上所述的利用TFF的至少一个浓缩步骤、利用TFF的至少第一渗滤步骤和至少如上所述的第二渗滤步骤。
因此,在优选的实施方案中,步骤C4中的至少一个第一渗滤步骤采用盐水溶液作为渗滤溶液进行。在优选的实施方案中,盐水溶液的盐可以包含碱金属卤化物如NaCl、LiCl或KCl;有机盐如NaOAc,碱土金属卤化物如CaCl2;碱金属磷酸盐如Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4;或它们的组合。在优选的实施方案中,盐水溶液的盐可以包含碱金属卤化物如NaCl、LiCl或KCl;碱土金属卤化物如CaCl2。在更优选的实施方案中,盐水溶液包含约0.1M的碱金属卤化物至约1M的碱金属卤化物,更优选约0.2至约0.5M的碱金属卤化物。在另一优选的实施方案中,盐水溶液包含NaCl。在更优选的实施方案中,盐水溶液包含约0.1M的NaCl至约1M的NaCl,更优选约0.2至约0.5M的NaCl。在特别优选的实施方案中,盐水溶液包含0.2M的NaCl。在另一优选的实施方案中,盐水溶液不包含缓冲盐。盐的存在对于从RNA库中除去污染的亚精胺可能是有利的。在优选的实施方案中,第一渗滤步骤采用约1至约20DV的渗滤溶液、优选约1至约15DV的渗滤溶液,且更优选约5至约12DV的渗滤溶液、且甚至更优选约7至约10DV的渗滤溶液进行。在特别优选的实施方案中,第一渗滤步骤采用约10DV的渗滤溶液进行。
在优选的实施方案中,所述至少一个第二渗滤步骤采用水作为渗滤溶液进行。在优选的实施方案中,第一渗滤步骤约1至约20DV的渗滤溶液、优选约1至约15DV的渗滤溶液,且更优选约5至约12DV的渗滤溶液、且甚至更优选约6至约10DV的渗滤溶液进行。在特别优选的实施方案中,第二渗滤步骤采用约10DV的渗滤溶液进行。在优选的实施方案中,在第二渗滤步骤之后进行利用TFF浓缩RNA的步骤。
在特别优选的实施方案中,在本发明方法的所有TFF步骤中的渗滤溶液不包含缓冲盐。
特别优选的是,根据本发明的所有TFF步骤,即本文定义的步骤A3、C2和C4使用相同类型的TFF膜进行,优选使用相同类型的TFF膜盒进行。甚至更优选地,根据本发明的所有TFF步骤使用包含具有100kDa的MWCO的基于mPES的过滤膜或具有100kDa的MWCO的基于纤维素的过滤膜的TFF膜盒进行,例如可商购获得的TFF膜盒如具有100kDa的MWCO的NovaSepmPES和具有100kDa的MWCO的Hydrosart(Sartorius)基于纤维素的膜盒。最优选地,根据本发明的所有TFF步骤利用包含具有100kDa的MWCO的基于纤维素的过滤膜的TFF膜盒进行。
本领域技术人员将容易理解,对权利要求2的步骤A3的以上论述也适用于权利要求26的步骤d)和e)以及权利要求41的步骤iv)。类似地,对权利要求13的步骤C2的以上论述也适用于权利要求26的步骤h),以及分别地,对权利要求13的步骤C4的论述也适用于权利要求26的步骤j)和k)。
可选步骤D至F:
在又一实施方案中,根据本发明的方法包括至少一个另外的配制步骤D),例如,将经过纯化的RNA与聚阳离子化合物(例如聚阳离子聚合物或聚阳离子肽或蛋白质例如鱼精蛋白)络合。在本发明中,亚精胺的耗尽是必要的,以便提供与聚阳离子化合物的充分络合。
在又一实施方案中,根据本发明的方法进一步包括E)填充和/或F)冻干的步骤。
本发明是在政府的支持下根据DARPA授予的编号为HR0011-11-3-0001的协议完成的。政府对本发明有一定的权利。
附图说明
图1:进料流平行于膜表面流过,其中一部分流穿过膜(渗透物/滤液)(图1A),而剩余物(渗余物)从过滤组件再循环回到进料库(图1B;改编自Millipore文献编号TB032);浓缩、渗滤(脱盐和缓冲液交换)以及大分子与小分子分离是可能的。
图2:利用线性化pDNA进行MWCO筛选的结果。
图2A示出了来自三种不同质粒(P0625(2626bp)、P1040(3907bp)和P0532(7362bp))的线性化反应物的MWCO筛选实验的结果。可以容易地看出,使用具有100kDa的MWCO的两个制造商的旋转过滤器几乎完全保留三种不同的线性化pDNA,而较高MWCO导致了线性化质粒DNA的损失。
图2B示出了采用线性化质粒P1040(3907bp)进行MWCO筛选的DNA琼脂糖凝胶电泳。在DNA琼脂糖凝胶电泳中显示出线性化P1040样品和所得的过滤样品。LA:0.5μg的线性化反应物作为对照。将待分析的样品稀释,并将每泳道0.5μg DNA的固定量应用于凝胶。如果DNA的浓度太低,则施加最大量的DNA。由于DNA应用中的标准化,对DNA的保留没有定量的说明。但是分析表明在过滤期间DNA的完整性没有降低。此外,从凝胶中可以看出,高于100kDa的MWCO导致渗余物中质粒DNA的损失。
图3利用mRNA进行MWCO筛选的结果。
图3A示出了在转录反应后针对三种不同mRNA长度(R1871:589nt,R1265:1870nt,R1626:5337nt)进行RNA的MWCO筛选的结果。可以容易地看出,利用100kDa MWCO的两个制造商的旋转过滤器完全保留了三种不同的mRNA。
图3B示出了对所获得的RNA R1265的过滤样品进行的RNA琼脂糖凝胶电泳。将待分析的样品稀释,将每泳道1μg mRNA的固定量应用于凝胶。如果mRNA浓度太低,则施加最大量的mRNA。由于在mRNA应用中的标准化,对mRNA的保留没有定量的说明。但是分析表明在过滤期间mRNA的完整性没有降低。如在RNA浓度测量中所测量的,凝胶反映了相同的结果,RNAR1265完全被100kDa膜保留。
图4:中空纤维组件的流速筛选
将WFI中的RNA(3775nt,转录反应后的mRNA,在WFI中渗滤)用于利用中空纤维膜(GE,PES,100kDa,50cm2)进行流速筛选。如上所示,进料流量(FF)的增加导致渗透通量的增加,以及渗余物压力(0.5巴)的增加显示对渗透物通量率有影响。
图5:在1巴的dp和TMP下,不同TFF盒的渗透通量率。
三种不同TFF盒的通量率在126至140l/h/m2的范围内。
