KR20220078557A - 개선된 mrna 로딩된 지질 나노입자 및 이의 제조 방법 - Google Patents

개선된 mrna 로딩된 지질 나노입자 및 이의 제조 방법 Download PDF

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KR20220078557A
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cationic
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슈리랑 카르브
아쉬시 사로데
프랑크 데로사
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트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 mRNA를 캡슐화하는 개선된 지질 나노입자 제형을 제공한다.

Description

개선된 MRNA 로딩된 지질 나노입자 및 이의 제조 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 8일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/871,513호의 우선권을 주장하고, 그 개시 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
기술분야
본 발명은 지질 매개 mRNA 전달; 및 지질 화합물, 및 이러한 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이러한 화합물 및 조성물의 방법 및 용도, 그리고 이러한 화합물 및 조성물을 제조하는 프로세스에 관한 것이다.
전령 RNA 요법(MRT)은 다양한 질환의 치료 또는 예방에 점점 더 중요한 접근법이 되고 있다. MRT는 대상체의 체내에서 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 생산을 위한 요법을 필요로 하는 대상체에게 전령 RNA(mRNA)를 투여하는 것을 포함한다. 지질 나노입자는 mRNA의 효율적인 생체 내 전달을 위해 mRNA를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다.
확장 가능하고 비용 효율적인 제조 공정에 적용될 수 있는 지질 나노입자를 사용하여 mRNA의 생체 내 전달 및/또는 발현을 향상시킬 수 있는 새로운 방법 및 조성물을 식별하기 위한 많은 노력이 이루어져 왔다. 동시에, mRNA의 세포내 전달 및/또는 발현에 대한 이러한 임의의 강화가 지질 매개 mRNA 전달과 관련된 조성물의 안전성 및 내약성을 유지하거나 개선한다는 것도 중요하다.
mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 다중-성분 지질 나노입자는 생체 내 mRNA의 전달 및 발현을 달성하는 데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 최근 연구의 특정 초점은 mRNA 전달을 위한 새로운 양이온성 지질의 발견에 있었다. 다중-성분 지질 나노입자의 다른 성분은 거의 주목을 받지 않거나 전혀 주목받지 않는다. mRNA의 세포내 전달 및/또는 발현을 달성하도록 mRNA의 지질 나노입자 전달을 개선할 필요성이 지속적으로 존재한다. 동시에, 새로운 지질 나노입자 제형의 안전성 및 내약성을 유지하거나 개선하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 놀랍게도 mRNA를 캡슐화하는 다중성분 리포좀의 헬퍼 지질 성분을 최적화함으로써 생체 내 mRNA의 전달 및/또는 발현이 극적으로 개선될 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명은,하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 mRNA-캡슐화 지질 나노입자 제형 중의 헬퍼 지질로서의 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DEPE)의 존재가 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 헬퍼 지질 중 하나로서 포함하는 종래의 리포좀에 비해 2배 초과만큼 생체 내 mRNA의 전달 및/또는 발현을 증가시킬 수 있다는 발견에 기초한다. DEPE-함유 지질 나노입자는 안전성과 내약성 측면에서 DOPE-함유 지질 나노입자와 비슷하였다(ALT 및 AST와 같은 간 독성 마커에 의해 평가됨).
따라서, mRNA를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 지질 나노입자를 제공하는 것이 본 발명의 일 양태이며, 여기에서 지질 나노입자는 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기에서 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함한다. 지질 나노입자 내의 DEPE는 대상체에게 투여될 때 mRNA의 발현 강화를 제공한다.
본 발명의 구현예에서, DEPE, 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)은 다음의 구조:
Figure pct00001
또는 다음의 구조에 의해 구조적으로 표시된다
Figure pct00002
본 발명의 구현예에서, mRNA의 발현 강화는, 상이한 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고 DEPE를 포함하지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 지질 성분 및 양을 갖는 제2 지질 나노입자로부터의 동일한 mRNA의 발현에 비해 더 강화된다. 소정의 구현예에서, 발현 강화는 제2 지질 나노입자에 비해 2배 이상 증가된다. 일부 구현예에서, 제2 지질 나노입자 내의 상이한 하나 이상의 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-딜리놀레오일sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
소정의 구현예에서, 지질 나노입자 내의 DEPE는 지질 나노입자 내의 총 지질의 적어도 0.5 몰%의 농도로, 예를 들어 0.5 몰% 내지 50 몰%의 농도로, 특히 10 몰% 내지 45 몰%의 농도로 존재한다. 보다 일반적으로, 지질 나노입자 내의 DEPE는 지질 나노입자 내의 총 지질의 25 몰% 내지 35 몰%의 농도로 존재한다.
소정의 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 cKK-E12이거나 이를 포함한다.
소정의 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 ICE(이미다졸 콜레스테롤 에스테르)이거나 이를 포함한다.
소정의 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00003
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함하며;
식 중 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 지방족이고; 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 값을 갖는 정수이고; 각각의 A는 독립적으로 공유 결합 또는 아릴렌이고; 각각의 L1은 독립적으로 에스테르 기, 티오에스테르 기, 이황화 기 또는 무수물 기이고; 각각의 L2는 독립적으로 C2-C10 지방족이고; 각각의 X1은 독립적으로 H 또는 OH이며; 각각의 R3은 독립적으로 C6-C20이다. 소정의 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 다음의 화합물:
Figure pct00004
(화합물 1)
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 다음의 화합물:
Figure pct00005
(화합물 2)
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 다음의 화합물:
Figure pct00006
(화합물 3)
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함한다. 소정의 구현예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬을 가진 지질에 공유 결합된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하고 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 지질 나노입자는 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 포함하는 양이온성 지질을 또한 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C8-C16 길이의 1 내지 4개의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C10-C16 길이의 1 내지 4개의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C10-C14 길이의 1 내지 4개의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C10 길이의 1 내지 4개의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C12 길이의 1 내지 4개의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C16 길이의 1 내지 4개의 알킬 사슬(들)을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하고 헬퍼 지질로서의 DEPE를 포함하는 지질 나노입자는 또한 각각 C6-C20 길이의 1 내지 4개의 알킬 사슬(들)을 포함하는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C8-C16 길이의 1 내지 4개의 지방족 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C10-C14 길이의 1 내지 4개의 지방족 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C10 길이의 1 내지 4개의 지방족 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C12 길이의 1 내지 4개의 지방족 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 각각 C16 길이의 1 내지 4개의 지방족 사슬(들)을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하고 헬퍼 지질로서의 DEPE를 포함하는 지질 나노입자는 또한 리피도이드이거나 이를 포함하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 4개의 지방족 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 각각은 독립적으로 C6-C20 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 각각은 독립적으로 C8-C16 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 각각은 독립적으로 C10-C14 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 각각은 독립적으로 C10 또는 C12 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C6 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C8 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C10 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C12 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C14 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C16 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C18 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 모두는 C20 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C6 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C8 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C10 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C12 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C14 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C16 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C18 길이이다. 일부 구현예에서, 4개의 리피도이드 지방족 사슬 중 적어도 2개는 C20 길이이다.
일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하고 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 지질 나노입자는 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 포함하는 리피도이드를 또한 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 C8-C16 길이의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 C10-C14 길이의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 C10 길이의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 C12 길이의 알킬 사슬(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 C16 길이의 알킬 사슬(들)을 포함한다.
특정 구현예에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 스테롤을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스테롤은 콜레스테롤계 지질, 예를 들어, 콜레스테롤 또는 PEG화 콜레스테롤이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질 및 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 전형적인 구현예에서, 지질 나노입자의 지질 성분은 양이온성 지질(예를 들어, cKK-E12, 화합물 1, 화합물 2, 또는 화합물 3), PEG-변형 지질(예를 들어, DMG-PEG2K), 비-양이온성 지질(DEPE) 및 콜레스테롤계 지질(예를 들어, 콜레스테롤)을 포함하는 4가지 유형의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 약 30~60:25~35:20~30:1~15 사이에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 지질 성분은 양이온성 지질(예를 들어, ICE), PEG-변형 지질(예를 들어, DMG-PEG2K), 비-양이온성 지질(DEPE)을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 약 50~60:45~30:5~10 사이에 있을 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자에 의해 전달되는 mRNA는 생체 내에서 치료 단백질로 번역되는 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 소정의 구현예에서, 단백질을 암호화하는 mRNA는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 치료 폴리펩티드는 항체 경쇄 또는 항체 중쇄이다. 일부 구현예에서, 치료 폴리펩티드는 대상체에서 없거나 결핍된 폴리펩티드이다. 소정의 구현예에서, 단백질을 암호화하는 mRNA는 펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 항원이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에 대한 mRNA의 전달을 개선하는 것을 필요로 하는 대상체에서 이를 개선하는 방법을 제공하며, 방법은, 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함한다. 지질 나노입자 내의 DEPE는 대상체에게 투여될 때 mRNA의 발현 강화를 제공한다.
일부 구현예에서, mRNA는 생체 내에서 치료 단백질 또는 펩티드로 번역되는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA는 체계적으로 전달된다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 6시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 12시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 18시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 24시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 36시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 48시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 72시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 6시간 이상 경과 시 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 12시간 이상 경과 시 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 18시간 이상 경과 시 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 24시간 이상 경과 시 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 36시간 이상 경과 시 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 48시간 이상 경과 시 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 72시간 이상 경과 시 간에서 검출 가능하다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 제공하며, 여기에서, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 사용하기 위해, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하되, mRNA는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 적합한 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화한다. 관련 양태에서, 본 발명은 대상체에게서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자의 용도에 관한 것으로서, 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 상기 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하며, mRNA는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 적합한 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화한다. 일 구현예에서, mRNA는 대상체에게 없거나 결핍된 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하며, 여기서 질환 또는 장애는 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 결핍증이다. 또 다른 구현예에서, mRNA는 항체 경쇄 또는 항체 중쇄를 암호화하고, 대상체는 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 항체를 대상체에게 투여함으로써 치료 가능한 질환 또는 장애를 앓고 있다. 추가의 구현예에서, mRNA는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화하며, 여기서 상기 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해 상기 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명자들은 또한 DEPE를 헬퍼 지질로서 사용하면, DOPE가 헬퍼 지질 중 하나로서 사용될 때 안정한 리포좀을 형성하지 않는 다중-성분 제형을 제형화할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질의 혼합물을 제공하는 단계로서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 제공된 혼합물로부터 지질 나노입자를 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 방법은 mRNA를 지질 나노입자 내로 캡슐화하는 단계를 추가로 포함하며, 캡슐화는 단계 (b)에서 지질 나노입자를 형성하기 전 또는 후에 이루어질 수 있다. mRNA를 캡슐화하는 생성된 지질 나노입자는 안정적이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 지질 나노입자를 제조하는 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 헬퍼 지질의 사용을 명시적으로 배제한다: 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 및 이들의 조합. 일 구현예에서, DEPE는 10 몰% 내지 50 몰%의 농도로 혼합물에 존재한다. 일 구현예에서, 혼합물 중 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬을 가진 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질의 혼합물은 하나 이상의 스테롤, 예컨대 콜레스테롤계 지질을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤 및/또는 PEG화 콜레스테롤이다. 일 구현예에서, mRNA는 치료 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 미리 형성된 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 지질 나노입자를 제조하는 방법은, mRNA의 캡슐화 전 및/또는 후에 지질 나노입자를 접선 유동 여과(TFF)로 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 지질 나노입자를 트레할로스 용액 중에서 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 특정 이론에 구속되고자 함이 없이, DEPE 유도체, 구체적으로 다양한 길이의 지질 사슬을 갖는 DEPE 유도체 또는 조성물은 DEPE에 대해 본원에 기술된 것과 동일한 이점을 제공하는 것으로 여겨진다. 편의상, 전술한 본 발명의 요약 및 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 DEPE만을 참조한다. 그러나, DEPE의 지질 사슬에 대한 경미한 변이는 DEPE의 우수한 특성에 영향을 미치지 않으며, 이러한 DEPE 유도체는 본 발명에 명시적으로 포함된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이어지는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위에서 자명해진다. 하지만, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위가 본 발명의 구현예를 나타내지만, 이는 제한을 위해서가 아니라 단지 예시를 위해 주어지는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변형 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1은 DEPE 및 다른 헬퍼 지질을 포함하는 mRNA LNP에서 EPO 단백질 발현의 예시적인 그래픽 표현을 도시한다.
도 2는 DEPE 및 다른 헬퍼 지질을 포함하는 mRNA LNP에 대한 혈청 ALT 및 AST의 투여 후 수준의 예시적인 그래픽 표현을 도시한다.
다음의 구현예 및 그의 양태는 예시적이고 도시적이면서 범주를 제한하지 않는 시스템, 조성물, 및 방법과 함께 기술되고 예시된다.
정의
본 발명은 mRNA 치료 조성물을 생산하기 위한 지질 나노입자(LNP) 제형에 캡슐화된 mRNA를 제조하기 위한 개선된 공정을 제공한다.
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
아미노산: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로는, 폴리펩티드 사슬에 포함될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조인 H2N-C(H)(R)-COOH를 가진다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 실시예에서, 아미노산은 합성 아미노산이고, 일부 실시예에서 아미노산은 D-아미노산이며; 일부 실시예에서 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 주로 자연 발생 펩티드에서 발견되는 20종의 표준 l-아미노산 중 어느 하나를 지칭한다. "비표준 아미노산"은 합성으로 제조되었는지 또는 천연 공급원으로부터 수득한 것인지에 상관업이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "합성 아미노산"은 염, 아미노산 유도체(예컨대 아미드), 및/또는 치환물을 포함하는 화학적으로 변형된 아미노산을 망라하지만 이들로 한정되지는 않는다. 펩티드의 카복시-말단 아미노산 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하여, 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기에 의해 변형되고/되거나, 펩티드의 활성에 악영향을 미치지 않으면서 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학적 작용기와의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 이황화(disulfide) 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 예를 들어 하나 이상의 화학적 엔티티(entities)(예컨대, 메틸기, 아세테이트기, 아세틸기, 포스페이트기, 포밀 모이어티(formyl moieties), 이소프레노이드기, 설페이트기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 바이오틴(biotin) 모이어티 등)와 같은 하나 이상의 번역후 변형을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호교환적으로 사용되고, 자유 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 말할 수 있다. 유리 아미노산을 언급하는지 펩티드의 잔기를 언급하는지는 이 용어가 사용되는 문맥으로부터 분명해질 것이다.
동물(animal): 본원에서 사용되는 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비인간 동물을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 비인간 동물은 포유류(예: 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 동물은 유전자 이식 동물, 유전자 조작 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
대략(approximately) 또는 약(about): 본원에서 사용되는 용어 "대략(approximately)" 또는 "약(about)"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 진술되거나 달리 문맥으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 나타낸다.
조합(combining): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조합"은 혼합 또는 배합과 상호 교환적으로 사용된다. 조합은, mRNA-LNP 조성물을 수득하기 위해, 구별되는 특성을 갖는 이산된 LNP 입자들을 동일한 용액에서 서로 합치는 것, 예를 들어 mRNA-LNP와 빈 LNP를 조합하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2개의 LNP를 조합하는 것은 조합되는 성분의 특정 비율로 수행된다. 일부 구현예에서, 조합에 의해 생성된 조성물은 이의 성분 중 어느 하나 또는 둘 다와 구별되는 특성을 갖는다.
전달: 본원에서 사용되는 용어 "전달"은 국소적인 전달과 전신 전달 둘 다를 포함한다. 예를 들어, mRNA의 전달은: mRNA가 표적 조직에 전달되고, 암호화된 단백질 또는 펩티드가 발현되고, 표적 조직 내에 유지되는 상황("국소 분포" 또는 "국소 전달"로도 지칭됨); 및 mRNA가 표적 조직에 전달되고, 암호화된 단백질 또는 펩티드가 발현되고, 환자의 순환계(예컨대, 혈청) 내로 분비되고, 전신에 분포되어 다른 조직에 의해 흡수되는 상황("전신 분포" 또는 "전신 전달"로도 지칭됨)을 포함한다.
효능: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효능" 또는 문법적으로 동등한 표현은, 관련 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA의 전달과 관련하여, 생물학적으로 관련된 평가변수가 개선되는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 생물학적 평가변수는 투여 후 소정의 시점에 염화암모늄 접종에 대항하여 보호하는 것이다.
캡슐화: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캡슐화" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 개별 mRNA 분자를 나노입자 내에 가두는 공정을 지칭한다.
발현: 본원에서 사용되는 바와 같이, mRNA의 "발현"은 mRNA를 펩티드(예: 항원), 폴리펩티드, 또는 단백질(예: 효소)로 번역하는 것을 지칭하며, 문맥으로 나타나는 바와 같이, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 완전 조립된 단백질(예: 효소)의 번역 후 변형을 포함할 수도 있다. 본 출원에서, 용어 "발현" 및 "생산" 및 문법적으로 동등한 표현은 상호교환적으로 사용된다.
개선(improve), 증가(increase) 또는 감소(reduce): 본원에서 사용되는, 용어 "개선", "증가" 또는 "감소", 또는 문법적으로 동등한 표현은 베이스라인 측정치, 예컨대, 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 샘플 또는 대상체(또는 다수의 대조군 샘플 또는 대상체)에서의 측정치에 대한 상대적인 값을 나타낸다. "대조군 샘플"은 시험 항목을 제외하고는, 시험 샘플과 동일한 조건을 거치는 샘플이다. "대조군 대상체"는 치료받는 대상체와 동일한 형태의 질환에 걸린 대상체로서, 치료받는 대상체와 거의 동일한 연령이다.
불순물(impurities): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불순물"은 구속된 양의 액체, 기체 또는 고체 내부에 있는 물질로서, 표적 물질 또는 화합물의 화학적 조성과 상이한 물질을 지칭한다. 불순물은 오염물로도 지칭된다.
시험관내(in vitro): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체외(in vitro)"는 다세포 유기체 내가 아니라 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 말한다.
생체내(In Vivo): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체내(in vivo)"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 말한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들어, 생체외 시스템에 반대되는) 활세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하도록 사용될 수 있다.
단리된(isolated): 본원에서 사용되는 바, 용어 "분리된"은 (1) 최초에 생산되었을 때(자연적이고/이거나 실험 환경이거나) 결합된 적어도 일부의 구성 성분으로부터 분리된 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 엔티티(entity)를 말한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 최초에 결합된 다른 구성 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 보다 높은 순도이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 다른 성분이 없는 경우, 물질은 "순수"하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 엔티티의 순도 백분율의 계산에는 부형제(예컨대, 완충액, 용매, 물 등)가 포함되지 않아야 한다.).
국소 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는 용어 "국소 분포", "국소 전달" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 조직 특이적 전달 또는 분포를 지칭한다. 일반적으로, 국소 분포 또는 전달은 mRNA에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질(예컨대, 효소)이 세포 내에서 번역되고 발현되는 것을 필요로 하거나, 제한적으로 분비되어 환자의 순환계 내로 들어가지 않는 것을 필요로 한다.
전령 RNA(mRNA): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전령 RNA(mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, mRNA는 변형 및 비변형 RNA 둘 다를 망라한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비코딩 영역을 함유할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용해 생산되고 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. mRNA 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5' 에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 슈도우리딘, 및 5-메틸시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예컨대, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예컨대, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-디옥시리보스, 아라비노오스 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트기(예컨대, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포아미다이트 결합)이거나 이들을 포함한다.
핵산: 본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미로 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예컨대, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다.
환자: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 예컨대, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적을 위해 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다.
약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable): 본원에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 철저한 의학적 판단의 범주내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간과 동물의 조직과의 접촉에 있어 사용에 적합하고, 합리적인 유익성/위험성 비(benefit/risk ratio)에 상응하는 물질을 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한 염: 약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용 가능한 염에 대해 문헌[J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19]에서 상세하게 기술하고 있다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산과 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 비독성 산 첨가염의 예는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산, 또는 말론산과 같은 유기산으로 형성된 아미노기의 염 또는 이온교환과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용 가능한 염은 아디핀산염(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코르브산염(ascorbate), 아스파르트산염(aspartate), 벤젠설폰산염(benzenesulfonate), 벤조산염(benzoate), 중황산염(bisulfate), 붕산염(borate), 낙산염(butyrate), 캄퍼산염(camphorate), 캄퍼설폰산염(camphorsulfonate), 구연산염(citrate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 다이글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄설폰산염(ethanesulfonate), 포름산염(formate), 푸마르산염(fumarate), 글루코헵토네이트(glucoheptonate), 글리세로인산염(glycerophosphate), 글루코네이트(gluconate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 요오드화수소산염(hydroiodide), 2-하이드록시-에탄설폰산염(2-hydroxy-ethanesulfonate), 락토바이온산염(lactobionate), 젖산염(lactate), 라우린산염(laurate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 말론산염(malonate), 메탄설폰산염(methanesulfonate), 2-나프탈렌설폰산염(2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 질산염(nitrate), 올레산염(oleate), 옥살산염(oxalate), 팔미트산염(palmitate), 파모산염(pamoate), 펙티닌산염(pectinate), 과황산염(persulfate), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionate), 인산염(phosphate), 피크르산염(picrate), 피발산염(pivalate), 프로피온산염(propionate), 스테아르산염(stearate), 숙신산염(succinate), 황산염(sulfate), 주석산염(tartrate), 티오시안산염(thiocyanate), p-톨루엔설폰산염(p-toluenesulfonate), 운데카노에이트(undecanoate), 발레르산염(valerate salts) 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 할로겐화물, 수산화물, 카복시산염(carboxylate), 황산염, 인산염, 질산염, 설폰산염 및 아릴 설폰산염과 같은 반대 이온(counterion)을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 예컨대 알킬 할로겐화물과 같은 적절한 친전자물질을 사용하여 4급 알킬 아미노염(quarternized alkylated amino salt)을 형성하는 아민의 4급화로 형성된 염을 포함한다.
효험(potency): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효험" 또는 문법적으로 동등한 표현은 mRNA에 의해 암호화되는 단백질(들) 또는 펩티드(들)의 발현 수준 및/또는 이에 기인하는 생물학적 효과를 지칭한다.
염: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "염"은 산과 염기 사이의 중화 반응에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 이온 화합물을 지칭한다.
전신 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는, 용어 "전신 분포" 또는 "전신 전달" 또는 문법적으로 동등한 표현은 전신 또는 전체 유기체에 영향을 주는 전달 또는 분포 메커니즘 또는 접근법을 지칭한다. 일반적으로 전신 분포 또는 전달은 예컨대 혈류와 같은 신체의 순환계를 통해 달성된다. "국소 분포 또는 전달"의 정의와 비교됨.
대상체(subject): 본원에서 사용되는, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 가는 인간을 지칭하는 것으로, 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개인" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 취약하지만 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.
실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로(substantially)"는 관심있는 특징이나 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인(qualititave) 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 당업자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/지거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 현상 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적인 결여를 표현하기 위해 본원에서 사용된다.
표적 조직(Target tissues): 본원에서 사용되는, 용어 "표적 조직"은 치료 대상 질환이 발생된 임의의 조직을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적 조직은 질환 관련 병상, 증상, 또는 특징을 나타내는 조직들을 포함한다.
치료 지수: 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료 지수"는 약물이 독성으로 변하는 혈중 약물 농도와 약물이 효과적인 농도의 비율이다. 치료 지수가 클수록 약물은 더 안전하다.
치료: 본원에서 사용되는, 용어 "치료(treat, treatment, 또는 treating)"는 부분적으로 또는 완전하게 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제하고, 예방하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 발생 빈도를 감소시키는 임의의 방법을 지칭한다. 질환의 징후를 보이지 않고/않거나 질환의 초기 징후만을 보이는 대상체에 질환과 관련된 병상이 생길 위험을 감소시킬 목적으로 치료가 시행될 수 있다.
수율: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수율(yield)"은 출발 물질로서의 총 mRNA과 비교해 캡슐화 후 회수된 mRNA의 백분율을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "회수(recovery)"는 용어 "수율"과 상호 교환적으로 사용된다.
지방족(Aliphatic): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지방족(aliphatic)"은 C1-C40 탄화수소를 지칭하며, 포화 탄수화물 및 불포화 탄수화물 모두를 포함한다. 지방족은 선형, 분지형, 또는 환형일 수 있다. 예를 들어, C1-C20 지방족은 C1-C20 알킬(예: 선형 또는 분지형 C1-C20 포화 알킬), C2-C20 알케닐(예: 선형 또는 분지형 C4-C20 디에닐, 선형 또는 분지형 C6-C20 트리에닐, 등), 및 C2-C20 알키닐(예: 선형 또는 분지형 C2-C20 알키닐)을 포함할 수 있다. C1-C20 지방족은 C3-C20 환형 지방족(예: C3-C20 시클로알킬, C4-C20 시클로알케닐, 또는 C8-C20 시클로알키닐)을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 지방족은 하나 이상이 환형 지방족 및/또는 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대 산소, 질소, 또는 황을 포함할 수 있고, 임의로 하나 이상의 치환기, 예컨대 알킬, 할로, 알콕실, 하이드록시, 아미노, 아릴, 에테르, 에스테르, 또는 아미드로 치환될 수 있다. 지방족기는 치환되지 않거나 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 치환기로 치환된다. 예를 들어, 지방족은 할로겐, -COR', -CO2H, -CO2R', -CN, -OH, -OR', -OCOR', -OCO2R', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR' 또는 -SO2R' 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 독립적으로 선택된 치환기)으로 치환될 수 있으며, 식 중 R'의 각 인스턴스는 독립적으로 C1-C20 지방족(예: C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 알킬(예: 치환되지 않은 C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 C1-C3 알킬이다. 구현예에서 지방족은 치환되지 않는다. 구현예에서, 지방족은 임의의 헤테로 원자를 포함하지 않는다.
알킬(alkyl):본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬(alkyl)"은 비환형 선형 및 분지형 탄화수소 기를 의미하며, 예를 들어, "C1-C20 알킬"은 1 내지 20개의 탄소를 갖는 알킬기를 지칭한다. 알킬기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 세크-부틸, 터트-부틸, 펜틸, 이소펜틸 터트-펜틸헥실, 이소헥실 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 다른 알킬기는 본 개시의 이점을 고려할 때 당업자에게 쉽게 자명해질 것이다. 알킬기는 치환되지 않거나 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알킬기는 할로겐, -COR', -CO2H, -CO2R', -CN, -OH, -OR', -OCOR', -OCO2R', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR', 또는 -SO2R' 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 독립적으로 선택된 치환기)으로 치환될 수 있으며, 식 중 R'의 각 인스턴스는 독립적으로 C1-C20 지방족(예: C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 알킬(예: 치환되지 않은 C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 C1-C3 알킬이다. 구현예에서, 알킬은 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 치환기로) 치환된다. 구현예에서, 알킬기는 a-OH 기로 치환되고, 본원에서는 "하이드록시알킬" 기로서 지칭될 수도 있으며, 여기서 접두사는 -OH 기를 나타내고, "알킬"은 본원에 기술된 것과 같다.
알케닐(alkenyl): 본원에서 사용되는 바와 같이, "알케닐(alkenyl)"은 사슬을 따라 임의의 안정한 점에서 발생할 수 있는 하나 이상의 불포화 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 임의의 선형 또는 분지형 탄소수소 사슬을 의미하는데, 예를 들어, "C2-C20 알케닐"은 2 내지 20개의 탄소를 갖는 알케닐기를 지칭한다. 예를 들어, 알케닐기는 프로프-2-에닐, 부트-2-에닐, 부트-3-에닐, 2-메틸프로프-2-에닐, 헥스-2-에닐, 헥스-5-에닐, 2,3-디메틸부트-2-에닐 등을 포함한다. 구현예에서, 알케닐은 1, 2, 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함한다. 구현예에서, 알케닐은 단일 탄소-탄소 이중 결합을 포함한다. 구현예에서, 다수의 이중 결합(예: 2개 또는 3개)이 접합된다. 알케닐기는 치환되지 않거나 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알케닐기는 할로겐, -COR', -CO2H, -CO2R', -CN, -OH, -OR', -OCOR', -OCO2R', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR' 또는 -SO2R' 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 독립적으로 선택된 치환기)으로 치환될 수 있으며, 식 중 R'의 각 인스턴스는 독립적으로 C1-C20 지방족(예: C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 알킬(예: 치환되지 않은 C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 C1-C3 알킬이다. 구현예에서 알케닐은 치환되지 않는다. 구현예에서, 알케닐은 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 치환기로) 치환된다. 구현예에서, 알케닐기는 a-OH 기로 치환되고, 본원에서는 "하이드록시알케닐" 기로서 지칭될 수도 있으며, 여기서 접두사는 --OH 기를 나타내고, "알케닐"은 본원에 기술된 것과 같다.
알키닐(alkynyl): 본원에서 사용되는 바와 같이, "알키닐(alkynyl)"은 사슬을 따라 임의의 안정한 점에서 발생하는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 임의의 선형 또는 분지형 구성의 탄소수소 사슬을 의미하는데, 예를 들어, "C2-C20 알키닐"은 2 내지 20개의 탄소를 갖는 알키닐기를 지칭한다. 알키닐기의 예는 프로프-2-이닐, 부트-2-이닐, 부트-3-이닐, 펜트-2-이닐, 3-메틸펜트-4-이닐, 헥스-2-이닐, 헥스-5-이닐 등을 포함한다. 구현예에서, 알키닐은 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함한다. 알키닐기는 치환되지 않거나 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알키닐기는 할로겐, -COR', -CO2H, -CO2R', -CN, -OH, -OR', -OCOR', -OCO2R', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR', 또는 -SO2R' 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 독립적으로 선택된 치환기)으로 치환될 수 있으며, 식 중 R'의 각 인스턴스는 독립적으로 C1-C20 지방족(예: C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 알킬(예: 치환되지 않은 C1-C20 알킬, C1-C15 알킬, C1-C10 알킬, 또는 C1-C3 알킬)이다. 구현예에서, R'은 독립적으로 치환되지 않은 C1-C3 알킬이다. 구현예에서, 알키닐은 치환되지 않는다. 구현예에서, 알키닐은 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 치환기로) 치환된다.
아릴(aryl): 단독으로 또는 "아랄킬(aralkyl)"에서와 같이 더 큰 모이어티의 일부로서 사용되는 용어 "아릴(aryl)"은 총 6개 내지 14개의 고리 구성원을 갖는 단환, 이환, 또는 삼환 카보시클릭 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 상기 고리 시스템은 분자의 나머지에 대한 단일 부착점을 갖고, 시스템의 적어도 하나의 고리는 방향족이며, 시스템의 각 고리는 4개 내지 7개의 고리 구성원을 함유한다. 구현예에서, 아릴기는 6개의 고리 탄소 원자("C6 아릴"; 예를 들어, 페닐)를 갖는다. 일부 구현예에서, 아릴기는 10개의 고리 탄소 원자("C10 아릴"; 예를 들어, 1-나프틸 및 2-나프틸과 같은 나프틸)를 갖는다. 일부 구현예에서, 아릴기는 14개의 고리 탄소 원자("C14 아릴"; 예를 들어, 안트라실)를 갖는다. "아릴"도 고리 시스템을 포함하는데, 위에 정의된 것과 같이 아릴 고리는 하나 이상의 카보시클릴 또는 헤테로시클릴 기와 축합되고, 라디칼 또는 부착점은 아릴 고리 상에 있고, 이런 경우에, 탄소 원자의 수는 아릴 고리 시스템 내의 탄소 원자의 수를 계속해서 지정한다. 예시적인 아릴은 페닐, 나프틸, 및 안트라센을 포함한다.
아릴렌(arylene): 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아릴렌(arylene)"은 2가인 (즉, 분자에 대한 2개의 부착점을 갖는) 아릴기를 지칭한다. 예시적인 아릴렌은 페닐렌을 (예를 들어, 치환되지 않은 페닐렌 또는 치환된 페닐렌을) 포함한다.
본 발명의 조성물
일부 구현예에서, 본 발명은 LNP 및 mRNA를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 대상체에게 투여될 때, 대상체의 내성 또는 스트레스 수준을 변경시키지 않고, 생체 내에서 상당히 더 높은 수준의 mRNA 발현을 유도한다. 내성 또는 스트레스는 간 효소 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) 및/또는 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 상승에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 특정 제형은 제조의 장점, 예를 들어, 무엇보다도 일반적인 미리 형성된 LNP 모액 을 사용하는 것과 같은 제조 방법의 용이성을 제공한다.
본 발명의 관찰은, 단계 (a)에서 mRNA를 미리 형성된 빈 LNP와 혼합함으로써 형성된 mRNA-LNP를 단계 (b)에서 미리 형성된 LNP와 추가로 조합하여 mRNA-LNP 조성물을 형성할 때, 생성된 조성물의 효능이 단계 (a)의 mRNA-LNP와 비교하여 크게 증가한다는 것을 보여주었다. 이는, 미리 형성된 LNP가 비어 있고 (즉, mRNA를 포함하지 않고) mRNA-LNP와 동일한 지질 성분을 포함하는 경우에도 증가된 효능이 관찰되기 때문에 특히 주목할 만한 가치가 있다. 또한, 미리 형성된 LNP가 폴리뉴클레오티드 형질감염의 불량한 촉진자로 알려진 중성 지질만을 포함하는 경우에도, mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현 증가가 관찰된다.
따라서, 생체 내에서 내약성을 손상시키지 않고 mRNA-LNP 조성물의 증가된 효능이 달성 가능하다는 사실은 치료 설계 측면에서 본 발명의 방법의 현저한 이점이다.
본 발명의 이러한 양태는 적어도 2개의 상당한 이점을 허용한다: (i) 동일한 생물학적 효과를 달성하기 위해, 투여량 당 mRNA 치료 조성물 중 mRNA의 양을 낮추거나 투여 빈도를 낮추는 것을 가능하게 하여 조성물의 치료 지수를 증가시키는 것; (ii) 하나 이상의 미리 형성된 LNP를 벌크로 제조하여 본 발명에 기술된 것과 같은 원하는 제형을 달성하기 위한 다수의 혼합 및 조합 단계에 이용할 수 있게 하는 쉽고, 유연하고, 확장 가능한 및/또는 고 처리량 제조 방법의 개발을 가능하게 하는 것.
본 발명은, mRNA를 미리 형성된 빈 LNP와 혼합하여 제조한 mRNA-LNP를 미리 형성된 LNP와 추가로 조합하는 방법을 제공하며, 여기서 본 발명의 생성된 mRNA-LNP 조성물은 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 생체 내 발현을 증가시킨다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 다음 단계를 포함하는 제조 방법이다: (a) mRNA-LNP의 형성을 허용하는 조건 하에, 미리 형성된 빈 LNP를 mRNA와 혼합하는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 mRNA-LNP를 미리 형성된 LNP와 조합하여, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 적어도 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질의 유무와 상관없이 중성 지질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA는 단백질 또는 펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서 미리 형성된 LNP는 빈 LNP이다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서 미리 형성된 LNP는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서 미리 형성된 LNP는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서 미리 형성된 LNP는 단계 (a)에서 형성된 mRNA-LNP에 있는 것과 동일한 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 동일한 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서 미리 형성된 LNP는 단계 (a)에서 형성된 mRNA-LNP에 있는 것과는 상이한 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 mRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 빈 LNP 및 단계 (b)에서의 미리 형성된 LNP는 구별되는 이종 지질 나노입자이다. 예를 들어, 단계 (a)에서의 빈 LNP는 양이온성 지질 HGT-5003을 포함할 수 있고, 단계 (b)에서의 미리 형성된 LNP는 양이온성 지질 ICE를 포함한다. 또 다른 예에서, 단계 (a)에서의 빈 LNP는 양이온성 지질 ICE를 포함할 수 있고, 단계 (b)에서의 미리 형성된 LNP는 양이온성 지질 DOTAP를 포함한다. 또 다른 예에서, 단계 (a)에서의 빈 LNP는 양이온성 지질 HGT-4001을 포함할 수 있고, 단계 (b)에서의 미리 형성된 LNP는 양이온성 지질 ckk-E12를 포함한다. LNP에 적합한 다양한 지질 및 이를 생성하기 위한 방법은 아래의 각 섹션에 기술되어 있으며, LNP를 형성하기 위한 지질의 임의의 조합이 본원에서 고려된다.
일 구현예에서, 단계 (b)에서 생성된 mRNA-LNP 조성물은 제1 지질 나노입자 및 제2 지질 나노입자를 포함할 수 있고; 여기서 제1 지질 나노입자 및 제2 지질 나노입자는 동일한 지질 조성을 가지며, 여기서 적어도 일부의 제1 지질 나노입자는 mRNA를 포함한다. 일 구현예에서, 단계 (b)에서 생성된 mRNA-LNP 조성물은 제1 지질 나노입자 및 제2 지질 나노입자를 포함할 수 있고; 여기서 제1 지질 나노입자 및 제2 지질 나노입자는 구별되는 지질 조성을 갖는다. 예를 들어, mRNA-LNP 조성물은, 양이온성 지질 ICE를 포함하는 제1 지질 나노입자 및 양이온성 지질 DOTAP를 포함하는 제2 지질 나노입자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서 생성된 mRNA-LNP 조성물은, 양이온성 지질 C12-200을 포함하는 제1 지질 나노입자 및 양이온성 지질 DLinKC2DMA를 포함하는 제2 지질 나노입자를 포함할 수 있다. 따라서, 하기 각 섹션에 기술된 바와 같이 LNP를 생성하기에 적합한 다양한 지질의 임의의 조합이 본원에서 고려된다.
일부 구현예에서, 단계 (a)의 빈 LNP 또는 단계 (b)의 미리 형성된 LNP는 양이온성 지질을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 빈 LNP 또는 미리 형성된 LNP는 중성 지질 및/또는 PEG-변형 지질을 포함한다.
지질 나노입자 (LNP)
본 발명은, 무엇보다도, 효율적인 세포 흡수 및 생체 내 가공을 위해 전달 비히클에 mRNA가 캡슐화되는, mRNA 치료제를 위한 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전달 비히클", "수송 비히클", "나노입자" 또는 문법적으로 동등한 용어는 상호 교환적으로 사용된다. 전달 비히클은 하나 이상의 추가적인 핵산, 담체, 표적 리간드, 또는 안정화 시약과 조합하여 제형화되거나, 적합한 부형제와 혼합된 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa.,] 최신판에서 확인할 수 있다. 특정 전달 비히클은 핵산을 표적 세포에 형질감염시키는 것을 용이하게 하는 능력에 기초하여 선택된다.
일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 리포솜 전달 비히클, 예를 들어, 지질 나노입자(LNP) 또는 리포솜이다. 일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 4개 이하의 구별되는 지질 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 3개 이하의 구별되는 지질 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 구별되는 지질 성분은 스테롤계 양이온성 지질이다. 전형적인 구현예에서, 본 발명의 LNP는 mRNA를 캡슐화하는 리포좀이다. 적절한 리포좀의 지질 성분은 양이온성 지질(예: cKK-E12, 화합물 1, 화합물 2 또는 화합물 3), 비-양이온성 지질(DEPE), 콜레스테롤계 지질(예: 콜레스테롤), 및 PEG-변형 지질(DMG-PEG2K)을 포함한다. 대안적으로, 적절한 리포좀의 지질 성분은 스테롤계 양이온성 지질(예: ICE), 비-양이온성 지질(DEPE), 및 PEG-변형 지질(예: DMG-PEG2K)을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자 내 DEPE는, 특히 DOPE를 함유한 것 외에는 DEPE 함유 지질 나노입자와 (지질 성분 및 개별 지질 성분의 몰비의 측면에서) 조성이 동일한 지질 나노입자와 비교했을 때, 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA의 발현을 강화할 수 있다. 일부 구현예에서, DEPE-함유 지질 나노입자에 의해 전달된, 단백질을 암호화하는 mRNA의 발현은 DOPE-함유 지질 나노입자에 비해 적어도 2배 강화된다. mRNA의 발현 강화는, DEPE-함유 지질 나노입자, 및 상이한 헬퍼 지질(예: DOPE)을 포함하는 동일하게 제형화된 지질 나노입자를 (예를 들어 꼬리 정맥 주사에 의해) 시험 동물(예: 마우스)에게 투여하고, 하나 이상의 시점에 (예를 들어, 투여 후 4, 6, 8, 12, 18, 또는 24시간차에) mRNA의 발현을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA는 생체 내에서 치료 단백질로 번역되는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 단백질을 암호화하는 mRNA는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 치료 폴리펩티드는 항체 경쇄 또는 항체 중쇄이다. 일부 구현예에서, 치료 폴리펩티드는 mRNA가 투여되는 대상체에서 없거나 결핍된다. 일부 구현예에서, 단백질을 암호화하는 mRNA는 펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 항원이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 DEPE-함유 지질 나노입자는 대상체에게 투여될 때 안전하고 내약성이 있다. 예를 들어, 본 발명의 DEPE-함유 지질 나노입자는 대상체에게 투여될 때 임의의 뚜렷한 간 독성을 야기하지 않는다. 간 독성을 평가하기에 적합한 마커는 ALT 및 AST이다.
양이온성 지질
본원에서 사용되는 바와 같이, "양이온성 지질"이란 문구는 생리적인 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 띄는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2010/144740호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00007
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2013/149140호에 기재된 이온화(ionizable) 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화학식 중 하나의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00008
식 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 임의로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C1-C20 알킬, 및 임의로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 아실로 이루어진 군에서 선택되고, L1 및 L2는 각각 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-C30 알킬, 임의로 치환된 가변 불포화 C1-C30 알케닐, 및 임의로 치환된 C1-C30 알키닐로 이루어진 군에서 선택되며, m 및 o는 각각 독립적으로 0 및 임의의 양의 정수(예컨대, m은 3)로 이루어진 군에서 선택되고, n은 0이거나 임의의 양의 정수(예컨대, n은 1)이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-l-일) 테트라코사-15,18-디엔-1-아민("HGT5000") 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
Figure pct00009
(HGT-5000).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-4,15,18-트리엔-l-아민("HGT5001") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00010
(HGT-5001).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민("HGT5002") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00011
(HGT-5002).
　
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2010/053572호에 아미노 알코올 리피도이드로 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00012
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 지질은 상업적으로 이용 가능한 아민을 친유성아크릴레이트, 아크릴아미드, 또는 에폭시드와 반응시킴으로써 합성된다. 일부 구현예에서, 지질은 아민 86 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)에틸렌 디아민) 및 아민 87 (N-(3-아미노프로필)디에탄아민)으로부터 유래된다. 지질은 잠재적인 새로운 부류의 핵산 전달 시약으로서 다음 몇 가지 이점을 갖는다: (i) 리피도이드를 합성하는 데 사용되는 화학물질은 단순하고 경제적이며, (ii) 구조적 다양성의 라이브러리가 이미 개발되었고, (iii) 전달 시스템의 구조와 기능 사이의 상관 관계는 리피도이드 라이브러리를 스크리닝하여 축적된 대량의 데이터 집합으로부터 작제될 수 있음. 이러한 반응들은 간단하므로, 아민의 유형, 및 테일(또는 탄소-아암 사슬)의 길이 및 유형(아크릴아미드/아크릴레이트/에폭시드)을 변화시킴으로써 구조적으로 다양한 리피도이드 라이브러리를 구축할 수 있었다.
일부 구현예에서, 리피도이드는 약 2~20개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 5~18개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 10~16개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 10~14개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 10~12개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 10개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 12개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 14개의 탄소-아암 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리피도이드는 약 16개의 탄소-아암 사슬을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118725호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00013
.
　
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118724호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00014
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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 이온은 14,25-디트리데실 15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄의 화학식을 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2013/063468호 및 WO 2016/205691호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00015
식 중, RL의 각 인스턴스는 독립적으로 임의 치환된 C6-C40 알케닐이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00016
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00017
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00018
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00019
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/184256호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00020
식 중, 각각의 X는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 Y는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 m은 독립적으로 0 내지 20이고, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 6이고, 각각의 RA는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴(carbocyclyl), 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴(heterocyclyl), 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이고, 각각의 RB는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴, 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴, 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "표적 23" 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
Figure pct00021
(표적 23).
　
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/004202호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00022
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00023
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00024
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본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 통합되는, 미국 특허 가출원 제62/758,179호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00025
식 중 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 지방족이고; 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 값을 갖는 정수이고; 각각의 A는 독립적으로 공유 결합 또는 아릴렌이고; 각각의 L1은 독립적으로 에스테르 기, 티오에스테르 기, 이황화 기 또는 무수물 기이고; 각각의 L2는 독립적으로 C2-C10 지방족이고; 각각의 X1은 독립적으로 H 또는 OH이며; 각각의 R3은 독립적으로 C6-C20이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00026
(화합물 1).
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00027
(화합물 2).
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00028
(화합물 3).
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 통합된 J. McClellan, M. C. King의 문헌[Cell 2010, 141, 210-217] 및 Whitehead 등의 문헌[Nature Communications (2014) 5:4277]에 기술된 것과 같은 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 양이온성 지질은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00029
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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/199952호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00030
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00031
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00032
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00033
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00034
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00035
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00036
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00037
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00038
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00039
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00040
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00041
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00042
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본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/004143호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00043
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00044
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00045
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00046
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00047
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00048
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00049
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00050
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일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00051
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00052
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00053
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00054
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00055
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00056
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00057
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00058
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00059
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/075531호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00060
식 중, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa-, 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2 중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O) x, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, ,NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이거나 직접 결합이고, G1 및 G2는 각각 독립적으로 치환되지 않은 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고, G3는 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 시클로알킬렌, C3-C8 시클로알케닐렌이고, Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고, R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5 C(=O)R4이고, R4는 C1-C12 알킬이고, R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고, x는 0, 1 또는 2이다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/117528호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00061
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00062
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00063
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/049245호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 양이온성 지질은 다음의 식 중 하나의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00064
Figure pct00065
및
Figure pct00066
이들 네 개의 화학식 중 어느 하나에 있어서, R4는 -(CH2)nQ 및 -(CH2) nCHQR에서 독립적으로 선택되고, Q는 -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R) 및 헤테로고리로 이루어진 군에서 선택되며, n은 1, 2, 또는 3이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00067
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00068
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00069
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00070
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/173054호 및 WO 2015/095340호에 기술된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00071
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00072
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00073
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00074
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본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2012/170889호에 기재된 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00075
식 중, R1은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 임의로 치환된 알킬 아미노(예컨대, 디메틸아미노와 같은 알킬 아미노) 및 피리딜로 이루어진 군에서 선택되고, R2는 다음의 두 화학식 중 하나로 이루어진 군에서 선택되고,
Figure pct00076
및
Figure pct00077
식 중 R3 및 R4는 각각 독립적으로 임의 치환된, 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 알킬, 및 임의 치환된, 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 아실이고, n은 0 또는 임의의 양의 정수(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상)이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4001" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00078
(HGT4001).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4002" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00079
(HGT4002).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4003" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00080
(HGT4003).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4004" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00081
(HGT4004).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4005" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00082
(HGT4005).
　
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 2018년 5월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/672,194호에 기재된 것과 같은 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 미국 특허 가출원 제62/672,194호에 기술된 일반 식 중 어느 하나 또는 구조 (1a)-(21a) 및 (1b)-(21b) 및 (22)-(237) 중 어느 하나에 해당하는 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 식 (I')에 따른 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00083
식 중
RX는 독립적으로 -H, -L1-R1, 또는 -L5A-L5B-B'이고;
L1, L2, 및 L3 각각은 독립적으로 공유 결합, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)S-, 또는 -C(O)NRL-이고;
각각의 L4A 및 L5A는 독립적으로 -C(O)-, -C(O)O-, 또는 -C(O)NRL-이고;
각각의 L4B 및 L5B는 독립적으로 C1-C20 알킬렌, C2-C20 알케닐렌, 또는 C2-C20 알키닐렌이고;
각각의 B 및 B'은 NR4R5 또는 5-원 내지 10-원 질소 함유 헤테로아릴이고;
각각의 R1, R2, 및 R3은 독립적으로 C6-C30 알킬, C6-C30 알케닐, 또는 C6-C30 알키닐이고;
각각의 R4, 및 R5는 독립적으로 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, 또는 C2-C10 알키닐이며;
각각의 RL은 독립적으로 수소, C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 또는 C2-C20 알키닐이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질, 즉 62/672,194의 화합물 (139)를 포함한다:
Figure pct00084
("18:1 탄소 꼬리-리보스 지질").
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 N-[l-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드("DOTMA")를 포함한다. (본원에 참조로서 통합된 Feigner 등의 문헌[Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987)]; 미국 특허 제4,897,355호 참조). 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 기타 양이온성 지질은 예를 들어, 5-카복시스페르밀글리신디옥타데실아미드("DOGS"); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복스아미도에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄("DOSPA")(Behr 등의 문헌[Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989)]; 미국 특허 제5,171,678호; 미국 특허 제5,334,761호); l,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판("DODAP"); l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판("DOTAP")을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 양이온성 지질의 추가 예시는 다음을 또한 포함한다: 1,2-다이스테아릴옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DSDMA"); 1,2-다이올레일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DODMA"); 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DLinDMA"); l,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판("DLenDMA"); N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드("DODAC"); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드("DDAB"); N-(l,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드("DMRIE"); 3-다이메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-l-(시스,시스-9,12-옥타데카다이엔옥시)프로판("CLinDMA"); 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-다이메틸 l-l-(시스,시스-9', l-2'-옥타데칸다이엔옥시)프로판("CpLinDMA"); N,N-다이메틸-3,4-다이올레일옥시벤질아민("DMOBA"); 1 ,2-N,N'-다이올레일카바밀-3-다이메틸아미노프로판("DOcarbDAP"); 2,3-다이리놀레오일옥시-N,N-다이메틸프로필아민("DLinDAP"); l,2-N,N'-다이리놀레일카바밀-3-다이메틸아미노프로판("DLincarbDAP"); l,2-다이리놀레오일카바밀-3-다이메틸아미노프로판("DLinCDAP"); 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[l,3]-다이옥솔란("DLin-K-DMA"); 2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N,N-다이메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-1-아민("옥틸-CLinDMA"); (2R)-2-((8-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, N-다이메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-1-아민("옥틸-CLinDMA (2R)"); (2S)-2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, fsl-dimethyh3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-다이엔-1-일옥시]프로판-1-아민("Octyl-CLinDMA (2S)"); 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노에틸-[l,3]-다이옥솔란("DLin-K-XTC2-DMA"); 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-다이엔-1-일)-l ,3-다이옥솔란-4-일)-N,N-다이메틸에탄아민("DLin-KC2-DMA")(본원에 참조로서 포함되는 WO 2010/042877; Semple 등의 문헌[Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)] 참조). (Heyes, J. 등의 문헌[J Controlled Release 107: 276-287 (2005)]; Morrissey, DV. 등의 문헌[Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005)]; 국제 특허 공개 WO 2005/121348). 일부 구현예에서, 양이온성 지질 중 하나 이상은 이미다졸, 디알킬아미노, 또는 구아니디늄 모이어티 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 하나 이상의 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란("XTC"); (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에틸)테트라하이드로-3aH-시클로펜타[d] [1 ,3]디옥솔-5-아민("ALNY-100") 및/또는 4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드("NC98-5")를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 적어도 약 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 또는 70 중량%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조성물(예: 지질 나노입자) 중 총 지질 함량의 적어도 약 5 mol%, 10 mol%, 20 mol%, 30 mol%, 35 mol%, 40 mol%, 45 mol%, 50 mol%, 55 mol%, 60 mol%, 65 mol%, 또는 70 mol%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 약 30~70 중량%(예컨대, 약 30~65 중량%, 약 30~60 중량%, 약 30~55 중량%, 약 30~50 중량%, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, 또는 약 35~40 중량%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 약 30~70 몰%(예컨대, 약 30~65 몰%, 약 30~60 몰%, 약 30~55 몰%, 약 30~50 몰%, 약 30~45 몰%, 약 30~40 몰%, 약 35~50 몰%, 약 35~45 몰%, 또는 약 35~40 몰%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 스테롤계 양이온성 지질이 본원에 기술된 양이온성 지질 대신 또는 그에 더하여 사용될 수 있다. 적합한 스테롤계 양이온성 지질은 디알킬아미노-, 이미다졸-, 및 구아니디늄-함유 스테롤계 양이온성 지질이다. 예를 들어, 소정의 구현예는 아래의 구조식 (I)로 표시된 바와 같이, 이미다졸, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 즉 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함하는 하나 이상의 스테롤계 양이온성 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 소정의 구현예에서, 다음 구조식으로 표시된 바와 같이, 기능성 단백질을 암호화하는 RNA(예컨대, mRNA)를 전달하기 위한 지질 나노입자는 하나 이상의 이미다졸계 양이온성 지질, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 즉 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함할 수 있다:
Figure pct00085
(ICE).
일부 구현예에서, 리포솜 내 양이온성 지질의 백분율은 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 또는 70% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들)은 리포솜의 약 30~50 중량%(예컨대, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, 또는 약 35~40 중량%)를 구성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(예컨대, ICE 지질)은 몰비로 리포솜의 약 30%, 약 35%, 약 40 %, 약 45%, 또는 약 50%를 구성한다.
비-양이온성 지질(Non-Cationic Lipids)
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비양이온성 지질"은 임의의 중성, 쌍성이온성(zwitterionic), 또는 음이온성 지질을 지칭하며, 이는 본원에서 "헬퍼 지질"로서도 지칭된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "음이온성 지질"이란 용어는 선택된 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순 음전하를 보유하는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다.
본 발명은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하는 하나 이상의 비-양이온성 헬퍼 지질을 포함하는 mRNA-LNP에 관한 것이다. 일부 구현예에서, DEPE는 mRNA-LNP 중 유일한 비-양이온성 헬퍼 지질이다. 다른 구현예에서, mRNA-LNP의 헬퍼 지질 부분은 DEPE 및 콜레스테롤을 포함한다.
임의의 특정 이론에 구속되고자 함이 없이, 지질 사슬 길이 또는 조성이 DEPE와 상이한 소정의 DEPE 유도체도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 본 발명자들은 길이가 10~20개의 탄소인 알킬 또는 알켄 사슬이 mRNA-LNP의 형성에 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 일부 구현예에서, 길이가 16~20개의 탄소인 알킬 또는 알켄 사슬을 갖는 DEPE 유도체가 특히 바람직하다. 대안적으로, 길이가 10~14개의 탄소, 예를 들어 길이가 10, 12, 또는 14개의 탄소인 알킬 또는 알켄 사슬을 갖는 DEPE 유도체가 본 발명의 실시에 특히 적합할 수 있다.
mRNA-LNP에 포함될 수 있는 다른 비양이온성 지질 또는 헬퍼 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 포스파티딜세린, 스핑고지질, 세레브로시드, 강글리오시드, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, l-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 이와 같은 비-양이온성 지질은 단독으로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 기타 지질 예를 들어, 양이온성 지질과 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 또는 약 10% 내지 약 70%의 몰비를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 중성 지질, 즉 본 조성물이 제형화되고/되거나 투여되는 조건하에서 순전하(net charge)를 띠지 않는 지질이다. 일부 구현예에서, 리포솜 내 비-양이온성 지질의 백분율은 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과 또는 40% 초과일 수 있다.
콜레스테롤계 지질(Cholesterol-based Lipids)
일부 구현예에서, 조성물(예: 리포좀 조성물)은 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명을 실시하는 데 적합한 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다. 다른 적합한 콜레스테롤계 지질은 예를 들어, DC-Chol (N,N-디메틸-N-에틸카복스아미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(Gao 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991)]; Wolf 등의 문헌[BioTechniques 23, 139 (1997)]; 미국 특허 제5,744,335호), 또는 이미다졸 콜레스테롤 에스테르(ICE)를 포함한다.
일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 리포좀에 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 몰비(mol%)로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 또는 약 40% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 mol% 이하, 약 10 mol% 이하, 약 20 mol% 이하, 약 30 mol% 이하, 또는 약 40 mol% 이하일 수 있다.
일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 중량부(wt%)로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 wt% 초과, 약 10 wt% 초과, 약 20 wt% 초과, 약 30 wt% 초과, 또는 약 40 wt% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 wt% 이하, 약 10 wt% 이하, 약 20 wt% 이하, 약 30 wt% 이하, 또는 약 40 wt% 이하일 수 있다.
PEG화 지질
일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 하나 이상의 PGE화 지질을 포함하며, 이는 본원에서 PEG-변형 지질로서도 지칭된다. 본 발명을 실시하는 데 적합한 PEG-변형 지질 또는 PEG화 지질은 1,2-디미리스톨-라세-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2K)이다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 인지질 및 N-옥타노일-스핑고신-l-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라미드)을 포함하여 유도된 세라미드(PEG-CER)와 같은 유도된 지질의 사용이 또한 본 발명에서 고려된다. 고려된 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유 결합된 최대 2 kDa, 최대 3 kDa, 최대 4 kDa, 또는 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질 또는 PEG화 지질은 PEG화 콜레스테롤 또는 PEG-2K이다. 일부 구현예에서, 특히 유용한 교환 가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예컨대, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다. 이와 같은 성분을 첨가함으로써 복합체 응집을 예방할 수 있고, 또한 순환 수명을 늘리고 표적 조직에 대한 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있거나(Klibanov 등의 (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237 참조), 이들 성분은 생체 내에서 제형으로부터 신속하게 교환되도록 선택될 수 있다(미국 특허 제5,885,613호 참조). 특히 유용한 교환 가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예컨대, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다. 본 발명의 PEG-변형 인지질 및 유도된 지질은 리포솜 수송 비히클에 존재하는 총 지질의 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%의 몰비를 포함할 수 있다.
PEG-변형 인지질 및 유도체화 지질은 중량 기준으로 또는 몰 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% 또는 5% 이하를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 5% 이하를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 4% 이하를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 3% 이하를 일반적으로 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 2% 이하를 일반적으로 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 1% 이하를 일반적으로 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 약 1~5%, 약 1~4%, 약 1~3%, 또는 약 1~2%를 구성한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 중량 기준으로 또는 몰 농도 기준으로 적절한 지질 용액 중 총 지질의 0.01~3%(예를 들어, 약 0.01~2.5%, 0.01~2%, 0.01~1.5%, 또는 0.01~1%)를 구성한다.
몰 지질비
여러 가지 구현예에 따르면, 지질 나노입자를 포함할 뿐만 아니라 서로에 대한 이러한 지질의 상대적인 몰비를 포함하는 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및/또는 PEG-변형 지질의 선택은 선택된 지질(들)의 특성, 의도된 표적 세포의 성질, 전달되는 mRNA의 특성을 기초로 한다. 추가적인 고려 사항은, 예를 들어, 알킬 사슬의 포화뿐만 아니라 선택된 지질(들)의 크기, 전하, pH, pKa, 융해성(fusogenicity), 및 내약성을 포함한다. 따라서 몰비는 적절하게 조정될 수 있다.
미리 형성된 지질 나노입자를 제조하는 데 사용될 수 있고 이에 포함되는 다양한 조합의 지질, 즉 양이온성 지질, 비양이온성 지질, PEG-변형 지질, 및 임의로 콜레스테롤이 문헌 및 본원에서 기술된다. 예를 들어, 적절한 지질 용액은 cKK-E12, DEPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; C12-200, DEPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; HGT5000, DEPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; HGT5001, DEPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; cKK-E12, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; C12-200, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; HGT5000, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; 또는 HGT5001, DPPC, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2K; 또는 ICE, DEPE, 및 DMG-PEG2K를 함유할 수 있다. 지질의 추가 조합은 당업계에, 예를 들어, 2017년 11월 10일에 출원되고, WO 2018/089790로서 공개되고, 발명이 명칭이 "Novel ICE-based Lipid Nanoparticle Formulation for Delivery of mRNA"인 PCT/US17/61100; 2018년 3월 7일에 출원되고, WO 2018/165257로서 공개되고, 발명의 명칭이 "PolyAnionic Delivery of Nucleic Acids"인 PCT/US18/21292; 2018년 6월 11일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Poly (Phosphoesters) for Delivery of Nucleic Acids"인 PCT/US18/36920; 2018년 5월 24일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Thioester Cationic Lipids"인 미국 특허 가출원 제62/676,147호; 2018년 5월 30일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Cationic Lipids Comprising a Steroidal Moiety"인 미국 특허 가출원 제62/677,821호; 2018년 5월 30일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Macrocyclic Lipids"인 미국 특허 가출원 제62/677,809호; 2018년 5월 30일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Vitamin K Cationic Lipids"인 미국 특허 가출원 제62/677,818호; 2018년 5월 30일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Vitamin D Cationic Lipids"인 미국 특허 가출원 제62/677,828호; 2018년 5월 30일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Vitamin A Cationic Lipids"인 미국 특허 가출원 제62/677,851호; 2018년 5월 30일에 출원되고, 발명의 명칭이 "Vitamin E Cationic Lipids"인 미국 특허 가출원 제62/677,855호에 기술되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전체 범위가 참조로서 본원에 통합된다.
다양한 구현예에서, 양이온성 지질(예를 들어, cKK-E12, 화합물 1, 화합물 2, 또는 화합물 3, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)은 몰비 기준으로 리포솜의 약 30~60%(예를 들어, 약 30~55%, 약 30~50%, 약 30~45%, 약 30~40%, 약 35~50%, 약 35~45%, 또는 약 35~40%)를 구성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(예를 들어, cKK-E12, 화합물 1, 화합물 2, 또는 화합물 3, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)의 백분율은 몰비 기준으로 리포솜의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40 % 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 또는 약 60% 이상이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 약 30~60:25~35:20~30:1~15 사이에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:30:20:10이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:30:25:5이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:32:25:3이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 대략 50:25:20:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 50:45:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 50:40:10이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 55:40:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 55:35:10이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 60:35:5이다. 일부 구현예에서, 스테롤 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 60:30:10이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE 및 DEPE를 포함하고, ICE:DEPE의 몰비는 1:1보다 크다. 일부 구현예에서, ICE:DEPE의 몰비는 2.5:1보다 작다. 일부 구현예에서, ICE:DEPE의 몰비는 1:1 내지 2.5:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DEPE의 몰비는 대략 1.5:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DEPE의 몰비는 대략 1.7:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DEPE의 몰비는 대략 2:1이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 ICE 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비는 10:1보다 크다. 일부 구현예에서, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비는 16:1보다 작다. 일부 구현예에서, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 12:1이다. 일부 구현예에서, ICE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 14:1이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포좀은 DEPE 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 5:1보다 크다. 일부 구현예에서, DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 11:1보다 작다. 일부 구현예에서, DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 7:1이다. 일부 구현예에서, DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 대략 10:1이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포좀은 ICE, DEPE, 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 50:45:5이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포좀은 ICE, DEPE, 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 50:40:10이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포좀은 ICE, DEPE, 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 55:40:5이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포좀은 ICE, DEPE, 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 55:35:10이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포좀은 ICE, DEPE, 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 60:35:5이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포좀은 ICE, DEPE, 및 DMG-PEG-2K를 포함하고, ICE:DEPE:DMG-PEG-2K의 몰비는 60:30:10이다.
중합체
일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 담체로서 폴리머를 단독으로 사용하거나 본원에 기술된 여러 가지 지질을 포함하는 다른 담체들과 조합하여 사용함으로써 제형화된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 리포솜 전달 비히클은 또한 폴리머를 포함하는 나노입자를 망라한다. 적합한 폴리머는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드(polyglycolide) 코폴리머, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 아르기네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 프로타민(protamine), PEG화 프로타민, PLL, PEG화 PLL 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함할 수 있다. PEI가 존재하는 경우, 예컨대, 25 kDa 분지형 PEI(Sigma #408727)와 같이 10 내지 40 kDa 범위의 분자량의 PEI가 분지될 수 있다.
전령 RNA(mRNA)
본 발명은 임의의 mRNA를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. mRNA는 일반적으로 DNA로부터 리보솜에 정보를 전달하는 유형의 RNA로 간주된다. 일반적으로, 진핵 생물에서, mRNA 가공은 5' 말단 상에 "캡"을 추가하고 3' 말단 상에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 통상적인 캡은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결되는 구아노신인, 7-메틸구아노신 캡이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. 꼬리의 추가는 일반적으로 폴리아데닐화 이벤트이며, 이에 의해 폴리아데닐릴 모이어티가 mRNA 분자의 3' 말단에 첨가된다. 이러한 "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 전령 RNA는 리보솜에 의해, 단백질을 구성하는 일련의 아미노산으로 번역된다.
mRNA는 알려진 다양한 방법 중 어느 하나에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관 내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 간단히 말하면, IVT는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 시험관 내 합성 mRNA는 mRNA 합성 중에 사용되는 다양한 효소 및 기타 시약을 포함하는 바람직하지 않은 불순물을 제거하기 위해, 제형화 및 캡슐화 전에 정제될 수 있다.
본 발명은 다양한 길이의 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 또는 20 kb보다 큰, 시험관 내에서 합성된 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1~20 kb, 약 1~15 kb, 약 1~10 kb, 약 5~20 kb, 약 5~15 kb, 약 5~12 kb, 약 5~10 kb, 약 8~20 kb, 또는 약 8~15 kb 범위인, 시험관 내에서 합성된 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 변형되지 않은 mRNA 또는 일반적으로 안정성을 향상시키는 하나 이상의 변형을 포함하는 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형은 변형 뉴클레오티드, 변형 당 인산 골격, 및 5' 및/또는 3' 비번역 영역으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, mRNA의 변형은 RNA의 뉴클레오티드의 변형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 변형 mRNA는 예를 들어, 골격 변형, 당 변형, 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U))을 포함하되 이에 한정되지 않는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체(변형 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있고, 퓨린과 피리미딘의 변형 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서, 예컨대, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 유사우라실(5-우라실), 디하이드로우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-유사우라실, 큐에오신(queosine), 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신(wybutoxosine), 및 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 유사우리딘, 5-메틸시티딘, 및 이노신 등으로서 합성될 수 있다. 이와 같은 유사체의 제조는 미국 등록특허 번호 제4,373,071호, 미국 등록특허 번호 제4,401,796호, 미국 등록특허 번호 제4,415,732호, 미국 등록특허 번호 제4,458,066호, 미국 등록특허 번호 제4,500,707호, 미국 등록특허 번호 제4,668,777호, 미국 등록특허 번호 제4,973,679호, 미국 등록특허 번호 제5,047,524호, 미국 등록특허 번호 제5,132,418호, 미국 등록특허 번호 제5,153,319호, 미국 등록특허 번호 제5,262,530호, 및 미국 등록특허 번호 제5,700,642호에서 당업자에게 공지되어 있고, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
일반적으로, mRNA 합성은 5' 말단에 "캡"을 추가하고 3' 말단에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
따라서, 일부 구현예에서, mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 우선, RNA 말단 인산가수분해효소가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 인산기 중 하나를 제거하고, 2개의 말단 인산기를 남긴다; 그런 다음, 구아노신 삼인산(guanosine triphosphate, GTP)이 구아닐릴(guanylyl) 전이효소를 통해 말단 인산에 첨가되고 5'5'5 삼인산 결합을 생성한다; 그런 다음 구아닌의 7-질소가 메틸기 전이효소에 의해 메틸화된다. 2'-O-메틸화는 또한 7-메틸 구아노신 트리포스페이트 잔기 다음의 제1 염기 및/또는 제2 염기에서 일어날 수 있다. 캡 구조의 예는 이에 제한되지 않지만, m7GpppNp-RNA, m7GpppNmp-RNA, 및 m7GpppNmpNmp-RNA(여기서 m은 2'-O메틸 잔기를 나타냄)를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어, 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위 중 하나 이상, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 길이가 50 내지 500개의 뉴클레오티드이거나 더 길 수 있다.
시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 일부 구현예에서 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 mRNA를 포함하는 본 발명의 범위 내에서 다른 mRNA 공급원이 고려된다.
본 발명은 다양한 단백질을 암호화하는 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 적합한 mRNA의 비제한적인 예는 척수 운동 뉴런 1(SMN), 알파-갈락토시다아제(GLA), 아르기니노숙신산염 합성효소(ASS1), 오르니틴 트랜스카바밀라아제(OTC), 인자 IX(FIX), 페닐알라닌 하이드록실라아제(PAH), 에리트로포이에틴(EPO), 낭성 섬유증 막관통 전도 수용체(CFFF), 및 반딧불이 루시퍼라아제(FFL)를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 예시적인 mRNA 서열은 아래에 열거되어 있다:
지질 나노입자(LNP)의 형성
mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 제조하는 방법이 또한 제공하며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질의 혼합물을 제공하는 단계로서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 제공된 혼합물로부터 지질 나노입자를 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 방법은 mRNA를 지질 나노입자 내로 캡슐화하는 단계를 추가로 포함하며, 캡슐화는 단계 (b)에서 지질 나노입자를 형성하기 전 또는 후에 이루어질 수 있다. mRNA를 캡슐화하는 생성된 지질 나노입자는 안정적이다(예를 들어, 동결-해동 전과 후에 mRNA의 동일한 캡슐화를 유지하거나, 동결-해동 전과 후에 10% 이내에서 mRNA의 동일한 캡슐화를 유지함). 일 구현예에서, 본 발명에 따른 지질 나노입자를 제조하는 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 헬퍼 지질의 사용을 명시적으로 배제한다: 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 및 이들의 조합.
다양한 캡슐화 방법이 미국 특허 출원 공개 제2011/0244026호, 미국 특허 출원 공개 제2016/0038432호, 미국 특허 출원 공개 제2018/0153822호, 미국 특허 출원 공개 제2018/0125989호, 및 2019년 7월 23일에 출원한 미국 특허 가출원 제62/877,597호에 기술되어 있고, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있으며, 이들 문헌 모두는 본원에 참조로서 통합된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 방법 A는, 미국 특허 제2016/0038432호에 기술된 바와 같이, 먼저 지질을 지질 나노입자로 미리 형성하지 않고, mRNA를 지질의 혼합물과 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 종래의 방법을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 방법 B 또는 "리믹스(Remix)"는, 미국 특허 제2018/0153822호에 기술된 바와 같이, 미리 형성된 지질 나노입자를 mRNA와 혼합함으로써 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법을 지칭한다. "스텝 다운 리믹스(Step Down Remix)" 또는 "스텝 업 리믹스(Step Up Remix)"는 미국 특허 가출원 제63/021,319호에 기술된 바와 같이, "리믹스" 방법을 기반으로 하는 개선된 방법이다. "스텝 다운 리믹스"는 미리 형성된 빈 지질 나노입자의 현탁액을, 순차적으로 첨가되는 mRNA 용액의 배치(batch)와 혼합하는 것을 포함한다. mRNA 용액 배치를 첨가할 때마다, 양이온성 지질 대 mRNA의 몰비("N/P")가 상이한 중간체 혼합물이 생성되며, N/P 비율은 높게 시작해서 최종 제형에서는 낮은 N/P 비율로 감소한다. "스텝 업 리믹스"에서, 미리 형성된 빈 지질 나노입자의 현탁액을 mRNA 용액에 배치 방식으로 첨가하되, 양이온성 지질 대 mRNA의 등몰 비율로 시작한다. 예를 들어, 양이온성 지질 대 mRNA의 비율이 4:1에 도달할 때까지 미리 형성된 빈 지질 나노입자를 4개의 배치로 첨가한다.
일 구현예에서, DEPE는 10 몰% 내지 50 몰%의 농도로 혼합물에 존재한다. 보다 일반적으로, 혼합물 중의 DEPE는 혼합물 중의 총 지질의 25몰% 내지 35몰%의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 혼합물 중 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬을 가진 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질의 혼합물은 하나 이상의 스테롤, 예컨대 콜레스테롤계 지질을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤 및/또는 PEG화 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 헬퍼 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 약 30~60:25~35:20~30:1~15 사이에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 미리 형성된 빈 지질 나노입자는 에탄올에 용해된 지질을 수용액(지질 용액)과 혼합함으로써 형성된다. 일부 구현예에서, 지질은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 하나 이상의 콜레스테롤 지질을 또한 함유한다. 일부 구현예에서, 지질은 에탄올 모액으로 존재한다. 미리 형성된 지질 나노입자는 이들 지질을 혼합함으로써 형성된다. 일반적으로, 일부 구현예에서, 용해된 지질을 함유하는 지질 용액, 및 수용액이나 완충제액은 지질이 mRNA가 없는 나노입자(즉 미리 형성된 빈 지질 나노입자)를 형성할 수 있도록 용액으로 혼합된다.
지질 용액
본 발명에 따르면, 지질 용액은 mRNA의 캡슐화를 위한 지질 나노입자를 형성하기에 적합한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 에탄올계이다. 예를 들어, 적합한 지질 용액은 순수 에탄올(즉, 100% 에탄올)에 용해된 바람직한 지질의 혼합물을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 이소프로필 알코올계이다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 디메틸설폭시드계이다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 에탄올, 이소프로필 알코올, 및 디메틸설폭시드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 적절한 용매의 혼합물이다.
적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 다양한 농도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 약 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 2.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, 4.0 mg/ml, 5.0 mg/ml, 6.0 mg/ml, 7.0 mg/ml, 8.0 mg/ml, 9.0 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 또는 100 mg/ml의 총 농도로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 약 0.1~100 mg/ml, 0.5~90 mg/ml, 1.0~80 mg/ml, 1.0~70 mg/ml, 1.0~60 mg/ml, 1.0~50 mg/ml, 1.0~40 mg/ml, 1.0~30 mg/ml, 1.0~20 mg/ml/ml, 1.0~15 mg/ml/ml, 1.0~10 mg/ml, 1.0~9 mg/ml/ml, 1.0~8 mg/ml, 1.0~7 mg/ml, 1.0~6ml, 또는 1.0~5 mg/ml 범위의 총 농도로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 최대 약 100 mg/ml, 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 10 mg/ml의 총 농도로 함유할 수 있다.
임의의 바람직한 지질이 mRNA를 캡슐화하기에 적합한 임의의 비율로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 양이온성 지질, 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 및/또는 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 및/또는 하나 이상의 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 하나 이상의 중성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하는 원하는 지질 혼합물을 함유한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자 제형을 제조하는 데 사용되는 미리 형성된 빈(즉, mRNA가 없는) 지질 나노입자 제형은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 트레할로스 용액에서 안정적으로 냉동될 수 있다. 일부 구현예에서, 빈 지질 나노입자에 mRNA를 첨가하면 임의의 하류 정제 또는 가공을 필요로 하지 않고 냉동된 형태로 안정적으로 저장할 수 있는 최종 제형을 생성할 수 있다.
mRNA-LNP의 형성
본원에서 사용되는 바와 같이, mRNA-로딩된 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 형성하는 방법은 용어 "mRNA 캡슐화" 또는 이의 문법적으로 다른 표현과 상호 교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합함으로써 형성되며, 여기서 여기서 mRNA 용액 및/또는 지질 용액은 혼합 단계 이전에 주변 온도보다 더 높은 소정의 온도로 가열된다(2015년 7월 2일에 출원되고, 발명이 명칭이 "Encapsulation of messenger RNA"인 미국 특허 출원 제14/790,562호 및 2014년 7월 2일에 출원된 이의 미국 특허 가출원 제62/020,163호를 참조하고, 이들의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다).
일반적으로, 임의의 원하는 지질이 mRNA-LNP의 형성에 적합한 임의의 비율로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 양이온성 지질, 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 및/또는 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 및/또는 하나 이상의 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 하나 이상의 중성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하는 원하는 지질 혼합물을 함유한다.
일부 구현예에서, mRNA 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자 용액은 mRNA가 지질 나노입자에 캡슐화되도록 용액으로 혼합된다. 이러한 용액은 제형 또는 캡슐화 용액으로도 지칭된다. 미리 형성된 지질 나노입자를 mRNA와 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 방법은 2017년 11월 10일에 "Improved Process of Preparing mRNA-Loaded Lipid Nanoparticles"라는 발명의 명칭 하에 PCT/US17/61113으로서 출원되어 WO2018/089801로서 공개되고; 동시에 동일한 발명의 명칭 하에 미국 특허 출원 제15/809,68호로서 출원된 선행 발명에 이전에 기술되었다. 상기 출원의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 에탄올과 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 에탄올, 약 15% 에탄올, 약 20% 에탄올, 약 25% 에탄올, 약 30% 에탄올, 약 35% 에탄올, 또는 약 40% 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 이소프로필 알코올과 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 이소프로필 알코올, 약 15% 이소프로필 알코올, 약 20% 이소프로필 알코올, 약 25% 이소프로필 알코올, 약 30% 이소프로필 알코올, 약 35% 이소프로필 알코올, 또는 약 40% 이소프로필 알코올을 포함한다.
일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 다이메틸 설폭시드와 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 다이메틸 설폭시드, 약 15% 다이메틸 설폭시드, 약 20% 다이메틸 설폭시드, 약 25% 다이메틸 설폭시드, 약 30% 다이메틸 설폭시드, 약 35% 다이메틸 설폭시드, 또는 약 40% 다이메틸 설폭시드를 포함한다.
일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 완충제 또는 염을 함유할 수도 있다. 예시적인 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 및 인산나트륨을 포함할 수 있다. 예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 신규한 나노입자 제형을 제조하는 데 사용되는 미리 형성된 빈 지질 나노입자 제형은 10% 트레할로스 용액에서 안정적으로 냉동될 수 있다.
일부 구현예에서, 에탄올, 구연산염 완충제, 및 기타 불안정화제는 mRNA를 첨가하는 동안 존재하지 않으며, 따라서 제형은 임의의 추가적인 하류 가공을 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 신규한 방법에 의해 제조된 지질 나노입자 제형은 트레할로스 용액 중의 미리 형성된 지질 나노입자를 포함한다. 불안정화제의 부재와 트레할로스 용액의 안정성은 mRNA-캡슐화 지질 나노입자의 제형화 규모를 쉽게 확장할 수 있게 하고 생산을 증가시킨다.
mRNA 용액
mRNA는 지질 용액과 혼합하기 위한 용액으로 제공될 수 있으므로, mRNA는 지질 나노입자로 캡슐화될 수 있다. 적절한 mRNA 용액은 1 mg/ml 미만의 다양한 농도로 캡슐화할 mRNA를 함유하는 임의의 수용액일 수 있다. 예를 들어, 적절한 mRNA 용액은 약 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 또는 1.0 mg/m 이하의 농도로 mRNA를 함유할 수 있다.
일반적으로, 적절한 mRNA 용액은 완충제 및/또는 염을 함유할 수도 있다. 일반적으로, 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨 및 인산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제의 적절한 농도는 약 0.1 mM 내지 100 mM, 0.5 mM 내지 90 mM, 1.0 mM 내지 80 mM, 2 mM 내지 70 mM, 3 mM 내지 60 mM, 4 mM 내지 50 mM, 5 mM 내지 40 mM, 6 mM 내지 30 mM, 7 mM 내지 20 mM, 8 mM 내지 15 mM, 또는 9 내지 12 mM의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제의 적절한 농도는 약 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 또는 50 mM 이상이다.
예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 중 염의 적절한 농도는 약 1 mM 내지 500 mM, 5 mM 내지 400 mM, 10 mM 내지 350 mM, 15 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 250 mM, 30 mM 내지 200 mM, 40 mM 내지 190 mM, 50 mM 내지 180 mM, 50 mM 내지 170 mM, 50 mM 내지 160 mM, 50 mM 내지 150 mM, 또는 50 mM 내지 100 mM의 범위일 수 있다. 적절한 mRNA 용액 중 염 농도는 약 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM 이상이다.
일부 구현예에서, 적절한 mRNA 용액은 약 3.5~6.5, 3.5~6.0, 3.5~5.5, 3.5~5.0, 3.5~4.5, 4.0~5.5, 4.0~5.0, 4.0~4.9, 4.0~4.8, 4.0~4.7, 4.0~4.6, 또는 4.0~4.5 범위의 pH를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 용액은 약 3.5, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.1, 6.3, 및 6.5 이하의 pH를 가질 수 있다.
본 발명에 적절한 mRNA 용액은 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 본원에 기술된 완충액에 직접 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은, 캡슐화를 위해 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합하기 전에 mRNA 모액과 완충액을 혼합함으로써 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은, 캡슐화를 위해 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합하기 직전에 mRNA 모액과 완충액을 혼합함으로써 생성할 수 있다. 예를 들어, 적절한 mRNA 모액은 물 중 mRNA를 약 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 또는 1.6 mg/ml, 2.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.5 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.5 mg/ml, 또는 5.0 mg/ml 이상의 농도로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 모액은 펌프를 사용하여 완충액과 혼합된다. 예시적인 펌프는 기어 펌프, 연동 펌프, 및 원심 펌프를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
일반적으로, 완충액은 mRNA 모액의 속도보다 더 높은 속도로 혼합된다. 예를 들어, 완충액은 mRNA 모액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 높은 속도로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 구연산염 완충액을 mRNA 모액과 혼합함으로써 mRNA 용액을 먼저 생성하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 적절한 구연산염 완충액은 pH가 약 4.5인 약 10 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl을 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 모액은 약 1 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 50 mg/ml, 또는 약 100 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다.
일부 구현예에서, 구연산염 완충액은 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 또는 4800~6000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 구연산염 완충액은 약 220 ml/분, 약 600 ml/분, 약 1200 ml/분, 약 2400 ml/분, 약 3600 ml/분, 약 4800 ml/분, 또는 약 6000 ml/분의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 10~30 ml/분, 약 30~60 ml/분, 약 60~120 ml/분, 약 120~240 ml/분, 약 240~360 ml/분, 약 360~480 ml/분, 또는 약 480~600 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 20 ml/분, 약 40 ml/분, 약 60 ml/분, 약 80 ml/분, 약 100 ml/분, 약 200 ml/분, 약 300 ml/분, 약 400 ml/분, 약 500 ml/분, 또는 약 600 ml/분의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, 완충액은 약 100~6000 ml/분(예를 들어, 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 4800~6000 ml/분, 또는 60~420 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 60 ml/분, 100 ml/분, 140 ml/분, 180 ml/분, 220 ml/분, 260 ml/분, 300 ml/분, 340 ml/분, 380 ml/분, 420 ml/분, 480 ml/분, 540 ml/분, 600 ml/분, 1200 ml/분, 2400 ml/분, 3600 ml/분, 4800 ml/분, 또는 6000 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 10~600 ml/분(예를 들어, 약 5~50 ml/분, 약 10~30 ml/분, 약 30~60 ml/분, 약 60~120 ml/분, 약 120~240 ml/분, 약 240~360 ml/분, 약 360~480 ml/분, 또는 약 480~600 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 모액은 약 5 ml/분, 10 ml/분, 15 ml/분, 20 ml/분, 25 ml/분, 30 ml/분, 35 ml/분, 40 ml/분, 45 ml/분, 50 ml/분, 60 ml/분, 80 ml/분, 100 ml/분, 200 ml/분, 300 ml/분, 400 ml/분, 500 ml/분, 또는 600 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자 및 mRNA는 펌프 시스템을 사용해 혼합된다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템은 무펄스 유동 펌프(pulse-less flow pump)를 포함한다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템은 기어 펌프(gear pump)이다. 일부 구현예에서, 적절한 펌프는 연동 펌프(peristaltic pump)이다. 일부 구현예에서, 적절한 펌프는 삼투 펌프(centrifugal pump)이다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템을 사용하는 방법은 대규모로 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 것과 같은 펌프를 사용해 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 mRNA 용액을 미리 형성된 지질 나노입자 용액과 혼합하여 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 미리 형성된 지질 나노입자와 혼합하는 방법은 본 발명에 따른 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다.
일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액은 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분의 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액은 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, mRNA는 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분 범위의 유속으로 용액에 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 용액에 혼합된다.
일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 미리 형성된 지질 입자와 조합하는 단계는 펌프 시스템을 사용하여 수행된다. 이러한 조합하는 단계는 펌프를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA가 캡슐화된 지질 나노입자는 미리 형성된 지질 나노입자와 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분의 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 용액에 혼합된다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자와 mRNA를 혼합하는 단계는 임의의 펌프가 없는 상태로 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 용액 중 하나 이상을 주변 온도보다 높은 온도로 가열하는 (또는 가열하여 주변 온도보다 높은 온도로 유지시키는) 단계(즉, 열원으로부터 용액에 열을 인가하는 단계)를 포함하며, 상기 하나 이상의 용액은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 혼합 용액이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 mRNA 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자 용액 중 하나 또는 둘 다를 가열하는 단계를 혼합 단계 전에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 가열하는 단계를 혼합 단계 동안에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 가열하는 단계를 혼합 단계 후에 포함한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상을 가열하는 (또는 용액 중 하나 이상을 유지하는 온도) 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃ 이상이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상을 가열하는 온도는 약 25~70℃, 약 30~70℃, 약 35~70℃, 약 40~70℃, 약 45~70℃, 약 50~70℃, 또는 약 60~70℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상을 가열하는, 주변 온도보다 높은 온도는 약 65℃이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 주변 온도로 유지시키는 단계(즉, 열원으로부터 용액에 열을 인가하지 않는 단계)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 mRNA 용액 및 미리 형성된 지질 나노입자 용액 중 하나 또는 둘 다를 주변 온도로 유지시키는 단계를 혼합 단계 전에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 주변 온도로 유지시키는 단계를 혼합 단계 동안에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 혼합 단계 후에 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 주변 온도로 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 또는 16℃ 이하이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 15~35℃, 약 15~30℃, 약 15~25℃, 약 15~20℃, 약 20~35℃, 약 25~35℃, 약 30~35℃, 약 20~30℃, 약 25~30℃, 또는 약 20~25℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 20~25℃이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 방법은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액과 mRNA를 포함하는 용액을 혼합하여 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 형성하는 단계를 주변 온도에서 수행하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 약 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노 입자의 실질적으로 전부는 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의하면 캡슐화율은 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 초과한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의하면, 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 mRNA가 회수된다.
일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 또는 1:20의 비율로 조합된다. 지질 나노입자를 조합하는 방법은 지질 나노입자를 mRNA와 혼합하는 단계에 대해 전술한 것과 같다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 20:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 19:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 15:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 10:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 9:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 8:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 7:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 6:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 5:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 4:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 3:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 2:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:2의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:3의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:4의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:5의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:6의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:7의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:8의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:9의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:10의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:12의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:15의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 상기 방법의 단계 (b)에서 미리 형성된 지질 입자와 1:20의 비율로 조합된다.
정제
일부 구현예에서, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 또는 mRNA-LNP는 정제되고/되거나 농축된다. 다양한 정제 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 미리 형성된 지질 나노입자는 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 중력 기반 법선 여과(NFF)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 임의의 다른 적합한 여과 방법에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 원심분리에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 크로마토그래피 방법에 의해 정제된다.
약학적 제형 및 치료적 용도
mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 원하는 완충액, 예를 들어 PBS에서 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 더 높은 효험과 효능을 갖는 mRNA-LNP 조성물을 생성하여 투여량을 낮출 수 있게 함으로써 치료 지수를 긍정적인 방향으로 이동시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 작은 입자 크기(예: 150 nm 미만)를 갖는 균질한 mRNA-LNP를 생성한다.
따라서, 본 발명은 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 정제된 나노입자의 대부분, 즉 정제된 나노입자의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 약 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP의 실질적으로 전부는 약 150 nm 미만(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다. 100 nm 미만의 크기를 갖는 지질 나노입자는 간 천공을 통해 침투하여 간세포에 접근할 수 있기 때문에 특히 적합하다. 유사하게, 약 100 nm 이하의 크기를 갖는 지질 나노입자는 쉽게 분무되며, 분무를 사용하여 대상체에게 투여될 때 폐 깊숙이 침투할 수 있다.
또한, 입자 크기 범위가 좁은 보다 균질한 나노입자는 본 발명의 방법에 의해 달성된다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 조성물 중 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 약 75~150 nm(예를 들어, 약 75~145 nm, 약 75~140 nm, 약 75~135 nm, 약 75~130 nm, 약 75~125 nm, 약 75~120 nm, 약 75~115 nm, 75~110 nm, 약 75~105 nm, 약 75~100 nm, 약 75~95 nm, 약 75~90 nm, 또는 약 75~85 nm) 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노 입자의 실질적으로 전부는 75~100 nm(예를 들어, 약 75~145 nm, 약 75~140 nm, 약 75~135 nm, 약 75~130 nm, 약 75~125 nm, 약 75~120 nm, 약 75~115 nm, 75~110 nm, 약 75~105 nm, 약 75~100 nm, 약 75~95 nm, 약 75~90 nm, 또는 약 75~85 nm) 범위의 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 중의 나노입자의 분산성, 또는 분자 크기의 이질성(PDI)의 척도는 약 0.23 미만(예를 들어, 약 0.23, 0.22, 0.21, 0.20, 0.19, 0.18, 0.17, 0.16, 0.15, 0.14, 0.13, 0.12, 0.11, 0.10, 0.09, 또는 0.08 미만)이다. 특정 구현예에서, PDI는 약 0.16 미만이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 100 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의하면, 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 mRNA가 회수된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 mRNA는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하는 온전성을 보유한다. 일부 구현예에서, mRNA는 100%의 온전성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 대상체에게 특이적 투여량의 조성물을 투여할 수 있도록 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 약 5 mg/kg 또는 5 mg/kg 미만의 mRNA(즉, 4 mg/kg 미만의 mRNA, 3 mg/kg 미만, 2 mg/kg 미만, 1.0 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.016 mg/kg. 0.05 mg/kg, 및 0.016 mg/kg 미만의 mRNA)의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 4 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 3 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 2 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 1 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.6 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.5 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.3 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.2 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.1 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.08 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.06 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.05 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 지질 나노입자의 조성물은 0.01 mg/kg 미만의 mRNA 지질 나노입자의 투여량 농도로 제형화된다.
소정의 구현예에서, 치료 효과를 발휘하는 데 필요한 mRNA의 양은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%만큼 감소된다. 소정의 구현예에서, 치료 효과를 발휘하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드의 양은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 15배, 20배, 또는 25배 이상만큼 감소된다.
따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 대상체에게 전달하거나 인간 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물은 대상체의 폐 또는 폐 세포 내로의 전달을 위해 사용된다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 폐 또는 폐 세포에 전달하거나 대상체의 폐 또는 폐 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 낭성 섬유증 막관통 전달 조절자, 즉 CFTR을 암호화하는 mRNA를 제조하는 방법에 유용하다. CFTR mRNA는 낭성 섬유증을 치료하기 위한 치료 조성물을 필요로 하는 대상체의 폐에 전달된다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 간 또는 간 세포에 전달하거나 대상체의 간 또는 간 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 요소 회로 질환과 관련된 것들, 리소좀 저장 장애와 관련된 것들, 글리코겐 저장 장애와 관련된 것들, 아미노산 대사 장애와 관련된 것들, 지질 대사 또는 섬유증 장애와 관련된 것들, 메틸말론산혈증과 관련된 것들, 또는 풍부한 전장 mRNA를 간 또는 간 세포에 전달하거나 이를 이용해 간 또는 간 세포를 치료하는 것이 치료적 이점이 되는 임의의 다른 대사 장애와 관련된 것들을 포함할 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 요소 순환 질환과 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 오르니틴 트랜스카바밀라아제(OTC) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 합성효소 1 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 카바모일 포스페이트 합성효소 I 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 리아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아르기나아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 리소좀 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 알파 갈라토시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글루코세레브로시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 이두로네이트-2-설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 이두로니다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 N-아세틸-알파-D-글루코사미니다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 헤파린 N-설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 갈락토사민-6 설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 베타-갈락토시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 리소좀 리파아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아랄설파타아제 B (N-아세틸갈락토사민-4-설파타아제) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 전사 인자 EB(TFEB)를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 산 알파-글루코시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글루코스-6-포스파타아제 (G6PC) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 간 글리코겐 포스포릴라아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 포스포글리세레이트 뮤타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 탈분지 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 아미노산 대사 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 하이드록실라아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글루타릴-CoA 데하이드로제나아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 프로피오닐-CoA 카복실라아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 옥살라아제 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소를 암호화하는 전장 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 지질 대사 장애 또는 섬유증 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 mTOR 억제제를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 ATPase 인지질 수송 8B1 (ATP8B1) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 NF-카파 B 억제제, 예컨대 I-카파 B 알파, 인터페론 관련 발달성 조절물질 1 (IFRD1), 및 시르투인 1(SIRT1) 중 하나 이상을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 PPAR-감마 단백질 또는 활성 변이체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 메틸말론산혈증과 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 뮤타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 에피머라아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 간으로의 전달 또는 간의 치료가 치료적 이점을 제공할 수 있는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 윌슨병(Wilson disease) 단백질로도 알려진 ATP7B 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 포스포빌리노겐 데아미나아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X와 같은 하나 이상의 응고 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 혈색소 침착증(HFE) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심혈관 병태를 치료하거나 대상체의 심혈관 세포에 전달하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 혈관 내피 성장 인자 A 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 릴랙신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-9 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-2 수용체 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 근육 또는 근육 세포에 전달하거나 대상체의 근육 또는 근육 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 디스트로핀 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심근 또는 심근 세포에 전달하거나 대상체의 심근 또는 심근 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 칼륨 채널 및 나트륨 채널 중 하나 또는 둘 다를 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Kv7.1 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Nav1.5 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신경계 또는 신경계 세포에 전달하거나 대상체의 신경계 또는 신경계 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 1 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 2 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 D 구성원 1 (ABCD1) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 CLN3 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포에 전달하거나 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 베타 글로빈 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 브루톤 티로신 키나아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 응고 효소, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신장 또는 신장 세포에 전달하거나 대상체의 신장 또는 신장 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 IV형 콜라겐 알파 5 사슬 (COL4A5) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 안구 또는 안세포에 전달하거나 대상체의 안구 또는 안세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 A 구성원 4 (ABCA4) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 망막층간 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 망막 색소 상피-특이적 65 kDa (RPE65) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 290 kDa의 중심체 단백질(CDP290)을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체 또는 대상체의 세포에 백신을 전달하거나 대상체 또는 대상체의 세포를 백신으로 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 발명은 바이러스와 같은 감염원의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 광견병 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 사이토메갈로 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 로타 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 간염 바이러스, 예컨대 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 유두종 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 단순 헤르페스 바이러스, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 1형 또는 단순 헤르페스 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스 1형 또는 인간 면역 결핍 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 메타뉴모바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스, 예컨대 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2형, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 말라리아 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 지카 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 치쿤구니야 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암과 연관되었거나 대상체의 암 세포로부터 식별된 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체 본인의 암 세포로부터 결정된 항원, 즉 맞춤화된 암 백신을 제공하기 위한 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 KRAS 유전자로부터 발현된 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체일 수 있다. 소정의 구현예에서, 항체는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (b)에서 2개의 별도의 mRNA-LNP는 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 mRNA-LNP 조성물은 상이한 지질 조성물을 포함하는 LNP, 및 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP의 조합을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 LNP는 동일하지 않다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 OX40에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 VEGF에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 조직 괴사 인자 알파에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 CD3에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 CD19에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 면역조절물질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 12를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 23을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 36 감마를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 인터페론 유전자의 자극제(STING) 단백질의 구성적 활성 변이체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 단백질, 예컨대 Cas 9 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 메가뉴클레아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 징크 핑거 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 안구 질환을 치료하기 위해 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 망막층간 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 데 사용된다.
실시예
본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다.
다음의 실시예에 기술된 mRNA-LNP 시험 물품은, 달리 명시되지 않는 한, 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질(예를 들어, DEPE 또는 DOPE와 같은 비-양이온성 지질), 하나 이상의 PEG화 지질, 및 임의로 하나 이상의 스테롤(예를 들어, mRNA를 캡슐화하도록 설계된 콜레스테롤)을 다양한 비율로 사용하는 다성분 지질 혼합물에 캡슐화된 mRNA를 함유한다.
실시예 1. mRNA의 제조
mRNA의 시험관 내 전사
달리 기술되지 않는 한, mRNA는 T7 중합효소 또는 SP6 중합효소를 사용하여 시험관 내 전사(IVT)를 통해 합성하였다. 간략하게, SP6 중합효소 IVT 반응에 있어서, 전사된 mRNA의 1 g 마다, RNA 중합효소-특이적 프로모터, SP6 RNA 중합효소, RNase 억제제, 피로포스파타아제, 5 mM NTP, 10 mM DTT, 및 반응 완충액(10x - 250 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 20 mM 스피르미딘, 50 mM NaCl)이 포함된 20 mg의 선형 이중 가닥 DNA 플라스미드를 함유하는 반응물을 RNase-무함유 물로 제조한 다음, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, DNase I 및 DNase I 완충액(10x - 100 mM 트리스-HCl, 5 mM MgCl2, 및 25 mM CaCl2, pH 7.6)을 첨가하여 반응물을 퀀칭시켜, 정제를 위해 제제 중의 이중-가닥 DNA 템플릿의 분해를 용이하게 하였다.
mRNA의 5' 캡핑
달리 기술되지 않는 한, IVT 반응의 일부로서 캡 구조를 포함시킴으로써, IVT 전사된 mRNA를 이의 5' 말단에서 캡핑하거나 후속 효소 단계에서 캡핑하였다. IVT 반응의 일부로서 캡핑하는 경우, 캡 유사체를 제1 "염기"로서 초기 RNA 가닥에 혼입할 수 있다. 캡 유사체는 캡 0, 캡 1, 캡 2, m6Am, 또는 비천연 캡일 수 있다. 대안적으로, IVT 후에 예를 들어 구아닐레이트 트랜스퍼라아제를 사용하여 5' N7-메틸구아닐레이트 캡 0 구조를 첨가하고, Pechter, P. 및 Brownlee, G.G.의 문헌["Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249]에 기술된 것과 같이 2' O-메틸트랜스퍼라아제를 사용해 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 2' O 위치에 메틸기를 첨가하여 캡 1 구조를 생성함으로써, 캡핑되지 않고 정제된 시험관 내 전사된 (IVT) mRNA가 캡을 포함하도록 이를 효소적으로 변환시켰다.
mRNA의 3' 테일링
달리 기술되지 않는 한, IVT 반응의 일부로서 mRNA를 테일링하는 테일 템플릿을 선형화된 플라스미드에 포함시킴으로써 IVT 전사된 mRNA를 이의 3' 단부에서 테일링하거나, 후속 효소 단계에서 테일링하였다. IVT 반응의 일부로서의 테일링하는 경우, 폴리-T 또는 유사한 테일링 특징부를 pDNA 템플릿에 혼입하는 것은, IVT 공정의 일부로서 폴리A 테일 또는 유사한 적절한 테일이 mRNA 상에 형성되도록 수행된다. 대안적으로, IVT 반응 후에 IVT-생성된 mRNA의 3' 말단에 폴리-A 꼬리를 예를 들어 폴리-A 중합효소를 사용하여 효소적으로 첨가할 수 있다.
실시예 2. 지질 나노입자(LNP)의 제조 및 mRNA의 캡슐화
방법 B에 따라 LNP를 제조하고, 양이온성 지질로서 화합물 3을 포함하는 LNP에 mRNA를 캡슐하 하였다. 방법 B는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 출원 공개 제US2018153822호에 추가로 기술되어 있다. 전술한 바와 같이, LNP 제제는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질(예를 들어, DEPE 또는 DOPE와 같은 비양이온성 지질), 하나 이상의 PEG화 지질, 및 하나 이상의 스테롤(예를 들어, 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득된 mRNA를 캡슐화하도록 설계된 콜레스테롤)을 포함하는 다성분 지질 혼합물이었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 방법 A는 LNP가 다성분 지질 혼합물로부터 형성되고 mRNA가 LNP를 형성하는 것들에 캡슐화되는 것이 단일 단계로 이루어지는 종래 방법을 지칭한다.
방법 B는 미리 형성된 지질 나노입자를 mRNA와 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 방법을 지칭한다. 에탄올과 같은 용매에 용해된 다성분 지질 혼합물을 구연산염 완충액과 즉시 혼합함으로써 미리 형성된 LNP를 mRNA가 없는 상태로 먼저 제조하였다. 두 가지 스트림의 혼합을 통해 빈 지질 나노입자를 형성하였는데, 이는 자가 조립 방법이었다. 생성된 제형을 통해 알코올을 함유하는 구염산염 완충액 중 빈 지질 나노입자를 수득하고, (예를 들어, 법선 유동 여과(TFF)에 의해) 이를 완충액 교환하여 10% w/v 트레할로스 용액 완충액 중 빈 지질 나노입자를 수득하였다. 그런 다음, 수용액 중에서 빈 지질 나노입자와 mRNA를 혼합하여 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 형성하였다.
구체적으로, 빈 지질 나노입자를 제조하기 위해, 헬퍼 지질로서 DEPE 또는 DOPE를 양이온성 지질로서 화합물 3, PEG-변형 지질로서 DMG-PEG2K, 및 콜레스테롤과 함께 표 2-1에 기술된 비율로 사용하였다.
[표 2-1]
Figure pct00086
놀랍게도, 양이온성 지질로서 화합물 3을 포함하는 이들 다성분 지질 혼합물은 비-양이온성 헬퍼 지질로서 DOPE를 사용하여 제형화할 수 없었지만, 비-양이온성 헬퍼 지질로서 DOPE 대신에 DEPE를 사용했을 때 안정한 리포좀을 형성하였음을 발견하였다.
실시예 3. DEPE를 사용해 생체 내에서 LNP 중 mRNA의 생산 강화하기
본 실시예는 DEPE를 헬퍼 지질로서 포함하는 LNP를 사용했을 때 LNP에 캡슐화된 mRNA의 예상치 못한 효능의 증가를 예시한다.
EPO를 암호화하는 mRNA를 실시예 1에 기술된 바와 같이 합성하였다. 실시예 2에 기술된 것과 같은 방법 B를 사용하여, 상이한 헬퍼 지질을 포함하지만 그 외에는 동일한 LNP에 mRNA를 캡슐화하였다(하기 표 3-1 참조). 구체적으로, 각각의 mRNA-캡슐화 LNP는 상이한 헬퍼 지질을 포함하였지만 동일한 양이온성 지질(화합물 1), 동일한 PEG-변형 지질(DMG-PEG2K), 동일한 스테롤 화합물(콜레스테롤), 동일한 몰비의 이들 지질, 동일한 mRNA(EPO mRNA), 동일한 N/P 비율 = 4(즉, 양이온성 지질 대 mRNA의 몰비), 동일한 mRNA 농도(0.2 mg/mL)를 포함하였고, 이는 동일한 방법(방법 B)에 따라 제조하였다. 생성된 mRNA-LNP의 특성은 표 3-1에 제공되어 있다.
[표 3-1]
Figure pct00087
상이한 헬퍼 지질이 포함된 LNP에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 4개의 시험 물품 각각(표 3-1의 1~4)을 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스(n=5, CD-1 마우스 6~8주령)에게 5 mL/kg의 부피 중 1 mg/kg의 mRNA의 투여량으로 정맥 내 투여하였다. 투여 후 6시간차에, 꼬리를 절단하여 중간 전혈을 채취하였다. 투여 후 24시간차에, 모든 동물을 안락사시킨 개흉하여 말단 혈액을 채취하였다. 혈청 샘플 중 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 수준을 제조사 지침에 따라 ELISA 키트(R&D system Cat# DEP00)에 의해 결정하였다. 또한, 표준 기술에 따라 ELISA에 의해 혈청 ALT 및 AST 수준을 측정하였다. EPO 단백질 발현 및 ALT/AST 결과는 표 3-2에 제공되어 있고, 도 1 및 도 2에 각각 그래프로 도시되어 있다.
[표 3-2]
Figure pct00088
표 3-2 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 mRNA LNP는, 다른 헬퍼 지질을 포함하지만 그 외에는 동일한 mRNA LNP로부터의 단백질 발현과 비교했을 때 현저하게 더 높은 생체 내 단백질 발현을 제공하였다. 구체적으로, 투여 후 6시간차에, DEPE를 포함하는 mRNA LNP는, 같은 시점에 DEPE가 아닌 헬퍼 지질, 예를 들어 DOPE, DLOPE, 또는 POPE를 포함하는 mRNA LNP로부터의 단백질 발현의 100%를 초과하는, 즉, 2배보다 더 높은 생체 내 단백질 발현을 제공하였다. 유사하게, 투여 후 24시간차에, DEPE를 포함하는 mRNA LNP는, 같은 시점에 DEPE가 아닌 헬퍼 지질, 예를 들어 DOPE, DLOPE, 또는 POPE를 포함하는 mRNA LNP로부터의 단백질 발현의 100%를 초과하는, 즉, 2배보다 더 높은 생체 내 단백질 발현을 제공하였다.
또한, 표 3-2 및 도 2에도 나타낸 바와 같이, 투여 후 24시간차에 ALT 및 AST 수준은 헬퍼 지질에 상관없이 모든 mRNA LNP에 대해 실질적으로 유사하였는데, 이는 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 mRNA LNP가 DEPE 이외의 헬퍼 지질, 예를 들어, DOPE, DLOPE, 또는 POPE를 포함하는 mRNA LNP와 유사한 안전성 및 내약성을 갖는 동시에, 현저하게 더 강력했음을 나타낸다.
실시예 4. 헬퍼 지질로서 DEPE 또는 DOPE를 사용하여 지질 나노입자(LNP) 제조하기
본 실시예는, mRNA-캡슐화 지질 나노입자(mRNA-LNP) 제형에 헬퍼 지질로서 DEPE를 사용하면, 헬퍼 지질로서 (DOPE)를 포함하는 종래의 리포좀에 비해 최대 2배까지 mRNA로부터의 단백질 발현을 생체 내에서 증가시킬 수 있음을 예시한다. 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 mRNA-LNP가 헬퍼 지질로서 DOPE를 포함하는 동일한 mRNA-LNP와 비교하여 캡슐화 효율을 증가시킨다는 것이 또한 관찰되었다. 특히, 이러한 발현 강화 및 이러한 캡슐화 효율 강화는 상이한 양이온성 지질을 포함하는 매우 다양한 mRNA-LNP에 걸쳐 관찰되었다.
이들 연구에서, 헬퍼 지질로서 DEPE 또는 DOPE를 포함하고 표 4에 열거된 다양한 양이온성 지질을 포함하는 LNP에 OTC를 암호화하는 mRNA를 캡슐화하였다. 표 4에 기술된 각각의 양이온성 지질은, 각각의 지질에 대한 설명에서 끝자리 2개의 숫자로 표시된 것과 같이, C10, C12, C14, 또는 C16 길이의 4개의 알킬 사슬을 포함하였다. 양이온성 지질:DMG-PEG2K:콜레스테롤:헬퍼 지질의 몰비는 약 40:3:25:32였다. 연구의 생체 내 부분을 위해, 1 mg/kg의 각각의 제형화된 mRNA-LNP를 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 전달하였다. 24시간차에 마우스를 희생시키고, OTC를 암호화하는 mRNA의 생체 내 발현을 각 마우스의 간 균질물로부터 평가하였다. 평균 단백질 발현은 아래 표에 제공된다.
[표 4]
Figure pct00089
표 4는 헬퍼 지질로서 DOPE를 사용한 것에 비해 DEPE를 사용했을 때의 캡슐화 효율이 더 뛰어났음을 보여준다. 또한, 양이온성 지질로서 특정 리피도이드를 포함하는 다성분 지질 혼합물은 DOPE를 사용해서는 제형화조차 할 수 없었지만, 헬퍼 지질로서 DEPE를 사용했을 때 안정한 리포좀을 형성하였다는 것을 관찰하는 것은 놀라운 일이었다. 표 4는, 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 mRNA LNP는, 헬퍼 지질로서 DOPE를 포함하지만 그 외에는 동일한 mRNA LNP로부터의 단백질 발현과 비교했을 때 현저하게 더 높은 생체 내 단백질 발현을 나타냈다. 이는 다양한 양이온성 지질을 LNP에 사용한 경우에 해당하였다.
실시예 5. 다른 헬퍼 지질과 비교했을 때 헬퍼 지질로서 DEPE를 사용함으로써 강화된 생체 내 단백질 발현
본 실시예는, mRNA-캡슐화 지질 나노입자(mRNA-LNP)에 헬퍼 지질로서 DEPE를 사용하면, mRNA-LNP를 제조하는 데 사용된 다양한 캡슐화 방법에 걸쳐, 다른 유형의 헬퍼 지질을 사용하는 지질 나노입자에 비해 생체 내에서 mRNA의 발현을 증가시킬 수 있음을 예시한다.
이들 연구에서, PEG-변형 지질로서 DMG-PEG-2000, 양이온성 지질로서 cDD-TE-4-E12, 콜레스테롤, 및 DEPE를 포함하여 여러 가지 상이한 헬퍼 지질 중 하나를 표 5-1, 표 5-2, 표 5-3, 및 표 5-4에 표시된 것과 같은 몰 지질 비율로 포함하는 LNP(N/P = 4)에 OTC를 암호화하는 mRNA를 캡슐화하였다. 각각의 mRNA-LNP 제형은, 다음 4가지 상이한 캡슐화 방법 중 하나를 사용하여 제조하였다: 종래 방법, 표 5-1에 기술된 제형을 위한 방법, 표 5-2에 기술된 제형을 위한 리믹스 방법, 표 5-3에 기술된 제형을 위한 스텝업 리믹스 방법, 또는 표 5-4에 기술된 제형을 위한 스텝 다운 리믹스 방법. mRNA-LNP를 LNP 크기, 다중분산성, 및 캡슐화 백분율에 대해 평가하고, 이들 각각에 대한 결과를 아래 표에 제시하였다. 연구의 생체 내 부분을 위해, 1 mg/kg의 각각의 제형화된 mRNA-LNP를 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 전달하였다(n=5). 24시간차에 마우스를 희생시키고, OTC를 암호화하는 mRNA의 생체 내 발현을 각 마우스의 간 균질물로부터 평가하였다. 평균 단백질 발현은 아래 표에 제공된다.
[표 5-1]
Figure pct00090
[표 5-2]
Figure pct00091
[표 5-3]
Figure pct00092
[표 5-4]
Figure pct00093
표 5-1, 표 5-2, 표 5-3, 및 표 5-4는 LNP에 캡슐화한 mRNA를 마우스 그룹에게 전달한 후 24시간차에 상기 mRNA에 의한 단백질 발현 수준을 보여준다. 나타낸 바와 같이, 헬퍼 지질 DOPE 또는 DEPE를 사용해 제조한 LNP만이 상이한 캡슐화 방법에 걸쳐 단백질 발현의 측면에서 효능을 제공하였다. 특히, 생체 내 단백질 발현은 mRNA-LNP를 제조하는 데 사용된 캡슐화 방법과 상관없이, LNP를 제조하기 위한 헬퍼 지질로서 DEPE를 사용할 때 가장 높았다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 헬퍼 지질로서 DEPE를 포함하는 mRNA LNP의 이러한 증가된 효험 그러나 비슷한 안전성과 효능은 치료제로서 mRNA를 전달하는 데 상당한 이점을 제공한다.
균등물
당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에서 설명되는 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.

Claims (50)

  1. mRNA의 전달을 필요로 하는 대상체에게 이를 전달하기 위한 지질 나노입자로서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하되, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하는, 지질 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 지질 나노입자를 대상체에게 투여하면, 상이한 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고 DEPE는 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 지질 성분과 양을 갖는 제2 지질 나노입자에서의 동일한 mRNA의 발현과 비교했을 때, mRNA의 발현이 강화되는, 지질 나노입자.
  3. 제2항에 있어서, 상이한 하나 이상의 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 및/또는 이들의 조합을 포함하는, 지질 나노입자.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 발현은 제2 지질 나노입자에 비해 적어도 2배 강화되는, 지질 나노입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자 내 DEPE는 10 몰% 내지 50 몰%의 농도로 존재하는, 지질 나노입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 각각의 길이가 C10-C16인 1개 내지 4개의 알킬 사슬이거나 이를 포함하는, 지질 나노입자.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 4개의 지방족 사슬을 포함하는 리피도이드인, 지질 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 다음 화학식의 양이온성 지질:
    Figure pct00094

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함하며;
    식 중 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 지방족이고; 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 값을 갖는 정수이고; 각각의 A는 독립적으로 공유 결합 또는 아릴렌이고; 각각의 L1은 독립적으로 에스테르 기, 티오에스테르 기, 이황화 기 또는 무수물 기이고; 각각의 L2는 독립적으로 C2-C10 지방족이고; 각각의 X1은 독립적으로 H 또는 OH이며; 각각의 R3은 독립적으로 C6-C20인, 지질 나노입자.
  9. 제8항에 있어서, 식 중 각각의 R3은 독립적으로 C8-C16 지방족인, 지질 나노입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬을 포함하는, 지질 나노입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스테롤을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 스테롤은 콜레스테롤계 지질을 포함하는, 지질 나노입자.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤 및/또는 PEG화 콜레스테롤인, 지질 나노입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 생체 내에서 치료 단백질 또는 펩티드로 번역되는 단백질을 암호화하는 mRNA인, 지질 나노입자.
  15. 제14항에 있어서, 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA는 전신 전달되며, 번역된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 24시간차 또는 그 이후에 간 또는 혈청에서 검출 가능한, 지질 나노입자.
  16. 제15항에 있어서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드인, 지질 나노입자.
  17. 제16항에 있어서, 치료 폴리펩티드는 (a) 항체 경쇄 또는 항체 중쇄이거나, (b) 대상체에게 없거나 결핍된 폴리펩티드인, 지질 나노입자.
  18. 제14항에 있어서, 단백질을 암호화하는 mRNA는 펩티드를 암호화하는, 지질 나노입자.
  19. 제18항에 있어서, 펩티드는 항원인, 지질 나노입자.
  20. mRNA의 전달을 필요로 하는 대상체에게 mRNA를 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 지질 나노입자를 대상체에게 투여하면, 상이한 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고 DEPE는 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 지질 성분과 양을 갖는 제2 지질 나노입자로부터의 동일한 mRNA의 발현과 비교했을 때, mRNA의 발현이 강화되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상이한 하나 이상의 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 및/또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 발현은 제2 지질 나노입자에 비해 적어도 2배 강화되는, 지질 나노입자.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자 내 DEPE는 10 몰% 내지 50 몰%의 농도로 존재하는, 지질 나노입자.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 cKK-E12이거나 이를 포함하는, 방법.
  26. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 이미다졸 콜레스테롤 에스테르(ICE)이거나 이를 포함하는, 방법.
  27. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 다음 화학식의 양이온성 지질:
    Figure pct00095

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함하며;
    식 중 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 지방족이고; 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 값을 갖는 정수이고; 각각의 A는 독립적으로 공유 결합 또는 아릴렌이고; 각각의 L1은 독립적으로 에스테르 기, 티오에스테르 기, 이황화 기 또는 무수물 기이고; 각각의 L2는 독립적으로 C2-C10 지방족이고; 각각의 X1은 독립적으로 H 또는 OH이며; 각각의 R3은 독립적으로 C6-C20인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 양이온성 지질은 화합물 1이거나 이를 포함하는, 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬이거나 이를 포함하는, 방법.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스테롤을 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 하나 이상의 스테롤은 콜레스테롤계 지질을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤 및/또는 PEG화 콜레스테롤인, 방법.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 생체 내에서 치료 단백질로 번역되는 단백질을 암호화하는 mRNA인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 단백질을 암호화하는 mRNA는 폴리펩티드를 암호화하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 치료 폴리펩티드는 (a) 항체 경쇄 또는 항체 중쇄이거나, (b) 대상체에게 없거나 결핍된 폴리펩티드인, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 단백질을 암호화하는 mRNA는 펩티드를 암호화하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 펩티드는 항원인, 방법.
  39. mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 PEG-변형 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질의 혼합물을 제공하는 단계로서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)을 포함하는, 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 제공된 혼합물로부터 지질 나노입자를 형성하는 단계를 포함하되;
    상기 방법은 mRNA를 지질 나노입자 내로 캡슐화하는 단계를 추가로 포함하고, 캡슐화는 단계 (b)에서 지질 나노입자가 형성되기 전 또는 후에 이루어지는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 안정적인, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 및/또는 이들의 조합 중 어느 하나를 포함하지 않는, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, DEPE는 10 몰% 내지 50 몰%의 농도로 혼합물에 존재하는, 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 내 하나 이상의 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬이거나 이를 포함하는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물은 하나 이상의 스테롤을 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 하나 이상의 스테롤은 콜레스테롤계 지질을 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤 및/또는 PEG화 콜레스테롤인, 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 치료 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화하는, 방법.
  48. 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 미리 형성된 지질 나노입자 내로 캡슐화되는, 방법.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 mRNA의 캡슐화 전 및/또는 후에 지질 나노입자를 접선 유동 여과(TFF)로 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 지질 나노입자를 트레할로스 용액에서 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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