KR20210091120A

KR20210091120A - Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 공정

Info

Publication number: KR20210091120A
Application number: KR1020217008856A
Authority: KR
Inventors: 슈리랑 카르브; 자르나 파텔; 이 장; 아시쉬 사로데; 레베카 엘. 볼; 프랭크 데로사; 마이클 하틀린
Original assignee: 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-07-21
Also published as: CN112839639A; CA3108920A1; US20200085745A1; US20220395459A1; EP3843709A1; WO2020047061A1; US11357726B2; AU2019333042A1

Abstract

본 발명은 지질 나노입자를 제형화하고 mRNA를 캡슐화하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 사전 형성된 지질 나노입자로 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자와 mRNA의 용액을 저 농도로 혼합하는 단계를 포함한다.

Description

MRNA-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 공정

관련 출원

본 출원은 2018년 8월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/724,582호 및 2018년 8월 31일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/725,765호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 본원에 통합된다.

서열 목록의 참조에 의한 통합

2019년 8월 16일에 생성되었으며 크기가 17 KB인 "MRT_2030WO_Seq_Listing_ST25.txt"라는 명칭의 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 통합한다.

전령 RNA 요법(MRT)은 다양한 질환의 치료에 점점 더 중요한 접근법이 되고 있다. MRT는 환자의 신체 내에서 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 생산하기 위한 요법을 필요로 하는 환자에게 전령 RNA(mRNA)를 투여하는 것을 포함한다. 지질 나노입자는 mRNA의 효율적인 생체 내 전달을 위해 mRNA를 캡슐화하는 데 일반적으로 사용된다.

지질 나노입자 전달을 개선하기 위해, 예를 들어, 다양한 유형의 포유류 조직, 기관 및/또는 세포(예를 들어, 포유류 간 세포)에서 mRNA의 세포내 전달 및/또는 발현에 영향을 미칠 수 있는 신규한 지질 또는 특정 지질 조성물을 식별하는 데 많은 노력을 기울여 왔다. 그러나, 이러한 기존 접근법은 비용이 많이 들고, 시간이 많이 소요되며, 예측이 불가능하다.

본 발명은, 무엇보다도, 미리 형성된 지질 나노입자(LNP)를 mRNA와 혼합함으로써 mRNA-로딩된 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 제조하기 위한 더 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은, 혼합 단계 동안 미리 형성된 LNP 및/또는 mRNA의 농도를 낮추는 것이 캡슐화 효율과 mRNA 회수를 유지하면서 LNP의 응집체의 형성을 피하고/하거나 지질 나노입자의 크기를 감소시키는 것과 같은 예상치 못한 이점을 제공한다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명은 치료 용도를 위한 PEG-변형 지질의 수준이 더 낮은 mRNA-LNP를 제조하는 데 특히 유용하다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 지질 나노입자에 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자가 형성되도록 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA를 포함하는 용액을 혼합하는 단계를 포함하되, 상기 미리 형성된 지질 나노입자 및/또는 mRNA는 0.5 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 이하의 농도로 존재한다.

일부 구현예에서, mRNA는 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA 각각은 0.5 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA 각각은 0.1 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA 각각은 0.05 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 0.5 mg/ml 이하의 원하는 농도를 달성하기 위해 용액을 희석하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 지질 나노입자 중 총 지질의 3% 미만, 2.5% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만 또는 1% 미만을 구성한다.

일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 지질 나노입자 중 총 지질의 0.1% 내지 3%, 또는 0.75% 내지 2.5%, 또는 0.5% 내지 2%를 구성한다.

일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 지질 나노입자 중 총 지질의 약 1%를 구성한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA를 포함하는 용액은 10 mM 미만의 구연산염을 포함한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA를 포함하는 용액은 25% 미만의 비수성 용매를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 용액 중 하나 이상을 주변 온도보다 높은 온도로 가열하는 (또는 가열하여 주변 온도보다 높은 온도로 유지시키는) 단계(즉, 열원으로부터 용액에 열을 인가하는 단계)를 포함하며, 상기 하나 이상의 용액은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 혼합 용액이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 mRNA 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자 용액 중 하나 또는 둘 다를 가열하는 단계를 혼합 단계 전에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 가열하는 단계를 혼합 단계 동안에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 가열하는 단계를 혼합 단계 후에 포함한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상을 가열하는 (또는 용액 중 하나 이상을 유지하는 온도) 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃ 이상이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상을 가열하는 온도는 약 25~70℃, 약 30~70℃, 약 35~70℃, 약 40~70℃, 약 45~70℃, 약 50~70℃, 또는 약 60~70℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상을 가열하는, 주변 온도보다 높은 온도는 약 65℃이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 주변 온도로 유지시키는 단계(즉, 열원으로부터 용액에 열을 인가하지 않는 단계)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 mRNA 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자 용액 중 하나 또는 둘 다를 주변 온도로 유지시키는 단계를 혼합 단계 전에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 주변 온도로 유지시키는 단계를 혼합 단계 동안에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 주변 온도로 유지시키는 단계를 혼합 단계 후에 포함한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 또는 16℃ 이하이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 15~35℃, 약 15~30℃, 약 15~25℃, 약 15~20℃, 약 20~35℃, 약 25~35℃, 약 30~35℃, 약 20~30℃, 약 25~30℃, 또는 약 20~25℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 20~25℃이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액과 mRNA를 포함하는 용액을 혼합하여 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 형성하는 단계를 주변 온도에서 수행하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 에탄올에 용해된 지질을 수용액과 혼합함으로써 형성된다. 일부 구현예에서, 지질은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질, 및 하나 이상의 PEG 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 하나 이상의 콜레스테롤 지질을 또한 함유한다. 미리 형성된 지질 나노입자는 이들 지질을 혼합함으로써 형성된다. 따라서, 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질, 및 하나 이상의 PEG 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 또한 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 cKK-E12, OF-02, C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, ICE (이미다졸계), HGT5000, HGT5001, HGT4003, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA 및 DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, DLinSSDMA, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, 3-(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)-6-(4-((2-하이드록시도데실)(2-하이드록시운데실)아미노)부틸)-1,4-다이옥산-2,5-다이온 (표적 23), 3-(5-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)펜탄-2-일)-6-(5-((2-하이드록시도데실)(2-하이드록시운데실)아미노)펜탄-2-일)-1,4-다이옥산-2,5-다이온 (표적 24), N1GL, N2GL, V1GL, ccBene, ML7, 리보스 양이온성 지질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 ccBene을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 ML7을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 DLinSSDMA를 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 아미노 지질을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 아미노 지질은 WO2017180917에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2017180917에서의 예시적인 아미노지질은 단락 [0744]에서 기술된 것들, 예컨대 DLin-MC3-DMA (MC3), (13Z,16Z)-N,N-다이메틸-3-노닐도코사-13,16-다이엔-1-아민(L608), 및 화합물 18을 포함한다. 다른 아미노 지질은 화합물 2, 화합물 23, 화합물 27, 화합물 10, 및 화합물 20을 포함한다. 추가로, 본 발명에 사용하기에 적합한 아미노 지질은 WO2017112865에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2017112865에서의 예시적인 아미노 지질은 식 (I), (Ial)-(Ia6), (lb), (II), (IIa), (III), (IlIa), (IV), (17-1), (19-1), (19-11), 및 (20-1) 중 하나에 따른 화합물, 및 단락 [00185], [00201], [0276]의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 양이온성 지질은 WO2016118725에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2016118725에서의 예시적인 양이온성 지질은 KL22 및 KL25와 같은 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 양이온성 지질은 WO2016118724에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2016118725에서의 예시적인 양이온성 지질은 KL10, 1 ,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLin-DMA), 및 KL25와 같은 것들을 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-다이올레일-sn-글리세로-3-포스포티딜콜린(DOPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-다이올레일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG)로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C₆-C₂₀ 길이의 알킬 사슬을 가진 지질에 공유 결합된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬을 포함한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 약 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노 입자의 실질적으로 전부는 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의하면 캡슐화율은 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 초과한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 mRNA가 회수된다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA는 펌프 시스템을 사용해 혼합된다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템은 펄스 없는 유동 펌프를 포함한다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템은 기어 펌프(gear pump)이다. 일부 구현예에서, 적절한 펌프는 연동 펌프(peristaltic pump)이다. 일부 구현예에서, 적절한 펌프는 삼투 펌프(centrifugal pump)이다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템을 사용하는 방법은 대규모로 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 것과 같은 펌프를 사용해 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 mRNA 용액을 미리 형성된 지질 나노입자 용액과 혼합하여 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 미리 형성된 지질 나노입자와 혼합하는 방법은 본 발명에 따른 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액은 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분의 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액은 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA는 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분 범위의 유속으로 용액에 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 용액에 혼합된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 구연산염 완충액을 에탄올에 용해된 지질과 혼합하여 미리 형성된 지질 나노입자 용액을 먼저 생성하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 구연산염 완충액을 mRNA 모액과 혼합하여 mRNA 용액을 먼저 생성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적절한 구연산염 완충액은 pH가 약 4.5인 약 10 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl을 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 모액은 약 1 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 50 mg/ml, 또는 약 100 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다.

일부 구현예에서, 구연산염 완충액은 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 또는 4800~6000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 구연산염 완충액은 약 220 ml/분, 약 600 ml/분, 약 1200 ml/분, 약 2400 ml/분, 약 3600 ml/분, 약 4800 ml/분, 또는 약 6000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 10~30 ml/분, 약 30~60 ml/분, 약 60~120 ml/분, 약 120~240 ml/분, 약 240~360 ml/분, 약 360~480 ml/분, 또는 약 480~600 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 20 ml/분, 약 40 ml/분, 약 60 ml/분, 약 80 ml/분, 약 100 ml/분, 약 200 ml/분, 약 300 ml/분, 약 400 ml/분, 약 500 ml/분, 또는 약 600 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 mRNA를 함유하는 수용액을 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 수용액과 혼합함으로써 미리 형성된 지질 나노입자로 제조된다. 일부 구현예에서, mRNA를 함유하는 수용액 및/또는 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 수용액은 트레할로스, 수크로오스, 락토오스, 및 만니톨 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 수용액이다.

일부 구현예에서, 에탄올과 같은 비수성 용매 및 구연산염 중 하나 또는 둘 다는, 미리 형성된 지질 나노입자에 mRNA를 첨가하여 혼합하는 동안, mRNA를 함유하는 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 용액 중 하나 또는 둘 다에 존재하지 않는다(즉, 검출 가능한 수준 미만이다). 일부 구현예에서, mRNA를 함유하는 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 용액 중 하나 또는 둘 다는 완충액 교환됨으로써, 미리 형성된 지질 나노입자에 mRNA를 첨가하여 혼합하기 전에, 에탄올과 같은 비수성 용매 및 구연산염 중 하나 또는 둘 다가 제거된다. 일부 구현예에서, mRNA를 함유하는 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 용액 중 하나 또는 둘 다는 미리 형성된 지질 나노입자에 mRNA를 첨가하여 혼합하는 동안 잔류 구연산염만을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 함유하는 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 용액 중 하나 또는 둘 다는 에탄올과 같은 잔류 비수성 용매만을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 함유하는 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 용액 중 하나 또는 둘 다는, 미리 형성된 지질 나노입자에 mRNA를 첨가하는 동안 약 10 mM 미만(예를 들어, 약 9 mM 미만, 약 8 mM, 약 7 mM, 약 6 mM, 약 5 mM, 약 4 mM, 약 3 mM, 약 2 mM, 또는 약 1 mM 미만)으로 존재하는 구연산염을 함유한다. 일부 구현예에서, mRNA를 함유하는 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자를 함유하는 용액 중 하나 또는 둘 다는, 미리 형성된 지질 나노입자에 mRNA를 첨가하는 동안 약 25% 미만(예를 들어, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만)의 비수성 용매, 예컨대 에탄올을 함유한다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 용액은 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA가 혼합되어 해당 용액을 형성한 후에는 임의의 추가적인 하류 공정(예를 들어, 완충액 교환 및/또는 추가 정제 단계)을 필요로 하지 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 생성된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 상당량이 미리 형성된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 적어도 85%(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)가 미리 형성된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 정제된 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 정제된 지질 나노입자의 약 90% 초과는 약 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 개별 입자 크기를 갖고, 정제된 지질 나노입자의 약 70% 초과는 각각의 개별 입자 내에 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자의 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 약 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 개별 입자 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노 입자의 실질적으로 전부는 약 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 개별 입자 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자의 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 각각의 개별 입자 내에 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자의 실질적으로 전부는 각각의 개별 입자 내에 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다.

일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질, 및/또는 하나 이상의 PEG 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 개별 지질 나노입자는 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 또한 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 cKK-E12, OF-02, C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, ICE(이미다졸계), HGT5000, HGT5001, HGT4003, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA 및 DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, 3-(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)-6-(4-((2-하이드록시도데실)(2-하이드록시운데실)아미노)부틸)-1,4-다이옥산-2,5-다이온(표적 23), 3-(5-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)펜탄-2-일)-6-(5-((2-하이드록시도데실)(2-하이드록시운데실)아미노)펜탄-2-일)-1,4-다이옥산-2,5-다이온(표적 24), N1GL, N2GL, V1GL, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 아미노 지질을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 아미노 지질은 WO2017180917에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2017180917에서의 예시적인 아미노지질은 단락 [0744]에서 기술된 것들, 예컨대 DLin-MC3-DMA (MC3), (13Z,16Z)-N,N-다이메틸-3-노닐도코사-13,16-다이엔-1-아민(L608), 및 화합물 18을 포함한다. 다른 아미노 지질은 화합물 2, 화합물 23, 화합물 27, 화합물 10, 및 화합물 20을 포함한다. 추가로, 본 발명에 사용하기에 적합한 아미노 지질은 WO2017112865에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2017112865에서의 예시적인 아미노 지질은 식 (I), (Ial)-(Ia6), (lb), (II), (IIa), (III), (IlIa), (IV), (17-1), (19-1), (19-11), 및 (20-1) 중 하나에 따른 화합물, 및 단락 [00185], [00201], [0276]의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 양이온성 지질은 WO2016118725에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2016118725에서의 예시적인 양이온성 지질은 KL22 및 KL25와 같은 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 양이온성 지질은 WO2016118724에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. WO2016118725에서의 예시적인 양이온성 지질은 KL10, 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLin-DMA), 및 KL25와 같은 것들을 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤 또는 PEG화 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C₆-C₂₀ 길이의 알킬 사슬을 가진 지질에 공유 결합된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬을 함유한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 mRNA를 캡슐화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 유사우리딘(pseudouridine)으로 변형된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 5-메틸시티딘으로 변형된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 변형되지 않은 mRNA를 캡슐화하는 데 사용된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 지질 나노입자의 실질적인 응집을 초래하지 않는다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 다양한 방법을 사용하여 제조된, mRNA 로딩된 LNP를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 LNP의 실질적인 응집 없이 mRNA 로딩된 LNP를 포함하는 (예를 들어, 캡슐화 효율이 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 초과인) 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, mRNA 로딩된 LNP는 낮은 수준의 PEG-변형 지질(예를 들어, LNP 중 총 지질의 3%, 2.5%,2%, 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만)을 함유한다. 추가로, 본 발명은 생체 내에서 단백질을 생산하기 위해 mRNA를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 mRNA는 하나 이상의 관심 단백질(들) 또는 펩티드(들)를 암호화한다.

본원에서, 달리 명시되지 않는 한, "또는(or)"은 "및/또는(and/or)"을 의미한다. 본 개시에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함(comprise)" 및 이 용어의 다양한 형태, 예컨대 "포함하는(comprising) 및 포함하다(comprises)" 등은 다른 첨가물, 구성 요소, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)" 및 "대략(approximately)"은 동등하게 사용된다. 두 용어는 당업자가 이해하는 임의의 표준적인 변동폭을 포함하는 것으로 간주된다.

본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이어지는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위에서 자명해진다. 하지만, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위가 본 발명의 구현예를 나타내지만, 이는 제한을 위해서가 아니라 단지 예시를 위해 주어지는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변형 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백해질 것이다.

정의

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다.

알킬: 본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소기의 라디칼을 지칭한다("C_1-20 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C_1-3 알킬"). C_1-3 알킬기의 예는 메틸(C₁), 에틸 (C₂), n-프로필(C₃), 및 이소프로필(C₃)을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬기는 8 내지 12개의 탄소 원자를 갖는다("C_8-12 알킬"). C_8-12 알킬기의 예는 n-옥틸(C₈), n-노닐 (C₉), n-데실(C₁₀), n-운데실(C₁₁), n-도데실(C₁₂) 등을 포함하되, 이들로 한정되지는 않는다. 접두어인 "n-"(normal)은 분지되지 않은 알킬기를 지칭한다. 예를 들어, n-C₈ 알킬은 -(CH₂)₇CH₃을 지칭하고, n-C₁₀ 알킬은 -(CH₂)₉CH₃을 지칭하는 등과 같다.