图6:转录反应(A)后的RNA稳定性(B)和随后的TFF渗滤至WFI数小时后的RNA稳定性(B)。在不同温度(室温、5℃和-20℃)下储存后,通过分析型RP-HPLC测定RNA完整性(全长产物的相对面积)。在1、3、5、7、10、13、14、53和61天后分析未利用TFF的体外转录反应的RNA完整性。在1、5、7、12、14和33天后分析TFF后的体外转录反应的RNA完整性。
图7:用于耗尽亚精胺步骤的不同膜的测试
测试用于耗尽亚精胺步骤的两种膜(Novasep mPES 100kDa和基于纤维素的Sartorius Hydrosart 100kDa),采用0.2M NaCl用于渗滤。两种膜都显示可比的通量率。
图8:用于线性化反应物的TFF的具有较高膜负荷的不同膜的测试
为了线性化反应物的浓缩和渗滤,来自不同供应商(来自Sartorius的基于PES的膜Sartocon Slice 200和来自NovaSep的NovaSet-LS ProStream(低结合的mPES)以及来自Sartorius Hydrosart的基于纤维素的膜Sartocon Slice 200)的、具有100kDa的MWCO和200cm2的膜面积的、具有高的膜负荷(5.6和6g质粒DNA/m2)的、采用不同材料制备的TFF膜进行测试。
图8A示出了浓缩步骤中的通量率。线性化反应物从0.2g/l浓缩至约1.5g/l。采用以下参数:dp和TMP=1巴(P1=1.5巴,P2=0.5巴,P3=0巴)
图8B示出了渗滤步骤中的通量率。将线性化反物相对于10个渗滤体积的WFI利用与浓缩相同的参数进行渗滤。
所有测试的膜显示出相似的结果。在线性化反应物的浓缩过程中(图8A),通量率迅速下降,但在WFI渗滤期间(图8B),通量率再次升高。两种基于PES的膜(Sartorius PES和NovaSet mPES)均显示出相似的结果,但是Hydrosart膜(Sartorius)显示出较高的渗透通量率。
图9:线性化pDNA的琼脂糖凝胶电泳
1.)DNA大小的标准参照物
2.)浓缩后的TFF渗透物(10μl)
3.)渗滤后的TFF渗透物(10μl)
4.)TFF渗余物(3μl,0.1g/l)
5.)对照的线性化质粒(1.8μl,0.17g/l)
6.)对照的环状质粒(3μl,0.1g/l)
7)空
8.)DNA大小的标准参照物
在浓缩步骤和渗滤步骤的渗透物中只有可忽略量的质粒DNA是可见的。
图10:在TFF期间从RP-HPLC库采集的渗透物和渗余物样品的RNA琼脂糖凝胶电泳
1.)RNA标准参照物
2.)RP-HPLC库I
3.)RP-HPLC库II
4.)RP-HPLC库III
5.)TFF渗透物
6.)TFF渗透物(40倍浓缩)
7.)TFF渗余物库I
8.)TFF渗余物库II
9.)TFF渗余物库III
10.)最终产物
11.)对照
12.)对照
13)空
14.)RNA标准参照物
图11:在RNA产生和纯化过程中采集的样品的蛋白SDS PAGE
1蛋白质标准参照物
2线性化后的TFF渗余物
3转录反应
4RP-HPLC前的TFF渗余物
5RP-HPLC前的TFF渗余物
6RP-HPLC前的TFF渗余物
7RP-HPLC后的TFF渗余物库I
8RP-HPLC后的TFF渗余物库II
9RP-HPLC后的TFF渗余物库III
10最终产物
11对照
12蛋白质标准参照物
图12:TFF渗透通量率。将pDNA线性化反应物从0.2浓缩至1.5g/l DNA,利用Hydrosart100kDa,dp和TMP1巴;膜负荷:6g/m2;从0.2g/l DNA浓缩至1.5g/l DNA。
图13:TFF渗透通量率。将线性化pDNA渗滤到10DFV的WFI中,利用Hydrosart100kDa,dp和TMP:1巴;膜负荷:6g/m2。
图14:TFF渗透通量率。将RNA IVT-混合物渗滤到10DFV的WFI中,利用Hydrosart100kDa,dp和TMP:1巴;膜负荷:56g/m2;
图15:TFF渗透通量率。RP-HPLC RNA库的浓缩,利用Hydrosart 100kDa,dp和TMP:1巴;膜负荷:20g/m2;从0.1g/l RNA浓缩至5g/l RNA;温度17℃。
图16:TFF渗透通量率。RNA的渗滤,利用Hydrosart 100kDa,dp和TMP:1巴。(A)RNA渗滤至10DFV的0.2M NaCl中;(B)将RNA渗滤到10DFV的WFI中。
示例
示例1-材料
表1中的以下材料用于随后的实验部分:
表1:材料
一般方法:
示例2-质粒DNA的线性化:
以下条件用于质粒DNA的线性化:
1μg质粒DNA
0.5μl反应缓冲液
3单位限制酶EcoRI
加入5μl的WFI(注射用水)
反应物在37℃下孵育3小时,通过使限制酶热灭活(65℃,30分钟)终止反应。
示例3-TFF过程的一般描述
所有管和渗余物容器用75%EtOH和水清洗并组装。根据制造商的说明将膜盒固定到相应的夹持器(holder)中,并将中空纤维膜分别连接到系统。之后,将系统和膜用至少1L水、1L 1M或0.5M NaOH冲洗1小时(用于除去潜在的污染物如RNA酶),并再次用水洗涤,直到渗透物中的pH值为中性。随后,整个系统用注射用水(WFI)或渗滤溶液或缓冲液冲洗。
3.1-浓缩步骤
将DNA/RNA溶液填充至渗余物容器中,并通过设定指定的压力,任选地浓缩至所需浓度。
3.2-渗滤步骤
在任选的浓缩步骤之后,开始渗滤。因此,将渗滤管放入渗滤溶液或缓冲液中。在渗滤期间,由于出现的真空,离开系统的渗透物的量自动被渗滤溶液或缓冲液代替。当达到所需的渗滤体积(dv)时,任选地向系统中加入不同的渗滤溶液或缓冲液,并进行第二渗滤步骤。在TFF步骤结束之前,在将渗余物从系统中取出之前,可任选地将渗余物再次浓缩至所需体积。随后用25mL WFI(注射用水)或缓冲液冲洗系统(渗透阀关闭)。冲洗液任选地与TFF渗余物合并。任选地,测量RNA/DNA浓度并计算核酸的回收率。
3.3-系统/膜维护
在使用膜之后,将盒用0.5L水冲洗,随后用0.5M或1M NaOH冲洗1小时,然后再用水清洗,直到渗透物中的pH为中性。之后,测定水渗透通量值以核实膜的清洁度。最后,将膜从TFF系统中取出并储存在0.1M NaOH或20%EtOH中。之后将TFF系统采用75%EtOH和水清洗并干燥保存。
示例4-体外转录
4.1-体外转录
