JP2009544754A - ジヌクレオチドmrnaキャップアナログ - Google Patents
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Abstract
容易に合成され、高レベルのキャップ効率および転写効率および改善された翻訳効率をもたらす新規なキャップアナログが提供される。このようなキャップは、ジヌクレオチドキャップの一方または両方のグアノシンのN7位ならびにリボース環上の3’位でメチル化される。リボース環上の置換基はまた、正方向の配向で取り込まれるキャップをもたらす。キャップされたアナログを調製するのに有用な方法もまた提供され、このようなアナログを含むmRNA種を使用することおよび新規なキャップアナログを含むキットもまた本明細書で想定される。
Description
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2006年7月28日に出願された米国特許出願第60/820,771号(これは、参考として本明細書に援用される)からの優先権を主張する。
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2006年7月28日に出願された米国特許出願第60/820,771号(これは、参考として本明細書に援用される)からの優先権を主張する。
連邦政府の基金によって後援された研究または開発についての陳述
本明細書に記載される研究は、National Institutes of Healthによって授与されたSBIR助成金(SBIR Phase II、No.R44GM070156−02)によって少なくとも一部で基金提供を受けた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
本明細書に記載される研究は、National Institutes of Healthによって授与されたSBIR助成金(SBIR Phase II、No.R44GM070156−02)によって少なくとも一部で基金提供を受けた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
本明細書に使用されるセクションの見出しは、単に組織化の目的のためであり、いかなる場合においても本明細書に記載される内容を限定するものとしてみなされるべきではない。
導入
真核生物のmRNAは、その5’−末端に「キャップ」構造を有し、これは、翻訳において重要な役割を果たすことが良く知られている。天然に存在するキャップ構造は、三リン酸架橋(triphosphate bridge)を介して最初に転写されたヌクレオチドの5’−末端に連結し、m7G(5’)ppp(5’)N(ここで、Nは、任意のヌクレオチドである)をもたらす7−メチルグアノシンからなる。mRNAは、遺伝子発現において重要な役割を果たし得る。これは、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを保護し、核から細胞質へのRNAの輸送を可能にし、そして翻訳開始複合体の組立てに加わる。m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP)は、5’−末端にキャップ構造を有するRNAを得るために、インビトロでのT7またはSP6 RNAポリメラーゼによる転写においてプライマーとして使用されてきた。インビボでは、キャップは、酵素によって付加される。しかしながら、過去20年以上にわたり、多くの研究が、インビトロで合成されたmRNAを補充したインビトロ翻訳抽出物におけるタンパク質の合成を必要としていた。キャップされたmRNAのインビトロ合成のための一般的な方法は、転写の開始因子としての形態m7G(5’)ppp(5’)Gの予め形成されたジヌクレオチドを使用する。mCAP(擬対照的な(pseudosymmetrical)ジヌクレオチド)を使用することの欠点は、G部分またはm7G(m7Guo)部分の3’−OHが転写の伸長のための開始求核試薬(initiating nucleophile)として働く傾向が常にあることである。このことは、転写反応のイオン条件に依存して、ほぼ等しい割合で、形態m7G(5’)pppG(pN)nおよびG(5’)ppp7G(pN)nの2つの異性体のRNAの合成をもたらす。このことは、種々の下流のプロセス(例えば、インビトロ翻訳または結晶化研究)に問題となり得る。
真核生物のmRNAは、その5’−末端に「キャップ」構造を有し、これは、翻訳において重要な役割を果たすことが良く知られている。天然に存在するキャップ構造は、三リン酸架橋(triphosphate bridge)を介して最初に転写されたヌクレオチドの5’−末端に連結し、m7G(5’)ppp(5’)N(ここで、Nは、任意のヌクレオチドである)をもたらす7−メチルグアノシンからなる。mRNAは、遺伝子発現において重要な役割を果たし得る。これは、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを保護し、核から細胞質へのRNAの輸送を可能にし、そして翻訳開始複合体の組立てに加わる。m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP)は、5’−末端にキャップ構造を有するRNAを得るために、インビトロでのT7またはSP6 RNAポリメラーゼによる転写においてプライマーとして使用されてきた。インビボでは、キャップは、酵素によって付加される。しかしながら、過去20年以上にわたり、多くの研究が、インビトロで合成されたmRNAを補充したインビトロ翻訳抽出物におけるタンパク質の合成を必要としていた。キャップされたmRNAのインビトロ合成のための一般的な方法は、転写の開始因子としての形態m7G(5’)ppp(5’)Gの予め形成されたジヌクレオチドを使用する。mCAP(擬対照的な(pseudosymmetrical)ジヌクレオチド)を使用することの欠点は、G部分またはm7G(m7Guo)部分の3’−OHが転写の伸長のための開始求核試薬(initiating nucleophile)として働く傾向が常にあることである。このことは、転写反応のイオン条件に依存して、ほぼ等しい割合で、形態m7G(5’)pppG(pN)nおよびG(5’)ppp7G(pN)nの2つの異性体のRNAの合成をもたらす。このことは、種々の下流のプロセス(例えば、インビトロ翻訳または結晶化研究)に問題となり得る。
メチル化されていないキャップアナログは、グアノシン上のメチル基が除去された改変キャップアナログである。N7でのグアノシンのメチル化および3’O−メチル化および5’二リン酸合成のための選択的手順は、確立されている(非特許文献1および非特許文献2)。アンチリバースキャップアナログ(Anti−Reverse Cap Analog)(ARCA)は、3’OH基がOCH3で置換された改変キャップアナログである。ARCAおよび三重メチル化キャップアナログは、正方向の配向で取り込まれる。
細胞において、キャップは、核において付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによって触媒される。RNAの5’末端へのキャップの付加は、転写後に生じるが、それをほとんど検出できないように転写開始の直後に生じる。末端のヌクレオチドは、常にグアニンであり、それは、全ての他のヌクレオチドに対して逆方向の配向(すなわち、5’Gppp5’GpNpNp…)であり、キャップは、5’−5’三リン酸結合によって接続された2つのヌクレオチドを含む。
RNAの転写は、通常、ヌクレオシド三リン酸(通常、プリン、AまたはG)で開始する。転写がインビトロで生じる場合、それは、代表的に、ファージRNAポリメラーゼ(例えば、T7、T3またはSP6)、ファージポリメラーゼプロモーターを含むDNA鋳型、ヌクレオチド(ATP、GTP、CTPおよびUTP)およびマグネシウム塩を含む緩衝液を含む。キャップされたRNAの合成は、転写反応においてキャップアナログ(例えば、N7メチルGpppGまたはm7GpppG)の取り込みを含む。過剰なm7GpppG対GTP(4:1)は、各転写物が5’キャップを有する機会を増大させるのに有利に働く。Ambion(Ambion,Inc.、Austin、TX、a business of Applied Biosystems)からのmMESSAGE mMACMNE(登録商標)キットは、この比率を推奨し、代表的に、80%のキャップされたRNA対20%のキャップされていないRNAを得るが、GTPが転写物の伸長に必要とされるので、GTP濃度が律速になるにつれて、総RNAの総収量はより低くなる。
5’キャップ構造は、真核生物のリボソームを結合するのを助け、適切なAUG開始コドン(initiator codon)の認識を確実にすることによってmRNAの翻訳を増強する。この作用は、翻訳系および合成されている特定のmRNAによって変動し得る。コンセンサス配列5’−GCCACCAUGG−3’(「Kozak」配列としても公知である)は、真核生物mRNAの中で最も強力なリボソーム結合シグナルであると考えられている。効率的な翻訳の開始のために、重要なエレメントは、+1位のG残基および−3位のA残基である。
翻訳の間、キャップは、翻訳開始因子eIF−4Eに結合し、CBCは追加の開始因子を補充する。脱キャップ化(decapping)は、キャップへ結合するeIF−4Eと競合するタンパク質dcp1およびdcp2によって触媒される。翻訳は、mRNAによってコードされ、一緒になってペプチドを形成するアミノ酸をもたらし、そして翻訳は、3つのプロセス(開始、伸長および終止)として生じる。真核生物における開始は、リボソームの結合を含み、リボソームは、最初のメチオニンコドンについてmRNAをスキャンする。伸長は、終止コドン(翻訳を終止させる)に達するまで、アミノ酸の連続的な付加とともに進行する。
特定の遺伝子をコードするキャップされたRNAは、真核生物細胞にトランスフェクトされ得るか、細胞または胚において翻訳された産物の影響を研究するために細胞または胚へ微量注入され得る。キャップされていないRNAを使用した場合、これらの実験におけるRNAは迅速に分解され、翻訳されたタンパク質の収量は大いに減少する。
患者から単離された樹状細胞は、免疫原をコードするキャップされたRNAでトランスフェクトすることができる。樹状細胞は、キャップされたRNAをタンパク質へ翻訳し、このタンパク質は、このタンパク質に対する免疫応答を惹起する。小規模なヒト研究において、CEAキャップされたRNAを入れた樹状細胞での免疫療法は、膵患者(pancreatic patient)に対して安全かつ実行可能であることが示されている(非特許文献3)。未熟な樹状細胞へ単一キャップされたRNA種を導入することが、特異的なT−細胞応答を惹起したことも留意されている(非特許文献4)。
最近の文献は、2’OH基または3’OH基のいずれかでのm7Guoの化学的な改変が、たとえ2’OH基がホスホジエステル結合に関与しなくとも、もっぱら正方向の配向で取り込まれたキャップをもたらすことを明らかにする。この観察が、m7Guoの2’OHおよび3’OHの改変ならびに二重メチル化されたキャップアナログおよび三重メチル化されたキャップアナログを生成するためのm7Guoの改変についての調査を促進した。
Kore,A.およびParmar,G.Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids(2006)25:337〜340
Kore A.R.ら、Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids(2006)25(3):307〜14
Morseら、Int.J.Gastroinstest.Cancer(2002)32:1〜6
Heiserら、J.Clin.Invest.(2002)109:409〜417
以下:
式:
式:
式:
AまたはBがハロゲンである場合、このハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。グアノシン分子間のホスホジエステル結合は、三リン酸結合、四リン酸結合または五リン酸結合であり得る。
5’末端に先に記載される構造のうちの一つが取り込まれたRNA分子もまた提供される。
RNA転写物をキャップするためのキットもまた提供され、このキットは、処方物:a)請求項1に記載の構造:
ジヌクレオチドキャップアナログを合成する方法もまた提供され、この方法は、a)リボース環上に2’置換基および3’置換基のうちの少なくとも1つを含む第一のヌクレオシドを提供する工程、b)この第一のヌクレオシドをリン酸化して、第一のヌクレオチドを形成する工程、c)この第一のヌクレオチドをメチル化する工程、d)2’リボース環置換基を必要に応じて含むリン酸化された第二のヌクレオチドを添加する工程、ならびにe)この第一のヌクレオチドとこの第二のヌクレオチドを連結して、ジヌクレオチドキャップアナログを形成する工程、を包含する。
本教示のこれらおよび他の特徴が本明細書に示される。
当業者は、以下に記載される図面が、単に説明目的のためであることを理解する。これらの図面は、いかなる場合においても本教示の範囲を限定するとは意図されない。
種々の実施形態の説明
本明細書を解釈する目的のため、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語はまた複数形を含み、またその逆も同様である。以下に示される任意の定義が任意の他の書類(参考として本明細書に援用されるあらゆる書類を含む)における単語の使用法と対立する場合、例えば、その用語が元来使用される書類を解釈することにおいて反対の意味が明確に意図されない限り、本明細書および付随する特許請求の範囲を解釈する目的のために、以下に示される定義が常に支配する。本明細書における「または」の使用は、別様に記載されるか、「および/または」の使用が明らかに不適切である場合でない限り、「および/または」を意味する。本明細書における「1つの(a)」の使用は、別様に記載されるか、「1つ以上」の使用が明らかに不適切である場合でない限り、「1つ以上」を意味する。「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」および「含む(including)」の使用は交換可能であり、限定するとは意図されない。
本明細書を解釈する目的のため、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語はまた複数形を含み、またその逆も同様である。以下に示される任意の定義が任意の他の書類(参考として本明細書に援用されるあらゆる書類を含む)における単語の使用法と対立する場合、例えば、その用語が元来使用される書類を解釈することにおいて反対の意味が明確に意図されない限り、本明細書および付随する特許請求の範囲を解釈する目的のために、以下に示される定義が常に支配する。本明細書における「または」の使用は、別様に記載されるか、「および/または」の使用が明らかに不適切である場合でない限り、「および/または」を意味する。本明細書における「1つの(a)」の使用は、別様に記載されるか、「1つ以上」の使用が明らかに不適切である場合でない限り、「1つ以上」を意味する。「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」および「含む(including)」の使用は交換可能であり、限定するとは意図されない。
全体に亘って使用される場合、「Me」は「CH3」と同等であり、「OCH3」または「OMe」はメチル基に結合した酸素原子を示し、「CHO」は水素原子(H)に結合した炭素原子(C)および酸素原子(O)への二重結合(O=CH−)を意味し、「Et」はC2H5を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ARCA」またはアンチリバースキャップアナログとは、その3’OH基がOCH3で置換される改変キャップアナログをいう。その構造はm2 7,3’0(5’)Gppp(5’)Gと表される。
本明細書で使用される場合、用語「キャップ」とは、翻訳または局在化を促進するか、および/またはRNA転写物の5’末端に取り込まれた場合、そのRNA転写物の分解を防止する、伸長不能なジヌクレオチドをいい、代表的にm7GpppG構造またはm7GpppA構造を有する。それは、実際には、5’〜3’ではなく反対の配向(5’〜5’)で3つのリン酸基を介して分子の残りに結合されている改変塩基7−メチルグアノシンからなる(すなわち、P1−グアノシン−5’−イルP3−7−メチルグアノシン−5’−イル三リン酸(m7G5’ppp5’G))。
本明細書で使用される場合、用語「キャップアナログ」とは、単一のエレメントのみしか異なっていない可能性があるRNAキャップの構造上の誘導体をいう。
本明細書で使用される場合、用語「二重メチル化」キャップ(dm−CAP)とは、各N7位が−CH3基を含むジヌクレオチドキャップの各々のグアノシン分子をいう。これは、m7(5’)Gppp(5’)m7Gと示される。
本明細書で使用される場合、用語「三重メチル化」キャップ(tm−CAP)とは、ジヌクレオチドキャップのグアノシン分子の各N7位における−CH3基およびグアノシン分子のうちの1つのリボース環の2’位または3’位におけるさらなるOCH3基の存在をいう。tmCAPは、m2 7,2’O(5’)Gppp(5’)m7G、m2 7,3’O(5’)Gppp(5’)m7G、m7(5’)Gppp(5’)m2 7,2’OGまたはm7(5’)Gppp(5’)m2 7,3’O−Gと示される。
本明細書で使用される場合、用語「酵素的に取り込み可能な」とは、、鋳型依存性または鋳型非依存性のポリメラーゼ酵素の作用を介して、ポリヌクレオチド鎖の末端(例えば、3’末端)に、またはポリヌクレオチド鎖のニックトランスレーションによって内部に、ヌクレオチドが酵素的に取り込まれ得ることを意味する。ヌクレオチド−5’−三リン酸は、酵素的に取り込み可能なヌクレオチドの一例である。
