PL214850B1 - Cząsteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub białka - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub białka.

W organizmach eukariotycznych koniec 5' większości matrycowych RNA (mRNA) jest blokowany lub,,kapowany”. Kapowane są także pewne inne formy RNA, na przykład krótkie jądrowe RNA (snRNA). Oznacza to, że cząsteczka RNA ma na 5' końcu strukturę kapu, czyli mostek 5'-5'-trifosforanowy pomiędzy dwoma nukleozydowymi ugrupowaniami i 7-metyloguanozynę. Kapowanie mRNA i snRNA wspomaga ich normalne funkcje w komorkach.

Możliwość syntezy kapowanych cząsteczek RNA in vitro jest więc użyteczna, ponieważ pozwala uzyskać cząsteczki RNA zachowujące się odpowiednio w różnych biologicznych zastosowaniach. Takie zastosowania obejmują zarówno prace badawcze, jak i komercyjną produkcję polipeptydów, np. produkcję w układzie translacji pozakomórkowej polipeptydów zawierających w specyficznym miejscu „nienaturalny” aminokwas lub produkcję w hodowlach komórkowych polipeptydów, które ze względu na aktywność i stabilność wymagają potranslacyjnej modyfikacji. W tych drugich układach synteza przebiega w znacznie dłuższym czasie i dlatego otrzymuje się więcej białka.

Najczęściej stosowanym sposobem otrzymywania kapowanego RNA in vitro jest synteza RNA na matrycy DNA za pomocą bakteryjnej lub bakteriofagowej polimerazy RNA w obecności wszystkich czterech trifosforanów rybo nukleozydów oraz dinukleotydu kapu, takiego jak m⁷G(5')ppp(5')G (m⁷GpppG). Polimeraza inicjuje transkrypcję przez nukleofilowy atak 3'-OH ugrupowania Guo w m⁷GpppG na α-fosforan następnego transkrybowanego trifosforanu nukleozydu, dając jako początkowy produkt m⁷GpppGpN. Alternatywny produkt inicjowany przez GTP-pppGpN jest powstrzymywany przez ustalenie stosunku m⁷GpppG do GTP w transkrypcyjnej mieszaninie reakcyjnej od 5 do 10.

Syntetyczne RNA mogą być otrzymywane na matrycy DNA w transkrypcji pozakomórkowej. Patrz R. Contreras et al., “Simple, efficient in vitro synthesis of capped RNA useful for direct expression of cloned eukaryotic genes” Nucl. Acids Res., vol. 10. pp. 6353-6362 (1982); J. Yisraeli et al., “Synthesis of long, capped transcripts in vitro by SP6 and T7 RNA polymerases, str. 42-50 in J. Dahlberg et al. (Eds.). Meth. Enzymol., vol. 180., pp. 42-50 (1989); and D. Melton et al., “Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter” Nucl Acids Res., vol. 12, str. 7035-7056 (1984).

Tak otrzymane kapowane RNA są aktywne w reakcjach syntezy prowadzonych in vitro, patrz M. Konarska et al., “Recognition of cap structure in splicing in vitro of mRNA precursors. Cell, vol. 38, str. 731-736 (1984); oraz I. Edery et al., “Capdependent RNA splicing in a HeLa nuclear extract”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82. str. 7590-7594 (1985).

Translacja w układach pozakomórkowych z użyciem kapowanych mRNA jest bardziej wydajna niż przy użyciu niekapowanych mRNA. patrz S. Muthukrishnan et al., “5'-Terminal 7-methylguanosine in eukaryotic mRNA is required for translation,” Nature, vol. 255, str. 33-37 (1975); L. Chu et al., “Paradoxical observations on the 5' terminus of ovalbumin messenger ribonucleic acid,” J. Biol Chem., vol. 253, pp. 5228-5231 (1978); E. Darzynkiewicz et al., “β-Globin mRNAs capped with m⁷G, m₂ ^7,2G or m3^2.2.7G differ in intrinsic translation efficiency,” Nucl Acids Res., vol. 16, str. 8953- 8962 (1988); oraz E. Darzynkiewicz et al., “Inhibition of eukaryotic translation by nucleoside 5'-monophosphate analogues of mRNA 5'-cap: Changes in N7 substituent affect analogue activity,” Biochem., vol. 28, str. 4771-4778 (1989).

5'-niemetylowane mRNA są w procesach translacji mniej aktywne niż 5'-metylowane mRNA, patrz G. Both et al., “Methylation-dependent translation of viral messenger RNAs in vitro,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 72, str. 1189-1193 (1975).

Kapowane mRNA wprowadzone do hodowli komórek ssaka przez elektroporację także ulegają translacji bardziej skutecznie niż niekapowane mRNA, patrz E. Grudzien et al, “Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,” J. Biol. Chem. vol. 281, str. 1857-1867 (2006).

Doniesiono ponadto [A. Pasquinelli et al., “Reverse 5' caps in RNAs made in vitro by phage RNA polymerases,” RNA, vol. 1, str. 957-967 (1995)], że polimerazy bakteriofaga również wykorzystują grupę 3'-OH reszty 7-metylguanozyny w m⁷GpppG do inicjacji transkrypcji, wykazując, że w przybliżeniu 1/3 do 1/2 produktów RNA wytworzonych przy użyciu tego analogu kapu zawiera kap w odwrotnej orientacji, tj., Gpppm⁷GpN. Takie cząsteczki RNA z odwrotnie zorientowanym kapem zachowują się nieprawidłowo. Ci sami autorzy zauważyli, że w przypadku iniekcji do jąder Xenopus laevis transkryptów snRNA pre-U1 z odwrotnie zorientowanym kapem były one eksportowane wolniej niż

PL 214 850 B1 transkrypty naturalne. Podobnie, cytoplazmatyczne snRNA U1 z odwrotnie zorientowanym kapem były niewłaściwie wprowadzane do jądra.

Obecność kapu w mRNA silnie stymuluje translację. Wykazano, że mRNA zawierające kap wyłącznie w odwrotnej orientacji ulegały translacji w układzie pozakomórkowym z wydajnością wynoszącą tylko 4% wydajności mRNA zawierającego kap wyłącznie w normalnej orientacji, patrz E. Grudzien et al.. “Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency,” RNA vol. 10. str. 1479-1487 (2004).

W publikacji: J. Stępiński et al. „Synthesis and properties of mRNAs containing the novel „anti-reverse” cap analogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG,” RNA, vol. 7, str. 1486-1495 (2001) opisano syntezę i zastosowanie dwu nowych analogów kapu: m⁷3'dGpppG oraz 7,3'-O m2^7,3'-O GpppG, które nie mogą być wprowadzone w odwrotnej orientacji. mRNA kapowany tymi “anty-odwrotnymi analogami kapu” (ARCA) ulegał translacji w układach in vitro bardziej wydajnie niż mRNA kapowany konwencjonalnym analogiem, m⁷GpppG.

Z. Peng et al., w publikacji “Synthesis and application of a chain-terminating dinucleotide mRNA 7,3'-O cap analog,” Org. Lett., vol. 4, str. 161-164 (2002) opisali syntezę i zastosowanie m2^7,3'-OGpppG w transkrypcji in vitro homogenicznie kapowanego RNA.

J. Jemielity et al. w publikacji „Novel ‘anti-reverse' cap analogues with superior translational properties,” RNA. vol. 9, str. 1108-1122 (2003) donieśli, że podstawienie w pozycji 2' -OCH3 lub -H, z wytworzeniem odpowiednio 1 m2^7,2'-OGpppG lub m⁷2'dGpppG daje ARCA o właściwościach równorzędnych lub nawet nieco korzystniejszych niż w przypadku ARCA podstawionych w pozycji 3'. Kryterium oceny jest wiązanie z białkiem elF4E, prawidłowa inkorporacja do mRNA podczas transkrypcji in vitro oraz translacyjna wydajność mRNA otrzymanego w układzie pozakomórkowym.