利用T7聚合酶体外转录线性化的DNA质粒。体外转录在帽子类似物(m7GpppG)的存在下进行。体外转录在5.8mM的m7G(5')ppp(5')G帽子类似物、4mM ATP、4mM CTP、4mM UTP和1.45mM GTP、50μg/ml DNA质粒、80mM HEPES、24mM MgCl2、2mM亚精胺、40mM DTT、100U/μgDNA T7RNA聚合酶、5U/μg DNA焦磷酸酶和0.2U/μl RNA酶抑制剂下进行。
体外转录反应在37℃孵育4小时。
转录后,通过加入最终浓度为25mM的ETDA终止反应。
4.2-DNA模板的除去:DNA酶I(DNase I)处理
为了消化DNA模板,将6μl DNA酶I(1mg/ml)和0.2μl CaCl2溶液(0.1M)/μg质粒DNA加入到转录反应中,并在37℃下孵育3小时。
示例5-RNA的HPLC纯化
在100mM乙酸三乙铵(TEAA)中制备1g/l RNA,利用5μm PVDF过滤器过滤并用于制备型RP-HPLC。安装柱子(储存在88%乙腈中)后,将储存的溶液用超纯水洗出。接下来,将RNA样品装载到柱上,并用洗脱液B/洗脱液A-梯度(洗脱液A:在注射用水(WFI中的100mM乙酸三乙铵(TEAA),pH 7.0;洗脱液B:在25%乙腈中的100mM TEAA),以100%洗脱液A开始,并以100%洗脱液B结束。
在洗脱过程中,洗脱液被自动收集。随后通过光度测定(A260)分析洗脱液的RNA含量,并通过琼脂糖凝胶电泳或分析型HPLC分析RNA的完整性。
示例6-分析方法
6.1-RNA凝胶电泳
在含有甲醛的琼脂糖凝胶(0.7%w/w甲醛,1.2%w/v琼脂糖)中于3-吗啉代丙烷磺酸缓冲液中分离RNA(方法的具体细节参见Sambrook,Russel:Molecular Cloning:ALaboratory Manual,vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory,2000)。将RNA样品在RNA样品缓冲液(Thermo scie ntific)中在80℃下变性5分钟,然后装载到凝胶上。向每泳道加载1μg RNA。
6.2-蛋白质凝胶电泳(SDS-PAGE)
利用即用型的12%Mini-PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)进行SDS-PAGE。4×Laemmli上样缓冲液和10×SDS-PAGE运行缓冲液购自Bio-Rad。将样品与4×上样缓冲液混合并在95℃下孵育5分钟。样品加载量归一化为每泳道10μg RNA。施加150mV的电压(相当于约35mA/凝胶),直到最小的标准参照物条带达到凝胶的下端。根据制造商的方案,利用即用型Simply Blue Safe Stain(Invitrogen)进行蛋白条带的可视化。或者,利用Pierce银染试剂盒(Thermo Scie ntific)以增加染色灵敏度。
6.3-与RNA结合的亚精胺的定量
亚精胺通过如Flores等人(Plant Physiol.(1982)69,第701至706页)所述的改进的方案进行定量。简而言之,亚精胺在碱性条件下被苯甲酰化,然后用乙醚萃取。苯甲酰化的亚精胺通过HPLC或质谱法检测和定量。己二胺用作内标。
6.4-残留溶剂的测定
利用具有火焰离子化检测器(GC-FID)的定量气相色谱测定RNA样品中残留的溶剂的含量。
小规模测试:
示例7-孔筛选实验:
7.1-利用质粒DNA进行MWCO筛选。
为了确定在TFF中使用的膜的合适MWCO(截留分子量),进行MWCO筛选。因此利用旋转过滤器,因为它们需要小体积。利用100kDa、300kDa和1000kDa的MWCO测试来自两个不同制造商(来自PALL GmbH的Spin-Filter(100kDa、300kDa和1000kDa)的PES和来自Sartorius的Spin-Filter 500(100kDa、300kDa和1000kDa)的PES)的旋转过滤器。在使用之前,将旋转过滤器用500μl WFI(注射用水)冲洗,并且将WFI完全从渗透室中移出。随后,根据制造商的说明,加入300μl三种不同的线性化反应物(参见示例2)并在室温下离心。大约一半体积穿过膜后,停止离心并确定渗透物和渗余物室中的确切体积。然后用100μl WFI冲洗渗余物室并与渗余物合并。除了体积测量之外,还测定起始溶液和渗余物溶液中的DNA的浓度。通过测量260nm处的吸光度来光度测定DNA浓度。图2A示出了来自三种不同质粒(P0625(2626bp)、P1040(3907bp)、P0532(7362bp))的线性化反应物的MWCO筛选结果。可以很容易地看出,利用具有100kDa的MWCO的两个制造商的旋转过滤器几乎完全保留三种不同的线性化的pDNA,而较高MWCO导致了线性化的质粒DNA的损失。
线性化的P1040的样品和得到的过滤样品在图2B中通过DNA琼脂糖凝胶电泳显示。将待分析的样品稀释,并将每泳道0.5μg DNA的固定量施加于凝胶,如果DNA的浓度太低,则施加最大量的DNA。由于DNA应用中的标准化,对DNA的保留没有定量的说明。但是分析表明在过滤期间DNA的完整性没有降低。此外,从凝胶中可以看出,高于100kDa的MWCO导致渗余物中质粒DNA的损失。因此选择100kDa的MWCO用于关于线性化的质粒DNA的TFF的进一步实验。
7.2-利用RNA进行MWCO筛选
按照与对pDNA进行MWCO筛选所描述的相同的方式进行实验(示例7.1)。在使用之前,将旋转过滤器用500μl WFI(注射用水)冲洗,并且将WFI完全从渗透室中移出。之后,根据制造商的说明,加入300μl三种不同的转录反应物并在室温下离心。大约一半体积穿过膜后,停止离心并确定渗透物和渗余物室中的确切体积。然后用100μl WFI冲洗渗余物室并与渗余物合并。除了体积测量之外,还通过测量260nm处的吸光度来光度测定起始溶液和渗余物溶液中RNA的浓度。图3A示出了根据示例4的转录反应后的对于三种不同的mRNA长度(R1871:589nt,R1265:1870nt,R1626:5337nt)的RNA的MWCO筛选结果。可以容易地看出,利用具有100kDa MWCO的两个制造商的旋转过滤器完全保留了三种不同的mRNA。