아미노산: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로는, 폴리펩티드 사슬에 포함될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 아미노산은 일반적인 구조인 H₂N-C(H)(R)-COOH를 가진다. 일부 실시예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 실시예에서, 아미노산은 합성 아미노산이고, 일부 실시예에서 아미노산은 D-아미노산이며; 일부 실시예에서 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 주로 자연 발생 펩티드에서 발견되는 임의의 20종의 L-아미노산을 말한다. "비표준 아미노산"은 합성하여 제조되었는지 또는 천연 원료에서 얻은 것인지에 관계없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "합성 아미노산"은 염, 아미노산 유도체(예컨대 아미드), 및/또는 치환물을 포함하는 화학적으로 변형된 아미노산을 포함하되, 이들로 한정되지는 않는다. 펩티드의 카복시-말단 아미노산 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하여, 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기에 의해 변형되고/되거나, 펩티드의 활성에 악영향을 미치지 않으면서 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학적 작용기와의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 이황화(disulfide) 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 하나 이상의 번역 후 변형, 예컨대, 하나 이상의 화학적 엔티티(예를 들어, 메틸기, 아세테이트기, 아세틸기, 포스페이트기, 포밀 모이어티, 이소프레노이드기, 설페이트기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 바이오틴 모이어티 등)와의 회합을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호 교환적으로 사용되고, 유리 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 유리 아미노산을 언급하는지 펩티드의 잔기를 언급하는지는 이 용어가 사용되는 문맥으로부터 분명해질 것이다.

동물(animal): 본원에서 사용되는 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비인간 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 비인간 동물은 포유류(예컨대, 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 동물은 유전자 이식 동물, 유전자 조작 동물, 및/또는 클론일 수 있다.

대략(approximately) 또는 약(about): 본원에서 사용되는 용어 "대략(approximately)" 또는 "약(about)"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 진술되거나 달리 문맥으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 나타낸다.

전달: 본원에서 사용되는 용어 "전달"은 국소적인 전달과 전신 전달 둘 다를 포함한다. 예를 들어, mRNA의 전달은: mRNA가 표적 조직에 전달되고, 암호화된 단백질 또는 펩티드가 발현되고, 표적 조직 내에 유지되는 상황("국소 분포" 또는 "국소 전달"로도 지칭됨); 및 mRNA가 표적 조직에 전달되고, 암호화된 단백질 또는 펩티드가 발현되고, 환자의 순환계(예컨대, 혈청) 내로 분비되고, 전신에 분포되어 다른 조직에 의해 흡수되는 상황("전신 분포" 또는 "전신 전달"로도 지칭됨)을 포함한다.

효능: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효능" 또는 문법적으로 동등한 표현은, 관련 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA의 전달과 관련하여, 생물학적으로 관련된 평가변수가 개선되는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 생물학적 평가변수는 투여 후 특정 시점에 염화암모늄 접종에 대항하여 보호하는 것이다.

캡슐화: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캡슐화" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 개별 mRNA 분자를 나노입자 내에 가두는 공정을 지칭한다.

발현: 본원에서 사용되는 바와 같이, mRNA의 "발현"은 mRNA를 펩티드(예: 항원), 폴리펩티드, 또는 단백질(예: 효소)로 번역하는 것을 지칭하며, 문맥으로 나타나는 바와 같이, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 완전 조립된 단백질(예: 효소)의 번역 후 변형을 포함할 수도 있다. 본 출원에서, 용어 "발현" 및 "생산" 및 문법적으로 동등한 표현은 상호교환적으로 사용된다.

개선(improve), 증가(increase) 또는 감소(reduce): 본원에서 사용되는, 용어 "개선", "증가" 또는 "감소", 또는 문법적으로 동등한 표현은 베이스라인 측정치, 예컨대, 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 샘플 또는 대상체(또는 다수의 대조군 샘플 또는 대상체)에서의 측정치에 대한 상대적인 값을 나타낸다. "대조군 샘플"은 시험 항목을 제외하고는, 시험 샘플과 동일한 조건을 거치는 샘플이다. "대조군 대상체"는 치료 받는 대상체와 동일한 형태의 질환에 걸린 대상체로서, 치료 받는 대상체와 거의 동일한 연령이다.

불순물(impurities): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불순물"은 구속된 양의 액체, 기체 또는 고체 내부에 있는 물질로서, 표적 물질 또는 화합물의 화학적 조성과 상이한 물질을 지칭한다. 불순물은 오염물로도 지칭된다.

시험관내(in vitro): 본원에서 사용되는, 용어 "시험관내(in vitro)"는 다세포 유기체 내가 아니라 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 말한다.

생체내(In Vivo): 본원에서 사용되는, 용어 "생체내(in vivo)"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 말한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들어, 시험관내 시스템에 반대되는) 생세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하도록 사용될 수 있다.

단리된(isolated): 본원에서 사용되는 바, 용어 "분리된"은 (1) 최초에 생산되었을 때(자연적이고/이거나 실험 환경이거나) 결합된 적어도 일부의 구성 성분으로부터 분리된 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 엔티티(entity)를 말한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 최초에 결합된 다른 구성 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 보다 높은 순도이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 다른 성분이 없는 경우, 물질은 "순수"하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 엔티티의 순도 백분율의 계산에는 부형제(예컨대, 완충액, 용매, 물 등)가 포함되지 않아야 한다.).

국소 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는 용어 "국소 분포", "국소 전달" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 조직 특이적 전달 또는 분포를 지칭한다. 일반적으로, 국소 분포 또는 전달은 mRNA에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질(예컨대, 효소)이 세포 내에서 번역되고 발현되는 것을 필요로 하거나, 제한적으로 분비되어 환자의 순환계 내로 들어가지 않는 것을 필요로 한다.

전령 RNA(mRNA): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전령 RNA(mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, mRNA는 변형 및 비변형 RNA 둘 다를 망라한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비코딩 영역을 함유할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용해 생산되고 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. mRNA 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5' 에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 유사우리딘, 및 5-메틸시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예컨대, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예컨대, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트 기(예컨대, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포아미다이트 연결)이거나 이를 포함한다.

핵산: 본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미로 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예컨대, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 말한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 말한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다.

환자: 본원에서 사용되는, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 예컨대, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적을 위해 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 말한다. 전형적인 환자는 동물(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다.

약학적으로 허용 가능한: 본원에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 철저한 의학적 판단의 범주내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간과 동물의 조직과의 접촉에 있어 사용에 적합하고, 합리적인 유익성/위험성 비(benefit/risk ratio)에 상응하는 물질을 말한다.

약학적으로 허용 가능한 염: 약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용 가능한 염에 대해 J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19에서 상세하게 기술하고 있다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산과 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 비독성 산 첨가염의 예는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산, 또는 말론산과 같은 유기산으로 형성된 아미노기의 염 또는 이온교환과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용 가능한 염은 아디핀산염(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코르브산염(ascorbate), 아스파르트산염(aspartate), 벤젠설폰산염(benzenesulfonate), 벤조산염(benzoate), 중황산염(bisulfate), 붕산염(borate), 낙산염(butyrate), 캄퍼산염(camphorate), 캄퍼설폰산염(camphorsulfonate), 구연산염(citrate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 다이글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄설폰산염(ethanesulfonate), 포름산염(formate), 푸마르산염(fumarate), 글루코헵토네이트(glucoheptonate), 글리세로인산염(glycerophosphate), 글루코네이트(gluconate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 요오드화수소산염(hydroiodide), 2-하이드록시-에탄설폰산염(2-hydroxy-ethanesulfonate), 락토바이온산염(lactobionate), 젖산염(lactate), 라우린산염(laurate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 말론산염(malonate), 메탄설폰산염(methanesulfonate), 2-나프탈렌설폰산염(2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 질산염(nitrate), 올레산염(oleate), 옥살산염(oxalate), 팔미트산염(palmitate), 파모산염(pamoate), 펙티닌산염(pectinate), 과황산염(persulfate), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionate), 인산염(phosphate), 피크르산염(picrate), 피발산염(pivalate), 프로피온산염(propionate), 스테아르산염(stearate), 숙신산염(succinate), 황산염(sulfate), 주석산염(tartrate), 티오시안산염(thiocyanate), p-톨루엔설폰산염(p-toluenesulfonate), 운데카노에이트(undecanoate), 발레르산염(valerate salts) 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 및 N⁺(C_1-4 알킬)₄ 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용 가능한 염은 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 할로겐화물, 수산화물, 카복시산염(carboxylate), 황산염, 인산염, 질산염, 설폰산염 및 아릴 설폰산염과 같은 반대 이온(counterion)을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용 가능한 염은 예컨대 알킬 할로겐화물과 같은 적절한 친전자물질을 사용하여 4급 알킬 아미노염(quarternized alkylated amino salt)을 형성하는 아민의 4급화로 형성된 염을 포함한다.

효험(potency): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효험" 또는 문법적으로 동등한 표현은 mRNA에 의해 암호화되는 단백질(들) 또는 펩티드(들)의 발현 및/또는 이에 기인하는 생물학적 효과를 지칭한다.

염: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "염"은 산과 염기 사이의 중화 반응에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 이온 화합물을 지칭한다.

전신 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는, 용어 "전신 분포" 또는 "전신 전달" 또는 문법적으로 동등한 표현은 전신 또는 전체 유기체에 영향을 주는 전달 또는 분포 메커니즘 또는 접근법을 말한다. 일반적으로 전신 분포 또는 전달은 예컨대 혈류와 같은 신체의 순환계를 통해 달성된다. "국소 분포 또는 전달"의 정의와 비교됨.

대상체(subject): 본원에서 사용되는, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 말한다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 가는 인간을 지칭하는 것으로, 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개인" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 취약하지만 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.

실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바, 용어 "실질적으로(substantially)"는 관심있는 특징이나 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인(qualititave) 상태를 말한다. 생물학 분야의 당업자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/지거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 현상 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적인 결여를 표현하기 위해 본원에서 사용된다.

표적 조직(Target tissues): 본원에서 사용되는, 용어 "표적 조직"은 치료 대상 질환이 발생된 임의의 조직을 말한다. 일부 구현예에서, 표적 조직은 질환 관련 병상, 증상 또는 특징을 나타내는 조직들을 포함한다.

치료: 본원에서 사용되는, 용어 "치료(treat, treatment, 또는 treating)"는 부분적으로 또는 완전하게 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제하고, 예방하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 발생 빈도를 감소시키는 임의의 방법을 말한다. 질환의 징후를 보이지 않고/않거나 질환의 초기 징후만을 보이는 대상체에 질환과 관련된 병상이 생길 위험을 감소시킬 목적으로 치료가 시행될 수 있다.

수율: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수율(yield)"은 출발 물질로서의 총 mRNA과 비교해 캡슐화 후 회수된 mRNA의 백분율을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "회수(recovery)"는 용어 "수율"과 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명은 지질 나노입자(LNP)를 제형화하고, 미리 형성된 지질 LNP와 mRNA를 저농도로 혼합하는 것에 기초하여 mRNA를 캡슐화하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 LNP 중 하나 또는 둘 다와 mRNA는 캡슐화를 위해 1 mg/ml 이하(예를 들어, 0.9 mg/ml 이하, 0.8 mg/ml, 0.7 mg/ml 이하, 0.6 mg/ml 이하, 0.5 mg/ml 이하, 0.4 mg/ml 이하, 0.3 mg/ml 이하, 0.2 mg/ml 이하, 0.1 mg/ml 이하, 0.09 mg/ml 이하, 0.08 mg/ml 이하, 0.07 mg/ml 이하, 0.06 mg/ml 이하, 0.05 mg/ml 이하, 0.04 mg/ml 이하, 0.03 mg/ml 이하, 0.02 mg/ml 이하, 또는 0.01 mg/ml 이하)의 농도로 혼합된다.

일부 구현예에서, 본 지질 나노입자 제형화 및 제조 방법을 위한 최종 캡슐화 효율은 약 90%이다. 핵산의 전달을 위해서는, 높은 캡슐화 효율을 달성하는 것이 원료 의약품의 보호를 달성하고 생체 내 활성 손실을 감소시키는 데 중요하다. 또한, 본 발명의 신규한 방법에 의해 제조된 지질 나노입자 제형에 대한 놀라운 결과는 시험관 내에서 상당히 높은 형질감염 효율이 관찰되었다는 것이다.

본 발명의 다양한 양태는 다음의 섹션들에서 상세히 기술된다. 섹션들의 사용은 본 발명을 제한하는 것을 의도하지 않는다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다.

전령 RNA(mRNA)

본 발명은 임의의 mRNA를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. mRNA는 일반적으로 DNA로부터 리보솜에 정보를 전달하는 유형의 RNA로 간주된다. 일반적으로, 진핵 생물에서, mRNA 가공은 5' 말단 상에 "캡"을 추가하고 3' 말단 상에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 통상적인 캡은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결되는 구아노신인, 7- 메틸구아노신 캡이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. 꼬리의 추가는 일반적으로 폴리아데닐화 이벤트이며, 이에 의해 폴리아데닐릴 모이어티가 mRNA 분자의 3' 말단에 첨가된다. 이러한 "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 전령 RNA는 리보솜에 의해, 단백질을 구성하는 일련의 아미노산으로 번역된다.

mRNA는 알려진 다양한 방법 중 어느 하나에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 간단히 말하면, IVT는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다.

일부 구현예에서, 시험관내 합성 mRNA는, mRNA 합성 중에 사용되는 다양한 효소 및 기타 시약을 포함하는 바람직하지 않은 불순물을 제거하기 위해 제형화 및 캡슐화 전에 정제될 수 있다.

본 발명은 다양한 길이의 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 또는 20 kb보다 큰, 시험관 내에서 합성된 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1~20 kb, 약 1~15 kb, 약 1~10 kb, 약 5~20 kb, 약 5~15 kb, 약 5~12 kb, 약 5~10 kb, 약 8~20 kb, 또는 약 8~15 kb 범위인, 시험관 내에서 합성된 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 변형되지 않은 mRNA 또는 일반적으로 안정성을 향상시키는 하나 이상의 변형을 포함하는 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형은 변형 뉴클레오티드, 변형 당 인산 골격, 및 5' 및/또는 3' 비번역 영역으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, mRNA의 변형은 RNA의 뉴클레오티드의 변형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 변형 mRNA는 예를 들어, 골격 변형, 당 변형, 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U))을 포함하되 이에 한정되지 않는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체(변형 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있고, 퓨린과 피리미딘의 변형 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서, 예컨대, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-다이메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 유사우라실(5-우라실), 다이하이드로우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-유사우라실, 큐에오신(queosine), 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신(wybutoxosine), 및 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 유사우리딘, 5-메틸시티딘, 및 이노신 등으로서 합성될 수 있다. 이와 같은 유사체의 제조는 미국 등록특허 번호 제4,373,071호, 미국 등록특허 번호 제4,401,796호, 미국 등록특허 번호 제4,415,732호, 미국 등록특허 번호 제4,458,066호, 미국 등록특허 번호 제4,500,707호, 미국 등록특허 번호 제4,668,777호, 미국 등록특허 번호 제4,973,679호, 미국 등록특허 번호 제5,047,524호, 미국 등록특허 번호 제5,132,418호, 미국 등록특허 번호 제5,153,319호, 미국 등록특허 번호 제5,262,530호, 및 미국 등록특허 번호 제5,700,642호에서 당업자에게 공지되어 있고, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.

일반적으로, mRNA 합성은 5' 말단에 "캡"을 추가하고 3' 말단에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.

따라서, 일부 구현예에서, mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 우선, RNA 말단 인산가수분해효소가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 인산기 중 하나를 제거하고, 2개의 말단 인산기를 남긴다; 그런 다음, 구아노신 삼인산(guanosine triphosphate, GTP)이 구아닐릴(guanylyl) 전이효소를 통해 말단 인산에 첨가되고 5'5'5 삼인산 결합을 생성한다; 그런 다음 구아닌의 7-질소가 메틸기 전이효소에 의해 메틸화된다. 2'-O-메틸화는 또한 7-메틸 구아노신 트리포스페이트 잔기 다음의 제1 염기 및/또는 제2 염기에서 일어날 수 있다. 캡 구조의 예는 m7GpppNp-RNA, m7GpppNmpNmp-RNA, 및 m7GpppNmpNmp-RNA를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다(여기서 m은 2'-O메틸 잔기를 나타냄).