Ilość białka produkowanego przez syntetyczny mRNA wprowadzony do hodowli komórek ssaczych jest ograniczona przez degradację mRNA w naturalnym obiegu. Degradacja mRNA in vivo jest inicjowana głównie przez usunięcie kapu z nienaruszonego mRNA przez specyficzną pirofosfatazę,

Dcp 1/2, która rozszczepia α i β fosforany. E. Grudzień et al. w publikacji „Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs”, J. Biol. Chem., vol. 281, pp. 1857-1867 (2006) opisał syntezę analogu kapu, w którym grupa metylenowa zastępuje atom O pomiędzy grupami α and 7,3'-O β fosforanowymi, m2^7,3'-OGppCH2pG. mRNA kapowane tym analogiem były odporne na hydrolizę in vitro rekombinowanym ludzkim Dcp2.

7,3'-O

Po wprowadzeniu do hodowli komórkowych mRNA kapowane za pomocą m2^7,3'-OGppCH2pG były 7,3'-O bardziej stabilne niż kapowane za pomocą m₂ ^7,3'-OGpppG.

7,3'-O

Chociaż mRNA kapowane za pomocą m2^7,3'-OGppCH2pG były bardziej stabilne w hodowlach komórkowych, dawały mniejszą wydajność w procesie translacji, przypuszczalnie ze względu na znacz7,3'-O 7,3'-O nie mniejsze powinowactwo wiązania m₂ ^7,3'-OGpp_CH2pG do eIF4E in vitro w porównaniu z m₂ ^7,3'-OGpppG. Tak więc, chociaż były bardziej stabilne w hodowlach komórkowych, ta korzyść była dla wydajności syntetyzowanego białka wyrównana przez niższą wydajność translacji.

Możliwą poprawę tej sytuacji sugeruje publikacja: J. Kowalska et al. „Synthesis and properties of mRNA cap analogs containing phosphorothioate moiety in 5',5'-triphosphate chain,” Nucleos. Nucleot. Nucl. Acids, vol. 24, str. 595-600 (2005). Opisano tu syntezę trzech analogów kapu, gdzie O zastąpiono przez S w resztach fosforanowych α, β, lub γ. Każdy z nich syntetyzowano w dwu formach izomerycznych, które mogły być rozdzielone chromatograficznie.

Twórcy niniejszego wynalazku połączyli S-podstawienie przy różnych resztach fosforanowych z podstawieniem 2'-O metyl w celu zapewnienia prawidłowej orientacji podczas syntezy RNA in vitro, otrzymując analogi nazywane S-ARCA. Modyfikacja analogów ARCA zapewnia precyzyjne umiejscowienie tiofosforanowych grup α, β i γ w miejscach aktywnych białka wiążącego kap zarówno w procesie translacji, jak i usuwania kapu.

Stwierdzono, że jeden z tych analogów jest odporny na Dcp1/2, a inny jest odporny na degradację za pośrednictwem enzymu DcpS. S-ARCA mają większe powinowactwo do eIF4E niż odpowiednie analogi nie zawierające grupy tiofosforanowej. Translacja w hodowlach komórkowych, do których wprowadzono mRNA zawierający różne S-ARCA zachodzi z pięciokrotnie wyższą wydajnością niż w przypadku mRNA syntetyzowanego przy użyciu znanego analogu, m⁷GpppG.

Ponadto, okres półtrwania mRNAs kapowanego za pomocą S-ARCA jest trzykrotnie dłuższy niż mRNA syntetyzowanego przy użyciu niemodyfikowanego kapu. Połączenie wydajniejszej translacji oraz większej stabilności mRNA daje wzrost całkowitej produkcji białek w transfekowanych komórkach

PL 214 850 B1 w porównaniu z produkcją przy zastosowaniu znanych syntetycznych mRNA lub mRNA kapowanych za pomocą ARCA.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka RNA zawierająca na końcu 5' związek o wzorze 1, 2, 6, 7, 8, lub 9

PL 214 850 B1

w których Y1, Y2, Y3, a także Y4 obecne dla n=2 oznaczają niezależnie O lub S. przy czym co najmniej jeden Y oznacza S, n wynosi 1 lub 2,

R1 jest wybrany z grupy obejmującej H, OH, OCH3, i OCH2CH3,

R2 jest wybrany z grupy obejmującej H, OH, OCH3, i OCH2CH3, przy czym jeżeli R1 oznacza OH, a n wynosi 1 lub 2, wówczas R2 ma znaczenie inne niż OH, oraz jeżeli R2 oznacza OH, a n wynosi 1 lub 2, wówczas R1 ma znaczenie inne niż OH,

X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftyl lub podstawiony naftyl, natomiast

B we wzorze 2 oznacza grupę o wzorze 3, 4 lub 5, a we wzorach 6 i 7 oznacza guaninę, adeninę, urydynę lub cytozynę,

PL 214 850 B1

Związki o wzorze 1 mogą być w postaci diastereoizomerów lub ich mieszanin.

Na konferencji w Seattle w 2006 r wspomniano o syntezie trzech związków o wzorze 1, tzn. związku o wzorze 1, w którym a) R1 oznacza OCH3, n=1, Y1=S, Y2, Y3=O; b) R1 oznacza OCH3, n=1, Y2=S, Y1, Y3=O; c) R1 oznacza OCH3, n=1, Y3=S, Y1, Y2=O; Podano także informacje odnośnie ich oddziaływania z czynnikiem inicjującym translację eIF4E oraz odporności na degradację enzymem DcpS.

Nie ujawniono dotychczas informacji odnośnie zdolności tych związków do stymulacji biosyntezy białka in vitro oraz w komórkach. Pozostałe związki o wyżej podanych wzorach są nowe.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania RNA zawierającego na końcu 5' związek o wzorze 1, 2, 6, 7, 8, lub 9 polegający na tym, że na polinukleotydowej matrycy w obecności polimerazy RNA poddaje się reakcji ATP, CIP, UTP, GTP oraz związek o wzorze 1, 2, 6, 7, 8, lub 9 w warunkach zapewniających transkrypcję polinukleotydowej matrycy przez polimerazę RNA.

Wynalazek dotyczy także sposobu otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego antygenu in vitro, który charakteryzuje się tym, że translacji w układzie pozakomórkowym poddaje się cząsteczkę RNA zawierającą na końcu 5' związek o wzorze 1, 2, 6, 7, 8, lub 9, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA.

Sposób otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego antygenu w hodowli komórkowej polega według wynalazku na tym, że do hodowli komórkowej wprowadza się cząsteczkę RNA zawierającą na końcu 5' związek o wzorze 1, 2, 6, 7, 8, lub 9, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA.

Jak już wspomniano, translacja w hodowlach komórkowych, do których wprowadzono mRNA zawierający różne związki o wyżej podanych wzorach, nazywane S-ARCA, zachodzi z pięciokrotnie wyższą wydajnością niż w przypadku mRNA syntetyzowanego przy użyciu znanego analoga, m⁷GpppG.

Ponadto, okres półtrwania mRNAs kapowanego za pomocą S-ARCA jest trzykrotnie dłuższy niż mRNA syntetyzowanego przy użyciu niemodyfikowanego kapu. Połączenie wydajniejszej translacji oraz większej stabilności mRNA daje wzrost całkowitej produkcji białek w transfekowanych komórkach w porównaniu z produkcją przy zastosowaniu znanych syntetycznych mRNA lub mRNA kapowanych za pomocą ARCA.