此外,图3B中示出了所得的RNA R1265过滤样品的RNA琼脂糖凝胶电泳。将分析的样品稀释,将每泳道1μg mRNA的固定量施加于凝胶,如果mRNA浓度太低,则施加最大量的mRNA。由于在mRNA应用中的标准化,对mRNA的保留没有定量的说明。但是分析表明在过滤期间mRNA的完整性没有降低。如在RNA浓度测量中所测量的,凝胶反映了相同的结果,RNAR1265完全被100kDa膜保留,其中较高MWCO的RNA在渗透物中可见。因此选择100kDa的MWCO用于RNA溶液的TFF的进一步实验。
示例8-不同膜的参数筛选
已经渗滤在WFI中的体外转录反应物R2587(根据示例4)用于参数筛选。不同的膜(来自Sartorius的Sartocon Slice 200 100kDa的PES;来自Sartorius的Sartocon Slice200 100kDa的Hydrosart(基于纤维素的膜)和来自Novasep的NovaSet-LS ProStream(低结合的mPES)的100kDa)分别针对渗透通量相对于TMP和dp进行筛选。样品负荷为0.1mg RNA/cm2膜。与其它膜(来自Sartorius和NovaSep的基于聚醚砜(PES)的膜)相比,Hydrosart膜(来自Sartorius的基于纤维素的膜)显示出最高的渗透通量率。从表2所示的结果可以看出,至少0.5巴的膜上压差(dp)和至少0.75巴的跨膜压力(TMP)对于达到至少100l/h/m2的通量率是必要的。
表2:筛选实验选择的不同参数导致的通量率
基于这些实验,为转录反应的TFF选择以下参数:
表3:转录反应的TFF的选定参数
示例9-具有较高膜负荷的TFF
9.1-利用中空纤维组件的转录反应的TFF
将渗滤在WFI中的RNA体外转录反应物(R2587,3775nt)用于在中空纤维膜(来自GEHealthcare的中空纤维组件,100kDa,PES,50cm2)中进行流速筛选。膜负荷为约2.0mg RNA/cm2。如图4所示,进料流量(FF)的增加导致渗透通量的增加,渗余压力的增加(0.05MPa)表明也对渗透通量率有影响。通量率在5和85l/h/m2之间(见图4)。
9.2-T利用TFF盒组件的FF
将渗滤在WFI中的RNA体外转录反应物(R2312,1885nt)用于利用以下TFF参数进行TFF(表4):
表4:利用TFF膜盒组件的TFF参数
进料压力(p1) | 渗余压力(p2) | 渗透压力(p3) | dp | TMP |
0.15MPa | 0.05MPa | 0MPa | 0.1MPa | 0.1MPa |
膜负荷约为4.5mg RNA/cm2。将来自Novasep的100kDa的Sartorius PES和100kDa的NovaSet-LS ProStream(低结合的mPES)以及100kDa的Hydrosart Sartorius(基于纤维素的膜)盒分别用作TFF组件。如图5所示,获得的渗透通量率的值在约125至140l/h/m2之间,比中空纤维膜高。因此,利用TFF膜盒的渗滤过程更快,这是由于与利用中空纤维膜的通量率相比更高的通量率。
示例10-TFF期间的RNA稳定性
使用Sartorius PES的100kDa膜盒和如示例9.2所述的TFF参数,在室温下用WFI对含有mRNA的样品(R2564;2083nt)渗滤几个小时。将转录反应后的RNA稳定性与随后的TFF后的RNA的稳定性进行比较。通过分析型RP-HPLC确定稳定性,即RNA完整性(全长产物的相对面积)。
结果总结在图6中。
稳定性数据显示,转录反应混合物中的mRNA只有在-20℃下储存至多60天(85至90%)才是稳定的;在5℃下,完整性开始从起始缓慢下降(在61天内从85%下降到61%)。如果在室温下储存mRNA,则测量到非常快速下降的完整性(在14天内从81%降至51%)。另一方面,对如上所述的转录反应混合物进行TFF之后的mRNA如果在-20℃和5℃下储存则在30天内稳定。如果在室温下保存mRNA,则仍然显示出至少7天的高度完整性,然后在33天内缓慢下降到80%的完整性。从这个实验可以得出结论,与不通过TFF进行纯化的体外转录反应物中的RNA的稳定性相比,更高程度的RNA稳定性通过对WFI中的mRNA进行TFF得以实现。
示例11-含有RNA的RP-HPLC库的TFF
11.1-对RP-HPLC库进行渗滤的TFF参数
使用WFI、0.1M TEAA、13%乙腈中的RP-HPLC纯化的RNA样品(如示例5中所述)用于参数筛选。
就TMP相对于渗透通量和不同RNA浓度而言(表5),我们筛选了不同的膜(来自Sartorius的Hydrosart(基于纤维素的膜)、来自PALL的Omega Centramate T OS100T02,PES100kDa和来自Sartorius的具有100kDa和300kDa的MWCO的基于PES的膜)。在TMP筛选实验中,不同的膜表现相似。大体上,dp和TMP越高,测得的通量越高(表5)。在较高的TMP值下,该过程倾向于通过形成滤饼层(达到最大渗透通量,独立于TMP的渗透通量)而被控制。
表5:参数筛选的结果
尽管较高的dp和TMP值可能导致通量率的增加,但选择了以下用于大规模实验的参数(表6):
表6:对RP-HPLC库进行TFF而选定的参数
进料压力(p1) | 渗余压力(p2) | 渗透压力(p3) | dp | TMP |
0.1至0.2MPa | 0.05至0.1MPa | 0MPa | 0.05至0.1MPa | 0.075至0.15MPa |
选择表6中所示的TMP和dp的范围是因为在这些条件下该过程不是完全的滤饼层驱动。尽管较高的dp值(特别是较高的p1值)导致通量率的进一步增加,但由于泵力的限制,在大规模过程中的应用受到阻碍。此外,就RNA稳定性而言,较低的剪切力(较低的dp和TMP值)是优选的。
11.2-通过TFF耗尽亚精胺