일부 구현예에서, mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어, 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드일 수 있다.

일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위 중 하나 이상, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 길이가 50 내지 500개의 뉴클레오티드이거나 더 길 수 있다.

시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 일부 구현예에서 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 mRNA를 포함하는 다른 mRNA 공급원이 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 고려된다.

본 발명은 다양한 단백질을 암호화하는 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 적합한 mRNA의 비제한적인 예는 척수 운동 뉴런 1(SMN), 알파-갈락토시다아제(GLA), 아르기니노숙신산염 합성효소(ASS1), 오르니틴 트랜스카바밀라아제(OTC), 인자 IX(FIX), 페닐알라닌 하이드록실라아제(PAH), 에리트로포이에틴(EPO), 낭성 섬유증 막관통 전도 수용체(CFFF), 및 반딧불이 루시퍼라아제(FFL)를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 예시적인 mRNA 서열은 아래에 열거되어 있다:

코돈 최적화된 인간 OTC 코딩 서열

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코돈 최적화된 인간 ASS1 코딩 서열

AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA (서열번호 2)

코돈 최적화된 인간 CFTR 코딩 서열

AUGCAACGCUCUCCUCUUGAAAAGGCCUCGGUGGUGUCCAAGCUCUUCUUCUCGUGGACUAGACCCAUCCUGAGAAAGGGGUACAGACAGCGCUUGGAGCUGUCCGAUAUCUAUCAAAUCCCUUCCGUGGACUCCGCGGACAACCUGUCCGAGAAGCUCGAGAGAGAAUGGGACAGAGAACUCGCCUCAAAGAAGAACCCGAAGCUGAUUAAUGCGCUUAGGCGGUGCUUUUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGCAUCUUCCUCUACCUGGGAGAGGUCACCAAGGCCGUGCAGCCCCUGUUGCUGGGACGGAUUAUUGCCUCCUACGACCCCGACAACAAGGAAGAAAGAAGCAUCGCUAUCUACUUGGGCAUCGGUCUGUGCCUGCUUUUCAUCGUCCGGACCCUCUUGUUGCAUCCUGCUAUUUUCGGCCUGCAUCACAUUGGCAUGCAGAUGAGAAUUGCCAUGUUUUCCCUGAUCUACAAGAAAACUCUGAAGCUCUCGAGCCGCGUGCUUGACAAGAUUUCCAUCGGCCAGCUCGUGUCCCUGCUCUCCAACAAUCUGAACAAGUUCGACGAGGGCCUCGCCCUGGCCCACUUCGUGUGGAUCGCCCCUCUGCAAGUGGCGCUUCUGAUGGGCCUGAUCUGGGAGCUGCUGCAAGCCUCGGCAUUCUGUGGGCUUGGAUUCCUGAUCGUGCUGGCACUGUUCCAGGCCGGACUGGGGCGGAUGAUGAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGAAAGAUUUCCGAACGGCUGGUGAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCAGUGAAGGCCUACUGCUGGGAAGAGGCCAUGGAAAAGAUGAUUGAAAACCUCCGGCAAACCGAGCUGAAGCUGACCCGCAAGGCCGCUUACGUGCGCUAUUUCAACUCGUCCGCUUUCUUCUUCUCCGGGUUCUUCGUGGUGUUUCUCUCCGUGCUCCCCUACGCCCUGAUUAAGGGAAUCAUCCUCAGGAAGAUCUUCACCACCAUUUCCUUCUGUAUCGUGCUCCGCAUGGCCGUGACCCGGCAGUUCCCAUGGGCCGUGCAGACUUGGUACGACUCCCUGGGAGCCAUUAACAAGAUCCAGGACUUCCUUCAAAAGCAGGAGUACAAGACCCUCGAGUACAACCUGACUACUACCGAGGUCGUGAUGGAAAACGUCACCGCCUUUUGGGAGGAGGGAUUUGGCGAACUGUUCGAGAAGGCCAAGCAGAACAACAACAACCGCAAGACCUCGAACGGUGACGACUCCCUCUUCUUUUCAAACUUCAGCCUGCUCGGGACGCCCGUGCUGAAGGACAUUAACUUCAAGAUCGAAAGAGGACAGCUCCUGGCGGUGGCCGGAUCGACCGGAGCCGGAAAGACUUCCCUGCUGAUGGUGAUCAUGGGAGAGCUUGAACCUAGCGAGGGAAAGAUCAAGCACUCCGGCCGCAUCAGCUUCUGUAGCCAGUUUUCCUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAGGAAAACAUCAUCUUCGGCGUGUCCUACGAUGAAUACCGCUACCGGUCCGUGAUCAAAGCCUGCCAGCUGGAAGAGGAUAUUUCAAAGUUCGCGGAGAAAGAUAACAUCGUGCUGGGCGAAGGGGGUAUUACCUUGUCGGGGGGCCAGCGGGCUAGAAUCUCGCUGGCCAGAGCCGUGUAUAAGGACGCCGACCUGUAUCUCCUGGACUCCCCCUUCGGAUACCUGGACGUCCUGACCGAAAAGGAGAUCUUCGAAUCGUGCGUGUGCAAGCUGAUGGCUAACAAGACUCGCAUCCUCGUGACCUCCAAAAUGGAGCACCUGAAGAAGGCAGACAAGAUUCUGAUUCUGCAUGAGGGGUCCUCCUACUUUUACGGCACCUUCUCGGAGUUGCAGAACUUGCAGCCCGACUUCUCAUCGAAGCUGAUGGGUUGCGACAGCUUCGACCAGUUCUCCGCCGAAAGAAGGAACUCGAUCCUGACGGAAACCUUGCACCGCUUCUCUUUGGAAGGCGACGCCCCUGUGUCAUGGACCGAGACUAAGAAGCAGAGCUUCAAGCAGACCGGGGAAUUCGGCGAAAAGAGGAAGAACAGCAUCUUGAACCCCAUUAACUCCAUCCGCAAGUUCUCAAUCGUGCAAAAGACGCCACUGCAGAUGAACGGCAUUGAGGAGGACUCCGACGAACCCCUUGAGAGGCGCCUGUCCCUGGUGCCGGACAGCGAGCAGGGAGAAGCCAUCCUGCCUCGGAUUUCCGUGAUCUCCACUGGUCCGACGCUCCAAGCCCGGCGGCGGCAGUCCGUGCUGAACCUGAUGACCCACAGCGUGAACCAGGGCCAAAACAUUCACCGCAAGACUACCGCAUCCACCCGGAAAGUGUCCCUGGCACCUCAAGCGAAUCUUACCGAGCUCGACAUCUACUCCCGGAGACUGUCGCAGGAAACCGGGCUCGAAAUUUCCGAAGAAAUCAACGAGGAGGAUCUGAAAGAGUGCUUCUUCGACGAUAUGGAGUCGAUACCCGCCGUGACGACUUGGAACACUUAUCUGCGGUACAUCACUGUGCACAAGUCAUUGAUCUUCGUGCUGAUUUGGUGCCUGGUGAUUUUCCUGGCCGAGGUCGCGGCCUCACUGGUGGUGCUCUGGCUGUUGGGAAACACGCCUCUGCAAGACAAGGGAAACUCCACGCACUCGAGAAACAACAGCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCCACCUCCUCUUAUUACGUGUUCUACAUCUACGUCGGAGUGGCGGAUACCCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCAGAGGACUGCCGCUGGUCCACACCUUGAUCACCGUCAGCAAGAUUCUUCACCACAAGAUGUUGCAUAGCGUGCUGCAGGCCCCCAUGUCCACCCUCAACACUCUGAAGGCCGGAGGCAUUCUGAACAGAUUCUCCAAGGACAUCGCUAUCCUGGACGAUCUCCUGCCGCUUACCAUCUUUGACUUCAUCCAGCUGCUGCUGAUCGUGAUUGGAGCAAUCGCAGUGGUGGCGGUGCUGCAGCCUUACAUUUUCGUGGCCACUGUGCCGGUCAUUGUGGCGUUCAUCAUGCUGCGGGCCUACUUCCUCCAAACCAGCCAGCAGCUGAAGCAACUGGAAUCCGAGGGACGAUCCCCCAUCUUCACUCACCUUGUGACGUCGUUGAAGGGACUGUGGACCCUCCGGGCUUUCGGACGGCAGCCCUACUUCGAAACCCUCUUCCACAAGGCCCUGAACCUCCACACCGCCAAUUGGUUCCUGUACCUGUCCACCCUGCGGUGGUUCCAGAUGCGCAUCGAGAUGAUUUUCGUCAUCUUCUUCAUCGCGGUCACAUUCAUCAGCAUCCUGACUACCGGAGAGGGAGAGGGACGGGUCGGAAUAAUCCUGACCCUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACCCUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUCGACGUGGACAGCCUGAUGCGAAGCGUCAGCCGCGUGUUCAAGUUCAUCGACAUGCCUACUGAGGGAAAACCCACUAAGUCCACUAAGCCCUACAAAAAUGGCCAGCUGAGCAAGGUCAUGAUCAUCGAAAACUCCCACGUGAAGAAGGACGAUAUUUGGCCCUCCGGAGGUCAAAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCAAAGUACACCGAGGGAGGAAACGCCAUUCUCGAAAACAUCAGCUUCUCCAUUUCGCCGGGACAGCGGGUCGGCCUUCUCGGGCGGACCGGUUCCGGGAAGUCAACUCUGCUGUCGGCUUUCCUCCGGCUGCUGAAUACCGAGGGGGAAAUCCAAAUUGACGGCGUGUCUUGGGAUUCCAUUACUCUGCAGCAGUGGCGGAAGGCCUUCGGCGUGAUCCCCCAGAAGGUGUUCAUCUUCUCGGGUACCUUCCGGAAGAACCUGGAUCCUUACGAGCAGUGGAGCGACCAAGAAAUCUGGAAGGUCGCCGACGAGGUCGGCCUGCGCUCCGUGAUUGAACAAUUUCCUGGAAAGCUGGACUUCGUGCUCGUCGACGGGGGAUGUGUCCUGUCGCACGGACAUAAGCAGCUCAUGUGCCUCGCACGGUCCGUGCUCUCCAAGGCCAAGAUUCUGCUGCUGGACGAACCUUCGGCCCACCUGGAUCCGGUCACCUACCAGAUCAUCAGGAGGACCCUGAAGCAGGCCUUUGCCGAUUGCACCGUGAUUCUCUGCGAGCACCGCAUCGAGGCCAUGCUGGAGUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAGGAGAACAAGGUCCGCCAAUACGACUCCAUUCAAAAGCUCCUCAACGAGCGGUCGCUGUUCAGACAAGCUAUUUCACCGUCCGAUAGAGUGAAGCUCUUCCCGCAUCGGAACAGCUCAAAGUGCAAAUCGAAGCCGCAGAUCGCAGCCUUGAAGGAAGAGACUGAGGAAGAGGUGCAGGACACCCGGCUUUAA (서열번호 3)

코돈 최적화된 인간 CFTR mRNA 코딩 서열 비교

AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA (서열번호 4)

코돈 최적화된 인간 PAH 코딩 서열

AUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCCCAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAA (서열번호 5)

일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 mRNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 mRNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

mRNA 용액

mRNA는 지질 용액과 혼합하기 위한 용액으로 제공될 수 있으므로, mRNA는 지질 나노입자로 캡슐화될 수 있다. 적절한 mRNA 용액은 1 mg/ml 미만의 다양한 농도로 캡슐화할 mRNA를 함유하는 임의의 수용액일 수 있다. 예를 들어, 적절한 mRNA 용액은 약 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 또는 1.0 mg/m 이하의 농도로 mRNA를 함유할 수 있다.

일반적으로, 적절한 mRNA 용액은 완충제 및/또는 염을 함유할 수도 있다. 일반적으로, 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨 및 인산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제의 적절한 농도는 약 0.1 mM 내지 100 mM, 0.5 mM 내지 90 mM, 1.0 mM 내지 80 mM, 2 mM 내지 70 mM, 3 mM 내지 60 mM, 4 mM 내지 50 mM, 5 mM 내지 40 mM, 6 mM 내지 30 mM, 7 mM 내지 20 mM, 8 mM 내지 15 mM, 또는 9 내지 12 mM의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제의 적절한 농도는 약 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 또는 50 mM 이상이다.

예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 중 염의 적절한 농도는 약 1 mM 내지 500 mM, 5 mM 내지 400 mM, 10 mM 내지 350 mM, 15 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 250 mM, 30 mM 내지 200 mM, 40 mM 내지 190 mM, 50 mM 내지 180 mM, 50 mM 내지 170 mM, 50 mM 내지 160 mM, 50 mM 내지 150 mM, 또는 50 mM 내지 100 mM의 범위일 수 있다. 적절한 mRNA 용액 중 염 농도는 약 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM 이상이다.

일부 구현예에서, 적절한 mRNA 용액은 약 3.5~6.5, 3.5~6.0, 3.5~5.5, 3.5~5.0, 3.5~4.5, 4.0~5.5, 4.0~5.0, 4.0~4.9, 4.0~4.8, 4.0~4.7, 4.0~4.6, 또는 4.0~4.5 범위의 pH를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 용액은 약 3.5, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.1, 6.3, 및 6.5 이하의 pH를 가질 수 있다.

본 발명에 적절한 mRNA 용액은 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 본원에 기술된 완충액에 직접 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은, 캡슐화를 위해 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합하기 전에 mRNA 모액과 완충액을 혼합함으로써 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은, 캡슐화를 위해 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합하기 직전에 mRNA 모액과 완충액을 혼합함으로써 생성할 수 있다. 예를 들어, 적절한 mRNA 모액은 물 중 mRNA를 약 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 또는 1.6 mg/ml, 2.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.5 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.5 mg/ml, 또는 5.0 mg/ml 이상의 농도로 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, mRNA 모액은 펌프를 사용하여 완충액과 혼합된다. 예시적인 펌프는 기어 펌프, 연동 펌프, 및 원심 펌프를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

일반적으로, 완충액은 mRNA 모액의 속도보다 더 높은 속도로 혼합된다. 예를 들어, 완충액은 mRNA 모액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 높은 속도로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 100~6000 ml/분(예를 들어, 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 4800~6000 ml/분, 또는 60~420 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 60 ml/분, 100 ml/분, 140 ml/분, 180 ml/분, 220 ml/분, 260 ml/분, 300 ml/분, 340 ml/분, 380 ml/분, 420 ml/분, 480 ml/분, 540 ml/분, 600 ml/분, 1200 ml/분, 2400 ml/분, 3600 ml/분, 4800 ml/분, 또는 6000 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 10~600 ml/분(예를 들어, 약 5~50 ml/분, 약 10~30 ml/분, 약 30~60 ml/분, 약 60~120 ml/분, 약 120~240 ml/분, 약 240~360 ml/분, 약 360~480 ml/분, 또는 약 480~600 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 5 ml/분, 10 ml/분, 15 ml/분, 20 ml/분, 25 ml/분, 30 ml/분, 35 ml/분, 40 ml/분, 45 ml/분, 50 ml/분, 60 ml/분, 80 ml/분, 100 ml/분, 200 ml/분, 300 ml/분, 400 ml/분, 500 ml/분, 또는 600 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.

지질 용액

본 발명에 따르면, 지질 용액은 mRNA의 캡슐화를 위한 지질 나노입자를 형성하기에 적합한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 에탄올계이다. 예를 들어, 적합한 지질 용액은 순수 에탄올(즉, 100% 에탄올)에 용해된 바람직한 지질의 혼합물을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 이소프로필 알코올계이다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 다이메틸설폭시드계이다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 에탄올, 이소프로필 알코올, 및 다이메틸설폭시드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 적절한 용매의 혼합물이다.

적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 다양한 농도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 약 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 2.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, 4.0 mg/ml, 5.0 mg/ml, 6.0 mg/ml, 7.0 mg/ml, 8.0 mg/ml, 9.0 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 또는 100 mg/ml의 총 농도로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 약 0.1~100 mg/ml, 0.5~90 mg/ml, 1.0~80 mg/ml, 1.0~70 mg/ml, 1.0~60 mg/ml, 1.0~50 mg/ml, 1.0~40 mg/ml, 1.0~30 mg/ml, 1.0~20 mg/ml/ml, 1.0~15 mg/ml/ml, 1.0~10 mg/ml, 1.0~9 mg/ml/ml, 1.0~8 mg/ml, 1.0~7 mg/ml, 1.0~6ml, 또는 1.0~5 mg/ml 범위의 총 농도로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 최대 약 100 mg/ml, 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 10 mg/ml의 총 농도로 함유할 수 있다.

