TWI773666B - Crispr/cas 組分之脂質奈米粒子調配物 - Google Patents

Abstract

本發明提供可用於遞送CRISPR/Cas基因編輯組分之基於脂質奈米粒子之組合物及方法。

Description

CRISPR/CAS組分之脂質奈米粒子調配物

生物活性劑(包括治療相關化合物)難以到達標靶細胞或組織經常阻礙該等試劑遞送至個體。詳言之，許多生物活性劑進入活細胞可能受到細胞之膜系統限制。 尤其難以遞送至細胞之一類生物活性劑為生物製品，包括蛋白質、基於核酸之藥物及其衍生物。某些核酸及蛋白質在細胞或血漿中僅穩定有限持續時間，且有時帶高電荷，此可能使跨越細胞膜之遞送複雜。因此尤其關注可穩定化此類試劑且遞送此類試劑至細胞之組合物。脂質載劑、可生物降解之聚合物及各種結合系統可用於改善此等生物活性劑遞送至細胞。 現存在許多在活體內在細胞中編輯基因之組分及組合物，提供治療遺傳疾病、病毒性疾病、細菌性疾病、自體免疫疾病、癌症、衰老相關疾病及發炎性疾病之巨大潛能。若干此等編輯技術利用修復由諸如兆核酸酶、規律成簇之間隔短回文重複(CRISPR)相關(「Cas」)核酸酶、鋅指核酸酶(「ZFN」)及轉錄活化因子樣效應核酸酶(「TALEN」)之酶造成之雙鏈斷裂(「DSB」)的細胞機理。當在細胞中造成DSB時，細胞可藉由若干過程之一修復斷裂。一種此類過程包括DNA裂解末端之非同源末端接合(「NHEJ」)。在NHEJ期間，可藉由細胞添加或移除核苷酸，產生自裂解序列改變之序列。在其他情形下，細胞藉由同源定向修復(「HDR」)或同源重組(「HR」)機制修復DSB，其中與DSB之各末端同源之內源性或外源性模板例如用於直接修復斷裂。若干此等編輯技術利用修復單鏈斷裂或雙鏈斷裂(「DSB」)之細胞機理。 CRISPR/Cas基因編輯系統在細胞中呈核糖核蛋白複合物發揮活性。需要用於遞送CRISPR/Cas之蛋白質及核酸組分至細胞，諸如患者中之細胞的組合物。

本文中提供可用於遞送CRISPR/Cas基因編輯組分之基於脂質奈米粒子之組合物。 在一些實施例中，本文中提供一種產生經基因工程改造之肝細胞的方法，其包括使細胞與包含以下之脂質奈米粒子(LNP)接觸：2類Cas核酸酶mRNA；指導RNA核酸；CCD脂質；輔助脂質；中性脂質；及隱形脂質。亦提供包含2類Cas核酸酶mRNA、指導RNA核酸、CCD脂質、輔助脂質、中性脂質及隱形脂質之脂質奈米粒子(LNP)。 其他實施例提供一種基因編輯方法，其包括遞送2類Cas核酸酶mRNA及指導RNA核酸至肝細胞，其中將該2類Cas mRNA及該指導RNA核酸調配成包含以下之至少一種LNP組合物：CCD脂質；輔助脂質；中性脂質；及隱形脂質。其他實施例提供一種將CRISPR-Cas複合物投與肝細胞之方法，其包括使細胞與包含以下之LNP接觸：2類Cas核酸酶mRNA；指導RNA核酸；CCD脂質；輔助脂質；中性脂質；及隱形脂質。 在某些實施例中，提供一種改變肝細胞中之基因表現之方法，其包括向個體投與治療有效量之呈一或多種LNP調配物形式的2類Cas核酸酶mRNA及指導RNA核酸，其中至少一種LNP調配物包含：指導RNA核酸或2類Cas核酸酶mRNA；CCD脂質；輔助脂質；中性脂質；及隱形脂質。 在一些實施例中，產生經基因工程改造之肝細胞的方法包括使細胞與包含以下之脂質奈米粒子(LNP)接觸：2類Cas核酸酶mRNA；指導RNA核酸，其為或編碼單指導RNA (sgRNA)；CCD脂質；輔助脂質；中性脂質；及隱形脂質。 在某些態樣中，將2類Cas核酸酶mRNA調配於第一LNP組合物中且將指導RNA核酸調配於第二LNP組合物中。在其他態樣中，將2類Cas核酸酶mRNA及指導RNA核酸一起調配成LNP組合物。

本申請案主張2016年3月30日申請之美國臨時專利申請案No. 62/315,602、2016年8月16日申請之美國臨時專利申請案No. 62/375,776、2016年12月12日申請之美國臨時專利申請案No. 62/433,228及2017年3月7日申請之美國臨時專利申請案No. 62/468,300的優先權益，各臨時專利申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。 本發明提供用於遞送至細胞之CRISPR/Cas組分(「運載物」)之脂質奈米粒子(LNP)組合物的實施例及其使用方法。LNP可含有(i) CCD脂質、(ii)中性脂質、(iii)輔助脂質及(iv)隱形脂質。在某些實施例中，運載物包括編碼Cas核酸酶(諸如Cas9)之mRNA及指導RNA或編碼指導RNA之核酸。CRISPR/Cas 運載物 經由LNP調配物遞送之CRISPR/Cas運載物包括編碼Cas核酸酶之mRNA分子，其允許細胞中表現Cas核酸酶。運載物進一步含有一或多種指導RNA或編碼指導RNA之核酸。運載物可進一步包括用於修復或重組之模板核酸。Cas 核酸酶 所揭示之調配物之一種組分為編碼Cas核酸酶之mRNA，亦稱為Cas核酸酶mRNA。mRNA可經修飾以提高穩定性及/或免疫原性特性。可對mRNA內之一或多個核苷進行修飾。對mRNA核鹼基進行之化學修飾的實例包括假尿嘧啶核苷、1-甲基-假尿嘧啶核苷及5-甲基-胞嘧啶核苷。涵蓋已知提高穩定性、表現及免疫原性之其他修飾。編碼Cas核酸酶之mRNA可進行密碼子優化，以在諸如真核細胞、哺乳動物細胞或更特定人類細胞之特定細胞類型中表現。在一些實施例中，mRNA編碼人類密碼子優化之Cas9核酸酶或作為Cas核酸酶的人類密碼子優化之Cpf核酸酶。在一些實施例中，mRNA經純化。在一些實施例中，mRNA係使用沈澱法(例如LiCl沈澱、醇沈澱或同等方法，例如如本文中所述)純化。在一些實施例中，mRNA係使用基於層析之方法，諸如基於HPLC之方法或同等方法(例如如本文中所述)純化。在一些實施例中，mRNA係使用沈澱法(例如LiCl沈澱)與基於HPLC之方法兩者純化。 除Cas核酸酶之編碼序列之外，mRNA可包含3'或5'非轉譯區(UTR)。在一些實施例中，3'或5' UTR可來源於人類基因序列。示例性3'及5' UTR包括α-球蛋白及β-球蛋白、白蛋白、HSD17B4及真核延伸因子1α。另外，亦可使用病毒來源之5'及3' UTR且包括正痘病毒(orthopoxvirus)及細胞巨大病毒UTR序列。在某些實施例中，mRNA包括5'帽，諸如m7G(5')ppp(5')N。另外，此帽可為其中核苷酸N不含2'OMe之帽-0，或其中核苷酸N含有2'OMe之帽-1，或其中核苷酸N及N+1含有2'OMe之帽-2。此帽亦可具有結構m₂ ^7,3'-O G(5')N，如抗反向帽類似物(ARCA)所併入，且亦可包括類似帽-0、帽-1及帽-2等結構。在一些實施例中，5'帽可調控核輸出；阻止核酸外切酶降解；促進轉譯；及促進5'近端內含子切除。帽之穩定化元件包括硫代磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯修飾及亞甲橋。另外，帽亦可含有充當真核轉譯起始因子4E eIF4E之結合劑之非核酸實體。在某些實施例中，mRNA包括聚(A)尾。此尾長度可為約40至約300個核苷酸。在一些實施例中，尾長度可為約40至約100個核苷酸。在一些實施例中，尾長度可為約100至約300個核苷酸。在一些實施例中，尾長度可為約100至約300個核苷酸。在一些實施例中，尾長度可為約50至約200個核苷酸。在一些實施例中，尾長度可為約50至約250個核苷酸。在某些實施例中，尾長度可為約100、150或200個核苷酸。聚(A)尾可含有阻止核酸外切酶降解之修飾，包括硫代磷酸酯鍵，及對核鹼基之修飾。另外，聚(A)尾可含有3'「帽」，其可包括經修飾或非天然核鹼基或其他合成部分。 本文中描述之mRNA可包含至少一個能夠改變RNA之細胞內半衰期的元件。在一些實施例中，可增加RNA之半衰期。在一些實施例中，可減少RNA之半衰期。在一些實施例中，元件能夠增加RNA之穩定性。在一些實施例中，元件能夠降低RNA之穩定性。在一些實施例中，元件可促進RNA衰變。在一些實施例中，元件可活化轉譯。在一些實施例中，元件可在RNA之3' UTR內。舉例而言，元件可為mRNA衰變信號。在一些實施例中，元件可包括聚腺苷酸化信號(PA)。在一些實施例中，PA可在RNA之3' UTR內。在一些實施例中，RNA可不包含PA，使得其在細胞中在轉錄後更快地降解。在一些實施例中，元件可包括至少一個富含AU之元件(ARE)。在一些實施例中，元件不包括ARE。ARE可藉由ARE結合蛋白(ARE-BP)以視組織類型、細胞類型、時間選擇、細胞定位及環境而定的方式結合。在一些實施例中，ARE長度可包含50至150個核苷酸。在一些實施例中，ARE可包含序列AUUUA之至少一個複本。在一些實施例中，至少一個ARE可添加至RNA之3' UTR。在一些實施例中，元件可為旱獺肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHV)轉錄後調控元件(WPRE)，其產生增強自轉錄物表現之三級結構。在一些實施例中，WPRE可添加至RNA之3' UTR。在一些實施例中，元件可選自存在於快速或緩慢衰變轉錄物中之其他RNA序列基元。在一些實施例中，各元件可單獨使用。在一些實施例中，元件可與一或多個元件組合使用。 在一些實施例中，由遞送之mRNA編碼之核酸酶可包括來自CRISPR/Cas系統之Cas蛋白質。Cas蛋白質可包含至少一個與指導RNA (「gRNA」)相互作用之結構域。另外，Cas蛋白質可藉由指導RNA引導至標靶序列。指導RNA與Cas蛋白以及標靶序列相互作用，使得其引導與標靶序列之結合。在一些實施例中，指導RNA提供對所靶向之裂解的特異性，且Cas蛋白質可通用且與不同指導RNA配對以裂解不同標靶序列。在某些實施例中，Cas蛋白質可裂解單鏈或雙鏈DNA。在某些實施例中，Cas蛋白質可裂解RNA。在某些實施例中，Cas蛋白質可切割RNA。在一些實施例中，Cas蛋白質包含至少一個DNA結合域及至少一個核酸酶結構域。在一些實施例中，核酸酶結構域可與DNA結合域異源。在某些實施例中，Cas蛋白質可經修飾以降低或消除核酸酶活性。Cas蛋白質可用於結合於DNA序列且調節DNA序列之表現或活性。 在一些實施例中，CRISPR/Cas系統可包含1類或2類系統組分，包括核糖核酸蛋白複合物。參見例如Makarova等人,Nat Rev Microbiol , 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人,Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。2類CRISPR/Cas系統具有單蛋白效應子。II、V及VI類型之Cas蛋白質可為單蛋白之RNA指導之核酸內切酶，本文中稱為「2類Cas核酸酶」。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白質。Cpf1蛋白質(Zetsche等人,Cell , 163: 1-13 (2015))與Cas9同源，且含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列以引用的方式全部併入。參見例如Zetsche, 表S1及S3。 在一些實施例中，Cas蛋白質可來自II類CRISPR/Cas系統，亦即來自CRISPR/Cas9系統之Cas9蛋白質，或來自V型CRISPR/Cas系統，例如Cpf1蛋白質。在一些實施例中，Cas蛋白質可來自2類CRISPR/Cas系統，亦即單蛋白Cas核酸酶，諸如Cas9蛋白或Cpf1蛋白。蛋白質之2類Cas核酸酶家族為具有DNA核酸內切酶活性之酶，且其可藉由設計適當指導RNA來引導至使所需核酸標靶裂解，如本文中進一步描述。 2類CRISPR/Cas系統組分可來自IIA型、IIB型、IIC型、V型或VI型系統。涵蓋Cas9及其直系同源物。Cas9蛋白質或其他組分可來自之非限制性示例性物種包括化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes )、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、鏈球菌屬(Streptococcus sp. )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua )、加塞里乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri )、新兇手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida )、產琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes )、華德薩特菌(Sutterella wadsworthensis )、γ變形菌(Gamma proteobacterium )、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis )、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni )、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida )、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogene )、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum )、達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei )、始旋鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiralis )、綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes )、綠色產色鏈黴菌、粉紅鏈孢囊菌(Streptosporangium roseum )、酸熱脂環酸桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius )、假真菌樣芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides )、還原硒酸鹽芽胞桿菌(Bacillus selenitireducens )、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum )、德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii )、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius )、布氏乳酸桿菌(Lactobacillus buchneri )、齒垢密螺旋體(Treponema denticola )、海洋微隕菌(Microscilla marina )、伯克氏菌(Burkholderiales bacterium )、食萘極地單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans )、極地單胞菌屬(Polaromonas sp. )、瓦氏鱷球藻(Crocosphaera watsonii )、藍桿藻屬(Cyanothece sp. )、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa )、聚球藻屬(Synechococcus sp. )、阿拉伯糖醋桿菌(Acetohalobium arabaticum )、降解制氨菌屬(Ammonifex degensii )、貝氏熱解纖維素菌(Caldicelulosiruptor becscii )、脫硫柑橘黃龍菌(Candidatus Desulforudis )、肉毒桿菌(Clostridium botulinum )、艱難梭菌(Clostridium difficile )、大芬戈爾德菌(Finegoldia magna )、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus )、喜溫丙酸醱酵菌(Pelotomaculum thermopropionium )、喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus )、氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans )、酒色著色菌(Allochromatium vinosum )、海桿菌屬(Marinobacter sp. )、嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus )、沃氏亞硝化球菌(Nitrosococcus watsoni )、遊海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis )、消旋纖線桿菌(Ktedonobacter racemifer )、調查甲烷鹽菌(Methanohalobium evestigatum )、多變魚腥藻(Anabaena variabilis )、泡沫節球藻(Nodularia spumigena )、念珠藻屬(Nostoc sp. )、極大節旋藻(Arthrospira maxima )、鈍頂節旋藻(Arthrospira platensis )、節旋藻屬(Arthrospira sp. )、鞘絲藻屬(Lyngbya sp. )、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes )、顫藻屬(Oscillatoria sp. )、活動石袍菌(Petrotoga mobilis )、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus )、巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus )、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea )、海鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari )、食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans )、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria )或深海單細胞藍藻(Acaryochloris marina )。在一些實施例中，Cas9蛋白質可來自化膿性鏈球菌。在一些實施例中，Cas9蛋白質可來自嗜熱鏈球菌。在一些實施例中，Cas9蛋白質可來自金黃色葡萄球菌。在其他實施例中，Cpf1蛋白質可來自土拉熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis )、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium )、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus )、外來細菌(Peregrinibacteria bacterium )、帕克菌(Parcubacteria bacterium )、史密斯氏菌屬(Smithella )、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus )、產甲烷菌暫定種(Candidatus Methanoplasma termitum )、挑剔真桿菌(Eubacterium eligens )、牛眼莫拉菌(Moraxella bovoculi )、稻田氏鉤端螺旋體(Leptospira inadai )、狗口腔卟啉單胞菌(Porphyromonas crevioricanis )、解糖腖普雷沃氏菌(Prevotella disiens )或彌猴卟啉單胞菌(Porphyromonas macacae )。在某些實施例中，Cpf1蛋白質可來自胺基酸球菌屬或毛螺科菌。 在一些實施例中，2類Cas核酸酶可包含至少一個RuvC樣核酸酶結構域，諸如Cas9或Cpf1蛋白質。在一些實施例中，2類Cas核酸酶可包含超過一個核酸酶結構域。舉例而言，2類Cas核酸酶可包含至少一個RuvC樣核酸酶結構域及至少一個HNH樣核酸酶結構域。在一些實施例中，2類Cas核酸酶能夠將DSB引入標靶序列中。在一些實施例中，2類Cas核酸酶可經修飾以僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，2類Cas核酸酶可經修飾，使得核酸酶結構域之一進行突變或完全或部分缺失，從而降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，2類Cas核酸酶可經修飾以不含功能性RuvC樣核酸酶結構域。在其他實施例中，例如Cas9蛋白質之2類Cas核酸酶可經修飾以不含功能性HNH樣核酸酶結構域。在僅一個核酸酶結構域為功能性之一些實施例中，2類Cas核酸酶可為能夠將單鏈斷裂(「裂痕」)引入標靶序列中之切割酶。在一些實施例中，2類Cas核酸酶之核酸酶結構域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，核酸酶結構域突變可使DNA裂解活性不活化。在一些實施例中，核酸酶結構域突變可使2類Cas核酸酶之一個核酸酶結構域不活化，產生切割酶。在一些實施例中，切割酶可在RuvC樣核酸酶結構域中包含胺基酸取代。RuvC樣核酸酶結構域中之示例性胺基酸取代包括D10A (基於化膿性鏈球菌Cas9蛋白質，參見例如UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1))。其他示例性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。在一些實施例中，切割酶可在HNH樣核酸酶結構域中包含胺基酸取代。HNH樣核酸酶結構域中之示例性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於化膿性鏈球菌Cas9蛋白質)。示例性突變改變核酸酶結構域中之保守催化殘基且改變結構域之核溶解活性。在一些實施例中，本文中描述之核酸酶系統可包含切割酶及一對指導RNA，該對指導RNA分別與標靶序列之有義及反義鏈互補。指導RNA可藉由在標靶序列之相反鏈上產生裂痕(亦即雙重切割)來引導切割酶靶向且引入DSB。亦可使用嵌合2類Cas核酸酶，其中蛋白質之一個結構域或區域經不同蛋白質之一部分替代。舉例而言，核酸酶結構域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶之結構域替代。在某些實施例中，2類Cas核酸酶可經修飾以降低或消除核酸酶活性。其可用於結合於DNA序列且調節DNA序列之表現或活性。 在替代實施例中，Cas蛋白質可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。舉例而言，Cas蛋白質可為Cas3蛋白質。在一些實施例中，Cas蛋白質可來自II型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質可來自IV型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質可來自V型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質可來自VI型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質可具有RNA裂解活性。 在一些實施例中，核酸酶可與至少一個異源蛋白質結構域融合。至少一個蛋白質結構域可位於核酸酶之N端、C端或內部位置。在一些實施例中，兩個或更多個異源蛋白質結構域在核酸酶上之一或多個位置上。 在一些實施例中，蛋白質結構域可促進核酸酶輸送至細胞之細胞核中。舉例而言，蛋白質結構域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，核酸酶可與1-10個NLS融合。在一些實施例中，核酸酶可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，核酸酶可與1個NLS融合。在使用一個NLS情況下，NLS可在核酸酶之N端或C端上。在其他實施例中，核酸酶可與超過1個NLS融合。在一些實施例中，核酸酶可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，核酸酶可與兩個NLS融合。在某些情形下，兩個NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，核酸酶與兩個SV40 NLS序列在羧基端融合。在一些實施例中，核酸酶可與兩個NLS融合，一個在N端且一個在C端。在一些實施例中，核酸酶可與3個NLS融合。在一些實施例中，核酸酶可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單向序列，諸如SV40 NLS、PKKKRKV或PKKKRRV。在一些實施例中，NLS可為雙向序列，諸如核質蛋白之NLS KRPAATKKAGQAKKKK。在一特定實施例中，單一PKKKRKV NLS可在核酸酶之C端。 在一些實施例中，蛋白質結構域能夠改變核酸酶之細胞內半衰期。在一些實施例中，可增加核酸酶之半衰期。在一些實施例中，可減少核酸酶之半衰期。在一些實施例中，蛋白質結構域能夠增加核酸酶之穩定性。在一些實施例中，蛋白質結構域能夠降低核酸酶之穩定性。在一些實施例中，蛋白質結構域可充當蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可藉由蛋白水解酶，諸如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶介導。在一些實施例中，蛋白質結構域可包含PEST序列。在一些實施例中，核酸酶可藉由添加泛素或聚泛素鏈來修飾。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白質(UBL)。泛素樣蛋白質之非限制性實例包括小泛素樣修飾因子(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱干擾素刺激之基因-15 (ISG15))、泛素相關之修飾因子-1 (URM1)、神經元前驅細胞表現之發育下調蛋白-8 (NEDD8，在釀酒酵母中亦稱為Rub1)、人類白細胞抗原F相關(FAT10)、自我吞噬-8 (ATG8)及自我吞噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素摺疊修飾因子-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。 在一些實施例中，蛋白質結構域可為標記物結構域。標記物結構域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、抗原決定基標籤及報導基因序列。在一些實施例中，標記物結構域可為螢光蛋白質。適合螢光蛋白之非限制性實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami綠、Monomeric Azami綠、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色螢光蛋白 (mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他適合螢光蛋白。在其他實施例中，標記物結構域可為純化標籤及/或抗原決定基標籤。非限制性示例性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、殼多糖結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚-His及鈣調素。