7,2'-O

Na załączonych rysunkach Fig. 1 przedstawia schemat syntezy α S-ARCA m2^7,2'-OGpppSG.

7,2'-O

Fig. 2 przedstawia schemat syntezy γ S-ARCA m₂ ^7,2'-OGp_SppG.

7,2'-O

Fig. 3 przedstawia schemat syntezy β S-ARCA m₂ ^7,2'-OGpp_SpG.

Fig. 4 pokazuje analizę syntetyzowanych in vitro oligonukleotydów trawionych hDcp2 metodą anionowymiennej HPLC.

Fig. 5 pokazuje rozpad mRNA lucyferazy kapowanego za pomocą S-ARCA w komórkach HC11.

Fig. 6 pokazuje wydajność translacyjną mRNA kapowanego za pomocą S-ARCA w komórkach HC11.

Fig. 7 przedstawia polisomalną dystrybucję w komórkach HC11 mRNA lucyferazy i GAPDH kapowanego za pomocą S-ARCA.

Fig. 8 pokazuje czas ekspresji lucyferazy po nukleoporacji komórek HC11 mRNA kapowanym za pomocą S-ARCA.

Opisane niżej eksperymenty bliżej ilustrują wynalazek.

Nukleotydowe związki pośrednie były oczyszczane przy użyciu kolumnowej chromatografii jo3nowymiennej na DEAD-Sephadex A-25 (HCO^3- forma) przy użyciu liniowego gradientu wodorowęglanu

PL 214 850 B1 trietyloamoniowego (TEAB) w dejonizowanej wodzie. W wyniku oczyszczania otrzymywano produkty w postaci soli trietyloamoniowej po uprzednim odparowaniu roztworu z dodatkiem etanolu pod zmniejszonym ciśnieniem. Finalne produkty (analogi kapu) były rozdzielane przez półpreparatywne HPLC, a następnie liofilizowane w wyniku czego otrzymywano produkty końcowe w postaci soli amoniowych. Analityczne HPLC wykonywano na aparacie Spectra-Physics SP8800 wyposażonym w kolumnę Supelcosil LC-18-T RP (4.6 x 250 mm, przepływ 1.3 ml/min) stosując 0-25% metanolu w 0.05 M octanie amonu pH 5.9 i detekcję UV przy 260 nm. Półpreparatywne HPLC przeprowadzano na aparacie Waters 600E Multisolvent Delivery System wyposażonym w kolumnę RP Waters HR-C-18 (19 x 300 mm, przepływ 5.0 ml/min) stosując liniowy gradient metanolu w 0.05 M buforze wykonanym z octanu amo1 31 nu, pH 5.9, i detekcję UV przy 260 nm. Widma ¹H NMR i ³¹P NMR były zarejestrowane w temperaturze 25°C na aparacie Varian UNITY-plus odpowiednio przy 399.94 MHz i 161.90 MHz.

₁

Przesunięcia chemiczne w ¹H NMR podano w odniesieniu do 3-trimethylsilyl-[2,2,3,3-D4]31

-propionianu sodu (TSP) w D2O jako wzorca wewnętrznego. Przesunięcia chemiczne w ³¹P NMR podano w odniesieniu do 20% kwasu fosforowego w D2O jako wzorca zewnętrznego. Widma masowe rejestrowano na aparacie Micromass QToF 1 MS stosując jonizację ujemną (ESI (-)).

7-metyloguanozyna została zsyntetyzowana poprzez metylację guanozyny jodkiem metylu jak opisano poprzednio z modyfikacją polegającą na użyciu DMF zamiast DMA. [J. Jones et al. „Purine

Nucleosides. 111. Methylation Studies of Certain Naturally Occurring Purine Nucleosides”, J. Am.

Chem. Soc., vol. 85, pp. 193-201 (1963)] 7,2'-O-dimetylioguanozynę zsyntetyzowana z 2'-O-metyloguanozyny stosując procedurę analogiczną jak opisana wcześniej. [J. Kusmierek et al. “A new route to 2'(3')-O-alkyl purine nucleosides”, Nucleic Acids Res. vol. 1. pp. 73-77. Special Publication

No. 4 (1978).] GMP i GDP zakupiono z Sigma-Aldrich i przekształcono w sól trietyloamoniową stosu7,2'-O 7,2'-O jąc żywicę jonowymienną Dowex 50 WX 8. m₂ ^7,2'-OGMP i m₂ ^7,2'-OGDP otrzymano stosując metody opisane wcześniej [J. Jemielity et al. „Novel ‘anti-reverse' cap analogues with superior translational properties,” RNA, vol. 9, pp. 1108-1122 (2003)]. Sól trietyloamoniową kwasu tiofosforanowego otrzymnano z Na3PSO3 przez chromatografię jonowymienną wykonaną na żywicy Dowex 50 WX 8 i po odparowaniu do sucha przetrzymywano w temperaturze -20° [J Kowalska et al. “A simple and rapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at the terminal position of the phosphate chain”, Tetrahedron Lett., in press (2007) doi: 10.1016/j.tetlet.2007.05.170.]

7,2'-O

Ogólna procedura otrzymywania imidazolowych pochodnych (GMP-Im, m2^7,2'-OGMP-Im, GDP-Im, and m₂ ^7,2'-OGDP-Im)

[T. Mukaiyama, et al. „Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparation of active phosphorylating reagents”, M. Bull. Chem. Soc. Jpn, vol. 44. 2284 (1971).] Odpowiedni nukleotyd (1 mmol, TEA salt), imidazol (8 mmol), i 2,2'-dithiodipirydyna (3 mmol) zostały zmieszane w DMF (około 10 ml). Trietyloamine (2 mmol) i trifenylfosfina (3 mmol) były dodane i całość mieszano przez 6-8 h. Produkt wytrącono z mieszaniny reakcyjnej roztworem nadchloranu sodu w bezwodnym acetonie (1 mmol na ładunek ujemny) (50 ml). Po ochłodzeniu do 0°C osad przesączono, i kilkakrotnie przemyto bezwodnym acetonem, a następnie osad suszono nad P4O10. Wydajności 80 - 100%.

5' Tiofosforylacja nukleozydów

5'-tiofosforan guanozyny. Zawiesinę guanozyny (257 mg, 0.91 mmol. suszoną przez noc w eksykatorze próżniowym nad P4O10) in fosforanie trimetylu (4.6 ml) ochłodzono do 0°C. Dodano 2,6-dimetylopirydynę (338 μ|, 2.9 mmol) i PSCI₃ (203 μ|, 2.0 mmol). Reakcję prowadzono w 0°C przez noc, a następnie zatrzymano przez dodanie 0.25 M TEAB (40 ml), następnie mieszano przez 1 h. Chromatografia na DEAE-Sephadex z |iniowym gradientem 0-0.7 M TEAB dała 380 mg (0.67 mmo|)

GMPS (Wydajność 74%).

5'-tiofosforan 7-metyloguanozyny. Związek zsyntetyzowano stosując analogiczną procedurę do tej, którą zastosowano w przypadku GMPS stosując 7-metyloguanozynę (120 mg, 0.42 mmo|). Po DEAE-Sephadex'ie z gradientem 0-0.6 M TEAB otrzymano 57 mg (0.10 mmo|) m⁷GMPS (24% wydajność).