在第一个实验中,浓缩的RP-HPLC库用水(WFI)渗滤。在这种情况下,观察到在最终RNA溶液中的相对高的残留亚精胺浓度。为了消除亚精胺,在最终渗滤至水之前引入额外的渗滤步骤。筛选不同的渗滤溶液(表7)。在RP-HPLC纯化后,将约5至10mL含RNA(R2564)的溶液利用100至200mL的渗滤溶液渗滤,随后用100至200mL的水渗滤。在此,应用一次性使用的具有在10至100kDa之间的MWCO的基于PES的Vivaflow膜盒(Sartorius)。分别在10、20、30和40个渗滤交换体积后分析样品。最后,将渗余物浓缩至约0.5g/L,并且如示例6.3中所述测定亚精胺的量。作为对照,不用TFF调节RNA,而用氯化锂沉淀进行沉淀(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning,a laboratory manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press 1989),污染的亚精胺如示例6.3中所述进行确定。
结果总结在表7中。
表7:利用不同渗滤溶液进行TFF后的亚精胺浓度
采用纯水或20mM磷酸钠利用TFF对RP-HPLC库进行渗滤不能有效除去RNA结合的亚精胺。高盐渗滤溶液的应用,例如基于NaCl的溶液,导致RNA结合的亚精胺的基本完全耗尽。此外,盐(例如TEAA)、有机溶剂(TEA、ACN)被有效地除去。
随后的优化实验已经证明NaCl浓度可以被降低到至少0.2M,以便在渗滤期间增加渗透通量率而不影响亚精胺的消耗效率。向浓缩的RP-HPLC库中直接加入NaCl(终浓度分别为约0.5M或0.2M)导致通过TFF更快耗尽亚精胺(需要较少的渗滤溶液以达到亚精胺耗尽)。在渗滤溶液中应用较高浓度的NaCl是不可取的,因为这可能导致RNA沉淀,并因此阻塞TFF膜。亚精胺耗尽步骤可以在RP-HPLC纯化之后或体外转录后直接进行。
11.3.-用于亚精胺耗尽步骤的不同膜的测试:
进一步分析了两种膜(Novasep mPES 100kDa和基于纤维素的SartoriusHydrosart 100kDa)。我们在较高的样品负荷(约2mg mRNA/cm2膜)下测试了两种用于渗滤的膜。对于浓缩和渗滤,选择以下参数:dp=1巴和TMP=1.5巴,膜负荷:2.0mg mRNA/cm2膜。将在WFI、0.1M TEAA、13%乙腈和0.2M NaCl中的mRNA从0.1g/l浓缩至5g/l,并测定通量率。进行10个渗滤体积(dv)的0.2M NaCl溶液的渗滤和10dv的WFI的渗滤。
结果:
380mg mRNA的浓缩和渗滤的总时间非常相似:NovaSet:2.8小时,Hydrosart:2.68小时。图7示出了渗滤步骤的各自的通量率。
示例12-对具有较高膜负荷的线性化反应物进行TFF
对于线性化反应物的浓缩和渗滤,我们测试了来自不同供应商(来自Sartorius的基于PES的膜Sartocon Slice 200和来自NovaSep的NovaSet-LS ProStream(低结合的mPES)和来自Sartorius的基于纤维素的膜Sartocon Slice 200的Hydrosart)的、具有100kDa的MWCO和200cm2的膜面积、具有高的膜负荷(5.6和6g质粒DNA/m2)、由不同材料制成的TFF膜。为了对转录反应物进行TFF而选择的参数也在这一步中应用,因为它们之前显示出良好的结果。因此,选择dp和TMP=1巴(P1=1.5巴,P2=0.5巴和P3=0巴)以将pDNA(P1452.8,120mg)从0.2g/l浓缩至约1.5g/l,之后用10个渗滤体积的WFI进行渗滤。
结果:
所有被测试的膜显示出相似的结果。在对线性化反应物进行浓缩过程中(图8A),通量率迅速下降,但在WFI渗滤期间(图8B),通量率再次升高。两种基于PES的膜(SartoriusPES和NovaSet mPES)均显示出相似的结果,但是Hydrosart膜(Sartorius)显示出较高的渗透通量率。
示例13-完整的过程
13.1-pDNA的线性化
根据示例2进行质粒DNA P1141的线性化。
13.2-利用TFF对线性化的pDNA进行浓缩和渗滤
对线性化反应物进行切向流过滤,使用Vivaflow50过滤盒(PES膜,MWCO 100kDa,Sartorius)。在组装渗滤装置之前,采用乙醇和水将所有产品接触组件(管、进料罐等)彻底洗涤。接下来,采用超纯水洗涤装置。然后,该装置用500mM NaOH溶液化学消毒。随后,用WFI洗涤装置直至在渗余物中测量pH值为7。然后,根据示例2向进料罐中填充150ml线性化反应物。
在第一浓缩步骤中,过滤约100ml限制性反应物,以获得具有较高pDNA浓度的5ml渗余物。接下来,将进料罐抽真空,并将进料管连接至WFI瓶。然后,进行10体积(共500ml)WFI的渗滤过程。随后,尽可能地浓缩渗余物。浓缩后,将渗余物收集在无菌的50ml反应管中。在DNA琼脂糖凝胶上分析渗余物(参见图9)。渗余物溶液储存在-20℃。对于琼脂糖凝胶电泳,通过测量260nm处的吸光度来确定DNA浓度。将指定量的DNA用于凝胶电泳。
结果
光度法测定浓缩和渗滤后的DNA浓度:
不同DNA样品的DNA浓度通过测量260nm处的吸收来确定:
表8:质粒浓度
在22ml的终体积中,渗余物中的dsDNA浓度用光度法测定为1.05g/l。利用TFF对线性化的pDNA进行渗滤产生96.6%的输入DNA(input DNA)。
琼脂糖凝胶电泳:
在浓缩步骤和渗滤步骤的渗透物中只有可忽略量的质粒DNA是可见的。
13.3-RNA体外转录
800ml体外转录混合物将如示例4所述在37℃下孵育3小时。
接下来,加入CaCl2和DNA酶I并随后在37℃下孵育2小时。
13.4-对转录反应物进行渗滤
利用具有两个PES膜(Sartorius,200cm2,100kDa)的TFF系统Sartoflow 200将转录反应物的三个等份(各400ml)的缓冲液与WFI交换(表9中指示的工艺参数)。首先,容器和管用超纯水、乙醇和WFI清洗。然后组装装置,根据制造商的说明将过滤器盒安装在Sartocon夹持器上。整个系统用超纯水清洗。随后,通过用1M NaOH洗涤1小时对系统进行化学消毒。然后,用WFI洗涤装置直到在渗余物中测定pH值为7,并用500ml WFI平衡系统。之后,将400ml转录反应物(参见13.3)加入到渗余物储存器中,将压力(dp和TMP)设定为1巴,并用10个渗滤体积(DFV)的注射用水(WFI)开始渗滤过程。在利用TFF进行渗滤后,用光度法测量RNA浓度。
表9:用于对转录反应物进行渗滤的TFF参数
结果:
渗滤后RNA的最终浓度为5g/l,通过渗滤进行缓冲液交换后的RNA的总回收率为98%。
