CN116322758A - 基于核酸的组合疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其涉及药物组合物，其包含至少一种编码来自冠状病毒，优选大流行冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的核酸，以及至少一种编码来自其它病毒例如流感病毒或RSV病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的核酸。本文提供的药物组合物适用于治疗或预防至少一种冠状病毒的感染和至少一种其它病毒感染，因此可包含在组合疫苗中。药物组合物和组合疫苗的核酸序列优选与聚合物载剂、聚阳离子蛋白质或肽或者脂质纳米颗粒(LNP)缔合。本发明还涉及药物组合物和组合疫苗的第一和第二以及其它的医药用途，并且涉及治疗或预防冠状病毒感染和其它病毒感染的方法。

Description

基于核酸的组合疫苗
引言
本发明尤其涉及药物组合物，其包含至少一种编码来自冠状病毒(Coronavirus)，优选大流行冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的核酸，以及至少一种编码来自其它病毒例如流感病毒或RSV病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的核酸。本文提供的药物组合物适用于治疗或预防至少一种冠状病毒的感染和至少一种其它病毒感染，因此可包含在组合疫苗中。药物组合物和组合疫苗的核酸序列优选与聚合物载剂(carrier)、聚阳离子蛋白质或肽或者脂质纳米颗粒(LNP)缔合。本发明还涉及药物组合物和组合疫苗的第一和第二以及其它的医药用途，并且涉及治疗或预防冠状病毒感染和其它病毒感染的方法。
冠状病毒是冠状病毒科(Coronaviridae)具有高度传染性、有包膜、阳性的单链RNA病毒。冠状病毒(CoV)在遗传上具有高度可变性，并且个体病毒物种也可通过克服物种屏障来感染数个宿主物种。这种转移导致人类感染SARS相关冠状病毒(SARS-CoV-1)、感染中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及感染SARS-CoV-2(引起COVID-19病)。
SARS-CoV-1会导致严重急性呼吸综合症(SARS)，2002年至2003年间在37个国家感染了8422人并导致916人死亡。MERS-CoV于2012年首次在中东被发现。一份报告证实，截至2016年7月，27个国家有1791例MERS-CoV感染病例，包括至少有640例死亡。
冠状病毒大流行病——(最有可能)于2019/2020之交开始——归因于一种以前未知的冠状病毒(SARS-CoV-2)，它会导致严重呼吸疾病(COVID-19)。到2020年5月底，已确诊SARS-CoV-2感染病例近6,000,000例，几乎遍布世界每个国家，COVID-19相关死亡人数超过350,000。
这些当前的冠状病毒爆发表明了冠状病毒可能引起的严重的全球大流行病的巨大风险。提供一种针对(大流行)冠状病毒提供保护的疫苗对全球健康至关重要。为防止此类冠状病毒爆发的再次发生，提供一种保护冠状病毒感染和至少一种其它病毒感染，优选也会引起呼吸疾病的病毒感染的组合疫苗(或多病原体疫苗)也将是有利。此外，由于老年人群受此类病毒的影响强烈，因此提供一种对老年人群有效的组合疫苗将是有利的。
这种适合的其它病毒的示例是流感病毒。流感病毒是有包膜的RNA病毒。该科的三个属，甲型、乙型和丙型流感病毒，可引起人类流感。它们在宿主范围、表面糖蛋白的可变性、基因组组织和形态方面有所不同。根据病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)将甲型和乙型流感病毒进一步分类。通常，在流感季节会同时传播两到三种不同的流感病毒株。典型的流感大流行病导致肺炎和下呼吸道疾病的发病率升高，之后是升高的住院率或死亡率。老年人或有基础慢性疾病的人最有可能经历此类并发症，但年幼的婴儿也可能患上严重的疾病。据估计，全球每年发生超过10亿流感病例，导致300至500万例重症病例和30至50万例死亡。此外，对于在短短几天或几周内克服轻度病例的人来说，生产力和生活质量也都会受到很大损失。
除了冠状病毒和流感病毒外，肺病毒科(Pneumoviridae)的病毒也会引起严重的呼吸疾病。肺病毒科的成员包括例如呼吸道合胞病毒(RSV)和偏肺病毒(hMPV)。RSV是儿童在其一岁之前毛细支气管炎和肺炎的最常见病因。RSV还会导致反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，这可能发生在任何年龄，尤其是老年人或心脏、肺或免疫系统受损的人。hPMV是幼儿病毒性下呼吸道疾病的重要病因。hMPV的季节性流行病学看似与RSV相似，但感染和患病的发生率似乎要低得多。然而，hMPV在老年人中几乎与流感一样常见和严重。hMPV与哮喘患者和成人慢性阻塞性肺病(COPD)患者的更严重的疾病有关。据报道，在儿童和成人的长期护理机构中爆发了多起hMPV，导致死亡。
除了冠状病毒、流感病毒和肺病毒科之外，副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒也可引起严重的呼吸疾病。副粘病毒科的成员包括副流感病毒(PIV)和亨尼帕病毒(Henipavirus virus)。
副流感病毒，例如PIV 3型(PIV3)是婴幼儿期普遍存在的急性呼吸感染的主要原因。它的发病高峰在4-12月龄左右，并且3-10％的住院病例都是由该病毒引起的，主要是毛细支气管炎和肺炎。PIV3可能是致命的，并且在某些情况下与神经疾病如热性惊厥有关。它还可能导致气道重塑——一种重要的发病原因。在世界发展中地区，无论是原发性PIV3病毒感染还是诸如细菌感染之类的继发性后果，婴幼儿的死亡风险都是最高的。
亨尼帕病毒，包括亨德拉(Hendra)病毒和尼帕(Nipah)病毒，是最近出现的潜在大流行病的源头。亨德拉病毒于1994年在澳大利亚昆士兰州亨德拉的20匹马和两个人中爆发呼吸疾病后首次被发现。1995年，确定了1994年8月在昆士兰州麦凯发生的第二次不相关的爆发，其中两匹马死亡，一人死亡。据报道，马的死亡率超过70％，而人的死亡率为50％。尼帕病毒最初是在1999年对马来西亚和新加坡成年男性脑炎和呼吸疾病爆发的样品进行检查时分离出来的。尼帕病毒的宿主目前还不清楚，但疑似狐狸是自然宿主。人类感染尼帕病毒与以发烧和嗜睡为特征的脑炎以及更严重的中枢神经系统疾病如昏迷、癫痫发作和无法维持呼吸有关。一些患者在其感染早期就患有呼吸疾病。在1998-1999年的尼帕病毒病爆发期间，进入医院的约40％患有严重神经疾病的患者死亡。
如上概述，本发明目的是提供基于核酸的组合疫苗，其提供针对至少一种冠状病毒，具体地针对至少一种大流行冠状病毒，并且另外地针对至少一种例如选自至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒的其它病毒的有效保护。
开发组合疫苗是一项巨大的挑战，因为这种疫苗的不同组分常常是彼此不相容的。此外，不同的疫苗组分可能需要不同的接种间隔才能有效，这阻碍了组合疫苗的开发。除此之外，重要的是组合疫苗的所有组分都会诱导有效的免疫应答并且单一组分不具有免疫优势，或者这些组分不显示出免疫干扰。具体地，需要疫苗来保护老年人群，发现在老年人群中SARS-CoV-2病例的死亡率很高。
基于核酸的接种，包括DNA或RNA，代表了一项有前景的技术——用于针对新兴病毒的新型疫苗并且提供组合疫苗。可对核酸进行基因工程改造并施用于人类对象。转染的细胞直接产生编码抗原(例如由DNA或RNA，具体是mRNA提供)，这样会产生保护性免疫应答。
已经阐明了病毒特异性记忆T细胞在针对SARS-CoV感染的广泛且长期的保护中的关键作用(参见例如Channappanavar,Rudragouda,et al.“Virus-specific memory CD8 Tcells provide substantial protection from lethal severe acute respiratorysyndrome coronavirus infection.”Journal of virology 88.19(2014):11034-11044)。病毒特异性CD8 T细胞是例如病原体清除以及病毒攻击后介导保护所需要的。因此，一种有效的组合疫苗，例如包括SARS-CoV-2疫苗在内，不仅应诱导针对相应病原体的强烈功能性体液免疫应答，还应诱导病原体特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞应答，例如SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞应答。
因此，本发明目的是提供基于核酸的组合疫苗或多病原体疫苗，其提供针对冠状病毒感染的保护和针对至少一种其它病毒的保护。
定义
为了清楚和可读，提供以下定义。可以在本发明的每个实施方式上读到以这些定义提及的任何技术特征。可在这些实施方式的上下文中具体提供另外的定义和解释。
数字上下文中的百分比应理解为相对于相应项目的总数。在其它情况下，且除非该上下文另有规定，否则百分比应理解为重量百分比(wt.-％)。
约：当决定因素或值不一定需要相等，即100％相同时，使用术语“约”。因此，“约”是指决定因素或值可以偏差0.1％至20％，优选地0.1％至10％；具体地0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。本领域技术人员将知道，例如根据如何确定参数的方法，某些参数或值可能略有改变。例如，如果某个决定因素或值在本文中被限定为具有例如“约1000个核苷酸”的长度，则该长度可以偏差0.1％至20％，优选地0.1％至10％；具体地0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。因此，本领域技术人员将知道，在该具体示例中，该长度可以偏差1到200个核苷酸，优选地1到100个核苷酸；具体地5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个核苷酸。
适应性免疫应答：如本文所用的术语“适应性免疫应答”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指免疫系统(适应性免疫系统)的抗原特异性应答。抗原特异性允许产生专门(tailored)针对特定病原体或病原体感染细胞的应答。发起(支持，mount)这些专门的应答的能力通常由“记忆细胞”(B细胞)在体内维持。在本发明的上下文中，抗原由编码至少一种衍生自冠状病毒(组分A)或其它病毒(组分B)的抗原性肽或蛋白质的核酸(例如RNA或DNA)提供。
抗原：如本文所用的术语“抗原”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指可以被免疫系统，优选被适应性免疫系统识别并能够例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分触发抗原特异性免疫应答的物质。通常，抗原可以是或可以包含可由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白质。在本发明的上下文中，肽或蛋白质的包含至少一个表位的片段、变体和衍生物也可以理解为抗原。在本发明的上下文中，抗原可以是如本文指定的所提供的核酸的翻译产物。
抗原性肽或蛋白质：术语“抗原性肽或蛋白质”或“免疫原性肽或蛋白质”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指衍生自(抗原性或免疫原性)蛋白质的肽或蛋白质，其刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。因此，抗原性/免疫原性肽或蛋白质包含衍生出其的蛋白质(例如，冠状病毒(优选来自SARS-CoV-2)的刺突蛋白(S)、流感病毒的HA、RSV病毒的F蛋白等)的至少一个表位(如本文定义)或抗原(如本文定义)。
阳离子的：除非从具体的上下文中明确不同的含义，否则术语“阳离子的”是指相应的结构带有正电荷，无论是永久的还是非永久的，但响应于某些条件如pH。因此，术语“阳离子的”涵盖“永久阳离子的”和“可阳离子化的”。
可阳离子化的(cationisable)：如本文所用的术语“可阳离子化的”是指化合物或基团或原子在其环境的较低pH下带正电荷而在其环境的较高pH下不带电荷。同样在无法确定pH值的非水性环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在氢离子浓度高时带正电荷，而在氢离子浓度或活性低时不带电荷。它取决于在其带电荷或不带电荷的pH或氢离子浓度下，可阳离子化或可聚阳离子化的化合物的个体性质，具体是各个可阳离子化的基团或原子的pKa。在稀释的水性环境中，可以使用本领域技术人员熟知的所谓的Henderson-Hasselbalch方程来估计带有正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的分数。例如，在一些实施方式中，如果化合物或部分是可阳离子化的，则优选其在约1至9、优选4至9、5至8或甚至6至8的pH值下带正电荷，更优选pH值为或低于9、为或低于8、为或低于7，最优选在生理pH值下，例如约7.3至7.4，即在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下。在其它实施方式中，优选可阳离子化的化合物或部分在生理pH值(例如约7.0-7.4)下主要是中性的，但在较低的pH值时带正电荷。在一些实施方式中，可阳离子化的化合物或部分的pKa的优选范围为约5至约7。
编码序列/编码区：如本文所用的术语“编码序列”或“编码区”和对应的缩写“cds”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指可被翻译成肽或蛋白质的数个核苷酸三联体的序列。本发明上下文中的编码序列可以是DNA序列，优选RNA序列，由可被三除的多个核苷酸组成，这些核苷酸以起始密码子开始并且优选以终止密码子终止。
衍生自：如在整个本说明书中核酸的上下文中使用的术语“衍生自”，即核酸“衍生自”(另一种)核酸，是指衍生自(另一种)核酸的核酸与衍生出其的核酸共享例如至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。本领域技术人员知道，序列同一性通常是针对相同类型的核酸计算的，即针对DNA序列或针对RNA序列。因此，应当理解，如果DNA“衍生自”RNA或如果RNA“衍生自”DNA，则在第一步中将RNA序列转化为对应的DNA序列(具体是通过在整个序列中将尿嘧啶(U)替换为胸腺嘧啶(T))，反之亦然，将DNA序列转化为对应的RNA序列(具体是通过在整个序列中将T替换为U)。此后，确定DNA序列的序列同一性或RNA序列的序列同一性。优选地，“衍生自”一个核酸的核酸还指与衍生出其的核酸相比被修饰——例如为了进一步提高RNA稳定性和/或延长和/或增加蛋白质产量——的核酸。在氨基酸序列(例如抗原性肽或蛋白质)的上下文中，术语“衍生自”是指衍生自(另一个)氨基酸序列的氨基酸序列与衍生出其的氨基酸序列共享例如至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
表位：如本文所用的术语“表位”(在本领域中也称为“抗原决定簇”)将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指T细胞表位和B细胞表位。抗原性肽或蛋白质的T细胞表位或部分可包含优选长度为约6至约20个或甚至更多个氨基酸的片段，例如，由MHC I类分子加工和呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸的长度，例如8、9或10(或甚至11或12个氨基酸)，或由MHC II类分子加工和呈递的片段，优选具有约13至约20个或甚至更多个氨基酸的长度。这些片段通常由T细胞以由肽片段和MHC表面分子组成的复合物的形式识别，即片段通常不以其天然形式识别。B细胞表位通常是位于(天然)蛋白质或肽抗原外表面上的片段，优选具有5至15个氨基酸，更优选具有5至12个氨基酸，甚至更优选具有6至9个氨基酸，它可以被抗体识别，即以其天然形式识别。此外，蛋白质或肽的这种表位可选自本文提到的这种蛋白质或肽的变体中的任一种。在这种上下文中，表位可以是构象表位或不连续表位，其由如本文定义的蛋白质或肽的片段组成，这些蛋白质或肽的片段在如本文所述的蛋白质或多肽的氨基酸序列中是不连续的但却以三维结构聚集在一起，或者是由单条多肽链组成的连续表位或线性表位。
片段：如在整个本说明书中核酸序列(例如RNA或DNA)或氨基酸序列的上下文中使用的术语“片段”通常可以是例如核酸序列或氨基酸序列的全长序列的较短部分。因此，片段通常由与全长序列内的对应的一段序列(stretch)同一的序列组成。在本发明的上下文中，序列的优选片段由实体的连续的一段序列组成，如与衍生出该片段的分子中实体的连续的一段序列对应的核苷酸或氨基酸，其占衍生出该片段的总(即全长)分子(例如冠状病毒的刺突蛋白(S)、流感病毒的HA/NA等)的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。如在整个本说明书中蛋白质或肽的上下文中使用的术语“片段”通常可包含如本文所限定的蛋白质或肽的序列，该蛋白质或肽的序列关于其氨基酸序列，与原始蛋白质的氨基酸序列相比是N端和/或C端截短的。因此，这种截短可以在氨基酸水平上或相应地在核酸水平上发生。因此，与如本文所限定的此类片段相关的序列同一性可优选地指代如本文所限定的完整蛋白质或肽或指代此类蛋白质或肽的完整(编码)核酸分子。蛋白质或肽的片段可包含这些蛋白质或肽的至少一个表位。
异源的：在整个本说明书中核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“异源的”或“异源序列”是指这样的序列(例如DNA、RNA、氨基酸)：必须理解成衍生自另一个基因、另一个等位基因或例如另一个物种或病毒的序列。如果两个序列不是衍生自相同基因或相同等位基因，则它们通常被理解成是“异源的”。即，尽管异源序列在自然界中可能衍生自相同的生物体或病毒，但它们不会出现在相同的核酸或蛋白质中。
体液免疫应答：术语“体液免疫”或“体液免疫应答”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指B细胞介导的抗体产生以及任选地指伴随抗体产生的辅助过程。体液免疫应答的特征通常可在于例如Th2激活和细胞因子产生、生殖中心形成和同种异型转换、亲和力成熟和记忆细胞生成。体液免疫还可以指抗体的效应物功能，其包括病原体和毒素中和作用、经典补体激活和吞噬作用及病原体消除的调理促进。
(序列的)同一性：如在整个本说明书中核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“同一性”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指两个序列同一的百分比。为了确定两个序列——例如，如本文所限定的核酸序列或氨基酸(aa)序列，优选由如本文所限定的核酸序列编码的aa序列或aa序列本身——同一的百分比，可以比对该序列以便随后相互比较。因此，例如可以将第一序列的位置与第二序列的对应位置进行比较。如果第一个序列中的某个位置被与第二个序列中的某个位置的相同的残基占据，则这两个序列在该位置上是同一的。如果不是这种情况，则该位置的序列不同。如果与第一个序列相比，在第二个序列中发生了插入，则可以在第一个序列中插入空位以允许进一步比对。如果与第一个序列相比，在第二个序列中出现缺失，则可以在第二个序列中插入空位以允许进一步比对。然后，两个序列同一的百分比是相同位置的数量除以包括在一个序列中仅被占据的那些位置在内的位置的总数的函数。可以使用算法例如整合在BLAST程序中的算法来确定两个序列同一的百分比。
免疫原、免疫原性：术语“免疫原”或“免疫原性”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指能够刺激/诱导免疫应答的化合物。优选地，免疫原是肽、多肽或蛋白质。本发明意义上的免疫原是所提供的核酸(组分A和B)的翻译产物，其包含如本文定义的至少一个编码序列，该编码序列编码至少一种衍生自例如冠状病毒刺突蛋白(S)(优选衍生自SARS-CoV-2)的抗原性肽、蛋白质。通常，免疫原会引发适应性免疫应答。
免疫应答：术语“免疫应答”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指针对特定抗原的适应性免疫系统的特异性反应(所谓特异性或适应性免疫应答)或先天免疫系统的非特异性反应(所谓非特异性或先天免疫应答)，或其组合。
免疫系统：术语“免疫系统”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指可保护生物体免受感染的该生物体的系统。如果病原体成功通过生物体的物理屏障并进入该生物体，则先天免疫系统提供立即但非特异性的应答。如果病原体避开了该先天应答，则脊椎动物拥有第二层保护——适应性免疫系统。这里，免疫系统在感染过程中适应其应答以改善其对病原体的识别。病原体被消除之后，此种改善的应答随后以免疫记忆的形式保留，并且允许适应性免疫系统每次遭遇该病原体时发起更快速和更强烈的攻击。据此，免疫系统包括先天和适应性免疫系统。这两个部分中的每一个通常含有所谓的体液组分和细胞组分。
先天免疫系统：术语“先天免疫系统”(也称为非特异性或无特异性免疫系统)将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指通常包含以非特异性方式保护宿主免受其它生物体感染的细胞和机制的系统。这意味着先天系统的细胞可以以一般的方式识别和响应于病原体，但不像适应性免疫系统，它不赋予宿主持久或保护性免疫。先天免疫系统可以被例如Toll样受体、NOD样受体或RIG-1样受体等模式识别受体的配体激活。
类脂化合物：类脂化合物——也简称类脂——是一种脂质样化合物，即具有脂质样物理性质的两亲性化合物。在本发明的上下文中，术语脂质被认为包括类脂质化合物。
核酸、核酸分子：如本文中使用的，具体在组分A和组分B的上下文中使用的术语“核酸”或“核酸分子”将被本领域普通技术人员认识和理解。术语“核酸”或“核酸分子”优选是指DNA(分子)或RNA(分子)。该术语与术语多核苷酸同义使用。优选地，核酸或核酸分子是多聚体，包含通过糖/磷酸酯骨架的磷酸二酯键彼此共价连接的核苷酸单体或由通过糖/磷酸酯骨架的磷酸二酯键彼此共价连接的核苷酸单体组成。术语“核酸”或“核酸分子”还包括修饰的核酸(分子)，诸如本文定义的碱基修饰的、糖修饰的或骨架修饰的DNA或RNA(分子)。相应地，组分A和组分B的核酸可以是DNA或RNA。
核酸序列、DNA序列、RNA序列：术语“核酸序列”、“DNA序列”、“RNA序列”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指特定且独立次序的其核苷酸的顺序性(succession)。
多价疫苗或组合疫苗：这两个术语在本文中必须可互换地理解。本发明的多价疫苗或组合疫苗提供衍生自多于一种的病毒(例如本文定义的至少一种冠状病毒和本文定义的至少一种其它的病毒)的大于一的价(例如抗原)。基于核酸的组合疫苗也可被认为是“多病原体疫苗”。
永久阳离子的：如本文所用的术语“永久阳离子的”将会被本领域普通技术人员认识和理解，并且意指例如相应的化合物或基团或原子在其环境的任何pH值或氢离子活性下都带正电荷。通常，正电荷是由季氮原子的存在引起的。当化合物携带多个这样的正电荷时，它可被称为是永久聚阳离子的。
稳定化RNA：术语“稳定化RNA”是指经修饰的RNA，修饰使得与不进行这样修饰的RNA相比，它对例如环境因素或酶促消化——诸如外切核酸酶或内切核酸酶降解——的分解或降解更具稳定性。优选地，本发明上下文中的稳定化RNA在细胞如原核细胞或真核细胞中，优选在哺乳动物细胞如人细胞中是稳定化的。稳定化作用也可在细胞外发挥，例如在例如用于储存包含稳定化RNA的组合物的缓冲溶液等中发挥。
T细胞应答：如本文所用的术语“细胞免疫”或“细胞免疫应答”或“细胞性T细胞应答”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活，以及响应于抗原释放各种细胞因子。更一般地说，细胞免疫不是基于抗体的，而是基于免疫系统的细胞的激活。通常，细胞免疫应答的特征可例如在于激活能够在细胞中诱导凋亡的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，例如特特异性免疫细胞如树突细胞或其它细胞，在其表面展示外来抗原的表位。
(序列的)变体：如在整个本说明书中核酸序列的上下文中使用的术语“变体”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指衍生自另一核酸序列的核酸序列的变体。例如，与衍生出变体的核酸序列相比，核酸序列的变体可以表现出一个或多个核苷酸缺失、插入、添加和/或取代。核酸序列的变体可与衍生出该变体的核酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％同一性。变体是功能变体，因为变体保留了衍生出其的序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多的功能。核酸序列的“变体”在这样的核酸序列的至少10、20、30、50、75或100个核苷酸的一段片段内可具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％核苷酸同一性。
如在整个本说明书中蛋白质或肽的上下文中使用的术语“变体”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指这样的蛋白质或肽变体：其氨基酸序列与原始序列的区别在于一个或多个突变/取代，如一个或多个取代的、插入的和/或缺失的氨基酸。优选地，这些片段和/或变体具有相同的或相当的特异性抗原性特性(免疫原性变体、抗原性变体)。插入和取代是可能的——具体是在不引起对三维结构的修饰或不改变结合区域的那些序列位置处。可例如使用CD光谱(圆二色谱)容易地确定插入(一个或多个)或缺失(一个或多个)对三维结构的修饰。蛋白质或肽的“变体”可以在这样的蛋白质或肽的至少10、20、30、50、75或100个氨基酸的一段片段内具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸同一性。优选地，蛋白质的变体包括蛋白质的功能变体，这意味着在本发明的上下文中变体发挥与衍生出其的蛋白质基本上相同的免疫原性，或至少40％、50％、60％、70％、80％、90％的免疫原性。
发明内容
如在权利要求和下面的描述中进一步定义的，本发明的这些目的尤其通过提供药物组合物来解决，所述药物组合物包含下列或由下列组成：核酸，例如RNA或DNA，其包含编码至少一种来自冠状病毒的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列(“组分A”)；和核酸，例如RNA或DNA，其包含编码至少一种来自至少一种其它病毒的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列(“组分B”)。
适合地，本发明的药物组合物或组合疫苗具有以下有利特征中的至少一些：
·组分A和组分B的核酸在注射/接种部位(例如肌肉)翻译；
·诱导针对所有经编码的蛋白质(由组分A和组分B提供)的抗原特异性免疫应答，适合以非常低的剂量和给药方案；
·适合婴儿和/或新生儿或老年人，尤其是老年人接种；
·组合物/疫苗适合肌内施用；
·诱导针对冠状病毒，优选SARS-CoV-2(组分A)并且针对至少一种其它病毒(组分B)的特异性和功能性体液免疫应答；
·诱导针对冠状病毒，优选SARS-CoV-2(组分A)并且针对至少一种其它病毒(组分B)的广泛的功能性细胞T细胞应答；
·诱导针对冠状病毒，优选SARS-CoV-2(组分A)和至少一种其它病毒(组分B)的特异性B细胞记忆；
·诱导可有效中和冠状病毒，例如SARS-CoV-2，以及至少一种其它病毒的功能性抗体；
·诱导可有效中和冠状病毒例如SARS-CoV-2的新兴变体的功能性抗体；
·通过诱导粘膜IgA抗体来引发粘膜IgA免疫；
·诱导良好均衡的B细胞和T细胞应答；
·诱导针对冠状病毒感染例如针对SARS-CoV-2或其新兴变体的保护性免疫；
·快速发起(onset)针对冠状病毒，优选SARS-CoV-2(组分A)和至少一种其它病毒(组分B)的免疫保护；
·针对冠状病毒，优选SARS-CoV-2(组分A)和至少一种其它病毒(组分B)所诱导的免疫应答长久；
·不因接种或免疫病理学作用而增强病毒感染(例如SARS-CoV-2感染)；
·基于核酸的组合疫苗不会引起抗体依赖性增强(ADE)；
·施加疫苗后不会过度诱导全身性细胞因子或趋化因子应答——这可能会导致接种后出现所不期望的高反应原性；
·组合疫苗耐受性良好，无副作用，无毒性；
·基于核酸的组合疫苗的有利的稳定特性；
·组合疫苗生产的速度、适应性、简易性和可扩展性；
·只需接种一次或两次即可实现足够保护的有利的接种方案；
·只需要低剂量的组合物/疫苗即可实现足够保护的有利的接种方案。
本发明基于发明人的惊人发现，即药物组合物，其包含至少一种编码来自冠状病毒的至少一种肽或蛋白质的核酸(“组分A”)和至少一种编码来自其它病毒的至少一种肽或蛋白质的核酸(“组分B”)，能够在人类细胞中有效地共表达。更令人惊讶和出乎意料的是，施用包含所述组分的此类药物组合物会诱导针对经编码的冠状病毒抗原和针对至少一种其它病毒抗原的抗原特异性免疫应答。这些发现是本发明基于核酸的组合疫苗的基础，该组合疫苗提供针对至少一种冠状病毒，例如大流行冠状病毒，以及至少一种其它病毒，例如流感病毒和/或RSV病毒的保护(参见实施例部分)。
在第一方面，本发明提供了药物组合物，其包含下列或由下列组成：至少一种组分A，其包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体；和至少一种组分B，其包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
组分A的至少一种冠状病毒可适合地衍生自或选自大流行冠状病毒，例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV。组分B的至少一种其它病毒可适合地衍生自或选自至少一种其它病毒，例如至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒(例如呼吸道合胞病毒和/或至少一种偏肺病毒)和/或至少一种副粘病毒科病毒(例如副流感病毒和/或至少一种亨尼帕病毒)。
在第二方面，本发明提供了组合疫苗，其中所述组合疫苗包含如第一方面所定义的药物组合物(包括组分A和组分B)。因此，第二方面涉及多病原体疫苗。
在第三方面，本发明提供了试剂盒或多部分试剂盒(kits of parts)，其包含至少一种第一方面的药物组合物(包括组分A和组分B)和/或至少一种第二方面的组合疫苗。
本发明的其它方面涉及治疗或预防对象中多种病毒感染的方法，以及药物组合物、组合疫苗或试剂盒的第一和第二医药用途。还提供了制造药物组合物或组合疫苗的方法。
具体实施方式
本申请与电子格式的序列表一起提交，该序列表是说明书的一部分(WIPO标准ST.25)。序列表中包含的信息通过引用以其整体并入本文。在本文提及“SEQ ID NO”时，指的是序列表中具有相应标识符的对应核酸序列或氨基酸(aa)序列。对于许多序列而言，序列表还提供了另外的详细信息，例如关于某些结构特征、序列优化、GenBank(NCBI)或GISAID(epi)标识符，或有关其编码能力的另外的详细信息。具体地，此类信息在WIPO标准ST.25序列表中的数字标识符<223>下提供。因此，在所述数字标识符<223>下提供的信息全部明确地包括在本文中，并且必须被理解为是对基础(潜在，underlying)发明的描述的组成部分。当提及其它公开的专利申请或专利的“SEQ ID NO”时，所述序列，例如氨基酸序列或核酸序列通过引用明确并入本文。因此，这些序列构成了基础描述的组成部分。对于通过引用包含的“SEQ ID NO”而言，在(相应序列协议的)数字标识符<223>下提供的信息也明确以其整体包含在本文中，并且必须被理解为是对基础发明的描述的组成部分。因此，WO2014160463、WO2015024668、WO2017070626、WO2017070622、WO2017172890、WO2018081318、WO2018115527、WO2018170245、WO2018078053、WO2018115507、WO2019092153、WO2019202035中提供的“SEQ ID NO”通过引用并入本文本文，并因此是说明书的一部分。
药物组合物：
在第一方面，本发明涉及适用于组合疫苗或多病原体疫苗的药物组合物。
必须注意，在本发明的第一方面即本发明的药物组合物的上下文中描述的具体特征和实施方式同样适用于第二方面(本发明的组合疫苗)、第三方面(本发明的试剂盒或多部分试剂盒)或其它方面——包括例如医药用途(第一和第二医药用途)以及例如治疗方法。
在优选的实施方式中，第一方面的药物组合物包含下列或由下列组成：
-至少一种组分A，其包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体；和
-至少一种组分B，其包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
根据本发明的核酸，例如DNA或RNA，构成基于核酸的药物组合物或基于核酸的疫苗的基础。
本文提供的此类基于核酸的药物组合物(第一方面)或基于核酸的疫苗(第二方面)与经典疫苗方法相比具有优势：一般而言，基于蛋白质的疫苗或减毒活疫苗对于在发展中国家使用而言是次佳的，因为它们的生产成本高。此外，基于蛋白质的疫苗或减毒活疫苗需要较长的开发时间，不适合对大流行病毒爆发如2019/2020年冠状病毒SARS-CoV-2爆发作出迅速反应。此外，使用经典方法提供针对冠状病毒和其它病毒有效的组合疫苗仍然存在挑战(例如，有关单独组分相容性的问题)。
相比之下，根据本发明的基于核酸的药物组合物和疫苗实现了非常快速且具有成本效益的制造。因此，与已知疫苗相比，基于本发明核酸的疫苗能够更便宜且更快地生产和制造，这对于在发展中国家或全球大流行的上下文中使用特别有利。
基于组分A和组分B的核酸的药物组合物或疫苗的另一优点是，与基于蛋白质或肽的疫苗相比，这些组分是温度稳定的。此外，发明人发现，编码选自或衍生自冠状病毒的抗原的相应核酸序列可与例如编码选自或衍生自其它病毒(例如不同的冠状病毒、流感病毒、RSV病毒、PIV、hMPV、亨德拉、尼帕)的抗原的核酸序列组合，而不妨碍单独组分的功效(例如诱导细胞免疫应答和体液免疫应答)(参见实施例部分)。
组分A：
在各种优选的实施方式中，药物组合物的所述至少一种组分A包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
冠状病毒可分为α冠状病毒(甲型冠状病毒，Alphacoronavirus)属、β冠状病毒(乙型冠状病毒，Betacoronavirus)属、δ冠状病毒(德尔塔冠状病毒，Deltacoronavirus)属、γ冠状病毒(丙型冠状病毒，Gammacoronavirus)属和未分类的冠状病毒。冠状病毒在遗传上具有高度可变性，并且个体病毒物种也可通过克服物种屏障来感染数个宿主物种，从而有可能成为大流行病。
在优选的实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒选自或衍生自至少一种大流行冠状病毒。
在各种实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒，或组分A的至少一种大流行冠状病毒选自至少一种α冠状病毒、至少一种β冠状病毒、至少一种γ冠状病毒和/或至少一种δ冠状病毒，优选大流行α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒、δ冠状病毒。
在各种实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒，或组分A的至少一种大流行冠状病毒是β冠状病毒。适合地，β冠状病毒选自至少一种Sarbecovirus、至少一种Merbecovirus、至少一种Embecovirus、至少一种Nobecovirus和/或至少一种Hibecovirus。
在优选的实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒，或组分A的至少一种大流行冠状病毒是β冠状病毒，优选Sarbecovirus。在本发明的上下文中，优选的Sarbecovirus可选自SARS相关冠状病毒。优选的SARS相关冠状病毒可选自SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2。
在优选的实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒，或组分A的至少一种大流行冠状病毒是β冠状病毒，优选Merbecovirus。在本发明的上下文中，优选的Merbecovirus可选自MERS相关冠状病毒。优选的MERS相关冠状病毒可选自MERS-CoV。
术语“冠状病毒的抗原性肽或蛋白质”涉及选自或衍生自如本文定义的相应冠状病毒的任何肽或蛋白质，还涉及其片段、变体或衍生物，优选涉及其免疫原性片段或免疫原性变体。
术语“免疫原性片段”或“免疫原性变体”必须理解为能够在对象中引起免疫应答的对应冠状病毒抗原的任何片段/变体。
在本发明的上下文中，选自或衍生自冠状病毒，优选大流行冠状病毒的任何蛋白质都可用在本发明的上下文中并且可由组分A的编码序列或核酸适合地编码。在基础发明的范围内，所述至少一种抗原性肽或蛋白质可包括合成上改造的或人工冠状病毒肽或蛋白质，或由其组成。术语“合成上改造的”冠状病毒肽或蛋白质，或术语“人工冠状病毒肽或蛋白质”涉及在自然界中不存在的蛋白质。因此，与天然存在的冠状病毒肽或蛋白质相比，“人工冠状病毒肽或蛋白质”或“合成上改造的冠状病毒肽或蛋白质”可例如在至少一个氨基酸上不同，和/或可包含另外的肽或蛋白质元件(例如异源元件)，和/或可以是N端或C端延伸或截短的。
在优选的实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自冠状病毒，优选大流行冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括至少一种肽或蛋白质，其选自或衍生自结构蛋白、辅助蛋白或复制酶蛋白或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，结构蛋白选自或衍生自冠状病毒刺突蛋白(S)、冠状病毒包膜蛋白(E)、冠状病毒膜蛋白(M)或冠状病毒核衣壳蛋白(N)，或这些中任意者的免疫原性片段或变体。
在特别优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自冠状病毒刺突蛋白(S、S1、S2或S1和S2)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
如本文所用的术语刺突蛋白(S)是指冠状病毒蛋白质。刺突蛋白(S)是典型的I型病毒性融合蛋白，其在病毒表面作为三聚体存在，其中每个单体由头部(S1)和茎部(S2)组成。单个前体S多肽形成同源三聚体并在高尔基体内经历糖基化以及进行加工以去除信号肽，并被细胞蛋白酶切割以产生单独的S1和S2多肽链，它们在同源三聚体内仍作为S1/S2原聚体而缔合，因此是异源二聚体的三聚体。刺突糖蛋白的S1结构域包括：受体结合结构域(RBD)，其(最有可能)与血管紧张素转化酶2受体结合并介导病毒融合到宿主细胞中；N端结构域，其可初始接触靶细胞；以及两个子结构域，所有这些都对中和抗体敏感。S2结构域由参与与宿主内体膜膜融合的六螺旋束融合核心(six helix bundle fusion core)组成，并且也是中和的靶标。S2亚单位还包括两个七肽重复序列(heptad-repeat sequences)(HR1和HR2)和融合糖蛋白一贯的中央螺旋、跨膜结构域和胞质尾结构域。
在优选的实施方式中，刺突蛋白(S)的片段由组分A的核酸编码，其中所述片段可以是N端截短的，缺少例如全长冠状病毒S蛋白的N端氨基酸1到最多100。在实施方式中，刺突蛋白(S)的片段可由组分A的核酸编码，其中所述片段可以是C端截短的，缺少例如全长冠状病毒S蛋白的C端氨基酸1到最多200。这种“刺突蛋白(S)的片段”可包含氨基酸取代，以及任选地，至少一种异源肽或蛋白质元件(如下文关于具体冠状病毒描述的)。在优选的实施方式中，冠状病毒刺突蛋白(S)的片段可以是C端截短的，从而缺少C端跨膜结构域。
在优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括冠状病毒刺突蛋白(S)或由其组成，其中刺突蛋白(S)缺少跨膜结构域(TM或TMflex)。不希望受理论的束缚，如本文定义的缺少跨膜结构域(TM或TMflex)的冠状病毒刺突蛋白(S)可适用于疫苗，因为这样的蛋白质将是可溶的并且不锚定在细胞膜中。因此，可溶性蛋白质在施用于对象或细胞后可以以更高浓度产生(即翻译)，从而导致改善的免疫应答。
不希望受理论的束缚，RBD结构域和CND结构域对冠状病毒刺突蛋白(S)的免疫原性可以说是至关重要的。这两个区域都位于冠状病毒刺突蛋白的S1片段。因此，在本发明的上下文中可能适合的是，抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：冠状病毒的刺突蛋白的S1片段，或其免疫原性片段或免疫原性变体。适合地，这样的S1片段可至少包括如上定义的RBD结构域和/或CND结构域。
在特别优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括冠状病毒刺突蛋白(S)或由其组成，其中刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，所述经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括冠状病毒刺突蛋白片段S1，并且缺少至少70％、80％、90％、优选100％的刺突蛋白片段S2。这样的实施方式可以是有益的，因为S1片段包含中和表位而不存在包含S1和S2的全长蛋白的潜在问题。
不希望受理论的束缚，组分A的抗原性肽或蛋白质包括冠状病毒刺突蛋白片段S1和冠状病毒刺突蛋白片段S2(的至少一个片段)或由其组成可以是适合的，因为可以促进免疫原性冠状病毒刺突蛋白的形成。
因此，在特别优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括冠状病毒刺突蛋白(S)或由其组成，其中冠状病毒刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：冠状病毒刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体；和冠状病毒刺突蛋白片段S2，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：全长冠状病毒刺突蛋白，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。术语“全长冠状病毒刺突蛋白”必须被理解成冠状病毒刺突蛋白，优选衍生自大流行冠状病毒，具有对应于基本上全长刺突蛋白的氨基酸序列。
在特别优选的实施方式中，由组分A的核酸提供的冠状病毒刺突蛋白(S)被设计或改编以使S抗原稳定在融合前构象(pre-fusion conformation)中。融合前构象在有效疫苗的上下文中特别有利，因为中和抗体的几个潜在表位可能仅在所述融合前蛋白质构象下才可接近。此外，使S蛋白保持在融合前构象下旨在避免免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
因此，在优选的实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，其编码选自或衍生自冠状病毒，优选大流行冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质选自或衍生自刺突蛋白(S)，其中刺突蛋白(S)是融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)。适合地，所述融合前稳定化刺突蛋白包含至少一个融合前稳定化突变。
本文所用的术语“融合前构象”涉及冠状病毒S蛋白的胞外域在于分泌系统中加工成成熟的冠状病毒S蛋白后，且在触发导致冠状病毒S转变成融合后构象的融合事件之前所采用的结构构象。
与天然冠状病毒S序列相比，本文所述的“融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)”包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，相比于由对应的天然冠状病毒S序列形成的冠状病毒S胞外域三聚体，这提供了增加的融合前构象的保持。所述一个或多个氨基酸取代、缺失或插入使融合前构象“稳定化”可以是例如能量稳定化(例如，相对于融合后的开放构象，降低了融合前构象的能量)和/或动力学稳定化(例如，降低了从融合前构象向融合后构象的转变速率)。此外，与对应的天然冠状病毒S序列相比，使冠状病毒S胞外域三聚体稳定在融合前构象中可包括抗变性的增加。
因此，在优选的实施方式中，冠状病毒刺突蛋白包括一个或多个使S蛋白稳定在融合前构象中的氨基酸取代，例如，使S蛋白的膜远端部分(包括N端区域)稳定在融合前构象中的取代。
在实施方式中，融合前稳定化突变包括在S蛋白远端部分(包括N端区域)的氨基酸位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考的氨基酸位置)，优选地其中所述氨基酸被P取代。适合地，冠状病毒刺突蛋白的稳定化可通过用使刺突蛋白稳定在融合前构象中的氨基酸取代两个连续的氨基酸来获得。
在优选的实施方式中，所述至少一个融合前稳定化突变包括进一步使冠状病毒S蛋白的融合前状态稳定的空腔填充突变。术语“空腔填充突变”或“空腔填充氨基酸取代”涉及填充蛋白质如冠状病毒S蛋白胞外域的蛋白质核心内的空腔的氨基酸取代。空腔主要是折叠的蛋白质内不存在氨基酸或氨基酸侧链的空隙。在几个实施方式中，引入空腔填充氨基酸取代以填充冠状病毒S胞外域核心的融合前构象中存在的空腔，冠状病毒S胞外域核心在转变成融合后构象之后塌陷(例如，具有减小的体积)。
在优选的实施方式中，所述至少一个融合前稳定化突变包括进一步稳定融合前状态的突变的质子化位点。
在优选的实施方式中，所述至少一个融合前稳定化突变包括人工分子内二硫键。这种人工分子内二硫键的引入可进一步使S蛋白的膜远端部分(包括N端区域)稳定在融合前构象中；即，稳定在特异性结合一种或多种融合前特异性抗体，和/或呈递适合的抗原位点——其存在于S蛋白的融合前构象上，但不存在于融合后构象中——的构象中。在实施方式中，所述至少一个融合前稳定化突变包括2、3、4、5、6、7或8个不同的人工分子内二硫键。
必须强调的是，在本发明的上下文中，可如上所述使任何冠状病毒S蛋白，优选任何大流行冠状病毒S蛋白突变，以使刺突蛋白稳定在融合前构象中。因此，刺突蛋白可选自任何冠状病毒，优选地选自任何α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒、δ冠状病毒，更优选β冠状病毒。
根据各种优选的实施方式，组分A的核酸编码至少一种如本文定义的来自冠状病毒，优选大流行冠状病毒的抗原性肽或蛋白质，以及另外地，至少一种异源肽或蛋白质元件。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的冠状病毒抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善本发明的经编码的抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件(antigen clustering elements))，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分A的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
适合的多聚化结构域可选自根据WO2017081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的跨膜元件可选自根据WO2017081082的SEQID NO:1228-1343的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的VLP形成序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1168-1227的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的肽连接体可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1509-1565的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的自切割肽可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1434-1508的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的免疫佐剂序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1360-1421的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的树突细胞(DC)靶向序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1344-1359的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的分泌信号肽可选自根据所公开的PCT专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1-1115和SEQ ID NO:1728的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。在优选的实施方式中，所述至少一个编码序列另外地编码选自信号肽、连接体肽、辅助表位、抗原聚集元件、三聚化或多聚化元件、跨膜元件或VLP形成序列的一种或多种异源肽或蛋白质元件。
在优选的实施方式中，组分A的编码至少一种衍生自冠状病毒的抗原性蛋白质的核酸另外地编码至少一种异源三聚化元件、抗原聚集元件或VLP形成序列。
在优选的实施方式中，抗原聚集元件可选自铁蛋白元件或二氧四氢喋啶合酶(lumazine synthase)元件、乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或胶囊蛋白(encapsulin)。表达稳定聚集的冠状病毒刺突蛋白，优选处于其融合前构象中，可增加针对经编码的冠状病毒抗原的中和活性的量级和广度。
二氧四氢喋啶合酶(Lumazine,LS,LumSynth)是一种具有颗粒形成特性的酶，存在于多种生物体中，并且参与核黄素的生物合成。在特别优选的实施方式中，二氧四氢喋啶合酶用于促进抗原聚集，因此可促进或增强本发明的经编码的冠状病毒抗原的免疫应答。
在特别优选的实施方式中，抗原聚集元件(多聚化元件)是或衍生自二氧四氢喋啶合酶，其中所述抗原聚集结构域的氨基酸序列优选与氨基酸序列SEQ ID NO:112中的任一个、其片段或变体同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
铁蛋白是一种主要功能是在细胞内储存铁的蛋白质。几乎所有活的生物体都会产生铁蛋白——由24个亚单位组成，每个亚单位由四α-螺旋束组成，这些亚单位自组装成具有八面体对称性的四级结构。其自组装成纳米颗粒的特性非常适合携带和暴露抗原。
在特别优选的实施方式中，铁蛋白用于促进抗原聚集，因此可促进经编码的冠状病毒抗原，优选刺突蛋白的免疫应答。
在特别优选的实施方式中，抗原聚集元件(多聚化元件)选自或衍生自铁蛋白，其中所述抗原聚集结构域的氨基酸序列优选与氨基酸序列SEQ ID NO:113中的任一个、其片段或变体同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方式中，抗原聚集结构域是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg形成球形颗粒。添加乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)的片段序列可以特别有效地增强基于核酸的疫苗针对冠状病毒的免疫应答。
在特别优选的实施方式中，HBsAg用于促进抗原聚集，因此可促进如本文定义的经编码的冠状病毒抗原，优选刺突蛋白的免疫应答。
在一些实施方式中，抗原聚集元件是胶囊蛋白元件。添加胶囊蛋白序列可以特别有效地增强基于核酸的疫苗针对冠状病毒的免疫应答。在特别优选的实施方式中，胶囊蛋白用于促进抗原聚集，因此可促进如本文定义的经编码的冠状病毒抗原，优选冠状病毒刺突蛋白的免疫应答。
胶囊蛋白是一种从嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中分离出来的蛋白质，并且可用作允许抗原自组装形成抗原(纳米)颗粒的元件。胶囊蛋白由60个相同的31kDa单体组装而成，这些单体具有薄且二十面体T＝1对称笼结构，内径和外径分别为20nm和24nm。
在组分A的核酸的编码序列另外地编码异源抗原聚集元件的实施方式中，特别优选和适合产生包含抗原聚集元件和衍生自冠状病毒的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选刺突蛋白，缺少C端跨膜结构域(TM)或缺少部分C端跨膜结构域(TM)。
在其它实施方式中，当组分A的核酸的编码序列另外地编码如上定义的异源抗原聚集元件时，特别优选和适合产生包含抗原聚集元件和衍生自冠状病毒刺突蛋白片段S1的抗原性肽或蛋白质(缺少S2和/或TM和/或TMflex)的融合蛋白。此外，使用连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接体)。
其它适合的多聚化元件可选自根据WO2017081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。WO2017081082的SEQ ID NO:1116-1167通过引用并入本文本文。
在优选的实施方式中，三聚化元件可选自折叠子(foldon)元件。在优选的实施方式中，折叠子元件是纤维蛋白(fibritin)折叠子元件。表达稳定的三聚刺突蛋白，优选处于其融合前构象中，可增加针对冠状病毒的中和活性的量级和广度。
在特别优选的实施方式中，纤维蛋白折叠子元件用于促进抗原三聚化，因此可促进经编码的冠状病毒抗原，优选刺突蛋白的免疫应答。优选地，折叠子元件是或衍生自噬菌体，优选衍生自噬菌体T4，最优选衍生自噬菌体T4的纤维蛋白。
在特别优选的实施方式中，三聚化元件选自或衍生自折叠子，其中所述三聚化元件的氨基酸序列优选与氨基酸序列SEQ ID NO:114中的任一个、这些中任意者的片段或变体同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在组分A的核酸的编码序列另外地编码异源三聚化元件的实施方式中，特别优选和适合产生包含三聚化元件和衍生自冠状病毒的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自冠状病毒的缺少C端跨膜结构域或缺少部分C端跨膜结构域(TMflex)的刺突蛋白。
在其它实施方式中，当组分A的核酸的编码序列另外地编码如上定义的异源三聚化元件时，特别优选和适合产生包含三聚化元件和衍生自冠状病毒刺突蛋白片段S1的抗原性肽或蛋白质(缺少S2和/或TM和/或TMflex)的融合蛋白。此外，使用连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接体)。
其它适合的三聚化元件可选自根据WO2017081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。WO2017081082的SEQ ID NO:1116-1167通过引用并入本文本文。
在优选的实施方式中，可选择VLP形成序列并将其融合于如本文定义的冠状病毒抗原。以VLP形式表达稳定聚集的刺突蛋白可增加针对冠状病毒的中和活性的量级和广度。VLP在结构上模拟感染性病毒，并且它们可诱导强力的细胞免疫应答和体液免疫应答。
适合的VLP形成序列可选自衍生自乙型肝炎病毒核心抗原、HIV-1Gag蛋白或土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)的元件。
在特别优选的实施方式中，至少一种VLP形成序列是土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)。WhcAg元件用于促进VLP形成，因此可促进经编码的冠状病毒抗原，优选刺突蛋白的免疫应答。
在特别优选的实施方式中，VLP形成序列选自或衍生自折叠子，其中所述VLP形成序列的氨基酸序列优选与氨基酸序列SEQ ID NO:13171中的任一个、这些中任意者的片段或变体同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在组分A的核酸的编码序列另外地编码异源VLP形成序列的实施方式中，特别优选和适合产生包含VLP形成序列和衍生自冠状病毒的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自冠状病毒的缺少C端跨膜结构域或缺少部分C端跨膜结构域的刺突蛋白。
在其它实施方式中，当组分A的核酸的编码序列另外地编码如上定义的异源VLP形成序列时，特别优选和适合产生包含VLP形成序列和衍生自冠状病毒刺突蛋白片段S1的抗原性肽或蛋白质(缺少S2和/或TM和/或TMflex)的融合蛋白。此外，使用连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接体)。
在这种上下文中的其它适合的VLP形成序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1168-1227的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。WO2017081082的SEQ ID NO:1168-1227通过引用并入本文本文。
在实施方式中，抗原性肽或蛋白质包括异源信号肽。异源信号肽可用于改善经编码的冠状病毒抗原的分泌。
适合的分泌信号肽可选自根据所公开的PCT专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1-1115和SEQ ID NO:1728的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。WO2017081082的1-1115和SEQ ID NO:1728通过引用并入本文本文。
在组分A的核酸的编码序列另外地编码异源分泌信号肽的实施方式中，特别优选和适合产生包含异源分泌信号肽和衍生自冠状病毒的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自冠状病毒的刺突蛋白缺少N端内源性分泌信号肽(缺少aa 1至aa 15)。
根据优选的实施方式，组分A的核酸包含下列：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自冠状病毒的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在优选的实施方式中，组分A的核酸包含下列：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自至少一种冠状病毒的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体，其中所述至少一种冠状病毒选自至少一种(大流行)α冠状病毒、至少一种(大流行)β冠状病毒、至少一种(大流行)γ冠状病毒和/或至少一种(大流行)δ冠状病毒。
在这种上下文中，任何编码至少一种如本文定义的冠状病毒的抗原性蛋白质或其片段和变体的编码序列都可理解成是适合的编码序列，因此可包含在组分A的核酸中。
适用于组分A的核酸的适合的特征和实施方式在下文“核酸特征和实施方式”段落中提供。
适合地，组分A的核酸被配制和/或复合。适用于组分A的核酸复合或配制的适合的特征和实施方式在下文“配制和复合”段落中提供。
在本发明的上下文中，术语“核酸种类”不限于表示“一种单一的核酸分子”，而是要理解为包括基本上相同的核酸分子的集合。因此，它可能涉及多种基本上相同的核酸分子，例如DNA或RNA分子。
在实施方式中，组分A可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同冠状病毒的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的冠状病毒表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的冠状病毒表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分A包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的冠状病毒(例如，不同的冠状病毒分离株、不同的β冠状病毒、不同的大流行冠状病毒)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的冠状病毒”必须理解为至少两种相应的冠状病毒(例如不同的冠状病毒分离株、不同的β冠状病毒、不同的大流行冠状病毒等)之间的差异，其中差异体现在相应不同的冠状病毒的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的冠状病毒可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分A包含至少一种核酸，所述核酸编码选自或衍生自至少一种冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分A优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分A的肌内或皮内施用导致经编码的抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分A的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的冠状病毒抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致DNA转录成RNA，并随后在对象中将RNA翻译成经编码的冠状病毒抗原。
在实施方式中，向对象施用包含组分A的药物组合物引发中和抗体而不引发疾病增强抗体(disease enhancing antibody)。具体地，将包含编码冠状病毒融合前稳定化刺突蛋白的组分A的药物组合物向对象施用不引发免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
优选地，组分A适用于疫苗，具体地，适用于冠状病毒疫苗，优选本发明的组合疫苗。
下文提供了与本发明上下文中的具体的冠状病毒相关的实施方式(组分A-1、组分A-2、组分A-3)。
组分A-1：SARS-CoV-2
在特别优选的实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒是SARS-CoV-2病毒(也称为组分A-1)。
因此，在第一方面的优选实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
必须理解“组分A”段落中描述的一般实施方式和特征也可适用于编码SARS-CoV-2抗原性肽或蛋白质的核酸。
如本文所用，术语“人类冠状病毒2019”、“人类冠状病毒”(CV)、“nCoV-2019冠状病毒”、“nCoV-2019”、“冠状病毒”、“CV冠状病毒”、“HCoV-19”、“SARS2”、“COVID-19病毒”、“hCoV-19”、“SARS-CoV-2”或“冠状病毒SARS-CoV-2”在整个本发明中可互换使用，与2019/2020之交出现的一种新型大流行冠状病毒有关，其引起了COVID-19病。根据WHO(2020年2月)，该病毒正式命名为“SARS-CoV-2”，而相关疾病正式命名为“COVID-19”。
SARS-CoV-2属于冠状病毒科，具体是属于正冠状病毒，更具体是属于β冠状病毒。示例性SARS-CoV-2冠状病毒是分离株，包括但不限于下面列表A和列表B中提供的那些。
列表A：示例性SARS-CoV-2冠状病毒分离株(EPI/GISAID)：
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也可通过GenBank登录号提供的遗传信息来定义或识别示例性SARS-CoV-2冠状病毒，如下面列表B所提供的。
列表B：不同的SARS-CoV-2分离株的GenBank登录号：
NC_045512、LC528232、LC528233、LC529905、MN908947、MN938384、MN938385、MN938386、MN938387、MN938388、MN938389、MN938390、MN970003、MN970004、MN975262、MN975263、MN975264、MN975265、MN975266、MN975267、MN975268、MN985325、MN988668、MN988669、MN994467、MN994468、MN996527、MN996528、MN996529、MN996530、MN996531、MN997409、MT007544、MT012098、MT019529、MT019530、MT019531、MT019532、MT019533、MT020880、MT020881、MT027062、MT027063、MT027064、MT039873、MT039887、MT039888、MT039890、MT044257、MT044258、MT049951、MT050493、MT066156、MT066175、MT066176、MT072688、MT093571、MT093631、MT106052、MT106053、MT106054、MT118835、MT121215、MT123290、MT123291、MT123292、MT123293、MT126808、MT135041、MT135042、MT135043、MT135044、MT152824、MT159705、MT159706、MT159707、MT159708、MT159709、MT159710、MT159711、MT159712、MT159713、MT159714、MT159715、MT159716、MT159717、MT159718、MT159719、MT159720、MT159721、MT159722、MT163716、MT163717、MT163718、MT163719、MT163720、MT163721、MT184907、MT184908、MT184909、MT184910、MT184911、MT184912、MT184913、MT188339、MT188340、MT188341、MT192759、MT192765、MT192772或MT192773。
SARS-CoV-2冠状病毒的NCBI分类ID(NCBI:txid或taxID)归为：2697049。
在本发明的上下文中，任何选自或衍生自SARS-CoV-2的蛋白质都可用于本发明的上下文中，并且可适合由组分A的编码序列或核酸编码。进一步在基础发明的范围内，所述至少一种抗原性肽或蛋白质可包括下列或由下列组成：合成上改造的或人工SARS-CoV-2肽或蛋白质。术语“合成上改造的”SARS-CoV-2肽或蛋白质，或术语“人工SARS-CoV-2肽或蛋白质”涉及在自然界中不存在的蛋白质。因此，与天然SARS-CoV-2肽或蛋白质相比，“人工SARS-CoV-2肽或蛋白质”或“合成上改造的SARS-CoV-2肽或蛋白质”可例如在至少一个氨基酸上不同，和/或可包含另外的异源肽或蛋白质元件，和/或可以是N端或C端延伸或截短的。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括选自或衍生自结构蛋白、辅助蛋白或复制酶蛋白的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，结构蛋白选自或衍生自刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核衣壳蛋白(N)，或这些中任意者的免疫原性片段或变体。
在药物组合物的特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白(S、S1、S2或S1和S2)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
由组分A的核酸提供的适合的抗原性肽或蛋白质序列公开于表1，第1至41行，A列和B列。此外，关于选自或衍生自SARS-CoV-2的所述适合的抗原性肽或蛋白质序列的其它信息在ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在下文中，详细描述了由组分A(具体是组分A-1)的核酸提供的选自或衍生自SARS-CoV-2的优选抗原性肽或蛋白质序列。
必须注意的是，在提及氨基酸(aa)残基及其在SARS-CoV-2刺突蛋白(S)中的位置时，除非另有说明，否则本文使用的任何编号均与根据SEQ ID NO:1的SARS-CoV-2冠状病毒分离株EPI_ISL_402128(βCoV_武汉_WIV05_2019_EPI_ISL_402128)的对应刺突蛋白(S)中相应氨基酸残基的位置有关。相应的氨基酸位置——如果指的是SARS-CoV-2刺突蛋白——是关于SARS-CoV-2冠状病毒分离株EPI_ISL_402128(SEQ ID NO:1)示例性指示的。本领域技术人员当然能够将本说明书中以SARS-CoV-2EPI_ISL_402128(SEQ ID NO:1)为例的教导适用于其它SARS-CoV-2冠状病毒分离株中的其它抗原性肽或蛋白质，例如适用于以下分离株，包括但不限于：EPI_ISL_404227、EPI_ISL_403963、EPI_ISL_403962、EPI_ISL_403931、EPI_ISL_403930、EPI_ISL_403929、EPI_ISL_402130、EPI_ISL_402129、EPI_ISL_402128、EPI_ISL_402126、EPI_ISL_402125、EPI_ISL_402124、EPI_ISL_402123、EPI_ISL_402120、EPI_ISL_402119(其它SARS-CoV-2分离株在列表A和/或列表B中提供)
SARS-CoV-2刺突蛋白(S)的蛋白质注释是使用SEQ ID NO:1作为参考蛋白进行的。SARS-CoV-2参考蛋白的全长S有1273个氨基酸残基，并且包括以下元件：
-分泌信号肽：氨基酸位置aa 1至aa 15(参见SEQ ID NO:28)
-刺突蛋白片段S1：氨基氨基酸位置aa 1至aa 681(参见SEQ ID NO:27)
-受体结合结构域(RBD)：氨基酸位置aa 319至aa 541(参见SEQ ID NO:13243)
-关键中和结构域(CND)：氨基酸位置aa 329至aa 529(参见SEQ ID NO:13310)
-刺突蛋白片段S2：氨基酸位置aa 682至aa 1273(参见SEQ ID NO:30)
-跨膜结构域(TM)：氨基酸位置aa 1212至aa 1273(参见SEQ ID NO:49)
-跨膜结构域(TMflex)：氨基酸位置aa 1148至aa 1273(参见SEQ ID NO:13176)
必须注意的是，衍生自不同SARS-CoV-2分离株(列表A和列表B中提供了示例性SARS-CoV-2分离株)的刺突蛋白之间天然地会发生氨基酸水平的变异。在本发明的上下文中，此类氨基酸变异可应用于如本文所述的衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白的每一种抗原性肽或蛋白质。
因此，本文中提供并设想成在本发明上下文中合适的抗原的每一种SARS-CoV-2刺突蛋白都可具有一个或多个以下的氨基酸变异/取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)：D614G或G614D；H49Y或Y49H；V367F或F367V；P1263L或L1263P；V483A或A483V；S939F或F939S；S943P或P943S；L5F或F5L；L8V或V8L；S940F或F940S；C1254F或F1254C；Q239K或K239Q；M153T或T153M；V1040F或F1040V；A845S或S845A；Y145H或H145Y；A831V或V831A；M1229I或I1229M；H69或H69del/aa缺失；V70或H70del/aa缺失；H69_V70或H69del和H70del/aa缺失；A222V或V222A；Y453F或F453Y；S477N或N477S；I692V或V692I；R403K或K403R；K417N或N417K；N437S或S437N；N439K或K439N；V445A或A445V；V445I或I445V；V445F或F445V；G446V或V446G；G446S或S446G；G446A或A446G；L455F或F455L；F456L或L456F；K458N或N458K；A475V或V475A；G476S或S476G；G476A或A476G；S477I或I477S；S477R或R477S；S477G或G477S；S477T或T477S；T478I或I478T；T478K或K478T；T478R或R478T；T478A或A478T；E484Q或Q484E；E484K或K484E；E484A或A484E；E484D或D484E；G485R或R485G；G485S或S485G,F486L或L486F；N487I或I487N；Y489H或H489Y；F490S或S490F；F490L或L490F；Q493L或L493Q；Q493K或K493Q；S494P或P494S；S494L或L494S；P499L或L499P；T500I或I500T；N501Y或Y501N；N501T或T501N；N501S或S501N；V503F或F503V；V503I或I503V；G504D或D504G；Y505W或W505Y；Q506K或K506Q；Q506H或H506Q；H69或H69del/aa缺失；V70或H70del/aa缺失；H69_V70或H69del和H70del/aa缺失；A222V或V222A；Y453F或F453Y；S477N或N477S；I692V或V692I；R403K或K403R；K417N或N417K；N437S或S437N；N439K或K439N；V445A或A445V；V445I或I445V；V445F或F445V；G446V或V446G；G446S或S446G；G446A或A446G；L455F或F455L；F456L或L456F；K458N或N458K；A475V或V475A；G476S或S476G；G476A或A476G；S477I或I477S；S477R或R477S；S477G或G477S；S477T或T477S；T478I或I478T；T478K或K478T；T478R或R478T；T478A或A478T；E484Q或Q484E；E484K或K484E；E484A或A484E；E484D或D484E；G485R或R485G；G485S或S485G；F486L或L486F；N487I或I487N；Y489H或H489Y；F490S或S490F；F490L或L490F；Q493L或L493Q；Q493K或K493Q；S494P或P494S；S494L或L494S；P499L或L499P；T500I或I500T；N501Y或Y501N；N501T或T501N；N501S或S501N；V503F或F503V；V503I或I503V；G504D或D504G；Y505W或W505Y；Q506K或K506Q；Q506H或H506Q；Y144或Y144del/aa del；A570D或D570A；P681H或H681P；T716I或I716T；S982A或A982S；D1118H或H1118D；L18F或F18L；D80A或A80D；D215G或G215D；L242或L242del/aa缺失；A243或A243del/aa缺失；L244或L244del/aa缺失；L242_A243_L244或L242del和A243del和L244del/aa缺失；R246I或I246R；A701V或V701A；T20N或N20T；P26S或S26P；D138Y或Y138D；R190S或S190R；H655Y或Y655H；T1027I或I1027T；S13I或I13S；W152C或C152W；L452R或R452L；R346T或T346R；P384L或L384P；L452M或M452L；F456A或A456F；F456K或K456F；F456V或V456F；E484P或P484E；K417T或T417K；G447V或V447G；L452Q或Q452L；A475S或S475A；F486I或I486F；F490Y或Y490F；Q493R或R493Q；S494A或A494S；P499H或H499P；P499S或S499P；G502V或V502G；T748K或K748T；A522S或S522A；和/或V1176F或F1176V。
以下氨基酸变异(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)是特别优选的：
·H69del、V70del、Y144del、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H
·L18F、D80A、D215G、L242del、A243del、L244del、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V
·K417N、E484K、N501Y和D614G
·E484K和D614G
·L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y和T1027I
·S13I、W152C、L452R和D614G
·delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V和M1229I
·E484K、E484P或E484Q
·G446V
·G485R
在优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白(S)包含以下氨基酸变异(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)：L18F、D80A、D215G、delL242、delA243、delL244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V。
适合的SARS-CoV-2刺突蛋白(S)可选自或衍生自根据下表的新兴SARS-CoV-2变体：
Figure BDA0004113537810000281
Figure BDA0004113537810000291
在特别优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白(S)选自或衍生自B.1.351。
在一些实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白(S)的片段可由组分A的核酸编码，其中所述片段可以是N端截短的，缺少全长SARS-CoV-2冠状病毒参考蛋白(SEQ ID NO:1)的N端氨基酸1到最多200，和/或其中所述片段可以是C端截短的，缺少全长SARS-CoV-2冠状病毒参考蛋白(SEQ ID NO:1)的C端氨基酸(aa)531到最多aa 1273。此类“刺突蛋白(S)的片段”可另外包含氨基酸取代(如下所述)并且可另外包括至少一种异源肽或蛋白质元件(如下所述)。在优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白(S)的片段可以是C端截短的，从而缺少C端跨膜结构域(即缺少aa 1212至aa 1273或缺少aa 1148至aa1273)。
在一些实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS-CoV-2刺突蛋白(S)或由其组成，其中刺突蛋白(S)缺少跨膜结构域(TM)(氨基酸位置aa 1212至aa 1273)。在实施方式中，经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS-CoV-2刺突蛋白(S)或由其组成，其中刺突蛋白(S)缺少跨膜结构域(TMflex)的延伸部分(氨基酸位置aa1148至aa 1273)。不希望受理论的束缚，如本文定义的缺少跨膜结构域(TM或TMflex)的SARS-CoV-2刺突蛋白(S)可适用于SARS-CoV-2疫苗，因为这样的蛋白质将是可溶的而不是锚定在细胞膜中。因此，可溶性蛋白质在施用于对象后可以以更高浓度产生(即翻译)，从而导致改善的免疫应答。
不希望受理论的束缚，RBD(aa 319至aa 541)结构域和CND(aa 29至aa 529)结构域对SARS-CoV-2刺突蛋白(S)的免疫原性可以说是至关重要的。这两个区域都位于刺突蛋白的S1片段。因此，在本发明的上下文中可能适合的是，抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：刺突蛋白的S1片段，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，SARS-CoV-2的S1片段可至少包括如上定义的RBD结构域和/或CND结构域。
在优选实施方式中，经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括受体结合结构域(RBD；aa 319至aa 541)或由其组成，其中RBD包括下列或由下列组成：刺突蛋白片段，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在进一步优选的实施方式中，经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括截短的受体结合结构域(truncRBD；aa 334至aa 528)或由其组成，其中RBD包括下列或由下列组成：刺突蛋白片段，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
此类“刺突蛋白(S)的片段”(RBD；aa 319至aa 541或truncRBD，aa 334至aa 528)可另外包含氨基酸取代(如下所述)并且可另外包含至少一种异源肽或蛋白质元件(如下所述)。