임의의 바람직한 지질이 mRNA를 캡슐화하기에 적합한 임의의 비율로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 양이온성 지질, 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 및/또는 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 및/또는 하나 이상의 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다.

양이온성 지질

본원에서 사용되는 바와 같이, "양이온성 지질"이란 문구는 생리적인 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 띄는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2010/144740호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(다이메틸아미노) 부타노에이트 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2013/149140호에 기재된 이온화(ionizable) 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화학식 중 하나의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

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식 중, R₁ 및 R₂는 수소, 임의 치환된 가변 포화 또는 불포화 C₁-C₂₀ 알킬, 및 임의 치환된 가변 포화 또는 불포화 C₆-C₂₀ 아실로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고; L₁ 및 L₂는 수소, 임의 치환된 C₁-C₃₀ 알킬, 임의 치환된 가변 불포화 C₁-C₃₀ 알케닐, 및 임의 치환된 C₁-C₃₀ 알키닐로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고; m 및 o는 0 및 임의의 양의 정수로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되며(예를 들어, m은 3임); n은 0이거나 임의의 양의 정수이다(예를 들어, n은 1임). 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 (15Z, 18Z)-N,N-다이메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-l-일) 테트라코사-15,18-다이엔-1-아민("HGT5000") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 (15Z, 18Z)-N,N-다이메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일) 테트라코사-4,15,18-트리엔-l-아민("HGT5001") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 (15Z,18Z)-N,N-다이메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일) 테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민("HGT5002") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2010/053572호에 아미노 알코올 리피도이드로 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118725호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118724호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 이온은 14,25-다이트리데실 15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄의 식을 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 모두 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2013/063468호 및 WO 2016/205691호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

식 중, R^L의 각각의 예는 독립적으로 임의 치환된 C₆-C₄₀ 알케닐이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/184256호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

식 중, 각각의 X는 독립적으로 O 또는 S이고; 각각의 Y는 독립적으로 O 또는 S이고; 각각의 m은 독립적으로 0 내지 20이고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 6이고; 각각의 R_A는 독립적으로 수소, 임의 치환된 C1-50 알킬, 임의 치환된 C2-50 알케닐, 임의 치환된 C2-50 알키닐, 임의 치환된 C3-10 카보시클릴, 임의 치환된 3-14원 헤테로시클릴, 임의 치환된 C6-14 아릴, 임의 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이고; 각각의 R_B는 독립적으로 수소, 임의 치환된 C1-50 알킬, 임의 치환된 C2-50 알케닐, 임의 치환된 C2-50 알키닐, 임의 치환된 C3-10 카보시클릴, 임의 치환된 3-14원 헤테로시클릴, 임의 치환된 C6-14 아릴, 임의 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "표적 23" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/004202호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는 J. McClellan, M. C. King, Cell 2010, 141, 210-217 및 Whitehead 등의, Nature Communications (2014) 5:4277에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 양이온성 지질은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/199952호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/004143호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/075531호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

식 중, L¹ 또는 L² 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NR^aC(=O)-, -C(=O)NR^a-, NR^aC(=O)NR^a-, -OC(=O)NR^a-, 또는 -NR^aC(=O)O-이고, L¹ 또는 L² 중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NR^aC(=O)-, -C(=O)NR^a-, ,NR^aC(=O)NR^a-, -OC(=O)NR^a- 또는 -NR^aC(=O)O-이거나 직접 결합이고, G¹ 및 G²는 각각 독립적으로 비치환된 C₁-C₁₂ 알킬렌 또는 C₁-C₁₂ 알케닐렌이고, G³는 C₁-C₂₄ 알킬렌, C₁-C₂₄ 알케닐렌, C₃-C₈ 시클로알킬렌, C₃-C₈ 시클로알케닐렌이고, R^a는 H 또는 C₁-C₁₂ 알킬이고, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 C₆-C₂₄ 알킬 또는 C₆-C₂₄ 알케닐이고, R³은 H, OR⁵, CN, -C(=O)OR⁴, -OC(=O)R⁴ 또는 -NR⁵ C(=O)R⁴이고, R⁴는 C₁-C₁₂ 알킬이고, R⁵는 H 또는 C₁-C₆ 알킬이고, x는 0, 1 또는 2이다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/117528호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/049245호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 양이온성 지질은 다음의 화학식 중 하나의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

이들 네 개의 화학식 중 어느 하나에 있어서, R₄는 -(CH₂)_nQ 및 -(CH₂)_nCHQR에서 독립적으로 선택되고, Q는 -OR, -OH, -O(CH₂)_nN(R)₂, -OC(O)R, -CX₃, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(H)S(O)₂R, -N(R)C(O)N(R)₂, -N(H)C(O)N(R)₂, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)₂, -N(H)C(S)N(R)₂, -N(H)C(S)N(H)(R) 및 헤테로고리로 이루어진 군에서 선택되며, n은 1, 2, 또는 3이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/173054호 및 WO 2015/095340호에 기술된 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2012/170889호에 기재된 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

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식 중, R₁은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 임의로 치환된 알킬 아미노(예컨대, 다이메틸아미노와 같은 알킬 아미노) 및 피리딜로 이루어진 군에서 선택되고, R₂는 다음의 두 화학식 중 하나로 이루어진 군에서 선택되고,

식 중, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 임의로 치환된, 가변 포화 또는 불포화 C₆-C₂₀ 알킬, 및 임의로 치환된, 가변 포화 또는 불포화 C₆-C₂₀ 아실이고, n은 0 또는 임의의 양의 정수(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상)이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4001" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4002" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4003" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4004" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4005" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

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본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 2018년 5월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/672,194호에 기재된 것과 같은 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 미국 특허 가출원 제62/672,194호에 기술된 일반 식 중 어느 하나 또는 구조 (1a)-(21a) 및 (1b)-(21b) 및 (22)-(237) 중 어느 하나에 해당하는 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 (식 I')에 따른 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

식 중:

R^X는 독립적으로 -H, -L¹-R¹, 또는 -L^5A-L^5B-B'이고;

L¹, L², 및 L³ 각각은 독립적으로 공유 결합, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)S-, 또는 -C(O)NR^L-이고;

각각의 L^4A 및 L^5A는 독립적으로 -C(O)-, -C(O)O-, 또는 -C(O)NR^L-이고;

각각의 L^4B 및 L^5B는 독립적으로 C₁-C₂₀ 알킬렌, C₂-C₂₀ 알케닐렌, 또는 C₂-C₂₀ 알키닐렌이고;

각각의 B 및 B'은 NR⁴R⁵ 또는 5-원 내지 10-원 질소 함유 헤테로아릴이고;

각각의 R¹, R², 및 R³은 독립적으로 C₆-C₃₀ 알킬, C₆-C₃₀ 알케닐, 또는 C₆-C₃₀ 알키닐이고;

각각의 R⁴, 및 R⁵는 독립적으로 C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, 또는 C₂-C₁₀ 알키닐이며;

각각의 R^L은 독립적으로 수소, C₁-C₂₀ 알킬, C₂-C₂₀ 알케닐, 또는 C₂-C₂₀ 알키닐이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질, 즉 62/672,194의 화합물 (139)를 포함한다:

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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 N-[l-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드("DOTMA")를 포함한다. (Feigner 등의 Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); 미국 등록 특허 번호 제4,897,355호 (본원에 참조로서 포함됨)). 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 기타 양이온성 지질은 예를 들어, 5-카복시스페르밀글리신다이옥타데실아미드("DOGS"), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민-카복스아미도에틸]-N,N-다이메틸-l-프로판아미늄("DOSPA")(Behr 등의 Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); 미국 특허 제5,171,678호; 미국 특허 제5,334,761호), l,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판("DODAP"), l,2-다이올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판("DOTAP")을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 양이온성 지질의 추가 예시는 다음을 또한 포함한다: 1,2-다이스테아릴옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DSDMA"); 1,2-다이올레일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DODMA"); 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DLinDMA"); l,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DLenDMA"); N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드("DODAC"); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드("DDAB"); N-(l,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드("DMRIE"); 3-다이메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-l-(시스,시스-9,12-옥타데카다이엔옥시)프로판("CLinDMA"); 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-다이메틸 l-l-(시스,시스-9', l-2'-옥타데칸다이엔옥시)프로판("CpLinDMA"); N,N-다이메틸-3,4-다이올레일옥시벤질아민("DMOBA"); 1 ,2-N,N'-다이올레일카바밀-3-다이메틸아미노프로판("DOcarbDAP"); 2,3-다이리놀레오일옥시-N,N-다이메틸프로필아민("DLinDAP"); l,2-N,N'-다이리놀레일카바밀-3-다이메틸아미노프로판("DLincarbDAP"); l,2-다이리놀레오일카바밀-3-다이메틸아미노프로판("DLinCDAP"); 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[l,3]-다이옥솔란("DLin-K-DMA"); 2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N,N-다이메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-1-아민("옥틸-CLinDMA"); (2R)-2-((8-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, N-다이메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-1-아민("옥틸-CLinDMA (2R)"); (2S)-2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, fsl-dimethyh3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-다이엔-1-일옥시]프로판-1-아민("Octyl-CLinDMA (2S)"); 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노에틸-[l,3]-다이옥솔란("DLin-K-XTC2-DMA"); 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-다이엔-1-일)-l ,3-다이옥솔란-4-일)-N,N-다이메틸에탄아민("DLin-KC2-DMA")을 포함한다(본원에 참조로서 포함되는 WO 2010/042877; Semple 등의 Nature Biotech. 28: 172-176 (2010) 참조). (Heyes, J. 등의 J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV. 등의 Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); 국제 특허 공개 WO 2005/121348 참조). 일부 구현예에서, 양이온성 지질 중 하나 이상은 이미다졸, 다이알킬아미노, 또는 구아니디늄 모이어티 중 적어도 하나를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 하나 이상의 양이온성 지질은 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노에틸-[1,3]-다이옥솔란("XTC"); (3aR,5s,6aS)-N,N-다이메틸-2,2-다이((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에틸)테트라하이드로-3aH-시클로펜타[d] [1 ,3]다이옥솔-5-아민("ALNY-100") 및/또는 4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-다이운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-다이아미드("NC98-5")를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 적어도 약 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 또는 70 중량%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 적어도 약 5 몰%, 10 몰%, 20 몰%, 30 몰%, 35 몰%, 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 60 몰%, 65 몰%, 또는 70 몰%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 약 30~70 중량%(예컨대, 약 30~65 중량%, 약 30~60 중량%, 약 30~55 중량%, 약 30~50 중량%, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, 또는 약 35~40 중량%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 약 30~70 몰%(예컨대, 약 30~65 몰%, 약 30~60 몰%, 약 30~55 몰%, 약 30~50 몰%, 약 30~45 몰%, 약 30~40 몰%, 약 35~50 몰%, 약 35~45 몰%, 또는 약 35~40 몰%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다.

일부 구현예에서, 스테롤계 양이온성 지질이 본원에 기술된 양이온성 지질 대신 또는 그에 더하여 사용될 수 있다. 적합한 스테롤계 양이온성 지질은 다이알킬아미노-, 이미다졸-, 및 구아니디늄-함유 스테롤계 양이온성 지질이다. 예를 들어, 특정 구현예는 아래의 구조식 (I)로 표시된 바와 같이, 이미다졸, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 즉 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함하는 하나 이상의 스테롤계 양이온성 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 다음 구조식으로 표시된 바와 같이, 기능성 단백질을 암호화하는 RNA(예컨대, mRNA)를 전달하기 위한 지질 나노입자는 하나 이상의 이미다졸계 양이온성 지질, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 즉 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함할 수 있다:

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일부 구현예에서, 리포솜 내 양이온성 지질의 백분율은 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 또는 70% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들)은 리포솜의 약 30~50 중량%(예컨대, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, 또는 약 35~40 중량%)를 구성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(예컨대, ICE 지질)은 몰비로 리포솜의 약 30%, 약 35%, 약 40 %, 약 45%, 또는 약 50%를 구성한다.

본원에서 사용되는 문구 "비양이온성 지질"은 임의의 중성, 쌍성(zwitterionic) 또는 음이온성 지질을 말한다. 본원에서 사용되는 문구 "음이온성 지질"은 생리적인 pH와 같은 선택된 pH에서 순 음전하(net negative charge)를 띠는 임의의 많은 지질 종을 말한다. 비양이온성 지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine, POPE), 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l-카복실레이트(dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxylate, DOPE-mal), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine, DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민(dimyristoylphosphoethanolamine, DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine, DSPE), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 스핑고지질(sphingolipid), 세레브로시드(cerebroside), 강글리오시드(ganglioside), 16-O-모노메틸 PE(16-O-monomethyl PE), 16-O-다이메틸 PE(16-O-dimethyl PE), 18-1-트랜스 PE(18-1-trans PE), l-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(l-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine, SOPE), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

일부 구현예에서, 이와 같은 비양이온성 지질은 단독으로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 기타 지질 예를 들어, 양이온성 지질과 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 또는 약 10% 내지 약 70%의 몰비를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 중성 지질, 즉 본 조성물이 제형화되고/되거나 투여되는 조건하에서 순전하(net charge)를 띠지 않는 지질이다. 일부 구현예에서, 리포솜 내 비양이온성 지질의 백분율은 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과 또는 40% 초과일 수 있다.

적절한 콜레스테롤계 양이온성 지질은 예컨대, DC-Choi (N,N-다이메틸-N-에틸카복스아미도콜레스테롤), l,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(Gao 등의 Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf 등의 BioTechniques 23, 139 (1997); 미국 특허 제5,744,335호 참조) 또는 ICE를 포함한다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 2% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 몰비를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과 또는 40% 초과일 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 인지질, 및 N-옥타노일-스핑고신-1-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라미드)를 포함하는 유도된 세라미드(PEG-CER)와 같은 유도된 지질을 단독으로 사용하거나 바람직하게는 수송 비히클(예컨대, 지질 나노입자)을 포함하는 기타 지질 제형과 함께 조합하여 사용하는 것도 본 발명에서 고려된다. 고려된 PEG-변형 지질은 C₆-C₂₀ 길이의 알킬 사슬(들)을 갖는 지질에 공유 결합된 최대 S kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이와 같은 성분을 첨가함으로써 복합체 응집을 예방할 수 있고, 또한 순환 수명을 늘리고 표적 조직에 대한 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있거나(Klibanov 등의 (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237 참조), 이들 성분은 생체 내에서 제형으로부터 신속하게 교환되도록 선택될 수 있다(미국 특허 제5,885,613호 참조). 특히 유용한 교환 가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예컨대, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다. 본 발명의 PEG-변형 인지질 및 유도된 지질은 리포솜 수송 비히클에 존재하는 총 지질의 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%의 몰비를 포함할 수 있다.

여러가지 구현예에 따르면, 지질 나노입자를 포함할 뿐만 아니라 서로에 대한 이러한 지질의 상대적인 몰비를 포함하는 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및/또는 PEG-변형 지질의 선택은 선택된 지질(들)의 특성, 의도된 표적 세포의 성질, 전달되는 mRNA의 특성을 기초로 한다. 추가적인 고려 사항은, 예를 들어, 알킬 사슬의 포화뿐만 아니라 선택된 지질(들)의 크기, 전하, pH, pKa, 융해성(fusogenicity) 및 독성을 포함한다. 따라서 몰비는 적절하게 조정될 수 있다.

일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 담체로서 폴리머를 단독으로 사용하거나 본원에 기술된 여러 가지 지질을 포함하는 다른 담체들과 조합하여 사용함으로써 제형화된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 리포솜 전달 비히클은 또한 폴리머를 포함하는 나노입자를 망라한다. 적합한 폴리머는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드(polyglycolide) 코폴리머, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알지네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 프로타민(protamine), 페길화 프로타민, PLL, 페길화 PLL 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함할 수 있다. PEI가 존재하는 경우, 예컨대, 25 kDa 분지형 PEI(Sigma #408727)와 같이 10 내지 40 kDa 범위의 분자량의 PEI가 분지될 수 있다.

본 발명에 적합한 리포솜은 본원에 기술된 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 콜레스테롤 지질, PEG-변형 지질 및/또는 폴리머 중 임의의 것 하나 이상을 다양한 비율로 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 적합한 리포솜 제형은 cKK-E12, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; ICE, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; 또는 ICE, DOPE, 및 DMG-PEG2K에서 선택된 조합을 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 양이온성 지질(예컨대, cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)은 몰비로 리포솜의 약 30~60%(예컨대, 약 30~55%, 약 30~50%, 약 30~45%, 약 30~40%, 약 35~50%, 약 35~45%, 또는 약 35~40%)를 구성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(예컨대, cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)의 백분율은 몰비로 리포솜의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40 % 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 또는 약 60% 이상이다.