本明細書で使用される場合、用語「酵素的に伸長可能な」または「3’伸長可能な」とは、酵素作用によってヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに付加され得るヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味する。3’ヒドロキシル基を含むポリヌクレオチドは、酵素的に伸長可能なポリヌクレオチドの一例である。
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」とは、フッ素(F)、塩素(Cl)、臭素(Br)、ヨウ素(I)およびアスタチン(At)を含む元素の周期表の第7A属の非金属元素をいう。ハロゲンは、一価であり、容易に陰イオンを形成し、化合物またはイオンとして生じる。
本明細書で使用される場合、用語「ロックト核酸(locked nucleic acid)」(LNA)とは、2’Oメチレンビシクロヌクレオチドモノマーと4’Cメチレンビシクロヌクレオチドモノマーとの間の架橋をいう。
本明細書で使用される場合、用語「核酸塩基(nucleobase)」とは、窒素を含む複素環式部分核酸塩基をいう。適切な核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン(pseudoisocytosine)、2−チオウラシル、2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(8−アザ−7−デアザアデニン)が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」とは、リボース糖またはそのアナログのC−1’炭素に連結された核酸塩基から構成される化合物をいう。このリボース糖またはアナログは、置換されていても置換されていなくてもいい。置換リボース糖としては、1つ以上の炭素原子(好ましくは、3’−炭素原子)が、−R、−OR、−NRR(ここで、各R基は独立して−H、C1−C6アルキルまたはC3−C14アリールである)またはハロゲン(例えば、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード)のような1つ以上の同一または異なる置換基で置換されているリボースが挙げられるが、これらに限定されない。特に、リボースは、リボース、2’−デオキシリボース、2’,3’−ジデオキシリボース、3’−ハロリボース(例えば、3’−フルオロリボースまたは3’−クロロリボース)および3’−アルキルリボースである。代表的に、核酸塩基がAまたはGである場合、リボース糖は、この核酸塩基のN9位に結合している。核酸塩基がC、TまたはUである場合、ペントース糖は、この核酸塩基のN1位に結合している(KornbergおよびBaker、DNA Replication、第2版、Freeman,San Francisco,CA,(1992))。リボースアナログの例としては、例えば、アラビノース、2’−O−メチルリボースおよびロックトヌクレオシドアナログ(例えば、WO99/14226)が挙げられるが、多くの他のアナログもまた当該分野において知られている。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、モノマー単位としての、またはポリヌクレオチド内のヌクレオシドのリン酸エステルをいう。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド三リン酸」とは、5’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいう。
本明細書で使用される場合、本教示のヌクレオシドおよび/またはヌクレオチドは、「天然糖(natural sugar)」(すなわち、−リボースおよび2’−デオキシリボースなど)または糖アナログを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「糖アナログ」とは、糖リボースのアナログをいう。例示的なリボース糖アナログとしては、5個より多いかもしくは5個より少ない環原子を有する置換または非置換のフラノース(例えば、エリトロースおよびヘキソース)および置換または非置換の3−6個の炭素の非環式糖が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換フラノースおよび置換非環式糖は、1つ以上の炭素原子が、1つ以上の同一または異なる−R、−OR、−NRR(ここで、各Rは、独立して−H、(C1−C6)アルキルまたは(C3−C14)アリールである)またはハロゲン基で置換されているものである。5個の環原子を有する置換フラノースの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:2’−デオキシリボース、2’−(C1−C6)アルキルリボース、2’−(C1−C6)アルコキシリボース、2’−(C5−C14)アリールオキシリボース、2’,3’−ジデオキシリボース、2’,3’−ジデヒドロリボース、2’−デオキシ−3’−ハロリボース、2’−デオキシ−3’−フルオロリボース、2’−デオキシ−3’−クロロリボース、2’−デオキシ−3’−アミノリボース、2’−デオキシ−3’−(C1−C6)アルキルリボース、2’−デオキシ−3’−(C1−C6)アルコキシリボース、2’−デオキシ−3’−(C5−C14)アリールオキシリボース、3’−(C1−C6)アルキルリボース−5’−三リン酸、2’−デオキシ−3’−(C1−C6)アルキルリボース−5’−三リン酸、2’−デオキシ−3’−(C1−C6)アルコキシリボース−5’−三リン酸、2’−デオキシ−3’−(C5−C14)アリールオキシリボース−5’−三リン酸、2’−デオキシ−3’−ハロリボース−5’−三リン酸、2’−デオキシ−3’−アミノリボース−5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシリボース−5’−三リン酸または2’,3’−ジデヒドロリボース−5’−三リン酸。さらなる糖アナログはまた、構造:
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、交換可能に使用され、これらは、ヌクレオチドモノマーの一本鎖のポリマーおよび二本鎖のポリマーをいう。これらとしては、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連鎖(bond linkage)によって連結されたリボヌクレオチド(RNA)および2’−デオキシリボヌクレオチド(DNA)が挙げられる。ポリヌクレオチドは、もっぱらデオキシリボヌクレオチドから構成され得るか、もっぱらリボヌクレオチドから構成され得るか、またはこれらのキメラな(chimeric)混合物から構成され得る。
本明細書で使用される場合、用語「ターミネーター」とは、生じるポリヌクレオチド鎖への引き続くヌクレオチドの取り込みを妨害し、それによってポリメラーゼ媒介性の伸長を停止させる、酵素的に取り込み可能なヌクレオチドを意味する。代表的なターミネーターは、3’−ヒドロキシル置換基を欠き、例えば、2’,3’−ジデオキシリボース、2’,3’−ジデヒドロリボースおよび2’,3’−ジデオキシ−3’−ハロリボース(例えば、3’−デオキシ−3’−フルオロ−リボースまたは2’,3’−ジデオキシ−3’−フルオロリボースを含む。あるいは、2’,3’−ジデオキシ−β−D−リボフラノシル、β−D−アラビノフラノシル、3’−デオキシ−β−D−アラビノフラノシル、3’−アミノ−2’,3’−ジデオキシ−β−D−リボフラノシルおよび2’,3’−ジデオキシ−3’−フルオロ−β−D−リボフラノシルのようなリボフラノースアナログが使用され得る(例えば、Chidgeavadzeら、Nucleic Acids Res.,12:1671−1686(1984)、およびChidgeavadzeら、FEB.Lett.,183:275−278(1985)を参照のこと)。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆性のヌクレオチドターミネーターも含む(Metzkerら、Nucleic Acids Res.,22(20):4259(1994))。
本明細書で使用される場合、用語「伸長不能な」または「3’伸長不能な」とは、ターミネーターを、鋳型依存性のDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによって3’方向に伸長できないか、または実質的に伸長できない事実をいう。
本明細書で使用される場合、用語「TBDMS」とは、t−ブチルジメチルシリルをいう。
本明細書で使用される場合、用語「ない(void)」とは、キャップアナログのR1位に置換基が存在しないことをいう。置換基の欠如は、イミダゾール環上に陽電荷がないことをもたらす。一実施形態において、この置換基は、CH3基であり得る。このCH3基が存在する場合、イミダゾール環上に陽電荷が存在する。
キャップアナログは、転写反応において5’キャップされたRNA分子を合成するために使用される。転写反応における、GTPの部分のキャップアナログとの置き換えは、転写物の対応する画分へのキャップ構造の取り込みをもたらす。一般的に、キャップされたmRNAは、インビトロ翻訳系内の網状赤血球溶解物およびコムギ胚芽においてより効率的に翻訳される。キャップされていないmRNAは迅速に分解されるので、微量注入実験のためにインビトロ転写物がキャップされることが重要である。キャップアナログは、タンパク質合成の開始工程の高度に特異的なインヒビターとしても使用される。
一実施形態において、新規なARCA、二重メチル化されたキャップアナログおよび三重メチル化されたキャップアナログが開示される。これらのキャップ構造は、正方向の配向で結合するように(すなわち、5’Gppp5’GpNpNp....)合成および設計されている。生じた新規なキャップアナログは、図6、8および10に示されるように、標準的なキャップアナログと比較して、転写の収量および効率を改善することが実証されている。
これらのアナログはまた、リボース環の2’位および/または3’位に新規な置換基(これは、正方向の配向でのキャップの結合ももたらす)を有する。一実施形態において、リボース環の2’位または3’位に結合したフッ素が、図11および図12に示されるように、キャップ効率および翻訳効率の両方を改善することが示されている。
効率的にキャップされるだけではなく高レベルの転写されたRNAを得る、キャップされたRNAの合成は、満たされていない必要性の領域にある。Ambionによって使用される一つのアプローチは、米国特許出願公開第2005/0287539号(これは、参考として本明細書に援用される)に開示される。正方向の配向でのみ取り込まれるキャップアナログの合成は、転写および翻訳の効率を改善する。
米国特許第7,074,596号におけるDarynkiewiczらの教示は、アンチリバースキャップアナログのための合成方法およびメチル化方法を提示することを試みている。教示されるメチル化の方法は、本発明者らの手では再現性がなく、リンカーの合成もヌクレオチドを連結するための方法も再現性がなかった。
したがって、当該分野において、効率的にRNAを合成する高収量の転写反応に対する満たされていない必要性が存在する。生じたRNAは、リボザイム研究、アンチセンス研究および生物物理学研究ならびに遺伝子アレイ分析を含む種々の適用に用途が見出される。さらに、キャップされたRNA転写物を、インビボ発現(例えば、微量注入実験、トランスフェクション実験および感染実験)およびインビトロ翻訳のようなタンパク質合成を必要とする適用のために使用する。
合成mCAPが1回(time)あたり約50%でRNAに逆方向の配向で結合する課題を克服するために、NTPとキャップRNAとが匹敵する濃度で存在する場合、本発明の適用は、改変キャップアナログ、アンチリバースキャップアナログ(ARCA)ならびに二重メチル化キャップアナログおよび三重メチル化キャップアナログの合成のための化学的に便利でありかつ再現性のある方法を教示する(図1および図2)。
リボース環上の2’位および3’位における種々の部分が置換されているm7,2’FG[5’]ppp[5’]Gおよびm7,2’FG[5’]ppp[5’]m7G、二重メチル化キャップのような新規なキャップアナログの設計および合成が示される(図2)。
三重メチル化キャップもまた発見され、かつ合成される。このようなキャップとしては、m27,2’OG[5’]ppp[5’]m7G、m27,2’OG[5’]ppp[5’]m2’OG5、m27,3’OG[5’]ppp[5’]m7Gおよびm27,2’OG[5’]ppp[5’]m27,2’OGが挙げられる。さらに、標準的かつ従来のARCA キャップアナログと比較した、HeLa細胞を使用することによる転写効率、キャップ化効率および翻訳効率についての新規な改変キャップアナログの適合性の詳細が示される。
1H NMRおよび31P NMRによって構造を確認した。「アンチリバース」キャップアナログ(ARCA)を使用してT7 RNAポリメラーゼによって生成した転写物は、予測された長さであり、サイズおよび均質性においてm7GpppGで生成された転写物と見分けがつかなかった。HeLa細胞によってインビトロ転写されたRNAにおいて標準的なキャップアナログでキャップされたルシフェラーゼおよびARCAキャップされたルシフェラーゼを使用することによって、トランスフェクションアッセイを実行した。最後に、ルシフェラーゼ活性を測定し、ARCAキャップされた転写物が、m7GpppGキャップされた転写物のルシフェラーゼ活性の2.2〜2.5倍であることを明らかにした。この知見はまた、従来のインビトロ合成されたmRNAにおけるリバースキャップの存在がそれらの翻訳効率を低下させることも示唆する。
当業者は、多くの改変、代替物および等価物が可能であることを理解する。
全てのこのような改変、代替物および等価物は、本明細書に包含されることが意図される。
材料および方法
試薬
全ての試薬および溶媒は、他に述べられない限り、さらに精製することなく使用する。グアノシン5’−二リン酸、硫酸ジメチル、無水ジメチルホルムアミド、2,2’−ジチオジピリジン(Aldrithiol)、トリフェニルホスフィン、トリメチルホスフェート((OMe)3P)、オキシ塩化リン、五酸化リン、オルトリン酸、無水塩化メチレン、ジクロロメタン、トリブチルアミン、無水ピリジンを、Sigma−Aldrich Co.から購入した。3’−O−Me−グアノシンは、Chemgene,Boston,MAから利用可能である。イミダゾリドGMP、イミダゾリドGDP、イミダゾリド2’F−GMP、イミダゾリド3’CF3−GDP、イミダゾリドm7GMP、1M トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェートおよびトリブチルアンモニウムオルトホスフェートは、本明細書またはA.KoreおよびG.Parmar,Synthetic Comm.,36:3393−3399,2006(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)に教示されるように作製した。
試薬
全ての試薬および溶媒は、他に述べられない限り、さらに精製することなく使用する。グアノシン5’−二リン酸、硫酸ジメチル、無水ジメチルホルムアミド、2,2’−ジチオジピリジン(Aldrithiol)、トリフェニルホスフィン、トリメチルホスフェート((OMe)3P)、オキシ塩化リン、五酸化リン、オルトリン酸、無水塩化メチレン、ジクロロメタン、トリブチルアミン、無水ピリジンを、Sigma−Aldrich Co.から購入した。3’−O−Me−グアノシンは、Chemgene,Boston,MAから利用可能である。イミダゾリドGMP、イミダゾリドGDP、イミダゾリド2’F−GMP、イミダゾリド3’CF3−GDP、イミダゾリドm7GMP、1M トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェートおよびトリブチルアンモニウムオルトホスフェートは、本明細書またはA.KoreおよびG.Parmar,Synthetic Comm.,36:3393−3399,2006(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)に教示されるように作製した。
キャップアナログを、1H NMRおよび31P NMR(Bruker Avance),400MHzによって分析した.1Hを、400.1446006MHzで収集し、31Pを、161.9968531で収集し、両方ともQNPプローブを使用した。質量分析法(すなわち、Applied Biosystems/Sciex MDX API 150モデル)およびMALDI−TOF(Applied Biosystems Voyager DE−PROモデル)ならびに分析用HPLC(Aliance,Water’s)を、Hypersil SAXカラム、5μm、250×4.6mm(Altech)を使用して実行した。
本教示の局面は、以下の実施例を鑑みてさらに理解され得る。この実施例は、いかなる場合においても本教示の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
本教示は、種々の実施形態と組み合わせて記載されているが、本教示がこのような実施形態に限定されることを意図していない。それどころか、本教示は、当業者によって認識される種々の代替物、改変および等価物を包含する。
実施例1
7−メチルグアノシン5’−二リン酸の合成。攪拌棒を装着し、きれいでかつ乾燥した2000mL丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、氷酢酸でpHを4.0に調整した200mLの水に、遊離酸または対イオン形態としてのナトリウムのいずれかで、乾燥し、微細に粉末化されたグアノシン5’−二リン酸(1)、(10.0g、20.5mmol)をゆっくり溶解させる。次に、硫酸ジメチル(20mL、119.04mmol)を、室温で一定に攪拌しながら、1時間にわたって添加し、そして反応を、さらに1時間続けさせた。この時間の間、pHの低下が観察されたが、10 mM NaOHを滴下して加えることによって、pHをpH3.8〜4.0の間に維持した。メチル化を、進行について分析用HPLCによってモニタリングした。メチル化は、2時間以内に98%完了したと測定された。2時間後、反応混合物を、CHCl3(3×200mL)で抽出し、反応しなかった過剰の硫酸ジメチルを除去した。