5'-tiofosforan 7,2'-O-dimetyloguanozyny. Związek zsyntetyzowano stosując analogiczną procedurę do tej, którą zastosowano w przypadku GMPS stosując 7,2'-O-dimetyloguanozynę (70 mg, 0.23 mmol), z tą różnicą, że zamiast fosforanu trimetylu użyto fosforan tri ety|u. Po DEAE-Sephadex'ie z gradientem 0-0.6 M TEAB otrzymano 75 mg (0.13 mmo|) 5'-tiofosforanu 7,2'-O-dimety|oguanozyny (53% wydajność).

PL 214 850 B1

Synteza nukleozydu 5'-(2-tiodifosforanów)

5'-(2-tiodifosforan) 7,2'-O-dimetyloguanozyny. Bezwodny chlorek cynku (190 mg. 1.40 mmol) 7,2'-O został dodany do zawiesiny m2^7,2'-OGMP-Im (100 mg. 0.21 mmol) i soli trietyloamoniowej kwasu tiofosforanowego (220 mg) w 5 ml DMF. Otrzymany roztwór mieszano przez 20 min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano dodając EDTA (560 mg w 50 ml wody) i zobojętniono stałym NaHCO3. Oczyszczano na DEAE-Sephadex stosując gradient 0-1 M TEAB. odparowano, a następnie suszono nad P₄O₁₀ otrzymując 106 mg (0.15 mmol) m₂ ^7,2-0GDP3S (wydajność 71%).

MS ESI (-): Obliczony dla C12H18N5O10P2S: 486.02; znaleziony 485.98.

Synteza S-ARCA m₂ ^7,2'-OGppp_SG, izomery D1 i D2. GMPS (48 mg, 0.084 mmol) i m₂ ^7,2'-OGDP-Im (57 mg, 0.10 mmol) zmieszano w 2 ml DMF. następnie dodano bezwodny ZnCl2 (115 mg, 0.84 mmol). Otrzymany roztwór mieszano magnetycznie w temperaturze pokojowej przez 2 dni. Reakcję zatrzymano dodając 350 mg EDTA w 30 ml wody i zobojętniono stałym NaHCO3. Produkt rozdzielono na izomery D1 i D2 półpreparatywne RP-HPLC stosując liniowy gradient metanolu w 0.05 M octanie amonu, pH 5.9, 0-50% przez 45 min.

MS ESI (-): Obliczone dla C22H30N10O17P3S: 831.07; znaleziono: 830.91.

D1: Wydajność 5.2 mg; ¹H NMR: δ 8.10 (1H, s), 5.94 (1H. d), 5.81 (1H, d); 4.68 (1H; t), 4.56 (1H, t), 4.50 (1H, m), 4.39-4.26 (7H, m), 4.08 (3H, s), 3.59 (3H, s), ³¹P NMR: δ 43.61 (1P, d, Pa), -11.33 (1P, d. Ργ), -23.85 (1P, dd, Ρβ).

D2: 7.4 mg; ¹H NMR: δ 8.07 (1H, s), 5.93 (1H, d), 5.80 (1H. d); 4.66 (1H; t). 4.52 (1H, t), 4.47 (2H, m), 4.35-4.21 (6H, m), 4.07 (3H, s), 3.59 (3H, s) ³¹P NMR: δ 43.70 (1P,d, Pa), -11.34 (1P, d, Ργ), -23.80 (1P, dd, Ρβ).

7,2'-O 7,2'-O m₂ ^7,2'-OGppSpG, izomery D1 i D2. Związki zsyntetyzowano jak opisano dla m2^7,2'-OGpppSG stosując m₂ ^7,2-0 GDP3S (106 mg, 0.16 mmol), GMP-Im (103 mg. 0.24 mmol). i ZnCl₂ (260 mg, 1.9 mmol) w 5 ml DMF. Reakcję zatrzymano dodając 800 mg EDTA w 100 ml wody zobojętniono stałym NaHCO3. Produkt rozdzielono na izomery D1 i D2 stosując półpreparatywne RP-HPLC stosując liniowy gradient metanolu w 0.05 M octanie amonu, pH 5.9, 0-50% przez 45 min.

MS ESI (-): Obliczono dla C22H30N10O17P3S: 831.07; znaleziono: 831.03.

D1: Wydajność: 10 mg; ¹H NMR: δ 9.03 (1H*, s), 8.06 (1H. s), 6.00 (1H, d); 5.83 (1H; d), 4.72 (1H, t), 4.56 (2H, m), 4.45 (1H, m), 4.35-4.23 (7H, m), 4.09 (3H, s), 3.62 (3H, s); ³¹P NMR: δ 30.27 (1P, t, Ρβ), -12.08 (2Ρ, d, Pa and Ργ).

D2: Wydajność: 12 mg; ¹H NMR: δ 9.02 (1H*, s), 8.04 (1H, s), 5.96 (1H, d); 5.81 (1H; d), 4.71 (1H, t), 4.57 (1H, t), 4.52 (1H, m), 4.43 (1H, m), 4.38-4.26 (6H, m), 4.10 (3H, s), 3.61 (3H, s); ³¹P NMR: δ 30.27 (1P, t, Ρβ). -12.08 (2Ρ, d, Pa i Ργ).

7,2'-O 7,2'-O m₂ ^7,2'-OGpSppG, izomery D1 i D2 Związki zsyntetyzowano jak opisano dla m2^7,2'-OGpppSG stosując m2^7,2'-OGMPS (70 mg, 0.15 mmol), GDP-Im (107 mg, 0.20 mmol), i bezwodny ZnCl2 (220 mg, 1.6 mmol) w 3 ml of DMF. Reakcję zatrzymano dodając 650 mg EDTA w 70 ml wody i produkty rozdzielono stosując półpreparatywne RP-HPLC stosując liniowy gradient metanolu w 0.05 M octanie amonu. pH 5.9, 0-50% przez 45 min. MS ESI (-): Calc, for C22H30N10O17P3S: 831.07; found: 830.94 (D1).

D1: Wydajność 15 mg; ¹H NMR: δ 9.08 (1H*, s), 8.01 (1H, s). 5.95 (1H, d), 5.79 (1H, d); 4.68 (1H; t), 4.56 (1H, t), 4.50 (1H, m), 4.40-4.23 (7H, m), 4.08 (3H, s), 3.59 (3H, s); ³¹P NMR: δ 43.63 (1P, d, Ργ), -11.25 (1P, d, Pa), -23.85 (1P, dd, Ρβ).

D2: 20 mg; ¹H NMR: δ 9.06 (1H*,s) 8.01 (1H, s), 5.93 (1H, d), 5.78 (1H, d); 4.66 (1H; t), 4.48 (3H, m), 4.34-4.26 (5H, m), 4.18 (1H, m), 4.08 (3H, s), 3.61 (3H, s) ³¹P NMR: δ 43.12 (1P,d, Ργ), -11.32 (1P, d, Pa), -23.72 (1P, dd, Ρβ). (*Protony częściowo wymieniane podczas eksperymentu NMR.)

Kultury komórkowe

Ssacze komórki nabłonka HC11 zostały zklonowane z linii gruczołowych komórek ssaczych COMMA-1D [K. Danielson et al. „Epithelial mouse mammary cell line exhibiting normal morphogenesis in vivo and functional differentiation in vitro,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 81, pp. 3756-3760 (1984)]. Hodowla komórkowa prowadzona była w medium 1640 zawierającym 10% Bovine Growth Serum (HyClone), 5 μg/ml insuliny bydlęcej (Sigma), oraz 10 ng/ml rekombinowanego EGF (BD Biosciences).