일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 약 30~60:25~35:20~30:1~15 사이에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:30:20:10이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:30:25:5이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:32:25:3이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 50:25:20:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 50:45:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 50:40:10이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 55:40:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 55:35:10이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 60:35:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 60:30:10이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE 및 DOPE를 포함하고, ICE:DOPE의 몰비가 1:1보다 크다. 일부 구현예에서, ICE:DOPE의 몰비는 2.5:1보다 작다. 일부 구현예에서, ICE:DOPE의 몰비는 1:1 내지 2.5:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DOPE의 몰비는 대략 1.5:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DOPE의 몰비는 대략 1.7:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DOPE의 몰비는 대략 2:1이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비가 10:1보다 크다. 일부 구현예에서, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비는 16:1보다 작다. 일부 구현예에서, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 12:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 14:1이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 DOPE 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비가 5:1보다 크다. 일부 구현예에서, DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 11:1보다 작다. 일부 구현예에서, DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 7:1이다. 일부 구현예에서, DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 10:1이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE, DOPE 및 DMG-PEG-2K를 50:45:5의 ICE:DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE, DOPE 및 DMG-PEG-2K를 50:40:10의 ICE:DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE, DOPE 및 DMG-PEG-2K를 55:40:5의 ICE:DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE, DOPE 및 DMG-PEG-2K를 55:35:10의 ICE:DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE, DOPE 및 DMG-PEG-2K를 60:35:5의 ICE:DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE, DOPE 및 DMG-PEG-2K를 60:30:10의 ICE:DOPE:DMG-PEG-2K의 몰비로 포함한다.

PEG화 지질

일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 하나 이상의 PGE화 지질을 포함한다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 인지질 및 N-옥타노일-스핑고신-l-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라미드)을 포함하여 유도된 세라미드(PEG-CER)와 같은 유도된 지질의 사용이 또한 본 발명에서 고려된다. 고려된 PEG-변형 지질은 C₆-C₂₀ 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유 결합된 최대 2 kDa, 최대 3 kDa, 최대 4 kDa, 또는 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질 또는 PEG화 지질은 PEG화 콜레스테롤 또는 PEG-2K이다. 일부 구현예에서, 특히 유용한 교환 가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예컨대, C₁₄ 또는 C₁₈)을 갖는 PEG-세라미드이다.

PEG-변형 인지질 및 유도체화 지질은 중량 기준으로 또는 몰 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% 또는 5% 이하를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 5% 이하를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 4% 이하를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 3% 이하를 일반적으로 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 2% 이하를 일반적으로 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 1% 이하를 일반적으로 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 1~5%, 약 1~4%, 약 1~3%, 또는 약 1~2%를 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 0.01~3%(예를 들어, 약 0.01~2.5%, 0.01~2%, 0.01~1.5%, 또는 0.01~1%)를 구성한다.

미리 형성된 지질 나노입자를 제조하는 데 사용될 수 있고 이에 포함되는 다양한 조합의 지질, 즉 양이온성 지질, 비양이온성 지질, PEG-변형 지질, 및 임의로 콜레스테롤이 문헌 및 본원에서 기술된다. 예를 들어, 적절한 지질 용액은: cKK-E12, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; HGT5001, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; cKK-E12, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; C12-200, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; HGT5000, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; HGT5001, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; 또는 ICE, DOPE, 및 DMG-PEG2K를 함유할 수 있다. 지질의 추가 조합은 당업계에 기술되며, 예를 들어, 미국 특허 출원 제62/420, 421호(2016년 11월 10일 출원), 미국 특허 출원 제62/421, 021호(2016년 11월 11일 출원), 미국 특허 출원 제62/464, 327호(2017년 2월 27일 출원), 및 "Novel ICE-based Lipid Nanoparticle Formulation for Delivery of mRNA"라는 명칭으로 2017년 11월 10일에 출원된 PCT 출원에 기술되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전체 범위가 참조로서 본원에 포함된다. 지질 혼합물뿐만 아니라 서로에 대한 이러한 지질의 상대 몰비를 포함하는 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및/또는 PEG-변형 지질을 선택하는 것은 선택된 지질(들)의 특징 및 캡슐화할 mRNA의 성질 및 특징에 기초한다. 추가적인 고려 사항은, 예를 들어, 알킬 사슬의 포화뿐만 아니라 선택된 지질(들)의 크기, 전하, pH, pKa, 융해성(fusogenicity) 및 독성을 포함한다. 따라서 몰비는 적절하게 조정될 수 있다.

미리 형성된 나노입자 형성 및 혼합 방법

본 발명은 미리 형성된 빈 지질 나노입자(즉, mRNA 없이 형성된 지질 나노입자)와 mRNA를 저 농도로 혼합하면 지질 나노입자의 응집 없이 효율적으로 캡슐화를 수행할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명은 저 수준의 PEG-변형 지질(예를 들어, LNP 중 총 지질의 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 이하)을 함유하는 미리 형성된 지질 나노입자로 mRNA를 캡슐화하는 데 특히 유용하다. 임의의 이론에 구속되고자 함이 없이, 저 수준의 PEG-변형 지질을 함유하는 지질 나노입자는 응집하는 경향이 있는 것으로 여겨진다.

일부 이전에 개시된 방법의 경우, 일부 구현예에서, 이전 발명은 mRNA 용액과 지질 용액을 혼합함으로써 지질 나노입자로 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법을 제공하는데, 여기서 mRNA 용액 및/또는 용액은 혼합 단계 이전에 주변 온도보다 높은 소정의 온도까지 가열되어, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 형성한다(2015년 7월 2일에 출원된 "Encapsulation of messenger RNA"라는 명칭의 미국 특허 출원 제14/790,562호, 및 2014년 7월 2일에 출원된 이의 미국 특허 가출원 제62/020,163호를 참조하며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 통합됨).

본 발명은 mRNA를 함유하는 지질 나노입자를 제조하기 위한 신규한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 mRNA와 조합하는 단계를 포함하되, 미리 형성된 지질 나노입자는 저 수준의 PEG-변형 지질(일반적으로, LNP 중 총 지질의 3% 이하)을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 응집을 피하고 캡슐화의 높은 효율을 보장하기 위해, LNP 농도는 약 1 mg/ml까지 낮아질 수(희석될 수) 있고, 동시에 mRNA 농도도 약 1 mg/ml까지 낮아질 수(희석될 수) 있다. 일부 구현예에서, LNP 농도는 약 0.9 mg/ml 이하, 또는 0.8 mg/ml 이하, 또는 0.7 mg/ml 이하, 또는 0.6 mg/ml 이하, 또는 0.5 mg/ml 이하, 또는 0.4 mg/ml 이하, 또는 0.3 mg/ml 이하, 또는 0.2 mg/ml 이하, 또는 0.1 mg/ml 이하, 또는 0.05 mg/ml 이하, 또는 0.01 mg/ml 이하로 낮아진다. 일부 구현예에서, 상응하는 mRNA 농도는 약 3 mg/ml 이하, 또는 약 2 mg/ml 이하, 또는 약 1 mg/ml 이하, 또는 약 0.9 mg/ml 이하, 또는 0.8 mg/ml 이하, 또는 0.7 mg/ml 이하, 또는 0.6 mg/ml 이하, 또는 0.5 mg/ml 이하, 또는 0.4 mg/ml 이하, 또는 0.3 mg/ml 이하, 또는 0.2 mg/ml 이하, 또는 0.1 mg/ml 이하, 또는 0.05 mg/ml 이하, 또는 0.01 mg/ml 이하로 낮아진다. 일부 구현예에서, LNP 입자가 응집하지 않도록 캡슐화 혼합물 중 LNP 농도는 0.05 mg/ml 내지 2 mg/ml이고, 상응하는 mRNA 농도는 0.05 mg/ml 내지 2 mg/ml이다. 일부 구현예에서, 캡슐화 혼합물 중 예시적인 LNP 농도는 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml의 범위이다. 일부 구현예에서, mRNA 혼합물 중 예시적인 mRNA 농도는 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml의 범위이다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA 각각의 농도는 캡슐화를 위해 혼합하는 동안 1 mg/ml 미만이다. 생성된 제형화된 입자는 높은 효험과 효능을 갖는다. 구성 요소를 혼합하는 단계는, 상기 방법 전반에 걸쳐 지질/mRNA (N/P) 비를 일정하게 유지시키고 손쉽게 규모를 키울 수 있는 펌프 시스템을 사용해 이루어진다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대규모로 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다.

mRNA의 특정 양이온성 지질 나노입자 제형의 경우, mRNA의 보호 및 전달에 필수적인 mRNA의 높은 캡슐화를 달성하기 위해, 구연산염 완충액 중의 mRNA를 가열해야 한다. 이들 공정 또는 방법에서, 가열 단계는 제형화 공정 이전에 이루어질 필요가 있는데(즉, 별개의 성분을 가열함), 이는 제형화 후에 (나노 입자를 형성한 후에) 가열하면 지질 나노입자 내에 mRNA를 캡슐화하는 효율을 증가되지 않기 때문이다. 대조적으로, 본 발명의 신규한 방법의 일부 구현예에서, mRNA의 가열 순서는 mRNA 캡슐화 백분율에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 혼합 용액 중 하나 이상을 가열하는 단계를 제형화 공정의 전 또는 후에 수행할 필요가 없다(즉, 주변 온도로 유지시키는 것으로 충분함). 이는, 혼합 단계 후에 온도 변화를 제어하는 것이 더 쉬워지므로, 정밀하게 규모를 확장하는 데 있어서 잠재적으로 큰 이점을 제공한다.

일부 구현예에서, 이러한 신규한 방법으로, mRNA를 미리 형성된 빈(즉, mRNA가 없는) 지질 나노입자와 혼합하는 단계를 사용해 mRNA를 캡슐화하는 것(방법 B)은 mRNA를 단지 지질 성분(즉, 지질 나노입자로 미리 형성되지 않음)과 혼합함으로써 캡슐화하는 것(방법 A)과 비교했을 때 효험을 현저하게 더 높인다. 하기 실시예에서 기술된 바와 같이, 예를 들어, 표 3 및 4에서, 시험된 임의의 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자의 효험은, 방법 B에 의해 제조될 때 방법 A 대비 100% 초과 내지 1000% 초과 더 강력하다.

일부 구현예에서, mRNA가 없는 빈(즉, mRNA가 없는) 지질 나노입자는 용매에 용해된 지질을 함유하는 지질 용액과 수용액/완충액을 혼합함으로써 형성된다. 일부 구현예에서, 용매는 에탄올일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용액은 구연산염 완충액일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "주변 온도"는 실내 온도, 또는 가열 또는 냉각 없이 관심 대상(예를 들어, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 용액, mRNA 용액, 또는 mRNA를 함유하는 지질 나노입자 용액)을 둘러싸는 온도를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 또는 16℃ 이하이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 15~35℃, 약 15~30℃, 약 15~25℃, 약 15~20℃, 약 20~35℃, 약 25~35℃, 약 30~35℃, 약 20~30℃, 약 25~30℃, 또는 약 20~25℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 20~25℃이다.

따라서, 주변 온도보다 높은 소정의 온도는 일반적으로 약 25℃를 초과한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 소정의 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃이거나 더 높다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 소정의 온도는 약 25~70℃, 약 30~70℃, 약 35~70℃, 약 40~70℃, 약 45~70℃, 약 50~70℃, 또는 약 60~70℃의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 적합한 소정의 온도는 약 65℃이다.

일부 구현예에서, mRNA, 또는 미리 형성된 빈(즉, mRNA가 없는) 지질 나노입자 용액, 또는 둘 다는 혼합 전에 주변 온도보다 높은 소정의 온도로 가열될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 및 미리 형성된 빈 지질 나노입자 용액은 혼합 전에 별도로 소정의 온도로 가열된다. 일부 구현예에서, mRNA 및 미리 형성된 빈 지질 나노입자 용액은 주변 온도에서 혼합되지만, 혼합 후에는 소정의 온도로 가열된다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 용액은 소정의 온도로 가열된 다음, 주변 온도에서 mRNA와 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 소정의 온도로 가열된 다음, 주변 온도에서 미리 형성된 빈 지질 나노입자 용액과 혼합된다.

일부 구현예에서, 주변 온도의 mRNA 모액을 가열된 완충액에 첨가하여 바람직한 소정의 온도를 달성함으로써, mRNA 용액은 소정의 온도로 가열된다.

일부 구현예에서, 용해된 지질을 함유하는 지질 용액, 또는 수용액/완충액, 또는 둘 다는, 혼합 전에, 주변 온도보다 높은 소정의 온도로 가열될 수 있다. 일부 구현예에서, 용해된 지질을 함유하는 지질 용액 및 수용액은, 혼합 전에, 별도로 소정의 온도로 가열될 수 있다. 일부 구현예에서, 용해된 지질을 함유하는 지질 용액 및 수용액은 주변 온도에서 혼합되지만, 혼합 후에는, 소정의 온도로 가열된다. 일부 구현예에서, 용해된 지질을 함유하는 지질 용액은 소정의 온도로 가열된 다음, 주변 온도의 수용액과 혼합된다. 일부 구현예에서, 수용액은 소정의 온도로 가열된 다음, 용해된 지질을 함유하는 주변 온도의 지질 용액과 혼합된다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 혼합 용액 중 하나 이상을 가열하는 단계를 제형화 공정의 전 또는 후에 수행되지 않는다.

일부 구현예에서, 지질 용액 및 수용액 또는 완충액은 펌프를 사용하여 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 미리 형성된 빈 지질 나노입자 용액은 펌프를 사용하여 혼합될 수 있다. 캡슐화 절차가 광범위한 규모로 수행될 수 있기 때문에, 바람직한 규모를 감당할 수 있는 상이한 유형의 펌프가 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 무펄스 유동 펌프(pulse-less flow pumps)를 사용하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 무펄스 유동 펌프는 안정적인 유속으로 연속 유동을 확립할 수 있는 임의의 펌프를 지칭한다. 적합한 펌프의 유형은 기어 펌프 및 원심 펌프를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 기어 펌프는 콜-파머Cole-Parmer) 또는 디에너(Diener) 기어 펌프를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 원심 펌프는 그레인저(Grainger) 또는 콜-파머에 의해 제조되는 것들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

mRNA 용액 및 미리 형성된 빈 지질 나노입자 용액은 다양한 유속으로 혼합될 수 있다. 일반적으로, mRNA 용액은 지질 용액보다 더 빠른 속도로 혼합될 수 있다. 예를 들어, mRNA 용액은 지질 용액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 빠른 속도로 혼합될 수 있다.

혼합을 위한 적절한 유속은 규모에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 40~400 ml/분, 60~500 ml/분, 70~600 ml/분, 80~700 ml/분, 90~800 ml/분, 100~900 ml/분, 110~1000 ml/분, 120~1100 ml/분, 130~1200 ml/분, 140~1300 ml/분, 150~1400 ml/분, 160~1500 ml/분, 170~1600 ml/분, 180~1700 ml/분, 150~250 ml/분, 250~500 ml/분, 500~1000 ml/분, 1000~2000 ml/분, 2000~3000 ml/분, 3000~4000 ml/분, 또는 4000~5000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 200 ml/분, 약 500 ml/분, 약 1000 ml/분, 약 2000 ml/분, 약 3000 ml/분, 약 4000 ml/분, 또는 약 5000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, 지질 용액 또는 미리 형성된 지질 나노입자 용액을 약 25~75 ml/분, 20~50 ml/분, 25~75 ml/분, 30~90 ml/분, 40~100 ml/분, 50~110 ml/분, 75~200 ml/분, 200~350 ml/분, 350~500 ml/분, 500~650 ml/분, 650~850 ml/분, 또는 850~1000 ml/분 범위의 유속으로 혼합한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일반적으로, 일부 구현예에서, 용해된 지질을 함유하는 지질 용액, 및 수용액이나 완충제액은 지질이 mRNA가 없는 나노입자(또는 미리 형성된 빈 지질 나노입자)를 형성할 수 있도록 용액으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자 용액은 mRNA가 지질 나노입자에 캡슐화되도록 용액으로 혼합된다. 이러한 용액은 제형 또는 캡슐화 용액으로도 지칭된다. 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 에탄올과 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 에탄올, 약 15% 에탄올, 약 20% 에탄올, 약 25% 에탄올, 약 30% 에탄올, 약 35% 에탄올, 또는 약 40% 에탄올을 포함한다.