7−メチルグアノシン5’−二リン酸の合成。攪拌棒を装着し、きれいでかつ乾燥した2000mL丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、氷酢酸でpHを4.0に調整した200mLの水に、遊離酸または対イオン形態としてのナトリウムのいずれかで、乾燥し、微細に粉末化されたグアノシン5’−二リン酸(1)、(10.0g、20.5mmol)をゆっくり溶解させる。次に、硫酸ジメチル(20mL、119.04mmol)を、室温で一定に攪拌しながら、1時間にわたって添加し、そして反応を、さらに1時間続けさせた。この時間の間、pHの低下が観察されたが、10 mM NaOHを滴下して加えることによって、pHをpH3.8〜4.0の間に維持した。メチル化を、進行について分析用HPLCによってモニタリングした。メチル化は、2時間以内に98%完了したと測定された。2時間後、反応混合物を、CHCl3(3×200mL)で抽出し、反応しなかった過剰の硫酸ジメチルを除去した。
生じた水層を、さらにロータリーエバポレータによって蒸発させ、あらゆるクロロホルムの痕跡を除去し、さらに、次に水で1.5Lに希釈し、陰イオン交換樹脂(すなわち、BPG 100カラムに充填されたDEAE Sepharosa fast flow(Amersham GE,Piscataway,NJ,USA))にロードした。BPG(生物学的処理ガラス(biological process glass))100の仕様:400mmの総容積(bed volume)までDEAE Sepharosa fast flow樹脂で充填した、100/500カラム(直径100mmおよび高さ50cm)。AKTA purifier 100 FPLC(Amersham GE)を使用し、100mL/分の流量で、4総容積の0%〜80%の勾配の1M TEAB緩衝液(重炭酸トリエチルアンモニウム)(pH7.5)を使用することによって所望の化合物を溶出した。45% TEAB緩衝液において、7−メチルグアノシン5’−二リン酸(m7GDP)を、254nmでの強力な紫外の吸光度を伴う大きなブロードなピークとして溶出した。残留する重炭酸塩を、メタノール(3×600mL)と共に蒸発させることによって除去した。生じた残渣を、遠心分離管に移し、1.1L アセトンに溶解させた8.9g 過塩素酸ナトリウムを添加し、2時間、4℃で冷却した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を捨てた。沈殿物を、新規な部(portion)のアセトンで粉砕し、冷却し、遠心分離し、これを一回反復した。沈殿物を、減圧デシケーター内でP2O5によって乾燥させた。生じた非晶質の白色粉末は7メチル−グアノシン5’−二リン酸であった。Kore,A.およびParmar,G.Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids,25:337−340,2006(この全体が、参考として援用される)から採用。
実施例2
ヌクレオシド−5’−二リン酸の合成
以下の手順はグアノシン−5’−二リン酸の合成を示すが、当業者は、アデノシン−5’−二リン酸、ウリジン−5’−二リン酸およびシチジン−5’−二リン酸ならびにそれらのアナログを合成するための手順を使用し得る。攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した500mL 丸底フラスコにおいて、無水ジメチルホルムアミド(200mL)中のグアノシン5’−一リン酸(10.0g、21.5mmol)のトリエチルアンモニウム塩を一緒に攪拌し、トリエチルアミン(2.4mL、142.8mmol)を添加し、5分間攪拌し、その後、イミダゾール(5.86g、86.1mmol)、2,2’−ジチオジピリジン(7.4g、33.58mmol)およびトリフェニルホスフィン(8.9g、33.9mmol)を添加した。攪拌を、2時間、室温で続けた。HPLCによって測定されるように反応を完了させ、次に、アセトン(1500mL)中の過塩素酸ナトリウム(7g)の混合物にゆっくり注ぎ、その後、4℃で30分間冷却した。反応混合物を遠心分離し、上清を捨てた。イミダゾールおよびトリフェニルホスフィンの痕跡を、固体を新規な部のアセトン(400mL)で粉砕することによって除去し、冷却し、再度遠心分離し、そしてこれを一回反復した。沈殿物を、24℃、真空オーブン内でP2O5によって乾燥させた(30mbarの圧力)。このようにして得たリボヌクレオシド−5’−ホスホロイミダゾリドを、ジメチルホルムアミド(dimethylforamide)(200mL)に溶解させ、そしてジメチルホルムアミド(80mL)中のトリブチルアンモニウムオルトホスフェートの1M溶液を、30分間にわたって、激しく攪拌した混合物に滴下して加えた。塩化亜鉛(2g、14.67mmol)を添加し、反応混合物を、室温で3時間攪拌した。反応の完了を、HPLCによってモニタリングした。反応混合物を、水(50mL)でクエンチし、クロロホルムで抽出し(3×200mL)、ロータリーエバポレータ内で濃縮し、次に陰イオン交換樹脂へ加えることによって精製した。
ヌクレオシド−5’−二リン酸の合成
以下の手順はグアノシン−5’−二リン酸の合成を示すが、当業者は、アデノシン−5’−二リン酸、ウリジン−5’−二リン酸およびシチジン−5’−二リン酸ならびにそれらのアナログを合成するための手順を使用し得る。攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した500mL 丸底フラスコにおいて、無水ジメチルホルムアミド(200mL)中のグアノシン5’−一リン酸(10.0g、21.5mmol)のトリエチルアンモニウム塩を一緒に攪拌し、トリエチルアミン(2.4mL、142.8mmol)を添加し、5分間攪拌し、その後、イミダゾール(5.86g、86.1mmol)、2,2’−ジチオジピリジン(7.4g、33.58mmol)およびトリフェニルホスフィン(8.9g、33.9mmol)を添加した。攪拌を、2時間、室温で続けた。HPLCによって測定されるように反応を完了させ、次に、アセトン(1500mL)中の過塩素酸ナトリウム(7g)の混合物にゆっくり注ぎ、その後、4℃で30分間冷却した。反応混合物を遠心分離し、上清を捨てた。イミダゾールおよびトリフェニルホスフィンの痕跡を、固体を新規な部のアセトン(400mL)で粉砕することによって除去し、冷却し、再度遠心分離し、そしてこれを一回反復した。沈殿物を、24℃、真空オーブン内でP2O5によって乾燥させた(30mbarの圧力)。このようにして得たリボヌクレオシド−5’−ホスホロイミダゾリドを、ジメチルホルムアミド(dimethylforamide)(200mL)に溶解させ、そしてジメチルホルムアミド(80mL)中のトリブチルアンモニウムオルトホスフェートの1M溶液を、30分間にわたって、激しく攪拌した混合物に滴下して加えた。塩化亜鉛(2g、14.67mmol)を添加し、反応混合物を、室温で3時間攪拌した。反応の完了を、HPLCによってモニタリングした。反応混合物を、水(50mL)でクエンチし、クロロホルムで抽出し(3×200mL)、ロータリーエバポレータ内で濃縮し、次に陰イオン交換樹脂へ加えることによって精製した。
カラムクロマトグラフィによる精製を、XK 50/60カラム(直径50mmおよび長さ60cm)(Amersham GE)に充填したDEAE Sepharose fast flow樹脂によって達成した。AKTA purifier 100 FPLC(Amersham GE)を使用し、20mL/分の流量で、4総容積の0%〜80%の勾配の1M TEAB緩衝液(重炭酸トリエチルアンモニウム)(pH7.5)を使用することによって所望の化合物を溶出した。55%のTEAB緩衝液において、所望の産物(ヌクレオシド−5’−二リン酸)を、254nmでの強力な紫外の吸光度を伴う大きなブロードなピークとして溶出した。ヌクレオシド−5’−二リン酸を含む画分をプールし、ロータリーエバポレータを使用して蒸発させ、所望の二リン酸化合物のトリエチルアミン塩を得た。A.KoreおよびG.Parmar,Synthetic Comm.(2006)上記、から採用。
実施例3
3’−O−メチルグアノシン一リン酸(3’−O−Me−GMP)のTEA塩(化合物2)の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した500mL 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、トリメチルホスフェート((OMe)3P)(50mL)およびオキシ塩化リン(POCl3)(6mL、60mmol)の混合物に、アルゴン下で攪拌を続けながら、0℃、少量で、乾燥し、かつ微細に粉末化された3’−O−Me−グアノシン(1)(6g、20mmol)をゆっくり添加する。混合物を0℃〜4℃に保ち、少なくとも19時間攪拌した。ジエチルエーテル(200mL)を添加し、過剰なオキシ塩化リンを抽出し、同時に3’−O−メチルグアノシン−5’−ホスホロジクロリデート(phosphodichloridate)を沈殿させた。次に、これを、遠心分離によってペレットにし、水中の100mL 氷冷5% NaHCO3に溶解させた。生じた水溶液を、1N NaOHを使用してpH約1.5に調整した。さらに20時間、0℃〜4℃で攪拌した後、pHを7.0に調整し、生じた混合物を、DEAE Sephadex A25のカラムに加えた。カラムを、5mM TEAB緩衝液、pH7.5で洗浄し、次に、新規に調製した1M 重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝液(pH7.5)で溶出した。3’−O−Me GMP TEA塩(2)を含む画分をプールし、乾燥するまで濃縮した。
3’−O−メチルグアノシン一リン酸(3’−O−Me−GMP)のTEA塩(化合物2)の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した500mL 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、トリメチルホスフェート((OMe)3P)(50mL)およびオキシ塩化リン(POCl3)(6mL、60mmol)の混合物に、アルゴン下で攪拌を続けながら、0℃、少量で、乾燥し、かつ微細に粉末化された3’−O−Me−グアノシン(1)(6g、20mmol)をゆっくり添加する。混合物を0℃〜4℃に保ち、少なくとも19時間攪拌した。ジエチルエーテル(200mL)を添加し、過剰なオキシ塩化リンを抽出し、同時に3’−O−メチルグアノシン−5’−ホスホロジクロリデート(phosphodichloridate)を沈殿させた。次に、これを、遠心分離によってペレットにし、水中の100mL 氷冷5% NaHCO3に溶解させた。生じた水溶液を、1N NaOHを使用してpH約1.5に調整した。さらに20時間、0℃〜4℃で攪拌した後、pHを7.0に調整し、生じた混合物を、DEAE Sephadex A25のカラムに加えた。カラムを、5mM TEAB緩衝液、pH7.5で洗浄し、次に、新規に調製した1M 重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝液(pH7.5)で溶出した。3’−O−Me GMP TEA塩(2)を含む画分をプールし、乾燥するまで濃縮した。
実施例4
3’−O−Me−GMPイミダゾリド(化合物3)の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した1L 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水DMF(144mL)をゆっくり添加し、トリエチルアミン(0.933mL、9.23mmol)を少なくとも5分間にわたって攪拌する。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、乾燥し、かつ微細に粉末化された3’−O−Me−GMP TEA塩(2)(3.5g、7.34mmol)を添加した。その後、イミダゾール(2.05g、30.1mmol)、アルドリチオール(2.65g、12.02mmol)およびトリフェニルホスフィン(3.13g、11.9mmol)を添加し、反応を、少なくとも2〜3時間、室温で攪拌した。この時間の間、反応物は可溶性になり、反応が透明な黄色を呈した。完了時に、攪拌を続けながら、過塩素酸ナトリウム(3.0g、24.5mmol)をアセトンに溶解させ、反応混合物にゆっくり加えた。次に、この混合物を2つの1L nalgeneボトルに注ぎ、冷蔵庫内で−80℃、30分間冷却した。その後、この混合物を3000rpm、15分間の遠心分離に供し、上清を捨てた。沈殿物を新規な部のアセトンで粉砕し、遠心分離した。この処理をさらに一回繰り返し、沈殿物を五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、3’−O−Me−GMPイミダゾリドを得た。
3’−O−Me−GMPイミダゾリド(化合物3)の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した1L 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水DMF(144mL)をゆっくり添加し、トリエチルアミン(0.933mL、9.23mmol)を少なくとも5分間にわたって攪拌する。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、乾燥し、かつ微細に粉末化された3’−O−Me−GMP TEA塩(2)(3.5g、7.34mmol)を添加した。その後、イミダゾール(2.05g、30.1mmol)、アルドリチオール(2.65g、12.02mmol)およびトリフェニルホスフィン(3.13g、11.9mmol)を添加し、反応を、少なくとも2〜3時間、室温で攪拌した。この時間の間、反応物は可溶性になり、反応が透明な黄色を呈した。完了時に、攪拌を続けながら、過塩素酸ナトリウム(3.0g、24.5mmol)をアセトンに溶解させ、反応混合物にゆっくり加えた。次に、この混合物を2つの1L nalgeneボトルに注ぎ、冷蔵庫内で−80℃、30分間冷却した。その後、この混合物を3000rpm、15分間の遠心分離に供し、上清を捨てた。沈殿物を新規な部のアセトンで粉砕し、遠心分離した。この処理をさらに一回繰り返し、沈殿物を五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、3’−O−Me−GMPイミダゾリドを得た。
実施例5
3’O−Me−GDP TEA塩(化合物4)の合成
トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェートリンカーの合成:
無水オルトリン酸(22.5g、229.59mmol)を、攪拌棒を装着した、きれいでかつオーブン乾燥させた250mLフラスコ内の50mLの無水塩化メチレンに加えた。次に、トリブチルアミン(54.6mL、229.6mmol)を、30分間にわたり、添加漏斗を介してこの溶液に滴下して加えた。この混合物を1時間攪拌させた。次に、CH2Cl2を蒸発させ、反応残渣を3×30mLの無水ピリジン、そして次に2×30mLの無水DMFとともに同時に蒸発させた。トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェートリンカー産物を1 Mの最終濃度になるように100mL 無水DMFに溶解させ、4℃、4Å モレキュラーシーブ上で保存した。
3’O−Me−GDP TEA塩(化合物4)の合成
トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェートリンカーの合成:
無水オルトリン酸(22.5g、229.59mmol)を、攪拌棒を装着した、きれいでかつオーブン乾燥させた250mLフラスコ内の50mLの無水塩化メチレンに加えた。次に、トリブチルアミン(54.6mL、229.6mmol)を、30分間にわたり、添加漏斗を介してこの溶液に滴下して加えた。この混合物を1時間攪拌させた。次に、CH2Cl2を蒸発させ、反応残渣を3×30mLの無水ピリジン、そして次に2×30mLの無水DMFとともに同時に蒸発させた。トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェートリンカー産物を1 Mの最終濃度になるように100mL 無水DMFに溶解させ、4℃、4Å モレキュラーシーブ上で保存した。
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した1L 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水DMF(40mL)をゆっくり加え、少なくとも5分間攪拌した。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、微細に粉末化された3’−O−Me−GMP イミダゾリド(3)(3.0g、7.04mmol)を添加した。内容物が溶解するまで塩化亜鉛(2.0g、14.67mmol)を少量で加えた。その後、トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェートリンカーおよび1M トリブチルアンモニウムオルトホスフェート(40mL)を、アルゴン下で反応混合物にゆっくり加え、反応を室温で5時間攪拌した。次に、反応を、HPLCに供し、このHPLCは、出発材料、3’−O−Me−GMP イミダゾリド(3)のその対応する二リン酸塩への完全な変換を示した。完了時に、反応に水(100mL)を補充し、反応物混合物をクロロホルム(3×250mL)で溶出し、蒸発による容積低減(volume reduction)(約100mL)に供し、DEAE Sephadex A25カラムに加え、新規に調製した1M TEAB、pH7.5の直線勾配で溶出した。純粋な3’O−Me−GDP TEA塩(化合物4)を含む画分を溶出し、合わせて、乾燥するまで蒸発させた。