PL 214 850 B1

Synteza mRNA In vitro

Kapowane RNA było otrzymane przez transkrypcję in vitro w obecności plazmidu zawierającego gen lucyferazy (pluc-A60), T7 polimerazę oraz wszystkie cztery trifosforanowe nukleozydy i różne dinukleotydowe analogi kapu. [J. Jemielity et al. „Novel ‘anti-reverse' cap analogues with superior translational properties,” RNA. vol. 9, pp. 1108-1122 (2003).] Typowe warunki reakcji transkrypcji: 40 mM

Tris-HCl. pH 7.9, 6 mM MgCl₂, 2 mM spermidyna, 10 mM DTT, 0.1 mg/ml BSA, 1 U/μΙ of RNasin (Promega), 0.5 mM ATP, 0.5 mM CTP, 0.5 mM UTP, 0.1 mM GTP, 1 mM analoukapu, 15 μg/μl DNA, i 1 U/μΙ T7 polimerazy (Promega). pluc-A₆₀, który zawiera całkowitą sekwencję kodującą lucyferazę świetlika w pGEM4 (Promega) oraz na końcu 3' 60-nt ogon poli(A) [E. Grudzien et al., „Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,” J. Biol. Chem., vol. 281, pp. 1857 -1867 (2006)]. był trawiony przy użyciu Hpal do syntezy mRNA lucyferazy oraz Ncol do syntezy kapowanych oligonukleotydów.

Krótkie RNA były syntetyzowane w obecności 10 μ^^ [α- P]GTP (ICN) w 50^l mieszaninach reakcyjnych inkubowanych przez 45 min w^r 37°C. Mieszaniny reakcyjne były ekstrahowane fenolem chloroformem, a następnie RNA było oddzielane od niewbudowanych nukleotydów przy użyciu kolumn do wirowania (Ambion), stosując protokół producenta. Stężenie mRNA było wyznaczane przez pomiar promieniowania Czerenkowa pochodzący od [α- P]GTP w finalnej mieszaninie reakcji transkrypcji i było następnie użyte do przekształcenia cpm (rozpadów na minutę) w pmol (pikomole).

mRNA było syntetyzowane w 200^l mieszaninie reakcyjnej inkubowanej przez 45 min w 37°C. Po inkubacji, 200^l mieszaniny reakcyjne były traktowane 3 jednostkami DNase RQ1 (Promega) przez 20 min w 37°C, następnie RNA było oczyszczane przy użyciu RNeasy mini kit (Qiagen) według protokołu producenta. Stężenie RNA wyznaczono spektrofotometrycznie.

Badania dekapingu RNA in vitro

Aktywność Dcp2 była mierzona na skróconym mRNA lucyferazy (48 nukleotydów). GST-hDcp2 był ekspresjonowany w Escherichia coli i oczyszczany jak opisano przez Z. Wang et al. „The hDcp2 protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, pp. 12663 -12668 (2002). Kapowane oligonukleotydy były najpierw poddane trawieniu GST-hDcp2 w 37°C przez h w odpowiednim buforze (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM octanu potasu, 2 mM octanu magnezu, 0.5 mM MnCl2, 2 mM ditiotreitolu, and 0.1 mM sperminy). [C. Piccirillo et al. „Functional characterization of the mammalian mRNA decapping enzyme hDcp2,” RNA, vol. 9, pp. 1138-1147 (2003)] Mieszanina reakcyjna była ekstrahowana jednokrotnie taką samą objętością fenolu oraz dwukrotnie chloroformem a następnie mRNA wytrącono etanolem. Produkty reakcji dekapingu były dalej trawione koktajlem rybonukleaz (RiboShredder; Epicentre) w 37°C przez 1 h. Produkty rozdzielano przy użyciu HPLC na kolumnie jonowymiennej (4.6 x 250-mm Partisil 10SAX/25 column, Whatman). Stosowany program elucji miał następującą postać: 1 min, liniowy gradient do 112 mM KH2PO4, pH 4.5, przez 20 min, liniowy gradient 112-450 mM KH2PO4 przez 15 min, liniowy gradient 450 mM do 1.5 M KH2PO4 przez 15 min, elucja izokratyczna 1.5 M KH2PO4 przez 9 min, całość przy przepływie 1 ml/min.

Pomiar wydajności translacji i rozpadu mRNA w komórkach HC11.

Dwie metody, elektroporacja i nukleoporacja, były użyte w celu dostarczenia RNA do komórek. W przypadku elektroporacji, 5 μg RNA było wprowadzone do 10⁷ HC11 komórek w całkowitej objętości 400 μl serum-reduced RPMI 1640 medium w Gene kuwecie elektroporacyjnej (szczelina 4 mm) stosując Bio-Rad Genepulser™ przy następujących ustawieniach 0.22 kV i 960 μF. Następnie, komórki były przemywane dwukrotnie PBS, wirowane przez 2 min 300 x g w temperaturze pokojowej, ponownie zawieszone w ogrzanym kompletnym medium i umieszczone w 37°C. Nukleoporacja była przeprowadzona przy użyciu Amaxa Nucleofector II (Amaxa Biosystems) zgodnie z rekomendacją producenta. 1 mikrogramowe próbki RNA były wprowadzone do 10⁶ HC11 komórek stosując Nucleofector Solution V i rekomendowane ustawienia (program T-024).

Do pomiarów wydajności translacji, komórki podzielono na kilka probówek Eppendorf'a, umieszczono w łaźni wodnej w 37°C, i wytrząsano. Do pomiaru stabilności mRNA komórki były umieszczone w 35-mm szalkach do hodowli komórkowych i umieszczone w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Komórki zbierano po różnych czasach inkubacji i przemywano dwukrotnie PBS.

₅

W celu ekstrakcji cytoplazmatycznego RNA, 2 x 10 komórek zostało poddanych lizie w 175 μl buforu lizującego (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5% (v/v) Igepal (Sigma),

I 1 mM ditiotreitolu). RNA było następnie oczyszczane stosując RNeasy mini kit. W celu ekstrakcji ₅ białka, 2 x 10 komórek było lizowanych w 200 μl Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega).

PL 214 850 B1

Aktywność lucyferazy w ekstraktach komórkowych była mierzona zgodnie z protokołem producenta (Promega).

Przygotowanie polisomów

W celu rozdziału rybosomalnych podjednostek i kompleksu inicjującego, 4 x 10⁶ HC11 komórek potraktowano przez 2 min oziębionym w lodzie PBS zawierającym 0.1 mg/ml cykloheksaimidu, przemyto dwukrotnie tym samym medium, i lizowano w 600 μΐ 0.3 M NaCl, 15 mM Tris-HCl (pH 7.6), 15 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 1 mg/ml heparyna, i 0,1 mg/ml cykloheksaimidu. Po odwirowaniu przy 14,000 x g przez 10 min, supernatant został naniesiony na 15-45% gradient sacharozowy w tym samym buforze tylko niezawierającym Tritonu X-100 następnie odwirowywano stosując rotor Beckman SW41 Ti przy 38,000 rpm i 4°C przez 2 h. Gradienty były frakcjonowane stosując ciągły monitoring absorbancji przy 260 nm. RNA z każdej frakcji (1 ml) było izolowane i analizowane za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

PCR w czasie rzeczywistym

Około 2 μg próbki całkowitego RNA izolowanego z komórek HC11 i oczyszczanego przy użyciu RNeasy mini kit (Qiagen) potraktowano 3 jednostkami DNase RQ1 (Promega) przez 20 min w 37°C. Odwrotna transkrypcja była przeproawdzona na 400 ng RNA w 20^l mieszaninach reakcyjnych zawierających 5.5 mM MgCl2, 500 μΜ każdego dNTP, 2.5 μΜ losowych heksamerów, 0,2 jednostek inhibitora RNase, i 0,8 jednostek MultiScribe odwrotnej transkryptazy (Applied Biosystems). Mieszaniny reakcyjne były inkubowane w 25°C przez 10 min, 48°C przez 30 min, i 95°C przez 5 min. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono stosując specjalnie zaprojektowany starter dla każdego mRNA stosując Beacon Designer tool (Bio-Rad). W celu detekcji sekwencji na końcach mRNA lucyferazy stosowano startery 5'-CGTTCGGTTGGCAGAAGCTA-3' i 5'-ACTGTTGAGCAATTCACGTTCATT-3' mRNA lucyferazy, od struktury kapu do początku 3'-terminalnego homopolymerowego traktu, składało się z 1714 nukleotydów. Powyższe startery amplifikują nukleotydy 226-398. poziom mysiego mRNA kodującego GAPDH zmierzono tą samą metodą i dla takich samych próbek RNA stosując następujące startery 5'-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3' i 5'-GAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGA-3'.