示例13.5-对经调节的转录反应物进行RP-HPLC纯化
通过添加1M乙酸三乙铵(TEAA)和WFI,将由示例13.4获得的RNA溶液稀释至100mMTEAA和1g/l的浓度。按照示例5逐步纯化RNA。收集HPLC级分(fraction),收集含有产物的级分并分成三个库I至III。
此外,分析各级分的RNA含量(UV260/280),并分析每个级分的RNA完整性。
结果:
表10:在RP-HPLC纯化后确定RNA浓度和RNA完整性
与起始材料(TFF调节的RNA)相比,通过分离降解(aborted)的RNA种类,完整性可以提高>10%(RP-HPLC之前86.5%的RNA完整性)。
示例13.6-通过TFF对RP-HPLC库进行浓缩和渗滤
三个RP-HPLC纯化的RNA库利用TFF通过额外的浓缩和渗滤步骤分别处理,以进一步从杂质(例如亚精胺污染物)分离RNA并交换溶剂。
首先,利用TFF将每个库从0.12g/l浓缩至约5g/l。将5M NaCl溶液加入渗余物中以获得0.2M NaCl的最终浓度。然后,对0.2M NaCl进行渗滤(10DFV)以除去亚精胺杂质。接下来,将渗滤溶液与WFI(10DFV)交换。工艺参数如表11所示。在TFF之后通过测量260nm处的吸光度来确定RNA浓度。对于琼脂糖凝胶电泳,将指定量的RNA用于凝胶电泳。
表11:用于RP-HPLC库的TFF的参数
结果:
渗滤后的产率通过分光光度测定分别为94.44%、94.3%和90.5%。
琼脂糖凝胶电泳:
分析RP-HPLC纯化后的TFF渗滤过程的样品。利用琼脂糖凝胶电泳分析各个样品(参见图10)。各个RNA琼脂糖凝胶的加载方案如表12所示。
表12:在对RP-HPLC库进行TFF期间采集的渗透物和渗余物样品的加载方案。
结果:
TFF渗透物样品中不含有可检测水平的RNA(即使样品已被浓缩了40倍)。
TFF渗余物样品和最终的TFF调节的RNA库含有约100%完整性的RNA,所有带有2476个碱基的条带都符合理论上预期的大小。
示例13.7-利用BCA测定法测定蛋白质含量
为了确定样品中的蛋白质含量,采用BCA-测试。与蛋白质标准品(牛血清白蛋白,BSA)相比,通过在562nm处的吸光度光度测量样品中含有的总蛋白质浓度。利用可商购获得的BCA试剂盒根据制造商的说明进行测试。
为了制备20μg/ml牛血清白蛋白(BSA)溶液储备液,将20μl BSA溶液[1mg/ml]与980μl注射用水混合。将该BSA储备溶液用于利用不同浓度的BSA溶液(每种50μl,稀释于WFI)产生标准曲线:2.5μg/ml;5μg/ml;10μg/ml;15μg/ml;20μg/ml。
测量来自线性化反应后进行TFF的样品(示例13.2)、来自转录反应物的样品(示例13.3)、来自RP-HPLC之前进行TFF的样品(示例13.4)和来自RP-HPLC之后用0.2M NaCl进行TFF的样品(示例13.5和13.6)中的蛋白质含量。
结果:
测量在标准光度计上进行。结果显示在表13中。
表13:测量的蛋白质浓度
显示了BCA测定法的数值。1:线性化反应后的TFF渗余物;2:转录反应物;3-5:RP-HPLC前转录反应物的TFF渗余物;6-8:RP-HPLC后转录反应物的TFF渗余物
可以观察到在整个RNA纯化过程中单位RNA的蛋白质含量的逐步消耗。
SDS-PAGE:
SDS-PAGE用于确定不同样品中的蛋白质含量。将指定量的样品用于SDS-PAGE。结果如图11所示。
表14:用于SDS PAGE的样品
RP-HPLC纯化后,样品中没有可检测到蛋白条带。
示例13.8-亚精胺浓度的测定
根据示例6.3,测定在RP-HPLC(示例13.4)之前TFF渗余物和RP-HPLC纯化之后利用0.2M NaCl进行TFF(示例13.5和13.6)的TFF渗余物中的亚精胺浓度。
结果:
表15:RNA样品中的亚精胺浓度
结果:
在RP-HPLC纯化之前,在TFF渗余物的样品中可检测到亚精胺。在通过RP-HPLC纯化和利用0.2M NaCl进行TFF的样品中,仅检测到非常少量的亚精胺(参见表15)。
示例13.9-有机溶剂的测定
乙腈(ACN)和TEAA的浓度根据示例6.4测定。
结果:
RP-HPLC纯化并进行TFF后的最终样品含有小于40ppm的ACN和小于2ppm的TEAA。
示例14-工艺和关键工艺参数的概述:
在下文中,举例说明了本发明方法的另一个示例,提供了用于每个单独步骤的方法的工艺参数,包括线性化反应物的浓缩和线性化的质粒DNA的渗滤,RNA体外转录反应物的渗滤以及RP-HPLC RNA库的浓缩和渗滤。
14.1-线性化反应物的浓缩和线性化的质粒DNA利用TFF的的渗滤:
如示例2中所述进行质粒DNA的线性化。对于线性化反应物(根据示例2进行)的切向流过滤,利用Hydrosart过滤盒(基于纤维素的膜,MWCO 100kDa,Sartorius)。如上所述(参见示例13)进行质粒DNA的浓缩过程以及渗滤过程。图12中提供了线性化混合物浓度的结果。图13中提供了线性化的质粒DNA的渗滤结果。相关的工艺参数总结在表16中。
表16:质粒DNA浓缩和渗滤的TFF工艺参数
14.2-利用TFF对RNA IVT反应物进行渗滤:
如示例4中所述进行RNA体外转录。对于RNA IVT反应物(根据示例4进行)的切向流过滤,利用Hydrosart过滤盒(基于纤维素的膜,MWCO 100kDa,Sartorius)。如上所述进行RNA IVT反应物的调节(参见示例13)。图14中提供了对RNA IVT反应物进行渗滤的结果。相关的工艺参数总结在表17中。
表17:RNA IVT反应渗滤的TFF工艺参数
14.3-对RP-HPLC RNA库进行浓缩和渗滤
如示例5所述,通过RP-HPLC纯化体外转录出的RNA。对于RP-HPLC RNA库的切向流过滤,利用Hydrosart过滤盒(基于纤维素的膜,MWCO 100kDa,Sartorius)。如上所述对RP-HPLC RNA库进行浓缩(参见示例13)。图15中提供了对RP-HPLC RNA进行浓缩的结果。如上所述(参见示例13),将RNA渗滤到0.2M NaCl中,并进一步将RNA渗滤到WFI中。图16中提供了对RP-HPLC RNA库进行渗滤的结果。相关的工艺参数总结在表18中。
表18:RP-HPLC RNA浓缩和渗滤的TFF工艺参数