実施例6
m2 7,3’OGDP(化合物5)の合成
100mLのヌクレアーゼを含まない水中の3’−O−Me−GDP TEA塩(4)(4.0g、6.1mmol)の攪拌溶液に、濃縮した氷酢酸をゆっくり加え、溶液のpHを4.0に調整した; 50mM NaOHを用いてpH約4.0〜4.5を維持しながら、硫酸ジメチル((Me)2SO4)(20mL、210mmol)を、60分間にわたってゆっくり滴下して加えた。反応を、室温で2時間攪拌し、メチル化をHPLCによってモニタリングした。2時間後、反応混合物をCHCl3(3×250mL)で抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去した。水層をDEAE Sephadexカラムに加え、産物を含む画分をプールし、蒸発させて、五酸化リンにより真空デシケーター内で乾燥させ、3’−O−Me(N7−Me)GDP(化合物5)を微細な粉末として得た。
m2 7,3’OGDP(化合物5)の合成
100mLのヌクレアーゼを含まない水中の3’−O−Me−GDP TEA塩(4)(4.0g、6.1mmol)の攪拌溶液に、濃縮した氷酢酸をゆっくり加え、溶液のpHを4.0に調整した; 50mM NaOHを用いてpH約4.0〜4.5を維持しながら、硫酸ジメチル((Me)2SO4)(20mL、210mmol)を、60分間にわたってゆっくり滴下して加えた。反応を、室温で2時間攪拌し、メチル化をHPLCによってモニタリングした。2時間後、反応混合物をCHCl3(3×250mL)で抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去した。水層をDEAE Sephadexカラムに加え、産物を含む画分をプールし、蒸発させて、五酸化リンにより真空デシケーター内で乾燥させ、3’−O−Me(N7−Me)GDP(化合物5)を微細な粉末として得た。
実施例7
m2 7,3’OG[5’]ppp[5’]G(化合物7)の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した1L 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水DMF(165mL)をゆっくり添加し、攪拌した。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、微細に粉末化された3’−O−Me−GDP TEA塩(5)(4.0g、5.84mmol)を添加した。内容物が溶解するまで、塩化亜鉛(2.0g、14.67mmol)を少量で加えた。その後、イミダゾリドGMP(化合物6)(6.00g、14.08mmol)を、アルゴン下で反応混合物にゆっくり加えた。反応を室温で攪拌し、メチル化をHPLCによってモニタリングした。出発材料(3’−O−Me−GDP TEA塩)の完全な消失時に、反応を水(200mL)中のEDTA(3.0g)の溶液に注ぎ、pHを飽和NaHCO3によって7.0に調整した。次に、これをDEAE Sephadexカラムに加え、新規に調製した1M TEAB、pH7.5の直線勾配によって溶出した。産物を含む画分をプールし、蒸発および乾燥させて、純粋な3’−O−Me−N7−Me−G[5’]ppp[5’]G(化合物7)を得、−20℃で保存した。
m2 7,3’OG[5’]ppp[5’]G(化合物7)の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した1L 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水DMF(165mL)をゆっくり添加し、攪拌した。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、微細に粉末化された3’−O−Me−GDP TEA塩(5)(4.0g、5.84mmol)を添加した。内容物が溶解するまで、塩化亜鉛(2.0g、14.67mmol)を少量で加えた。その後、イミダゾリドGMP(化合物6)(6.00g、14.08mmol)を、アルゴン下で反応混合物にゆっくり加えた。反応を室温で攪拌し、メチル化をHPLCによってモニタリングした。出発材料(3’−O−Me−GDP TEA塩)の完全な消失時に、反応を水(200mL)中のEDTA(3.0g)の溶液に注ぎ、pHを飽和NaHCO3によって7.0に調整した。次に、これをDEAE Sephadexカラムに加え、新規に調製した1M TEAB、pH7.5の直線勾配によって溶出した。産物を含む画分をプールし、蒸発および乾燥させて、純粋な3’−O−Me−N7−Me−G[5’]ppp[5’]G(化合物7)を得、−20℃で保存した。
実施例8 m2 7,3’OG[5’]ppp[5’]m7G(化合物8)の合成
5.0mLの水中の化合物7(500mg、0.612mmol)の攪拌溶液に、濃縮した氷酢酸をゆっくり加え、溶液のpHを4.0に調整し、そして、50mM NaOHでpH約4.0〜4.5に維持しながら、この混合物に、硫酸ジメチル(2.0mL、21.1mmol)を、60分間にわたってゆっくりと滴下して加えた。反応を、2時間、室温で攪拌し、メチル化をHPLCによってモニタリングした。2時間後、反応混合物をCHCl3(3×50mL)で抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去した。水層を、DEAE Sephadexカラムに加え、産物を含む画分をプールし、蒸発および乾燥させて、純粋なトリメチル化CAP(m27,3’OG[5’]ppp[5’]m7G)(化合物8)を得た。その後、これを、Strata AWカラムを通過させて、その塩を除去し、遊離酸形態にした。
5.0mLの水中の化合物7(500mg、0.612mmol)の攪拌溶液に、濃縮した氷酢酸をゆっくり加え、溶液のpHを4.0に調整し、そして、50mM NaOHでpH約4.0〜4.5に維持しながら、この混合物に、硫酸ジメチル(2.0mL、21.1mmol)を、60分間にわたってゆっくりと滴下して加えた。反応を、2時間、室温で攪拌し、メチル化をHPLCによってモニタリングした。2時間後、反応混合物をCHCl3(3×50mL)で抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去した。水層を、DEAE Sephadexカラムに加え、産物を含む画分をプールし、蒸発および乾燥させて、純粋なトリメチル化CAP(m27,3’OG[5’]ppp[5’]m7G)(化合物8)を得た。その後、これを、Strata AWカラムを通過させて、その塩を除去し、遊離酸形態にした。
実施例9
2’F GMP(化合物14)の合成:
窒素雰囲気下、0℃で、POCl3(3.97g、26.3mmol)および(OMe)3P(20.0mL)の攪拌溶液に、2’−フルオログアノシン(2.5g、8.77mmol)を添加し、反応混合物を2時間、0℃で攪拌した。2時間後、50.0mLの水を反応混合物に添加した。生じた反応混合物を酢酸エチル(2×50mL)で洗浄し、リン酸化剤を除去した。集めた水溶液を、1N NaOHによって滴下してpH1.5に調整し、4℃で12時間攪拌した。12時間後、この水溶液を、ローターエバポレータの下で約20mLまで濃縮した。0℃で、遠心分離管内で、100mLのアセトン中の過塩素酸ナトリウム(3.0g)へ、この濃縮溶液(20.0mL)を2分間にわたりゆっくり添加した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を除去した。この沈殿物を500mLの水に溶解させ、飽和NaHCO3によってpHを5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リン(P2O5)によって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末として2’F GMP(化合物14)(収量:3.54g、87%)を得た。
2’F GMP(化合物14)の合成:
窒素雰囲気下、0℃で、POCl3(3.97g、26.3mmol)および(OMe)3P(20.0mL)の攪拌溶液に、2’−フルオログアノシン(2.5g、8.77mmol)を添加し、反応混合物を2時間、0℃で攪拌した。2時間後、50.0mLの水を反応混合物に添加した。生じた反応混合物を酢酸エチル(2×50mL)で洗浄し、リン酸化剤を除去した。集めた水溶液を、1N NaOHによって滴下してpH1.5に調整し、4℃で12時間攪拌した。12時間後、この水溶液を、ローターエバポレータの下で約20mLまで濃縮した。0℃で、遠心分離管内で、100mLのアセトン中の過塩素酸ナトリウム(3.0g)へ、この濃縮溶液(20.0mL)を2分間にわたりゆっくり添加した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を除去した。この沈殿物を500mLの水に溶解させ、飽和NaHCO3によってpHを5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リン(P2O5)によって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末として2’F GMP(化合物14)(収量:3.54g、87%)を得た。
実施例10
イミダゾリド2’F GMP(Im2’F GMP)(化合物15)の合成:
50mLの乾燥DMF中の2’F GMP TEA塩14(2.0g、4.3mmol)の攪拌溶液へ、イミダゾール(1.50g、21.5mmol)、トリフェニルホスフィン(PPh3)(2.26g、8.6mmol)、アルドリチオール(1.90g、8.6mmol)およびトリエチルアミン(0.43g、4.3mmol)を添加した。反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で5時間攪拌した。0℃、遠心分離管内で、100mLアセトン中の過塩素酸ナトリウム(2.0g)の溶液へ、上記の反応混合物を5分間にわたりゆっくり添加した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を除去した。固体を、新規な部のアセトン(100mL)によって粉砕し、冷却し、再度遠心分離した。この処理を二回繰り返し、生じた固体をP2O5によって真空デシケーター内で乾燥させ、白色の粉末としてイミダゾリド2’F GMP(化合物15)(収量:1.44g、81%)を得た。
イミダゾリド2’F GMP(Im2’F GMP)(化合物15)の合成:
50mLの乾燥DMF中の2’F GMP TEA塩14(2.0g、4.3mmol)の攪拌溶液へ、イミダゾール(1.50g、21.5mmol)、トリフェニルホスフィン(PPh3)(2.26g、8.6mmol)、アルドリチオール(1.90g、8.6mmol)およびトリエチルアミン(0.43g、4.3mmol)を添加した。反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で5時間攪拌した。0℃、遠心分離管内で、100mLアセトン中の過塩素酸ナトリウム(2.0g)の溶液へ、上記の反応混合物を5分間にわたりゆっくり添加した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を除去した。固体を、新規な部のアセトン(100mL)によって粉砕し、冷却し、再度遠心分離した。この処理を二回繰り返し、生じた固体をP2O5によって真空デシケーター内で乾燥させ、白色の粉末としてイミダゾリド2’F GMP(化合物15)(収量:1.44g、81%)を得た。
実施例11
2’F GDP(化合物16)の合成:
10.0mLの乾燥DMF中のイミダゾリド2’F GMP 15(1.2g、2.89mmol)および塩化亜鉛(0.38g、2.89mmol)の攪拌溶液へ、DMF中の18mLの1M トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェート(トリス(Et3NH)3PO4)を、窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を、室温で3時間攪拌した。3時間後、反応混合物を50.0mLの水で希釈した。生じた反応混合物を酢酸エチル(2×50mL)で洗浄し、リン酸化剤を除去した。収集した水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末として2’F GDP(化合物16)(収量 1.34g、72%)を得た。
2’F GDP(化合物16)の合成:
10.0mLの乾燥DMF中のイミダゾリド2’F GMP 15(1.2g、2.89mmol)および塩化亜鉛(0.38g、2.89mmol)の攪拌溶液へ、DMF中の18mLの1M トリス(トリエチルアンモニウム)ホスフェート(トリス(Et3NH)3PO4)を、窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を、室温で3時間攪拌した。3時間後、反応混合物を50.0mLの水で希釈した。生じた反応混合物を酢酸エチル(2×50mL)で洗浄し、リン酸化剤を除去した。収集した水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末として2’F GDP(化合物16)(収量 1.34g、72%)を得た。
実施例12
m7,2’FGDP(化合物17)の合成:
20.0mLの水中の2’F GDP 16(0.75g、1.16mmol)の攪拌溶液へ、酢酸をゆっくり添加し、溶液のpHを4.0に調整した。この混合物へ、硫酸ジメチル(3.0mL)を、30分間にわたって滴下して加え、反応混合物を、室温で、4時間攪拌した。メチル化が進行するにつれて、pHが、約pH2.0に低下し、1M NaOH溶液を使用してpH4.0へ再び調整した。4時間後、反応混合物をCHCl3(3×50mL)で抽出し、未反応の過剰な硫酸ジメチルを除去した。収集した水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムに加えた。最終産物を、HPLC??によってメチル化についてモニタリングし、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末としてm7,2’FGDP(化合物17)(収量 0.64g、83%)を得た。
m7,2’FGDP(化合物17)の合成:
20.0mLの水中の2’F GDP 16(0.75g、1.16mmol)の攪拌溶液へ、酢酸をゆっくり添加し、溶液のpHを4.0に調整した。この混合物へ、硫酸ジメチル(3.0mL)を、30分間にわたって滴下して加え、反応混合物を、室温で、4時間攪拌した。メチル化が進行するにつれて、pHが、約pH2.0に低下し、1M NaOH溶液を使用してpH4.0へ再び調整した。4時間後、反応混合物をCHCl3(3×50mL)で抽出し、未反応の過剰な硫酸ジメチルを除去した。収集した水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムに加えた。最終産物を、HPLC??によってメチル化についてモニタリングし、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末としてm7,2’FGDP(化合物17)(収量 0.64g、83%)を得た。
実施例13
m7,2’FGpppG(化合物18)の合成:
10.0mLの乾燥DMF中のm7,2’FGDP 17(0.2g、0.3mmol)およびイミダゾリドGMP(ImGMP)(0.19g、0.45mmol)の攪拌溶液へ、塩化亜鉛(81mg、0.6mmol)を、窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で1時間攪拌した。1時間後、反応混合物を、0℃で、100.0mLの水中のEDTA二ナトリウム(0.45g、1.2mmol)の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5へ調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物18の10.0mL TEA塩へ濃縮した。生じた10.0mLをStrata−X−AWカラムに通過させ、10.0mLの水、次に10.0mLのMeOHによって洗浄した。その後、化合物18を、15.0mLのNH4OH/MeOH/H2O(2/25/73)によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてm7,2’FGpppG(化合物18)(収量:0.15g、58%)を得た。
m7,2’FGpppG(化合物18)の合成:
10.0mLの乾燥DMF中のm7,2’FGDP 17(0.2g、0.3mmol)およびイミダゾリドGMP(ImGMP)(0.19g、0.45mmol)の攪拌溶液へ、塩化亜鉛(81mg、0.6mmol)を、窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で1時間攪拌した。1時間後、反応混合物を、0℃で、100.0mLの水中のEDTA二ナトリウム(0.45g、1.2mmol)の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5へ調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物18の10.0mL TEA塩へ濃縮した。生じた10.0mLをStrata−X−AWカラムに通過させ、10.0mLの水、次に10.0mLのMeOHによって洗浄した。その後、化合物18を、15.0mLのNH4OH/MeOH/H2O(2/25/73)によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてm7,2’FGpppG(化合物18)(収量:0.15g、58%)を得た。