Amplifikację i detekcję przeprowadzono stosując system detekcji i Cycler IQ PCR czasu rzeczywistego w 25^l mieszaninach reakcyjnych zawierających 5 μl mieszanin reakcji transkrypcji (50 ng cDNA), 12.5 μl IQ SYBRgreen Supermix. i 0.3 mM starterów (Bio-Rad). Warunki inkubacji były następujące: 3 min w 95°C w celu aktywacji polimerazy i 40 cykli 15 s w 95°C i 1 min w 60°C.

Poziom mRNA lucyferazy został obliczony używając przepisu zamieszczonego w User Bulletin No. 2 dla ABI Prism 7700 Sequence Detection System. Po obliczeniu ilości mRNA lucyferazy z krzywej wzorcowej, przeprowadzono normalizację dla ilości mRNA mysiego GAPDH w każdej probówce. Na podstawie ilość mRNA lucyferazy pozostającego po różnych czasach wyekstrapolowano procent RNA w czasie zero, wyniki przedstawiono jako zależność log10([RNA]) do czasu półtrwania. Do analizy RNA z gradientu polisomów, in vitro-zsyntetyzowany GFP mRNA został dodany do każdej frakcji izolowanego RNA jako standard wewnętrzny w celu kontroli zróżnicowania wydajności RNA. Poziom mRNA GFP został użyty do normalizacji poziomów mRNA luciferazy i GAPDH.

Wyniki

Przygotowano i zbadano serię trzech analogów kapu modyfikowanych grupą metylowa w pozycji 2' 7-metyloguanozyny (ARCA) oraz resztą tiofosforanową w pozycjach α, β, lub γ łańcucha 5',5'-trifosforanowego. We wszystkich tych S-ARCA, jeden z niemostkowych tlenów w łańcuchu trifosforanowym jest zastąpiony na atom siarki. Ze względu na obecność stereogenicznego P-centrum każdy z analogów został otrzymany jako mieszanina distereoizomerów (nazwanych D1 i D2 według kolejności ich eluowania z kolumny RP-HPLC). Zostały one rozdzielone stosując HPLC I kolumnę z odwróconymi fazami (RP), dając w ten sposób sześć związków, które zostały następnie przetestowane pod względem ich właściwości biochemicznych i biologicznych.

Analogi typu ARCA zostały zaprojektowane w celu zapewnienia poprawnej orientacji struktury kapu na końcu 5' w transkryptach mRNA otrzymanych w wyniku transkrypcji in vitro. Jakkolwiek zwykle pozycja 3' w 7-metyloguanosine jest zmodyfikowana dla tego celu, użyliśmy analogu modyfikowanego w pozycji 2' z dwóch zasadniczych powodów: (i) nasze poprzednie badania wskazują, że 2'-O-metylowane analogi są wbudowywane do mRNA wyłącznie w poprawnej orientacji i wykazują nawet nieco lepsze właściwości translacyjne niż ich 3'-modifikowane odpowiedniki, (ii) komercyjnie dostępna 2'-O-metylguanozyna, która jest materiałem startowym do syntezy jest około dziesięciokrotnie tańsza od 3'-O-metyloguanozyny.

PL 214 850 B1

Synteza tiofosforanowych analogów kapu

Chemiczna synteza S-ARCA była przeprowadzona z wykorzystaniem metod podobnych do poprzednio rozwinientych do syntezy analogów niemodyfikowanych w 5',5'-polifosforanowym [M. Kadokura et al., „Efficient synthesis of γ-methyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions,” Tetrahedron Lett., vol. 38, pp. 8359-8362 (1997); J. Stepinski et al., „Synthesis and properties of mRNAs containing the novel „anti-reverse” cap analogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG,” RNA, vol. 7, pp. 1486-1495 (2001), and J. Jemielity et al., „Novel ‘anti-reverse' cap analogues with superior translational properties,” RNA, vol. 9, pp. 1108-1122 (2003)]. Według tego podejścia dwa mononukleotydy, z których jeden uprzednio zaktywowano w postaci odpowiedniego imidazolidu, są sprzęgane w DMF. Reakcja jest w dużym stopniu ułatwiana przez zastosowanie 8-molowego nadmiaru ZnCl2, który jednocześnie poprawia rozpuszczalność w medium organicznym, chroni przed hydrolizą imidazolową pochodną, oraz przyspiesza szybkość reakcji. Podobną metodologie zastosowaliśmy do syntezy związków zawierających mieszane bezwodnikowe wiązanie fosforano-tiofosforanoweothioate. Kluczowym etapem każdej z syntez było sprzęganie odpowiedniego imidazolidu z 5'-tiofosforanem nukleozydu lub 5'-(2-tiodifosforanu) nukleozydu w DMF w obecności ZnCl2. Dotychczas nie opisano użycia tiofosforanowych nukleotydów w tego typu reakcji. Pośrednie 5'-(2-tiodifosforany) nukleozydów zostały wydajnie otrzymane w ostatnio opracowanej reakcji, w której anion tiofosforano3wy (PSO3^3-) zastosowano jako nukleofil. [J. Kowalska et al., “A simple and rapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at the terminal position of the phosphate chain”, Tetrahedron Lett., in press (2007) doi: 10.1016/j.tetlet.2007.05.170].

Drogi syntezy prowadzące do otrzymania analogów zawierających modyfikację tiofosforanową w pozycjach α, γ, lub β mostka trifosforanowego przedstawiono odpowiednio na Figurach 1,2 i 3.