在特别优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS-CoV-2刺突蛋白(S)或由其组成，其中SARS-CoV-2刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS-CoV-2刺突蛋白片段S1，并且缺少至少70％、80％、90％、优选100％的刺突蛋白片段S2(aa 682至aa1273)。这样的实施方式可以是有益的，因为SARS-CoV-2S1片段包含中和表位而不存在包含S1和S2的全长蛋白的潜在问题。
不希望受理论的束缚，组分A的抗原性肽或蛋白质包括SARS-CoV-2刺突蛋白片段S1和SARS-CoV-2刺突蛋白片段S2(的至少一个片段)或由其组成可以是适合的，因为可以促进免疫原性SARS-CoV-2刺突蛋白的形成。
因此，在特别优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS-CoV-2刺突蛋白(S)或由其组成，其中SARS-CoV-2刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：SARS-CoV-2刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体；和SARS-CoV-2刺突蛋白片段S2，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：全长SARS-CoV-2刺突蛋白或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
术语“全长SARS-CoV-2刺突蛋白”必须理解成SARS-CoV-2刺突蛋白，优选衍生自SARS-CoV-2冠状病毒，其氨基酸序列对应于基本上完整的刺突蛋白。因此，“全长刺突蛋白”可包括aa 1至aa 1273(参考蛋白：SEQ ID NO:1)。因此，全长SARS-CoV-2刺突蛋白通常可包括分泌信号肽、刺突蛋白片段S1、刺突蛋白片段S2、受体结合域(RBD)和关键中和结构域CND以及跨膜结构域。值得注意的是，术语“全长SARS-CoV-2刺突蛋白”也包括包含某些氨基酸取代(例如，为实现S蛋白的融合前稳定化)或天然存在的氨基酸缺失的变体。
在特别优选的实施方式中，由组分A的核酸提供的SARS-CoV-2刺突蛋白(S)被设计或改编以使抗原稳定在融合前构象中。融合前构象在有效的SARS-CoV-2疫苗的上下文中特别有利，因为中和抗体的几个潜在表位可能仅在所述融合前蛋白质构象下才可接近。此外，使该蛋白质保持在融合前构象下旨在避免免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
在优选的实施方式中，将编码融合前稳定化刺突蛋白的核酸(或组合物或疫苗)向对象施用会引发刺突蛋白中和抗体而不引发疾病增强抗体。具体地，将编码融合前稳定化刺突蛋白的核酸(或组合物或疫苗)向对象施用不会引发免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
因此，在优选的实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质选自或衍生自刺突蛋白(S)，其中刺突蛋白(S)是融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)。适合地，所述融合前稳定化刺突蛋白包含至少一个融合前稳定化突变。
SARS-CoV-2刺突蛋白的稳定化可通过将K986和/或V987位的至少一个氨基酸取代为使刺突蛋白稳定在融合前构象中的氨基酸来获得(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的融合前稳定化突变包括在K986位处的氨基酸取代，其中氨基酸K986被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)，优选其中氨基酸K986被P取代。在实施方式中，融合前稳定化突变包括在V987位处的氨基酸取代，其中氨基酸V987被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考SEQID NO:1的氨基酸位置)，优选其中氨基酸V987被P取代。
适合地，SARS-CoV-2刺突蛋白的稳定化可通过用使刺突蛋白稳定在融合前构象中的氨基酸取代K986和V987位的两个连续的氨基酸来获得(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在优选实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的融合前稳定化突变包括在K986和V987位处的氨基酸取代，其中氨基酸K986和/或V987被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
优选地，融合前构象的稳定化是通过在SARS-CoV-2刺突蛋白的残基K986和V987处引入两个连续的脯氨酸取代来获得的(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
因此，在优选的实施方式中，SARS-CoV-2的融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)包括至少一个融合前稳定化突变，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括以下氨基酸取代：K986P和V987P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
因此，以上提供的任何NCBI蛋白质登录号，或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946的任何蛋白质或其片段或变体都可由技术人员选择，从而将此类氨基酸改变引入SARS-CoV-2刺突蛋白中，优选氨基酸取代：K986P和V987P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括进一步稳定融合前状态的空腔填充突变，其中所述突变/氨基酸取代选自包括T887W；A1020W；T887W和A1020W；或P1069F的列表(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在一些实施方式中，以下氨基酸取代T887W；A1020W；T887W和A1020W；或P1069F中的至少一种可与SARS-CoV-2刺突蛋白中的(K986P和V987P)取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)组合。
在特别优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白包含以下氨基取代(根据参考SEQID NO:1的氨基酸位置)中的至少一种：
·T887W；K986P和V987P
·A1020W；K986P和V987P
·T887W和A1020W；K986P和V987P
·P1069F；K986P和V987P
因此，以上提供的SARS-CoV-2的任何NCBI蛋白质登录号，或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946的任何蛋白质或其片段或变体都可由技术人员选择，从而引入此类氨基酸改变，适合地选自T887W；A1020W；T887W和A1020W；或P1069F的氨基酸取代；或选自(T887W；K986P和V987P)；(A1020W；K986P和V987P)；(T887W和A1020W；K986P和V987P)；(P1069F；K986P和V987P)的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在实施方式中，以下氨基酸取代F817P、A892P、A899P和A942P中的至少一种可与(K986P和V987P)取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)组合。
在实施方式中，SARS-CoV-2冠状病毒刺突蛋白包括以下氨基酸取代(根据参考SEQID NO:1的氨基酸位置)中的至少一种：
·F817P；K986P和V987P
·A892P；K986P和V987P
·A899P；K986P和V987P
·A942P；K986P和V987P
在特别优选的实施方式中，SARS-CoV-2冠状病毒刺突蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)：
·F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P(S_stab_PP_hex)
因此，以上提供的任何NCBI蛋白质登录号，或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946的任何蛋白质或其片段或变体都可由技术人员选择，从而引入此类氨基酸改变，适合地选自F817P、A892P、A899P、A942P的氨基酸取代；或选自(F817P；K986P和V987P)；(A892P；K986P和V987P)；(A899P；K986P和V987P)；(A942P；K986P和V987P)；(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P)的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括进一步稳定融合前状态的突变的质子化位点，其中所述突变/氨基酸取代选自H1048Q和H1064N；H1083N和H1101N；或H1048Q和H1064N和H1083N和H1101N(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在实施方式中，以下氨基酸取代H1048Q和H1064N；H1083N和H1101N；或H1048Q和H1064N和H1083N和H1101N中的至少一种可与(K986P和V987P)取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)组合成SARS-CoV-2刺突蛋白。
在特别优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)中的至少一种：
·H1048Q和H1064N；K986P和V987P
·H1083N和H1101N；K986P和V987P
·H1048Q和H1064N和H1083N和H1101N；K986P和V987P
因此，以上提供的任何SARS-CoV-2NCBI蛋白质登录号，或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946的任何蛋白质或其片段或变体都可由技术人员选择，从而将此类氨基酸改变引入SARS-CoV-2刺突蛋白，适合地选自H1048Q和H1064N；H1083N和H1101N；或H1048Q和H1064N和H1083N和H1101N的氨基酸取代；或选自(H1048Q和H1064N；K986P和V987P)；(H1083N和H1101N；K986P和V987P)；(H1048Q和H1064N和H1083N和H1101N；K986P和V987P)的氨基酸取代；(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括人工分子内二硫键。可引入这种人工分子内二硫键以进一步使SARS-CoV-2S蛋白的膜远端部分(包括N端区域)稳定在融合前构象中；即，稳定在特异性结合一种或多种融合前特异性抗体，和/或呈递适合的抗原位点——其存在于SARS-CoV-2S蛋白的融合前构象上，但不存在于融合后构象中——的构象中。
在优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括人工分子内二硫键，优选其中所述至少一个人工分子内二硫键包含选自以下列表的下列氨基酸取代中的至少两种，所述列表包括I712C、I714C、P715C、T874C、G889C、A890C、I909C、N914C、Q965C、F970C、A972C、R995C、G999C、S1003C、L1034C、V1040C、Y1047C、S1055C、P1069C、T1077C、Y1110C或S1123C(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括人工分子内二硫键，其中所述至少一个人工分子内二硫键包含下列氨基酸取代中的至少一种：I712C和T1077C；I714C和Y1110C；P715C和P1069C；G889C和L1034C；I909C和Y1047C；Q965C和S1003C；F970C和G999C；A972C和R995C；A890C和V1040C；T874C和S1055C；或N914C和S1123C(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括2、3、4、5、6、7或8个不同的人工分子内二硫键，其中每一个二硫键可选自下列氨基酸取代：I712C和T1077C；I714C和Y1110C；P715C和P1069C；G889C和L1034C；I909C和Y1047C；Q965C和S1003C；F970C和G999C；A972C和R995C；A890C和V1040C；N914C和S1123C；T874C和S1055C；或N914C和S1123C(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在实施方式中，下列氨基酸取代I712C和T1077C；I714C和Y1110C；P715C和P1069C；G889C和L1034C；I909C和Y1047C；Q965C和S1003C；F970C和G999C；A972C和R995C；A890C和V1040C；T874C和S1055C；或N914C和S1123C中的至少一种，优选2、3、4、5种或更多种可与(K986P和V987P)取代组合。例如，融合前稳定化SARS-CoV-2S蛋白可包含两个不同的人工分子内二硫键，例如I712C和T1077C；P715C和P1069C；以及另外地K986P和V987P取代等(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在特别优选的实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)中的至少一种：
·I712C和T1077C；K986P和V987P
·I714C和Y1110C；K986P和V987P
·P715C和P1069C；K986P和V987P
·G889C和L1034C；K986P和V987P
·I909C和Y1047C；K986P和V987P
·Q965C和S1003C；K986P和V987P
·F970C和G999C；K986P和V987P
·A972C和R995C；K986P和V987P
·A890C和V1040C；K986P和V987P
·T874C和S1055C；K986P和V987P
·N914C和S1123C；K986P和V987P
因此，以上提供的任何SARS-CoV-2NCBI蛋白质登录号，或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946的任何蛋白质或其片段或变体都可由技术人员选择，从而将此类氨基酸改变引入SARS-CoV-2刺突蛋白，适合地选自I712C和T1077C；I714C和Y1110C；P715C和P1069C；G889C和L1034C；I909C和Y1047C；Q965C和S1003C；F970C和G999C；A972C和R995C；A890C和V1040C；T874C和S1055C；或N914C和S1123C；或N914C和S1123C的氨基酸取代；或选自(I712C；T1077C；K986P；V987P)或(I714C；Y1110C；K986P；V987P)或(P715C；P1069C；K986P；V987P)或(G889C；L1034C；K986P；V987P)或(I909C；Y1047C；K986P；V987P)或(Q965C；S1003C；K986P；V987P)或(F970C；G999C；K986P；V987P)或(A972C；R995C；K986P；V987P)或(A890C和V1040C；K986P和V987P)或(T874C和S1055C；K986P和V987P)或(N914C和S1123C；K986P和V987P)的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
必须强调的是，在本发明的上下文中任何SARS-CoV-2刺突蛋白都可如上所述进行突变或修饰(以参考蛋白SEQ ID NO:1为例)，以使刺突蛋白稳定在融合前的构象中。
根据各种优选的实施方式，组分A的核酸编码至少一种如本文定义的选自或衍生自SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质和另外地至少一种异源肽或蛋白质元件，优选选自或衍生自信号肽、连接体、辅助表位、抗原聚集元件、三聚化元件、跨膜元件和/或VLP形成序列。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善本发明的经编码的抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件)，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分A的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
在优选的实施方式中，组分A的编码至少一种如本文定义的选自或衍生自SARS-CoV-2的抗原性蛋白质的核酸另外地编码至少一种异源三聚化元件、抗原聚集元件或VLP形成序列。
在优选的实施方式中，抗原聚集元件可选自铁蛋白元件或二氧四氢喋啶合酶元件、乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或胶囊蛋白。表达稳定聚集的SARS-CoV-2刺突蛋白，优选处于其融合前构象中，可增加针对经编码的SARS-CoV-2肽/蛋白质的中和活性的量级和广度。
在优选的实施方式中，二氧四氢喋啶合酶用于促进SARS-CoV-2蛋白的抗原聚集，因此可促进或增强经编码的SARS-CoV-2抗原，优选SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫应答。在优选的实施方式中，铁蛋白用于促进SARS-CoV-2蛋白的抗原聚集，因此可促进经编码的SARS-CoV-2抗原，优选SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫应答。在优选的实施方式中，HBsAg用于促进SARS-CoV-2蛋白的抗原聚集，因此可促进经编码的SARS-CoV-2抗原，优选SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫应答。在优选的实施方式中，胶囊蛋白用于促进SARS-CoV-2蛋白的抗原聚集，因此可促进经编码的SARS-CoV-2抗原，优选SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫应答。
在组分A的编码序列另外地编码异源抗原聚集元件的一些实施方式中，特别优选和适合产生包含抗原聚集元件和衍生自SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选刺突蛋白，缺少C端跨膜结构域(TM)(缺少aa 1212至aa1273)或缺少部分C端跨膜结构域(TMflex)，例如缺少aa 1148至aa 1273。
因此，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，都可经修饰以去除aa 1212至aa 1273位的内源性跨膜结构域(TM)，因此可用作本发明上下文中的“C端截短的”SARS-CoV-2蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。此外，与SEQ IDNO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，都可经修饰以去除aa 1148至aa1273位的内源性跨膜结构域(TMflex)的一部分，因此可用作本发明上下文中的“C端截短的”SARS-CoV-2蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。适合的缺少C端跨膜结构域(TM或TMflex)的刺突蛋白可选自SEQ ID NO:31-39、1614-3623、13377-13510。
在其它实施方式中，当组分A的编码序列另外地编码如上定义的异源抗原聚集元件时，特别优选和适合产生包含抗原聚集元件和选自或衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白片段S1的抗原性肽或蛋白质(缺少S2和/或TM和/或TMflex)的融合蛋白。此外，使用连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接体)。
在优选的实施方式中，三聚化元件可选自折叠子元件。在优选的实施方式中，折叠子元件是纤维蛋白折叠子元件。表达稳定的三聚刺突蛋白，优选处于其融合前构象中，可增加针对SARS-CoV-2的中和活性的量级和广度。
在特别优选的实施方式中，纤维蛋白折叠子元件用于促进抗原三聚化，因此可促进经编码的SARS-CoV-2抗原，优选SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫应答。优选地，折叠子元件是或衍生自噬菌体，优选衍生自噬菌体T4，最优选衍生自噬菌体T4的纤维蛋白。
在组分A的核酸的编码序列另外地编码异源三聚化元件的实施方式中，特别优选和适合产生包含三聚化元件和衍生自SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自SARS-CoV-2的缺少C端跨膜结构域(缺少aa 1212至aa 1273)或缺少部分C端跨膜结构域(TMflex)——例如缺少aa 1148至aa 1273——的刺突蛋白。
在其它实施方式中，当组分A的核酸的编码序列另外地编码如上定义的异源三聚化元件时，特别优选和适合产生包含三聚化元件和衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白片段S1的抗原性肽或蛋白质(缺少S2和/或TM和/或TMflex)的融合蛋白。此外，使用连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的(例如，根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接体)。
在优选的实施方式中，可选择VLP形成序列并将其融合于如本文定义的SARS-CoV-2抗原。以VLP形式表达稳定聚集的SARS-CoV-2刺突蛋白可增加针对SARS-CoV-2的中和活性的量级和广度。VLP在结构上模拟感染性病毒，并且它们可诱导强力的细胞免疫应答和体液免疫应答。
适合的VLP形成序列可选自衍生自乙型肝炎病毒核心抗原、HIV-1Gag蛋白或土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)的元件。
在特别优选的实施方式中，至少一种VLP形成序列是土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)。WhcAg元件用于促进VLP形成，因此可促进经编码的冠状病毒抗原，优选刺突蛋白的免疫应答。
在组分A的核酸的编码序列另外地编码异源VLP形成序列的实施方式中，特别优选和适合产生包含VLP形成序列和衍生自SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自SARS-CoV-2的缺少C端跨膜结构域(缺少aa1212至aa 1273)或缺少部分C端跨膜结构域(TMflex)——例如缺少aa 1148至aa 1273——的刺突蛋白。
因此，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，都可修饰为在aa 1212至aa 1273位缺少内源性跨膜元件，因此可用作本发明上下文中的“C端截短的”SARS-CoV-2S蛋白。此外，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，都可经修饰以去除aa 1148至aa 1273位的内源性跨膜结构域(TMflex)的一部分，因此可用作本发明上下文中的“C端截短的”SARS-CoV-2S蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。适合的缺少C端跨膜结构域(TM或TMflex)的SARS-CoV-2刺突蛋白可选自SEQ IDNO:31-39、1614-3623、13377-13510。
在其它实施方式中，当核酸的编码序列另外地编码如上定义的异源VLP形成序列时，特别优选和适合产生包含VLP形成序列和衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白片段S1的抗原性肽或蛋白质(缺少S2和/或TM和/或TMflex)的融合蛋白。此外，使用连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接体)。
在实施方式中，抗原性肽或蛋白质包括如上定义的异源信号肽。异源信号肽可用于改善编码的SARS-CoV-2抗原的分泌。
在组分A的核酸的编码序列另外地编码异源分泌信号肽的实施方式中，特别优选和适合产生包含异源分泌信号肽和衍生自SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自SARS-CoV-2的刺突蛋白缺少N端内源性分泌信号肽(缺少aa 1至aa 15)。因此，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732或22737-22758、22929-22964中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，都可修饰为在aa 1至aa 15位缺少内源性分泌信号肽，因此可用作本发明上下文中的“N端截短的”SARS-CoV-2蛋白。
在以下列表1中，进一步详细指定了如上定义的适合的SARS-CoV-2冠状病毒抗原性肽和蛋白质(例如命名、蛋白质元件等)。
列表1：示例性的/适合的SARS-CoV-2抗原设计：
·全长刺突蛋白(S)，其包括aa 1至aa 1273；
ο参见例如SEQ ID NO:1、274。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和K986P、V987P取代(S_stab_PP)；
ο参见例如SEQ ID NO:10、341。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和K986P、V987P取代(S_stab_PP)；
ο参见例如SEQ ID NO:22961。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和K986P、V987P取代(S_stab_PP)；
ο参见例如SEQ ID NO:22960。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、A942P脯氨酸取代；S_stab_PP_hex
ο参见例如SEQ ID NO:22732。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和K986P、V987P取代和空腔填充突变(T887W、
A1020W)；S_stab_PP_cav
ο参见例如SEQ ID NO:408。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和K986P、V987P取代和空腔填充突变(P1069F)；
S_stab_PP_cav
ο参见例如SEQ ID NO:475。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和K986P、V987P取代和空腔填充突变(H1048Q、
H1064N、H1083N、H1101N)；S_stab_PP_prot
ο参见例如SEQ ID NO:542。
·稳定化S蛋白，其包括aa1-aa1273和人工二硫键(S_stab_disul)I712C、T1077C；
ο参见例如SEQ ID NO:19、609。
·不含跨膜结构域的S，其包括aa1-aa1211(S_woTM)；
ο参见例如SEQ ID NO:31、1614。
·不含跨膜结构域flex的S，其包括aa1-aa1147(S_woTMflex)；
ο参见例如SEQ ID NO:2619。
·S_woTM，其包括K986P、V987P取代(S_stab_PP_woTM)
ο参见例如SEQ ID NO:40、1681。
·S_woTMflex，其包括K986P、V987P取代(S_stab_PP_woTMflex)
ο参见例如SEQ ID NO:2686。
·刺突蛋白片段S1，其包括aa 1至aa 681(S1)；
ο参见例如SEQ ID NO:27、1279。
·S_woTM，其包括二氧四氢喋啶合酶；
ο参见例如SEQ ID NO:58、3624。
·S_woTMflex，其包括二氧四氢喋啶合酶；
ο参见例如SEQ ID NO:7644。
·S_stab_PP_woTM，其包括二氧四氢喋啶合酶；
ο参见例如SEQ ID NO:85、3691。
·S_stab_PP_woTMflex，其包括二氧四氢喋啶合酶；
ο参见例如SEQ ID NO:7711。
·S_woTM，其包括铁蛋白元件；
ο参见例如SEQ ID NO:67、4629。
·S_woTMflex，其包括铁蛋白元件；
ο参见例如SEQ ID NO:8649。
·S_stab_PP_woTM，其包括铁蛋白元件；
ο参见例如SEQ ID NO:94、4696。
·S_stab_PP_woTMflex，其包括铁蛋白元件；
ο参见例如SEQ ID NO:8716。
·S_woTM，其包括折叠子元件；
ο参见例如SEQ ID NO:76、5634。
·S_woTMflex，其包括折叠子元件；
ο参见例如SEQ ID NO:9654。
·S_stab_PP_woTM，其包括折叠子元件；
ο参见例如SEQ ID NO:103、5701。
·S_stab_PP_woTMflex，其包括折叠子元件；
ο参见例如SEQ ID NO:9721。
·S_woTM，其包括VLP序列(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO:6639。
·S_woTMflex，其包括VLP序列(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO 10659。
·S_stab_PP_woTM，其包括VLP序列(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO:6706。
·S_stab_PP_woTMflex，其包括VLP序列(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO:10726。
·truncRBD，其包括折叠子元件：
ο参见例如SEQ ID NO:22734。
·truncRBD，其包括二氧四氢喋啶合酶(C端)
ο参见例如SEQ ID NO:22735。
·truncRBD，其包括二氧四氢喋啶合酶(N端)
ο参见例如SEQ ID NO:22736。
·truncRBD，其包括铁蛋白元件：
ο参见例如SEQ ID NO:22733。
列表1中提供的氨基酸位置根据的是参考SEQ ID NO:1。
表1(第1至41行)提供了优选的如上定义的选自或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原性肽或蛋白质。其中，第1至41行中每一行与适合的SARS-CoV-2构建物对应。表1的A列提供了对适合的SARS-CoV-2抗原构建物的简短描述。表1的B列提供了各个SARS-CoV-2抗原构建物的蛋白质(氨基酸)SEQ ID NO。表1的C列提供了对应的野生型或参考核酸编码序列的SEQ ID NO。表1的D列提供了对应的G/C优化的核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ ID NO。表1的E列提供了对应的人类密码子使用(codon usage)适应的核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ ID NO。表1的F列提供了对应的G/C含量修饰的核酸编码序列(opt10,gc mod)的SEQ IDNO。
值得注意的是，本发明的描述明确包括在本申请的ST.25序列表的<223>标识符下提供的信息。优选的包含表1的编码序列的核酸构建物，例如包含表1的编码序列的mRNA序列提供在表3A和3B中。
表1：优选的SARS-CoV-2构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)：
Figure BDA0004113537810000401
/>
Figure BDA0004113537810000411
/>
Figure BDA0004113537810000421
/>
Figure BDA0004113537810000431
在优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-1)的至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表1中提供(参见A列和B列的第1至41行)，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-1)的至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质(融合前稳定化刺突蛋白(S_stab))包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:10-26、40-48、85-111、341-1278、1681-2618、2686-3623、3691-4628、4696-5633、5701-6638、6706-7643、7711-8648、8716-9653、9721-10658、10726-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的至少一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表1中提供(参见A列和B列的第2至5行、第12-15行、第17-20行、第22-25行、第27-30行和第32-35行)，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在特别优选的实施方式中，选自或衍生自SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:10、21、22、25、27、274、341、408、475、542、743、810、1011、1145、1212、1279、8716、10726、22732-22758、22929-22942、22947-22964中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，选自或衍生自SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:10-18、341-407、22947-22964中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表1中提供(参见A列和B列的第2行)，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步更优选的实施方式中，融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:22960、22961、22963中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在进一步更优选的实施方式中，融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:22961中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在甚至更优选的实施方式中，选自或衍生自SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:10或341中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
根据优选的实施方式，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含下列：编码至少一种如上定义的衍生自SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的SARS-CoV-2抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体都可理解为是适合的编码序列，因此可包含在组分A的核酸中。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原性肽或蛋白质，优选编码SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一个的至少一个编码序列，或其片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)或其片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。关于所述氨基酸序列的其它信息也提供在表1(参见A列和B列的第1至41行)以及表3A和3B中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含编码序列，所述编码序列包括编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-147、148-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列中的任一个，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表1(参见C-F列的第1至7行、第9行、第11-41行)以及表3A和3B中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分A的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即SARS-CoV-2肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。
术语“参考编码序列”涉及这样的编码序列：其是待修饰和/或优化的原始序列。
在特别优选的实施方式中，核酸组分A的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:136-138、140-143、145-175、11731-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、14142-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的密码子修饰的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于这些适合的编码核酸序列中的每一个的其它信息也可源自序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情。第一方面的适合的编码序列在表1中提供。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表1(参见D-F列的第1至7行、第9行、第11-41行)以及表3A和3B中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:136-138、140、141、148、149、152、155、156、159、162、163、166、169、170、173、11731-11813、11815、11817-11966、12271-12472、12743-12944、13514、13515、14124-14132、14142-14150、14160-14168、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23040、23077-23148、23189-23260、23297-23368、23409-23480、23517-23588、23629-23700、23737-23808、23849-23920、23957-24028、24069-24140、24177-24248、24289-24360、24397-24468、24509-24580、24617-24688、24729-24800、24837-24908、24949-25020、25057-25128、25169-25240、25277-25348、25389-25460、25497-25568、25609-25680、25717-25788、25829-25900、25937-26008、26049-26120、26157-26228、26269-26340、26377-26448、26489-26560、26597-26668、26709-26780、26817-26888、26925-26937的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的G/C修饰的编码序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于这些适合的编码核酸序列中的每一个的其它信息也可源自序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情。第一方面的适合的编码序列在表1中提供。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表1(参见D列的第1至7行、第9行、第11-41行)以及表3A和3B中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:142、143、145、150、153、157、160、164、167、171、174、11967-12033、12473-12539、12945-13011的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的人类密码子使用适应的编码序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于这些适合的编码核酸序列中的每一个的其它信息也可源自序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情。第一方面的适合的编码序列在表1中提供。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表1(参见E列的第1至7行、第9行、第11-41行)以及表3A和3B中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:146、147、151、154、158、161、165、168、172、175、12034-12050、12052、12054-12203、12540-12675、13012-13147、13519、13520、14133-14141、14151-14159、14169-14177、23041-23076、23149-23184、23261-23296、23369-23404、23481-23516、23589-23624、23701-23736、23809-23844、23921-23956、24029-24064、24141-24176、24249-24284、24361-24396、24469-24504、24581-24616、24689-24724、24801-24836、24909-24944、25021-25056、25129-25164、25241-25276、25349-25384、25461-25496、25569-25604、25681-25716、25789-25824、25901-25936、26009-26044、26121-26156、26229-26264、26341-26376、26449-26484、26561-26596、26669-26704、26781-26816、26889-26924的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的G/C修饰的编码序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于这些适合的编码核酸序列中的每一个的其它信息也可源自序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情。第一方面的适合的编码序列在表1中提供。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表1(参见F列的第1至7行、第9行、第11-41行)以及表3A和3B中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在甚至更优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:136-138、142、143、146、147、11731、11798、11804、11805、11808、11810、11811、11812、12035、12049、22759-22785、22965-22982、23077-23094、23149的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的G/C修饰的编码序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于这些适合的编码核酸序列中的每一个的其它信息也可源自序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情。第一方面的适合的编码序列在表1中提供。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表1(参见F列的第1至7行、第9行、第11-41行)以及表3A和3B中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与根据SEQ ID NO:137的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的G/C修饰的编码序列，或其片段或变体。
在进一步特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与根据SEQ ID NO:23090、23091、23093、23094的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的G/C修饰的编码序列，或其片段或变体。
在进一步特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与根据SEQ ID NO:23091的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的G/C修饰的编码序列，或其片段或变体。
在进一步的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与根据SEQ ID NO:23113、23167的密码子修饰的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的G/C修饰的编码序列，或其片段或变体。
表3A(C列和D列)中提供了组分A(具体是组分A-1)的优选核酸序列，包括特别优选的mRNA序列。其中，每一行代表本发明具体的适合的SARS-CoV-2构建物(与表1比较)，其中SARS-CoV-2构建物的描述在表3A的A列中指示，而相应的SARS-CoV-2构建物的氨基酸序列的SEQ ID NO在B列中提供。表1中提供了编码相应的SARS-CoV-2构建物的编码序列的对应的SEQ ID NO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
C列和D列中提供了对应的核酸，优选编码RNA序列，具体是包括优选的编码序列的mRNA序列，其中C列提供了具有如本文定义的UTR组合“HSD17B4/PSMB3”的核酸序列，其中D列提供了具有如本文定义的“α-珠蛋白”3’UTR的核酸序列。
表3A：编码SARS-CoV-2抗原的核酸，优选mRNA构建物
Figure BDA0004113537810000481
/>
Figure BDA0004113537810000491
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Figure BDA0004113537810000501
/>
Figure BDA0004113537810000511
表3B中提供了本发明的进一步优选的核酸序列，优选mRNA序列。其中，每一列代表本发明具体的适合的SARS-CoV-2(nCoV-2019)构建物(与表1和表3B比较)，其中B列代表“全长刺突蛋白；S”，表1和表3A的第1行，而C列代表“稳定化刺突蛋白；S_stab_PP”，与表1和表3A的第2行比较。
第1行提供了相应的SARS-CoV-2构建物的氨基酸序列的SEQ ID NO。表1中提供了编码相应的SARS-CoV-2构建物的编码序列的对应的SEQ ID NO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
第2-16行中提供了对应的核酸序列，优选编码RNA序列，具体是包括优选的编码序列的mRNA序列，其中每一行提供了具有UTR组合和适合的3’端的核酸序列。
表3B：适用于冠状病毒疫苗的核酸，优选mRNA构建物
Figure BDA0004113537810000512
/>
Figure BDA0004113537810000521
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3A(具体参见C列和D列)和3B(具体参见第2-16行)中提供。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:162-175、12676-13147、14160-14177、22813-22839、23189-23404的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3A(具体参见D列)和3B(具体参见第2行)中提供。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:148-161、12204-12675、14142-14159、22786-22812、23409-23624、24729-24944的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3A(具体参见C列)和表3B(参见第3行、第7行)中提供。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:149-154、156-161、163-168、170-175、12338、12352、12541、12555、12810、12824、13013、13027、22786、22792、22794、22796、22798、22800、22802、22804、22806、22808、22810、22812、22813、22819、22821、22823、22825、22827、22829、22831、22833、22835、22837、22839、23517-23624、23297-23404、24837-24944的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3A(参见C列和D列，第2行和第6行)和表3B(参见C列)中提供。
在甚至更优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:149、156、12338、150、157、151、158、12541、163、170、12810、164、171、165、172、13013、12342-12351、12545-12554、12814-12823、13017-13026、14133的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ IDNO的<223>标识符下提供，并且在表3A和3B中提供。
在甚至更优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、选自SEQ ID NO:149、150、163、164、165、24837、23311、23531、24851、23310、23530、24850、23313、23533、24853、23314、23534、24854的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3中提供(参见C列和D列，第2行)。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、选自SEQ ID NO:163的核酸序列，或该序列的片段或变体。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、选自SEQ ID NO:149的核酸序列，或该序列的片段或变体。
在进一步特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:24837的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或该序列的片段或变体。
在进一步特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:23311、23531、24851的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在进一步优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:23310、23530、24850的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在进一步优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:23313、23533、24853、23314、23534、24854的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在进一步的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:26633或26907的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在进一步优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，其中所述RNA序列包含如本文定义的帽1结构。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3A和3B中提供。
在进一步实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，其中所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3A和3B中提供。
在进一步的实施方式中，组分A(具体是组分A-1)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，其中所述RNA序列包含如本文定义的帽1结构，并且其中所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表3A和3B中提供。
适用于组分A-1的核酸的适合的特征和实施方式在下文“核酸特征和实施方式”段落中提供。
适合地，组分A-1的核酸被配制和/或复合。适用于组分A的核酸复合或配制的适合的特征和实施方式在下文“配制和复合”段落中提供。
在实施方式中，组分A包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分A(具体是组分A-1)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样定义。
在实施方式中，组分A可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同SARS-CoV-2的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的SARS-CoV-2表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的SARS-CoV-2表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分A包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的SARS-CoV-2(例如，不同的SARS-CoV-2分离株)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的SARS-CoV-2”必须理解为至少两种相应的SARS-CoV-2(例如不同的SARS-CoV-2分离株)之间的差异，其中差异体现在相应不同的SARS-CoV-2的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的SARS-CoV-2可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在实施方式中，组分A-1包括2、3、4或5种核酸种类(例如DNA或RNA)，优选RNA种类，其中所述核酸种类包含下列或由下列组成：与选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列以及任选地，至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂，其中所述2、3、4或5种核酸种类中的每一种编码SARS-CoV-2冠状病毒的不同的抗原性肽或蛋白质。
因此，在实施方式中，组分A-1包括两种核酸种类(例如DNA或RNA)，优选RNA种类，其中所述核酸种类包含下列或由下列组成：与选自SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列以及任选地，至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂，其中所述两种核酸种类中的每一种编码SARS-CoV-2冠状病毒的不同的抗原性肽或蛋白质。
在实施方式中，组分A-1包括三种核酸种类(例如DNA或RNA)，优选RNA种类，其中所述核酸包含下列或由下列组成：与选自148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列以及任选地，至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂，其中所述2、3、4或5种核酸种类中的每一种编码SARS-CoV-2冠状病毒的不同的抗原性肽或蛋白质。
优选地，组分A-1的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类各自编码不同的融合前稳定化刺突蛋白(如第一方面中定义的)。优选地，通过在刺突蛋白的残基K986和V987(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)处引入两个连续的脯氨酸取代来获得融合前构象的稳定化。因此，在优选的实施方式中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种融合前稳定化刺突蛋白(S stab)各自包含至少一个融合前稳定化突变，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括以下氨基酸取代：K986P和V987P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
适合地，不同的刺突蛋白或融合前稳定化刺突蛋白至少衍生自B.1.1.7、B.1.351、P.1或CAL.20C。
适合地，不同的刺突蛋白或融合前稳定化刺突蛋白在S蛋白中具有氨基酸变化，包括：
(i)delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V和M1229I；
(ii)delH69、delV70、delY144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H；
(iii)L18F、D80A、D215G、delL242、delA243、delL244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V；
(iv)L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y和T1027I；和/或
(v)S13I、W152C、L452R和D614G。
因此，组分A-1的所述至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类各自编码不同的融合前稳定化刺突蛋白，其中所述2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种稳定化刺突蛋白选自与SEQ ID NO:10-26、341-407、609-1278、13521-13587、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，组分A-1包含2、3、4或5种核酸种类，这些核酸种类包含编码与SEQ ID NO:10、22961；22960、22963、22941、22964中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的编码序列。
在优选的实施方式中，组分A-1包含一种核酸种类，所述核酸种类包含编码与SEQID NO:10中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的编码序列，其中多价组合物另外包含选自下列的至少2、3、4种其它的RNA种类
i)一种核酸种类，其包含编码与SEQ ID NO:22961中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的编码序列；和/或
ii)一种核酸种类，其包含编码与SEQ ID NO:22960中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的编码序列；和/或
iii)一种核酸种类，其包含编码与SEQ ID NO:22963中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的编码序列；和/或
iv)一种核酸种类，其包含编码与SEQ ID NO:22941中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的编码序列；和/或
v)一种核酸种类，其包含编码与SEQ ID NO:22964中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的编码序列。
优选地，组分A的所述至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类包含核酸编码序列，所述核酸编码序列各自编码不同的融合前稳定化刺突蛋白，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或甚至更多个核酸编码序列选自与SEQ ID NO:136-138、140-143、145-175、11731-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些中任意者的片段或变体。
在优选的实施方式中，组分A-1包含一种核酸种类，所述核酸种类包含与SEQ IDNO:137中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列，其中多价组合物另外包含选自下列的至少2、3、4种其它的RNA种类
i)一种核酸种类，其包含与SEQ ID NO:23091中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
ii)一种核酸种类，其包含与SEQ ID NO:23090中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
iii)一种核酸种类，其包含与SEQ ID NO:23093中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
iv)一种核酸种类，其包含与SEQ ID NO:22999中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
v)一种核酸种类，其包含与SEQ ID NO:23094中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列。
优选地，组分A-1的所述至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类包含核酸编码序列，所述核酸编码序列各自编码不同的融合前稳定化刺突蛋白，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种核酸编码序列选自与SEQ ID NO:149-151、163-165、12338、12541、12810-12813、12901、12931、13013、22792、22794、22796、22798、22802、22804、22806、22810、22813、22819、22821、22823、22825、22827、22829、22831、22833、22835、22837、22839、23297-23314、23369、23517-23520、23523-23525、23527、23529、23530、23589、23737、23957、24397、24837、25057、25277、25717、26925-26937中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列，或这些中任意者的片段或变体。
在优选的实施方式中，组分A-1包含一种RNA种类，所述RNA种类包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:163中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列，其中多价组合物另外包含选自下列的至少2、3、4种其它的RNA种类
i)一种RNA种类，其包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:23311中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列；和/或
ii)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23310中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
iii)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23313中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
iv)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23219中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
v)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23314中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；
其中，优选地，这些mRNA种类中的每一种包含帽1结构，并且任选地，这些mRNA种类中的每一种不包含修饰的核苷酸。
在优选的实施方式中，组分A-1包含一种RNA种类，所述RNA种类包含与SEQ ID NO:149或24837中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列或由其组成，其中多价组合物另外包含选自下列的至少2、3、4种其它的RNA种类
i)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23531或24851中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列或由其组成；和/或
ii)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23530或24850中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
iii)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23533或24853中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
iv)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23439或24759中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；和/或
v)一种RNA种类，其包含与SEQ ID NO:23534或24854中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的编码序列；
其中，优选地，这些mRNA种类中的每一种包含帽1结构，并且任选地，这些mRNA种类中的每一种不包含修饰的核苷酸。
在进一步优选的实施方式中，组分A-1包含与SEQ ID NO:149或24837、23531或24851、23530或24850、23533或24853、23439或24759或23534或24854中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少两种RNA种类。
在优选的实施方式中，组分A-1包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分A优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分A-1的肌内或皮内施用导致经编码的SARS-CoV-2抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分A的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的SARS-CoV-2抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的SARS-CoV-2抗原。
在实施方式中，向对象施用包含组分A-1的药物组合物引发针对SARS-CoV-2的中和抗体而不引发疾病增强抗体。具体地，将包含编码SARS-CoV-2融合前稳定化刺突蛋白的组分A-1的药物组合物向对象施用不引发免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
在优选的实施方式中，组分A-1的施用引发针对由组分A-1的至少一种核酸提供的经编码的SARS-CoV-2抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答，。
优选地，组分A-1适用于疫苗，具体地，适用于SARS-CoV-2疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分A-1中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分A-1包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
下面，以项目列表的形式提供组分A1的优选实施方式(参见下文)。
项目1：组分A-1涉及组合物，其包含mRNA，所述mRNA包含：
(a)至少一个编码序列，其编码与SEQ ID NO:10、341、22960、22961、22963，优选SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的SARS-CoV-2刺突蛋白(S)，即包含至少一个融合前稳定化突变的融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)；
(b)至少一个异源非翻译区(UTR)；和
(c)至少一种药学上可接受的载剂，
其中所述mRNA与脂质纳米颗粒(LNP)复合或缔合，并且其中所述LNP包含：
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物；和
(iv)至少一种PEG-脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇和0.5-15％PEG-脂质。
项目2：项目1的组分A-1，其中所述mRNA包含至少一个聚(A)序列，优选包含30至200个腺苷核苷酸和/或至少一个聚(C)序列，优选包含10至40个胞嘧啶核苷酸。
项目3：项目1或2的组分A-1，其中所述mRNA包含5’-帽结构，优选m7G、帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构。
项目4：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述S蛋白包含融合前稳定化K986P和V987P突变。
项目5：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中所述至少一个密码子修饰的编码序列选自C最大化编码序列、CAI最大化编码序列、人类密码子使用适应的编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列，或其任意组合。
项目6：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述至少一个编码序列的G/C含量与对应的野生型或参考核酸序列的编码序列的G/C含量相比增加了至少10％、20％或30％。
项目7：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述至少一个编码序列具有至少约50％、55％或60％，优选约63.9％的G/C含量。
项目8：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:149、163、24837、26633、26907，优选SEQ ID NO:163具有至少90％同一性的序列。
项目9：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述至少一个异源非翻译区选自至少一个异源5’-UTR和/或至少一个异源3’-UTR。
项目10：项目9的组分A-1，其中所述至少一个异源3’-UTR包含下列或由下列组成：衍生自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白(称为“muag”)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR，或衍生自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的核酸序列。
项目11：项目9的组分A-1，其中所述至少一个异源5’-UTR包含下列或由下列组成：衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5’-UTR，或衍生自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的核酸序列。
项目12：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述核酸包含至少一个组蛋白茎环。
项目13：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述mRNA包括核苷酸类似物。
项目14：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述mRNA不包含1-甲基假尿苷取代。
项目15：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述mRNA具有至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，最优选至少约80％的RNA完整性。
项目16：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述mRNA是已通过RP-HPLC和/或TFF纯化的经纯化的mRNA。
项目17：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述mRNA是已通过RP-HPLC和/或TFF纯化的经纯化mRNA，并且包含少达约5％、10％或20％的双链RNA副产物作为尚未经RP-HPLC和/或TFF纯化的RNA。
项目18：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述LNP包含根据式III的阳离子脂质：
Figure BDA0004113537810000621
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：L1或L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，优选L1或L2是O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基或C3-C8环亚烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；并且
x是0、1或2。
项目19：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述LNP包含根据式III-3的阳离子脂质：
Figure BDA0004113537810000631
项目20：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述LNP包含根据式IVa的PEG脂质：
Figure BDA0004113537810000632
项目21：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述LNP包含：
(i)至少一种根据式(III-3)的阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质，包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种固醇，包括胆固醇；和
(iv)至少一种根据式(IVa)的PEG-脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇和0.5-15％ PEG-脂质。
项目22：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述mRNA的至少70％、75％、80％、85％、90％或95％在约5℃的温度下作为液体储存后至少约两周是完好的。
项目23：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述组合物包含少于约20％的游离RNA，优选少于约15％的游离RNA，更优选少于约10％的游离RNA。
项目24：前述项目中任一项的组分A-1，其中所述LNP的平均直径为约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm至200nm。
项目25：前述项目中任一项的组分A-1，其中组分A-1适用于治疗或预防COVID-19。
项目26：前述项目中任一项的组分A-1，其中(在施用后)组分A-1在所述对象中诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体。
项目27：前述项目中任一项的组分A-1，其中(在施用后)组分A-1刺激抗体应答，所述抗体应答针对每个冠状病毒中和抗体产生约10个与约300个之间；约20个与约300个之间；约20个与约200个之间；或约30个与约100个之间的冠状病毒刺突蛋白结合抗体。
项目27：前述项目中任一项的组分A-1，其中(在施用后)组分A-1在所述对象中刺激免疫应答，保护所述对象免受COVID-19。
组分A-2：SARS相关病毒
在特别优选的实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒是SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1病毒(也称为组分A-2)。
因此，在第一方面的实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
必须理解，在“组分A”段落中描述的一般实施方式和特征也可适用于编码SARS-CoV-1抗原性肽或蛋白质的核酸。
SARS-CoV相关病毒属于冠状病毒科，具体是属于正冠状病毒，更具体是属于β冠状病毒属。SARS-CoV-1(严重急性呼吸系统综合症冠状病毒、SARS-冠状病毒、SCV)会引起严重呼吸综合症病(SARS)。示例性SARS-CoV-1冠状病毒可通过NCBI分类法ID:694009，NCBI参考：DQ182595.1识别。
在本发明上下文中其它适合的SARS相关病毒是SARS-CoV/Tor2、HCoV/OC43、HCoV/HKU1/N5、HCoV/229E/BN1/GER/2015、HCoV/NL63/RPTEC/2004、蝙蝠SARS样CoV/WIV1、BatCoV/HKU9-1 BF_005I、PDCoV/猪/泰国/S5011/2015、PEDV/NPL-PEDv/2013/P10、PEDV/NPL-PEDv/2013/P10或MHV/S。
在本发明的上下文中，选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的任何蛋白质都可用在本发明的上下文中并且可由组分A(具体地，组分A-2)的编码序列或核酸适合地编码。进一步在基础发明的范围内，所述至少一种抗原性肽或蛋白质可包括合成上改造的或人工SARS-CoV-1肽或蛋白质，或由其组成。术语“合成上改造的”SARS-CoV-1肽或蛋白质，或术语“人工冠状病毒肽或蛋白质”涉及在自然界中不存在的蛋白质。因此，与天然SARS-CoV-1肽或蛋白质相比，“人工冠状病毒肽或蛋白质”或“合成上改造的冠状病毒肽或蛋白质”可例如在至少一个氨基酸上不同，和/或可包含另外的肽或蛋白质元件，和/或可以是N端或C端延伸或截短的。
在优选的实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括选自或衍生自结构蛋白、辅助蛋白或复制酶蛋白的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，结构蛋白选自或衍生自刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核衣壳蛋白(N)，或这些中任意者的免疫原性片段或变体。
在药物组合物的特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白(S、S1、S2或S1和S2)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
由组分A(具体是组分A-2)的核酸提供的适合的抗原性肽或蛋白质序列公开于表4中，第1至45行，A列和B列。此外，关于选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的所述适合的抗原性肽或蛋白质序列的其它信息在ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在下文中，详细描述了由组分A的核酸提供的选自或衍生自SARS-CoV-1的优选抗原性肽或蛋白质序列。
必须注意的是，衍生自不同SARS分离株的刺突蛋白之间天然地会发生氨基酸水平的变异。在本发明的上下文中，此类氨基酸变异可应用于如本文所述的衍生自SARS相关病毒或SARS-CoV-1刺突蛋白的每一种抗原性肽或蛋白质。
在实施方式中，SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白(S)的片段可由组分A的核酸编码，其中所述片段可以是N端截短的，和/或其中所述片段可以是C端截短的。此类“刺突蛋白(S)的片段”可另外包含氨基酸取代(如下所述)并且可另外包含至少一种异源肽或蛋白质元件(如下所述)。
在实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白(S)，其中刺突蛋白(S)缺少跨膜结构域(TM)。不希望受理论的束缚，如本文定义的缺少跨膜结构域(TM)的SARS-CoV-1刺突蛋白(S)可适用于组合疫苗，因为这种蛋白质将是可溶的，而不是锚定在细胞膜中。因此，可溶性蛋白质在施用于对象后可以以更高浓度产生(即翻译)，从而导致改善的免疫应答。
不希望受理论的束缚，RBD结构域和CND结构域对SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白(S)的免疫原性可以说是至关重要的。这两个区域都位于刺突蛋白的S1片段。因此，在本发明的上下文中可能适合的是，抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：刺突蛋白的S1片段，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的S1片段可至少包括如上定义的RBD结构域和/或CND结构域。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白(S)或由其组成，其中刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白片段S1，并且缺少至少70％、80％、90％、优选100％的刺突蛋白片段S2。这样的实施方式可以是有益的，因为SARS-CoV-1S1片段包含中和表位而不存在包含S1和S2的全长蛋白的潜在问题。
不希望受理论的束缚，组分A(具体是组分A-2)的抗原性肽或蛋白质包括SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白片段S1和SARS-CoV-1刺突蛋白片段S2(的至少一个片段)或由其组成可以是适合的，因为可以促进免疫原性刺突蛋白的形成。
因此，在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白(S)或由其组成，其中刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体；和刺突蛋白片段S2，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：全长SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-2)的核酸提供的SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白(S)被设计或改编以使抗原稳定在融合前构象中。融合前构象在有效的SARS-CoV-1疫苗的上下文中特别有利，因为中和抗体的几个潜在表位可能仅在所述融合前蛋白质构象下才可接近。此外，使该蛋白质保持在融合前构象下旨在避免免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
因此，在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质选自或衍生自刺突蛋白(S)，其中刺突蛋白(S)是融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)。适合地，所述融合前稳定化刺突蛋白包含至少一个融合前稳定化突变。
SARS-CoV-1刺突蛋白的稳定化可通过将K968和/或V969位的至少一个氨基酸取代为使刺突蛋白稳定在融合前构象中的氨基酸来获得(根据参考SEQ ID NO:14906的氨基酸位置)。
在实施方式中，SARS-CoV-1刺突蛋白的融合前稳定化突变包括在K968位处的氨基酸取代，其中氨基酸K968被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:14906的氨基酸位置)，优选其中氨基酸K968被P取代。在实施方式中，融合前稳定化突变包括在V969位处的氨基酸取代，其中氨基酸V969被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:14906的氨基酸位置)，优选其中氨基酸V969被P取代。
因此，在优选的实施方式中，SARS-CoV-1的融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)包括至少一个融合前稳定化突变，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括以下氨基酸取代：K968P和V969P(根据参考SEQ ID NO:14906的氨基酸位置)。
技术人员可选择任何SARS相关病毒蛋白质或其片段或变体来引入此类氨基酸变化(例如，此类双脯氨酸突变)。实例包括HCoV/OC43刺突蛋白(1-1353)(A1070P_L1071P)、HCoV/OC43/1783A_10刺突蛋白(1-1362)(A1079P_L1080P)、HCoV/HKU1/N5刺突蛋白(1-1351)(N1067P_L1068P)、HCoV/229E/BN1/GER/2015刺突蛋白(1-1171)(I869P_I870P)、HCoV/NL63/RPTEC/2004刺突蛋白(1-1356)(S1052P_I1053P)、蝙蝠SARS样CoV/WIV1刺突蛋白(1-1256)(K969P_V970P)、BatCoV/HKU9-1 BF_005I刺突蛋白(1-1274)(G983P_L984P)、PDCoV/猪/泰国/S5011/2015刺突蛋白(1-1160)((E855P_V856P)、PEDV/NPL-PEDv/2013/P10刺突蛋白(1-1386)(I1076P_L1077P)、MHV/S刺突蛋白(1-1361)(A1073P_L1074P)。
在实施方式中，SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括空腔填充突变。
在实施方式中，SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括突变的质子化位点。
在实施方式中，SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括人工分子内二硫键。可引入这种人工分子内二硫键以进一步使S蛋白的膜远端部分(包括N端区域)稳定在融合前构象中；即，稳定在特异性结合一种或多种融合前特异性抗体，和/或呈递适合的抗原位点——其存在于S蛋白的融合前构象上，但不存在于融合后构象中——的构象中。
技术人员可选择任何SARS相关病毒，优选SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1S蛋白或其片段或变体，以引入至少一个空腔填充突变、至少一个突变的质子化位点和/或至少一个人工分子内二硫键。
根据各种优选的实施方式，组分A(具体是组分A-2)的核酸编码至少一种如本文定义的选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质和另外地至少一种异源肽或蛋白质元件，优选选自或衍生自信号肽、连接体、辅助表位、抗原聚集元件、三聚化元件、跨膜元件和/或VLP形成序列。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善经编码的抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件)，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分A(具体是组分A-2)的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的编码至少一种如本文定义的选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的抗原性蛋白质的核酸另外地编码至少一种如本文定义的异源三聚化元件、如本文定义的抗原聚集元件或如本文定义的VLP形成序列。
抗原聚集元件可选自如本文定义的铁蛋白元件或如本文定义的二氧四氢喋啶合酶元件、如本文定义的乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或如本文定义的胶囊蛋白。在组分A(具体是组分A-2)的编码序列另外地编码异源抗原聚集元件的一些实施方式中，特别优选和适合产生包含抗原聚集元件和衍生自SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选SARS-CoV-1刺突蛋白，缺少C端跨膜结构域(TM)或部分TM。此外，使用如本文定义的连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的。
三聚化元件可选自如本文定义的折叠子元件。在优选的实施方式中，折叠子元件是如本文定义的纤维蛋白折叠子元件。在组分A(具体是组分A-2)的核酸的编码序列另外地编码异源三聚化元件的实施方式中，特别优选和适合产生包含三聚化元件和衍生自SARS相关病毒，优选是SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自SARS相关病毒，优选是SARS-CoV-1的刺突蛋白，其缺少C端跨膜结构域或部分TM。此外，使用如本文定义的连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的。
可选择VLP形成序列并将其融合于SARS相关病毒，优选如本文定义的SARS-CoV-1抗原。适合的VLP形成序列可选自衍生自如本文定义的乙型肝炎病毒核心抗原、如本文定义的HIV-1Gag蛋白或如本文定义的土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)的元件。在组分A(具体是组分A-2)的核酸的编码序列另外地编码异源VLP形成序列的实施方式中，特别优选和适合产生包含VLP形成序列和衍生自SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自SARS-CoV-1的刺突蛋白，其缺少C端跨膜结构域(TM)或部分TM。此外，使用如本文定义的连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的。
在实施方式中，抗原性肽或蛋白质包括如上定义的异源信号肽。异源信号肽可用于改善编码的SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1抗原的分泌。在组分A(具体是组分A-2)的核酸的编码序列另外地编码异源分泌信号肽的实施方式中，特别优选和适合产生包含异源分泌信号肽和衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的刺突蛋白缺少N端内源性分泌信号肽。
表4(第1至45行)提供了优选的如上定义的选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质。其中，第1至45行中每一行与适合的SARS-CoV-1构建物或SARS相关病毒构建物对应。表4的A列提供了对适合的抗原构建物的简短描述。表4的B列提供了各个抗原构建物的蛋白质(氨基酸)SEQ ID NO。表4的D列提供了对应的G/C优化的核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ ID NO。表4的E列提供了对应的人类密码子使用适应的核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ ID NO。
值得注意的是，本发明的描述明确包括在本申请的ST.25序列表的<223>标识符下提供的信息。优选的包含表4的编码序列的核酸构建物，例如包含表4的编码序列的mRNA序列提供在表5中。
表4：SARS-CoV-1和SARS相关构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)：
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Figure BDA0004113537810000701
在优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14906-14950中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表4中提供(参见A列和B列的第1至45行)，并且在相应序列SEQID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步的实施方式中，由组分A(具体是组分A-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2017070626的SEQ ID NO:29、32或34中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。WO2017070626的SEQ ID NO:29、32或34，以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在进一步的实施方式中，由组分A(具体是组分A-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2018081318的SEQ ID NO:7或30中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。WO2018081318的SEQ ID NO:7或30，以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
选自或衍生自SARS-CoV-1的其它适合的抗原性肽或蛋白质可选自或衍生自WO2017070626的表12。因此，WO2017070626的表12的全部内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质(融合前稳定化刺突蛋白(S_stab))包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14907、14910、14914、14916、14920、14924、14928、14932、14936、14940、14944、14948中的至少一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表4中提供，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
根据优选的实施方式，组分A(具体是组分A-2)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如上定义的衍生自SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体都可理解为是适合的编码序列，因此可包含在组分A的核酸中。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自SARS相关病毒的抗原性肽或蛋白质，优选编码SEQID NO:14906-14950；WO2018115527的SEQ ID NO:1-152、1448-1548；WO2017070626的SEQID NO:29、32或34；WO2018081318的SEQ ID NO:7或30中的任一个的至少一个编码序列，或其片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与SEQ ID NO:14906-14950；WO2018115527的SEQ ID NO:1-152、1448-1548；WO2017070626的SEQ ID NO:29、32或34；WO2018081318的SEQ ID NO:7或30中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或其片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。关于所述氨基酸序列的其它信息也提供在表4(参见A列和B列的第1至45行)、表5中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的核酸包含下列：包括编码SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1抗原的、与选自SEQ ID NO:14951-15220的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列中的任一个的编码序列，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表4(参见第1至45行)、表5中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即SARS相关病毒肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。
在特别优选的实施方式中，核酸组分A(具体是组分A-2)的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
表5中提供了组分A(具体是组分A-2)的优选核酸序列，包括特别优选的mRNA序列。其中，每一行代表本发明具体的适合的SARS相关病毒构建物(与表4比较)，其中SARS相关病毒构建物的描述在表5的A列中指示，而相应的SARS相关病毒构建物的氨基酸序列的SEQ IDNO在B列中提供。表4中提供了编码相应的SARS相关病毒构建物的编码序列的对应的SEQ IDNO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
表5：编码SARS相关或SARS-CoV-1抗原的核酸，优选mRNA构建物
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在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-2)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码SARS相关病毒抗原的、与选自SEQ ID NO:15041-15220的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表5(具体参见C列和D列)中提供。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，并且其中所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
适用于组分A-2的核酸的适合的特征和实施方式在下文“核酸特征和实施方式”段落中提供。
适合地，组分A-2的核酸被配制和/或复合。适用于组分A的核酸复合或配制的适合的特征和实施方式在下文“配制和复合”段落中提供。
在实施方式中，组分A(具体是组分A-2)包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分A(具体是组分A-2)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样定义。
在实施方式中，组分A(具体是组分A-2)可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同SARS相关病毒的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的SARS相关病毒表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的SARS相关病毒表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分A(具体是组分A-2)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的SARS相关病毒(例如，不同的SARS相关病毒分离株)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的SARS相关病毒”必须理解为至少两种相应的SARS相关病毒(例如不同的SARS相关病毒分离株)之间的差异，其中差异体现在相应不同的SARS相关病毒的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的SARS相关病毒可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分A-2包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分A-2优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分A-2的肌内或皮内施用导致经编码的SARS相关病毒抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分A-2的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的SARS相关病毒抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的SARS相关病毒抗原。
在实施方式中，向对象施用包含组分A-2的药物组合物引发针对SARS相关病毒的中和抗体而不引发疾病增强抗体。具体地，将包含编码SARS相关病毒融合前稳定化刺突蛋白的组分A-2的药物组合物向对象施用不引发免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
在优选的实施方式中，组分A-2的施用引发针对由组分A-2的至少一种核酸提供的经编码的SARS相关病毒抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分A-2适用于疫苗，具体地，适用于SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分A-2中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分A-2包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
组分A-3：MERS-CoV
在特别优选的实施方式中，组分A的至少一种冠状病毒是MERS-CoV病毒(也称为组分A-3)。
因此，在第一方面的实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
必须理解“组分A”段落中描述的一般实施方式和特征也可适用于编码MERS-CoV抗原性肽或蛋白质的核酸。
MERS-CoV属于冠状病毒科，具体是属于正冠状病毒，更具体是属于β冠状病毒。MERS-CoV(中东呼吸综合征冠状病毒、MERS-冠状病毒、EMC/2012(HCoV-EMC/2012))会引起严重呼吸综合症病。示例性MERS-CoV冠状病毒可通过NCBI分类法ID:1335626，NCBI参考：NC_038294.1识别。适合的MERS-CoV毒株/分离株可选自MERS-CoV/MERS-CoV-吉达-人类-1、MERS-CoV/Al-哈萨_4_2013、MERS-CoV/利雅得_14_2013、MERS-CoV/利雅得_14_2013、MERS-CoV/利雅得_14_2013刺突蛋白、MERS-CoV/英格兰1刺突蛋白、MERS-CoV/英格兰1刺突蛋白(变体)。
在本发明的上下文中，任何选自或衍生自MERS-CoV的蛋白质都可用于本发明的上下文中，并且可适合由组分A(具体是组分A-3)的编码序列或核酸编码。进一步在基础发明的范围内，所述至少一种抗原性肽或蛋白质可包括下列或由下列组成：合成上改造的或人工MERS-CoV肽或蛋白质。术语“合成上改造的”MERS-CoV肽或蛋白质，或术语“人工冠状病毒肽或蛋白质”涉及在自然界中不存在的蛋白质。因此，与天然MERS-CoV肽或蛋白质相比，“人工冠状病毒肽或蛋白质”或“合成上改造的冠状病毒肽或蛋白质”可例如在至少一个氨基酸上不同，和/或可包含另外的异源肽或蛋白质元件，和/或可以是N端或C端延伸或截短的。
在优选的实施方式中，组分A的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括选自或衍生自结构蛋白、辅助蛋白或复制酶蛋白的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，结构蛋白选自或衍生自刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核衣壳蛋白(N)，或这些中任意者的免疫原性片段或变体。
在药物组合物的特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自MERS-CoV刺突蛋白(S、S1、S2或S1和S2)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
由组分A(具体是组分A-3)的核酸提供的适合的抗原性肽或蛋白质序列公开于表6，第1至16行，A列和B列。此外，关于选自或衍生自MERS-CoV的所述适合的抗原性肽或蛋白质序列的其它信息在ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在下文中，详细描述了由组分A的核酸提供的选自或衍生自MERS-CoV的优选抗原性肽或蛋白质序列。
必须注意的是，衍生自不同MERS-CoV分离株的刺突蛋白之间天然地会发生氨基酸水平的变异。在本发明的上下文中，此类氨基酸变异可应用于如本文所述的衍生自MERS-CoV刺突蛋白的每一种抗原性肽或蛋白质。
在实施方式中，MERS-CoV刺突蛋白(S)的片段可由组分A的核酸编码，其中所述片段可以是N端截短的，和/或其中所述片段可以是C端截短的。此类“刺突蛋白(S)的片段”可另外包含氨基酸取代(如下所述)并且可另外包含至少一种异源肽或蛋白质元件(如下所述)。
在实施方式中，组分A的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：MERS-CoV刺突蛋白(S)，其中刺突蛋白(S)缺少跨膜结构域(TM)。不希望受理论的束缚，如本文定义的缺少跨膜结构域(TM)的MERS-CoV刺突蛋白(S)可适用于组合疫苗，因为这种蛋白质将是可溶的，而不是锚定在细胞膜中。因此，可溶性蛋白质在施用于对象后可以以更高浓度产生(即翻译)，从而导致改善的免疫应答。
不希望受理论的束缚，RBD结构域和CND结构域对MERS-CoV刺突蛋白(S)的免疫原性可以说是至关重要的。这两个区域都位于刺突蛋白的S1片段。因此，在本发明的上下文中可能适合的是，抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：刺突蛋白的S1片段，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，MERS-CoV的S1片段可至少包括如上定义的RBD结构域和/或CND结构域。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括MERS-CoV刺突蛋白(S)或由其组成，其中MERS-CoV刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括MERS-CoV刺突蛋白片段S1，并且缺少至少70％、80％、90％、优选100％的刺突蛋白片段S2。这样的实施方式可以是有益的，因为MERS-CoV S1片段包含中和表位而不存在包含S1和S2的全长蛋白的潜在问题。
不希望受理论的束缚，组分A(具体是组分A-3)的抗原性肽或蛋白质包括MERS-CoV刺突蛋白片段S1和MERS-CoV刺突蛋白片段S2(的至少一个片段)或由其组成可以是适合的，因为可以促进免疫原性MERS-CoV刺突蛋白的形成。
因此，在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括MERS-CoV刺突蛋白(S)或由其组成，其中MERS-CoV刺突蛋白(S)包括下列或由下列组成：MERS-CoV刺突蛋白片段S1，或其免疫原性片段或免疫原性变体；和MERS-CoV刺突蛋白片段S2，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的经编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：全长MERS-CoV刺突蛋白，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-3)的核酸提供的MERS-CoV刺突蛋白(S)被设计或改编以使抗原稳定在融合前构象中。融合前构象在有效的MERS-CoV疫苗的上下文中特别有利，因为中和抗体的几个潜在表位可能仅在所述融合前蛋白质构象下才可接近。此外，使该蛋白质保持在融合前构象下旨在避免免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
因此，在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质选自或衍生自刺突蛋白(S)，其中刺突蛋白(S)是融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)。适合地，所述融合前稳定化刺突蛋白包含至少一个融合前稳定化突变。
MERS-CoV刺突蛋白的稳定化可通过将V1060和/或L1061位的至少一个氨基酸取代为使刺突蛋白稳定在融合前构象中的氨基酸来获得(根据参考SEQ ID NO:14794的氨基酸位置)。
在实施方式中，MERS-CoV刺突蛋白的融合前稳定化突变包括在V1060位处的氨基酸取代，其中氨基酸V1060被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:14794的氨基酸位置)，优选其中氨基酸V1060被P取代。在实施方式中，融合前稳定化突变包括在L1061位处的氨基酸取代，其中氨基酸L1061被选自A、I、L、M、F、V、G或P的氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:14794的氨基酸位置)，优选其中氨基酸L1061被P取代。
因此，在优选的实施方式中，MERS-CoV的融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)包括至少一个融合前稳定化突变，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括以下氨基酸取代：V1060P和L1061P(根据参考SEQ ID NO:14794的氨基酸位置)。
技术人员可选择任何MERS-CoV刺突蛋白或其片段或变体来引入此类氨基酸变化，优选氨基取代：V1060P和L1061P(根据参考SEQ ID NO:14794的氨基酸位置)。
技术人员可选择任何MERS-CoV刺突蛋白或其片段或变体来引入此类氨基酸变化(例如，此类双脯氨酸突变)。实例包括MERS-CoV/MERS-CoV-吉达-人类-1刺突蛋白(1-1353)(V1060P_L1061P)、MERS-CoV/Al-哈萨_4_2013刺突蛋白(1-1353)(V1060P_L1061P)、MERS-CoV/利雅得_14_2013刺突蛋白(1-1353)(V1060P_L1061P)、MERS-CoV/英格兰1刺突蛋白(1-1353)(V1060P_L1061P)。
在实施方式中MERS-CoV刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括空腔填充突变。
在一些实施方式中，用于稳定MERS-CoVS胞外域融合前构象的空腔填充取代可选自下列氨基酸取代：N1072F和A1083I；N1072F和L1086F；N1072F和V1087I；N1072F和E1090I；T1076F和A1083I；T1076F和L1086F；T1076F和V1087I；T1076F和El 0901；T1076I和A1083I；T1076I和L1086F；T1076I和V1087I；T1076I和E10901；A1018V；或A1018I。
在实施方式中，MERS-CoV刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括突变的质子化位点(R1020Q)。
在实施方式中，MERS-CoV刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括重新包装(repacking)取代，以使S胞外域稳定在融合前构象中，诸如下列之一：E793M和K1102F；E793M、K1102F和H1138F；D1068M和R1069W；A1083L；A1083L和V1087I；A1083L、V1087和E1090L；A834L和Q1084M；Q1066M；S454F；R921W；S612F和G1052F；或P476V、T477A和R1057W。
在实施方式中，MERS-CoV刺突蛋白的所述至少一个融合前稳定化突变包括人工分子内二硫键。可引入这种人工分子内二硫键以进一步使MERS-CoV刺突蛋白的膜远端部分(包括N端区域)稳定在融合前构象中；即，稳定在特异性结合一种或多种融合前特异性抗体，和/或呈递适合的抗原位点——其存在于MERS-CoV刺突蛋白的融合前构象上，但不存在于融合后构象中——的构象中。
在一些实施方式中，使MERS-CoV S胞外域稳定在融合前构象中的二硫键取代可选自下列氨基酸取代：T63C和V631C；T63C和Q638C；Q733C和D940C；S676C和D910C；V1087C(与天然序列中存在的半胱氨酸形成二硫键)；A432C和L1058C；或A432C和D1059C，从而使S胞外域稳定在融合前构象中。
技术人员可选择任何MERS-CoV刺突蛋白或其片段或变体，以引入至少一个空腔填充突变、至少一个突变的质子化位点和/或至少一个人工分子内二硫键。
根据各种优选的实施方式，组分A(具体是组分A-3)的核酸编码至少一种如本文定义的选自或衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质和另外地至少一种异源肽或蛋白质元件，优选选自或衍生自信号肽、连接体、辅助表位、抗原聚集元件、三聚化元件、跨膜元件和/或VLP形成序列。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善经编码的MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件)，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分A(具体是组分A-3)的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的编码至少一种如本文定义的选自或衍生自MERS-CoV的抗原性蛋白质的核酸另外地编码至少一种如本文定义的异源三聚化元件、如本文定义的抗原聚集元件或如本文定义的VLP形成序列。
抗原聚集元件可选自如本文定义的铁蛋白元件或如本文定义的二氧四氢喋啶合酶元件、如本文定义的乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或如本文定义的胶囊蛋白。在组分A(具体是组分A-3)的编码序列另外地编码异源抗原聚集元件的实施方式中，特别优选和适合产生包含抗原聚集元件和衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选MERS-CoV刺突蛋白，缺少C端跨膜结构域(TM)或部分TM。此外，使用如本文定义的连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的。
三聚化元件可选自如本文定义的折叠子元件。在优选的实施方式中，折叠子元件是如本文定义的纤维蛋白折叠子元件。在组分A(具体是组分A-3)的核酸的编码序列另外地编码异源三聚化元件的实施方式中，特别优选和适合产生包含三聚化元件和衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自MERS-CoV的刺突蛋白，其缺少C端跨膜结构域或部分TM。此外，使用如本文定义的连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的。
可选择VLP形成序列并将其融合于如本文定义的MERS-CoV抗原。适合的VLP形成序列可选自衍生自如本文定义的乙型肝炎病毒核心抗原、如本文定义的HIV-1Gag蛋白或如本文定义的土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)的元件。在组分A(具体是组分A-3)的核酸的编码序列另外地编码异源VLP形成序列的实施方式中，特别优选和适合产生包含VLP形成序列和衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自MERS-CoV的刺突蛋白，其缺少C端跨膜结构域(TM)或部分TM。此外，使用如本文定义的连接体元件将异源抗原聚集元件与抗原性肽或蛋白质隔开可以是适合的。
在实施方式中，抗原性肽或蛋白质包括如上定义的异源信号肽。异源信号肽可用于改善编码的MERS-CoV抗原的分泌。在组分A(具体是组分A-3)的核酸的编码序列另外地编码异源分泌信号肽的实施方式中，特别优选和适合产生包含异源分泌信号肽和衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质的融合蛋白。适合地，所述抗原性肽或蛋白质，优选衍生自MERS-CoV的刺突蛋白缺少N端内源性分泌信号肽。
表6(第1至16行)提供了优选的如上定义的选自或衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质。其中，第1至16行中每一行与适合的MERS-CoV构建物对应。表6的A列提供了对适合的MERS-CoV抗原构建物的简短描述。表6的B列提供了各个MERS-CoV抗原构建物的蛋白质(氨基酸)SEQ ID NO。表6的D列提供了对应的G/C优化的核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ IDNO。表6的E列提供了对应的人类密码子使用适应的核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ IDNO。
值得注意的是，本发明的描述明确包括在本申请的ST.25序列表的<223>标识符下提供的信息。优选的包含表6的编码序列的核酸构建物，例如包含表6的编码序列的mRNA序列提供在表7中。
表6：优选的MERS-CoV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)：
Figure BDA0004113537810000791
Figure BDA0004113537810000801
在优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-3)的至少一种核酸编码的选自或衍生自MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14794-14809中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表6中提供(参见A列和B列的第1至16行)，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步的实施方式中，由组分A(具体是组分A-3)的至少一种核酸编码的选自或衍生自MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018115527的SEQ ID NO:1-152或1448至1548中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018115527的SEQ ID NO:1-152或1448至1548以及与其相关的对应的公开内容(例如相应的序列表、表1-4和表7的第1列或第2列中的信息)通过引用并入本文。
在进一步的实施方式中，由组分A(具体是组分A-3)的至少一种核酸编码的选自或衍生自MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018081318的SEQ ID NO:2-4、28-29中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018081318的SEQ ID NO:2-4、28-29以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在进一步的实施方式中，由组分A(具体是组分A-3)的至少一种核酸编码的选自或衍生自MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2017070626的SEQ ID NO:24-28或33中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2017070626的SEQ ID NO:24-28或33以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
可从WO2017070626的表12中选择或衍生出其它适合的选自或衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质。因此，WO2017070626的表12的全部内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，由组分A(具体是组分A-3)的至少一种核酸编码的选自或衍生自MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质(融合前稳定化刺突蛋白(S_stab))包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14795、14797、14799-14802、14804中的至少一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表6(A列和B列)中提供，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
根据优选的实施方式，组分A(具体是组分A-3)的核酸包含编码至少一种如上定义的衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的MERS-CoV抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体都可理解为是适合的编码序列，因此可包含在组分A的核酸中。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质，优选编码SEQ IDNO:14794-14809；WO2018115527的SEQ ID NO:1-152、1448-1548；WO2018081318的SEQ IDNO:2-4、28-29；WO2017070626的SEQ ID NO:24-28或33中的任一个的至少一个编码序列，或其片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与SEQ ID NO:14794-14809；WO2018115527的SEQ ID NO:1-152、1448-1548；WO2018081318的SEQ ID NO:2-4、28-29；WO2017070626的SEQ ID NO:24-28或33中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或其片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。关于所述氨基酸序列的其它信息也提供在表6、表7中，并且在相应序列SEQ IDNO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的核酸包含下列或由下列组成：包括编码MERS-CoV抗原的、与选自SEQ ID NO:14810-14905的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列中的任一个的编码序列，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表6、表7中，并且在相应序列SEQ IDNO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码MERS-CoV抗原的、与已公开的PCT申请WO2018115527的SEQ ID NO:153-304或1549-1649、305-1368、1650-2356、2365、2366、2373-2378的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。值得注意的是，WO2018115527的SEQ ID NO:153-304或1549-1649、305-1368、1650-2356、2365、2366、2373-2378以及与其相关的对应的公开内容(例如相应的序列表、表1-4和表7的第4列或第4列中的信息)通过引用并入本文。
在进一步的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码MERS-CoV抗原的、与已公开的PCT申请WO2017070626的SEQ ID NO:20-23、65-68的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。值得注意的是，WO2017070626的SEQ ID NO:20-23、65-68以及与其相关的对应的公开内容(例如相应的序列表、表1-4和表7中的信息)通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即MERS-CoV肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。
在特别优选的实施方式中，核酸组分A(具体是组分A-3)的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
表7(C列和D列)中提供了组分A(具体是组分A-3)的优选核酸序列，包括特别优选的mRNA序列。其中，每一行代表本发明具体的适合的MERS-CoV构建物(与表6比较)，其中MERS-CoV构建物的描述在表7的A列中指示，而相应的MERS-CoV构建物的氨基酸序列的SEQID NO在B列中提供。表6中提供了编码相应的MERS-CoV构建物的编码序列的对应的SEQ IDNO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
表7：编码MERS-CoV抗原的核酸，优选mRNA构建物
Figure BDA0004113537810000821
/>
Figure BDA0004113537810000831
在优选的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码MERS-CoV抗原的、与选自SEQ ID NO:14842-14905的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表7(具体参见C列和D列)中提供。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在进一步的实施方式中，组分A(具体是组分A-3)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码MERS-CoV抗原的、与选自WO2018115527的SEQ ID NO:2373-2378和WO2017070626的SEQ ID NO:65-68的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在WO2018115527或WO2017070626的序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在WO2018115527的表1-4和表7中提供。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
适用于组分A-3的核酸的适合的特征和实施方式在下文“核酸特征和实施方式”段落中提供。
适合地，组分A-3的核酸被配制和/或复合。适用于组分A的核酸复合或配制的适合的特征和实施方式在下文“配制和复合”段落中提供。
在实施方式中，组分A(具体是组分A-3)包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分A(具体是组分A-3)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样定义。
在实施方式中，组分A(具体是组分A-3)可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同MERS-CoV的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的MERS-CoV表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的MERS-CoV表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分A(具体是组分A-3)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的MERS-CoV(例如，不同的MERS-CoV分离株)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的MERS-CoV”必须理解为至少两种相应的MERS-CoV(例如不同的MERS-CoV分离株)之间的差异，其中差异体现在相应不同的MERS-CoV的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的MERS-CoV可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分A-3包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分A-3优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分A-3的肌内或皮内施用导致经编码的MERS-CoV抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分A-3的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的MERS-CoV抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的MERS-CoV抗原。
在实施方式中，向对象施用包含组分A-3的药物组合物引发针对MERS-CoV的中和抗体而不引发疾病增强抗体。具体地，将包含编码MERS-CoV融合前稳定化刺突蛋白的组分A-3的药物组合物向对象施用不引发免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
在优选的实施方式中，组分A-3的施用引发针对由组分A-3的至少一种核酸提供的经编码的MERS-CoV抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分A-3适用于疫苗，具体地，适用于MERS-CoV疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分A-3中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分A-3包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
组分B：
在各种优选的实施方式中，药物组合物的至少一种组分B包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在本发明的上下文中，术语“选自或衍生自至少一种其它病毒的肽或蛋白质”在最宽泛的意义上涉及来自其它病毒的肽或蛋白质，其中该其它病毒未被选择用于组分A。
因此，在选择SARS-CoV-2作为组分A的至少一种冠状病毒的实施方式中，组分B的至少一种其它病毒可以是除SARS-CoV-2之外的任何病毒。
在优选的实施方式中，组分B的至少一种其它病毒选自或衍生自至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒。
在优选的实施方式中，所述至少一种肺病毒科病毒选自至少一种呼吸道合胞病毒和/或至少一种偏肺病毒。
在优选的实施方式中，所述至少一种副粘病毒科病毒选自至少一种副流感病毒和/或至少一种亨尼帕病毒。
在优选的实施方式中，所述至少一种副粘病毒科病毒选自至少一种副流感病毒和/或至少一种亨尼帕病毒。
根据实施方式，组分B的核酸包含编码选自或衍生自如本文定义的至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在优选的实施方式中，组分B的核酸包含编码选自或衍生自如本文定义的至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体，其中所述至少一种其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒。
在这种上下文下，编码如本文定义的其它病毒的至少一种抗原性蛋白质或其片段和变体的任何编码序列可被理解为是适合的编码序列，因此可包含在组分B的核酸中。
适用于组分B的核酸的适合的特征和实施方式在下文“核酸特征和实施方式”段落中提供。
适合地，组分B的核酸被配制和/或复合。适用于组分A的核酸复合或配制的适合的特征和实施方式在下文“配制和复合”段落中提供。
在实施方式中，组分B可包括多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分B包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样定义。
在实施方式中，组分B可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同其它病毒的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的其它病毒表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的其它病毒表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分B包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的其它病毒(例如，不同的流感病毒、不同的RSV病毒、不同的PIV)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的其它病毒”必须理解为至少两种相应的其它病毒之间的差异，其中差异体现在相应不同的其它病毒的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的其它病毒可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分B包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分B优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分B的肌内或皮内施用导致经编码的其它病毒抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分B的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的其它病毒抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的其它病毒抗原。
在优选的实施方式中，组分B的施用引发针对由组分B的至少一种核酸提供的经编码的其它病毒抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分B适用于疫苗，优选组合疫苗或本发明的组合疫苗。
下文提供了与本发明上下文中具体的其它病毒相关的实施方式(组分B-1、组分B-2、组分B-3、组分B-4)。
B-1组分：不同的冠状病毒
在优选的实施方式中，组分B的所述至少一种其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒(也称为组分B-1)，其中所述至少一种不同的冠状病毒不是组分A的冠状病毒。
必须理解，在“组分B”段落中描述的一般实施方式和特征也可适用于编码不同的冠状病毒抗原性肽或蛋白质的核酸。
在组分A(包括组分A-1、组分A-2和组分A-3)的上下文中提供的特征和实施方式同样适用于组分B(具体是组分B-1)。因此，任何核酸，例如在组分A(包括组分A-1、组分A-2和组分A-3)的上下文中提供的DNA或RNA同样可选择用于组分B(具体是组分B-1)。
在实施方式(其中组分A包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种如本文定义的SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体)中，组分B的至少一种不同的冠状病毒可选自任何冠状病毒，优选任何大流行冠状病毒，其中所述至少一种不同的冠状病毒不是SARS-CoV-2。因此，在组分A(包括组分A-1、组分A-2和组分A-3)的上下文中提供的任何核酸同样可选择用于组分B(具体是组分B-1)，其中组分B的至少一种核酸不编码SARS-CoV-2抗原。
在实施方式(其中组分A包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种如本文定义的SARS-CoV-1的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体)中，组分B的至少一种不同的冠状病毒可选自任何冠状病毒，优选任何大流行冠状病毒，其中所述至少一种不同的冠状病毒不是SARS-CoV-1。因此，在组分A(包括组分A-1、组分A-2和组分A-3)的上下文中提供的任何核酸同样可选择用于组分B(具体是组分B-1)，其中组分B的至少一种核酸不编码SARS-CoV-1抗原。
在实施方式中(其中组分A包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种如本文定义的MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体)中，组分B的至少一种不同的冠状病毒可选自任何冠状病毒，优选任何大流行冠状病毒，其中所述至少一种不同的冠状病毒不是MERS-CoV。因此，在组分A(包括组分A-1、组分A-2和组分A-3)的上下文中提供的任何核酸同样可选择用于组分B(具体是组分B-1)，其中组分B的至少一种核酸不编码MERS-CoV抗原。
在优选的实施方式中，由组分B的至少一种核酸编码的、选自或衍生自至少一种不同的冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、14794-14809、14906-14950、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，组分B的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码至少一种不同的冠状病毒抗原的、与SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-147、148-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、14810-14905、14951-15220、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
在优选的实施方式中，组分B的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种不同的冠状病毒抗原的、与选自SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、14842-14905、15041-15220、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-1)可包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种不同的冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分B包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样定义。
在优选的实施方式中，组分B-1包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种不同的冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分B-1优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分B-1的肌内或皮内施用导致经编码的不同的冠状病毒抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分B-1的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的不同的冠状病毒抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的不同的冠状病毒抗原。
在实施方式中，向对象施用包含组分B-1的药物组合物引发针对不同的冠状病毒的中和抗体而不引发疾病增强抗体。具体地，将包含编码冠状病毒融合前稳定化刺突蛋白的组分B-1的药物组合物向对象施用不引发免疫病理学效应，比如，例如增强的疾病和/或抗体依赖性增强(ADE)。
在优选的实施方式中，组分B-1的施用引发针对由组分B-1的至少一种核酸提供的经编码的不同的冠状病毒抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分B-1适用于疫苗，具体地，适用于不同的冠状病毒疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分B-1中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分B-1包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
组分B-2：流感病毒
在优选的实施方式中，组分B的所述至少一种其它病毒选自至少一种流感病毒(也称为组分B-2)。流感病毒属于正粘病毒科(NCBI分类ID:11308)，正粘病毒科被细分为α流感病毒(Alphainfluenzavirus)(包括甲型流感病毒的属)、β流感病毒(Betainflurnzavirus)(包括乙型流感病毒的属)、γ流感病毒(Gammainfluenzavirus)(包括丙型流感病毒的属)和δ流感病毒(Deltainfluenzavirus)(包括丁型流感病毒的属)。
必须理解“组分B”段落中描述的一般实施方式和特征也可适用于编码流感病毒抗原性肽或蛋白质的核酸。
在本发明的上下文中，任何流感病毒，不管具体的基因型、种类、毒株、分离株或血清型如何，都可选择作为组分B的“至少一种其它病毒”。
适合地，组分B(具体是组分B-2)的至少一种流感病毒可选自至少一种甲型流感病毒(NCBI分类ID:11320)和/或至少一种乙型流感病毒(NCBI分类ID:11520)和/或至少一种丙型流感病毒(NCBI分类ID:11552)和/或至少一种丁型流感病毒(NCBI分类ID:1511084)。
因此，在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种流感病毒选自至少一种甲型流感和/或至少一种乙型流感和/或至少一种丙型流感。在优选的实施方式中，至少一种流感病毒选自至少一种甲型流感病毒和/或至少一种乙型流感病毒。
所述至少一种甲型流感病毒可选自以选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18的血凝素(HA)为特征的甲型流感病毒。优选地，甲型流感病毒选自以选自H1、H3、H5、H7、H9或H10的血凝素(HA)为特征的流感病毒。
此外，特别优选的是以选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11的神经氨酸酶(NA)为特征的甲型流感病毒。最优选地，甲型流感病毒选自以选自N1、N2和N8的神经氨酸酶(NA)为特征的流感病毒。
在实施方式中，所述至少一种流感病毒选自至少一种甲型流感病毒，所述甲型流感病毒选自包括H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7和H10N8的列表中的至少一种，优选选自H1N1、H3N2、H5N1和H5N8中的至少一种。
适合的甲型和乙型流感病毒毒株可选自FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009、FLUAV/H1N1/A/密歇根/45/2015、FLUAV/H1N1/A/荷兰/602/2009、FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014、FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008、FLUBV/H0N0/B/普吉岛/3073/2013、FLUAV/H1N1/A/布里斯班/02/2018、FLUAV/H1N1/A/布里斯班/02/2018、FLUAV/H1N1/A/广东-茂南/SWL1536/2019、FLUAV/H1N1/A/广东-茂南/SWL1536/2019、FLUAV/H3N2/A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016、FLUAV/H3N2/A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016NYMC-X-307、FLUAV/H3N2/A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016-CDC-LV18A、FLUAV/H3N2/A/堪萨斯州/14/2017、FLUAV/H3N2/A/堪萨斯州/14/2017CBER-22B CDC19A、FLUAV/H3N2/A/瑞士/8060/2017、FLUAV/H3N2/A/香港/2671/2019、FLUAV/H3N2/A/香港/45/2019、FLUAV/H3N2/A/南澳大利亚/34/2019、FLUAV/H7N9/A/鸡/浙江/C483/2013(H7N9)、FLUAV/H10N8/A/江西/IPB13/2013(H10N8)、FLUAV/越南/1203/2004(H5N1)。
在实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)、核输出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶碱性蛋白PB1、PB1-F2和/或聚合酶碱性蛋白2(PB2)的至少一种肽或蛋白质，或其片段或变体，或选自或衍生自任何合成上改造的流感病毒肽或蛋白。
在优选的实施方式中，由组分B的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在特别优选的实施方式中，至少一个编码区编码流感病毒的血凝素(HA)的至少一种全长蛋白，和/或神经氨酸酶(NA)的至少一种全长蛋白，或其变体。
根据各种实施方式，组分B(具体是组分B-2)的核酸编码至少一种如本文定义的来自流感病毒的抗原性肽或蛋白质，以及另外地至少一种异源肽或蛋白质元件。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的流感抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善本发明的经编码的抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件)，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分B的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
适合的多聚化结构域可选自根据WO2017081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的跨膜元件可选自根据WO2017081082的SEQID NO:1228-1343的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的VLP形成序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1168-1227的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的肽连接体可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1509-1565的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的自切割肽可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1434-1508的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的免疫佐剂序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1360-1421的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的树突细胞(DC)靶向序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1344-1359的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的分泌信号肽可选自根据已公开的PCT专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1-1115和SEQ ID NO:1728的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。
在优选的实施方式中，所述至少一个编码序列另外地编码一种或多种异源肽或蛋白质元件，所述异源肽或蛋白质元件选自信号肽、连接体肽、辅助表位、抗原聚集元件、三聚化或多聚化元件、跨膜元件或VLP形成序列。
优选的如上定义的选自或衍生自流感病毒的抗原性肽或蛋白质在表8(第1至52行)中提供。其中，第1至52行中每一行与适合的流感构建物对应。表8的A列提供了对适合的流感抗原构建物的简短描述。表8的B列提供了各个流感抗原构建物的蛋白质(氨基酸)SEQID NO。表8的D列提供了对应的G/C优化的核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ ID NO。表8的E列提供了对应的人类密码子使用适应的核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ ID NO。
值得注意的是，本发明的描述明确包括在本申请的ST.25序列表的<223>标识符下提供的信息。优选的包含表8的编码序列的核酸构建物，例如包含表8的编码序列的mRNA序列提供在表9和表10中。
表8：优选的流感病毒构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)：
Figure BDA0004113537810000911
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Figure BDA0004113537810000921
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Figure BDA0004113537810000931
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ IDNO:14178-14229中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表8(参见A列和B列的第1至52行)中提供，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种甲型流感病毒(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14178-14181、14184-14204(甲型流感的HA)中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表8(A列和B列)中提供，并且在相应序列SEQ IDNO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种甲型流感病毒(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14210-14213、14216-14227(甲型流感的NA)中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表8(A列和B列)中提供，并且在相应序列SEQ IDNO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种乙型流感病毒(HA和NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14182-14183、14205-14209、14214-14215、14228-14229中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表8(A列和B列)中提供，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步的实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018170245的SEQ ID NO:1-444、458、460、462-479或543-565中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。值得注意的是，WO2018170245的SEQ ID NO:1-444、458、460、462-479或543-565以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018078053的SEQ ID NO:1-32012、224269、224309中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018078053的SEQ ID NO:1-32012、224269、224309以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。在实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种甲型流感病毒(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018078053的SEQ ID NO:1-14031中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018078053的SEQ ID NO:1-14031以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。在实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种甲型流感病毒(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018078053的SEQ ID NO:14032-26397、224309、224310中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018078053的SEQ ID NO:14032-26397、224309、224310以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。在实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种乙型流感病毒(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018078053的SEQ ID NO:26398-28576中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018078053的SEQ ID NO:26398-28576以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。在实施方式中，由组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种乙型流感病毒(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2018078053的SEQ ID NO:28577-30504中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018078053的SEQ ID NO:28577-30504以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
根据优选的实施方式，组分B(具体是组分B-2)的核酸包含编码至少一种如上定义的衍生自至少一种流感病毒的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的流感病毒抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体都可理解为是适合的编码序列，因此可包含在组分B的核酸中。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自流感病毒的抗原性肽或蛋白质，优选编码WO2018170245的SEQ ID NO:1-444、458、460、462-479或543-565；WO2018078053的SEQ ID NO:1-32012、224269、224309中的任一个的至少一个编码序列，或这些中任意者的片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与WO2018170245的SEQ ID NO:1-444、458、460、462-479或543-565；WO2018078053的SEQ ID NO:1-32012、224269、224309中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或这些中任意者的片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自流感病毒的抗原性肽或蛋白质，优选编码SEQ IDNO:14178-14229中的任一个的至少一个编码序列，或这些中任意者的片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与SEQ ID NO:14178-14229中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或这些中任意者的片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码流感病毒抗原的、与选自已公开的PCT申请WO2018170245的SEQ IDNO:447-457、459、461、491-503、505-523、524-542、566-569、570-573的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018170245的SEQ ID NO:447-457、459、461、491-503、505-523、524-542、566-569、570-573以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码流感病毒抗原的、与选自已公开的PCT申请WO2018078053的SEQ IDNO:32013-46043、64025-78055、224085-224106、96037-110067、128049-142079、160061-174091、192073-206103、58410-60588、90422-92600、224107-224112、122434-124612、154446-156624、186458-188636、218470-220648、46044-58409、224311、224312、78056-90421、224113、224313-224317、110068-122433、142080-154445、174092-186457、206104-218469、60589-62516、92601-94528、124613-126540、156625-158552、188637-190564、220649-222576、224085-224284的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2018078053的SEQ IDNO:32013-46043、64025-78055、224085-224106、96037-110067、128049-142079、160061-174091、192073-206103、58410-60588、90422-92600、224107-224112、122434-124612、154446-156624、186458-188636、218470-220648、46044-58409、224311、224312、78056-90421、224113、224313-224317、110068-122433、142080-154445、174092-186457、206104-218469、60589-62516、92601-94528、124613-126540、156625-158552、188637-190564、220649-222576、224085-224284以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码流感病毒抗原的、与选自已公开的PCT申请WO2019092153的SEQ IDNO:26-14079、14080-16264、16265-28640、28641的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2019092153的SEQ ID NO:26至14079、14080至16264、16265至28640、28641以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码流感病毒抗原的至少一个核酸序列，所述核酸与选自SEQID NO:14230-14333、14334-14541、26946、26947-26955的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或这些序列中任意者的片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表8(C-F列)、表9中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码甲型流感病毒抗原(HA)的、与选自SEQ ID NO:14230-14233、14236-14256、14282-14285、14288-14308、14334-14337、14340-14360、14386-14389、14392-14412、14438-14441、14444-14464、14490-14493、14496-14516、26949、26947、26950、26948的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表8(C-F列)、表9中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码甲型流感病毒(NA)抗原的、与选自SEQ ID NO:14366-14369、14372-14383、14418-14421、14424-14435、14470-14473、14476-14487、14522-14525、14528-14539、26953、26954的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表8(C-F列)、表9中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码乙型流感病毒抗原的、与选自SEQ ID NO:14234、14235、14257-14261、14266、14267、14280、14281、14286、14287、14309-14313、14318、14319、14332、14333、14338、14339、14361-14365、14370、14371、14384、14385、14390、14391、14413-14417、14422、14423、14436、14437、14442、14443、14465-14469、14474、14475、14488、14489、14494、14495、14517-14521、14526、14527、14540、14541、26951、26952、26955的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表8(C-F列)、表9中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即流感病毒肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。在特别优选的实施方式中，核酸组分B的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
组分B(具体是组分B-2)的优选的核酸序列，包括特别优选的mRNA序列，在表9(C列和D列)中提供。其中，每一行代表本发明具体的适合的流感病毒构建物(与表8比较)，其中流感病毒构建物的描述在表9的A列中指示，而相应的流感病毒构建物的氨基酸序列的SEQID NO在B列中提供。表8中提供了编码相应的流感病毒构建物的编码序列的对应的SEQ IDNO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
表9：编码流感病毒抗原的核酸，优选mRNA构建物
Figure BDA0004113537810000971
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Figure BDA0004113537810000981
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Figure BDA0004113537810000991
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码流感病毒抗原的、与已公开的PCT申请WO2018078053的SEQ ID NO:224085-224284中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，优选mRNA序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。任选地，其中所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，并且其中所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码流感抗原的、与选自SEQ ID NO:14334-14541、26946-26955的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。任选地，其中所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或其中所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表9(具体参见C列和D列)中提供。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分B(具体是组分B-2)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同流感病毒的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的流感病毒表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的流感病毒表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-2)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的流感病毒(例如，不同的流感病毒分离株/毒株)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的流感病毒”必须理解为至少两种相应的流感病毒(例如不同的流感病毒分离株)之间的差异，其中差异体现在相应不同的流感病毒的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的流感病毒可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)包含编码流感病毒抗原的多个核酸序列，优选2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或100个编码流感病毒抗原的核酸序列，优选其中所述多个核酸序列中的每一个选自编码如本文定义的流感抗原的核酸序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的所述多个核酸序列编码至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自如本文定义的HA的抗原性肽或蛋白质，以及至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自至少一种如本文定义的甲型流感病毒的如本文定义的NA的抗原性肽或蛋白质。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-2)的所述多个核酸序列编码至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自如本文定义的HA的抗原性肽或蛋白质，以及至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自至少一种乙型流感病毒的如本文定义的NA的抗原性肽或蛋白质。
在这种上下文下，特别优选药物组合物的组分B(具体是组分B-2)包括至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H1的蛋白质——优选血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)——的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H3的蛋白质——优选血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)——的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H5的蛋白质——优选血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)——的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，以及任选地至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H7的蛋白质——优选血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)——的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，和/或任选地至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H9的蛋白质——优选血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)——的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列。
优选地，药物组合物的组分B(具体是组分B-2)包括至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H1的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H1的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H3的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H3的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H5的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H5的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列；以及任选地至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H7的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H7的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，和/或任选地至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H9的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H9的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列。
在具体实施方式中，药物组合物的组分B(具体是组分B-2)包括至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H1N1的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H1N1的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H3N2的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H3N2的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列，至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H5N1的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自甲型流感病毒H5N1的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列。
此外，药物组合物的组分B(具体是组分B-2)优选还包含至少一种核酸，具体是编码衍生自至少一种乙型流感病毒的血凝素(HA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列和/或至少一种核酸，具体是编码衍生自至少一种乙型流感病毒的神经氨酸酶(NA)的至少一种抗原性肽或蛋白质的RNA序列。
优选地，在这种上下文下，组分B的核酸序列(一个或多个)包括以下表10的RNA序列(“优选的RNA序列”)或由其组成：
表10:优选的流感病毒RNA序列
Figure BDA0004113537810001021
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B(具体是组分B-2)是四价流感混合物，其包含核酸，优选如本文定义的RNA序列。这种情况下特别优选的是核酸的组合，优选编码以下蛋白质序列的RNA(例如适用于四价流感混合物)：
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的HA蛋白
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的HA蛋白
-FLUBV/H0N0/B/普吉岛/3073/2013的HA蛋白
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的HA蛋白
适用于所述四价流感混合物的RNA序列可选自表10。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B(具体是组分B-2)是三价流感混合物，其包含核酸，优选如本文定义的RNA序列。这种情况下特别优选的是核酸的组合，优选编码以下蛋白质序列的RNA(例如适用于三价流感混合物)：
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的NA蛋白
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的NA蛋白
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的NA蛋白
适用于所述三价流感混合物的RNA序列可选自表10。
在更优选的实施方式中，药物组合物的组分B(具体是组分B-2)是四价流感混合物，其包含核酸，优选如本文定义的RNA序列。这种情况下特别优选的是核酸的组合，优选编码以下蛋白质序列的RNA(例如适用于四价流感混合物)：
-FLUAV/H1N1/A/荷兰/602/2009的HA蛋白
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的HA蛋白
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的HA蛋白
-甲型流感/越南/1194/2004(H5N1)的HA蛋白
适用于所述四价流感混合物的RNA序列可选自表10。
在又特别优选的实施方式中，药物组合物的组分B(具体是组分B-2)是七价(septavalent或septivalent)流感混合物，其包含核酸，优选如本文定义的RNA序列。这种情况下特别优选的是核酸的组合，优选编码以下蛋白质序列的RNA(例如适用于七价流感混合物)：
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的HA蛋白
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的HA蛋白
-FLUBV/H0N0/B/普吉岛/3073/2013的HA蛋白
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的HA蛋白
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的NA蛋白
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的NA蛋白
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的NA蛋白
适用于所述七价流感混合物的RNA序列可选自表10。
因此，在实施方式中，组分B(具体是B-2)包含编码流感病毒抗原的多个核酸序列，其中流感病毒选自包括FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009、FLUAV/H1N1/A/密歇根州/45/2015、FLUAV/H1N1/A/荷兰/602/2009、FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014、FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008、FLUBV/H0N0/B/普吉岛/3073/2013的列表。
在优选的实施方式中，组分B(具体是B-2)包含多个核酸序列，优选七个核酸序列，其编码多种流感病毒抗原，优选七种流感病毒抗原，其中流感病毒抗原选自
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的HA蛋白，
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的HA蛋白，
-FLUBV/H0N0/B/普吉岛/3073/2013的HA蛋白，
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的HA蛋白，
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的NA蛋白，
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的NA蛋白，和
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的NA蛋白，
优选地，其中核酸序列，优选RNA序列，选自表10。
在优选的实施方式中，组分B-2包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分B-2优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分B-2的肌内或皮内施用导致经编码的流感病毒抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分B-2的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的流感病毒抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的流感病毒抗原。
在优选的实施方式中，组分B-2的施用引发针对由组分B-2的至少一种核酸提供的经编码的流感病毒抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分B-2适用于疫苗，具体适用于流感病毒疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分B-2中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分B-2包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
组分B-3：肺病毒科病毒
在优选的实施方式中，组分B的所述至少一种其它病毒选自肺病毒科的至少一种病毒。
必须理解“组分B”段落中描述的一般实施方式和特征也可适用于编码肺病毒科抗原性肽或蛋白质的核酸。
肺病毒科(NCBI分类ID:11244)是单股反链病毒目(Mononegavirales)中的一个病毒科。它是在2015年通过提升现已解散的副粘病毒亚科——肺病毒科而创建的。目前肺病毒科有5个种，分为2个属(偏肺病毒和正肺病毒)。正肺病毒(NCBI分类ID:1868215)是包括人类呼吸道合胞病毒RSV(例如RSV A、RSV B)的属。偏肺病毒(NCBI分类ID:162387)是包括人类偏肺病毒(hMPV)的属。
肺病毒科病毒的基因组由不分段的负义单链RNA组成。它的大小约为15kb，并且一般编码11种蛋白质。该基因组的一个独特的特征是M2基因，它编码蛋白质M2-1和M2-2。这个家族的病毒通常与呼吸感染有关，并且通过呼吸分泌物传播。
在本发明的实施方式中，选自或衍生自肺病毒科的任何蛋白质可用于本发明的上下文中，并且可由组分B(具体是组分B-4)的编码序列或核酸编码。
适用于本发明上下文的是致病性肺病毒科病毒，包括呼吸道合胞病毒和/或至少一种偏肺病毒。
组分B-3a：呼吸道合胞病毒(RSV)：
在优选的实施方式中，组分B的所述至少一种其它病毒选自肺病毒科的至少一种呼吸道合胞病毒(RSV)(在本文中也称为组分B-3a)。
如本文所用，术语“呼吸道合胞病毒”或对应的缩写“RSV”不限于包括任何来源的任何呼吸道合胞病毒的具体病毒株、变体、血清型或分离株等。
适用于本发明上下文中的RSV病毒可选自已公开的PCT专利申请WO2019202035的列表1(“RSV病毒株”)。因此，WO2019202035的列表1以及与其相关的公开内容通过引用并入本文。
在本发明的优选实施方式中，所述至少一种抗原性肽或蛋白质衍生自呼吸道合胞病毒分离株RSV孟菲斯-37(孟菲斯-37株)(NCBI分类ID:12814)和/或人类呼吸道合胞病毒A2、人类呼吸道合胞病毒(A2株)(NCBI分类ID:11259)。
在实施方式中，由组分B(具体是组分B-3)的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种RSV融合蛋白F、RSV基质蛋白M、RSV核蛋白N、RSV M2-1蛋白和/或RSV磷蛋白P的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-3)的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种RSV融合蛋白F的至少一种肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
RSV F蛋白最初表达(在感染宿主细胞后)成单一多肽前体，被称为全长融合蛋白F(在本文称为“F0”)。F0在内质网中形成三聚体，并在两个保守位点处被细胞/宿主弗林蛋白酶样蛋白酶加工，生成F1、F2和Pep27多肽。Pep27多肽被切除，而不构成成熟的F蛋白的一部分。F2多肽起源于F0前体的N端部分，并通过两个二硫键连接到F1多肽。F1多肽起源于F0前体的C端部分，并通过连接到胞质尾区的跨膜结构域将成熟的F蛋白锚定在膜中。三个F2-F1异源二聚体单元(“原聚体”)组装形成成熟的F蛋白。最初，成熟的F蛋白处于亚稳态形式(在本文中称为“融合前构象”)。触发后，它会经历剧烈且不可逆的构象变化(在本文称中为“融合后构象”)，将病毒膜和靶细胞膜融合。
在本发明的上下文中，适合的RSV F蛋白可选自或衍生自已公开的PCT专利申请WO2019202035的列表2中提供的RSV F蛋白。因此，WO2019202035的列表2以及与其相关的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，选自或衍生自RSV F蛋白的至少一种抗原性肽或蛋白质是全长F蛋白(F0)或C端缺失的F蛋白(F-del)，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在本发明的上下文中，“RSV F蛋白”、“RSV融合蛋白(F)”、“RSV F”或“F”可以以其最宽泛的含义来理解，并且指代F0(F多肽前体)、F1、F2和Pep27多肽、F2-F1异源二聚体或成熟的F蛋白(包含三个F2-F1异源二聚体)，或这些中任意者的片段和变体。因此，术语“衍生自RSV融合(F)蛋白的肽或蛋白质”是指衍生自例如F0(F蛋白多肽前体)、F1、F2和Pep27多肽、F2-F1异源二聚体或成熟的F蛋白的肽、蛋白质、片段或变体。此外，术语“衍生自RSV融合(F)蛋白的肽或蛋白质”是指衍生自如上定义的“RSV F蛋白”或“RSV融合蛋白(F)”的肽、蛋白质、片段或变体，其可以在遗传上改造成例如缺少某些蛋白质元件(例如胞质尾区、弗林蛋白酶切割位点、Pep27)或者例如包含另外的元件(例如连接体元件、异源信号肽等)。
必须注意的是，在提到氨基酸(aa)残基及其在RSV F蛋白中的位置时，除非另有说明，否则本文使用的任何编号均涉及相应的aa残基在HRSV(A2)的对应F0前体蛋白(WO2019202035的SEQ ID NO:68)或HRSV(孟菲斯-37)的对应F0前体蛋白(WO2019202035的SEQ ID NO:8937或11726)中的位置，其中第“1”位对应于第一个aa残基，即HRSV(A2)F0前体蛋白或HRSV(孟菲斯-37)F0前体蛋白的N端的aa残基。
在特别优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的核酸编码衍生自RSV F蛋白的至少一种抗原性肽或蛋白质，其中所述RSV F蛋白被设计成使抗原稳定在融合前构象中。融合前构象在有效的RSV疫苗的上下文中特别有利，因为中和抗体的几个潜在表位可能仅在所述蛋白质构象下才可接近。
因此，在优选的实施方式中，RSV F蛋白选自或衍生自包含至少一个融合前稳定化突变的融合前稳定化F蛋白(F_stab)。
在几个实施方式中，RSV F蛋白包括一个或多个使F蛋白稳定在融合前构象中的氨基酸取代，例如，使F蛋白的膜远端部分(包括F1多肽的N端区域)稳定在融合前构象中。例如，氨基酸取代可引入非天然二硫键或者可以是空腔填充氨基酸取代。
因此，在几个实施方式中，优选的RSV F蛋白包括形成非天然二硫键的S155C和S290C取代，非天然二硫键使蛋白质稳定在融合前构象中；即，稳定在特异性结合一种或多种融合前特异性抗体，和/或呈递适合的抗原位点——其存在于RSV F蛋白的融合前构象上，但不存在于融合后构象中——的构象中。在进一步的实施方式中，重组RSV F蛋白可另外包括在第190位、第207位或第190位和第207位的F、L、W、Y、H或M取代。
因此，在特别优选的实施方式中，组分B的核酸编码衍生自RSV F蛋白的至少一种抗原性肽或蛋白质，其中RSV F蛋白包含DSCav1突变(S155C、S290C、S190F和V207L)，或其片段或变体。
在优选的实施方式中，所述至少一种抗原性肽或蛋白质可以是包含成熟F的F1和F2这两个亚单位作为单一多肽链的经改造的蛋白质，其中F2和F1优选经由连接体(GS)连接。F2-连接体-F1 RSV F蛋白缺少aa104-144(包括弗林蛋白酶切割位点和Pep27)并且包含F2多肽和F1多肽之间的连接体元件(例如GS连接体)。F2-连接体-F1蛋白可在稳定性和/或抗原性方面表现出优异的特性。
因此，在优选的实施方式中，RSV F蛋白包含融合成单一多肽链的两个亚单位F2和F1，其中F2和F1经由连接体元件，优选如本文指定的GS连接体连接，优选产生稳定的F2-连接体-F1蛋白。
优选地，所述F2-连接体-F1融合蛋白，例如F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553)另外包含如上概述的DScavl突变(在本文中称为“mut0”)。
在特别优选的实施方式中，RSV F蛋白可另外包含至少一种选自下列的其它突变：(S46G、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、N67I、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(A149C、Y458C)、(N183GC、N428C)、(Q98C、Q361C、S46G、E92D、L95M、S215P、I217P、I221M、R429K、K465Q)、(Q98C、Q361C、L95M、I221M、R429K)或(N183GC、N428C、S46G、N67I、E92D、S215P、K465Q)或其片段或变体。
在特别优选的实施方式中，F2-连接体-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))优选除DSCavl突变外可另外包含至少一种选自下列的突变：S46G、A149C、S215P、Y458C、K465Q，在本文中称为“mut1”；S46G、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q，在本文中称为“mut2”；S46G、N67I、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q，在本文中称为“mut3”；A149C、Y458C，在本文中称为“mut4”；N183GC、N428C，在本文中称为“mut5”；Q98C、Q361C、S46G、E92D、L95M、S215P、I217P、I221M、R429K、K465Q，在本文中称为“mut6”；Q98C、Q361C、L95M、I221M、R429K，在本文中称为“mut7”；N183GC、N428C、S46G、N67I、E92D、S215P、K465Q，在本文中称为“mut8”。
根据各种实施方式，组分B(具体是组分B-3a)的核酸编码至少一种如本文定义的来自RSV的抗原性肽或蛋白质，并且另外地编码至少一种异源肽或蛋白质元件。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的RSV抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善经编码的RSV抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件)，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分B(具体是组分B-3a)的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
适合的多聚化结构域可选自根据WO2017081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的跨膜元件可选自根据WO2017081082的SEQID NO:1228-1343的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的VLP形成序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1168-1227的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的肽连接体可选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO:1509-1565的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的自切割肽可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1434-1508的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的免疫佐剂序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1360-1421的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的树突细胞(DC)靶向序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1344-1359的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。适合的分泌信号肽可选自根据已公开的PCT专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1-1115和SEQ ID NO:1728的氨基酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。
在优选的实施方式中，所述至少一个编码序列另外地编码一种或多种异源肽或蛋白质元件，所述异源肽或蛋白质元件选自信号肽、连接体肽、辅助表位、抗原聚集元件、三聚化或多聚化元件、跨膜元件或VLP形成序列。
优选的如上定义的选自或衍生自RSV的抗原性肽或蛋白质在表11(第1至10行)中提供。其中，第1至10行中每一行与适合的RSV构建物对应。表11的A列提供了对适合的RSV抗原构建物的简短描述。表11的B列提供了各个RSV抗原构建物的蛋白质(氨基酸)SEQ ID NO。表11的D列提供了对应的G/C优化的核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ ID NO。表11的E列提供了对应的人类密码子使用适应的核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ ID NO。
值得注意的是，本发明的描述明确包括在本申请的ST.25序列表的<223>标识符下提供的信息。优选的包含表11的编码序列的核酸构建物，例如包含表11的编码序列的mRNA序列提供在表12中。
表11：优选的RSV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)：
行 A B D E
1 HRSV-A/RSVA/智人/USA/84I-215A-01/1984融合糖蛋白(F0) 14542 14552 14562
2 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F0) 14543 14553 14563
3 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F-del) 14544 14554 14564
4 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F0_DSCav1) 14545 14555 14565
5 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F-del_DSCav1) 14546 14556 14566
6 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F_DSCav1_mut4) 14547 14557 14567
7 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F-del_DSCav1_mut4) 14548 14558 14568
8 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F_DSCav1_mut5) 14549 14559 14569
9 HRSV-A/A2融合糖蛋白(F-del_DSCav1_mut5) 14550 14560 14570
10 HRSV-A/A2基质蛋白(M2-1) 14551 14561 14571
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14542-14551中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表8(参见A列和B列的第1至10行)中提供，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
已公开的PCT专利申请WO2019202035的表1中提供了可由组分B(具体是组分B-3a)的核酸编码的其它RSV F蛋白。因此，已公开的PCT专利申请WO2019202035的表1以及与其相关的公开内容和说明通过引用并入本文。
在其它实施方式中，由组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475、8279-9683中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2019202035的SEQ ID NO:68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475、8279-9683以及与其相关的对应的公开内容(例如WO2019202035的表1中提供的信息)通过引用并入本文。
在其它实施方式中，由组分B(具体是组分B-3)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2014160463的SEQ ID NO:1-1428中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些序列中任意者的片段或变体。因此，WO2014160463的SEQ ID NO:1-1428以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在其它实施方式中，由组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2015024668的SEQ ID NO:1-11中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些序列中任意者的片段或变体。因此，WO2015024668的SEQ ID NO:1-11以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在其它实施方式中，由组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2017070622的SEQ ID NO:3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些序列中任意者的片段或变体。因此，WO2017070622的SEQ ID NO:3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在其它实施方式中，由组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2017172890的SEQ ID NO:1-65、81-95、110-116中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些序列中任意者的片段或变体。因此，WO2017172890的SEQ ID NO:1-65、81-95、110-116以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
根据优选的实施方式，组分B(具体是组分B-3a)的核酸包含编码至少一种如上定义的衍生自至少一种RSV的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的RSV抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体都可理解为是适合的编码序列，因此可包含在组分B的核酸中。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自RSV的抗原性肽或蛋白质，优选编码WO2019202035的SEQID NO:68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475、8279-9683；WO2014160463的SEQ ID NO:1-1428；WO2015024668的SEQID NO:1-11；WO2017070622的SEQ ID NO:3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243、245；和WO2017172890的SEQ ID NO:1-65、81-95、110-116中的任一个的至少一个编码序列，或这些序列中任意者的片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与WO2019202035的SEQ ID NO:68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475、8279-9683；WO2014160463的SEQ ID NO:1-1428；WO2015024668的SEQ ID NO:1-11；WO2017070622的SEQ ID NO:3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243、245；和WO2017172890的SEQ ID NO:1-65、81-95、110-116中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或这些序列中任意者的片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自RSV的抗原性肽或蛋白质，优选编码SEQ ID NO:14542-14551中的任一个的至少一个编码序列，或这些中任意者的片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与SEQ ID NO:14542-14551中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或这些中任意者的片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:69-482、484-897、899-1266、1268-1635、1637-2004、2006-2373、2375-2742、2744-3111、3113-3480、3482-3849、3851-4218、4220-4587、4589-4956、4958-5325、5327-5694、5696-6063、6065-6432、6434-6801、6803-7170、7172-7539、7541-7908、7910-8277、8278、11727-12094、12096-12463、12465-12832、12834-13201、13941-14308、14310-14677、14679-15046、15048-15415、15417-15784、15786-16153、13203-13570、13572-13939、16155-16522、16524-16891、16893-17260、17262-17629、17631-17998、18000-17998、18369-18736、18738-19105、19107-19474、19476-19843、21363-21706中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2019202035的SEQ ID NO:69-482、484-897、899-1266、1268-1635、1637-2004、2006-2373、2375-2742、2744-3111、3113-3480、3482-3849、3851-4218、4220-4587、4589-4956、4958-5325、5327-5694、5696-6063、6065-6432、6434-6801、6803-7170、7172-7539、7541-7908、7910-8277、8278、11727-12094、12096-12463、12465-12832、12834-13201、13941-14308、14310-14677、14679-15046、15048-15415、15417-15784、15786-16153、13203-13570、13572-13939、16155-16522、16524-16891、16893-17260、17262-17629、17631-17998、18000-17998、18369-18736、18738-19105、19107-19474、19476-19843、21363-21706以及与其相关的对应的公开内容(也参见WO2019202035中的表3-6)通过引用并入本文。有关这些适合的核酸序列中的每一个的其它信息也可源自WO2019202035的序列表，具体源自其中在WO2019202035的序列表中标识符<223>下提供的详情。
在其它实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与已公开的专利申请WO2014160463的SEQ IDNO:383-388同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。因此，WO2014160463的SEQ ID NO:383-388以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在其它实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与已公开的专利申请WO2015024668的SEQ IDNO:12-22同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。因此，WO2015024668的SEQ ID NO:12-22以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在其它实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与已公开的专利申请WO2017070622的SEQ IDNO:1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、244、246、257、258-280同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。因此，WO2017070622的SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、244、246、257、258-280以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在其它实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与已公开的专利申请WO2017172890的SEQ IDNO:96-99同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。因此，WO2017172890的SEQ ID NO:96-99以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与选自SEQ ID NO:14552-14571、14572-14611的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表11(C-F列)、表12中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3)的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即RSV肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。在特别优选的实施方式中，核酸组分B(具体是组分B-3)的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
组分B(具体是组分B-3a)的优选的核酸序列，包括特别优选的mRNA序列，在表12(C列和D列)中提供。其中，每一行代表本发明具体的适合的RSV构建物(与表11比较)，其中RSV构建物的描述在表12的A列中指示，而相应的RSV病毒构建物的氨基酸序列的SEQ ID NO在B列中提供。表11中提供了编码相应的RSV构建物的编码序列的对应的SEQ ID NO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
表12：编码RSV抗原的核酸，优选mRNA构建物
Figure BDA0004113537810001121
Figure BDA0004113537810001131
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与选自SEQ ID NO:14572-14611的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表12中提供。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在进一步的实施方式中，组分B(具体是组分B-3)的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与选自已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:78-482、493-897、907-1266、1276-1635、1645-2004、2014-2373、2383-2742、2752-3111、3121-3480、3490-3849、3859-4218、4228-4587、4597-4956、4966-5325、5335-5694、5704-6063、6073-6432、6442-6801、6811-7170、7180-7539、7549-7908、7918-8277、8278、21415-21480、21561-21626、11735-12094、12104-12463、12473-12832、12842-13201、13949-14308、14318-14677、14687-15046、15056-15415、15425-15784、15794-16153、13211-13570、13580-13939、16163-16522、16532-16891、16901-17260、17270-17629、17639-17998、18008-18367、18377-18736、18746-19105、19115-19474、19484-19843、21489-21552、21635-21698的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。有关这些适合的核酸序列中的每一个的其它信息也可源自WO2019202035的序列表，具体源自其中在WO2019202035的序列表中标识符<223>下提供的详情，或源自WO2019202035中的表5A、5B、6A、6B。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在各种实施方式中，组分B，具体是如本文定义的组分B-3a，可包含多个或至少多于一个如本文定义的核酸序列。在实施方式中，药物组合物的组分B可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的如本文定义的核酸序列，其各自编码衍生自遗传上相同的RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。
在各种实施方式中，组分B，具体是如本文定义的组分B-3，可包含多个或至少多于一个如本文定义的核酸序列。在实施方式中，药物组合物的组分B可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的如本文定义的核酸序列，其各自编码衍生自遗传上不同的RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)不同的RSV表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白优选在至少一个氨基酸上有差异。
在一些实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种其它核酸，例如编码选自糖蛋白G、短疏水蛋白SH、基质蛋白M、核蛋白N、大聚合酶L、M2-1蛋白、M2-2蛋白、磷蛋白P、非结构蛋白NS1或非结构蛋白的RSV抗原的DNA或RNA构建物，或其任意组合。
根据优选的实施方式，组分B(具体是组分B-3a)包含至少一种、两种或三种其它核酸序列，所述核酸序列包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自RSV基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白和/或磷蛋白P或其组合，优选选自M2-1的至少一种抗原性肽或蛋白质。
因此，在一些实施方式中，组分B可包含至少一种编码如上定义的RSV F肽或蛋白质的核酸，以及另外地至少一种其它核酸——包含至少一个编码衍生自RSV的、选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白和/或磷蛋白P或其组合的至少一种抗原性肽或蛋白质的编码序列。
添加包含至少一个编码衍生自RSV M、N、M2-1和/或磷蛋白P(或其组合)的至少一种抗原性肽或蛋白质的编码序列的其它核酸，对例如促进T细胞免疫应答是特别有利的。
在优选的实施方式中，第二方面的组合物可适合地包含至少一种编码RSF F的第一方面的人工RNA、至少一种包含编码衍生自RSV M的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列的其它人工RNA、至少一种包含编码衍生自RSV N的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列的其它人工RNA、至少一种包含编码衍生自RSV P的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列的其它人工RNA、以及至少一种包含编码衍生自RSV M2-1的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列的其它人工RNA。
优选地，组分B(具体是B-3a)的其它核酸的编码序列编码与已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:9684、10053-10133、10134、10503-10636、10637、11006-11182、11183、11552-11725、19844、20213、20582、20951中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些序列中任意者的片段或变体。因此，WO2019202035的SEQ ID NO:9684、10053-10133、10134、10503-10636、10637、11006-11182、11183、11552-11725、19844、20213、20582、20951以及与这些序列相关的公开内容通过引用并入本文。有关这些编码RSV蛋白的适合的氨基酸序列中的每一个的其它信息也可源自WO2019202035的序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情，如下文说明的。
在进一步的实施方式中，所述其它核酸的编码序列编码至少一种如本文定义的抗原性肽或蛋白质，以及另外地异源分泌信号序列或异源分泌信号肽。异源分泌信号序列可增加经编码的抗原性肽或蛋白质的分泌。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一个其它核酸序列的至少一个编码序列包含编码RSV抗原的核酸序列或由其组成，所述核酸包含下列或由下列组成：与选自已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:9685-9692、10135-10142、10638-10645、11184-11119、19845-19852、20214-20221、20583-20590、20952-20959、21385-21388、21411-21414的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。因此，WO2019202035的SEQ ID NO:9685-9692、10135-10142、10638-10645、11184-11119、19845-19852、20214-20221、20583-20590、20952-20959、21385-21388、21411-21414以及与这些序列相关的公开内容通过引用并入本文。有关这些编码RSV蛋白的适合的氨基酸序列中的每一个的其它信息也可源自WO2019202035的序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情，如下文说明的。在这种上下文中，优选的RSV多肽、核酸和mRNA序列分别提供在已公开的PCT申请WO2019202035的表7A中。WO2019202035的表7A的全部内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3a)的至少一个其它核酸序列的至少一个编码序列包含编码RSV抗原的核酸序列或由其组成，所述核酸包含下列或由下列组成：与选自已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:9693-10052、10143-10502、10646-11005、11192-11551、19853-20212、20222-20581、20591-20950、20960-21319、21481-21488、21627-21634、21553-21560、21699-21706的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。因此，WO2019202035的SEQ ID NO:9693-10052、10143-10502、10646-11005、11192-11551、19853-20212、20222-20581、20591-20950、20960-21319、21481-21488、21627-21634、21553-21560、21699-21706以及与这些序列相关的公开内容通过引用并入本文。有关这些编码RSV蛋白的适合的氨基酸序列中的每一个的其它信息也可源自WO2019202035的序列表，具体源自其中在标识符<223>下提供的详情，如下文说明的。在这种上下文中，优选的RSV多肽、核酸和mRNA序列分别提供在已公开的PCT申请WO2019202035的表7A中。WO2019202035的表7A的全部内容通过引用并入本文。
适合地，组分B，具体是组分B-3a包含编码至少两种不同的RSV抗原的核酸序列，其中适合的组合在WO2019202035的表7B中提供，WO2019202035的表7A的全部内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分B-3a包含至少一种核酸，所述核酸编码至少一种选自或衍生自至少一种RSV的抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分B-3a优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分B-3a的肌内或皮内施用导致经编码的RSV抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分B-3a的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的RSV抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的RSV抗原。
在优选的实施方式中，组分B-3a的施用引发针对由组分B-3a的至少一种核酸提供的经编码的RSV抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分B-3a适用于疫苗，具体适用于RSV疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分B-3a中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分B-3a包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
组分B-3b：人类偏肺病毒：
在优选的实施方式中，组分B的所述至少一种其它病毒选自肺病毒科的至少一种偏肺病毒(在本文中也称为组分B-3b)。适合地，偏肺病毒选自人类偏肺病毒(hMPV)。
人类偏肺病毒(hMPV)是肺病毒科的负义单链RNA病毒，并且与禽偏肺病毒(Avianmetapneumovirus,AMPV)C亚群密切相关。它在2001年首次分离得到。它是仅次于人类正肺病毒(Human orthopneumovirus,RSV)的幼儿下呼吸道感染的第二大常见病因。hMPV在老年人中几乎与流感一样常见和严重。hMPV与患有哮喘的人群和患有慢性阻塞性肺病(COPD)的成人的较严重疾病有关。据报道，在儿童和成人的长期护理机构中爆发了多起hMPV，导致死亡。
在本发明的上下文中，可选择任何人类偏肺病毒(hMPV；NCBI分类ID:162145)，而不考虑基因型、种类、毒株、分离株或血清型。如本文提供的供使用的hMPV毒株的非限制性示例包括CAN98-75(CAN75)和CAN97-83(CAN83)hMPV毒株、hMPV Al、A2、B l或B2毒株、hMPV分离株TN/92-4(例如WO2017070626的SEQ ID NO:1和5)、hMPV分离株NL/1/99(例如WO2017070626的SEQ ID NO:2和6)、hMPV分离株PER/CFI0497/2010/B(例如WO2017070626的SEQ ID NO:3和7)或hMPV分离株00-1。
在一些实施方式中，偏肺病毒选自hMPV Al、A2、B l或B2毒株、CAN98-75(CAN75)hMPV毒株、CAN97-83(CAN83)hMPV、hMPV分离株TN/92-4(例如WO2017070626的SEQ ID NO:1和5)、hMPV分离株NL/1/99(例如WO2017070626的SEQ ID NO:2和6)、hMPV分离株PER/CFI0497/2010/B(例如WO2017070626的SEQ ID NO:3和7)。在一些实施方式中，偏肺病毒选自HMPV/TN/92-4、HMPV/NL/1/99、HMPV/萨巴纳或HMPV/00-1。
在一些实施方式中，由组分B的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括选自或衍生自至少一种hMPV F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白和/或SH蛋白的至少一种肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)的至少一种抗原性肽或蛋白质选自或衍生自hMPV F蛋白，或其免疫原性片段或变体。
在优选的实施方式中，选自或衍生自hMPV F蛋白的至少一种抗原性肽或蛋白是全长F蛋白(F0)或C端缺失的F蛋白(F-del)，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在优选的实施方式中，hMPV F蛋白选自或衍生自包含至少一个融合前稳定化突变的融合前稳定化F蛋白(F_stab)。
根据各种优选的实施方式，组分B的核酸编码至少一种如本文定义的来自hMPV的抗原性肽或蛋白质，以及另外地至少一种异源肽或蛋白质元件。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的hMPV抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善经编码的hMPV抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件)，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分B(具体是组分B-3b)的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
表13(第1至29行)提供了优选的如上定义的选自或衍生自hMPV的抗原性肽或蛋白质。其中，第1至29行中每一行与适合的hMPV构建物对应。表13的A列提供了对适合的hMPV抗原构建物的简短描述。表13的B列提供了各个hMPV抗原构建物的蛋白质(氨基酸)SEQ IDNO。表13的D列提供了对应的G/C优化的核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ ID NO。表13的E列提供了对应的人类密码子使用适应的核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ ID NO。
值得注意的是，本发明的描述明确包括在本申请的ST.25序列表的<223>标识符下提供的信息。优选的包含表13的编码序列的核酸构建物，例如包含表13的编码序列的mRNA序列提供在表14中。
表13：优选的hMPV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)：
Figure BDA0004113537810001171
Figure BDA0004113537810001181
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-3b)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种hMPV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14626-14649、26966-26971中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表13中提供(参见A列和B列的第1至29行)，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步的实施方式中，由组分B(具体是组分B-3b)的至少一种核酸编码的选自或衍生自hMPV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2017070626的SEQ ID NO:5-8中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2017070626的SEQ ID NO:5-8以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
其它hMPV抗原也可衍生自或选自可通过WO2017070626的表4中提供的GenBank登录号识别的蛋白质。WO2017070626的表4的全部内容通过引用并入本文。
根据优选的实施方式，组分B(具体是组分B-3b)的核酸包含编码至少一种如上定义的衍生自hMPV的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的hMPV抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体都可理解为是组分B的适合的编码序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自hMPV的抗原性肽或蛋白质，优选编码SEQ ID NO:14626-14649、26966-26971；WO2017070626的SEQ ID NO:5-8中的任一个的至少一个编码序列，或其片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与SEQ ID NO:14626-14649、26966-26971；WO2017070626的SEQ ID NO:5-8中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或其片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。关于所述氨基酸序列的其它信息也提供在表13、表14中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括编码hMPV抗原的核酸序列或由其组成，所述编码hMPV抗原的核酸序列包括下列或由下列组成：与选自SEQ ID NO:14650-14697、14698-14793、26972-26978、26979-26991的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表13、表14中，并且在相应序列SEQ IDNO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步的实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)的核酸包含编码序列，所述编码序列包括下列：编码hMPV抗原的、与选自已公开的PCT专利申请WO2017070626的SEQ ID NO:1-4、57-60的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列中的任一个，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。因此，WO2017070626的SEQ ID NO:1-4、57-60以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即hMPV肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。
在特别优选的实施方式中，核酸组分B(具体是组分B-3b)的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
表14(C列和D列)中提供了组分B(具体是组分B-3b)的优选核酸序列，包括特别优选的mRNA序列。其中，每一行代表本发明具体的适合的hMPV构建物(与表13比较)，其中hMPV构建物的描述在表14的A列中指示，而相应的hMPV构建物的氨基酸序列的SEQ ID NO在B列中提供。表13中提供了编码相应的hMPV构建物的编码序列的对应的SEQ ID NO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
表14：编码hMPV抗原的核酸，优选mRNA构建物
A B C D
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(F0) 14626 14698,14722 14746,14770
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14627 14699,14723 14747,14771
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14628 14700,14724 14748,14772
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14629 14701,14725 14749,14773
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14630 14702,14726 14750,14774
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14631 14703,14727 14751,14775
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14632 14704,14728 14752,14776
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14633 14705,14729 14753,14777
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14634 14706,14730 14754,14778
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14635 14707,14731 14755,14779
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14636 14708,14732 14756,14780
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14637 14709,14733 14757,14781
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14638 14710,14734 14758,14782
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14639 14711,14735 14759,14783
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14640 14712,14736 14760,14784
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14641 14713,14737 14761,14785
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14642 14714,14738 14762,14786
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14643 14715,14739 14763,14787
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14644 14716,14740 14764,14788
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14645 14717,14741 14765,14789
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14646 14718,14742 14766,14790
HMPV/TN/92-4融合糖蛋白(变体) 14647 14719,14743 14767,14791
HMPV/NL/1/99融合糖蛋白(F0) 14648 14720,14744,26979 14768,14792,26985
HMPV/萨巴纳融合糖蛋白(F0) 14649 14721,14745 14769,14793
HMPV/NL/1/99融合糖蛋白(变体) 26967 26980 26986
HMPV/NL/1/99融合糖蛋白(变体) 26968 26981 26987
HMPV/00-1融合糖蛋白(F0) 26969 26982 26988
HMPV/00-1融合糖蛋白(变体) 26970 26983 26989
HMPV/00-1融合糖蛋白(变体) 26971 26984 26990
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码hMPV抗原的、与选自SEQ ID NO:14698-14793、26979-26991的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表14(C列和D列)中提供。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在进一步的实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码hMPV抗原的、与选自WO2017070626的SEQ ID NO:57-60的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种hMPV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分B(具体是组分B-3b)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样定义。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同hMPV的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的hMPV表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的hMPV表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-3b)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的hMPV(例如，不同的hMPV分离株)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的hMPV”必须理解为至少两种相应的hMPV(例如不同的hMPV分离株)之间的差异，其中差异体现在相应不同的hMPV的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的hMPV可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分B-3b包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种hMPV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分B-3b优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分B-3b的肌内或皮内施用导致经编码的hMPV抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分B-3b的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的hMPV抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的hMPV抗原。
在优选的实施方式中，组分B-3b的施用引发针对由组分B-3b的至少一种核酸提供的经编码的hMPV抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分B-3b适用于疫苗，具体适用于hMPV疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分B-3中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分B-3包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
组分B-4：副粘病毒科病毒
在优选的实施方式中，组分B的所述至少一种其它病毒选自副粘病毒科(“副粘病毒”)的至少一种病毒。
必须理解“组分B”段落中描述的一般实施方式和特征也可适用于编码副粘病毒科抗原性肽或蛋白质的核酸。
副粘病毒科有4个亚科，17个属和77个种，其中3个属未分到亚科中。与这个科相关的疾病包括麻疹、腮腺炎和呼吸道感染。
在实施方式中，选自或衍生自副粘病毒的任何蛋白质都可用于本发明的上下文中并且可由组分B(具体是组分B-4)的编码序列或核酸编码。
适用于本发明上下文的是致病性副粘病毒，包括人类副流感病毒(hPIV)或亨尼帕病毒。
组分B-4a：副流感病毒(PIV)：
在优选的实施方式中，组分B的所述至少一种其它病毒选自副粘病毒科的至少一种副流感病毒(PIV)，优选副粘病毒科的人类副流感病毒(hPIV)(在本文中也称为组分B-4a)。
人类副流感病毒(hPIV)是婴儿和儿童呼吸道疾病的第二大最常见病因。hPIV病毒属于呼吸道病毒属(NCBI分类ID:186938)。副流感病毒也称为呼吸道病毒。有四种类型的hPIV，称为HPIV-1、HPIV-2、HPIV-3和HPIV-4。HPIV-1和HPIV-2可能会引起类似感冒的症状，连同儿童的哮吼。HPIV-3与细支气管炎、支气管炎和肺炎有关。HPIV-4不如其它类型那么常见，并且已知会引起轻微到严重的呼吸道疾病。在本发明的上下文中，可选择任何副流感病毒。
在本发明的上下文中，可选择任何副流感病毒，例如任何hPIV，而不管基因型、种类、菌株、分离株或血清型如何。
在实施方式中，至少一种人类hPIV选自hPIV-1、hPIV-2、hPIV-3或hPIV-4。
在实施方式中，至少一种人类hPIV可选自hPIV-1(别名，人类呼吸道病毒1，NCBI分类ID:12730)。在本发明的上下文中，hPIV-1病毒可选自hPIV-1(人类/华盛顿/1957；NCBI分类ID:11211)、hPIV-1(CI-14/83；NCBI分类ID:31606)、hPIV-1(CI-5/73；NCBI分类ID:31607)、hPIV-1(A1426/86-315/62M-753；NCBI分类ID:36412)、hPIV-1(C35；NCBI分类ID:31605)、hPIV-1(C39；NCBI分类ID:11210)、hPIV-1(华盛顿/1964；NCBI分类ID:188538)。
在实施方式中，至少一种人类hPIV可选自hPIV-3(别名，人类呼吸道病毒3，NCBI分类ID:11216)。在本发明的上下文中，hPIV-3病毒可选自hPIV-3(AUS/124854/74；NCBI分类ID:11218)、hPIV-3(NIH 47885；NCBI分类ID:11217)、hPIV-3(TEX/12677/83；NCBI分类ID:11221)、hPIV-3(TEX/545/80；NCBI分类ID:11219)、hPIV-3(TEX/9305/82；NCBI分类ID:11220)、hPIV-3(WASH/1511/73；NCBI分类ID:11223)、hPIV-3(WASH/641/79；NCBI分类ID:11222)、hPIV-3(Simian Agent 10；NCBI分类ID:929831)、hPIV-3(HPIV3/智人/PER/FLA4571/2008；NCBI分类ID:11216)或hPIV-3(HPIV3/USA/629-D01959/2007；NCBI分类ID:11216)。
在优选的实施方式中，至少一种人类hPIV选自如本文定义的hPIV-3病毒。
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-4a)的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括选自或衍生自以下的至少一种肽或蛋白质或由其组成：至少一种PIV血凝素-神经氨酸酶、融合(F)糖蛋白、基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、病毒复制酶(L)、非结构V蛋白，或其免疫原性片段。
PIV血凝素-神经氨酸酶(PIV HN)是一种结构蛋白，存在于病毒包膜上，这里是附着和进入细胞所必需的。它识别并结合宿主细胞表面上的含唾液酸受体。作为一种神经氨酸酶，HN去除病毒颗粒中的唾液酸，阻止病毒的自我聚集，以及促进病毒的高效传播。此外，HN促进融合(F或F0)蛋白的活性，从而有助于宿主细胞表面的穿透。
PIV融合蛋白(PIV F)位于病毒包膜上，在这里其促进病毒融合和细胞进入。F蛋白最初是无活性的，但蛋白酶剪切导致其活性形式——F1和F2，它们通过二硫键连接。当HN蛋白与宿主细胞表面上的受体结合时，就会发生这种情况。在感染早期，F糖蛋白通过将病毒包膜融合到质膜来介导宿主细胞的穿透。在感染后期，F蛋白促进感染细胞与邻近的未感染细胞融合，这会导致合胞体的形成和感染的传播。
PIV基质蛋白(PIV M)存在于病毒包膜内并且协助病毒组装。它与核衣壳和包膜糖蛋白相互作用，在这里其促进后代病毒的出芽——通过其与病毒糖蛋白的胞质尾区上的特异性位点和核衣壳相互作用。它还在将病毒组分运输到出芽位点方面发挥作用。
PIV磷蛋白(PIV P)和PIV大聚合酶蛋白(L)存在于核衣壳中，在这里它们构成RNA聚合酶复合物的一部分。L蛋白——一种病毒RNA依赖性RNA聚合酶——促进基因组转录，而宿主细胞的核糖体将病毒mRNA翻译成病毒蛋白。
PIV V是一种非结构蛋白，其阻断受感染细胞中的IFN信号传导，因此充当毒力因子。
PIV核蛋白(N)以每6个核糖核苷酸1个N的比例包封基因组，从而使其免受核酸酶的影响。核衣壳(NC)具有螺旋结构。包封的基因组RNA称为NC并充当转录和复制的模板。在复制过程中，PIV3 N的包封与RNA合成偶联，并且所有复制产物都对核酸酶具有抗性。PrV3N同源多聚化形成核衣壳并与病毒基因组RNA结合。PrV3 N结合P蛋白，从而在模板上定位聚合酶。
根据各种优选的实施方式，组分B的核酸编码至少一种如本文定义的来自PIV的抗原性肽或蛋白质，以及另外地至少一种异源肽或蛋白质元件。
适合地，所述至少一种异源肽或蛋白质元件可促进或改善经编码的PIV抗原性肽或蛋白质的分泌(例如经由分泌信号序列)，促进或改善经编码PIV抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改善抗原复合物的形成(例如经由多聚化结构域或抗原聚集元件)，或促进或改善病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。此外，组分B(具体是组分B-4a)的核酸可另外地编码肽连接体元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
优选的如上定义的选自或衍生自hPIV的抗原性肽或蛋白质在表15中提供。其中，每一行与适合的hPIV构建物对应。表15的A列提供了对适合的hPIV抗原构建物的简短描述。表15的B列提供了各个hPIV抗原构建物的蛋白质(氨基酸)SEQ ID NO。表15的D列提供了对应的G/C优化的核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ ID NO。表15的E列提供了对应的人类密码子使用适应的核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ ID NO。
值得注意的是，本发明的描述明确包括在本申请的ST.25序列表的<223>标识符下提供的信息。优选的包含表15的编码序列的核酸构建物，例如包含表15的编码序列的mRNA序列提供在表16中。
表15：优选的PIV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)：
A B D E
HPIV3/智人/PER/FLA4571/2008融合糖蛋白(F0) 14612 14614,26960 14616
HPIV3/BJ/001/08血凝素-神经氨酸酶(HN) 14613 14615 14617
HPIV3/USA/629-D01959/2007融合糖蛋白(F0) 26956 26958
HPIV3/USA/629-D01959/2007融合糖蛋白(变体) 26957 26959
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-4a)的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种PIV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14612、14613、26956、26957中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。关于所述氨基酸序列的其它信息也在表15(A列和B列)中提供，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在进一步的实施方式中，由组分B(具体是组分B-4a)的至少一种核酸编码的选自或衍生自PIV的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2017070626的SEQ ID NO:13-14中的任一个同一或具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。因此，WO2017070626的SEQ ID NO:13-14以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。其它PIV抗原也可衍生自或选自可通过WO2017070626的表7中提供的GenBank登录号识别的蛋白质。WO2017070626的表7的全部内容通过引用并入本文。
根据优选的实施方式，组分B(具体是组分B-4a)的核酸包含编码至少一种如上定义的衍生自PIV的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的PIV抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体都可理解为是组分B的适合的编码序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)的核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自PIV的抗原性肽或蛋白质，优选编码SEQ ID NO:14612、14613、26956、26957；WO2017070626的SEQ ID NO:13-14中的任一个的至少一个编码序列，或其片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与SEQ ID NO:14612、14613、26956、26957；WO2017070626的SEQ ID NO:13-14中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或其片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。关于所述氨基酸序列的其它信息也提供在表15(A列和B列)、表16中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括编码PIV抗原的核酸下列或由其组成，所述编码PIV抗原的核酸下列包括下列或有下列组成：与选自SEQ ID NO:14614-14625、26958-26965的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于所述核酸序列的其它信息也提供在表15、表16中，并且在相应序列SEQ ID NO的ST.25序列表的<223>标识符下提供。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)的核酸包含编码序列，所述编码序列包括编码hPIV抗原的、与选自已公开的PCT专利申请WO2017070626的SEQ ID NO:9-12、61-64的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列中的任一个，或这些序列中任意者的片段或片段或变体。因此，WO2017070626的SEQ ID NO:9-12、61-64以及与其相关的对应的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即PIV肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。
在特别优选的实施方式中，核酸组分B(具体是组分B-4a)的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
表16(C列和D列)中提供了组分B(具体是组分B-4a)的优选核酸序列，包括特别优选的mRNA序列。其中，每一行代表本发明具体的适合的PIV构建物(与表15比较)，其中PIV构建物的描述在表16的A列中指示，而相应的PIV构建物的氨基酸序列的SEQ ID NO在B列中提供。表15中提供了编码相应的PIV构建物的编码序列的对应的SEQ ID NO。其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供。
表16：编码PIV抗原的核酸优选mRNA构建物
A B C D
HPIV3/智人/PER/FLA4571/2008融合糖蛋白(F0) 14612 14618,14620 14622,14624
HPIV3/BJ/001/08血凝素-神经氨酸酶(HN) 14613 14619,14621 14623,14625
HPIV3/USA/629-D01959/2007融合糖蛋白(F0) 26956 26961 26963
HPIV3/USA/629-D01959/2007融合糖蛋白(变体) 26957 26962 26964
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码PIV抗原的、与选自SEQ ID NO:14618-14625、26961-26965的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。关于相应的核酸序列的其它信息在序列表中相应的SEQ ID NO的<223>标识符下提供，并且在表16(C列和D列)中提供。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在进一步的实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)的核酸，优选RNA，包含下列或由下列组成：编码hPIV抗原的、与选自WO2017070626的SEQ ID NO:61-64的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种hPIV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分B(具体是组分B-4a)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样定义。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同hPIV的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的hPIV表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的hPIV表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-4a)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的hPIV(例如，不同的hPIV分离株)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的hPIV”必须理解为至少两种相应的hPIV(例如不同的hPIV分离株)之间的差异，其中差异体现在相应不同的hPIV的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的hPIV可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分B-4a包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种PIV的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分B-4a优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分B-4a的肌内或皮内施用导致所编码的PIV抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分B-4a的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的PIV抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的PIV抗原。
在优选的实施方式中，组分B-4a的施用引发针对由组分B-4a的至少一种核酸提供的经编码的PIV抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分B-4a适用于疫苗，具体适用于PIV疫苗，优选本发明的组合疫苗。
优选地，组分B-4a适用于疫苗，具体适用于RSV疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分B-4a中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分B-4a包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
组分B-4b：亨尼帕病毒：
在实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)的所述至少一种其它病毒选自副粘病毒科的至少一种亨尼帕病毒。
术语“亨尼帕病毒”涉及亨尼帕病毒属的任何病毒，而不管其基因型、种类、毒株、分离株或血清型(NCBI分类ID:260964)如何。术语亨尼帕病毒涉及包括选自但不限于松湾亨尼帕病毒(Cedar henipavirus)或松湾病毒(Cedar virus)(NCBI分类ID:1221391)、加纳蝙蝠亨尼帕病毒(Ghanaian bat henipavirus)或蝙蝠副粘病毒(NCBI分类ID:665603)、墨江亨尼帕病毒(Mojiang henipavirus)或墨江病毒(Mojiang virus)(NCBI分类ID:1474807)、亨德拉病毒(NCBI分类ID:928303)、尼帕病毒(NCBI分类ID:121791)的病毒株的病毒属。
在优选的实施方式中，所述至少一种亨尼帕病毒选自至少一种亨德拉病毒和/或至少一种尼帕病毒。
在实施方式中，由组分B(具体是组分B-4b)的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括至少一种肽或蛋白质或由其组成，所述至少一种肽或蛋白质选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒RNA指导的RNA聚合酶(L)、亨尼帕病毒融合蛋白(F)、亨尼帕病毒非结构蛋白(V)、亨尼帕病毒糖蛋白(G)、亨尼帕病毒核蛋白(N)、亨尼帕病毒基质蛋白(M)、亨尼帕病毒磷蛋白(P)、亨尼帕病毒C蛋白和亨尼帕病毒W蛋白。
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-4b)的至少一种核酸编码的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒糖蛋白和/或至少一种亨尼帕病毒融合蛋白的至少一种肽或蛋白质，或其片段或变体。
在优选的实施方式中，由组分B(具体是组分B-4b)的至少一种核酸编码的、选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:1-26、573-598、807-832、1041-1066、1513-1515中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。值得注意的是，已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:1-26、573-598、807-832、1041-1066、1513-1515以及与其相关的对应的公开内容(例如WO2018115507的表1、表1B、表2、表2B，或权利要求1-43)通过引用并入本文。
根据优选的实施方式，组分B(具体是组分B-4b)的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如上定义的衍生自亨尼帕病毒，具体是亨德拉病毒或尼帕病毒的抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列，或其片段和变体。在这种上下文中，编码至少一种如本文定义的亨尼帕病毒抗原性蛋白质的任何编码序列，或其片段和变体可被理解为是组分B的适合的编码序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码至少一种如本文定义的选自或衍生自亨尼帕病毒，具体是亨德拉病毒或尼帕病毒的抗原性肽或蛋白质，优选编码已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:1-26、573-598、807-832、1041-1066、1513-1515中的任一个的至少一个编码序列，或其片段或变体。必须理解，在核酸水平上，可选择编码与已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQID NO:1-26、573-598、807-832、1041-1066、1513-1515中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)，或其片段或变体，因此其可被理解为是本发明的适合的编码序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)的至少一种核酸的至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码亨尼帕病毒抗原，优选亨德拉病毒或尼帕病毒抗原的、与已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:27-234、599-806、833-1040、1067-1274、1275-1508、1516-1539、1540-1548中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。值得注意的是，已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:27-234、599-806、833-1040、1067-1274、1275-1508、1516-1539、1540-1548以及与其相关的对应的公开内容(例如WO2018115507的表5、6、7，或权利要求1-43)通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)的核酸的至少一个编码序列是如本文定义的密码子修饰的编码序列，其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列，即亨尼帕病毒肽或蛋白质，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，优选未被修饰。
在特别优选的实施方式中，核酸组分B(具体是组分B-4b)的至少一个编码序列是编码亨尼帕病毒抗原的密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列适合地选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
在优选的实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)的至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码亨尼帕病毒抗原，优选亨德拉病毒或尼帕病毒抗原的、与选自已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:1275-1508、1540-1548的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。值得注意的是，已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:1275-1508、1540-1548以及与其相关的对应的公开内容(例如WO2018115507的表5、6、7，或权利要求1-43)通过引用并入本文。任选地，所述核酸序列包含如本文定义的帽1结构，和/或所述RNA序列中至少一个，优选全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)包含多种或至少多于一种核酸种类，这些核酸种类包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒，优选亨德拉病毒或尼帕病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，例如，如本文定义的DNA或RNA种类。优选地，如本文定义的组分B(具体是组分B-4b)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸，每一种均如本文定义的那样。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自相同亨尼帕病毒的抗原性肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的亨尼帕病毒表达(基本上)相同的蛋白质或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的亨尼帕病毒表达基本上相同的蛋白质、肽或多蛋白，其中这些蛋白质、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列(一个或多个)上没有差异。
在实施方式中，组分B(具体是组分B-4b)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸种类，例如DNA或RNA，如本文定义的，其各自编码至少一种衍生自遗传上不同的亨尼帕病毒(例如，不同的亨尼帕病毒株或分离株)的肽或蛋白质，或其片段或变体。如在整个本说明书中使用的术语“不同的”或“不同的亨尼帕病毒”必须理解为至少两种相应的亨尼帕病毒(例如不同的亨尼帕病毒株或分离株)之间的差异，其中差异体现在相应不同的亨尼帕病毒的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的亨尼帕病毒可表达至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白在至少一个氨基酸上有差异。
在优选的实施方式中，组分B-4b包含至少一种核酸，其编码选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组分B-4b优选肌内或皮内施用。
优选地，所述组分B-4b的肌内或皮内施用导致经编码的亨尼帕病毒抗原构建物在对象中表达。在核酸是RNA的实施方式中，组分B-4b的施用导致RNA在对象中翻译和产生经编码的亨尼帕病毒抗原。在核酸是DNA(例如质粒DNA、腺病毒DNA)的实施方式中，施用所述组合物导致在对象中DNA转录成RNA，并随后将RNA翻译成经编码的亨尼帕病毒抗原。
在优选的实施方式中，组分B-4b的施用引发针对由组分B-4b的至少一种核酸提供的经编码的亨尼帕病毒抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
优选地，组分B-4b适用于疫苗，具体适用于亨尼帕病毒疫苗，优选本发明的组合疫苗。
在实施方式中，包含在如本文定义的组分B-4b中的核酸以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
如果组分B-4b包含多种或至少多于一种如本文定义的核酸种类，则每种核酸种类的核酸的量以下列量来提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
在一些实施方式中，每种核酸种类的核酸的量在质量上基本相等。在其它实施方式中，每种核酸种类的核酸的量被选择为是等摩尔的。
核酸特征和实施方式：
在下文中，进一步指定与包含在药物组合物中的核酸相关的适合的特征和实施方式。具体地，进一步指定涉及组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)和/或组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)的核酸的适合的特征和实施方式。
因此，下文中提供的特征和实施方式可被理解为是(i)至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体(组分A，具体是组分A-1、A-2、A-3)的适合的特征和实施方式。下文中提供的特征和实施方式可被理解为是(ii)至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体(组分B，具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B4a、B4b)的适合的特征和实施方式。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是人工核酸，例如人工DNA或人工RNA。
本文所用的术语“人工核酸”意指并非天然存在的核酸。换言之，人工核酸可以理解为非天然核酸分子。这种核酸分子，由于其个体序列(例如G/C含量修饰的编码序列，UTR)和/或由于其它修饰(例如，核苷酸的结构修饰)，可以是非天然的。一般，可以通过基因工程设计和/或生成人工核酸，以相应于期望的人工核苷酸序列。在这种上下文中，人工核酸是可不天然存在的序列，即其至少一个核苷酸区别于野生型或对照序列/天然存在的序列(经由例如下文进一步指定的密码子修饰)。术语“人工核酸”不限于表示“一个分子”，而是被理解为包含基本相同核酸分子的总体。因此，它可涉及多个基本相同的核酸分子。如本文所用的术语“人工核酸”可例如涉及人工DNA或优选地涉及人工RNA。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，例如DNA或RNA，是修饰的和/或稳定化核酸，优选修饰的和/或稳定化人工核酸。
根据优选的实施方式，组分A和/或组分B的核酸因此可作为“稳定化人工核酸”或“稳定化编码核酸”提供，也就是说显示出对体内降解的提高的抗性的核酸和/或显示出提高的体内稳定性的核酸，和/或显示出提高的体内可翻译性的核酸。在下文中，描述了适合地使核酸“稳定”的此上下文中具体的适合的修饰/改编。优选地，本发明的核酸可作为“稳定化RNA”、“稳定化编码RNA”、“稳定化DNA”或“稳定化编码DNA”提供。
在下文中，描述了能够使组分A和/或组分B的核酸“稳定”的适合的修饰。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，例如RNA或DNA，包含至少一个密码子修饰的编码序列。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列。适合地，与对应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，由至少一个密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列未被修饰。
术语“密码子修饰的编码序列”涉及与对应野生型或参考编码序列相比，在至少一个密码子(编码一个氨基酸的核苷酸三联体)上不同的编码序列。适合地，本发明上下文中的密码子修饰的编码序列可显示出对体内降解的提高的抗性和/或提高的体内稳定性，和/或提高的体内可翻译性。最广泛意义上的密码子修饰利用了遗传密码的简并性，其中多个密码子可编码相同的氨基酸并且可互换使用(参见WO2020002525的表1)来优化/修饰如上概述的体内应用的编码序列。
在优选实施方式中，组分A和/或组分B的核酸的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自C最大化编码序列、CAI最大化编码序列、人类密码子使用适应的编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列，或其任意组合。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸的至少一个编码序列具有至少约50％、55％或60％的G/C含量。在具体实施方式中，组分A和/或组分B的核酸的至少一个编码序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％的G/C含量。
当转染到哺乳动物宿主细胞中时，包含密码子修饰的编码序列的组分A和/或组分B的核酸具有12-18小时或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞(例如肌肉细胞)表达。
当转染到哺乳动物宿主细胞中时，包含密码子修饰的编码序列的组分A和/或组分B的核酸被翻译成蛋白质，其中蛋白质的量至少相当于，或优选至少多10％，或至少多20％，或至少多30％，或至少多40％，或至少多50％，或至少多100％，或至少多200％，或多于转染到哺乳动物宿主细胞中的天然存在的或野生型或参考编码序列所获得的蛋白质的量。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可被修饰，其中与对应野生型或参考编码序列的C含量相比，至少一个编码序列的C含量可增加，优选最大化(在本文中称为“C最大化编码序列”)。与由相应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，由核酸的C最大化编码序列编码的氨基酸序列优选未被修饰。可使用根据WO2015/062738的修饰方法适合地进行C最大化核酸序列的产生。在此上下文中，WO2015/062738的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可被修饰，其中与对应野生型或参考编码序列的G/C含量相比，至少一个编码序列的G/C含量可被优化(在本文中称为“G/C内容优化的编码序列”)。该上下文中的“优化的”是指这样的编码序列，其中G/C含量优选增加到基本上最高的可能的G/C含量。核酸的G/C含量优化的编码序列所编码的氨基酸序列与相应野生型或参考编码序列所编码的氨基序列相比优选未被修饰。G/C含量优化的核酸序列(RNA或DNA)的产生可使用根据WO2002/098443的方法进行。在这种上下文中，WO2002/098443的公开内容包含在本发明的整个范围内。在包括序列表的<223>标识符在内的整个说明书中，G/C优化的编码序列由缩写“opt1”或“GC”指示。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可被修饰，其中至少一个编码序列中的密码子可适应人类密码子使用(在本文中称为“人类密码子使用适应的编码序列”)。在人类中编码相同氨基酸的密码子以不同的频率出现。因此，根据人类密码子使用，核酸的编码序列优选被修饰使得编码相同氨基酸的密码子的频率对应该密码子的天然存在的频率。例如，在氨基酸Ala的情况下，野生型或参考编码序列优选以如下方式进行适应：密码子“GCC”以0.40的频率使用，密码子“GCT”以0.28的频率使用，密码子“GCA”以0.22的频率使用，以及密码子“GCG”以0.10的频率使用等(参见例如WO2020002525的表1)。因此，这样的程序(如关于Ala所举例说明)适用于由核酸的编码序列编码的每个氨基酸，以获得适合人类密码子使用的序列。在整个描述中，包括序列表的<223>标识符，人类密码子使用适应的编码序列由缩写“opt3”或“人类”表示。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可被修饰，其中与对应野生型或参考编码序列的G/C含量相比，至少一个编码序列的G/C含量可被修饰(在本文中称为“G/C含量修饰的编码序列”)。在这种上下文中，术语“G/C优化”或“G/C含量修饰”涉及与对应的野生型或参考编码序列相比，包含修饰的，优选增加数量的鸟苷和/或胞嘧啶核苷酸的核酸。这种增加的数量可通过用含有鸟苷或胞嘧啶核苷酸的密码子取代含有腺苷或胸腺嘧啶核苷酸的密码子来产生。有利地，具有增加的G/C含量的核酸序列比具有增加的A/U的序列更稳定或表现出更好的表达。与相应的野生型或参考序列编码的氨基酸序列相比，由组分A和/或组分B的核酸的G/C含量修饰的编码序列编码的氨基酸序列优选未被修饰。优选地，核酸的编码序列的G/C含量与对应野生型或参考核酸序列的编码序列的G/C含量相比增加至少10％、20％、30％，优选增加至少40％(在本文中称为“opt 10”或“gc mod”)。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可被修饰，其中在至少一个编码序列中密码子适应指数(CAI)可以被增加或优选地被最大化(在本文中称为“CAI最大化编码序列”)。优选的是，在例如人类中相对稀有的野生型或参考核酸序列的所有密码子被交换为在例如人类中常见的相应的密码子，其中常见的密码子与相对稀有的密码子编码相同的氨基酸。适合地，最常见的密码子用于经编码的蛋白质的各个氨基酸(参见WO2020002525的表1，用星号标记最常见的人类密码子)。适合地，核酸包括至少一个编码序列，其中所述至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。最优选地，所述至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为1(CAI＝1)。例如，在氨基酸Ala的情况下，野生型或参考编码序列以如下方式适应：最常见的人类密码子“GCC”总是用于所述氨基酸。因此，这样的程序(如关于Ala所举例说明)适用于由核酸的编码序列编码的每个氨基酸，以获得CAI最大化编码序列。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可通过相对于原始核酸序列(例如野生型或参考序列)中A和/或U核苷酸的数量改变核酸序列中A和/或U核苷酸的数量来修饰。优选地，进行这样的AU改变以修改单个核酸在组合物中的保留时间，从而(i)允许使用HPLC方法进行共纯化，和/或允许对所获得的核酸组合物进行分析。这种方法在已公开的PCT申请WO2019092153A1中有详细描述。WO2019092153A1的权利要求1至70通过引用并入本文。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，其中密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C修饰的编码序列。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个异源非翻译区(UTR)。
术语“非翻译区”或“UTR”或“UTR元件”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指一般位于编码序列的5’或3’的核酸分子的一部分。UTR不翻译成蛋白质。UTR可以是核酸，例如DNA或RNA的一部分。UTR可包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这样的调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点、启动子元件等。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含蛋白质编码区(“编码序列”或“cds”)和5’-UTR和/或3’-UTR。值得注意的是，UTR可携带决定核酸例如RNA周转(turnover)、稳定性和定位的调节序列元件。此外，UTR可携带增强翻译的序列元件。在核酸序列(包括DNA和RNA)的医学应用中，将核酸翻译成至少一种肽或蛋白质对于治疗功效至关重要。3’-UTR和/或5’-UTR的某些组合可增强编码本发明的肽或蛋白质的可操作地连接的编码序列的表达。携带所述UTR组合的核酸分子有利地使抗原性肽或蛋白质在向对象施用后——优选肌内施用后——快速和瞬时表达。因此，如本文提供的包含3’-UTR和/或5’-UTR的某些组合的组分A和/或组分B的核酸特别适合作为疫苗施用，具体适合施用到对象的肌肉、真皮或表皮中。
适合地，组分A和/或组分B的核酸包含至少一种异源5’-UTR和/或至少一种异源3’-UTR。所述异源5’-UTR或3’-UTR可衍生自天然存在的基因或可在合成上经改造。在优选实施方式中，核酸，优选RNA包含至少一种如本文定义的编码序列，其可操作地连接到至少一种(异源)3’-UTR和/或至少一种(异源)5’-UTR。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，例如RNA或DNA包含至少一个异源3’-UTR。
术语“3’-非翻译区”或“3’-UTR”或“3’-UTR元件”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指核酸分子的位于编码序列的3’(即下游)并且不翻译成蛋白质的部分。3’-UTR可以是核酸例如DNA或RNA的一部分，位于编码序列与(任选的)末端聚(A)序列之间。3’-UTR可包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这样的调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点等。
优选地，组分A和/或组分B的核酸包含3’-UTR，其可衍生自与具有增强的半衰期的RNA相关的基因(即提供稳定的RNA)。
在一些实施方式中，3’-UTR包括聚腺苷酸化信号、影响细胞内核酸定位稳定性的蛋白质结合位点或一种或多种miRNA或miRNA结合位点中的一个或多个。
微小RNA(或miRNA)是19-25个核苷酸长的非编码RNA，其与核酸分子的3’-UTR结合并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。例如，已知微小RNA调节RNA，从而调节例如在肝脏(miR-122)、心脏(miR-ld、miR-149)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)中的蛋白质表达。RNA可包括一种或多种微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA种子。这样的序列可以例如对应于任何已知的微小RNA，如US20050261218和US20050059005中教导的那些。
因此，miRNA或上文限定的miRNA的结合位点可以从3’-UTR中去除或者可以引入到3’-UTR中，从而使核酸例如DNA或RNA的表达适应期望的细胞类型或组织(例如肌肉细胞)。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个异源3’-UTR，其中所述至少一个异源3’-UTR包含下列：衍生自或选自选自PSMB3、ALB7、α-球蛋白(称为“muag”)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR的核酸序列，或衍生自或选自这些基因中任一个的同源物、片段或变体，优选根据与SEQ ID NO:253-268、22902-22905、22892-22895同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些中任意者的片段或变体。该上下文中特别优选的核酸序列可衍生自已公开的PCT申请WO2019077001A1，具体是WO2019077001A1的权利要求9。WO2019077001A1的权利要求9的对应3’-UTR序列通过引用并入本文(例如，WO2019077001A1的SEQ ID NO:23-34，或其片段或变体)。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含衍生自α-珠蛋白基因的3’-UTR。所述衍生自α珠蛋白基因(“muag”)的3’-UTR可包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:267、268、22896-22901、22906-22911同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在进一步的实施方式中，核酸包含衍生自RPS9基因的3’-UTR。所述衍生自RPS9基因的3’-UTR可包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:263、264、22894、22895、22904、22905同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在其它实施方式中，核酸包含3’-UTR，所述3’-UTR包含下列或由下列组成：与SEQID NO:22876-22891同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含衍生自PSMB3基因的3’-UTR。所述衍生自PSMB3基因的3’-UTR可包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:253或254同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在其它实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可包含如WO2016107877中描述的3’-UTR，WO2016107877中关于3’-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。适合的3’-UTR是WO2016107877的SEQ ID NO:1-24和SEQ ID NO:49-318，或这些序列的片段或变体。在其它实施方式中，核酸包含如WO2017036580中描述的3’-UTR，WO2017036580中涉及3’-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。适合的3’-UTR是WO2017036580的SEQ ID NO:152-204，或这些序列的片段或变体。在其它实施方式中，核酸包含如WO2016022914中描述的3’-UTR，WO2016022914中涉及3’-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的3’-UTR是根据WO2016022914的SEQ ID NO:20-36的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，例如RNA或DNA，包含至少一个异源5’-UTR。
术语“5’-非翻译区”或“5’-UTR”或“5’-UTR元件”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指核酸分子的位于编码序列的5’(即“上游”)并且不翻译成蛋白质的部分。5’-UTR可以是核酸的位于编码序列的5’的部分。一般，5’-UTR从转录起始位点开始，在编码序列的起始密码子前结束。5’-UTR可包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这样的调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点等。5’-UTR可以是转录后修饰的，例如通过酶促或转录后添加5’-帽结构(例如，对于如下定义的mRNA而言)。
优选地，组分A和/或组分B的核酸包含5’-UTR，其可衍生自与具有增强的半衰期的RNA相关的基因(即提供稳定的RNA)。
在一些实施方式中，5’-UTR包括影响细胞内RNA稳定性或RNA定位的蛋白质结合位点或一种或多种miRNA或miRNA结合位点中的一个或多个(如上文定义)。
因此，miRNA或上文定义的miRNA的结合位点可以从5’-UTR中去除或引入到5’-UTR中，从而使核酸的表达适应期望的细胞类型或组织(例如肌肉细胞)。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个异源5’-UTR，其中所述至少一个异源5’-UTR包含下列：衍生自或选自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5’-UTR的核酸序列，或衍生自或选自这些基因中任一个的同源物、片段或变体，其根据与SEQ ID NO:231-252、22870-22875同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些中任意者的片段或变体。该上下文中特别优选的核酸序列可选自已公开的PCT申请WO2019077001A1，具体是WO2019077001A1的权利要求9。WO2019077001A1的权利要求9的对应5’-UTR序列通过引用并入本文(例如，WO2019077001A1的SEQ ID NO:1-20，或其片段或变体)。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含衍生自RPL31基因的5’-UTR，其中所述衍生自RPL31基因的5’-UTR包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:243、244、22872、22873同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可包含衍生自SLC7A3基因的5’-UTR，其中所述衍生自SLC7A3基因的5’-UTR包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:245、246、22874、22875同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含衍生自或选自HSD17B4基因的5’-UTR，其中所述衍生自HSD17B4基因的5’-UTR包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:231、232、22870、22871同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在其它实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含5’-UTR，所述5’-UTR包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:22848-22869同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在其它实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可包含如WO2013143700中描述的5’-UTR，WO2013143700中关于5’-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是衍生自WO2013143700的SEQ ID NO:1-1363、SEQ ID NO:1395、SEQ ID NO:1421和SEQ IDNO:1422的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其它实施方式中，核酸包含WO2016107877中描述的5’-UTR，WO2016107877中涉及5’-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是根据WO2016107877的SEQ ID NO:25-30和SEQ ID NO:319-382的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其它实施方式中，核酸包含如WO2017036580中描述的5’-UTR，WO2017036580中涉及5’-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是根据WO2017036580的SEQ ID NO:1-151的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其它实施方式中，核酸包含如WO2016022914中描述的5’-UTR，WO2016022914中关于5’-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是根据WO2016022914的SEQ ID NO:3-19的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个如本文指定的编码至少一种如本文定义的抗原性蛋白质的编码序列，其可操作地连接至选自下列5’UTR/3’UTR组合(“也称为UTR设计”)的3’-UTR和/或5’-UTR：a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-2(NDUFA4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、a-4(NOSIP/PSMB3)、a-5(MP68/PSMB3)、b-1(UBQLN2/RPS9)、b-2(ASAH1/RPS9)、b-3(HSD17B4/RPS9)、b-4(HSD17B4/CASP1)、b-5(NOSIP/COX6B1)、c-1(NDUFA4/RPS9)、c-2(NOSIP/NDUFA1)、c-3(NDUFA4/COX6B1)、c-4(NDUFA4/NDUFA1)、c-5(ATP5A1/PSMB3)、d-1(Rpl31/PSMB3)、d-2(ATP5A1/CASP1)、d-3(SLC7A3/GNAS)、d-4(HSD17B4/NDUFA1)、d-5(Slc7a3/Ndufa1)、e-1(TUBB4B/RPS9)、e-2(RPL31/RPS9)、e-3(MP68/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、e-5(ATP5A1/RPS9)、e-6(ATP5A1/COX6B1)、f-1(ATP5A1/GNAS)、f-2(ATP5A1/NDUFA1)、f-3(HSD17B4/COX6B1)、f-4(HSD17B4/GNAS)、f-5(MP68/COX6B1)、g-1(MP68/NDUFA1)、g-2(NDUFA4/CASP1)、g-3(NDUFA4/GNAS)、g-4(NOSIP/CASP1)、g-5(RPL31/CASP1)、h-1(RPL31/COX6B1)、h-2(RPL31/GNAS)、h-3(RPL31/NDUFA1)、h-4(Slc7a3/CASP1)、h-5(SLC7A3/COX6B1)、i-1(SLC7A3/RPS9)、i-2(RPL32/ALB7)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-珠蛋白基因)。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含编码至少一种如本文定义的抗原性蛋白质的至少一种如本文定义的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接至HSD17B4 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR(HSD17B4/PSMB3(UTR设计a-1))。
在进一步优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含编码至少一种如本文定义的抗原性蛋白质的至少一种如本文指定的编码序列，优选衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，其中所述编码序列可操作地连接至SLC7A3 5’-UTR和PSMB33’-UTR(SLC7A3/PSMB3(UTR设计a-3))。
在进一步优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含编码至少一种如本文定义的抗原性蛋白质的至少一种如本文指定的编码序列，优选衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，其中所述编码序列可操作地连接至RPL31 5’-UTR和RPS9 3’-UTR(RPL31/RPS9(UTR设计e-2))。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含编码至少一种如本文定义的抗原性蛋白质的至少一种如本文定义的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接至α-珠蛋白(“muag”)3’-UTR。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，例如DNA或RNA可以是单顺反子、双顺反子或多顺反子的。
术语“单顺反子”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指仅包含一个编码序列的核酸。如本文所用的术语“双顺反子”或“多顺反子”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指可包含两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)编码序列的核苷酸。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是单顺反子的。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是单顺反子的，并且所述核酸的编码序列编码至少两种不同的抗原性肽或蛋白质。因此，所述编码序列可编码至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种和更多种抗原性肽或蛋白质，这些抗原性肽或蛋白质连接或不连接氨基酸连接体序列，其中所述连接体序列可包括刚性连接体、柔性连接体、可切割连接体或其组合。此类构建物在本文中称为“多抗原构建物”。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可以是双顺反子或多顺反子的，并且包含至少两个编码序列，其中所述至少两个编码序列编码两种或更多种不同的如本文指定的抗原性肽或蛋白质。因此，双顺反子或多顺反子核酸中的编码序列适合地编码如本文定义的不同的抗原性蛋白质或肽或其免疫原性片段或免疫原性变体。优选地，所述双顺反子或多顺反子构建物中的编码序列可被至少一个IRES(内部核糖体进入位点)序列隔开。因此，术语“编码两种或更多种抗原性肽或蛋白质”可意为(而不限于此)双顺反子或多顺反子核酸编码病毒分离株的例如至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种(优选不同的)抗原性肽或蛋白质。可选地，双顺反子或多顺反子核酸可编码例如至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种(优选不同的)衍生自同一病毒的抗原性肽或蛋白质。在此上下文中，适合的IRES序列可选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1566-1662的核酸序列的列表，或这些序列的片段或变体。在此上下文中，WO2017081082中涉及IRES序列的公开内容通过引用并入本文。
必须理解，在本发明的上下文中，编码序列的某些组合可通过单顺反子、双顺反子和多顺反子DNA和/或RNA构建物和/或多抗原构建物的任意组合产生，以获得编码如本文定义的多种抗原性肽或蛋白质的核酸组(nucleic acid set)。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸的核糖体结合位点环境中的A/U(A/T)含量与其相应的野生型或参考核酸的核糖体结合位点环境中的A/U(A/T)含量相比可以是增加的。此修饰(核糖体结合位点周围的A/U(A/T)含量增加)提高了核糖体与核酸(例如与RNA)结合的效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合进而具有有效翻译核酸的效果。
因此，在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含核糖体结合位点，也称为“Kozak序列”，其与序列SEQ ID NO:180、181、22845-22847中的任一个或其片段或变体同一或具有至少80％、85％、90％、95％同一性。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个聚(N)序列，例如至少一个聚(A)序列、至少一个聚(U)序列、至少一个聚(C)序列或其组合。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选RNA包含至少一个聚(A)序列。
如本文使用的术语“聚(A)序列”、“聚(A)尾”或“3’-聚(A)尾”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是腺苷核苷酸的序列，一般位于线性RNA(或环状RNA中)的3’-端处，具有至多约1000个腺苷核苷酸。优选地，所述聚(A)序列基本上是均聚的，例如，例如100个腺苷核苷酸的聚(A)序列具有基本上100个核苷酸的长度。在其它实施方式中，聚(A)序列可被不同于腺苷核苷酸的至少一个核苷酸打断，例如，例如100个腺苷核苷酸的聚(A)序列可具有多于100个核苷酸的长度(包含100个腺苷核苷酸以及除此之外所述至少一个核苷酸——或一段序列的核苷酸——不同于腺苷核苷酸)。必须理解，如本文定义的“聚(A)序列”一般涉及RNA——然而在本发明的上下文中，该术语同样涉及DNA分子中对应的序列(例如“聚(T)序列”)。
聚(A)序列可包含约10至约500个腺苷核苷酸、约10至约200个腺苷核苷酸、约40至约200个腺苷核苷酸或约40至约150个腺苷核苷酸。适合地，聚(A)序列的长度可为至少约或甚至多于约10、50、64、75、100、200、300、400或500个腺苷核苷酸。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个包含约30至约200个腺苷核苷酸的聚(A)序列。在特别优选的实施方式中，聚(A)序列包含约64个腺苷核苷酸(A64)。在其它特别优选的实施方式中，聚(A)序列包含约100个腺苷核苷酸(A100)。在其它实施方式中，聚(A)序列包含约150个腺苷核苷酸。
在进一步的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个包含约100个腺苷核苷酸的聚(A)序列，其中聚(A)序列被非腺苷核苷酸打断，优选被10个非腺苷核苷酸打断(A30-N10-A70)。
如本文定义的聚(A)序列可正好位于组分A和/或组分B的核酸的3’端，优选正好位于RNA的3’端。在优选的实施方式中，3’-端核苷酸(即多核苷酸链中最后一个3’-端核苷酸)是至少一个聚(A)序列的3’-端A核苷酸。术语“正好位于3’端”必须理解为恰好位于3’端——换句话说，该核酸的3’端由以A核苷酸终止的聚(A)序列组成。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸序列，优选RNA包含至少70个腺苷核苷酸的聚(A)序列，优选连续至少70个腺苷核苷酸，其中3’-端核苷酸是腺苷核苷酸。
在这种上下文中，已经表明以腺苷核苷酸结尾会降低RNA疫苗对IFNα的诱导。这一点特别重要，因为IFNα的诱导被认为是接种对象发烧的主要因素，当然必须避免这种情况。
在组分A和/或组分B的核酸是RNA的实施方式中，核酸的聚(A)序列优选在RNA体外转录期间从DNA模板获得。在其它实施方式中，聚(A)序列在体外通过化学合成的常用方法获得，而不必从DNA模板转录。在其它实施方式中，聚(A)序列是使用可商购的聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的对应方案，或可选地通过使用固定的聚(A)聚合酶，例如使用WO2016174271中描述的方法和手段，通过RNA的酶促聚腺苷酸化(在RNA体外转录后)产生聚(A)序列。
组分A和/或组分B的核酸可包含通过酶促聚腺苷酸化获得的聚(A)序列，其中核酸分子的大部分包括约100(+/-20)至约500(+/-50)，优选地约250(+/-20)个腺苷核苷酸。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含衍生自模板DNA的聚(A)序列，并且任选地，另外包含通过酶促聚腺苷酸化产生的至少一个另外的聚(A)序列，例如在WO2016091391中所描述。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个聚腺苷酸化信号。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个聚(C)序列。
本文所用的术语“聚(C)序列”意指最多约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸序列。在优选的实施方式中，聚(C)序列包含约10至约200个胞嘧啶核苷酸、约10至约100个胞嘧啶核苷酸、约20至约70个胞嘧啶核苷酸、约20至约60个胞嘧啶核苷酸或约10至约40个胞嘧啶核苷酸。在特别优选的实施方式中，聚(C)序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个组蛋白茎环(hSL)或组蛋白茎环结构。
术语“组蛋白茎环”(在例如序列表中缩写为“hSL”)意指形成主要存在于组蛋白mRNA中的茎环二级结构的核酸序列。
组蛋白茎环结构/序列可以适合地选自WO2012019780中公开的组蛋白茎环序列，涉及组蛋白茎环序列/组蛋白茎环结构的公开内容通过引用并入本文。在本发明内可以使用的组蛋白茎环序列可优选地衍生自WO2012019780的式(I)或(II)。根据进一步优选的实施方式，组分A和/或组分B的核酸可包含至少一个组蛋白茎环序列，其衍生自专利申请WO2012019780的具体式(Ia)或(IIa)中的至少一个。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个组蛋白茎环，其中所述组蛋白茎环(hSL)包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:178或179同一或具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在其它实施方式中，组分A和/或组分B的核酸不包含如本文定义的hsL。
在实施方式中，具体在涉及RNA的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含3’-端序列元件。所述3’-端序列元件包含聚(A)序列以及任选地组蛋白茎环序列。因此，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个3’-端序列元件，所述3’-端序列元件包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:182-230、22912、22913同一或具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在优选的实施方式中，具体在涉及RNA的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸包含3’-端序列元件。所述3’-端序列元件包含聚(A)序列以及任选地组蛋白茎环序列。因此，组分A和/或组分B的核酸包含至少一个3’-端序列元件，所述3’-端序列元件包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:182、187、189、192、199、207同一或具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其片段或变体。
在各种实施方式中，具体在涉及RNA的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可包含根据SEQ ID NO:176、177、22840-22844的5’-端序列元件，或其片段或变体。这样的5’-端序列元件包括例如T7 RNA聚合酶的结合位点。此外，所述5’-端起始序列的第一个核苷酸可优选包含2’O甲基化，例如2’O甲基化的鸟苷或2’O甲基化的腺苷。
优选地，组分A和/或组分B的核酸，例如RNA或DNA一般包含约50至约20000个核苷酸，或约500至约10000个核苷酸，或约1000至约10000个核苷酸，或优选约1000至约5000个核苷酸，或甚至更优选约2000至约5000个核苷酸。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是DNA或RNA。
在实施方式中，DNA是质粒DNA或线性编码DNA构建物，其中DNA包括下列或由下列组成：如本文定义的核酸元件(例如包括编码序列、UTR、聚(A/T)、聚腺苷酸化信号、启动子)。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是DNA表达载体。这样的DNA表达载体可选自细菌质粒、腺病毒、痘病毒、副痘病毒(口疮病毒)、牛痘苗病毒、鸡痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒(AAV)、甲病毒(α病毒，Alphavirus)、慢病毒、λ噬菌体、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、李斯特菌属(Listeria sp)和沙门氏菌属(Salmonella sp)。
适合地，DNA还可包含可操作地连接至组分A和/或组分B的相应抗原编码序列的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是例如来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子，如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV即刻早期启动子(CMV immediate early promoter)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子也可以是来自人类基因如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸或人类金属硫蛋白(metalothionein)的启动子。启动子也可以是组织特异性启动子，如肌肉或皮肤特异性启动子，天然的或是合成的。此类启动子的示例在美国专利申请公开号US20040175727中有所描述。在优选的实施方式中，载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或任何能够表达编码冠状病毒抗原的DNA并使细胞能够将序列翻译成被免疫系统识别的抗原的其它表达载体。
可例如使用如WO2009150222A2中描述和在PCT权利要求1至33中限定的载体生成其它适合的质粒DNA，以允许在细胞系(例如，在昆虫细胞系)中有效产生经编码的抗原，与WO2009150222A2的权利要求1至33相关的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是基于腺病毒的载体。这种基于腺病毒的载体可包含至少一个编码序列，其编码至少一种如本文定义的抗原性肽或蛋白质(例如，组分A的冠状病毒抗原、组分B的其它病毒抗原)。
在本发明的上下文中，可使用任何适合的基于腺病毒的载体，如WO2005071093或WO2006048215中描述的那些。适合地，所使用的基于腺病毒的载体是猿猴腺病毒，从而避免接种后预先存在的针对普通人类实体的抗体如AdHu5对免疫应答的抑制。适合的猿猴腺病毒载体包括AdCh63(参见WO2005071093)或AdCh68(Cohen et al J.Gen Virol 200283:151)，但也可使用其它载体。适合地，腺病毒载体将使E1区缺失，使其在人类细胞中存在复制缺陷。腺病毒的其它区域如E3和E4也可以是缺失的。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是基于口疮病毒的载体。此类基于口疮病毒的载体可包含至少一个编码序列，其编码至少一种如本文定义的抗原性肽或蛋白质(例如，组分A的冠状病毒抗原、组分B的其它病毒抗原)。
在本发明特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是RNA。
优选地，组分A和/或组分B的RNA一般包含约50至约20000个核苷酸，或约500至约10000个核苷酸，或约1000至约10000个核苷酸，或优选约1000至约5000个核苷酸，或甚至更优选约2000至约5000个核苷酸。
根据优选的实施方式，组分A和/或组分B的核酸是RNA，优选编码RNA。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的(编码)RNA选自mRNA、(编码)自我复制RNA、(编码)环状RNA、(编码)病毒RNA，或(编码)复制子RNA。
在实施方式中，RNA是环状RNA。如本文所用，“环状RNA”或“circRNA”必须理解为是编码至少一种如本文定义的抗原性肽或蛋白质的环状多核苷酸构建物。优选地，这样的circRNA是单链RNA分子。在优选的实施方式中，所述circRNA包含至少一个编码序列，其编码至少一种如本文定义的抗原性蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
在实施方式中，RNA是复制子RNA。术语“复制子RNA”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是优化的自我复制RNA。此类构建物可包括衍生自例如甲病毒(例如SFV、SIN、VEE或RRV)的复制酶元件和用感兴趣的核酸(即编码如本文定义的抗原性肽或蛋白质的编码序列)取代结构病毒蛋白。可选地，复制酶可被提供在独立的编码RNA构建物或编码DNA构建物上。复制酶的下游可以是控制复制子RNA复制的亚基因组启动子(sub-genomic promoter)。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸不是复制子RNA或自我复制RNA。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是mRNA。
优选地，组分A和/或组分B的mRNA不包含复制酶元件(例如编码复制酶的核酸)。
术语“RNA”和“mRNA”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是核糖核酸分子，即由核苷酸组成的多聚体。这些核苷酸通常是单磷酸腺苷、单磷酸尿苷、单磷酸鸟苷和单磷酸胞苷单体，它们沿着所谓的骨架相互连接。骨架由第一个单体的糖(即核糖)与第二个相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定的顺序性被称为RNA序列。mRNA(信使RNA)提供了可翻译成特定肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸编码序列。
在本发明的上下文中，组分A和/或组分B的RNA，优选mRNA，可提供至少一个编码如本文定义的抗原性蛋白质的编码序列，其在施用后(例如在向对象，例如人类对象施用后)被翻译成(功能性)抗原。
因此，组分A和/或组分B的RNA，优选mRNA，适用于疫苗，优选本发明的组合疫苗。
适合地，组分A和/或组分B的RNA可通过添加5’-帽结构来修饰，5’-帽结构优选地稳定RNA和/或增强经编码抗原的表达和/或减少先天免疫系统的刺激(在向对象施用后)。在核酸是RNA，具体是线性编码RNA，例如线性mRNA或线性编码复制子RNA的实施方式中，5’-帽结构是特别重要的。
因此，在优选的实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含5’-帽结构，优选m7G、帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构。
如本文所用的术语“5’-帽结构”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指位于RNA(例如mRNA)的5’端的5’修饰的核苷酸，特别是鸟嘌呤核苷酸。优选地，5’-帽结构经由5’-5’-三磷酸键连接到RNA。
适用于本发明上下文中的5’-帽结构是帽0(第一个核碱基的甲基化，例如m7GpppN)、帽1(m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的另外的甲基化)、帽2(m7GpppN下游第二个核苷酸的核糖的另外的甲基化)、帽3(m7GpppN下游第三个核苷酸的核糖的另外的甲基化)、cap4(m7GpppN下游第四个核苷酸的核糖的另外的甲基化)、ARCA(抗反向帽类似物)、经修饰的ARCA(例如硫代磷酸修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮-鸟苷。
5’-帽(帽0或帽1)结构可在化学RNA合成或使用帽类似物的RNA体外转录(共转录加帽)中形成。
本文所用的术语“帽类似物”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且意指具有帽功能的非可聚合二核苷酸或三核苷酸，因为当在核酸分子的5’-端处并入时，它促进翻译或定位和/或防止核酸分子特别是RNA分子的降解。非可聚合意思是帽类似物将仅在5’-端被并入，因为其不具有5’三磷酸，因此不能通过模版依赖的聚合酶，特别是通过模板依赖的RNA聚合酶在3’-方向上延伸。帽类似物的示例包括但不限于选自下列的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化帽类似物(例如GpppG)；二甲基化帽类似物(例如m2,7GpppG)、三甲基化帽类似物(例如m2,2,7GpppG)、二甲基化对称帽类似物(例如m7Gpppm7G)或抗反向帽类似物(例如ARCA；m7,2’OmeGpppG、m7,2’dGpppG、m7,3’OmeGpppG、m7,3’dGpppG以及它们的四磷酸衍生物)。之前已经描述了其它帽类似物(WO2008016473、WO2008157688、WO2009149253、WO2011015347和WO2013059475)。WO2017066793、WO2017066781、WO2017066791、WO2017066789、WO2017/053297、WO2017066782、WO2018075827和WO2017066797中描述了该上下文中其它适合的帽类似物，其中涉及帽类似物的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，经修饰的帽1结构是使用如WO2017053297、WO2017066793、WO2017066781、WO2017066791、WO2017066789、WO2017066782、WO2018075827和WO2017066797中公开的三核苷酸帽类似物产生的。具体地，可从WO2017053297的权利要求1-5中公开的结构衍生的任何帽结构都可适合地用于共转录产生经修饰的帽1结构。此外，可以从WO2018075827的权利要求1或权利要求21中限定的结构衍生的任何帽结构都可适合地用于共转录产生经修饰的帽1结构。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA，具体是mRNA包含帽1结构。
在优选的实施方式中，5’-帽结构可适合地使用如本文定义的三核苷酸帽类似物以共转录方式，优选在如本文定义的RNA体外转录反应中添加。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA的帽1结构是使用采用三核苷酸帽类似物m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG的共转录加帽形成的。在该上下文中优选的帽1类似物是m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。
在其它优选的实施方式中，本发明的RNA的帽1结构是使用采用三核苷酸帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG的共转录加帽形成的。
在其它实施方式中，本发明的RNA的帽0结构是使用采用帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)G的共转录加帽形成的。
在其它实施方式中，5’-帽结构是通过使用加帽酶(例如牛痘苗病毒加帽酶和/或帽依赖性2’-O-甲基转移酶)的酶促加帽而产生帽0或帽1或帽2结构形成的。5’-帽结构(帽0或帽1)可以使用固定化加帽酶和/或帽依赖性2’-O-甲基转移酶，使用WO2016193226中公开的方法和方式进行添加。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA(种类)中约70％、75％、80％、85％、90％、95％包括帽1结构，如使用加帽试验所确定的。在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA(种类)中少于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％不包括帽1结构，如使用加帽试验所确定的。在其它优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA(种类)中约70％、75％、80％、85％、90％、95％包括帽0结构，如使用加帽试验所确定的。在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA(种类)中少于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％不包括帽0结构，如使用加帽试验所确定的。
在本发明的上下文中，术语“RNA种类”不限于意指“单个分子”，而是要理解为包括基本上同一的RNA分子的全体。因此，它可涉及多个基本上同一的(编码)RNA分子。
为了确定帽0或帽1结构的存在与否，可以使用如已公开的PCT申请WO2015101416中描述的加帽试验，具体是如已公开的PCT申请WO2015101416的权利要求27至46中描述的加帽试验。可用于确定RNA的帽0或帽1结构的存在与否的其它加帽试验描述于PCT/EP2018/08667或已公开的PCT申请WO2014152673和WO2014152659中。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)帽结构。在此类实施方式中，RNA包含5’-端m7G帽和m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的另外的甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化腺苷。优选地，RNA(种类)中约70％、75％、80％、85％、90％、95％包含如使用加帽试验所确定的这样的帽1结构。
在其它优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)帽结构。在此类实施方式中，RNA包含5’-端m7G帽和相邻核苷酸的核糖的另外的甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化鸟苷。优选地，编码RNA(种类)中约70％、75％、80％、85％、90％、95％包含如使用加帽试验所确定的这样的帽1结构。
因此，所述RNA或mRNA序列的第一个核苷酸，即m7G(5’)ppp结构下游的核苷酸，可以是2’O甲基化鸟苷或2’O甲基化腺苷。
根据实施方式，组分A和/或组分B的RNA是经修饰的RNA，其中修饰是指化学修饰，包括骨架修饰以及糖修饰或碱基修饰。
经修饰的RNA可包括核苷酸类似物/修饰，例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。本发明上下文中的骨架修饰是这样的修饰，其中RNA的核苷酸的骨架的磷酸酯被化学修饰。本发明上下文中的糖修饰是对RNA的核苷酸的糖的化学修饰。此外，本发明上下文中的碱基修饰是对RNA的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在此上下文中，核苷酸类似物或修饰优选地选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
在特别优选的实施方式中，可并入组分A和/或组分B的经修饰的RNA中的核苷酸类似物/修饰优选地选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸、2-氨基嘌呤-核糖-5’-三磷酸；2-氨基腺苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5’-三磷酸、2-硫尿苷-5’-三磷酸、2’-氟胸苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基-肌苷-5’-三磷酸、4-硫尿苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸、7-脱氮腺苷-5’-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸、8-叠氮基腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸或嘌呤霉素-5’-三磷酸、黄苷-5’-三磷酸。特别优选选自下列碱基修饰核苷酸的核苷酸用于碱基修饰：5-甲基胞苷-5’-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸和假尿苷-5’-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酰甲基尿苷、1-牛磺酰甲基-假尿苷、5-牛磺酰甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酰甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺苷、7-脱氮-8-氮杂腺苷、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲基硫-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺苷、2-甲基硫-腺苷和2-甲氧基-腺苷、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁苷(wybutosine)、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟嘌呤、5’-O-(1-硫代磷酸基)-腺苷、5’-O-(1-硫代磷酸基)-胞苷、5’-O-(1-硫代磷酸基)-鸟苷、5’-O-(1-硫代磷酸基)-尿苷、5’-O-(1-硫代磷酸基)-假尿苷、6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。
在一些实施方式中，至少一个经修饰的核苷酸选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
在该上下文下特别优选的是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。
因此，在实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，组分A和/或组分B的编码序列中基本上所有的，例如基本上100％的尿嘧啶具有化学修饰，优选化学修饰在尿嘧啶的第5位。
将经修饰的核苷酸如假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和/或5-甲氧基尿苷并入到组分A和/或组分B的编码序列中可以是有利的，因为不希望的先天免疫应答(在施用编码RNA或疫苗后)可以得以调节或减少(如果需要的话)。
在实施方式中，组分A和/或组分B的RNA包含编码至少一种如本文定义的抗原性蛋白质的至少一个编码序列，其中所述编码序列包含选自假尿苷(ψ)和N1-甲基假尿苷(m1ψ)的至少一个经修饰的核苷酸，优选地，其中所有尿嘧啶核苷酸都被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代，任选地其中所有尿嘧啶核苷酸都被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA不包含N1-甲基假尿苷(m1ψ)取代的位置。在进一步的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA不包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷取代的位置。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA包含仅由G、C、A和U核苷酸组成的编码序列，因此不包含经修饰的核苷酸(除了5’端帽结构(帽0、帽1、帽2))。
在实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是RNA，其中可使用本领域已知的任何方法制备RNA，包括化学合成，如，例如固相RNA合成，以及体外方法，如RNA体外转录反应。因此，在优选的实施方式中，RNA是通过RNA体外转录获得的。
因此，在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸优选是体外转录的RNA。
术语“RNA体外转录”或“体外转录”涉及其中RNA在无细胞系统(体外)中合成的过程。RNA可通过DNA依赖性体外转录合适的DNA模板获得，根据本发明，该模板是线性化的质粒DNA模板或PCR扩增的DNA模板。用于控制RNA体外转录的启动子可以是任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的具体示例是T7、T3、SP6或Syn5 RNA聚合酶。在本发明的优选的实施方式中，DNA模板在其进行RNA体外转录之前用适合的限制酶线性化。
一般用于RNA体外转录的试剂包括：具有启动子序列的DNA模板(线性化的质粒DNA或PCR产物)，该启动子序列对其各自的RNA聚合酶(如噬菌体编码的RNA聚合酶(T7、T3、SP6或Syn5)具有高结合亲和性；用于四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷酸三磷酸(NTP)；任选地，如本文定义的帽类似物；任选地，如本文定义的进一步修饰的核苷酸；能够与DNA模板内的启动子序列结合的DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3、SP6或Syn5RNA聚合酶)；任选地，灭活任何可能污染RNA酶的核糖核酸酶(RNA酶)抑制剂；任选地，降解焦磷酸的焦磷酸酶，其可抑制RNA体外转录；MgCl2，其供应Mg2+离子作为聚合酶的辅助因子；维持适合的pH值的缓冲液(TRIS或HEPES)，其还可包含抗氧化剂(例如DTT)，和/或最佳浓度的多胺，如亚精胺，例如WO2017109161中所公开的包含TRIS-柠檬酸盐的缓冲液系统。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RNA的帽1结构是使用采用三核苷酸帽类似物m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG的共转录加帽形成的。可适用于制造本发明的编码RNA的优选的帽1类似物是m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。
在其它优选的实施方式中，本发明的RNA的帽1结构是使用三核苷酸帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG的共转录加帽形成的。
在其它实施方式中，本发明的RNA的帽0结构是使用采用帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)G的共转录加帽形成的。
在实施方式中，用于RNA体外转录的核苷酸混合物可另外包含如本文定义的经修饰的核苷酸。在此上下文中，优选的经修饰的核苷酸可选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。在具体实施方式中，核苷酸混合物中的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)替换(部分地或全部地)，以获得经修饰的RNA。
在优选的实施方式中，用于RNA体外转录的核苷酸混合物不包含如本文定义的经修饰核苷酸。在优选的实施方式中，用于RNA体外转录的核苷酸混合物仅包含G、C、A和U核苷酸，以及任选地如本文定义的帽类似物。
在优选的实施方式中，用于RNA体外转录反应的核苷酸混合物(即混合物中各核苷酸的分数)可针对给定的RNA序列进行优化，优选如WO20151S8933所描述的。
在此上下文中，已在序列优化的核苷酸混合物以及任选地帽类似物的存在下进行了体外转录，优选其中序列优化的核苷酸混合物不包含化学修饰的核苷酸。
在此上下文中，序列优化的核苷三磷酸(NTP)混合物是核苷三磷酸(NTP)的混合物，用于包含四种核苷三磷酸(NTP)——GTP、ATP、CTP和UTP的给定序列的RNA分子的体外转录反应，其中序列优化的核苷三磷酸(NTP)混合物中四种核苷三磷酸(NTP)中每一种的分数对应于所述RNA分子中相应核苷酸的分数。如果RNA分子中不存在核糖核苷酸，则对应的核苷三磷酸也不存在于序列优化的核苷三磷酸(NTP)混合物中。
在必须产生多于一种不同的如本文定义的RNA——例如必须产生2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的RNA——的实施方式中，可适合地使用如WO2017109134中描述的程序。
在基于核酸的疫苗生产的上下文中，可能需要提供GMP级核酸，例如GMP级RNA或DNA。GMP级RNA或DNA可使用监管机构批准的制造工艺生产。因此，在特别优选的实施方式中，RNA生产在现行良好生产规范(GMP)下进行，在DNA和RNA水平上实施各种质量控制步骤，优选根据WO2016180430。在优选的实施方式中，本发明的RNA是GMP级RNA，特别是GMP级mRNA。因此，用于疫苗的RNA优选是GMP级RNA。
所获得的RNA产物优选使用
Figure BDA0004113537810001491
(CureVac,Tübingen,德国；根据WO2008077592的RP-HPLC)和/或切向流过滤(如WO2016193206中描述的)和/或寡聚d(T)纯化(参见WO2016180430)进行纯化。
优选地，根据本发明的RNA是使用下列进行纯化的：RP-HPLC，优选采用具有大孔苯乙烯/二乙烯苯柱(例如粒径30μm，孔径
Figure BDA0004113537810001492
)的反向高压液相色谱(RP-HPLC)，并且另外使用带有截留分子量约为100kDa的纤维素基膜的过滤盒。
在进一步优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选RNA，经冻干(例如根据WO2016165831或WO2011069586)以产生如本文定义的温度稳定的经干燥的核酸(粉末)(例如RNA或DNA)。还可使用喷雾干燥或喷雾冷冻干燥(例如根据WO2016184575或WO2016184576)来干燥本发明的核酸，特别是RNA，以产生如本文定义的温度稳定的RNA(粉末)。因此，在制造和纯化核酸，具体是RNA的上下文中，WO2017109161、WO2015188933、WO2016180430、WO2008077592、WO2016193206、WO2016165831、WO2011069586、WO2016184575和WO2016184576的公开内容通过引用并入本文。
因此，在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是经干燥的核酸，特别是经干燥的RNA。
如本文所用的术语“经干燥的RNA”必须被理解为是如上定义的已经被冻干或喷雾干燥或喷雾冷冻干燥以获得温度稳定的经干燥的RNA(粉末)的RNA。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是经纯化的核酸，特别是纯化的RNA。
如本文所用的术语“纯化的核酸”必须被理解为是在某些纯化步骤之后相比起始材料具有更高纯度的核酸。纯化核酸中基本上不存在的典型杂质包括肽或蛋白质、亚精胺、BSA、无效核酸序列、核酸片段、游离核苷酸、细菌杂质或源自纯化程序的杂质。因此，在这方面期望“核酸纯度”尽可能接近100％。对于核酸纯度，还期望全长核酸的量尽可能接近100％。因此，如本文使用的“纯化的核酸”具有超过75％、80％、85％、非常特别地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及最有利地99％或更高的纯度。纯度可例如通过分析HPLC测定，其中上文提供的百分比对应于靶核酸的峰面积与代表副产物的所有峰的总面积之间的比。可选地，纯度可例如通过分析琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳来测定。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸是纯化的RNA，优选纯化的mRNA。
如本文所用的术语“纯化的RNA”必须理解为是在某些纯化步骤(例如HPLC、TFF、寡聚d(T)纯化、沉淀步骤)之后相比起始材料(例如体外转录的RNA)具有更高纯度的RNA。纯化的RNA中基本不存在的典型杂质包括肽或蛋白质(例如源自DNA依赖性RNA体外转录的酶，例如RNA聚合酶、RNA酶、焦磷酸酶、限制性内切核酸酶、DNA酶)、亚精胺、BSA、无效RNA序列、RNA片段(短双链RNA片段、无效序列等)、游离核苷酸(经修饰的核苷酸、常规NTP、帽类似物)、模板DNA片段、缓冲液组分(HEPES、TRIS、MgCl2)等。可能源自例如发酵程序的其它潜在杂质包括细菌杂质(生物负载、细菌DNA)或源自纯化程序的杂质(有机溶剂等)。因此，在这方面，期望“RNA纯度”尽可能接近100％。对于RNA纯度，还期望全长RNA转录物的量尽可能接近100％。因此，如本文所使用的“纯化的RNA”具有超过75％、80％、85％、非常特别地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及最有利地99％或更高的纯度。纯度可例如通过分析HPLC测定，其中上文提供的百分比对应于靶RNA的峰面积与代表副产物的所有峰的总面积之间的比。可选地，纯度可例如通过分析琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳来测定。
必须理解，如本文定义的“经干燥的RNA”和如本文定义的“纯化的RNA”或如本文定义的“GMP级RNA”可具有优异的稳定特性(体外、体内)和提高的效率(例如mRNA在体内的可翻译性更好)，因此特别适用于医学目的，例如组合疫苗。
在组分A和/或组分B的核酸是RNA的特别优选的实施方式中，RNA已经通过RP-HPLC和/或TFF纯化以除去双链RNA、非加帽RNA和/或RNA片段。
在例如RNA体外转录期间，双链RNA作为副产物的形成可导致先天免疫应答，特别是IFNα的诱导，IFNα是在接种对象中诱导发烧的主要因素，这当然是一种不希望的副作用。当前的dsRNA免疫印迹技术(例如，通过斑点杂交、血清学特异性电子显微镜(serologicalspecific electron microscopy,SSEM)或ELISA)用于检测核酸混合物中的dsRNA种类并确定其大小。
适合地，RNA已通过如本文所述的RP-HPLC和/或TFF纯化以减少dsRNA的量。
在优选的实施方式中，RNA包含比未经RP-HPLC和/或TFF纯化的RNA少约5％、10％或20％的双链RNA副产物。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的RP-HPLC和/或TFF纯化的RNA包含比用寡聚dT纯化、沉淀、过滤和/或AEX纯化的RNA少约5％、10％或20％的双链RNA副产物。
在实施方式中，组合物的RNA具有范围约40％至约100％的RNA完整性。
术语“RNA完整性”总体上描述完整的RNA序列是否存在于组合物中。RNA完整性低可能是由于RNA降解、RNA切割、RNA化学合成不正确或不完全、碱基配对不正确、经修饰的核苷酸的整合或已整合的核苷酸的修饰、加帽缺失或加帽不完全、缺少聚腺苷酸化或聚腺苷酸化不完全或者RNA体外转录不完全等等。RNA是一种脆弱的分子，很容易降解，这可能是例如温度、核糖核酸酶、pH或其它因素(例如亲核攻击、水解等)的结果，这些可能会降低RNA完整性，结果降低RNA的功能性。
技术人员可从多种不同的色谱法或电泳法中进行选择来测定RNA完整性。色谱法和电泳法是本领域公知的。如果使用色谱法(例如RP-HPLC)，则RNA完整性的分析可基于测定对应色谱图中全长RNA的峰面积(或“峰下面积”)。峰面积可通过评估检测器系统的信号的任何适合的软件来测定。测定峰面积的过程也称为积分。代表全长RNA的峰面积一般关于各个样品中总RNA的峰面积来设置。RNA完整性可用％RNA完整性表示。
在本发明各方面的上下文中，RNA完整性可使用分析(RP)HPLC来测定。一般地，可用清涤剂(例如约2％ Triton X100)处理包含包封RNA的脂质基载剂的组合物的测试样品，以解离脂质基载剂并释放包封的RNA。可使用适合的结合化合物，例如Agencourt AMPureXP珠(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)，基本上根据制造商的说明来捕获释放的RNA。在制备RNA样品后，可执行分析(RP)HPLC以测定RNA完整性。一般地，为了测定RNA完整性，可使用例如注射用水(WFI)将RNA样品稀释至0.1g/l的浓度。可将约10μl稀释后的RNA样品注射到HPLC柱(例如整体聚(苯乙烯-二乙烯苯)基质)中。可采用标准条件进行分析(RP)HPLC，例如：梯度1：缓冲液A(0.1M TEAA(pH7.0))；缓冲液B(含25％乙腈的0.1M TEAA(pH7.0))。从30％缓冲液B开始，梯度在2min内扩展到32％缓冲液B，然后在15分钟内以1ml/min的流速扩展到55％缓冲液B。一般是在260nm的波长下记录HPLC色谱图。可使用软件评估所获得的色谱图，并且可如本领域公知的那样以百分比(％)来测定相对峰面积。相对峰面积表示具有100％ RNA完整性的RNA的量。由于注射到HPLC中的RNA的量一般是已知的，因此对相对峰面积的分析提供了有关RNA完整性的信息。因此，如果例如总共注射了100ng RNA，以100ng为相对峰面积，则RNA完整性为100％。如果，例如，相对峰面积对应于80ng，则RNA完整性将为80％。因此，本发明上下文中的RNA完整性是使用分析HPLC，优选分析RP-HPLC测定的。
在实施方式中，组合物的RNA具有范围为约40％至约100％的RNA完整性。在实施方式中，RNA具有范围为约50％至约100％的RNA完整性。在实施方式中，RNA具有范围为约60％至约100％的RNA完整性。在实施方式中，RNA具有范围为约70％至约100％的RNA完整性。在实施方式中，RNA完整性例如为约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。使用分析HPLC，优选分析RP-HPLC来适合地测定RNA。
在优选的实施方式中，组合物的RNA具有至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，最优选至少约80％或约90％的RNA完整性。使用分析HPLC，优选分析RP-HPLC来适合地测定RNA。
在如本文定义的共转录加帽之后，以及在如本文定义的纯化之后，可使用如已公开的PCT申请WO2015101416中描述的，具体是如已公开的PCT申请WO2015101416的权利要求27至46中描述的加帽试验来确定所获得的RNA的加帽程度。可选地，可使用PCT/EP2018/08667中描述的加帽试验。
在实施方式中，用于进行RNA体外转录的自动化装置可用于生产和纯化组分A和/或组分B的核酸。这样的装置也可用于生产组合物或疫苗(参见方面2和3)。优选地，可适合地使用如WO2020002598中描述的装置，具体是如WO2020002598的权利要求1至59和/或68至76(以及图1-18)中描述的装置。
本文描述的方法可优选适用于如下文进一步详细描述的生产药物组合物或组合疫苗的方法。
在各种实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA优选沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)5’-帽结构，优选如本文指定的；
B)5’-端起始元件，优选如本文指定的；
C)任选地，5’-UTR，优选如本文指定的；
D)核糖体结合位点，优选如本文指定的；
E)至少一个编码序列，优选如本文指定的；
F)3’-UTR，优选如本文指定的；
G)任选地，聚(A)序列，优选如本文指定的；
H)任选地，聚(C)序列，优选如本文指定的；
I)任选地，组蛋白茎环，优选如本文指定的；
J)任选地，3’-端序列元件，优选如本文指定的。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA优选沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)5’-帽结构，选自m7G(5’)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)；
B)5’-端起始元件，选自SEQ ID NO:176或177或其片段或变体；
C)任选地，衍生自HSD17B4基因的5’-UTR；
D)核糖体结合位点，选自SEQ ID NO:180、181、22845-22847或其片段或变体；
E)至少一个如本文指定的编码序列，优选密码子优化的编码序列；
F)3’-UTR，衍生自PSMB3基因或α-珠蛋白基因(“muag”)的3’-UTR；
G)任选地，包含约30至约500个腺苷的聚(A)序列；
H)任选地，包含约10至约100个胞嘧啶的聚(C)序列；
I)任选地，选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎环；
J)任选地，选自SEQ ID NO:182-230的3’-端序列元件。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)如本文定义的帽1结构；
B)如本文指定的编码序列，优选密码子优化的编码序列；
C)如本文定义的3’-UTR，衍生自muag基因的3’-UTR，优选根据SEQ ID NO:267、268、22896-22901、22906-22911；
D)包含约64个A核苷酸的聚(A)序列；
E)包含约10至约100个胞嘧啶的聚(C)序列；
F)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎环。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)如本文定义的帽1结构，优选密码子优化的编码序列；
B)如本文定义的5’-UTR，衍生自HSD17B4基因，优选根据SEQ ID NO:231或232；
C)如本文指定的编码序列；
D)如本文定义的3’-UTR，衍生自PSMB3基因的3’-UTR，优选根据SEQ ID NO:253或254；
E)包含约64个A核苷酸的聚(A)序列；
F)任选地，包含约10至约100个胞嘧啶的聚(C)序列；
G)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎环；
H)任选地，3’-端序列元件SEQ ID NO:182-230。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)如本文定义的帽1结构；
B)如本文定义的5’-UTR，衍生自HSD17B4基因，优选根据SEQ ID NO:231或232；
C)如本文指定的所选择的编码序列，优选密码子优化的编码序列；
D)如本文定义的3’-UTR，衍生自PSMB3基因的3’-UTR，优选根据SEQ ID NO:253或254；
E)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎环；
F)包含约100个A核苷酸的聚(A)序列，优选代表3’端。
在甚至更特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)如本文定义的帽1结构；
B)如本文定义的5’-UTR，衍生自HSD17B4基因，优选根据SEQ ID NO:231或232；
C)如本文指定的所选择的编码序列，优选密码子优化的编码序列；
D)如本文定义的3’-UTR，衍生自PSMB3基因的3’-UTR，优选根据SEQ ID NO:253或254；
E)包含约100个A核苷酸的聚(A)序列，优选代表3’端。
在进一步优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)如本文定义的帽1结构；
B)如本文定义的5’-UTR，衍生自SLC7A3基因，优选根据SEQ ID NO:245或246；
C)如本文指定的所选择的编码序列，优选密码子优化的编码序列；
D)如本文定义的3’-UTR，衍生自PSMB3基因的3’-UTR，优选根据SEQ ID NO:253或254；
E)任选地，选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎环；
F)包含约100个A核苷酸的聚(A)序列，优选代表3’端。
在进一步优选的实施方式中，组分A和/或组分B的核酸，优选组分A和组分B的mRNA沿5’-至3’-方向包含下列元件：
A)如本文定义的帽1结构；
B)如本文定义的5’-UTR，衍生自RPL31基因，优选根据SEQ ID NO:243或243；
C)如本文指定的所选择的编码序列，优选密码子优化的编码序列；
D)如本文定义的3’-UTR，衍生自RPS9基因的3’-UTR，优选根据SEQ ID NO:263或264；
E)任选地，选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎环；
F)包含约100个A核苷酸的聚(A)序列，优选代表3’端。
配制和复合：
在下文中，进一步指定了涉及药物组合物的配制和/或复合的适合的特征和实施方式。具体地，进一步指定了涉及组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)的配制和/或复合和/或组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)的配制和/或复合的适合的特征和实施方式。
在优选的实施方式中，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂。
本文所用的术语“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的赋形剂”优选包括组合物供施用的液体或非液体基础。如果组合物以液体形式提供，则载剂可以是水，例如无热原水；等渗盐水或缓冲(水性)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。可以使用水或优选地缓冲液，更优选地水性缓冲液，其含有钠盐(优选地至少50mM的钠盐)、钙盐(优选地至少0.01mM的钙盐)以及任选地钾盐(优选地至少3mM的钾盐)。根据优选的实施方式，钠盐、钙盐以及任选地钾盐可以以其卤化物的形式(例如氯化物、碘化物或溴化物)、以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等的形式出现。钠盐的示例包括NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的示例包括KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，以及钙盐的示例包括CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。
此外，上述阳离子的有机阴离子可在缓冲液中。因此，在实施方式中，药物组合物可包含药学上可接受的载剂或赋形剂，使用一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂来例如提高稳定性、增加细胞转染、允许持续或延迟、增加经编码的抗原性肽或蛋白质在体内的翻译和/或改变经编码的抗原性肽或蛋白质在体内的释放曲线(分布，profile)。除了常规的赋形剂诸如任何以及所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂(vehicles)、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本发明的赋形剂还可包括(非限制地)类脂质(lipidoids)、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质体复合物(lipoplexes)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、转染有多核苷酸的细胞、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物及其组合。在实施方式中，也可使用适合向对象施用的一种或多种相容的固体或液体填料或稀释剂或包封化合物。如本文所用的术语“相容的”是指组合物的成分能够与组分A和/或组分B的至少一种核酸以及任选地组合物的多种核酸混合，这种混合方式不发生相互作用，发生相互作用将大大降低组合物在一般使用条件(例如肌内或皮内施用)下的生物活性或药学有效性。药学上可接受的载剂或赋形剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适合向待治疗的人施用。可用作药学上可接受的载剂或赋形剂的化合物可以是糖，如，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖和蔗糖；淀粉，如，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋糖；纤维素及其衍生物，如，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；动物脂；固体助流剂，如，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如，例如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。
可优选地选择药物组合物的至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂，以适合肌内或皮内递送/施用所述药物组合物。药物组合物优选是适合向对象进行肌内施用的组合物。
考虑了施用药物组合物的对象包括但不限于人类和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本发明的药物组合物可适合地是无菌的和/或无热原的。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸与其它化合物复合或缔合以获得配制组合物。在此上下文中的制剂可具有转染剂的功能。在此上下文中的制剂也可具有使核酸免于降解的功能。
在实施方式中，组分A的至少一种核酸和组分B的至少一种核酸分别配制。
在优选的实施方式中，组分A的至少一种核酸和组分B的至少一种核酸共配制。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸，优选组分A和/或组分B的至少一种RNA与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物复合或缔合，或至少部分地复合或部分地缔合。优选地，组分A和组分B的至少一种核酸与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物复合或缔合，或至少部分地复合或部分地缔合，其中组分A和组分B分别配制或其中组分A和组分B共配制。
在优选的实施方式中，所述一种或多种阳离子或聚阳离子化合物选自阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白质、阳离子或聚阳离子肽或其任意组合。
如本文所用的术语“阳离子或聚阳离子化合物”将被本领域技术人员认识和理解，并且例如意指带电荷的分子，其在范围约1至9的pH值下、在范围约3至8的pH值下、在范围约4至8的pH值下、在范围约5至8的pH值下、更优选地在范围约6至8的pH值下、甚至更优选地在范围约7至8的pH值下、最优选地在生理pH(例如范围约7.2至7.5)下带正电荷。因此，阳离子组分(例如阳离子肽、阳离子蛋白质、阳离子聚合物、阳离子多糖、阳离子脂质(包括类脂质))可以是在生理条件下带正电荷的任何带正电荷的化合物或聚合物。“阳离子或聚阳离子肽或蛋白质”可含有至少一种带正电荷的氨基酸或多于一种带正电荷的氨基酸，例如选自Arg、His、Lys或Orn。因此，“聚阳离子”组分也处在给定条件下表现出多于一个正电荷的范围内。
在此上下文中特别优选的阳离子或聚阳离子化合物可选自阳离子或聚阳离子肽或蛋白质或其片段的以下列表：鱼精蛋白、核仁素(nucleoline)、精胺或亚精胺或其它阳离子肽或蛋白质，诸如聚-L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)，包括HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat衍生肽、穿透素、VP22衍生或类物肽、HSV VP22(单纯疱疹)、MAP、KALA或蛋白转导结构域(PTD)、PpT620、富脯氨酸肽、富精氨酸肽、富赖氨酸肽、MPG-肽(一种或多种)、Pep-1、L-寡聚体、降钙素肽(一种或多种)、触角足基因(Antennapedia)衍生肽、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、转运素(Transportan)、Buforin-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT衍生肽、SAP或组蛋白。更优选地，组分A和/或组分B的核酸(例如DNA或RNA)，例如编码RNA，优选mRNA，与一种或多种聚阳离子复合，优选与鱼精蛋白或oligofectamine复合，最优选与鱼精蛋白复合。在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种RNA，与鱼精蛋白复合。
可用作转染剂或复合剂的进一步优选的阳离子或聚阳离子化合物可包括阳离子多糖，例如壳聚糖、聚凝胺等；阳离子脂质，例如DOTMA、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS、DIMRI、DOTAP、DC-6-14、CLIP1、CLIP6、CLIP9、oligofectamine；或阳离子或聚阳离子聚合物，例如经修饰的聚氨基酸，诸如β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺等，经修饰的聚乙烯，诸如PVP等，经修饰的丙烯酸酯，诸如pDMAEMA等，经修饰的氨基胺，诸如pAMAM等，经修饰的聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺末端修饰的1,4丁二醇二丙烯酸-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状聚合物，诸如聚丙胺树枝状聚合物或pAMAM系树枝状聚合物等，聚亚胺(一种或多种)，诸如PEI、聚(丙烯亚胺)等、聚烯丙基胺、糖骨架系聚合物，诸如环糊精系聚合物、葡聚糖系聚合物等，硅烷骨架系聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物等、由一个或多个阳离子嵌段(例如选自上文提到的阳离子聚合物)的和一个或多个亲水或疏水嵌段(例如聚乙二醇)的组合构成的嵌段聚合物；等等。
在此上下文中，特别优选组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种RNA，与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合物载剂，优选阳离子蛋白质或肽复合或至少部分地复合。在此上下文中，WO2010037539和WO2012113513的公开内容通过引用并入本文。部分地是指只有一部分核酸与阳离子化合物复合，而其余核酸处于未复合形式(“游离”)。
在实施方式中，药物组合物包含组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种RNA，其与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物(优选鱼精蛋白)以及至少一种游离(非复合)核酸复合。
在此上下文中，特别优选组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种RNA与鱼精蛋白复合或至少部分地复合。优选地，组分A和/或组分B的核酸，特别是鱼精蛋白复合RNA中的RNA，与游离RNA的摩尔比可选自约0.001:1至约1:0.001的摩尔比，包括约1:1的比。适合地，通过以RNA:鱼精蛋白重量为2:1的重量比(w/w)，将鱼精蛋白-海藻糖溶液添加到RNA样品中，使复合的RNA与鱼精蛋白复合。
可用于复合组分A和/或组分B的核酸的进一步优选的阳离子或聚阳离子蛋白质或肽可衍生自专利申请WO2009030481或WO2011026641的式(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x，WO2009030481或WO2011026641中与其相关的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种RNA，与优选地选自SEQ ID NO:269-273的至少一种阳离子或聚阳离子蛋白质或肽或其任意组合复合或至少部分地复合。
根据各种实施方式，本发明的组合物包含组分A和组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种如本文定义的RNA，以及聚合物载剂。
如本文所用的术语“聚合物载剂”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指促进另一种化合物(例如组分A和/或组分B的货物核酸)的运输和/或复合的化合物。聚合物载剂一般是由聚合物形成的载剂。聚合物载剂可通过共价或非共价相互作用与其货物(例如组分A和/或组分B的DNA或RNA)缔合。聚合物可基于不同的亚单位，诸如共聚物。
在此上下文中适合的聚合物载剂可包括，例如，聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸酯、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化鱼精蛋白、PEG化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二甲基-3,3’-二硫代双丙酰亚胺(DTBP)、聚(乙烯亚胺)双氨基甲酸酯(PEIC)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、组氨酸修饰的PLL、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯亚胺)(PPI)、聚(氨基胺)(PAMAM)、聚(氨基乙烯亚胺)(SS-PAEI)、三乙烯四胺(TETA)、聚(β-氨基酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(PHP)、聚(烯丙基胺)、聚(α-[4-氨基丁基]-L-乙醇酸(PAGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶)、聚(磷腈)(PPZ)、聚(磷酸酯)(PPE)、聚(磷酰胺)(PPA)、聚(N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺)(pHPMA)、聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(pDMAEMA)、聚(2-氨基乙基磷酸丙烯酯)PPE_EA)、半乳糖基化壳聚糖、N-十二烷基化壳聚糖、组蛋白、胶原和葡聚糖-精胺。在一个实施方式中，聚合物可以是惰性聚合物，诸如但不限于PEG。在一个实施方式中，聚合物可以是阳离子聚合物，诸如但不限于PEI、PLL、TETA、聚(烯丙基胺)、聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶)、pHPMA和pDMAEMA。在一个实施方式中，聚合物可以是生物可降解PEI，诸如但不限于DSP、DTBP和PEIC。在一个实施方式中，聚合物可以是生物可降解的，诸如但不限于组氨酸修饰的PLL、SS-PAEI、聚(β-氨基酯)、PHP、PAGA、PLGA、PPZ、PPE、PPA和PPE-EA。
适合的聚合物载剂可以是由二硫化物交联的阳离子化合物形成的聚合物载剂。二硫化物交联的阳离子化合物可彼此相同或不同。聚合物载剂也可含有其它组分。根据本发明使用的聚合物载剂可包括如本文定义的阳离子肽、蛋白质或聚合物以及任选地其它组分的混合物，其通过二硫键交联(经由-SH基团)。
在此上下文中，根据专利申请WO2012/013326的式{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x(Cys)y}和式Cys,{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}Cys2的聚合物载剂是优选的，WO2012/013326中与其相关的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，聚合载体用于复合组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选地组分A和/或组分B的至少一种RNA可衍生自根据专利申请WO2011026641的式(L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)的聚合物载剂分子，WO2011026641中与其相关的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，聚合物载剂化合物由下列形成，或包括下列或由下列组成：肽元件CysArg12Cys(SEQ ID NO:269)或CysArg12(SEQ ID NO:270)或TrpArg12Cys(SEQ ID NO:271)。在特别优选的实施方式中，聚合物载剂化合物由(R12C)-(R12C)二聚体、(WR12C)-(WR12C)二聚体或(CR12)-(CR12C)-(CR12)三聚体组成，其中二聚体(例如(WR12C))或三聚体(例如(CR12))中的各个肽元件经由-SH基团连接。
在实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种RNA与包含HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO:272，作为肽单体)、HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO:272，作为肽单体)、HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ IDNO:273，作为肽单体)的聚乙二醇/肽聚合物和/或包含HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH(肽单体的SEQ ID NO:273)的聚乙二醇/肽聚合物复合或缔合。
在其它实施方式中，组合物包含组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，其中组分A和/或组分B的至少一种核酸，优选至少一种RNA与聚合物载剂复合或缔合，以及任选地与至少一种如WO2017212008A1、WO2017212006A1、WO2017212007A1和WO2017212009A1中描述的脂质组分复合或缔合。在此上下文中，WO2017212008A1、WO2017212006A1、WO2017212007A1和WO2017212009A1的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，(第一和/或第二组分的)聚合物载剂是肽聚合物，优选如上文定义的聚乙二醇/肽聚合物，和脂质组分，优选类脂质组分。
类脂质(lipidoid或lipidoit)是脂质样化合物，即具有脂质样物理特性的两亲性化合物。类脂质优选是包括两个或更多个阳离子氮原子和至少两个亲脂性尾的化合物。与许多常规的阳离子脂质不同，类脂质可以不含可水解的连接基团，具体是包括可水解酯、酰胺或氨基甲酸酯基团的连接基团。类脂质的阳离子氮原子可以是可阳离子化或永久阳离子的，或者阳离子氮的两种类型都可以存在于化合物中。在本发明上下文中，认为术语脂质也涵盖类脂质。
在本发明的一些实施方式中，类脂质可包括PEG部分。
在优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选组分A和/或组分B的至少一种RNA酸与聚合物载剂复合或缔合，优选与如上定义的聚乙二醇/肽聚合物，以及类脂质组分复合或缔合。
在实施方式中，组分A和组分B的至少一种核酸与如上定义的聚合物和如上定义的脂质或类脂质组分复合或缔合，或至少部分地复合或部分地缔合，其中组分A和组分B分别配制或其中组分A和组分B共配制。
适合地，类脂质是阳离子的，这表示其是可阳离子化或永久阳离子的。在一个实施方式中，类脂质是可阳离子化的，即其包括一个或多个可阳离子化氮原子，而无永久阳离子氮原子。在另一实施方式中，类脂质的阳离子氮原子中至少一个是永久阳离子的。任选地，类脂质包括两个永久阳离子氮原子、三个永久阳离子氮原子或甚至四个或更多个永久阳离子氮原子。
在优选的实施方式中，类脂质可以是选自已公开的PCT专利申请WO2017212009A1的第50-54页的表中提供的类脂质的类脂质的任一种，所述表中提供的具体的类脂质以及与其相关的具体公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，类脂质可以是选自3-C12-OH、3-C12-OH-cat、3-C12-酰胺、3-C12-酰胺一甲基、3-C12-酰胺二甲基、RevPEG(10)-3-C12-OH、RevPEG(10)-DLin-pAbenzoic、3C12酰胺-TMA cat.、3C12酰胺-DMA、3C12酰胺-NH2、3C12酰胺-OH、3C12酯-OH、3C12酯-amin、3C12酯-DMA、2C12Amid-DMA、3C12-lin-amid-DMA、2C12-sperm-amid-DMA或3C12-sperm-amid-DMA(参见已公开的PCT专利申请WO2017212009A1的表(第50-54页))中的任一种。特别优选的是3-C12-OH或3-C12-OH-cat。
在优选的实施方式中，包含如上文指定的类脂质(例如3-C12-OH或3-C12-OH-cat)的聚乙二醇/肽聚合物被用于复合所述至少一种核酸以形成具有下列N/P比的复合物：约0.1至约20，或约0.2至约15，或约2至约15，或约2至约12，其中N/P比被定义为阳离子肽或聚合物的碱性基团的氮原子与核酸的磷酸基团的摩尔比。在此上下文中，已公开的PCT专利申请WO2017212009A1的公开内容，具体是WO2017212009A1的权利要求1至10，以及与其相关的具体公开内容通过引用并入本文。
其它适合的类脂质可衍生自已公开的PCT专利申请WO2010053572。具体地，可在本发明的上下文中使用可衍生自已公开的PCT专利申请WO2010053572的权利要求1至297的类脂质，例如被并入到如本文所述的肽聚合物中，或例如被并入到脂质纳米颗粒中(如下所述)。因此，已公开的PCT专利申请WO2010053572的权利要求1至297以及与其相关的具体公开内容通过引用并入本文。
在脂质体或LNP中包封/复合：
在优选的实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选组分A的至少一种RNA和/或组分B的至少一种RNA与一种或多种脂质(例如阳离子脂质和/或中性脂质)复合、用其包封、用其部分地包封或与其缔合，从而形成基于脂质的载剂，如脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体，优选脂质纳米颗粒。
在实施方式中，组分A的至少一种核酸和组分B的至少一种核酸与一种或多种脂质(例如阳离子脂质和/或中性脂质)复合、用其包封、用其部分地包封或与其缔合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体，优选脂质纳米颗粒。
在实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸分别配制(在如本文定义的任何制剂或复合剂中)，优选其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸配制在单独的脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体中。
在实施方式中，组分A的至少一种核酸和组分B的至少一种核酸共配制(在如本文定义的任何制剂或复合剂中)，优选其中组分A的至少一种核酸和组分B的至少一种核酸配制在单独的脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体中。
脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体——并入的核酸(例如DNA或RNA)可完全或部分位于脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的内部空间中、在脂质层/膜内或与脂质层/膜的外表面缔合。将核酸并入到脂质体/LNP中在本文中也称为“包封”，其中核酸(例如RNA)被完全包含在脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的内部空间内。将核酸并入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的目的是使核酸，优选RNA免受可能含有降解核酸的酶或化学物质或条件的环境和/或导致核酸快速排泄的系统或受体的影响。此外，将核酸，优选RNA并入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体可促进核酸的摄取，并因此可增强组分A和/或组分B的核酸——例如编码至少一种抗原性肽或蛋白质的核酸——的治疗效果。因此，将组分A和/或B的核酸，例如组分A和/或组分B的RNA或DNA并入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体可特别适合本发明的组合疫苗，例如特别适合肌内和/或皮内施用。在此上下文中，术语“复合”或“缔合”是指(组分A和/或组分B)的核酸与一种或多种脂质基本上稳定组合成更大的复合物或组装体，而无需共价结合。
术语“脂质纳米颗粒”，也称为“LNP”，不限于任何特定的形态，并且包括当阳离子脂质和任选地一种或多种其它脂质在例如水性环境中和/或存在核酸(例如RNA)的情况下组合时产生的任何形态。例如，脂质体、脂质复合物、脂质体复合物等都在脂质纳米颗粒(LNP)的范围内。
脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体可以具有不同的尺寸，诸如但不限于多层囊泡(MLV)——其可以直径为数百纳米并且可以包含被狭窄水性隔室分隔的一系列同心双层、小单细胞囊泡(SUV)——其直径可以小于50nm，以及大单层囊泡(LUV)，其直径可以在50nm和500nm之间。
本发明的LNP适合地表征为具有通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离的内部水空间的微观囊泡。LNP的双层膜一般由两亲性分子如合成或天然来源的脂质形成，这些脂质可包括空间上隔开的亲水性结构域和疏水性结构域。脂质体的双层膜还可由两亲性聚合物和表面活性剂(例如，多聚体、囊泡(niosomes)等)形成。在本发明的上下文中，LNP一般用于将组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸，优选至少一种RNA运输到靶组织。
因此，在优选的实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸，优选至少一种RNA，与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物，优选LNP。优选地，LNP(脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)特别适用于肌内和/或皮内施用。
在实施方式中，至少约80％、85％、90％、95％的脂质系载剂，优选LNP，具有球形形态，优选包含实心的核或部分实心的核。
LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)一般包括至少一种阳离子脂质和一种或多种赋形剂，其选自中性脂质、带电脂质、类固醇和或聚合物缀合的脂质(例如PEG化脂质)。核酸(例如RNA、DNA)可被包封在LNP的脂质部分中或由LNP的一些或整个脂质部分包围的水性空间中。核酸(例如RNA、DNA)或其部分还可与LNP缔合和复合。LNP可包括能够形成核酸附着的颗粒的任何脂质，或其中包封一种或多种核酸的任何脂质。优选地，包含核酸的LNP包括一种或多种阳离子脂质，以及一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和PEG化脂质。
优选地，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，优选胆固醇；和
(iv)至少一种聚合物缀合的脂质，优选PEG-脂质；
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇和0.5-15％聚合物缀合的脂质。
LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)的阳离子脂质可以是可阳离子化的，即其在pH低于脂质的可离子化基团的pK时被质子化，但在较高的pH值下逐渐变得中性。在低于pK的pH值下，脂质则能够与带负电荷的核酸缔合。在某些实施方式中，阳离子脂质包括两性离子脂质，其在pH值降低时呈现(assumes)正电荷。
这样的脂质(或脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体)包括但不限于DSDMA、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)(也称为N-(2,3-二油酰基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵和1,2-二油基氧-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐)、N-(1-(2,3-二油基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧)丙基胺(DODMA)、ckk-E12、ckk、1,2-二亚油基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-y-亚麻基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、98N12-5、1,2-二亚油基氨基甲酰基氧-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、ICE(咪唑类)、HGT5000、HGT5001、DMDMA、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环)HGT4003、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DM A)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸(MC3)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺))、1,1’-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-l,16-二酰胺)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧)-N,N-二甲基丙烷-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)、
Figure BDA0004113537810001621
(市售的包括DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE)的阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL,Grand Island,N.Y.)；/>
Figure BDA0004113537810001622
(市售的包括N-(1-(2,3二油基氧)丙基)-N-(2-(精胺羧氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)的阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL)；以及/>
Figure BDA0004113537810001623
(市售的包括乙醇中的双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)的阳离子脂质，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)或前述中任一种的任意组合。在本发明的组合物和方法中使用的其它适合的阳离子脂质包括国际专利公开WO2010053572(并且特别地，第[00225]段处描述的CI 2-200)和WO2012170930中描述的阳离子脂质(两者均通过引用并入本文)、HGT4003、HGT5000、HGTS001、HGT5001、HGT5002(参见US20150140070A1)。
在实施方式中，脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的阳离子脂质可以是氨基脂质。
代表性氨基脂质包括但不限于1,2-二亚油基氧-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧-3吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧-3二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N二亚油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[l,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；MC3(US20100324120)。
在实施方式中，脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的阳离子脂质可以是氨基醇类脂质。
可在本发明中使用的氨基醇类脂质可通过在美国专利号8,450,298(其通过引用以其整体并入本文)中描述的方法制备。适合的(可离子化)脂质还可以是在WO2017075531A1(其通过引用并入本文)中的表1、2和3所公开以及权利要求1-24中所定义的化合物。
在另一实施方式中，适合的脂质可以是如WO2015074085A1中公开的化合物(即ATX-001至ATX-032或权利要求1-26中指定的化合物)、美国申请号61/905,724和15/614,499或美国专利号9,593,077和9,567,296(其通过引用并入本文)中公开的化合物。
在其它实施方式中，适合的阳离子脂质可以是如WO2017117530A1(其通过引用以其整体并入本文)中公开的化合物(即脂质13、14、15、16、17、18、19、20，或权利要求中指定的化合物)。
在优选的实施方式中，可离子化脂质/阳离子脂质还可选自WO2018078053A1中公开的脂质(即衍生自WO2018078053A1的式I、II和III的脂质，或WO2018078053A1的权利要求1至12中指定的脂质)，WO2018078053A1的公开内容通过引用以其整体并入本文。在此上下文中，WO2018078053A1的表7中公开的脂质(例如如衍生自式I-1至I-41的脂质)和WO2018078053A1的表8中公开的脂质(例如衍生自式II-1至II-36的脂质)可适合地用于本发明的上下文中。因此，WO2018078053A1的式I-1至式I-41以及式II-1至式II-36，以及涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。
在优选实施方式中，阳离子脂质可衍生自已公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式III。因此，WO2018078053A1的式III以及涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选组分A和/或组分B的至少一种RNA与一种或多种脂质复合，从而形成LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)，其中LNP的阳离子脂质选自已公开的PCT专利申请WO2018078053A1的表9的结构III-1至III-36。因此，WO2018078053A1的式III-1至III-36以及涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。
在特别优选的实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选组分A的至少一种RNA酸和/或组分B的至少一种RNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体，优选LNP，其中脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体，优选LNP包含根据式III-3的阳离子脂质：
Figure BDA0004113537810001641
如本文适合地使用的式III-3脂质具有化学术语((4-羟丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)，也称为ALC-0315。
在某些实施方式中，如本文定义的阳离子脂质，更优选地阳离子脂质化合物III-3相对于LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)的总脂质含量以约30至约95摩尔百分比的量存在于LNP中。如果在LNP内并入多于一种阳离子脂质，那么这样的百分比适用于组合的阳离子脂质。
在实施方式中，阳离子脂质以约30至约70摩尔百分比的量存在于LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约40至约60摩尔百分比，如约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60摩尔百分比的量存在于LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)中。在实施方式中，阳离子脂质以约47至约48摩尔百分比，如分别约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、50.0摩尔百分比的量存在于LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)中，其中特别优选47.7摩尔百分比。
在一些实施方式中，阳离子脂质以约20mol％至约70或75mol％或约45至约65mol％或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或约70mol％总脂质的比存在于LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)中。在进一步的实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含按摩尔计(基于脂质纳米颗粒中100％脂质总摩尔数)约25％至约75％的阳离子脂质，例如按摩尔计约20至约70％、约35至约65％、约45至约65％、约60％、约57.5％、约57.1％、约50％或约40％。在一些实施方式中，阳离子脂质与核酸(例如编码RNA或DNA)的比为约3至约15，如约5至约13或约7至约11。
其它适合的(阳离子或可离子化)脂质公开在WO2009086558、WO2009127060、WO2010048536、WO2010054406、WO2010088537、WO2010129709、WO2011153493、WO2013063468、US20110256175、US20120128760、US20120027803、US8158601、WO2016118724、WO2016118725、WO2017070613、WO2017070620、WO2017099823、WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2008103276、WO2013086373、WO2013086354、美国专利号7,893,302、7,404,969、8,283,333、8,466,122和8,569,256以及美国专利公开号US20100036115、US20120202871、US20130064894、US20130129785、US20130150625、US20130178541、US20130225836、US20140039032和WO2017112865中。在此上下文中，WO2009086558、WO2009127060、WO2010048536、WO2010054406、WO2010088537、WO2010129709、WO2011153493、WO2013063468、US20110256175、US20120128760、US20120027803、US8158601、WO2016118724、WO2016118725、WO2017070613、WO2017070620、WO2017099823、WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2008103276、WO2013086373、WO2013086354、美国专利号7,893,302、7,404,969、8,283,333、8,466,122和8,569,256以及美国专利公开号US20100036115、US20120202871、US20130064894、US20130129785、US20130150625、US20130178541、US20130225836和US20140039032以及WO2017112865中具体涉及适用于LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)的(阳离子)脂质的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，如本文定义的氨基或阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化基团，使得脂质在生理pH(例如pH7.4)或以下的pH时带正电荷，而在第二pH(优选在生理pH或生理pH以上时)时为中性。当然，应该理解，质子的添加或去除，作为pH的函数，是平衡过程，并且对带电或中性脂质的提及是指主要种类的性质，而不要求所有脂质以带电或中性形式存在。具有多于一个可质子化或可去质子化基团的脂质或两性离子型脂质不被排除在外，并且可同样适用于本发明的上下文中。在一些实施方式中，可质子化脂质的可质子化基团的pKa在约4至约11范围内，例如pKa为约5至约7。
LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)可包含两种或更多种(不同的)如本文定义的阳离子脂质。可选择阳离子脂质以促成不同的有利性质。例如，可在LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)中使用性质如胺pKa、化学稳定性、循环半衰期、组织中的半衰期、组织中的净累积或毒性不同的阳离子脂质。具体地，可以选择阳离子脂质，使得混合LNP的性质比个体脂质的单LNP的性质更理想。
可考虑核酸货物的量来选择永久阳离子脂质或类脂质的量。在一个实施方式中，选择这些量使得纳米颗粒(一种或多种)的或组合物的N/P比在约0.1至约20的范围内。在此上下文，N/P比被定义为脂质或类脂质的碱性含氮基团的氮原子(“N”)与被用作货物的核酸的磷酸基团(“P”)的摩尔比。N/P比可基于例如1ug RNA一般含有约3nmol磷酸残基来计算，前提是RNA表现出碱基的统计学分布。脂质或类脂质的“N”值可根据其分子量和永久阳离子基团与永久可阳离子化基团(如果存在的话)的相对含量来计算。
LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)在体内的特性和行为可通过向LNP表面添加亲水性聚合物涂层例如聚乙二醇(PEG)来修饰，以赋予空间稳定。此外，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)可用于通过附接配体(例如抗体、肽和碳水化合物)而特异性靶向其表面或附接的PEG链的末端(例如经由PEG化脂质或PEG化胆固醇)。
在一些实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括聚合物缀合的脂质。术语“聚合物缀合的脂质”是指包括脂质部分和聚合物部分两者的分子。聚合物缀合的脂质的示例是PEG化脂质。术语“PEG化脂质”是指包括脂质部分和聚乙二醇部分两者的分子。PEG化脂质在本领域是已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。
如本文定义的聚合物缀合的脂质，例如PEG-脂质，可用作减少聚集的脂质。
在某些实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括稳定脂质，其是聚乙二醇-脂质(PEG化脂质)。适合的聚乙二醇-脂质包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、PEG-修饰的二烷基甘油。代表性聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在优选的实施方式中，聚乙二醇-脂质是PEG-2000-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG)。在其它实施方式中，LNP包括PEG化二酰基甘油(PEG-DAG)如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG化神经酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在优选的实施方式中，PEG化脂质优选地衍生自已公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IV)。因此，衍生自已公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IV)的PEG化脂质，以及涉及其的相应的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸(例如RNA或DNA)与一种或多种脂质复合，从而形成LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)，其中LNP包括聚合物缀合的脂质，优选PEG化脂质，其中PEG脂质优选地衍生自已公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IVa)。因此，衍生自已公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IVa)的PEG化脂质，以及涉及其的相应的公开内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸，优选至少一种RNA组分A和/或组分B，与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)，其中LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括聚合物缀合的脂质，优选PEG化脂质/PEG脂质。在优选的实施方式中，所述PEG脂质或PEG化脂质具有式(IVa)：
Figure BDA0004113537810001671
其中n的平均值范围为30至60，如约30±2、32±2、34±2、36±2、38±2、40±2、42±2、44±2、46±2、48±2、50±2、52±2、54±2、56±2、58±2或60±2。在最优选的实施方式中，n为约49。在另一个优选的实施方式中，n为约45。在进一步优选的实施方式中，所述PEG脂质具有式(IVa)，其中n是经选择使得PEG脂质的平均分子量为约2000g/mol至约3000g/mol或约2300g/mol至约2700g/mol，甚至更优选约2500g/mol的整数。
适用于本文的式IVa的脂质具有化学术语2[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺，也称为ALC-0159。
在此上下文中适合的PEG脂质的其它示例提供在US20150376115A1和WO2015199952中，其各自通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括基于LNP中脂质的总摩尔数小于约3、2或1摩尔百分比的PEG或PEG-修饰的脂质。在进一步的实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括按摩尔计(基于LNP中100％脂质总摩尔数)约0.1％至约20％的PEG-修饰的脂质，例如约0.5至约10％、约0.5至约5％、约10％、约5％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％、约1％、约0.5％或约0.3％。在优选的实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括按摩尔计(基于LNP中100％脂质总摩尔数)约1.0％至约2.0％的PEG-修饰的脂质，例如约1.2至约1.9％、约1.2至约1.8％、约1.3至约1.8％、约1.4至约1.8％、约1.5至约1.8％、约1.6至约1.8％，具体是约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％，最优选1.7％。在各种实施方式中，阳离子脂质与PEG化脂质的摩尔比范围为约100:1至约25:1。
在优选的实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括在颗粒形成期间或制造过程中稳定颗粒的形成的一种或多种另外的脂质(例如中性脂质和/或一种或多种类固醇或类固醇类似物)。
在优选的实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸，优选至少一种RNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)，其中LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括一种或多种中性脂质和/或一种或多种类固醇或类固醇类似物。
适合的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以未带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任一种。代表性中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
在实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括一种或多种中性脂质，其中中性脂质选自二硬脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)或其混合物。
在一些实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包括选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在各种实施方式中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比范围为约2:1至约8:1。
在优选的实施方式中，中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。适合地，阳离子脂质与DSPC的摩尔比可在约2:1至约8:1的范围内。
在优选的实施方式中，类固醇是胆固醇。适合地，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比可在约2:1至约1:1的范围内。在一些实施方式中，胆固醇可被PEG化。
固醇可为脂质颗粒的约10mol％至约60mol％或约25mol％至约40mol％。在一个实施方式中，固醇是脂质颗粒中存在的总脂质的约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或约60mol％。在另一个实施方式中，LNP包含按摩尔计(基于脂质纳米颗粒中100％脂质总摩尔数)约5％至约50％的固醇，例如按摩尔计约15％至约45％、约20％至约40％、约48％、约40％、约38.5％、约35％、约34.4％、约31.5％或约31％。
优选地，脂质LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含：
(a)组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸，优选组分A和/或组分B的至少一种RNA，(b)阳离子脂质，(c)聚集减少剂(如聚乙二醇(PEG)脂质或PEG-修饰的脂质)，(d)任选地非阳离子脂质(如中性脂质)，以及(e)任选地固醇。
在一些实施方式中，阳离子脂质(如上定义)、非阳离子脂质(如上定义)、胆固醇(如上定义)和/或PEG-修饰的脂质(如上定义)可以以各种相对摩尔比组合。例如，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇类脂质与PEG化脂质的比可介于约30-60:20-35:20-30:1-15，或分别以约40:30:25:5、50:25:20:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:32:20:8、40:32:25:3或40:33:25:2的比，或以约50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3 40:30:20:10、40:30:25:5或40:32:20:8、40:32:25:3或40:33:25:2的比。
在一些实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含式(III)脂质、组分A和/或组分B的至少一种核酸(优选如本文定义的至少一种RNA)、中性脂质、类固醇和PEG化脂质。在优选的实施方式中，式(III)脂质是脂质化合物III-3(ALC-0315)，中性脂质是DSPC，类固醇是胆固醇，以及PEG化脂质是式(Iva ALC-0159)化合物。
在优选的实施方式中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)主要由下列组成：(i)至少一种阳离子脂质；(ii)中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，其摩尔比为约20-60％阳离子脂质:5-25％中性脂质:25-55％固醇；0.5-15％ PEG-脂质。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸，优选组分A和/或组分B的至少一种RNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)，其中LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含
(i)至少一种如本文定义的阳离子脂质，优选式(III)脂质，更优选脂质III-3(ALC-0315)；
(ii)至少一种如本文定义的中性脂质，优选1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种如本文定义的类固醇或类固醇类似物，优选胆固醇；和
(iv)至少一种如本文定义的聚合物缀合的脂质，优选PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，优选式(IVa ALC-0159)或衍生自式(IVa ALC-0159)的PEG化脂质。
在特别优选的实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸，优选组分A和/或组分B的至少一种RNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP包含(i)至(iv)，其摩尔比为约20-60％阳离子脂质:5-25％中性脂质:25-55％固醇；0.5-15％聚合物缀合的脂质，优选PEG-脂质。
在一个优选的实施方式中，脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含：具有式(III)的阳离子脂质和/或具有式(IV)的PEG脂质，任选地中性脂质，优选1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和任选地类固醇，优选胆固醇，其中阳离子脂质与DSPC的摩尔比任选地在约2:1至8:1的范围内，其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比任选地在约2:1至1:1的范围内。
在特别优选的实施方式中，组合物包含组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸，优选至少一种RNA，包含脂质纳米颗粒(LNP)，其具有下列摩尔比：大约50:10:38.5:1.5，优选47.5:10:40.8:1.7或更优选47.4:10:40.9:1.7(即阳离子脂质(优选脂质III-3(ALC-0315))、DSPC、胆固醇和聚合物缀合的脂质(优选PEG-脂质(优选n＝49的式(IVa)的PEG-脂质，甚至更优选n＝45的式(IVa)的PEG-脂质；ALC-0159)的比例(mol％)；溶解于乙醇中)。
脂质纳米颗粒中核酸的总量可以变化，并且根据例如核酸与总脂质w/w比限定。在本发明的一个实施方式中，核酸，具体是RNA与总脂质的比小于0.06w/w，优选地在0.03w/w和0.04w/w之间。
在优选的实施方式中，脂质与核酸的w/w比为约10:1至约60:1，优选约20:1至约30:1，例如约25:1。
在优选的实施方式中，包封核酸的脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的n/p比在约1至约10的范围内，优选在约5至约7的范围内，更优选约6。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)仅由三种脂质组分组成，即咪唑胆固醇酯(ICE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。
在一个实施方式中，组合物的脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含阳离子脂质、类固醇、中性脂质和聚合物缀合的脂质，优选PEG化脂质。优选地，聚合物缀合的脂质是PEG化脂质或PEG-脂质。在具体实施方式中，脂质纳米颗粒包含类似于阳离子脂质
Figure BDA0004113537810001691
SS-EC(原名:SS-33/4PE-15；NOF公司,东京,日本)的阳离子脂质，其满足下式
Figure BDA0004113537810001701
如下文进一步描述，这些脂质纳米颗粒被称为“GN01”。
此外，在具体实施方式中，GN01脂质纳米颗粒包含类似于结构1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)的中性脂质：
Figure BDA0004113537810001702
此外，在具体实施方式中，GN01脂质纳米颗粒包含聚合物缀合的脂质，优选聚乙二醇化脂质，是具有下列结构的1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)：
Figure BDA0004113537810001703
/>
如本领域中所用，“DMG-PEG 2000”被认为是1,2-DMG PEG2000和1,3-DMG PEG2000以约97:3比例的混合物。
因此，根据优选实施方式之一的GN01脂质纳米颗粒(GN01-LNP)包含SS-EC阳离子脂质、中性脂质DPhyPE、胆固醇和聚合物缀合的脂质(聚乙二醇化脂质)1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
在优选的实施方式中，GN01 LNP包含：
(a)量为45-65mol％的阳离子脂质SS-EC(原名:SS-33/4PE-15；NOF公司,东京,日本)；
(b)量为25-45mol％的胆固醇，；
(c)量为8-12mol％的DPhyPE；和
(d)量为1-3mol％的PEG-DMG 2000；
各个量均是相对于GN01脂质纳米颗粒的所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在进一步优选的实施方式中，如本文所述的GN01脂质纳米颗粒包含59mol％阳离子脂质、10mol％中性脂质、29.3mol％类固醇和1.7mol％聚合物缀合的脂质，优选聚乙二醇化脂质。在最优选的实施方式中，如本文所述的GN01脂质纳米颗粒包含59mol％阳离子脂质SS-EC、10mol％DPhyPE、29.3mol％胆固醇和1.7mol％DMG-PEG 2000。
GN01脂质纳米颗粒中阳离子脂质的量相对于核酸的量也可表示为重量比(缩写为例如“m/m”)。例如，GN01脂质纳米颗粒包含至少一种核酸，优选至少一种RNA，其含量使得实现脂质与RNA的重量比在约20至约60，或约10至约50的范围内。在其它实施方式中，阳离子脂质与核酸或RNA的比为约3至约15，如约5至约13、约4至约8或约7至约11。在本发明非常优选的实施方式中，总脂质/RNA质量比为约40或40，即质量过量约40或40倍以确保RNA包封。另一优选的RNA/脂质比在约1和约10之间、在约2和约5之间、在约2和约4之间，或优选约3。
此外，可考虑核酸货物如RNA化合物的量来选择阳离子脂质的量。在一个实施方式中，N/P比可在约1至约50的范围内。在另一个实施方式中，范围是约1至约20、约1至约10、约1至约5。在一个优选的实施方式中，选择这些量使得GN01脂质纳米颗粒的或组合物的N/P比在约10至约20的范围内。在其它非常优选的实施方式中，N/P是14(即14倍摩尔过量的正电荷以确保核酸包封)。
在优选的实施方式中，GN01脂质纳米颗粒包含59mol％阳离子脂质
Figure BDA0004113537810001711
SS-EC(原名:SS-33/4PE-15,正如从实施例部分显而易见；NOF公司,东京,日本)、29.3mol％胆固醇作为类固醇、10mol％DPhyPE作为中性脂质/磷脂以及1.7mol％DMG-PEG 2000作为聚合物缀合的脂质。与使用DPhyPE相关的另一个创造性优点是由于其庞大的尾部而具有高融合能力，由此它能够与内体脂质高水平融合。对于“GN01”，N/P(脂质与核酸例如RNA摩尔比)优选为14，并且总脂质/RNA质量比优选为40(m/m)。
在其它实施方式中，组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸，优选至少一种RNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)，其中LNP(或脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)包含
I.至少一种阳离子脂质；
Ii.至少一种中性脂质；
lii.至少一种类固醇或类固醇类似物；和
liii.至少一种如本文定义的PEG-脂质，
其中阳离子脂质是DLin-KC2-DMA(50mol％)或DLin-MC3-DMA(50mol％)，中性脂质是DSPC(10mol％)，PEG脂质是PEG-DOMG(1.5mol％)，以及结构脂质是胆固醇(38.5mol％)。
在其它实施方式中，组分A和/或组分B的至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选至少一种RNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP包含SS15/Chol/DOPE(或DOPC)/DSG-5000，mol％为50/38.5/10/1.5。
在其它实施方式中，组分A和/或组分B的核酸可被配制在脂质体中，例如被配制在如WO2019222424、WO2019226925、WO2019232095、WO2019232097或WO2019232208中描述的脂质体中，WO2019222424、WO2019226925、WO2019232095、WO2019232097或WO2019232208中涉及脂质体或脂质系载剂分子的公开内容通过引用并入本文。
在各种实施方式中，适合地包封组分A和/或组分B的至少一种核酸的LNP的平均直径为约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、约90nm至约190nm、约90nm至约180nm、约90nm至约170nm、约90nm至约160nm、约90nm至约150nm、约90nm至约140nm、约90nm至约130nm、约90nm至约120nm、约90nm至约100nm、约70nm至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm并且基本上无毒。如本文所用，平均直径可由如本领域公知的动态光散射所测定的z-平均尺寸表示。
在本发明另一优选的实施方式中，脂质纳米颗粒的流体动力学直径分别在约50nm至约300nm，或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm，或约60nm至约120nm的范围内。
在本发明另一优选的实施方式中，脂质纳米颗粒的流体动力学直径分别在约50nm至约300nm，或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm，或约60nm至约120nm的范围内。
在另一优选的实施方式中，脂质纳米颗粒的Z-平均尺寸在约60nm至约120nm范围内，优选小于约120nm，更优选小于约100nm，最优选小于约80nm。
适合地，LNP包括少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的、粒度超过约500nm的LNP。适合地，LNP包括少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的、粒度小于约20nm的LNP。
纳米颗粒(例如LNP)的多分散指数(PDI)一般在0.1至0.5的范围内。在特定实施方式中，PDI在0.2以下。一般地，PDI通过动态光散射测定。
在优选的实施方式中，组合物的多分散指数(PDI)值小于约0.4，优选小于约0.3，更优选小于约0.2，最优选小于约0.1。
在各种实施方式中，药物组合物的核酸例如RNA不超过一定比例的游离RNA。
在此上下文中，术语“游离RNA”或“非复合RNA”或“非包封RNA”包括未被包封在如本文定义的脂质系载剂中的RNA分子。在组合物的配制期间(例如在将RNA包封到脂质系载剂中期间)，游离RNA可代表污染或杂质。
技术人员可选择多种不同的方法来测定组合物中游离核酸或游离RNA的量和/或比例。组合物中的游离RNA可通过色谱法(例如AEX、SEC)或通过使用与组合物中游离RNA结合的探针(例如染料)来测定。在本发明的上下文中，可采用基于染料的试验来测定游离RNA或非包封RNA的量。可用于测定游离RNA的量和/或比例的适合的染料包括
Figure BDA0004113537810001721
染料、/>
Figure BDA0004113537810001722
染料、/>
Figure BDA0004113537810001723
RNA染料、/>
Figure BDA0004113537810001724
RNA染料、Quant-iTTMRNA染料、/>
Figure BDA0004113537810001725
染料、/>
Figure BDA0004113537810001726
染料。此类染料适用于辨别游离RNA和包封的RNA。可按照供应商说明书的推荐，使用由限定量的游离RNA或包封RNA组成的参考标准品并将其与相应的试剂(例如/>
Figure BDA0004113537810001727
试剂(激发500nm/发射525nm))混合。一般地，根据制造商的说明书，使用Quant-iT RiboGreen RNA试剂对组合物的游离RNA进行定量。在本发明的上下文中，游离RNA的比例一般使用RiboGreen试验来测定。
在实施方式中，组合物包含游离核酸，如范围在约30％至约0％的游离RNA。在实施方式中，组合物包含约20％的游离RNA(和约80％的包封的RNA)、约15％的游离RNA(和约85％的包封的RNA)、约10％的游离RNA(和约90％的包封的RNA)或约5％的游离RNA(和约95％的包封的RNA)。在优选的实施方式中，组合物包含少于约20％的游离RNA，优选少于约15％的游离RNA，更优选少于约10％的游离RNA，最优选少于约5％的游离RNA。
在包含RNA核酸的方面中，术语“包封的RNA”包括被包封在如本文定义的脂质系载剂中的RNA分子。本发明上下文中包封的RNA的比例一般使用RiboGreen试验来测定。
因此，在实施方式中，组合物中约70％至约100％的RNA被包封在脂质系载剂中。在实施方式中，组合物包含约80％的包封的RNA(和约20％的游离RNA)、约85％的包封的RNA(和约15％的游离RNA)、约90％的包封的RNA(和约10％的游离RNA)或约95％的包封的RNA(和5％的游离RNA)。
在优选的实施方式中，组合物中包含的80％的核酸(例如，RNA)被包封，优选组合物中包含的85％的RNA被包封，更优选组合物中包含的90％的RNA被包封，最优选组合物中包含的95％的RNA被包封。
在实施方式中，包封RNA的脂质系载剂已通过至少一个纯化步骤，优选通过至少一个TFF步骤和/或至少一个净化步骤和/或至少一个过滤步骤纯化。适合地，纯化的组合物w包含少于约500ppM乙醇，优选少于约50ppM乙醇，更优选少于约5ppM乙醇。
在各种实施方式中，第一方面的药物组合物包含浓度为约50mM至约300mM的糖，优选浓度为约150mM的蔗糖。
在组合物中包含本发明组分A和/或组分B的多于一种或者多种，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种核酸种类的实施方式中，所述多于一种或者所述多种，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种核酸种类可被复合在一种或多种脂质中，从而形成包含多于一种或多种，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种不同的核酸种类的LNP。
在实施方式中，可将本文描述的核酸制剂(例如聚合物、LNP、脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)冻干以提高制剂和/或组分A和/或组分B的核酸的储存稳定性。在实施方式中，可将本文描述的核酸制剂(例如聚合物、LNP、脂质体、纳米脂质体、脂质体复合物)喷雾干燥以提高制剂和/或组分A和/或B的核酸的储存稳定性。用于冻干和/或喷雾干燥的冻干保护剂可选自海藻糖、蔗糖、甘露糖、葡聚糖和菊粉。优选的冻干保护剂是蔗糖，任选地包括其它冻干保护剂。进一步优选的冻干保护剂是海藻糖，任选地包括其它冻干保护剂。
适合地，将药物组合物，例如包含LNP的组合物冻干(例如根据WO2016165831或WO2011069586)以产生如本文定义的温度稳定的经干燥的核酸(粉末)组合物(例如DNA或RNA)。也可使用喷雾干燥或喷雾冷冻干燥(例如根据WO2016184575或WO2016184576)对组合物，例如包含LNP的组合物进行干燥以产生如本文定义的温度稳定的组合物(粉末)。
因此，在优选的实施方式中，药物组合物是经干燥的组合物。
如本文所用的术语“经干燥的组合物”必须被理解为这样的组合物：已经如上定义的经冻干或喷雾干燥或喷雾冷冻干燥以获得温度稳定的经干燥的组合物(粉末)，例如包含LNP复合的RNA(如上定义)。
在实施方式中，冻干或喷雾干燥的组合物具有少于约10％的含水量。
在优选的实施方式中，冻干或喷雾干燥的组合物具有约0.5％和5％之间的含水量。
在优选的实施方式中，冻干或喷雾干燥的组合物在约5℃下储存后至少2个月，优选至少3个月、4个月、5个月、6个月是稳定的。
根据进一步的实施方式，药物组合物可包含至少一种佐剂。
适合地，优选加入佐剂以增强组合物的免疫刺激特性。
如本文所用的术语“佐剂”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指可改变(例如增强)其它剂的效果或者可适合支持组合物的施用和递送的药理学剂和/或免疫学剂。术语“佐剂”指的是广谱物质。一般地，这些物质能够增加抗原的免疫原性。例如，佐剂可被先天免疫系统识别并且例如可引发先天免疫应答(即非特异性免疫应答)。“佐剂”一般不引发适应性免疫应答。在本发明的上下文中，佐剂可增强核酸所提供的抗原性肽或蛋白质的效果。在此上下文中，所述至少一种佐剂可选自技术人员已知并且适用于当前情况——即支持在对象中，例如在人类对象中诱导免疫应答——的任何佐剂。
因此，药物组合物可包含至少一种佐剂，其中所述至少一种佐剂可适合地选自WO2016203025中提供的任何佐剂。WO2016203025的权利要求2至17中任一项公开的佐剂，优选WO2016203025的权利要求17中公开的佐剂是特别适合的，与其相关的具体内容通过引用并入本文。佐剂可适合地用于和包含在第一方面的组合物或第二方面的组合疫苗中，以例如减少针对经编码的蛋白质的充分的免疫应答所需的(组分A和/或组分B的)核酸的量和/或提高组合物/疫苗的治疗/接种功效，特别是对老年人的治疗/接种。适合冠状病毒组合物或疫苗(具体是对于包含第三方面的多肽的组合物)的上下文中的佐剂可以是Toll样受体9(TLR9)激动剂佐剂，CpG 1018TM。
除了本文指定的组分外，药物组合物还可包含：至少一种其它组分——其可选自其它抗原(例如以肽或蛋白质的形式，优选衍生自如本文指定的冠状病毒和/或如本文指定的其它病毒)或其它编码抗原的核酸；其它免疫治疗剂；一种或多种辅助物质(细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子)；或任何其它化合物——由于其对人类Toll样受体的结合亲和力(作为配体)而已知具有免疫刺激性；和/或佐剂核酸，优选免疫刺激性RNA(isRNA)，例如CpG-RNA等。
在实施方式中，药物组合物包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂。这种拮抗剂可优选地共配制在如本文定义的脂质系载剂中。
PCT专利申请PCT/EP2020/072516(其全部公开内容通过引用并入本文)中公开了至少一种RNA感知模式识别受体(RNA sensing pattern recognition receptor)的适合的拮抗剂。具体地，并入了涉及如PCT/EP2020/072516的权利要求1至94中任一项所限定的至少一种RNA感知模式识别受体的适合的拮抗剂的公开内容。
在优选的实施方式中，组合物包含选自Toll样受体，优选地TLR7和/或TLR8的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂。
在实施方式中，至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂选自核苷酸、核苷酸类似物、核酸、肽、蛋白质、小分子、脂质或这些中任意者的片段、变体或衍生物。
在优选的实施方式中，至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂是单链寡核苷酸，优选地单链RNA寡核苷酸。
在实施方式中，至少一种RNA感知模式识别受体的拮抗剂是单链寡核苷酸，其包含下列或由下列组成：与选自PCT/EP2020/072516的SEQ ID NO:85-212的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段。
在优选的实施方式中，至少一种RNA感知模式识别受体的拮抗剂是单链寡核苷酸，其包含下列或由下列组成：与选自PCT/EP2020/072516的SEQ ID NO:85-87、149-212的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段。
在本发明的上下文中，至少一种RNA感知模式识别受体的特别优选的拮抗剂是5’-GAG CGmG CCA-3’(PCT/EP2020/072516的SEQ ID NO:85)或其片段。
在实施方式中，如本文定义的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂与至少一种核酸，优选如本文定义的编码抗原性肽或蛋白质的RNA的摩尔比的范围适合地为约1:1至约100:1，或范围为约20:1至约80:1。
在实施方式中，其中如本文定义的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂与至少一种核酸，优选如本文定义的编码抗原性肽或蛋白质的RNA的重量/重量比的范围适合地为约1:1至约1:30，或范围为约1:2至约1:10。
组分A和组分B的组合：
在下文中，进一步指定了涉及药物组合物(和组合疫苗)的组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)和组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)的适合的组合的适合的特征和实施方式。
如本文概述的，本发明涉及包含至少一种组分A和至少一种组分B的药物组合物，其中组分A包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，组分A选自下列组分中的至少一种
A-1至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的，和/或
A-2至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS相关病毒(例如SARS-CoV-1)的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的，和/或
A-3至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的。
必须理解，组分A-1包含编码选自或衍生自至少一种SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分A-1：SARS-CoV-2”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分A-1的上下文中定义的。所述编码SARS-CoV-2抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码SARS-CoV-2抗原的至少一种核酸。所述编码SARS-CoV-2抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
必须理解，组分A-2包含编码选自或衍生自至少一种SARS相关病毒(例如SARS-CoV-1)的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分A-2：SARS相关病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分A-2的上下文中定义的。所述编码至少一种SARS相关病毒抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种SARS相关病毒抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种SARS相关病毒抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
必须理解，组分A-3包含编码选自或衍生自至少一种MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分A-3：MERS-CoV”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分A-3的上下文中定义的。所述编码至少一种MERS-CoV抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种MERS-CoV抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种MERS-CoV抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
在实施方式中，组分A选自A-1和A-2；A-1和A-3；A-2和A-3；或A-1和A-2和A-3。
在优选的实施方式中，组分A选自组分A-1(SARS-CoV-2)。
如本文概述的，本发明涉及包含至少一种组分A和至少一种组分B的药物组合物，其中组分B包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
适合地，组分B选自下列组分中的至少一种
B-1至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种不同的冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的，和/或
B-2至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的，和/或
B-3至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种肺病毒科病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的，和/或
B-4至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种副粘病毒科病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的。
必须理解，组分B-1包含编码选自或衍生自至少一种不同的冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-1：不同的冠状病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-1的上下文中定义的。所述编码不同的冠状病毒的抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码不同的冠状病毒抗原的至少一种核酸。所述编码不同的冠状病毒抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
必须理解，组分B-2包含编码选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-2：流感病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-2的上下文中定义的。所述编码至少一种流感病毒抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种流感病毒抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种流感病毒抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
必须理解，组分B-3包含编码选自或衍生自至少一种肺病毒科病毒(例如RSV和/或hMPV)的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-3：肺病毒科病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-3的上下文中定义的。所述编码至少一种肺病毒科病毒(例如RSV和/或hMPV)抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种肺病毒科病毒(例如RSV和/或hMPV)抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种肺病毒科病毒(例如RSV和/或hMPV)抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
必须理解，组分B-4包含编码选自或衍生自至少一种副粘病毒科病毒(例如PIV和/或亨尼帕病毒)的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-4：副粘病毒科病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-4的上下文中定义的。所述编码至少一种副粘病毒科病毒(例如PIV和/或亨尼帕病毒)抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种副粘病毒科病毒(例如PIV和/或亨尼帕病毒)抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种副粘病毒科病毒(例如PIV和/或亨尼帕病毒)抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-1和组分B-2。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-2。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-2以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-1和组分B-3。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-3。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-3以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-1和组分B-4。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-4。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-4以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-2和组分B-3。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-3。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-3以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-2和组分B-4。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-4。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-4以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-3和组分B-4。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-3和如本文定义的至少一种组分B-4。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-3和如本文定义的至少一种组分B-4以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-1和组分B-2以及组分B3。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-2以及如本文定义的至少一种组分B-3。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-3以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-1和组分B-2以及组分B4。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-2以及如本文定义的至少一种组分B-4。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-4以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-1和组分B-3以及组分B4。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-3以及如本文定义的至少一种组分B-4。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-1和如本文定义的至少一种组分B-3和如本文定义的至少一种组分B-4以及如本文定义的至少一种组分A-1。
在优选的实施方式中，药物组合物的组分B选自组分B-2和组分B-3以及组分B4。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-3和如本文定义的至少一种组分B-4。在特别优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-2和如本文定义的至少一种组分B-3和如本文定义的至少一种组分B-4以及如本文定义的至少一种组分A-1。
适合地，组分B-3选自下列组分中的至少一种
B-3a至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种RSV病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的，和/或
B-3b至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种hMPV病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的。
必须理解，组分B-3a包含编码选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-3a：呼吸道合胞病毒(RSV)”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-3a的上下文中定义的。所述编码至少一种RSV抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种RSV抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种RSV抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
必须理解，组分B-3b包含编码选自或衍生自至少一种hMPV的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-3b：人类偏肺病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-3a的上下文中定义的。所述编码至少一种hMPV抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种hMPV抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种hMPV抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
在优选的实施方式中，组分B-3选自组分B-3a。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-3a。
适合地，组分B-4选自下列组分中的至少一种
B-4a至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种PIV病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的，和/或
B-4b至少一种核酸，包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选如本文定义的。
必须理解，组分B-4a包含编码选自或衍生自至少一种hPIV的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-4a：副流感病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-4a的上下文中定义的。所述编码至少一种PIV抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种PIV抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种PIV抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
必须理解，组分B-4b包含编码选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一种核酸，如段落“组分B-4b：亨尼帕病毒”中定义的，优选具有核酸序列，优选mRNA序列，如在组分B-4b的上下文中定义的。所述编码至少一种亨尼帕病毒抗原的核酸序列的适合的特征在“核酸特征和实施方式”段落中提供。此外，优选配制和/或复合编码至少一种亨尼帕病毒抗原的至少一种核酸。所述编码至少一种亨尼帕病毒抗原的核酸的适合的制剂或复合物在“配制和复合”段落中提供。
在优选的实施方式中，组分B-4选自组分B-4a。因此，在优选的实施方式中，药物组合物包含如本文定义的至少一种组分B-4a。
在优选的实施方式中，药物组合物包含下列或由下列组成：如本文定义的组分A-1和如本文定义的组分B-3a。
在优选的实施方式中，药物组合物包含下列或由下列组成：如本文定义的组分A-1和如本文定义的组分B-2。
在优选的实施方式中，药物组合物包含下列或由下列组成：如本文定义的组分A-1和如本文定义的组分B-2以及如本文定义的组分B-3a。
在药物组合物或疫苗的优选实施方式中，当向对象施用时，组分A的至少一种核酸(具体是组分A-1、A-2、A-3)和组分B的至少一种核酸(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)被翻译成抗原性肽或蛋白质。
当向对象施用时，优选药物组合物或疫苗在所述对象中诱导针对由组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)编码的肽或蛋白质的抗原特异性体液免疫应答和针对由组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)编码的肽或蛋白质的抗原特异性体液免疫应答。
当向对象施用时，优选药物组合物或疫苗在所述对象中诱导针对由组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)编码的肽或蛋白质的抗原特异性T细胞应答和针对组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)编码的肽或蛋白质的抗原特异性T细胞应答。
当向对象施用时，优选药物组合物或疫苗在所述对象中诱导针对由组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)编码的肽或蛋白质的抗原特异性B细胞记忆和针对组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)编码的肽或蛋白质的抗原特异性B细胞记忆。
组合疫苗：
在第二方面，本发明涉及基于核酸的组合疫苗或多病原体疫苗。
必须注意，在本发明第一方面的上下文中描述的具体特征和实施方式，即本发明的包含组分A和组分B的药物组合物，同样适用于第二方面(组合疫苗)、第三方面(本发明的试剂盒或多部分试剂盒)或其它方面包括例如医药用途(第一和第二医药用途)以及例如治疗方法。
在第二方面的优选实施方式中，组合疫苗包含至少一种如第一方面的上下文中所定义的组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)和至少一种如第一方面的上下文中所定义的组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)。
术语“组合疫苗”或“多病原体疫苗”或“多价疫苗”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是提供至少两种表位或抗原——优选免疫原——的预防或治疗材料。在本发明的上下文中，至少两种抗原或抗原功能由如本文定义的组分A和组分B适合地提供，并且选自或衍生自至少两种不同的病毒(例如(组分A的)SARS-CoV-2和(组分B的)流感病毒)。
因此，在优选的实施方式中，第二方面的组合疫苗包含至少一种如第一方面的上下文中定义的组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)和至少一种如第一方面的上下文中定义的组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)。
根据优选的实施方式，如本文定义的组合疫苗还可包含药学上可接受的载剂或赋形剂以及任选地至少一种如在第一方面的上下文中指定的佐剂。在此上下文中适合的佐剂可选自WO2016203025的权利要求17中公开的佐剂。
组合疫苗一般包含安全且有效量的核酸(例如DNA或RNA)，优选第一方面的RNA(由组分A和组分B提供)。如本文所用，“安全且有效量”是指足以显著引起与本文指定的病毒感染相关的疾病或障碍的积极改变的核酸组分的量。同时，“安全且有效量”少到足以避免严重的副作用。关于本发明的核酸、组合物或疫苗，“安全且有效量”这一表述优选是指核酸、组合物或疫苗的以使得不会实现过度或破坏性免疫反应(例如先天免疫应答)的方式适合刺激适应性免疫系统抵抗如本文指定的病毒的量。
如本文定义的核酸、组合物或疫苗的“安全且有效量”将在技术人员的知识和经验范围内，结合待治疗的具体状况还有待治疗患者的年龄和身体情况、状况严重程度、治疗持续时间、伴随疗法的属性、所用具体药学上可接受的载剂的属性和类似因素而变化。此外，核酸、组合物或疫苗的“安全且有效量”可取决于施加/递送途径(皮内、肌内、鼻内)、施加装置(喷射注射、针注射、微针贴片、电穿孔装置)和/或复合/配制(鱼精蛋白复合或LNP包封，DNA或RNA)。此外，核酸、组合物或疫苗的“安全且有效量”可取决于治疗对象(婴儿、孕妇、免疫功能低下的人类对象等)的身体状况。
如本文所用的药学上可接受的载剂优选包括本发明冠状病毒疫苗的液体或非液体基础。如果本发明疫苗以液体形式提供，则载剂将是水，一般是无热原水；等渗盐水或缓冲(水性)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。优选地，林格乳酸盐(Ringer-Lactate)溶液用作根据本发明的疫苗或组合物的液体基础，如WO2006122828中所述，涉及适合的缓冲溶液的公开内容通过引用并入本文。用作疫苗或组合物，具体用作包含LNP的组合物/疫苗的液体基础的其它优选溶液包括蔗糖和/或海藻糖。
如本文定义的药学上可接受的载剂或赋形剂的选择原则上由施用根据本发明的药物组合物(一种或多种)或疫苗的方式决定。冠状病毒疫苗优选局部施用。局部施用的途径总体上包括例如局部施用途径，但也包括皮内、透皮、皮下或肌内注射或损伤内、颅内、肺内、心脏内、关节内和舌下注射。更优选地，根据本发明的组合物或疫苗可通过皮内、皮下或肌内途径施用，优选通过注射，其可以是无针式注射和/或针式注射。在本发明上下文中优选的是肌内注射。组合物/疫苗因此优选被配制成液体或固体形式。待施用的根据本发明的疫苗或组合物的适合的量可通过常规实验确定，例如，通过使用动物模型。这种模型包括(不暗示任何限制)兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。用于注射的优选单位剂型包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。应将这种溶液的pH调节至约7.4。
在实施方式中，组合疫苗以冻干或喷雾干燥形式提供。这种冻干或喷雾干燥的疫苗可包含海藻糖和/或蔗糖，并且可在向对象施用之前在适合的液体缓冲液中重构。在一些实施方式中，冻干疫苗包含与LNP复合的RNA。在一些实施方式中，冻干组合物的含水量少于约10％。例如，冻干组合物可具有约0.1％至10％、0.1％至7.5％或0.5％至7.5％的含水量，优选冻干组合物具有约0.5％至约5.0％的含水量。
组合疫苗可根据本发明用于人类医学目的，也可用于兽医医学目的(哺乳动物、脊椎动物或鸟类)。
在优选的实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种冠状病毒，优选针对大流行冠状病毒，优选针对SARS-CoV-2、SARS-CoV-1或MERS-CoV的适应性免疫应答。在优选的实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种流感病毒，优选针对至少一种甲型流感病毒和/或至少一种乙型流感病毒的适应性免疫应答。在优选的实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种肺病毒科病毒，优选针对至少一种RSV和/或至少一种hMPV的适应性免疫应答。在实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种副粘病毒科病毒，优选针对至少一种PIV和/或至少一种亨尼帕病毒的适应性免疫应答。
在优选的实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种冠状病毒，优选针对大流行冠状病毒，优选针对SARS-CoV-2、SARS-CoV-1或MERS-CoV的中和抗体滴度。在优选的实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种流感病毒，优选针对至少一种甲型流感病毒和/或至少一种乙型流感病毒的中和抗体滴度。在优选的实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种肺病毒科病毒，优选针对至少一种RSV和/或至少一种hMPV的中和抗体滴度。在实施方式中，组合疫苗引发针对至少一种副粘病毒科病毒，优选针对至少一种PIV和/或至少一种亨尼帕病毒的中和抗体滴度。
在一些实施方式中，中和抗体滴度为至少100个中和单位/毫升(NU/mL)、至少500NU/mL或至少1000NU/mL。
在一些实施方式中，在施用组合物或组合疫苗后约1至约72小时，在对象中产生可检测水平的相应抗原。
在一些实施方式中，在施用组合物或组合疫苗后约1天至约72天，在对象的血清中产生至少100NU/ml、至少500NU/ml或至少1000NU/ml的中和抗体滴度(针对冠状病毒)。
在特别优选的实施方式中，组合疫苗或组合物引发能够有效中和相应病毒(例如，SARS-CoV-2冠状病毒和至少一种其它病毒)的功能性抗体。
在进一步优选的实施方式中，组合疫苗或组合物通过诱导粘膜IgA抗体来引发粘膜IgA免疫。
在特别优选的实施方式中，组合疫苗或组合物引发能够有效中和相应病毒(例如，SARS-CoV-2冠状病毒和至少一种其它病毒)的功能性抗体。
在进一步特别优选的实施方式中，组合疫苗或组合物诱导针对相应病毒(例如针对SARS-CoV-2冠状病毒和至少一种其它病毒)的广泛的功能性细胞性T细胞应答。
在进一步特别优选的实施方式中，组合疫苗或组合物诱导针对相应病毒(例如针对SARS-CoV-2冠状病毒和至少一种其它病毒)的良好平衡的B细胞和T细胞应答。
在一些实施方式中，中和抗体滴度相对于未接种的对照对象的中和抗体滴度或相对于接种减毒活病毒疫苗、灭活病毒疫苗或蛋白质亚单位病毒疫苗的对象的中和抗体滴度足以将病毒感染减少至少50％。
在一些实施方式中，中和抗体滴度和/或T细胞免疫应答相对于未接种的对照对象的中和抗体滴度足以降低无症状病毒感染率。
在一些实施方式中，中和抗体滴度和/或T细胞免疫应答足以防止对象中的病毒潜伏。
在一些实施方式中，中和抗体滴度足以阻断病毒与对象的上皮细胞融合。
在优选的实施方式中，中和抗体滴度在单次1ug-100ug剂量的组合物或组合疫苗后被诱导。在进一步优选的实施方式中，中和抗体滴度在单次2ug-20ug剂量的组合物或组合疫苗后被诱导。
在一些实施方式中，中和抗体滴度在单次1ug-100ug剂量的组合物或组合疫苗后20天内，或在第二次1ug-100μg剂量的组合物或组合疫苗后40天内被诱导。
在优选的实施方式中，将治疗有效量的组合物或组合疫苗向对象施用会在对象中诱导针对冠状病毒的T细胞免疫应答。在优选的实施方式中，T细胞免疫应答包括CD4+T细胞免疫应答和/或CD8+T细胞免疫应答。
在优选的实施方式中，第二方面的组合疫苗引发针对由组分A(具体是组分A-1、A-2、A-3)的至少一种核酸提供的所有经编码抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答，并且另外引发针对由组分B(具体是组分B-1、B-2、B-3、B-3a、B-3b、B-4、B-4a、B-4b)的至少一种核酸提供的所有经编码抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
在优选的实施方式中，第二方面的组合疫苗在施用低剂量的组合疫苗后引发针对所有经编码抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。在优选的实施方式中，低剂量包含少于约100μg，优选少于约50μg，更优选少于约20μg的核酸，甚至更优选少于约10μg。
在优选的实施方式中，第二方面的组合疫苗在施用低剂量的组合疫苗后引发针对所有经编码抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。在优选的实施方式中，低剂量包含少于约100μg，优选少于约50μg，更优选少于约20μg的核酸，甚至更优选少于约10μg的核酸。
在优选的实施方式中，第二方面的组合疫苗在年龄为约5岁以下的对象中引发抗原特异性免疫应答。因此，基于核酸的组合疫苗特别适用于婴儿。
在优选的实施方式中，第二方面的组合疫苗在年龄为约60岁以上的对象中引发抗原特异性免疫应答。因此，基于核酸的组合疫苗特别适合老年人。
在各种实施方式中，组合疫苗针对至少一种冠状病毒，并且另外地针对至少一种另外的冠状病毒和/或至少一种流感病毒和/或至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒。因此，组合疫苗是针对多种呼吸道病毒的组合疫苗。
在优选的实施方式中，组合疫苗针对至少一种冠状病毒，优选SARS-CoV-2，以及至少一种流感病毒和/或RSV病毒。因此，组合疫苗是冠状病毒-流感疫苗、冠状病毒-RSV疫苗或冠状病毒-流感-RSV疫苗。
在实施方式中，组合疫苗针对至少一种冠状病毒，优选SARS-CoV-2，以及至少一种流感病毒和/或RSV病毒，以及任选地针对至少一种PIV和/或至少一种hMPV。因此，组合疫苗是冠状病毒-流感-PIV疫苗、冠状病毒-RSV-PIV疫苗、冠状病毒-流感-RSV-PIV疫苗、冠状病毒-流感-hMPV疫苗、冠状病毒-RSV-hMPV疫苗、冠状病毒-流感-RSV-hMPV疫苗、冠状病毒-流感-PIV-hMPV疫苗、冠状病毒-RSV-PIV-hMPV疫苗或冠状病毒-流感-RSV-PIV-hMPV疫苗。
试剂盒或多部分试剂盒、应用、医药用途、治疗方法：
在第三方面，本发明提供了适用于治疗或预防病毒感染的试剂盒或多部分试剂盒。优选地，所述试剂盒或多部分试剂盒适用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2感染，以及另外地，其它感染。
值得注意的是，与第一方面的药物组合物和第二方面的组合疫苗相关的实施方式可同样继续阅读，并理解为是本发明第三方面的试剂盒或多部分试剂盒的适合的实施方式。
在优选的实施方式中，试剂盒或多部分试剂盒包含至少一种第一方面的药物组合物和/或至少一种第二方面的组合疫苗。
此外，试剂盒或多部分试剂盒可包括用于增溶的液体媒剂，和/或提供有关组分的施用和剂量的信息的技术说明书。
所述试剂盒的技术说明书可包含有关施用和剂量以及患者群体的信息。这样的试剂盒，优选多部分试剂盒，可适用于例如本文提及的任何应用或用途，优选适用于第一方面的药物组合物或第二方面的组合疫苗用于治疗或预防由冠状病毒，优选SARS-CoV-2冠状病毒引起的感染或疾病以及其它病毒感染(例如由流感病毒和/或RSV和/或PIV和/或hMPV引起)的用途。
优选地，药物组合物或疫苗被提供在试剂盒的单独部分中，其中药物组合物或组合疫苗优选被冻干或喷雾干燥或喷雾冷冻干燥。
试剂盒还可包含用于溶解经干燥或冻干的核酸组合物或疫苗的媒剂(例如缓冲溶液)作为一部分。
在优选的实施方式中，如本文定义的试剂盒或多部分试剂盒包含林格乳酸盐溶液。
在优选的实施方式中，如本文定义的试剂盒或多部分试剂盒包含用于施用组合物/疫苗的多剂量容器和/或施用装置(例如皮内注射用注射器)。
任何上述试剂盒均可用于如本文定义的治疗或预防。
第一和第二/其它医药用途：
其它方面涉及第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗和第三方面的试剂盒或多部分试剂盒的第一医药用途。
值得注意的是，与第一方面的组合物、第二方面的疫苗或第三方面的试剂盒或多部分试剂盒相关的实施方式可同样继续阅读，并理解为是本发明的医药用途的适合的实施方式。
因此，本发明提供如第一方面中定义的药物组合物用作药物、如第二方面中定义的组合疫苗用作药物以及如第三方面中定义的试剂盒或多部分试剂盒用作药物。
本发明还提供组合物、疫苗或试剂盒的数种应用和用途。
具体地，药物组合物、多肽、疫苗或试剂盒可用于人类医学目的，也可用于兽医医学目的，优选用于人类医学目的。
具体地，药物组合物、组合疫苗或试剂盒或多部分试剂盒用作人类医学目的的药物，其中所述组合物、疫苗或试剂盒或多部分试剂盒可适用于小婴儿、新生儿、免疫功能低下的接受者以及孕妇和哺乳期妇女和老年人。具体地，药物组合物、组合疫苗或试剂盒或多部分试剂盒用作人类医学目的的药物，其中所述组合物、疫苗或试剂盒或多部分试剂盒特别适用于老年人类对象。
所述药物组合物、组合疫苗或试剂盒用作人类医学目的的药物，其中所述组合物、疫苗或试剂盒或多部分试剂盒特别适合肌内注射或皮内注射。
在又另一方面，本发明涉及所提供的药物组合物、组合疫苗或试剂盒的第二医药用途。
一方面，本发明涉及第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗、第三方面的试剂盒或多部分试剂盒在用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2的感染(或与此类感染相关的障碍)以及在治疗或预防至少一种其它病毒的感染(或与此类感染相关的障碍)中的用途，优选地其中所述其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒。
一方面，本发明涉及第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗、第三方面的试剂盒或多部分试剂盒在用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2的感染(或与此类感染相关的障碍)以及在治疗或预防至少一种流感病毒的感染(或与此类感染相关的障碍)以及任选地治疗或预防至少一种PIV和/或hMPV的感染中的用途。
一方面，本发明涉及第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗、第三方面的试剂盒或多部分试剂盒在用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2的感染(或与此类感染相关的障碍)以及在治疗或预防至少一种RSV的感染(或与此类感染相关的障碍)以及任选地治疗或预防至少一种PIV和/或hMPV的感染中的用途。
一方面，本发明涉及第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗、第三方面的试剂盒或多部分试剂盒在用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2的感染(或与此类感染相关的障碍)以及在治疗或预防至少一种流感病毒的感染(或与此类感染相关的障碍)和至少一种RSV的感染(或与此类感染相关的障碍)以及任选地治疗或预防至少一种PIV和/或hMPV的感染中的用途。
特别地，第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗或第三方面的试剂盒或多部分试剂盒可用于预防性(暴露前预防或暴露后预防)和/或治疗性治疗由至少一种冠状病毒，优选SARS-CoV-2冠状病毒引起的以及由至少一种其它病毒(例如不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或在至少一种副粘病毒科病毒)引起的感染的方法中。
药物组合物或组合疫苗可优选局部施用。具体地，组合物或疫苗可通过皮内、皮下、鼻内或肌内途径施用。在实施方式中，本发明的核酸、组合物、多肽、疫苗可通过常规针式注射或无针式喷射注射来施用。在此上下文中优选的是肌内注射。
在使用质粒DNA并将其包含在药物组合物或疫苗中的实施方式中，组合物/疫苗可通过装置例如电穿孔装置，优选用于皮内或肌内递送的电穿孔装置来施用。适合地，可使用如US7245963B2中描述的装置，具体是如US7245963B2的权利要求1至68所定义的装置。
在使用腺病毒DNA并将其包含在药物组合物或组合疫苗中的实施方式中，组合物/疫苗可通过鼻内施用来施用。
在实施方式中，包含在如本文定义的组合物或疫苗中的核酸以下列量提供：以约100ng至约500ug的量、以约1ug至约200ug的量、以约1ug至约100ug的量、以约5ug至约100ug的量，优选以约10ug至约50ug的量，具体地，以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、6ug、7ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量。
值得注意的是，所述量涉及由所述至少一种组分A和组分B提供的核酸的总量。
在一些实施方式中，包含核酸的疫苗或包含核酸的组合物以有效量进行配制，以在对象中产生抗原特异性免疫应答。在一些实施方式中，有效量是1μg至200μg、1μg至100μg或5μg至100μg的总剂量。
值得注意的是，所述有效量涉及由所述至少一种组分A和组分B提供的核酸的总量。
在核酸被提供在脂质系载剂例如LNP中的实施方式中，一个剂量中包含的如本文定义的PEG-脂质的量低于约50μg PEG脂质，优选低于约45μg PEG脂质，更优选低于约40μgPEG脂质。
在一个剂量中含有少量PEG脂质可降低不良反应(例如过敏)的风险。
在特别优选的实施方式中，一个剂量中包含的PEG-脂质的量在约3.5μg PEG脂质至约35μg PEG脂质的范围内。
在核酸被提供在脂质系载剂例如LNP中的实施方式中，一个剂量中包含的如本文定义的阳离子脂质的量低于约400μg阳离子脂质，优选低于约350μg阳离子脂质，更优选低于约300μg阳离子脂质。
在一个剂量中含有少量阳离子脂质可降低不良反应的风险(例如更少)。
在特别优选的实施方式中，一个剂量中包含的阳离子-脂质的量在约30μg PEG脂质至约300μg PEG脂质的范围内。
在一个实施方式中，用于对象抵抗至少一种冠状病毒，优选SARS-CoV-2和抵抗至少一种其它病毒的治疗或预防的免疫方案包括单一剂量的药物组合物或组合疫苗。
在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的1ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的2ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的3ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的4ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的5ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的6ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的7ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的8ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的9ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的10ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的11ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的12ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的13ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的14ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的15ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的20ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的25ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的30ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的40ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的50ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的100ug剂量。在一些实施方式中，有效量是在一次接种中向对象施用的200ug剂量。值得注意的是，所述剂量涉及由所述至少一种组分A和组分B提供的核酸的总剂量。
在优选的实施方式中，用于治疗或预防至少一种冠状病毒感染和至少一种其它病毒感染的免疫方案包括一系列单一剂量(doses)或剂量(dosages)的药物组合物或组合疫苗。如本文所用，单一剂量分别指初始/第一剂量、第二剂量或任何其它剂量，其优选被施用以“加强”免疫反应。
在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的1ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的2ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的3ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的4ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的5ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的6ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的7ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的8ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的9ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的10ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的11ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的12ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的13ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的14ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的15ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的20ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的25ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的30ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的40ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的50ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的100ug剂量。在一些实施方式中，有效量是向对象施用总共两次的200ug剂量。值得注意的是，所述剂量涉及由所述至少一种组分A和组分B提供的核酸的总剂量。
在优选的实施方式中，疫苗/组合物使对象对冠状病毒感染和对一种其它病毒感染免疫(如本文定义的在施用后)至少1年，优选至少2年。在优选的实施方式中，疫苗/组合物使对象对冠状病毒感染和对一种其它病毒感染免疫超过2年，更优选超过3年，甚至更优选超过4年，甚至更优选超过5-10年。
治疗和使用方法、诊断方法及用途：
另一方面，本发明涉及治疗或预防障碍的方法。
值得注意的是，与第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗、第三方面的试剂盒或多部分试剂盒或医药用途相关的实施方式可同样继续阅读，并理解为是如本文提供的治疗方法的适合的实施方式。此外，与如本文提供的治疗方法相关的具体特征和实施方式也可适用于本发明的医药用途。
预防(抑制)或治疗疾病，具体是病毒感染涉及抑制例如在处于疾病如病毒感染的风险的对象中的疾病或状况的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗性干预。关于疾病或病理状况的术语“改善”是指任何可观察到的治疗的有益效果。抑制疾病可包括预防或降低疾病的风险，如预防或降低病毒感染的风险。有益效果可例如通过延迟易感对象中疾病临床症状的发作、降低疾病的一些或所有临床症状的严重程度、减缓疾病的进展、减少病毒载量、对象整体健康或安康方面的改善，或通过特定疾病所特有的其它参数来表明。“预防性”治疗是对未表现出疾病体征或只表现出早期体征的对象施用的治疗，目的是降低发展病理学的风险。
在优选的实施方式中，本发明涉及治疗或预防障碍的方法，其中所述方法包括向有需要的对象应用或施用至少一种第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗或第三方面的试剂盒或多部分试剂盒。
在优选的实施方式中，障碍是冠状病毒感染，或与此类感染相关的障碍，具体是SARS-CoV-2感染，或与此类感染相关的障碍(例如COVID-19)，以及另外的其它病毒感染，任选地其中所述其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒，或与这些感染中任意者相关的障碍。
在优选的实施方式中，本发明涉及治疗或预防如上定义的障碍的方法，其中所述方法包括向有需要的对象应用或施用至少第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗或第三方面的试剂盒或多部分试剂盒，其中所述有需要的对象优选是哺乳动物对象。
在特别优选的实施方式中，所述有需要的对象是哺乳动物对象，优选人类对象，例如新生儿、孕妇、免疫功能低下者和/或老年人。
在特别优选的实施方式中，人类对象是老年人类对象。
在某些实施方式中，通过向有需要的对象应用或施用至少第一方面的药物组合物、第二方面的组合疫苗或第三方面的试剂盒或多部分试剂盒来治疗或预防疾病的方法被进一步定义为减少对象中的疾病负担的方法。例如，所述方法优选降低COVID-19病的一种或多种症状的严重性和/或持续时间。在一些方面中，方法降低了对象将需要住院、入住重症监护病房、用补充氧气治疗和/或用呼吸机治疗的可能性。在进一步的方面中，所述方法降低了对象将发展出发烧、呼吸困难；嗅觉丧失和/或味觉丧失的可能性。在优选的方面中，所述方法降低了对象将发展出重度或中度COVID-19病的可能性。在某些方面中，实施方式的方法在对象被施用实施方式的组合物后约2周至1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或2年预防重度或中度COVID-19病。在优选的方面中，实施方式的方法预防有症状的COVID-19病。在进一步的方面中，实施方式的方法在对象被施用实施方式的组合物后约2周至1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或2年防止对象中可检测水平的SARS CoV-2核酸。在进一步的方面中，实施方式的方法被定义为在对象中提供对冠状病毒感染(例如，SARS CoV-2感染)的保护性免疫的方法。在更进一步的方面中，实施方式的方法在至少80％、85％、90％或95％的治疗对象中预防中度和重度COVID-19病。在又进一步的方面中，实施方式的方法在施用第二或后续免疫原性组合物(例如，加强施用)后约2周至约1年，在至少80％、85％、90％或95％的治疗对象中预防中度和重度COVID-19病。在又进一步的方面中，实施方式的方法在施用第二或后续组合物后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年，在至少80％、85％、90％或95％的治疗对象中预防中度和重度COVID-19病。
如本文所用，重度COVID-19病被定义为经历下列中一项或多项的对象：
·表明重度全身性疾病的静息临床体征(呼吸频率≥30次呼吸/分钟，心率≥125/分钟，海平面室内空气下SpO2≤93％或PaO2/FIO2<300mm Hg(根据海拔高度调整))
·呼吸衰竭(被定义为需要高流量氧气、无创通气、机械通气或ECMO)
·休克迹象(SBP<90mm Hg，DBP<60mm Hg，或需要血管加压药)
·严重的肾、肝或神经功能障碍
·入住ICU
·死亡
如本文所用，中度COVID-19病被定义为经历下列中一项或多项的对象：
·呼吸急促或呼吸困难
·呼吸频率≥20次呼吸/分钟
·SpO2异常，但海平面室内空气下仍>93％(根据海拔高度调整)
·下呼吸道疾病的临床或影像学证据
·深静脉血栓形成(DVT)的放射学证据
如本文所用，轻度COVID-19病被定义为经历下列所有的对象：
·有症状并且
·没有呼吸急促或呼吸困难并且
·无低氧血症(根据海拔高度调整)并且
·不满足中度或重度COVID-19病的病例定义
在其它方面中，实施方式的方法包括(i)获得实施方式的组合物(例如，疫苗组合物)，其中所述组合物被冻干；(ii)将冻干组合物溶解在药学上可接受的液体载剂中以产生液体组合物；和(iii)向对象施用有效量的液体组合物。在一些方面中，冻干组合物包含少于约10％的含水量。例如，冻干组合物可优选包含约0.1％至约10％、0.5％至7.5％或0.5％至5.0％的水。具体地，此类治疗方法可包括下列步骤：
a)提供至少一种第一方面的药物组合物、至少一种第二方面的组合疫苗或第三方面的试剂盒或多部分试剂盒；
b)将所述组合物、疫苗或试剂盒或多部分试剂盒作为第一剂量向对象应用或施用；
c)任选地，优选在第一剂量后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月将所述组合物、疫苗或试剂盒或多部分试剂盒作为第二剂量或其它剂量向对象应用或施用。
如本文所用，第一剂量分别指初始/第一剂量、第二剂量或任何其它剂量，其优选被施用以“加强”免疫反应。
在某些方面中，向对象施用一次、两次、三次、四次或更多次疫苗/组合物。在一些方面中，向对象施用至少第一次和第二次(例如，初免和加强)疫苗/组合物。在一些方面中，发送施用是在第一次施用后至少10天、14天、21天、28天、35天、42天、49天或56天。在一些方面中，第一次施用和第二次施用之间的时间在约7天和约56天之间；在约14天和约56天之间；在约21天和约56天之间；或在约28天和约56天之间。在进一步的方面中，向对象施用三次或更多次疫苗/组合物。在某些方面中，每次施用疫苗/组合物之间至少有10天、14天、21天、28天、35天、42天、49天或56天。
在一些方面中，根据实施方式进行治疗的对象先前感染过SARS CoV-2或先前用至少第一SARS CoV-2疫苗组合物治疗过。在一些方面中，对象用一个、两个、三个或更多个剂量的第一SARS CoV-2疫苗组合物治疗过。在一些方面中，用于治疗对象的实施方式的组合物是与先前用于治疗对象的组合物相比不同类型的疫苗组合物。在一些方面中，对象先前用mRNA疫苗如BNT162或mRNA-1273治疗过。在进一步的方面中，对象先前用蛋白质亚单位疫苗如基于刺突蛋白的疫苗，例如NVX-CoV2373或COVAX治疗过。在进一步的方面中，对象先前用病毒载体疫苗如基于腺病毒载体的疫苗，例如ADZ1222或Ad26.COV-2.S治疗过。在进一步的方面中，先前用疫苗组合物治疗过的对象具有可检测到的SARS CoV-2结合抗体如SARSCoV-2S蛋白结合抗体或SARS CoV-2N蛋白结合抗体。在进一步的方面中，根据实施方式进行治疗的对象在至少约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年前用第一SARS CoV-2疫苗组合物治疗过。在更进一步的方面中，根据实施方式进行治疗的对象在约3个月与2年之间以前或在约6个月与2年之间以前用第一SARS CoV-2疫苗组合物治疗过。在一些方面中，用实施方式的其它疫苗组合物治疗的对象在至少80％、85％、90％或95％的治疗对象中免于中度和重度COVID-19病。例如，在施用其它组合物后约2周至约1年，治疗对象在至少80％、85％、90％或95％的治疗对象中可免于中度和重度COVID-19病。在更进一步的方面中，在所述施用后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年，施用实施方式的其它疫苗组合物在至少80％、85％、90％或95％的治疗对象中预防中度和重度COVID-19病。
在某些方面中，实施方式的方法被进一步定义为在对象中刺激抗体或CD8+T细胞应答的方法。在一些方面中，所述方法被定义为在对象中刺激中和抗体应答的方法。在进一步的方面中，所述方法被定义为在对象中刺激保护性免疫应答的方法。在又进一步的方面中，所述方法被定义为在对象中刺激TH2定向免疫应答的方法。
在进一步的方面中，实施方式的疫苗/组合物的施用刺激抗体应答，所述抗体应答对于对象中的每种冠状病毒中和抗体产生约10至约500个冠状病毒刺突蛋白结合抗体。例如，施用可刺激抗体应答，所述抗体应答对于每种冠状病毒中和抗体产生不超过约200个刺突蛋白结合抗体。在进一步的方面中，施用刺激抗体应答，所述抗体应答对于每种冠状病毒中和抗体产生约10至约300；约20至约300；约20至约200；约30至约100；或约30至约80个冠状病毒刺突蛋白结合抗体。在更进一步的方面中，施用实施方式的组合物在对象中刺激抗体应答，所述抗体应答包括一定比例的刺突蛋白结合抗体与冠状病毒中和抗体，在普通恢复期患者血清(来自从冠状病毒感染康复的对象)中发现刺突蛋白结合抗体与冠状病毒中和抗体的比例为20％、15％、10％或5％。
在又进一步的方面中，施用实施方式的组合物在对象中刺激抗体应答，所述抗体应答对于每种冠状病毒中和抗体产生约1至约500个冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域(RBD)结合抗体。在进一步的方面中，施用刺激抗体应答，所述抗体应答对于每种冠状病毒中和抗体产生不超过约50个刺突蛋白RBD结合抗体。在更进一步的方面中，施用刺激抗体应答，所述抗体应答对于每种冠状病毒中和抗体产生约1至约200；约2至约100；约3至约200；约5至约100；约5至约50；或约5至约20个刺突蛋白RBD结合抗体。在更进一步的方面中，施用实施方式的组合物在对象中刺激抗体应答，所述抗体应答包括一定比例的刺突蛋白RBD结合抗体与冠状病毒中和抗体，在普通恢复期患者血清(来自从冠状病毒感染康复的对象)中发现刺突蛋白RBD结合抗体与冠状病毒中和抗体的比例为20％、15％、10％或5％。
在更进一步的方面中，施用实施方式的疫苗/组合物在对象中基本上不诱导IL-4、IL-13、TNF和/或IL-1β的增加。在进一步的方面中，施用实施方式的疫苗/组合物在对象中基本上不诱导血清IL-4、IL-13、TNF和/或IL-1β的增加。在一些方面中，施用实施方式的疫苗/组合物在对象中的注射部位(例如，肌内注射部位)处基本上不诱导IL-4、IL-13、TNF和/或IL-1β的增加。
在更进一步的方面中，实施方式的方法包括将实施方式的疫苗/组合物向患有疾病的人类对象施用。在某些方面中，对象患有心血管疾病、肾病、肺病或自身免疫性疾病。在一些方面中，将实施方式的疫苗/组合物施用于接受抗凝疗法的对象。
根据进一步的方面，本发明还提供了制造组合物或疫苗的方法，包括下列步骤：
a)任选地，根据WO2019092153A1(权利要求1至70)调整组分A和B的各自序列的AU计数，从而改变核酸组分在HPLC上的保留时间，允许在步骤c)中共纯化核酸组分；
b)在帽类似物的存在下使用DNA模板进行(组分A和B的)RNA体外转录步骤以获得加帽的mRNA，优选具有如表17中提供的核酸序列，任选地其中使用，3、4、5、6、7、8、9、10种不同的DNA模板在RNA体外转录步骤中同时产生2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的RNA；
c)使用RP-HPLC，和/或TFF，和/或Oligo(dT)纯化和/或AEX，优选使用RP-HPLC和TFF纯化步骤a)的所获得的加帽RNA；
d)提供包含步骤b的(组分A和B的)纯化的加帽RNA的第一液体组合物；
e)提供第二液体组合物，其包含至少一种如本文定义的阳离子脂质、如本文定义的中性脂质、如本文定义的类固醇或类固醇类似物以及如本文定义的PEG-脂质；
f)将第一液体组合物和第二液体组合物引入至少一个混合装置中以允许形成包含加帽RNA的LNP；
g)纯化所获得的包含加帽RNA的LNP；
h)任选地，冻干包含加帽RNA的纯化的LNP。
优选地，步骤e)的混合装置是T形件连接器(T-piece connector)或微流体混合装置。优选地，纯化步骤f)包括选自沉淀步骤、透析步骤、过滤步骤、TFF步骤中的至少一个步骤。任选地，可在步骤a)或b)之后进行酶促聚腺苷酸化步骤。任选地，可实施进一步的纯化步骤以例如去除残留的DNA、缓冲液、小RNA副产物等。任选地，在不存在帽类似物的情况下进行RNA体外转录，并且在RNA体外转录后进行酶促加帽步骤。任选地，RNA体外转录在至少一种如本文定义的经修饰的核苷酸的存在下进行。
在实施方式中，步骤a，优选步骤a-c，更优选上文概述的所有步骤(a-g)在用于RNA体外转录的自动化装置中进行。这种装置也可用于生产组合物或疫苗。优选地，可适合地使用如WO2020002598中描述的装置，具体是WO2020002598的权利要求1至59和/或68至76(以及图1-18)中描述的装置。
在进一步的方面中，本发明提供了稳定药物组合物或组合疫苗的方法，包括冻干或喷雾干燥组合物或疫苗以产生稳定化的组合物或疫苗。优选地，稳定化的组合物或疫苗的含水量少于约10％，优选含水量在约0.5％和5.0％之间。因此，本发明提供了通过如本文定义的稳定方法生产的稳定化的冻干组合物或疫苗。
列表和表格的简要说明
列表A：示例性SARS-CoV-2冠状病毒分离株(EPI/GISAID)
列表B：不同SARS-CoV-2分离株的GenBank登录号
列表1：示例性适合的SARS-CoV-2抗原设计
表1：优选的SARS-CoV-2构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)
表3A：核酸，优选编码SARS-CoV-2抗原的mRNA构建物
表3B：核酸，优选编码SARS-CoV-2抗原的mRNA构建物
表4：SARS-CoV-1和SARS相关构建物(氨基酸序列、核酸编码序列)
表5：核酸，优选编码SARS相关抗原或SARS-CoV-1抗原的mRNA构建物
表6：优选的MERS-CoV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)
表7：核酸，优选编码MERS-CoV抗原的mRNA构建物
表8：优选的流感病毒构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)
表9：核酸，优选编码流感病毒抗原的mRNA构建物
表10：优选的流感病毒RNA序列
表11：优选的RSV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)
表12：核酸，优选编码RSV抗原的mRNA构建物
表13：优选的hMPV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)
表14：核酸，优选编码hMPV抗原的mRNA构建物
表15：优选的hPIV构建物(氨基酸序列和核酸编码序列)
表16：核酸，优选编码hPIV抗原的mRNA构建物
表17：实施例中使用的mRNA构建物概览
表18：基于核酸的组合疫苗和接种方案概览
表A：实施例的脂质系载剂组成
表19：基于核酸的组合疫苗和接种方案概述
表20：基于核酸的组合疫苗和接种方案概述
附图说明
图1包含组分A-1的组合疫苗诱导针对SARS-CoV-2刺突蛋白的体液免疫应答——通过第一次接种后在第21天ELISA(图1A)以及通过第二次接种后在第42天VNT试验(图1B)显示。实施例3和表19中提供了进一步的详情。
图2包含组分B-3a的组合疫苗诱导针对RSV F蛋白的体液免疫应答——通过第一次接种后在第21天ELISA(图2A)以及第二次接种后在第42天ELISA(图2B)
显示。实施例3和表19中提供了进一步的详情。
图3包含组分B-2的组合疫苗诱导针对流感HA(A1加州/07/09)的体液免疫应答——通过第一次接种后在第21天ELISA(图3A)以及第二次接种后在第42天ELISA(图3B)显示。实施例3和表19中提供了进一步的详情。
图4包含组分A-1的组合疫苗诱导针对SARS-CoV-2刺突蛋白的体液免疫应答——通过第一次接种后在第21天ELISA(图4A)以及通过第二次接种后在第42天VNT试验(图4B)显示。实施例4和表20中提供了进一步的详情。
图5包含组分B-3a的组合疫苗诱导针对RSV F蛋白的体液免疫应答——通过第一次接种后在第21天ELISA(图5A)以及第二次接种后在第42天ELISA(图5B)显示。实施例4和表20中提供了进一步的详情。
图6包含组分B-3b的组合疫苗诱导针对hMPV F蛋白的体液免疫应答——通过hMPV-A1(图6A)和hMPV-B1(图6B)第二次接种后在第42天基于FACS的免疫测定显示。实施例4和表20中提供了进一步的详情。
图7包含组分B-4a的组合疫苗诱导针对PIV3 F蛋白的体液免疫应答——通过第二次接种后在第42天基于FACS的免疫测定显示。实施例4和表20中提供了进一步的详情。
图8包含组分B-2的组合疫苗诱导针对流感HA(A1加州/07/09)的体液免疫应答——通过第二次接种后在第42天ELISA显示。实施例4和表20中提供了进一步的详情。
缩写
FLUAV：甲型流感病毒
FLUBV：乙型流感病毒
RSV：人类呼吸道合胞病毒
HRSV-A、RSV-A：人类呼吸道合胞病毒A型
HPIV、hPIV：人类呼吸道病毒(人类副流感病毒)
HPIV3：人类呼吸道病毒3
HMPV、hMPV：人类偏肺病毒
MERS-CoV：中东呼吸综合征相关冠状病毒
SARS-CoV：严重急性呼吸综合症相关冠状病毒
HCoV：人类冠状病毒
蝙蝠SARS样CoV：蝙蝠SARS样冠状病毒
BatCoV：果蝠冠状病毒
PDCoV：猪德尔塔冠状病毒
PEDV：猪流行性腹泻病毒
MHV：鼠肝炎病毒
实施例
在下文中，呈现了说明本发明的各种实施方式和方面的具体实施例。然而，本发明的范围不应受到此处所描述的具体实施方式的限制。为使本领域技术人员能够更清楚地理解和实践本发明，给出以下制备和实施例。然而，本发明的范围不限于所示例的实施方式，这些实施方式仅旨在说明本发明的单个方面，并且功能上等同的方法在本发明的范围内。实际上，根据前面的描述和下面的实施例，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。所有这些修改都落入所附权利要求的范围内。
实施例1：DNA和RNA构建物、组合物和疫苗的制备
本实施例提供了获得本发明的RNA的方法以及产生本发明的组合物或疫苗的方法。
1.1.DNA和RNA构建物的制备：
制备编码不同的病毒抗原设计的DNA序列并用于随后的RNA体外转录反应。所述DNA序列是通过为了稳定和表达优化而引入G/C优化或修饰的编码序列(例如，“cds opt1”)来修饰野生型或参考编码DNA序列制备的。序列被引入到pUC衍生的DNA载体中，以包含稳定的3’-UTR序列和5’-UTR序列，另外还包含腺苷的一段序列(例如A64或A100)，以及任选地组蛋白-茎-环(hSL)结构，以及任选地30个胞嘧啶的一段序列(例如C30)(参见表17)。使用本领域已知的常用方案，将获得的质粒DNA构建物转化到细菌中并增殖。最终，质粒DNA构建物被提取、纯化并用于随后的RNA体外转录。
1.2.由质粒DNA模板进行RNA体外转录：
使用限制酶对根据小节1.1制备的DNA质粒进行酶促线性化，并用于在适合的缓冲液条件下、在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)和帽类似物(例如m7GpppG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG))存在的情况下使用T7 RNA聚合酶的DNA依赖性RNA体外转录。使用RP-HPLC(
Figure BDA0004113537810001952
CureVac AG,Tübingen,德国；WO2008077592)纯化所获得的RNA构建物并用于体外和体内实验。所生成的RNA序列/构建物提供在表17中，其中指示了经编码的抗原性蛋白质和相应的UTR元件。
表17：实施例中使用的mRNA构建物概览
Figure BDA0004113537810001951
Figure BDA0004113537810001961
1.4.LNP配制的mRNA组合物的制备：
使用阳离子脂质、结构脂质、PEG-脂质和胆固醇制备LNP。利用如下概述的T形件配制，将脂质溶液(在乙醇中)与RNA溶液(水性缓冲液)混合。通过透析将所获得的LNP重新缓冲在碳水化合物缓冲液中，以及任选地使用超速离心管将其浓缩至目标浓度。在用于体外或体内实验之前，LNP配制的mRNA被储存在-80℃下。
简而言之，根据PCT公开号WO2015199952、WO2017004143和WO2017075531(其全部公开内容通过引用并入本文)中描述的一般程序制备和测试脂质纳米颗粒。使用可电离的氨基脂质(阳离子脂质)、磷脂、胆固醇和PEG化脂质(脂质见表A)制备脂质纳米颗粒(LNP)配制的mRNA。如下制备LNP。将根据式III-3的阳离子脂质(ALC-0315)、DSPC、胆固醇和根据式IVa的PEG-脂质(ALC-0159)以大致47.5:10:40.8:1.7的摩尔比溶解在乙醇中。以mRNA与总脂质的比为0.03-0.04w/w制备包含化合物III-3(ALC-0315)的脂质纳米颗粒(LNP)。简而言之，将mRNA在10至50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4)中稀释至0.05至0.2mg/mL。使用注射泵，以约1:5/1:3(vol/vol)的比将乙醇脂质溶液与mRNA水溶液混合，总流速在15ml/min以上。然后除去乙醇并通过透析将外部缓冲液替换为PBS。最后，使脂质纳米颗粒通过0.2μm孔径的无菌过滤器过滤。脂质纳米颗粒的粒径为60-90nm——通过使用Malvern Zetasizer Nano(Malvern,UK)进行准弹性光散射测定的。
表A：实施例的脂质系载剂组成
Figure BDA0004113537810001971
1.5.组合mRNA疫苗的制备：
以分别或共配制的方式用LNP配制组合mRNA疫苗。对于分别混合或配制的mRNA疫苗，如实施例1.4中的描述来制备每种mRNA组分并分别进行LNP配制，然后将不同的LNP配制组分进行混合。对于共配制的mRNA疫苗，先将不同的mRNA组分混合在一起，然后在LNP中共配制，如实施例1.4中的描述。
实施例2：用基于核酸的组合疫苗接种小鼠
LNP配制的mRNA疫苗的制备：
如实施例1中的描述(RNA体外转录)制备用于组合疫苗的mRNA构建物。在用于体内接种实验之前，根据实施例1.4和实施例1.5用LNP配制HPLC纯化的mRNA。
免疫：
雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA组合疫苗(相应的RNA标识符见表17)，剂量如表18所示。作为阴性对照，一组小鼠接种了缓冲液。所有动物都在第0天和第21天接种。在第21天(初免后)和第42天(加强后)收集血液样品用于测定抗体滴度。接种实验后，测定组合疫苗的效率。
表18：基于核酸的组合疫苗和接种方案概览
Figure BDA0004113537810001981
使用ELISA测定IgG1和IgG2抗体滴度：
使用包被用重组抗原性蛋白质进行ELISA。使用相应的血清稀释液孵育包被板，并使用生物素化同种型特异性抗小鼠抗体，然后是链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)，以Amplex为底物来检测特异性抗体包被的蛋白质的结合。在接种后第21天和第42天通过ELISA测量抗体(IgG1、IgG2a)的终点滴度。
刺突蛋白特异性免疫应答的检测(SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV)：
使用lipofectamine，用2μg的编码刺突蛋白的mRNA转染海拉细胞。转染后20h收获细胞，并以1x105个/孔的密度接种到96孔板中。将细胞与接种小鼠的血清样品(1:50稀释)一起孵育，然后与FITC缀合的抗小鼠IgG抗体一起孵育。在BD FACS Canto II上使用DIVA软件获取细胞，并通过FlowJo进行分析。
细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准方案分离来自接种小鼠的脾细胞。简而言之，使分离的脾挤压(grinded)通过细胞过滤器(cell strainer)并在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红细胞裂解。在用PBS/1％FBS进行大量洗涤后，将脾细胞接种到96孔板中(2x106个细胞/孔)。在37℃、存在蛋白质运输抑制剂的情况下，用蛋白质特异性肽表位的混合物(每种肽5μg/ml)——在2.5μg/ml抗CD28抗体(BD Biosciences)存在的情况下——刺激细胞6小时。刺激后，根据制造商的说明书使用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)洗涤细胞并将细胞内细胞因子染色。下列抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1:200)、CD8-APC-H7(1:100)、TNF-PE(1:100)、IFNγ-APC(1:100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1:200)(BDBiosciences)并与1:100稀释的Fcγ-block一起孵育。Aqua染料(Aqua Dye)用于区分活/死细胞(Invitrogen)。使用Canto II流式细胞仪(Beckton Dickinson)获取细胞。使用FlowJo软件包(Tree Star,Inc.)分析流式细胞术数据。
病毒中和滴度的测定：
收集血清，测定经由CPE(细胞病变效应)或经由基于假型颗粒的试验(pseudotyped particle-based assay)所检测到的中和滴度(VNT)。
HA特异性免疫应答的测定
HA特异性免疫应答(B细胞免疫应答)的检测是通过检测针对特定流感病毒的IgG2a抗体来进行的。因此，在接种后三周，从接种小鼠采集血液样品并制备血清。使MaxiSorb板(Nalgene Nunc International)包被特定的重组HA蛋白。用含0.05％吐温-20和1％ BSA的1xPBS阻断后，将板与稀释的小鼠血清(如所示)一起孵育。随后添加生物素偶联的二抗(抗小鼠-IgG2a,Pharmingen)。洗涤后，将板与辣根过氧化物酶-链霉亲和素一起孵育，然后加入Amplex UltraRed试剂(Invitrogen)，随后对荧光产物进行定量。
病毒中和RSV滴度的测定：
利用空斑减少中和测试(PRNT)测量血清样品的RSV病毒中和滴度(VNT)。使稀释的血清样品与RSV/A2在室温下孵育1小时，然后接种到24孔板中汇合的HEp-2单细胞层上，重复两次。在5％ CO2培养箱中37℃下培养一小时后，用0.75％甲基纤维素培养基覆盖孔。孵育4天后，去除覆盖层，将细胞固定并染色。在病毒对照的终点减少60％时测定对应的倒数(交互，reciprocal)中和抗体滴度。
实施例3：用基于核酸的组合疫苗(SARS-CoV-2、RSV和/或流感的mRNA疫苗)接种小 鼠
本实施例表明，组合mRNA疫苗诱导针对组合疫苗所有组分(选自组分A和/或选自组分B的包含编码至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列的mRNA)的强烈且抗原特异性免疫应答。
LNP配制的mRNA疫苗组合物/组合的制备：
如实施例1中的描述(RNA体外转录)制备用于组合疫苗的mRNA构建物。在用于体内接种实验之前，根据实施例1.4和/或实施例1.5用LNP配制HPLC纯化的mRNA。
免疫：
雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA组合疫苗(相应的RNA标识符见表17)，剂量如表19所示。作为阴性对照，一组小鼠接种了缓冲液(0.9％NaCl)。所有动物都在第0天和第21天接受25μl的注射体积并接种。在第21天(首次接种后)和第42天(二次接种后)收集血液样品用于测定抗体滴度。
表19：基于核酸的组合疫苗和接种方案概览
Figure BDA0004113537810002001
使用ELISA测定SARS-CoV-2和RSV的总IgG抗体滴度：
使用Amplex ELISA定量SRBD或RSV-F蛋白特异性总IgG结合抗体。按1:5预稀释样品，并测试连续的1:10稀释度(8个稀释度)。SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD-His用于包被(1μg/ml)或2.5μg/mL rec.RSV-F GP A2(SinoBiological,Cat:11049-V08B)。在每个孵育步骤后彻底清洗板。在37℃下包被4-5小时。随后在4℃下过夜对其阻断。在单独的未包被板上的阻断缓冲液中按1:5预稀释血清样品。将经滴定的血清样品加入到预包被板中并在RT下孵育2-4h。将检测抗体加入每个孔中(1:300)并在RT下孵育1-1.5h。在无菌阻断缓冲液(不含NaN3的1％ BSA)中与HRP-链霉亲和素(1:1000)一起孵育30分钟。将
Figure BDA0004113537810002002
UltraRed试剂(溶于DMSO中；1:200,底物缓冲液中30％过氧化氢H2O21:2000)加入到每个孔中。在最短45分钟和最长24小时后测量荧光。在SARS-CoV-2初始接种后第21天以及RSV初始接种后第21天和第42天，通过ELISA测量抗体的终点滴度。
SARS-CoV-2的病毒中和滴度的测定：
收集血清，测定经由CPE(细胞病变效应)检测到的SARS-CoV-2中和滴度(VNT)。将重复两次测试的热灭活血清(56℃,30分钟)的连续稀释液——起始稀释度为1:10，随后1:2连续稀释——与100TCID50的野生型SARS-CoV-2(2019-nCov/意大利-INMI1毒株)在37℃下一起孵育1小时。每个板都包含细胞对照用的一个专用行(8个孔)——其仅包含细胞和培养基，以及病毒对照的一个专用行——其仅包含细胞和病毒。在将100μl的病毒血清混合物与一层汇合的Vero E6细胞(ATCC,Cat.1586)一起孵育，然后在37℃下孵育3天并对CPE形成进行显微镜评分后，对感染性病毒进行定量。每次运行(run)都进行返滴定，以验证工作病毒溶液的TCID50的正确范围。根据Reed&Muench描述的方法计算VN滴度。如果未观察到中和(MNt<10)，则报告为5的任意值。在VisMederi srl(锡耶纳,意大利)进行分析。用第42天收集的血清测量病毒中和滴度。
流感HA特异性免疫应答的测定(通过血凝素抑制试验)
通过血凝抑制(HI)试验分析功能性抗HA抗体滴度。将血清与受体破坏酶(RDEII,Denka Seiken)在37℃下一起孵育过夜，灭活(56℃,60分钟)。将预处理的血清的稀释液与4HAU的灭活甲型流感H1N1加州/07/09(NIBSC材料09/174)一起孵育45min，并加入50μl0.5％红细胞溶液。将板孵育45-60分钟，并且HI滴度由导致对凝集完全抑制的血清的最高稀释度决定。
结果：
如图1A所示，用编码全长S稳定化蛋白(S_stab)的mRNA或包含编码全长S稳定化蛋白(S_stab)的mRNA的组合疫苗接种，在单次接种后(第21天)诱导了高滴度的刺突特异性结合抗体(图1A：总IgG)。图1B显示了第二次接种后(第42天)功能性抗体的诱导(图1B：病毒中和抗体VNT)。组分A-1与组分B-2(七价流感mRNA疫苗(第5组))和/或B-3a(RSV mRNA疫苗(第3组)、(第6组))的组合不以负向(negative)方式影响体液抗体应答的诱导。数据表明，所观察到的包含编码全长S稳定化蛋白的mRNA的各个组合疫苗的免疫应答与单价疫苗组(第1组)观察到的免疫应答相当。
所诱导的针对RSV F蛋白(组分B-3a)的抗体应答显示在图2A中(第21天，初始接种后)和图2B中(第42天，二次接种后)。所有包含编码RSV F蛋白的mRNA的组合疫苗都诱导了高滴度的IgG抗体(第3组和第6组)。数据表明，所观察到的包含编码RSV F蛋白的mRNA的各个组合疫苗的免疫应答与单价疫苗(第2组)观察到的免疫应答相当。
如图3A和图3B所示，通过血凝素抑制试验测量的针对流感病毒的功能性抗体的诱导是由包含七价流感疫苗组分B-2的疫苗组合诱导的。在一次接种后的第21天(图3A)和在两次接种后的第42天(图3B)测定HI滴度。数据表明，所观察到的包含编码流感抗原的mRNA的组合疫苗(第5组和第6组)的免疫应答与七价流感疫苗(第4组)观察到的免疫应答相当。
如本实施例所示，所测试的组合疫苗适合将不同的mRNA组分递送至宿主细胞以将mRNA组分翻译成抗原性蛋白质或抗原性肽，这会诱导针对所有经编码蛋白质的抗原特异性免疫应答。
综上所述，这些数据表明SARS CoV-2、流感病毒和RSV抗原的组合是可能的，并且组合疫苗诱导了针对每种经编码抗原的强烈免疫应答。除此之外，所测试的组合疫苗的所有组分都诱导了有效的免疫应答，这表明单一组分不是免疫显性的，或者组合疫苗的组分不显示出免疫干扰。
实施例4：用基于核酸的组合疫苗(SARS-CoV-2、RSV、流感、hMPV和/或PIV3的mRNA 疫苗)接种小鼠
本实施例表明，组合mRNA疫苗诱导针对组合疫苗所有组分(选自组分A和/或选自组分B的包含编码至少一种抗原性肽或蛋白质的至少一个编码序列的mRNA)的强烈且抗原特异性免疫应答。组合疫苗诱导了针对所有经编码蛋白质的高抗体应答，在LNP配制后——如果共配制或者分别混合的话——是独立的。本实施例还显示了五种不同mRNA疫苗组分的组合(组分A-1：SARS-CoV-2，组分B-3a：RSV，组分B-2：流感，七价；组分B-3b：hMPV(二价)以及组分B-4a：PIV)。这种组合疫苗包括12种不同的抗原(12价)。
LNP配制的mRNA疫苗的制备：
如实施例1中的描述(RNA体外转录)制备用于组合疫苗的mRNA构建物。在用于体内接种实验之前，根据实施例1.4和/或实施例1.5用LNP配制HPLC纯化的mRNA。
共配制的12价组合疫苗(参见第7组，表20)是通过按体积摩尔浓度混合制备的，因此混合了相等数量的RNA分子(等摩尔)。分别配制的12价组合疫苗(参见第6组，表20)，使用的是RNA的总量，而不根据体积摩尔浓度进行调整(等质量)。
免疫：
雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA组合疫苗(相应的RNA标识符见表17)，剂量如表20所示。作为阴性对照，一组小鼠接种了缓冲液(0.9％NaCl)。所有动物都在第0天和第21天接受25μl并接种。在第7天和第21天(首次接种后)和第42天(二次接种后)收集血液样品用于测定抗体滴度。
表20：基于核酸的组合疫苗和接种方案概览
Figure BDA0004113537810002021
/>
Figure BDA0004113537810002031
如实施例3中的描述来分析SARS-CoV-2、流感和RSV特异性免疫应答(VNT、总IgG和HI滴度)
基于FACS的ELISA测定PIV-3或hMPV-A1和hMPV-B1特异性免疫应答
使用Lipofectamine2000，对每个T75烧瓶——R27(R10326(hMPV-A1稳定化融合蛋白，含弗林蛋白酶切割-F(19-539)PFs_GCv3.1))、R28(R10329(hMPV-B1稳定化融合蛋白，含弗林蛋白酶切割-F(19-539)_PFs_GCv3.1))、R26(R10331(稳定化PIV-3融合蛋白-F(19-539)DS2-Cav_GCv3.1))的海拉细胞转染17μg mRNA。脂质转染后18-24h收获转染细胞，并以2x105个细胞/孔接种在96V型底板(96V-bottom plate)中。用第42天收集的小鼠血清样品作为一抗，然后是抗小鼠FITC缀合的二抗。
结果
如图4A所示，只用编码全长S稳定化蛋白(S_stab)的mRNA接种或用包含编码全长S稳定化蛋白(S_stab)的mRNA的组合疫苗接种，在单次接种后(第21天)诱导了高滴度的刺突特异性结合抗体(图4A：总IgG，ELISA)。图4B显示了在二次接种(第42天)后功能性抗体的诱导(图4B：病毒中和抗体VNT)。与组分B-3b(hMPV，二价mRNA疫苗(A+D))或B-4a(PIV-3mRNA疫苗(A+E))的组合不以负向方式影响体液抗体应答的诱导。数据表面，所观察到的包含编码全长S稳定化蛋白的mRNA的各个组合疫苗的免疫应答与单价疫苗组(第1组)观察到的免疫应答相当。
即使是12价疫苗组合(第6组和第7组)也诱导了高SARS-CoV-2特异性免疫应答(结合抗体和VNT)。与分别LNP配制和混合的mRNA组合(第6组)相比，LNP共配制疫苗组合(第7组)的应答略高。
通过ELISA测量的RSV-F特异性免疫应答显示在图5A(第21天)和图5B(第42天)中。两种12价组合疫苗(第6组和第7组)均诱导了高滴度的总IgG。两组在第42天的滴度(图5B)可能甚至更高(由箭头指示，由于试验条件)。针对包含组分B-3b(包含编码hMPV抗原的mRNA)的组合疫苗的抗体滴度也提高了轻微的IgG滴度(第2组和第4组)。这可能是相关病毒株的F蛋白之间交叉免疫导致的。RSV和hMPV都属于肺病毒科。
如图6A和图6B所示，包含组分B3-b(包含编码二价hMPV抗原的mRNA(第2、3、6和7组))的所有疫苗组合均诱导针对hMPV A1和B1毒株的F蛋白的强烈体液免疫应答(图6A：hMPV A1，图6B：hMPV B1，第42天)。图7展示了在首次接种后第42天引发的针对PIV3 F蛋白的免疫应答。包含组分B-4a(包含编码PIV3 F蛋白的mRNA(第4、5、6和7组))的所有疫苗组合都诱导了针对PIV3 F蛋白的体液免疫应答。
如图8所示，通过血凝素抑制试验测量的针对流感病毒的功能性抗体的诱导是由包含七价流感疫苗组分B-2(第6组和第7组)的疫苗组合诱导的。两次接种后第42天测定HI滴度。
如本实施例所示，所测试的组合疫苗适合将不同的mRNA组分递送至宿主细胞以将mRNA组分翻译成抗原性蛋白质或抗原性肽，这会诱导针对所有经编码蛋白质的抗原特异性免疫应答。
综上所述，这些数据表明SARS CoV-2、流感病毒、hMPV、PIV和RSV抗原的组合是可能的，并且组合疫苗诱导了针对每种经编码抗原的强烈免疫应答。除此之外，所测试的组合疫苗的所有组分都诱导了有效的免疫应答，这表明单一组分不是免疫显性的，或者组合疫苗的组分不显示出免疫干扰。
实施例5：基于核酸的组合疫苗的临床开发
为了证明基于核酸的组合疫苗的安全性和有效性，启动了临床试验(1期)。在临床试验中，人类志愿者队列被肌内注射至少两次(例如第0天和第28天，剂量为2μg、6μg或18μg基于核酸的组合疫苗(根据本发明在LNP中配制)。为了评估疫苗的安全性(safetyprofile)，在施用后对对象进行监测(生命体征、接种部位耐受性评估、血液学分析)。通过测定来自接种对象的血清中的病毒中和滴度(VNT)来分析免疫的功效。在第0天——作为基线——和完全接种后收集血液样品。分析血清的病毒中和抗体。

Claims (170)

1.药物组合物，其包含下列或由下列组成：
-至少一种组分A，所述组分A包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体，以及
-至少一种组分B，所述组分B包含至少一种核酸，所述核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种其它病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述至少一种肺病毒科病毒选自至少一种呼吸道合胞病毒和/或至少一种偏肺病毒。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述至少一种副粘病毒科病毒选自至少一种副流感病毒和/或至少一种亨尼帕病毒。
5.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种冠状病毒选自至少一种大流行冠状病毒。
6.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种冠状病毒选自至少一种α冠状病毒、至少一种β冠状病毒、至少一种γ冠状病毒和/或至少一种δ冠状病毒。
7.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种冠状病毒，优选所述β冠状病毒，选自至少一种Sarbecovirus、至少一种Merbecovirus、至少一种Embecovirus、至少一种Nobecovirus和/或至少一种Hibecovirus。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述至少一种Sarbecovirus选自SARS-CoV-1病毒和/或SARS-CoV-2病毒。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述至少一种Merbecovirus选自MERS-CoV病毒。
10.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中由组分A的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白(S、S1、S2或S1和S2)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述刺突蛋白选自或衍生自包含至少一个融合前稳定化突变的融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括下列氨基酸取代：K986P和V987P。
14.根据权利要求12至13所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括空腔填充突变，优选地选自包括T887W；A1020W；T887W和A1020W；或P1069F的列表。
15.根据权利要求12至14所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括突变的质子化位点，优选地选自包括H1048Q和H1064N；H1083N和H1101N；或H1048Q和H1064N以及H1083N和H1101N的列表。
16.根据权利要求12至15所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括至少一个人工分子内二硫键，优选地选自包括I712C和T1077C；I714C和Y1110C；P715C和P1069C；G889C和L1034C；I909C和Y1047C；Q965C和S1003C；F970C和G999C；A972C和R995C；A890C和V1040C；T874C和S1055C；N914C和S1123C；或N914C和S1123C的列表。
17.根据权利要求10至16所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸另外地编码选自或衍生自信号肽、连接体、辅助表位、抗原聚集元件、三聚化元件、跨膜元件和/或VLP形成序列的至少一种异源肽或蛋白质元件。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述至少一种异源抗原聚集元件选自或衍生自铁蛋白元件、二氧四氢喋啶合酶元件、乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或胶囊蛋白，和/或其中所述至少一种异源三聚化元件选自或衍生自折叠子元件，优选纤维蛋白折叠子元件，和/或其中所述至少一种VLP形成序列选自或衍生自土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)。
19.根据权利要求10至18所述的药物组合物，其中由组分A的所述至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS-CoV-2的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938或26939中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
20.根据权利要求10至19所述的药物组合物，其中由组分A的所述至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS-CoV-2的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:10-26、40-48、85-111、341-1278、1681-2618、2686-3623、3691-4628、4696-5633、5701-6638、6706-7643、7711-8648、8716-9653、9721-10658、10726-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的至少一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
21.根据权利要求10至20所述的药物组合物，其中所述至少一种抗原性肽或蛋白质是包含融合前稳定化K986P和V987P突变的S蛋白，其包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:10、341、22960、22961、22963同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个氨基酸序列，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
22.根据权利要求10至21所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-147、148-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
23.根据权利要求10至22所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，所述编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:136-138、140-143、145-147、148-175、11731-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、14142-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
24.根据权利要求10至23所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
25.根据权利要求10至24所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:149、163、24837、26633、26907的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
26.根据权利要求10至24所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码SARS-CoV-2抗原的、与选自SEQ ID NO:23311、23531、24851、23310、23530、24850、23313、23533、24853、23314、23534、24854的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
27.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的所述冠状病毒是SARS相关病毒，优选SARS-CoV-1病毒。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中由组分A的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自刺突蛋白(S、S1、S2或S1和S2)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述刺突蛋白选自或衍生自包含至少一个融合前稳定化突变的融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括下列氨基酸取代：K968P和V969P。
31.根据权利要求29至30所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括选自至少一个空腔填充突变、至少一个突变的质子化位点和/或至少一个人工分子内二硫键中的至少一种。
32.根据权利要求27至31所述的药物组合物，其中由组分A的所述至少一种核酸编码的选自或衍生自SARS相关病毒的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14906-14950中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
33.根据权利要求27至32所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码SARS相关病毒抗原的、与选自SEQ ID NO:14951-15220的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的或片段或变体。
34.根据权利要求27至33所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码SARS相关病毒抗原的、与选自SEQ ID NO:15041-15220的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的或片段或变体。
35.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的所述冠状病毒是MERS-CoV病毒。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中由组分A的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自MERS-CoV冠状病毒刺突蛋白(S、S1、S2或S1和S2)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述刺突蛋白选自或衍生自包含至少一个融合前稳定化突变的融合前稳定化刺突蛋白(S_stab)。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括下列氨基酸取代：V1060P和L1061P。
39.根据权利要求37至38所述的药物组合物，其中所述至少一个融合前稳定化突变包括选自至少一个空腔填充突变、至少一个突变的质子化位点和/或至少一个人工分子内二硫键中的至少一种。
40.根据权利要求35至39所述的药物组合物，其中由组分A的所述至少一种核酸编码的MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14794-14809中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
41.根据权利要求35至40所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码MERS-CoV抗原的、与选自SEQ ID NO:14810-14905的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
42.根据权利要求35至41所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码MERS-CoV抗原的、与选自SEQ ID NO:14842-14905的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的或片段或变体。
43.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒，其中所述至少一种不同的冠状病毒不是组分A的所述冠状病毒，优选地其中所述至少一种不同的冠状病毒不是SARS-CoV-2。
44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸选自权利要求5至42中任一项限定的编码冠状病毒抗原的至少一种核酸。
45.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种其它病毒选自至少一种流感病毒。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中至少一种流感病毒选自甲型流感、乙型流感或丙型流感，优选地其中所述至少一种流感病毒选自至少一种甲型流感病毒和/或至少一种乙型流感病毒。
47.根据权利要求45或46所述的药物组合物，其中所述至少一种流感病毒选自至少一种甲型流感病毒，所述甲型流感病毒选自包括H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7和H10N8的列表中的至少一种，优选地选自H1N1、H3N2、H5N1、H5N8中的至少一种。
48.根据权利要求45至47所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
49.根据权利要求45至48所述的药物组合物，其中由组分B的至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种流感病毒的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14178-14229中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
50.根据权利要求45至49所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码流感病毒抗原的、与选自SEQ ID NO:14230-14333、14334-14541、26946、26947-26955的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
51.根据权利要求45至50所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码甲型流感HA抗原的、与选自SEQ ID NO:14230-14233、14236-14256、14282-14285、14288-14308、14334-14337、14340-14360、14386-14389、14392-14412、14438-14441、14444-14464、14490-14493、14496-14516、26946-26950的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
52.根据权利要求45至51所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码甲型流感NA抗原的、与选自SEQ ID NO:14366-14369、14372-14383、14418-14421、14424-14435、14470-14473、14476-14487、14522-14525、14528-14539、26953、26954的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
53.根据权利要求45至52所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括下列或由下列组成：编码乙型流感抗原的、与选自SEQ ID NO:14234、14235、14257-14261、14266、14267、14280、14281、14286、14287、14309-14313、14318、14319、14332、14333、14338、14339、14361-14365、14370、14371、14384、14385、14390、14391、14413-14417、14422、14423、14436、14437、14442、14443、14465-14469、14474、14475、14488、14489、14494、14495、14517-14521、14526、14527、14540、14541、26951、26952、26955的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少一个核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
54.根据权利要求45至53所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码流感病毒抗原的、与选自SEQ ID NO:14334-14541、26947-26955的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
55.根据权利要求45至54所述的药物组合物，其中组分B包含多个编码流感病毒抗原的核酸序列，优选2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或100个编码流感病毒抗原的核酸序列，优选地其中所述多个中的每一个选自权利要求45至54中限定的核酸序列。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述多个核酸序列编码至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自至少一种甲型流感病毒的HA的抗原性肽或蛋白质以及至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自至少一种甲型流感病毒的NA的抗原性肽或蛋白质。
57.根据权利要求55或56所述的药物组合物，其中所述多个核酸序列编码至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自至少一种乙型流感病毒的HA的抗原性肽或蛋白质以及至少一种，优选2、3、4、5、6种选自或衍生自至少一种乙型流感病毒的NA的抗原性肽或蛋白质。
58.根据权利要求45至57所述的药物组合物，其中组分B包含编码流感病毒抗原的多个核酸序列，其中所述流感病毒选自包括FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009、FLUAV/H1N1/A/密歇根州/45/2015、FLUAV/H1N1/A/荷兰/602/2009、FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014、FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008、FLUBV/H0N0/B/普吉岛/3073/2013的列表。
59.根据权利要求45至57所述的药物组合物，其中组分B包含多个核酸序列，优选七个核酸序列，其编码多种流感病毒抗原，优选七种流感病毒抗原，其中所述流感病毒抗原选自
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的HA蛋白，
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的HA蛋白，
-FLUBV/H0N0/B/普吉岛/3073/2013的HA蛋白，
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的HA蛋白，
-FLUAV/H3N2/A/香港/4801/2014的NA蛋白，
-FLUAV/H1N1/A/加州/7/2009的NA蛋白，和
-FLUBV/H0N0/B/布里斯班/60/2008的NA蛋白。
60.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种其它病毒选自肺病毒科的至少一种呼吸道合胞病毒(RSV)。
61.根据权利要求60所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种RSV融合蛋白F、基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白和/或磷蛋白P的至少一种肽或蛋白质，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体，优选地选自或衍生自RSV融合蛋白F，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
62.根据权利要求61所述的药物组合物，其中选自或衍生自RSV F蛋白的所述至少一种抗原性肽或蛋白质是全长F蛋白(F0)或C端缺失的F蛋白(F-del)，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
63.根据权利要求61至62所述的药物组合物，其中所述RSV F蛋白选自或衍生自包含至少一个融合前稳定化突变的融合前稳定化F蛋白(F_stab)。
64.根据权利要求61至63所述的药物组合物，其中所述RSV F蛋白在一条多肽链中包含两个亚单位F2和F1，其中F2和F1经由连接体元件，优选地GS连接体连接以产生稳定的F2-连接体-F1蛋白，任选地其中所述F2-连接体-F1蛋白缺少aa104-aa144。
65.根据权利要求60至64所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种RSV的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14542-14551中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
66.根据权利要求60至65所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括编码RSV抗原的核酸序列或由其组成，所述编码RSV抗原的核酸序列包括下列或由下列组成：与选自SEQ ID NO:14552-14571、14572-14611的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
67.根据权利要求60至66所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与选自SEQ ID NO:14572-14611的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
68.根据权利要求60至67所述的药物组合物，其包含至少一种、两种或三种其它核酸序列，所述核酸序列包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自RSV基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白和/或磷蛋白P或其组合，优选选自M2-1的至少一种抗原性肽或蛋白质。
69.根据权利要求68所述的药物组合物，其中所述至少一个其它人工核酸序列的所述至少一个编码序列编码与已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:9684、10053-10133、10134、10503-10636、10637、11006-11182、11183、11552-11725、19844、20213、20582、20951中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些序列中任意者的片段或变体。
70.根据权利要求68至69所述的药物组合物，其中所述至少一个其它核酸序列的所述至少一个编码序列包含编码RSV抗原的核酸序列或由其组成，所述编码RSV抗原的核酸序列包括下列或由下列组成：与选自已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:9685-9692、10135-10142、10638-10645、11184-11119、19845-19852、20214-20221、20583-20590、20952-20959、21385-21388、21411-21414的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
71.根据权利要求68至70所述的药物组合物，其中所述至少一种其它核酸包含下列或由下列组成：编码RSV抗原的、与选自已公开的PCT申请WO2019202035的SEQ ID NO:9693-10052、10143-10502、10646-11005、11192-11551、19853-20212、20222-20581、20591-20950、20960-21319、21481-21488、21627-21634、21553-21560、21699-21706的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
72.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种其它病毒选自至少一种偏肺病毒，优选地肺病毒科的人类偏肺病毒(hMPV)。
73.根据权利要求72所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种hMPV F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白和SH蛋白的至少一种肽或蛋白质，或其免疫原性片段或免疫原性变体。
74.根据权利要求72至73所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种hMPV的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14626-14649、26966-26971中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
75.根据权利要求72至74所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括编码hMPV抗原的核酸序列或由其组成，所述编码hMPV抗原的核酸序列包括下列或由下列组成：与选自SEQ ID NO:14650-14697、14698-14793、26972-26978、26979-26991的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
76.根据权利要求72至75所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码hMPV抗原的、与选自SEQ ID NO:14698-14793、26979-26991的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
77.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种其它病毒选自至少一种副流感病毒(PIV)，优选地副粘病毒科的人类副流感病毒(hPIV)。
78.根据权利要求77所述的药物组合物，其中所述至少一种PIV选自hPIV-1、hPIV-2或hPIV-3血清型，优选地hPIV-3血清型。
79.根据权利要求77或78所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括选自或衍生自下列的至少一种肽或蛋白质或由其组成：至少一种PIV血凝素-神经氨酸酶(HN)、PIV融合(F)糖蛋白、PIV基质蛋白(M)、PIV核衣壳蛋白(N)、PIV病毒复制酶(L)、PIV非结构V蛋白，或其免疫原性片段。
80.根据权利要求77至79所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的选自或衍生自至少一种PIV的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与SEQ ID NO:14612、14613、26956、26957中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
81.根据权利要求77至80所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括编码PIV抗原的核酸序列或由其组成，所述编码PIV抗原的核酸序列包括下列或有下列组成：与选自SEQ ID NO:14614-14617、14618-14625、26958-26965的核酸序列中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
82.根据权利要求77至81所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码PIV抗原的、与选自SEQ ID NO:14618-14625、26961-26965的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
83.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种其它病毒选自副粘病毒科的至少一种亨尼帕病毒。
84.根据权利要求83所述的药物组合物，其中所述至少一种亨尼帕病毒选自至少一种亨德拉病毒和/或至少一种尼帕病毒。
85.根据权利要求83或84所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包括下列或由下列组成：选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒糖蛋白和/或至少一种亨尼帕病毒融合蛋白的至少一种肽或蛋白质，或其片段或变体。
86.根据权利要求83至85所述的药物组合物，其中由组分B的所述至少一种核酸编码的、选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒的所述至少一种抗原性肽或蛋白质包含下列或由下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ ID NO:1-26、573-598、807-832、1041-1066、1513-1515中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个，或这些中任意者的免疫原性片段或免疫原性变体。
87.根据权利要求83至86所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸的所述至少一个编码序列包括编码亨尼帕病毒抗原的核酸序列或由其组成，所述编码亨尼帕病毒抗原的核酸序列包括下列或有下列组成：与已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQ IDNO:27-234、599-806、833-1040、1067-1274、1275-1508、1516-1539、1540-1548中的任一个同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
88.根据权利要求83至87所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸包含下列或由下列组成：编码亨尼帕病毒抗原的、与选自已公开的PCT专利申请WO2018115507的SEQID NO:1275-1508、1540-1548的核酸序列同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或这些序列中任意者的片段或变体。
89.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A选自下列组分中的至少一种：
A-1至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS-CoV-2的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求10至26中限定的，和/或
A-2至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种SARS相关病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求27至34中限定的，和/或
A-3至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种MERS-CoV的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求35至42中限定的。
90.根据权利要求89所述的药物组合物，其中组分A选自A-1和A-2；A-1和A-3；A-2和A-3；或A-1与A-2和A-3。
91.根据权利要求89所述的药物组合物，其中组分A选自组分A-1。
92.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分B选自下列组分中的至少一种：
B-1至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种不同的冠状病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求43至44中限定的，和/或
B-2至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种流感病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求45至59中限定的，和/或
B-3至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种肺病毒科病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求60至76中限定的，和/或
B-4至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种副粘病毒科病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求77至88中限定的。
93.根据权利要求92所述的药物组合物，其中组分B选自B-1和B-2；B-1和B-3；B-1和B-4；B-2和B-3；B-2和B-4；或B-3和B-4。
94.根据权利要求92所述的药物组合物，其中组分B的所述至少一种核酸选自B-1与B-2和B-3；B-1与B-2和B-4；B-1与B-3和B-4；B-2与B-3和B-4。
95.根据权利要求92至94所述的药物组合物，其中组分B-3选自下列组分中的至少一种：
B-3a至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种RSV的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求60至71中限定的，和/或
B-3b至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种hMPV的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求72至76中限定的。
96.根据权利要求95所述的药物组合物，其中组分B-3选自B-3a。
97.根据权利要求92至96所述的药物组合物，其中组分B-4选自下列组分中的至少一种：
B-4a至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种PIV的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求77至82中限定的，和/或
B-4b至少一种核酸，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自或衍生自至少一种亨尼帕病毒的至少一种抗原性肽或蛋白质或其免疫原性片段或免疫原性变体，优选权利要求83至88中限定的。
98.根据权利要求97所述的药物组合物，其中组分B4选自组分B-4a。
99.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其包含下列或由下列组成：组分A-1和组分B-3a。
100.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其包含下列或由下列组成：组分A-1和组分B-2。
101.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其包含下列或由下列组成：组分A-1与组分B-2和组分B-3a。
102.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的核酸的至少一个编码序列和/或组分B的核酸的至少一个编码序列是密码子修饰的编码序列，优选地其中由所述至少一个密码子修饰的编码序列编码的所述氨基酸序列，与对应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比未被修饰。
103.根据权利要求102所述的药物组合物，其中所述至少一个密码子修饰的编码序列选自C最大化编码序列、CAI最大化编码序列、人类密码子使用适应的编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列，或其任意组合。
104.根据权利要求102或103所述的药物组合物，其中所述至少一个密码子修饰的编码序列是G/C优化的编码序列、人类密码子使用适应的编码序列或G/C含量修饰的编码序列。
105.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的所述至少一个编码序列和/或组分B的所述至少一种核酸具有至少约50％、55％或60％的G/C含量。
106.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含至少一个异源非翻译区，所述异源非翻译区选自至少一个异源5’-UTR和/或至少一个异源3’-UTR。
107.根据权利要求106所述的药物组合物，其中所述至少一个异源3’-UTR包含下列或由下列组成：衍生自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR，或衍生自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的核酸序列。
108.根据权利要求106或107所述的药物组合物，其中所述至少一个异源5’-UTR包含下列或由下列组成：衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5’-UTR，或衍生自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的核酸序列。
109.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A和/或组分B的核酸包含与下列可操作地连接的至少一个编码序列：
-α-珠蛋白3’-UTR；或
-HSD17B4 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR(HSD17B4/PSMB3)；或
-SLC7A3 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR(SLC7A3/PSMB3)；或
-RPL31 5’-UTR和RPS9 3’-UTR(RPL31/RPS9)。
110.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A和/或组分B的核酸包含至少一个编码序列，所述编码序列可操作地连接至HSD17B4 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR(HSD17B4/PSMB3)。
111.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含至少一个聚(A)序列，优选地包含30至200个腺苷核苷酸，任选地其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含至少一个聚(C)序列，优选地包含10至40个胞嘧啶核苷酸。
112.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含至少一个组蛋白茎环或组蛋白茎环结构。
113.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸是DNA或RNA。
114.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸是编码RNA，优选地mRNA、自我复制RNA、环状RNA或复制子RNA。
115.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸是mRNA，优选地纯化的mRNA。
116.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸是RNA，其中所述RNA具有至少约50％的RNA完整性，优选地至少约60％的RNA完整性，更优选地至少约70％的RNA完整性，最优选地至少约80％的RNA完整性。
117.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含5’-帽结构，优选地m7G、帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构。
118.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
119.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含选自假尿苷(ψ)和N1-甲基假尿苷(m1ψ)的至少一个经修饰的核苷酸，任选地其中全部的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸替代。
120.根据权利要求1至117所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸是不包含化学修饰的核苷酸的RNA。
121.根据权利要求1至117所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸包含仅由G、C、A和U核苷酸组成的编码序列。
122.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其包含至少一种药学上可接受的载剂。
123.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物，优选地阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白质、阳离子或聚阳离子肽，或其任何组合复合或缔合，或至少部分地复合或部分地缔合。
124.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸与一种或多种脂质复合或缔合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体。
125.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸与一种或多种脂质复合或缔合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)。
126.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸被分别配制，优选地其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸被配制在单独的脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体中。
127.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸被共配制，优选地其中组分A的至少一种核酸和/或组分B的至少一种核酸被共配制在脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体中。
128.根据权利要求124至127所述的药物组合物，其中所述脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体包含至少一种阳离子脂质，优选地根据式III-3的阳离子脂质：
Figure FDA0004113537740000141
129.根据权利要求124至128所述的药物组合物，其中所述脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体包含至少一种聚合物缀合的脂质，优选地PEG脂质，优选地根据式(IVa)的PEG-脂质：
Figure FDA0004113537740000142
/>
其中n的平均值范围为30至60，优选地其中n的平均值为约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54，最优选地其中n的平均值为49或45。
130.根据权利要求124至128所述的药物组合物，其中所述脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体包含至少一种聚合物缀合的脂质，优选地PEG脂质，优选地根据式(IVa)的PEG-脂质：
Figure FDA0004113537740000151
其中n是经选择使得所述PEG脂质的平均分子量为约2000g/mol至约3000g/mol或约2300g/mol至约2700g/mol，优选地约2500g/mol的整数。
131.根据权利要求124至130所述的药物组合物，其中所述脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体包含一种或多种中性脂质和/或一种或多种类固醇或类固醇类似物。
132.根据权利要求131所述的药物组合物，其中所述中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，优选地其中所述阳离子脂质与DSPC的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。
133.根据权利要求131或132所述的药物组合物，其中所述类固醇是胆固醇，优选地其中所述阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约2:1至约1:1的范围内。
134.根据权利要求124至133所述的药物组合物，其中所述脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体，优选地所述LNP包含下列或由下列组成：
(i)至少一种阳离子脂质，优选地权利要求128中限定的至少一种阳离子脂质；
(ii)中性脂质，优选地权利要求132中限定的中性脂质；
(iii)类固醇或类固醇类似物，优选地权利要求133中限定的类固醇或类固醇类似物；和
(iv)聚合物缀合的脂质，优选地PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，优选地权利要求129或130中限定的PEG-脂质。
135.根据权利要求134所述的药物组合物，其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇和0.5-15％聚合物缀合的脂质，优选地PEG-脂质。
136.根据权利要求134或135所述的药物组合物，其中(i)至(iv)的摩尔比为约50:10:38.5:1.5，优选地47.5:10:40.8:1.7或更优选地47.4:10:40.9:1.7。
137.根据权利要求124至136所述的药物组合物，其中脂质与核酸的wt/wt比为约10:1至约60:1，优选地约20:1至约30:1，例如约25:1。
138.根据权利要求124至137所述的药物组合物，其中包封所述核酸的所述脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的n/p比在约1至约10的范围内，优选地在约5至约7的范围内，更优选地约6。
139.根据权利要求124至138所述的药物组合物，其中所述组合物的多分散指数(PDI)值小于约0.4，优选地小于约0.3，更优选地小于约0.2，最优选地小于约0.1。
140.根据权利要求124至139所述的药物组合物，其中所述LNP的Z-平均尺寸在约60nm至约120nm范围内，优选地小于约120nm。
141.根据权利要求124至140所述的药物组合物，其中所述组合物包含少于约20％的游离(非复合)RNA，优选地少于约15％的游离(非复合)RNA，更优选地少于约10％的游离(非复合)RNA。
142.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是冻干组合物、喷雾干燥组合物或喷雾冷冻干燥组合物，任选地包含至少一种药学上可接受的冻干保护剂。
143.根据权利要求142所述的药物组合物，其中所述冻干组合物或喷雾干燥组合物的含水量少于约10％，优选地含水量在约0.5％和5％之间。
144.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中当向对象施用时，组分A的至少一种核酸和组分B的至少一种核酸被翻译成适合诱导免疫应答的抗原性肽或蛋白质。
145.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中当向对象施用时，在所述对象中诱导针对由组分A编码的肽或蛋白质的抗原特异性体液免疫应答和针对由组分B编码的肽或蛋白质的抗原特异性体液免疫应答。
146.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中当向对象施用时，在所述对象中诱导针对由组分A编码的肽或蛋白质的抗原特异性T细胞应答和针对由组分B编码的肽或蛋白质的抗原特异性T细胞应答。
147.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中在向对象施用后，在所述对象中建立针对由组分A编码的肽或蛋白质的抗原特异性B细胞记忆和针对由组分B编码的肽或蛋白质的抗原特异性B细胞记忆。
148.组合疫苗，其包含权利要求1至147中限定的至少一种组分A和至少一种组分B。
149.根据权利要求148所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗抵抗至少一种冠状病毒，优选地SARS-CoV-2，以及至少一种流感病毒和/或RSV病毒。
150.根据权利要求148至149所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗抵抗至少一种冠状病毒，优选地SARS-CoV-2，至少一种流感病毒，至少一种RSV病毒，以及任选地抵抗至少一种PIV和/或至少一种hMPV。
151.根据权利要求148至150所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗引发针对由组分A的至少一种核酸提供的所有经编码抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答，并且另外地引发针对由组分B的至少一种核酸提供的所有经编码抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答。
152.根据权利要求148至151所述的组合疫苗，其中在施用低剂量的所述疫苗后，所述疫苗引发针对所有经编码抗原的包括T细胞应答和/或B细胞应答的抗原特异性免疫应答，优选地其中所述低剂量包含少于约20μg核酸。
153.根据权利要求148至152所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗在年龄为约5岁或更年幼的对象中引发抗原特异性免疫应答。
154.根据权利要求148至153所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗在年龄为约60岁或更年长的对象中引发抗原特异性免疫应答。
155.试剂盒或多部分试剂盒，其包含至少一种权利要求1至147所述的药物组合物，和/或至少一种权利要求148至153所述的组合疫苗，任选地包含至少一种用于增溶的液体媒剂，以及任选地，提供有关试剂盒组分的施用和剂量的信息的技术说明书。
156.根据权利要求1至147所述的药物组合物、根据权利要求148至153所述的组合疫苗、根据权利要求155所述的试剂盒或多部分试剂盒，其作为药物使用。
157.根据权利要求1至147所述的药物组合物、根据权利要求148至153所述的组合疫苗、根据权利要求155所述的试剂盒或多部分试剂盒，其用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2的感染，以及至少一种其它病毒的感染，优选地其中所述其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒。
158.根据权利要求1至147所述的药物组合物、根据权利要求148至153所述的组合疫苗、根据权利要求155所述的试剂盒或多部分试剂盒，其用于治疗或预防至少一种冠状病毒，优选SARS-CoV-2，以及至少一种流感病毒的感染，或治疗或预防与此类感染相关的障碍。
159.根据权利要求1至147所述的药物组合物、根据权利要求148至153所述的组合疫苗、根据权利要求155所述的试剂盒或多部分试剂盒，其用于治疗或预防至少一种冠状病毒，优选SARS-CoV-2，以及至少一种RSV的感染，或治疗或预防与此类感染相关的障碍。
160.根据权利要求1至147所述的药物组合物、根据权利要求148至153所述的组合疫苗、根据权利要求155所述的试剂盒或多部分试剂盒，其用于治疗或预防至少一种冠状病毒，优选SARS-CoV-2、至少一种RSV以及至少一种流感病毒的感染，或治疗或预防与此类感染相关的障碍。
161.治疗或预防障碍的方法，其中所述方法包括向有需要的对象应用或施用权利要求1至147所述的药物组合物、权利要求148至153所述的组合疫苗或权利要求155所述的试剂盒或多部分试剂盒。
162.治疗或预防权利要求161的障碍的方法，其中所述障碍是冠状病毒，优选SARS-CoV-2的感染，以及至少一种其它病毒的感染，任选地其中所述其它病毒选自至少一种不同的冠状病毒、至少一种流感病毒、至少一种肺病毒科病毒和/或至少一种副粘病毒科病毒，或治疗或预防与这些感染相关的障碍的方法。
163.治疗或预防权利要求161或162的障碍的方法，其中所述有需要的对象是哺乳动物对象，优选地人类对象。
164.治疗或预防权利要求161或163的障碍的方法，其中所述有需要的对象是人类对象，优选地老年人类对象。
165.治疗或预防权利要求161或164的障碍的方法，其中所述方法在所述施用后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年，在至少80％、85％、90％或95％的治疗对象中预防中度和重度COVID-19病，并预防与冠状病毒感染、流感病毒感染、肺病毒科病毒感染和/或副粘病毒科病毒感染相关的至少一种其它疾病。
166.治疗或预防权利要求161或165的障碍的方法，其中对所述对象施用包含约5μg至约50μg RNA的单剂量。
167.治疗或预防权利要求161或165的障碍的方法，其中对所述对象施用包含约5μg至约50μg RNA的双剂量。
168.使权利要求1至147的药物组合物或权利要求148至153的组合疫苗稳定化的方法，包括冻干所述组合物或疫苗以产生稳定化的组合物或疫苗。
169.根据权利要求168所述的稳定化的方法，其中所述稳定化的组合物或疫苗的含水量少于约10％，优选地含水量在约0.5％和5.0％之间。
170.稳定化的冻干组合物或疫苗，其通过权利要求168至169的方法产生。
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