HPLC分析:出発時のイミダゾリドは3.49分でのピークを与え、GDPのピークは5.95分であった。新規な産物のピークは7.13分であった。1時間後の粗製の反応混合物は、97%の産物のピーク(7.14分)および3%の出発材料のピーク(5.95分)を与えた。
10.0mLの乾燥DMF中のm7,2’FGDP 17(0.25g、0.38mmol)およびイミダゾリドm7GMP(m7−ImGMP)(0.24g、0.57mmol)の攪拌溶液へ、塩化亜鉛(0.10g、0.76mmol)を、窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で6時間攪拌した。6時間後、反応混合物を、0℃で、100.0mLの水中のEDTA二ナトリウム(0.57g、1.52mmol)の溶液へ添加した。生じた水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5へ調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物20の10.0mL TEA塩へ濃縮した。生じた10.0mLをStrata−X−AWカラムに通過させ、10.0mLの水、次に10.0mLのMeOHによって洗浄した。その後、化合物20を、15.0mLのNH4OH/MeOH/H2O(2/25/73)によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてm7,2’−FGpppm7G(化合物20)(収量:0.21g、64%)を得た。
10.0mLの乾燥DMF中のm2 7,2’OGDP(N7Me2’O−MeGDP) 21(0.22g、0.33mmol)およびイミダゾリドm2’O[GMP(Im2’O−MeGMP) 22(0.14g、0.33mmol)の攪拌溶液へ、塩化亜鉛(0.09g、0.66mmol)を、窒素雰囲気下で加え、反応混合物を室温で2時間攪拌した。2時間後、反応混合物を、0℃で100.0mLの水中のEDTA二ナトリウム(0.49g、1.32mmol)の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物23の10.0mL TEA塩へ濃縮した。生じた10.0mLをStrata−X−AWカラムに通過させ、10.0mLの水、次に10.0mLのMeOHによって洗浄した。その後、化合物23を、15.0mLのNH4OH/MeOH/H2O(2/25/73)によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてm2 7,2’OG[5’]ppp[5’]m2’OG(化合物23)(収量:0.18g、63%)を得た。
10.0mLの乾燥DMF中のm2 7,2’OGDP(N7Me2’−O−MeGDP) 21(0.18g、0.27mmol)およびイミダゾリドm2 7,2’OGMP(Im N7Me−2’−O−MeGMP) 24(0.18g、0.41mmol)の攪拌溶液へ、塩化亜鉛(0.07g、0.54mmol)を、窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で6時間攪拌した。6時間後、反応混合物を、0℃で100.0mLの水中のEDTA二ナトリウム(0.40g、1.08mmol)の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物25の10.0mL TEA塩へ濃縮した。生じた10.0mLをStrata−X−AWカラムに通過させ、10.0mLの水、次に10.0mLのMeOHによって洗浄した。その後、化合物25を、15.0mLのNH4OH/MeOH/H2O(2/25/73)によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてm2 7,2’OG[5’]ppp[5’]m2 7,2’OG(化合物25)(収量:0.13g、54%)を得た。
10.0mLの乾燥DMF中のm2 7,2’OGDP(N7Me2’−O−MeGDP) 21(0.20g、0.3mmol)およびイミダゾリドm7GDP(ImN7MeGMP)(0.19g、0.45mmol)の攪拌溶液へ、塩化亜鉛(0.08g、0.6mmol)を窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で6時間攪拌した。6時間後、反応混合物を、0℃で100.0mLの水中のEDTA二ナトリウム(0.45g、1.2mmol)の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和NaHCO3によってpH5.5に調整し、DEAE Sephadexカラムにロードした。所望の産物を、0M〜1M TEAB緩衝液、pH7.5の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物26の10.0mL TEA塩へ濃縮した。生じた10.0mLをStrata−X−AWカラムに通過させ、10.0mLの水、次に10.0mLのMeOHによって洗浄した。その後、化合物26を、15.0mLのNH4OH/MeOH/H2O(2/25/73)によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末(化合物26)(収量:0.16g、62%)を得た。
T7 RNAポリメラーゼ転写を、20μLの最終容積でmMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7キット(Ambion)を使用することにより実行し、この転写は、示される最終濃度で以下の試薬を含む:1μgの直線化したAmbLucポリA DNA、1×反応緩衝液、7.5mMの各ATP、UTPおよびCTP、1.5mM GTP、6.5mMのmCAPおよび2’フルオロキャップアナログ、ならびに50U/μlのT7 RNAポリメラーゼ。転写反応を、37℃で2時間インキュベートした。残存するプラスミドDNAを加水分解するために、1μLのturbo DNAseを反応混合物に添加し、さらに、37℃で15分間インキュベートした。転写された、キャップされたmRNAおよびキャップされていないmRNAを、MEGAclearTMキット(Ambion)を使用することによって精製した。
AmbLuc ポリ(A)(Ambion)、転写は、改変されたキャップアナログおよび標準的なキャップアナログについて匹敵する収量を生成した(図5および6を参照のこと)。Bioanalyzerアッセイは、全てのmRNAが分解されず、高い完全性を保持することを示す(図7を参照のこと)。
実施例19 翻訳アッセイ:
HeLa細胞を用いたトランスフェクション後の種々の時点における、mCAP、二重メチル化、三重メチル化およびARCAキャップされたルシフェラーゼRNAからのタンパク質発現は、三重メチル化キャップを含む転写物が、トランスフェクトされた細胞においてより多く翻訳されることを示す。mCAPおよび二重メチル化キャップによるタンパク質発現の比較は、HeLa細胞によるインビボにおいて二重メチル化キャップ転写物が、1倍のタンパク質を生成するが、ARCAは、3倍のタンパク質を生成し、そして三重メチル化キャップは、4倍のタンパク質を生成することを示唆する。図9を参照のこと。
HeLa細胞を用いたトランスフェクション後の種々の時点における、mCAP、二重メチル化、三重メチル化およびARCAキャップされたルシフェラーゼRNAからのタンパク質発現は、三重メチル化キャップを含む転写物が、トランスフェクトされた細胞においてより多く翻訳されることを示す。mCAPおよび二重メチル化キャップによるタンパク質発現の比較は、HeLa細胞によるインビボにおいて二重メチル化キャップ転写物が、1倍のタンパク質を生成するが、ARCAは、3倍のタンパク質を生成し、そして三重メチル化キャップは、4倍のタンパク質を生成することを示唆する。図9を参照のこと。
試験した全ての改変キャップ化合物は、ゲルシフトアッセイによって決定されるように、T7ポリメラーゼの基質である。このゲルシフトアッセイは、キャップされていないRNAに比べてより遅い移動に基づいて、キャップされたRNAが形成されたことを明確に明らかにする(図8および10を参照のこと)。
上記の実施例は、特定のキャップアナログを記載するが、また本発明を実施することにおいて作用する、想定されるさらなるキャップアナログが存在し、これらは、以下に示される:
m7,2’FG[5’]ppp[5’]2’FGおよびm7,2’FG[5’]ppp[5’]m7,2’FGを作製するためのスキーム
Claims (49)
-
Aは、ハロゲン、OH、OCH3、H、t−ブチルジメチルシリルおよび2’,3 ’−O−イソプロピリデンから選択され;
Bは、ハロゲン、OH、OCH3、NH2、N3、NO2、CF3、CHO、S、t−ブチルジメチルシリル、LNAおよび2’,3 ’−O−イソプロピリデンから選択され;
R1はCH3であるかまたは存在せず;
R2はOH、OCH3およびハロゲンから選択され;
nは1、2または3であり;かつ
BがOHまたはOCH3であり、R1が存在せず、R2がOHである場合、AはOHでもOCH3でもなく、A、BおよびR2がOHである場合、R1はCH3ではない、
組成物。 - Aがフッ素である、請求項1に記載の組成物。
- Bがフッ素である、請求項1に記載の組成物。
- R2がフッ素である、請求項1に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項1に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項2に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項3に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項4に記載の組成物。
- Aが、ハロゲン、OH、OCH3、H、t−ブチルジメチルシリルおよび2’−3’−O−イソプロピリデンから選択され;
Bが、ハロゲン、OH、OCH3、NH2、N3、NO2、CHO、S、t−ブチルジメチルシリル、LNAおよび2’,3’−O−イソプロピリデンから選択され;
R1が存在せず;
R2がOH、OCH3およびハロゲンから選択され;
nは1、2または3であり;そして
AがOHまたはOCH3である場合、R2はOHではない、
請求項1に記載の組成物。 - Aがフッ素である、請求項9に記載の組成物。
- Bがフッ素である、請求項9に記載の組成物。
- R2がフッ素である、請求項9に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項9に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項10に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項11に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項12に記載の組成物。
- Aが、ハロゲン、OH、OCH3、H,−および2’,3’−O−イソプロピリデンから選択され;
Bが、CF3、OH、OCH3、NH2、N3、NO2、CHO、LNAおよび2’,3’−O−イソプロピリデンから選択され;
R1がCH3であり;
R2がOH、OCH3およびハロゲンから選択され;
nが1、2または3であり;そして
AがOHである場合、R2はOHではない、
請求項1に記載の組成物。 - Aがフッ素である、請求項17に記載の組成物。
- R2がフッ素である、請求項17に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項17に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項18に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項19に記載の組成物。
- AがOHおよびOCH3から選択され;
BがOHおよびOCH3から選択され、;
R1がCH3であり;
R2がOCH3であり;そして
nが1、2または3である、
請求項1に記載の組成物。 - AがOHであり、BがOCH3である、請求項23に記載の組成物。
- AがOCH3であり、BがOHである、請求項23に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項23に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項24に記載の組成物。
- RNA分子の5’末端に結合した、請求項25に記載の組成物。
- RNA転写物をキャップするためのキットであって、該キットは:
a)構造:
Aは、ハロゲン、OH、OCH3、H、t−ブチルジメチルシリルおよび2’,3’−O−イソプロピリデンから選択され;
Bは、ハロゲン、OH、OCH3、NH2、N3、NO2,CF3、CHO、S、t−ブチルジメチルシリル、LNAおよび2’,3’−O−イソプロピリデンから選択され;
R1はCH3であるかまたは存在せず;
R2がOH、OCH3およびハロゲンから選択され;
nは1、2または3であり;かつ
BがOHまたはOCH3であり、R1が存在せず、R2がOHである場合、AはOHでもOCH3でもなく、A、BおよびR2がOHである場合、R1はCH3ではない、
キャップアナログ、ならびに
b)RNAポリメラーゼ、
を含む、キット。 - ジヌクレオチドキャップアナログを合成する方法であって、該方法は:
a)リボース環上に2’置換基および3’置換基のうちの少なくとも1つを含む第一のヌクレオシドを提供する工程、
b)該第一のヌクレオシドをリン酸化して、第一のヌクレオチドを形成する工程、
c)該第一のヌクレオチドをメチル化する工程、
d)必要に応じて2’リボース環置換基を含む、リン酸化された第二のヌクレオチドを添加する工程、ならびに
e)該第一のヌクレオチドと該第二のヌクレオチドを連結して、ジヌクレオチドキャップアナログを形成する工程、
を包含する、方法。 - 前記リボース環が、その2’位に置換基を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記2’置換基が、ハロゲン、OH、OCH3、H、t−ブチルジメチルシリルおよび2’,3’−O−イソプロピリデンから選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記ハロゲンがフッ素である、請求項32に記載の方法。
- 前記リボース環が、その3’位に置換基を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記3’置換基が、ハロゲン、OH、OCH3、NH2、N3、NO2、CF3、CHO、S、t−ブチルジメチルシリル、LNAおよび2’,3’−O−イソプロピリデンから選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記ハロゲンがフッ素である、請求項35に記載の方法。
- 前記工程e)にf)前記第二のヌクレオチドをメチル化する工程が続く、請求項30に記載の方法。
- 前記第一のヌクレオシドがグアノシンである、請求項30に記載の方法。
- 工程c)が、前記ヌクレオチドのN7位をメチル化することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記第二のヌクレオチドがグアニル酸である、請求項30に記載の方法。
- 前記第二のヌクレオチドの前記2’置換基が、ハロゲン、OHまたはCH3である、請求項30に記載の方法。
- 前記ハロゲンがフッ素である、請求項41に記載の方法。
- f)前記第二のヌクレオチドをメチル化する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 工程f)が、N7位をメチル化することを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記連結する工程が、ZnCl2によって触媒される、請求項30に記載の方法。
- ヌクレオチドをさらに含む、請求項29に記載のキット。
- リボヌクレアーゼインヒビターをさらに含む、請求項29に記載のキット。
- 酵素緩衝液をさらに含む、請求項29に記載のキット。
- ヌクレオチド緩衝液をさらに含む、請求項29に記載のキット。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016503029A (ja) * | 2012-12-13 | 2016-02-01 | アデュロ バイオテック,インコーポレイテッド | 明確な立体化学を有する環状プリンジヌクレオチドを含む組成物ならびにそれらの調製および使用方法 |
US10131686B2 (en) | 2013-04-29 | 2018-11-20 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Compositions and methods for altering second messenger signaling |
JP2021048864A (ja) * | 2015-09-21 | 2021-04-01 | トリリンク バイオテクノロジーズ エルエルシー | 5’キャップ付rnaを合成するための組成物および方法 |
Families Citing this family (181)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009544754A (ja) | 2006-07-28 | 2009-12-17 | アプライド バイオシステムズ, エルエルシー | ジヌクレオチドmrnaキャップアナログ |
