CN109310751A - 广谱流感病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及流感病毒核糖核酸(RNA)疫苗，以及使用所述疫苗和包含所述疫苗的组合物的方法。

Description

广谱流感病毒疫苗
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2015年10月22日提交的美国临时申请号62/245,225、2015年10月28日提交的美国临时申请号62/247,501、2015年10月29日提交的美国临时申请号62/248,248和2015年10月22日提交的美国临时申请号62/245,031的权益，所述美国临时申请各自以引用的方式整体并入本文。
背景
流感病毒是正粘病毒科(orthomyxoviridae)的成员，并且基于它们的核蛋白(NP)和基质(M)蛋白之间的抗原性差异来分类成三种不同类型(A、B和C)。正粘病毒是直径约100nm的包膜动物病毒。流感病毒粒子由含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋核衣壳)和由基质蛋白(M1)内衬在内部的外部脂蛋白包膜组成。甲型流感病毒的区段化基因组由八个线性负极性单链RNA分子(对于丙型流感病毒是七个分子)组成，所述分子编码若干多肽，包括：RNA引导的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和核蛋白(NP)，其形成核衣壳；基质蛋白(M1、M2，其也是包埋在病毒膜中的表面暴露的蛋白质)；从脂蛋白包膜伸出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；以及非结构蛋白(NS1和NS2)。基因组的转录和复制发生在核中，并且装配发生在质膜处。
血凝素是甲型流感病毒和乙型流感病毒的主要包膜糖蛋白，并且丙型流感病毒的血凝素-酯酶(HE)是与HA同源的蛋白质。流感病毒的HA蛋白的快速进化导致不断出现新病毒株，从而致使宿主的适应性免疫应答针对新感染仅具有部分保护性。使用传统疫苗对流感和其他感染进行治疗和防治的最大挑战是疫苗在广度方面的限制，即提供仅针对密切相关亚型的保护作用。此外，为完成当前标准流感病毒疫苗生产过程所需的时长阻碍在大流行情况下迅速开发和生产适合疫苗。
脱氧核糖核酸(DNA)疫苗接种是一种用于刺激对外来抗原诸如流感抗原的体液和细胞免疫应答的技术。将经遗传工程化的DNA(例如裸质粒DNA)直接注射至活体宿主中导致它的少数细胞直接产生抗原，从而产生保护性免疫应答。然而，在这个技术的情况下，出现潜在问题，包括可能导致插入诱变，此可导致对致癌基因的活化或对肿瘤抑制基因的抑制。
概述
本文提供一种建立在以下知识上的核糖核酸(RNA)疫苗(或组合物或免疫原性组合物)：RNA(例如信使RNA(mRNA))可安全地引导身体的细胞机构来产生从天然蛋白质至抗体和可在细胞内部和外部具有治疗活性的其他完全新型蛋白质构建体的几乎任何目标蛋白质。本公开的RNA疫苗可用于诱导针对流感病毒的平衡免疫应答，其包括细胞免疫性与体液免疫性两者，而无例如可能导致插入诱变的风险。
视感染的盛行性或未满足医学需求的程度或水平而定，RNA(例如mRNA)疫苗可用于各种环境中。RNA疫苗可用于治疗和/或预防属于各种基因型、病毒株和分离株的流感病毒。RNA疫苗通常具有优越性质，因为相比于可商购获得的抗病毒治疗性治疗，它们产生大得多的抗体效价，并且更早产生应答。在不希望受理论束缚下，据信呈mRNA多核苷酸形式的RNA疫苗被更好设计以在翻译后产生适当蛋白质构象，因为RNA疫苗征用天然细胞机构。不同于离体制造并且可触发非所要细胞应答的传统疫苗，RNA(例如mRNA)疫苗以更天然方式向细胞系统递呈。
可存在其中人员处于被超过一种流感病毒株感染的风险下的情况。归因于包括但不限于制造速度、能够快速调适疫苗以适应所感知的地理威胁等的许多因素，所以RNA(例如mRNA)治疗性疫苗特别可经受组合疫苗接种方法。此外，因为疫苗利用人体来产生抗原性蛋白质，所以疫苗可经受对较大更复杂抗原性蛋白质的产生，从而允许在人受试者中达成适当折叠、表面表达、抗原递呈等。为针对超过一种流感病毒株进行保护，可施用组合疫苗，其包括编码第一流感病毒或生物体的至少一种抗原性多肽蛋白质(或其抗原性部分)的RNA(例如mRNA)，并且进一步包括编码第二流感病毒或生物体的至少一种抗原性多肽蛋白质(或其抗原性部分)的RNA。RNA(例如mRNA)可例如共同配制于单一脂质纳米粒子(LNP)中，或可配制于单独LNP中以进行共同施用。
本公开的一些实施方案提供流感病毒(流感)疫苗(或组合物或免疫原性组合物)，其包括至少一种具有编码至少一种流感抗原性多肽或其免疫原性片段(例如能够诱导对流感的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框的RNA多核苷酸。
在一些实施方案中，至少一种抗原性多肽是以下中的一者：HA的被称为HA1、HA2的确定抗原性子结构域或HA1和HA2的组合，以及至少一种选自神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)和非结构蛋白2(NS2)的抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种抗原性多肽是HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物，以及至少一种选自NA、NP、M1、M2、NS1和NS2的抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种抗原性多肽是HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物，以及至少两种选自NA、NP、M1、M2、NS1和NS2的抗原性多肽。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码流感病毒蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码多种流感病毒蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如至少一种HA1、HA2或两者组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任一者或其任何或所有的组合的至少一种HA1、HA2或两者组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，以及至少一种具有编码从流感病毒获得的选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质的开放阅读框的其他RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任一者或其任何或所有的组合中的至少一者)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，以及至少两种具有两个编码从流感病毒获得的两种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质的开放阅读框的其他RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任一者或其任何或所有的组合中的至少一者)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，以及至少三种具有三个编码从流感病毒获得的三种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质的开放阅读框的其他RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任一者或其任何或所有的组合中的至少一者)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，以及至少四种具有四个编码从流感病毒获得的四种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质的开放阅读框的其他RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任一者或其任何或所有的组合中的至少一者)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，以及至少五种具有五个编码从流感病毒获得的五种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质的开放阅读框的其他RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任一者或其任何或所有的组合中的至少一者)、NP蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段、M2蛋白或其免疫原性片段、NS1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
本公开的一些实施方案提供以下新型流感病毒多肽序列：H1HA10-折叠子_ΔNgly1；H1HA10TM-PR8(H1 A/波多黎各(Puerto Rico)/8/34 HA)；H1HA10-PR8-DS(H1 A/波多黎各/8/34 HA；pH1HA10-Cal04-DS(H1 A/加利福尼亚(California)/04/2009 HA)；来自加利福尼亚04的大流行性H1HA10；pH1HA10-铁蛋白(ferritin)；HA10；来自加利福尼亚04的大流行性H1HA10；来自加利福尼亚04病毒株的大流行性H1HA10/不具有折叠子并且具有K68C/R76C三聚化突变；来自A/波多黎各/8/34病毒株的H1HA10，不具有折叠子并且具有Y94D/N95L三聚化突变；来自A/波多黎各/8/34病毒株的H1HA10，不具有折叠子并且具有K68C/R76C三聚化突变；H1N1 A/越南(Viet Nam)/850/2009；H3N2 A/威斯康星(Wisconsin)/67/2005；H7N9(A/安徽(Anhui)/1/2013)；H9N2 A/香港(Hong Kong)/1073/99；H10N8 A/JX346/2013。
本公开的一些实施方案提供流感病毒(流感)疫苗，其包括至少一种具有编码上述新型流感病毒多肽序列的至少一种流感抗原性多肽或免疫原性片段(例如能够诱导对流感的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，流感疫苗包含至少一种具有编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，所述流感抗原性多肽包含与上述新型流感病毒序列的氨基酸序列具有至少75％(例如在75％与100％之间(包括端值)的任何数值，例如70％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)同一性的经修饰序列。经修饰序列可与上述新型流感病毒序列的氨基酸序列至少75％(例如在75％与100％之间(包括端值)的任何数值，例如70％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)同一。
本公开的一些实施方案提供包含编码上述新型流感病毒多肽序列的序列的经分离核酸；包含所述核酸的表达载体；和包含所述核酸的宿主细胞。本公开也提供一种产生任何上述新型流感病毒序列的多肽的方法。一种方法可包括在培养基中在容许上述新型流感病毒序列进行核酸表达的条件下培养宿主细胞，以及从培养的细胞或细胞的培养基纯化新型流感病毒多肽。本公开也提供针对新型流感病毒序列的抗体分子，包括全长抗体和抗体衍生物。
在一些实施方案中，对RNA(例如mRNA)疫苗的开放阅读框进行密码子优化。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种包含由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)的抗原性多肽，并且是密码子优化mRNA。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗进一步包含佐剂。
表7-13提供美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)登录号。应了解短语“表7-13的氨基酸序列”是指由7-13中所列的一个或多个NCBI登录号标识的氨基酸序列。各氨基酸序列以及与由表7-13的登录号涵盖的各氨基酸序列具有大于95％同一性或大于98％同一性的变体包括在本公开的构建体(多核苷酸/多肽)内。
在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：447-457、459、461中的任一者标识的序列，以及与野生型mRNA序列具有小于80％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：447-457、459、461中的任一者标识的序列，以及与野生型mRNA序列具有小于75％、85％或95％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：447-457、459、461中的任一者标识的序列，以及与野生型mRNA序列具有小于50-80％、60-80％、40-80％、30-80％、70-80％、75-80％或78-80％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：447-457、459、461中的任一者标识的序列，以及与野生型mRNA序列具有小于40-85％、50-85％、60-85％、30-85％、70-85％、75-85％或80-85％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：447-457、459、461中的任一者标识的序列，以及与野生型mRNA序列具有小于40-90％、50-90％、60-90％、30-90％、70-90％、75-90％、80-90％或85-90％同一性的核酸编码。
在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：491-503中的任一者标识的序列，并且与野生型mRNA序列具有小于80％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：491-503中的任一者标识的序列的核酸编码，并且与野生型mRNA序列具有小于75％、85％或95％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：491-503中的任一者标识的序列的核酸编码，并且与野生型mRNA序列具有小于50-80％、60-80％、40-80％、30-80％、70-80％、75-80％或78-80％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：491-503中的任一者标识的序列的核酸编码，并且与野生型mRNA序列具有小于40-85％、50-85％、60-85％、30-85％、70-85％、75-85％或80-85％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQID NO：491-503中的任一者标识的序列的核酸编码，并且与野生型mRNA序列具有小于40-90％、50-90％、60-90％、30-90％、70-90％、75-90％、80-90％或85-90％同一性。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种包含由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)的抗原性多肽，以及与野生型mRNA序列具有至少80％(例如85％、90％、95％、98％、99％)同一性，但不包括野生型mRNA序列。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种包含由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)的抗原性多肽，并且与野生型mRNA序列具有小于95％、90％、85％、80％或75％同一性。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种包含由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)的抗原性多肽，并且与野生型mRNA序列具有30-80％、40-80％、50-80％、60-80％、70-80％、75-80％或78-80％、30-85％、40-85％、50-805％、60-85％、70-85％、75-85％或78-85％、30-90％、40-90％、50-90％、60-90％、70-90％、75-90％、80-90％或85-90％同一性。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种与由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种与由1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)具有95％-99％同一性的抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种与由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，以及具有膜融合活性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种与由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)具有95％-99％同一性，以及具有膜融合活性的抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种附接至细胞受体的流感抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种导致病毒膜和细胞膜的融合的流感抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种导致病毒结合至所感染细胞的流感抗原性多肽。
本公开的一些实施方案提供一种疫苗，其包括在脂质纳米粒子内配制的至少一种核糖核酸(RNA)(例如mRNA)多核苷酸，所述多核苷酸具有编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框、至少一个5′末端帽和至少一个化学修饰。
在一些实施方案中，5’末端帽是7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
在一些实施方案中，至少一个化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，化学修饰在尿嘧啶的5位。在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，化学修饰是N1-乙基假尿苷。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含阳离子脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是可离子化阳离子脂质，并且非阳离子脂质是中性脂质，并且固醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自由以下组成的组：2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)。
在一些实施方案中，脂质是
在一些实施方案中，脂质是
本公开的一些实施方案提供一种疫苗，其包括至少一种编码至少一种流感抗原性多肽的RNA(例如mRNA)多核苷酸，其中所述开放阅读框中至少80％(例如85％、90％、95％、98％、99％)的尿嘧啶具有化学修饰，任选其中所述疫苗在脂质纳米粒子(例如脂质纳米粒子包含阳离子脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质)中配制。
在一些实施方案中，开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰在尿嘧啶的5位。在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，开放阅读框中100％的尿嘧啶在尿嘧啶的5位具有N1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)多核苷酸的开放阅读框编码至少两种流感抗原性多肽。在一些实施方案中，开放阅读框编码至少五种或至少十种抗原性多肽。在一些实施方案中，开放阅读框编码至少100种抗原性多肽。在一些实施方案中，开放阅读框编码2-100种抗原性多肽。
在一些实施方案中，疫苗包含至少两种RNA(例如mRNA)多核苷酸，各自具有编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框。在一些实施方案中，疫苗包含至少五种或至少十种RNA(例如mRNA)多核苷酸，各自具有编码至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框。在一些实施方案中，疫苗包含至少100种RNA(例如mRNA)多核苷酸，各自具有编码至少一种抗原性多肽的开放阅读框。在一些实施方案中，疫苗包含2-100种RNA(例如mRNA)多核苷酸，各自具有编码至少一种抗原性多肽的开放阅读框。
在一些实施方案中，使至少一种流感抗原性多肽融合于信号肽。在一些实施方案中，信号肽选自：HuIgGk信号肽(METPAQLLFLLLLWLPDTTG；SEQ ID NO：480)；IgE重链ε-1信号肽(MDWTWILFLVAAATRVHS；SEQ ID NO：481)；日本脑炎PRM信号序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：482)、VSVg蛋白信号序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：483)和日本脑炎JEV信号序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：484)。
在一些实施方案中，使信号肽融合于至少一种抗原性多肽的N末端。在一些实施方案中，使信号肽融合于至少一种抗原性多肽的C末端。
在一些实施方案中，至少一种流感抗原性多肽包含突变的N连接糖基化位点。
本文也提供任一先前段落的在纳米粒子(例如脂质纳米粒子)中配制的流感RNA(例如mRNA)疫苗。
在一些实施方案中，纳米粒子具有50-200nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米粒子是脂质纳米粒子。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含阳离子脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含约20-60％阳离子脂质、0.5-15％经PEG修饰的脂质、25-55％固醇和25％非阳离子脂质的摩尔比。在一些实施方案中，阳离子脂质是可离子化阳离子脂质，并且非阳离子脂质是中性脂质，并且固醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
在一些实施方案中，纳米粒子具有小于0.4(例如小于0.3、0.2或0.1)的多分散性值。
在一些实施方案中，纳米粒子在中性pH值下具有净中性电荷。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗是多价的。
本公开的一些实施方案提供在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法，其包括以有效产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用任何如本文提供的RNA(例如mRNA)疫苗。在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗是流感疫苗。在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗是包含流感疫苗的组合的组合疫苗(广谱流感疫苗)。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。
在一些实施方案中，一种产生抗原特异性免疫应答的方法包括向受试者施用单剂量(无加强剂量)的本公开的流感RNA(例如mRNA)疫苗。
在一些实施方案中，一种方法进一步包括向受试者施用第二(加强)剂量的流感RNA(例如mRNA)疫苗。可施用额外剂量的流感RNA(例如mRNA)疫苗。
在一些实施方案中，在第一剂量或第二(加强)剂量的疫苗之后，受试者展现至少80％(例如至少85％、至少90％或至少95％)的血清转换率。血清转换是特异性抗体产生并变得在血液中可检测所处的时期。在已发生血清转换之后，可在血液测试中关于抗体来检测病毒。在感染或免疫期间，抗原进入血液中，并且免疫系统作为应答开始产生抗体。在血清转换之前，抗原自身可能可检测或可能不可检测，但抗体被视为不存在。在血清转换期间，抗体存在，但尚未可检测。在血清转换之后的任何时间，可在血液中检测到抗体，从而指示先前或当前感染。
在一些实施方案中，通过真皮内注射、肌肉内注射或通过鼻内施用来向受试者施用流感RNA(例如mRNA)疫苗。在一些实施方案中，通过肌肉内注射来向受试者施用流感RNA(例如mRNA)疫苗。
本公开的一些实施方案提供在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法，其包括以在受试者中有效产生抗原特异性免疫应答的量向受试者施用流感RNA(例如mRNA)疫苗。在一些实施方案中，可通过在向受试者施用任何本公开的流感RNA(例如mRNA)疫苗之后测定抗体效价(结合至流感抗原性多肽的抗体的效价)来确定受试者中的抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至少1个log。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加1-3个log。
在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至至少2倍。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至至少5倍。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至至少10倍。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至2-10倍。
在一些实施方案中，对照是在尚未被施用本公开的RNA(例如mRNA)疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照是在已被施用活体减毒或失活流感病毒的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价，或其中对照是在已被施用重组或纯化流感蛋白疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照是在已被施用流感病毒样粒子(VLP)疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价(参见例如CoxRG等，J Virol.2014年6月；88(11)：6368-6379)。
以有效量(有效诱导免疫应答的量)向受试者施用本公开的RNA(例如mRNA)疫苗。在一些实施方案中，有效量是等于降低至重组流感蛋白疫苗的护理标准剂量的至少1/2、至少1/4、至少1/10、至少1/100、至少1/1000的剂量，其中在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价等于在被施用护理标准剂量的重组流感蛋白疫苗、纯化流感蛋白疫苗、活体减毒流感疫苗、失活流感疫苗或流感VLP疫苗的对照受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，有效量是等于降低至重组流感蛋白疫苗的护理标准剂量的1/2-1/1000的剂量，其中在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价等于在被施用护理标准剂量的重组流感蛋白疫苗、纯化流感蛋白疫苗、活体减毒流感疫苗、失活流感疫苗或流感VLP疫苗的对照受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，对照是在已被施用包含流感病毒的结构蛋白的病毒样粒子(VLP)疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗以在受试者中有效产生抗原特异性免疫应答的量配制。
在一些实施方案中，有效量是25μg至1000μg、或50μg至1000μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用的25μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用的100μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用的400μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用的500μg的剂量。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗的功效(或有效性)大于60％。在一些实施方案中，疫苗的RNA(例如mRNA)多核苷酸对应至少一种流感抗原性多肽。
可使用标准分析评估疫苗功效(参见例如Weinberg等，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。举例来说，可通过双盲随机化临床对照试验测量疫苗功效。可将疫苗功效表示为在未接种疫苗(ARU)研究组与接种疫苗(ARV)研究组之间在疾病发病率(AR)方面的成比例降低，并且可使用下式由接种疫苗组之中的疾病的相对风险(RR)计算：
功效＝(ARU-ARV)/ARU x 100；并且
功效＝(1-RR)x 100。
同样，可使用标准分析评估疫苗有效性(参见例如Weinberg等，J InfectDis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。疫苗有效性是对疫苗(其可已被证明具有高疫苗功效)使群体的疾病减轻的程度的评估。这个量度可评估疫苗接种程序而非仅仅疫苗自身在天然实地条件下而非在对照临床试验中的益处和不利作用的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效能)成比例，但也受群体中的目标组被免疫的良好程度影响，以及受影响‘现实世界’住院治疗效果、非卧床诊视或成本的其他非疫苗相关因素影响。举例来说，可使用回顾性病例对照分析，其中比较一组受感染病例和适当对照之中的疫苗接种率。可将疫苗有效性表示为比率差异，其中使用尽管进行疫苗接种但还是显现感染的机会比率(OR)：
有效性＝(1-OR)x 100。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗的功效(或有效性)是至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在一些实施方案中，疫苗使受试者针对流感免疫多达2年。在一些实施方案中，疫苗使受试者针对流感免疫超过2年，超过3年，超过4年，或5-10年。
在一些实施方案中，受试者是约5岁或更年轻。举例来说，受试者的年龄可在约1岁与约5岁之间(例如约1、2、3、5或5岁)，或在约6个月与约1岁之间(例如约6、7、8、9、10、11或12个月)。在一些实施方案中，受试者是约12个月大或更年轻(例如12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2个月或1个月)。在一些实施方案中，受试者是约6个月大或更年轻。
在一些实施方案中，受试者足月出生(例如约37-42周)。在一些实施方案中，受试者过早出生，例如在妊娠的约36周或更早(例如约36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25周)。举例来说，受试者可已在妊娠的约32周或更早出生。在一些实施方案中，受试者在妊娠的约32周与约36周之间过早出生。在所述受试者中，RNA(例如mRNA)疫苗可在以后生活中施用，例如在年龄是约6个月至约5岁或更年长时。
在一些实施方案中，受试者是年龄在约20岁与约50岁之间(例如约20、25、30、35、40、45或50岁)的年轻成人。
在一些实施方案中，受试者是约60岁、约70岁或更年长(例如约60、65、70、75、80、85或90岁)的年长受试者。
在一些实施方案中，受试者已暴露于流感病毒(例如沙眼衣原体(C.trachomatis))；受试者被流感病毒(例如沙眼衣原体)感染；或受试者处于被流感病毒(例如沙眼衣原体)感染的风险下。
在一些实施方案中，受试者是免疫损害的(具有受损免疫系统，例如患有免疫病症或自体免疫病症)。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗被化学修饰。在其他实施方案中，核酸疫苗未被修饰。
其他方面提供用于对受试者接种疫苗的组合物和对受试者接种疫苗的方法，其包括向所述受试者施用包含一种或多种具有编码第一病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定化元件，并且其中佐剂不与所述疫苗共同配制或共同施用。
在其他方面，本发明是用于对受试者接种疫苗的组合物或对受试者接种疫苗的方法，其包括向所述受试者施用包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中向所述受试者施用在10μg/kg与400μg/kg之间的剂量的所述核酸疫苗。在一些实施方案中，RNA多核苷酸的剂量是每剂1-5μg、5-10μg、10-15μg、15-20μg、10-25μg、20-25μg、20-50μg、30-50μg、40-50μg、40-60μg、60-80μg、60-100μg、50-100μg、80-120μg、40-120μg、40-150μg、50-150μg、50-200μg、80-200μg、100-200μg、120-250μg、150-250μg、180-280μg、200-300μg、50-300μg、80-300μg、100-300μg、40-300μg、50-350μg、100-350μg、200-350μg、300-350μg、320-400μg、40-380μg、40-100μg、100-400μg、200-400μg、或300-400μg。在一些实施方案中，通过真皮内或肌肉内注射来向受试者施用核酸疫苗。在一些实施方案中，在第0天向受试者施用核酸疫苗。在一些实施方案中，在第21天向受试者施用第二剂量的核酸疫苗。
在一些实施方案中，25微克的剂量的RNA多核苷酸被包括在向受试者施用的核酸疫苗中。在一些实施方案中，100微克的剂量的RNA多核苷酸被包括在向受试者施用的核酸疫苗中。在一些实施方案中，50微克的剂量的RNA多核苷酸被包括在向受试者施用的核酸疫苗中。在一些实施方案中，75微克的剂量的RNA多核苷酸被包括在向受试者施用的核酸疫苗中。在一些实施方案中，150微克的剂量的RNA多核苷酸被包括在向受试者施用的核酸疫苗中。在一些实施方案中，400微克的剂量的RNA多核苷酸被包括在向受试者施用的核酸疫苗中。在一些实施方案中，200微克的剂量的RNA多核苷酸被包括在向受试者施用的核酸疫苗中。在一些实施方案中，相较于远端淋巴结，RNA多核苷酸在100倍高的水平下积累在局部淋巴结中。在其他实施方案中，核酸疫苗被化学修饰，而在其他实施方案中，核酸疫苗未被化学修饰。
本发明的各个方面提供一种核酸疫苗，其包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定化元件，以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中佐剂不包括在所述疫苗中。在一些实施方案中，稳定化元件是组蛋白茎-环。在一些实施方案中，稳定化元件是相对于野生型序列，具有增加的GC含量的核酸序列。
本发明的各个方面提供包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸存在于用于在体内向宿主施用的制剂中，此对可接受百分比的人受试者赋予优于针对第一抗原的血清保护的准则的抗体效价。在一些实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的抗体效价是中和抗体效价。在一些实施方案中，中和抗体效价大于蛋白疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价大于佐剂化蛋白疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价是1,000-10,000、1,200-10,000、1,400-10,000、1,500-10,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,800-10,000、2000-10,000、2,000-5,000、2,000-3,000、2,000-4,000、3,000-5,000、3,000-4,000、或2,000-2,500。通常将中和效价表示为实现空斑数目降低50％所需的最高血清稀释度。
也提供包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸存在于制剂中，所述制剂用于在体内向宿主施用以引发比由具有稳定元件或与佐剂一起配制以及编码所述第一抗原性多肽的mRNA疫苗引发的抗体效价更长久持续的高抗体效价。在一些实施方案中，配制RNA多核苷酸以在单次施用的1周内产生中和抗体。在一些实施方案中，佐剂选自阳离子肽和免疫刺激性核酸。在一些实施方案中，阳离子肽是鱼精蛋白。
各个方面提供包含一种或多种具有包含至少一个化学修饰或任选不包含经修饰核苷酸的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中所述RNA多核苷酸存在于制剂中，所述制剂用于在体内向宿主施用以使所述宿主中的抗原表达的水平显著超过由具有稳定元件或与佐剂一起配制以及编码所述第一抗原性多肽的mRNA疫苗产生的抗原表达的水平。
其他方面提供包含一种或多种具有包含至少一个化学修饰或任选不包含经修饰核苷酸的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中相比于为未修饰mRNA疫苗产生相等抗体效价所需的RNA多核苷酸，所述疫苗具有的RNA多核苷酸是至少10倍少。在一些实施方案中，RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
本发明的各个方面也提供一种处于使用单位下的疫苗，其包含10ug与400ug之间的一种或多种具有包含至少一个化学修饰或任选不包含经修饰核苷酸的开放阅读框的RNA多核苷酸，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，以及药学上可接受的载体或赋形剂，被配制以向人受试者中递送。在一些实施方案中，疫苗进一步包含阳离子脂质纳米粒子。
本发明的各个方面提供在个体或个体群体中创建、维持或恢复对病毒株的抗原性记忆的方法，其包括向所述个体或群体施用抗原性记忆加强核酸疫苗，所述疫苗包含(a)至少一种RNA多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一个化学修饰或任选不包含经修饰核苷酸，以及两个或更多个密码子优化的开放阅读框，所述开放阅读框编码一组参照抗原性多肽，和(b)任选地，药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，通过选自由肌肉内施用、真皮内施用和皮下施用组成的组的途径来向个体施用疫苗。在一些实施方案中，施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适于注射组合物的装置接触。在一些实施方案中，施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适于与电穿孔组合注射组合物的装置接触。
本发明的各个方面提供对受试者接种疫苗的方法，其包括以有效对所述受试者接种疫苗的量向所述受试者施用25ug/kg与400ug/kg之间的单剂量的核酸疫苗，所述疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。
其他方面提供包含一种或多种具有包含至少一个化学修饰的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中相比于为未修饰mRNA疫苗产生相等抗体效价所需的RNA多核苷酸，所述疫苗具有的RNA多核苷酸是至少10倍少。在一些实施方案中，RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
其他方面提供包含LNP配制的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有不包含核苷酸修饰(未修饰)的开放阅读框，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中相比于为不在LNP中配制的未修饰mRNA疫苗产生相等抗体效价所需的RNA多核苷酸，所述疫苗具有的RNA多核苷酸是至少10倍少。在一些实施方案中，RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
实施例中呈现的数据证明使用本发明的制剂，免疫应答得以显著增强。根据本发明，化学修饰的RNA疫苗与未修饰RNA疫苗两者均适用。惊人的是，与先前技术报道优选的是使用在载体中配制的未化学修饰的mRNA来生产疫苗不同，本文描述相比于未修饰mRNA，化学修饰的mRNA-LNP疫苗需要低得多的有效mRNA剂量，即，当在除LNP以外的载体中配制时，有效mRNA剂量是未修饰mRNA的10倍少。相比于在不同脂质载体中配制的mRNA疫苗，本发明的化学修饰的RNA疫苗与未修饰RNA疫苗两者均产生更好免疫应答。
在其他方面，本发明涵盖一种治疗年龄是60岁或更年长的年长受试者的方法，其包括以有效对所述受试者接种疫苗的量向所述受试者施用核酸疫苗，所述疫苗包含一种或多种具有编码病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。
在其他方面，本发明涵盖一种治疗年龄是17岁或更年轻的年轻受试者的方法，其包括以有效对所述受试者接种疫苗的量向所述受试者施用核酸疫苗，所述疫苗包含一种或多种具有编码病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。
在其他方面，本发明涵盖一种治疗成年受试者的方法，其包括以有效对所述受试者接种疫苗的量向所述受试者施用核酸疫苗，所述疫苗包含一种或多种具有编码病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。
在一些方面，本发明是一种用组合疫苗对受试者接种疫苗的方法，所述组合疫苗包括至少两种编码抗原的核酸序列，其中所述疫苗的剂量是组合治疗剂量，其中编码抗原的每个单独核酸的剂量是亚治疗剂量。在一些实施方案中，组合剂量是向受试者施用的核酸疫苗中的25微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是向受试者施用的核酸疫苗中的100微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是向受试者施用的核酸疫苗中的50微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是向受试者施用的核酸疫苗中的75微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是向受试者施用的核酸疫苗中的150微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是向受试者施用的核酸疫苗中的400微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗原的每个单独核酸的亚治疗剂量是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微克。在其他实施方案中，核酸疫苗被化学修饰，而在其他实施方案中，核酸疫苗的核苷酸未被修饰。
RNA多核苷酸是SEQ ID NO：447-457、459、461和491-503中的一者，并且包括至少一个化学修饰。在其他实施方案中，RNA多核苷酸是SEQ ID NO：447-457、459、461和491-503中的一者，并且不包括任何核苷酸修饰，或是未修饰的。在其他实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码具有SEQ ID NO：1-444、458、460和462-479中的任一者的抗原性蛋白质，并且包括至少一个化学修饰。在其他实施方案中，RNA多核苷酸编码具有SEQ ID NO：1-444、458、460和462-479中的任一者的抗原性蛋白质，并且不包括任何核苷酸修饰，或是未修饰的。
在优选方面，本发明的疫苗(例如LNP囊封的mRNA疫苗)产生抗原特异性抗体在接种疫苗的受试者的血液或血清中的防治有效和/或治疗有效水平、浓度和/或效价。如本文所定义，术语抗体效价是指在例如人受试者的受试者中产生的抗原特异性抗体的量。在示例性实施方案中，将抗体效价表示为仍然产生阳性结果的最大稀释度(在连续稀释中)的倒数。在示例性实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定或测量抗体效价。在示例性实施方案中，通过中和测定，例如通过微量中和测定来测定或测量抗体效价。在某些方面，将抗体效价测量结果表示为比率，诸如1∶40、1∶100等。
在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生大于1∶40、大于1∶100、大于1∶400、大于1∶1000、大于1∶2000、大于1∶3000、大于1∶4000、大于1∶500、大于1∶6000、大于1∶7500、大于1∶10000的抗体效价。在示例性实施方案中，截至疫苗接种之后10天，截至疫苗接种之后20天，截至疫苗接种之后30天，截至疫苗接种之后40天，或截至疫苗接种之后50天或更多天，产生或达到抗体效价。在示例性实施方案中，在向受试者施用的单剂量的疫苗之后，产生或达到效价。在其他实施方案中，在多次剂量之后，例如在第一剂量和第二剂量(例如加强剂量)之后，产生或达到效价。
在本发明的示例性方面，抗原特异性抗体以μg/ml的单位计量，或以IU/L(每升对应的国际单位)或mIU/ml(每毫升对应的毫国际单位)的单位计量。在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生＞0.5μg/ml、＞0.1μg/ml、＞0.2μg/ml、＞0.35μg/ml、＞0.5μg/ml、＞1μg/ml、＞2μg/ml、＞5μg/ml或＞10μg/ml。在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生＞10mIU/ml、＞20mIU/ml、＞50mIU/ml、＞100mIU/ml、＞200mIU/ml、＞500mIU/ml或＞1000mIU/ml。在示例性实施方案中，截至疫苗接种之后10天，截至疫苗接种之后20天，截至疫苗接种之后30天，截至疫苗接种之后40天，或截至疫苗接种之后50天或更多天，产生或达到抗体水平或浓度。在示例性实施方案中，在向受试者施用的单剂量的疫苗之后，产生或达到水平或浓度。在其他实施方案中，在多次剂量之后，例如在第一剂量和第二剂量(例如加强剂量)之后，产生或达到水平或浓度。在示例性实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定或测量抗体水平或浓度。在示例性实施方案中，通过中和测定，例如通过微量中和测定来测定或测量抗体水平或浓度。
本公开的各种实施方案的细节阐述于以下描述中。本公开的其他特征、目标和优势将根据描述和权利要求而显而易知。
附图简述
先前以及其他目标、特征和优势将根据对本发明的特定实施方案的以下描述而显而易知，如附图中所说明，其中遍及不同视图，同样的参考记号是指相同部分。附图未必将依照比例，而是将重点放在说明本发明的各种实施方案的原理上。
图1显示从ELISA获得的数据，其证明用编码来自不同病毒株的HA主干蛋白序列的RNA进行疫苗接种诱导结合至一组不同重组HA(rHA)的血清抗体。
图2显示证明从用第二组mRNA疫苗抗原接种疫苗的小鼠获得的血清抗体效价诱导结合至一组不同重组HA(rHA)蛋白的血清抗体的数据。
图3显示使编码来自H1病毒株的HA主干蛋白的mRNA与编码来自H3病毒株的HA主干蛋白的mRNA组合不导致干扰对任一HA的免疫应答。
图4A-4B描绘从用测试疫苗接种疫苗的动物汇集的血清的终点效价。在图4A中，测试疫苗显示在x轴上，并且将与来自各不同流感病毒株的HA的结合至绘制成终点效价。在图4B中，测试疫苗显示在x轴上，并且绘制针对NP蛋白的终点效价。
图5显示通过评估血清中和一组HA假型病毒的能力来对功能性抗体应答的考查。
图6显示绘制成诱导倍数(样品发光/本底发光)相对于血清浓度的数据。
图7是对在mRNA疫苗接种之后细胞介导的免疫应答的表示。从疫苗接种小鼠收集脾细胞，并且用重叠NP肽的汇集物刺激。绘制分泌三种细胞因子(IFN-γ、IL-2或TNF-α)中的一者的CD4或CD8 T细胞的％。
图8是对在mRNA疫苗接种之后细胞介导的免疫应答的表示。从疫苗接种小鼠收集脾细胞，并且用重叠HA肽的汇集物刺激。绘制分泌三种细胞因子(IFN-γ、IL-2或TNF-α)中的一者的CD4或CD8 T细胞的％。
图9显示在用致死剂量的小鼠适应的H1N1 A/波多黎各/8/1934激发之后的鼠重量减轻。计算各动物的相较于基线的重量减少百分比，并且在组内进行平均化。随以天数计的时间绘制组平均值。误差棒代表平均值标准误差。NIHGen6HASS-折叠子+NP组合疫苗的功效好于单独NIHGen6HASS-折叠子或NP mRNA疫苗的功效。
图10显示在所有疫苗剂量下，以及在评估的所有共同配制和共同递送方法的情况下，疫苗功效都类似。在用致死剂量的小鼠适应的H1N1 A/波多黎各/8/1934激发之后，计算各动物的相较于基线的重量减少百分比，并且在组内进行平均化。随以天数计的时间绘制组平均值。误差棒代表平均值标准误差。
图11A描绘从用测试疫苗接种疫苗的动物汇集的血清的终点效价。图11B显示测试疫苗(NIHGen6HASS-折叠子和NIHGen6HASS-TM2)的功效类似。在用致死剂量的小鼠适应的H1N1 A/波多黎各/8/1934激发之后，计算相较于基线的组重量减少百分比，并且随以天数计的时间进行绘制。
图12A显示来自用编码来自H1亚型的共有HA抗原的mRNA免疫的小鼠的血清能够可检测地中和PR8荧光素酶病毒。图12B显示来自用编码H1亚型共有HA抗原以及铁蛋白融合序列的mRNA免疫的小鼠的血清能够可检测地中和PR8荧光素酶病毒，例外之处是Merck_pH1_Con_铁蛋白mRNA，而来自用编码共有H3抗原以及铁蛋白融合序列的mRNA接种疫苗的小鼠的血清不能中和PR8荧光素酶病毒。
图13A-13B显示在用致死剂量的小鼠适应的H1N1 A/波多黎各/8/1934激发之后的鼠重量减轻。计算相较于基线的组重量减少百分比，并且随以天数计的时间进行绘制。
图14显示对一组假病毒进行以评估由共有HA抗原引发的血清中和活性的广度的中和测定的结果。
图15A描绘从用测试疫苗接种疫苗的动物汇集的血清的ELISA终点抗HA抗体效价。图15B显示在用致死剂量的小鼠适应的B/安娜堡/1954激发之后的鼠重量减轻。计算相较于基线的组重量减少百分比，并且随以天数计的时间进行绘制。图16A-16C显示描绘NIHGen6HASS-折叠子疫苗的稳健抗体应答的数据，所述抗体应答如通过ELISA测定(将板用重组表达的NIHGen6HASS-折叠子[HA主干]或NP蛋白涂布)所测量。图16A显示先前用接种疫苗以及用NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗进行单次加强的4只恒河猴随时间的针对HA主干的效价。图16B描绘来自在第0、28和56天用相同NIHGen6HASS-折叠子RNA疫苗接种疫苗的4只恒河猴的随时间的针对HA主干的效价。图16C说明在第0、28和56天用NP mRNA疫苗接种疫苗的4只恒河猴随时间的针对NP的抗体效价，并且显示疫苗引发对NP的稳健抗体应答。
图17A-17B显示考查能够结合至来自广泛多种流感病毒株的重组血凝素(rHA)的抗体的存在的ELISA的结果。图17A显示先前用接种疫苗以及用NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗进行单次加强的恒河猴的结果，并且图17B显示在第0、28和56天用相同NIHGen6HASS-折叠子RNA疫苗接种疫苗的原初恒河猴的结果。
图18是对在mRNA疫苗接种之后细胞介导的免疫应答的表示。从疫苗接种猕猴收集外周血液单核细胞，并且用重叠NP肽的汇集物刺激。绘制分泌三种细胞因子(IFN-γ、IL-2或TNF-α)中的一者的CD4或CD8 T细胞的％。
图19显示血凝集抑制(HAI)测试的结果。包括安慰剂受试者(以各组的25％为目标)。根据方案显示数据，并且排除未接受第22天注射的那些。
图20显示每个受试者的HAI测试动力学，包括安慰剂受试者(以各组的25％为目标)。
图21显示微量中和(MN)测试的结果，包括安慰剂受试者(以各组的25％为目标)。根据方案显示数据，并且排除未接受第22天注射的那些。
图22显示每个受试者的MN测试动力学，包括安慰剂受试者(以各组的25％为目标)。
图23是描绘HAI与MN之间的极其强烈关联的图。数据包括安慰剂受试者(以各组的25％为目标)。
详细描述
本公开的实施方案提供包括编码流感病毒抗原的多核苷酸的RNA(例如mRNA)疫苗。如本文提供的流感病毒RNA疫苗可用于诱导平衡免疫应答，其包括细胞免疫性与体液免疫性两者，而无与DNA疫苗接种相关的许多风险。
在一些实施方案中，病毒是甲型流感病毒株或乙型流感病毒株或其组合。在一些实施方案中，甲型流感病毒株或乙型流感病毒株与禽、猪、马、狗、人或非人灵长类动物相关。在一些实施方案中，抗原性多肽编码血凝素蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方案中，血凝素蛋白是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其免疫原性片段。在一些实施方案中，血凝素蛋白不包含头部结构域。在一些实施方案中，血凝素蛋白包含头部结构域的一部分。在一些实施方案中，血凝素蛋白不包含细胞质结构域。在一些实施方案中，血凝素蛋白包含细胞质结构域的一部分。在一些实施方案中，截短血凝素蛋白包含跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，血凝素蛋白或其片段的氨基酸序列包含与具有由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)的氨基酸序列中的任一者的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％或99％同一性。在一些实施方案中，病毒选自由H1N1、H3N2、H7N9和H10N8组成的组。在一些实施方案中，抗原性多肽选自具有由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)的那些蛋白质或其免疫原性片段。
一些实施方案提供流感疫苗，其包含在阳离子脂质纳米粒子内配制的一种或多种具有编码血凝素蛋白的开放阅读框的RNA多核苷酸以及药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，血凝素蛋白选自H1、H7和H10。在一些实施方案中，RNA多核苷酸进一步编码神经氨酸酶蛋白。在一些实施方案中，血凝素蛋白源于甲型流感病毒株或乙型流感病毒株或其组合。在一些实施方案中，流感病毒选自H1N1、H3N2、H7N9和H10N8。
一些实施方案提供预防或治疗流感病毒性感染的方法，其包括向受试者施用任何本文所述的疫苗。在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答。在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括B细胞应答。在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答与B细胞应答两者。在一些实施方案中，产生抗原特异性免疫应答的方法涉及单次施用疫苗。在一些实施方案中，通过真皮内、肌肉内注射、皮下注射、鼻内接种或口服施用来向受试者施用疫苗。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)多核苷酸或其部分可编码流感病毒株的一种或多种多肽或其片段作为抗原。所述抗原包括但不限于由本文呈现的表中所列的多核苷酸或其部分编码的那些抗原。在表中，GenBank登录号或GI登录号代表所编码抗原的完全或部分CDS。RNA(例如mRNA)多核苷酸可包含具有表中所列的任何序列的区域或所列mRNA的整个编码区。它们可包含杂合区域或嵌合区域、或模拟物或变体。
在以下实施方案中，当提及至少一种具有编码特定流感病毒蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸时，多核苷酸可包含所述特定流感病毒蛋白序列的编码区或那个特定流感病毒蛋白序列的mRNA的整个编码区。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1-H18的至少一种HA1、HA2或两者组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1-H18的至少一种HA1、HA2或两者组合)以及至少一种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1-H18中的至少一者)以及至少两种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1-H18中的至少一者)以及至少三种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1-H18中的至少一者)以及至少四种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1-H18中的至少一者)以及至少五种选自NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段(例如H1-H18中的至少一者)、NP蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段、M2蛋白或其免疫原性片段、NS1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段和NA蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白和NA蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白、NP蛋白或其免疫原性片段和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白、M1蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、M2蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、M2蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白或其免疫原性片段、NS1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段和NA蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HAl蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和NA蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NP蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、M2蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、M2蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA1蛋白或其免疫原性片段、NS1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)和NA蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)和NS1蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NP蛋白或其免疫原性片段和NA蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NP蛋白或其免疫原性片段和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NP蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NP蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NP蛋白和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NA蛋白或其免疫原性片段和M1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NA蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NA蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NA蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、M1蛋白或其免疫原性片段和M2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、M1蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、M1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、M2蛋白或其免疫原性片段和NS1蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的H HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、M2蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从流感病毒获得的HA蛋白(HA或其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列的衍生物)、NS1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
应了解本公开不意图受限于特定流感病毒株。如本文提供的所用流感病毒株可为任何流感病毒株。优选流感病毒株和优选流感抗原的实例提供于下表7-13中。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H1/波多黎各/8/1934获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H1/新喀里多尼亚(NewCaledonia)/20/1999获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H1/加利福尼亚/04/2009获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H5/越南/1194/2004获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H2/日本(Japan)/305/1957获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H9/香港/1073/99获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H3/爱知(Aichi)/2/1968获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H3/布里斯班(Brisbane)/10/2007获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H7/安徽/1/2013获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H10/江西-东湖(Jiangxi-Donghu)/346/2013获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H3/威斯康星/67/2005获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码从H1/越南/850/2009获得的流感抗原性多肽(例如HA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、任何先前流感抗原的免疫原性片段、任何先前流感抗原的变体或同源物、或两种或更多种先前流感抗原、变体或同源物的任何组合)的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码流感H7N9 HA1蛋白、铁蛋白和树突细胞靶向肽的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸(参见例如Ren X等Emerg InfectDis 2013；19(11)：1881-84；Steel J等mBio 2010；1(1)：e00018-10；Kanekiyo M.等Nature2013；499：102-6，其各自以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码禽流感H7 HA蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码流感H7 HA1蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸(参见例如Steel J等mBio 2010；1(1)：e00018-10)。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码流感H7N9 HA1蛋白和铁蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸(参见例如Kanekiyo M.等Nature 2013；499：102-6)。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码流感H5N1蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，流感H5N1蛋白来自人病毒株。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码流感H1N1蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码来自甲型流感病毒株诸如人H1N1、H5N1、H9N2或H3N2的流感蛋白的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码具有纳米主链的流感H1N1 HA的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸(参见例如Walker A等Sci Rep 2011：1(5)：1-8，其以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种具有编码无糖基化流感H1N1 HA的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸(参见例如Chen J等PNAS USA 2014；111(7)：2476-81，其以引用的方式并入本文)。
流感疫苗可包含例如至少一种具有编码至少一种选自本文提供的流感HA2主干抗原的流感HA2主干抗原的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，本文提供的流感HA2主干抗原例如是表16中所列的包含由SEQ ID NO：394-412中的任一者标识的氨基酸序列的那些。
本公开也涵盖一种流感疫苗，其包含例如至少一种具有选自SEQ ID NO：491-503中所列的流感序列的核酸序列的RNA(例如mRNA)多核苷酸(也参见：Mallajosyula VV等，Front Immunol.2015年6月26日；6：329.；Mallajosyula VV等，Proc Natl Acad Sci U SA.2014年6月24日；111(25)：E2514-23.；Bommakanti G等，J Virol.2012年12月；86(24)：13434-44；Bommakanti G等，Proc Natl Acad Sci U S A.2010年8月3日；107(31)：13701-6以及Yassine等，Nat Med.2015年9月；21(9)：1065-70；Impagliazzo等，Science，2015年9月18日；349(6254))。
国际申请号PCT/US2015/02740的整个内容以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的疫苗是共有序列。如本文所用的“共有序列”是指基于对特定流感抗原的多种亚型的比对分析的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的mRNA序列，并且用于诱导针对特定流感抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫性。
可将编码本文提供的流感抗原的mRNA设置成在接种疫苗的哺乳动物中导致血清转换，并且提供针对广泛范围的季节性流感病毒株以及大流行性流感病毒株的交叉反应性的疫苗。可通过测量针对不同血凝素流感病毒株的抑制效价来测定血清转换和广泛交叉反应性。优选组合包括至少两种来自本文所述的各流感抗原的抗原。
已发现本文所述的mRNA疫苗在若干方面优于当前疫苗。首先，脂质纳米粒子(LNP)递送优于其他制剂，包括文献中所述的基于鱼精蛋白的方法，并且额外佐剂将不是必要的。使用LNP使得能够有效递送化学修饰的mRNA疫苗或未修饰mRNA疫苗。另外，本文已证明经修饰LNP配制mRNA疫苗与未修饰LNP配制mRNA疫苗两者均以显著程度优于常规疫苗。在一些实施方案中，本发明的mRNA疫苗在优越性方面是常规疫苗的至少10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1,000倍。
尽管已试图产生功能性RNA疫苗，包括mRNA疫苗和自我复制性RNA疫苗，但这些RNA疫苗的治疗功效尚未被充分确定。十分惊人的是，根据本发明的各个方面，本发明者已发现一类用于在体内递送mRNA疫苗的制剂，其导致显著增强以及在许多方面具有协同作用的免疫应答，包括增强的抗原产生和具有中和能力的功能性抗体产生。即使当相较于在其他类别的基于脂质的制剂的情况下使用的mRNA剂量，施用显著更低剂量的mRNA时，也可实现这些结果。本发明的制剂已显示足以确定功能性mRNA疫苗作为防治剂和治疗剂的功效的显著出乎意料的体内免疫应答。另外，自我复制性RNA疫苗依赖于病毒复制路径来将足够RNA递送至细胞以产生免疫原性应答。本发明的制剂不需要病毒复制来产生足够蛋白质以导致强烈免疫应答。因此，本发明的mRNA不是自我复制性RNA，并且不包括为病毒复制所必需的组分。
在一些方面，本发明涉及脂质纳米粒子(LNP)制剂使包括化学修饰的mRNA疫苗和未修饰mRNA疫苗的mRNA疫苗的有效性显著增强的惊人发现。使用若干不同抗原，在体内考查在LNP中配制的mRNA疫苗的功效。本文呈现的结果证明在LNP中配制的mRNA疫苗超过其他可商购获得的疫苗而具有出乎意料的优越功效。
除提供增强的免疫应答之外，相比于其他测试疫苗，本发明的制剂也以更少剂量的抗原产生更快速免疫应答。相比于在不同载体中配制的疫苗，本发明的mRNA-LNP制剂也产生就定量和定性来说更好的免疫应答。
本文所述的数据证明本发明的制剂超过现有抗原疫苗而产生显著出乎意料的改进。另外，即使当mRNA的剂量低于其他疫苗时，本发明的mRNA-LNP制剂也优于其他疫苗。已证明编码来自不同病毒株的HA蛋白序列诸如HA主干序列的mRNA会诱导结合至一组不同重组HA(rHA)蛋白的血清抗体。在所有疫苗剂量下，以及在评估的所有共同配制和共同递送方法的情况下，疫苗在小鼠中的功效都类似。
本文所述的研究中使用的LNP先前已用于在各种动物模型中以及在人中递送siRNA。鉴于与用LNP制剂递送siRNA关联所进行的观察，LNP适用于疫苗中的事实是十分惊人的。已观察到治疗性递送在LNP中配制的siRNA导致与短暂IgM应答相关的不合需要的炎症性应答，从而通常导致抗原产生降低和免疫应答受损害。与用siRNA观察的研究结果不同，本文证明本发明的LNP-mRNA制剂会产生对于防治方法和治疗方法足够的增强IgG水平，而非短暂IgM应答。
核酸/多核苷酸
如本文提供的流感病毒疫苗包含至少一种具有编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框的(一种或多种)核糖核酸(RNA)(例如mRNA)多核苷酸。术语“核酸”包括包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物被称为多核苷酸。因此，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。
核酸可为或可包括例如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)、亚乙基核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或其嵌合体或组合。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸充当信使RNA(mRNA)。“信使RNA”(mRNA)是指编码(至少一种)多肽(天然存在的、非天然存在的或经修饰氨基酸聚合物)，并且可在体外、在体内、原位或离体被翻译以产生所编码多肽的任何多核苷酸。熟练技术人员将了解，除当另外指示时之外，本申请中阐述的多核苷酸序列将在代表性DNA序列中叙述“T”，但当序列代表RNA(例如mRNA)时，“T”将被替换成“U”。因此，由用特定序列标识号标识的DNA编码的任何RNA多核苷酸都也可包括由所述DNA编码的相应RNA(例如mRNA)序列，其中DNA序列的各“T”用“U”替换。
mRNA分子的基本组分通常包括至少一个编码区、5′非翻译区(UTR)、3′UTR、5′帽和聚腺苷酸尾部。本公开的多核苷酸可充当mRNA，但可在它们的功能性和/或结构性设计特征方面区别于野生型mRNA，所述特征用于克服使用基于核酸的治疗剂进行有效多肽表达的现有问题。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗的RNA多核苷酸编码2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10种抗原性多肽。在一些实施方案中，流感疫苗的RNA(例如mRNA)多核苷酸编码至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种抗原性多肽。在一些实施方案中，流感疫苗的RNA(例如mRNA)多核苷酸编码至少100或至少200种抗原性多肽。在一些实施方案中，流感疫苗的RNA多核苷酸编码1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35、30-40、35-45、40-50、1-50、1-100、2-50或2-100种抗原性多肽。
在一些实施方案中，对本公开的多核苷酸进行密码子优化。密码子优化方法在本领域中是已知的，并且可如本文所提供加以使用。在一些实施方案中，密码子优化可用于使靶标中的密码子频率和宿主生物体匹配以确保适当折叠；偏重GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基延伸最少；定制转录和翻译控制区；插入或移除蛋白质移行序列；在所编码蛋白质中移除/添加翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加、移除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制位点；修饰核糖体结合至位点和mRNA降解位点；调整翻译速率以使蛋白质的各种结构域适当折叠；或减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务在本领域中是已知的-非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)的服务、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专有方法。在一些实施方案中，使用最优化算法使开放阅读框(ORF)序列最优化。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如编码目标多肽或蛋白质(例如抗原性蛋白质或抗原性多肽)的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于95％序列同一性、小于90％序列同一性、小于85％序列同一性、小于80％序列同一性或小于75％序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如编码目标多肽或蛋白质(例如抗原性蛋白质或多肽)的天然存在的或野生型mRNA序列)共有65％与85％之间(例如约67％与约85％之间、或约67％与约80％之间)序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如编码目标多肽或蛋白质(例如抗原性蛋白质或多肽)的天然存在的或野生型mRNA序列)共有65％与75％之间或约80％序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA(例如mRNA)可例如是其中G/C的水平得以增强的RNA。核酸分子的G/C含量可影响RNA的稳定性。相比于含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的核酸，具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA可在功能上更稳定。WO02/098443公开一种含有通过翻译区中的序列修饰加以稳定的mRNA的药物组合物。归因于遗传密码的简并性，修饰通过将现有密码子替换成促进更大RNA稳定性而不改变所得氨基酸的那些来起作用。方法限于RNA的编码区。
抗原/抗原性多肽
在一些实施方案中，抗原性多肽(例如至少一种流感抗原性多肽)长于25个氨基酸，并且短于50个氨基酸。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述各物的其他等效物、变体和类似物。多肽可为单分子或可为多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。多肽也可包括单链多肽或多链多肽，诸如抗体或胰岛素，并且可彼此缔合或连接。最通常地，二硫键见于多链多肽中。术语“多肽”也可适用于氨基酸聚合物，其中至少一个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
“多肽变体”是相对于天然序列或参照序列在它的氨基酸序列方面不同的分子。相较于天然序列或参照序列，氨基酸序列变体可在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失、插入或前述各物中的任何两者或三者的组合。通常，变体与天然序列或参照序列具有至少50％同一性。在一些实施方案中，变体与天然序列或参照序列共有至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，提供“变异模拟物”。“变异模拟物”含有至少一个将模拟活化序列的氨基酸。举例来说，谷氨酸可充当磷酸苏氨酸和/或磷酸丝氨酸的模拟物。或者，变异模拟物可导致去活化，或导致含有所述模拟物的产物失活。举例来说，苯丙氨酸可充当酪氨酸的失活性替代物，或丙氨酸可充当丝氨酸的失活性替代物。
“直系同源物”是指不同物种中通过物种形成而从共同祖先基因进化的基因。通常，直系同源物在进化的过程中保留相同功能。鉴定直系同源物对于可靠预测新测序基因组中的基因功能是重要的。
“类似物”意图包括仍然维持亲本或起始多肽的一种或多种性质，差异在于具有一个或多个氨基酸改变例如氨基酸残基的取代、添加或缺失的多肽变体。
本公开提供基于多核苷酸或多肽的若干类型的组合物，包括变体和衍生物。这些包括例如取代性、插入性、缺失和共价变体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变体”同义，并且通常是指相对于参照分子或起始分子，已以任何方式修饰和/或变化的分子。
因此，在本公开的范围内包括编码相对于参照序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽特别是本文公开的多肽序列的多核苷酸。举例来说，可将序列标签或氨基酸诸如一个或多个赖氨酸添加至肽序列中(例如在N末端或C末端处)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于使肽溶解性增加或允许达成生物素化。或者，可任选使位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域处的氨基酸残基缺失，从而提供截短序列。或者，视序列的用途而定，可使某些氨基酸(例如C末端残基或N末端残基)缺失，所述用途如例如所述序列作为可溶性或附接至固体载体的较大序列的一部分进行表达。
“取代性变体”在涉及多肽时是天然或起始序列中至少一个氨基酸残基被移除，并且不同氨基酸在相同位置被插入它的地点中的那些。取代可为单一的，其中分子中仅一个氨基酸已被取代，或它们可为多重的，其中同一分子中的两个或更多个(例如3、4或5个)氨基酸已被取代。
如本文所用，术语“保守性氨基酸取代”是指用具有类似尺寸、电荷或极性的不同氨基酸取代通常存在于序列中的氨基酸。保守性取代的实例包括将非极性(疏水性)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代成另一非极性残基。同样，保守性取代的实例包括将一个极性(亲水性)残基取代成另一残基，诸如在精氨酸与赖氨酸之间，在谷氨酰胺与天冬酰胺之间，以及在甘氨酸与丝氨酸之间。另外，将碱性残基诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代成另一残基，或将一个酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸取代成另一酸性残基是保守性取代的额外实例。非保守性取代的实例包括将非极性(疏水性)氨基酸残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸取代成极性(亲水性)残基诸如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸，和/或将极性残基取代成非极性残基。
“特征”在涉及多肽或多核苷酸时分别定义为分子的基于氨基酸序列或基于核苷酸的不同组分。由多核苷酸编码的多肽的特征包括表面表现形式、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端及其任何组合。
如本文所用，当涉及多肽时，术语“结构域”是指多肽的具有一种或多种可鉴定结构或功能特征或性质(例如结合能力、充当蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的基序。
如本文所用，当涉及多肽时，术语“位点”在它涉及基于氨基酸的实施方案时与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。如本文所用，当涉及多核苷酸时，术语“位点”在它涉及基于核苷酸的实施方案时与“核苷酸”同义使用。位点代表肽或多肽或多核苷酸内的可在基于多肽或基于多核苷酸的分子内被修饰、操作、改变、衍生或变化的位置。
如本文所用，术语“末端(termini/terminus)”在涉及多肽或多核苷酸时分别是指多肽或多核苷酸的尽头。所述尽头不仅仅限于多肽或多核苷酸的第一位点或最终位点，而是可包括在末端区域中的额外氨基酸或核苷酸。基于多肽的分子可被表征为具有N末端(由具有游离氨基(NH2)的氨基酸封端)与C末端(由具有游离羧基(COOH)的氨基酸封端)两者。在一些情况下，蛋白质由以二硫键或以非共价力集合的多个多肽链组成(多聚体、寡聚物)。这些蛋白质具有多个N末端和C末端。或者，可修饰多肽的末端以使它们视情况而定以基于非多肽的部分诸如有机缀合物开始或结束。
如由本领域技术人员所认识到，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源性蛋白质也被视为在目标多肽的范围内。举例来说，本文提供长度是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或长于100个氨基酸的参照蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参照多肽序列短至少一个氨基酸残基，但另外同一的多肽序列)。在另一实例中，可根据本公开来利用包括具有与任何本文所述的序列40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％同一的20、30、40、50或100个(连续)氨基酸的链段的任何蛋白质。在一些实施方案中，多肽包括如任何本文提供或本文参照的序列中所示的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变。在另一实例中，可根据本公开来利用包括具有与任何本文所述的序列大于80％、90％、95％或100％同一的20、30、40、50或100个氨基酸的链段的任何蛋白质，其中所述蛋白质具有以下链段：所述链段具有与任何本文所述的序列小于80％、75％、70％、65％至60％同一的5、10、15、20、25或30个氨基酸。
本公开的多肽或多核苷酸分子可与参照分子(例如参照多肽或参照多核苷酸)，例如与本领域所述的分子(例如工程化或设计的分子或野生型分子)共有某一程度的序列类似性或同一性。如本领域中已知的术语“同一性”是指两个或更多个多肽或多核苷酸的序列之间的关系，如通过将序列进行比较所确定。在本领域中，同一性也意指两个序列之间的序列相关性程度，如通过具有两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串段之间的匹配的数目所确定。同一性衡量两个或更多个序列之间相对于较小序列的同一匹配百分比，其中采用通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)处理的空位比对(如果有的话)。相关肽的同一性可易于通过已知方法来计算。“同一性％”在它适用于多肽或多核苷酸序列时定义为在将序列对准以及必要时引入空位以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基同一的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是熟知的。同一性取决于对同一性百分比的计算，但可由于在计算中引入的空位和罚分而在数值方面不同。通常，特定多核苷酸或多肽的变体与那个特定参照多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％序列同一性，如通过本文所述以及为本领域技术人员所知的序列比对程序和参数所确定。所述比对工具包括BLAST套件的那些(Stephen F.Altschul等(1997).″Gapped BLASTand PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs，″NucleicAcids Res.25：3389-3402)。另一普及局部比对技术基于Smith-Waterman算法(Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147：195-197)。一种基于动态规划的一般性整体比对技术是Needleman-Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)“A general method applicable tothe search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.”J.Mol.Biol.48：443-453)。更新近地，开发了快速最优整体序列比对算法(Fast OptimalGlobal Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA)，其据称比包括Needleman-Wunsch算法的其他最优整体比对方法更快产生对核苷酸和蛋白质序列的整体比对。本文描述其他工具，具体来说，在以下对“同一性”定义时描述。
如本文所用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。共有通过比对匹配残基来确定的阈值水平的类似性或同一性的聚合分子(例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子)被称为同源。同源性是描述分子之间的关系的定性术语，并且可基于定量类似性或同一性。类似性或同一性是确定两个所比较序列之间的序列匹配程度的定量术语。在一些实施方案中，如果聚合分子序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一或类似，那么它们被视为彼此“同源”。术语“同源”必须是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。如果两个多核苷酸序列编码的多肽就至少一个具有至少20个氨基酸的链段来说至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％同一，那么它们被视为同源。在一些实施方案中，同源性多核苷酸序列的特征在于能够编码具有至少4-5个独特指定的氨基酸的链段。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性通过编码具有至少4-5个独特指定的氨基酸的链段的能力来确定。如果两个蛋白质就至少一个具有至少20个氨基酸的链段来说至少50％、60％、70％、80％或90％同一，那么所述两个蛋白质序列被视为同源。
同源性暗示所比较序列在进化中从共同来源分散。术语“同源物”是指由于从共同祖先序列遗传而与第二氨基酸序列或核酸序列相关的第一氨基酸序列或核酸序列(例如基因(DNA或RNA)或蛋白质序列)。术语“同源物”可适用于通过物种形成事件而分开的基因和/或蛋白质之间的关系，或适用于通过遗传重复事件而分开的基因和/或蛋白质之间的关系。“直系同源物”是不同物种中通过物种形成而从共同祖先基因(或蛋白质)进化的基因(或蛋白质)。通常，直系同源物在进化的过程中保留相同功能。“旁系同源物”是由于基因组内的重复而相关的基因(或蛋白质)。直系同源物在进化的过程中保留相同功能，而旁系同源物进化出新功能，即使这些功能与原始功能相关。
术语“同一性”是指聚合分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。对两个多核酸序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最优比较目的将两个序列对准来进行(例如可在第一核酸序列和第二核酸序列中的一者或两者中引入空位以达成最优比对，并且可出于比较目的而忽视非同一序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而对准的序列的长度是参照序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。接着比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，那么分子在那个位置处是同一的。两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要被引入以达成两个序列的最优比对的空位的数目和各空位的长度的情况下，由序列共有的同一位置的数目的函数。可使用数学算法来实现序列比较以及确定两个序列之间的同一性百分比。举例来说，两个核酸序列之间的同一性百分比可使用诸如以下中所述的那些方法的方法确定：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编，Academic Press，New York，1993；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey，1994；以及SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M Stockton Press，New York，1991；其各自以引用的方式并入本文。举例来说，可使用Meyers和Miller(CABIOS，1989，4：11-17)的算法来确定两个核酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。两个核酸序列之间的同一性百分比可或者使用GCG软件包中的GAP程序，在利用NWSgapdna.CMP矩阵下确定。通常用于确定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM JApplied Math.，48：1073(1988)中公开的那些；所述文献以引用的方式并入本文。用于确定同一性的技术被编纂在可公开获得的计算机程序中。用以确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12，387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215，403(1990))。
多蛋白和多组分疫苗
本公开涵盖包含各自编码单一抗原性多肽的多种RNA(例如mRNA)多核苷酸的流感疫苗，以及包含编码超过一种抗原性多肽(例如呈融合多肽形式)的单一RNA多核苷酸的流感疫苗。因此，包含具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸和具有编码第二抗原性多肽的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸的疫苗组合物涵盖(a)包含编码第一抗原性多肽的第一RNA多核苷酸和编码第二抗原性多肽的第二RNA多核苷酸的疫苗，和(b)包含编码第一抗原性多肽和第二抗原性多肽(例如呈融合多肽形式)的单一RNA多核苷酸的疫苗。在一些实施方案中，本公开的RNA(例如mRNA)疫苗包含2-10(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10)种或更多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，其各自编码不同抗原性多肽(或单一RNA多核苷酸编码2-10种或更多种不同抗原性多肽)。抗原性多肽可选自任何本文所述的流感抗原性多肽。
在一些实施方案中，多组分疫苗包含至少一种编码至少一种融合于信号肽的流感抗原性多肽(例如SEQ ID NO：488-490)的RNA(例如mRNA)多核苷酸。可使信号肽融合在抗原性多肽的N末端或C末端。
信号肽
在一些实施方案中，由流感RNA(例如mRNA)多核苷酸编码的抗原性多肽包含信号肽。包含蛋白质的N末端15-60个氨基酸的信号肽通常为跨越分泌路径上的膜进行易位所需，并且因此，普遍控制真核生物与原核生物两者中的大多数蛋白质向分泌路径中的进入。信号肽通常包括三个区域：具有不同长度的N末端区域，其通常包含带正电荷氨基酸；疏水性区域；和羧基末端短肽区域。在真核生物中，初生前体蛋白质(前蛋白质)的信号肽引导核糖体到达粗糙内质网(ER)膜，并且引发增长中的肽链跨越它进行转运以进行加工。ER加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常由宿主细胞的ER驻留性信号肽酶从前体蛋白质裂解，或它们保持未裂解，并且充当膜锚。信号肽也可有助于蛋白质靶向细胞膜。然而，信号肽不负责成熟蛋白质的最终目的地。在它们的序列中缺少额外地址标签的分泌蛋白质被默认地分泌至外部环境中。在近些年期间，已发展出一种更先进的信号肽见解，其显示某些信号肽的功能和免疫显性比先前预期要更加多变。
本公开的流感疫苗可包含例如编码人工信号肽的RNA(例如mRNA)多核苷酸，其中所述信号肽编码序列可操作地附接至抗原性多肽的编码序列，并且与所述编码序列同框。因此，在一些实施方案中，本公开的流感疫苗产生融合于信号肽的抗原性多肽。在一些实施方案中，使信号肽融合于抗原性多肽的N末端。在一些实施方案中，使信号肽融合于抗原性多肽的C末端。
在一些实施方案中，融合于抗原性多肽的信号肽是人工信号肽。在一些实施方案中，融合于由RNA(例如mRNA)疫苗编码的抗原性多肽的人工信号肽从免疫球蛋白获得，例如IgE信号肽或IgG信号肽。在一些实施方案中，融合于由RNA(例如mRNA)疫苗编码的抗原性多肽的信号肽是具有以下序列的Ig重链ε-1信号肽(IgE HC SP)：MDWTWILFLVAAATRVHS；SEQID NO：481。在一些实施方案中，融合于由(例如mRNA)RNA(例如mRNA)疫苗编码的抗原性多肽的信号肽是具有以下序列的IgGk链V-III区HAH信号肽(IgGk SP)：METPAQLLFLLLLWLPDTTG；SEQ ID NO：480。在一些实施方案中，信号肽选自：日本脑炎PRM信号序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：482)、VSVg蛋白信号序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：483)和日本脑炎JEV信号序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ IDNO：484)。
在一些实施方案中，由RNA(例如mRNA)疫苗编码的抗原性多肽包含融合于由SEQID NO：480-484中的任一者标识的信号肽的由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)。本文公开的实例不意图具有限制性，并且本领域中已知的用以有助于使蛋白质靶向ER以进行加工和/或使蛋白质靶向细胞膜的任何信号肽都可根据本公开加以使用。
信号肽可具有15-60个氨基酸的长度。举例来说，信号肽可具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的长度。在一些实施方案中，信号肽具有20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、15-55、20-55、25-55、30-55、35-55、40-55、45-55、50-55、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、15-35、20-35、25-35、30-35、15-30、20-30、25-30、15-25、20-25或15-20个氨基酸的长度。
信号肽通常在ER加工期间在裂解连结点处从初生多肽裂解。由本公开的流感RNA(例如mRNA)疫苗产生的成熟抗原性多肽通常不包含信号肽。
化学修饰
在一些实施方案中，本公开的流感疫苗至少包含具有编码至少一种包含至少一个化学修饰的抗原性多肽的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸。
术语“化学修饰”和“化学修饰的”是指关于腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷在它们的位置、样式、百分比或群体中的至少一者方面进行修饰。通常，这些术语不指天然存在的5′末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修饰。关于多肽，术语“修饰”是指关于一组典型20种氨基酸进行的修饰。如果如本文提供的多肽含有氨基酸取代、插入、或取代和插入的组合，那么它们也被视为“经修饰”。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含各种(超过一种)不同修饰。在一些实施方案中，多核苷酸的特定区域含有一个、两个或更多个(任选是不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，相对于未修饰多核苷酸，引入细胞或生物体中的经修饰RNA多核苷酸(例如经修饰mRNA多核苷酸)分别在所述细胞或生物体中展现降解降低。在一些实施方案中，引入细胞或生物体中的经修饰RNA多核苷酸(例如经修饰mRNA多核苷酸)可分别在所述细胞或生物体中展现免疫原性降低(例如先天性应答降低)。
多核苷酸的修饰包括不限于本文所述的那些。多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)可包含天然存在的修饰、非天然存在的修饰，或多核苷酸可包含天然存在的修饰和非天然存在的修饰的组合。多核苷酸可包括例如对糖、核苷碱基或核苷间键联(例如对连接磷酸酯，对磷酸二酯键联或对磷酸二酯主链)的任何适用修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含在多核苷酸的合成或合成后期间引入以实现所需功能或性质的非天然经修饰核苷酸。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可用化学合成或用聚合酶引入在链的末端或链中任何其他地方。可对多核苷酸的任何区域进行化学修饰。
本公开提供多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)的经修饰核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核苷碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸酯基团的核苷。经修饰核苷酸可通过用以包括一个或多个经修饰或非天然核苷的任何适用方法来合成，所述方法诸如像化学、酶促或重组方法。多核苷酸可包含一个或多个具有连接的核苷的区域。所述区域可具有可变主链键联。键联可为标准磷酸二酯键联，在所述情况下，多核苷酸将包含核苷酸的区域。
经修饰核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且也涵盖在核苷酸和/或包含非标准或经修饰碱基的经修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键接受体的排列容许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补性非标准碱基结构之间进行氢键合。所述非标准碱基配对的一个实例是在经修饰核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或连接体的任何组合都可并入本公开的多核苷酸中。
适用于本公开的疫苗中的多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)的修饰包括但不限于以下：2-甲基硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷；2-甲基硫基-N6-甲基腺苷；2-甲基硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甘氨酸基氨基甲酰基腺苷；N6-异戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；1，2′-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2′-O-甲基腺苷；2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲基硫基-N6异戊烯基腺苷；2-甲基硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2′-O-甲基腺苷；2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；异戊烯基腺苷；N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷；N6，2′-O-二甲基腺苷；N6，2′-O-二甲基腺苷；N6，N6，2′-O-三甲基腺苷；N6，N6-二甲基腺苷；N6-乙酰基腺苷；N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲基腺苷；2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺苷；7-脱氮-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6，N6(二甲基)腺嘌呤；N6-顺-羟基-异戊烯基-腺苷；α-硫代-腺苷；2(氨基)腺嘌呤；2(氨基丙基)腺嘌呤；2(甲基硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(氨基烷基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2’-氨基-2’-脱氧-ATP；2’-叠氮基-2’-脱氧-ATP；2′-脱氧-2′-a-氨基腺苷TP；2′-脱氧-2′-a-叠氮基腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(脱氮)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(氨基)腺嘌呤；8(烷基硫基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(卤代)腺嘌呤；8-(羟基)腺嘌呤；8-(烷基硫基)腺嘌呤；8-(硫醇)腺嘌呤；8-叠氮基-腺苷；氮杂腺嘌呤；脱氮腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(异戊基)腺嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-脱氮腺苷TP；2’氟-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2’-OMe-2-氨基-ATP；2’O-甲基-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2′-a-乙炔基腺苷TP；2-氨基腺嘌呤；2-氨基腺苷TP；2-氨基-ATP；2′-a-三氟甲基腺苷TP；2-叠氮基腺苷TP；2′-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2′-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2′-脱氧-2′，2′-二氟腺苷TP；2′-脱氧-2′-a-巯基腺苷TP；2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-氨基腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-叠氮基腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-溴腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-氯腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-氟腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-碘腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-巯基腺苷TP；2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巯基腺苷TP；2-甲氧基-腺嘌呤；2-甲基硫基-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-脱氮-3-溴腺苷TP；3-脱氮-3-氯腺苷TP；3-脱氮-3-氟腺苷TP；3-脱氮-3-碘腺苷TP；3-脱氮腺苷TP；4′-叠氮基腺苷TP；4′-碳环腺苷TP；4′-乙炔基腺苷TP；5′-高腺苷TP；8-氮杂-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-脱氮腺苷TP；2-氨基嘌呤；7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤；2，6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤；2-硫代胞苷；3-甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；5-羟基甲基胞苷；5-甲基胞苷；N4-乙酰基胞苷；2′-O-甲基胞苷；2′-O-甲基胞苷；5，2′-O-二甲基胞苷；5-甲酰基-2′-O-甲基胞苷；赖西丁(Lysidine)；N4，2′-O-二甲基胞苷；N4-乙酰基-2′-O-甲基胞苷；N4-甲基胞苷；N4，N4-二甲基-2’-OMe-胞苷TP；4-甲基胞苷；5-氮杂-胞苷；假-异胞苷；吡咯并-胞苷；α-硫代-胞苷；2-(硫代)胞嘧啶；2’-氨基-2’-脱氧-CTP；2’-叠氮基-2’-脱氧-CTP；2′-脱氧-2′-a-氨基胞苷TP；2′-脱氧-2′-a-叠氮基胞苷TP；3(脱氮)5(氮杂)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(脱氮)5(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞苷；4，2′-O-二甲基胞苷；5(卤代)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(卤代)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-溴-胞苷；5-碘-胞苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮基)胞嘧啶；6-氮杂-胞苷；氮杂胞嘧啶；脱氮胞嘧啶；N4(乙酰基)胞嘧啶；1-甲基-1-脱氮-假异胞苷；1-甲基-假异胞苷；2-甲氧基-5-甲基-胞苷；2-甲氧基-胞苷；2-硫代-5-甲基-胞苷；4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷；4-甲氧基-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-假异胞苷；4-硫代-假异胞苷；5-氮杂-泽布拉瑞(zebularine)；5-甲基-泽布拉瑞；吡咯并-假异胞苷；泽布拉瑞；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP；2，2’-脱水-胞苷TP盐酸盐；2’氟-N4-Bz-胞苷TP；2’氟-N4-乙酰基-胞苷TP；2’-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷TP；2’O-甲基-N4-Bz-胞苷TP；2′-a-乙炔基胞苷TP；2′-a-三氟甲基胞苷TP；2′-b-乙炔基胞苷TP；2′-b-三氟甲基胞苷TP；2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷TP；2′-脱氧-2′-a-巯基胞苷TP；2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-氨基胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-叠氮基胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-溴胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-氯胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-氟胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-碘胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-巯基胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基胞苷TP；2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP；3′-乙炔基胞苷TP；4′-叠氮基胞苷TP；4′-碳环胞苷TP；4′-乙炔基胞苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖胞苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-(4-氨基-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-氨基烯丙基-CTP；5-氰基胞苷TP；5-乙炔基阿糖胞苷TP；5-乙炔基胞苷TP；5′-高胞苷TP；5-甲氧基胞苷TP；5-三氟甲基-胞苷TP；N4-氨基-胞苷TP；N4-苯甲酰基-胞苷TP；假异胞苷；7-甲基鸟苷；N2，2′-O-二甲基鸟苷；N2-甲基鸟苷；丫苷(Wyosine)；1，2′-O-二甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；2′-O-甲基鸟苷；2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；2′-O-甲基鸟苷；2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷；7-氰基-7-脱氮鸟苷；古嘌苷(Archaeosine)；甲基丫苷；N2，7-二甲基鸟苷；N2，N2，2′-O-三甲基鸟苷；N2，N2，7-三甲基鸟苷；N2，N2-二甲基鸟苷；N2，7，2′-O-三甲基鸟苷；6-硫代-鸟苷；7-脱氮-鸟苷；8-氧代-鸟苷；N1-甲基-鸟苷；α-硫代-鸟苷；2(丙基)鸟嘌呤；2-(烷基)鸟嘌呤；2’-氨基-2’-脱氧-GTP；2’-叠氮基-2’-脱氧-GTP；2′-脱氧-2′-a-氨基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-a-叠氮基鸟苷TP；6(甲基)鸟嘌呤；6-(烷基)鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-甲基-鸟苷；7(烷基)鸟嘌呤；7(脱氮)鸟嘌呤；7(甲基)鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-(脱氮)鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；8(烷基)鸟嘌呤；8(炔基)鸟嘌呤；8(卤代)鸟嘌呤；8(烷基硫基)鸟嘌呤；8-(烯基)鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(氨基)鸟嘌呤；8-(卤代)鸟嘌呤；8-(羟基)鸟嘌呤；8-(烷基硫基)鸟嘌呤；8-(硫醇)鸟嘌呤；氮杂鸟嘌呤；脱氮鸟嘌呤；N(甲基)鸟嘌呤；N-(甲基)鸟嘌呤；1-甲基-6-硫代-鸟苷；6-甲氧基-鸟苷；6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷；6-硫代-7-脱氮-鸟苷；6-硫代-7-甲基-鸟苷；7-脱氮-8-氮杂-鸟苷；7-甲基-8-氧代-鸟苷；N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷；N2-甲基-6-硫代-鸟苷；1-Me-GTP；2’氟-N2-异丁基-鸟苷TP；2’O-甲基-N2-异丁基-鸟苷TP；2′-a-乙炔基鸟苷TP；2′-a-三氟甲基鸟苷TP；2′-b-乙炔基鸟苷TP；2′-b-三氟甲基鸟苷TP；2′-脱氧-2′，2′-二氟鸟苷TP；2′-脱氧-2′-a-硫基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-氨基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-叠氮基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-溴鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-氯鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-氟鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-碘鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-巯基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基鸟苷TP；4′-叠氮基鸟苷TP；4′-碳环鸟苷TP；4′-乙炔基鸟苷TP；5′-高鸟苷TP；8-溴-鸟苷TP；9-脱氮鸟苷TP；N2-异丁基-鸟苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1，2′-O-二甲基肌苷；2′-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2′-O-甲基肌苷；环氧基辫苷(Queuosine)；半乳糖基-辫苷；甘露糖基辫苷；辫苷；烯丙基氨基-胸苷；氮杂胸苷；脱氮胸苷；脱氧-胸苷；2’-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；3-甲基尿苷；5-羧基甲基尿苷；5-羟基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸基甲基-2-硫代尿苷；5-牛磺酸基甲基尿苷；二氢尿苷；假尿苷；(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-5-羧基丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-甲基-假尿苷；2′-O-甲基尿苷；2′-O-甲基假尿苷；2′-O-甲基尿苷；2-硫代-2′-O-甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；3，2′-O-二甲基尿苷；3-甲基-假-尿苷TP；4-硫代尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯；5，2′-O-二甲基尿苷；5，6-二氢-尿苷；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-羧基羟基甲基尿苷；5-羧基羟基甲基尿苷甲酯；5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷TP；5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基二氢尿苷；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲酯-尿苷TP；N1-甲基-假-尿苷；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲酯；3-(3-氨基-3-羧基丙基)-尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫代-尿苷；1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1取代的2(硫代)-假尿嘧啶；1取代的2，4-(二硫代)假尿嘧啶；1取代的4(硫代)假尿嘧啶；1取代的假尿嘧啶；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2-(硫代)-假尿嘧啶；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；2(硫代)假尿嘧啶；2′脱氧尿苷；2′氟尿苷；2-(硫代)尿嘧啶；2，4-(二硫代)假尿嘧啶；2’甲基，2’氨基，2’叠氮基，2’氟-鸟苷；2’-氨基-2’-脱氧-UTP；2’-叠氮基-2’-脱氧-UTP；2’-叠氮基-脱氧尿苷TP；2’-O-甲基假尿苷；2′脱氧尿苷；2′氟尿苷；2′-脱氧-2′-a-氨基尿苷TP；2′-脱氧-2′-a-叠氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶；4(硫代)假尿嘧啶；4-(硫代)假尿嘧啶；4-(硫代)尿嘧啶；4-硫代尿嘧啶；5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-氨基丙基)尿嘧啶；5(氨基烷基)尿嘧啶；5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5(胍鎓烷基)尿嘧啶；5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基氨基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍鎓烷基)尿嘧啶；5-(卤代)尿嘧啶；5-(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶；5-(甲基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶；5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶；5-(甲基)假尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-氨基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘-尿苷；5-尿嘧啶；6(偶氮基)尿嘧啶；6-(偶氮基)尿嘧啶；6-氮杂-尿苷；烯丙基氨基-尿嘧啶；氮杂尿嘧啶；脱氮尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿嘧啶；4-硫代-假-UTP；1-羧基甲基-假尿苷；1-甲基-1-脱氮-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸基甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺酸基甲基-4-硫代-尿苷；1-牛磺酸基甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫代-假尿苷；2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷；2-硫代-1-甲基-假尿苷；2-硫代-5-氮杂-尿苷；2-硫代-二氢假尿苷；2-硫代-二氢尿苷；2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫代-1-甲基-假尿苷；4-硫代-假尿苷；5-氮杂-尿苷；二氢假尿苷；(±)1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；1-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2，2，3，3，3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2，2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2，4，6-三甲基苯甲基)假尿苷TP；1-(2，4，6-三甲基-苯甲基)假-UTP；1-(2，4，6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-氨基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-氨基-乙基)假-UTP；1-(2-羟基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3，4-双-三氟甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(3，4-二甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-(3-氨基-丙基)假-UTP；1-(3-环丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP；1-(4-氨基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯甲基)假-UTP；1-(4-氨基-丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯基)假-UTP；1-(4-叠氮基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-溴苯甲基)假尿苷TP；1-(4-氯苯甲基)假尿苷TP；1-(4-氟苯甲基)假尿苷TP；1-(4-碘苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲烷磺酰基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基-苯甲基)假-UTP；1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP；1-(4-甲基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苯甲基)假-UTP；1-(4-硝基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苯甲基)假-UTP；1(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫代甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苯甲基)假尿苷TP；1-(5-氨基-戊基)假-UTP；1-(6-氨基-己基)假-UTP；1，6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP；1-乙酰基假尿苷TP；1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-氨基甲基-假-UTP；1-苯甲酰基假尿苷TP；1-苯甲基氧基甲基假尿苷TP；1-苯甲基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-环丁基甲基-假-UTP；1-环丁基-假-UTP；1-环庚基甲基-假-UTP；1-环庚基-假-UTP；1-环己基甲基-假-UTP；1-环己基-假-UTP；1-环辛基甲基-假-UTP；1-环辛基-假-UTP；1-环戊基甲基-假-UTP；1-环戊基-假-UTP；1-环丙基甲基-假-UTP；1-环丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羟基甲基假尿苷TP；1-异丙基-假-UTP；1-Me-2-硫代-假-UTP；1-Me-4-硫代-假-UTP；1-Me-α-硫代-假-UTP；1-甲烷磺酰基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2，2，2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(取代的苯基)假-UTP；1-甲基-6-氨基-假-UTP；1-甲基-6-叠氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲酸乙酯-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲酰基-假-UTP；1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP；1-甲基-6-羟基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-异丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-叔丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-吗啉代甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-特戊酰基假尿苷TP；1-炔丙基假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-丙炔基-假尿苷；1-对甲苯基-假-UTP；1-叔丁基-假-UTP；1-硫代甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫代吗啉代甲基假尿苷TP；1-三氟乙酰基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2，2’-脱水-尿苷TP；2’-溴-脱氧尿苷TP；2’-F-5-甲基-2’-脱氧-UTP；2’-OMe-5-Me-UTP；2’-OMe-假-UTP；2′-a-乙炔基尿苷TP；2′-a-三氟甲基尿苷TP；2′-b-乙炔基尿苷TP；2′-b-三氟甲基尿苷TP；2′-脱氧-2′，2′-二氟尿苷TP；2′-脱氧-2′-a-巯基尿苷TP；2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-氨基尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-叠氮基尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-溴尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-氯尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-氟尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-碘尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-巯基尿苷TP；2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫代-尿苷；2-甲氧基尿苷；2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4′-叠氮基尿苷TP；4′-碳环尿苷TP；4′-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲基氨基尿苷TP；5′-高尿苷TP；5-碘-2’-氟-脱氧尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘化甲基-6-氘化尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基阿糖尿苷TP；6-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-吗啉代)-假-UTP；6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；6-(取代的苯基)-假-UTP；6-氨基-假-UTP；6-叠氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯-假-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲基氨基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-甲酸乙酯-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲酰基-假-UTP；6-羟基氨基-假-UTP；6-羟基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-异丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲基氨基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-叔丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；Alpha-硫代-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-对苯甲酸；假-UTP-N1-对苯甲酸；怀丁苷(Wybutosine)；羟基怀丁苷；异丫苷；过氧怀丁苷；修饰不完全的羟基怀丁苷；4-脱甲基丫苷；2，6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；1，3，5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘；2(氨基)嘌呤；2，4，5-(三甲基)苯基；2‘甲基，2’氨基，2’叠氮基，2’氟-胞苷；2’甲基，2’氨基，2’叠氮基，2’氟-腺嘌呤；2’甲基，2’氨基，2’叠氮基，2’氟-尿苷；2′-氨基-2′-脱氧核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2′-叠氮基-2′-脱氧核糖；2′氟-2′-脱氧核糖；2′-氟修饰的碱基；2′-O-甲基-核糖；2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基；3-(甲基)异喹诺酮基；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4，6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5取代的嘧啶；5-(甲基)异喹诺酮基；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮基)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪1-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异喹诺酮基；7-(丙炔基)异喹诺酮基，丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-脱氮-肌苷基；7取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异喹诺酮基；异鸟苷；N2取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；水粉蕈素(Nubularine)；O6取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素(Oxoformycin)TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；并五苯基；苯蒽基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；芪基；取代的1，2，4-三唑；并四苯基；杀结核菌素(Tubercidine)；黄嘌呤；黄嘌呤核苷-5’-TP；2-硫代-泽布拉瑞；5-氮杂-2-硫代-泽布拉瑞；7-脱氮-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基-核糖苷-TP；间型霉素A(Formycin A)TP；间型霉素B TP；Pyrrolosine TP；2′-OH-阿糖腺苷TP；2′-OH-阿糖胞苷TP；2′-OH-阿糖尿苷TP；2′-OH-阿糖鸟苷TP；5-(2-甲氧甲酰基乙烯基)尿苷TP；和N6-(19-氨基-五氧杂十九基)腺苷TP。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两个(例如2、3、4个或更多个)以上提及的经修饰核苷碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中的经修饰核苷碱基选自由以下组成的组：假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、N1-乙基假尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两个(例如2、3、4个或更多个)以上提及的经修饰核苷碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中的经修饰核苷碱基选自由以下组成的组：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷和α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，多核苷酸包括至少两个(例如2、3、4个或更多个)以上提及的经修饰核苷碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)就特定修饰来说被均一修饰(例如完全修饰，遍及整个序列加以修饰)。举例来说，多核苷酸可用5-甲基-胞苷(m5C)均一修饰，这意味着mRNA序列中的所有胞嘧啶残基都用5-甲基-胞苷(m5C)替换。类似地，多核苷酸可通过用经修饰残基诸如以上阐述的那些进行替换来就序列中存在的任何类型的核苷残基来说被均一修饰。
具有经修饰胞嘧啶的示例性核苷碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)和2-硫代-5-甲基-胞苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷碱基是经修饰尿苷。示例性核苷碱基以及在一些实施方案中经修饰核苷碱基是经修饰胞嘧啶。具有经修饰尿苷的核苷包括5-氰基尿苷和4’-硫代尿苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷碱基是经修饰腺嘌呤。具有经修饰腺嘌呤的示例性核苷碱基和核苷包括7-脱氮-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)和N6-甲基-腺苷(m6A)。
在一些实施方案中，经修饰核苷碱基是经修饰鸟嘌呤。具有经修饰鸟嘌呤的示例性核苷碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、丫苷(imG)、甲基丫苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷。
本公开的多核苷酸可沿分子的整个长度加以部分或完全修饰。举例来说，在本发明的多核苷酸中，或在其给定的预定序列区域中(例如在包括或排除聚腺苷酸尾部的mRNA中)，一种或多种或所有或给定类型的核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一者或多者或全部)可被均一修饰。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸中(或其给定序列区域中)的所有核苷酸X都是经修饰核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
多核苷酸可含有约1％至约100％经修饰核苷酸(相对于总体核苷酸内含物，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一者或多者)，或任何间插百分比(例如1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％、以及95％至100％)。任何剩余百分比以存在未修饰A、G、U或C来说明。
多核苷酸可含有最少1％以及最多100％经修饰核苷酸，或任何间插百分比，诸如至少5％经修饰核苷酸，至少10％经修饰核苷酸，至少25％经修饰核苷酸，至少50％经修饰核苷酸，至少80％经修饰核苷酸，或至少90％经修饰核苷酸。举例来说，多核苷酸可含有经修饰嘧啶，诸如经修饰尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶用经修饰尿嘧啶(例如5取代的尿嘧啶)替换。经修饰尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物替换，或可由具有不同结构的多个化合物(例如2、3、4个或更多个独特结构)替换。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶用经修饰胞嘧啶(例如5取代的胞嘧啶)替换。经修饰胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物替换，或可由具有不同结构的多个化合物(例如2、3、4个或更多个独特结构)替换。
因此，在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗包含5′UTR元件、任选加以密码子优化的开放阅读框和3′UTR元件、聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号，其中RNA未被化学修饰。
在一些实施方案中，经修饰核苷碱基是经修饰尿嘧啶。具有经修饰尿嘧啶的示例性核苷碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸基甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即具有核苷碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)以及5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲氧甲酰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷碱基是经修饰胞嘧啶。具有经修饰胞嘧啶的示例性核苷碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉瑞、5-氮杂-泽布拉瑞、5-甲基-泽布拉瑞、5-氮杂-2-硫代-泽布拉瑞、2-硫代-泽布拉瑞、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(k2C)、α-硫代-胞苷、2′-O-甲基-胞苷(Cm)、5，2′-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2′-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4，2′-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2′-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4，N4，2′-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫代-胞苷、2’-F-阿糖胞苷、2’-F-胞苷和2’-OH-阿糖胞苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷碱基是经修饰腺嘌呤。具有经修饰腺嘌呤的示例性核苷碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2、6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酸基氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6，N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6，2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6，N6，2′-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1，2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2’-F-阿糖腺苷、2’-F-腺苷、2’-OH-阿糖腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九基)-腺苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷碱基是经修饰鸟嘌呤。具有经修饰鸟嘌呤的示例性核苷碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、丫苷(imG)、甲基丫苷(mimG)、4-脱甲基-丫苷(imG-14)、异丫苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、修饰不完全的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧基辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2，N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2，7-二甲基-鸟苷(m2，7G)、N2、N2，7-二甲基-鸟苷(m2，2，7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2，N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2，7-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2，7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1，2′-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2’-F-阿糖鸟苷和2’-F-鸟苷。
RNA(例如mRNA)的体外转录
本公开的流感病毒疫苗包含至少一种RNA多核苷酸，诸如mRNA(例如经修饰mRNA)。mRNA例如在体外从被称为“体外转录模板”的模板DNA转录。在一些实施方案中，体外转录模板编码5′非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并且编码3′UTR和聚腺苷酸尾部。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于由模板编码的mRNA。
“5′非翻译区”(5′UTR)是指mRNA的直接在起始密码子(即mRNA转录物的由核糖体翻译的首个密码子)的上游(即5′)的区域，其不编码多肽。
“3′非翻译区”(3′UTR)是指mRNA的直接在终止密码子(即mRNA转录物的发出翻译终止信号的密码子)的下游(即3′)的区域，其不编码多肽。
“开放阅读框”是以起始密码子(例如甲硫氨酸(ATG))开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束的一段连续DNA，并且编码多肽。
“聚腺苷酸尾部”是mRNA的在3′UTR的下游，例如直接在其下游(即3′)的区域，其含有多个连续单磷酸腺苷。聚腺苷酸尾部可含有10至300个单磷酸腺苷。举例来说，聚腺苷酸尾部可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾部含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物环境中(例如在细胞中，在体内)，聚腺苷酸尾部起保护mRNA免遭例如在细胞质中的酶促降解的作用，并且有助于转录终止，mRNA从核输出以及翻译。
在一些实施方案中，多核苷酸包括200至3,000个核苷酸。举例来说，多核苷酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000、或2000至3000个核苷酸。
鞭毛蛋白(Flagellin)佐剂
鞭毛蛋白是一种具有约500个氨基酸的单体蛋白质，其聚合以形成与细菌运动相关的鞭毛。鞭毛蛋白由多种鞭毛细菌(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))以及非鞭毛细菌(诸如大肠杆菌(Escherichia coli))表达。先天性免疫系统的细胞(树突细胞、巨噬细胞等)对鞭毛蛋白的感知由Toll样受体5(TLR5)以及由Nod样受体(NLR)Ipaf和Naip5介导。TLR和NLR已被鉴定为在使先天性免疫应答和适应性免疫应答活化方面起作用。因此，鞭毛蛋白在疫苗中提供佐剂作用。
编码已知鞭毛蛋白多肽的核苷酸和氨基酸序列可在NCBI GenBank数据库中公开获得。来自鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、幽门螺旋杆菌(H.Pylori)、霍乱弧菌(V.Cholera)、粘质沙雷氏菌(S.marcesens)、福氏志贺菌(S.flexneri)、梅毒密螺旋体(T.Pallidum)、嗜肺军团菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferei)、艰难梭菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、克拉里奇巴尔通氏体(B.clarridgeiae)、奇异变形杆菌(P.Mirabilis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilus)、单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)的鞭毛蛋白序列以及其他鞭毛蛋白序列是已知的。
如本文所用的鞭毛蛋白多肽是指全长鞭毛蛋白、其免疫原性片段以及与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少50％序列同一性的肽。示例性鞭毛蛋白包括来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(UniPro条目号：Q56086)、鼠伤寒沙门氏菌(A0A0C9DG09)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)(A0A0C9BAB7)和肠道沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)(Q6V2X8)的鞭毛蛋白，以及具有由SEQ ID NO 1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列(也参见表7-13)的蛋白质。在一些实施方案中，鞭毛蛋白多肽与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，鞭毛蛋白多肽是免疫原性片段。免疫原性片段是鞭毛蛋白的激起免疫应答的部分。在一些实施方案中，免疫应答是TLR5免疫应答。免疫原性片段的一实例是其中铰链区的全部或一部分已被缺失或用其他氨基酸替换的鞭毛蛋白。举例来说，可将抗原性多肽插入铰链区中。铰链区是鞭毛蛋白的高变区。鞭毛蛋白的铰链区也被称为“D3结构域或区域”、“螺旋桨结构域或区域”、“高变结构域或区域”和“可变结构域或区域”。如本文所用的“铰链区的至少一部分”是指鞭毛蛋白的铰链区的任何部分，或铰链区的全部。在其他实施方案中，鞭毛蛋白的免疫原性片段是鞭毛蛋白的具有20、25、30、35或40个氨基酸的C末端片段。
鞭毛蛋白单体由结构域D0至D3形成。形成主干的D0和D1由串联长α螺旋组成，并且在不同细菌之间高度保守。D1结构域包括适用于达成TLR5活化的若干段氨基酸。整个D1结构域或结构域内的一个或多个活性区域是鞭毛蛋白的免疫原性片段。D1结构域内的免疫原性区域的实例包括残基88-114和残基411-431(在鼠伤寒沙门氏菌FliC鞭毛蛋白中)。在88-100区域中的13个氨基酸内，在沙门氏菌鞭毛蛋白与仍然保持TLR5活化作用的其他鞭毛蛋白之间容许具有至少6个取代。因此，鞭毛蛋白的免疫原性片段包括使TLR5活化的鞭毛蛋白样序列，并且含有与FliC的88-100中的沙门氏菌序列(LQRVRELAVQSAN；SEQ ID NO：504)53％或更大同一的具有13个氨基酸的基序。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗包括编码鞭毛蛋白和一个或多个抗原性多肽的融合蛋白的RNA。如本文所用的“融合蛋白”是指构建体的两个组分的连接。在一些实施方案中，使抗原性多肽的羧基末端融合或连接于鞭毛蛋白多肽的氨基末端。在其他实施方案中，使抗原性多肽的氨基末端融合或连接于鞭毛蛋白多肽的羧基末端。融合蛋白可包括例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个鞭毛蛋白多肽连接于一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个抗原性多肽。当使两个或更多个鞭毛蛋白多肽和/或两个或更多个抗原性多肽连接时，这种构建体可被称为“多聚体”。
融合蛋白的各组分可彼此直接连接，或它们可通过连接体来连接。举例来说，连接体可为氨基酸连接体。由RNA(例如mRNA)疫苗编码的用以连接融合蛋白的组分的氨基酸连接体可包括例如至少一个选自由赖氨酸残基、谷氨酸残基、丝氨酸残基和精氨酸残基组成的组的成员。在一些实施方案中，连接体的长度是1-30、1-25、1-25、5-10、5、15或5-20个氨基酸。
在其他实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗包括至少两种单独RNA多核苷酸，一种编码一种或多种抗原性多肽，并且另一种编码鞭毛蛋白多肽。至少两种RNA多核苷酸可共同配制于诸如脂质纳米粒子的载体中。
治疗方法
本文提供用于预防和/或治疗人和其他哺乳动物的流感病毒的组合物(例如药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。流感病毒RNA疫苗可用作治疗剂或防治剂。它们可在医学中用于预防和/或治疗感染性疾病。在示例性方面，本公开的流感病毒RNA疫苗用于提供免遭流感病毒的防治性保护作用。免遭流感病毒的防治性保护作用可在施用本公开的流感病毒RNA疫苗之后实现。疫苗可施用一次、两次、三次、四次或更多次。尽管不太合乎需要，但有可能向受感染个体施用疫苗以实现治疗响应。可能需要相应调整给药。
在一些实施方案中，本公开的流感病毒疫苗可用作一种预防受试者的流感病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种如本文提供的流感病毒疫苗。在一些实施方案中，本公开的流感病毒疫苗可用作一种抑制受试者的原发性流感病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种如本文提供的流感病毒疫苗。在一些实施方案中，本公开的流感病毒疫苗可用作一种治疗受试者的流感病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种如本文提供的流感病毒疫苗。在一些实施方案中，本公开的流感病毒疫苗可用作一种降低受试者的流感病毒感染的发生的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种如本文提供的流感病毒疫苗。在一些实施方案中，本公开的流感病毒疫苗可用作一种抑制流感病毒从受流感病毒感染的第一受试者向未受流感病毒感染的第二受试者扩散的方法，所述方法包括向所述第一受试者和所述第二受试者中的至少一者施用至少一种如本文提供的流感病毒疫苗。
在本发明的各个方面，提供一种在受试者中引发针对流感病毒的免疫应答的方法。方法涉及向受试者施用流感病毒RNA疫苗，其包含至少一种具有编码至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，由此在受试者中诱导对流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫应答，其中相对于用防治有效剂量的针对流感病毒的传统疫苗接种疫苗的受试者中的抗抗原性多肽抗体效价，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原性多肽抗体效价增加。“抗抗原性多肽抗体”是特异性结合至抗原性多肽的血清抗体。
防治有效剂量是在临床可接受水平下预防病毒感染的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量是疫苗的包装插页中所列的剂量。如本文所用的传统疫苗是指除本公开的mRNA疫苗以外的疫苗。举例来说，传统疫苗包括但不限于活体微生物疫苗、杀灭微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白质抗原疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已获得监管核准和/或由国立药物监管机构例如美国食品与药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA)登记的疫苗。
在一些实施方案中，相对于用防治有效剂量的针对流感病毒的传统疫苗接种疫苗的受试者中的抗抗原性多肽抗体效价，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原性多肽抗体效价增加1个log至10个log。
在一些实施方案中，相对于用防治有效剂量的针对流感的传统疫苗接种疫苗的受试者中的抗抗原性多肽抗体效价，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原性多肽抗体效价增加1个log、2个log、3个log、5个log或10个log。
在本公开的其他方面，提供一种在受试者中引发针对流感病毒的免疫应答的方法。方法涉及向受试者施用流感病毒RNA疫苗，其包含至少一种具有编码至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，由此在受试者中诱导对流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫应答，其中受试者中的所述免疫应答等效于用针对流感病毒的传统疫苗在相对于RNA疫苗是2倍至100倍的剂量水平下接种疫苗的受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等效于用传统疫苗在相对于流感疫苗是2、3、4、5、10、50、100倍的剂量水平下接种疫苗的受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等效于用传统疫苗在相对于流感疫苗是10-100倍或100-1000倍的剂量水平下接种疫苗的受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白质]抗体效价来评估免疫应答。
一些实施方案提供一种通过以下方式来在受试者中诱导免疫应答的方法：向所述受试者施用流感RNA(例如mRNA)疫苗，其包含至少一种具有编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框的RNA(例如mRNA)多核苷酸，由此在所述受试者中诱导对所述抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫应答，其中相对于在用防治有效剂量的针对流感的传统疫苗接种疫苗的受试者中诱导的免疫应答，所述受试者中的所述免疫应答早2天至10周被诱导。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答在用防治有效剂量的传统疫苗在相对于流感RNA(例如mRNA)疫苗是2倍至100倍的剂量水平下接种疫苗的受试者中被诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等效于用传统疫苗在相对于流感RNA(例如mRNA)疫苗是2、3、4、5、10、50、100倍的剂量水平下接种疫苗的受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，相对于在用防治有效剂量的传统疫苗接种疫苗的受试者中诱导的免疫应答，受试者中的免疫应答早2天或早3天被诱导。
在一些实施方案中，相对于在用防治有效剂量的传统疫苗接种疫苗的受试者中诱导的免疫应答，受试者中的免疫应答早1周、2周、3周、5周或10周被诱导。
治疗性和防治性组合物
本文提供用于预防、治疗或诊断例如人和其他哺乳动物的流感的组合物(例如药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。流感RNA(例如mRNA)疫苗可用作治疗剂或防治剂。它们可在医学中用于预防和/或治疗感染性疾病。在一些实施方案中，本公开的呼吸道RNA(例如mRNA)疫苗用于对免疫效应细胞进行致敏，例如以离体使外周血液单核细胞(PBMC)活化，接着将其输注(再输注)至受试者中。
在一些实施方案中，可向受试者(例如哺乳动物受试者诸如人受试者)施用如本文所述的含有RNA(例如mRNA)多核苷酸的流感疫苗，并且所述RNA(例如mRNA)多核苷酸在体内被翻译以产生抗原性多肽。
可诱导流感RNA(例如mRNA)疫苗以达成在细胞、组织或生物体中翻译多肽(例如抗原或免疫原)。在一些实施方案中，所述翻译在体内发生，但所述翻译可离体、在培养中或在体外发生。在一些实施方案中，使细胞、组织或生物体与有效量的含有流感RNA(例如mRNA)疫苗的组合物接触，所述疫苗含有具有至少一个编码抗原性多肽的可翻译区域的多核苷酸。
流感RNA(例如mRNA)疫苗的“有效量”至少部分地基于靶标组织、靶标细胞类型、施用手段、多核苷酸的物理特征(例如大小和经修饰核苷的程度)和疫苗的其他组分以及其他决定因素而提供。一般来说，流感RNA(例如mRNA)疫苗组合物的有效量提供随细胞中的抗原产生而变化的诱导或加强免疫应答，优选比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未修饰多核苷酸的组合物更高效。抗原产生增加可通过以下来证明：细胞转染增加(用RNA(例如mRNA)疫苗转染的细胞的百分比)、从多核苷酸进行的蛋白质翻译增加、核酸降解降低(如例如由从经修饰多核苷酸进行的蛋白质翻译的持续时间增加所证明)或宿主细胞的抗原特异性免疫应答改变。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如mRNA)疫苗(包括多核苷酸它们的编码多肽)可用于治疗流感。
流感RNA(例如mRNA)疫苗可作为主动免疫流程的一部分向健康个体或在潜伏时期期间在感染早期或在症状发作之后的活动性感染期间防治性或治疗性施用。在一些实施方案中，对细胞、组织或受试者提供的本公开的RNA(例如mRNA)疫苗的量可为有效用于免疫防治的量。
流感RNA(例如mRNA)疫苗可与其他防治性或治疗性化合物一起施用。作为一非限制性实例，防治性或治疗性化合物可为佐剂或加强剂。如本文所用，当涉及防治性组合物诸如疫苗时，术语“加强”是指额外施用防治性(疫苗)组合物。加强剂(或加强疫苗)可在较早施用防治性组合物之后给与。在初始施用防治性组合物与加强剂之间的施用时间可为但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。在一些实施方案中，在初始施用防治性组合物与加强剂之间的施用时间可为但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施方案中，类似于本领域中已知的失活疫苗的施用，可肌肉内、真皮内或鼻内施用流感RNA(例如mRNA)疫苗。在一些实施方案中，肌肉内施用流感RNA(例如mRNA)疫苗。
视感染的盛行性或未满足医学需求的程度或水平而定，流感RNA(例如mRNA)疫苗可用于各种环境中。作为一非限制性实例，RNA(例如mRNA)疫苗可用于治疗和/或预防多种流感。RNA(例如mRNA)疫苗具有优越性质，因为它们产生大得多的抗体效价，并且相比于可商购获得的抗病毒剂/组合物，更早产生应答。
本文提供药物组合物，其包括流感RNA(例如mRNA)疫苗和RNA(例如mRNA)疫苗组合物和/或复合物，任选与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
流感RNA(例如mRNA)疫苗可单独或与一种或多种其他组分联合配制或施用。举例来说，流感RNA(例如mRNA)疫苗(疫苗组合物)可包含包括但不限于佐剂的其他组分。
在一些实施方案中，流感(例如mRNA)疫苗不包括佐剂(它们不含佐剂)。
流感RNA(例如mRNA)疫苗可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种额外活性物质，诸如像治疗活性物质、防治活性物质或两者组合。疫苗组合物可为无菌的，无热原的，或无菌且无热原。在配制和/或制造药物制剂诸如疫苗组合物时的一般考虑事项可例如见于Remington：The Science andPractice of Pharmacy第21版，Lippincott Williams&Wilkins，2005(以引用的方式整体并入本文)中。
在一些实施方案中，向人、人患者或受试者施用流感RNA(例如mRNA)疫苗。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指RNA(例如mRNA)疫苗或其中含有的多核苷酸，例如编码抗原性多肽的RNA多核苷酸(例如mRNA多核苷酸)。
可通过药理学领域中已知或今后开发的任何方法制备本文所述的流感疫苗组合物的制剂。一般来说，所述制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，接着如果必要和/或合乎需要，那么将产品划分、成形和/或包装成所需单次或多次剂量单位。
本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将视治疗的受试者的身份、身材和/或状况而变化，并且进一步视施用组合物所将采用的途径而变化。举例来说，组合物可包含在0.1％与100％之间，例如在0.5与50％之间，在1-30％之间，在5-80％之间，至少80％(w/w)的活性成分。
可使用一种或多种赋形剂配制流感RNA(例如mRNA)疫苗以：使稳定性增加；使细胞转染增加；容许持续或延迟释放(例如从储槽制剂释放)；改变生物分布(例如靶向特定组织或细胞类型)；使所编码蛋白质在体内的翻译增加；和/或改变所编码蛋白质(抗原)在体内的释放概况。除传统赋形剂诸如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或混悬助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，赋形剂也可包括不限于类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质复合物、核心-壳体纳米粒子、肽、蛋白质、用流感RNA(例如mRNA)疫苗转染的细胞(例如用于向受试者中移植)、透明质酸酶、纳米粒子模拟物及其组合。
稳定元件
已发现天然存在的真核mRNA分子含有稳定元件，除其他结构特征诸如5′帽结构或3′聚腺苷酸尾部之外，也包括但不限于在它们的5′末端的非翻译区(UTR)(5′UTR)和/或在它们的3′末端的非翻译区(3′UTR)。5′UTR与3′UTR两者均通常从基因组DNA转录，并且是成熟前mRNA的元件。成熟mRNA的特征性结构特征诸如5′帽和3′聚腺苷酸尾部通常在mRNA加工期间添加至转录的(成熟前)mRNA中。3′聚腺苷酸尾部通常是一段添加至转录的mRNA的3′末端的腺嘌呤核苷酸。它可包含多达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3′聚腺苷酸尾部的长度可为对于个体mRNA的稳定性来说所必需的要素。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可包括一种或多种稳定元件。稳定元件可包括例如组蛋白茎-环。已鉴定作为32kDa蛋白质的茎-环结合蛋白(SLBP)。它在核与细胞质两者中在组蛋白信息的3′末端与组蛋白茎-环缔合。它的表达水平由细胞周期调控；它在S期期间达到峰值，此时组蛋白mRNA水平也升高。已显示所述蛋白质为由U7snRNP对组蛋白前mRNA进行高效3′末端加工所必需。在加工之后，SLBP继续与茎-环缔合，接着在细胞质中刺激成熟组蛋白mRNA翻译成组蛋白。SLBP的RNA结合结构域遍及后生动物和原生动物是保守的；它与组蛋白茎-环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎-环在5’的至少三个核苷酸和在3’的两个核苷酸。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗包括编码区、至少一个组蛋白茎-环，以及任选地，聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号通常应使所编码蛋白质的表达水平增强。在一些实施方案中，所编码蛋白质不是组蛋白、报告体蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或标志物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，尽管两者均代表自然界中的替代性机理，但聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号和至少一个组蛋白茎-环的组合以协同方式作用以增加蛋白质表达，超过单独元件各自观察到的水平。已发现聚腺苷酸和至少一个组蛋白茎-环的组合的协同作用不取决于元件的顺序或聚腺苷酸序列的长度。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗不包含组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括在天然存在的茎-环的3′的一段具有约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸，其代表参与将组蛋白前mRNA加工成成熟组蛋白mRNA中的U7 snRNA的结合位点。理想地，本发明核酸不包括内含子。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可或可不含有增强子和/或启动子序列，其可以是修饰的或未修饰的，或其可以是活化的或未活化的。在一些实施方案中，组蛋白茎-环通常源于组蛋白基因，并且包括由包括短序列(例如由短序列组成)的间隔子分隔的两个相邻的、部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，所述间隔子形成结构的环。未配对的环区域通常不能与茎环元件中的任一者进行碱基配对。它更经常存在于RNA中，正如是许多RNA二级结构的关键组分那样，但也可存在于单链DNA中。茎-环结构的稳定性通常取决于配对区域的长度、错配或突起数目和碱基组成。在一些实施方案中，可产生摇摆碱基配对(非沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对)。在一些实施方案中，至少一个组蛋白茎-环序列包含15至45个核苷酸的长度。
在其他实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可已移除一个或多个富含AU的序列。有时被称为AURES的这些序列是见于3’UTR中的去稳定序列。可将AURES从RNA(例如mRNA)疫苗移除。或者，AURES可保持在RNA(例如mRNA)疫苗中。
纳米粒子制剂
在一些实施方案中，在纳米粒子中配制流感RNA(例如mRNA)疫苗。在一些实施方案中，在脂质纳米粒子中配制流感RNA(例如mRNA)疫苗。在一些实施方案中，在被称为阳离子脂质纳米粒子的脂质-聚阳离子复合物中配制流感RNA(例如mRNA)疫苗。作为一非限制性实例，聚阳离子可包括阳离子肽或多肽，诸如但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸。在一些实施方案中，在包括非阳离子脂质诸如但不限于胆固醇或二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的脂质纳米粒子中配制流感RNA(例如mRNA)疫苗。
脂质纳米粒子制剂可受但不限于以下的影响：对阳离子脂质组分的选择、阳离子脂质饱和的程度、聚乙二醇化的性质、所有组分的比率和诸如尺寸的生物物理学参数。在Semple等人(Nature Biotech.2010 28：172-176)的一个实例中，脂质纳米粒子制剂由57.1％阳离子脂质、7.1％二棕榈酰基磷脂酰胆碱、34.3％胆固醇和1.4％PEG-c-DMA组成。作为另一实例，改变阳离子脂质的组成可将siRNA更有效递送至各种抗原递呈细胞(Basha等Mol Ther.2011 19：2186-2200)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂可包含35至45％阳离子脂质、40％至50％阳离子脂质、50％至60％阳离子脂质和/或55％至65％阳离子脂质。在一些实施方案中，在脂质纳米粒子中，脂质与RNA(例如mRNA)的比率可为5∶1至20∶1、10∶1至25∶1、15∶1至30∶1和/或至少30∶1。
在一些实施方案中，可使脂质纳米粒子制剂中的PEG的比率增加或降低，和/或可将PEG脂质的碳链长度从C14改进至C18以改变脂质纳米粒子制剂的药物动力学和/或生物分布。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子制剂可含有相较于阳离子脂质、DSPC和胆固醇，0.5％至3.0％、1.0％至3.5％、1.5％至4.0％、2.0％至4.5％、2.5％至5.0％和/或3.0％至6.0％的脂质摩尔比的PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)(在本文中也称为PEG-DOMG)。在一些实施方案中，PEG-c-DOMG可用PEG脂质诸如但不限于PEG-DSG(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)和/或PEG-DPG(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)替换。阳离子脂质可选自本领域中已知的任何脂质，诸如但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗制剂是包含至少一种脂质的纳米粒子。脂质可选自但不限于DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙二醇化脂质和氨基醇脂质。在一些实施方案中，脂质可为阳离子脂质，诸如但不限于DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA和氨基醇脂质。氨基醇阳离子脂质可为美国专利公布号US20130150625中所述和/或通过美国专利公布号US20130150625中所述的方法制备的脂质，所述专利以引用的方式整体并入本文。作为一非限制性实例，阳离子脂质可为2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，2Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物1)；2-氨基-3-[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物2)；2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛基氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中的化合物3)；和2-(二甲基氨基)-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物4)；或其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
脂质纳米粒子制剂通常包含脂质，特别是可离子化阳离子脂质，例如2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)或9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，并且进一步包含中性脂质、固醇和能够减少粒子聚集的分子例如PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由以下组成：(i)至少一种选自由以下组成的组的脂质：2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)；(ii)中性脂质，其选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和SM；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，呈20-60％阳离子脂质：5-25％中性脂质：25-55％固醇：0.5-15％PEG-脂质的摩尔比。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括基于摩尔数，25％至75％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，例如基于摩尔数，35至65％、45至65％、60％、57.5％、50％或40％。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括基于摩尔数，0.5％至15％的中性脂质，例如基于摩尔数，3至12％、5至10％或15％、10％或7.5％。中性脂质的实例包括但不限于DSPC、POPC、DPPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，制剂包括基于摩尔数，5％至50％的固醇(例如基于摩尔数，15至45％、20至40％、40％、38.5％、35％或31％)。固醇的一非限制性实例是胆固醇。在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括基于摩尔数，0.5％至20％的PEG或经PEG修饰的脂质(例如基于摩尔数，0.5至10％、0.5至5％、1.5％、0.5％、1.5％、3.5％或5％)。在一些实施方案中，PEG或经PEG修饰的脂质包含平均分子量是2,000Da的PEG分子。在一些实施方案中，PEG或经PEG修饰的脂质包含平均分子量是小于2,000，例如约1,500Da、约1,000Da或约500Da的PEG分子。经PEG修饰的脂质的非限制性实例包括PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DMG)(在本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(进一步讨论于Reyes等J.Controlled Release，107，276-287(2005)中，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括25-75％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，0.5-15％的中性脂质，5-50％的固醇，和0.5-20％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括35-65％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，3-12％的中性脂质，15-45％的固醇，和0.5-10％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括45-65％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，5-10％的中性脂质，25-40％的固醇，和0.5-10％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括60％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，7.5％的中性脂质，31％的固醇，和1.5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括50％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，10％的中性脂质，38.5％的固醇，和1.5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括50％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，10％的中性脂质，35％的固醇，4.5％或5％的PEG或经PEG修饰的脂质，和0.5％的靶向性脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括40％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，15％的中性脂质，40％的固醇，和5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括57.2％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，7.1％的中性脂质，34.3％的固醇，和1.4％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，脂质纳米粒子制剂包括57.5％的选自是PEG-cDMA(PEG-cDMA进一步讨论于Reyes等(J.Controlled Release，107，276-287(2005)中，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)的PEG脂质的阳离子脂质，7.5％的中性脂质，31.5％的固醇，和3.5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由呈20-70％阳离子脂质：5-45％中性脂质：20-55％胆固醇：0.5-15％经PEG修饰的脂质的摩尔比的脂质混合物组成。在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由呈20-60％阳离子脂质：5-25％中性脂质：25-55％胆固醇：0.5-15％经PEG修饰的脂质的摩尔比的脂质混合物组成。
在一些实施方案中，摩尔脂质比率是50/10/38.5/1.5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG)、57.2/7.1134.3/1.4(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DPPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-cDMA)、40/15/40/5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG)、50/10/35/4.5/0.5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DSG)、50/10/35/5(阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG)、40/10/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG或PEG-cDMA)、35/15/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG或PEG-cDMA)或52/13/30/5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG或PEG-cDMA)。
脂质纳米粒子组合物和制备它们的方法的非限制性实例描述于例如Semple等(2010)Nat.Biotechnol.28：172-176；Jayarama等(2012)，Angew.Chem.Int.Ed.，51：8529-8533；以及Maier等(2013)Molecular Therapy 21，1570-1578(其各自的内容以引用的方式整体并入本文)中。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂可包含阳离子脂质、PEG脂质和结构性脂质，并且任选包含非阳离子脂质。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含40-60％的阳离子脂质，5-15％的非阳离子脂质，1-2％的PEG脂质和30-50％的结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含50％阳离子脂质，10％非阳离子脂质，1.5％PEG脂质和38.5％结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含55％阳离子脂质，10％非阳离子脂质，2.5％PEG脂质和32.5％结构性脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质可为本文所述的任何阳离子脂质，诸如但不限于DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子制剂可为4组分脂质纳米粒子。脂质纳米粒子可包含阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG脂质和结构性脂质。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含40-60％的阳离子脂质，5-15％的非阳离子脂质，1-2％的PEG脂质和30-50％的结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含50％阳离子脂质，10％非阳离子脂质，1.5％PEG脂质和38.5％结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含55％阳离子脂质，10％非阳离子脂质，2.5％PEG脂质和32.5％结构性脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质可为本文所述的任何阳离子脂质，诸如但不限于DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子制剂可包含阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG脂质和结构性脂质。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子包含50％的阳离子脂质DLin-KC2-DMA，10％的非阳离子脂质DSPC，1.5％的PEG脂质PEG-DOMG和38.5％的结构性脂质胆固醇。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子包含50％的阳离子脂质DLin-MC3-DMA，10％的非阳离子脂质DSPC，1.5％的PEG脂质PEG-DOMG和38.5％的结构性脂质胆固醇。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子包含50％的阳离子脂质DLin-MC3-DMA，10％的非阳离子脂质DSPC，1.5％的PEG脂质PEG-DMG和38.5％的结构性脂质胆固醇。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子包含55％的阳离子脂质L319，10％的非阳离子脂质DSPC，2.5％的PEG脂质PEG-DMG和32.5％的结构性脂质胆固醇。
疫苗组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量可根据所治疗受试者的身份、身材和/或状况而变化，并且进一步根据组合物的施用途径而变化。举例来说，组合物可包含在0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。举例来说，组合物可包含在0.1％与100％之间，例如在.5与50％之间，在1-30％之间，在5-80％之间，至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗组合物可包含在包含MC3、胆固醇、DSPC和PEG2000-DMG的脂质纳米粒子、缓冲剂柠檬酸钠、蔗糖和注射用水中配制的本文所述的多核苷酸。作为一非限制性实例，组合物包含：2.0mg/mL的药物物质，21.8mg/mL的MC3，10.1mg/mL的胆固醇，5.4mg/mL的DSPC，2.7mg/mL的PEG2000-DMG，5.16mg/mL的柠檬酸钠，71mg/mL的蔗糖和1.0mL的注射用水。
在一些实施方案中，纳米粒子(例如脂质纳米粒子)具有10-500nm、20-400nm、30-300nm、40-200nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米粒子(例如脂质纳米粒子)具有50-150nm、50-200nm、80-100nm或80-200nm的平均直径。
脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子
本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可使用一种或多种脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子来配制。在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗的药物组合物包括脂质体。脂质体是人工制备的囊泡，其可主要由脂质双层组成，并且可作为递送载体用于施用营养物和药物制剂。脂质体可具有不同尺寸，诸如但不限于直径可为数百纳米，并且可含有由狭窄水性区室分隔的一系列同心双层的多层囊泡(MLV)，直径可为小于50nm的小单细胞囊泡(SUV)，以及直径可在50与500nm之间的大单层囊泡(LUV)。脂质体设计可包括但不限于调理素(opsonin)或配体以改善脂质体对不健康组织的附着或激活诸如但不限于胞吞的事件。脂质体可含有低pH或高pH以改善药物制剂的递送。
脂质体的形成可取决于物理化学特征，诸如但不限于圈闭的药物制剂和脂质体成分、脂质囊泡分散于其中的介质的性质、圈闭物质的有效浓度和它的潜在毒性、在施加和/或递送囊泡期间涉及的任何其他过程、囊泡用于预定应用的最优化尺寸、多分散性和储存期限、以及大规模生产安全和高效脂质体产品的批次与批次间重现性和可能性。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可包括但不限于诸如由以下形成的那些的脂质体：1，2-二油烯基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、来自MarinaBiotech(Bothell，WA)的DiLa2脂质体、1，2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)和MC3(US20100324120；以引用的方式整体并入本文)以及可递送小分子药物的脂质体，诸如但不限于来自Janssen Biotech，Inc.(Horsham，PA)的
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可包括但不限于诸如由合成先前已被描述并且显示适于在体外和在体内进行寡核苷酸递送的稳定化质粒-脂质粒子(SPLP)或稳定化核酸脂质粒子(SNALP)形成的那些的脂质体(参见Wheeler等Gene Therapy.1999 6：271-281；Zhang等Gene Therapy.1999 6：1438-1447；Jeffs等Pharm Res.2005 22：362-372；Morrissey等，Nat Biotechnol.2005 2：1002-1007；Zimmermann等，Nature.2006 441：111-114；Heyes等J Contr Rel.2005 107：276-287；Semple等Nature Biotech.2010 28：172-176；Judge等J Clin Invest.2009 119：661-673；deFougerolles Hum GeneTher.2008 19：125-132；美国专利公布号US20130122104；其全都整体并入本文)。Wheeler等人的原始制造方法是清洁剂透析方法，其稍后由Jeffs等人改进，并且被称为自发囊泡形成方法。除多核苷酸之外，脂质体制剂还由3至4个脂质组分组成。作为一实例，脂质体可含有但不限于55％胆固醇，20％二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，10％PEG-S-DSG和15％1，2-二油烯基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DODMA)，如由Jeffs等人所述。作为另一实例，某些脂质体制剂可含有但不限于48％胆固醇，20％DSPC，2％PEG-c-DMA和30％阳离子脂质，其中阳离子脂质可为1，2-二硬脂基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1，2-二亚麻基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)，如由Heyes等人所述。
在一些实施方案中，脂质体制剂可包含约25.0％胆固醇至约40.0％胆固醇、约30.0％胆固醇至约45.0％胆固醇、约35.0％胆固醇至约50.0％胆固醇和/或约48.5％胆固醇至约60％胆固醇。在一些实施方案中，制剂可包含选自由以下组成的组的百分比的胆固醇：28.5％、31.5％、33.5％、36.5％、37.0％、38.5％、39.0％和43.5％。在一些实施方案中，制剂可包含约5.0％至约10.0％DSPC和/或约7.0％至约15.0％DSPC。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗药物组合物可在诸如但不限于以下的脂质体中配制：DiLa2脂质体(Marina Biotech，Bothell，WA)、(MarinaBiotech，Bothell，WA)、基于中性DOPC(1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如针对卵巢癌的siRNA递送(Landen等Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)；所述文献以引用的方式整体并入本文)和透明质酸涂布的脂质体(QuietTherapeutics，Israel)。
在一些实施方案中，阳离子脂质可为低分子量阳离子脂质，诸如美国专利申请号20130090372中所述的那些，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可配制于可在官能化脂质双层之间具有交联的脂质囊泡中。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可在脂质-聚阳离子复合物中配制。脂质-聚阳离子复合物的形成可通过本领域中已知和/或如美国公布号20120178702中所述的方法来实现，所述公布以引用的方式整体并入本文。作为一非限制性实例，聚阳离子可包括阳离子肽或多肽，诸如但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸。在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可在脂质-聚阳离子复合物中配制，所述复合物可进一步包括非阳离子脂质，诸如但不限于胆固醇或二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一些实施方案中，可使脂质纳米粒子(LNP)制剂中的PEG的比率增加或降低，和/或可将PEG脂质的碳链长度从C14改进至C18以改变LNP制剂的药物动力学和/或生物分布。作为一非限制性实例，LNP制剂可含有相较于阳离子脂质、DSPC和胆固醇，约0.5％至约3.0％、约1.0％至约3.5％、约1.5％至约4.0％、约2.0％至约4.5％、约2.5％至约5.0％和/或约3.0％至约6.0％的脂质摩尔比的PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)(在本文中也称为PEG-DOMG)。在一些实施方案中，PEG-c-DOMG可用PEG脂质诸如但不限于PEG-DSG(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)和/或PEG-DPG(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)替换。阳离子脂质可选自本领域中已知的任何脂质，诸如但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可在脂质纳米粒子中配制。
在一些实施方案中，包含多核苷酸的RNA(例如mRNA)疫苗制剂是可包含至少一种脂质的纳米粒子。脂质可选自但不限于DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙二醇化脂质和氨基醇脂质。在另一方面，脂质可为阳离子脂质，诸如但不限于DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA和氨基醇脂质。氨基醇阳离子脂质可为美国专利公布号US20130150625中所述和/或通过美国专利公布号US20130150625中所述的方法制备的脂质，所述专利以引用的方式整体并入本文。作为一非限制性实例，阳离子脂质可为2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，2Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物1)；2-氨基-3-[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物2)；2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛基氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中的化合物3)；和2-(二甲基氨基)-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物4)；或其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
脂质纳米粒子制剂通常包含脂质，特别是可离子化阳离子脂质，例如2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)或9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，并且进一步包含中性脂质、固醇和能够减少粒子聚集的分子例如PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由以下组成：(i)至少一种选自由以下组成的组的脂质：2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)；(ii)中性脂质，其选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和SM；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，呈约20-60％阳离子脂质：5-25％中性脂质：25-55％固醇：0.5-15％PEG-脂质的摩尔比。
在一些实施方案中，制剂包括基于摩尔数，约25％至约75％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，例如基于摩尔数，约35至约65％、约45至约65％、约60％、约57.5％、约50％或约40％。
在一些实施方案中，制剂包括基于摩尔数，约0.5％至约15％的中性脂质，例如基于摩尔数，约3至约12％、约5至约10％、或约15％、约10％或约7.5％。中性脂质的实例包括但不限于DSPC、POPC、DPPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，制剂包括基于摩尔数，约5％至约50％的固醇(例如基于摩尔数，约15至约45％、约20至约40％、约40％、约38.5％、约35％或约31％)。一示例性固醇是胆固醇。在一些实施方案中，制剂包括基于摩尔数，约0.5％至约20％的PEG或经PEG修饰的脂质(例如基于摩尔数，约0.5至约10％、约0.5至约5％、约1.5％、约0.5％、约1.5％、约3.5％或约5％)。在一些实施方案中，PEG或经PEG修饰的脂质包含平均分子量是2,000Da的PEG分子。在其他实施方案中，PEG或经PEG修饰的脂质包含平均分子量是小于2,000，例如约1,500Da、约1,000Da或约500Da的PEG分子。经PEG修饰的脂质的实例包括但不限于PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DMG)(在本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(进一步讨论于Reyes等J.Controlled Release，107，276-287(2005)中，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括25-75％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，0.5-15％的中性脂质，5-50％的固醇，和0.5-20％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括35-65％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，3-12％的中性脂质，15-45％的固醇，和0.5-10％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括45-65％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，5-10％的中性脂质，25-40％的固醇，和0.5-10％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括约60％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，约7.5％的中性脂质，约31％的固醇，和约1.5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括约50％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，约10％的中性脂质，约38.5％的固醇，和约1.5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括约50％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，约10％的中性脂质，约35％的固醇，约4.5％或约5％的PEG或经PEG修饰的脂质，和约0.5％的靶向性脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括约40％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，约15％的中性脂质，约40％的固醇，和约5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括约57.2％的选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)的阳离子脂质，约7.1％的中性脂质，约34.3％的固醇，和约1.4％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，基于摩尔数，本公开的制剂包括约57.5％的选自是PEG-cDMA(PEG-cDMA进一步讨论于Reyes等(J.Controlled Release，107，276-287(2005)中，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)的PEG脂质的阳离子脂质，约7.5％的中性脂质，约31.5％的固醇，和约3.5％的PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由呈约20-70％阳离子脂质：5-45％中性脂质：20-55％胆固醇：0.5-15％经PEG修饰的脂质的摩尔比；更优选呈约20-60％阳离子脂质：5-25％中性脂质：25-55％胆固醇：0.5-15％经PEG修饰的脂质的摩尔比的脂质混合物组成。
在一些实施方案中，摩尔脂质比率是约50/10/38.5/1.5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG)、57.2/7.1134.3/1.4(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DPPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-cDMA)、40/15/40/5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG)、50/10/35/4.5/0.5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DSG)、50/10/35/5(阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG)、40/10/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG或PEG-cDMA)、35/15/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG或PEG-cDMA)或52/13/30/5(mol％阳离子脂质/中性脂质例如DSPC/胆固醇/经PEG修饰的脂质例如PEG-DMG或PEG-cDMA)。
脂质纳米粒子组合物及其制备方法的实例例如描述于Semple等(2010)Nat.Biotechnol.28：172-176；Jayarama等(2012)，Angew.Chem.Int.Ed.，51：8529-8533；以及Maier等(2013)Molecular Therapy 21，1570-1578(其各自的内容以引用的方式整体并入本文)中。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子制剂可包含阳离子脂质、PEG脂质和结构性脂质，并且任选包含非阳离子脂质。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含约40-60％的阳离子脂质，约5-15％的非阳离子脂质，约1-2％的PEG脂质和约30-50％的结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含约50％阳离子脂质，约10％非阳离子脂质，约1.5％PEG脂质和约38.5％结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含约55％阳离子脂质，约10％非阳离子脂质，约2.5％PEG脂质和约32.5％结构性脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质可为本文所述的任何阳离子脂质，诸如但不限于DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子制剂可为4组分脂质纳米粒子。脂质纳米粒子可包含阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG脂质和结构性脂质。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含约40-60％的阳离子脂质，约5-15％的非阳离子脂质，约1-2％的PEG脂质和约30-50％的结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含约50％阳离子脂质，约10％非阳离子脂质，约1.5％PEG脂质和约38.5％结构性脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含约55％阳离子脂质，约10％非阳离子脂质，约2.5％PEG脂质和约32.5％结构性脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质可为本文所述的任何阳离子脂质，诸如但不限于DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子制剂可包含阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG脂质和结构性脂质。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子包含约50％的阳离子脂质DLin-KC2-DMA，约10％的非阳离子脂质DSPC，约1.5％的PEG脂质PEG-DOMG和约38.5％的结构性脂质胆固醇。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子包含约50％的阳离子脂质DLin-MC3-DMA，约10％的非阳离子脂质DSPC，约1.5％的PEG脂质PEG-DOMG和约38.5％的结构性脂质胆固醇。作为一非限制性实例，脂质纳米粒子包含约50％的阳离子脂质DLin-MC3-DMA，约10％的非阳离子脂质DSPC，约1.5％的PEG脂质PEG-DMG和约38.5％的结构性脂质胆固醇。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子包含约55％的阳离子脂质L319，约10％的非阳离子脂质DSPC，约2.5％的PEG脂质PEG-DMG和约32.5％的结构性脂质胆固醇。
作为一非限制性实例，阳离子脂质可选自(20Z，23Z)-N，N-二甲基二十九-20，23-二烯-10-胺、(17Z，20Z)-N，N-二甲基二十六-17，20-二烯-9-胺、(1Z，19Z)-N5N-二甲基二十五-16、19-二烯-8-胺、(13Z，16Z)-N，N-二甲基二十二-13，16-二烯-5-胺、(12Z，15Z)-N，N-二甲基二十一-12，15-二烯-4-胺、(14Z，17Z)-N，N-二甲基二十三-14，17-二烯-6-胺、(15Z，18Z)-N，N-二甲基二十四-15，18-二烯-7-胺、(18Z，21Z)-N，N-二甲基二十七-18，21-二烯-10-胺、(15Z，18Z)-N，N-二甲基二十四-15，18-二烯-5-胺、(14Z，17Z)-N，N-二甲基二十三-14，17-二烯-4-胺、(19Z，22Z)-N，N-二甲基二十八-19，22-二烯-9-胺、(18Z，21Z)-N，N-二甲基二十七-18，21-二烯-8-胺、(17Z，20Z)-N，N-二甲基二十六-17，20-二烯-7-胺、(16Z，19Z)-N，N-二甲基二十五-16，19-二烯-6-胺、(22Z，25Z)-N，N-二甲基三十一-22，25-二烯-10-胺、(21Z，24Z)-N，N-二甲基三十-21，24-二烯-9-胺、(18Z)-N，N-二甲基二十七-18-烯-10-胺、(17Z)-N，N-二甲基二十六-17-烯-9-胺、(19Z，22Z)-N，N-二甲基二十八-19，22-二烯-7-胺、N，N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z，23Z)-N-乙基-N-甲基二十九-20，23-二烯-10-胺、1-[(11Z，14Z)-1-壬基二十-11，14-二烯-1-基]吡咯烷、(20Z)-N，N-二甲基二十七-20-烯-10-胺、(15Z)-N，N-二甲基二十七-15-烯-10-胺、(14Z)-N，N-二甲基二十九-14-烯-10-胺、(17Z)-N，N-二甲基二十九-17-烯-10-胺、(24Z)-N，N-二甲基三十三-24-烯-10-胺、(20Z)-N，N-二甲基二十九-20-烯-10-胺、(22Z)-N，N-二甲基三十一-22-烯-10-胺、(16Z)-N，N-二甲基二十五-16-烯-8-胺、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一-12，15-二烯-1-胺、(13Z，16Z)-N，N-二甲基-3-壬基二十二-13，16-二烯-1-胺、N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺、1-[(1S，2R)-2-己基环丙基]-N，N-二甲基十九烷-10-胺、N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺、N，N-二甲基-21-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]二十一烷-10-胺，N，N-二甲基-1-[(1S，2S)-2-{[(1R，2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九烷-10-胺，N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺、N，N-二甲基-[(1R，2S)-2-十一基环丙基]十四烷-5-胺、N，N-二甲基-3-{7-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1-胺、1-[(1R，2S)-2-庚基环丙基]-N，N-二甲基十八烷-9-胺、1-[(1S，2R)-2-癸基环丙基]-N，N-二甲基十五烷-6-胺、N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺、R-N，N-二甲基-1-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙-2-胺、S-N，N-二甲基-1-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛基氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N，N-二甲基-1-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧基]丙-2-胺、1-{2-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛基氧基)甲基]乙基}氮杂环丁烷、(2S)-1-(己基氧基)-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2S)-1-(庚基氧基)-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N，N-二甲基-1-(壬基氧基)-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N，N-二甲基-1-[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙-2-胺；(2S)-N，N-二甲基-1-[(6Z，9Z，12Z)-十八-6，9，12-三烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z，14Z)-二十-11，14-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(戊基氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己基氧基)-3-[(11Z，14Z)-二十-11，14-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z，14Z)-二十-11，14-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛基氧基)丙-2-胺、1-[(13Z，16Z)-二十二-13，16-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛基氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z，16Z)-二十二-13，16-二烯-1-基氧基]-3-(己基氧基)-N，N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二-13-烯-1-基氧基]-3-(己基氧基)-N，N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二-13-烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛基氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六-9-烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛基氧基)丙-2-胺、(2R)-N，N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2R)-1-[(3，7-二甲基辛基)氧基]-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N，N-二甲基-1-(辛基氧基)-3-({8-[(1S，2S)-2-{[(1R，2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}氧基)丙-2-胺、N，N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧基}-3-(辛基氧基)丙-2-胺和(11E，20Z，23Z)-N，N-二甲基二十九-11，20，2-三烯-10-胺或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗的LNP制剂可含有3％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG。在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗的LNP制剂可含有1.5％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗的药物组合物可包括至少一种国际公布号WO2012099755中所述的聚乙二醇化脂质，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，LNP制剂可含有PEG-DMG 2000(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。在一些实施方案中，LNP制剂可含有PEG-DMG 2000、本领域中已知的阳离子脂质和至少一种其他组分。在一些实施方案中，LNP制剂可含有PEG-DMG 2000、本领域中已知的阳离子脂质、DSPC和胆固醇。作为一非限制性实例，LNP制剂可含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇。作为另一非限制性实例，LNP制剂可含有呈2∶40∶10∶48的摩尔比的PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇(参见例如Geall等，Nonviral delivery of self-amplifying RNA(e.g.，mRNA)vaccines，PNAS 2012；PMID：22908294，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
本文所述的脂质纳米粒子可在无菌环境中制备。
在一些实施方案中，LNP制剂可以诸如核酸-脂质粒子的纳米粒子形式配制。作为一非限制性实例，脂质粒子可包含一种或多种活性剂或治疗剂；一种或多种占粒子中存在的总脂质的约50mol％至约85mol％的阳离子脂质；一种或多种占粒子中存在的总脂质的约13mol％至约49.5mol％的非阳离子脂质；以及一种或多种占粒子中存在的总脂质的约0.5mol％至约2mol％的抑制粒子的聚集的缀合脂质。
纳米粒子制剂可包含磷酸缀合物。磷酸缀合物可使纳米粒子的体内循环时间增加和/或使纳米粒子的靶向递送增加。作为一非限制性实例，磷酸缀合物可包括具有国际申请号WO2013033438中所述的任一结构式的化合物，所述申请的内容以引用的方式整体并入本文。
纳米粒子制剂可包含聚合物缀合物。聚合物缀合物可为水溶性缀合物。聚合物缀合物可具有如美国专利申请号20130059360中所述的结构，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，可使用美国专利申请号20130072709中所述的方法和/或区段化聚合试剂制备具有本公开的多核苷酸的聚合物缀合物，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，聚合物缀合物可具有包含环部分的侧挂侧基，所述聚合物缀合物诸如但不限于美国专利公布号US20130196948中所述的聚合物缀合物，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
纳米粒子制剂可包含用以使本公开的纳米粒子在受试者中的递送增强的缀合物。此外，缀合物可抑制受试者中对纳米粒子的吞噬清除。在一个方面，缀合物可为根据人膜蛋白CD47设计的“自身”肽(例如由Rodriguez等(Science 2013 339，971-975)所述的“自身”粒子，所述文献以引用的方式整体并入本文)。如由Rodriguez等人所示，自身肽使巨噬细胞介导的对纳米粒子的清除延迟，此使纳米粒子的递送增强。在另一方面，缀合物可为膜蛋白CD47(例如参见Rodriguez等Science 2013 339，971-975，其以引用的方式整体并入本文)。Rodriguez等人显示，类似于“自身”肽，相较于搅乱肽和PEG涂布的纳米粒子，CD47可使受试者中的循环粒子比率增加。
在一些实施方案中，在纳米粒子中配制本公开的RNA(例如mRNA)疫苗，所述纳米粒子包含用以使本公开的纳米粒子在受试者中的递送增强的缀合物。缀合物可为CD47膜，或缀合物可源于CD47膜蛋白，诸如先前所述的“自身”肽。在一些实施方案中，纳米粒子可包含PEG以及CD47或其衍生物的缀合物。在一些实施方案中，纳米粒子可包含上述“自身”肽与膜蛋白CD47两者。
在一些实施方案中，可使“自身”肽和/或CD47蛋白缀合于如本文所述的病毒样粒子或假病毒粒子以递送本公开的RNA(例如mRNA)疫苗。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗药物组合物包含本公开的多核苷酸和可具有可降解键联的缀合物。缀合物的非限制性实例包括包含可离子化氢原子的芳族部分、间隔部分和水溶性聚合物。作为一非限制性实例，包含具有可降解键联的缀合物的药物组合物和用于递送所述药物组合物的方法描述于美国专利公布号US20130184443中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
纳米粒子制剂可为包含碳水化合物载体和RNA(例如mRNA)疫苗的碳水化合物纳米粒子。作为一非限制性实例，碳水化合物载体可包括但不限于经酸酐修饰的植物糖原或糖原型物质、植物糖原辛烯基丁二酸酯、植物糖原β-糊精、经酸酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如国际公布号WO2012109121；其内容以引用的方式整体并入本文)。
本公开的纳米粒子制剂可用表面活性剂或聚合物涂布以使粒子的递送改进。在一些实施方案中，纳米粒子可用亲水性包衣涂布，所述包衣诸如但不限于PEG包衣和/或具有中性表面电荷的包衣。亲水性包衣可有助于在中枢神经系统内递送具有较大有效载荷诸如但不限于RNA(例如mRNA)疫苗的纳米粒子。作为一非限制性实例，包含亲水性包衣的纳米粒子和制备所述纳米粒子的方法描述于美国专利公布号US20130183244中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的脂质纳米粒子可为亲水性聚合物粒子。亲水性聚合物粒子和制备亲水性聚合物粒子的方法的非限制性实例描述于美国专利公布号US20130210991中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的脂质纳米粒子可为疏水性聚合物粒子。
脂质纳米粒子制剂可通过用称为快速消除脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解阳离子脂质替换阳离子脂质来改进。已显示诸如但不限于DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA的可离子化阳离子脂质会随时间积累在血浆和组织中，并且可为潜在毒性来源。在大鼠中，对快速消除脂质的快速代谢可使脂质纳米粒子的可耐受性和治疗指数改进从1mg/kg剂量至10mg/kg剂量的数量级。包括酶降解酯键可使阳离子组分的降解和代谢概况改进，同时仍然维持reLNP制剂的活性。可使酯键在内部位于脂质链内，或可使它在末端位于脂质链的末端。内部酯键可替换脂质链中的任何碳。
在一些实施方案中，可使内部酯键位于饱和碳的任一侧上。
在一些实施方案中，免疫应答可通过递送可包括纳米物质、聚合物和免疫原的脂质纳米粒子来引发。(美国公布号20120189700和国际公布号WO2012099805；其各自以引用的方式整体并入本文)。聚合物可囊封纳米物质，或部分囊封纳米物质。免疫原可为本文所述的重组蛋白、经修饰RNA和/或多核苷酸。在一些实施方案中，可配制脂质纳米粒子以用于诸如但不限于针对病原体的疫苗中。
脂质纳米粒子可经工程化以改变粒子的表面性质，因此脂质纳米粒子可穿透粘膜屏障。粘液位于粘膜组织上，所述粘膜组织诸如但不限于口腔(例如颊膜和食道膜以及扁桃腺组织)、眼、胃肠(例如胃、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻、呼吸道(例如鼻、咽、气管和支气管膜)、生殖器(例如阴道、子宫颈和尿道膜)。对于达成较高药物囊封效率以及能够提供对一系列广泛药物的持续递送来说是优选的大于10-200nm的纳米粒子已被认为太大以致不能穿过粘膜屏障快速扩散。粘液被连续分泌，排出，废弃或消化以及再循环，因此大多数经捕集粒子可在数秒内或在数小时内被从粘膜组织移除。已用低分子量聚乙二醇(PEG)密集涂布的大型聚合纳米粒子(直径是200nm-500nm)穿过粘液扩散低至相同粒子在水中扩散的仅1/4至1/6(Lai等PNAS 2007 104：1482-487；Lai等Adv Drug Deliv Rev.2009 61：158-171；其各自以引用的方式整体并入本文)。可使用渗透率和/或荧光显微术技术来确定纳米粒子的输送，所述技术包括但不限于荧光光漂白后恢复(FRAP)和高分辨率多粒子追踪(MPT)。作为一非限制性实例，可穿透粘膜屏障的组合物可如美国专利号8,241,670或国际专利公布号WO2013110028中所述加以制备，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。
经工程化以穿透粘液的脂质纳米粒子可包含聚合物质(即聚合核心)和/或聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。聚合物质可包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。聚合物质可为生物可降解的和/或生物可相容的。生物可相容聚合物的非限制性实例描述于国际专利公布号WO2013116804中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可另外对聚合物质进行照射。作为一非限制性实例，可对聚合物质进行γ照射(参见例如国际申请号WO201282165，其以引用的方式整体并入本文)。特定聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PEO-共-D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PPO-共-D，L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷酯、聚氨酯、聚L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟基丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(醚酯)、聚碳酸酯、聚烯烃诸如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇诸如聚(乙二醇)(PEG)、聚氧化烯(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷酯诸如聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯诸如聚(乙酸乙烯酯)、聚卤乙烯诸如聚(氯乙烯)(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素诸如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟基丙基纤维素、羧基甲基纤维素，丙烯酸的聚合物诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸十二基酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八基酯)及其共聚物和混合物，聚二噁烷酮和它的共聚物、聚羟基链烷酸酯、聚反丁烯二酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、PEG-PLGA-PEG和三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米粒子可用共聚物涂布或与共聚物缔合，所述共聚物诸如但不限于嵌段共聚物(诸如国际公布号WO2013012476中所述的分支聚醚-聚酰胺嵌段共聚物，所述公布以引用的方式整体并入本文)和(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(参见例如美国公布20120121718和美国公布20100003337和美国专利号8,263,665，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。共聚物可为通常被认为是安全的(GRAS)聚合物，并且可以不产生新的化学实体的方式形成脂质纳米粒子。举例来说，脂质纳米粒子可包含涂布PLGA纳米粒子的泊洛沙姆，而不形成新的化学实体，所述纳米粒子仍然能够快速穿透人粘液(Yang等Angew.Chem.Int.Ed.2011 50：2597-2600；其内容以引用的方式整体并入本文)。一种用以产生可穿透人粘液的纳米粒子的非限制性可缩放方法由Xu等人(参见例如J Control Release 2013，170：279-86；其内容以引用的方式整体并入本文)描述。
聚合物-维生素缀合物的维生素可为维生素E。缀合物的维生素部分可用其他适合组分诸如但不限于维生素A、维生素E、其他维生素、胆固醇、疏水性部分、或其他表面活性剂的疏水性组分(例如固醇链、脂肪酸、烃链和氧化烯链)替代。
经工程化以穿透粘液的脂质纳米粒子可包括表面改变剂，诸如但不限于多核苷酸、阴离子蛋白质(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子表面活性剂，诸如像二甲基二(十八基)-溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如N-乙酰基半胱氨酸、艾蒿(mugwort)、菠萝蛋白酶(bromelain)、木瓜蛋白酶(papain)、大青(clerodendrum)、乙酰基半胱氨酸、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美斯纳(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺素β4(thymosin β4)、链道酶α(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)、厄多司坦(erdosteine))和各种DNA酶，包括rhDNA酶。可使表面改变剂包埋或缠绊在粒子的表面中，或安置(例如通过涂布、吸附、共价连接或其他过程)在脂质纳米粒子的表面上。(参见例如美国公布20100215580以及美国公布20080166414和US20130164343；其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，粘液穿透性脂质纳米粒子可包含至少一种本文所述的多核苷酸。可使多核苷酸囊封在脂质纳米粒子中和/或安置在粒子的表面上。可使多核苷酸共价偶联于脂质纳米粒子。粘液穿透性脂质纳米粒子的制剂可包含多种纳米粒子。此外，制剂可含有可与粘液相互作用以及改变周围粘液的结构性质和/或粘着性质以使粘膜粘附降低的粒子，此可使粘液穿透性脂质纳米粒子向粘膜组织的递送增加。
在一些实施方案中，粘液穿透性脂质纳米粒子可为包含粘膜穿透增强性包衣的低张制剂。制剂对于它所向其递送的上皮来说可为低张的。低张制剂的非限制性实例可见于国际专利公布号WO2013110028中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，为使穿过粘膜屏障的递送增强，RNA(例如mRNA)疫苗制剂可包括或可为低张溶液。发现低张溶液使诸如但不限于粘液穿透性粒子的粘膜惰性粒子能够到达阴道上皮表面所处的速率增加(参见例如Ensign等Biomaterials 2013 34(28)：6922-9，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，将RNA(例如mRNA)疫苗配制成脂质复合物，诸如不限于来自Silence Therapeutics(London，United Kingdom)的ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和其他siRNA-脂质复合物技术，来自(Cambridge，MA)的STEMFECTTM，以及基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白的靶向和非靶向核酸递送(Aleku等Cancer Res.200868：9788-9798；Strumberg等Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50：76-78；Santel等，GeneTher 2006 13：1222-1234；Santel等，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等，PulmPharmacol.Ther.2010 23：334-344；Kaufmann等Microvasc Res 2010 80：286-293；Weide等J Immunother.2009 32：498-507；Weide等J Immunother.2008 31：180-188；PascoloExpert Opin.Biol.Ther.4：1285-1294；Fotin-Mleczek等，2011 J.Immunother.34：1-15；Song等，Nature Biotechnol.2005，23：709-717；Peer等，Proc Natl Acad Sci U S A.20076；104：4095-4100；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19：125-132，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，也可构建所述制剂，或改变组合物以使它们在体内被动地或主动地被导向不同细胞类型，包括但不限于肝细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、抗原递呈细胞和白细胞(Akinc等Mol Ther.2010 18：1357-1364；Song等，Nat Biotechnol.200523：709-717；Judge等，J Clin Invest.2009 119：661-673；Kaufmann等，Microvasc Res2010 80：286-293；Santel等，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等，Gene Ther 200613：1360-1370；Gutbier等，Pulm Pharmacol.Ther.2010 23：334-344；Basha等，Mol.Ther.2011 19：2186-2200；Fenske和Cullis，Expert Opin Drug Deliv.2008 5：25-44；Peer等，Science.2008 319：627-630；Peer和Lieberman，Gene Ther.2011 18：1127-1133，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。使制剂被动靶向肝细胞的一个实例包括基于DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA的脂质纳米粒子制剂，已显示其在体内结合至载脂蛋白E，并且促进这些制剂向肝细胞中结合和摄取(Akinc等Mol Ther.2010 18：1357-1364，其内容以引用的方式整体并入本文)。制剂也可通过在它们的表面上表达不同配体来被选择性靶向，如由但不受限于叶酸、转铁蛋白、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)和抗体靶向方法所例示(Kolhatkar等，Curr Drug Discov Technol.2011 8：197-206；Musacchio和Torchilin，Front Biosci.2011 16：1388-1412；Yu等，Mol Membr Biol.2010 27：286-298；Patil等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25：1-61；Benoit等，Biomacromolecules.2011 12：2708-2714；Zhao等，Expert Opin Drug Deliv.2008 5：309-319；Akinc等，Mol Ther.2010 18：1357-1364；Srinivasan等，Methods Mol Biol.2012820：105-116；Ben-Arie等，Methods Mol Biol.2012 757：497-507；Peer 2010 J ControlRelease.20：63-68；Peer等，Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104：4095-4100；Kim等，Methods Mol Biol.2011 721：339-353；Subramanya等，Mol Ther.2010 18：2028-2037；Song等，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Peer等，Science.2008 319：627-630；Peer和Lieberman，Gene Ther.2011 18：1127-1133，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，将RNA(例如mRNA)疫苗配制成固体脂质纳米粒子。固体脂质纳米粒子(SLN)可为球形，具有在10至1000nm之间的平均直径。SLN具有固体脂质核心基质，其可使亲脂性分子溶解，并且可用表面活性剂和/或乳化剂稳定化。在一些实施方案中，脂质纳米粒子可为自装配脂质-聚合物纳米粒子(参见Zhang等，ACS Nano，2008，2，第1696-1702页；其内容以引用的方式整体并入本文)。作为一非限制性实例，SLN可为国际专利公布号WO2013105101中所述的SLN，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。作为另一非限制性实例，SLN可通过国际专利公布号WO2013105101中所述的方法或过程制备，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子可用于使多核苷酸引导的蛋白质产生的功效改进，因为这些制剂可能够使由RNA(例如mRNA)疫苗达成的细胞转染增加和/或使所编码蛋白质的翻译增加。一个所述实例涉及使用脂质囊封来使得能够有效全身性递送聚合复合物质粒DNA(Heyes等，Mol Ther.2007 15：713-720；其内容以引用的方式整体并入本文)。脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子也可用于使多核苷酸的稳定性增加。
在一些实施方案中，可配制本公开的RNA(例如mRNA)疫苗以进行控制释放和/或靶向递送。如本文所用，“控制释放”是指符合特定释放样式以实现治疗效果的药物组合物或化合物释放概况。在一些实施方案中，可将RNA(例如mRNA)疫苗囊封至本文所述和/或本领域中已知的递送剂中以达成控制释放和/或靶向递送。如本文所用，术语“囊封”意指包封、包围或包裹。当它涉及本公开化合物的制剂时，囊封可为实质性囊封、完全囊封或部分囊封。术语“实质上囊封”意指至少大于50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9或大于99.999％的本公开的药物组合物或化合物可被包封、包围或包裹在递送剂内。“部分囊封”意指小于10、10、20、30、40、50或更少的本公开的药物组合物或化合物可被包封、包围或包裹在递送剂内。有利的是，可通过使用荧光和/或电子显微照片测量本公开的药物组合物或化合物的逃逸或活动性来测定囊封。举例来说，至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大于99.99％的本公开的药物组合物或化合物被囊封在递送剂中。
在一些实施方案中，控制释放制剂可包括但不限于三嵌段共聚物。作为一非限制性实例，制剂可包括两种不同类型的三嵌段共聚物(国际公布号WO2012131104和WO2012131106，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可将RNA(例如mRNA)疫苗囊封至脂质纳米粒子或快速消除脂质纳米粒子中，并且可接着将脂质纳米粒子或快速消除脂质纳米粒子囊封至本文所述和/或本领域中已知的聚合物、水凝胶和/或手术密封剂中。作为一非限制性实例，聚合物、水凝胶或手术密封剂可为PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics，Inc.Alachua，FL)、(Halozyme Therapeutics，SanDiego CA)、手术密封剂诸如纤维蛋白原(fibrinogen)聚合物(Ethicon Inc.Cornelia，GA)、(Baxter International，Inc Deerfield，IL)、基于PEG的密封剂和(Baxter International，Inc Deerfield，IL)。
在一些实施方案中，可将脂质纳米粒子囊封至本领域中已知的在注射至受试者中时可形成凝胶的任何聚合物中。作为另一非限制性实例，可将脂质纳米粒子囊封至可为生物可降解的聚合物基质中。
在一些实施方案中，用于控制释放和/或靶向递送的RNA(例如mRNA)疫苗制剂也可包括至少一种控制释放包衣。控制释放包衣包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基乙基纤维素、EUDRAGITEUDRAGIT和纤维素衍生物诸如乙基纤维素水性分散液(和)。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗控制释放和/或靶向递送制剂可包含至少一种可含有聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)及其组合。在一些实施方案中，可降解聚酯可包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。
在一些实施方案中，包含至少一种多核苷酸的RNA(例如mRNA)疫苗控制释放和/或靶向递送制剂可包含至少一种如美国专利号8,404,222中所述的PEG和/或PEG相关聚合物衍生物，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，包含至少一种多核苷酸的RNA(例如mRNA)疫苗控制释放递送制剂可为US20130130348中所述的控制释放聚合物系统，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可将本公开的RNA(例如mRNA)疫苗囊封成治疗性纳米粒子，在本文中称为“治疗性纳米粒子RNA(例如mRNA)疫苗”。治疗性纳米粒子可通过本文所述和本领域中已知的方法来配制，诸如但不限于国际公布号WO2010005740、WO2010030763、WO2010005721、WO2010005723、WO2012054923、美国公布号US20110262491、US20100104645、US20100087337、US20100068285、US20110274759、US20100068286、US20120288541、US20130123351和US20130230567以及美国专利号8,206,747、8,293,276、8,318,208和8,318,211中的方法；所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，治疗性聚合物纳米粒子可通过美国公布号US20120140790中所述的方法来鉴定，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可配制治疗性纳米粒子RNA(例如mRNA)疫苗以达成持续释放。如本文所用，“持续释放”是指药物组合物或化合物符合历经特定时期的释放速率。时期可包括但不限于数小时、数天、数周、数月和数年。作为一非限制性实例，持续释放纳米粒子可包含聚合物和治疗剂诸如但不限于本公开的多核苷酸(参见国际公布号2010075072以及美国公布号US20100216804、US20110217377和US20120201859，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。在另一非限制性实例中，持续释放制剂可包含容许达成持久生物可用性的试剂，诸如但不限于晶体、大分子凝胶和/或颗粒混悬液(参见美国专利公布号US20130150295，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可配制治疗性纳米粒子RNA(例如mRNA)疫苗以达成靶标特异性。作为一非限制性实例，治疗性纳米粒子可包括皮质类固醇(参见国际公布号WO2011084518，其内容以引用的方式整体并入本文)。作为一非限制性实例，治疗性纳米粒子可在国际公布号WO2008121949、WO2010005726、WO2010005725、WO2011084521以及美国公布号US20100069426、US20120004293和US20100104655中所述的纳米粒子中配制，所述公布各自的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的纳米粒子可包含聚合基质。作为一非限制性实例，纳米粒子可包含两种或更多种聚合物，诸如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子包含二嵌段共聚物。在一些实施方案中，二嵌段共聚物可包括PEG与诸如但不限于以下的聚合物组合：聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。在另一实施方案中，二嵌段共聚物可为高X二嵌段共聚物，诸如国际专利公布号WO2013120052中所述的那些，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
作为一非限制性实例，治疗性纳米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公布号US20120004293和美国专利号8,236,330，其各自以引用的方式整体并入本文)。在另一非限制性实例中，治疗性纳米粒子是包含PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物的隐形纳米粒子(参见美国专利号8,246,968和国际公布号WO2012166923，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。在另一非限制性实例中，治疗性纳米粒子是如美国专利公布号US20130172406中所述的隐形纳米粒子或靶标特异性隐形纳米粒子，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含多嵌段共聚物(参见例如美国专利号8,263,665和8,287,910以及美国专利公布号US20130195987，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在另一非限制性实例中，脂质纳米粒子包含嵌段共聚物PEG-PLGA-PEG(参见例如，热敏性水凝胶(PEG-PLGA-PEG)在Lee等Thermosensitive Hydrogel as a TGF-β1 GeneDelivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing.Pharmaceutical Research，200320(12)：1995-2000中用作TGF-β1基因递送载体；在Li等Controlled Gene DeliverySystem Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel.PharmaceuticalResearch 2003 20：884-888；以及Chang等，Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle.JControlled Release.2007 118：245-253中用作控制基因递送系统，所述文献各自的内容以引用的方式整体并入本文)。本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可在包含PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物的脂质纳米粒子中配制。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含多嵌段共聚物(参见例如美国专利号8,263,665和8,287,910以及美国专利公布号US20130195987，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可将本文所述的嵌段共聚物包括在包含非聚合胶束和嵌段共聚物的聚离子复合物中。(参见例如美国公布号20120076836，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种聚(乙烯基酯)聚合物。聚(乙烯基酯)聚合物可为共聚物诸如无规共聚物。作为一非限制性实例，无规共聚物可具有诸如国际申请号WO2013032829或美国专利公布号US20130121954中所述的那些的结构，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，可使聚(乙烯基酯)聚合物缀合于本文所述的多核苷酸。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种二嵌段共聚物。二嵌段共聚物可为但不限于聚(乳酸)-聚(亚乙基)二醇共聚物(参见例如国际专利公布号WO2013044219，其内容以引用的方式整体并入本文)。作为一非限制性实例，治疗性纳米粒子可用于治疗癌症(参见国际公布号WO2013044219，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种本文所述和/或本领域中已知的阳离子聚合物。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种含胺聚合物，诸如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物、聚(β-氨基酯)(参见例如美国专利号8,287,849，其内容以引用的方式整体并入本文)及其组合。
在一些实施方案中，本文所述的纳米粒子可包含胺阳离子脂质，诸如国际专利申请号WO2013059496中所述的那些，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，阳离子脂质可具有氨基-胺或氨基-酰胺部分。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种可含有聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)及其组合。在一些实施方案中，可降解聚酯可包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。
在一些实施方案中，合成纳米载体可含有免疫刺激剂以使由递送合成纳米载体所致的免疫应答增强。作为一非限制性实例，合成纳米载体可包含Th1免疫刺激剂，其可使免疫系统的基于Th1的应答增强(参见国际公布号WO2010123569和美国公布号US20110223201，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可配制合成纳米载体以达成靶向释放。在一些实施方案中，配制合成纳米载体以使多核苷酸在指定pH下和/或在所需时间间隔之后释放。作为一非限制性实例，可配制合成纳米粒子以使RNA(例如mRNA)疫苗在24小时之后和/或在4.5的pH下释放(参见国际公布号WO2010138193和WO2010138194以及美国公布号US20110020388和US20110027217，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可配制合成纳米载体以达成对本文所述的多核苷酸的控制和/或持续释放。作为一非限制性实例，用于持续释放的合成纳米载体可通过本领域中已知、本文所述和/或如国际公布号WO2010138192和美国公布号20100303850中所述的方法来配制，所述公布各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可配制RNA(例如mRNA)疫苗以达成控制和/或持续释放，其中制剂包含至少一种是结晶侧链(CYSC)聚合物的聚合物。CYSC聚合物描述于美国专利号8,399,007中，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可配制合成纳米载体以用作疫苗。在一些实施方案中，合成纳米载体可囊封至少一种编码至少一种抗原的多核苷酸。作为一非限制性实例，对于某一疫苗剂型，合成纳米载体可包括至少一种抗原以及赋形剂(参见国际公布号WO2011150264和美国公布号US20110293723，所述公布各自的内容以引用的方式整体并入本文)。作为另一非限制性实例，疫苗剂型可包括至少两种具有相同或不同抗原以及赋形剂的合成纳米载体(参见国际公布号WO2011150249和美国公布号US20110293701，所述公布各自的内容以引用的方式整体并入本文)。疫苗剂型可通过本文所述、本领域中已知和/或国际公布号WO2011150258和美国公布号US20120027806中所述的方法来选择，所述公布各自的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，合成纳米载体可包含至少一种编码至少一种佐剂的多核苷酸。作为非限制性实例，佐剂可包含二甲基二(十八基)溴化铵、二甲基二(十八基)氯化铵、二甲基二(十八基)磷酸铵或二甲基二(十八基)乙酸铵(DDA)和分支杆菌的总体脂质提取物的无极性部分或所述无极性部分的一部分(参见例如美国专利号8,241,610，其内容以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含至少一种多核苷酸以及佐剂。作为一非限制性实例，包含多核苷酸和佐剂的合成纳米载体可通过国际公布号WO2011150240和美国公布号US20110293700中所述的方法来配制，所述公布各自的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，合成纳米载体可囊封至少一种编码来自病毒的肽、片段或区域的多核苷酸。作为一非限制性实例，合成纳米载体可包括但不限于国际公布号WO2012024621、WO201202629、WO2012024632以及美国公布号US20120064110、US20120058153和US20120058154中所述的任何纳米载体，所述公布各自的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可使合成纳米载体偶联于可能够触发体液应答和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的多核苷酸(参见例如国际公布号WO2013019669，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可将RNA(例如mRNA)疫苗囊封在两性离子脂质中，连接于两性离子脂质和/或与两性离子脂质缔合。两性离子脂质和使用两性离子脂质的方法的非限制性实例描述于美国专利公布号US20130216607中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。在一些方面，两性离子脂质可用于本文所述的脂质体和脂质纳米粒子中。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可在如美国专利公布号US20130197100中所述的胶体纳米载体中配制，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，纳米粒子可针对口服施用加以优化。纳米粒子可包含至少一种阳离子生物聚合物，诸如但不限于壳聚糖或其衍生物。作为一非限制性实例，纳米粒子可通过美国公布号20120282343中所述的方法来配制，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，LNP包含脂质KL52(美国申请公布号2012/0295832中公开的一种氨基-脂质，所述申请公布的内容以引用的方式整体并入本文)。施用LNP的活性和/或安全性(如通过考查例如ALT/AST、白血细胞计数和细胞因子诱导中的一者或多者所度量)可通过并有所述脂质来改进。可在静脉内和/或以一次或多次剂量施用包含KL52的LNP。在一些实施方案中，相较于包含MC3的LNP，施用包含KL52的LNP产生相等或改进的mRNA和/或蛋白质表达。
在一些实施方案中，可使用较小LNP递送RNA(例如mRNA)疫苗。所述粒子可包含从低于0.1um直至100nm的直径，诸如但不限于小于0.1um、小于1.0um、小于5um、小于10um、小于15um、小于20um、小于25um、小于30um、小于35um、小于40um、小于50um、小于55um、小于60um、小于65um、小于70um、小于75um、小于80um、小于85um、小于90um、小于95um、小于100um、小于125um、小于150um、小于175um、小于200um、小于225um、小于250um、小于275um、小于300um、小于325um、小于350um、小于375um、小于400um、小于425um、小于450um、小于475um、小于500um、小于525um、小于550um、小于575um、小于600um、小于625um、小于650um、小于675um、小于700um、小于725um、小于750um、小于775um、小于800um、小于825um、小于850um、小于875um、小于900um、小于925um、小于950um、小于975um或小于1000um。
在一些实施方案中，可使用较小LNP递送RNA(例如mRNA)疫苗，所述LNP可包含以下直径：约1nm至约100nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约50nm、约20至约50nm、约30至约50nm、约40至约50nm、约20至约60nm、约30至约60nm、约40至约60nm、约20至约70nm、约30至约70nm、约40至约70nm、约50至约70nm、约60至约70nm、约20至约80nm、约30至约80nm、约40至约80nm、约50至约80nm、约60至约80nm、约20至约90nm、约30至约90nm、约40至约90nm、约50至约90nm、约60至约90nm和/或约70至约90nm。
在一些实施方案中，使用包括微流体混合器的方法合成所述LNP。微流体混合器的实例可包括但不限于狭缝叉指式微混合器，包括但不限于由Microinnova(Allerheiligenbei Wildon，Austria)制造的那些，和/或交错人字形微混合器(SHM)(Zhigaltsev，I.V等，Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems withaqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing已发表(Langmuir.2012.28：3633-40)；Belliveau，N.M.等，Microfluidic synthesis of highlypotent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.MolecularTherapy-Nucleic Acids.2012.1：e37；Chen，D.等，Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidicformulation.J Am Chem Soc.2012.134(16)：6948-51，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，包括SHM的LNP产生方法进一步包括混合至少两个输入物流，其中混合通过微结构诱导的混沌平流(MICA)来发生。根据这个方法，流体物流流过存在于人字形图案中的通道，从而导致旋流以及使流体在彼此周围叠合。这个方法也可包括用于流体混合的表面，其中所述表面在流体循环期间改变定向。使用SHM产生LNP的方法包括美国申请公布号2004/0262223和2012/0276209中公开的那些，所述申请公布各自的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可在使用微混合器产生的脂质纳米粒子中配制，所述微混合器诸如但不限于来自Institut für Mikrotechnik MainzGmbH(Mainz Germany)的狭缝叉指式微结构化混合器(SIMM-V2)或标准狭缝叉指式微混合器(SSIMM)或履带式微混合器(CPMM)或冲击-射流微混合器(IJMM)。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可在使用微流体技术产生的脂质纳米粒子中配制(参见例如Whitesides，George M.The Origins and the Future ofMicrofluidics.Nature，2006 442：368-373；以及Abraham等Chaotic Mixer forMicrochannels.Science，2002295：647-651；其各自以引用的方式整体并入本文)。作为一非限制性实例，控制微流体配制包括用于在低雷诺数(Reynolds number)下在微通道中混合稳定压力驱动的流动物流的被动方法(参见例如Abraham等Chaotic Mixer forMicrochannels.Science，2002 295：647-651，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可在使用微混合器芯片产生的脂质纳米粒子中配制，所述芯片诸如但不限于来自Harvard Apparatus(Holliston，MA)或Dolomite Microfluidics(Royston，UK)的那些。微混合器芯片可用于以拆分和重组机理快速混合两个或更多个流体物流。
在一些实施方案中，可使用国际专利公布号WO2013063468或美国专利号8,440,614中所述的药物囊封微球体配制本公开的RNA(例如mRNA)疫苗以达成递送，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。微球体可包含如国际专利公布号WO2013063468中所述的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)化合物，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，氨基酸、肽、多肽、脂质(APPL)适用于将本公开的RNA(例如mRNA)疫苗递送至细胞(参见国际专利公布号WO2013063468，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可在具有以下直径的脂质纳米粒子中配制：约10至约100nm，诸如但不限于约10至约20nm、约10至约30nm、约10至约40nm、约10至约50nm、约10至约60nm、约10至约70nm、约10至约80nm、约10至约90nm、约20至约30nm、约20至约40nm、约20至约50nm、约20至约60nm、约20至约70nm、约20至约80nm、约20至约90nm、约20至约100nm、约30至约40nm、约30至约50nm、约30至约60nm、约30至约70nm、约30至约80nm、约30至约90nm、约30至约100nm、约40至约50nm、约40至约60nm、约40至约70nm、约40至约80nm、约40至约90nm、约40至约100nm、约50至约60nm、约50至约70nm约50至约80nm、约50至约90nm、约50至约100nm、约60至约70nm、约60至约80nm、约60至约90nm、约60至约100nm、约70至约80nm、约70至约90nm、约70至约100nm、约80至约90nm、约80至约100nm和/或约90至约100nm。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可具有约10至500nm的直径。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可为国际专利公布号WO2013059922中所述的极限尺寸脂质纳米粒子，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。极限尺寸脂质纳米粒子可包含包围水性核心或疏水性核心的脂质双层；其中所述脂质双层可包含磷脂，诸如但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂、C8-C20脂肪酸二酰基磷脂酰胆碱和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)。在一些实施方案中，极限尺寸脂质纳米粒子可包含聚乙二醇-脂质，诸如但不限于DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG和DSPE-PEG。
在一些实施方案中，使用国际专利公布号WO2013063530中所述的递送方法，可将RNA(例如mRNA)疫苗递送、定位和/或集中在特定位置中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。作为一非限制性实例，可在向受试者递送RNA(例如mRNA)疫苗之前、同时或之后，向所述受试者施用空聚合粒子。空聚合粒子一旦与受试者接触即经受体积变化，并且变得安置、包埋、固定或圈闭在受试者中的特定位置处。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可在活性物质释放系统中配制(参见例如美国专利公布号US20130102545，其内容以引用的方式整体并入本文)。活性物质释放系统可包含1)至少一种键合于寡核苷酸抑制链的纳米粒子，所述抑制链与催化活性核酸杂交，和2)键合于至少一种基底分子的化合物，所述基底分子键合于治疗活性物质(例如本文所述的多核苷酸)，其中所述治疗活性物质通过由所述催化活性核酸裂解所述基底分子来释放。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可在包含内部核心和外部表面的纳米粒子中配制，所述内部核心包含非细胞物质，所述外部表面包含细胞膜。细胞膜可源于细胞，或膜源于病毒。作为一非限制性实例，纳米粒子可通过国际专利公布号WO2013052167中所述的方法制备，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。作为另一非限制性实例，国际专利公布号WO2013052167中所述的纳米粒子可用于递送本文所述的RNA(例如mRNA)疫苗，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可在多孔纳米粒子支撑的脂质双层(原细胞)中配制。原细胞描述于国际专利公布号WO2013056132中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的RNA(例如mRNA)疫苗可在如美国专利号8,420,123和8,518,963以及欧洲专利号EP2073848B1中所述或通过美国专利号8,420,123和8,518,963以及欧洲专利号EP2073848B1中所述的方法制备的聚合纳米粒子中配制，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。作为一非限制性实例，聚合纳米粒子可具有高玻璃转变温度，所述聚合纳米粒子诸如美国专利号8,518,963中所述的纳米粒子或通过美国专利号8,518,963中所述的方法制备的纳米粒子，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。作为另一非限制性实例，用于口服和胃肠外制剂的聚合物纳米粒子可通过欧洲专利号EP2073848B1中所述的方法制备，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的RNA(例如mRNA)疫苗可在用于成像中的纳米粒子中配制。纳米粒子可为脂质体纳米粒子，诸如美国专利公布号US20130129636中所述的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。作为一非限制性实例，脂质体可包含2-{4，7-双-羧基甲基-10-[(N，N-二硬脂基酰胺基甲基-N′-酰胺基-甲基]-1，4，7，10-四氮杂环十二-1-基}-乙酸钆(III)和中性完全饱和磷脂组分(参见例如美国专利公布号US20130129636，其内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可用于本公开中的纳米粒子通过美国专利申请号US20130130348中所述的方法来形成，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
本公开的纳米粒子可进一步包括营养物，诸如但不限于其缺乏可导致从贫血至神经管缺陷的健康危害的那些(参见例如国际专利公布号WO2013072929中所述的纳米粒子，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。作为一非限制性实例，营养物可为呈亚铁、铁盐或元素铁形式的铁、碘、叶酸、维生素或微量营养物。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可在可溶胀纳米粒子中配制。可溶胀纳米粒子可为但不限于美国专利号8,440,231中所述的那些，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。作为一非限制性实施方案，可溶胀纳米粒子可用于将本公开的RNA(例如mRNA)疫苗递送至肺系统(参见例如美国专利号8,440,231，其内容以引用的方式整体并入本文)。
本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可在聚酐纳米粒子中配制，所述纳米粒子诸如但不限于美国专利号8,449,916中所述的那些，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
本公开的纳米粒子和微粒可在几何上工程化来调节巨噬细胞和/或免疫应答。在一些实施方案中，在几何上工程化的粒子可具有不同形状、尺寸和/或表面电荷以并有本公开的多核苷酸来达成靶向递送，诸如但不限于肺递送(参见例如国际公布号WO2013082111，其内容以引用的方式整体并入本文)。在几何上工程化的粒子可具有的其他物理特征包括但不限于穿孔、角度化臂部、不对称性和表面粗糙性、可改变与细胞和组织的相互作用的电荷。作为一非限制性实例，本公开的纳米粒子可通过国际公布号WO2013082111中所述的方法制备，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的纳米粒子可为水溶性纳米粒子，诸如但不限于国际公布号WO2013090601中所述的那些，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文。纳米粒子可为无机纳米粒子，其具有致密性和两性离子性配体以展现良好水溶性。纳米粒子也可具有小流体动力学直径(HD)，关于时间、pH和盐度的稳定性，以及低水平的非特异性蛋白质结合。
在一些实施方案中，本公开的纳米粒子可通过美国专利公布号US20130172406中所述的方法来开发，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的纳米粒子是隐形纳米粒子或靶标特异性隐形纳米粒子，诸如但不限于美国专利公布号US20130172406中所述的那些，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。本公开的纳米粒子可通过美国专利公布号US20130172406中所述的方法制备，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，隐形或靶标特异性隐形纳米粒子可包含聚合基质。聚合基质可包含两种或更多种聚合物，诸如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚酯、聚酐、聚醚、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯或其组合。
在一些实施方案中，纳米粒子可为具有高密度核酸层的纳米粒子-核酸杂合结构。作为一非限制性实例，纳米粒子-核酸杂合结构可通过美国专利公布号US20130171646中所述的方法制备，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。纳米粒子可包含核酸，诸如但不限于本文所述和/或本领域中已知的多核苷酸。
可将本公开的至少一种纳米粒子包埋在纳米结构中的核心中，或用能够在纳米结构内或在纳米结构的表面上携带或缔合至少一种有效载荷的低密度多孔3-D结构或包衣涂布。包含至少一种纳米粒子的纳米结构的非限制性实例描述于国际专利公布号WO2013123523中，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗可与阳离子或聚阳离子化合物缔合，所述化合物包括鱼精蛋白、核仁蛋白(nucleoline)、精胺或亚精胺、或其他阳离子肽或蛋白质，诸如聚L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)，包括HIV结合肽、HIV-1 Tat(HIV)、Tat源性肽、穿透蛋白(Penetratin)、VP22源性肽或类似肽、瘟疫病毒Erns、HSV、VP22(单纯性疱疹(Herpes simplex))、MAP、KALA或蛋白质转导结构域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG-肽、Pep-1、L-寡聚物、降血钙素(Calcitonin)肽、触角足蛋白(Antennapedia)源性肽(特别是来自果蝇触角足蛋白)、pAntp、pIsl、FGF、乳铁传递蛋白(Lactoferrin)、转运素(Transportan)、Buforin-2、Bac715-24、SynB、SynB、pVEC、hCT源性肽、SAP、组蛋白，阳离子多糖例如壳聚糖、聚凝胺、阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)、阳离子脂质例如DOTMA：[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基)]-N，N，N-三甲基氯化铵、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油烯基磷脂酰基乙醇-胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS：二(十八基)酰胺基甘氨酰基精胺、DIMRI：二肉豆蔻基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵、DOTAP：二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷、DC-6-14：O，O-二(十四酰基)-N-α-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物、CLIP 1：外消旋-[(2，3-二(十八基)氧基丙基)(2-羟基乙基)]-二甲基氯化铵、CLIP6：外消旋-[2(2，3-二(十六基)氧基丙基氧基甲基氧基)乙基]-三甲铵、CLIP9：外消旋-[2(2，3-二(十六基)氧基丙基氧基丁二酰基氧基)乙基]-三甲铵、寡聚转染胺(oligofectamine)，或阳离子或聚阳离子聚合物，例如经修饰聚氨基酸，诸如β-氨基酸聚合物或反向聚酰胺等，经修饰聚乙烯，诸如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鎓))等，经修饰丙烯酸酯，诸如pDMAEMA(聚(甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯))等，经修饰酰胺基胺，诸如pAMAM(聚(酰胺基胺))等，经修饰聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺末端修饰的1，4丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状聚合物，诸如聚丙胺树枝状聚合物或基于pAMAM的树枝状聚合物等，聚亚胺，诸如PEI：聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯亚胺)等，聚烯丙基胺、基于糖主链的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物、基于右旋糖酐的聚合物、壳聚糖等，基于甲硅烷主链的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物等，由一个或多个阳离子嵌段(例如选自如上提及的阳离子聚合物)的组合以及一个或多个亲水性或疏水性嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物等。
在其他实施方案中，RNA(例如mRNA)疫苗不与阳离子或聚阳离子化合物缔合。
疫苗施用模式
可通过产生治疗有效效果的任何途径来施用流感RNA(例如mRNA)疫苗。这些途径包括但不限于真皮内、肌肉内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供包括向有此需要的受试者施用RNA(例如mRNA)疫苗的方法。视受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重性、特定组合物、它的施用模式、它的活性模式等而定，所需精确量将在受试者与受试者之间不同。流感RNA(例如mRNA)疫苗组合物通常以剂量单位形式配制以易于达成剂量的施用和均一性。然而，应了解RNA(例如mRNA)疫苗组合物的总每日用量将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。用于任何特定患者的特定治疗有效、防治有效或适当成像剂量水平都将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和膳食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中熟知的类似因素。
在一些实施方案中，流感疾病RNA(例如mRNA)疫苗组合物可在足以递送每kg受试者体重0.0001mg至100mg，0.001mg至0.05mg，0.005mg至0.05mg，0.001mg至0.005mg，0.05mg至0.5mg，0.01mg至50mg，0.1mg至40mg，0.5mg至30mg，0.01mg至10mg，0.1mg至10mg，或1mg至25mg的剂量水平下每天，一天一次或多次，每周，每个月等施用以获得所需治疗、诊断、防治或成像作用(参见例如国际公布号WO2013078199中所述的单位剂量的范围，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文)。所需剂量可一天三次、一天两次、一天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周，每四周，每2个月，每3个月，每6个月等加以递送。在一些实施方案中，可使用多次施用(例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送所需剂量。当采用多次施用时，可使用分次给药方案，诸如本文所述的那些。在示例性实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗组合物可在足以递送0.0005mg/kg至0.01mg/kg，例如约0.0005mg/kg至约0.0075mg/kg，例如约0.0005mg/kg、约0.001mg/kg、约0.002mg/kg、约0.003mg/kg、约0.004mg/kg或约0.005mg/kg的剂量水平下施用。
在一些实施方案中，流感疾病RNA(例如mRNA)疫苗组合物可在足以递送0.025mg/kg至0.250mg/kg，0.025mg/kg至0.500mg/kg，0.025mg/kg至0.750mg/kg，或0.025mg/kg至1.0mg/kg的剂量水平下施用一次或两次(或更多次)。
在一些实施方案中，流感疾病RNA(例如mRNA)疫苗组合物可在以下总剂量下或在足以递送以下总剂量的剂量水平下施用两次(例如第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后、或第0天和10年后)：0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg。本公开涵盖更高和更低施用剂量和频率。举例来说，可施用流感RNA(例如mRNA)疫苗组合物3次或4次。
在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗组合物可在以下总剂量下或在足以递送以下总剂量的剂量水平下施用两次(例如第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后、或第0天和10年后)：0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg。
在一些实施方案中，用于对受试者接种疫苗的方法中的流感RNA(例如mRNA)疫苗以在10μg/kg与400μg/kg之间的单剂量的核酸疫苗形式(以用以对所述受试者接种疫苗的有效量)向所述受试者施用。在一些实施方案中，用于对受试者接种疫苗的方法中的RNA(例如mRNA)疫苗以在10μg与400μg之间的单剂量的核酸疫苗形式(以用以对所述受试者接种疫苗的有效量)向所述受试者施用。在一些实施方案中，用于对受试者接种疫苗的方法中的流感RNA(例如mRNA)疫苗以25-1000μg的单剂量向所述受试者施用。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗以25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg的单剂量向受试者施用。举例来说，流感RNA(例如mRNA)疫苗可以25-100、25-500、50-100、50-500、50-1000、100-500、100-1000、250-500、250-1000或500-1000μg的单剂量向受试者施用。在一些实施方案中，用于对受试者接种疫苗的方法中的流感RNA(例如mRNA)疫苗以两次剂量向所述受试者施用，所述剂量的组合等于25-1000μg的流感RNA(例如mRNA)疫苗。
可将本文所述的流感RNA(例如mRNA)疫苗药物组合物配制成本文所述的剂型，诸如鼻内、气管内或可注射(例如静脉内、眼内、玻璃体内、肌肉内、真皮内、心内、腹膜内、鼻内和皮下)剂型。
流感病毒RNA(例如mRNA)疫苗制剂和使用方法
本公开的一些方面提供流感RNA(例如mRNA)疫苗的制剂，其中所述RNA(例如mRNA)疫苗以在受试者中有效产生抗原特异性免疫应答(例如产生对流感抗原性多肽具有特异性的抗体)的量配制。“有效量”是RNA(例如mRNA)疫苗的有效产生抗原特异性免疫应答的剂量。本文也提供在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答通过测量在被施用如本文提供的流感RNA(例如mRNA)疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价来表征。抗体效价是受试者内抗体的量的测量结果，所述抗体例如是对特定抗原(例如流感抗原性多肽)或抗原的表位具有特异性的抗体。通常将抗体效价表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种用于例如测定抗体效价的常见测定。
在一些实施方案中，抗体效价用于评估受试者是否已患有感染，或确定是否需要免疫。在一些实施方案中，抗体效价用于确定自体免疫应答的强度，确定是否需要加强免疫，确定先前疫苗是否有效，以及鉴定任何当前或先前感染。根据本公开，抗体效价可用于确定由流感RNA(例如mRNA)疫苗在受试者中诱导的免疫应答的强度。
在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价增加至少1个log。举例来说，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价可增加至少1.5个、至少2个、至少2.5个或至少3个log。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加1个、1.5个、2个、2.5个或3个log。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加1-3个log。举例来说，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价可增加1-1.5个、1-2个、1-2.5个、1-3个、1.5-2个、1.5-2.5个、1.5-3个、2-2.5个、2-3个或2.5-3个log。
在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价增加至至少2倍。举例来说，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价可增加至至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至2-10倍。举例来说，相对于对照，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10倍。
在一些实施方案中，对照是在尚未被施用本公开的流感RNA(例如mRNA)疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照是在已被施用活体减毒流感疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。减毒疫苗是通过使有活力的(活体)病毒的毒性降低来产生的疫苗。减毒病毒以致使它相对于活体未修饰病毒是无害的或毒性更小的方式被改变。在一些实施方案中，对照是在被施用失活流感疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照是在被施用重组或纯化流感蛋白疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。重组蛋白疫苗通常包括已在异源性表达系统(例如细菌或酵母)中产生或从大量病原性生物体纯化的蛋白质抗原。在一些实施方案中，对照是在已被施用流感病毒样粒子(VLP)疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是相较于重组流感蛋白疫苗的护理标准剂量得以降低的剂量。如本文提供的“护理标准”是指医学或心理学治疗指导方针，并且可为一般的或特定的。“护理标准”指定基于科学证据和对给定病状的治疗中涉及的医学专业人员之间的合作的适当治疗。它是医师/临床医师应遵循的针对某一类型的患者、疾患或临床情况的诊断和治疗过程。如本文提供的“护理标准剂量”是指重组或纯化流感蛋白疫苗或活体减毒或失活流感疫苗的由医师/临床医师或其他医学专业人员将在遵循用于治疗或预防流感或相关病状的护理标准指导方针下向受试者施用以治疗或预防流感或相关病状的剂量。
在一些实施方案中，在被施用有效量的流感RNA(例如mRNA)疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价等于在被施用护理标准剂量的重组或纯化流感蛋白疫苗或活体减毒或失活流感疫苗的对照受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是等于降低至重组或纯化流感蛋白疫苗的护理标准剂量的至少1/2的剂量。举例来说，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量可为等于降低至重组或纯化流感蛋白疫苗的护理标准剂量的至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/6、至少1/7、至少1/8、至少1/9或至少1/10的剂量。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是等于降低至重组或纯化流感蛋白疫苗的护理标准剂量的至少1/100、至少1/500或至少1/1000的剂量。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是等于降低至重组或纯化流感蛋白疫苗的护理标准剂量的1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/50、1/100、1/250、1/500或1/1000的剂量。在一些实施方案中，在被施用有效量的流感RNA(例如mRNA)疫苗的受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价等于在被施用护理标准剂量的重组或蛋白质流感蛋白疫苗或活体减毒或失活流感疫苗的对照受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是等于降低至重组或纯化流感蛋白疫苗的护理标准剂量的1/2至1/1000(例如1/2至1/100、1/10至1/1000)的剂量，其中在受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价等于在被施用护理标准剂量的重组或纯化流感蛋白疫苗或活体减毒或失活流感疫苗的对照受试者中产生的抗流感抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是等于降低至重组流感蛋白疫苗的护理标准剂量的1/2至1/1000、1/2至1/900、1/2至1/800、1/2至1/700、1/2至1/600、1/2至1/500、1/2至1/400、1/2至1/300、1/2至1/200、1/2至1/100、1/2至1/90、1/2至1/80、1/2至1/70、1/2至1/60、1/2至1/50、1/2至1/40、1/2至1/30、1/2至1/20、1/2至1/10、1/2至1/9、1/2至1/8、1/2至1/7、1/2至1/6、1/2至1/5、1/2至1/4、1/2至1/3、1/3至1/1000、1/3至1/900、1/3至1/800、1/3至1/700、1/3至1/600、1/3至1/500、1/3至1/400、1/3至1/300、1/3至1/200、1/3至1/100、1/3至1/90、1/3至1/80、1/3至1/70、1/3至1/60、1/3至1/50、1/3至1/40、1/3至1/30、1/3至1/20、1/3至1/10、1/3至1/9、1/3至1/8、1/3至1/7、1/3至1/6、1/3至1/5、1/3至1/4、1/4至1/1000、1/4至1/900、1/4至1/800、1/4至1/700、1/4至1/600、1/4至1/500、1/4至1/400、1/4至1/400、1/4至1/200、1/4至1/100、1/4至1/90、1/4至1/80、1/4至1/70、1/4至1/60、1/4至1/50、1/4至1/40、1/4至1/30、1/4至1/20、1/4至1/10、1/4至1/9、1/4至1/8、1/4至1/7、1/4至1/6、1/4至1/5、1/4至1/4、1/5至1/1000、1/5至1/900、1/5至1/800、1/5至1/700、1/5至1/600、1/5至1/500、1/5至1/400、1/5至1/300、1/5至1/200、1/5至1/100、1/5至1/90、1/5至1/80、1/5至1/70、1/5至1/60、1/5至1/50、1/5至1/40、1/5至1/30、1/5至1/20、1/5至1/10、1/5至1/9、1/5至1/8、1/5至1/7、1/5至1/6、1/6至1/1000、1/6至1/900、1/6至1/800、1/6至1/700、1/6至1/600、1/6至1/500、1/6至1/400、1/6至1/300、1/6至1/200、1/6至1/100、1/6至1/90、1/6至1/80、1/6至1/70、1/6至1/60、1/6至1/50、1/6至1/40、1/6至1/30、1/6至1/20、1/6至1/10、1/6至1/9、1/6至1/8、1/6至1/7、1/7至1/1000、1/7至1/900、1/7至1/800、1/7至1/700、1/7至1/600、1/7至1/500、1/7至1/400、1/7至1/300、1/7至1/200、1/7至1/100、1/7至1/90、1/7至1/80、1/7至1/70、1/7至1/60、1/7至1/50、1/7至1/40、1/7至1/30、1/7至1/20、1/7至1/10、1/7至1/9、1/7至1/8、1/8至1/1000、1/8至1/900、1/8至1/800、1/8至1/700、1/8至1/600、1/8至1/500、1/8至1/400、1/8至1/300、1/8至1/200、1/8至1/100、1/8至1/90、1/8至1/80、1/8至1/70、1/8至1/60、1/8至1/50、1/8至1/40、1/8至1/30、1/8至1/20、1/8至1/10、1/8至1/9、1/9至1/1000、1/9至1/900、1/9至1/800、1/9至1/700、1/9至1/600、1/9至1/500、1/9至1/400、1/9至1/300、1/9至1/200、1/9至1/100、1/9至1/90、1/9至1/80、1/9至1/70、1/9至1/60、1/9至1/50、1/9至1/40、1/9至1/30、1/9至1/20、1/9至1/10、1/10至1/1000、1/10至1/900、1/10至1/800、1/10至1/700、1/10至1/600、1/10至1/500、1/10至1/400、1/10至1/300、1/10至1/200、1/10至1/100、1/10至1/90、1/10至1/80、1/10至1/70、1/10至1/60、1/10至1/50、1/10至1/40、1/10至1/30、1/10至1/20、1/20至1/1000、1/20至1/900、1/20至1/800、1/20至1/700、1/20至1/600、1/20至1/500、1/20至1/400、1/20至1/300、1/20至1/200、1/20至1/100、1/20至1/90、1/20至1/80、1/20至1/70、1/20至1/60、1/20至1/50、1/20至1/40、1/20至1/30、1/30至1/1000、1/30至1/900、1/30至1/800、1/30至1/700、1/30至1/600、1/30至1/500、1/30至1/400、1/30至1/300、1/30至1/200、1/30至1/100、1/30至1/90、1/30至1/80、1/30至1/70、1/30至1/60、1/30至1/50、1/30至1/40、1/40至1/1000、1/40至1/900、1/40至1/800、1/40至1/700、1/40至1/600、1/40至1/500、1/40至1/400、1/40至1/300、1/40至1/200、1/40至1/100、1/40至1/90、1/40至1/80、1/40至1/70、1/40至1/60、1/40至1/50、1/50至1/1000、1/50至1/900、1/50至1/800、1/50至1/700、1/50至1/600、1/50至1/500、1/50至1/400、1/50至1/300、1/50至1/200、1/50至1/100、1/50至1/90、1/50至1/80、1/50至1/70、1/50至1/60、1/60至1/1000、1/60至1/900、1/60至1/800、1/60至1/700、1/60至1/600、1/60至1/500、1/60至1/400、1/60至1/300、1/60至1/200、1/60至1/100、1/60至1/90、1/60至1/80、1/60至1/70、1/70至1/1000、1/70至1/900、1/70至1/800、1/70至1/700、1/70至1/600、1/70至1/500、1/70至1/400、1/70至1/300、1/70至1/200、1/70至1/100、1/70至1/90、1/70至1/80、1/80至1/1000、1/80至1/900、1/80至1/800、1/80至1/700、1/80至1/600、1/80至1/500、1/80至1/400、1/80至1/300、1/80至1/200、1/80至1/100、1/80至1/90、1/90至1/1000、1/90至1/900、1/90至1/800、1/90至1/700、1/90至1/600、1/90至1/500、1/90至1/400、1/90至1/300、1/90至1/200、1/90至1/100、1/100至1/1000、1/100至1/900、1/100至1/800、1/100至1/700、1/100至1/600、1/100至1/500、1/100至1/400、1/100至1/300、1/100至1/200、1/200至1/1000、1/200至1/900、1/200至1/800、1/200至1/700、1/200至1/600、1/200至1/500、1/200至1/400、1/200至1/300、1/300至1/1000、1/300至1/900、1/300至1/800、1/300至1/700、1/300至1/600、1/300至1/500、1/300至1/400、1/400至1/1000、1/400至1/900、1/400至1/800、1/400至1/700、1/400至1/600、1/400至1/500、1/500至1/1000、1/500至1/900、1/500至1/800、1/500至1/700、1/500至1/600、1/600至1/1000、1/600至1/900、1/600至1/800、1/600至1/700、1/700至1/1000、1/700至1/900、1/700至1/800、1/800至1/1000、1/800至1/900、1/或900至1/1000的剂量。在一些实施方案中，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价等于在被施用护理标准剂量的重组或纯化流感蛋白疫苗或活体减毒或失活流感疫苗的对照受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，有效量是等于降低至重组流感蛋白疫苗的护理标准剂量的(等于降低至重组流感蛋白疫苗的护理标准剂量的至少)1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/110、1/120、1/130、1/140、1/150、1/160、1/170、1/1280、1/190、1/200、1/210、1/220、1/230、1/240、1/250、1/260、1/270、1/280、1/290、1/300、1/310、1/320、1/330、1/340、1/350、1/360、1/370、1/380、1/390、1/400、1/410、1/420、1/430、1/440、1/450、1/4360、1/470、1/480、1/490、1/500、1/510、1/520、1/530、1/540、1/550、1/560、1/5760、1/580、1/590、1/600、1/610、1/620、1/630、1/640、1/650、1/660、1/670、1/680、1/690、1/700、1/710、1/720、1/730、1/740、1/750、1/760、1/770、1/780、1/790、1/800、1/810、1/820、1/830、1/840、1/850、1/860、1/870、1/880、1/890、1/900、1/910、1/920、1/930、1/940、1/950、1/960、1/970、1/980、1/990或1/1000的剂量。在一些实施方案中，在受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价等于在被施用护理标准剂量的重组或纯化流感蛋白疫苗或活体减毒或失活流感疫苗的对照受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是50-1000μg的总剂量。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-1000、60-900、60-800、60-700、60-600、60-500、60-400、60-300、60-200、60-100、60-90、60-80、60-70、70-1000、70-900、70-800、70-700、70-600、70-500、70-400、70-300、70-200、70-100、70-90、70-80、80-1000、80-900、80-800、80-700、80-600、80-500、80-400、80-300、80-200、80-100、80-90、90-1000、90-900、90-800、90-700、90-600、90-500、90-400、90-300、90-200、90-100、100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、300-1000、300-900、300-800、300-700、300-600、300-500、300-400、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、500-1000、500-900、500-800、500-700、500-600、600-1000、600-900、600-900、600-700、700-1000、700-900、700-800、800-1000、800-900或900-1000μg的总剂量。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用的25-500μg的剂量。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是总计两次向受试者施用的25-500、25-400、25-300、25-200、25-100、25-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-500、100-400、100-300、100-200、150-500、150-400、150-300、150-200、200-500、200-400、200-300、250-500、250-400、250-300、300-500、300-400、350-500、350-400、400-500或450-500μg的剂量。在一些实施方案中，流感RNA(例如mRNA)疫苗的有效量是总计两次向受试者施用的25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg的总剂量。
额外实施方案
1.一种流感病毒疫苗或组合物或免疫原性组合物，其包含：
至少一种具有5’末端帽、编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框和3’聚腺苷酸尾部的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸。
2.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由用SEQ ID NO：447-457、459、461标识的序列编码。
3.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：491-503标识的序列。
4.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：1-444、458、460、462-479标识的序列。
5.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由用SEQ ID NO：457标识的序列编码。
6.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：501标识的序列。
7.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：458标识的序列。
8.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由用SEQ ID NO：459标识的序列编码。
9.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：502标识的序列。
10.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：460标识的序列。
11.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由用SEQ ID NO：461标识的序列编码。
12.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：503标识的序列。
13.如段落1所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：462标识的序列。
14.如段落1-13中的任一者所述的疫苗，其中所述5’末端帽是或包含7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
15.如段落1-14中的任一者所述的疫苗，其中所述开放阅读框中100％的尿嘧啶被修饰以在所述尿嘧啶的5位包括N1-甲基假尿苷。
16.如段落1-15中的任一者所述的疫苗，其中所述疫苗在包含以下的脂质纳米粒子中配制：DLin-MC3-DMA；胆固醇；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
17.如段落16所述的疫苗，其中所述脂质纳米粒子进一步包含柠檬酸钠缓冲剂、蔗糖和水。
18.一种流感病毒疫苗或组合物或免疫原性组合物，其包含：
至少一种具有5’末端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、由SEQ ID NO：501标识的序列和3’聚腺苷酸尾部的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中由SEQ ID NO：501标识的所述序列的尿嘧啶核苷酸被修饰以在所述尿嘧啶核苷酸的5位包括N1-甲基假尿苷。
19.一种流感病毒疫苗，其包含：
至少一种具有5’末端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、由SEQ ID NO：502标识的序列和3’聚腺苷酸尾部的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中由SEQ ID NO：502标识的所述序列的尿嘧啶核苷酸被修饰以在所述尿嘧啶核苷酸的5位包括N1-甲基假尿苷。
20.一种流感病毒疫苗或组合物或免疫原性组合物，其包含：
至少一种具有5’末端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、由SEQ ID NO：503标识的序列和3’聚腺苷酸尾部的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中由SEQ ID NO：503标识的所述序列的尿嘧啶核苷酸被修饰以在所述尿嘧啶核苷酸的5位包括N1-甲基假尿苷。
21.如段落18-20中的任一者所述的疫苗，其在包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG的脂质纳米粒子中配制。
本发明在它的应用方面不限于以下描述中阐述或附图中说明的构建细节和组分排列。本发明能够具有其他实施方案，并且能够以各种方式实施或进行。此外，本文所用的措辞和术语出于描述目的，并且不应被视为具有限制性。在本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意图涵盖此后所列的条目及其等效物以及额外条目。
实施例
实施例1：制造多核苷酸
根据本公开，对多核苷酸和/或其部分或区域的制造可利用题为“ManufacturingMethods for Production of RNA Transcripts”的国际公布WO2014/152027中教导的方法来实现，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文。
纯化方法可包括国际公布WO2014/152030和国际公布WO2014/152031中教导的那些，所述公布各自以引用的方式整体并入本文。
多核苷酸的检测和表征方法可如国际公布WO2014/144039中所教导来进行，所述公布以引用的方式整体并入本文。
对本公开的多核苷酸的表征可使用多核苷酸定位、逆转录酶测序、电荷分布分析、RNA杂质检测或前述各物中的两者或更多者的任何组合来实现。“表征”包括例如测定RNA转录物序列，测定RNA转录物的纯度，或测定RNA转录物的电荷异质性。所述方法教导于例如国际公布WO2014/144711和国际公布WO2014/144767中，所述公布各自的内容以引用的方式整体并入本文。
实施例2：嵌合多核苷酸合成
根据本公开，嵌合多核苷酸的两个区域或部分可使用三磷酸盐化学加以连结或连接。具有100个核苷酸或更少的第一区域或部分被化学合成具有例如5’单磷酸根和末端3’脱OH或经阻断OH。如果该区域长于80个核苷酸，那么它可被合成为用于连接的两条链。
如果将第一区域或部分使用体外转录(IVT)合成为非位置修饰区域或部分，那么可继之以向5’单磷酸根的转化以及后续对3’末端的加帽。
单磷酸根保护基可选自本领域中已知的那些中的任一者。
嵌合多核苷酸的第二区域或部分可使用化学合成或IVT方法来合成。IVT方法可包括可利用具有经修饰帽的引物的RNA聚合酶。或者，可化学合成具有多达130个核苷酸的帽，并且使其偶联于IVT区域或部分。
对于连接方法，用DNA T4连接酶进行的连接，继之以用DNA酶处理应易于避免串联。
整个嵌合多核苷酸无需被制造具有磷酸根-糖主链。如果一个区域或部分编码多肽，那么所述区域或部分可包含磷酸根-糖主链。
接着使用任何已知点击化学、orthoclick化学、solulink或为本领域中的人士所知的其他生物缀合化学进行连接。
合成途径
嵌合多核苷酸可使用一系列起始区段来制备。所述区段包括：
(a)经加帽和经保护的5′区段，其包含正常3′OH(SEG.1)
(b)5′三磷酸根区段，其可包括多肽的编码区和正常3′OH(SEG.2)
(c)嵌合多核苷酸的3′末端(例如尾部)的5′单磷酸根区段，其包含虫草素(cordycepin)或不包含3′OH(SEG.3)
在(化学或IVT)合成之后，区段3(SEG.3)可用虫草素处理，接着用焦磷酸酶处理以产生5′单磷酸根。
可接着使用RNA连接酶使区段2(SEG.2)连接于SEG.3。接着使连接的多核苷酸纯化，并且用焦磷酸酶处理以裂解二磷酸根。可接着使经处理的SEG.2-SEG.3构建体纯化，并且使SEG.1连接于5’末端。可对嵌合多核苷酸进行另一纯化步骤。
当嵌合多核苷酸编码多肽时，连接或连结的区段可表示为：5′UTR(SEG.1)、开放阅读框或ORF(SEG.2)和3′UTR+聚腺苷酸(SEG.3)。
各步骤的产率可多达90-95％。
实施例3：用于cDNA产生的PCR
可使用由Kapa Biosystems(Woburn，MA)制造的2x KAPA HIFITM HotStartReadyMix进行用于制备cDNA的PCR程序。这个体系包括12.5μl 2x KAPA ReadyMix；0.75μl正向引物(10μM)；0.75μl反向引物(10μM)；100ng模板cDNA；和dH2O稀释至25.0μl。反应条件可为在95℃下持续5分钟。可如下进行反应：25个循环的98℃持续20秒，接着58℃持续15秒，接着72℃持续45秒；接着72℃持续5分钟，接着4℃直至终止。
可根据制造商说明书(多达5μg)，使用Invitrogen的PURELINKTM PCR微型试剂盒(Carlsbad，CA)来净化反应。更大量的反应可能需要使用具有更大处理量的产品进行净化。在净化之后，可使用NANODROPTM对cDNA定量，并且通过琼脂糖凝胶电泳来分析以确认cDNA具有预期大小。可接着提交cDNA以进行测序分析，随后继续进行体外转录反应。
实施例4：体外转录(IVT)
体外转录反应产生RNA多核苷酸。所述多核苷酸可包含本公开的多核苷酸的区域或部分，包括化学修饰的RNA(例如mRNA)多核苷酸。化学修饰的RNA多核苷酸可为均一修饰的多核苷酸。体外转录反应利用三磷酸核苷酸(NTP)的定制混合物。NTP可包括化学修饰的NTP，或天然NTP和化学修饰的NTP的混合物，或天然NTP。
典型体外转录反应包括以下：
1)模板cDNA 1.0μg
2)10x转录缓冲液 2.0μl
(400mM Tris-HCl pH 8.0，190mM
MgCl2，50mM DTT，10mM亚精胺)
3)定制NTP(各自25mM) 0.2μl
4)RNA酶抑制剂 20U
5)T7 RNA聚合酶 3000U
6)dH2O 直至20.0μl，和
7)在37℃下孵育3小时-5小时。
可将粗制IVT混合物在4℃下储存过夜以在次日进行净化。1U的无RNA酶的DNA酶可接着用于消化原始模板。在37℃下孵育15分钟之后，可遵循制造商说明书，使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)来纯化mRNA。这个试剂盒可纯化多达500μg的RNA。在净化之后，RNA多核苷酸可使用NANODROPTM加以定量，并且通过琼脂糖凝胶电泳来分析以确认RNA多核苷酸具有适当大小，并且尚未发生RNA降解。
实施例5：酶促加帽
如下进行对RNA多核苷酸的加帽，其中混合物包括：60μg-180μg IVT RNA和直至72μl的dH2O。在65℃下孵育混合物5分钟以使RNA变性，接着立刻转移至冰上。
方案接着涉及混合10x加帽缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)，60mM KCl，12.5mMMgCl2)(10.0μl)；20mM GTP(5.0μl)；20mM S-腺苷基甲硫氨酸(2.5μl)；RNA酶抑制剂(100U)；2′-O-甲基转移酶(400U)；痘苗加帽酶(鸟苷酰基转移酶)(40U)；dH2O(直至28μl)；以及在37℃下孵育30分钟(对于60μg RNA)或多达2小时(对于180μg RNA)。
可接着遵循制造商说明书，使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)来纯化RNA多核苷酸。在净化之后，RNA可使用NANODROPTM(ThermoFisher，Waltham，MA)加以定量，并且通过琼脂糖凝胶电泳来分析以确认RNA多核苷酸具有适当大小，并且尚未发生RNA降解。RNA多核苷酸产物也可通过运行逆转录PCR以产生用于测序的cDNA来测序。
实施例6：聚腺苷酸加尾反应
在cDNA中无多聚胸苷酸的情况下，必须在对最终产物进行净化之前进行聚腺苷酸加尾反应。这通过以下方式来进行：混合加帽的IVT RNA(100μl)；RNA酶抑制剂(20U)；10x加尾缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)，2.5M NaCl，100mM MgCl2)(12.0μl)；20mM ATP(6.0μl)；聚腺苷酸聚合酶(20U)；dH2O直至123.5μl，以及在37℃下孵育30分钟。如果聚腺苷酸尾部已在转录物中，那么可省略加尾反应，并且直接继续用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)(多达500μg)进行净化。聚腺苷酸聚合酶可为在酵母中表达的重组酶。
应了解聚腺苷酸加尾反应的持续性或完整性可能未必始终产生精确大小的聚腺苷酸尾部。因此，核苷酸数目近似在40-200之间例如约40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、150-165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165的聚腺苷酸尾部在本公开的范围内。
实施例7：天然5′帽和5′帽类似物
对多核苷酸的5′-加帽可根据制造商方案在体外转录反应期间使用以下化学RNA帽类似物并行完成以产生5′-鸟苷帽结构：3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G[ARCA帽]；G(5′)pPP(5′)A；G(5′)ppp(5′)G；m7G(5′)ppp(5′)A；m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。对经修饰RNA的5′-加帽可在转录后使用痘苗病毒加帽酶来完成以产生“帽0”结构：m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。可使用痘苗病毒加帽酶与2′-O甲基-转移酶两者来产生m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以产生帽1结构。帽2结构可继之以使用2′-O甲基-转移酶对5′-倒数第三个核苷酸进行2′-O-甲基化来从帽1结构产生。可继之以使用2′-O甲基转移酶对5′倒数第四个核苷酸进行2′-O-甲基化来从帽2结构产生帽3结构。酶优选由重组来源获得。
当被转染至哺乳动物细胞中时，经修饰的mRNA具有在12-18小时之间，或超过18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性。
实施例8：加帽测定
蛋白质表达测定
可将含有任何本文教导的帽的编码多肽的多核苷酸(例如mRNA)在相等浓度下转染至细胞中。在转染后6、12、24和/或36小时，可通过ELISA来测定分泌至培养基中的蛋白质的量。向培养基中分泌较高水平的蛋白质的合成多核苷酸对应于具有较高翻译能力帽结构的合成多核苷酸。
纯度分析合成
可使用变性琼脂糖-尿素凝胶电泳或HPLC分析来比较含有任何本文教导的帽的编码多肽的RNA(例如mRNA)多核苷酸的纯度。相较于具有多个条带或拖尾条带的多核苷酸，根据电泳具有单个统一条带的RNA多核苷酸对应于更高纯度产物。具有单一HPLC峰的化学修饰的RNA多核苷酸也对应于较高纯度产物。效率较高的加帽反应提供更纯的多核苷酸群体。
细胞因子分析
可将含有任何本文教导的帽的编码多肽的RNA(例如mRNA)多核苷酸在多种浓度下转染至细胞中。在转染后6、12、24和/或36小时，分泌至培养基中的促炎性细胞因子诸如TNF-α和IFN-β的量可通过ELISA来测定。导致较高水平的促炎性细胞因子分泌至培养基中的RNA多核苷酸对应于含有免疫-活化性帽结构的多核苷酸。
加帽反应效率
可在核酸酶处理之后通过LC-MS来分析含有任何本文教导的帽的编码多肽的RNA(例如mRNA)多核苷酸的加帽反应效率。核酸酶处理加帽的多核苷酸产生可通过LC-MS检测的游离核苷酸和加帽的5′-5-三磷酸根帽结构的混合物。可将LC-MS图谱上加帽产物的量表示为来自反应的总多核苷酸的百分比，并且对应于加帽反应效率。根据LC-MS，具有较高加帽反应效率的帽结构具有较高量的加帽产物。
实施例9：经修饰的RNA或RT PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
可将各个RNA多核苷酸(200-400ng于20μl体积中)或逆转录PCR产物(200-400ng)上样至非变性1.2％琼脂糖E凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上的孔中，并且根据制造商方案跑12-15分钟。
实施例10：NANODROPTM修饰的RNA定量和紫外光谱数据
含化学修饰的RNA多核苷酸的TE缓冲液(1μl)用于NANODROPTM紫外吸光度读取以定量来自化学合成或体外转录反应的各多核苷酸的产量。
实施例11：使用类脂质配制经修饰的mRNA
可在添加至细胞之前通过使多核苷酸与类脂质在设置比率下混合来配制RNA(例如mRNA)多核苷酸以进行体外实验。体内制剂可能需要添加额外成分以有助于全身循环。为测试这些类脂质形成适于在体内起作用的粒子的能力，用于siRNA-类脂质制剂的标准配制过程可用作起始点。在形成粒子之后，添加多核苷酸，并且使其与复合物整合。使用标准染料排斥测定来测定囊封效率。
实施例12：小鼠免疫原性研究
HA主干抗原的比较
在这个实施例中，进行测定以相较于蛋白质抗原来评价对使用mRNA/LNP平台递送的流感病毒疫苗抗原的免疫应答。本研究被设计来测试包含编码从不同流感病毒株获得的HA主干蛋白的mRNA多核苷酸的候选流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性。测试动物是从Charles River Laboratories获得的6-8周龄雌性BALB/c小鼠。测试疫苗包括在MC3 LNP中配制的以下mRNA：H1/波多黎各/8/1934的主干(基于Mallajosyula V等PNAS 2014年6月24日；111(25)：E2514-23)，H1/新喀里多尼亚/20/1999的主干(基于Mallajosyula V等PNAS2014年6月24日；111(25)：E2514-23)，H1/加利福尼亚/04/2009的主干(基于MallajosyulaV等PNAS 2014年6月24日；111(25)：E2514-23)，H5/越南/1194/2004的主干(基于Mallajosyula V等PNAS 2014年6月24日；111(25)：E2514-23)，H10/江西-东湖/346/2013的主干，以及全长H10/江西-东湖/346/2013。
在这个研究中测试的蛋白疫苗包括pH1HA10-折叠子蛋白，如Mallajosyula等ProcNatl Acad Sci U S A.2014；111(25)：E2514-23中所述。额外对照包括MC3(关于LNP的作用进行对照)和PR8流感病毒。
用100μL总体积的各测试疫苗对小鼠进行肌肉内免疫，所述疫苗以50μL免疫形式向各四头肌施用，例外之处是PR8流感病毒对照的施用，其在用氯胺酮(Ketamine)和甲苯噻嗪(Xylazine)的混合物使动物镇静下以20μL的体积进行鼻内递送。各测试疫苗的组号以及疫苗剂量概述于下表中：
表1.RNA测试疫苗
在第0和3周用两次剂量的各种流感病毒RNA疫苗制剂使小鼠免疫，并且在用第二剂量进行免疫之后2周收集血清。
为测试血清中能够结合至来自广泛多种流感病毒株的血凝素(HA)的抗体的存在，将ELISA板用100ng的从Sino Biological Inc.获得的以下重组HA涂布：甲型流感H1N1(A/新喀里多尼亚/20/99)，目录号11683-V08H；甲型流感H3N2(A/爱知/2/1968)，目录号11707-V08H；甲型流感H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)目录号11055-V08H；甲型流感H1N1(A/波多黎各/8/34)目录号11684-V08H；甲型流感H3N2(A/布里斯班/10/2007)，目录号11056-V08H；甲型流感H2N2(A/日本/305/1957)目录号11088-V08H；甲型流感H7N9(A/安徽/1/2013)目录号40103-V08H；流感H5N1(A/越南/1194/2004)目录号11062-V08H1；流感H9N2(A/香港/1073/99)目录号11229-V08H和甲型流感H10N8(A/江西-东湖/346/2013)目录号40359-V08B。在涂布之后，将板洗涤，用具有0.05％吐温-20(Tween-20)的磷酸盐缓冲盐水(PBST)+3％奶阻断，并且将100μL的对照抗体或来自经免疫小鼠的血清(于PBST+3％奶中稀释)添加至各板的顶部孔中并连续稀释。将板密封，并且在室温下孵育2小时。将板洗涤，并且将山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP缀合物(Novex，1∶2000稀释于PBST/3％奶中)添加至含有小鼠血清的各孔中。将板在室温下孵育1小时，洗涤，并且与TMB底物(Thermo Scientific)一起孵育。使颜色显现10分钟，接着用100μL 2N硫酸猝灭。在微板读取器上在450nM下对板进行读取。计算终点效价(是本底的2.5倍高)。
在图1中，测试疫苗显示在y轴上，并且绘制针对来自各不同流感病毒株的HA的终点效价。来自第1组(H1、H2、H5、H9)流感病毒株的HA用实心圆圈指示，而来自第2组(H3、H7、H10)流感病毒株的HA用空心圆圈指示。图1说明囊封在MC3脂质纳米粒子中的编码基于HA的抗原的基于mRNA的疫苗诱导针对HA的高抗体结合效价。图1也说明被设计来表达来自不同H1N1或H5N1流感病毒株的主干结构域的一部分的mRNA疫苗引发能够结合测试的所有第1组株HA以及若干第2组株的高抗体效价。图1也说明相比于相同主干结构域的蛋白质疫苗，被设计来表达H1N1 A/加利福尼亚/04/2009主干结构域的一部分的mRNA疫苗诱导更高效价。
在另一小鼠免疫原性研究中，评价对使用mRNA/LNP平台递送的额外流感病毒疫苗抗原的免疫应答。这个研究的目的在于评价第二组mRNA疫苗抗原在小鼠中引发交叉保护性免疫应答的能力，以及评估用编码流感HA抗原的mRNA疫苗共同给药的潜力。测试动物是从Charles River Laboratories获得的6-8周龄雌性BALB/c小鼠。测试疫苗包括在MC3 LNP中配制的以下mRNA：H1HA6(基于Bommakanti G等J Virol.2012年12月；86(24)：13434-44)；H3HA6(基于Bommakanti G等PNAS 2010年8月3日；107(31)：13701-6)；H1HA10-折叠子_ΔNgly；eH1HA(来自H1N1 A/波多黎各/8/34的HA的外结构域)；eH1HA_天然信号序列(具有它的天然信号序列的eH1HA)；H3N2 A/威斯康星/67/2005主干；H3N2A/香港/1/1968主干(基于Mallajosyula V等Front Immunol.2015年6月26日；6：329)；H7N9 A/安徽/1/2013主干；H1N1 A/加利福尼亚/04/2009主干RNA(基于Mallajosyula V等PNAS 2014年6月24日；111(25)：E2514-23)；和H1N1 A/波多黎各/8/1934主干RNA(基于Mallajosyula V等PNAS 2014年6月24日；111(25)：E2514-23)。
对照包括：MC3(关于LNP的作用进行对照)；原初(未接种疫苗的动物)；和用H1N1A/PR/8/34和H3N2 A/HK/1/68流感病毒进行疫苗接种(阳性对照)。
用100μL总体积的各测试疫苗对小鼠进行肌肉内免疫，所述疫苗以50μL免疫形式向各四头肌施用，例外之处是H1N1 A/PR/8/34和H3N2 A/HA/1/68流感病毒对照的施用，其在用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物使动物镇静下以20μL的体积进行鼻内递送。各测试疫苗的组号以及疫苗剂量概述于下表中：
表2.测试疫苗
在研究开始日使动物免疫，接着在初始免疫之后3周再次免疫。在第二剂量之后2周从动物收集血清。为测试血清中能够结合至来自广泛多种流感病毒株的血凝素(HA)的抗体的存在，将ELISA板用100ng的从Sino Biological Inc.获得的以下重组HA涂布：甲型流感H1N1(A/新喀里多尼亚/20/99)，目录号11683-V08H；甲型流感H3N2(A/爱知/2/1968)，目录号11707-V08H；甲型流感H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)目录号11055-V08H；甲型流感H1N1(A/波多黎各/8/34)目录号11684-V08H；甲型流感H3N2(A/布里斯班/10/2007)，目录号11056-V08H；甲型流感H2N2(A/日本/305/1957)目录号11088-V08H；甲型流感H7N9(A/安徽/1/2013)目录号40103-V08H和甲型流感H3N2(A/莫斯科(Moscow)/10/99)目录号40154-V08。进行ELISA测定，并且如上所述计算终点效价。图2和3显示在用测试疫苗进行第二次免疫之后的终点抗HA抗体效价。测试疫苗显示在x轴上，并且绘制与来自各不同流感病毒株的HA的结合。所有编码HA主干的mRNA疫苗都具有免疫原性，并且引发识别来自一组不同甲型流感病毒株的HA的稳健抗体应答。H1HA6、eH1HA和eH1HA_天然信号序列mRNA跨越第1组HA的小组引发最高总体结合效价，而H3HA6RNA跨越第2组Ha引发最高总体结合效价(图2)。也测试主干mRNA疫苗的组合的免疫原性。在这个研究中，在与LNP一起配制之前混合各个mRNA(第9组，共同形式)，或在混合之前将各个mRNA与LNP一起配制(第10组，混合形式)。如图3中所示，无论配制方法如何，使基于H1主干的mRNA和基于H3主干的mRNA组合都不导致干扰对任一抗原的免疫应答。
实施例13：小鼠功效研究
1号甲型流感激发
这个研究被设计来测试候选流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性和功效。测试动物是从Charles River Laboratories获得的6-8周龄雌性BALB/c小鼠。测试疫苗包括在MC3LNP中配制的以下mRNA：NIHGen6HASS-折叠子mRNA(基于Yassine等Nat.Med.2015年9月；21(9)：1065-70)，编码来自H3N2株的核蛋白NP的mRNA，或NIHGen6HASS-折叠子和NP mRNA的若干组合中的一者。测试若干疫苗抗原共同递送方法，包括：在与LNP一起配制之前混合各个mRNA(共同形式)，在混合之前配制各个mRNA(混合各个LNP)，以及单独地配制mRNA并注射远端部位(相对腿)(远距离各个LNP)。对照动物用编码来自H1N1 A/波多黎各/8/1934的HA的外结构域的RNA(eH1HA，阳性对照)或空MC3LNP(用以关于LNP的作用进行对照)接种疫苗，或不接种疫苗(原初)。
在第0周和第3周，用100μL总体积的各测试疫苗对动物进行肌肉内(IM)免疫，所述疫苗以50μL免疫形式向各四头肌施用。这个研究中评价的候选流感病毒疫苗在以上描述，并且概述于下表中。在第二剂量之后2周从所有动物收集血清。在第6周时，从一子组动物(n＝4)收集脾。其余动物(n＝6)在用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物加以镇静下用致死剂量的小鼠适应的流感病毒株H1N1 A/波多黎各/8/1934进行鼻内激发。持续感染后20天，记录致死率，并且每日评估各个小鼠重量。
表3.测试疫苗
为测试血清中能够结合至来自广泛多种流感病毒株的血凝素(HA)或核蛋白(NP)的抗体的存在，将ELISA板用100ng的从Sino Biological Inc.获得的以下重组蛋白涂布：甲型流感H1N1(A/新喀里多尼亚/20/99)HA，目录号11683-V08H；甲型流感H3N2(A/爱知/2/1968)HA，目录号11707-V08H；甲型流感H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)HA，目录号11055-V08H；甲型流感H1N1(A/波多黎各/8/34)HA，目录号11684-V08H；甲型流感H1N1(A/布里斯班/59/2007)HA，目录号11052-V08H；甲型流感H2N2(A/日本/305/1957)HA，目录号11088-V08H；甲型流感H7N9(A/安徽/1/2013)HA，目录号40103-V08H，甲型流感H3N2(A/莫斯科/10/99)HA，目录号40154-V08和甲型流感H3N2(A/爱知/2/1968)核蛋白目录号40207-V08B。进行ELISA测定，并且如上所述计算终点效价。图4描绘从用测试疫苗接种疫苗的动物汇集的血清的终点效价。测试疫苗显示在图4A的x轴上，并且绘制与来自各不同流感病毒株的HA的结合。NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗引发高效价的结合测试的所有H1、H2和H7 HA的抗体。无论mRNA共同配制或共同递送的方法如何，使NIHGen6HASS-折叠子mRNA与编码NP的mRNA组合都不负面影响观察的抗HA应答。在从来自单独研究的相同组收集的血清中，也在来自用含NP mRNA疫苗接种疫苗的动物的血清中检测到对NP蛋白的稳健抗体应答，所述NP mRNA是单独NP或与NIHGen6HASS-折叠子mRNA共同配制(图4B)。
为探测功能性抗体应答，评估血清中和一组HA-假型病毒的能力(图5)。简要来说，用含有萤火虫荧光素酶基因的复制缺陷性逆转录病毒载体、编码人气道丝氨酸蛋白酶的表达载体和编码流感血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的表达载体共同转染293细胞。将所得假病毒从培养上清液收集，过滤，并且滴定。在37℃下在96孔板中使连续血清稀释液与假病毒储备物(每孔30,000-300,000相对光单位)一起孵育1小时，随后将293细胞添加至各孔中。在37℃下孵育培养物72小时，添加荧光素酶底物和细胞裂解试剂，并且在光度计上测量相对光单位(RLU)。将中和效价表示为抑制50％的假病毒感染的血清稀释度的倒数(IC50)。
对于各测试样品(沿x轴列出)，各棒条代表中和不同病毒假型的IC50。尽管来自原初小鼠或NP RNA疫苗接种小鼠的血清不能抑制假病毒感染，但来自用10μg或5μg的NIHGen6HASS-折叠子mRNA或用NIHGen6HASS-折叠子和NPmRNA的组合接种疫苗的小鼠的血清在类似程度上中和测试的所有H1和H5病毒假型。
也评估NIHGen6HASS-折叠子抗血清在体外介导抗体-依赖性细胞细胞毒性(ADCC)替代活性的能力。简要来说，使连续滴定的小鼠血清样品与在细胞表面上稳定表达来自H1N1 A/波多黎各/8/1934的HA的A549细胞一起孵育。随后，将ADCC生物测定效应细胞(ADCCBioassay Effector cells，Promega，小鼠FcgRIV NFAT-Luc效应细胞)添加至血清/靶标细胞混合物。约6小时后，将Bio-glo试剂(Promega)添加至样品孔，并且测量发光。将数据绘制成诱导倍数(样品发光/本底发光)相对于血清浓度(图6)。当与适当靶标细胞一起孵育时，来自NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗接种小鼠的血清能够刺激替代ADCC效应细胞系，从而表明疫苗可诱导能够介导体内ADCC活性的抗体。
在施用第二疫苗剂量之后3周，从各组中的一子组动物收集脾，并且将来自同一组中的动物的脾细胞汇集。将脾淋巴细胞用HA或NP肽的汇集物刺激，并且通过细胞内染色和流式细胞术来测量IFN-γ、IL-2或TNF-a产生。图7是对在用NP肽的汇集物刺激之后的应答的表示，并且图8是对在用H1 HA肽的汇集物刺激之后的应答的表示。在用NP mRNA在存在或不存在NIHGen6HASS-折叠子mRNA下进行疫苗接种之后，抗原-特异性CD4和CD8 T细胞见于脾中。在用NIHGen6HASS-折叠子RNA进行疫苗接种或向远端注射部位(远端部位)递送NIHGen6HASS-折叠子和NP RNA之后，仅观察到HA-特异性CD4细胞。然而，当向同一注射部位共同施用NIHGen6HASS-折叠子和NP RNA(共同形式，混合)时，检测到HA-特异性CD8 T细胞应答。
在用小鼠适应的H1N1 A/波多黎各/8/1934进行致死性激发之后，截至感染后第12天，所有原初动物都死于感染(图9)。相比之下，用NIHGen6HASS-折叠子mRNA、NP mRNA、NIHGen6HASS-折叠子和NP mRNA的任何组合、或eH1HA mRNA接种疫苗的所有动物都存活于激发。如图9中所见，尽管不存在致死性，但用H3N2 NP mRNA接种疫苗以及用H1N1病毒激发的小鼠在恢复之前减少大量(约15％)重量。用NIHGen6HASS-折叠子RNA接种疫苗的那些也减少约5％体重。相比之下，用NIHGen6HASS-折叠子和NP mRNA的组合接种疫苗的小鼠似乎完全被保护免遭致死性流感病毒激发，这类似于用表达与激发病毒的HA抗原同源的HA抗原(eH1HA)的mRNA接种疫苗的那些。在所有疫苗剂量下，以及在评估的所有共同配制和共同递送方法的情况下，疫苗功效都类似(图10)。
2号甲型流感激发
这个研究被设计来测试候选流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性和功效。测试动物是从Charles River Laboratories获得的6-8周龄雌性BALB/c小鼠。测试疫苗包括在MC3LNP中配制的以下mRNA：NIHGen6HASS-折叠子mRNA(基于Yassine等Nat.Med.2015年9月；21(9)：1065-70)和NIHGen6HASS-TM2 mRNA。将对照动物用编码来自H1N1 A/波多黎各/8/1934的HA的外结构域的mRNA(eH1HA，阳性对照)接种疫苗，或不接种疫苗(原初)。
在第0周和第3周，用100μL总体积的各测试疫苗对动物进行肌肉内(IM)免疫，所述疫苗以50μL免疫形式向各四头肌施用。这个研究中评价的候选流感病毒疫苗在以上描述，并且概述于下表中。在第二剂量之后2周从所有动物收集血清。在第6周，所有动物都在用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物加以镇静下用致死剂量的小鼠适应的流感病毒株H1N1 A/波多黎各/8/1934进行鼻内激发。持续感染后20天，记录致死率，并且每日评估组中小鼠重量。
表4.测试疫苗
为测试血清中能够结合至来自广泛多种流感病毒株的血凝素(HA)的抗体的存在，将ELISA板用100ng的从Sino Biological Inc.获得的以下重组HA涂布：甲型流感H1N1(A/新喀里多尼亚/20/99)，目录号11683-V08H；甲型流感H3N2(A/爱知/2/1968)，目录号11707-V08H；甲型流感H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)目录号11055-V08H；甲型流感H1N1(A/波多黎各/8/34)目录号11684-V08H；甲型流感H1N1(A/布里斯班/59/2007)，目录号11052-V08H；甲型流感H2N2(A/日本/305/1957)目录号11088-V08H；甲型流感H7N9(A/安徽/1/2013)目录号40103-V08H和甲型流感H3N2(A/莫斯科/10/99)目录号40154-V08。进行ELISA测定，并且如上所述计算终点效价。图11A描绘从用测试疫苗接种疫苗的动物汇集的血清的终点效价。测试疫苗显示在x轴上，并且绘制与来自各不同流感病毒株的HA的结合。NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗引发高效价的结合测试的所有H1、H2和H7 HA的抗体。相较于来自NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗接种小鼠的那些结合效价，来自NIHGen6HASS-TM2 mRNA疫苗接种小鼠的结合效价降低。
在用小鼠适应的H1N1 A/波多黎各/8/1934进行致死性激发之后，截至感染后第16天，所有原初动物都死于感染(图11B)。相比之下，用NIHGen6HASS-折叠子mRNA、NIHGen6HASS-TM2 mRNA或eH1HA RNA接种疫苗的所有动物都存活于激发。如图11B中所示，NIHGen6HASS-TM2疫苗的功效等于NIHGen6HASS-折叠子疫苗的功效。
3号甲型流感激发
在这个实施例中，进行两只动物研究和测定以评价对使用mRNA/LNP平台递送的流感病毒共有血凝素(HA)疫苗抗原的免疫应答。这些研究的目的在于评价共有HA mRNA疫苗抗原在小鼠中引发交叉保护性免疫应答的能力。
为产生共有HA序列，通过在http：//www.fludb.org处的网站从NIAID流感研究数据库(Influenza Research Database，IRD)(Squires等，Influenza Other RespirViruses.2012年11月；6(6)：404-416.)获得2415条甲型流感血清型H1 HA序列。在移除重复序列和实验室株之后，剩余2385个条目，包括来自大流行性H1N1株(pH1N1)的1735条H1序列和来自季节性H1N1株(sH1N1)的650条H1序列。使用Matlab 9.0生物信息学工具箱(MathWorks，Natick，MA)，分别比对大流行性H1序列和季节性H1序列，并且产生各组的共有序列。使用经修改Seq2Logo程序(Thomsen等，Nucleic Acids Res.2012年7月；40(网络服务器发表)：W281-7)，分别产生两组的序列概况。
测试动物是从Charles River Laboratories获得的6-8周龄雌性BALB/c小鼠。测试疫苗包括在MC3 LNP中配制的以下mRNA：ConH1和ConH3(基于Webby等，PLoS One.2015年10月15日；10(10)：e0140702.)；Cobra_P1和Cobra_X3(基于Carter等，J Virol.2016年4月14日；90(9)：4720-34)；MRK_pH1_Con和MRK_sH1_Con(上述大流行性和季节性共有序列)；以及以上提及的6个抗原中的每一个连同用于达成潜在粒子形成的铁蛋白融合序列一起。
对照包括：MC3(关于LNP的作用进行对照)；原初(未接种疫苗的动物)；和用编码来自株H1N1 A/PR/8/34的HA的外结构域的eH1HA RNA进行疫苗接种(关于病毒激发进行阳性对照)。
在第0周和第3周，用100μL总体积的各测试疫苗对动物进行肌肉内(IM)免疫，所述疫苗以50μL免疫形式向各四头肌施用。这个研究中评价的候选流感病毒疫苗在以上描述，并且概述于下表中。在第二剂量之后2周(第5周)从所有动物收集血清。在第6周，动物在用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物加以镇静下用致死剂量的小鼠适应的流感病毒株H1N1 A/波多黎各/8/1934(PR8)进行鼻内激发。持续感染后20天，记录致死率，并且每日评估组重量。
表5.测试疫苗
为测试血清抗体中和激发病毒株的能力，使用具有高斯(Gaussia)荧光素酶报告基因的经修饰PR8病毒，进行微量中和测定(Pan等，Nat Commun.2013；4：2369)。简要来说，在具有TPCK处理的胰蛋白酶的病毒稀释剂中稀释PR8荧光素酶病毒。将血清样品1∶10稀释，接着在96孔细胞培养板中连续稀释3倍。使50μL各稀释的血清样品和相等体积的稀释病毒在孔中混合，并且在37℃下在5％CO2下孵育1小时，随后添加100μL的1.5x 10^5个细胞/mL的MDCK细胞。接着在37℃下在5％CO2下将板孵育72小时。在EnVision读取器(PerkinElmer)上，用高斯荧光素酶发光测定试剂盒(Gaussia Luciferase Glow Assay Kit，Pierce)读取发光信号。如图12A中所示，来自用编码来自H1亚型的共有HA抗原的mRNA免疫的小鼠的血清能够可检测地中和PR8荧光素酶病毒，即使这些抗原的HA序列与PR8株的HA序列有8-19％不同。HA序列匹配抗原(eH1HA)引发高得多的针对这个病毒的血清中和抗体应答。相比之下，来自用编码共有H3抗原(ConH3)的RNA接种疫苗的小鼠的血清不能中和PR8荧光素酶病毒，从而表明来自不同亚型(例如H1和H3)的共有序列可能不交叉反应。类似地，来自用编码H1亚型共有HA抗原以及铁蛋白融合序列的mRNA免疫的小鼠的血清能够可检测地中和PR8荧光素酶病毒，例外之处是Merck_pH1_Con_铁蛋白mRNA，而来自用编码共有H3抗原以及铁蛋白融合序列的mRNA接种疫苗的小鼠的血清不能中和PR8荧光素酶病毒(图12B)。与血清中和数据一致，用共有H1 HA抗原(具有或不具有铁蛋白融合)免疫的小鼠存活于致死性PR8病毒激发，并且不显示重量减轻，例外之处是Merck_pH1_Con_铁蛋白mRNA组，而ConH3、原初和仅LNP对照组中的小鼠在激发后重量快速减轻(图13)。用Merck_pH1_Con_铁蛋白mRNA免疫的小鼠存活于致死性PR8病毒激发，并且显示重量减轻5-10％，从而表明部分保护作用可通过除病毒中和以外的一种或多种机理加以介导。
为评估由共有HA抗原引发的血清中和活性的广度，如上所述对一组假病毒进行中和测定(图14)。如所预期，来自用流感病毒H1N1 A/波多黎各/8/1934免疫的小鼠的血清(来自实施例12中所述的研究)仅能够中和匹配的假病毒株(PR8)。相比之下，来自用共有H1 HA抗原以及eH1HA抗原免疫的小鼠的血清能够中和一组不同第1组假病毒，包括来自亚型H1和H5的株，但不中和来自第2组(亚型H3)的株。一致的是，来自用共有H3 HA抗原免疫的小鼠的血清能够中和来自第2组(亚型H3)的株，但不中和任何第1组假病毒。
乙型流感激发
这个研究被设计来测试候选流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性和功效。测试动物是从Charles River Laboratories获得的6-8周龄雌性BALB/c小鼠。测试疫苗包括在MC3LNP中配制的以下mRNA：B/普吉(Phuket)/3073/2013 sHA(可溶性HA)，B/普吉/3073/2013mHA(具有膜锚的全长HA)，B/布里斯班/60/2008 sHA，B/维多利亚(Victoria)/02/1987sHA，B/维多利亚/02/1987 mHA，B/山形(Yamagata)/16/1988 mHA或BHA10(HA主干设计)。对照动物用非致死剂量的小鼠适应的B/安娜堡(Ann Arbor)/1954(阳性对照)或空MC3 LNP(用以关于LNP的作用进行对照)接种疫苗，或不接种疫苗(原初)。
在第0周和第3周，用100μL总体积的各测试疫苗对动物进行肌肉内(IM)免疫，所述疫苗以50μL免疫形式向各四头肌施用。这个研究中评价的候选流感病毒疫苗在以上描述，并且概述于下表中。在第二剂量之后2周从所有动物收集血清。在第6周，所有动物(n＝每组10只动物)都在用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物加以镇静下用致死剂量的小鼠适应的流感病毒株B/安娜堡/1954进行鼻内激发。持续感染后20天，记录致死率，并且每日评估组中小鼠重量。
本文所述的每条序列涵盖化学修饰的序列或不包含核苷酸修饰的未修饰序列。
表6.测试疫苗
图15A描绘从用测试疫苗接种疫苗的动物汇集的血清的ELISA终点抗HA抗体效价。测试疫苗显示在x轴上，并且绘制与来自各不同流感病毒株的HA的结合。除源于B/普吉/3073/2013的那些之外，所有测试疫苗都具有免疫原性，并且血清抗体结合至来自B/山形/16/1988(山形谱系)与B/佛罗里达(Florida)/4/2006(维多利亚谱系)两者的HA。
在用小鼠适应的B/安娜堡/1954进行致死性激发之后，截至感染后第16天，90％的MC3疫苗接种动物和原初动物死于感染(图15B)。B/普吉/3073/2013 sHA和mHA mRNA疫苗不显示针对致死性激发的功效，并且BHA10主干mRNA疫苗仅保护半数动物。所有其他测试疫苗都保护小鼠完全免遭致死(图15B)，但仅B/山形/16/1988 mHA RNA疫苗能够预防用异源性病毒株激发的动物的致死和重量减轻(图15B)。
实施例14：非人灵长类动物免疫原性
这个研究被设计来测试候选流感病毒疫苗在恒河猴(rhesus macaques)中的免疫原性。测试疫苗包括在MC3 LNP中配制的以下mRNA：NIHGen6HASS-折叠子mRNA(基于Yassine等Nat.Med.2015年9月；21(9)：1065-70)和编码来自H3N2流感病毒株的NP蛋白的NP mRNA。
第1组中的动物已先前用季节性失活流感疫苗接种疫苗，并且在第0天用300μg的NIHGen6HASS-折叠子mRNA进行肌肉内(IM)加强。第2和3组中的动物在研究开始时是流感原初动物，并且在第0、28和56天分别用300μg的NIHGen6HASS-折叠子mRNA或300μg的NP mRNA接种疫苗。在研究开始之前(第-8天)以及在第14、28、42、56、70、84、112、140和168天，从所有动物收集血清。
NIHGen6HASS-折叠子疫苗引发稳健的抗体应答，如通过ELISA测定(将板用重组表达的NIHGen6HASS-折叠子[HA主干]或NP蛋白涂布)所测量，并且数据描绘于图16中。图16A显示先前用接种疫苗以及用NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗进行单次加强的4只恒河猴随时间的针对HA主干的效价。图16B描绘来自在第0、28和56天用相同NIHGen6HASS-折叠子RNA疫苗接种疫苗的4只恒河猴的随时间的针对HA主干的效价。NIHGen6HASS-折叠子RNA疫苗能够在先前用失活流感疫苗接种疫苗的动物中使抗HA主干抗体结合效价加强，以及在原初动物中引发稳健应答。在两个组中，HA主干效价保持升高超过基线直至至少第168研究日。图16C说明在第0、28和56天用NP mRNA疫苗接种疫苗的4只恒河猴随时间的针对NP的抗体效价，并且显示疫苗引发对NP的稳健抗体应答。
为测试第1和2组血清中能够结合至来自广泛多种流感病毒株的血凝素(HA)的抗体的存在，如上所述将ELISA板用来自一组不同流感病毒株的重组HA涂布。将EC10效价计算为达到最大信号的10％的血清稀释度的倒数。对于第1组中的动物(图17A)，单剂量的NIHGen6HASS-折叠子疫苗使针对H1 HA的效价加强至约40-60倍，并且效价在疫苗接种后约28天达到峰值。效价从第28天至第70天降低，但第70天效价仍然是在疫苗接种之前测量的效价的约10-30倍高。NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗不使针对来自H3或H7流感株的HA的效价加强。对于第2组中的动物(图17B)，在各次剂量的NIHGen6HASS-折叠子mRNA疫苗之后，针对H1和H2 HA的抗体效价升高，并且效价似乎在第2剂量之后最显著升高。
除稳健抗体应答之外，NP mRNA疫苗也在恒河猴中引发细胞介导的免疫性。在第0、42、70和140研究日，从第3组NP mRNA疫苗接种的恒河猴收集PBMC。淋巴细胞用NP肽的汇集物刺激，并且通过细胞内染色和流式细胞术来测量IFN-γ、IL-2或TNF-α产生。图18是对在NP肽汇集物刺激之后的应答的表示。在用NP mRNA进行疫苗接种之后，抗原特异性CD4和CD8T细胞见于外周血液中，并且这些细胞维持高于基线直至至少第140研究日。
实施例15：H7N9免疫原性研究
本研究被设计来测试H7N9免疫原性。在第1和22天向40只动物施用25μM肌肉内免疫，并且在第1、8、22和43天收集血液。使用血液样品进行血凝集抑制(HAI)和微量中和测试。
HAI测试显示包括安慰剂组的所有动物的几何平均效价(GMT)是45。仅响应者的GMT是116(图19)。每名单独的受试者的HAI动力学在图20中给出。
微量中和(MN)测试显示包括安慰剂组的所有动物的几何平均效价(GMT)是36。仅响应者的GMT是84(图21)。各受试者的MN测试动力学在图22中给出。
HAI和MN显示极其强烈关联(图23)。仅1名受试者在一个测定中具有保护性效价，但在另一测定中没有。此外，10名受试者在第43天不具有可检测HAI或MN效价。
表7.流感H1N1抗原
表8.流感H3N2抗原
表9.流感H5N1抗原
表10.其他甲型流感抗原(H1N＊、H2N＊、H3N＊)
表11.其他甲型流感抗原(H4N＊-H13N＊)
表12.乙型流感抗原
表13.丙型流感抗原
表14：H7血凝素氨基酸序列
表15：H10血凝素氨基酸序列
表16.示例性流感HA主干抗原
表16中所列的各氨基酸序列的第一加下划线序列指示信号或分泌序列，其可由实现相同或类似功能的替代性序列替代，或可使所述信号或分泌序列缺失。表16中所列的氨基酸序列的第二加下划线序列指示折叠子序列，其是天然地进行三聚以使3个HA主干一起呈三聚体形式的异源性序列。所述折叠子序列可由实现相同或类似功能的替代性序列替代。
表17.示例性流感构建体
各构建体的5’UTR：
各构建体的3’UTR：
表17中所列的各氨基酸序列的第一加下划线序列指示信号或分泌序列，其可由实现相同或类似功能的替代性序列替代，或可使所述信号或分泌序列缺失。
表18.流感核酸
各构建体的5’UTR：
各构建体的3’UTR：
表19：野生型血凝素抗原的实例
表20：额外流感构建体
表20中所列的各氨基酸序列的加下划线序列指示信号或分泌序列，其可由实现相同或类似功能的替代性序列替代，或可使所述信号或分泌序列缺失。
表21：额外流感序列
表22.信号肽
表23：鞭毛蛋白核酸序列
表24：鞭毛蛋白氨基酸序列
表25.流感mRNA构建体
等效方案
本领域技术人员将仅使用常规实验就会认识到或能够确定本文所述的本公开的特定实施方案的许多等效方案。所述等效物意图由以下权利要求涵盖。
本文公开的包括专利文件的所有参考文献都以引用的方式整体并入本文。

Claims (66)

1.一种流感病毒疫苗，其包含：
在脂质纳米粒子中配制的至少一种具有编码至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸。
2.如权利要求1所述的流感疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽是流感血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、HA1或HA2的免疫原性片段、或前述各物中的任何两者或更多者的组合。
3.如权利要求1所述的流感疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA1、HA2、或HA1和HA2的组合，并且至少一种抗原性多肽选自由神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)和非结构蛋白2(NS2)组成的组。
4.如权利要求3所述的流感疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA2，并且至少一种抗原性多肽选自由NA、NP、M1、M2、NS1和NS2组成的组。
5.如权利要求4所述的流感疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA2，并且至少一种抗原性多肽选自由NA、NP、M1、M2、NS1和NS2组成的组。
6.如权利要求1-5中任一项所述的流感疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽来自流感病毒株H1/波多黎各/8/1934、H1/新喀里多尼亚/20/1999、H1/加利福尼亚/04/2009、H5/越南/1194/2004、H2/日本/305/1957、H9/香港/1073/99、H3/爱知/2/1968、H3/布里斯班/10/2007、H7/安徽/1/2013、H10/江西-东湖/346/2013、H3/威斯康星/67/2005、H1/越南/850/2009或其组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ IDNO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种RNA多肽由用SEQ ID NO：447-457、459、461中的任一者标识的核酸序列编码，和/或其中所述至少一种RNA多肽包含由SEQ ID NO：491-503中的任一者标识的核酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽具有与由SEQID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽具有与由SEQID NO：1-444、458、460、462-479中的任一者标识的氨基酸序列具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求1-10中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽具有与SEQID NO：1-444、458、460、462-479的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附接至细胞受体、导致病毒膜和细胞膜的融合和/或负责所述病毒结合至所感染细胞。
12.如权利要求1-11中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽具有与SEQID NO：1-444、458、460、462-479的氨基酸序列具有90％-99％同一性的氨基酸序列，并且其中所述抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附接至细胞受体、导致病毒膜和细胞膜的融合和/或负责所述病毒结合至所感染细胞。
13.如权利要求1-2中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框是密码子优化的。
14.如权利要求1-3中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗是多价的。
15.如权利要求1-4中任一项所述的疫苗，其以有效产生抗原特异性免疫应答的量配制。
16.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用如权利要求1-15中任一项所述的疫苗。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中向所述受试者施用单剂量的所述疫苗。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中向所述受试者施用加强剂量的所述疫苗。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述疫苗通过真皮内注射或肌肉内注射来向所述受试者施用。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中相对于对照，在所述受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加至少1个log。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其中相对于对照，在所述受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价增加1-3个log。
23.如权利要求16-22中任一项所述的方法，其中相对于对照，在所述受试者中产生的所述抗抗原性多肽抗体效价增加至至少2倍。
24.如权利要求16-23中任一项所述的方法，其中相对于对照，在所述受试者中产生的所述抗抗原性多肽抗体效价增加至2-10倍。
25.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述对照是在尚未被施用针对所述病毒的疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
26.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述对照是在已被施用针对所述病毒的活体减毒疫苗或失活疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
27.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述对照是在已被施用针对所述病毒的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
28.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述对照是在已被施用针对所述病毒的VLP疫苗的受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
29.如权利要求16-28中任一项所述的方法，其中所述有效量是等于降低至针对所述病毒的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的护理标准剂量的至少1/2的剂量，并且其中在所述受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价等于在分别被施用所述护理标准剂量的针对所述病毒的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的对照受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
30.如权利要求16-28中任一项所述的方法，其中所述有效量是等于降低至针对所述病毒的活体减毒疫苗或失活疫苗的护理标准剂量的至少1/2的剂量，并且其中在所述受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价等于在分别被施用所述护理标准剂量的针对所述病毒的活体减毒疫苗或失活疫苗的对照受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
31.如权利要求16-28中任一项所述的方法，其中所述有效量是等于降低至针对所述病毒的VLP疫苗的护理标准剂量的至少1/2的剂量，并且其中在所述受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价等于在被施用所述护理标准剂量的针对所述病毒的VLP疫苗的对照受试者中产生的抗抗原性多肽抗体效价。
32.如权利要求16-31中任一项所述的方法，其中所述有效量是50μg-1000μg的总剂量。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述有效量是总计两次向所述受试者施用的25μg、100μg、400μg或500μg的剂量。
34.如权利要求16-33中任一项所述的方法，其中所述疫苗针对所述病毒的功效大于65％。
35.如权利要求16-34中任一项所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者针对所述病毒免疫多达2年。
36.如权利要求16-34中任一项所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者针对所述病毒免疫超过2年。
37.如权利要求16-36中任一项所述的方法，其中所述受试者已暴露于所述病毒，其中所述受试者被所述病毒感染，或其中所述受试者处于被所述病毒感染的风险下。
38.如权利要求16-37中任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫损害的。
39.如权利要求1-15中任一项所述的疫苗，用于在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法中，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用所述疫苗。
40.如权利要求1-15中任一项所述的疫苗在制造用于在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法中的药剂中的用途，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用所述疫苗。
41.一种工程化的核酸，其编码如权利要求1-15中任一项所述的疫苗的至少一种RNA多核苷酸。
42.一种包含工程化的核酸的表达载体，所述工程化的核酸编码如权利要求1-15中任一项所述的疫苗的至少一种RNA多核苷酸。
43.一种包含工程化的核酸的宿主细胞，所述经工程化的核酸编码如权利要求1-16中任一项所述的疫苗的至少一种RNA多核苷酸。
44.一种产生多肽的方法，其包括在容许由所述核酸编码的多肽的表达的条件下在培养基中培养如权利要求43所述的宿主细胞，以及从所述培养的细胞或所述细胞的培养基纯化所述多肽。
45.一种多重共有亚型疫苗，其包含至少一种具有编码至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，其中所述疫苗提供针对多种流感病毒株的交叉反应性，所述疫苗包含至少一种共有血凝素抗原。
46.如权利要求45所述的疫苗，其中所述共有血凝素抗原选自由流感血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、HA1或HA2的免疫原性片段、或前述各物中的任何两者或更多者的组合组成的组。
47.如权利要求45所述的疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA1、HA2、或HA1和HA2的组合，并且至少一种抗原性多肽选自由神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)和非结构蛋白2(NS2)组成的组。
48.如权利要求47所述的疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA2，并且至少一种抗原性多肽选自由NA、NP、M1、M2、NS1和NS2组成的组。
49.如权利要求48所述的疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA2，并且至少一种抗原性多肽选自由NA、NP、M1、M2、NS1和NS2组成的组。
50.如权利要求45-49中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽来自流感病毒株H1/波多黎各/8/1934、H1/新喀里多尼亚/20/1999、H1/加利福尼亚/04/2009、H5/越南/1194/2004、H2/日本/305/1957、H9/香港/1073/99、H3/爱知/2/1968、H3/布里斯班/10/2007、H7/安徽/1/2013、H10/江西-东湖/346/2013、H3/威斯康星/67/2005、H1/越南/850/2009或其组合。
51.如权利要求45-49中任一项所述的疫苗，其在脂质纳米粒子中配制。
52.如权利要求51或权利要求1-15中任一项所述的疫苗，其中所述纳米粒子具有50-200nm的平均直径。
53.如权利要求51或权利要求1-15中任一项所述的疫苗，其中所述脂质纳米粒子包含阳离子脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。
54.如权利要求53所述的疫苗，其中所述脂质纳米粒子载体包含摩尔比约20-60％阳离子脂质、0.5-15％经PEG修饰的脂质、25-55％固醇和25％非阳离子脂质。
55.如权利要求54所述的疫苗，其中所述阳离子脂质是可离子化阳离子脂质，并且所述非阳离子脂质是中性脂质，并且所述固醇是胆固醇。
56.如权利要求54所述的疫苗，其中所述阳离子脂质选自2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
57.如权利要求51-56中任一项所述的疫苗，其中所述纳米粒子具有小于0.4的多分散性值。
58.如权利要求51-57中任一项所述的疫苗，其中所述纳米粒子在中性pH值下具有净中性电荷。
59.如权利要求1-15或45-58中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸包含至少一个化学修饰。
60.如权利要求59所述的疫苗，其中所述化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
61.一种在哺乳动物中诱导针对多种流感病毒株的交叉反应性的方法，所述方法包括向有此需要的所述哺乳动物施用如权利要求1-15或45-60中任一项所述的疫苗。
62.如权利要求61所述的方法，其中向所述哺乳动物分开施用至少两种具有各自编码共有血凝素抗原的开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸。
63.如权利要求61所述的方法，其中向所述哺乳动物同时施用至少两种具有各自编码共有血凝素抗原的开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸。
64.一种用于对受试者接种疫苗的药物组合物，其包含
有效剂量的编码流感病毒抗原的mRNA，
其中所述有效剂量足以产生如在施用后1-72小时在所述受试者的血清中所测量的、可检测水平的抗原。
65.如权利要求64所述的组合物，其中所述抗原的截断指数是1-2。
66.一种用于对受试者接种疫苗的药物组合物，其包含
有效剂量的编码流感病毒抗原的mRNA，
其中所述有效剂量足以产生如在施用后1-72小时在所述受试者的血清中所测量的、由针对所述抗原的中和抗体产生的1,000-10,000中和效价。
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