实施方案列表:
1、一种产生和纯化RNA的方法,该方法包括以下步骤:
A)提供编码RNA的DNA;
B)转录DNA以产生包含转录出的RNA的溶液;和
C)通过一个或多个切向流过滤(TFF)步骤调节和/或纯化包含转录出的RNA的溶液。
2、根据项1所述的方法,其中在步骤A)中提供质粒DNA作为编码RNA的DNA,并且该方法包括步骤A)之后的步骤:
A1)在线性化反应中线性化质粒DNA;
A2)任选地终止线性化反应;和
A3)通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化包含线性化的质粒DNA的线性化反应物。
3、根据项1或2所述的方法,其中步骤C)包括利用TFF的至少一个渗滤步骤和/或至少一个浓缩步骤。
4、根据项3所述的方法,其中步骤C)中至少一个利用TFF的渗滤步骤包括采用盐水溶液的渗滤。
5、根据项4所述的方法,其中盐水溶液是NaCl溶液,优选包含约0.1M NaCl至约1MNaCl的水溶液,更优选包含约0.2至约0.5M NaCl的溶液。
6、根据项3所述的方法,其中步骤C)中至少一个利用TFF的渗滤步骤包括采用水的渗滤。
7、根据项1至6中任一项所述的方法,其中所述方法不包括酚/氯仿提取和/或DNA和/或RNA沉淀的步骤。
8、根据项1至7中任一项所述的方法,其中所述方法不包括使用TFF中空纤维膜的步骤。
9、根据项1至8中任一项所述的方法,其中所述至少一个或多个TFF步骤包括使用具有≤500kDa、优选≤200kDa且最优选≤100kDa的截留分子量的TFF膜。
10、根据项1至9中任一项所述的方法,其中所述至少一个或多个TFF步骤包括使用包含聚醚砜(PES)、改性聚醚砜(mPES)、纤维素衍生物膜或它们的组合中的至少一种的TFF膜。
11、根据项1至10中任一项的方法,其中所述至少一个或多个TFF步骤包括使用包含具有约100kDa的截留分子量的纤维素衍生物膜的TFF膜。
12、根据项1至11中任一项所述的方法,其中所述至少一个或多个TFF步骤包括使用TFF膜盒。
13、根据项1至12中任一项所述的方法,其中所述方法在步骤C)中包括在一个或多个TFF步骤之前或之后的至少一种另外的纯化方法。
14、根据项1至13中任一项所述的方法,其中所述方法在步骤C)中包括以下步骤:
C1)任选地终止转录;
C2)通过一个或多个TFF步骤调节和/或纯化包含转录出的RNA的溶液;
C3)通过任何另外的纯化方法纯化RNA;和
C4)通过一个或多个TFF步骤调节和/或任选地纯化步骤C3)之后获得的包含转录出的RNA的溶液。
15、根据项14所述的方法,其中步骤C2)包括采用水的至少一个利用TFF的渗滤步骤和/或采用盐水溶液、优选NaCl水溶液、且更优选采用包含约0.1M NaCl至约1M NaCl的水溶液、更优选包含约0.2至约0.5M NaCl的溶液的至少一个渗滤的步骤。
16、根据项14或15所述的方法,其中步骤C4)包括至少一个利用TFF的第一渗滤步骤。
17、根据项16所述的方法,其中步骤C4)包括至少一个利用TFF的第二渗滤步骤。
18、根据项16或17中任一项所述的方法,其中步骤C4)中至少一个利用TFF的第一渗滤步骤包括采用盐水溶液、优选NaCl水溶液、且更优选采用包含约0.1M NaCl至约1MNaCl的水溶液、更优选包含约0.2至约0.5M NaCl的溶液的渗滤。
19、根据项17或18所述的方法,其中步骤C4)中利用TFF的所述第二渗滤步骤包括采用水的渗滤。
20、根据项13至19中任一项所述的方法,其中所述至少一种另外的纯化方法通过高效液相色谱法(HPLC)或低常压液相色谱法进行。
21、根据项13至20中任一项所述的方法,其中所述至少一种另外的纯化方法是反相色谱法。
22、根据项1至21中任一项所述的方法,其中所有的TFF步骤均使用相同的TFF膜进行。
23、根据项1至22中任一项所述的方法,其中所述转录出的RNA选自由mRNA、病毒RNA、逆转录病毒RNA和复制子RNA、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、CRISPR RNA、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激RNA、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)和与Piwi相互作用的RNA(piRNA)或全细胞RNA组成的组,且优选为mRNA。
24、根据项1至23中任一项所述的方法,其中步骤B)中的转录DNA以体外转录进行。
Claims (33)
1.一种产生和纯化RNA的方法,所述方法包括以下步骤:
A)提供编码所述RNA的DNA;
B)体外转录所述DNA以产生包含转录出的RNA的溶液;和
C)通过一个或多个切向流过滤(TFF)步骤渗滤和/或浓缩和/或纯化所述包含转录出的RNA的溶液,其中所述方法在步骤C)中包括在所述一个或多个TFF步骤之前的至少一种另外的纯化方法,其中所述另外的纯化方法通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行,
其中所述一个或多个TFF步骤包括使用TFF膜盒。
2.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤A)中提供质粒DNA作为编码所述RNA的DNA,并且所述方法包括步骤A)之后的步骤:
A1)在线性化反应中线性化所述质粒DNA;
A2)任选地终止所述线性化反应;和
A3)通过一个或多个TFF步骤渗滤和/或浓缩和/或纯化包含线性化的质粒DNA的线性化反应物。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中步骤C)包括至少一个利用TFF的渗滤步骤和/或至少一个利用TFF的浓缩步骤。
4.根据权利要求3所述的方法,其中步骤C)中所述至少一个利用TFF的渗滤步骤包括采用盐水溶液的渗滤。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述盐水溶液是NaCl溶液。