WO2009058911A2 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Applied Biosystems Inc. | Preparation and isolation of 5' capped mrna |
US9067964B2 (en) | 2008-12-18 | 2015-06-30 | Oligomer Sciences Ab | Complex and method for enhancing nuclear delivery |
CA2807552A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
SI3970742T1 (sl) | 2010-08-31 | 2022-08-31 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Pegilirani liposomi za dostavo RNA, ki kodira imunogen |
DK3590949T3 (da) | 2010-10-01 | 2022-07-11 | Modernatx Inc | Ribonukleinsyrer indeholdende n1-methyl-pseudouracil og anvendelse heraf |
CA2831613A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
SG10201602654SA (en) | 2011-10-03 | 2016-05-30 | Moderna Therapeutics Inc | Modified nucleosides,nucleotides,and nucleic acids,and uses thereof |
WO2013059475A1 (en) | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Life Technologies Corporation | Alkynyl-derivatized cap analogs, preparation and uses thereof |
WO2013090648A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | modeRNA Therapeutics | Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
JP2015516143A (ja) | 2012-04-02 | 2015-06-08 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
US10501513B2 (en) | 2012-04-02 | 2019-12-10 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides |
US9303079B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
LT2922554T (lt) | 2012-11-26 | 2022-06-27 | Modernatx, Inc. | Terminaliai modifikuota rnr |
EP2931319B1 (en) | 2012-12-13 | 2019-08-21 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleic acid molecules and uses thereof |
CA2903487A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Quantitative assessment for cap efficiency of messenger rna |
EA201591286A1 (ru) | 2013-03-14 | 2016-02-29 | Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. | Количественная оценка эффективности кэп матричной рнк |
US20160184458A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-06-30 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders |
WO2014144767A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
US10077439B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-18 | Modernatx, Inc. | Removal of DNA fragments in mRNA production process |
WO2014152027A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Manufacturing methods for production of rna transcripts |
WO2014152031A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ribonucleic acid purification |
US9724408B2 (en) | 2013-05-18 | 2017-08-08 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions and methods for activating stimulator of interferon gene-dependent signalling |
RS62529B1 (sr) | 2013-07-11 | 2021-11-30 | Modernatx Inc | Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe |
WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
AU2014329452B2 (en) | 2013-10-03 | 2019-06-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
JP6893785B2 (ja) | 2013-10-22 | 2021-06-23 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | mRNAのCNS送達及びその使用方法 |
MX2016005237A (es) | 2013-10-22 | 2016-08-12 | Shire Human Genetic Therapies | Terapia de acido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa. |
EA201690576A1 (ru) | 2013-10-22 | 2016-10-31 | Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. | Липидные композиции для доставки матричной рнк |
EA201992208A1 (ru) | 2013-10-22 | 2020-07-31 | Транслейт Био, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК |
SG11201604198YA (en) | 2013-12-30 | 2016-07-28 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
EP3090060B1 (en) | 2013-12-30 | 2019-02-20 | CureVac AG | Methods for rna analysis |
ME03314B (me) | 2014-03-24 | 2019-10-20 | Translate Bio Inc | Irnk terapija za liječenje očnih oboljenja |
WO2015161137A1 (en) * | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | 3'-substituted methyl or alkynyl nucleosides for the treatment of hcv |
CA2949106C (en) | 2014-05-30 | 2023-10-24 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids |
EP3521456B1 (en) | 2014-06-10 | 2023-01-04 | CureVac Manufacturing GmbH | Methods and means for enhancing rna production |
EP3157573A4 (en) | 2014-06-19 | 2018-02-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
CN106795142B (zh) | 2014-06-24 | 2022-11-04 | 川斯勒佰尔公司 | 用于递送核酸的立体化学富集组合物 |
EP3169335B8 (en) | 2014-07-16 | 2019-10-09 | ModernaTX, Inc. | Circular polynucleotides |
WO2016077125A1 (en) | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof |
US9943595B2 (en) | 2014-12-05 | 2018-04-17 | Translate Bio, Inc. | Messenger RNA therapy for treatment of articular disease |
AU2016233135B2 (en) | 2015-03-19 | 2021-07-08 | Translate Bio, Inc. | mRNA therapy for pompe disease |
WO2016154596A1 (en) | 2015-03-25 | 2016-09-29 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods, compositions and components |
SG11201707832RA (en) | 2015-04-22 | 2017-11-29 | Curevac Ag | Rna containing composition for treatment of tumor diseases |
EP3294888A1 (en) | 2015-05-11 | 2018-03-21 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids |
AU2016261358B2 (en) | 2015-05-11 | 2021-09-16 | Editas Medicine, Inc. | Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
CN107873055B (zh) | 2015-05-29 | 2021-09-17 | 库瑞瓦格房地产有限公司 | 包括至少一个切向流过滤步骤的产生和纯化rna的方法 |
WO2016201047A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation |
WO2017001058A1 (en) | 2015-07-01 | 2017-01-05 | Curevac Ag | Method for analysis of an rna molecule |
US11434486B2 (en) | 2015-09-17 | 2022-09-06 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides containing a morpholino linker |
DK3350333T3 (da) | 2015-09-17 | 2022-01-31 | Modernatx Inc | Polynukleotider, der indeholder en stabiliserende haleregion |
HUE057613T2 (hu) | 2015-09-17 | 2022-05-28 | Modernatx Inc | Vegyületek és készítmények terápiás szerek intracelluláris bejuttatására |
SI3362461T1 (sl) | 2015-10-16 | 2022-05-31 | Modernatx, Inc. | Analogi kape MRNA z modificirano fosfatno povezavo |
WO2017066791A1 (en) * | 2015-10-16 | 2017-04-20 | Modernatx, Inc. | Sugar substituted mrna cap analogs |
WO2017066797A1 (en) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | Modernatx, Inc. | Trinucleotide mrna cap analogs |
AU2016340183A1 (en) * | 2015-10-16 | 2018-04-19 | Modernatx, Inc. | mRNA cap analogs and methods of mRNA capping |
CA3001351A1 (en) | 2015-10-21 | 2017-04-27 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hepatitis b virus |
WO2017075475A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus |
DK3394030T3 (da) | 2015-12-22 | 2022-03-28 | Modernatx Inc | Forbindelser og sammensætninger til intracellulær afgivelse af midler |
EP3394280A1 (en) | 2015-12-23 | 2018-10-31 | CureVac AG | Method of rna in vitro transcription using a buffer containing a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid or a salt thereof |
WO2017140345A1 (en) | 2016-02-15 | 2017-08-24 | Curevac Ag | Method for analyzing by-products of rna in vitro transcription |
US11920174B2 (en) | 2016-03-03 | 2024-03-05 | CureVac SE | RNA analysis by total hydrolysis and quantification of released nucleosides |
WO2017177169A1 (en) | 2016-04-08 | 2017-10-12 | Rana Therapeutics, Inc. | Multimeric coding nucleic acid and uses thereof |
WO2017191264A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Curevac Ag | Nucleic acid molecules and uses thereof |
US20210162037A1 (en) | 2016-05-04 | 2021-06-03 | Curevac Ag | Influenza mrna vaccines |
IL302641A (en) | 2016-05-06 | 2023-07-01 | Juno Therapeutics Inc | Genetically engineered cells and methods for their preparation |
JP2019522047A (ja) | 2016-06-13 | 2019-08-08 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症治療のためのメッセンジャーrna療法 |
WO2017218704A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-21 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
SG10201913631TA (en) | 2016-08-19 | 2020-03-30 | Curevac Ag | Rna for cancer therapy |
BR112019008481A2 (pt) | 2016-10-26 | 2020-03-03 | Curevac Ag | Vacinas de mrna de nanopartículas lipídicas |