Reakcja dekapingu in vitro

Znane są dwa enzymy powodujące dekaping, Dcp1/Dcp2, który działa na nienaruszony mRNA zaczynając degradację w kierunku 5'>3' oraz DcpS, który działa na krótkie oligonukleotydy zawierające strukturę kapu, powstałe w wyniku degradacji 3'>5. Ponieważ Dcp1/Dcp2 lub sam Dcp2 uwalniają m⁷GDP z kapowanego mRNA, rozszczepienie następuje pomiędzy α- i β-fosforanem. [Z. Wang et al., „The hDcp2 protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. vol. 99, pp. 12663-12668 (2002).] Poprzednio wykazano, że 5'-monotiofosforany nukleozydów jak również ich di- i trifosforanowe analogi takie jak ATPyS, GTPyS, a także GDPeS były odporne na działanie pirofosfataz. [F. Eckstein et al., „Guanosine 5'-O-(2-thiodiphosphate). An inhibitor of adenylate cyclase stimulation by guanine nucleotides and fluoride ions”, J. Biol. Chem., vol. 254, pp. 9829-9834 (1979), oraz D. Cassel et al, „Activation of turkey erythrocyte adenylate cyclase and blocking of the catecholamine-stimulated GTPase by guanosine 5'-(gamma-thio) triphosphate”, Biochem Biophys Res Commun, vol. 77, pp. 868-873 (1977).] Co więcej, polinukleotydy zawierające internuleotydowe wiązanie tiofosforanowe były degradowane znacznie wolniej niż ich naturalne odpowiedniki [H. Matzura et al., „A polyribonucleotide containing alternation P=O and P=S linkages”, Eur. J. Biochem., vol. 3, pp. 448-452 (1968).] Co ciekawe tiofosforanowe diastereomery mogą wykazywać dużą różnorodność pod względem specyficzności cięcia przez różne nukleazy. Nukleaza P1 hydrolizuje diastereoizomery Sp znacznie szybciej niż Rp. [B. Potter et al, „Synthesis and configurational analysis of a dinucleoside phosphate isotopically chiral at phosphorus. Stereochemical course of Penicillium citrum nuclease P1 reaction.”, Biochemistry, vol. 22, pp. 1369-1377 (1983)]. Rybonukleaza T1 i fosfodiesteraza z jadu węża tną Rp diastereomery a nie Sp. [F. Eckstein et al, „Stereochemistry of the transesterification step of ribonuclease T1”, Biochemistry, vol. 11, pp. 3507-3512 (1972), and P. Burgers et al., „Absolute Configuration of the Diastereomers of Adenosine 5'-O-(1-thiotriphosphate): Consequences for the stereochemistry of polymerization by DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 75, pp. 4798-4800 (1978).] W oparciu o te obserwacje

7,2'-O 7,2'-O można podejrzewać, że mRNA kapowane różnymi distereomerami m₂ ^7,2'-OGpppSG i m2^7,2'-OGppSpG może się różnić podatnością na cięcie przez Dcp1/Dcp2.

W celu rozwiązania tego problemu, zbadaliśmy podatność na hydrolizę przez hDcp2 oligonukleotydy kapowane różnymi S-ARCA [See Z. Wang et al., „The hDcp2 protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, pp. 12663-12668 (2002), oraz Z. Wang et al., „An mRNA Stability Complex Functions with Poly(A)-Binding Protein To Stabilize mRNA In Vitro”, Mol. Cell. Biol., vol. 19, pp. 4552-4560 (1999).] Analogi kapu użyte w tych badaniach były nieznako12

PL 214 850 B1 wane, więc w celu śledzenia produktów reakcji zsyntetyzowaliśmy kapowane oligonukleotydy w obec32 ności [α- P]GTP i matrycy DNA w których G jest pierwszym po promotorze rybonukleotydem. Kapowane przy użyciu S-ARCA oligonukleotydy były poddane trawieniu Dcp2 in vitro, następnie produkty tej reakcji były traktowane koktajlem rybonukleaz (RiboShredder from Epicenter). Chromatografia jonowymienna została zastosowana do rozdziału znakowanych monofosforanów 3'-nukleozydów (3'-NMP*). otrzymanych z RNA, ze znakowanego 5'-terminalnego produktu (Fig. 4). Ten ostatni składał 7,2'-O 7,2'-O się z p₃Gp* powstałego z niekapowanego transkryptu i m₂ ^7,2'-OGp3Gp* (kiedy m2^7,2'-OGp3G był użyty) lub pGp* powstałych z kapowanego mRNA odpowiednio bądź to odpornego bądź nieodpornego na enzymatyczne rozszczepienie. Wszystkie analogi użyte In tych badaniach były analogami typu ARCAs, co zapewniało wbudowanie wyłącznie w prawidłowej orientacji do RNA. Co więcej tylko 5'7,2'-O

-końcowy produkt (m2^7,2'-OGp3Gp*) był obserwowany po traktowaniu rybonukleazami. Dodatkowo, niekapowany RNA nie jest substratem dla Dcp2, co tłumaczy obecność p3Gp* po trawieniu przez

Dcp2.

W celu wyznaczenia, który analog kapu chroni mRNA przed rozszczepieniem przez hDcp2, trawiliśmy kapowany - ³²P-znakowany krótki RNA rekombinowanym hDcp2 stosując warunki, w któ7,2'-O rych (i) oligonukleotydy kapowane m2^7,2'-OGp3G były całkowicie trawione przez hDcp2 (Fig. 4A) i (ii)

7,3'-O 7,3'-O oligonukleotydy kapowane m₂ ^7,3'-OGppCH2pG były odporne (Fig. 4B). m2^7,3'-OGppCH2pG jak pokazano poprzednio chroni mRNA przeciw degradacji przez hDcp2 [E. Grudzien et al, „Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,” J. Biol. Chem., vol. 281, pp. 1857-1867 (2006)]. 7,2'-O

Odkryliśmy, ze tylko izomer D2 m2^7,2'-OGppSpG stabilizuje RNA przeciwko hydrolizie przez hDcp2

7,2'-O 7,2'-O (Fig. 4D). Oligonukleotydy kapowane izomerami m₂ ^7,2'-OGpppSG i m2^7,2'-OGpSppG nie wykazywały zwiększonej odporności na hDcp2 (Fig. 4).

5' degradacja mRNA kapowanego tiofosforanowymi analogami

7,2'-O

Ponieważ krótki RNA kapowany m2^7,2'-OGppSpG był odporny na hydrolizę hDcp2 badano wpływ obecności tego analoga na zmianę stabilności mRNA w komórkach. Jako metodę wprowadzenia syntetycznego mRNA lucyferazy do mysich nabłonkowych komórek HC11 stosowano nukleoporację lub elektroporację. Metody te pozwalają określić syntezę lucyferazy i poziom mRNA lucyferazy. Dla elektroporacji zastosowano warunki optymalizowane uprzednio patrz E. Grudzien et al. „Differential inhibition mRNA degradation pathways by novel cap analogs” J. Biol. Chem., vol.281, str. 1857-1867 (2006).

mRNA lucyferazy zawierające różne 5'-końcowe analogi i 3'-końcowe poli(A) trakty (Luc-A60) syntetyzowano in vitro. Po nukleoporacji komórki były usuwane w odstępach albo do 90 min. w celu określenia wydajności translacji przez wzrost aktywności lucyferazy, albo do 8 h dla pomiaru stabilności mRNA lucyferazy na drodze rzeczywistego czasu PCR.

Stabilność Luc-A60 kapowanych różnymi S-ARCA określono po nukleoporacji do komórek HC11. Pozostający mRNA określano przy różnych czasach metodą rzeczywistego czasu PCR. Luc7,2'-O

A60 kapowany za pomocą m2^7,2'-OGppSpG był bardziej stabilny (t1/2=257 min) niż mRNA kapowany naturalnym m⁷Gp3G (t1/2=86 min) lub m2^7,2'-OGp3G (t1/2=155 min) (Fig. 5 oraz tablica). To sugeruje, że

7,2'-O wzrost stabilności mRNA jest spowodowany odpornością na hydrolizę Dcp1/Dcp2. Ani m2^7,2'-OGpppSG

7,2'-O (D1) (t1/2=169 min), ani m2^7,2'-OGppSpG (D1) (D1) (t1/2=185 min) nie nadawały znacznie większej stabil7,2'-O ności niż m2^7,2'-OGp3G (t1/2=155 min) (patrz tabela). Jest godne uwagi, że powinowactwo do elF4E m2^7,2'-OGpppSG (D1) i m₂ ^7,2'-OGppSpG (D1) jest trzykrotnie większe niż m2^7,2'-OGp3G.