6.根据权利要求3所述的方法,其中步骤C)中所述至少一个利用TFF的渗滤步骤包括采用水的渗滤。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法不包括使用TFF中空纤维膜的步骤。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述一个或多个TFF步骤包括使用具有≤500kDa的截留分子量的TFF膜。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述一个或多个TFF步骤包括使用包含聚醚砜(PES)、改性聚醚砜(mPES)、纤维素衍生物膜或它们的组合中的至少一种的TFF膜。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述一个或多个TFF步骤包括使用包含具有100kDa的截留分子量的纤维素衍生物膜的TFF膜。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法在步骤C)中包括以下步骤:
C1)任选地终止转录;
C2)通过一个或多个TFF步骤渗滤和/或浓缩和/或纯化所述包含转录出的RNA的溶液;
C3)通过另外的纯化方法纯化所述RNA,其中所述另外的纯化方法不包括酚/氯仿提取和/或DNA和/或RNA沉淀的步骤;和
C4)通过一个或多个TFF步骤渗滤和/或浓缩和/或纯化步骤C3)后获得的所述包含转录出的RNA的溶液。
12.根据权利要求11所述的方法,其中步骤C2)包括采用水的利用TFF的渗滤和/或采用盐水溶液的渗滤的至少一个步骤。
13.根据权利要求11所述的方法,其中步骤C4)包括至少一个利用TFF的第一渗滤步骤。
14.根据权利要求13所述的方法,其中步骤C4)包括至少一个利用TFF的第二渗滤步骤。
15.根据权利要求13所述的方法,其中步骤C4)中所述至少一个利用TFF的第一渗滤步骤包括采用盐水溶液的渗滤。
16.根据权利要求14所述的方法,其中步骤C4)中所述利用TFF的第二渗滤步骤包括采用水的渗滤。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所有的TFF步骤均使用相同的TFF膜进行。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述TFF膜如权利要求7所定义。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述TFF膜是纤维素衍生物膜。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述转录出的RNA选自由mRNA、病毒RNA、逆转录病毒RNA和复制子RNA、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、CRISPR RNA、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激RNA、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)和与Piwi相互作用的RNA(piRNA)或全细胞RNA组成的组。
21.一种产生和纯化RNA的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供编码所述RNA的质粒DNA;
b)在线性化反应中线性化所述质粒DNA;
c)任选地终止所述线性化反应;
d)通过一个TFF步骤对包含线性化的质粒DNA的线性化反应物进行浓缩;
e)通过一个TFF步骤对包含线性化的质粒DNA的线性化反应物进行渗滤;
f)转录所述DNA以产生包含转录出的RNA的溶液;
g)任选地终止转录;
h)通过一个TFF步骤对所述包含转录出的RNA的溶液进行渗滤;
i)通过至少一种另外的纯化方法纯化所述RNA,其中所述另外的纯化方法通过反相高效液相色谱法进行;
j)通过一个TFF步骤对步骤i)后获得的所述包含转录出的RNA的溶液进行浓缩;和
k)通过利用TFF的第一步骤和第二步骤对步骤j)之后获得的所述包含转录出的RNA的溶液进行渗滤;
其中步骤j)或步骤k)中的所述TFF包括使用TFF膜盒。
22.根据权利要求21所述的方法,其中步骤k)中利用TFF的第一渗滤步骤包括采用盐水溶液的渗滤。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述盐水溶液是NaCl溶液。
24.根据权利要求21所述的方法,其中步骤k)中利用TFF的第二渗滤步骤包括采用水的渗滤。
25.根据权利要求21所述的方法,其中所述方法不包括使用TFF中空纤维膜的步骤。
26.根据权利要求21所述的方法,其中每个TFF步骤包括使用具有≤500kDa的截留分子量的TFF膜。
27.根据权利要求21所述的方法,其中每个TFF步骤包括使用包含聚醚砜(PES)、改性聚醚砜(mPES)、纤维素衍生物膜或它们的组合中的至少一种的TFF膜。
28.根据权利要求21所述的方法,其中每个TFF步骤包括使用包含具有100kDa的截留分子量的纤维素衍生物膜的TFF膜。
29.根据权利要求21所述的方法,其中所有TFF步骤均使用相同的TFF膜进行。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述TFF膜是纤维素衍生物膜。
31.根据权利要求21所述的方法,其中每个TFF步骤包括使用TFF膜盒。
32.根据权利要求21所述的方法,其中所述转录出的RNA由mRNA、病毒RNA、逆转录病毒RNA和复制子RNA、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、CRISPR RNA、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激RNA、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)和与Piwi相互作用的RNA(piRNA)或全细胞RNA组成的组。
33.根据权利要求21所述的方法,其中步骤f)中的转录所述DNA以RNA体外转录进行。
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