US11583504B2 (en) | 2016-11-08 | 2023-02-21 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
US11400109B2 (en) | 2016-11-10 | 2022-08-02 | Translate Bio, Inc. | Subcutaneous delivery of messenger RNA |
US11141476B2 (en) | 2016-12-23 | 2021-10-12 | Curevac Ag | MERS coronavirus vaccine |
US11524066B2 (en) | 2016-12-23 | 2022-12-13 | CureVac SE | Henipavirus vaccine |
US11920148B2 (en) | 2017-02-22 | 2024-03-05 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for gene editing |
WO2018160592A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Translatable molecules and synthesis thereof |
WO2018165257A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Translate Bio, Inc. | Polyanionic delivery of nucleic acids |
PL3596041T3 (pl) | 2017-03-15 | 2023-03-06 | Modernatx, Inc. | Związek i kompozycje do dokomórkowego dostarczania środków terapeutycznych |
EP3595727A1 (en) | 2017-03-15 | 2020-01-22 | ModernaTX, Inc. | Lipid nanoparticle formulation |
US11377643B2 (en) | 2017-05-31 | 2022-07-05 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Therapeutics for glycogen storage disease type III |
US11015204B2 (en) | 2017-05-31 | 2021-05-25 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Synthesis and structure of high potency RNA therapeutics |
EP3630200A4 (en) | 2017-05-31 | 2021-02-24 | Arcturus Therapeutics, Inc. | THERAPEUTICS FOR PHENYLKETONURIA |
EP3638716B1 (en) | 2017-06-12 | 2022-01-05 | Translate Bio, Inc. | Poly(phosphoesters) for delivery of nucleic acids |
EP3638678A1 (en) | 2017-06-14 | 2020-04-22 | Modernatx, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of agents |
US10780183B2 (en) | 2017-06-19 | 2020-09-22 | Translate Bio, Inc. | Messenger RNA therapy for the treatment of Friedreich's ataxia |
CN111328287A (zh) | 2017-07-04 | 2020-06-23 | 库瑞瓦格股份公司 | 新型核酸分子 |
WO2019036638A1 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-21 | Modernatx, Inc. | METHODS FOR PREPARING MODIFIED RNA |
US11602557B2 (en) | 2017-08-22 | 2023-03-14 | Cure Vac SE | Bunyavirales vaccine |
JP7275111B2 (ja) | 2017-08-31 | 2023-05-17 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 脂質ナノ粒子の生成方法 |
RU2020117848A (ru) | 2017-11-08 | 2021-12-08 | Куревак Аг | Адаптиция последовательности phk |
WO2019115635A1 (en) | 2017-12-13 | 2019-06-20 | Curevac Ag | Flavivirus vaccine |
US11167043B2 (en) | 2017-12-20 | 2021-11-09 | Translate Bio, Inc. | Composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency |
WO2019122371A1 (en) | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Curevac Ag | Linear double stranded dna coupled to a single support or a tag and methods for producing said linear double stranded dna |
WO2019152802A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Translate Bio, Inc. | Cationic polymers |
US20210361761A1 (en) | 2018-04-05 | 2021-11-25 | Curevac Ag | Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination |
BR112020020933A2 (pt) | 2018-04-17 | 2021-04-06 | Curevac Ag | Moléculas de rna de rsv inovadoras e composições para vacinação |
CA3097912A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Translate Bio, Inc. | Subcutaneous delivery of messenger rna |
WO2019222424A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Translate Bio, Inc. | Ribose cationic lipids |
US20220008338A1 (en) | 2018-05-24 | 2022-01-13 | Translate Bio, Inc. | Thioester Cationic Lipids |
US20210206739A1 (en) | 2018-05-30 | 2021-07-08 | Translate Bio, Inc. | Vitamin Cationic Lipids |
EP3801467A1 (en) | 2018-05-30 | 2021-04-14 | Translate Bio, Inc. | Messenger rna vaccines and uses thereof |
CN112672761A (zh) | 2018-05-30 | 2021-04-16 | 川斯勒佰尔公司 | 磷酸酯阳离子脂质 |
JP7463006B2 (ja) | 2018-05-30 | 2024-04-08 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | ステロイド性部分を含むカチオン性脂質 |
US20210260178A1 (en) | 2018-06-27 | 2021-08-26 | Curevac Ag | Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination |
WO2020056294A1 (en) | 2018-09-14 | 2020-03-19 | Translate Bio, Inc. | Composition and methods for treatment of methylmalonic acidemia |
CA3113436A1 (en) | 2018-09-19 | 2020-03-26 | Modernatx, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
EP3852728A1 (en) | 2018-09-20 | 2021-07-28 | Modernatx, Inc. | Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof |
WO2020097376A1 (en) | 2018-11-09 | 2020-05-14 | Translate Bio, Inc. | Multi-peg lipid compounds |
AU2019374871A1 (en) | 2018-11-09 | 2021-05-27 | Translate Bio, Inc. | PEG lipidoid compounds |
US20220016265A1 (en) | 2018-11-09 | 2022-01-20 | Translate Bio, Inc. | Messenger rna therapy for treatment of ocular diseases |
MX2021005482A (es) | 2018-11-09 | 2021-09-08 | Translate Bio Inc | Lípidos de 2,5-dioxopiperazina con porciones éster, tioéster, disulfuro y anhidrido intercaladas. |
AU2019378763A1 (en) | 2018-11-12 | 2021-06-03 | Translate Bio, Inc. | Methods for inducing immune tolerance |
AU2019383413A1 (en) | 2018-11-21 | 2021-05-27 | Translate Bio, Inc. | Cationic lipid compounds and compositions thereof for use in the delivery of messenger RNA |
EP4299750A2 (en) | 2018-12-06 | 2024-01-03 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating ornithine transcarbamylase deficiency |
EP3897702A2 (en) | 2018-12-21 | 2021-10-27 | CureVac AG | Rna for malaria vaccines |
US20220073962A1 (en) | 2018-12-21 | 2022-03-10 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
JP2022516356A (ja) | 2019-01-07 | 2022-02-25 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | 原発性線毛機能不全症の治療のための組成物および方法 |
SG11202108098QA (en) | 2019-01-31 | 2021-08-30 | Modernatx Inc | Vortex mixers and associated methods, systems, and apparatuses thereof |
CN113939282A (zh) | 2019-01-31 | 2022-01-14 | 摩登纳特斯有限公司 | 制备脂质纳米颗粒的方法 |
WO2020161342A1 (en) | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Curevac Ag | Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophtalmic diseases |
EP3956303A1 (en) | 2019-04-18 | 2022-02-23 | Translate Bio, Inc. | Cystine cationic lipids |
EP3959195B1 (en) | 2019-04-22 | 2023-11-08 | Translate Bio, Inc. | Thioester cationic lipids |
US20220257724A1 (en) | 2019-05-03 | 2022-08-18 | Translate Bio, Inc. | Di-thioester cationic lipids |
EP3976593A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | Translate Bio, Inc. | Macrocyclic lipids |
WO2020254535A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Curevac Ag | Rotavirus mrna vaccine |
WO2020257716A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Translate Bio, Inc. | Tricine and citric acid lipids |
WO2020257611A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Translate Bio, Inc. | Cationic lipids comprising an hydroxy moiety |
CA3144902A1 (en) | 2019-08-14 | 2022-01-19 | Andreas Thess | Rna combinations and compositions with decreased immunostimulatory properties |
JP2023507465A (ja) | 2019-12-20 | 2023-02-22 | キュアバック エスイー | 核酸を送達するための脂質ナノ粒子 |
IL293571A (en) | 2020-02-04 | 2022-08-01 | Curevac Ag | Corona virus vaccine |
US11576966B2 (en) | 2020-02-04 | 2023-02-14 | CureVac SE | Coronavirus vaccine |
JP2023517644A (ja) | 2020-03-09 | 2023-04-26 | アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド | コロナウイルスワクチン組成物及び方法 |
EP4132576A1 (en) | 2020-04-09 | 2023-02-15 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Nucleic acid vaccines for coronavirus |
WO2021204175A1 (en) | 2020-04-09 | 2021-10-14 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid nanoparticle composition |
IL297419A (en) | 2020-04-22 | 2022-12-01 | BioNTech SE | Vaccine against the corona virus |
US20230226219A1 (en) | 2020-05-14 | 2023-07-20 | Translate Bio, Inc. | Peg lipidoid compounds |
CN116322758A (zh) | 2020-05-29 | 2023-06-23 | 库尔维科欧洲股份公司 | 基于核酸的组合疫苗 |
US20220331414A1 (en) | 2020-06-30 | 2022-10-20 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
WO2022006527A1 (en) | 2020-07-02 | 2022-01-06 | Maritime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for reverse gene therapy |
US20230272052A1 (en) | 2020-07-31 | 2023-08-31 | CureVac SE | Nucleic acid encoded antibody mixtures |
TW202214566A (zh) | 2020-08-20 | 2022-04-16 | 大陸商蘇州艾博生物科技有限公司 | 脂質化合物及脂質奈米粒子組合物 |
CA3170743A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Susanne RAUCH | Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines |
JP2023549592A (ja) | 2020-10-20 | 2023-11-28 | エスティー ファーム カンパニー リミテッド | 5’-キャッピングされたrna合成用オリゴヌクレオチド |
JP2023552468A (ja) | 2020-12-09 | 2023-12-15 | ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア | Rnaの製造 |
WO2022137133A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | Rna vaccine against sars-cov-2 variants |
KR20230164648A (ko) | 2020-12-22 | 2023-12-04 | 큐어백 에스이 | SARS-CoV-2 변이체에 대한 RNA 백신 |
CA3171051A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration |
AU2021412833A1 (en) | 2020-12-28 | 2023-07-06 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv |
WO2022152109A2 (en) | 2021-01-14 | 2022-07-21 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
CN116615472A (zh) | 2021-01-14 | 2023-08-18 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 聚合物缀合的脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 |
CA3170747A1 (en) | 2021-01-27 | 2022-08-04 | Moritz THRAN | Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna |
JP2024511206A (ja) | 2021-03-26 | 2024-03-12 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 免疫原性組成物 |
CA3171429A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-09-30 | Alexander SCHWENGER | Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna |
CA3171589A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-03 | Moritz THRAN | Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression |
EP4204390A1 (en) | 2021-05-24 | 2023-07-05 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
CA3171750A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Tim SONNTAG | Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases |
IL309505A (en) | 2021-09-03 | 2024-02-01 | CureVac SE | Lipid nanoparticles for nucleic acid delivery |
WO2023031392A2 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | CureVac SE | Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine |
AR127312A1 (es) | 2021-10-08 | 2024-01-10 | Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd | Compuestos lipídicos ycomposiciones de nanopartículas lipídicas |
CN116064598B (zh) | 2021-10-08 | 2024-03-12 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 冠状病毒的核酸疫苗 |
AU2022358824A1 (en) | 2021-10-08 | 2024-04-11 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
KR20230083197A (ko) | 2021-12-01 | 2023-06-09 | 에스티팜 주식회사 | 5'-캡핑된 rna 합성용 올리고뉴클레오티드 |
CN114250268A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-29 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 检测mRNA样品的加帽效率的产品及用途 |
WO2023144330A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | CureVac SE | Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors |
KR20230123318A (ko) | 2022-02-16 | 2023-08-23 | 에스티팜 주식회사 | 5'-캡핑된 rna 합성용 올리고뉴클레오티드 |
US20230279376A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions |
US20230293646A1 (en) | 2022-03-21 | 2023-09-21 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for treating lipoprotein-related diseases |
WO2023183889A1 (en) | 2022-03-24 | 2023-09-28 | Excepgen Inc. | Compositions and methods for protein expression with rna |
CN114685588B (zh) * | 2022-05-05 | 2024-03-29 | 江苏申基生物科技有限公司 | 一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物 |
WO2023227608A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide |
CN115057903B (zh) * | 2022-06-22 | 2024-03-29 | 江苏申基生物科技有限公司 | 一种含吗啉环结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 |
CN114853836A (zh) * | 2022-06-24 | 2022-08-05 | 江苏申基生物科技有限公司 | 一种含gna结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 |
WO2024002985A1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-04 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
CN114941018B (zh) * | 2022-06-28 | 2023-09-22 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | cap1帽类似物的合成方法 |
WO2024037578A1 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Composition of lipid nanoparticles |
WO2024068545A1 (en) | 2022-09-26 | 2024-04-04 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza virus vaccines |
WO2024075022A2 (en) | 2022-10-04 | 2024-04-11 | BioNTech SE | Rna constructs and uses thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998034942A2 (en) * | 1997-02-06 | 1998-08-13 | Inspire Pharmaceuticals, Inc. | Dinucleotides and their use |
WO2006004648A1 (en) * | 2004-06-29 | 2006-01-12 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for preparing capped rna |
WO2006078821A2 (en) * | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Invitrogen Corporation | Products and processes for in vitro synthesis of biomolecules |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2341057A3 (en) | 1997-09-12 | 2011-11-23 | Exiqon A/S | Oligonucleotide Analogues |
US7074596B2 (en) | 2002-03-25 | 2006-07-11 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues |
JP2009544754A (ja) | 2006-07-28 | 2009-12-17 | アプライド バイオシステムズ, エルエルシー | ジヌクレオチドmrnaキャップアナログ |
CN107501370B (zh) | 2007-06-19 | 2021-06-18 | 路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会 | 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
WO2009058911A2 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Applied Biosystems Inc. | Preparation and isolation of 5' capped mrna |
-
2007
- 2007-07-10 JP JP2009522766A patent/JP2009544754A/ja active Pending
- 2007-07-10 EP EP07810384A patent/EP2049665A2/en not_active Withdrawn
- 2007-07-10 CA CA002659301A patent/CA2659301A1/en not_active Abandoned
- 2007-07-10 WO PCT/US2007/015896 patent/WO2008016473A2/en active Application Filing
- 2007-07-10 US US12/375,527 patent/US8304529B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998034942A2 (en) * | 1997-02-06 | 1998-08-13 | Inspire Pharmaceuticals, Inc. | Dinucleotides and their use |
WO2006004648A1 (en) * | 2004-06-29 | 2006-01-12 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for preparing capped rna |
WO2006078821A2 (en) * | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Invitrogen Corporation | Products and processes for in vitro synthesis of biomolecules |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016503029A (ja) * | 2012-12-13 | 2016-02-01 | アデュロ バイオテック,インコーポレイテッド | 明確な立体化学を有する環状プリンジヌクレオチドを含む組成物ならびにそれらの調製および使用方法 |
JP2018135367A (ja) * | 2012-12-13 | 2018-08-30 | アデュロ バイオテック,インコーポレイテッド | 明確な立体化学を有する環状プリンジヌクレオチドを含む組成物ならびにそれらの調製および使用方法 |
US10414789B2 (en) | 2012-12-13 | 2019-09-17 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use |
US10131686B2 (en) | 2013-04-29 | 2018-11-20 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Compositions and methods for altering second messenger signaling |
US10385091B2 (en) | 2013-04-29 | 2019-08-20 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Compositions and methods for altering second messenger signaling |
US11014956B2 (en) | 2013-04-29 | 2021-05-25 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center; The Rockefeller | Compositions and methods for altering second messenger signaling |
JP2021048864A (ja) * | 2015-09-21 | 2021-04-01 | トリリンク バイオテクノロジーズ エルエルシー | 5’キャップ付rnaを合成するための組成物および方法 |
JP7082174B2 (ja) | 2015-09-21 | 2022-06-07 | トリリンク バイオテクノロジーズ エルエルシー | 5’キャップ付rnaを合成するための組成物および方法 |
US11414453B2 (en) | 2015-09-21 | 2022-08-16 | Trilink Biotechnologies, Llc | Compositions and methods for synthesizing 5′-capped RNAs |
US11578095B2 (en) | 2015-09-21 | 2023-02-14 | Trilink Biotechnologies, Llc | Compositions and methods for synthesizing 5'-Capped RNAs |
US11878991B2 (en) | 2015-09-21 | 2024-01-23 | Trilink Biotechnologies, Llc | Compositions and methods for synthesizing 5′-Capped RNAs |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20100261231A1 (en) | 2010-10-14 |
WO2008016473A2 (en) | 2008-02-07 |
EP2049665A2 (en) | 2009-04-22 |
CA2659301A1 (en) | 2008-02-07 |
WO2008016473A3 (en) | 2008-04-10 |
US8304529B2 (en) | 2012-11-06 |
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120316 |
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A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120808 |