Wydajność translacyjna mRNA lucyferazy kapowanego za pomocą S-ARCA w komórkach

HC11.

Określono także wydajność translacyjną dla mRNA lucyferazy kapowanego za pomocą S-ARCA w hodowlach komórkowych. To obejmowało dwa pomiary prowadzone przy różnych czasach po nukleoporacji - pomiar aktywności lucyferazy metodą luminometryczną oraz pomiar poziomu

7,2'-O 7,2'-O

Luc-A₆₀ metodą rzeczywistego czasu PCR. mRNA Luc-A₆₀ kapowany m₂ ^7,2'-OGpp_SpG (D1) i m₂ ^7,2'-OGppSpG (D2) ulegał translacji odpowiednio 2,8 i 5,1 raza wydajniej niż mRNA Luc-A60 kapowany m⁷Gp3G (Fig. 6, tabela). W układzie translacji pozakomórkowej w retikulocytowym lizacie królika mR7,2'-O 7,2'-O

NA Luc-A₆₀ kapowany m₂ ^7,2'-OGppSpG (D1) i m2^7,2'-OGppSpG (D2) ulegał translacji 2,3 raza wydajniej niż mRNA Luc-A60 kapowany m⁷Gp3G. Te różnice sugerują, że wzrost wydajności translacyjnej

PL 214 850 B1 w hodowlach komórkowych jest związany z wyższą stabilnością mRNA (który nie jest czynnikiem dla systemów translacji pozakomórkowej), ponieważ tylko mRNA kapowane analogami odpornymi na hDcp2 ulegały także wydajniejszej translacji.

Połączenie większej stabilności i wyższej wydajności translacji mRNA lucyferazy zawierającego S-ARCA daje większą całkowitą ekspresję białka w komórkach HC11

Określono także całkowitą akumulację lucyferazy, co określono jako jej aktywność, jako funkcję

7,2'-O 7,2'-O 7,2'-O czasu dla mRNA kapowanego za pomocą m₂ ^7,2'-OGp₃G, m₂ ^7,2'-OGppSpG (D1) i m2^7,2'-OGppSpG (D2). Komórki HC11 poddano nukleoporacji i lizowano przy różnych czasach do 10 h. Aktywność lucyferazy mierzona w supernatancie była znormalizowana przez ilość Luc-A60 dostarczaną do komórek. Jak pokazano na fig. 8 aktywność lucyferazy w komórkach HC11 po nukleoporacji była maksymalna przy 3 h, a następnie 10-krotnie spadła po 10 h. Kinetyka ekspresji była zgodna z okresem półtrwania białka lucyferazy, który wynosi około 180 min i półokresem trwania różnych mRNA lucyferazy, które wynoszą odpowiednio 155, 185 i 257 min.

7,2'-O

Największa akumulacja lucyferazy była dla Luc-A60 kapowanego za pomocą m2^7,2'-OGppSpG (D2), który miał zarówno największą wydajność translacyjną, jak i najwyższą stabilność. Wzrost całkowitej ekspresji białka z mRNA kapowanego tym analogiem może być nawet większy dla białek z dłuższym okresem półtrwania.

W zamieszczonej niżej tabeli pokazano wydajność translacyjną oraz stabilność mRNA lucyferazy z różnymi tiofosforanowymi analogami kapu w komórkach HC11.

T a b e l a

No.	Typ kapu w Luc-A60 mRNA	kap - eIF4E Kas [M-6]a	mRNA okres półtrwania (min)b	Względna wydajność translacyjnac
1	m7Gp3G	9.4 ± 0.8	86 ± 1*	1.00
2	m27,2 0Gp3G	10.8 ± 0.3	155 ± 9	2.1 ± 0.2
3	m27,2'-0GpppsG (D1)	34.3 ± 1.3	169 ± 19	2.5 ± 0.8
4	m27,2'-0GpppsG (D2)	12.9 ± 0.9	164 ± 1	1.8 ± 0.4
5	m27,2'-0GppspG (D1)	42.1 ± 1.6	185 ± 22	2.8 ± 0.3
6	m27,2'-0GppspG (D2)	18.3 ± 3.4	257 ± 4*	5.1 ± 0.5
7	m27,2'-0GpsppG (D1)	19.3 ± 1.8	149 ± 9	2.0 ± 0.1
8	m27,2'-0GpsppG (D2)	15.4 ± 0.5	139 ± 6	1.9 ± 0.1

^a Stale równowagi asocjacji dla oddziaływania mysich eIF4E (aminokwasy 28-217) z analogami kapu przy 20°C. Mysie eIF4E (reszty 28-217) były ekspresjonowane w E. coli, a miareczkowania fluorescencyjne prowadzono metodą opisaną w J. Zuberek et al., „Phosphorylation of eIF4E attenuates its interaction with mRNA cap analogs by electrostatic repusion: Intein-mediated protein ligation strategy to obtain phosphorylated protein” RNA, vol. 9, str. 52-61 (2003) i A. Niedźwiecka et al., „Biophysical studies of eIF4E cap-binding protein: recognition of mRNA 5' cap structure and synthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1 proteins” J. Mol. Biol. vol. 319, str. 615-635 (2002).

^b Degradację 5'-końcowych sekwencji w Luc-A60 mRNA kapowanym za pomocą wskazanych analogów określono metodą rzeczywistego czasu PCR z primerami o kierunku przeciwnym do 5'-końca mRNA lucyferazy.

^c Wydajność translacyjna Luc-A60 mRNA kapowanego za pomocą wskazanych analogów w komórkach HC11. Aktywność lucyferazy była normalizowana ilością RNA lucyferazy w komórkach. Względną wydajność translacji obliczono metodą opisaną przez J. Jemielity et al., „Novel ‘anti-reverse' cap analogues with superior translatio nal properties” RNA, vol. 9, str. 1108-1122 (2003).

* Wskazano półokresy trwania, które znacznie różnią się (p < 0.05) od półokresów dla mRNA kapowanego za

Claims (5)

1. Cząsteczka RNA zawierająca na końcu 5' związek o wzorze 1:

w którym Y1, Y2, Y3, a także Y4 obecne dla n=2 oznaczają niezależnie O lub S, przy czym co najmniej jeden Y oznacza S,

R1 jest wybrany z grupy obejmującej H, OH, OCH3, i OCH2CH3,

R2 jest wybrany z grupy obejmującej H, OH, OCH3, i OCH2CH3, n wynosi 1 lub 2, przy czym jeżeli R1 oznacza OH, a n wynosi 1 lub 2, wówczas R2 ma znaczenie inne niż OH, oraz jeżeli R2 oznacza OH, a n wynosi 1 lub 2, wówczas R1 ma znaczenie inne niż OH jego diastereoizomery lub ich mieszaniny.

2. Sposób otrzymywania RNA zawierającego na końcu 5' związek o wzorze 1 według zastrz. 1 in vitro, znamienny tym, że na polinukleotydowej matrycy w obecności polimerazy RNA poddaje się reakcji ATP, CTP, UTP, GTP oraz związek o wzorze 1 w warunkach zapewniających transkrypcję polinukleotydowej matrycy przez polimerazę RNA.

3. Sposób otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego antygenu in vitro, znamienny tym, że translacji w układzie pozakomórkowym poddaje się RNA zawierającą na końcu 5' związek o wzorze 1 według zastrz. 1, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA.

4. Sposób otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego w hodowli komórkowej, znamienny tym, że do hodowli komórkowej wprowadza się cząsteczkę RNA zawierającą na końcu 5' związek o wzorze 1 według zastrz. 1, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA.

5. Cząsteczka RNA zawierająca na końcu 5' związek o wzorze 2: