TW201534578A - 新穎脂質 - Google Patents

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TW201534578A
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lipid
substituent
alkyl
nucleic acid
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TW103123094A
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Makoto Koizumi
Yoshiyuki Onishi
Takako Niwa
Masakazu Tamura
Yuji Kasuya
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Daiichi Sankyo Co Ltd
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Abstract

本發明係關於一種形成脂質粒子之作為新穎陽離子性脂質之式(Ia)記載的化合物之提供、一種含該化合物的脂質粒子之提供、一種含該脂質粒子的核酸脂質粒子、一種含有該核酸脂質粒子作為有效成分的醫藥。 □

Description

新穎脂質
本發明係關於新穎陽離子性脂質、形成脂質粒子的新穎陽離子性脂質、含該陽離子性脂質的脂質粒子、於該脂質粒子進一步含有核酸的核酸脂質粒子、含有該核酸脂質粒子作為有效成分的醫藥組成物、及使用該醫藥組成物的治療方法。
作為抑制細胞、組織、或個體內之標的基因的表現的方法，有於該細胞、組織、或個體內導入雙股RNA的手法。藉由雙股RNA之導入，具有與此序列相同性的mRNA會被分解，而標的基因的表現被抑制。此效果被稱為「RNA干擾」或「RNAi」。RNA干擾最初於線蟲中被報告(例如，參照非專利文獻1)，之後於植物中亦被報告(例如，參照非專利文獻2)。
於3’末端具有2個核苷酸的外伸(overhang)的正義鏈、反義鏈之各自由21個核苷酸而成的雙股RNA(小干擾RNA(small interfering RNA：siRNA))，已被報告於脊椎動物之培養細胞，具有RNA干擾作用(例如，參照非專利文獻3)。siRNA係有用於基因機能的鑑定、適合於有用物質生產的細胞株之篩選、參與疾病的基因之控制等 ，但具有容易被RNA分解酵素分解的性質(例如，參照非專利文獻4)。
siRNA或者修飾siRNA之類的雙股多核苷酸係具有13,000左右的分子量、具有水溶性、且具有電荷的分子的緣故，為了使透過細胞膜，一般係使用轉染試藥之類的送達技術(例如，參照非專利文獻5)。尤其脂質體(liposome)係將質體DNA等之核酸分子封入，形成核酸脂質粒子，而被廣泛使用於核酸分子之送達(例如，參照非專利文獻6)。又，含陽離子性脂質的脂質體係已被報告可與siRNA混合而形成核酸脂質粒子，送達至細胞內(例如，參照專利文獻1)。然而，陽離子性脂質因係非活體成分，故可以低濃度使用的陽離子性脂質正被冀求。就陽離子性脂質而言，已知二甲基胺基戊酸衍生物(專利文獻1)、二甲基胺基丁酸衍生物(專利文獻2)、二甲基胺基乙基碳酸酯衍生物(專利文獻3)等。
本發明者們為了取得可封入如siRNA的雙股多核苷酸、DNA、反義寡核苷酸等之核酸，且可以低濃度使用的陽離子性脂質而成的脂質粒子，專心進行研究的結果，發現新穎的陽離子性脂質，而且可封入核酸分子、可以低濃度使用，且作成高細胞內送達為可能的該新穎陽離子性脂質而成的核酸脂質粒子，遂而完成本發明。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2012/108397號小冊
[專利文獻2]國際公開第2012/054365號小冊
[專利文獻3]國際公開第2010/054405號小冊
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Nature、1998年、第391卷、p.806-811
[非專利文獻2]Science、1999年、第286卷、p.950-952
[非專利文獻3]Nature、2001年、第411卷、p.494-498
[非專利文獻4]Clinical Chemistry、2002年、第48卷、p.1647-1653
[非專利文獻5]Jonural of Medicinal Chemistry、2010年、第57卷、p.7887-7901
[非專利文獻6]Gene Therapy 1999年、第6卷、p.271-281
本發明之一個課題係提供形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質。
本發明之其他之一個課題係提供藉由組合兩性脂質、固醇類、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質而形成脂質粒子的新穎陽離子性脂質。
本發明之其他之一個課題係提供含該陽離子性脂質的脂質粒子。
本發明之其他之一個課題係提供於該脂質粒子進一步含有核酸的核酸脂質粒子。
本發明之其他之一個課題係提供含有該核酸脂質粒子作為有效成分的醫藥組成物。
本發明之其他之一個課題係提供使用該醫藥組成物的治療方法。
即，本發明係包含以下各項。
(1)一種通式(Ia)所表示的陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽， 式中，R1及R2係獨立表示氫原子、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6烯基、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6炔基、或可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C3-C7環烷基，或R1及R2與彼等之鍵結的氮原子一起形成3員-10員之雜環，該雜環可具有1或複數個選自取代基群α的取代基，作為該雜環之構成原子，除了R1及R2所鍵結的氮原子之外，可含有1或複數個氮原子、氧原子、或硫原子；R8表示氫原子、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基；或者，R1與R8可表示一起形成-(CH2)q-基；取代基群α係表示由鹵素原子、側氧基、羥基、硫烷基、胺基、氰基、C1-C6烷基、鹵化C1-C6烷基、C1-C6烷 氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基胺基、及C1-C7烷醯基組成之群；L1係表示可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C24烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C24烯基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C3-C24炔基、或可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基；L2係與L1獨立，表示可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C24烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C24烯基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C3-C24炔基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C24烷氧基)甲基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C24烯基)氧基甲基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C3-C24炔基)氧基甲基、或可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷氧基)甲基；取代基群β1係表示由鹵素原子、側氧基、氰基、C1-C6烷基、鹵化C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C7烷醯基、及C1-C7烷醯基氧基、C3-C7烷氧基氧基、(C1-C6烷氧基)羰基、(C1-C6烷氧基)羧基、(C1-C6烷氧基)胺甲醯基、(C1-C6烷基胺基)羧基組成之群；Q係表示下述之式(II)所表示的基；
L1及L2係具有1或複數個選自取代基群β1的取代基，取代基群β1係C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C7烷醯基、或C1-C7烷醯基氧基的情形，L1所具有的選自取代基群β1的取代基與L2所具有的選自取代基群β1的取代基係可彼此鍵結形成環狀構造；k表示1、2、3、4、5、6或7；m表示0或1；p表示0、1或2；q表示1、2、3或4；r表示0、1、2或3；惟，p+r為2以上、或q+r為2以上。
(2)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係獨立為可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基。
(3)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係獨立為C1-C3烷基。
(4)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係皆為甲基。
(5)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係與彼等鍵結的氮原子一起，形成可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之吖丁啶、吡咯啶、哌啶、氮呯、二氫吡咯、二氫吡啶、四氫吡啶、哌、啉、二氫唑、或二氫噻唑。
(6)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係與彼等鍵結的氮原子一起，形成可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之吖丁啶、吡咯啶、哌啶、或啉。
(7)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係與彼等鍵結的氮原子一起，形成吖丁啶、吡咯啶、或啉。
(8)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R8係一起形成-(CH2)q-基；p+q係2、3或4；R2係可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C3烷基。
(9)如(8)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係C1-C3烷基。
(10)如(8)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基。
(11)如選自(1)至(10)中任一項記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L1係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C17-C19烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C17-C19烯基、或可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C4烷基)-(Q)k-(C4-C9烷基)基；k係1、2或3。
(12)如選自(1)至(10)中任一項記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L1係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基 、十七碳三烯基、十八碳三烯基、或十九碳三烯基。
(13)如選自(1)至(10)中任一項記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L1係(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基、順式-9-十八碳烯基(油醯基)、順式-8,11-十七碳二烯基、順式-9,12-十八碳二烯基(亞油醯基)、順式-10,13-十九碳二烯基、或順式-6,9,12-十八碳三烯基(次亞油醯基)。
(14)如選自(1)至(13)中任一項記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L2係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C19烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C19烯基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C4烷基)-(Q)k-(C4-C9烷基)基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C19烷氧基)甲基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C19烯基)氧基甲基、或可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷氧基)甲基；k係1、2或3。
(15)如選自(1)至(13)中任一項記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L2係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之癸基、癸烯基、十一基、十一烯基、十二基、十二烯基、癸二烯基、十一碳二烯基、十二碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、十七碳三烯基、十八碳三烯基、十九碳三烯基、癸氧基甲基、癸烯氧基甲基、十一基氧基甲基、十一烯 基氧基甲基、十二基氧基甲基、十二烯基氧基甲基、癸二烯基氧基甲基、十一碳二烯基氧基甲基、十二碳二烯基氧基甲基、十七碳二烯基氧基甲基、十八碳二烯基氧基甲基、十九碳二烯基氧基甲基、十七碳三烯基氧基甲基、十八碳三烯基氧基甲基、或十九碳三烯基氧基甲基。
(16)如選自(1)至(13)中任一項記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L2係癸基、順式-7-癸烯基、(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基、順式-9-十八碳烯基(油醯基)、順式-8,11-十七碳二烯基、順式-9,12-十八碳二烯基(亞油醯基)、順式-10,13-十九碳二烯基、順式-6,9,12-十八碳三烯基(次亞油醯基)、癸氧基甲基、順式-7-癸烯氧基甲基、(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基氧基甲基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基氧基甲基、順式-9-十八碳烯基氧基甲基(油醯基氧基甲基)、順式-8,11-十七碳二烯基氧基甲基、順式-9,12-十八碳二烯基氧基甲基(亞油醯基氧基甲基)、順式-10,13-十九碳二烯基氧基甲基、或順式-6,9,12-十八碳三烯基氧基甲基(次亞油醯基氧基甲基)。
(17)如選自(1)至(16)中任一項記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中m為0。
(18)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2皆為甲基；R8係氫原子；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基、 可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p+r係2；m係0。
(19)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基；R1及R8一起形成-(CH2)q-基；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基、可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p係2；q係2；r係0；m係0。
(20)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基；R1及R8一起形成-(CH2)q-基；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基、可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p係1；q係2或3；r係1；m係0。
(21)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基；R1及R8一起形成-(CH2)q-基；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基、可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯氧基 取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p係0；q係3或4；r係2；m係0。
(22)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(23)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(24)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(25)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(26)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(27)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(28)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(29)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(30)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(31)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(32)如(1)記載之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
(33)一種脂質粒子，其含有選自(1)至(32)之至少任一項記載之陽離子性脂質。
(34)如(33)記載之脂質粒子，其特徵為含有減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質。
(35)如(34)記載之脂質粒子，其中減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質係PEG-脂質。
(36)如(35)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA)、或1,2-二肉豆蔻醯基-sn-丙三醇甲氧基聚乙二醇。
(37)如(35)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA)。
(38)如(35)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二棕櫚基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DPA)、或1,2-二棕櫚醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇。
(39)如(35)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二棕櫚基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DPA)。
(40)如(35)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DSA)、或1,2-二硬脂醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇。
(41)如(35)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲 氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DSA)。
(42)如選自(35)至(41)中任一項記載之脂質粒子，其中PEG之分子量係1,000至5,000。
(43)如選自(35)至(41)中任一項記載之脂質粒子，其中PEG之分子量係1,800至2,200。
(44)如選自(33)至(43)中任一項記載之脂質粒子，其特徵為含有固醇類。
(45)如(44)記載之脂質粒子，其中固醇類係膽固醇。
(46)如選自(33)至(45)中任一項記載之脂質粒子，其特徵為含有兩性脂質。
(47)如(46)記載之脂質粒子，其中兩性脂質係選自二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二肉荳蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、二油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)、及鞘磷脂(SM)的至少任一者。
(48)如(46)記載之脂質粒子，其中兩性脂質係二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)。
(49)如選自(46)至(48)中任一項記載之脂質粒子，其中兩性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質之脂質組成以莫耳量計，兩性脂質為25%以下、固醇類為15%以上、陽離子性脂質為20%~70%、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質為1%~10%。
(50)如選自(46)至(48)中任一項記載之脂質粒子，其中兩性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質之脂質組成以莫耳量計，兩性脂質為15%以下、固醇類為32%以上、陽離子性脂質為45%~65%、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質為1.5%~3%。
(51)一種核酸脂質粒子，其包含選自如(33)至(50)中任一項記載之脂質粒子及核酸。
(52)如(51)記載之核酸脂質粒子，其中核酸係選自由單股DNA、單股RNA、DNA與RNA混合的單股多核苷酸、雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之雜交多核苷酸及DNA與RNA混合的2種多核苷酸組成之群組的任一者。
(53)如(51)記載之核酸脂質粒子，其中核酸為具有RNA干擾作用的單股或雙股多核苷酸。
(54)如(51)記載之核酸脂質粒子，其中核酸為單股RNA。
(55)如(51)至(54)中任一項記載之核酸脂質粒子，其陽離子性脂質之分子數(N)與來自核酸的磷原子數(P)之比率(N/P)係2.0~9.0。
(56)如(51)至(54)中任一項記載之核酸脂質粒子，其陽離子性脂質之分子數(N)與來自核酸的磷原子數(P)之比率(N/P)係3.0~9.0。
(57)如(51)至(56)中任一項記載之核酸脂質粒子，其平均粒徑為約30nm-約300nm。
(58)如(51)至(56)中任一項記載之核酸脂質粒子，其 平均粒徑為約30nm-約200nm。
(59)如(51)至(56)中任一項記載之核酸脂質粒子，其平均粒徑為約30nm-約100nm。
(60)一種醫藥，其含有選自如(51)至(59)中任一項記載之核酸脂質粒子作為有效成分。
(61)如(60)記載之醫藥，其用於治療或預防來自標的基因表現的疾病。
(62)如(60)記載之醫藥，其中來自標的基因表現的疾病係癌、肝臟疾病、膽囊疾病、纖維症、貧血、或基因疾病。
(63)一種標的基因之表現抑制方法，其係藉由將選自如(51)至(59)中任一項記載之核酸脂質粒子投予哺乳動物。
(64)一種來自標的基因表現的疾病之治療或預防用之方法，其係藉由將選自如(51)至(59)中任一項記載之核酸脂質粒子投予哺乳動物。
(65)如(64)記載之方法，其中來自標的基因表現的疾病係癌。以及
(66)一種通式(I)所表示的陽離子性脂質， 式中，R1及R2係獨立表示氫原子、可具有1或複數個選自取 代基群α的取代基之C1-C6烷基、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6烯基、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6炔基、或可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C3-C7環烷基，或R1及R2與彼等之鍵結的氮原子一起形成3員-10員之雜環，該雜環可具有1或複數個選自取代基群α的取代基，作為該雜環之構成原子，除了R1及R2所鍵結的氮原子之外，可含有1或複數個氮原子、氧原子、或硫原子；R3及R4係獨立表示氫原子、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基，或R3及R4係與彼等鍵結的碳原子一起形成3員-10員之烴環；或者，R1係與R1鍵結的氮原子、R3、及R3鍵結的碳原子一起形成3員-10員之雜環，該雜環可具有1或複數個選自取代基群α的取代基，作為該雜環之構成原子，除了R1所鍵結的氮原子之外，可含有1或複數個氮原子、氧原子、或硫原子；R2及R4係獨立表示氫原子、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6烯基、或可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6炔基；R5及R6係獨立表示氫原子、或C1-C3烷基；R7係表示氫原子、或可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基；取代基群α係表示由鹵素原子、側氧基、羥基、硫烷基、胺基、氰基、C1-C6烷基、鹵化C1-C6烷基、C1-C6烷 氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基胺基、及C1-C7烷醯基組成之群；L1及L2係獨立表示可具有1或複數個選自取代基群β的取代基之C10-C24烷基、可具有1或複數個選自取代基群β的取代基之C10-C24烯基、可具有1或複數個選自取代基群β的取代基之C3-C24炔基、可具有1或複數個選自取代基群β的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基；取代基群β係表示由鹵素原子、側氧基、羥基、硫烷基、胺基、氰基、C1-C6烷基、鹵化C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C7烷醯基、及C1-C7烷醯基氧基、C3-C7烷氧基氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基羧基、C1-C6烷氧基胺甲醯基、C1-C6烷基胺基羧基組成之群；Q係表示下述之式(II)所表示的基；
L1及L2為具有1或複數個選自取代基群β的取代基，取代基群β為硫烷基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C7烷醯基、或C1-C7烷醯基氧基的情形，L1所具有的選自取代基群β的取代基、與L2所具有的選自取代基群β的取代基係可彼此鍵結而形成環狀構造；k表示1至7之整數；m表示0至1之整數；n表示3至6之整數。
依據本發明，可提供形成脂質粒子的新穎陽離子性脂質。
又，依據本發明，藉由兩性脂質、固醇類、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質的組合，可提供形成脂質粒子的新穎陽離子性脂質。
又，依據本發明，可提供含該陽離子性脂質的脂質粒子。
又，依據本發明，可提供於該脂質粒子進一步含有核酸的核酸脂質粒子。
又，依據本發明，可提供含有該核酸脂質粒子作為有效成分的醫藥組成物。
又，依據本發明，可提供使用該醫藥組成物的疾病之治療方法。
第1圖呈示用於式(I)所表示的陽離子性脂質之合成的中間體(A5)之製法之概要的圖。
第2圖呈示用於式(I)所表示的陽離子性脂質之合成的B法之概要的圖。
第3圖呈示式(I)所表示的陽離子性脂質之合成的C法之概要的圖。
第4圖呈示構成核酸脂質粒子的核酸中，具有雙股構造的核酸之構造的圖。圖中，上列為正義鏈、下列為反義鏈。符號中，白正方形(□)表示RNA，黑圓形(●)表示DNA，白圓形(○)表示2’-O-甲基RNA。各符號間之線係 表示核苷間之磷酸二酯鍵。圖中之p係表示-P(=O)(OH)-，有p鍵結的情形，多核苷酸之末端之羥基的氫原子被去除。於多核苷酸之末端無任何鍵結的情形，RNA、DNA、或者2’-O-甲基RNA之3’末端或5’末端為OH基。X係於說明書中，於「3-4-2.修飾雙股多核苷酸」之項目中記載的修飾反義鏈之5’末端的化合物。Linker係於說明書，於「3-4-3.修飾單股多核苷酸」之項目中記載的多核苷酸之連結子。
第5圖於試驗例10中的具有實施例19、45、及54的化合物的核酸脂質粒子於腫瘤中所示的PLK-1表現抑制活性的圖。
第6圖呈示試驗例11中的含有實施例8之化合物的核酸脂質粒子會促進mRNA的表現的圖。圖之上部係呈示經赫斯特(Hoechst)染色的核的影像、下部係呈示mCherry之影像。
[實施發明之形態]
以下，詳細說明本發明之實施之形態。
1.陽離子性脂質
於本說明書所揭示的陽離子性脂質可以其本身單獨來使用，亦可與其他物質組合來使用，例如，可作為構成脂質粒子的成分來使用，亦可作為構成核酸脂質粒子的成分來使用。
1-1.基之定義
於本發明，「陽離子性脂質」係指於生理學的pH等 之選擇的pH，對應其脂質之具有的pKa，一部分的分子為具有實質之正電荷的脂質。本發明之陽離子性脂質係可離子化的脂質(ionizable lipid)，與於任一pH之全部分子皆為具有實質之正電荷的脂質之具有4級胺的陽離子性脂質(例如，N,N-二油醯基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC))並不相同。
R1、R2、R3、R4、R7、R8、取代基群α、及取代基群β之定義中的「C1-C6烷基」係表示碳數1至6個之直鏈、或分枝鏈之烷基。例如，可列舉甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、n-己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基等。C1-C6烷基較適合為C1-C4烷基，更適合為C1-C3烷基。
R1、R2、R3、R5、及R6之定義中的「C1-C3烷基」係表示碳數1至3個之直鏈、或分枝鏈之烷基。例如，可列舉甲基、乙基、丙基、異丙基，較適合為甲基。
R1、R2、及R4之定義中的「C2-C6烯基」係表示碳數2至6個之直鏈、或分枝鏈之烯基。例如，可列舉乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、異丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-4- 戊烯基、5-己烯基。
R1、R2、及R4之定義中的「C2-C6炔基」係表示碳數2至6個之直鏈、或分枝鏈之炔基。例如，可列舉乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-甲基-2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、5-己炔基。
R1及R2中定義的「C3-C7環烷基」係表示碳數3至7個之環烷基。例如，可列舉環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基。
R1、R2、及R3之定義中的「3員-10員之雜環」係表示至少含1個氮原子，進一步可含有1或複數個選自氮原子、硫原子及氧原子組成之群組的原子之飽和或部分不飽和的3至10員之單環、或2環之雜環基。例如，可列舉吖丁啶、吡咯啶、哌啶、氮呯、二氫吡咯、二氫吡啶、四氫吡啶、哌、啉、二氫唑、或二氫噻唑。R1及R2與彼等之鍵結的氮原子一起形成的雜環係適合為吖丁啶、吡咯啶、或啉。R1與R1之鍵結的氮原子、R3、及R3之鍵結的碳原子一起形成的雜環係適合為吖丁啶、吡咯啶、哌啶、或啉。
R3及R4之定義中的「3員-10員之烴環」係表示碳數3至10個之飽和烴環基。例如，可列舉環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基。
取代基群α、及取代基群β之定義中的「鹵素原子」係指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，適合地 為氟原子。
取代基群α、及取代基群β之定義中的「鹵化C1-C6烷基」係表示上述「C1-C6烷基」之1個或2個氫原子經上述「鹵素原子」取代的基。例如，可列舉氟甲基、氯甲基、1-氟乙基、1-氯乙基、2-氟乙基、1,2-二氟丙基。鹵化C1-C6烷基係適合地為鹵化C1-C4烷基，更適合地為鹵化C1-C3烷基。
取代基群α、及取代基群β之定義中的「C1-C6烷氧基」係表示上述「C1-C6烷基」與氧原子鍵結的基。例如，可列舉甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、n-丁氧基、s-丁氧基、tert-丁氧基、n-戊氧基。C1-C6烷氧基係適合地為C1-C4烷氧基，更適合地為C1-C2烷氧基。
取代基群α、及取代基群β之定義中的「C1-C6烷基硫烷基」係表示上述「C1-C6烷基」與硫原子鍵結的基。例如，可列舉甲基硫烷基、乙基硫烷基、n-丙基硫烷基、n-丁基硫烷基、s-丁基硫烷基、tert-丁基硫烷基、n-戊基硫烷基。C1-C6烷基硫烷基係適合地為C1-C4烷基硫烷基，更適合地為C1-C2烷基硫烷基。
取代基群α之定義中的「C1-C6烷基胺基」係表示上述「C1-C6烷基」與氮原子鍵結的基。例如，可列舉甲基胺基、乙基胺基、n-丙基胺基、n-丁基胺基、s-丁基胺基、tert-丁基胺基、n-戊基胺基、n-己基胺基、N,N-二甲基胺基、N,N-二乙基胺基、N,N-二n-丙基胺基、N,N-二異丙基胺基、N,N-二n-丁基胺基、N,N-二異丁基胺基、N,N-二s-丁基胺基、N,N-二tert-丁基胺基。C1-C6 烷基胺基係適合地為C1-C4烷基胺基，更適合地為C1-C2烷基胺基。
取代基群α、及取代基群β之定義中的「C1-C7烷醯基」係表示碳數1至7個之烷醯基。例如，可列舉甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、三甲基乙醯基、戊醯基、異戊醯基、己醯基、庚醯基。
取代基群β之定義中的「C1-C7烷醯基氧基」係表示上述「C1-C7烷醯基」與氧原子鍵結的基。例如，可列舉甲醯氧基、乙醯氧基、丙醯氧基、丁醯氧基、異丁醯氧基、戊醯氧基、三甲基乙醯氧基、戊醯氧基、異戊醯氧基、己醯氧基、庚醯氧基。
取代基群β之定義中的「C3-C7烷氧基氧基」係表示碳數3至7之直鏈、分枝鏈、或環狀烷之1個或2個碳原子經氧原子取代，且進一步與氧原子鍵結的基(惟，過氧化物除外)。例如，可列舉甲氧基甲氧基、乙氧基甲氧基、乙氧基乙氧基、2-四氫呋喃基氧基、2-四氫哌喃基氧基。
取代基群β之定義中的「(C1-C6烷氧基)羰基」係表示上述「C1-C6烷氧基」與羰基鍵結的基。例如，可列舉甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、異丙氧基羰基、丁氧基羰基、異丁氧基羰基、sec-丁氧基羰基、tert-丁氧基羰基、戊氧基羰基、己氧基羰基等。
取代基群β之定義中的「(C1-C6烷氧基)羧基」係表示上述「C1-C6烷氧基」與羧基鍵結的基。例如，可列舉甲氧基羧基、乙氧基羧基、丙氧基羧基、異丙氧 基羧基、丁氧基羧基、異丁氧基羧基、sec-丁氧基羧基、tert-丁氧基羧基、戊氧基羧基、己氧基羧基等。
取代基群β之定義中的「(C1-C6烷氧基)胺甲醯基」係表示上述「C1-C6烷氧基」與胺甲醯基鍵結的基。例如，可列舉甲氧基胺甲醯基、乙氧基胺甲醯基、丙氧基胺甲醯基、異丙氧基胺甲醯基、丁氧基胺甲醯基、異丁氧基胺甲醯基、sec-丁氧基胺甲醯基、tert-丁氧基胺甲醯基、戊氧基胺甲醯基、己氧基胺甲醯基等。
取代基群β之定義中的「(C1-C6烷基胺基)羧基」係表示上述「C1-C6烷基胺基」與羧基鍵結的基。例如，可列舉甲基胺基羧基、乙基胺基羧基、n-丙基胺基羧基、n-丁基胺基羧基、s-丁基胺基羧基、tert-丁基胺基羧基、n-戊基胺基羧基、n-己基胺基羧基、N,N-二甲基胺基羧基、N,N-二乙基胺基羧基、N,N-二n-丙基胺基羧基、N,N-二異丙基胺基羧基、N,N-二n-丁基胺基羧基、N,N-二異丁基胺基羧基、N,N-二s-丁基胺基羧基、N,N-二tert-丁基胺基羧基等。
L1、及L2之定義中的「C10-C24烷基」係表示碳數10至24個之直鏈烷基。例如，可列舉癸基、十一碳基、十二碳基、十三碳基、十四碳基、十五碳基、十六碳基、十七碳基、十八碳基、十九碳基、二十碳基、二十一碳基、二十二碳基、二十三碳基、二十四碳基。L1中的「C10-C24烷基」適合地為十七碳基、十八碳基、十九碳基。L2中的「C10-C24烷基」係適合地為癸基、十一碳基、十二碳基。
L1、及L2之定義中的「C10-C24烯基」係表示碳數10至24個之直鏈烯基。本案中的「C10-C24烯基」係亦包含C10-C24烷二烯基、C10-C24烷三烯基、及C10-C24烷四烯基之任一者。例如，可列舉癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、癸二烯基、十一碳二烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、二十三碳二烯基、二十四碳二烯基、癸三烯基、十一碳三烯基、十二碳三烯基、十三碳三烯基、十四碳三烯基、十五碳三烯基、十六碳三烯基、十七碳三烯基、十八碳三烯基、十九碳三烯基、二十碳三烯基、二十一碳三烯基、二十二碳三烯基、二十三碳三烯基、或二十四碳三烯基。L1中的「C10-C24烯基」係適合地為十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、十七碳三烯基、十八碳三烯基、或十九碳三烯基。L1係適合地為(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基、順式-9-十八碳烯基(油醯基)、順式-8,11-十七碳二烯基、順式-9,12-十八碳二烯基(亞油醯基)、順式-10,13-十九碳二烯基、或順式-6,9,12-十八碳三烯基(次亞油醯基)。L2中的「C10-C24烯基」係適合 地為癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、癸二烯基、十一碳二烯基、十二碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、十七碳三烯基、十八碳三烯基、或十九碳三烯基。L2係適合地為順式-7-癸烯基、(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基、順式-9-十八碳烯基(油醯基)、順式-8,11-十七碳二烯基、順式-9,12-十八碳二烯基(亞油醯基)、順式-10,13-十九碳二烯基、或順式-6,9,12-十八碳三烯基(次亞油醯基)。
L1、及L2之定義中的「C3-C24炔基」係表示碳數3至24個之直鏈炔基。本案中的「C3-C24炔基」係亦包含C3-C24烷二炔基、C3-C24烷三炔基、及C3-C24烷四炔基之任一者。例如，丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一碳炔基、十二碳炔基、十三碳炔基、十四碳炔基、十五碳炔基、十六碳炔基、十七碳炔基、十八碳炔基、十九碳炔基、二十碳炔基、二十一碳炔基、二十二碳炔基、二十三碳炔基、或二十四碳炔基，適合地為癸炔基。
L1、及L2之定義中的「(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基」係例如，以下之構造式所示的基。
L2之定義中的「(C10-C24烷氧基)甲基」係表示前述「C10-C24烷基」與氧原子鍵結，且該氧原子鍵結甲基。例如，可列舉癸氧基甲基、十一碳基氧基甲基、十二碳基氧基甲基、十三碳基氧基甲基、十四碳基氧基甲基、十五碳基氧基甲基、十六碳基氧基甲基、十七碳 基氧基甲基、十八碳基氧基甲基、十九碳基氧基甲基、二十碳基氧基甲基、二十一碳基氧基甲基、二十二碳基氧基甲基、二十三碳基氧基甲基、二十四碳基氧基甲基。適合地為癸氧基甲基、十一碳基氧基甲基、十二碳基氧基甲基。
L2之定義中的「(C10-C24烯基)氧基甲基」係表示前述「C10-C24烯基」與氧原子鍵結，且該氧原子鍵結甲基。本案中的「(C10-C24烯基)氧基甲基」亦包含(C10-C24烷二烯基)氧基甲基、(C10-C24烷三烯基)氧基甲基、及(C10-C24烷四烯基)氧基甲基之任一者。例如，可列舉癸烯氧基甲基、十一碳烯基氧基甲基、十二碳烯基氧基甲基、十三碳烯基氧基甲基、十四碳烯基氧基甲基、十五碳烯基氧基甲基、十六碳烯基氧基甲基、十七碳烯基氧基甲基、十八碳烯基氧基甲基、十九碳烯基氧基甲基、二十碳烯基氧基甲基、二十一碳烯基氧基甲基、二十二碳烯基氧基甲基、二十三碳烯基氧基甲基、二十四碳烯基氧基甲基、癸二烯基氧基甲基、十一碳二烯基氧基甲基、十二碳二烯基氧基甲基、十三碳二烯基氧基甲基、十四碳二烯基氧基甲基、十五碳二烯基氧基甲基、十六碳二烯基氧基甲基、十七碳二烯基氧基甲基、十八碳二烯基氧基甲基、十九碳二烯基氧基甲基、二十碳二烯基氧基甲基、二十一碳二烯基氧基甲基、二十二碳二烯基氧基甲基、二十三碳二烯基氧基甲基、二十四碳二烯基氧基甲基、癸三烯基氧基甲基、十一碳三烯基氧基甲基、十二碳三烯基氧基甲基、十三碳三烯基氧基甲 基、十四碳三烯基氧基甲基、十五碳三烯基氧基甲基、十六碳三烯基氧基甲基、十七碳三烯基氧基甲基、十八碳三烯基氧基甲基、十九碳三烯基氧基甲基、二十碳三烯基氧基甲基、二十一碳三烯基氧基甲基、二十二碳三烯基氧基甲基、二十三碳三烯基氧基甲基、或二十四碳三烯基氧基甲基。適合地為癸烯氧基甲基、十一碳烯基氧基甲基、十二碳烯基氧基甲基、十七碳烯基氧基甲基、十八碳烯基氧基甲基、癸二烯基氧基甲基、十一碳二烯基氧基甲基、十二碳二烯基氧基甲基、十七碳二烯基氧基甲基、十八碳二烯基氧基甲基、十九碳二烯基氧基甲基、十七碳三烯基氧基甲基、十八碳三烯基氧基甲基、或十九碳三烯基氧基甲基，更適合地為順式-7-癸烯氧基甲基、(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基氧基甲基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基氧基甲基、順式-9-十八碳烯基氧基甲基(油醯基氧基甲基)、順式-8,11-十七碳二烯基氧基甲基、順式-9,12-十八碳二烯基氧基甲基(亞油醯基氧基甲基)、順式-10,13-十九碳二烯基氧基甲基、或順式-6,9,12-十八碳三烯基氧基甲基(次亞油醯基氧基甲基)。
L2之定義中的「(C3-C24炔基)氧基甲基」係表示前述「C3-C24炔基」與氧原子鍵結，且該氧原子鍵結甲基。本案中的「(C3-C24炔基)氧基甲基」亦包含(C3-C24烷二炔基)氧基甲基、(C3-C24烷三炔基)氧基甲基、及(C3-C24烷四炔基)氧基甲基之任一者。例如，可列舉丙炔基氧基甲基、丁炔基氧基甲基、戊炔基氧基甲基、己炔 基氧基甲基、庚炔基氧基甲基、辛炔基氧基甲基、壬炔基氧基甲基、癸炔基氧基甲基、十一碳炔基氧基甲基、十二碳炔基氧基甲基、十三碳炔基氧基甲基、十四碳炔基氧基甲基、十五碳炔基氧基甲基、十六碳炔基氧基甲基、十七碳炔基氧基甲基、十八碳炔基氧基甲基、十九碳炔基氧基甲基、二十碳炔基氧基甲基、二十一碳炔基氧基甲基、二十二碳炔基氧基甲基、二十三碳炔基氧基甲基、或二十四碳炔基氧基甲基，適宜為癸炔基氧基甲基。
L2之定義中的「(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)氧基甲基」係指前述「(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基」與氧原子鍵結，且該氧原子鍵結甲基。
L1及L2具有1或複數個選自取代基群β的取代基，L1所具有的選自取代基群β的取代基與L2所具有的選自取代基群β的取代基彼此鍵結而形成環狀構造的情形中的取代基群β係適合地為C2-C6烷醯基氧基，更適合地為丙醯基氧基。更具體而言，L1所具有的選自取代基群β的取代基與L2所具有的選自取代基群β的取代基係彼此鍵結而形成-OCOCH2CH2COO-基。
本案中的取代基群β係適合地為由鹵素原子、側氧基、氰基、C1-C6烷基、鹵化C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C7烷醯基、及C1-C7烷醯基氧基、C3-C7烷氧基氧基、(C1-C6烷氧基)羰基、(C1-C6烷氧基)羧基、(C1-C6烷氧基)胺甲醯基、(C1-C6烷基胺基)羧基組成的群組(取代基群β1)，更適合地為C2-C5烷醯基 氧基，又更適合地為乙醯氧基或丙醯基氧基，特別適合地為乙醯氧基。
本發明之陽離子性脂質係可藉由通常方法作成「藥理上可容許的鹽」，就如此的鹽而言，適合地為鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之類的鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽之類的鹼土類金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；銨鹽之類的無機鹽；t-辛基胺鹽、二苄基胺鹽、啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡萄糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽之類的有機鹽等之胺鹽；氟化氫酸鹽、鹽酸鹽、溴化氫酸鹽、碘化氫酸鹽之類的鹵素原子化氫酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽之類的低級烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽之類的芳基磺酸鹽；乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等之有機酸鹽；及甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之類的胺基酸鹽。
本發明之陽離子性脂質亦可呈水合物或溶媒合物而存在，本發明亦包含彼等之水合物或溶媒合物。
本發明之陽離子性脂質中有立體異構物、幾何異構物、阻轉異構物存在的情形，只要未特別明示， 本發明亦包含彼等之異構物及任意之異構物之任意比率的混合物。
1-2.陽離子性脂質之具體例
就本發明之陽離子性脂質之具體例而言，例如，可列舉以下之表1記載的化合物1-1至1-481、表2記載之化合物2-1至2-570。表1及表2中的「C17-1」係表示順式-8-十七碳烯基，「C18-1」係表示順式-9-十八碳烯基(油醯基)，「C17-2」係表示順式,順式-8,11-十七碳二烯基，「Lin」係表示順式,順式-9,12-十八碳二烯基(亞油醯基)，「C19-2」係表示順式,順式-10,13-十九碳二烯基，「C17-31」係表示順式,順式,順式-5,8,11-十七碳三烯基，「C17-32」係表示順式,順式,順式-8,11,14-十七碳三烯基，「C17-33」係表示7-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]庚基，「C17-A」係表示(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基，「C17-H」係表示(R)-11-己烯基氧基-順式-8-十七碳烯基，「C17-OH」係表示(R)-11-羥基-順式-8-十七碳烯基，「C17-T」係表示(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基，「C17-T2」係表示(R)-11-(四氫-2H-呋喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基，「Me」係表示甲基，「Et」係表示乙基，「Pr」係表示丙基，「C10」係表示癸基，「C11」係表示十一碳基，「C12」係表示十二碳基，「C13」係表示十三碳基，「C14」係表示十四碳基，「C15」係表示十五碳基，「C16」係表示十六碳基，「C17」係表示十七碳基，「C18」係表示十八碳基，「C19」係表示十九碳基，「C20」係 表示二十碳基，「C21」係表示二十一碳基，「C22」係表示二十二碳基，「C23」係表示二十三碳基，「C24」係表示二十四碳基，「C10-1」係表示順式-7-癸烯基，「C10-2」係表示7-癸炔基，「C17-O-Su-O-C17」係表示(R)-11-羥基-順式-8-十七碳烯基彼此藉由琥珀酸交聯的基，「-」表示單鍵。
1-3.陽離子性脂質之製造方法
本發明之陽離子性脂質係可藉由採用各種周知之合成法，而加以製造。就周知之合成法而言，有「Comprehensive Organic Transformations(第2版)」、Wiley-VCH、1999年；「Comprehensive Organic Synthesis」、Pergamon、1991年等記載者等。依據使用的官能基的種類，於原料或中間體之階段，進行適切的保護基所致的保護，或者於該官能基置換為可容易變換的官能基而進行反應者係有製造上有效果的情形。就此等之官能基而言，有羥基、羧基、胺基、多重鍵結等，彼等之官能基之保護及脫保護、或對彼等之官能基的誘導化，可藉由周知之方法來進行。就周知之方法而言，有「Protective Groups in Organic Synthesis(第4版)」、Wiley-Interscience、2006年等。
第1圖~第3圖中呈示概要，以下呈示本發明 之陽離子性脂質(I)之製造方法。惟，製造方法並未限於下述之方法。
式中，G1、G2、G3、G4及G5係獨立表示氫原子、選自取代基群β的取代基、或可成為用以誘導為取代基群β之合成化學上可容許的保護體或前驅體的取代基。
p1、p2係獨立表示0至21之整數。
G6、G7、G10、G11、及G12係獨立表示可具有1或複數個選自取代基群β的取代基的C10-C24烷基、可具有1或複數個選自取代基群β的取代基的C10-C24烯基、可具有1或複數個選自取代基群β的取代基的C3-C24炔基、可具有1或複數個選自取代基群β的取代基的(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基、或可成為用以誘導為彼等之取代基之合成化學上可容許的保護體或前驅體的取代基。
G8係表示以下構造式所示的取代基、或可成為用以誘導為彼等之取代基之合成化學上可容許的保護體或前驅體的取代基。
G9係只要一般作為羧基之保護基來使用者即可，並未特別限定，例如，可列舉甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、苄基、p-硝基苄基、o-硝基苄基、p-甲氧基苄基等。
1-3-1.A法
A法之概要示於第1圖。
1-3-1-1.A-1步驟
A-1步驟係由具有羥基的末端炔化合物(A1)及具有脫離性取代基的烷基化合物(A2)來製造具有羥基的內部炔化合物(A3)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系、鹵化碳系等之溶媒，較佳為醯胺系及亞碸系等之非質子性極性溶媒，更佳為N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。
就使用的試藥而言，有過渡金屬化合物等，較佳為銅化合物，更佳為碘化銅(I)。
就使用的添加劑而言，有無機鹽類、無機鹼類、鹼金屬烷氧化物類、鹼土類金屬烷氧化物類、有機鹼類等中，複數使用者，較佳為無機鹽類與無機鹼類，更佳為碘化鈉與碳酸鉀。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為0℃-100℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方 法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-1-2.A-2步驟
A-2步驟係由具有羥基的內部炔化合物(A3)來製造具有甲醯基的內部炔化合物(A4)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有亞碸系等之溶媒，較佳為二甲基亞碸(DMSO)。
就使用的試藥而言，例如，有三氧化硫-吡啶錯合物、氯化草酸等。
就使用的添加劑而言，有無機鹼類、有機鹼類，較佳為有機鹼類，更佳為三乙基胺。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為0℃-100℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-1-3.A-3步驟
A-3步驟係由具有甲醯基的內部炔化合物(A4)製造具有羧基的內部炔化合物(A5)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度 溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有醇系、胺系、水系等之溶媒，較佳為醇系溶媒，更佳為tert-丁基醇。
就使用的試藥而言，例如，有無機氧化劑：亞氯酸鈉等。
就使用的添加劑而言，有無機鹽類、無機鹼類、鹼金屬烷氧化物類、鹼土類金屬烷氧化物類，較佳為磷酸鹽類，更佳為磷酸二氫鈉類。
就進一步使用的添加劑而言，例如，有2-甲基-2-丁烯。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為0℃-100℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-2.B法
B法之概要示於第2圖。
1-3-2-1.B-1步驟
B-1步驟係由羧酸類(B1)來製造N-甲氧基羧酸醯胺類(B2)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系、鹵化碳系等之溶媒，較佳為鹵化碳系溶媒，更佳為二氯甲烷。
就使用的副原料而言，例如，N,O-二甲基乙醇胺鹽酸鹽等。
就使用的試藥而言，脫水縮合劑：碳化二亞胺類等，較佳為1-乙基-3-(3’-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。
就使用的添加劑而言，無機鹼類、鹼金屬烷氧化物類、鹼土類金屬烷氧化物類、有機鹼類，較佳為有機鹼類，更佳為三乙基胺。就進一步使用的添加劑而言，為脫水縮合活性化劑：N-羥基雜環狀化合物類，較佳為1-羥基苯并咪唑水合物。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為-78℃-100℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-2-2.B-2步驟
B-2步驟係由N-甲氧基羧酸醯胺類(B2)製造酮類(B3)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系等之溶媒，較佳為二乙基醚、四氫呋喃等之醚系溶媒。
就使用的試藥而言，有格任亞(Grignard)試藥、烷基鋰試藥、烷基鋅試藥等，較佳為格任亞試藥、烷基鋰試藥。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為-78℃-100℃，較佳為-30℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-2-3.B-3步驟
B-3步驟係自酮類(B3)製造醇類(B4)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系、醇系、胺系、水系等之溶媒，較佳為醇系、水系等之質子性溶媒，更佳為甲醇或 乙醇之水溶液。
就使用的試藥而言，有一般作為還原劑使用的硼試藥、鋁試藥等，較佳為氫化硼鈉。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為0℃-100℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-2-4.B-4步驟
B-4步驟係自分子內具有三鍵的醇類(B4)製造分子內具有雙鍵的醇類(B4’)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、醇系、胺系、水系等之溶媒，較佳為醇系、水系等之質子性溶媒，更佳為甲醇或乙醇。
就使用的副原料而言，例如，作為氫氣或氫供予體之還原劑等，較佳為氫、氫化硼鈉等，此等單獨或複數組合來使用。
就使用的觸媒而言，過渡金屬化合物類等，較佳為 負載鈀金屬類、鎳化合物類、鈷化合物類，更佳為聚乙亞胺負載鈀、乙酸鎳(II)四水合物。
使用鎳化合物類、鈷化合物類等作為觸媒的情形，就使用的添加劑而言，為有機鹼類，較佳為乙二胺。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為-78℃-80℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-2-5.B-5步驟
B-5步驟係自醇類(B4)製造碳酸酯類(B5)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系、鹵化碳系、胺系等之溶媒，較佳為芳香族系、鹵化碳系等之低極性溶媒，更佳為甲苯、二氯甲烷。
就使用的副原料而言，例如，為醇類及p-硝基苯基取代碳酸酯等之活性碳酸酯類等。
就使用醇作為副原料的情形所使用的試藥而言，為光氣等價體等，較佳為二光氣、三光氣。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為-78℃-100℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-2-6.B-6步驟
B-6步驟係自分子內具有三鍵的碳酸酯類(B5)製造分子內具有雙鍵的碳酸酯類(B5’)的步驟。
本步驟可以與B-4步驟同樣之方法進行。
1-3-2-7.B-7步驟
B-7步驟係自醇類(B6)製造醛類(B7)的步驟。
雖可使用各種一般的氧化反應，但使用亞碸作為氧化劑的情形，就使用的溶媒而言，較佳為二甲基亞碸。
就使用的試藥而言，氯化草醯、三氟乙酸、二環己基碳化二亞胺、三氧化硫吡啶錯合物等。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為-78℃-80℃，較佳為0℃-60℃。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後， 添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-2-8.B-8步驟
B-8步驟係自醛類(B7)製造醇類(B4)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系等之溶媒，較佳為二乙基醚、四氫呋喃等之醚系溶媒。
就使用的試藥而言，有格任亞試藥、烷基鋰試藥、烷基鋅試藥等，較佳為格任亞試藥、烷基鋰試藥。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為-78℃-100℃，較佳為-30℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-3.C法
C法之概要示於第3圖。
1-3-3-1.C-1步驟
C-1步驟係自無取代丙二酸酯類(C1)製造一取代丙二酸酯類(C2)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系、醇系等之溶媒，較佳為甲苯、二甲苯等之芳香族系溶媒。
就使用的副原料而言，例如，烷基鹵化物類、烷基磺酸酯類等。
就使用的試藥而言，無機鹼類、鹼金屬烷氧化物類、鹼土類金屬烷氧化物類、有機鹼類等，較佳為氫化鈉、甲醇鈉。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為0℃-200℃，較佳為50℃-150℃。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-3-2.C-2步驟
C-2步驟係自一取代丙二酸酯類(C2)製造酯類(C3)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系、水系等之溶媒，較佳為醯胺系及亞碸系等之非質子性極性溶媒，更佳為二甲基亞碸(DMSO)。
就使用的試藥而言，有無機鹽類、無機鹼類等，較佳為氯化鋰、氰酸鈉。
就使用的添加劑而言，有水等。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為80℃-200℃，較佳為120℃-180℃。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-3-3.C-3步驟
C-3步驟係自酯類(C3)製造酮酸酯類(C4)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系等之溶媒，較佳為芳香族系溶媒，更佳為二甲苯類。
就使用的副原料而言，例如，與原料相同的醇縮合 的構造之各種有機酸酯等。
就使用的試藥而言，有無機鹼類、鹼金屬烷氧化物類、鹼土類金屬烷氧化物類、有機鹼類等，較佳為氫化鈉。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為50℃-200℃，較佳為120℃-180℃。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-3-4.C-4步驟
C-4步驟係自酮酸酯類(C4)製造酮類(相當於C5：B3的化合物)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有醚系、酯系、醯胺系、腈系、亞碸系、醇系、水系等之溶媒，較佳為醇系、水系等之質子性溶媒，更佳為甲醇或乙醇之水溶液。
就使用的試藥而言，有無機鹼類、鹼金屬烷氧化物類、鹼土類金屬烷氧化物類等，較佳為氫氧化鈉、氫氧化鋰。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，通常為0℃-120℃，較佳為50℃-100℃。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-3-5.C-5步驟
C-5步驟係自一取代丙二酸酯類(C2)製造二取代丙二酸酯類(C6)的步驟。
本步驟係以相同於C-1步驟的方法來進行。
1-3-3-6.C-6步驟
C-6步驟係自二取代丙二酸酯類(C6)製造酯類(C7)的步驟。
本步驟係可以與C-2步驟相同的方法進行。
1-3-3-7.C-7步驟
C-7步驟係自酯類(C7)製造2-取代醇類(C8)的步驟。
就使用的溶媒而言，只要不妨礙反應，且可某程度溶解起始物質的溶媒即可，並未特別限定，有芳香族系、醚系等之溶媒，較佳為四氫呋喃。
就使用的試藥而言，有一般的還原劑：氫化鋰鋁等。
反應溫度係依起始物質、溶媒、試藥等之種類而異，但通常為-78℃-80℃，較佳為0℃-室溫。
反應結束後，本反應之目的化合物係依據通常方法，可自反應混合物採取。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存有不需要的物質的情形，藉由過濾去除後，添加與水及己烷或乙酸乙酯等之類不會混和的有機溶媒，水洗後，將含目的化合物的有機層分離，以無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸氫鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而可獲得。獲得的目的化合物係因應必要，藉由通常方法，例如，再結晶、再沉澱或層析而進一步被純化。
1-3-3-8.C-8步驟
C-8步驟係自2-取代醇類(C8)製造碳酸酯類(C9)的步驟。
本步驟係可以與B-5步驟相同的方法來進行。
2.脂質粒子
本說明書中的脂質粒子係具有選自脂質體、脂質所凝集的脂質凝集體、及膠束(micelle)任一者之構造的組成物所包含，但只要含有脂質的組成物即可，脂質粒子之構造並未限於此等。脂質體係具有脂質雙層構造，且於內部具有水相。脂質體係有脂質之二分子膜重疊為多數層狀的多重層脂質體、膜為1片的單層脂質體，本發明之脂質體包含兩者之脂質體。
本發明之「脂質粒子」係含於選自以下之(a)至(c)的任一者之組成物。
(a)包含陽離子性脂質、及減少脂質粒子形成之際的 凝集的脂質的組成物、(b)包含陽離子性脂質、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質、及固醇類的組成物、(c)包含陽離子性脂質、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質、固醇類、及兩性脂質的組成物。
其中，陽離子性脂質係上述「1.陽離子性脂質」之項目所記載的各種陽離子性脂質之1或2種以上。就具體例而言，可列舉表1或表2記載之1或2種以上之化合物。
就兩性脂質而言，可列舉下述之「2-1.兩性脂質」之項目記載之1或2種以上。
就固醇類而言，可列舉下述之「2-2.固醇類」之項目記載之1或2種以上。
就減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質而言，可列舉下述之「2-3.減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質」之項目記載之1或2種以上。
2-1.兩性脂質
於本說明書，「兩性脂質」係指對極性、非極性之溶媒同時具有親和性的脂質。
就兩性脂質之例而言，可列舉「Liposomes：from physics to applications」之Chapter 1. Chemistry of lipids and liposomes(出版社：Elsevier，出版年：1993年，著者：D.D.Lasic)等記載之脂質。例如，包含磷脂質、糖脂質、胺基脂質、神經鞘脂(sphingolipid)、二醇類、飽和或不飽和之脂肪酸，但未限定於此等。具體例記載於2-1-1至2-1-3。
2-1-1.磷脂質
磷脂質係大致分成甘油磷脂(glycerophospholipid)與神經鞘磷脂(sphingophospholipid)。甘油磷脂之代表性者可列舉磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯基絲胺酸(PS)、磷脂醯基肌醇(PI)、磷脂醯基丙三醇(PG)、磷脂醯基乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA，phosphatidic acid)。另一方面，神經鞘磷脂之代表性者可列舉鞘磷脂(SM)。例如，可列舉以下之(a)至(g)記載之脂質。
(a)磷脂醯膽鹼類
就磷脂醯膽鹼類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉荳蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二癸醯基磷脂醯膽鹼(DDPC)、二辛醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二己醯基磷脂醯膽鹼(DHPC)、二丁醯基磷脂醯膽鹼(DBPC)、二反油醯基磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼、二花生四烯醯基磷脂醯膽鹼、二二十碳烯醯基磷脂醯膽鹼(DEPC)、二庚醯基磷脂醯膽鹼、二己醯基磷脂醯膽鹼、二(十七碳醯基)磷脂醯膽鹼、二山萮醯基磷脂醯膽鹼、桐醯基(eleostearoyl)磷脂醯膽鹼、氫化卵磷脂醯膽鹼(HEPC)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、1-棕櫚醯基-2-花生四烯醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、1-棕櫚醯基-2-亞油醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、1,2-二肉豆蔻 醯基醯胺-1,2-去氧磷脂醯膽鹼、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、1-肉豆蔻醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二-0-十六碳基磷脂醯膽鹼、反式二反油醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基-磷脂醯膽鹼、n-十八碳基-2-甲基磷脂醯膽鹼、n-十八碳基磷脂醯膽鹼、1-月桂基丙二醇-3-磷膽鹼、赤-N-二十四碳醯基神經鞘磷脂醯膽鹼及棕櫚醯基-(9-順式-十八碳醯基)-3-sn-磷脂醯膽鹼等，較佳可列舉DSPC、DPPC及DMPC。
(b)磷脂醯基絲胺酸類
就磷脂醯基絲胺酸類之具體例而言，可列舉二硬脂醯基磷脂醯基絲胺酸(DSPS)、二肉豆蔻醯基磷脂醯基絲胺酸(DMPS)、二月桂醯基磷脂醯基絲胺酸(DLPS)、二棕櫚醯基磷脂醯基絲胺酸(DPPS)、二油醯基磷脂醯基絲胺酸(DOPS)、溶磷脂醯基絲胺酸、桐醯基磷脂醯基絲胺酸、1,2-二-(9-順式-十八碳醯基)-3-sn-磷脂醯基絲胺酸等。
(c)磷脂醯基肌醇類
就磷脂醯基肌醇類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯基肌醇(DPPI)、二硬脂醯基磷脂醯基肌醇(DSPI)、二月桂醯基磷脂醯基肌醇(DLPI)等。
(d)磷脂醯基丙三醇類
就磷脂醯基丙三醇類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯基丙三醇(DPPG)、二硬脂醯基磷脂醯基丙三醇(DSPG)、二油醯基磷脂醯基丙三醇(DOPG)、二月桂醯基磷脂醯基丙三醇(DLPG)、二肉豆蔻醯基磷脂醯基丙三醇(DMPG)、溶磷脂醯基丙三醇、氫化大豆磷脂醯基丙三 醇(HSPG)、氫化卵磷脂醯基丙三醇(HEPG)、心磷脂(cardiolipin)(二磷脂醯基丙三醇)等。
(e)磷脂醯基乙醇胺類
就磷脂醯基乙醇胺類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇胺(DPPE)、二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(DSPE)、二油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)、二月桂醯基磷脂醯基乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯基乙醇胺(DMPE)、二癸醯基磷脂醯基乙醇胺(DDPE)、N-戊二醯基磷脂醯基乙醇胺(NGPE)、溶磷脂醯基乙醇胺、N-(7-硝基-2,1,3-苄醯氧基二唑-4-基)-1,2-二油醯基-sn-磷脂醯基乙醇胺、桐醯基磷脂醯基乙醇胺、N-琥珀醯基二油醯基磷脂醯基乙醇胺、1-十六碳基-2-棕櫚醯基甘油磷脂醯基乙醇胺等，較佳可列舉DOPE。
(f)磷脂酸類
就磷脂酸類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂酸(DPPA)、二硬脂醯基磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻醯基磷脂酸(DMPA)、二油醯基磷脂酸(DOPA)等。
(g)神經鞘磷脂
就神經鞘磷脂之具體例而言，可列舉鞘磷脂(SM)、二棕櫚醯基鞘磷脂、二硬脂醯基鞘磷脂、神經醯胺胺乙基膦酸(ceramide ciliatine)、神經醯胺磷醯基乙醇胺、神經醯胺磷醯基丙三醇等，較佳可列舉SM。
2-1-2.糖脂質
糖脂質可大致分成甘油糖脂質及神經鞘糖脂質。例如，可列舉以下之(a)或(b)記載之脂質。
(a)甘油糖脂質
就甘油糖脂質之具體例而言，可列舉二糖基二甘油酯、糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、亞硫酸核糖基(sulfoxyribosyl)二甘油酯、(1,3)-D-甘露糖基(1,3)二甘油酯、二半乳糖基甘油酯、二半乳糖基二月桂醯基甘油酯、二半乳糖基二肉豆蔻醯基甘油酯、二半乳糖基二棕櫚醯基甘油酯、二半乳糖基二硬脂醯基甘油酯、半乳糖基甘油酯、半乳糖基二月桂醯基甘油酯、半乳糖基二肉豆蔻醯基甘油酯、半乳糖基二棕櫚醯基甘油酯、半乳糖基二硬脂醯基甘油酯、二半乳糖基二醯基丙三醇等。
(b)神經鞘糖脂質
就神經鞘糖脂質之具體例而言，可列舉神經醯胺(腦苷脂(cerebroside))、半乳糖基神經醯胺、乳糖基神經醯胺、二半乳糖基神經醯胺、神經節苷脂(ganglioside)GM1、神經節苷脂GM2、神經節苷脂GM3、硫脂(sulfatide)、神經醯胺寡己糖苷及紅細胞糖苷脂(globoside)等。
2-1-3.飽和或不飽和脂肪酸
就飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸之具體例而言，可使用辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、二十酸、十二碳烯酸、十四碳烯酸、油酸、亞油酸(linoleic acid)、次亞麻油酸(linolenic acid)、二十碳烯酸、芥子酸(erucic acid)及二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid)等之碳 數5~30之飽和或不飽和之脂肪酸。
2-2.固醇類
就固醇類之具體例而言，可列舉膽固醇、膽固醇琥珀酸、二氫膽固醇、羊毛固醇(lanosterol)、二氫羊毛固醇、鏈甾醇(desmosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、植物固醇(sitosterol)、油菜籽固醇(campesterol)、蕓苔甾醇(brassicasterol)、酵母甾醇(zymosterol)、麥角固醇(ergosterol)、油菜籽固醇(campesterol)、海藻固醇(fucosterol)、22-酮甾醇(ketosterol)、20-羥基固醇、7-羥基膽固醇、19-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、7-去氫膽固醇、5α-膽固醇-7-烯-3β-醇、表膽固醇(epicholesterol)、去氫麥角固醇、硫酸膽固醇、半琥珀酸膽固醇、酞酸膽固醇、磷酸膽固醇、戊酸膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯、3βN-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基膽固醇、膽固醇乙酸酯、膽固醇基油酸酯、膽固醇基亞油酸酯、膽固醇基肉豆蔻酸酯、膽固醇基棕櫚酸酯、膽固醇基花生酸酯、糞甾烷醇(coprostanol)、膽固醇酯、膽固醇基磷酸膽鹼、及3,6,9-三氧辛烷-1-醇-膽固醇基-3e-醇，較佳為膽固醇及膽固醇半琥珀酸酯，更佳為可列舉膽固醇。
2-3.減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質
作為減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質，可使用非離子性水溶性高分子鍵結的脂質。
非離子性水溶性高分子係指於水或緩衝液等之水性媒體中去除末端而不具有解離基的高分子或將該 高分子之末端加以烷氧基化的高分子。就如此非離子性水溶性高分子之例而言，可列舉：(1)將乙烯基醇、甲基乙烯基醚、乙烯基吡咯啶酮、乙烯基唑啶酮、乙烯基甲基唑啶酮、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶、N-乙烯基琥珀醯亞胺、N-乙烯基甲醯胺、N-乙烯基-N-甲基甲醯胺、N-乙烯基乙醯胺、N-乙烯基-N-甲基乙醯胺、甲基丙烯酸2-羥基乙酯、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、N,N-二甲基丙烯醯胺、N-異丙基丙烯醯胺、二丙酮丙烯醯胺、羥甲基丙烯醯胺、丙烯醯基啉、丙烯醯基吡咯啶、丙烯醯基哌啶、苯乙烯、氯甲基苯乙烯、溴甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸n-丙酯、氰基丙烯酸異丙酯、氰基丙烯酸n-丁酯、氰基丙烯酸異丁酯、氰基丙烯酸tert-丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油基酯、乙基乙烯基醚、n-丙基乙烯基醚、異丙基乙烯基醚、n-丁基乙烯基醚、異丁基乙烯基醚、tert-丁基乙烯基醚等之單體單元作為構成成分的非離子性之乙烯基系高分子或該高分子之末端經烷氧基化的高分子；(2)將選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、羥丁胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸之類的胺基酸的任一者之單體單元作為構成成分的非離子性多胺基酸或該高分子之末端經烷氧基化的高分子；(3)將選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白 胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、羥丁胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸之類的胺基酸的2種以上之單體單元作為構成成分的非離子性合成多胜肽或該高分子之末端經烷氧基化的高分子；(4)將選自乙醇酸及乳酸的單體單元作為構成成分的非離子性聚酯或該高分子之末端經烷氧基化的高分子；(5)將選自亞甲基二醇、乙二醇、n-丙二醇、異丙二醇、羥基丙二醇之類的二醇類的單體單元作為構成成分的非離子性聚醚或該高分子之末端經烷氧基化的高分子；(6)葡聚糖、果膠、普魯蘭多醣(pullulan)之類的糖類等之非離子性天然高分子或該高分子之末端經烷氧基化的高分子；(7)甲基纖維素、羥基丙基纖維素之類的纖維素類等之非離子性改質天然高分子或該高分子之末端經烷氧基化的高分子；及、(8)將上述(1)及至(7)之相異的2種以上之高分子作為構成單位的嵌段聚合物或接枝共聚物或該共聚物之末端經烷氧基化的共聚物。
此等之非離子性水溶性高分子中，適合地為非離子性聚醚、非離子性聚酯、非離子性聚胺基酸或非離子性合成多胜肽或此等之高分子之末端經烷氧基化的高分子，更適合地為非離子性聚醚或非離子性聚酯或此等之高分子之末端經烷氧基化的高分子，又更適合地為 非離子性聚醚或非離子性單烷氧基聚醚，特適合地為聚乙二醇或單甲氧基聚乙二醇，最適合地為單甲氧基聚乙二醇。
又，此等之非離子性水溶性高分子之平均分子量並未特別限定，但適合地為1000及至12000，更適合地為1000及至5000，又更適合地為1800至2200。
脂質部分可使用於「2-1」記載之「兩性脂質」、「2-2」記載之「固醇類」所列舉的脂質等。
就非離子性水溶性高分子鍵結的脂質之具體例而言，例如，可列舉二醯基丙三醇鍵結單甲氧基聚乙二醇、磷脂醯基乙醇胺鍵結單甲氧基聚乙二醇、神經醯胺鍵結單甲氧基聚乙二醇(美國專利5,885,613號)等，但並未限定於此等。
更具體而言，可列舉以下任一者之具有分子量約2000之PEG之下式 所表示的1,2-二月桂醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇、以下之式 所表示的1,2-二肉豆蔻醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇、以下之式 所表示的1,2-二棕櫚醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇、以下之式 所表示的1,2-二硬脂醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇、以下之式 所表示的N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA：J.Controlled Release(2006)112、p.280-290)、以下之式 所表示的N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二棕櫚基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DPA：J.Controlled Release(2006)112、p.280-290)、以下之式 所表示的N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DSA：J.Controlled Release(2006)112、p.280-290)
以下之式 所表示的mPEG2000-1,2-二-O-肉豆蔻基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-DMG：記載於WO2009/132131實施例21)、以下之式 所表示的mPEG2000-1,2-二-O-棕櫚基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-DPG：記載於WO2009/132131實施例21)、及以下之式 所表示的mPEG2000-1,2-二-O-硬脂基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-DSG：記載於WO2009/132131實施例21)，較佳為N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA)、及1,2-二肉豆蔻醯基-sn-丙三醇甲氧基聚乙二醇，更佳可列舉N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA)。
上述之構造式中之CH3O(CH2CH2O)n’CH2CH2O-係表示非離子性水溶性高分子，其平均分子量並未特別限定，但適合地為1000及至12000，更適合地為1000及至5000，更適合地為1800至2200。n’係由非離子性水溶性高分子之平均分子量所考量的數值，其數並未特別限定，但適合地為20至280，更適合地為20至120，又更適合地為35至50。
又，只要可防止脂質粒子之凝集，亦可使用通常之PEG替代上述PEG-脂質或同時使用。若於脂質粒子之製造後為安定的，亦可於投予前經透析去除PEG。
2-4.其他脂質粒子之構成成分
本發明之脂質粒子只要維持脂質粒子之構造即可，可含有其他物質，就如此脂質粒子之一例而言，可列舉含有選自聚醯胺‧寡聚物(參照美國專利US6320017號)、胜肽、蛋白質、界面活性劑之1或2種以上的脂質粒子。
使本發明之脂質粒子之構成成分與具有向標的分子的指向性的配體結合亦為可能的。
就配體而言，例如，可列舉(1)與藉由所欲輸送的細胞而被支配表現的特定之細胞受體結合之荷爾蒙、成長因子、其適當的寡胜肽片段或低分子化合物、或(2)於標的細胞上與支配性發見的抗原性抗原決定位作特異性結合的多株或單株抗體、或其適當的片段(例如，Fab；F(ab’)2)。
2-5.脂質粒子之組成比率
本發明中的脂質粒子中之陽離子性脂質，係於存在於脂質粒子中的全部脂質中，以莫耳量計，含約20%~約80%，較佳為約20%~約70%，更佳為約45%~約65%。本發明所使用的陽離子性脂質之莫耳量，係存在於脂質粒子中的全部脂質中，下限較佳為20%，更佳為45%，上限係較佳為80%，更佳為70%，又更佳為65%。兩性脂質，係存在於脂質粒子中的全部脂質中，以莫耳量計， 含約0%~約35%，較佳為約0%~約20%，更佳為約5%~約15%。本發明所使用的兩性脂質之莫耳量，係存在於脂質粒子中的全部脂質中，下限較佳為5%，上限較佳為35%，更佳為20%，又更佳為15%。固醇類，係存在於脂質粒子中的全部脂質中，以莫耳量計，含約0%~約70%，較佳為約15%~約70%，更佳為約15%~約35%。本發明所使用的固醇類之莫耳量，係存在於脂質粒子中的全部脂質中，下限較佳為15%，上限較佳為70%，更佳為35%。減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質，係存在於脂質粒子中的全部脂質中，以莫耳量計，含約0.5%~約10%，較佳為約1%~約10%，更佳為約1.5%~約10%，特佳為約1.5%~約3%。本發明之減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質之莫耳量，係存在於脂質粒子中的全部脂質中，下限較佳為0.5%，更佳為1%，更佳為1.1%，又更佳為1.2%，又更佳為1.3%，特佳為1.4%，最佳為1.5%，上限較佳為10%，更佳為5%，又更佳為3%。
本發明之脂質粒子於使用兩性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質的情形，脂質組成，以莫耳量計，兩性脂質為20%以下，固醇類為15%~70%，陽離子性脂質為20%~70%，減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質為1%~10%係較佳，兩性脂質為5%~15%以下，固醇類為15%~40%以上，陽離子性脂質為45%~65%，減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質為1.5%~3%係更佳。
就本發明之脂質粒子之較佳例而言，以莫耳 比計，可列舉選自下列任一者之比率：兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質係10：48：40：2、10：38：50：2、10：33：55：2、10：28：60：2、15：33：50：2、10：48.5：40：1.5、10：47.5：40：2.5。更適合地，以莫耳比計，兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質係選自10：38：50：2、10：33：55：2、10：28：60：2、15：33：50：2之任一者之比率。
3.核酸脂質粒子
本發明係提供於上述「2.脂質粒子」之項目中記載之脂質粒子進一步含有核酸的核酸脂質粒子。所謂「核酸脂質粒子」的用語係意指脂質粒子與核酸之複合體。就脂質粒子與核酸形成複合體的核酸脂質粒子之一例而言，可列舉具有核酸埋於脂質之雙重膜中的構造的核酸脂質粒子。就本發明之核酸脂質粒子之一例而言，可列舉含核酸、陽離子性脂質、兩性脂質、固醇類及減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質的組成物。
本發明之核酸脂質粒子內之陽離子性脂質的分子數(N)與來自核酸的磷原子數(P)之比率(N/P)係較佳為約2.0~15.0，更佳為約2.0~12.0。又更佳為2.0~9.0，又更佳為3.0~9.0。N/P比率之下限係較佳為2.0，更佳為2.5，又更佳為3.0，上限較佳為15.0，更佳為12.0，又更佳為9.0。
本發明之核酸脂質粒子係較佳為具有約30nm~約300nm之平均粒徑，更佳為約30nm~約200nm ，又較佳為具有約30nm~約100nm之平均粒徑。平均粒徑係指使用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)等之機器，基於動態光散射法等之原理所測定的體積平均粒徑。
以通常條件經核酸酶分解的核酸，存於本發明之核酸脂質粒子內的情形，於水溶液中對經由核酸酶的分解係有耐性的。
核酸脂質粒子及彼等之調製方法揭示於美國專利第5,753,613號；第5,785,992號；第5,705,385號；第5,976,567號；第5,981,501號；第6,110,745號；第6,320,017號；國際公開公報第96/40964號及國際公開公報第07/012191號。
於本說明書，所謂「核酸」、「寡核苷酸」或「多核苷酸」的用語係指將至少二個之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以單鍵、雙鍵或3鍵任一者之形式含有的聚合物。
只要未特別指示，具體的核酸序列亦包含隱含其保存性修飾的變異物(例如簡併密碼子(degenerate codon)取代物)、對偶基因(allelic gene)、同源基因(ortholog)、SNP及互補的序列、以及明示指示的序列。
DNA可為反義、質體DNA、質體DNA之一部、事先經濃縮的DNA、聚合酶鏈反應(PCR)之產物、載體(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色體)、基因表現單元(expression cassette)、嵌合序列、染色體DNA或彼等之群之衍生物的形式。
於本說明書，所謂核酸的用語係被用於所有基因、質體、cDNA、訊息RNA(mRNA)、及干擾RNA分子(例如，由合成siRNA或質體所表現的siRNA)。
3-1.形成核酸脂質粒子的核酸
形成本發明之核酸脂質粒子的核酸亦可包含熟悉本項技術領域者已知的形態。就如此核酸之形態之具體例而言，可列舉單股DNA、單股RNA、DNA與RNA混合的單股多核苷酸。就其他之形態之核酸的具體例而言，可列舉雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之雜交多核苷酸、DNA與RNA混合的2種之多核苷酸而成的雙股多核苷酸。
3-2.核苷或核苷酸
構成本發明之核酸脂質粒子所含的核酸的核苷或核苷酸係除了天然型者之外，亦可包含經化學修飾的修飾核苷或修飾核苷酸。就修飾核苷/核苷酸而言，例如，可列舉糖修飾核苷/核苷酸、核酸鹼修飾核苷/核苷酸、骨架修飾核苷/核苷酸、或彼等之組合(例如，參照Nucleic Acid Research,1997,Vol.25,No.22,4429-4443)。
於本說明書，「天然型之核苷」係指2’-去氧腺苷、2’-去氧鳥苷、2’-去氧胞苷、2’-去氧-5-甲基胞苷、胸苷等之2’-去氧核苷、腺苷、鳥苷、胞苷、5-甲基胞苷、尿苷等之核糖核苷。又，「寡核苷酸」係指由核苷之糖部分與磷酸形成酯的化合物所構成的寡核苷酸。於本說明書，寡核苷酸與多核苷酸係以相同意義來使用。
於本說明書，亦將2’-去氧腺苷表示為At、2’-去氧鳥苷表示為Gt、2’-去氧胞苷表示為Ct、2’-去氧-5- 甲基胞苷表示為5meCt、胸苷表示為Tt、2’-去氧尿苷表示為Ut、腺苷表示為Art、鳥苷表示為Grt、胞苷表示為Crt、5-甲基胞苷表示為5meCrt、尿苷表示為Urt。又，於本說明書中，亦將2’-去氧腺苷核苷酸表示為Ap、2’-去氧鳥苷核苷酸表示為Gp、2’-去氧胞苷核苷酸表示為Cp、2’-去氧-5-甲基胞苷核苷酸表示為5meCp、胸苷核苷酸表示為Tp、2’-去氧尿苷核苷酸表示為Up、腺苷核苷酸表示為Arp、鳥苷核苷酸表示為Grp、胞苷核苷酸表示為Crp、5-甲基胞苷核苷酸表示為5meCrp、尿嘧啶核苷酸表示為Urp。
於本說明書，關於替代核苷酸之磷酸酯之成為硫代磷酸酯的硫代磷酸酯，作為對應Ap者表示為As、對應Gp者表示為Gs、對應Cp者表示為Cs、對應5meCp者表示為5meCs、對應Tp者表示為Ts、對應Up者表示為Us、對應Arp者表示為Ars、對應Grp者表示為Grs、對應Crp者表示為Crs、對應5meCrp者表示為5meCrs、對應Urp者表示為Urs。
本說明書中的「糖修飾核苷」係指核苷之糖部分為經修飾的核苷。就糖修飾核苷而言，例如，可列舉2’-O-甲基核苷、2’-O,4’-C-伸乙基核苷(ENA)、2’-O,4’-C-亞甲基核苷酸(BNA/LNA)。
其中，就2’-O-甲基修飾之例而言，有2’-O-甲基核苷及2’-O-甲基核苷酸，對應Art者表示為Am1t、對應Grt者表示為Gm1t、對應Crt者表示為Cm1t、對應5meCrt者表示為5meCm1t、對應Urt者表示為Um1t、對應Arp者表 示為Am1p、對應Grp者表示為Gm1p、對應Crp者表示為Cm1p、對應5meCrp者表示為5meCm1p、對應Urp者表示為Um1p、對應Ars者表示為Am1s、對應Grs者表示為Gm1s、對應Crs者表示為Cm1s、對應5meCs者表示為5meCm1s、對應Urs者表示為Um1s。
於本說明書附加的序列表，各序列之<223>之項目中，“cm”表示2’-O-甲基胞苷(2’-O-Methylcytidine)，“um”表示2’-O-甲基尿苷(2’-O-Methyluridine)，“gm”表示2’-O-甲基鳥苷(2’-O-Methylguanosine)。
於本說明書，2’-O,4’-C-伸乙基核苷酸單元及「ENA單元」係指於上述之各核苷、各核苷酸具有ENA者，表示對應At者為A2t、對應Ap者為Ae2p、對應As者為Ae2s、對應Gt者為G2t、對應Gp者為Ge2p、對應Gs者為Ge2s、對應5meCt者為C2t、對應5meCp者為Ce2p、對應5meCs者為Ce2s、對應Tt者為T2t、對應Tp者為Te2p、對應Ts者為Te2s之類的具有ENA單元的核苷及核苷酸。
於本說明書，2’-O,4’-C-亞甲基核苷酸單元及「2’,4’-BNA/LNA單元」係指於上述之各核苷、各核苷酸具有2’,4’-BNA/LNA者，表示對應At者為A1t、對應Ap者為Ae1p、對應As者為Ae1s、對應Gt者為G1t、對應Gp者為Ge1p、對應Gs者為Ge1s、對應5meCt者為C1t、對應5meCp者為Ce1p、對應5meCs者為Ce1s、對應Tt者為T1t、對應Tp者為Te1p、對應Ts者為Te1s之類具有2’,4’-BNA/LNA單元的核苷及核苷酸。
以下表示各核苷酸之構造式。
3-3.標的基因
於本說明書，「標的基因」係於將其導入的細胞、組織、或固體(以下有時將其稱為「被導入體」)，只要為RNA即可，並未特別限制，可為被轉譯為蛋白質的mRNA，亦可為未被轉譯為蛋白質的非編碼RNA。就非編 碼RNA而言，可為機能性RNA，例如，可列舉mRNA之非轉譯區域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(mRNA-like non-coding RNA)、長鏈ncRNA(long non-coding RNA)、snRNA(小核RNA(small nuclear RNA))、snoRNA(小核仁RNA(small nucleolar RNA))、miRNA(microRNA)等。具體而言，可為於導入的被導入體之內在性者，亦可為藉由基因導入等而被導入的外來性者。又，可為存於染色體上的基因，亦可為染色體外者。就外來性之基因而言，例如，可列舉可感染被導入體之來自病毒、細菌、真菌或原生動物者，並未限定於此等。關於基因之機能，可為已知者，亦可為未知者。
就如此標的基因之例而言，可列舉於具有特定疾病的患者，會特異性地表現上升及/或特異性地變異的基因。就疾病而言，例如，可列舉中樞疾病(例如，阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、痴呆、攝食障礙等)、炎症性疾病(例如，過敏、風濕病、變形性關節症、全身性紅斑性狼瘡(erythematosus)等)、循環器疾病(例如，高血壓症、心肥大、狹心症、動脈硬化症、高膽固醇血症等)、癌(例如，非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、肝臟癌、腎臟癌、胰臟癌、惡性黑色素瘤等)、呼吸器疾病(例如，肺炎、支氣管炎、氣喘、慢性閉塞性肺疾病、肺纖維症等)、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、貧血(例如，伴隨慢性疾病的貧血、鐵劑難治性缺鐵性貧血(iron-refractory iron deficiency anemia)等)、老化性黃 斑變性症、免疫系疾病(例如，克隆氏症(Crohn's disease)、異位性皮膚炎、自體免疫疾病、免疫不全、白血病等)、肝臟‧膽囊疾病(例如，非醇性脂肪性肝炎、肝硬化、肝炎、肝衰竭、膽汁鬱滯症、結石等)、消化道疾病(例如，潰瘍、腸炎、吸收不良等)、感染症、肥胖、纖維症(例如，肺纖維症、肝纖維症、腎纖維症、骨髓纖維症等)。就此等之疾病之原因基因而言，例如，可列舉紡錘體驅動蛋白(kinesin spindle protein(KSP))、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor(VEGF))、轉甲狀腺素蛋白(transthyretin(TTR))、前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisn/kexin type 9(PCSK9))、polo類激酶1(polo-like kinase 1(PLK-1))、ApoB-100、核糖核苷酸還原酶M2單元(ribonucleotide reductase M2 subunit(RRM2))、簇集蛋白(clusterin)、心休克蛋白27(heat shock protein 27(Hsp27))、生存素(surviving)、真核起始因子-4E(eukaryotic initiation factor-4E(eIF-4E))、細胞內黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1))、介白素4受體之α次單元(alpha subunit of the interleukin 4 receptor(IL-4R-alpha))、XI因子、VII因子、N-ras、H-ras、K-ras、bcl-2、bcl-xL、Her-1、Her-2、Her-3、Her-4、MDR-1、人類β-連鎖蛋白(β-catenin)基因、DDX3(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多胜肽3，連結X的)、骨髓樣細胞白血病序列1(Myeloid Cell Leukemia Sequence 1(MCL1))基因、PKR(Eif2ak2)、Hsp47(Serpinh1)、鐵調節 素(Hepcidin)、活性化蛋白C(APC)、轉錄之訊號傳導子及活化子(signal tranducer and activator of transcription(STAT3))、Collagen、type I、alpha 1(Col1A1)，但未限定於此等。
3-4.雙股多核苷酸
本發明之核酸脂質粒子所含的核酸係對標的基因具有RNA干擾作的核酸的情形，只要具有核酸之RNA干擾作用即可，其構造及化學修飾並無限制，例如，可列舉siRNA(例如，參照WO2002/044321、Current Opinion in Chemical Biology 570-579)、由將RNA與2’-OMeRNA交互鍵結的多核苷酸而成的AtuRNAi(例如參照WO2004/015107)、於以下之3-4-1項目說明之DNA與2’-OMeRNA為交互鍵結的多核苷酸中正義鏈與反義鏈為相異種類之核酸係以華生-克里克(Watson-Crick)鹼基對形成雙股的雙股多核苷酸(例如，參照WO2010/001909)、於以下之3-4-2項目中說明之多核苷酸末端經修飾的核酸(例如，參照WO2010/052715)、及於以下之3-4-3項目中說明的反義鏈多核苷酸之5’末端與正義鏈多核苷酸之3’末端之各個藉由連結子結合而成為單股，再於分子內形成華生-克里克鹼基對而具有雙股構造的單股多核苷酸(例如，參照WO2012/074038)等。
此等之多核苷酸之構造示於第4圖。
於本說明書中，「與標的基因相同之核苷酸序列而成的」係指由與標的基因之至少一部分的核苷酸序列相同之序列而成，但除了完全相同之序列外，只要 具有抗標的基因之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用者即可，亦包含實質上相同的序列。「由與標的基因互補的核苷酸序列而成的」係指與標的基因之至少一部分之核苷酸序列互補的序列而成，但於完全互補的序列之外，只要具有抗標的基因之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用即可，亦包含實質上相同的序列。又，於標的基因已知SNPs等的情形，具有彼等之變異的序列亦包含於相同之核苷酸序列。於本說明書中，含與標的基因互補的核苷酸序列且具有抗標的基因之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的多核苷酸稱為抗標的基因的多核苷酸。
本發明之核酸粒子所含的核酸之核苷酸序列係只要具有抗標的基因之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用即可，並未特別限制，例如，亦可藉由基於使用電腦軟體(例如，GENETYX(註冊商標)：GENETYX COORPORATION製等)而預測具有抗標的基因的RNA干擾作用的序列來決定正義鏈及反義鏈之序列來決定，更基於選擇的序列，藉由確認製作的多核苷酸之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦可加以決定。
具有RNA干擾作用的雙股多核苷酸之正義鏈及反義鏈之鏈長係只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，由10個核苷酸至標的基因之開放讀碼區(ORF)之全長為止的任一長度，較佳為由18個核苷酸至標的基因之開放讀碼區(ORF)之全長為止之任一長度，更佳為10至100個核苷酸，又更佳為15~30個核苷酸。
作為具有RNA干擾作用的雙股多核苷酸，於DNA與2’-OMeRNA交互鍵結的多核苷酸使用於正義鏈與反義鏈為相異種類之核酸作華生-克里克鍵結的雙股多核苷酸(WO2010/001909)的情形，就正義鏈而言，18~21個的鏈長為較佳，18~19個之鏈長為更佳。就反義鏈而言，19~21個之鏈長為較佳，21個鏈長為更佳。又並無其全體為雙股構造的必要，亦包含5’及/或3’末端有一部分突出者，其突出末端為1~5個核苷酸，較佳為1~3個核苷酸，更佳為2個核苷酸。又，就最佳例而言，可列舉具有於反義鏈之多核苷酸之3’末端有2個核苷酸突出(外伸構造)構造，形成18個鹼基對的多核苷酸。
3-4-1.DNA與2’-OMeRNA為交互鍵結的多核苷酸
就本發明之核酸脂質粒子所含的核酸之一例而言，可為於DNA與2’-OMeRNA交互鍵結的多核苷酸，以正義鏈與反義鏈為相異的種類之核酸作成華生-克里克鍵結的雙股多核苷酸。
就如此雙股多核苷酸之具體例而言，例如，可列舉WO2010/001909之實施例51記載之正義鏈CT-169：HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1t-H(序列表之序列識別號1)及實施例45記載之反義鏈CT-157：HO-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號2) 所構成的雙股多核苷酸；WO2010/001909之實施例20記載之正義鏈為CT-103：HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-At-H(序列表之序列識別號3)與實施例45記載之反義鏈CT-157：HO-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號2)所構成的雙股多核苷酸。
3-4-2.修飾雙股多核苷酸
於使用具有RNA干擾作用的核酸作為核酸脂質粒子所含的核酸的情形，只要具有RNA干擾作用即可，可列舉多核苷酸之末端為經修飾的核酸之一例。例如，於siRNA、AtuRNAi、DNA與2’-OMeRNA交互鍵結的多核苷酸，以正義鏈與反義鏈為相異種類之核酸作華生-克里克鍵結的雙股多核苷酸(例如，參照WO2010/001909)等之具有RNA干擾作用的雙股多核苷酸，反義鏈之5’末端的磷酸基經5’芳基磷酸修飾的雙股多核苷酸(例如，參照WO2010/052715)。
就如此修飾雙股多核苷酸之具體例而言，例如，可列舉下列構成的修飾雙股多核苷酸，WO2010/052715之實施例1記載之正義鏈CT-169：HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1t-H(序列表之序列識別號1)及具有選自以下之(1)至(3)任一個序列的反義鏈：
(1)實施例17記載之反義鏈CT-292：X-P(=O)(OH)-O-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號4)，X為次式所表示的序列；
(2)實施例26記載之反義鏈CT-315：X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號5)，X為次式所表示的序列；
(3)實施例83記載之反義鏈CT-387：X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號6)，X為次式所表示的序列。
3-4-3.修飾單股多核苷酸
就核酸脂質粒子所含的核酸而言，只要具有RNA干擾作用，為具有抗標的基因的正義鏈多核苷酸、及具有與該正義鏈多核苷酸互補的鹼序列的反義鏈多核苷酸的 核苷酸，亦包含於各自該反義鏈多核苷酸之5’末端與該正義鏈多核苷酸之3’末端，具有藉由形成磷酸二酯構造的連結子結合的單股構造的多核苷酸(例如，參照WO2012/074038)。
就如此化合物之具體例而言，例如，可列舉WO2012/074038之實施例12記載之多核苷酸CT-454：HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號7(正義鏈區域)及序列識別號8(反義鏈區域))；實施例28記載之多核苷酸HS-005：HO-Cp-Gm1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Cp-Gm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號9(正義鏈區域)及序列識別號10(反義鏈區域))；實施例29記載之多核苷酸HS-006：HO-Cp-Am1p-Gp-Am1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Gp-Gm1p-Tp-Gm1p-Cp-Um1p-Ap-Um1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Ap-Um1p-Ap-Gm1p-Cp-Am1p-Cp-Cm1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Tp-Cm1p-Tp-Gm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號11(正義鏈區域)及序列識別號12(反義鏈區域))；實施例30記載多核苷酸多核苷酸HS-005s：HO-Cp-Gm1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p- Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Cp-Gm1p-Tps-Um1t-H(序列表之序列識別號13(正義鏈區域)及序列識別號14(反義鏈區域))；實施例31記載多核苷酸多核苷酸HS-006s：HO-Cp-Am1p-Gp-Am1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Gp-Gm1p-Tp-Gm1p-Cp-Um1p-Ap-Um1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Ap-Um1p-Ap-Gm1p-Cp-Am1p-Cp-Cm1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Tp-Cm1p-Tp-Gm1p-Tps-Um1t-H(序列表之序列識別號15(正義鏈區域)及序列識別號16(反義鏈區域))；X為次式所表示的序列。
X之末端之亞甲基係與正義鏈多核苷酸之3’末端結合而形成磷酸二酯鍵，與苯基結合的氧原子係與反義鏈多核苷酸之5’末端結合而形成磷酸二酯鍵。
3-4-3.單股RNA
作為核酸脂質粒子所含的核酸，只要為單股RNA即可，並未特別限制，亦含有轉譯為蛋白質的mRNA。為了使轉譯效率提升，於5’末端亦可含有如m7GpppG的蓋帽構造、內部核糖體進入部位(IRES)、及/或於3’末端含有poly-A尾部。再者，可包含3’及/或5’非轉譯區域對安定化蛋白質有貢獻的序列、促進轉翻的序列。
單股RNA係可藉由活體外轉錄反應由具有所欲鹼基序列的DNA來製造。活體外轉錄所需要的酵素、緩衝液、及核苷-5’-三磷酸混合物(腺苷-5’-三磷酸(ATP)、鳥苷-5’-三磷酸(GTP)、胞苷-5’-三磷酸(CTP)及尿苷-5’-三磷酸(UTP))係已經市售(AmpliScribe T7 High Yield Transcription Kit(Epicentre)、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Life thechnologies)等)。為了製造單股RNA所使用的DNA，可使用經選殖化的DNA，例如，質體DNA或DNA片段。
又，為了獲得使安定性提升、又使免疫原生性降低的mRNA，於活體外轉錄反應，藉由同時使用修飾核苷-5’-三磷酸與未修飾核苷-5’-三磷酸，亦可於mRNA中導入修飾核苷酸(Kormann,M.(2011)Nature Biotechnology 29,154-157.)。作為使用的修飾尿苷-5’-三磷酸，可列舉2-硫尿苷-5’-三磷酸、4-硫尿苷-5’-三磷酸、4’-硫尿苷-5’-三磷酸、或假尿苷-5’-三磷酸。作為使用的修飾胞苷-5’-三磷酸，可列舉5-甲基胞苷-5’-三磷酸、或4-硫胞苷-5’-三磷酸。作為修飾核苷-5’-三磷酸，亦可同時使用修飾尿苷-5’-三磷酸及修飾胞苷-5’-三磷酸。
未修飾尿苷-5’-三磷酸與修飾尿苷-5’-三磷酸之比率係50~95%之未修飾尿苷-5’-三磷酸、5~50%修飾尿苷-5’-三磷酸為較佳。再者，70~95%之未修飾尿苷-5’-三磷酸、5~30%修飾尿苷-5’-三磷酸為較佳。未修飾胞苷-5’-三磷酸與修飾胞苷-5’-三磷酸之比率係50~95%之未修飾胞苷-5’-三磷酸、5~50%修飾胞苷-5’-三磷 酸為較佳。再者，70~95%之未修飾胞苷-5’-三磷酸、5~30%修飾胞苷-5’-三磷酸為較佳。
含有藉由使用修飾核苷-5’-三磷酸的活體外轉錄反應所獲得的修飾核苷酸(或者修飾核苷)的單股RNA係可藉由核酸酶而完全水解(因應必要，亦可以磷酸酶進行脫磷酸)、薄層層析(TLC)或高速液體層析(HPLC)等來分析，而可求得修飾核苷酸與未修飾核苷酸(或者修飾核苷與未修飾核苷)之含有比率。
未修飾之尿苷與修飾尿苷之比率係50~95%之未修飾尿苷、5~50%修飾尿苷為較佳。再者，70~95%之未修飾尿苷、5~30%修飾尿苷為較佳。未修飾之胞苷與修飾胞苷之比率係50~95%之未修飾胞苷、5~50%修飾胞苷為較佳。再者，70~95%之未修飾胞苷、5~30%修飾胞苷為較佳。
單股RNA係用於疾病之治療、或者用於有益蛋白質之供給。單股RNA係藉由本發明之核酸脂質粒子，被運送至具有疾病的臟器，進而於細胞質內，單股RNA被搬運。單股RNA編碼蛋白質的情形，於細胞質內蛋白質被轉譯，此蛋白質導致疾病的治癒。
作為疾病之治療對象，由於基因變異而蛋白質會不存在，或者，有供給量減少的情形。又，亦有即使蛋白質存在，由於其基因之變異而蛋白質之變異會發生，其變異蛋白質之機能與天然型蛋白質相比為弱的情形。對於此等蛋白質之缺失或缺損，使用編碼蛋白質的單股RNA，可導致疾病之治癒。就使用單股RNA可治癒 的疾病而言，可列舉由於基因缺損所產生的疾病(基因疾病)、及由於臟器衰竭而體內蛋白質不存在所致的疾病。
就基因缺損所產生的疾病(基因疾病)而言，可列舉(括弧內表示基因名)、糖原病Ia(葡萄糖-6-磷酸酶)、糖原病Ib(葡萄糖-6-磷酸移位酶)、糖原病III(澱粉1,6-葡萄糖苷酶(amylo-1,6-glucosidase))、糖原病IV(澱粉1,4→1,6轉葡萄糖基酶(transglucosylase))、糖原病VI(肝磷酸化酶(phosphorylase))、糖原病IX、糖原病VIII(肝磷酸化酶激酶(phosphorylase kinase))、α1-抗胰蛋白酶(antitrypsin)缺損症(α1-抗胰蛋白酶)、先天性血色素沉著病(hemochromatosis)、鐵調節素(hepcidin)缺損症(鐵調節素)、血友病A及B(凝固第VIII因子、凝固第IX因子)、先天性凝固阻止因子缺損症(蛋白質C、凝血因子Va及VIIIa之不活化因子)、血栓性血小板減少紫斑病(ADAMTS13)、先天性無巨核球性血小板減少症、血小板生成素(thrombopoietin)缺損症(血小板生成素)等。作為因臟器衰竭而體內無蛋白質存在所致的疾病，可列舉紅血球生成素(erythropoietin，EPO)成長荷爾蒙(生長激素(somatotropin)、hGH)。
3-5.核酸脂質粒子之製造方法
本發明之核酸脂質粒子之製造方法係只要可製造核酸脂質粒子即可，並未特別限制，例如，可藉由薄膜法、逆相蒸發法、乙醇注入法、醚注入法、脫水-再水合法、界面活性劑透析法、水合法、冷凍融解法等之方法加以製造。更具體而言，可以下述之乙醇注入法來製造。
使陽離子性脂質、兩性脂質、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質等之疏水性物質可溶化於50~90%乙醇。另一方面，使上述核酸等之親水性物質可溶化於pH3~6之緩衝液。
上述，藉由脂質乙醇溶液及核酸水溶液以1：20~1：1之體積比加以混合，進行脂質粒子之形成、及帶負電的核酸與帶正電的陽離子性脂質之靜電的相互作用所致的核酸脂質粒子之形成，會獲得核酸脂質粒子之粗分散液。
又，於其他態樣，脂質乙醇溶液係藉由與不含核酸的緩衝液混合，而形成脂質粒子。之後，藉由混合核酸水溶液，亦可使核酸脂質粒子形成。
接著，藉由超過濾或透析等之方法，進行於獲得的核酸脂質粒子之粗分散液所含的乙醇及游離之核酸之除去，安定的核酸脂質粒子會獲得。
就如此核酸脂質粒子之例，例如可列舉包含選自以下之(a)至(g)組成之群之任一者的莫耳比而成的構成成分的核酸脂質粒子。
(a)兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質=10：48：40：2、(b)兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質=10：38：50：2、(c)兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質=10：33：55：2、(d)兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒 子形成之際的凝集的脂質=10：28：60：2、(e)兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質=15：33：50：2、(f)兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質=10：48.5：40：1.5、(g)兩性脂質：固醇類：陽離子性脂質：減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質=10：47.5：40：2.5。
核酸脂質粒子中之陽離子性脂質的分子數(N)與來自核酸的磷原子數(P)之比率(N/P)係較佳為約2.0~15.0，更佳為約2.0~12.0。又更佳為2.0~9.0，又更佳為3.0~9.0。N/P比率之下限係較佳為2.0，更佳為2.5，又更佳為3.0，上限係較佳為15.0，更佳為12.0，又更佳為9.0。
4.含有核酸脂質粒子的醫藥
本發明之核酸脂質粒子可成為一種醫藥品，只要其具有抗標的基因的RNA干擾作用及或基因抑制作用。
就醫藥品而言，只要是用以治療或預防來自標的基因表現的疾病的醫藥品即可，並未特別限定，但適合地可列舉為用以治療或預防中樞疾病(例如，阿茲海默氏病、痴呆、攝食障礙等)、炎症性疾病(例如，過敏、風濕病、變形性關節症、全身性紅斑性狼瘡(erythematosus)等)、循環器疾病(例如，高血壓症、心肥大、狹心症、動脈硬化症、高膽固醇血症等)、癌(例如，非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、肝臟癌、腎臟癌、胰臟癌、惡性黑色素瘤等)、呼吸器疾病(例如，肺炎 、支氣管炎、氣喘、慢性閉塞性肺疾病、肺纖維症等)、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、貧血(例如，伴隨慢性疾病的貧血、鐵劑難治性缺鐵性貧血、癌性貧血等)、老化性黃斑變性症、免疫系疾病(例如，克隆氏症、異位性皮膚炎、自體免疫疾病、免疫不全、白血病等)、肝臟‧膽囊疾病(例如，非醇性脂肪性肝炎、肝硬變、肝炎、肝衰竭、膽汁鬱滯症、結石等)、消化管疾病(例如，潰瘍、腸炎、吸收不良等)、感染症、肥胖、纖維症(例如，肺纖維症、肝纖維症、腎纖維症、骨髓纖維症等)之醫藥品。更適合地為用以治療或預防癌(例如，非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、肝臟癌、腎臟癌、胰臟癌、惡性黑色素瘤等)、呼吸器疾病(例如，肺炎、支氣管炎、氣喘、慢性閉塞性肺疾病、肺纖維症等)、肝臟‧膽囊疾病(例如，非醇性脂肪性肝炎、肝硬變、肝炎、肝衰竭、膽汁鬱滯症、結石等)之醫藥品。更適合地為用以治療或預防癌(結腸癌、直腸癌、肝臟癌)、貧血(伴隨慢性疾病的貧血、鐵劑難治性缺鐵性貧血、癌性貧血)、肝臟疾病(非醇性脂肪性肝炎、肝硬變、肝炎)、膽囊疾病(膽汁鬱滯症)、纖維症(肺纖維症、肝纖維症、腎纖維症)之醫藥品。
本發明之核酸脂質粒子係可成為一種醫藥品，只要使用單股RNA，用於供給有益蛋白質而用於疾病之治療。於3-4-3.呈示實例。
本發明之核酸脂質粒子係可單獨、或依據投 予路徑及標準的醫藥的慣例被選擇與生理學上可容許的載劑之混合物中的任一者來投予。
一般而言，標準之生理食鹽水被使用作為藥學上可容許的載劑。
就其他之適合的載劑而言，例如，包含水、緩衝化水、0.4%食鹽水、0.3%甘胺酸等，且為了提高安定性，含有白蛋白、脂蛋白質、球蛋白等之糖蛋白質。
藥學的載劑一般而言係於粒子形成後被添加。因此，粒子形成後，粒子可於標準之生理學的食鹽水之類的藥學上可容許的載劑中加以稀釋。
醫藥調合物中之粒子之濃度係極廣泛，即重量小於約0.05%，通常為由約2~5%或至少2~5%，至10~30%左右，依據所選擇的具體投予樣式，主要由液體的容積、黏度等來選擇。例如，藉由提高濃度，可使伴隨治療的液體負荷變小。此係粥狀動脈硬化症關連鬱血性心衰竭或重症高血壓之患者所特別冀望。或者，由刺激性脂質所構成的粒子，可稀釋為低濃度，減輕投予部位之炎症。
典型地，核酸脂質粒子內之核酸之濃度係約1~20%，更佳為約3~10%。
本發明之藥學的組成物可藉由通常周知之滅菌技術來滅菌。水溶液係為了使用而包裝、或可於無菌的條件下過濾而冷凍乾燥，冷凍乾燥製劑係投予前與無菌水溶液合併。組成物係可含有例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣等之pH調節及緩衝化劑，以及 浸透壓調節劑等接近生理學的狀態所必要的藥學上可容許的輔助物質。
除此之外，粒子懸浮液可含有免於儲藏中之自由基及脂質之過氧化損傷來保護脂質的脂質保護劑。α生育酚等之脂肪親和性自由基猝熄劑、及含鐵氧胺之類的水溶性離子特異的嵌合化劑為適合的。
此等之使用之其他例，核酸脂質粒子係含有凝膠、油、乳劑等，但未限定於此等，可被併入廣範圍之局部投予形態。例如，含有核酸脂質粒子的懸浮液係可調合為局部用霜劑、糊劑、軟膏、凝膠、洗劑等來投予。
本發明之核酸脂質粒子亦提供導入核酸(例如質體或siRNA)至細胞內的方法。方法為，首先如上述形成粒子時，其次藉由引起粒子送達細胞、核酸向細胞內送達的充分時間接觸，可於活體外或活體內實施。
本發明之核酸脂質粒子係可吸附於幾乎任一種形式的細胞使彼等混合或接觸。一旦吸附時，可形成粒子經細胞部分而被吞噬、或脂質與細胞膜交換、或與細胞融合之任一者。
粒子之核酸部分之移送或併入係藉由此等路徑之任意一者而引起。尤其，融合發生的情形，粒子膜係併入細胞膜內，而粒子之內容物與細胞內液合併。
本發明之核酸脂質粒子係有用於治療或預防參與或反應細胞或組織中的標的基因表現程度的所有特徵、疾病或症狀。就成為治療或預防對象的疾病而言， 只要為來自標的基因表現的疾病即可，並未特別限定，但適合地為癌、貧血、肝臟疾病、膽囊疾病、纖維症、或基因疾病。本發明之核酸脂質粒子係可投與有其必要的哺乳動物(較佳為人類)。
本發明係提供抑制或向下調節細胞或組織中的標的基因表現的方法。又，本發明於標的基因為未被轉譯為蛋白質的非編碼RNA的情形，抑制或向下調節非編碼RNA之表現，進而向下調節參與該非編碼RNA的基因的表現，或者，依據情況，提供向下調節的方法。
[實施例]
以下，進一步具體地說明實施例、參考例及試驗例，但本發明並未限定於此等例。又，於下述實施例，與基因操作有關的各操作只要未特別明示，則依據「Molecular Cloning」[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊]記載之方法來進行，或者，使用市售試藥或套組的情形，依據市售品之指示書來使用。
(參考例1)
碳酸4-硝基苯基(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯
於二異丙基乙基胺(0.50g，3.8mmol)及4-二甲基胺基吡啶(0.12g，0.95mmol)之二氯甲烷(61mL)溶液，添加WO2010042877實施例1及實施例7記載之(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.50g，0.95mmol)及4-硝基苯基氯甲酸酯(0.38g，1.9mmol)，使 於室溫反應5小時。減壓下去除揮發分，經過濾去除經添加乙酸乙酯所產生的固體，於減壓下餾除所獲得的溶液之溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得目的物(0.61g，93%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.8Hz),1.21-1.44(36H,m),1.59-1.73(4H,m),2.00-2.09(8H,m),2.77(4H,t,J=6.8Hz),4.77-4.85(1H,m),5.28-5.42(8H,m),7.38(2H,d,J=9.3Hz),8.28(2H,d,J=9.3Hz)。
(參考例2)
碳酸2-(二甲基胺基)乙基(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯
於參考例1獲得的碳酸4-硝基苯基(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯(0.20g，0.29mmol)、2-二甲基胺基乙醇(0.26g，2.9mmol)及二異丙基乙基胺(0.15g，1.2mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加4-二甲基胺基吡啶(0.14g，1.2mmol)，使於室溫反應整夜。水處理後，經由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(100mg，54%)。本化合物係WO2010/054405之表中記載的化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.8Hz),1.20-1.40(36H,m),1.45-1.65(4H,m),1.96-2.08(8H,m),2.28(6H,s),2.60(2H,t,J=5.9Hz),2.77(4H,t,J=6.8Hz),4.21(2H,t,J=5.9Hz),4.64-4.71,1H,m),5.27-5.42(8H,m).
MS(ESI+)m/z 644[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 644.6012(3.0mDa)。
(實施例1)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯(例示化合物1-467)
於參考例1所獲得的碳酸4-硝基苯基(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯(0.20g，0.29mmol)、3-二甲基胺基-1-丙醇(0.30g，2.9mmol)及二異丙基乙基胺(0.15g，1.2mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加4-二甲基胺基吡啶(0.14g，1.2mmol)，使於室溫中反應整夜。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(100mg，53%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.8Hz),1.20-1.40(36H,m),1.45-1.65(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.3,7.3Hz),1.95-2.10(8H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.3Hz),2.77(4H,t,J=6.8Hz),4.18(2H,t,J=6.3Hz),4.63-4.73,1H,m),5.27-5.43(8H,m).
MS(ESI+)m/z 658[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 658.6164(2.6mDa)。
(參考例3)
(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-酮
於亞油酸甲酯(30.0g，101mmol)之二甲苯(55mL)溶液中，歷經10分鐘添加以己烷洗淨的氫化鈉(5.05g，63% ，132mmol)之二甲苯(10mL)懸浮液後，於150℃使反應5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒，獲得油狀物質。於此油狀物質中添加四氫呋喃(413mL)及5N氫氧化鈉水溶液(102mL)，於100℃使反應5.5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(23.0g，91%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.6Hz),1.24-1.40(28H,m),1.51-1.60(4H,m),2.01-2.09(8H,m),2.38(4H,t,J=7.4Hz),2.77(4H,t,J=6.6Hz),5.29-5.43(8H,m)。
(參考例4)
(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-醇
於參考例3所獲得的(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-酮(23.0g，46.1mmol)之甲醇(187mL)及四氫呋喃(187mL)溶液中，添加氫化硼鈉(1.74g，46.1mmol)後，使於室溫反應80分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(22.2g，96%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=7.0Hz),1.24-1.48(36H,m),2.01-2.09(8H,m),2.77(4H,t,J=6.3Hz),3.55-3.62(1H,m),5.29-5.43(8H,m)。
(參考例5)
碳酸4-硝基苯基(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-基酯
於二異丙基乙基胺(0.20g，1.5mmol)及4-二甲基胺基吡啶(0.05g，0.38mmol)之二氯甲烷(25mL)溶液中，添加參考例4所獲得的(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-醇(0.19g，0.38mmol)及氯甲酸4-硝基苯基酯(0.15g，0.77mmol)，使於室溫中反應整夜。減壓下去除揮發分，藉由過濾去除添加己烷所發生的固體，獲得的溶液於減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得目的物(0.12g，47%)。
(實施例2)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-基酯(例示化合物1-118)
於參考例5所獲得的碳酸4-硝基苯基(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-基酯(0.03g，0.05mmol)、3-二甲基胺基-1-丙醇(0.05g，0.5mmol)及二異丙基乙基胺(0.03g，0.2mmol)之二氯甲烷(6mL)溶液中，添加4-二甲基胺基吡啶(0.02g，0.2mmol)，使於室溫反應4日。追加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.1g，1mmol)，再使反應2日。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(10mg，31%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.6Hz), 1.22-1.42(34H,m),1.48-1.65(4H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.98-2.10(8H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.77(4H,t,J=6.6Hz),4.18(2H,t,6.6Hz),4.64-4.73(1H,m),5.37-5.43(8H,m).
MS(ESI+)m/z 630[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 630.5839(1.4mDa)。
(實施例3)
碳酸4-(二甲基胺基)丁基(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-基酯(例示化合物1-129)
於參考例5所獲得的碳酸4-硝基苯基(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-基酯(0.12g，0.18mmol)、4-二甲基胺基-1-丁醇(0.22g，1.8mmol)及二異丙基乙基胺(0.10g，0.72mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加4-二甲基胺基吡啶(0.09g，0.72mmol)，使於室溫中反應整夜。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(30mg，26%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.6Hz),1.21-1.42(34H,m),1.47-1.64(6H,m),1.71(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.99-2.09(8H,m),2.21(6H,s),2.27(2H,t,J=7.4Hz),2.77(4H,t,J=6.6Hz),4.14(2H,t,J=6.6Hz),4.63-4.72(1H,m),5.28-5.43(8H,m).
MS(ESI+)m/z 644[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 644.6008(2.6mDa)。
(參考例6)
(9Z,26Z)-三十五-9,26-二烯-18-酮
於油酸甲酯(10.0g，33.4mmol)之二甲苯(18mL)溶液中，歷經5分鐘添加以己烷洗淨的氫化鈉(1.65g，63%，43.4mmol)之二甲苯(3mL)懸浮液後，於150℃使反應5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒，獲得油狀物質。於此油狀物質中添加四氫呋喃(135mL)及5N氫氧化鈉水溶液(33mL)，於100℃使反應5.5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒後，以丙酮-己烷溶媒使產生固體。自經過濾去除固體的溶液，減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(7.50g，89%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.8Hz),1.21-1.36(40H,m),1.52-1.60(4H,m),1.97-2.04(8H,m),2.38(4H,t,J=7.6Hz),5.30-5.39(4H,m)。
(參考例7)
(9Z,26Z)-三十五-9,26-二烯-18-醇
於參考例6所獲得的(9Z,26Z)-三十五-9,26-二烯-18-酮(5.0g，9.9mmol)之甲醇(40mL)及四氫呋喃(40mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.38g，9.9mmol)後，使於室溫反應80分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後 ，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(4.5g，90%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.6Hz),1.21-1.37(48H,m),1.37-1.49(4H,m),1.97-2.06(8H,m),3.55-3.62(1H,m),5.31-5.40(4H,m)。
(實施例4)
碳酸3-二甲基胺基丙基(9Z,26Z)-三十五-9,26-二烯-18-基酯(例示化合物1-50)
於參考例7所獲得的(9Z,26Z)-三十五-9,26-二烯-18-醇(0.25g，0.50mmol)及吡啶(0.25g，3.1mmol)之甲苯(5.0mL)溶液中，歷經2分鐘添加三光氣(0.10g，0.34mmol)之甲苯(0.74mL)溶液。於室溫攪拌100分鐘後，添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.54g，5.2mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(296mg，94%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.86-0.91(6H,m),1.22-1.36(44H,m),1.50-1.59(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.8,7.3Hz),1.97-2.04(8H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.3Hz),4.18(2H,t,J=6.8Hz),4.65-4.72(1H,m),5.33-5.37(4H,m).
MS(ESI+)m/z 634[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 634.6169(3.1mDa)。
(參考例8)
(3Z,6Z,9Z,26Z,29Z,32Z)-三十五-3,6,9,26,29,32-六烯-18-酮
於α-次亞麻油酸甲酯(10.0g，33.4mmol)之二甲苯(18mL)溶液中，歷經5分鐘添加以己烷洗淨的氫化鈉(1.65g，63%，43.4mmol)之二甲苯(3mL)懸浮液後，於150℃使反應5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒，獲得油狀物質。於此油狀物質中添加四氫呋喃(135mL)及5N氫氧化鈉水溶液(33mL)，於100℃使反應5.5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒後，以丙酮-己烷溶媒使固體產生。自經過濾去除固體的溶液，減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(6.10g，74%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.98(6H,t,J=7.6Hz),1.22-1.40(16H,m),1.52-1.60(4H,m),2.00-2.19(8H,m),2.39(4H,t,J=7.6Hz),2.74-2.83(8H,m),5.28-5.43(12H,m)。
(參考例9)
(3Z,6Z,9Z,26Z,29Z,32Z)-三十五-3,6,9,26,29,32-六烯-18-醇
於參考例8所獲得的(3Z,6Z,9Z,26Z,29Z,32Z)-三十五-3,6,9,26,29,32-六烯-18-酮(5.0g，10.1mmol)之甲醇(41mL)及四氫呋喃(41mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.38g ，10mmol)後，使於室溫反應80分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，藉由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(4.0g，79%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.98(6H,t,J=7.6Hz),1.24-1.48(24H,m),2.00-2.20(8H,m),2.75-2.84(8H,m),3.55-3.61(1H,m),5.29-5.43(12H,m)。
(實施例5)
碳酸3-二甲基胺基丙基(3Z,6Z,9Z,26Z,29Z,32Z)-三十五-3,6,9,26,29,32-六烯-18-基酯(例示化合物1-176)
於參考例9所獲得的(3Z,6Z,9Z,26Z,29Z,32Z)-三十五-3,6,9,26,29,32-六烯-18-醇(0.25g，0.50mmol)及吡啶(0.25g，3.1mmol)之甲苯(5.0mL)溶液中，歷經2分鐘添加三光氣(0.10g，0.34mmol)之甲苯(0.75mL)溶液。於室溫攪拌100分鐘後，添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.55g，5.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(274mg，87%，異構物混合物)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.98(6H,t,J=7.6Hz),1.24-1.39(20H,m),1.49-1.62(4H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.6Hz),2.00-2.19(8H,m),2.22,(6H,s),2.36(2H,t,J=7.6Hz),2.74-2.84(8H,m),4.17(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.71(1H,m),5.28-5.44(12H,m).
MS(ESI+)m/z 626[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 626.5512(-0.5mDa)。
(參考例10)
(6Z,9Z,12Z,23Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,12,23,26,29-六烯-18-酮
於γ-次亞麻油酸甲酯(5.00g，17.1mmol)之二甲苯(9mL)溶液中，歷經5分鐘添加以己烷洗淨的氫化鈉(0.85g，63%，22.2mmol)之二甲苯(1.5mL)懸浮液後，於150℃使反應5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒，獲得油狀物質。於此油狀物質中添加四氫呋喃(69mL)及5N氫氧化鈉水溶液(17mL)，於100℃使反應5.5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒後，以丙酮-己烷溶媒使固體產生。自經過濾去除固體的溶液，減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(3.80g，90%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.86-0.91(6H,m),1.23-1.42(16H,m),1.55-1.63(4H,m),1.98-2.20(8H,m),2.39(4H,t,J=7.6Hz),2.78-2.83(8H,m),5.25-5.44(12H,m)。
(參考例11)
(6Z,9Z,12Z,23Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,12,23,26,29-六烯-18-醇
於參考例10所獲得的(6Z,9Z,12Z,23Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,12,23,26,29-六烯-18-酮(3.0g，6.1mmol)之甲醇(25mL)及四氫呋喃(25mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.23g，6.1mmol)後，使於室溫反應80分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(2.1g，70%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.86-0.91(6H,m),1.24-1.50(24H,m),1.99-2.21(8H,m),2.78-2.84(8H,m),3.55-3.62(1H,m),5.28-5.44(12H,m)。
(實施例6)
碳酸3-二甲基胺基丙基(6Z,9Z,12Z,23Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,12,23,26,29-六烯-18-基酯(例示化合物1-152)
於參考例11所獲得的(6Z,9Z,12Z,23Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,12,23,26,29-六烯-18-醇(0.25g，0.50mmol)及吡啶(0.25g，3.1mmol)之甲苯(5.0mL)溶液中，歷經2分鐘添加三光氣(0.10g，0.34mmol)之甲苯(0.75mL)溶液。於室溫攪拌100分鐘後，添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.55g，5.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(240mg，76%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.86-0.91(6H,m),1.22-1.42(20H,m),1.51-1.63(4H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.3Hz),1.99-2.19(8H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t, J=7.3Hz),2.78-2.83(8H,m),4.17(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.72(1H,m),5.30-5.45(12H,m).
MS(ESI+)m/z 626[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 626.5515(0.3mDa)。
(參考例12)
二-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基丙二酸二甲酯
於丙二酸二甲酯(13.5g，102mmol)之甲苯(500mL)溶液中，歷經5分鐘添加以己烷洗淨的氫化鈉(5.17g，63%，136mmol)之甲苯(6mL)懸浮液。於80℃攪拌30分鐘後，添加甲烷磺酸(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基酯(WO2009/132131記載實施例1之化合物，23.4g，67.9mmol)，於100℃攪拌4小時，於120℃攪拌2小時。1N氫氯酸水溶液處理後，進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(9.71g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.90(6H,t,J=7.0Hz),1.07-1.16(4H,m),1.21-1.40(32H,m),1.82-1.89(4H,m),2.01-2.08(8H,m),2.77(4H,t,J=6.6Hz),3.71(6H,s),5.29-5.43(8H,m)。
又，獲得呈無色液體之副生物(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基丙二酸二甲酯(8.50g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85(3H,t,J=7.0Hz),1.21-1.37(18H,m),1.81-1.90(2H,m),1.96-2.05(4H,m),2.74(2H,t,J=6.6Hz),3.32(1H,t、J=7.4Hz),3.70(6H,s),5.25-5.39(4H,m)。
(參考例13)
(11Z,14Z)-2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]二十-11-二烯酸甲酯
於參考例12所獲得的二-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基丙二酸二甲酯(5.00g，7.95mmol)及水(2.15g，119mmol)之二甲基亞碸(39.5mL)溶液中，添加氯化鋰(1.01g，23.9mmol)。於150℃攪拌5小時後，添加水(2.15g，119mmol)及氯化鋰(1.01g，23.9mmol)。於160℃使反應5小時，冷卻至室溫，水處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(3.00g，66%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=7.0Hz),1.20-1.47(38H,m),1.55-1.64(2H,m),2.01-2.09(8H,m),2.28-2.37(1H,m),2.77(4H,t,J=6.6Hz),3.67(3H,s),5.29-5.46(8H,m)。
(參考例14)
(11Z,14Z)-2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]二十-11,14-二烯-1-醇
於參考例13所獲得的(11Z,14Z)-2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]二十-11-二烯酸甲酯(3.00g，5.25mmol)之四氫呋喃(40mL)溶液中，添加氫化鋰鋁(0.400g，10.5mmol)，於室溫攪拌1小時。以水(0.4mL)、15%氫氧化鈉水溶液(0.4mL)、水(1.2mL)處理，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除 溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(1.00g，35%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=7.0Hz),1.24-1.44(38H,m),1.97-2.09(9H,m),2.78(4H,t,J=6.6Hz),4.15(2H,t,J=6.3Hz),5.29-5.43(8H,m)。
(實施例7)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14Z)-2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]二十-11,14-二烯-1-基酯(例示化合物1-477)
將參考例14所獲得的(11Z,14Z)-2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]二十-11,14-二烯-1-醇(0.15g，0.28mmol)及吡啶(0.14g，1.8mmol)之甲苯(0.6mL)溶液，於冰浴中冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.06g，0.19mmol)之甲苯(0.24mL)溶液。於0℃攪拌2小時後，升溫至10℃並攪拌30分鐘，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基1-丙醇(0.30g，2.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(130mg，70%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.21-1.40(40H,m),1.62-1.69(1H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.01-2.09(8H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.78(4H,t,J=6.6Hz),4.03(2H,d,J=5.9Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),5.29-5.43(8H,m).
MS(ESI+)m/z 672[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 672.6309(1.4mDa)。
(參考例15)
(9Z,12Z)-N-甲氧基-N-甲基十八-9,12-二烯醯胺
於亞油酸(10.0g，35.7mmol)及N,O-二甲基乙醇胺鹽酸鹽(6.56g，71.3mmol)之二氯甲烷(250mL)溶液中，添加1-羥基苯并咪唑水合物(10.9g，71.3mmol)、三乙基胺(7.22g，71.3mmol)、1-乙基-3-(3’-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(13.7g，71.3mmol)，並使於室溫中反應整夜。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(11.4g，99%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.0Hz),1.24-1.40(14H,m),1.63(2H,quint,J=7.4Hz),2.00-2.09(4H,m),2.41(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.18(3H,s),3.68(3H,s),5.29-5.43(4H,m)。
(參考例16)
(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-酮
將參考例15所獲得的(9Z,12Z)-N-甲氧基-N-甲基十八-9,12-二烯醯胺(11.4g，35.2mmol)之四氫呋喃(157mL)溶液，以水浴冷卻至15℃，歷經20分鐘滴加1N溴化n-癸基鎂四氫呋喃溶液(52.9mL，52.9mmol)後，使於室溫反應整夜。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(14.3g，99%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.0Hz),0.90(3H,t,J=7.0Hz),1.20-1.40(28H,m),1.50-1.60(4H,m),2.00-2.09(4H,m),2.38(4H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),5.28-5.42(4H,m)。
(參考例17)
(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇
於參考例16所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-酮(14.3g，35.2mmol)之甲醇(106mL)及四氫呋喃(106mL)溶液中，添加氫化硼鈉(1.33g，35.2mmol)後，使於室溫反應70分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(13.5g，95%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.0Hz),0.90(3H,t,J=7.0Hz),1.23-1.47(40H,m),2.01-2.09(4H,m),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.54-3.62(1H,m),5.29-5.42(4H,m)。
(實施例8)
碳酸3-二甲基胺基丙基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物1-72)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.15g，0.37mmol)及吡啶(0.18g，2.3mmol)之甲苯(0.8mL)溶液，以冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.07g，0.25mmol)之甲苯(0.31mL)溶液。於0℃攪拌1小時後，升溫至10℃並攪拌20分鐘，再度冷卻至0℃。添加 3-二甲基胺基1-丙醇(0.40g，3.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(100mg，51%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.22-1.39(32H,m),1.49-1.62(4H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.6Hz),2.01-2.08(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.6Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.72(1H,m),5.29-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 536[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 536.5038(-0.5mDa)。
(實施例9)
碳酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物2-72)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.26g，0.64mmol)及吡啶(0.32g，4.0mmol)之甲苯(7.4mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.13g，0.44mmol)之甲苯(0.9mL)溶液。於0℃攪拌20分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加(1-甲基-3-哌啶基)甲醇(0.87g，6.7mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(360mg，55%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.21-1.39(32H,m),1.49-1.76(9H,m),1.86-1.92(1H,m),1.96-2.07(5H,m),2.26(3H,s),2.74(1H,d,J=10.5Hz),2.77(2H,t,J=6.8Hz),2.85(1H,d,J=10.5Hz),3.94(1H,dt,J=3.2,7.3Hz),4.06(1H,ddd,J=3.2,5.9,10.7Hz),4.65-4.71(1H,m),5.29-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 562[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 562.5196(-0.3mDa)。
(實施例10)
碳酸1-甲基哌啶-4-基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物2-66)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.300g，0.738mmol)及吡啶(0.368g，4.65mmol)之甲苯(7.4mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.151g，0.509mmol)之甲苯(1.1mL)溶液。於0℃攪拌20分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加4-羥基-1-甲基哌啶(0.892g，7.75mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(249mg，62%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.20-1.40(32H,m),1.49-1.62(4H,m),1.73-1.84(2H,m),1.92-2.01(2H,m),2.01-2.08(4H,m),2.16-2.25(2H,m),2.28(3H,s),2.65-2.73(2H,m),2.77(2H,t,J=6.6Hz), 4.57-4.66(1H,m),4.64-4.73(1H,m),5.28-5.43(4H,m).
MS(ESI+)m/z 548[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 548.5042(-0.1mDa)。
(實施例11)
碳酸(1-甲基吡咯啶-3-基)甲基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物2-71)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.300g，0.738mmol)及吡啶(0.368g，4.65mmol)之甲苯(7.4mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.151g，0.509mmol)之甲苯(1.1mL)溶液。於0℃攪拌20分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加(1-甲基吡咯啶-3-基)甲醇(0.892g，7.75mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(234mg，58%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.20-1.40(32H,m),1.45-1.64(5H,m),1.95-2.07(5H,m),2.30(1H,dd,J=5.5,9.4Hz),2.34(3H,s),2.51(2H,t,J=7.0Hz),2.23-2.62(1H,m),2.65(1H,dd,J=7.8,9.0Hz),2.77(2H,t,J=6.3Hz),4.03(1H,ddd,J=2.0,7.8,9.8Hz),4.07(1H,ddd,J=2.0,7.0,10.6Hz),4.68(1H,tt,J=5.5,7.0Hz),5.29-5.43(4H,m).
MS(ESI+)m/z 548[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 548.5050(0.7mDa)。
(實施例12)
碳酸1-甲基吡咯啶-3-基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物2-64)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.150g，0.369mmol)及吡啶(0.184g，2.32mmol)之甲苯(3.7mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.0755g，0.254mmol)之甲苯(0.55mL)溶液。於0℃攪拌20分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加1-甲基-3-吡咯烷醇(0.392g，3.87mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(99.9mg，50%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.0Hz),0.89(3H,t,J=7.0Hz),1.22-1.40(32H,m),1.47-1.60(4H,m),1.92(1H,dddd,J=2.7,6.3,7.4,13.7Hz),2.01-2.09(4H,m),2.28(1H,dddd,J=6.3,7.4,7.8,13.7Hz),2.36(3H,s),2.41(1H,ddd,J=6.3,7.8,9.0Hz),2.67(1H,dd,J=2.7,10.9Hz),2.73(1H,ddd,J=6.3,7.4,9.0Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),2.82(1H,dd,J=5.9,10.9Hz),4.67(1H,tt,J=5.5,7.0Hz),5.08(1H,ddt,J=5.9,7.8,2.7Hz),5.28-5.43(4H,m).
MS(ESI+)m/z 534[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 534.4891(0.5mDa)。
(實施例13)
碳酸2-(1-甲基吡咯啶-2-基)乙基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物2-75)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.200g，0.492mmol)及吡啶(0.245g，3.10mmol)之甲苯(5mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.101g，0.339mmol)之甲苯(0.74mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加1-甲基-2-吡咯啶甲醇(0.667g，5.16mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(98.5mg，36%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.0Hz),0.89(3H,t,J=7.0Hz),1.22-1.40(32H,m),1.44-1.85(8H,m),1.92-2.18(8H,m),2.32(3H,s),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.06(1H,ddd,J=2.3,8.2,8.6Hz),4.11-4.26(2H,m),4.65-4.72(1H,m),5.29-5.43(4H,m).
MS(ESI+)m/z 562[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 562.5203(0.4mDa)。
(實施例14)
碳酸(1-甲基哌啶-4-基)甲基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物2-73)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.200g，0.492mmol)及吡啶(0.245g，3.10mmol)之甲苯(5mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三 光氣(0.101g，0.339mmol)之甲苯(0.74mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加4-羥基甲基-1-甲基哌啶(0.667g，5.16mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(21.7mg，8%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.0Hz),0.90(3H,t,J=7.0Hz),1.23-1.39(28H,m),1.49-1.61(6H,m),1.63-1.71(1H,m),1.74(2H,d,J=14.1Hz),1.91(2H,t,J=11.7Hz),2.00-2.03(4H,m),2.27(3H,s),2.77(2H,t,J=6.6Hz),2.86(2H,d,J=11.7Hz),3.98(2H,d,J=6.6Hz),4.64-4.71(1H,m),5.29-5.43(4H,m).
MS(ESI+)m/z 562[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 562.5204(0.5mDa)。
(參考例18)
(21Z,24Z)-三十-21,24-二烯-13-醇
於參考例15所獲得的(9Z,12Z)-N-甲氧基-N-甲基二十八-9,12-二烯醯胺(0.50g，1.5mmol)之四氫呋喃(6.9mL)溶液中，歷經3分鐘滴加1N溴化n-十二碳基鎂 二乙基醚溶液(4.6mL，4.6mmol)後，使於室溫反應6小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得含預定中間體的酮體的混合物(0.93g)。於此酮體混合物之甲醇(4.6mL)及四氫呋喃(4.6mL)溶液 中，添加氫化硼鈉(0.06g，1.5mmol)後，使於室溫反應3小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。藉由於減壓下餾除溶媒，獲得呈無色液體之目的物(0.59g，89%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=6.8Hz),0.90(3H,t,J=6.8Hz),1.22-1.48(44H,m),2.02-2.08(4H,m),2.77(2H,t,J=6.8Hz),3.55-3.62(1H,m),5.30-5.42(4H,m)。
(實施例15)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(21Z,24Z)-三十-21,24-二烯-13-基酯(例示化合物1-112)
將參考例18所獲得的(21Z,24Z)-三十-21,24-二烯-13-醇(0.15g，0.35mmol)及吡啶(0.17g，2.2mmol)之甲苯(3.4mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.07g，0.24mmol)之甲苯(0.5mL)溶液。於0℃攪拌2小時後，添加3-二甲基胺基1-丙醇(0.37g，3.6mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(177mg，91%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.21-1.40(36H,m),1.49-1.63(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.6Hz),2.01-2.08(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.6Hz),2.78(2H,t,J=6.6Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.72(1H,m),5.29-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 564[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 564.5359(0.3mDa)。
(參考例19)
(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-3-炔-11-酮
於參考例15所獲得的(9Z,12Z)-N-甲氧基-N-甲基-二十八-9,12-二烯醯胺(1.00g，3.09mmol)之四氫呋喃(6.2mL)溶液中，歷經3分鐘滴加0.5N氯化(癸-7-炔基)鎂四氫呋喃溶液(12.4mL，6.20mmol)後，使於室溫反應6小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(1.03g，83%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.1Hz),1.11(3H,t,J=7.3Hz),1.23-1.61(24H,m),2.01-2.08(4H,m),2.11-2.19(4H,m),2.36-2.41(4H,m),2.77(2H,t,J=6.8Hz),5.29-5.42(4H,m)。
(參考例20)
(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-3-炔-11-醇
於參考例19所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-3-炔-11-酮(1.0g，2.56mmol)之甲醇(7.7mL)及四氫呋喃(7.7mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.097g，2.6mmol)後，使於室溫反應3小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.78g，75%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.1Hz),1.11(3H,t,J=7.3Hz),1.24-1.52(28H,m),2.02-2.08(4H,m),2.11-2.19(4H,m),2.77(2H,t,J=6.8Hz),3.55-3.62(1H,m),5.30-5.42(4H,m)。
(實施例16)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-3-炔-11-基酯(例示化合物1-99)
將參考例20所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-3-炔-11-醇(0.15g，0.37mmol)及吡啶(0.19g，2.4mmol)之甲苯(3.7mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.076g，0.26mmol)之甲苯(0.5mL)溶液。於0℃攪拌2小時後，添加3-二甲基胺基1-丙醇(0.40g，3.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(183mg，93%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=6.6Hz),1.11(3H,t,J=7.3Hz),1.23-1.64(28H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.3Hz),2.01-2.08(4H,m),2.10-2.19(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.3Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.71(1H,m),5.29-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 532[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 532.4739(0.9mDa)。
(參考例21)
(3Z,19Z,22Z)-二十八-3,19,22-三烯-11-醇
氫氣環境下，於乙酸鎳(II)四水合物(0.24g，0.97mmol)中添加乙醇(12mL)，並添加氫化硼鈉(0.037g，0.97mmol)之乙醇(6mL)溶液。於室溫攪拌15分鐘後，添加乙二胺(0.23g，3.9mmol)，再攪拌15分鐘。其次歷經1分鐘添加參考例20所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-3-炔-11-醇(0.39g，0.97mmol)之乙醇(6mL)溶液，室溫氫氣環境下攪拌5.5小時。以20%乙酸乙酯-己烷溶液稀釋，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.37g，95%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.1Hz),0.95(3H,t,J=7.3Hz),1.23-1.48(28H,m),1.99-2.08(8H,m),2.77(2H,t,J=6.8Hz),3.55-3.61(1H,m),5.29-5.42(6H,m)。
(實施例17)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(3Z,19Z,22Z)-二十八-3,19,22-三烯-11-基酯(例示化合物1-87)
將參考例21所獲得的(3Z,19Z,22Z)-二十八-3,19,22-三烯-11-醇(0.15g，0.37mmol)及吡啶(0.19g，2.4mmol)之甲苯(3.7mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.075g，0.26mmol)之甲苯(0.5mL)溶液。於0℃攪拌2小時後，添加3-二甲基胺基1-丙醇(0.40g，3.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無 色液體之目的物(136mg，69%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=6.6Hz),0.95(3H,t,J=7.6Hz),1.22-1.40(24H,m),1.49-1.64(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.3Hz),1.97-2.08(8H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.3Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),4.17(2H,J=6.6Hz),4.65-4.71(1H,m),5.27-5.43(6H,m).
MS(ESI+)m/z 534[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 534.4891(0.5mDa)。
(實施例18)
碳酸4-(二甲基胺基)丁基(11Z,14Z)-2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]二十-11,14-二烯-1-基酯(例示化合物1-478)
將參考例14所獲得的(11Z,14Z)-2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]二十-11,14-二烯-1-醇(0.15g，0.28mmol)及吡啶(0.14g，1.8mmol)之甲苯(0.6mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.06g，0.19mmol)之甲苯(0.24mL)溶液。於0℃攪拌2小時後，升溫至10℃並攪拌30分鐘，再度冷卻至0℃。添加4-二甲基胺基1-丁醇(0.35g，2.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(80mg，42%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.86-0.92(6H,m),1.20-1.40(40H,m),1.50-1.59(2H,m),1.63-1.74(3H,m),2.01-2.09(8H,m),2.21(6H,s),2.28(2H,t,J=7.4Hz), 2.78(4H,t,J=6.6Hz),4.02(2H,d,J=5.9Hz),4.14(2H,t,J=6.6Hz),5.29-5.43(8H,m).
MS(ESI+)m/z 686[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 686.6461(1.0mDa)。
(參考例22)
二十八-11-醇
於十八醛(0.62g)之四氫呋喃(2.3mL)溶液中，添加1N溴化n-癸基鎂 二乙基醚溶液(4.6mL，4.6mmol)，並使於室溫反應20分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈白色蠟狀固體之目的物(0.34g，36%)。
(實施例19)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基二十八-11-基酯(例示化合物1-8)
將參考例22獲得的二十八-11-醇(0.11g，0.27mmol)及吡啶(0.13g，1.7mmol)之甲苯(2.7mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.055g，0.18mmol)之甲苯(0.40mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.29g，2.8mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(114mg，79%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m), 1.22-1.35(46H,m),1.48-1.64(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.17(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.72(1H,m).
MS(ESI+)m/z 540[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z540.5344(-1.2mDa)。
(參考例23)
(Z)-N-甲氧基-N-甲基十八-9-烯醯胺
於油酸(10.3g，36.3mmol)及N,O-二甲基乙醇胺鹽酸鹽(7.08g，72.6mmol)之二氯甲烷(250mL)溶液中，添加1-羥基苯并咪唑水合物(11.1g，72.6mmol)、三乙基胺(7.34g，72.6mmol)、1-乙基-3-(3’-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(13.9g，72.6mmol)，使於室溫中反應整夜。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(12.1g，99%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.1Hz),1.22-1.37(20H,m),1.63(2H,quint,J=7.3Hz),1.97-2.04(4H,m),2.41(2H,t,J=7.3Hz),3.18(3H,s),3.68(3H,s),5.31-5.38(2H,m)。
(參考例24)
(Z)-二十八-19-烯-11-酮
於參考例23所獲得的(Z)-N-甲氧基-N-甲基十八-9-烯醯胺(0.50g，1.5mmol)之四氫呋喃(7.7mL)溶液中，添加1N溴化n-癸基鎂 四氫呋喃溶液(3.1mL，3.1mmol)後，使於室溫反應1小時，其次於60℃使反應30分鐘。飽和氯 化銨水溶液處理後，減壓下去除揮發分，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.59g，93%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.85-0.90(6H,m),1.20-1.36(34H,m),1.52-1.60(4H,m),1.98-2.04(4H,m),2.38(4H,t,J=7.3Hz),5.32-5.38(2H,m)。
(參考例25)
(Z)-二十八-19-烯-11-醇
於參考例24所獲得的(Z)-二十八-19-烯-11-酮(0.59g，1.4mmol)之甲醇(4.3mL)及四氫呋喃(4.3mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.054g，1.4mmol)後，使於室溫反應60分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.45g，77%)。
(實施例20)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z)-二十八-19-烯-11-基酯(例示化合物1-16)
將參考例25所獲得的(Z)-二十八-19-烯-11-醇(0.45g，1.1mmol)及吡啶(0.55g，6.9mmol)之甲苯(11mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.23g，6.9mmol)之甲苯(1.7mL)溶液。於0℃攪拌30分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(1.2g，12mmol)，使於室溫反應3小時。飽和 重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(530mg，89%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(6H,t,J=6.8Hz),1.21-1.37(38H,m),1.49-1.62(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.6Hz),1.97-2.04(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.6Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.71(1H,m),5.32-5.37(2H,m).
MS(ESI+)m/z 538[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 538.5193(-0.6mDa)。
(參考例26)
十八-9,12,15-三炔-1-醇
於9-癸-1-醇(5.15g，33.4mmol)及1-溴辛-2,5-二炔(已知化合物，6.18g，33.4mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(66mL)溶液中，依序添加碘化鈉(5.56g，37.1mmol)、碳酸鉀(10.2g，74.1mmol)、碘化銅(I)(7.06g，37.1mmol)，使於室溫中反應整夜。藉由Celite®去除不溶物，飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶媒進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(8.40，97%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：.12(3H,t,J=7.6Hz),1.24-1.42(10H,m),1.48(2H,tt,J=7.1,7.6Hz),1.57(2H,tt,J=6.6,7.1Hz),2.12-2.21(4H,m),3.14(2H,s), 3.14(2H,s),3.64(2H,t,J=6.6Hz)。
(參考例27)
十八-9,12,15-三炔酸
於參考例26所獲得的十八-9,12,15-三炔-1-醇(8.40g，32.5mmol)及三乙基胺(16.4g，163mmol)之二甲基亞碸(97mL)溶液中添加三氧化硫-吡啶(12.9g，81.3mmol)，使於室溫反應3小時。水處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓餾除溶媒，使獲得的褐色液體溶解於tert-丁基醇(130mL)及2-甲基-2-丁烯(18mL)，歷經5分鐘滴加磷酸二氫鈉二水合物(11.2g，71.5mmol)及次氯酸鈉(6.47g，71.5mmol)之水(130mL)溶液後，使於室溫反應50分鐘。以水稀釋，經由己烷-乙酸乙酯混合溶媒進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色固體之目的物(6.13g，69%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：1.12(3H,t,J=7.6Hz),1.27-1.41(6H,m),1.48(2H,tt,J=7.1,7.3Hz),1.64(2H,tt,J=7.1,7.6Hz),2.12-2.20(4H,m),2.35(2H,t,J=7.6Hz),3.14(4H,s)。
(參考例28)
N-甲氧基-N-甲基十八-9,12,15-三炔醯胺
於參考例27所獲得的十八-9,12,15-三炔酸(5.13g，18.8mmol)及N,O-二甲基乙醇胺鹽酸鹽(3.67g，37.7mmol)之二氯甲烷(132mL)溶液中，添加1-羥基苯并咪唑水合物(5.77g，37.7mmol)、三乙基胺(3.81g，37.7mmol)、1-乙 基-3-(3’-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(7.22g，37.7mmol)，使於室溫中反應整夜。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(4.00g，67%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：1.12(3H,t,J=7.6Hz),1.29-1.41(6H,m),1.48(2H,tt,J=7.1,7.3Hz),1.63(2H,quint,J=7.3Hz),2.11-2.20(4H,m),2.41(2H,t,J=7.3Hz),3.14(4H,s),3.18(3H,s),3.68(3H,s)。
(參考例29)
二十八-19,22,25-三炔-11-酮
於參考例28所獲得的N-甲氧基-N-甲基十八-9,12,15-三炔醯胺(1.00g，3.17mmol)之四氫呋喃(15mL)溶液中，添加1N溴化n-癸基鎂 四氫呋喃溶液(6.34mL，6.34mmol)後，使於室溫反應1小時，其次於60℃使反應30分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，減壓下去除揮發分，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.40g，32%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.1Hz),1.12(3H,t,J=7.6Hz),1.20-1.39(20H,m),1.47(2H,tt,J=7.1,7.3Hz),1.51-1.59(4H,m),2.12-2.20(4H,m),2.38(4H,t,J=7.6Hz),3.14(4H,s)。
(參考例30)
二十八-19,22,25-三炔-11-醇
於參考例29所獲得的二十八-19,22,25-三炔-11-酮(0.40g，1.0mmol)之甲醇(3.0mL)及四氫呋喃(3.0mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.038g，1.0mmol)後，使於室溫反應60分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.25g，62%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.1Hz),1.12(3H,t,J=7.6Hz),1.21-1.52(30H,m),2.12-2.20(4H,m),3.14(2H,s),3.14(2H,s),3.55-3.60(1H,m)。
(參考例31)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基二十八-19,22,25-三炔-11-基酯
將參考例30所獲得的二十八-19,22,25-三炔-11-醇(0.25g，0.63mmol)及吡啶(0.31g，4.0mmol)之甲苯(6.2mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.13g，0.43mmol)之甲苯(0.9mL)溶液。於0℃攪拌20分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.68g，6.6mmol)，使於室溫反應2.5小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.22g，66%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.1Hz),1.12(3H,t,J=7.6Hz),1.20-1.60(30H,m),1.84(2H,tt, J=6.6,7.6Hz),2.11-2.20(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.6Hz),3.14(4H,s),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.71(1H,m)。
(實施例21)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22Z,25Z)-二十八-19,22,25-三烯-11-基酯(例示化合物1-164)
氫氣環境下，於乙酸鎳(II)四水合物(0.104g，0.417mmol)中添加乙醇(5.0mL)，添加氫化硼鈉(0.015g，0.417mmol)之乙醇(2.5mL)溶液。於室溫攪拌15分鐘後，添加乙二胺(0.100g，1.67mmol)，再攪拌15分鐘。其次歷經1分鐘添加參考例31所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基二十八-19,22,25-三炔-11-基酯(0.220g，0.417mmol)之乙醇(2.5mL)溶液，於室溫氫氣環境下反應整夜。以己烷溶液稀釋，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=6.8Hz),0.98(3H,t,J=7.6Hz),1.20-1.39(26H,m),1.49-1.62(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.3Hz),1.99-2.11(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.3Hz),2.78-2.83(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.71(1H,m),5.28-5.43(6H,m).
MS(ESI+)m/z 534[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 534.4885(-0.1mDa)。
(參考例32)
(9Z,12R)-12-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}十八-9-烯酸甲酯
於篦麻油酸甲酯(ricinoleic acid methyl ester)(16.7g，53.4mmol)及咪唑(7.28g，107mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(53.4mL)溶液中，歷經2分鐘添加氯化tert-丁基(二甲基)矽烷(12.1g，80.2mmol)後，使於室溫中反應整夜。以水處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(23.2g，99%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.03-0.06(6H,m),0.86-0.90(12H,m),1.22-1.45(18H,m),1.62(2H,tt,J=6.8,7.6Hz),2.01(2H,q,J=6.6Hz),2.18(2H,t,J=5.9Hz),2.30(2H,t,J=7.6Hz),3.65(1H,quint,J=5.9Hz),3.67(3H,s),5.33-5.45(2H,m)。
(參考例33)
(5R,7Z,24Z,27R)-5,27-二己基-2,2,3,3,29,29,30,30-八甲基-4,28-二氧-3,29-二矽烷三十-7,24-二烯-16-酮
於參考例32所獲得的(9Z,12R)-12-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}十八-9-烯酸甲酯(12g，28.1mmol)之二甲苯(15mL)溶液中，歷經5分鐘添加經己烷洗淨的氫化鈉(1.37g，64%，36.6mmol)之二甲苯(5mL)懸浮液後，於150℃使反應5.5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒，獲得油狀物質。於此油狀物質中添加四氫呋喃(120mL)及5N氫氧化鈉水溶液(28mL)，並於90℃使反應5.5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾 除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(7.24g，67%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.03-0.06(12H,m),0.86-0.90(24H,m),1.21-1.45(36H,m),1.51-1.59(4H,m),2.01(4H,q,J=6.6Hz),2.18(4H,t,J=5.9Hz),2.38(4H,t,J=7.6Hz),3.65(2H,quint,J=5.9Hz),5.32-5.46(4H,m)。
(參考例34)
(5R,7Z,24Z,27R)-5,27-二己基-2,2,3,3,29,29,30,30-八甲基-4,28-二氧-3,29-二矽烷三十-7,24-二烯-16-醇
於參考例33所獲得的(5R,7Z,24Z,27R)-5,27-二己基-2,2,3,3,29,29,30,30-八甲基-4,28-二氧-3,29-二矽烷三十-7,24-二烯-16-酮(5.5g，7.2mmol)之甲醇(22mL)及四氫呋喃(22mL)溶液中，歷經2分鐘添加氫化硼鈉(0.27g，7.2mmol)後，使於室溫反應3小時。飽和氯化銨水溶液處理後，減壓下去除揮發分，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(5.0g，91%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.03-0.05(12H,m),0.86-0.90(24H,m),1.22-1.47(44H,m),2.01(4H,q,J=6.6Hz),2.18(4H,t,J=5.9Hz),3.55-3.61(1H,m),3.65(2H,quint,J=5.9Hz),5.34-5.46(4H,m)。
(參考例35)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(5R,7Z,24Z,27R)-5,27-二己基-2,2,3,3,29,29,30,30-八甲基-4,28-二氧-3,29-二矽烷 三十-7,24-二烯-16-基酯
於參考例34所獲得的(5R,7Z,24Z,27R)-5,27-二己基-2,2,3,3,29,29,30,30-八甲基-4,28-二氧-3,29-二矽烷三十-7,24-二烯-16-醇(1.00g，1.31mmol)及吡啶(0.651g，8.23mmol)之甲苯(13.1mL)溶液中，歷經1分鐘添加三光氣(0.268g，0.690mmol)之甲苯(1.96mL)溶液。於室溫攪拌2小時後，添加3-二甲基胺基-1-丙醇(1.42g，13.7mmol)，使於室溫反應3小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(1.15g，98%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.03-0.05(12H,m),0.88(6H,t,J=6.8Hz),0.89(18H,s),1.21-1.46(40H,m),1.49-1.62(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.8,7.3Hz),2.01(4H,q,J=6.6Hz),2.18(4H,t,J=5.9Hz),2.22(2H,t,J=7.3Hz),3.65(2H,quint,J=5.9Hz),4.17(2H,t,J=6.8Hz),4.65-4.71(1H,m),5.33-5.46(4H,m)。
(實施例22)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(7R,9Z,26Z,29R)-7,29-二羥基三十五-9,26-二烯-18-基酯(例示化合物1-308)
於參考例35所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(5R,7Z,24Z,27R)-5,27-二己基-2,2,3,3,29,29,30,30-八甲基-4,28-二氧-3,29-二矽烷三十-7,24-二烯-16-基酯(1.15g，1.29mmol)中，添加1N氟化四n-丁基銨 四氫呋喃溶液(19.3mL，19.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳 酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.56g，65%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(6H,t,J=6.8Hz),1.23-1.38(36H,m),1.40-1.50(4H,m),1.50-1.62(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.8,7.3Hz),2.04(4H,q,J=7.1Hz),2.21(4H,t,J=7.1Hz),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.3Hz),3.57-3.64(2H,m),4.17(2H,t,J=6.8Hz),4.65-4.71(1H,m),5.37-5.44(1H,m),5.54-5.58(1H,m)。
(實施例23)
二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五-9,26-二烯-7,29-二基酯(例示化合物1-233)
於實施例22所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(7R,9Z,26Z,29R)-7,29-二羥基三十五-9,26-二烯-18-基酯(0.15g，0.23mmol)及吡啶(0.36g，4.5mmol)之二氯甲烷(4.5mL)溶液中，添加氯乙酸(0.18g，2.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(155mg，92%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.22-1.38(40H,m),1.49-1.63(8H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.3Hz),1.98-2.05(10H,m),2.22(6H,s),2.24-2.33(4H,m),2.36(2H,t,J=7.3Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.71 (1H,m),4.87(2H,quint,J=6.3Hz),5.29-5.36(2H,m),5.44-5.50(2H,m).
MS(ESI+)m/z 750[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 750.6247(-0.1mDa)。
(實施例24)
碳酸(7R,9Z,26Z,29R)-7,29-二己基-2,5-二側氧基-1,6-二氧環二十九-9,26-二烯-18-基3-(二甲基胺基)丙基酯(例示化合物1-319)
於實施例22所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(7R,9Z,26Z,29R)-7,29-二羥基三十五-9,26-二烯-18-基酯(1.19g，1.72mmol)及吡啶(1.13g，14.3mmol)之二氯甲烷(40mL)溶液中，歷經1.5小時滴加氯琥珀酸(0.186g，1.20mmol)之二氯甲烷(13mL)溶液，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(20mg，1%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.88(6H,t,J=6.6Hz),1.21-1.39(40H,m),1.51-1.63(8H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.3Hz),1.98-2.07(4H,m),2.22(6H,s),2.28(2H,t,J=7.1Hz),2.32(2H,t,J=7.3Hz),2.36(2H,t,J=7.6Hz),2.60(4H,s),4.17(2H,t,J=6.6Hz),4.68(1H,quint,J=6.1Hz),4.86-4.92(2H,m),5.29-5.36(2H,m),5.43-5.50(2H,m).
MS(ESI+)m/z 748[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 748.6091(0.0mDa)。
(參考例36)
(11Z,14Z)-N-甲氧基-N-甲基二十-11,14-二烯醯胺
於(11Z,14Z)-二十-11,14-二烯酸(Chem.Lett.1998，2,175記載、化合物3,4.45g，14.4mmol)及N,O-二甲基乙醇胺鹽酸鹽(2.87g，28.9mmol)之二氯甲烷(71mL)溶液中，添加1-羥基苯并咪唑水合物(3.90g，28.9mmol)、三乙基胺(2.95g，28.9mmol)、1-乙基-3-(3’-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(5.53g，28.9mmol)，使於室溫中反應整夜。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(5.00g，99%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.0Hz),1.24-1.40(18H,m),1.62(2H,quint,J=7.4Hz),2.02-2.07(4H,m),2.41(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.18(3H,s),3.68(3H,s),5.29-5.43(4H,m)。
(參考例37)
(21Z,24Z)-三十-21,24-二烯-11-醇
於參考例36所獲得的(11Z,14Z)-N-甲氧基-N-甲基二十-11,14-二烯醯胺(0.50g，1.4mmol)之四氫呋喃(6.3mL)溶液中，歷經3分鐘滴加1N溴化n-癸基鎂 二乙基醚溶液(4.3mL，4.3mmol)後，使於室溫反應1.5小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，進行矽膠管柱層析，獲得的油狀物質於甲醇(5.4mL)及四氫呋喃 (5.4mL)溶液，添加氫化硼鈉(0.05g，1.3mmol)後，使於室溫反應30分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。藉由於減壓下餾除溶媒，獲得含目的物的混合物。
(實施例25)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(21Z,24Z)-三十-21,24-二烯-11-基酯(例示化合物1-444)
於參考例37所獲得的(21Z,24Z)-三十-21,24-二烯-11-醇(0.15g，0.35mmol)及吡啶(0.17g，2.18mmol)之甲苯(0.7mL)溶液中，歷經2分鐘添加三光氣(0.07g，0.25mmol)之甲苯(0.29mL)溶液。於室溫攪拌2小時後，添加3-二甲基胺基1-丙醇(0.37g，3.6mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(100mg，51%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.21-1.40(36H,m),1.49-1.61(4H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.6Hz),2.01-2.08(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.6Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.65-4.72(1H,m),5.29-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 564[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 564.5352(-0.4mDa)。
(實施例26)
碳酸(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-基3-(吡咯 啶-1-基)丙基酯(例示化合物1-77)
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.200g，0.492mmol)及吡啶(0.245g，3.10mmol)之甲苯(4.9mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.101g，0.339mmol)之甲苯(0.74mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-(吡咯啶-1-基)丙-1-醇(0.667g，5.16mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(127mg，46%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=6.7Hz),0.89(3H,t,J=6.7Hz),1.20-1.40(32H,m),1.48-1.64(4H,m),1.74-1.81(4H,m),1.90(2H,tt,J=6.7,7.4Hz),2.01-2.09(4H,m),2.45-2.54(4H,m),2.53(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.7Hz),4.19(2H,t,J=6.7Hz),4.70(1H,tt,J=5.5,7.0Hz),5.28-5.43(4H,m).
MS(ESI+)m/z 562[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 562.5203(0.4mDa)。
(參考例38)
(19Z,22R)-22-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}二十八-19-烯-11-酮
於參考例32所獲得的(9Z,12R)-12-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}十八-9-烯酸甲酯(2.00g，4.69mmol)及十一酸甲酯(2.82g，14.1mmol)之二甲苯(20mL)溶液中，歷經 5分鐘添加經己烷洗淨的氫化鈉(0.879g，64%，23.4mmol)之二甲苯(8mL)懸浮液後，於150℃使反應6.5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒，獲得油狀物質。於此油狀物質中添加四氫呋喃(94mL)及5N氫氧化鈉水溶液(23mL)，於90℃使反應5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得含目的物的液體(3.41g，含不純物)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.03-0.05(6H,m),0.85-0.91(15H,m),1.21-1.44(36H,m),1.50-1.60(4H,m),1.97-2.04(2H,m),2.18(2H,t,J=6.3Hz),2.38(4H,t,J=7.4Hz),3.61-3.68(1H,m),5.33-5.46(2H,m)。
(參考例39)
(19Z,22R)-22-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}二十八-19-烯-11-醇
於含參考例38所獲得的(19Z,22R)-22-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}二十八-19-烯-11-酮的混合物(3.41g))之甲醇(24mL)及四氫呋喃(24mL)溶液中，歷經2分鐘添加氫化硼鈉(0.30g，8.0mmol)後，使於室溫反應1.5小時。飽和氯化銨水溶液處理後，減壓下去除揮發分，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得含目的物的液體(3.54g，含不純物)。
(參考例40)
碳酸(19Z,22R)-22-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}二十八-19-烯-11基3-(二甲基胺基)丙基酯
將含參考例39所獲得的(19Z,22R)-22-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}二十八-19-烯-11-醇的混合物(3.54g)及吡啶(4.00g，50.6mmol)之甲苯(78.8mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(1.62g，5.45mmol)之甲苯(11.8mL)溶液。於0℃攪拌30分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(8.81g，85.4mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得含目的物的液體(2.58g，含不純物)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.03-0.06(6H,m),0.85-0.91(15H,m),1.23-1.64(40H,m),1.84(2H,tt,J=6.7,7.4Hz),1.97-2.04(2H,m),2.15-2.20(2H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),3.61-3.68(1H,m),4.17(2H,t,J=6.7Hz),4.69(1H,tt,J=5.5,7.0Hz),5.32-5.46(2H,m)。
(實施例27)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-基酯(例示化合物1-298)
於含參考例40所獲得的碳酸(19Z,22R)-22-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}二十八-19-烯-11基3-(二甲基胺基)丙基酯的混合物(2.58g，)中，添加1N氟化四n-丁基銨四氫呋喃溶液(23.2mL，23.2mmol)，使於室溫中反應整 夜。水處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.500g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=6.7Hz),0.89(3H,t,J=6.7Hz),1.20-1.38(28H,m),1.40-1.62(8H,m),1.84(2H,tt,J=6.7,7.4Hz),2.01-2.08(2H,m),2.18-2.23(2H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),3.61(1H,tt,J=5.3,5.9Hz),4.18(2H,t,J=6.7Hz),4.69(1H,tt,J=5.5,6.3Hz),5.36-5.45(1H,m),5.52-5.60(1H,m).
MS(ESI+)m/z 554[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 554.5146(-0.2mDa)。
(實施例28)
乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八-9-烯-7-基酯(例示化合物1-212)
於實施例27所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-基酯(0.20g，0.36mmol)及吡啶(0.57g，7.2mmol)之二氯甲烷(7.2mL)溶液中，添加氯乙酸(0.28g，3.6mmol)，使於室溫反應3小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(42mg，20%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=6.7Hz),0.89(3H,t,J=6.7Hz),1.20-1.37(32H,m),1.48-1.61(4H, m),1.85(2H,tt,J=6.7,7.4Hz),1.97-2.02(2H,m),2.03(3H,s),2.22(6H,s),2.28(2H,dd,J=6.3,7.0Hz),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.18(2H,t,J=6.7Hz),4.69(1H,tt,J=5.5,6.3Hz),4.87(1H,quint,J=6.3Hz),5.32(1H,dtt,J=11.0,1.6,7.0Hz),5.47(dtt,J=11.0,1.6,7.0Hz).
MS(ESI+)m/z 596[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 596.5269(1.5mDa)。
(參考例41)
1,15-雙[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十五-8-酮
於8-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]辛酸甲酯(Bioorg.Med.Chem.Lett.2003,13,1037記載、化合物6之中間體，1.50g，4.48mmol)之二甲苯(6.0mL)溶液中，歷經2分鐘添加經己烷洗淨的氫化鈉(0.219g，64%，5.83mmol)之二甲苯(0.7mL)懸浮液後，於150℃使反應5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒，獲得油狀物質。於此油狀物質中添加四氫呋喃(22.4mL)及5N氫氧化鈉水溶液(5.4mL)，於90℃使反應5小時。冷卻至室溫後，以水處理，藉由己烷-乙酸乙酯混合溶液進行提取。獲得的有機層以無水硫酸鎂使乾燥，減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.294g，23%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.17)(6H,m),0.57-1.61(60H,m),2.38(4H,t,J=7.4Hz)。
(參考例42)
1,15-雙[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十五-8-醇
於參考例41所獲得的1,15-雙[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十五-8-酮(0.29g，0.51mmol)之甲醇(1.5mL)及四氫呋喃(1.5mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.019g，0.51mmol)後，使於室溫反應90分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.23g，78%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.16)(6H,m),0.57-1.60(64H,m),3.54-3.63(1H,m)。
(實施例29)
碳酸1,15-雙[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十五-8-基3-二甲基胺基丙基酯(例示化合物1-200)
將參考例42所獲得的1,15-雙[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十五-8-醇(0.13g，0.22mmol)及吡啶(0.11g，1.4mmol)之甲苯(2.2mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.046g，0.15mmol)之甲苯(0.34mL)溶液的溶液，於0℃攪拌20分鐘後，升溫至室溫並攪拌40分鐘，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.24g，2.4mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層 以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(150mg，94%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.16)(6H,m),0.56-1.66(64H,m),1.84(2H,tt,J=6.7,7.4Hz),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.17(2H,t,J=6.7Hz),4.70(1H,tt,J=5.5,7.0Hz).
MS(ESI+)m/z 710[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 710.6463(1.2mDa)。
(參考例43)
8-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]-N-甲氧基-N-甲基辛醯胺
於8-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]辛酸甲酯(Bioorg.Med.Chem.Lett.2003,13,1037記載、化合物6，3.00g，9.36mmol)及N,O-二甲基乙醇胺鹽酸鹽(1.83g，18.7mmol)之二氯甲烷(65.5mL)溶液中，添加1-羥基苯并咪唑水合物(2.87g，18.7mmol)、三乙基胺(1.89g，18.7mmol)、1-乙基-3-(3’-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(3.59g，18.7mmol)，使於室溫中反應整夜。水處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(3.08g，91%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.17)(3H,m),0.57-1.56(28H,m),1.57-1.67(2H,m),2.41(2H,t,J=7.4Hz),3.18(3H,s),3.68(3H,s)。
(參考例44)
1-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十八-8-酮
將參考例43所獲得的8-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]-N-甲氧基-N-甲基辛醯胺(2.00g，5.50mmol)之四氫呋喃(24.5mL)溶液，於水浴冷卻至15℃，歷經15分鐘滴加1N溴化n-癸基鎂 四氫呋喃溶液(8.25mL，8.25mmol)後，使於室溫反應整夜。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(1.56g，64%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.17)(3H,m),0.57-1.62(49H,m),2.38(4H,t,J=7.4Hz)。
(參考例45)
1-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十八-8-醇
於參考例44所獲得的1-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十八-8-酮(1.56g，3.51mmol)之甲醇(10.5mL)及四氫呋喃(10.5mL)溶液中，添加氫化硼鈉(0.133g，3.51mmol)後，使於室溫反應90分鐘。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(1.50g，96%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.17)(3H,m),0.57-1.56(53H,m),3.54-3.62(1H,m)。
(實施例30)
碳酸3-二甲基胺基丙基1-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十八-8-基酯(例示化合物1-188)
將參考例45所獲得的1-[2-({2-[(2-乙基環丙基)甲基]環丙基}甲基)環丙基]十八-8-醇(0.25g，0.56mmol)及吡啶(0.28g，3.5mmol)之甲苯(5.6mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.12g，0.39mmol)之甲苯(0.84mL)溶液，於0℃攪拌20分鐘後，升溫至室溫並攪拌40分鐘，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.61g，5.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(155mg，48%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.16)(3H,m),0.57-1.65(53H,m),1.84(2H,tt,J=6.7,7.4Hz),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.18(2H,t,J=6.7Hz),4.67(1H,tt,J=5.5,7.0Hz).
MS(ESI+)m/z 576[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 576.5367(1.1mDa)。
(實施例31)封入雙股多核苷酸的核酸脂質粒子之調製
將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：以下記載為DSPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下記載為Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、實施例1、2、3、或8記載之化合物(作為LP)、及N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基 ]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(以下記載為PEG-C-DMA)，以DSPC：Chol：LP：PEG-C-DMA=20：48：30：2之莫耳比於90%乙醇中，調製成為總脂質濃度25mM的脂質溶液。
將國際公開第2010/001909號小冊實施例45及實施例51記載之多核苷酸CT-157：HO-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列識別號2)(包含與人類β-連鎖蛋白基因(GenBank accession No.NM_001904.3)之核苷酸編號3139-3157互補的序列的多核苷酸)及多核苷酸CT-169：HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1t-H(序列表之序列識別號1)(包含人類β-連鎖蛋白基因(GenBank accession No.NM_001904.3)之核苷酸編號3139-3156之序列)使用DNA合成機來合成，置入各300pmol之1個試管，減壓下乾燥，添加30μL之siRNA懸浮緩衝液(QIAGEN)，於65℃加熱1分鐘後，於室溫放置5分鐘，使退火(annealing)，獲得10μM之雙股多核苷酸溶液，之後以檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)，調製為1mg/mL而獲得雙股多核苷酸溶液。將上述之脂質溶液與雙股多核苷酸溶液加熱至37℃，將各100μL混合，接著，添加檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，300mM NaCl，pH6.0)200μL，藉由於37℃培育30分鐘，獲得核酸脂質粒子之分散液。 核酸脂質粒子之分散液藉由以約100mL之磷酸緩衝液(pH7.4)透析12-18小時(Float-A-Lyzer G2，MWCO：100kD，Spectra/Por)，進行乙醇去除及由於中和而未封入的雙股多核苷酸的去除，獲得封入siRNA的包含實施例1、2、3、或8記載之化合物的核酸脂質粒子之純化的分散液。作為對照檢體，使用參考例2記載之化合物、及WO2012/054365記載的化合物1(Compound 1)。
(實施例32)雙股多核苷酸封入核酸脂質粒子之特性評價
進行包含實施例31所調製的核酸脂質粒子的分散液之特性評價。說明各自之特性評價之方法。
(1)平均粒徑
脂質體之粒徑係以Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)來測定。表中之平均粒徑係表示體積平均粒徑，±以下表示偏差。
(2)雙股多核苷酸之封入率
雙股多核苷酸之封入率係使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit(Invitrogen)，依據所附說明書來測定。
即，於0.015% Triton X-100界面活性劑存在下及非存在下，定量核酸脂質粒子之分散液中之雙股多核苷酸，藉由下式算出封入率。
{[界面活性劑存在下的雙股多核苷酸量]-[界面活性劑非存在下的雙股多核苷酸量]}/[界面活性劑存在下的雙股多核苷酸量]}x100(%)
(3)雙股多核苷酸與脂質之比率
核酸脂質粒子之分散液與乙腈、氯仿以1：1：1之比率混合，以15,000rpm離心2分鐘後，回收上層之水層，提取雙股多核苷酸。試料中之雙股多核苷酸量以離子交換層析來測定(System：Agilent 1100series，Column：TSKgel DEAE-2SW(2.6×150mm)(TOSOH股份有限公司)，緩衝液A：20%乙腈，緩衝液B：20%乙腈，1.6M甲酸銨，梯度(B%)：30-55%(0-20分鐘)，流速：1mL/分鐘，溫度：40℃，偵測：260nm)。
核酸脂質粒子之分散液中之磷脂質量使用磷脂質C-Test Wako(和光純藥工業股份有限公司)，依據所附說明書來測定。即，於1% Triton X-100界面活性劑存在下，定量試料中之磷脂質。
核酸脂質粒子之分散液中之膽固醇及LP量以逆相層析來測定(系統：Agilent 1100series，管柱：Chromolith Performance RP-18 endcapped 100-3 monolithic HPLC-column(Merck)，緩衝液A：0.01%三氟乙酸，緩衝液B：0.01%三氟乙酸，甲醇，梯度(B%)：87-92%(0-10分鐘)，流速：2mL/分鐘，溫度：50℃，偵測：205nm)。
由磷脂質量與構成脂質體的脂質成分之組成比，算出總脂質量，由上述之多核苷酸量及總脂質量，藉由下式算出多核苷酸與脂質之比率。
[雙股多核苷酸濃度]/[總脂質濃度](wt/wt)
結果示於表3。
由磷脂質量、膽固醇量、及LP量與構成脂質體的脂質成分之組成比，算出總脂質量，由上述之多核苷酸量及總脂質量，藉由下式算出多核苷酸與脂質之比率。
[雙股多核苷酸濃度]/[總脂質濃度](wt/wt)
結果示於表4。
由以上之結果可知，雙股多核苷酸被封入脂質粒子內，彼等之核酸脂質粒子係具有約100nm至約300nm之平均粒徑。
(試驗例1)
如以下，比較使用的新穎脂質而調製的核酸脂質粒子獲得的人類β-連鎖蛋白基因表現抑制活性的強度。
(1)轉染
將人類大腸癌SW480細胞株(來自人類大腸腺癌)，於含10%胎牛血清的RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)(培養培養基)中，調製為50,000個細胞/mL之濃度。而且，於96孔平底盤(Falcon公司製)各播種100μL，於37℃、5.0%碳酸氣體下培養1日。將含實施例31所調製的核酸脂 質粒子之分散液以培養培養基使於培養基中成為最終雙股多核苷酸濃度為30、3.0、0.3、及0.03nM的方式製作稀釋列後，添加於去除培養上清液的細胞，再繼續培養3日。對於各濃度以N=3進行。
(2)即時PCR
自經轉染的細胞，即時PCR測定用之溶菌液(lysate)及cDNA係使用TaqMan(註冊商標)Fast-Cells-to-Ct kit(Ambion公司)，依據說明書之記載來調製。溶菌液調製時係使用添加DNase I的胞溶溶液(Lysis Solution)。即時PCR用之探針係人類β-連鎖蛋白基因用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Assays(CTNNB1、FAM probe)(Hs00355045_m1、Applied Biosystems公司製)，使用人類-GAPDH基因探針作為內部標準(VIC probe、Hs99999905_m1、Applied Biosystems公司製)。384孔PCR盤(Applied Biosystems公司製)每1孔，添加5μL之TaqMan(註冊商標)Fast Advanced Master Mix、2μL之無RNase水、0.5μL之各基因探針、2μL之調製的cDNA溶液，總量為10μL，設置於ViiATM7 Real-time PCR system(Applied Biosystem公司製)，以下列條件實施PCR。即時PCR係對自溶菌液調製的cDNA以N=4來實施。
PCR初期活性化 95℃、20秒
PCR 95℃、1秒
62℃、20秒
此PCR循環係重複40次。
(3)即時PCR解析
定量解析係以△△Ct法來進行。求得由各經轉染的人類β-連鎖蛋白與人類GAPDH之Ct值的差(△Ct)減去未處理細胞(=NC)之△Ct的值(△△Ct)，相對於NC的相對值(RQ)係以下列式算出。
RQ=2-△△Ct
RQ=1作為抑制率0%、RQ=0作為理論上之抑制率100%，核酸脂質粒子之IC50值使用GraphPad PRISM(GraphPad Software Inc.)來算出。其結果，如表5所示，含實施例1、2及3之化合物的核酸脂質粒子與含成為對照的參考例2之脂質的核酸脂質粒子比較，顯示強的β-連鎖蛋白基因表現之抑制活性。據此可知，實施例1、2及3之化合物係有用於調製顯示強活性的核酸脂質粒子的有益的新穎脂質。
(試驗例2)
如以下，比較使用的新穎脂質所調製的核酸脂質粒子所獲的人類β-連鎖蛋白基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類肝臟癌HepG2細胞株(來自人類肝臟癌)，於含10%胎牛血清的DMEM培養基(Invitrogen公司製)(培養培 養基)中調製為50000個細胞/mL之濃度。而且，於96孔平底盤(Falcon公司製)個播種100μL，於37℃、5.0%碳酸氣體下培養1日。將含實施例31所調製的核酸脂質粒子之分散液以培養培養基使於培養基中成為最終雙股多核苷酸濃度為30、3.0、0.3、及0.03nM的方式製作稀釋列後，添加於去除培養上清液的細胞，再繼續培養3日。對於各濃度以N=3進行。
(2)即時PCR
自經轉染的細胞，即時PCR測定用之溶菌液及cDNA係使用TaqMan(註冊商標)Fast-Cells-to-Ct kit(Ambion公司)，依據說明書之記載來調製。溶菌液調製時係使用添加DNase I的胞溶溶液。即時PCR用之探針係人類β-連鎖蛋白基因用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Assays(CTNNB1、FAM probe)(Hs00355045_m1、Applied Biosystems公司製)，使用人類-GAPDH基因探針作為內部標準(VIC probe、Hs99999905_m1、Applied Biosystems公司製)。384孔PCR盤(Applied Biosystems公司製)每1孔，添加5μL之TaqMan(註冊商標)Fast Advanced Master Mix、2μL之無RNase水、0.5μL之各基因探針、2μL之調製的cDNA溶液，總量為10μL，設置於ViiATM7 Real-time PCR system(Applied Biosystem公司製)，以下列條件實施PCR。即時PCR係對自溶菌液調製的cDNA以N=4來實施。
PCR初期活性化95℃、20秒
PCR 95℃、1秒
62℃、20秒
此PCR循環係重複40次。
(3)即時PCR解析
定量解析係以△△Ct法來進行。求得由各經轉染的人類β-連鎖蛋白與人類GAPDH之Ct值的差(△Ct)減去未處理細胞(=NC)之△Ct的值(△△Ct)，相對於NC的相對值(RQ)係以下列式算出。
RQ=2-△△Ct
RQ=1作為抑制率0%、RQ=0作為理論上之抑制率100%，核酸脂質粒子之IC50值使用GraphPad PRISM(GraphPad Software Inc.)來算出。其結果，如表6所示，含實施例1、2及3之化合物的核酸脂質粒子與含成為對照的參考例2之脂質的核酸脂質粒子比較，顯示強的β-連鎖蛋白基因表現之抑制活性。據此可知，實施例1、2及3之化合物係有用於調製顯示強活性的核酸脂質粒子的有益的新穎脂質。
(試驗例3)
如以下，比較使用的新穎脂質所調製的核酸脂質粒子所獲的人類β-連鎖蛋白基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類大腸癌SW480細胞株(來自人類大腸腺癌)，於含10%胎牛血清的RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)(培養培養基)中調製為50000個細胞/mL之濃度。而且，於96孔平底盤(Falcon公司製)個播種100μL，於37℃、5.0%碳酸氣體下培養1日。將含實施例31所調製的核酸脂質粒子之分散液以培養培養基使於培養基中成為最終雙股多核苷酸濃度為30、3.0、0.3、及0.03nM的方式製作稀釋列後，添加於去除培養上清液的細胞，再繼續培養4小時。對於各濃度以N=3進行。
(2)即時PCR
自經轉染的細胞，即時PCR測定用之溶菌液及cDNA係使用TaqMan(註冊商標)Fast-Cells-to-Ct kit(Ambion公司)，依據說明書之記載來調製。溶菌液調製時係使用添加DNase I的胞溶溶液。即時PCR用之探針係人類β-連鎖蛋白基因用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Assays(CTNNB1、FAM probe)(Hs00355045_m1、Applied Biosystems公司製)，使用人類-GAPDH基因探針作為內部標準(VIC probe、Hs99999905_m1、Applied Biosystems公司製)。384孔PCR盤(Applied Biosystems公司製)每1孔，添加5μL之TaqMan(註冊商標)Fast Advanced Master Mix、2μL之無RNase水、0.5μL之各基因探針、2μL之調製的cDNA溶液，總量為10μL，設置於ViiATM7 Real-time PCR system(Applied Biosystem公司製)，以下列條件實施PCR。即時PCR係對自溶菌液調製的cDNA以N=4來實施。
PCR初期活性化95℃、20秒
PCR 95℃、1秒
62℃、20秒
此PCR循環係重複40次。
(3)即時PCR解析
定量解析係以△△Ct法來進行。求得由各經轉染的人類β-連鎖蛋白與人類GAPDH之Ct值的差(△Ct)減去未處理細胞(=NC)之△Ct的值(△△Ct)，相對於NC的相對值(RQ)係以下列式算出。
RQ=2-△△Ct
RQ=1作為抑制率0%、RQ=0作為理論上之抑制率100%，核酸脂質粒子之IC50值使用GraphPad PRISM(GraphPad Software Inc.)來算出。其結果，如表7所示，含實施例8之化合物的核酸脂質粒子與含成為對照的脂質化合物1的核酸脂質粒子比較，顯示強的β-連鎖蛋白基因表現之抑制活性。據此可知，實施例8之化合物係有用於調製顯示強活性的核酸脂質粒子的有益的新穎脂質。
(試驗例4)
如以下，比較使用的新穎脂質所調製的核酸脂質粒子所獲的人類β-連鎖蛋白基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類子宮頸部癌Hela細胞株(來自人類子宮頸部癌)於含10%胎牛血清的DMEM培養基(Invitrogen公司製)(培養培養基)中調製為50000個細胞/mL之濃度。而且，於96孔平底盤(Falcon公司製)個播種100μL，於37℃、5.0%碳酸氣體下培養1日。將含實施例31所調製的核酸脂質粒子之分散液以培養培養基使於培養基中成為最終雙股多核苷酸濃度為30、3.0、0.3、及0.03nM的方式製作稀釋列後，添加於去除培養上清液的細胞，再繼續培養4小時。對於各濃度以N=3進行。
(2)即時PCR
自經轉染的細胞，即時PCR測定用之溶菌液及cDNA係使用TaqMan(註冊商標)Fast-Cells-to-Ct kit(Ambion公司)，依據說明書之記載來調製。溶菌液調製時係使用添加DNase I的胞溶溶液。即時PCR用之探針係人類β-連鎖蛋白基因用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Assays(CTNNB1、FAM probe)(Hs00355045_m1、Applied Biosystems公司製)，使用人類-GAPDH基因探針作為內部標準(VIC probe、Hs99999905_m1、Applied Biosystems公司製)。384孔PCR盤(Applied Biosystems公司製)每1孔，添加5μL之TaqMan(註冊商標)Fast Advanced Master Mix、2μL之無RNase水、0.5μL之各基因探針、2μL之調製的cDNA溶液，總量為10μL，設置於ViiATM7 Real-time PCR system(Applied Biosystem公司製)，以下列條件實施PCR。即時PCR係對自溶菌液調製的cDNA以N=4來實施。
PCR初期活性化95℃、20秒
PCR 95℃、1秒
62℃、20秒
此PCR循環係重複40次。
(3)即時PCR解析
定量解析係以△△Ct法來進行。求得由各經轉染的人類β-連鎖蛋白與人類GAPDH之Ct值的差(△Ct)減去未處理細胞(=NC)之△Ct的值(△△Ct)，相對於NC的相對值(RQ)係以下列式算出。
RQ=2-△△Ct
RQ=1作為抑制率0%、RQ=0作為理論上之抑制率100%，核酸脂質粒子之IC50值使用GraphPad PRISM(GraphPad Software Inc.)來算出。其結果，如表8所示，含實施例8之化合物的核酸脂質粒子與含成為對照的脂質化合物1的核酸脂質粒子比較，顯示強的β-連鎖蛋白基因表現之抑制活性。據此可知，實施例8之化合物係有用於調製顯示強活性的核酸脂質粒子的有益的新穎脂質。
(試驗例5)Hep3B細胞(人類肝臟癌細胞)中的實施例化合物之細胞增殖抑制活性之測定
使用MEM(Invitrogen公司製)(含有10%胎牛血清(Hyclone公司製)、1mM丙酮酸鈉(Invitrogen公司製)及1x 非必需胺基酸(Invitrogen公司製))作為培養基，以一定密度將人類肝臟癌細胞株Hep3B細胞配置於96孔盤(150μL/孔)，其次於37℃、5%CO2培養24小時。於各孔追加含實施例31所調製的核酸脂質粒子的分散液使最終濃度為0.01、0.03、0.1、0.3、1及3μM，其次培養72小時(3日)。72小時(3日)培養後，使用MTT試驗，測定實施例化合物之細胞增殖抑制活性。即，於各孔追加20μL之MTT溶液(以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)作成5mg/mL)，於37℃、5%CO2培養4小時。去除培養上清液後，於各孔追加DMSO(150μL)，震盪5分鐘。平盤之吸光度(540nm)以平盤讀數機(SpectraMaxPlus384、Molecular Devices Corporation製)來測定。決定化合物投予組之生存細胞數與未處理細胞群之生存細胞數之相對比率，之後進行抑制50%細胞增殖的IC50濃度之計算。
(試驗例6)實施例化合物之活體內抗腫瘤試驗
1週的馴化飼育後，將1×107個培養的人類Hep3B細胞移植於裸鼠之側腹部皮下。腫瘤移植約2週後，將腫瘤體積作為指標來分組，將含實施例31所調製的核酸脂質粒子的分散液(成為1或3mg/kg等的方式來投予)以每週2次至3次於小鼠尾靜脈內投予。對照組則投予PBS。進行腫瘤徑之測定，觀察腫瘤體積之推移。
於驗證活體內削減(knock down)作用的情形，於投予次日，自擔癌小鼠採取腫瘤塊，使用QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN公司製)及氯仿而提取核酸後，依據 RNeasy mini kit(QIAGEN公司製)所附的說明書，將全RNA純化。使用此等，藉由TaqmanPCR將標的分子之mRNA定量。
(實施例33)封入雙股多核苷酸的核酸脂質粒子之調製
將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：以下記載為DSPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下記載為Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、實施例8記載之化合物(作為LP)、及N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(以下記載為PEG-C-DMA)，以表9記載之莫耳比，於乙醇中，調製為總脂質濃度成為26.8mM的脂質溶液。
將Nature Biotechnology(2008)26、561-569記載的雙股多核苷酸(siFVII：抗小鼠VII因子的siRNA)，使用含30%乙醇的檸檬酸緩衝液(10mM Citrate Buffer，pH4.0)，調製為1mg/mL，而獲得雙股多核苷酸溶液。
將上述之脂質溶液、雙股多核苷酸溶液、及檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)加熱至37℃。使脂質溶液與檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)之體積比成為3：7的方式，於檸檬酸緩衝液中滴加脂質溶液而混合，獲得脂質體粗分散液。接著，使來自LP的氮原子(N)與來自雙股多核苷酸的磷原子(P)之比率(N/P)成為3的方式，將上述脂質體粗分散液滴入雙股多核苷酸溶液並混合，藉由於37℃培育30分鐘，獲得核酸脂質粒子 之分散液。藉由將核酸脂質粒子之分散液以約100mL之磷酸緩衝液(pH7.4)透析12-18小時(Float-A-Lyzer G2，MWCO：100kD，Spectra/Por)，進行乙醇去除及因中和而未封入的雙股多核苷酸之去除，獲得由雙股多核苷酸、表9記載之脂質而成的核酸脂質粒子之經純化的分散液。
(實施例34)雙股多核苷酸封入核酸脂質粒子之特性評價
進行實施例33所調製的核酸脂質粒子之分散液之特性評價。以實施例32記載之方法進行特性評價，將實施 例33記載之核酸脂質粒子之多核苷酸封入率、多核苷酸與脂質之重量比、及平均粒徑示於表10、表11、及表12。
由以上之結果可知，雙股多核苷酸被封入脂質粒子內，彼等之核酸脂質粒子係具有約80nm至約300nm之平均粒徑。
(試驗例7)VII因子(FVII)蛋白質測定
VII因子蛋白質測定係依據Nature Biotechnology(2010)28,172-176記載的方法。將C57BL6/J小鼠(雄‧9週齡)隨機分組(n=4)。將實施例33所調製的核酸脂質粒子之分散液成為0.3mg/kg的方式於尾靜脈注射。投予1日後自尾靜脈進行約50μL之採血，而獲得血漿。使用獲得的血漿，使用Biophen FVII assay kit(Aniara製)，依據所附說明書來測定VII因子蛋白質量。
收集等量之PBS投予組之各個體的血漿樣品的FVII量作為100%，各個體之血漿樣品的FVII量之相對比率(%)作為測定值(A)。自PBS投予組之各個體之測定值求得彼等之平均值(B)。由式A/Bx100(%)求得各個體之測定值(A)之相對比率，各核酸脂質粒子投予組之相對比率之平均值示於表13、表14、及表15。其結果，如表13、表14、及表15所示，實施例33所調製的粒子1至8、粒子12至17、粒子20至24、粒子26、及粒子27的核酸脂質粒子係顯示強的FVII抑制活性。據此可知，具有如粒子1至8、粒子12至17、粒子20至24、粒子26、及粒子27的脂質組成的核酸脂質粒子係有益於作為能抑制基因表現的核酸脂質粒子。
(參考例46)
碳酸3-溴丙基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯
將參考例17所獲得的(19Z,22Z)-二十八-19,22-二烯-11-醇(0.55g，1.4mmol)及吡啶(0.67g，8.5mmol)之甲苯(14mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.28g，0.93mmol)之甲苯(2.0mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-溴-1-丙醇(2.0g，14mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由乙酸乙酯-己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.32g，41%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.21-1.40(32H,m),1.52-1.61(4H,m),2.01-2.09(4H,m),2.23(2H,quint,J=6.3Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.49(2H,t,J=6.3Hz),4.27(2H,t,J=6.3Hz),4.66-4.73(1H,m),5.29-5.44(4H,m)。
(實施例35)
碳酸3-(吖丁啶-1-基)丙基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(例示化合物1-76)
於參考例46所獲得的碳酸3-溴丙基(9Z,12Z)-二十八-19,22-二烯-11-基酯(0.16g，0.28mmol)之四氫呋喃(8.0mL)溶液中，添加吖丁啶(0.40g，7.0mmol)，微波照射下，於120℃使反應50分鐘。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由乙酸乙酯-己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層 析，獲得呈無色液體之目的物(119mg，77%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.21-1.40(32H,m),1.47-1.61(4H,m),1.71(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.01-2.10(m,6H),2.46(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.16(4H,t,J=6.6Hz),4.15(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.71(1H,m),5.28-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 548[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 548.5044(0.1mDa)。
(實施例36)
碳酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-基酯(例示化合物2-102)
將參考例4所獲得的(6Z,9Z,26Z,29Z)-三十五-6,9,26,29-四烯-18-醇(0.22g，0.44mmol)及吡啶(0.22g，2.8mmol)之甲苯(4.4mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.090g，0.30mmol)之甲苯(0.66mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加(1-甲基-3-哌啶基)甲醇(0.60g，4.6mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由乙酸乙酯-己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(201mg，70%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,m),0.92-1.04(1H,m),1.21-1.40(36H,m),1.48-1.78(8H,m),1.85-1.94(1H,m),1.96-2.10(9H,m),2.26(3H,s),2.77(4H,t,J=6.6Hz),2.72-2.90(2H,m),3.94(1H,dd, J=7.4,10.6Hz),4.05(1H,dd,J=5.5,10.6Hz),4.64-4.72(1H,m),5.28-5.42(8H,m).
MS(ESI+)m/z 656[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 656.5981(-0.1mDa)。
(實施例37)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22R)-22-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十八-19-烯-11-基酯(例示化合物1-334)
於實施例27所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-基酯(0.21g，0.38mmol)及p-甲苯磺酸一水合物(0.079g，0.42mmol)之二氯甲烷(3.8mL)溶液中，添加3,4-二氫-2H-哌喃(0.16g，1.9mmol)，並使於室溫反應3小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，進行提取、獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(210mg，87%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.22-1.85(48H,m),1.84(2H,tt,J=6.7,7.4Hz),1.98-2.06(2H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),3.44-3.52(1H,m),3.57-3.72(1H,m),3.87-3.97(1H,m),4.18(2H,t,J=6.7Hz),4.64-4.75(2H,m),5.32-5.50(2H,m).
MS(ESI+)m/z 638[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 638.5723(1.6mDa)。
(參考例47)
(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-酮
於參考例38所獲得的(19Z,22R)-22-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}二十八-19-烯-11-酮(2.0g，3.7mmol)中添加1M氟化四-n-丁基銨四氫呋喃溶液，並使於室溫反應5小時。水處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層藉由進行矽膠管柱層析，獲得含目的物的液體(0.66g)。生成物不進行其以上之純化，直接用於下一反應。
(參考例48)
乙酸(7R,9Z)-18-羥基二十八-9-烯-7-基酯
於含參考例47所獲得的(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-酮的混合物(0.33g)及吡啶(1.1g，14mmol)之二氯甲烷(7.1mL)溶液中，歷經1分鐘滴加氯化乙醯(0.56g，7.1mmol)，並使於室溫反應1小時。水處理後進行提取，藉由減壓下除去揮發分，獲得液體混合物。使此混合物溶解於四氫呋喃(2.1mL)及甲醇(2.1mL)，添加氫化硼鈉(0.054g，1.4mmol)，並使於室溫反應1小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層藉由進行矽膠管柱層析，獲得含目的物的液體(0.33g)。生成物不進行其以上之純化，直接用於下一反應。
(實施例38)
乙酸(7R,9Z)-18-({[(1-甲基哌啶-3-基)甲氧基]羰基}氧基)二十八-9-烯-7-基酯(例示化合物2-132)
將含參考例48所獲得的乙酸(7R,9Z)-18-羥基二十八-9-烯-7-基酯的混合物(0.33g)及吡啶(0.35g，4.5mmol)之甲苯(7.1mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.14g，0.49mmol)之甲苯(1.1mL)溶液。於0℃攪拌 10分鐘後，升溫至室溫並攪拌30分鐘，再度冷卻至0℃。添加(1-甲基-3-哌啶基)甲醇(0.96g，7.4mmol)，使於室溫反應90分鐘。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(110mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.86-0.91(6H,m),0.93-1.05(1H,m),1.17-1.38(36H,m),1.48-1.78(8H,m),1.85-1.94(1H,m),1.96-2.07(6H,m),2.24-2.34(5H,m),2.74(1H,d,J=10.5Hz),2.86(1H,d,J=10.5Hz),3.95(1H,ddd,J=2.7,7.4,10.2Hz),4.06(1H,ddd,J=2.7,5.9,10.2Hz),4.64-4.71(1H,m),4.87(1H,quint,J=6.3Hz),5.27-5.37(1H,m),5.43-5.51(1H,m).
MS(ESI+)m/z 622[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 622.5438(2.8mDa)。
(參考例49)
己酸(7R,9Z)-18-羥基二十八-9-烯-7-基酯
於含參考例47所獲得的(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-酮的混合物(0.30g)及吡啶(1.1g，14mmol)之二氯甲烷(7.1mL)溶液中，歷經1分鐘滴加己酸酐(0.76g，3.5mmol)，添加4-(二甲基胺基)吡啶(0.01g)，並使於室溫反應90分鐘。飽和重碳酸鈉水溶液處理後進行提取，藉由減壓下除去揮發分而獲得液體混合物。使此混合物溶解於四氫呋喃(2.1mL)及甲醇(2.1mL)，添加氫化硼鈉(0.054g，1.4mmol)，並使於室溫反應4小時。飽和氯化銨 水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層藉由進行矽膠管柱層析，獲得含目的物的液體(0.17g)。生成物不進行其以上之純化，直接用於下一反應。
(實施例39)
己酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八-9-烯-7-基酯(例示化合物1-255)
將含參考例49所獲得的己酸(7R,9Z)-18-羥基二十八-9-烯-7-基酯的混合物(0.17g)及吡啶(0.16g，2.0mmol)之甲苯(3.3mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.067g，0.22mmol)之甲苯(0.49mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌45分鐘，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.35g，3.4mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(150mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.84-0.92(9H,m),1.20-1.38(40H,m),1.48-1.66(8H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.97-2.04(2H,m),2.22(6H,s),2.27(2H,t,J=7.4Hz),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.72(1H,m),4.88(1H,quint,J=6.3Hz),5.27-5.37(1H,m),5.42-5.51(1H,m).
MS(ESI+)m/z 652[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 652.5892(1.2mDa)。
(實施例40)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22R)-22-(四氫呋喃-2-基氧基)二十八-19-烯-11-基酯(例示化合物1-377)
於實施例27所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-基酯(0.055g，0.099mmol)及p-甲苯磺酸水合物(0.026g，0.14mmol)之二氯甲烷(1.3mL)溶液中，添加2,3-二氫呋喃(0.044g，0.63mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(33mg，53%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.82-0.88(6H,m),1.20-1.62(48H,m),1.74-2.05(8H,m),2.21(6H,s),2.33(2H,t,J=7.4Hz),3.51-4.05(3H,m),4.15(2H,t,J=6.7Hz),4.62-4.70(1H,m),5.28-5.46(3H,m).
MS(ESI+)m/z 624[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 624.5574(0.7mDa)。
(實施例41)
二丙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五-9,26-二烯-7,29-二基酯
於實施例22所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(7R,9Z,26Z,29R)-7,29-二羥基三十五-9,26-二烯-18-基酯(0.35g，0.53mmol)及吡啶(0.83g，10.5mmol)之二氯甲烷(5.3mL)溶液中，添加丙酸氯(0.49g，5.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓 下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(260mg，64%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.84-0.91(6H,m),1.13(6H,t,J=7.4Hz),1.22-1.39(36H,m),1.48-1.61(8H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.01(4H,dd,J=6.6,7.0Hz),2.22(6H,s),2.30(4H,q,J=7.4Hz),2.28-2.33(4H,m),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.72(1H,m),4.88(2H,tt,J=5.9,6.6Hz),5.33(2H,ttd,J=1.2,7.0,10.9Hz),5.46(2H,ttd,J=1.2,7.0,10.9Hz).
MS(ESI+)m/z 778[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 778.6555(-0.6mDa)。
(參考例50)
(9Z,12R)-十八-9-烯-1,12-二醇
於氫化鋰鋁(3.87g，102mmol)之四氫呋喃(235mL)溶液中，歷經50分鐘滴加(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯酸甲酯(31.1g，78.4mmol，文獻已知化合物(J.Org.Chem.,2001,66,22,7487-7495))，使於室溫反應1.5小時。以水(4mL)處理後，添加乙酸乙酯，藉由過濾固體成分而去除。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(17.9g，62%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=6.6Hz),1.21-1.87(22H,m),1.98-2.07(2H,m),2.20-2.40(2H,m),3.44-3.52(1H,m),3.58-3.71(3H,m),3.87-3.97(1H,m),4.64-4.74(1H,m),5.33-5.49(2H,m)。
(參考例51)
甲烷磺酸(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯-1-基酯
將參考例50所獲得的(9Z,12R)-十八-9-烯-1,12-二醇(17.9g，48.6mmol)及三乙基胺(5.90g，58.3mmol)之二氯甲烷(122mL)溶液冷卻至0℃，歷經5分鐘滴加氯化甲烷磺醯(6.68g，58.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。藉由於減壓下餾除溶媒，獲得含目的物的黃色液體。
(參考例52)
(7R,9Z)-18-溴十八-9-烯-7-醇
於參考例51所獲得的甲烷磺酸(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯-1-基酯的溶液(21.6g，48.4mmol，理論量)之二乙基醚(145mL)溶液中，添加溴化鎂-二乙基醚錯合物(31.2g，121mmol)，使於室溫中反應整夜。以冰水處理後，藉由二乙基醚進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，使溶解於乙醇(100mL)，添加2N鹽酸水溶液(80mL)，並於室溫攪拌整夜。減壓下餾除揮發分，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(14.1g，84%)。
(參考例53)
2-{[(7R,9Z)-18-溴十八-9-烯-7-基]氧基}四氫-2H-哌喃
於參考例52所獲得的(7R,9Z)-18-溴十八-9-烯-7-醇 (14.1g，40.6mmol)及p-甲苯磺酸水合物(0.154g，0.81mmol)之二氯甲烷(81.2mL)溶液中，添加3,4-二氫-2H-哌喃(6.83g，81.2mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(15.1，86%)。
(參考例54)
(7R,9Z,28Z,31R)-7,31-雙(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)三十七-9,28-二烯-19-醇
將經乾燥的鎂(切削狀，0.42g，17.4mmol)浸漬於四氫呋喃(3.0mL)，添加1,2-二溴乙烷(3滴)並激烈攪拌。
溶液變成黑灰色後，歷經1小時添加參考例53所獲得的2-{[(7R,9Z)-18-溴十八-9-烯-7-基]氧基}四氫-2H-哌喃(5.00g，11.6mmol)之四氫呋喃(8.5mL)溶液，並於室溫攪拌3小時。於此溶液中添加甲酸乙酯(0.47g，5.79mmol)，使於室溫中反應整夜。水處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，使溶解於乙醇(25mL)，並添加5N氫氧化鈉水溶液(5mL)，於室溫攪拌1小時。以水稀釋後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(2.10g，50%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.23-1.62(52H,m),1.66-1.89(4H,m),1.98-2.07(4H,m), 2.20-2.41(4H,m),3.45-3.52(2H,m),3.54-3.71(3H,m),3.87-3.98(2H,m),4.64-4.75(2H,m),5.33-5.50(4H,m)。
(參考例55)
(7R,9Z,28Z,31R)-7,31-雙(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)三十七-9,28-二烯-19-基3-(二甲基胺基)丙基
將參考例54所獲得的(7R,9Z,28Z,31R)-7,31-雙(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)三十七-9,28-二烯-19-醇(1.00g，1.36mmol)及吡啶(0.68g，8.6mmol)之甲苯(13.6mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.279g，0.94mmol)之甲苯(2.05mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1.5小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(1.48g，14.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(1.00g，85%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.22-1.85(56H,m),1.79-1.88(2H,m),1.98-2.06(4H,m),2.20-2.38(12H,m),3.44-3.52(2H,m),3.58-3.71(2H,m),3.87-3.97(2H,m),4.18(2H,t,J=6.7Hz),4.64-4.74(3H,m),5.32-5.49(4H,m)。
(參考例56)
碳酸(7R,9Z,28Z,31R)-7,31-二羥基三十七-9,28-二烯-19-基酯3-(二甲基胺基)丙基酯
於參考例55所獲得的(7R,9Z,28Z,31R)-7,31-雙(四氫 -2H-哌喃-2-基氧基)三十七-9,28-二烯-19-基3-(二甲基胺基)丙基(1.00g、1.16mmol)之乙醇(11.6mL)溶液中，添加2N鹽酸水溶液(5.79mL，11.6mmol)，並使於室溫反應2.5小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.68g，84%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.22-1.61(48H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.01-2.08(4H,m),2.18-2.24(10H,m),2.34(2H,t,J=7.4Hz),3.61(2H,quint,J=5.9Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.72(1H,m),5.36-5.44(2H,m),5.52-5.61(2H,m)。
(實施例42)
二乙酸(7R,9Z,28Z,31R)-19-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十七-9,28-二烯-7,31-二基酯
於參考例56所獲得的碳酸(7R,9Z,28Z,31R)-7,31-二羥基三十七-9,28-二烯-19-基酯3-(二甲基胺基)丙基酯(0.68g，0.98mmol)及吡啶(2.3g，29mmol)之二氯甲烷(9.8mL)溶液，添加氯乙酸(1.2g，15mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(523mg，69%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m), 1.20-1.38(40H,m),1.48-1.61(8H,m),1.85(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.98-2.08(10H,m),2.22(6H,s),2.29(4H,dt,J=6.3,6.6Hz),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.72(1H,m),4.87(2H,quint,J=6.3Hz),5.36(1H,ttd,J=1.2,6.6,10.9Hz),5.47(1H,ttd,J=1.2,6.6,10.9Hz).
MS(ESI+)m/z 778[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 778.6557(-0.4mDa)。
(參考例57)
(21Z,24R)-24-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}三十-21-烯-13-酮
於參考例32所獲得的(9Z,12R)-12-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}-N-甲氧基-N-甲基十八-9-烯醯胺(0.80g，1.8mmol)之二乙基醚(8.8mL)溶液中，歷經1分鐘滴加1N溴化n-十二碳基鎂二乙基醚溶液(2.6mL，2.6mmol)後，使於室溫反應整夜。飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.55g，55%)。
(參考例58)
(21Z,24R)-24-羥基三十-21-烯-13-酮
於參考例57所獲得的(21Z,24R)-24-{[tert-丁基(二甲基)矽基]氧基}三十-21-烯-13-酮(0.55g，0.97mmol)中，添加1N氟化四n-丁基銨四氫呋喃溶液(4.9mL，4.9mmol)，使於室溫中反應整夜。以水處理後，經由己烷進行提 取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.23g，52%)。
(參考例59)
乙酸(7R,9Z)-18-側氧基三十-9-烯-7-基酯
於參考例58所獲得的(21Z,24R)-24-羥基三十-21-烯-13-酮(0.23g，0.51mmol)及吡啶(0.81g，10mmol)之二氯甲烷(5.1mL)溶液中，添加氯乙酸(0.40g，5.1mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.21g，84%)。
(參考例60)
乙酸(7R,9Z)-18-羥基三十-9-烯-7-基酯
於參考例59所獲得的乙酸(7R,9Z)-18-側氧基三十-9-烯-7-基酯溶(0.21g，0.43mmol)之四氫呋喃(1.3mL)及甲醇(1.3mL)溶液中，添加氫化硼鈉(32mg，0.85mmol)，使於室溫反應1小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。藉由於減壓下餾除溶媒，獲得含目的物的黃色液體。
(實施例43)
乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十-9-烯-7-基酯
將含參考例60所獲得的乙酸(7R,9Z)-18-羥基三十-9-烯-7-基酯的溶液(0.21g，0.42mmol，理論量)及吡啶 (0.21g，2.7mmol)之甲苯(4.2mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.087g，0.29mmol)之甲苯(0.64mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1.5小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.46g，4.5mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(111mg，42%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.23-1.35(36H,m),1.48-1.66(6H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.97-2.05(2H,m),2.03(3H,s),2.22(3H,s),2.25-2.32(2H,m),2.36(2H,t,J=7.4Hz),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.72(1H,m),4.86(1H,quint,J=6.3Hz),5.28-5.51(2H,m).
MS(ESI+)m/z 624[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 624.5566(-0.1mDa)。
(參考例61)
丁酸(7R,9Z)-18-側氧基三十-9-烯-7-基酯
於參考例39所獲得的(19Z,22R)-22-羥基二十八-19-烯-11-酮(0.34g，0.80mmol)及吡啶(1.3g，16mmol)之二氯甲烷(8.0mL)溶液中，添加氯丁酸(0.86g，8.0mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.40g，100%)。
(參考例62)
丁酸(7R,9Z)-18-羥基二十八-9-烯-7-基酯
於參考例61所獲得的丁酸(7R,9Z)-18-側氧基三十-9-烯-7-基酯(0.40g，0.81mmol)之四氫呋喃(2.4mL)及甲醇(2.4mL)溶液中，添加氫化硼鈉(61mg，1.6mmol)，使於室溫反應1小時。飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。藉由於減壓下餾除溶媒，獲得含目的物的黃色液體。
(實施例44)
丁酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)二十八-9-烯-7-基酯
將含參考例62所獲得的丁酸(7R,9Z)-18-羥基二十八-9-烯-7-基酯的溶液(0.40g，0.81mmol，理論量)及吡啶(0.40g，5.1mmol)之甲苯(8.1mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.17g，0.56mmol)之甲苯(1.2mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1.5小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.88g，8.5mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(99mg，20%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.90(6H,m),0.94(3H,t,J=7.4Hz),1.21-1.39(32H,m),1.47-1.62(6H,m),1.65(2H,sext,J=7.4Hz),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.01(2H,q,J=6.6Hz),2.22(6H,s),2.23-2.39(4H,m), 4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.72(1H,m),4.89(2H,quint,J=6.3Hz),5.28-5.50(2H,m).
MS(ESI+)m/z 624[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 624.5599(3.2mDa)。
(參考例63)
三十烷-11-醇
於二十烷醇(0.64g，2.2mmol)之二乙基醚(11mL)溶液中，歷經2分鐘滴加1N溴化n-癸基鎂二乙基醚溶液(3.2mL，3.2mmol)後，使於室溫反應整夜。1N鹽酸水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.37g，39%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=7.0),1.20-1.33(50H,m),1.36-1.48(4H,m),3.54-3.62(1H,br)。
(實施例45)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基 三十烷-11-基酯
於參考例63所獲得的三十烷-11-醇(0.18g，0.41mmol)及吡啶(0.20g，2.6mmol)之甲苯(4.1mL)溶液中，歷經2分鐘添加三光氣(0.084g，0.28mmol)之甲苯(0.62mL)溶液。於室溫攪拌1小時後，添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.44g，4.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(185mg，79%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.84(6H,t,J=7.0Hz),1.16-1.32(50H,m),1.44-1.60(4H,m),1.82(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.19(6H,s),2.32(2H,t,J=7.4Hz),4.14(2H,t,J=6.6Hz),4.61-4.68(1H,m).
MS(ESI+)m/z 568[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 568.5663(-0.6mDa)。
(實施例46)
碳酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基三十烷-11-基酯
於參考例63所獲得的三十烷-11-醇(0.18g，0.41mmol)及吡啶(0.20g，2.6mmol)之甲苯(4.1mL)溶液中，歷經2分鐘添加三光氣(0.084g，0.28mmol)之甲苯(0.62mL)溶液。於室溫攪拌1小時後，添加1-甲基-3-哌啶甲醇(0.56g，4.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(145mg，60%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=7.0Hz),1.20-1.36(50H,m),1.48-1.77(8H,m),1.85-1.94(1H,m),1.95-2.07(1H,m),2.26(3H,s),2.75(1H,d,J=10.9Hz),2.86(1H,d,J=10.9Hz),3.94(1H,dd,J=7.4,10.9Hz),4.06(1H,dd,J=5.9,10.9Hz),4.64-4.71(1H,m).
MS(ESI+)m/z 594[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 594.5827(0.2mDa)。
(參考例64)
(6Z,9Z)-18-[2-(乙烯基氧基)乙氧基]十八-6,9-二烯
於亞油醯基醇(3.90g，14.6mmol)、甲苯磺醯基乙烯基乙二醇(4.76g，16.1mmol)及硫酸四丁基銨(1.24g，3.66mmol)之甲苯(23.4mL)溶液中，添加50%氫氧化鈉水溶液(11.5mL)，使於室溫中反應整夜。添加甲苯磺醯基乙烯基乙二醇(2.00g，6.76mmol)，使於室溫反應5日夜。經水稀釋後，藉由二乙基醚進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(2.44，50%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.0Hz),1.25-1.40(16H,m),1.54-1.63(2H,m),2.01-2.08(4H,m),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.48(2H,t,J=6.6Hz),3.64-3.68(2H,m),3.81-3.85(2H,m),4.01(1H,dd,J=2.0,7.0Hz),4.19(1H,dd,J=2.0,14.1Hz),6.52(1H,dd,J=7.0,14.1Hz)。
(參考例65)
2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]乙醇
於參考例64所獲得的(6Z,9Z)-18-[2-(乙烯基氧基)乙氧基]十八-6,9-二烯(5.70g，17mmol)之乙醇(34mL)及四氫呋喃(34mL)溶液中，添加1N鹽酸水溶液(17mL，17mmol)，使於室溫反應1.5小時。經水稀釋後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(2.00g，38%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(3H,t,J=7.0Hz),1.23-1.40(16H,m),1.51-1.63(2H,m),1.95(1H,t,J=6.3Hz),2.01-2.09(4H,m),2.77(2H,t,J=6.6Hz), 3.53(2H,t,J=4.3Hz),3.73(2H,dt,J=6.3,4.3Hz),5.29-5.43(4H,m)。
(參考例66)
[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]乙醛
於參考例65所獲得的2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]乙醇(1.00g，3.2mmol)及三乙基胺(1.63g，16.1mmol)之二甲基亞碸(6.4mL)溶液中，添加三氧化硫-吡啶錯合物(1.54g，9.7mmol)，使於室溫反應1.5小時。經水稀釋後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(0.57g，57%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：1.11(3H,t,J=6.8Hz),1.25-1.41(16H,m),1.59-1.67(2H,m),2.02-2.08(4H,m),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.53(2H,t,J=6.6Hz),4.06(2H,s),5.30-5.42(4H,m),9.74-9.75(1H,m)。
(參考例67)
(11Z,14Z)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-11,14-二烯-2-醇
於參考例66所獲得的[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]乙醛(1.27g，4.1mmol)之二乙基醚(12.4mL)溶液中，添加0.5N溴化亞油醯基鎂(14mL，7.0mmol)，使於室溫反應3小時，接著於60℃使反應3小時。以飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(0.48g，21%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=7.0Hz),1.23-1.46(34H,m),1.52-1.61(4H,m),2.01-2.08(8H,m),2.31(1H,d,J=3.1Hz),2.77(4H,t,J=6.6Hz),3.23(1H,dd,J=8.2,9.4Hz),3.39-3.51(3H,m),3.72-3.81(1H,m),5.29-5.43(8H,m)。
(實施例47)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14Z)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-11,14-二烯-2-基酯
將參考例67所獲得的(11Z,14Z)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-11,14-二烯-2-醇(0.27g，0.48mmol)及吡啶(0.24g，3.0mmol)之甲苯(4.8mL)溶液於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.099g，0.33mmol)之甲苯(0.72mL)溶液。於0℃攪拌30分鐘後，升溫至室溫並攪拌1.5小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.52g，5.1mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(330mg，24%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88-0.94(6H,m),1.24-1.43(34H,m),1.52-1.67(4H,m),1.86(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.96-2.11(8H,m),2.24(6H,s),2.38(2H,t,J=7.4Hz),2.79(4H,t,J=6.6Hz),3.38-3.54(4H,m),4.21(2H,t,J=6.6Hz),4.82-4.89(1H,m),5.31-5.45(8H,m).
MS(ESI+)m/z 688[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 688.6269(2.5mDa)。
(參考例68)
10-{2-[(2-戊基環丙基)甲基]環丙基}-1-[(8-{2-[(2-戊基環丙基)甲基]環丙基}辛基)氧基]癸-2-醇
於冷卻至0℃的1.1N二乙基鋅己烷溶液(7.3mL，7.7mmol)之二氯甲烷(12mL)溶液中，歷經10分鐘添加氯碘甲烷(1.7g，9.6mmol)後，歷經40分鐘添加參考例R18所獲得的(11Z,14Z)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-11,14-二烯-2-醇(0.27g，0.48mmol)、氯碘甲烷(1.0g，5.7mmol)之二氯甲烷(7.0mL)溶液，使於室溫中反應整夜。以飽和氯化銨水溶液處理後，藉由二氯甲烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(0.29g，98%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.32)-(-0.24)(4H,m),0.57-0.84(12H,m),0.85-0.92(6H,m),0.97-1.62(50H,m),2.31(1H,d,J=3.1Hz),3.23(1H,dd,J=8.2,9.4Hz),3.39-3.52(3H,m),3.73-3.80(1H,m)。
(實施例48)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基10-{2-[(2-戊基環丙基)甲基]環丙基}-1-[(8-{2-[(2-戊基環丙基)甲基]環丙基}辛基)氧基]癸-2-基酯
將參考例68所獲得的10-{2-[(2-戊基環丙基)甲基]環丙基}-1-[(8-{2-[(2-戊基環丙基)甲基]環丙基}辛基)氧基 ]癸-2-醇(0.17g，0.28mmol)及吡啶(0.14g，1.7mmol)之甲苯(2.8mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.056g，0.19mmol)之甲苯(0.42mL)溶液。於0℃攪拌1小時後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.30g，2.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(135mg，66%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：(-0.34)-(-0.23)(4H,m),0.57-0.84(12H,m),0.86-0.92(6H,m),0.97-1.66(50H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),3.35-3.53(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.80-4.87(1H,m).
MS(ESI+)m/z 744[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 744.6876(0.6mDa)。
(參考例69)
1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-2-醇
於參考例66所獲得的[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]乙醛(0.22g，0.71mmol)之四氫呋喃(2.9mL)溶液中，添加0.5N氯化十八碳基鎂(3.0mL，1.5mmol)，使於室溫中反應整夜。以飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(0.13g，31%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.20-1.62(52H,m),2.01-2.08(4H,m),2.31(1H,d,J=3.1Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.23(1H,dd,J=8.2,9.4Hz),3.39-3.55(3H,m),3.73-3.80(1H,m),5.29-5.42(4H,m)。
(實施例49)
碳酸3-(二甲基胺基丙基)1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-2-基酯
將參考例69所獲得的1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-2-醇(0.13g，0.22mmol)及吡啶(0.11g，1.4mmol)之甲苯(2.2mL)溶液於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加三光氣(0.045g，0.15mmol)之甲苯(0.33mL)溶液。於0℃攪拌40分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.24g，2.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(86mg，56%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.22-1.41(48H,m),1.50-1.66(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.01-2.09(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.35-3.53(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.80-4.86(1H,m),5.29-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 692[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 692.6588(3.1mDa)。
(參考例70)
(11Z,14Z)-1-(十八氧基)二十-11,14-二烯-2-醇
於十八-1-基氧基乙醛(0.25g，0.80mmol)之四氫呋喃(2.4mL)溶液中，添加0.5N溴化亞油醯基鎂(2.4mL，1.2mmol)，並使於室溫反應4小時。以飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(0.17g，38%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88-0.94(6H,m),1.22-1.70(52H,m),2.04-2.11(4H,m),2.35(1H,d,J=3.1Hz),2.80(2H,t,J=6.6Hz),3.26(1H,dd,J=8.2,9.4Hz),3.42-3.58(3H,m),3.75-3.83(1H,m),5.32-5.45(4H,m)。
(實施例50)
碳酸3-(二甲基胺基丙基)(11Z,14Z)-1-(十八氧基)二十-11,14-二烯-2-基酯
將參考例70所獲得的(11Z,14Z)-1-(十八氧基)二十-11,14-二烯-2-醇(0.17g，0.30mmol)及吡啶(0.15g，1.9mmol)之甲苯(3.0mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.062g，0.21mmol)之甲苯(0.45mL)溶液。於0℃攪拌30分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.33g，3.2mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。 減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(53mg，25%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.21-1.40(48H,m),1.50-1.65(4H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),2.01-2.09(4H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.35-3.53(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.80-4.87(1H,m),5.29-5.42(4H,m).
MS(ESI+)m/z 692[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 692.6578(2.1mDa)。
(參考例71)
(11Z,14R)-1-(十八氧基)-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-醇
將經乾燥的鎂(切削狀，0.48g，19.8mmol)浸漬於四氫呋喃(4.0mL)，添加1,2-二溴乙烷(3滴)，並激烈攪拌。
溶液變成黑灰色後，歷經40分鐘添加參考例53所獲得的2-{[(7R,9Z)-18-溴十八-9-烯-7-基]氧基}四氫-2H-哌喃(5.70g，13.2mmol)之四氫呋喃(18.5mL)溶液，並於室溫攪拌3小時。
將獲得的格任亞試藥溶液中7.5mL添加於十八-1-基氧基乙醛(0.78g，2.5mmol)之四氫呋喃(7.5mL)溶液，並使於室溫反應6小時。以飽和氯化銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.61g，37%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=7.0Hz),1.20-2.40(64H,m),3.23(1H,dd,J=8.2,9.4Hz),3.39-3.56(5H,m),3.58-3.70(1H,m),3.73-3.81(1H,m),3.87-3.98(1H,m),4.64-4.74(1H,m),5.34-5.50(2H,m)。
(參考例72)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-1-(十八氧基)-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-基酯
將參考例71所獲得的(11Z,14R)-1-(十八氧基)-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-醇(0.61g，0.92mmol)及吡啶(0.46g，5.8mmol)之甲苯(9.2mL)溶液於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.19g，0.63mmol)之甲苯(1.4mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.99g，9.6mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.41g，56%)。
(參考例73)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-14-羥基-1-(十八氧基)二十-11-烯-2-基酯
於參考例72所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-1-(十八氧基)-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-基酯(0.41g、0.52mmol)之乙醇(5.2mL)溶液中，添加2N鹽酸水溶液(2.6mL，5.2mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由乙酸乙酯進 行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.34g，92%)。
(實施例51)
乙酸(7R,9Z)-19-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)-20-(十八氧基)二十-9-烯-7基酯
於參考例73所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-14-羥基-1-(十八氧基)二十-11-烯-2-基酯(0.11g、0.16mmol)及吡啶(0.25g，3.1mmol)之二氯甲烷(1.6mL)溶液中，添加氯乙酸(0.12g，1.6mmol)，並使於室溫反應3小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(75mg，64%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.21-1.37(50H,m),1.50-1.66(6H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.97-2.06(5H,m),2.22(6H,s),2.25-2.31(2H,m),2.36(2H,t,J=7.4Hz),3.35-3.51(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.79-4.91(2H,m),5.28-5.36(1H,m),5.43-5.51(1H,m).
MS(ESI+)m/z 752[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 752.6775(3.4mDa)。
(參考例74)
(11Z,14R)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-醇
將經乾燥的鎂(切削狀，0.24g，9.7mmol)浸漬於四氫呋喃(3.0mL)，添加1,2-二溴乙烷(4滴)，並激烈攪拌。溶液變成黑灰色後，歷經40分鐘添加參考例53所獲得的2-{[(7R,9Z)-18-溴十八-9-烯-7-基]氧基}四氫-2H-哌喃(2.8g，6.5mmol)之四氫呋喃(18.5mL)溶液，並於室溫攪拌整夜。
於獲得的格氏試藥溶液中添加參考例66所獲得的[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]乙醛(2.0g，6.5mmol)，並於60℃使反應2小時。以飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.27g，6%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.22-2.40(54H,m),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.23(1H,dd,J=8.2,9.4Hz),3.39-3.56(5H,m),3.58-3.72(1H,m),3.72-3.81(1H,m),3.86-3.98(1H,m),4.64-4.74(1H,m),5.28-5.49(6H,m)。
(參考例75)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-基酯
將參考例74所獲得的(11Z,14R)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-醇(0.27g，0.41mmol)及吡啶(0.20g，2.6mmol)之甲苯(4.1mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經2分鐘添加 三光氣(0.084g，0.28mmol)之甲苯(0.61mL)溶液。於0℃攪拌15分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.44g，4.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.16g，48%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.23-1.88(50H,m),1.98-2.09(8H,m),2.22(6H,m),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.35-3.52(5H,m),3.59-3.71(1H,m),3.87-3.97(1H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.63-4.73(1H,m),4.80-4.87(1H,m),5.29-5.49(6H,m)。
(參考例76)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-14-羥基-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-11-烯-2-基酯
於參考例75所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-14-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)二十-11-烯-2-基酯(0.16g、0.20mmol)之乙醇(0.98mL)溶液中，添加2N鹽酸水溶液(0.49mL，0.98mmol)，並使於室溫反應3小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.08g，60%)。
(實施例52)
乙酸(7R,9Z)-19-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)-20-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-9-烯-7-基酯
於參考例76所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14R)-14-羥基-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]二十-11-烯-2-基酯(0.08g、0.11mmol)及吡啶(0.37g，4.5mmol)之二氯甲烷(2.3mL)溶液中，添加氯乙酸(0.18g，2.3mmol)，使於室溫反應3小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(53mg，63%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.23-1.40(36H,m),1.50-1.64(6H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.97-2.09(9H,m),2.22(6H,s),2.25-2.32(2H,m),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.35-3.52(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.80-4.91(2H,m),5.28-5.51(6H,m).
MS(ESI+)m/z 748[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 748.6489(3.4mDa)。
(參考例77)
2-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}乙醇
於氫化鈉(64%，2.97g、79.2mmol)之N,N-二甲基甲醯胺懸浮液中，添加乙二醇(5.25g、84.5mmol)，並於80℃ 攪拌45分鐘。添加參考例51所獲得的甲烷磺酸(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯-1-基酯(11.8g、26.4mmol)，於80℃使反應2小時。經水處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(8.36g，77%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.0Hz),1.23-1.62(26H,m),1.66-1.75(1H,m),1.78-1.87(1H,m),1.97-2.07(3H,m),2.23(1H,t,J=6.3Hz),2.26-2.41(1H,m),3.47(2H,t,J=6.6Hz),3.53(2H,dd,J=3.1,5.1Hz),3.58-3.72(1H,m),3.87-3.98(1H,m),4.64-4.74(1H,m),5.33-5.49(2H,m)。
(參考例78)
{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}乙醛
於參考例77所獲得的2-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}乙醇(5.36g，13.0mmol)及三乙基胺(6.57g，65.0mmol)之二甲基亞碸(26.0mL)溶液中，添加三氧化硫-吡啶錯合物(5.17g，32.5mmol)，並使於室溫反應2.5小時。經水稀釋後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(3.96g，74%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.0Hz),1.23-1.67(26H,m),1.66-1.75(1H,m),1.78-1.86(1H,m), 1.98-2.07(3H,m),2.20-2.41(2H,m),3.44-3.54(3H,m),3.55-3.71(1H,m),3.87-3.97(1H,m),4.06(2H,s),4.64-4.74(1H,m),5.32-5.49(2H,m),9.75(1H,s)。
(參考例79)
1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-2-醇
於參考例78所獲得的{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}乙醛(0.40g，0.97mmol)之四氫呋喃(2.9mL)溶液中，添加0.5N氯化十八碳基鎂(2.4mL，1.2mmol)，使於室溫中反應整夜。以飽和氯化銨水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(0.24g，37%)。
(參考例80)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-2-基酯
將參考例79所獲得的1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-2-醇(0.24g，0.36mmol)及吡啶(0.18g，2.3mmol)之甲苯(3.6mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.074g，0.25mmol)之甲苯(0.54mL)溶液。於0℃攪拌10分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.39g，3.8mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉 由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.24g，84%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.88(3H,t,J=7.0Hz),1.21-1.75(60H,m),1.81-2.40(8H,m),2.22(6H,s),3.35-3.53(5H,m),3.58-3.72(1H,m),3.87-3.97(1H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.73(1H,m),4.80-4.87(1H,m),5.32-5.49(2H,m)。
(參考例81)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基1-{[(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯-1-基]氧基}二十-2-基酯
於參考例80所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-2-基酯(0.24g、0.30mmol)之乙醇(3.0mL)溶液中，添加2N鹽酸水溶液(1.5mL，3.0mmol)，並使於室溫反應2小時。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.16g，76%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.21-1.65(54H,m),1.84(2H,dd,J=6.6,7.4Hz),2.05(2H,q,J=6.6Hz),2.18-2.24(2H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),3.35-3.52(4H,m),3.37-3.65(1H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.83(1H,quint,J=5.9Hz),5.35-5.44(1H,m),5.52-5.61(1H,m)。
(實施例53)
乙酸(20,23R)-2-甲基-9-十八碳基-7-側氧基-6,8,11-三氧-2-氮二十九-20-烯-23-基酯
於參考例81所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基1-{[(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯-1-基]氧基}二十-2-基酯(0.16g、0.23mmol)及吡啶(0.36g，4.6mmol)之二氯甲烷(2.3mL)溶液中，添加氯乙酸(0.18g，2.3mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(121mg，70%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.91(6H,m),1.22-1.38(50H,m),1.49-1.65(6H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.97-2.06(5H,m),2.22(6H,s),2.25-2.32(2H,m),2.36(2H,t,J=7.4Hz),3.35-3.53(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.79-4.91(2H,m),5.28-5.36(1H,m),5.43-5.51(1H,m).
MS(ESI+)m/z 752[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 752.6802(3.4mDa)。
(參考例82)
(11Z,14Z)-1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-11,14-二烯-2-醇
於參考例78所獲得的{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}乙醛(0.40g，0.97mmol)之四氫呋喃(2.9mL)溶液中，添加0.5N溴化亞油醯基鎂(2.9mL，1.5mmol)，使於室溫中反應整夜。以飽和氯化 銨水溶液處理後，經由乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈黃色液體之目的物(0.37g，57%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.23-1.87(48H,m),1.98-2.40(9H,m),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.23(1H,dd,J=8.2,9.4Hz),3.39-3.52(4H,m),3.58-3.71(1H,m),3.73-3.80(1H,m),3.87-3.97(1H,m),4.64-4.74(1H,m),5.29-5.49(6H,m)。
(參考例83)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14Z)-1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-11,14-二烯-2-基酯
將參考例82所獲得的(11Z,14Z)-1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-11,14-二烯-2-醇(0.37g，0.56mmol)及吡啶(0.28g，3.5mmol)之甲苯(5.6mL)溶液，於冰浴冷卻至0℃，歷經1分鐘添加三光氣(0.11g，0.39mmol)之甲苯(0.84mL)溶液。於0℃攪拌30分鐘後，升溫至室溫並攪拌1小時，再度冷卻至0℃。添加3-二甲基胺基-1-丙醇(0.61g，5.9mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.33g，75%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.23-1.75(48H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz), 1.98-2.40(8H,m),2.22(6H,s),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.3Hz),3.35-3.53(5H,m),3.58-3.71(1H,m),3.87-3.97(1H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.64-4.74(1H,m),4.80-4.87(1H,m),5.29-5.48(6H,m)。
(參考例84)
碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14Z)-1-{[(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯-1-基]氧基}二十-11,14-二烯-2-基酯
於參考例83所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14Z)-1-{[(9Z,12R)-12-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)十八-9-烯-1-基]氧基}二十-11,14-二烯-2-基酯(0.33g、0.42mmol)之乙醇(4.2mL)溶液中，添加2N鹽酸水溶液(2.1mL，4.2mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷-乙酸乙酯進行提取，獲得的有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.29g，98%)。
(實施例54)
乙酸(20,23R)-2-甲基-9-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基]-7-側氧基-6,8,11-三氧-2-氮二十九-20-烯-23-基酯
於參考例84所獲得的碳酸3-(二甲基胺基)丙基(11Z,14Z)-1-{[(9Z,12R)-12-羥基十八-9-烯-1-基]氧基}二十-11,14-二烯-2-基酯(0.51g、0.72mmol)及吡啶(1.1g，14mmol)之二氯甲烷(7.2mL)溶液中，添加氯乙酸(0.57g，7.2mmol)，使於室溫中反應整夜。飽和重碳酸鈉水溶液處理後，經由己烷進行提取，獲得的有機層以無水硫 酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，藉由進行矽膠管柱層析，獲得呈無色液體之目的物(0.42g，78%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.85-0.92(6H,m),1.23-1.40(36H,m),1.49-1.65(6H,m),1.84(2H,tt,J=6.6,7.4Hz),1.98-2.08(9H,m),2.22(6H,s),2.25-2.32(2H,m),2.36(2H,t,J=7.4Hz),2.77(2H,t,J=6.6Hz),3.35-3.53(4H,m),4.18(2H,t,J=6.6Hz),4.80-4.91(2H,m),5.28-5.51(6H,m).
MS(ESI+)m/z 748[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 748.6476(2.1mDa)。
(實施例55)雙股多核苷酸封入核酸脂質粒子之特性評價
以與實施例31相同之方法，獲得含參考例2、實施例41、實施例42、或實施例43記載之化合物的核酸脂質粒子之分散液。關於含獲得的核酸脂質粒子的分散液，以下列方法實施特性評價。
(1)平均粒徑
脂質體之粒徑係以Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)來測定。表中之平均粒徑係表示體積平均粒徑，±以下表示偏差。
(2)雙股多核苷酸之封入率
雙股多核苷酸之封入率係使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit(Invitrogen)，依據所附說明書來測定。
即，於0.015% Triton X-100界面活性劑存在下及非 存在下，定量核酸脂質粒子之分散液中之雙股多核苷酸，藉由下式算出封入率。
{[界面活性劑存在下的雙股多核苷酸量]-[界面活性劑非存在下的雙股多核苷酸量]}/[界面活性劑存在下的雙股多核苷酸量]}x100(%)
(3)雙股多核苷酸與脂質之比率
核酸脂質粒子之分散液於5% Triton X-100界面活性劑存在下，試料中之雙股多核苷酸量以離子交換層析測定(系統：Agilent 1100系列，管柱：DNAPac PA200(4×250mm)(Thermo Fisher Scientific股份有限公司)，緩衝液A：10mM Tris，25mM過氯酸鈉，20%乙醇，pH7.0，緩衝液B：10mMTris，250mM過氯酸鈉，20%乙醇，pH7.0，梯度(B%)：20-70%(0-15分鐘)，流速：0.5mL/分鐘，溫度：40℃，偵測：260nm)。
核酸脂質粒子之分散液中之磷脂質量使用磷脂質C-Test Wako(和光純藥工業股份有限公司)，依據所附說明書來測定。即，於1%Triton X-100界面活性劑存在下，定量試料中之磷脂質。
核酸脂質粒子之分散液中之膽固醇及LP量以逆相層析來測定(系統：Agilent 1100系列，管柱：Chromolith Performance RP-18 endcapped 100-3 monolithic HPLC-column(Merck)，緩衝液A：0.01%三氟乙酸，緩衝液B：0.01%三氟乙酸，甲醇，梯度(B%)：82-92%(0-10分鐘)，流速：2mL/分鐘，溫度：50℃，偵測：205nm)。
由磷脂質量、膽固醇量、及LP量及構成脂質體的脂質成分之組成比，算出總脂質量，由上述之多核苷酸量及總脂質量，藉由下式算出多核苷酸與脂質之比率。
[雙股多核苷酸濃度]/[總脂質濃度](wt/wt)
結果示於表16。
藉由以上之結果可知，雙股多核苷酸被封入脂質粒子內，彼等之核酸脂質粒子係具有約100nm至約200nm之平均粒徑。
(試驗例8)
以與試驗例3相同的操作，使用新穎脂質而調製的核酸脂質粒子於SW480細胞中，以50nM、5nM、0.5nM及0.05nM處理，比較人類β-連鎖蛋白基因表現抑制活性之強度。
其結果，如表17所示，含實施例41、42、及43之化合物的核酸脂質粒子，與含成為對照的脂質的參考例2的核酸脂質粒子比較，顯示強的β-連鎖蛋白基因表現之抑制活性。據此可知，實施例8之化合物係有用於調製顯示強活性的核酸脂質粒子之有益的新穎脂質。
(實施例56)雙股多核苷酸封入核酸脂質粒子之特性評價
將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：以下記載為DSPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下記載為Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、實施例23或28記載之化合物(作為LP)、及N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(以下記載為PEG-C-DMA)，以DSPC：Chol：LP：PEG-C-DMA=10：48：40：2之莫耳比，於乙醇中，調製成為總脂質濃度26.8mM的脂質溶液。
將Nature Biotechnology(2008)26、561-569記載的雙股多核苷酸(siFVII：抗小鼠VII因子的siRNA)，以含30%乙醇的檸檬酸緩衝液(10mM Citrate Buffer，pH4.0)調製為1mg/mL，獲得雙股多核苷酸溶液。
將上述之脂質溶液、雙股多核苷酸溶液、及檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)加熱至37℃。使脂質溶液與檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)之體積比成為3：7的方式，將脂質溶液滴加至檸檬酸緩衝液而混合，獲得脂質體粗分散液。接著，使來自LP的氮 原子(N)與來自雙股多核苷酸的磷原子(P)之比率(N/P)成為3的方式，將上述脂質體粗分散液滴加至雙股多核苷酸溶液而混合，藉由於37℃培育30分鐘，獲得核酸脂質粒子之分散液。藉由核酸脂質粒子之分散液以約100mL之磷酸緩衝液(pH7.4)透析12-18小時(Float-A-Lyzer G2，MWCO：100kD，Spectra/Por)，進行乙醇去除及因中和而未封入之雙股多核苷酸之去除，獲得含雙股多核苷酸、實施例23或28記載之化合物的核酸脂質粒子之經純化的分散液。
關於獲得的核酸脂質粒子，以實施例55記載之方法進行特性評價，核酸脂質粒子之多核苷酸封入率、多核苷酸與脂質之重量比、及平均粒徑示於表18。
由以上之結果可知，雙股多核苷酸被封入脂質粒子內，彼等之核酸脂質粒子係具有約100nm至約300nm之平均粒徑。
(試驗例9)VII因子(FVII)蛋白質測定
以與試驗例7相同之操作，比較使用新穎脂質所調製的核酸脂質粒子所致VII因子蛋白質表現抑制活性的強度。經調製的核酸脂質粒子之分散液以成為0.1mg/kg的方式於尾靜脈注射。投予1日後及6日後自尾靜脈進行約50μL之採血，獲得血漿。
投予1日後及6日後之結果，各自示於表19。其結果，含實施例23及24之化合物的核酸脂質粒子係顯示強的FVII抑制活性。由此可知，含實施例23及28之化合物的核酸脂質粒子係有益於作為能抑制基因表現的核酸脂質粒子。
(實施例57)雙股多核苷酸封入核酸脂質粒子之特性評價
將二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：以下記載為DPPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下記載為Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、實施例19、45或54記載之化合物(作為LP)、及N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂醯基氧基丙基-3-胺(以下記載為PEG-C-DSA)，以DPPC：Chol：LP：PEG-C-DSA=7：33.5：57：2.5之莫耳比，於乙醇中，調製成為總脂質濃度6.5mM的脂質溶液。
將Journal Clinical Investigation(2009)119、661-673記載的雙股多核苷酸(PLK1424-2/A：抗小鼠PLK1的siRNA)，使用含30%乙醇的檸檬酸緩衝液(10mM Citrate Buffer，pH4.0)，調製為1mg/mL，獲得雙股多核苷酸溶液。
將上述之脂質溶液、雙股多核苷酸溶液、及檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)加熱至37℃。使脂質溶液與檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)之體積比成為3：7的方式，將脂質溶液滴加至檸檬酸緩衝液而混合，獲得脂質體粗分散液。接著，使來自LP的氮原子(N)與來自雙股多核苷酸的磷原子(P)之比率(N/P)成為3的方式，將上述脂質體粗分散液滴加至雙股多核苷酸溶液而混合，藉由於37℃培育30分鐘，獲得核酸脂質粒子之分散液。藉由核酸脂質粒子之分散液以約100mL之磷酸緩衝液(pH7.4)透析12-18小時(Float-A-Lyzer G2，MWCO：100kD，Spectra/Por)，進行乙醇去除及因中和而未封入之雙股多核苷酸之去除，獲得含雙股多核苷酸、實施例19、45或54記載之化合物的核酸脂質粒子之經純化的分散液。
關於獲得的核酸脂質粒子，以實施例55記載之方法進行特性評價，核酸脂質粒子之多核苷酸封入率、多核苷酸與脂質之重量比、及平均粒徑示於表20。
由以上之結果可知，雙股多核苷酸被封入脂質粒子內，彼等之核酸脂質粒子係具有約50nm至約150nm之平 均粒徑。
(試驗例10)
將裸鼠(CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu])馴化飼育8日後，將培養的人類Hep3B細胞以(1×107個/小鼠)移植於鼠右側腹部皮下。腫瘤移植19日後，將腫瘤體積作為指標來分組，次日，將含實施例57所調製的核酸脂質粒子的分散液(成為1mg/kg及3mg/kg的方式投予)於小鼠尾靜脈內投予。對照組則投予PBS。核酸脂質粒子投予之次日，自擔癌小鼠採取腫瘤塊，使用QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN公司製)及氯仿而提取核酸後，依據QIAGNE RNeasy Plus Mini kit(QIAGEN公司製)所附的說明書，將全RNA純化。
將16μL之經純化的RNA及4μL之SuperScript VILO Master mix(Life technologies公司)混合，以下列條件進行RT反應。
RT反應25℃ 10分鐘
42℃ 60分鐘
85℃ 5分鐘
作為即時PCR用之探針，人類PLK-1基因探針係使用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Assays(PLK-1、FAM probe、Hs00153444_m1、Applied Biosystems公司製)、作為內部標準之人類-GAPDH基因探針係使用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Assays(VIC probe、Hs99999905_m1、Applied Biosystems公司製)。於384孔PCR平盤(Applied Biosystems公司製)每1孔，添加5μL之 TaqMan(註冊商標)Fast Advanced Master Mix、2.66μL無RNase水、0.17μL之各基因探針、2μL之調製的cDNA溶液，總量作成10μL，設置於ViiATM7即時PCR系統(Applied Biosystem公司製)，以下列條件實施PCR。即時PCR係對調製的cDNA以N=4來實施。
PCR初期活性化 95℃、20秒
PCR 95℃、1秒
62℃、20秒
此PCR循環係重複40次。
定量解析係以△△Ct法來進行。求得由各核酸脂質粒子投予組之人類PLK-1與人類GAPDH之Ct值之差(△Ct)減去PBS投予組之△Ct的值(△△Ct)，相對於PBS投予組的相對值(RQ)、RQmax及RQmin係以下列式算出。
RQ=2-△△Ct
RQmax=2-95%CI of△△Ct(95%CI of△△Ct：△△Ct之95%信賴區間之最大值)
RQmin=2-95%CI of△△Ct(95%CI of△△Ct：△△Ct之95%信賴區間之最小值)
(CI：confidence interval)：信賴區間)
結果示於第5圖。圖中之誤差線係由以下之式算出。
+誤差線：RQmax-RQ、-誤差線：RQ-RQmin)
其結果，如第5圖所示，具有實施例19、45、及54之化合物的核酸脂質粒子係於腫瘤中顯示強的PLK-1表現抑制活性。由此可知，具有實施例19、45、及、54之化合物的核酸脂質粒子係有益於作為能抑制基因表現的 核酸脂質粒子。
(實施例58)封入mRNA的核酸脂質粒子之調製
二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：以下記載為DSPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下記載為Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、實施例8記載之化合物(作為LP)、及N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(以下記載為PEG-C-DMA)，以DSPC：Chol：LP：PEG-C-DMA=10：48：40：2之莫耳比，成為總脂質濃度10mM的方式溶解於乙醇。將獲得的脂質溶液以體積比成為脂質溶液：檸檬酸緩衝液=3：7的方式滴加至檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)而混合，獲得脂質粒子之粗分散液。
另一方面，將mCherry mRNA(5meC、Ψ)(以下，記載為mCherry mRNA、目錄編號：L-6113、TriLink BioTechnologies,Inc.)或螢火蟲螢光酶(Firefly Luciferase)mRNA(5meC、Ψ)(以下，記載為FLuc mRNA，目錄編號：L-6107、TriLink BioTechnologies,Inc.)，以含30%乙醇的檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)，調製為0.1mg/mL。
接著，LP之分子數(N)與來自mRNA的磷原子數(P)之比率(N/P)以成為N/P=9.0之莫耳比的方式，將上述之脂質粒子之粗分散液790μL與mRNA溶液350μL混合，藉由於37℃培育30分鐘，獲得核酸脂質粒子之分散液。藉 由將核酸脂質粒子之分散液以約100mL之磷酸緩衝液(pH7.4)透析12-18小時(Float-A-Lyzer G2，MWCO：100kD，Spectra/Por)，進行乙醇去除，獲得含mRNA被封入的實施例8記載之化合物的核酸脂質粒子之經純化的分散液。
(實施例59)mRNA封入核酸脂質粒子之特性評價
進行含實施例58所調製的核酸脂質粒子的分散液之特性評價。說明各自之特性評價之方法。
(1)平均粒徑
脂質體之粒徑係以Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)來測定。表中之平均粒徑係表示體積平均粒徑，±以下係表示偏差。
(2)mRNA之封入率
mRNA之封入率係使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit(Invitrogen)，依據所附說明書來測定。
即，於0.015% Triton X-100界面活性劑存在下及非存在下，定量核酸脂質粒子之分散液中之mRNA，並藉由下式算出封入率。
{[界面活性劑存在下的mRNA量]-[界面活性劑非存在下的mRNA量]}/[界面活性劑存在下的mRNA量]}x100(%)
(3)mRNA與脂質之比率
將核酸脂質粒子之分散液中之磷脂質量，使用磷脂質C-Test Wako(和光純藥工業股份有限公司)，依據所附 說明書來測定。即，於1% Triton X-100界面活性劑存在下，定量試料中之磷脂質。
核酸脂質粒子之分散液中之膽固醇及LP量以逆相層析來測定(系統：Agilent 1100系列，管柱：Chromolith Performance RP-18 endcapped 100-3 monolithic HPLC-column(Merck)，緩衝液A：0.01%三氟乙酸，緩衝液B：0.01%三氟乙酸，甲醇，梯度(B%)：82-92%(0-10分鐘)，流速：2mL/分鐘，溫度：50℃，偵測：205nm)。
由磷脂質量、膽固醇量、及LP量及構成脂質體的質成分之組成比，算出總脂質量，由上述(2)之「界面活性劑存在下的mRNA量」，藉由下式算出mRNA與脂質之比率。
[界面活性劑存在下的mRNA濃度]/[總脂質濃度](wt/wt)
結果示於表21。
由以上之結果可知，mRNA被封入脂質粒子內，彼等之核酸脂質粒子係具有約100nm至約200nm之平均粒徑。
(試驗例11)
如以下，測定使用新穎脂質所調製的核酸脂質粒子所致的mCherry的表現。
(1)轉染
將人類肝細胞癌HuH-7細胞株，於含10%胎牛血清的 DMEM培養基(Invitrogen公司製)(培養培養基)中調製為10,000個細胞/mL之濃度。而且，於96孔平底盤(Falcon公司製)各播種100μL，於37℃、5.0%碳酸氣體下培養1日。將實施例58所調製的核酸脂質粒子之分散液於培養基中之最終的mRNA濃度成為2、0.4、及0.08μg/mL的方式於培養培養基製作稀釋列後，添加於去除培養上清液的細胞，再繼續培養。對各濃度以N=3來進行。對照組係僅以培養培養基培養。
(2)mCherry之螢光觀察
轉染之1日後，去除上述之培養培養基，各添加100μL之10N Mildform(和光純藥工業股份有限公司)，於室溫、遮光下放置10分鐘。以DPBS(Dulbecco’s PBS、Life Technologies公司製)洗滌10N Mildform後，各添加50μL之DPBS調製為20μg/mL的Hoechst33342，三鹽酸鹽，三水合物(Invitrogen公司製)，於室溫、遮光下放置1小時。取代為DPBS後，以IN Cell Analyzer 6000(GE Healthcare)，觀察螢光。測定條件示於以下。Hoechst；激發波長：405nm，檢測波長：455nm/50nm(濾光器中心波長/帶寬)、mCherry；激發波長：561nm，檢測波長：605nm/52nm(濾光器中心波長/帶寬)。
其結果示於第6圖。圖上段係呈示經赫斯特染色的核的影樣，下段係呈示mCherry之影像。具有實施例8的核酸脂質粒子會促進mCherry的表現係明顯可知的。由此可知，含實施例8之化合物的核酸脂質粒子係有益作為能促進mRNA的表現得核酸脂質粒子。
(3)螢光酶之表現量測定
轉染之6小時後，使用Luciferase reporter Gene Assay,high sensitivity(Roche公司製)，將螢光酶之表現量，依據所附說明書來測定。相對冷光單位(Relative Luminescent Units(RLU))之N=3之平均值示於表22。
其結果顯示，具有實施例8的核酸脂質粒子促進FLuc之表現。由此可知，含實施例8之化合物的核酸脂質粒子係有益於作為能促進mRNA表現的核酸脂質粒子。
(實施例60)封入雙股多核苷酸的核酸脂質粒子之調製
將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：以下記載為DSPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下記載為Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、實施例8記載之化合物(作為LP)、及N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(以下記載為PEG-C-DMA)，以DSPC：Chol：LP：PEG-C-DMA=10：48：40：2之莫耳比，於乙醇中，調製脂質溶液成為總脂質濃度為26.8mM。
將Nature Biotechnology(2008)26、561-569記載的雙股多核苷酸(siFVII：抗小鼠VII因子的siRNA)，使用含 30%乙醇的檸檬酸緩衝液(10mM Citrate Buffer，pH4.0)，調製為1mg/mL，獲得雙股多核苷酸溶。
將上述之脂質溶液、雙股多核苷酸溶液、及檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)加熱至37℃。使脂質溶液與檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)之體積比成為3：7的方上，將脂質溶液滴加至檸檬酸緩衝液而混合，獲得脂質體粗分散液。接著，使LP之分子數(N)與來自雙股多核苷酸的磷原子數(P)之比率(N/P)成為表23記載之莫耳比的方式，將上述脂質體粗分散液滴加至雙股多核苷酸溶液而混合，藉由於37℃培育30分鐘，獲得核酸脂質粒子之分散液。藉由將核酸脂質粒子之分散液以約100mL之磷酸緩衝液(pH7.4)透析12-18小時(Float-A-Lyzer G2，MWCO：100kD，Spectra/Por)，進行乙醇去除及中和所致的未封入之雙股多核苷酸的去除，獲得由雙股多核苷酸、實施例8記載之脂質而成的核酸脂質粒子之經純化的分散液。
(實施例61)雙股多核苷酸封入核酸脂質粒子 之特性評價
進行實施例60所調製的核酸脂質粒子之分散液之特性評價。以實施例32記載之方法進行特性評價，實施例60記載之核酸脂質粒子之多核苷酸封入率、多核苷酸與脂質之重量比、及平均粒徑示於表24。
由以上之結果可知，雙股多核苷酸係被封入脂質粒子內，彼等之核酸脂質粒係具有約100nm至約200nm之平均粒徑。
(試驗例12)VII(FVII)因子蛋白質測定
VII因子蛋白質測定係依據Nature Biotechnology(2010)28,172-176記載之方法。將C57BL6/J小鼠(雄．9週齡)隨機分組(n=4)。將實施例60所調製的核酸脂質粒子之分散液以成為0.3mg/kg的方式由尾靜脈注射。投予1日後自尾靜脈進行約50μL之採血，獲得血漿。使用獲得的血漿，使用Biophen FVII assay kit(Aniara製)，依據所附的說明書，測定VII因子蛋白質量。
將PBS投予組之各個體之血漿樣品等量收集者之 FVII量作為100%，各個體之血漿樣品之FVII量之相對比率(%)作為測定值(A)。由PBS投予組之各個體之測定值求得彼等之平均值(B)。各個體之測定值(A)之相對比率自式A/Bx100(%)求得，各核酸脂質粒子投予組之相對比率之平均值示於表25。其結果，如表25所示，實施例60所調製的粒子28至35之核酸脂質粒子係顯示強的FVII抑制活性。由此可知，具有如粒子28至35的脂質組成的核酸脂質粒子係有益作為能抑制基因表現的核酸脂質粒子。
[產業上之可利用性]
依據本發明，可提供藉由組合兩性脂質、固醇類、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質而形成脂質粒子的新穎陽離子性脂質。
又，依據本發明，可提供含該陽離子性脂質的脂質粒子。
再者，依據本發明，可提供於該脂質粒子進一步含有核酸的核酸脂質粒子。本發明之該核酸脂質粒子係可成為醫藥組成物。
[序列表之非關鍵詞文字]
序列識別號1：CT-169
序列識別號2：CT-157
序列識別號3：CT-103
序列識別號4：CT-292
序列識別號5：CT-315
序列識別號6：CT-387
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序列識別號15：HS-006s之正義鏈區域
序列識別號16：HS-006s之反義鏈區域
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<222> (18)..(18)
<223> um
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HS-006s之反義股區域
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (3)..(3)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (5)..(5)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2’-O-甲基腺苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (9)..(9)
<223> cm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> 2’-O-甲基腺苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (15)..(15)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> cm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (21)..(21)
<223> um
<400> 16

Claims (65)

  1. 一種通式(Ia)所表示的陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽， 式中，R1及R2係獨立表示氫原子、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6烯基、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C2-C6炔基、或可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C3-C7環烷基，或者，R1及R2與彼等之鍵結的氮原子一起形成3員-10員之雜環，該雜環可具有1或複數個選自取代基群α的取代基，作為該雜環之構成原子，除了R1及R2所鍵結的氮原子之外，可含有1或複數個氮原子、氧原子、或硫原子；R8表示氫原子、可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基；或者，R1及R8可表示一起形成-(CH2)q-基；取代基群α係表示由鹵素原子、側氧基、羥基、硫烷基(sulfanyl group)、胺基、氰基、C1-C6烷基、鹵化C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基胺基、及C1-C7烷醯基組成之群；L1表示可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C24烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1 的取代基之C10-C24烯基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C3-C24炔基、或可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基；L2係與L1獨立，表示可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C24烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C24烯基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C3-C24炔基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷基)基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C24烷氧基)甲基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C24烯基)氧基甲基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C3-C24炔基)氧基甲基、或者，可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷氧基)甲基；取代基群β1係表示由鹵素原子、側氧基、氰基、C1-C6烷基、鹵化C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C7烷醯基、及C1-C7烷醯基氧基、C3-C7烷氧基氧基、(C1-C6烷氧基)羰基、(C1-C6烷氧基)羧基、(C1-C6烷氧基)胺甲醯基、(C1-C6烷基胺基)羧基組成之群；Q表示下述之式(II)所表示的基； L1及L2係具有1或複數個選自取代基群β1的取代基，取代基群β1為C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C7烷醯基、或C1-C7烷醯基氧基的情形，L1所具有的選自取代基群β1的取代基與L2所具有的選自取代基群β1的取代基係可彼此鍵結形成環狀構造；k表示1、2、3、4、5、6或7；m表示0或1；p表示0、1或2；q表示1、2、3或4；r表示0、1、2或3；惟，p+r係2以上、或者，q+r係2以上。
  2. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係獨立為可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C6烷基。
  3. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係獨立為C1-C3烷基。
  4. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係皆為甲基。
  5. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係與彼等鍵結的氮原子一起，形成可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之、吖丁啶、吡咯啶、哌啶、氮呯、二氫吡咯、二氫吡啶、四氫吡啶、哌、啉、二氫唑、或二氫噻唑。
  6. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係與彼等鍵結的氮原子一起，形成可具有1或 複數個選自取代基群α的取代基之吖丁啶、吡咯啶、哌啶、或啉。
  7. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2係與彼等鍵結的氮原子一起，形成吖丁啶、吡咯啶、或啉。
  8. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R8係一起形成-(CH2)q-基；p+q係2、3或4；R2係可具有1或複數個選自取代基群α的取代基之C1-C3烷基。
  9. 如請求項8之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係C1-C3烷基。
  10. 如請求項8之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基。
  11. 如請求項1至10中任一項之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L1係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C17-C19烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C17-C19烯基、或可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C4烷基)-(Q)k-(C4-C9烷基)基；k係1、2或3。
  12. 如請求項1至10中任一項之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L1係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、十七碳三烯基、十八碳三烯基、或十九碳三烯基。
  13. 如請求項1至10中任一項之陽離子性脂質或其藥理上 可容許的鹽，其中L1係(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基、順式-9-十八碳烯基(油醯基)、順式-8,11-十七碳二烯基、順式-9,12-十八碳二烯基(亞油醯基)、順式-10,13-十九碳二烯基、或順式-6,9,12-十八碳三烯基(次亞油醯基)。
  14. 如請求項1至13中任一項之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L2係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C19烷基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之C10-C19烯基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C4烷基)-(Q)k-(C4-C9烷基)基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C19烷氧基)甲基、可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C10-C19烯基)氧基甲基、或可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之(C1-C10烷基)-(Q)k-(C1-C10烷氧基)甲基；k係1、2或3。
  15. 如請求項1至13中任一項之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L2係可具有1或複數個選自取代基群β1的取代基之癸基、癸烯基、十一基、十一烯基、十二基、十二烯基、癸二烯基、十一碳二烯基、十二碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、十七碳三烯基、十八碳三烯基、十九碳三烯基、癸氧基甲基、癸烯氧基甲基、十一基氧基甲基、十一烯基氧基甲基、十二基氧基甲基、十二烯基氧基甲基、癸二烯基氧基甲基、十一碳二烯基氧基甲基、十二 碳二烯基氧基甲基、十七碳二烯基氧基甲基、十八碳二烯基氧基甲基、十九碳二烯基氧基甲基、十七碳三烯基氧基甲基、十八碳三烯基氧基甲基、或十九碳三烯基氧基甲基。
  16. 如請求項1至13中任一項之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中L2係癸基、順式-7-癸烯基、(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基、順式-9-十八碳烯基(油醯基)、順式-8,11-十七碳二烯基、順式-9,12-十八碳二烯基(亞油醯基)、順式-10,13-十九碳二烯基、順式-6,9,12-十八碳三烯基(次亞油醯基)、癸氧基甲基、順式-7-癸烯氧基甲基、(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基氧基甲基、(R)-11-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)-順式-8-十七碳烯基氧基甲基、順式-9-十八碳烯基氧基甲基(油醯基氧基甲基)、順式-8,11-十七碳二烯基氧基甲基、順式-9,12-十八碳二烯基氧基甲基(亞油醯基氧基甲基)、順式-10,13-十九碳二烯基氧基甲基、或順式-6,9,12-十八碳三烯基氧基甲基(次亞油醯基氧基甲基)。
  17. 如請求項1至16中任一項之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中m係0。
  18. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R1及R2皆為甲基；R8係氫原子；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基 、可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p+r係2；m係0。
  19. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基；R1及R8一起成為-(CH2)q-基；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基、可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p係2；q係2；r係0；m係0。
  20. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基；R1及R8一起形成-(CH2)q-基；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基、可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p係1；q係2或3；r係1；m係0。
  21. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其中R2係甲基；R1及R8一起形成-(CH2)q-基；L1係可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烷基、或可經1個乙醯氧基取代之C17-C19烯基；L2係可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烷基、可經1個乙醯氧基取代之C10-C19烯基、可經1個乙醯氧基取代之(C10-C19烷氧基)甲基、或可經1個乙醯 氧基取代之(C10-C19烯基)氧基甲基；p係0；q係3或4；r係2；m係0。
  22. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  23. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  24. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  25. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  26. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  27. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  28. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  29. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  30. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  31. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  32. 如請求項1之陽離子性脂質或其藥理上可容許的鹽，其係下式所表示者 。
  33. 一種脂質粒子，其含有如請求項1至32中任一項之陽離子性脂質。
  34. 如請求項33之脂質粒子，其含有減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質。
  35. 如請求項34之脂質粒子，其中減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質係PEG-脂質。
  36. 如請求項35之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA)、或1,2-二肉豆蔻醯基-sn-丙三醇甲氧基聚乙二醇。
  37. 如請求項35之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA)。
  38. 如請求項35之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二棕櫚基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DPA)、或1,2-二棕櫚醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇。
  39. 如請求項35之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二棕櫚基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DPA)。
  40. 如請求項35之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DSA)、或1,2-二硬脂醯基-sn-丙三醇 甲氧基聚乙二醇。
  41. 如請求項35之脂質粒子，其中PEG-脂質係N-[甲氧基 聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DSA)。
  42. 如請求項35至41中任一項之脂質粒子，其中PEG之分子量係1,000至5,000。
  43. 如請求項35至41中任一項之脂質粒子，其中PEG之分子量係1,800至2,200。
  44. 如請求項33至43中任一項之脂質粒子，其含有固醇類。
  45. 如請求項44之脂質粒子，其中固醇類為膽固醇。
  46. 如請求項33至45中任一項之脂質粒子，其含有兩性脂質。
  47. 如請求項46之脂質粒子，其中兩性脂質係選自二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二肉荳蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、二油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)、及鞘磷脂(SM)之至少任一者。
  48. 如請求項46之脂質粒子，其中兩性脂質係二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)。
  49. 如請求項46至48中任一項之脂質粒子，其中兩性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質之脂質組成以莫耳量計，兩性脂質為25%以下、固醇類為15%以上、陽離子性脂質為20%~70%、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質為1%~10%。
  50. 如請求項46至48中任一項之脂質粒子，其中兩性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質的脂質組成以莫耳量計，兩性脂質為15% 以下、固醇類為32%以上、陽離子性脂質為45%~65%、減少脂質粒子形成之際的凝集的脂質為1.5%~3%。
  51. 一種核酸脂質粒子，其包含如請求項33至50中任一項之脂質粒子及核酸。
  52. 如請求項51之核酸脂質粒子，其中核酸係選自由單股DNA、單股RNA、DNA與RNA混合的單股多核苷酸、雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之雜交多核苷酸及DNA與RNA混合的2種多核苷酸組成之群組的任一者。
  53. 如請求項51之核酸脂質粒子，其中核酸為具有RNA干擾作用的單股或雙股多核苷酸。
  54. 如請求項51之核酸脂質粒子，其中核酸為單股RNA。
  55. 如請求項51至54中任一項之核酸脂質粒子，其陽離子性脂質之分子數(N)與來自核酸的磷原子數(P)之比率(N/P)係2.0~9.0。
  56. 如請求項51至54中任一項之核酸脂質粒子，其陽離子性脂質之分子數(N)與來自核酸的磷原子數(P)之比率(N/P)係3.0~9.0。
  57. 如請求項51至56中任一項之核酸脂質粒子，其平均粒徑為約30nm-約300nm。
  58. 如請求項51至56中任一項之核酸脂質粒子，其平均粒徑為約30nm-約200nm。
  59. 如請求項51至56中任一項之核酸脂質粒子，其平均粒徑為約30nm-約100nm。
  60. 一種醫藥，其含有如請求項51至59中任一項之核酸脂質粒子作為有效成分。
  61. 如請求項60之醫藥，其用於治療或預防來自標的基因表現的疾病。
  62. 如請求項60之醫藥，其中來自標的基因表現的疾病係癌、肝臟疾病、膽囊疾病、纖維症、貧血、或基因疾病。
  63. 一種標的基因之表現抑制方法，其係藉由將如請求項51至59中任一項之核酸脂質粒子投予哺乳動物。
  64. 一種來自標的基因表現的疾病之治療或預防用之方法，其係藉由將如請求項51至59中任一項之核酸脂質粒子投予哺乳動物。
  65. 如請求項64之方法，其中來自標的基因表現的疾病係癌。
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