일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 이소프로필 알코올과 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 이소프로필 알코올, 약 15% 이소프로필 알코올, 약 20% 이소프로필 알코올, 약 25% 이소프로필 알코올, 약 30% 이소프로필 알코올, 약 35% 이소프로필 알코올, 또는 약 40% 이소프로필 알코올을 포함한다.

일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 다이메틸 설폭시드와 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 다이메틸 설폭시드, 약 15% 다이메틸 설폭시드, 약 20% 다이메틸 설폭시드, 약 25% 다이메틸 설폭시드, 약 30% 다이메틸 설폭시드, 약 35% 다이메틸 설폭시드, 또는 약 40% 다이메틸 설폭시드를 포함한다.

일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 완충제 또는 염을 함유할 수도 있다. 예시적인 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 및 인산나트륨을 포함할 수 있다. 예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 신규한 나노입자 제형을 제조하는 데 사용되는 미리 형성된 빈 지질 나노입자 제형은 10% 트레할로스 용액에서 안정적으로 냉동될 수 있다.

일부 구현예에서, 이러한 신규한 나노입자 제형을 제조하는 데 사용되는 미리 형성된 빈(즉, mRNA가 없는) 지질 나노입자 제형은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 트레할로스 용액에서 안정적으로 냉동될 수 있다. 일부 구현예에서, 빈 지질 나노입자에 mRNA를 첨가하면 임의의 하류 정제 또는 가공을 필요로 하지 않고 냉동된 형태로 안정적으로 저장할 수 있는 최종 제형을 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 에탄올, 구연산염 완충제, 및 기타 불안정화제는 mRNA를 첨가하는 동안 존재하지 않으며, 따라서 제형은 임의의 추가적인 하류 가공을 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 신규한 방법에 의해 제조된 지질 나노입자 제형은 트레할로스 용액 중의 미리 형성된 지질 나노입자로 구성된다. 불안정화제의 부재와 트레할로스 용액의 안정성은 mRNA-캡슐화 지질 나노입자의 제형화 규모를 쉽게 확장할 수 있게 하고 생산을 증가시킨다.

정제

일부 구현예에서, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 또는 mRNA를 함유하는 지질 나노입자는 정제되고/되거나 농축된다. 다양한 정제 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 접선 유동 여과를 사용해 정제된다. 십자류 여과로도 지칭되는 접선 유동 여과(TFF)는 여과될 물질이 필터를 관통하기 보다는 필터를 가로 질러 접선 방향으로 통과하는 여과 유형이다. TFF의 경우, 원하지 않는 투과물은 필터를 관통하는 반면, 원하는 잔류물은 필터를 따라 통과하여 하류에서 수집된다. 원하는 물질은 일반적으로 TFF의 잔류물에 함유된다는 것에 주목할 필요가 있는데, 이는 전통적인 전량 여과 방식(dead-end filtration)에서 일반적으로 발생하는 것과는 반대이다.

필터링될 물질에 따라, TFF는 일반적으로 미세여과(microfiltration) 또는 초미세여과(ultrafiltration)에 사용된다. 미세여과는 일반적으로 필터가 0.05 μm 내지 1.0 μm의 기공 크기를 갖는 것으로서 정의되는 반면, 초미세여과는 일반적으로 0.05 μm 미만의 기공 크기를 갖는 필터를 포함한다. 특정 필터에 대한 분자량 컷오프(MWCO)로도 지칭되는 공칭 분자량 한계(NMWL)도 기공 크기에 따라 결정되는데, 미세여과 막은 일반적으로 1,000 kDa 초과의 NMWL을 가지며 초미세여과 필터는 1 kDa 내지 1,000 kDa의 NMWL을 갖는다.

접선 유동 여과의 주요 이점은, 전통적인 "전량" 여과가 진행되는 동안 응집되어 필터를 차단할 수 있는 비투과성 입자(때로는 "필터 케이크"로 지칭됨)가 오히려 필터의 표면을 따라 반송된다는 것이다. 이러한 이점은 연속 작동이 요구되는 산업 공정에서 접선 유동 여과가 광범위하게 이용될 수 있도록 하는데, 이는 일반적으로 필터를 분리해 청소할 필요가 없고, 따라서 고장 시간이 상당히 감소되는 때문이다.

접선 유동 여과는 무엇보다도 농축 및 투석여과을 포함하는 여러 가지 목적으로 사용될 수 있다. 농축은 용매가 용액으로부터 제거되는 반면 용질 분자는 남게 되는 과정이다. 샘플을 효과적으로 농축시키기 위해, 남겨야 할 용질 분자의 분자량보다 실질적으로 낮은 NMWL 또는 MWCO를 갖는 막이 사용된다. 일반적으로, 당업자는 표적 분자(들)의 분자량보다 3 내지 6 단계 아래의 NMWL 또는 MWCO를 갖는 필터를 선택할 수 있다.

투석여과는, 이들 나노입자의 용액 중 농도를 변화시키지 않으면서도 원치 않는 작은 입자는 필터를 통과시키고, 원하는 더 큰 나노입자는 잔류물 내에 남게 하는 분획화 공정이다. 투석여과는 종종 용액으로부터 염 또는 반응 완충액을 제거하는 데 사용된다. 투석여과는 연속적이거나 불연속적일 수 있다. 연속 투석여과의 경우, 여액이 생성되는 것과 동일한 속도로 투석여과 용액이 샘플 피드에 첨가된다. 불연속 투석여과의 경우, 먼저 용액을 희석한 다음, 시작 농도로 다시 농축시킨다. 불연속 투석여과는 원하는 나노입자 농도에 도달할 때까지 반복될 수 있다.

정제되고/되거나 농축된 지질 나노입자는, 예를 들어 PBS와 같은 원하는 완충액 중에서 제형화될 수 있다.

mRNA를 캡슐화하는 제공된 나노입자

본 발명에 따른 방법은 효험과 효능을 높여 투여량을 낮출 수 있게 함으로써 치료 지수를 양의 방향으로 이동시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 균질하고 작은 입자 크기(예를 들어, 150 nm 미만)를 생성할 뿐만 아니라 종래 기술의 방법과 비교해 캡슐화 효율 및/또는 mRNA 회수율을 상당히 개선시킨다.

따라서, 본 발명은 본원에 기재된 정제된 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 정제된 나노입자의 대부분, 즉 정제된 나노입자의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 약 150 nm(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노 입자의 실질적으로 전부는 약 150 nm(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다.

또한, 입자 크기 범위가 좁은 보다 균질한 나노입자는 본 발명의 방법에 의해 달성된다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 조성물 중 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 약 75~150 nm(예를 들어, 약 75~145 nm, 약 75~140 nm, 약 75~135 nm, 약 75~130 nm, 약 75~125 nm, 약 75~120 nm, 약 75~115 nm, 75~110 nm, 약 75~105 nm, 약 75~100 nm, 약 75~95 nm, 약 75~90 nm, 또는 약 75~85 nm) 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노 입자의 실질적으로 전부는 75~100 nm(예를 들어, 약 75~145 nm, 약 75~140 nm, 약 75~135 nm, 약 75~130 nm, 약 75~125 nm, 약 75~120 nm, 약 75~115 nm, 75~110 nm, 약 75~105 nm, 약 75~100 nm, 약 75~95 nm, 약 75~90 nm, 또는 약 75~85 nm) 범위의 크기를 갖는다.

일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 중의 나노입자의 분산성, 또는 분자 크기의 이질성(PDI)의 척도는 약 0.23 미만(예를 들어, 약 0.23, 0.22, 0.21, 0.20, 0.19, 0.18, 0.17, 0.16, 0.15, 0.14, 0.13, 0.12, 0.11, 0.10, 0.09, 또는 0.08 미만)이다. 특정 구현예에서, PDI는 약 0.16 미만이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 중의 정제된 지질 나노입자의 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 각각의 개별 입자 내에 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 정제된 지질 나노입자의 실질적으로 전부는 각각의 개별 입자 내에 mRNA를 캡슐화한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 mRNA가 회수된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 대상체에게 투여량으로 투여될 수 있도록 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 1.0 mg/kg 미만(예: 0.6 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.05 mg/kg, 및 0.016 mg/kg)의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 낮은 투여량으로도 높은 효험과 효능을 얻는다는 예상치 못한 발견으로 인해 투여량이 감소된다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 또는 40%만큼 감소된다.

일부 구현예에서, 방법 B에 의해 생산된 mRNA 캡슐화 지질 나노입자의 효험은 방법 B에 의해 제조될 때 방법 A에 비해 100% 초과(즉, 200% 초과, 300% 초과, 400% 초과, 500% 초과, 600% 초과, 700% 초과, 800% 초과, 또는 900% 초과) 내지 1000% 초과 강력하다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 대상체에게 전달하거나 인간 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물은 대상체의 폐 또는 폐 세포 내로의 전달을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 폐 또는 폐 세포에 전달하거나 대상체의 폐 또는 폐 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 낭성 섬유증 막관통 전달 조절자, 즉 CFTR을 암호화하는 mRNA를 제조하는 방법에 유용하다. CFTR mRNA는 낭성 섬유증을 치료하기 위한 치료 조성물을 필요로 하는 대상체의 폐에 전달된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 간 또는 간 세포에 전달하거나 대상체의 간 또는 간 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 요소 회로 질환과 관련된 것들, 리소좀 저장 장애와 관련된 것들, 글리코겐 저장 장애와 관련된 것들, 아미노산 대사 장애와 관련된 것들, 지질 대사 또는 섬유증 장애와 관련된 것들, 메틸말론 신혈증과 관련된 것들, 또는 풍부한 전장 mRNA를 간 또는 간 세포에 전달하거나 이를 이용해 간 또는 간 세포를 치료하는 것이 치료적 이점이 되는 임의의 다른 대사 장애와 관련된 것들을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 요소 순환 질환과 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 오르니틴 트랜스카바밀라아제(OTC) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 합성효소 1 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 카바모일 포스페이트 합성효소 I 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 리아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기나아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 리소좀 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 알파 갈라토시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루코세레브로시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이두로네이트-2-설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이두로니다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 N-아세틸-알파-D-글루코사미니다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 헤파린 N-설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 갈락토사민-6 설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 베타-갈락토시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 리소좀 리파아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아랄설파타아제 B (N-아세틸갈락토사민-4-설파타아제) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전사 인자 EB(TFEB)를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 산 알파-글루코시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루코스-6-포스파타아제 (G6PC) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 간 글리코겐 포스포릴라아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 포스포글리세레이트 뮤타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 탈분지 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 아미노산 대사 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 하이드록실라아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루타릴-CoA 데하이드로제나아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프로피오닐-CoA 카복실라아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 옥살라아제 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소를 암호화하는 전장 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 지질 대사 장애 또는 섬유증 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 mTOR 억제제를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATPase 인지질 수송 8B1 (ATP8B1) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 NF-카파 B 억제제, 예컨대 I-카파 B 알파, 인터페론 관련 발달성 조절물질 1 (IFRD1), 및 시르투인 1(SIRT1) 중 하나 이상을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 PPAR-감마 단백질 또는 활성 변이체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론산혈증과 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 뮤타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 에피머라아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 간으로의 전달 또는 간의 치료가 치료적 이점을 제공할 수 있는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 윌슨병(Wilson disease) 단백질로도 알려진 ATP7B 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 포스포빌리노겐 데아미나아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X와 같은 하나 이상의 응고 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 혈색소 침착증(HFE) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포에 전달하거나 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 혈관 내피 성장 인자 A 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 릴랙신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-9 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-2 수용체 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 근육 또는 근육 세포에 전달하거나 대상체의 근육 또는 근육 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 디스트로핀 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심근 또는 심근 세포에 전달하거나 대상체의 심근 또는 심근 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 칼륨 채널 및 나트륨 채널 중 하나 또는 둘 다를 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Kv7.1 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Nav1.5 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신경계 또는 신경계 세포에 전달하거나 대상체의 신경계 또는 신경계 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 1 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 2 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 D 구성원 1 (ABCD1) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CLN3 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포에 전달하거나 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 베타 글로빈 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 브루톤 티로신 키나아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 응고 효소, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신장 또는 신장 세포에 전달하거나 대상체의 신장 또는 신장 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 IV형 콜라겐 알파 5 사슬 (COL4A5) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 안구 또는 안세포에 전달하거나 대상체의 안구 또는 안세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 A 구성원 4 (ABCA4) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 망막층간 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 망막 색소 상피-특이적 65 kDa (RPE65) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 290 kDa의 중심체 단백질(CDP290)을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체 또는 대상체의 세포에 백신을 전달하거나 대상체 또는 대상체의 세포를 백신으로 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 바이러스와 같은 감염원의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 광견병 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 사이토메갈로 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 로타 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 간염 바이러스, 예컨대 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 유두종 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 단순 헤르페스 바이러스, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 1형 또는 단순 헤르페스 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스 1형 또는 인간 면역 결핍 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 메타뉴모바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스, 예컨대 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2형, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 말라리아 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 지카 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 치쿤구니야 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암과 연관되었거나 대상체의 암 세포로부터 식별된 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체 본인의 암 세포로부터 결정된 항원, 즉 맞춤화된 암 백신을 제공하기 위한 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 KRAS 유전자로부터 발현된 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 이중 특이적 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 OX40에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 VEGF에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 조직 괴사 인자 알파에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CD3에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CD19에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 면역조절물질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 12를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 23을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 36 감마를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 인터페론 유전자의 자극제(STING) 단백질의 구성적 활성 변이체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 단백질, 예컨대 Cas 9 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메가뉴클레아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 징크 핑거 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 안구 질환을 치료하기 위해 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 망막층간 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 데 사용된다.

실시예

본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다.

물질:

다음의 실시예에서 기술된 지질 나노입자 제형은 달리 명시되지 않는 한, 앞서 논의된 것과 같은 여러 가지 핵산 물질을 캡슐화하도록 설계된 하나 이상의 양이온성 지질, 헬퍼 지질(예컨대, 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질) 및 PEG화 지질이 사용된 다양한 비율의 다성분 지질 혼합물을 함유한다. 다음 실시예에 기술된 mRNA는 반딧불 루시퍼라아제(FFL-mRNA) 또는 에리트로포이에틴(EPO-mRNA)을 암호화하는 mRNA였다.

실시예 1. 저농도의 지질 나노입자 및/또는 mRNA를 사용해 낮은 PEG-지질을 갖는 지질 나노입자 #1로 mRNA 캡슐화하기

본 실시예는 PEG-지질의 낮은 몰%를 갖는 지질 나노입자로 mRNA를 캡슐화하기 위한 방법 B에 대한 개선을 예시한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 방법 B는 미리 형성된 지질 나노입자를 mRNA와 혼합함으로써 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 공정을 지칭하며, 이에 대해서는 미국 특허 출원 공개 제US2018153822호에 추가로 기술된 바와 같고, 동 문헌은 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 다양한 온도(즉, 혼합물을 가열하거나 가열하지 않음), 완충제, 및 농도와 같은 상이한 조건의 범위가 방법 B에 사용될 수 있다. 본 실시예 및 다른 실시예에 기술된 예시적인 조건은 단지 예시를 위한 것이다.

요약하자면, 하기 표 1에 기술된 지질을 에탄올과 구연산염 완충액에 용해시키고, 미국 특허 출원 공개 제US2018153822호에 기술된 것과 같은 방법 B에 따라, mRNA가 없는 상태에서 표 1에 기술된 몰%로 먼저 함께 혼합하였다. 두 가지 스트림의 순간 혼합을 통해 빈 지질 나노입자를 형성하였는데, 이는 자가 조립 공정이었다. 생성된 제형은 알코올을 함유하는 시트르산 완충액 중 빈 지질 나노입자를 제공하였는데, 이를 (예를 들어, 법선 유동 여과(TFF)에 의해) 완충액 교환하여 10% wt/볼륨 트레할로스 용액 완충액 중 빈 지질 나노입자를 제공하였다.

지질	몰 %
CCBene	50
DMG-PEG	1.5
DSPC	10
콜레스테롤	38.5

방법 B의 경우, 그런 다음, 미리 형성된 빈 지질 나노입자로 이루어진 생성된 현탁액을 mRNA의 현탁액과 혼합하였다. 혼합 단계는, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 0.5 mg/ml의 동일한 농도로 사용해 수행하였다. 그러나, 이러한 혼합은 혼합물로부터 실질적인 침전을 초래하였는데, 이는 지질 나노입자 중 PEG-지질의 백분율이 높은 경우, 예를 들어 3%를 초과할 때는 일반적으로 관찰되지 않는다.

놀랍게도, (표 1에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 더 낮은 농도로 혼합했을 때는 침전이 관찰되지 않았다. 특히, (표 1에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 0.1 mg/ml의 농도로 함께 혼합했을 때에는 침전이 관찰되지 않았고, 나아가, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형은 다른 바람직한 특징을 포함하였다(평균 입자 직경 = 139 nm, 다중분산 지수(PDI) = 0.068, 및 mRNA 캡슐화율 = 90%). 또한, (표 1에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 0.05 mg/ml의 훨씬 더 낮은 농도로 함께 혼합했을 때에는 침전이 관찰되지 않았고, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형은 평균 입자 직경 = 123 nm, PDI = 0.091, 및 mRNA 캡슐화율 = 91%를 가졌다.

실시예 2. 저농도의 지질 나노입자 및/또는 mRNA를 사용해 낮은 PEG-지질을 갖는 지질 나노입자 #2로 mRNA 캡슐화하기

본 실시예는 낮은 몰%의 PEG-지질을 갖는 지질 나노입자로 mRNA를 캡슐화하기 위한 방법 B에 대한 개선의 또 다른 예시로서, 방법 B에서 저농도의 지질 나노입자 및 mRNA를 사용한 경우 낮은 몰%의 PEG-지질을 포함하는 지질 나노입자에 대해 관찰된 침전이 해결된다.

본 실시예에서, 하기 표 2에 기술된 지질을 에탄올과 구연산염 완충액에 용해시키고, 방법 B에 따라 및 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이, mRNA가 없는 상태에서 표 2에 기술된 동일한 몰%로 먼저 함께 혼합한 다음, 완충액 교환하였다.

지질	몰 %
표적23	40
DMG-PEG	3
DOPE	30
콜레스테롤	27

방법 B의 경우, 그런 다음, 미리 형성된 빈 지질 나노입자로 이루어진 생성된 현탁액을 mRNA의 현탁액과 혼합하였다. 혼합 단계는, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 0.3 mg/ml의 동일한 농도로 사용해 수행하였다. 그러나, 이러한 혼합은 혼합물로부터 실질적인 침전을 초래하였는데, 이는 지질 나노입자 중 PEG-지질의 백분율이 높을 때에는 일반적으로 관찰되지 않는다.

놀랍게도, (표 2에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 더 낮은 농도로 혼합했을 때는 침전이 관찰되지 않았다. 특히, (표 2에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 0.1 mg/ml의 농도로 함께 혼합했을 때에는 침전이 관찰되지 않았고, 나아가, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형은 바람직한 특징을 포함하였다(평균 입자 직경 = 92 nm, PDI = 0.105, 및 mRNA 캡슐화율 = 96%). 또한, (표 2에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 0.05 mg/ml의 훨씬 더 낮은 농도로 함께 혼합했을 때에는 침전이 관찰되지 않았고, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형은 평균 입자 직경 = 92 nm, PDI = 0.127, 및 mRNA 캡슐화율 = 95%를 가졌다.

실시예 3. 저농도의 지질 나노입자 및/또는 mRNA를 사용해 낮은 PEG-지질을 갖는 지질 나노입자 #3으로 mRNA 캡슐화하기

본 실시예에서, 하기 표 3에 기술된 지질을 에탄올과 구연산염 완충액에 용해시키고, 방법 B에 따라 및 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이, mRNA가 없는 상태에서 표 3에 기술된 동일한 몰%로 먼저 함께 혼합한 다음, 완충액 교환하였다.

지질	몰 %
ML7	50
DMG-PEG	1.5
DOPE	10
콜레스테롤	38.5

방법 B의 경우, 그런 다음, 미리 형성된 빈 지질 나노입자로 이루어진 생성된 현탁액을 mRNA의 현탁액과 혼합하였다. 혼합 단계는, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 1.0 mg/ml의 동일한 농도로 사용해 수행하였다. 그러나, 이러한 혼합은 혼합물로부터 실질적인 침전을 초래하였는데, 이는 지질 나노입자 중 PEG-지질의 백분율이 높을 때에는 일반적으로 관찰되지 않는다.

놀랍게도, (표 3에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 더 낮은 농도로 혼합했을 때는 침전이 관찰되지 않았다. 특히, (표 3에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 0.01 mg/ml의 더 낮은 농도로 함께 혼합했을 때에는 침전이 관찰되지 않았고, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형은 평균 입자 직경 = 163 nm를 가졌다.

실시예 4. 저농도의 지질 나노입자 및/또는 mRNA를 사용해 지질 나노입자 #4로 mRNA 캡슐화하기

본 실시예는 지질 나노입자로 mRNA를 캡슐화하기 위한 방법 B에 대한 개선의 또 다른 예시로서, 방법 B에서 저농도의 지질 나노입자 및 mRNA를 사용한 경우, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형에서 더 작은 지질 나노입자 크기를 가능하게 한다.

본 실시예에서, 하기 표 4에 기술된 지질을 에탄올과 구연산염 완충액에 용해시키고, 방법 B에 따라 및 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이, mRNA가 없는 상태에서 표 4에 기술된 동일한 몰%로 먼저 함께 혼합한 다음, 완충액 교환하였다.

지질	몰 %
ML7	50
DMG-PEG	2.5
DSPC	10
콜레스테롤	37.5

방법 B의 경우, 그런 다음, 미리 형성된 빈 지질 나노입자로 이루어진 생성된 현탁액을 mRNA의 현탁액과 혼합하였다. 혼합 단계는, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 1.0 mg/ml의 동일한 농도로 사용해 수행하였다. 본 실시예에서, 이러한 혼합 단계는 혼합물로부터 실질적인 침전을 초래하지 않았지만, 생성된 mRNA-지질 나노입자 제형 중 지질 나노입자의 평균 직경은 152 nm로 상대적으로 컸고, 캡슐화율은 92%였다.

그러나, (표 4에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 더 낮은 농도로 함께 혼합했을 때, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형 중 지질 나노입자의 평균 직경은 더 작았다. 특히, (표 4에 기술된 바와 같은) 동일한 미리 형성된 빈 지질 나노입자 현탁액 및 동일한 mRNA 현탁액을 각각 동일한 볼륨과 각각 0.1 mg/ml의 더 낮은 농도로 함께 혼합했을 때, 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형은 133 nm의 더 작은 평균 입자 직경을 가졌고, mRNA 캡슐화율은 85%였다.

종합하면, 이들 실시예에서의 이들 데이터는, 본원 및 미국 특허 출원 공개 제US2018153822호에 기술된 것과 같은 방법 B의 캡슐화 방법을 사용할 때, 지질 나노입자 및/또는 mRNA의 농도를 낮추는 것이 실질적인 이점이 될 수 있음을 보여준다. 이러한 이점에는, 낮은 몰%의 PEG 지질을 가진 지질 나노입자를 사용할 때의 침전 또는 응집이 방지되거나 회피되는 것이 포함된다. 이점에는 생성된 mRNA - 지질 나노입자 제형에 더 작은 지질 나노입자 크기를 제공하는 것도 포함될 수 있다.

균등물

당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에서 설명되는 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.

SEQUENCE LISTING <110> Translate Bio, Inc. <120> IMPROVED PROCESS OF PREPARING MRNA-LOADED LIPID NANOPARTICLES <130> MRT-2030WO <150> 62/724,582 <151> 2018-08-29 <150> 62/725,765 <151> 2018-08-31 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1065 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 augcuguuca accuucggau cuugcugaac aacgcugcgu uccggaaugg ucacaacuuc 60 augguccgga acuucagaug cggccagccg cuccagaaca aggugcagcu caaggggagg 120 gaccuccuca cccugaaaaa cuucaccgga gaagagauca aguacaugcu guggcuguca 180 gccgaccuca aauuccggau caagcagaag ggcgaauacc uuccuuugcu gcagggaaag 240 ucccugggga ugaucuucga gaagcgcagc acucgcacua gacugucaac ugaaaccggc 300 uucgcgcugc ugggaggaca ccccugcuuc cugaccaccc aagauaucca ucugggugug 360 aacgaauccc ucaccgacac agcgcgggug cugucgucca uggcagacgc gguccucgcc 420 cgcguguaca agcagucuga ucuggacacu cuggccaagg aagccuccau uccuaucauu 480 aauggauugu ccgaccucua ccaucccauc cagauucugg ccgauuaucu gacucugcaa 540 gaacauuaca gcucccugaa ggggcuuacc cuuucgugga ucggcgacgg caacaacauu 600 cugcacagca uuaugaugag cgcugccaag uuuggaaugc accuccaagc agcgaccccg 660 aagggauacg agccagacgc cuccgugacg aagcuggcug agcaguacgc caaggagaac 720 ggcacuaagc ugcugcucac caacgacccu cucgaagccg cccacggugg caacgugcug 780 aucaccgaua ccuggaucuc caugggacag gaggaggaaa agaagaagcg ccugcaagca 840 uuucaggggu accaggugac uaugaaaacc gccaaggucg ccgccucgga cuggaccuuc 900 uugcacuguc ugcccagaaa gcccgaagag guggacgacg agguguucua cagcccgcgg 960 ucgcuggucu uuccggaggc cgaaaacagg aaguggacua ucauggccgu gauggugucc 1020 cugcugaccg auuacucccc gcagcugcag aaaccaaagu ucuga 1065 <210> 2 <211> 1239 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 augagcagca agggcagcgu ggugcuggcc uacagcggcg gccuggacac cagcugcauc 60 cugguguggc ugaaggagca gggcuacgac gugaucgccu accuggccaa caucggccag 120 aaggaggacu ucgaggaggc ccgcaagaag gcccugaagc ugggcgccaa gaagguguuc 180 aucgaggacg ugagccgcga guucguggag gaguucaucu ggcccgccau ccagagcagc 240 gcccuguacg aggaccgcua ccugcugggc accagccugg cccgccccug caucgcccgc 300 aagcaggugg agaucgccca gcgcgagggc gccaaguacg ugagccacgg cgccaccggc 360 aagggcaacg accaggugcg cuucgagcug agcugcuaca gccuggcccc ccagaucaag 420 gugaucgccc ccuggcgcau gcccgaguuc uacaaccgcu ucaagggccg caacgaccug 480 auggaguacg ccaagcagca cggcaucccc auccccguga cccccaagaa ccccuggagc 540 auggacgaga accugaugca caucagcuac gaggccggca uccuggagaa ccccaagaac 600 caggcccccc ccggccugua caccaagacc caggaccccg ccaaggcccc caacaccccc 660 gacauccugg agaucgaguu caagaagggc gugcccguga aggugaccaa cgugaaggac 720 ggcaccaccc accagaccag ccuggagcug uucauguacc ugaacgaggu ggccggcaag 780 cacggcgugg gccgcaucga caucguggag aaccgcuuca ucggcaugaa gagccgcggc 840 aucuacgaga cccccgccgg caccauccug uaccacgccc accuggacau cgaggccuuc 900 accauggacc gcgaggugcg caagaucaag cagggccugg gccugaaguu cgccgagcug 960 guguacaccg gcuucuggca cagccccgag ugcgaguucg ugcgccacug caucgccaag 1020 agccaggagc gcguggaggg caaggugcag gugagcgugc ugaagggcca gguguacauc 1080 cugggccgcg agagcccccu gagccuguac aacgaggagc uggugagcau gaacgugcag 1140 ggcgacuacg agcccaccga cgccaccggc uucaucaaca ucaacagccu gcgccugaag 1200 gaguaccacc gccugcagag caaggugacc gccaaguga 1239 <210> 3 <211> 4443 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 augcaacgcu cuccucuuga aaaggccucg guggugucca agcucuucuu cucguggacu 60 agacccaucc ugagaaaggg guacagacag cgcuuggagc uguccgauau cuaucaaauc 120 ccuuccgugg acuccgcgga caaccugucc gagaagcucg agagagaaug ggacagagaa 180 cucgccucaa agaagaaccc gaagcugauu aaugcgcuua ggcggugcuu uuucuggcgg 240 uucauguucu acggcaucuu ccucuaccug ggagagguca ccaaggccgu gcagccccug 300 uugcugggac ggauuauugc cuccuacgac cccgacaaca aggaagaaag aagcaucgcu 360 aucuacuugg gcaucggucu gugccugcuu uucaucgucc ggacccucuu guugcauccu 420 gcuauuuucg gccugcauca cauuggcaug cagaugagaa uugccauguu uucccugauc 480 uacaagaaaa cucugaagcu cucgagccgc gugcuugaca agauuuccau cggccagcuc 540 gugucccugc ucuccaacaa ucugaacaag uucgacgagg gccucgcccu ggcccacuuc 600 guguggaucg ccccucugca aguggcgcuu cugaugggcc ugaucuggga gcugcugcaa 660 gccucggcau ucugugggcu uggauuccug aucgugcugg cacuguucca ggccggacug 720 gggcggauga ugaugaagua cagggaccag agagccggaa agauuuccga acggcuggug 780 aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucagugaagg ccuacugcug ggaagaggcc 840 auggaaaaga ugauugaaaa ccuccggcaa accgagcuga agcugacccg caaggccgcu 900 uacgugcgcu auuucaacuc guccgcuuuc uucuucuccg gguucuucgu gguguuucuc 960 uccgugcucc ccuacgcccu gauuaaggga aucauccuca ggaagaucuu caccaccauu 1020 uccuucugua ucgugcuccg cauggccgug acccggcagu ucccaugggc cgugcagacu 1080 ugguacgacu cccugggagc cauuaacaag auccaggacu uccuucaaaa gcaggaguac 1140 aagacccucg aguacaaccu gacuacuacc gaggucguga uggaaaacgu caccgccuuu 1200 ugggaggagg gauuuggcga acuguucgag aaggccaagc agaacaacaa caaccgcaag 1260 accucgaacg gugacgacuc ccucuucuuu ucaaacuuca gccugcucgg gacgcccgug 1320 cugaaggaca uuaacuucaa gaucgaaaga ggacagcucc uggcgguggc cggaucgacc 1380 ggagccggaa agacuucccu gcugauggug aucaugggag agcuugaacc uagcgaggga 1440 aagaucaagc acuccggccg caucagcuuc uguagccagu uuuccuggau caugcccgga 1500 accauuaagg aaaacaucau cuucggcgug uccuacgaug aauaccgcua ccgguccgug 1560 aucaaagccu gccagcugga agaggauauu ucaaaguucg cggagaaaga uaacaucgug 1620 cugggcgaag gggguauuac cuugucgggg ggccagcggg cuagaaucuc gcuggccaga 1680 gccguguaua aggacgccga ccuguaucuc cuggacuccc ccuucggaua ccuggacguc 1740 cugaccgaaa aggagaucuu cgaaucgugc gugugcaagc ugauggcuaa caagacucgc 1800 auccucguga ccuccaaaau ggagcaccug aagaaggcag acaagauucu gauucugcau 1860 gagggguccu ccuacuuuua cggcaccuuc ucggaguugc agaacuugca gcccgacuuc 1920 ucaucgaagc ugauggguug cgacagcuuc gaccaguucu ccgccgaaag aaggaacucg 1980 auccugacgg aaaccuugca ccgcuucucu uuggaaggcg acgccccugu gucauggacc 2040 gagacuaaga agcagagcuu caagcagacc ggggaauucg gcgaaaagag gaagaacagc 2100 aucuugaacc ccauuaacuc cauccgcaag uucucaaucg ugcaaaagac gccacugcag 2160 augaacggca uugaggagga cuccgacgaa ccccuugaga ggcgccuguc ccuggugccg 2220 gacagcgagc agggagaagc cauccugccu cggauuuccg ugaucuccac ugguccgacg 2280 cuccaagccc ggcggcggca guccgugcug aaccugauga cccacagcgu gaaccagggc 2340 caaaacauuc accgcaagac uaccgcaucc acccggaaag ugucccuggc accucaagcg 2400 aaucuuaccg agcucgacau cuacucccgg agacugucgc aggaaaccgg gcucgaaauu 2460 uccgaagaaa ucaacgagga ggaucugaaa gagugcuucu ucgacgauau ggagucgaua 2520 cccgccguga cgacuuggaa cacuuaucug cgguacauca cugugcacaa gucauugauc 2580 uucgugcuga uuuggugccu ggugauuuuc cuggccgagg ucgcggccuc acugguggug 2640 cucuggcugu ugggaaacac gccucugcaa gacaagggaa acuccacgca cucgagaaac 2700 aacagcuaug ccgugauuau cacuuccacc uccucuuauu acguguucua caucuacguc 2760 ggaguggcgg auacccugcu cgcgaugggu uucuucagag gacugccgcu gguccacacc 2820 uugaucaccg ucagcaagau ucuucaccac aagauguugc auagcgugcu gcaggccccc 2880 auguccaccc ucaacacucu gaaggccgga ggcauucuga acagauucuc caaggacauc 2940 gcuauccugg acgaucuccu gccgcuuacc aucuuugacu ucauccagcu gcugcugauc 3000 gugauuggag caaucgcagu gguggcggug cugcagccuu acauuuucgu ggccacugug 3060 ccggucauug uggcguucau caugcugcgg gccuacuucc uccaaaccag ccagcagcug 3120 aagcaacugg aauccgaggg acgauccccc aucuucacuc accuugugac gucguugaag 3180 ggacugugga cccuccgggc uuucggacgg cagcccuacu ucgaaacccu cuuccacaag 3240 gcccugaacc uccacaccgc caauugguuc cuguaccugu ccacccugcg gugguuccag 3300 augcgcaucg agaugauuuu cgucaucuuc uucaucgcgg ucacauucau cagcauccug 3360 acuaccggag agggagaggg acgggucgga auaauccuga cccucgccau gaacauuaug 3420 agcacccugc agugggcagu gaacagcucg aucgacgugg acagccugau gcgaagcguc 3480 agccgcgugu ucaaguucau cgacaugccu acugagggaa aacccacuaa guccacuaag 3540 cccuacaaaa auggccagcu gagcaagguc augaucaucg aaaacuccca cgugaagaag 3600 gacgauauuu ggcccuccgg aggucaaaug accgugaagg accugaccgc aaaguacacc 3660 gagggaggaa acgccauucu cgaaaacauc agcuucucca uuucgccggg acagcggguc 3720 ggccuucucg ggcggaccgg uuccgggaag ucaacucugc ugucggcuuu ccuccggcug 3780 cugaauaccg agggggaaau ccaaauugac ggcgugucuu gggauuccau uacucugcag 3840 caguggcgga aggccuucgg cgugaucccc cagaaggugu ucaucuucuc ggguaccuuc 3900 cggaagaacc uggauccuua cgagcagugg agcgaccaag aaaucuggaa ggucgccgac 3960 gaggucggcc ugcgcuccgu gauugaacaa uuuccuggaa agcuggacuu cgugcucguc 4020 gacgggggau guguccuguc gcacggacau aagcagcuca ugugccucgc acgguccgug 4080 cucuccaagg ccaagauucu gcugcuggac gaaccuucgg cccaccugga uccggucacc 4140 uaccagauca ucaggaggac ccugaagcag gccuuugccg auugcaccgu gauucucugc 4200 gagcaccgca ucgaggccau gcuggagugc cagcaguucc uggucaucga ggagaacaag 4260 guccgccaau acgacuccau ucaaaagcuc cucaacgagc ggucgcuguu cagacaagcu 4320 auuucaccgu ccgauagagu gaagcucuuc ccgcaucgga acagcucaaa gugcaaaucg 4380 aagccgcaga ucgcagccuu gaaggaagag acugaggaag aggugcagga cacccggcuu 4440 uaa 4443 <210> 4 <211> 4443 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 augcagcggu ccccgcucga aaaggccagu gucgugucca aacucuucuu cucauggacu 60 cggccuaucc uuagaaaggg guaucggcag aggcuugagu ugucugacau cuaccagauc 120 cccucgguag auucggcgga uaaccucucg gagaagcucg aacgggaaug ggaccgcgaa 180 cucgcgucua agaaaaaccc gaagcucauc aacgcacuga gaaggugcuu cuucuggcgg 240 uucauguucu acgguaucuu cuuguaucuc ggggagguca caaaagcagu ccaaccccug 300 uuguuggguc gcauuaucgc cucguacgac cccgauaaca aagaagaacg gagcaucgcg 360 aucuaccucg ggaucggacu guguuugcuu uucaucguca gaacacuuuu guugcaucca 420 gcaaucuucg gccuccauca caucgguaug cagaugcgaa ucgcuauguu uagcuugauc 480 uacaaaaaga cacugaaacu cucgucgcgg guguuggaua agauuuccau cggucaguug 540 gugucccugc uuaguaauaa ccucaacaaa uucgaugagg gacuggcgcu ggcacauuuc 600 guguggauug ccccguugca agucgcccuu uugaugggcc uuauuuggga gcuguugcag 660 gcaucugccu uuuguggccu gggauuucug auuguguugg cauuguuuca ggcugggcuu 720 gggcggauga ugaugaagua ucgcgaccag agagcgggua aaaucucgga aagacucguc 780 aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucggucaaag ccuauugcug ggaagaagcu 840 auggagaaga ugauugaaaa ccuccgccaa acugagcuga aacugacccg caaggcggcg 900 uauguccggu auuucaauuc gucagcguuc uucuuuuccg gguucuucgu ugucuuucuc 960 ucgguuuugc cuuaugccuu gauuaagggg auuauccucc gcaagauuuu caccacgauu 1020 ucguucugca uuguauugcg cauggcagug acacggcaau uuccgugggc cgugcagaca 1080 ugguaugacu cgcuuggagc gaucaacaaa auccaagacu ucuugcaaaa gcaagaguac 1140 aagacccugg aguacaaucu uacuacuacg gagguaguaa uggagaaugu gacggcuuuu 1200 ugggaagagg guuuuggaga acuguuugag aaagcaaagc agaauaacaa caaccgcaag 1260 accucaaaug gggacgauuc ccuguuuuuc ucgaacuucu cccugcucgg aacacccgug 1320 uugaaggaca ucaauuucaa gauugagagg ggacagcuuc ucgcgguagc gggaagcacu 1380 ggugcgggaa aaacuagccu cuugauggug auuauggggg agcuugagcc cagcgagggg 1440 aagauuaaac acuccgggcg uaucucauuc uguagccagu uuucauggau caugcccgga 1500 accauuaaag agaacaucau uuucggagua uccuaugaug aguaccgaua cagaucgguc 1560 auuaaggcgu gccaguugga agaggacauu ucuaaguucg ccgagaagga uaacaucguc 1620 uugggagaag gggguauuac auugucggga gggcagcgag cgcggaucag ccucgcgaga 1680 gcgguauaca aagaugcaga uuuguaucug cuugauucac cguuuggaua ccucgacgua 1740 uugacagaaa aagaaaucuu cgagucgugc guguguaaac uuauggcuaa uaagacgaga 1800 auccugguga caucaaaaau ggaacaccuu aagaaggcgg acaagauccu gauccuccac 1860 gaaggaucgu ccuacuuuua cggcacuuuc ucagaguugc aaaacuugca gccggacuuc 1920 ucaagcaaac ucauggggug ugacucauuc gaccaguuca gcgcggaacg gcggaacucg 1980 aucuugacgg aaacgcugca ccgauucucg cuugagggug augccccggu aucguggacc 2040 gagacaaaga agcagucguu uaagcagaca ggagaauuug gugagaaaag aaagaacagu 2100 aucuugaauc cuauuaacuc aauucgcaag uucucaaucg uccagaaaac uccacugcag 2160 augaauggaa uugaagagga uucggacgaa ccccuggagc gcaggcuuag ccucgugccg 2220 gauucagagc aaggggaggc cauucuuccc cggauuucgg ugauuucaac cggaccuaca 2280 cuucaggcga ggcgaaggca auccgugcuc aaccucauga cgcauucggu aaaccagggg 2340 caaaacauuc accgcaaaac gacggccuca acgagaaaag ugucacuugc accccaggcg 2400 aauuugacug aacucgacau cuacagccgu aggcuuucgc aagaaaccgg acuugagauc 2460 agcgaagaaa ucaaugaaga agauuugaaa gaguguuucu uugaugacau ggaaucaauc 2520 ccagcgguga caacguggaa cacauacuug cguuacauca cggugcacaa guccuugauu 2580 uucguccuca ucuggugucu cgugaucuuu cucgcugagg ucgcagcguc acuugugguc 2640 cucuggcugc uugguaauac gcccuugcaa gacaaaggca auucuacaca cucaagaaac 2700 aauuccuaug ccgugauuau cacuucuaca agcucguauu acguguuuua caucuacgua 2760 ggaguggccg acacucugcu cgcgaugggu uucuuccgag gacucccacu cguucacacg 2820 cuuaucacug ucuccaagau ucuccaccau aagaugcuuc auagcguacu gcaggcuccc 2880 auguccaccu ugaauacgcu caaggcggga gguauuuuga aucgcuucuc aaaagauauu 2940 gcaauuuugg augaccuucu gccccugacg aucuucgacu ucauccaguu guugcugauc 3000 gugauugggg cuauugcagu agucgcuguc cuccagccuu acauuuuugu cgcgaccguu 3060 ccggugaucg uggcguuuau caugcugcgg gccuauuucu ugcagacguc acagcagcuu 3120 aagcaacugg agucugaagg gaggucgccu aucuuuacgc aucuugugac caguuugaag 3180 ggauugugga cguugcgcgc cuuuggcagg cagcccuacu uugaaacacu guuccacaaa 3240 gcgcugaauc uccauacggc aaauugguuu uuguauuuga guacccuccg augguuucag 3300 augcgcauug agaugauuuu ugugaucuuc uuuaucgcgg ugacuuuuau cuccaucuug 3360 accacgggag agggcgaggg acgggucggu auuauccuga cacucgccau gaacauuaug 3420 agcacuuugc agugggcagu gaacagcucg auugaugugg auagccugau gagguccguu 3480 ucgagggucu uuaaguucau cgacaugccg acggagggaa agcccacaaa aaguacgaaa 3540 cccuauaaga augggcaauu gaguaaggua augaucaucg agaacaguca cgugaagaag 3600 gaugacaucu ggccuagcgg gggucagaug accgugaagg accugacggc aaaauacacc 3660 gagggaggga acgcaauccu ugaaaacauc ucguucagca uuagccccgg ucagcgugug 3720 ggguugcucg ggaggaccgg gucaggaaaa ucgacguugc ugucggccuu cuugagacuu 3780 cugaauacag agggugagau ccagaucgac ggcguuucgu gggauagcau caccuugcag 3840 caguggcgga aagcguuugg aguaaucccc caaaaggucu uuaucuuuag cggaaccuuc 3900 cgaaagaauc ucgauccuua ugaacagugg ucagaucaag agauuuggaa agucgcggac 3960 gagguuggcc uucggagugu aaucgagcag uuuccgggaa aacucgacuu uguccuugua 4020 gaugggggau gcguccuguc gcaugggcac aagcagcuca ugugccuggc gcgauccguc 4080 cucucuaaag cgaaaauucu ucucuuggau gaaccuucgg cccaucugga cccgguaacg 4140 uaucagauca ucagaaggac acuuaagcag gcguuugccg acugcacggu gauucucugu 4200 gagcaucgua ucgaggccau gcucgaaugc cagcaauuuc uugucaucga agagaauaag 4260 guccgccagu acgacuccau ccagaagcug cuuaaugaga gaucauuguu ccggcaggcg 4320 auuucaccau ccgauagggu gaaacuuuuu ccacacagaa auucgucgaa gugcaagucc 4380 aaaccgcaga ucgcggccuu gaaagaagag acugaagaag aaguucaaga cacgcgucuu 4440 uaa 4443 <210> 5 <211> 1359 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 5 augagcaccg ccgugcugga gaaccccggc cugggccgca agcugagcga cuucggccag 60 gagaccagcu acaucgagga caacugcaac cagaacggcg ccaucagccu gaucuucagc 120 cugaaggagg aggugggcgc ccuggccaag gugcugcgcc uguucgagga gaacgacgug 180 aaccugaccc acaucgagag ccgccccagc cgccugaaga aggacgagua cgaguucuuc 240 acccaccugg acaagcgcag ccugcccgcc cugaccaaca ucaucaagau ccugcgccac 300 gacaucggcg ccaccgugca cgagcugagc cgcgacaaga agaaggacac cgugcccugg 360 uucccccgca ccauccagga gcuggaccgc uucgccaacc agauccugag cuacggcgcc 420 gagcuggacg ccgaccaccc cggcuucaag gaccccgugu accgcgcccg ccgcaagcag 480 uucgccgaca ucgccuacaa cuaccgccac ggccagccca ucccccgcgu ggaguacaug 540 gaggaggaga agaagaccug gggcaccgug uucaagaccc ugaagagccu guacaagacc 600 cacgccugcu acgaguacaa ccacaucuuc ccccugcugg agaaguacug cggcuuccac 660 gaggacaaca ucccccagcu ggaggacgug agccaguucc ugcagaccug caccggcuuc 720 cgccugcgcc ccguggccgg ccugcugagc agccgcgacu uccugggcgg ccuggccuuc 780 cgcguguucc acugcaccca guacauccgc cacggcagca agcccaugua cacccccgag 840 cccgacaucu gccacgagcu gcugggccac gugccccugu ucagcgaccg cagcuucgcc 900 caguucagcc aggagaucgg ccuggccagc cugggcgccc ccgacgagua caucgagaag 960 cuggccacca ucuacugguu caccguggag uucggccugu gcaagcaggg cgacagcauc 1020 aaggccuacg gcgccggccu gcugagcagc uucggcgagc ugcaguacug ccugagcgag 1080 aagcccaagc ugcugccccu ggagcuggag aagaccgcca uccagaacua caccgugacc 1140 gaguuccagc cccuguacua cguggccgag agcuucaacg acgccaagga gaaggugcgc 1200 aacuucgccg ccaccauccc ccgccccuuc agcgugcgcu acgaccccua cacccagcgc 1260 aucgaggugc uggacaacac ccagcagcug aagauccugg ccgacagcau caacagcgag 1320 aucggcaucc ugugcagcgc ccugcagaag aucaaguaa 1359

Claims

지질 나노입자로 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법으로서,
미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA를 포함하는 용액을 혼합하여, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자가 형성되도록 하는 단계를 포함하되,
상기 미리 형성된 지질 나노입자 및/또는 mRNA는 0.5 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재하는, 방법.
제1항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자는 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 이하의 농도로 존재하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, mRNA는 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA 각각은 0.1 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA 각각은 0.05 mg/ml 이하의 농도로 용액에 존재하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 0.5 mg/ml 이하의 농도를 달성하도록 용액을 희석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자는 PEG-변형 지질을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, PEG-변형 지질은 지질 나노입자 중 총 지질의 3% 미만, 2.5% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만 또는 1% 미만을 구성하는, 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, PEG-변형 지질은 지질 나노입자 중 총 지질의 0.1% 내지 3%, 또는 0.75% 내지 2.5%, 또는 0.5% 내지 2%를 구성하는, 방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, PEG-변형 지질은 지질 나노입자 중 총 지질의 약 1%를 구성하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA를 포함하는 용액은 10 mM 미만의 구연산염을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA를 포함하는 용액은 25% 미만의 비수성 용매를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합 단계 후에, 지질 나노입자 및 mRNA를 주변 온도보다 더 높은 온도로 가열하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합 단계 전에, mRNA 및/또는 미리 형성된 지질 나노입자는 주변 온도보다 더 높은 온도로 가열되는, 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃이거나 더 높은, 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도는 약 25~70℃, 약 30~70℃, 약 35~70℃, 약 40~70℃, 약 45~70℃, 약 50~70℃, 또는 약 60~70℃의 범위인, 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도는 약 65℃인, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자는 에탄올에 용해된 지질을 수용액과 혼합함으로써 형성되는, 방법.
제18항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 및 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 cKK-E12, OF-02, C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, ICE (이미다졸계), HGT5000, HGT5001, HGT4003, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA 및 DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, DLinSSDMA, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, 3-(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)-6-(4-((2-하이드록시도데실)(2-하이드록시운데실)아미노)부틸)-1,4-다이옥산-2,5-다이온 (표적 23), 3-(5-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)펜탄-2-일)-6-(5-((2-하이드록시도데실)(2-하이드록시운데실)아미노)펜탄-2-일)-1,4-다이옥산-2,5-다이온 (표적 24), ccBene, ML7, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제20항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 ccBene을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 ML7을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 DLinSSDMA를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 리보스 양이온성 지질을 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-다이올레일-sn-글리세로-3-포스포티딜콜린(DOPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-다이올레일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG)로부터 선택되는, 방법.
제7항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, PEG-변형 지질은 C₆-C₂₀ 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유 결합된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 75 내지 150 nm 범위의 크기를 갖는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자의 실질적으로 전부는 75 내지 150 nm 범위의 크기를 갖는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 지질 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 50 내지 80 nm 범위의 크기를 갖는, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 캡슐화 속도는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 초과하는, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 mRNA가 회수되는, 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 지질 나노입자의 실질적인 응집을 초래하지 않는, 방법.