非限制性示例性報導基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、螢光素酶或螢光蛋白。 在其他實施例中，蛋白質結構域可使核酸酶靶向至特定細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，蛋白質結構域可使核酸酶靶向粒線體。 在其他實施例中，蛋白質結構域可為效應結構域。當核酸酶經指導至其標靶序列時，例如當Cas9蛋白質藉由指導RNA指導至標靶序列時，效應結構域可修飾或影響標靶序列。在一些實施例中，效應結構域可選自核酸結合域、核酸酶結構域、表觀遺傳修飾結構域、轉錄活化結構域、甲基化結構域或轉錄抑制結構域。指導 RNA 在本發明之一些實施例中，LNP調配物之運載物包括至少一種指導RNA。指導RNA可指導2類Cas核酸酶至標靶核酸分子上之標靶序列，其中指導RNA與標靶序列雜交且Cas核酸酶裂解或調節標靶序列。在一些實施例中，指導RNA與2類核酸酶結合且提供2類核酸酶之裂解特異性。在一些實施例中，指導RNA及Cas蛋白質可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas複合物。在一些實施例中，CRISPR複合物可為II類CRISPR/Cas9複合物。在一些實施例中，CRISPR/Cas複合物可為V型CRISPR/Cas複合物，諸如Cpf1/指導RNA複合物。在一些實施例中，Cas核酸酶可為單蛋白Cas核酸酶，例如Cas9蛋白或Cpf1蛋白。在一些實施例中，指導RNA靶向Cas9蛋白裂解。 CRISPR/Cas9核酸酶系統之指導RNA包含CRISPR RNA (crRNA)及tracr RNA (tracr)。在一些實施例中，crRNA可包含與標靶核酸分子上之標靶序列互補且雜交之靶向序列。crRNA亦可包含與tracrRNA一部分互補且雜交之旗桿(flagpole)。在一些實施例中，crRNA可類似於自細菌之CRISPR基因座轉錄的天然存在之crRNA之結構，其中靶向序列充當CRISPR/Cas9系統之間隔子，且旗桿對應於側接CRISPR基因座上間隔子之重複序列一部分。 指導RNA可經由crRNA之靶向序列靶向任何相關序列。在一些實施例中，指導RNA之靶向序列與標靶核酸分子上之標靶序列之間的互補程度可為約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，指導RNA之靶向序列與標靶核酸分子上之標靶序列可100%互補。在其他實施例中，指導RNA之靶向序列與標靶核酸分子上之標靶序列可含有至少一個錯配。舉例而言，指導RNA之靶向序列與標靶核酸分子上之標靶序列可含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9或10個錯配。在一些實施例中，指導RNA之靶向序列與標靶核酸分子上之標靶序列可含有1-6個錯配。在一些實施例中，指導RNA之靶向序列與標靶核酸分子上之標靶序列可含有5或6個錯配。 靶向序列之長度可視所用CRISPR/Cas系統及組分而定。舉例而言，來自不同細菌物種之不同Cas蛋白質具有變化之最佳靶向序列長度。因此，靶向序列長度可包含5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個或超過50個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列長度可包含18-24個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列長度可包含19-21個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列長度可包含20個核苷酸。 旗桿可包含與tracr RNA具有足夠互補性之任何序列以促進功能性CRISPR/Cas複合物之形成。在一些實施例中，旗桿可包含與相同CRISPR/Cas系統中tracr RNA互補之天然存在之crRNA的所有或一部分序列(亦稱為「標籤」或「把手」)。在一些實施例中，旗桿可包含來自天然存在之CRISPR/Cas系統之所有或一部分重複序列。在一些實施例中，旗桿可包含截短或修飾之標籤或把手序列。在一些實施例中，沿著兩個序列中較短者之長度，tracr RNA與同tracr RNA雜交之旗桿部分之間的互補程度可為約40%、50%、60%、70%、80%或更高，但低於100%。在一些實施例中，沿著兩個序列中較短者之長度，tracr RNA與同tracr RNA雜交之旗桿部分不100%互補，因為tracr上存在一或多個凸起結構及/或tracr與旗桿之間存在擺動鹼基配對。旗桿之長度可視所用CRISPR/Cas系統或tracr RNA而定。舉例而言，旗桿長度可包含10-50個核苷酸或超過50個核苷酸。在一些實施例中，旗桿長度可包含15-40個核苷酸。在其他實施例中，旗桿長度可包含20-30個核苷酸。在其他實施例中，旗桿長度可包含22個核苷酸。舉例而言，當使用雙指導RNA時，旗桿長度可無上限。 在一些實施例中，tracr RNA可包含來自天然存在之CRISPR/Cas系統之所有或一部分野生型tracr RNA序列。在一些實施例中，tracr RNA可包含野生型tracr RNA之截短或修飾變異體。tracr RNA之長度可視所用CRISPR/Cas系統而定。在一些實施例中，tracr RNA長度可包含5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個或超過100個核苷酸。在某些實施例中，tracr長度為至少26個核苷酸。在其他實施例中，tracr長度為至少40個核苷酸。在一些實施例中，tracr RNA可包含某些二級結構，諸如一或多個髮夾或莖環結構，或一或多個凸起結構。 在一些實施例中，指導RNA可包含兩個RNA分子且在本文中稱為「雙指導RNA」或「dgRNA」。在一些實施例中，dgRNA可包含有包含crRNA之第一RNA分子及包含tracr RNA之第二RNA分子。第一及第二RNA分子可經由crRNA上旗桿與tracr RNA之間的鹼基配對而形成RNA雙鏈體。 在其他實施例中，指導RNA可包含單個RNA分子且在本文中稱為「單指導RNA」或「sgRNA」。在一些實施例中，sgRNA可包含與tracr RNA共價連接之crRNA。在一些實施例中，crRNA及tracr RNA可經由連接子共價連接。在一些實施例中，單分子指導RNA可包含經由crRNA上之旗桿與tracr RNA之間的鹼基配對所形成之莖環結構。在一些實施例中，sgRNA為能夠介導RNA指導之Cas9蛋白質對DNA之裂解的「Cas9 sgRNA」。在一些實施例中，sgRNA為能夠介導RNA指導之Cpf1蛋白質對DNA之裂解的「Cpf1 sgRNA」。在某些實施例中，指導RNA包含足以與Cas9蛋白質形成活性複合物且介導RNA指導之DNA裂解的crRNA及tracr RNA。在某些實施例中，指導RNA包含足以與Cpf1蛋白質形成活性複合物且介導RNA指導之DNA裂解的crRNA。參見Zetsche 2015。 本發明之某些實施例亦提供編碼本文中描述之指導RNA的核酸，例如表現卡匣。「指導RNA核酸」在本文中用以指指導RNA (例如sgRNA或dgRNA)及指導RNA表現卡匣(其為編碼一或多種指導RNA之核酸)。 在一些實施例中，核酸可為DNA分子。在一些實施例中，核酸可包含編碼crRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼crRNA之核苷酸序列包含經來自天然存在之CRISPR/Cas系統之所有或一部分重複序列側接的靶向序列。在一些實施例中，核酸可包含編碼tracr RNA之核苷酸序列。在一些實施例中，crRNA及tracr RNA可藉由兩個分開核酸編碼。在其他實施例中，crRNA及tracr RNA可藉由單個核酸編碼。在一些實施例中，crRNA及tracr RNA可藉由相反鏈之單個核酸編碼。在其他實施例中，crRNA及tracr RNA可藉由相同鏈之單個核酸編碼。在一些實施例中，表現卡匣編碼sgRNA。在一些實施例中，表現卡匣編碼Cas9核酸酶sgRNA。在一些實施例中，表現卡匣編碼Cpf1核酸酶sgRNA。 編碼指導RNA之核苷酸序列可操作地連接至至少一個轉錄或調控控制序列，諸如啟動子、3' UTR或5' UTR。在一個實例中，啟動子可為tRNA啟動子，例如tRNA^Lys3 或tRNA嵌合體。參見Mefferd等人,RNA . 2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic Acids Res . 2007 35: 2620-2628。在某些實施例中，啟動子可由RNA聚合酶III (Pol III)識別。Pol III啟動子之非限制性實例亦包括U6及H1啟動子。在一些實施例中，編碼指導RNA之核苷酸序列可操作地連接至小鼠或人類U6啟動子。在一些實施例中，表現卡匣為經修飾之核酸。在某些實施例中，表現卡匣包括經修飾之核苷或核苷酸。在一些實施例中，表現卡匣包括5'端修飾，例如經修飾以穩定化表現卡匣且防止其整合之核苷或核苷酸。在一些實施例中，表現卡匣包含在各鏈上具有5'端修飾之雙鏈DNA。在某些實施例中，表現卡匣包括反向雙去氧-T或反向無鹼基核苷或核苷酸作為5'端修飾。在一些實施例中，表現卡匣包括標記，諸如生物素、脫硫生物素-TEG、毛地黃毒苷及螢光標記物，包括例如FAM、ROX、TAMRA及AlexaFluor。 在某些實施例中，超過一種指導RNA可與CRISPR/Cas核酸酶系統一起使用。各指導RNA可含有不同靶向序列，使得CRISPR/Cas系統裂解超過一種標靶序列。在一些實施例中，一或多種指導RNA可具有相同或不同特性，諸如在CRISPR/Cas複合物內之活性或穩定性。在使用超過一種指導RNA下，各指導RNA可在相同或不同表現卡匣上編碼。用於驅動超過一種指導RNA之表現的啟動子可相同或不同。化學修飾之 RNA 經修飾之核苷或核苷酸可存在於指導RNA或mRNA中。包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸的指導RNA或編碼Cas核酸酶之mRNA稱為「經修飾」之RNA，以描述存在一或多種代替典型A、G、C及U殘基或除此之外使用的非天然存在及/或天然存在之組分或組態。在一些實施例中，經修飾之RNA用非典型核苷或核苷酸合成，此處稱為「經修飾」。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下一或多者：(i)磷酸二脂主鏈鍵中一個或兩個非連接磷酸氧及/或一或多個連接磷酸氧之改變，例如替代(一種示例性主鏈修飾)；(ii)核糖之成分，例如核糖上之2'羥基之改變，例如替代(一種示例性糖修飾)；(iii)磷酸部分經「去磷酸」連接子大規模替代(一種示例性主鏈修飾)；(iv)天然存在之核鹼基之修飾或替代，包括經非典型核鹼基之修飾或替代(一種示例性鹼基修飾)；(v)核糖-磷酸主鏈之替代或修飾(一種示例性主鏈修飾)；(vi)寡核苷酸之3'端或5'端之修飾，例如末端磷酸酯基之移除、修飾或替代或部分、帽或連接子之結合(此類3'或5'帽修飾可包含糖及/或主鏈修飾)；及(vii)糖之修飾或替代(一種示例性糖修飾)。 上列修飾可組合，以提供包含可具有兩個、三個、四個或超過四個修飾之核苷及核苷酸(統一為「殘基」)的經修飾之RNA。舉例而言，經修飾之殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每個鹼基經修飾，例如所有鹼基均具有經修飾之磷酸酯基，諸如硫代磷酸酯基。在某些實施例中，sgRNA分子之所有或基本所有磷酸酯基均經硫代磷酸酯基替代。在一些實施例中，經修飾之RNA在RNA之5'端上或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之RNA在RNA之3'端上或附近包含至少一個經修飾之殘基。 在某些實施例中，經修飾之殘基可併入指導RNA中。在某些實施例中，經修飾之殘基可併入mRNA中。在一些實施例中，指導RNA包含一個、兩個、三個或超過三個經修飾之殘基。在一些實施例中，指導RNA在指導RNA之5'及3'端中之每一者處包含一個、兩個、三個或超過三個經修飾之殘基。在一些實施例中，mRNA包含5個、10個、15個、50個、100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之指導RNA或mRNA中至少5% (例如至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%)之位置為經修飾之核苷或核苷酸。 未修飾之核酸易於由例如細胞核酸酶降解。舉例而言，核酸酶可水解核酸磷酸二酯鍵。因此，在一態樣中，本文中描述之指導RNA可含有一或多個經修飾之核苷或核苷酸，例如以引入對核酸酶之穩定性。在某些實施例中，本文中描述之mRNA可含有一或多個經修飾之核苷或核苷酸，例如以引入對核酸酶之穩定性。在一些實施例中，本文中描述之經修飾之RNA分子在活體內與離體引入細胞群體中時，可展現減少之先天性免疫反應。術語「先天性免疫反應」包括細胞對外源性核酸，包括單鏈核酸之反應，包括誘發細胞介素，尤其干擾素之表現及釋放，以及細胞死亡。 在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾之殘基之磷酸酯基可藉由一或多個氧經不同取代基替代而經修飾。此外，經修飾之殘基，例如經修飾之核酸中存在的經修飾之殘基，可包括未修飾之磷酸部分經如本文中描述之經修飾之磷酸酯基大規模替代。在一些實施例中，磷酸主鏈之主鏈修飾可包括產生不帶電連接子或具有不均勻電荷分佈之帶電連接子的改變。 經修飾之磷酸酯基之實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸鹽、硼烷磷酸酯、膦酸氫鹽、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。未修飾之磷酸酯基中之磷原子無對掌性。然而，一個非橋接氧經一個以上原子或原子組替代可使磷原子具有對掌性。立體異構磷原子可具有「R」組態(本文中Rp)或「S」組態(本文中Sp)。主鏈亦可藉由橋接氧(亦即將磷酸連接於核苷之氧)經氮(橋接胺基磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基磷酸酯)替代來修飾。替代可發生在任一連接氧或兩個連接氧上。 在某些主鏈修飾中磷酸酯基可經不含磷之連接子替代。在一些實施例中，帶電磷酸酯基可經中性部分替代。可替換磷酸酯基之部分之實例可包括(但不限於)例如甲基膦酸酯、羥基胺基、矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基伸肼基、亞甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基亞胺基。 亦可構築可模擬核酸之骨架，其中磷酸連接子及核糖經對核酸酶具抗性之核苷或核苷酸替代物替代。此類修飾可包含主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可藉由替代主鏈繫栓。實例可包括(但不限於)嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。 經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括一或多個對糖基之修飾，亦即糖修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如經許多不同「氧基」或「去氧基」取代基替代。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，因為羥基不再能去質子化，形成2'-醇鹽離子。 2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH₂ CH₂ O)_n CH₂ CH₂ OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為整數0至20 (例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，其將2'羥基用氟替代。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖」核酸(LNA)，其中2'羥基可例如藉由C_1-6 伸烷基或C_1-6 伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中示例性橋可包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋；O-胺基(其中胺基可為例如NH₂ ；烷胺基、二烷基胺基、雜環基、芳胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或多胺基)及胺基烷氧基、O(CH₂ )_n -胺基(其中胺基可為例如NH₂ ；烷胺基、二烷基胺基、雜環基、芳胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或多胺基)。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「未鎖」核酸(UNA)，其中核糖環缺乏C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE)、(OCH₂ CH₂ OCH₃ ，例如PEG衍生物)。 「去氧」2'修飾可包括氫(亦即去氧核糖，例如在部分dsRNA之懸垂部分上)；鹵基(例如溴基、氯基、氟基或碘基)；胺基(其中胺基可為例如-NH₂ 、烷胺基、二烷基胺基、雜環基、芳胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH₂ CH₂ NH)_n CH2CH₂ -胺基(其中胺基可例如如本文中描述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫烷氧基；及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經例如如本文中描述之胺基取代。 糖修飾可包含糖基，糖基亦可含有一或多個立體化學組態與核糖中之對應碳相反的碳。因此，經修飾之核酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖之核苷酸。經修飾之核酸亦可包括無鹼基糖。此等無鹼基糖亦可在一或多個構成糖原子上進一步經修飾。經修飾之核酸亦可包括一或多個呈L形式之糖，例如L-核苷。 可併入經修飾之核酸中的本文中描述的經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括經修飾之鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括(但不限於)腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。此等核鹼基可經修飾或完全替代，以提供可併入經修飾之核酸中的經修飾之殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如天然存在之鹼基及合成衍生物。 在採用雙指導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者可含有修飾。此類修飾可在crRNA及/或tracr RNA之一或兩個末端上。在包含sgRNA之實施例中，sgRNA之一或兩個末端上之一或多個殘基可經化學修飾，或整個sgRNA可經化學修飾。某些實施例包含5'端修飾。某些實施例包含3'端修飾。在某些實施例中，指導RNA分子之單鏈懸垂物中一或多個或所有核苷酸為去氧核苷酸。經修飾之mRNA可含有5'端及/或3'端修飾。模板核酸 本文中揭示之調配物可包括模板核酸。模板可用於改變或插入Cas核酸酶之標靶位點處或附近之核酸序列。 在一些實施例中，模板可用於同源重組。在一些實施例中，同源重組可將模板序列或模板序列一部分整合至標靶核酸分子。在一些實施例中，可提供單一模板。在其他實施例中，可提供兩個或更多個模板，使得同源重組可發生在兩個或更多個標靶位點。舉例而言，可提供不同模板，以修復細胞中單一基因，或細胞中兩種不同基因。在一些實施例中，提供至少一個模板之多個複本至細胞。在一些實施例中，不同模板可以獨立複本數或獨立量提供。 在其他實施例中，模板可用於同源定向修復，其包括DNA鏈侵入核酸中裂解位點。在一些實施例中，同源定向修復可使得所編輯之標靶核酸分子中包括模板序列。在一些實施例中，可提供單一模板。在其他實施例中，藉由同源定向修復，可在兩個或更多個位點使用具有不同序列之兩個或更多個模板。舉例而言，可提供不同模板，以修復細胞中單一基因，或細胞中兩種不同基因。在一些實施例中，提供至少一個模板之多個複本至細胞。在一些實施例中，不同模板可以獨立複本數或獨立量提供。 在其他實施例中，模板可用於非同源末端接合介導之基因編輯。在一些實施例中，模板序列與裂解位點附近之核酸序列不相似。在一些實施例中，併入模板或模板序列一部分。在一些實施例中，可提供單一模板。在其他實施例中，藉由非同源末端接合，可在兩個或更多個位點插入具有不同序列之兩個或更多個模板。舉例而言，可提供不同模板，以將單一模板插入細胞中，或將兩個不同模板插入細胞中。在一些實施例中，不同模板可以獨立複本數提供。在一些實施例中，模板包括側接末端反向重複(ITR，inverted terminal repeat)序列。 在一些實施例中，模板序列可對應於標靶細胞之內源序列。如本文所用，術語「內源序列」係指細胞原生序列。術語「外源序列」係指非細胞原生之序列，或在細胞基因組中之原生位置在不同位置之序列。在一些實施例中，內源序列可為細胞之基因組序列。在一些實施例中，內源序列可為染色體或染色體外序列。在一些實施例中，內源序列可為細胞之質體序列。在一些實施例中，模板序列可基本上與細胞中裂解位點處或附近之內源性序列一部分一致，但包含至少一個核苷酸改變。在一些實施例中，用模板修復裂解之標靶核酸分子可產生包含插入、缺失或取代標靶核酸分子之一或多個核苷酸的突變。在一些實施例中，突變可在自包含標靶序列之基因表現的蛋白質中產生一或多個胺基酸改變。在一些實施例中，突變可在自標靶基因表現之RNA中產生一或多個核苷酸改變。在一些實施例中，突變可改變標靶基因之表現水準。在一些實施例中，突變可增加或減少標靶基因之表現。在一些實施例中，突變可引起基因減弱。在一些實施例中，突變可引起基因敲除。在一些實施例中，突變可恢復基因功能。在一些實施例中，用模板修復裂解之標靶核酸分子可改變標靶基因之外顯子序列、內含子序列、調控序列、轉錄控制序列、轉譯控制序列、剪接位點或非編碼序列。 在其他實施例中，模板序列可包含外源序列。在一些實施例中，外源序列可包含可操作地連接於外源性啟動子序列之蛋白質或RNA編碼序列，使得在外源序列整合至標靶核酸分子後，細胞能夠表現所整合之序列編碼的蛋白質或RNA。在其他實施例中，在外源性序列整合至標靶核酸分子後，所整合之序列的表現可藉由內源性啟動子序列調控。在一些實施例中，外源序列可為染色體或染色體外序列。在一些實施例中，外源序列可提供編碼蛋白質或蛋白質一部分之cDNA序列。在其他實施例中，外源序列可包含外顯子序列、內含子序列、調控序列、轉錄控制序列、轉譯控制序列、剪接位點或非編碼序列。在一些實施例中，外源序列之整合可恢復基因功能。在一些實施例中，外源序列之整合可引起基因敲入。在一些實施例中，外源序列之整合可引起基因敲除。 模板可具有任何適合長度。在一些實施例中，模板長度可包含10個、15個、20個、25個、50個、75個、100個、150個、200個、500個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個或更多個核苷酸。模板可為單鏈核酸。模板可為雙鏈或部分雙鏈核酸。在某些實施例中，單鏈模板長度為20個、30個、40個、50個、75個、100個、125個、150個、175個或200個核苷酸。在一些實施例中，模板可包含與包含標靶序列之標靶核酸分子一部分互補的核苷酸序列(亦即「同源性臂」)。在一些實施例中，模板可包含與位於標靶核酸分子上裂解位點上游或下游之序列互補的同源性臂。在一些實施例中，模板可包含分別與位於裂解位點上游及下游之序列互補的第一同源性臂及第二同源性臂(亦稱為第一核苷酸序列及第二核苷酸序列)。在模板含有兩個同源性臂下，各臂可為相同長度或不同長度，且同源性臂之間的序列可基本上與同源性臂之間的標靶序列類似或一致，或其可完全無關。在一些實施例中，模板上第一核苷酸序列與裂解位點上游之序列之間及模板上第二核苷酸序列與裂解位點下游之序列之間的互補程度可容許模板與標靶核酸分子之間進行同源重組，諸如高保真度同源重組。在一些實施例中，互補程度可為約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，互補程度可為約95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，互補程度可為至少98%、99%或100%。在一些實施例中，互補程度可為100%。 在一些實施例中，模板含有含側接末端反向重複(ITR)序列之ssDNA或dsDNA。在一些實施方案中，模板呈質體、微環、奈米環或PCR產物供應。核酸之純化 在一些實施例中，核酸經純化。在一些實施例中，核酸係使用沈澱法(例如LiCl沈澱、醇沈澱或同等方法，例如如本文中所述)純化。在一些實施例中，核酸係使用基於層析之方法，諸如基於HPLC之方法或同等方法(例如如本文中所述)純化。在一些實施例中，核酸係使用沈澱法(例如LiCl沈澱)與基於HPLC之方法兩者純化。標靶序列 在一些實施例中，本發明之CRISPR/Cas系統可指導至標靶核酸分子上之標靶序列且使其裂解。舉例而言，標靶序列可由Cas核酸酶識別且裂解。在一些實施例中，指導RNA可指導2類Cas核酸酶至標靶核酸分子上之標靶序列，其中指導RNA與標靶序列雜交且Cas核酸酶使標靶序列裂解。在一些實施例中，指導RNA與包含同源PAM之標靶序列雜交且Cas蛋白質使其裂解。在一些實施例中，標靶序列可與指導RNA之靶向序列互補。在一些實施例中，指導RNA之靶向序列與同指導RNA雜交之對應標靶序列部分之間的互補程度可為約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，標靶之同源區與同源PAM序列鄰接。在一些實施例中，標靶序列可包含與指導RNA之靶向序列100%互補之序列。在其他實施例中，與指導RNA之靶向序列相比，標靶序列可包含至少一個錯配、缺失或插入。舉例而言，標靶序列與指導RNA之靶向序列可含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個錯配，視情況在與PAM鄰接之一部分標靶序列中。在一些實施例中，標靶序列與指導RNA之靶向序列可含有1-9個錯配。在一些實施例中，標靶序列與指導RNA之靶向序列可含有3-6個錯配。在一些實施例中，標靶序列與指導RNA之靶向序列可含有5個或6個錯配。 標靶序列之長度可視所用核酸酶系統而定。舉例而言，CRISPR/Cas系統之指導RNA之靶向序列長度可包含5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個或超過50個核苷酸，且標靶序列為對應長度，視情況與PAM序列鄰接。在一些實施例中，標靶序列長度可包含15-24個核苷酸。在一些實施例中，標靶序列長度可包含17-21個核苷酸。在一些實施例中，標靶序列長度可包含20個核苷酸。當使用切割酶時，標靶序列可包含由一對使DNA分子之相反鏈裂解之切割酶識別的一對標靶序列。在一些實施例中，標靶序列可包含由一對使DNA分子之相同鏈裂解之切割酶識別的一對標靶序列。在一些實施例中，標靶序列可包含由一或多種Cas核酸酶識別之標靶序列的一部分。 標靶核酸分子可為對於細胞而言為內源性或外源性之任何DNA或RNA分子。在一些實施例中，標靶核酸分子可為游離體DNA、質體、基因組DNA、病毒基因組、粒線體DNA或來自細胞或細胞中之染色體。在一些實施例中，標靶核酸分子之標靶序列可為來自細胞或細胞中之基因組序列。在其他實施例中，細胞可為哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞可為囓齒類動物細胞。在一些實施例中，細胞可為人類細胞。在一些實施例中，細胞可為肝細胞。在一些實施例中，細胞可為人類肝細胞。在一些實施例中，肝細胞為肝實質細胞。在一些實施例中，肝實質細胞為人類肝實質細胞。在一些實施例中，肝細胞為幹細胞。在一些實施例中，人類肝細胞可為肝竇內皮細胞(LSEC)。在一些實施例中，人類肝細胞可為庫柏法細胞(Kupffer cell)。在一些實施例中，人類肝細胞可為肝星狀細胞。在一些實施例中，人類肝細胞可為腫瘤細胞。在其他實施例中，細胞包含ApoE結合受體。在一些實施例中，人類肝細胞可為肝幹細胞。參見例如Wang等人, Nature, 2015；Font-Burgada等人, Cell, 2015, 162:766-799。 在其他實施例中，標靶序列可為病毒序列。在其他實施例中，標靶序列可為病原體序列。在其他實施例中，標靶序列可為合成序列。在其他實施例中，標靶序列可為染色體序列。在某些實施例中，標靶序列可包含易位接合，例如與癌症有關之易位。在一些實施例中，標靶序列可在真核染色體，諸如人類染色體上。在某些實施例中，標靶序列為肝特異性序列，因為其在肝細胞中表現。 在一些實施例中，標靶序列可位於基因之編碼序列、基因之內含子序列、調控序列、基因之轉錄控制序列、基因之轉譯控制序列、剪接位點或基因之間的非編碼序列中。在一些實施例中，基因可為蛋白質編碼基因。在其他實施例中，基因可為非編碼RNA基因。在一些實施例中，標靶序列可包含所有或一部分疾病相關基因。在某些情況下，基因在肝中表現。 在一些實施例中，標靶序列可位於基因組中控制染色質組織態樣之非基因功能位點，諸如骨架位點或基因座控制區。 在涉及Cas核酸酶，諸如2類Cas核酸酶之實施例中，標靶序列可與前間區序列鄰近基元(「PAM」)相鄰。在一些實施例中，PAM可與標靶序列之3'端相鄰或在其1個、2個、3個或4個核苷酸內。PAM之長度及序列可視所用Cas蛋白質而定。舉例而言，PAM可選自特定Cas9蛋白質或Cas9直系同源物之一致或特定PAM序列，包括Ran等人,Nature , 520: 186-191 (2015)之圖1及Zetsche 2015之圖S5中揭示之序列，各相關揭示內容以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，PAM長度可為2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個核苷酸。非限制性示例性PAM序列包括NGG、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA、TTN及NNNNGATT (其中N定義為任何核苷酸，且W定義為A或T)。在一些實施例中，PAM序列可為NGG。在一些實施例中，PAM序列可為NGGNG。在一些實施例中，PAM序列可為TTN。在一些實施例中，PAM序列可為NNAAAAW。脂質調配物 本文中揭示CRISPR/Cas運載物之LNP調配物之各種實施例。此類LNP調配物可包括CCD脂質以及輔助脂質、中性脂質及隱形脂質。「脂質奈米粒子」意謂包含複數個(亦即超過一個)彼此藉由分子間力物理締合之脂質分子的粒子。LNP可為例如微球體(包括單層及多層囊泡，例如「脂質體」-層狀相脂質雙層，在一些實施例中，其基本上為球狀且在更特定實施例中，可包含水性核心，例如包含RNA分子之實質部分)、於乳液中之分散相、膠束或於懸浮液中之內相。乳液、膠束及懸浮液可為適於局部及/或表面遞送之組合物。 本文中提供之LNP組合物優先由肝細胞(例如肝實質細胞)吸收。此外，LNP組合物為可生物降解的，因為其在治療有效劑量下未在活體內積累至細胞毒性水準。在一些實施例中，LNP組合物在治療劑量下未引起導致實質副作用之先天性免疫反應。在一些實施例中，本文中提供之LNP組合物在治療劑量下未引起毒性。LNP組合物特異性結合血液中之阿朴脂蛋白，諸如阿樸脂蛋白E (ApoE)。阿樸脂蛋白為在血漿中循環之蛋白質，其對於調控脂質輸送而言為關鍵的。ApoE表示在脂蛋白吸收期間與肝中細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖相互作用之一類阿樸脂蛋白。(參見例如Scherphof及Kamps, The role of hepatocytes in the clearance of liposomes from the blood circulation.Prog Lipid Res. 2001年5月;40(3):149-66)。CCD 脂質 用於遞送生物活性劑之脂質組合物可經調整以優先靶向肝細胞或器官。在某些實施例中，脂質組合物優先靶向阿樸脂蛋白E (ApoE)結合細胞，諸如表現ApoE受體之細胞。用於遞送CRISPR/Cas mRNA及指導RNA組分至肝細胞之脂質組合物包含CCD脂質。 在一些實施例中，CCD脂質為脂質A，其為十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂質A可描繪為：

。 脂質A可根據WO2015/095340 (例如第84-86頁)合成。 在一些實施例中，CCD脂質為脂質B，其為雙(癸酸)((5-((二甲基胺基)甲基)-1,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛-8,1-二基)酯，亦稱為雙(癸酸)((5-((二甲基胺基)甲基)-1,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛-8,1-二基)酯。脂質B可描繪為：

。 脂質B可根據WO2014/136086 (例如第107-09頁)合成。 在一些實施例中，CCD脂質為脂質C，其為(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-雙(十八-9,12-二烯酸)2-((4-(((3-(二甲基胺基)丙氧基)羰基)氧基)十六醯基)氧基)丙-1,3-二酯。脂質C可描繪為：

。 在一些實施例中，CCD脂質為脂質D，其為3-辛基十一酸3-(((3-(二甲基胺基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛醯基氧基)十三烷酯。 脂質D可描繪為：

。 脂質C及脂質D可根據WO2015/095340合成。 CCD脂質亦可為脂質A、脂質B、脂質C或脂質D之同等物。在某些實施例中，CCD脂質為脂質A之同等物或脂質B之同等物。 適合用於本文中描述之LNP中的CCD脂質在活體內為可生物降解的。CCD脂質具有低毒性(例如在大於或等於10 mg/kg之量下，在動物模型中耐受，無副作用)。在某些實施例中，包含CCD脂質之LNP包括其中在8小時、10小時、12小時、24小時或48小時或3天、4天、5天、6天、7天或10天內至少75% CCD脂質自血漿清除的LNP。在某些實施例中，包含CCD脂質之LNP包括其中在8小時、10小時、12小時、24小時或48小時或3天、4天、5天、6天、7天或10天內至少50% mRNA或指導RNA自血漿清除的LNP。在某些實施例中，包含CCD脂質之LNP包括例如藉由量測脂質(例如CCD脂質)、RNA (例如mRNA)或蛋白質組分，其中在8小時、10小時、12小時、24小時或48小時或3天、4天、5天、6天、7天或10天內至少50% LNP自血漿清除的LNP。在某些實施例中，量測LNP之封裝脂質對比游離脂質、RNA或蛋白質組分。 脂質清除率可如文獻中所述量測。參見Maier, M.A.等人, Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics.Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 (「Maier 」)。舉例而言，在Maier 中，含有靶向螢光素酶之siRNA的LNP-siRNA系統以0.3 mg/kg，藉由靜脈內快速注射，經由側尾靜脈，投與六至八週齡雄性C57Bl/6小鼠。血液、肝及脾樣品在給藥後0.083小時、0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、96小時及168小時收集。小鼠用鹽水灌注，接著收集組織且加工血液樣品以獲得血漿。加工所有樣品且藉由LC-MS分析。此外，Maier 描述一種用於在投與LNP-siRNA調配物後評定毒性之程序。舉例而言，靶向螢光素酶之siRNA以0、1、3、5及10 mg/kg (5隻動物/組)，經由單次靜脈內快速注射，以5 mL/kg之劑量體積，投與雄性史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat)。24小時後，自有意識動物之頸靜脈獲得約1 mL血液且分離血清。給藥後72小時，處死所有動物進行屍體解剖。評定臨床徵象、體重、血清化學、器官重量及組織病理學。雖然Maier 描述用於評定siRNA-LNP調配物之方法，可應用此等方法以評定投與本發明調配物之清除率、藥物動力學及毒性。 CCD脂質引起清除率增加。在一些實施例中，清除率為脂質清除率，例如CCD脂質自血液、血清或血漿清除之速率。在一些實施例中，清除率為RNA清除率，例如mRNA或指導RNA自血液、血清或血漿清除之速率。在一些實施例中，清除率為LNP自血液、血清或血漿清除之速率。在一些實施例中，清除率為LNP自組織，諸如肝組織或脾組織清除之速率。在某些實施例中，高速清除率產生無實質副作用之安全型態。CCD脂質降低循環及組織中之LNP積累。在一些實施例中，循環及組織中LNP積累減少產生無實質副作用之安全型態。 本發明之CCD脂質可電離，視其所處之培養基的pH值而定。舉例而言，在微酸性培養基中，CCD脂質可質子化，因此帶正電荷。相反，在微鹼性培養基中，諸如pH值為大約7.35之血液，CCD脂質可未質子化，因此不帶電荷。在一些實施例中，本發明之CCD脂質可在至少約9之pH值下質子化。在一些實施例中，本發明之CCD脂質可在至少約9之pH值下質子化。在一些實施例中，本發明之CCD脂質可在至少約10之pH值下質子化。 CCD脂質負載電荷之能力與其內在pKa有關。舉例而言，本發明之CCD脂質可各獨立地具有在約5.8至約6.2範圍內之pKa。此可為有利的，因為已發現pKa在約5.1至約7.4範圍內之陽離子型脂質有效遞送運載物至肝。此外，已發現pKa在約5.3至約6.4範圍內之陽離子型脂質有效遞送至腫瘤。參見例如WO 2014/136086。其他脂質 適用於本發明之脂質組合物中之「中性脂質」包括例如多種中性、不帶電或兩性離子脂質。適用於本發明中之中性磷脂之實例包括(但不限於) 5-十七基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二-二十碳烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DEPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞油醯基磷脂醯膽鹼二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在一個實施例中，中性磷脂可選自由二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)組成之群。在另一實施例中，中性磷脂可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)。中性脂質用於穩定LNP且改善LNP之加工。 「輔助脂質」為增強轉染(例如包括生物活性劑之奈米粒子之轉染)的脂質。輔助脂質提高轉染之機制包括提高粒子穩定性。在某些實施例中，輔助脂質提高膜融合性。輔助脂質包括類固醇、固醇及烷基間苯二酚。適用於本發明中之輔助脂質包括(但不限於)膽固醇、5-十七基間苯二酚及膽固醇半丁二酸酯。在一個實施例中，輔助脂質可為膽固醇。在一個實施例中，輔助脂質可為膽固醇半丁二酸酯。 「隱形脂質」為改變奈米粒子可存在於活體內(例如血液中)之時間長度的脂質。隱形脂質可藉由例如減少粒子聚集及控制粒度，來幫助調配過程。本文中使用之隱形脂質可調節LNP之藥物動力學特性。適用於本發明之脂質組合物中之隱形脂質包括(但不限於)具有連接於脂質部分之親水性頭基的隱形脂質。適用於本發明之脂質組合物中之隱形脂質及有關此類脂質之生物化學的資訊可見於Romberg等人, Pharmaceutical Research, 第25卷, 第1期, 2008, 第55-71頁及Hoekstra等人, Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52中。其他適合PEG脂質揭示於例如WO 2006/007712中。 在一個實施例中，隱形脂質之親水性頭基包含選自基於以下之聚合物的聚合物部分：PEG (有時稱為聚(氧化乙烯))、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(丙三醇)、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚胺基酸及聚[N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺]。 隱形脂質可包含脂質部分。在一些實施例中，隱形脂質之脂質部分可衍生自甘油二酯或二醯基咪唑二醯胺，包括包含烷基鏈長度獨立地包含約C4至約C40飽和或不飽和碳原子之二烷基甘油或二烷基咪唑二醯胺基團的甘油二酯或二醯基咪唑二醯胺，其中鏈可包含一或多個官能基，諸如醯胺或酯。二烷基甘油或二烷基咪唑二醯胺基團可進一步包含一或多個經取代之烷基。 除非另有指示，否則如本文所用，術語「PEG」意謂任何聚乙二醇或其他聚伸烷基醚聚合物。在一個實施例中，PEG為乙二醇或環氧乙烷之視情況經取代之線性或分支聚合物。在一個實施例中，PEG未經取代。在一個實施例中，PEG經例如一或多個烷基、烷氧基、醯基、羥基或芳基取代。在一個實施例中，該術語包括PEG共聚物，諸如PEG-聚胺脂或PEG-聚丙烯(參見例如J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992))；在另一實施例中，該術語不包括PEG共聚物。在一個實施例中，PEG之分子量為約130至約50,000，在一子實施例中，約150至約30,000，在一子實施例中，約150至約20,000，在一子實施例中，約150至約15,000，在一子實施例中，約150至約10,000，在一子實施例中，約150至約6,000，在一子實施例中，約150至約5,000，在一子實施例中，約150至約4,000，在一子實施例中，約150至約3,000，在一子實施例中，約300至約3,000，在一子實施例中，約1,000至約3,000，且在一子實施例中，約1,500至約2,500。 在某些實施例中，PEG (例如結合於脂質，諸如隱形脂質)為「PEG-2K」，亦稱為「PEG 2000」，其平均分子量為約2,000道爾頓。PEG-2K在本文中由以下式(I)表示，其中n為45，意謂數均聚合度包含約45個子單元

。然而，可使用此項技術中已知之其他PEG實施例，包括例如其中數均聚合度包含約23個子單元(n=23)及/或68個子單元(n=68)之PEG。在一些實施例中，n可在約30至約60範圍內。在一些實施例中，n可在約35至約55範圍內。在一些實施例中，n可在約40至約50範圍內。在一些實施例中，n可在約42至約48範圍內。在一些實施例中，n可為45。在一些實施例中，R可選自H、經取代之烷基及未經取代之烷基。在一些實施例中，R可為未經取代之烷基。在一些實施例中，R可為烷基。 在任一本文中描述之實施例中，隱形脂質可選自PEG-二月桂醯基甘油、PEG-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG) (目錄號GM-020，來自NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二棕櫚醯基甘油、PEG-二硬脂醯基甘油(PEG-DSPE) (目錄號DSPE-020CN，NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二月桂醯基咪唑二醯胺、PEG-二肉豆蔻醯基咪唑二醯胺、PEG-二棕櫚醯基咪唑二醯胺及PEG-二硬脂醯基咪唑二醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽固醇-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB (3,4-二-十四烷氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DMG) (目錄號880150P，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSPE) (目錄號880120C，Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020, NOF Tokyo, Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)及1,2-二硬脂醯基氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSA)。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-DMG。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-DSG。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-DSPE。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-DMA。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-DSA。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-C11。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-C14。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-C16。在一個實施例中，隱形脂質可為PEG2k-C18。LNP 調配物 LNP可含有(i)用於封裝及用於內體逃逸之CCD脂質、(ii)用於穩定化之中性脂質、(iii)亦用於穩定化之輔助脂質及(iv)隱形脂質。 在某些實施例中，運載物包括編碼Cas核酸酶(諸如Cas9)之mRNA及指導RNA或編碼指導RNA之核酸。在一個實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質，諸如脂質A、脂質B、脂質C或脂質D。在一些態樣中，CCD脂質為脂質A。在一些態樣中，CCD脂質為脂質B。在各種實施例中，LNP組合物包含CCD脂質、中性脂質、輔助脂質及隱形脂質。在某些實施例中，輔助脂質為膽固醇。在某些實施例中，中性脂質為DSPC。在特定實施例中，隱形脂質為PEG2k-DMG。在一些實施例中，LNP組合物可包含脂質A、輔助脂質、中性脂質及隱形脂質。在一些實施例中，LNP組合物包含CCD脂質、DSPC、膽固醇及隱形脂質。在一些實施例中，LNP組合物包含有包含PEG之隱形脂質。在某些實施例中，CCD脂質選自脂質A、脂質B、脂質C或脂質D。在其他實施例中，LNP組合物包含選自脂質A或脂質B之CCD脂質、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。 在一個實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質及編碼Cas核酸酶之mRNA。在一個實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、編碼Cas核酸酶之mRNA及至少一種其他脂質組分。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的一些組合物中，LNP包括至少一種選自輔助脂質、中性脂質或隱形脂質之其他脂質組分。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的某些組合物中，輔助脂質為膽固醇。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的其他組合物中，中性脂質為DSPC。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的其他實施例中，隱形脂質為PEG2k-DMG。在某些實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、輔助脂質、中性脂質、隱形脂質及編碼Cas核酸酶之mRNA。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的特定組合物中，CCD脂質選自脂質A、脂質B、脂質C或脂質D。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的其他組合物中，CCD脂質選自脂質A、脂質B、脂質C或脂質D，輔助脂質為膽固醇，中性脂質為DSPC，且隱形脂質為PEG2k-DMG。在一些實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA的組合物中之CCD脂質為脂質A。在一些實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA的組合物中之CCD脂質為脂質B。在一些實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA的組合物中之CCD脂質為脂質C。在一些實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA的組合物中之CCD脂質為脂質D。 在一個實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質及2類Cas核酸酶mRNA。在一個實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、2類Cas核酸酶mRNA及至少一種其他脂質組分。在包含2類Cas核酸酶mRNA之一些組合物中，LNP包括至少一種選自輔助脂質、中性脂質或隱形脂質之其他脂質組分。在包含2類Cas核酸酶mRNA之某些組合物中，輔助脂質為膽固醇。在包含2類Cas核酸酶mRNA之其他組合物中，中性脂質為DSPC。在包含2類Cas核酸酶mRNA之其他實施例中，隱形脂質為PEG2k-DMG。在某些實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、輔助脂質、中性脂質、隱形脂質及2類Cas核酸酶mRNA。在包含2類Cas核酸酶mRNA之特定組合物中，CCD脂質選自脂質A、脂質B、脂質C或脂質D。在包含2類Cas核酸酶mRNA之其他組合物中，CCD脂質選自脂質A、脂質B、脂質C或脂質D，輔助脂質為膽固醇，中性脂質為DSPC，且隱形脂質為PEG2k-DMG。在一些實施例中，包含2類Cas核酸酶mRNA之組合物中之CCD脂質為脂質A。在一些實施例中，包含2類Cas核酸酶mRNA之組合物中之CCD脂質為脂質B。在一些實施例中，包含2類Cas核酸酶mRNA之組合物中之CCD脂質為脂質C。在一些實施例中，包含2類Cas核酸酶mRNA之組合物中之CCD脂質為脂質D。 在一些實施例中，LNP組合物可包含指導RNA。在某些實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、指導RNA、輔助脂質、中性脂質及隱形脂質。在包含指導RNA之某些LNP組合物中，輔助脂質為膽固醇。在包含指導RNA之其他組合物中，中性脂質為DSPC。在包含指導RNA之其他實施例中，隱形脂質為PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些實施例中，LNP組合物包含脂質A、脂質B、脂質C或脂質D；輔助脂質；中性脂質；隱形脂質；及指導RNA。在包含指導RNA之某些組合物中，CCD脂質為脂質A。在包含指導RNA之某些組合物中，CCD脂質為脂質B。在包含指導RNA之某些組合物中，CCD脂質為脂質C。在包含指導RNA之某些組合物中，CCD脂質為脂質D。在包含指導RNA之其他組合物中，CCD脂質選自脂質A、脂質B、脂質C或脂質D；輔助脂質為膽固醇；中性脂質為DSPC；且隱形脂質為PEG2k-DMG。 在某些實施例中，LNP調配物包括在約25:1至約1:25範圍內的2類Cas核酸酶mRNA與gRNA核酸之比率。在某些實施例中，LNP調配物包括在約10:1至約1:10範圍內的2類Cas核酸酶mRNA與gRNA核酸之比率。如本文中所量測，比率係按重量計。在一些實施例中，LNP調配物包括在約5:1至約1:5範圍內的2類Cas核酸酶mRNA與gRNA核酸之比率。在一些實施例中，LNP調配物包括約1:1的2類Cas核酸酶mRNA與gRNA核酸之比率。在一些實施例中，LNP調配物包括在約1:1至約1:5範圍內的2類Cas核酸酶mRNA與gRNA核酸之比率。在一些實施例中，LNP調配物包括約10:1的2類Cas核酸酶mRNA與gRNA核酸之比率。在一些實施例中，LNP調配物包括約1:10的2類Cas核酸酶mRNA與gRNA核酸之比率。比率可為約25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:25。 在一個實施例中，LNP組合物可包含sgRNA。在一個實施例中，LNP組合物可包含Cas9 sgRNA。在一個實施例中，LNP組合物可包含Cpf1 sgRNA。在包含sgRNA之一些組合物中，LNP包括CCD脂質、輔助脂質、中性脂質及隱形脂質。在包含sgRNA之某些組合物中，輔助脂質為膽固醇。在包含sgRNA之其他組合物中，中性脂質為DSPC。在包含sgRNA之其他實施例中，隱形脂質為PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、輔助脂質、中性脂質、隱形脂質及sgRNA。在包含sgRNA之特定組合物中，CCD脂質為脂質A、脂質B、脂質C或脂質D。在包含sgRNA之其他組合物中，CCD脂質選自脂質A、脂質B、脂質C或脂質D；輔助脂質為膽固醇；中性脂質為DSPC；且隱形脂質為PEG2k-DMG。 在某些實施例中，LNP組合物包含編碼Cas核酸酶之mRNA及可為sgRNA之指導RNA。在一個實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、編碼Cas核酸酶之mRNA、指導RNA、輔助脂質、中性脂質及隱形脂質。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA的某些組合物中，輔助脂質為膽固醇。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA的一些組合物中，中性脂質為DSPC。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA之其他實施例中，隱形脂質為PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些實施例中，LNP組合物可包含CCD脂質、輔助脂質、中性脂質、隱形脂質、編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA的特定組合物中，CCD脂質為脂質A、脂質B、脂質C或脂質D。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA的其他組合物中，CCD脂質為脂質A、脂質B、脂質C或脂質D；輔助脂質為膽固醇；中性脂質為DSPC；且隱形脂質為PEG2k-DMG。 本文中揭示之LNP組合物可包括模板核酸。模板核酸可與編碼Cas核酸酶之mRNA，諸如2類Cas核酸酶mRNA共同調配。在一些實施例中，模板核酸可與指導RNA共同調配。在一些實施例中，模板核酸可與編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA共同調配。在一些實施例中，模板核酸可與編碼Cas核酸酶之mRNA或指導RNA分開調配。在此類調配物中，模板核酸可為單鏈或雙鏈，視所需修復機理而定。模板可具有與標靶DNA或與標靶DNA鄰接之序列同源的區域。 本發明之實施例亦提供根據調配物中組分脂質之各別莫耳比描述的脂質組合物。在一個實施例中，CCD脂質之mol-%可為約30 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，CCD脂質之mol-%可為約35 mol-%至約55 mol-%。在一個實施例中，CCD脂質之mol-%可為約40 mol-%至約50 mol-%。在一個實施例中，CCD脂質之mol-%可為約42 mol-%至約47 mol-%。在一個實施例中，CCD脂質之mol-%可為約45%。在一些實施例中，LNP批料之CCD脂質mol-%將為目標mol-% ±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批內可變性將小於15%、小於10%或小於5%。 在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約30 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約35 mol-%至約55 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約40 mol-%至約50 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約41 mol-%至約46 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約44 mol-%。在一些實施例中，LNP批料之輔助脂質mol-%將為目標mol-% ±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批內可變性將小於15%、小於10%或小於5%。 在一個實施例中，中性脂質之mol-%可為約1 mol-%至約20 mol-%。在一個實施例中，中性脂質之mol-%可為約5 mol-%至約15 mol-%。在一個實施例中，中性脂質之mol-%可為約7 mol-%至約12 mol-%。在一個實施例中，中性脂質之mol-%可為約9 mol-%。在一些實施例中，LNP批料之中性脂質mol-%將為目標mol-% ±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批內可變性將小於15%、小於10%或小於5%。 在一個實施例中，隱形脂質之mol-%可為約1 mol-%至約10 mol-%。在一個實施例中，隱形脂質之mol-%可為約1 mol-%至約5 mol-%。在一個實施例中，隱形脂質之mol-%可為約1 mol-%至約3 mol-%。在一個實施例中，隱形脂質之mol-%可為約2 mol-%。在一個實施例中，隱形脂質之mol-%可為約1 mol-%。在一些實施例中，LNP批料之隱形脂質mol-%將為目標mol-% ±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批內可變性將小於15%、小於10%或小於5%。 本發明之實施例亦提供根據CCD脂質之帶正電胺基(N)與待封裝之核酸之帶負電磷酸酯基(P)之間的比率描述的脂質組合物。此可在數學上由方程式N/P表示。在一個實施例中，N/P比率可為約0.5至約100。在一個實施例中，N/P比率可為約1至約50。在一個實施例中，N/P比率可為約1至約25。在一個實施例中，N/P比率可為約1至約10。在一個實施例中，N/P比率可為約1至約7。在一個實施例中，N/P比率可為約3至約5。在一個實施例中，N/P比率可為約4至約5。在一個實施例中，N/P比率可為約4。在一個實施例中，N/P比率可為約4.5。在一個實施例中，N/P比率可為約5。 在一些實施例中，LNP藉由將RNA水溶液與基於有機溶劑之脂質溶液，例如100%乙醇混合來形成。適合溶液或溶劑包括或可含有：水、PBS、Tris緩衝液、NaCl、檸檬酸鹽緩衝液、乙醇、氯仿、乙醚、環己烷、四氫呋喃、甲醇、異丙醇。可使用醫藥學上可接受之緩衝劑，例如用於活體內投與LNP。在某些實施例中，緩衝劑用於維持包含LNP之組合物之pH值為pH 7.0或超過pH 7.0。在其他實施例中，組合物具有在約7.3至約7.7範圍內或在約7.4至約7.6範圍內之pH值。在其他實施例中，組合物具有約7.3、7.4、7.5、7.6或7.7之pH值。組合物之pH值可用微型pH探針量測。在某些實施例中，低溫保護劑包括於組合物中。低溫保護劑之非限制性實例包括蔗糖、海藻糖、丙三醇、DMSO及乙二醇。示例性組合物可包括多達10%低溫保護劑，諸如蔗糖。在某些實施例中，LNP組合物可包括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%低溫保護劑。在某些實施例中，LNP組合物可包括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%蔗糖。在一些實施例中，LNP組合物可包括緩衝劑。在一些實施例中，緩衝劑可包含磷酸鹽緩衝液(PBS)、Tris緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液及其混合物。在某些示例性實施例中，緩衝劑包含NaCl。NaCl之示例性量可在約40 mM至約50 mM範圍內。在一些實施例中，NaCl之量為約45 mM。在一些實施例中，緩衝液為Tris緩衝液。Tris之示例性量可在約40 mM至約60 mM範圍內。在一些實施例中，Tris之量為約50 mM。在一些實施例中，緩衝液包含NaCl及Tris。LNP組合物之某些示例性實施例含有含5%蔗糖及45 mM NaCl之Tris緩衝液。在其他示例性實施例中，組合物含有約5% w/v、約45 mM NaCl及約50 mM Tris之蔗糖。鹽、緩衝液及低溫保護劑之量可變化，以維持整體調配物之滲透壓度。舉例而言，最終滲透壓度可維持在低於450 mOsm/L。在其他實施例中，滲透壓度在350與250 mOsm/L之間。某些實施例具有300 +/- 20 mOsm/L之最終滲透壓度。 在一些實施例中，使用微流體混合、T混合或交叉混合。在某些態樣中，流速、接合尺寸、接合幾何形狀、接合形狀、管直徑、溶液及/或RNA及脂質濃度可變化。LNP或LNP組合物可例如經由透析或層析來濃縮或純化。LNP可例如呈懸浮液、乳液或凍乾粉末儲存。在一些實施例中，LNP組合物儲存在2-8℃下，在某些態樣中，LNP組合物儲存在室溫下。在其他實施例中，LNP組合物冷凍儲存，例如儲存在-20℃或-80℃下。在其他實施例中，LNP組合物儲存在約0℃至約-80℃範圍內之溫度下。冷凍LNP組合物可在使用前，例如在冰上、在室溫下或在25℃下解凍。 動態光散射(「DLS」)可用於表徵本發明之LNP之多分散性指數(「pdi」)及尺寸。DLS量測由樣品經受光源所產生之光的散射。如自DLS量測所測定，PDI表示群體中粒度分佈(在平均粒度周圍)，其中完全均一群體之PDI為零。在一些實施例中，pdi可在約0.005至約0.75之範圍內。在一些實施例中，pdi可在約0.01至約0.5之範圍內。在一些實施例中，pdi可在約0.02至約0.4之範圍內。在一些實施例中，pdi可在約0.03至約0.35之範圍內。在一些實施例中，pdi可在約0.1至約0.35之範圍內。 本文中揭示之LNP具有約1至約250 nm之尺寸。在一些實施例中，LNP具有約10至約200 nm之尺寸。在其他實施例中，LNP具有約20至約150 nm之尺寸。在一些實施例中，LNP具有約50至約150 nm之尺寸。在一些實施例中，LNP具有約50至約100 nm之尺寸。在一些實施例中，LNP具有約50至約120 nm之尺寸。在一些實施例中，LNP具有約75至約150 nm之尺寸。在一些實施例中，LNP具有約30至約200 nm之尺寸。除非另外指示，否則本文中提及之所有尺寸均為如在Malvern Zetasizer上藉由動態光散射所量測，完全形成之奈米粒子的平均尺寸(直徑)。奈米粒子樣品在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋，以便計數率為大約200-400 kct。資料呈現為強度量度之加權平均數。在一些實施例中，形成平均封裝效率在約50%至約100%範圍內之LNP。在一些實施例中，形成平均封裝效率在約50%至約70%範圍內之LNP。在一些實施例中，形成平均封裝效率在約70%至約90%範圍內之LNP。在一些實施例中，形成平均封裝效率在約90%至約100%範圍內之LNP。在一些實施例中，形成平均封裝效率在約75%至約95%範圍內之LNP。 將細胞工程改造之方法；經工程改造之細胞 本文中揭示之LNP組合物可用於在活體內與活體外經由基因編輯將細胞工程改造之方法。在一些實施例中，該等方法包括使細胞與本文中描述之LNP組合物接觸。在一些實施例中，細胞可為哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞可為囓齒類動物細胞。在一些實施例中，細胞可為人類細胞。在一些實施例中，細胞可為肝細胞。在某些實施例中，細胞可為人類肝細胞。在一些實施例中，肝細胞為肝實質細胞。在一些實施例中，肝實質細胞為人類肝實質細胞。在一些實施例中，肝細胞為幹細胞。在一些實施例中，人類肝細胞可為肝竇內皮細胞(LSEC)。在一些實施例中，人類肝細胞可為庫柏法細胞。在一些實施例中，人類肝細胞可為肝星狀細胞。在一些實施例中，人類肝細胞可為腫瘤細胞。在一些實施例中，人類肝細胞可為肝幹細胞。在其他實施例中，細胞包含ApoE結合受體。 在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，例如來源於前面段落中任一細胞類型之經工程改造之細胞。此類經工程改造之細胞根據本文中描述之方法產生。在一些實施例中，經工程改造之細胞存在於組織或器官內，例如個體之肝內。 在本文中描述之一些方法及細胞中，細胞包含修飾，例如標靶序列中核苷酸之插入或缺失(「插缺」)或取代。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個、2個、3個、4個或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個或2個核苷酸之插入。在其他實施例中，修飾包含標靶序列中1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個或2個核苷酸之缺失。在一些實施例中，修飾包含引起標靶序列中框移突變之插缺。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個或2個核苷酸之取代。在一些實施例中，修飾包含由模板核酸(例如本文中描述之任何模板核酸)之併入所產生的核苷酸之一或多個插入、缺失或取代。 在一些實施例中，提供包含經工程改造之細胞的細胞群體，例如包含根據本文中描述之方法進行工程改造之細胞的細胞群體。在一些實施例中，群體包含在活體外培養之經工程改造之細胞。在一些實施例中，群體存在於組織或器官內，例如個體之肝內。在一些實施例中，群體內至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更多細胞經工程改造。在某些實施例中，本文中揭示之方法產生至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%編輯效率(或「編輯百分比」)，由插缺之缺失定義。在其他實施例中，本文中揭示之方法產生至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% DNA修飾效率，藉由偵測無論藉由插入、缺失、取代還是其他所引起之序列改變來定義。在某些實施例中，本文中揭示之方法產生約5%至約100%、約10%至約50%、約20%至約100%、約20%至約80%、約40%至約100%或約40%至約80%之間的編輯效率水準或DNA修飾效率水準。 在本文中描述之一些方法及細胞中，群體內之細胞包含修飾，例如標靶序列之插缺或取代。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個、2個、3個、4個或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個或2個核苷酸之插入。在其他實施例中，修飾包含標靶序列中1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個或2個核苷酸之缺失。在一些實施例中，修飾包含引起標靶序列中框移突變之插缺。在一些實施例中，群體中至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%或更多經工程改造之細胞包含框移突變。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，修飾包含標靶序列中1個或2個核苷酸之取代。在一些實施例中，修飾包含由模板核酸(例如本文中描述之任何模板核酸)之併入所產生的核苷酸之一或多個插入、缺失或取代。治療方法 本文中揭示之LNP組合物可用於在活體內與活體外進行基因編輯。在一個實施例中，本文中描述之一或多種LNP組合物可投與有需要之個體。在一個實施例中，治療有效量之本文中描述之組合物可接觸有需要之個體之細胞。在一個實施例中，基因工程改造之細胞可藉由細胞與本文中描述之LNP組合物接觸來產生。 在一些實施例中，該等方法包括向與肝病有關之細胞投與LNP組合物。在一些實施例中，該等方法包括治療肝病。在某些實施例中，該等方法包括使肝細胞與LNP組合物接觸。在某些實施例中，該等方法包括使肝實質細胞與LNP組合物接觸。在一些實施例中，該等方法包括使ApoE結合細胞與LNP組合物接觸。 在一個實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA、gRNA及模板的LNP組合物可投與細胞，諸如ApoE結合細胞。在某些情況下，包含Cas核酸酶及sgRNA的LNP組合物可投與細胞，諸如ApoE結合細胞。在一個實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA、gRNA及模板的LNP組合物可投與肝細胞。在某些情況下，包含Cas核酸酶及sgRNA的LNP組合物可投與肝細胞。在一些情況下，肝細胞係在個體中。在某些實施例中，個體可接收單劑LNP組合物。在其他實例中，個體可接收多劑LNP組合物。在投與超過一劑下，投與之劑量可相隔約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天或28天；相隔約2個月、3個月、4個月、5個月或6個月；或相隔約1年、2年、3年、4年或5年。 在一個實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA的LNP組合物可投與肝細胞(亦稱為肝細胞)，接著投與包含gRNA及視情況選用之模板之組合物。在一個實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA的LNP組合物可投與肝細胞，接著向細胞投與包含模板之LNP組合物。在一個實施例中，包含編碼Cas核酸酶之mRNA的LNP組合物可投與肝細胞，接著相繼投與包含gRNA之LNP組合物，接著投與包含模板之LNP組合物至細胞。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的LNP組合物在包含gRNA之LNP組合物之前投與的實施例中，投與可間隔約4小時、6小時、8小時、12小時或24小時或2天、3天、4天、5天、6天或7天。 在一個實施例中，LNP組合物可用於編輯基因，引起基因敲除。在一個實施例中，LNP組合物可用於編輯基因，引起基因修正。在一個實施例中，LNP組合物可用於編輯細胞，引起基因插入。 在一個實施例中，投與LNP組合物可引起基因編輯，產生持續反應。舉例而言，投與可產生一天、一個月、一年或更長時間之反應持續時間。如本文所用，「反應持續時間」意謂在使用本文中揭示之LNP組合物編輯細胞後，所得修飾在投與LNP組合物後仍存在一定時間段。修飾可藉由量測標靶蛋白含量來偵測。修飾可藉由偵測標靶DNA來偵測。在一些實施例中，反應持續時間可為至少1週。在其他實施例中，反應持續時間可為至少2週。在一個實施例中，反應持續時間可為至少1個月。在一些實施例中，反應持續時間可為至少2個月。在一個實施例中，反應持續時間可為至少4個月。在一個實施例中，反應持續時間可為至少6個月。在某些實施例中，反應持續時間可為約26週。在一些實施例中，反應持續時間可為至少1年。在一些實施例中，反應持續時間可為至少5年。在一些實施例中，反應持續時間可為至少10年。在至少6個月後，藉由量測標靶蛋白含量，或藉由偵測標靶DNA，可偵測持續反應。 LNP組合物可非經腸投與。LNP組合物可直接投與血流、組織、肌肉或內臟器官。投與可為全身性的，例如注射或輸注。投與可為局部的。適合投與方式包括靜脈內、動脈內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、顱骨內、視網膜下、玻璃體內、前房內、肌肉內、滑膜內及皮下投與。適合投與裝置包括針(包括顯微針)注射器、無針注射器及輸注技術。 LNP組合物將一般(而不一定)呈與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑結合之調配物投與。術語「賦形劑」包括除本發明化合物、其他脂質組分及生物活性劑以外的任何成分。賦形劑可賦予調配物功能(例如藥物釋放速度控制)及/或非功能(例如加工助劑或稀釋劑)特徵。賦形劑之選擇在很大程度上將視諸如特定投與模式、賦形劑對溶解性及穩定性之作用及劑型特性之因素而定。 非經腸調配物通常為水性或油性溶液或懸浮液。在調配物為水溶液之情況下，諸如糖(包括(而不限於)葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)、鹽、碳水化合物及緩衝劑(較佳3至9之pH值)，但對於一些應用，其可更適合調配為無菌非水溶液或乾燥形式以與諸如無菌無熱原質之水(WFI)的適合媒劑結合使用。 在一些實施例中，基因編輯方法修飾因子VII標靶基因。在某些實施例中，LNP組合物投與肝細胞以修飾因子VII基因。LNP組合物可用於治療肝病，諸如因子VII缺乏症。該等方法可調節異常因子VII活性。在某些實施例中，可投與LNP組合物以治療或預防血友病或血液凝固控制障礙。參見例如Lapecorella, M. and Mariani, G. Factor VII deficiency: defining the clinical picture and optimizing therapeutic options.Haemophilia (2008), 14, 1170-1175。在某些實施例中，可投與LNP組合物以治療或預防血栓形成傾向(血液形成凝塊之傾向增加的病狀)。 當存在組織損傷時，因子VII酶原與組織因子之間形成等莫耳複合物，在因子VII序列之152位裂解，形成活化因子VII或因子VIIa。因子VIIa/組織因子複合物引起凝結。因子VII相關病症之治療方法包括增加因子VIIa凝固之方法、改善血液凝固之方法或改善血液凝固型態之方法。在某些實施例中，該等方法向患有因子VII缺乏症之個體投與LNP組合物。在一些實施例中，該等方法向先前針對因子VII缺乏症，例如用重組因子VIIa治療之個體投與LNP組合物。 在一些實施例中，基因編輯方法修飾TTR標靶基因。在某些實施例中，LNP組合物可用於治療與肝中TTR表現有關之病症，諸如澱粉樣變性。在某些實施例中，可投與LNP組合物以治療或預防澱粉樣變性病，包括轉甲狀腺素蛋白型澱粉樣變性病。參見例如Patel, K.及Hawkins, P. Cardiac amyloidosis: where are we today?J. Intern. Med. (2008), 278, 126-144。 TTR相關病症可引起澱粉樣沈積物積累。因此，治療或預防TTR相關之病症的方法包括降低TTR含量之方法、減少TTR產生之方法、減少澱粉樣沈積物之方法、治療遺傳性轉甲狀腺素蛋白型澱粉樣變性病之方法、治療非遺傳性轉甲狀腺素蛋白型澱粉樣變性病之方法或影響心臟及自主及周圍神經中澱粉樣沈積物之方法。在一些實施例中，治療或預防TTR相關病症之方法包括向經診斷具有澱粉樣沈積物之個體投與LNP組合物。在某些實施例中，該等方法向需要減少TTR產生之個體投與LNP組合物。 在一些實施例中，基因編輯方法靶向選自以下之基因：SERPINA1 、FVIII 、FIX 、SERPING1 、KLKB1 、KNG1 、FXII 、ASS1 、ASL 、BCKDHA 、BCKDHB 、G6PC 、GO/HAO1 、AGXT 、PCCA 、PCCB 、OTC 、LIPA 、ABCB11 、GALT 、ATP7B 及PAH 。 在一些實施例中，基因編輯方法可用於治療罹患選自以下之疾病的個體：α1抗胰蛋白酶缺乏症、A型血友病、B型血友病、HAE、1型瓜胺酸血症、精胺基琥珀酸尿、楓糖尿症、肝糖儲積病、原發性1型高草酸尿症、丙酸血症、鳥胺酸轉胺甲醯酶缺乏症、膽固醇酯儲積病、進行性家族性肝內膽汁鬱積症、半乳糖血、威爾遜病(Wilson's disease)及苯酮尿症。 在申請專利範圍及/或本說明書中詞語「一種(a)」、「一(an)」或「該(The)」與術語「包含」結合使用時可意謂「一個」，但各亦與「一或多種」、「至少一種」及「一種或超過一種」之含義一致。除非另有說明，否則「或」之使用意謂「及/或」。術語「包括(including)」及「含有(containing)」以及其他形式，諸如「包括(includes)」、「包括(included)」、「含有(contains)」及「含有(contained)」之使用為非限制性的。除非另有說明，否則本申請案中給出之所有範圍均涵蓋終點。 實例 實例1. 材料與方法. 脂質奈米粒子 ( 「 LNP 」 ) 調配物 以約4.5之CCD脂質胺與RNA磷酸(N:P)莫耳比，調配LNP。以下列莫耳比，使脂質奈米粒子組分溶解於100%乙醇中：45 mol-% (12.7 mM) CCD脂質(例如脂質A或脂質B)；44 mol-% (12.4 mM)輔助脂質(例如膽固醇)；9 mol-% (2.53 mM)中性脂質(例如DSPC)；及2 mol-% (0.563 mM) PEG (例如PEG2k-DMG或PEG2k-C11)。使RNA運載物溶解於50 mM乙酸鹽緩衝液pH 4.5，使得RNA運載物之濃度為大約0.45 mg/mL。 藉由使用Precision Nanosystems NanoAssemblr^TM Benchtop儀器，根據製造商之方案，對脂質及RNA溶液進行微流體混合，來形成LNP。在混合期間，使用有差別之流速，維持2:1比率之水性與有機溶劑。在混合後，收集LNP，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，大約1:1)中稀釋，接著在輕緩攪拌下，使用10 kDa Slide-a-Lyzer^TM G2透析盒(ThermoFisher Scientific)，在4℃下，將剩餘緩衝液交換成PBS (樣品體積過量100倍)隔夜。接著，使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。將所得濾液儲存在2-8℃下。對分離之LNP進行表徵以如下所述，確定封裝效率、多分散性指數及平均粒度。 核酸酶 mRNA 及單一指導 RNA (sgRNA) 之活體外轉錄 ( 「 IVT 」 ) 藉由活體外轉錄，使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶，產生含有N1-甲基假-U之封端及聚腺苷酸化Cas9 mRNA。藉由在37℃下，與XbaI在以下條件下一起培育2小時，將含有T7啟動子及100 nt 聚(A/T)區之質體DNA線性化：200 ng/µL質體、2 U/µL XbaI (NEB)及1x反應緩衝液。藉由在65℃下加熱反應20分鐘，使XbaI不活化。使用二氧化矽maxi離心管柱(Epoch Life Sciences)將線性化質體自酶及緩衝鹽純化，且藉由瓊脂糖凝膠分析以證實線性化。將產生經Cas9修飾之mRNA之IVT反應在37℃下在以下條件中培育4小時：50 ng/µL線性化質體；各2 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)；10 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠類核糖核酸酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1x反應緩衝液。在培育4小時後，添加TURBO去氧核糖核酸酶(ThermoFisher)至0.01 U/µL之最終濃度，且將反應再培育30分鐘，以移除DNA模板。使用MegaClear Transcription Clean-up套組，根據製造商之方案(ThermoFisher)，自酶及核苷酸純化Cas9 mRNA。或者，舉例而言，如實例15所示，mRNA經由沈澱方案純化，在一些情況下，沈澱方案之後為基於HPLC之純化。簡言之，在去氧核糖核酸酶消化後，藉由添加0.21倍體積之7.5 M LiCl溶液且混合，使mRNA沈澱，且所沈澱之mRNA藉由離心，形成球粒。一旦移除上清液，將mRNA在水中復原。mRNA再次使用乙酸銨及乙醇沈澱。將5M乙酸銨與2倍體積之100% EtOH一起添加至mRNA溶液，得到2 M之最終濃度。將溶液混合且在-20℃下培育15分鐘。沈澱mRNA再次藉由離心形成球粒，移除上清液，且mRNA在水中復原。作為最終步驟，使用乙酸鈉及乙醇使mRNA沈澱。1/10體積之3 M乙酸鈉(pH 5.5)與2倍體積之100% EtOH一起添加至溶液。將溶液混合且在-20℃下培育15分鐘。沈澱mRNA再次藉由離心形成球粒，移除上清液，球粒用70%冷乙醇洗滌且風乾。將mRNA在水中復原。對於HPLC純化之mRNA，LiCl沈澱及復原後，mRNA藉由RP-IP HPLC純化(參見例如Kariko等人,Nucleic Acids Research ,2011 , 第39卷, 第21 e142期)。將選擇用於彙集之溶離份合併且如上所述，藉由乙酸鈉/乙醇沈澱來脫鹽。 對於所有方法，藉由在260 nm下量測吸光度(Nanodrop)，測定轉錄物濃度，且藉由Bioanlayzer (Agilent)，藉由毛細管電泳，分析轉錄物。 IVT亦用於以類似方法產生sgRNA。藉由將僅由T7 RNA聚合酶啟動子序列組成之頂部寡核苷酸及含有sgRNA模板及與啟動子位點互補之序列的底鏈退火，來產生sgRNA之DNA模板。經退火之模板直接用於以下條件下的IVT反應：125 nM模板；各7.5 mM GTP、ATP、CTP及UTP；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠類核糖核酸酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1x反應緩衝液。反應在37℃下培育8小時，接著添加TURBO去氧核糖核酸酶(ThermoFisher)至0.01 U/µL之最終濃度，且將反應再培育30分鐘，以移除DNA模板。藉由MegaClear Transcription Clean-up套組，根據製造商之方案(ThermoFisher)，純化sgRNA轉錄物。藉由在260 nm下之吸光度(Nanodrop)，測定轉錄物濃度，且藉由PAGE，分析轉錄物。 調配物分析 分析LNP調配物之平均粒度、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA封裝效率。藉由動態光散射(DLS)，使用Malvern Zetasizer DLS儀器，量測平均粒度及多分散性。在藉由DLS量測之前，LNP樣品在PBS中稀釋30倍。Z-平均直徑為基於強度之平均粒度之量測，其隨同pdi一起報導。 基於螢光之分析用於確定總RNA濃度及封裝效率。將LNP用1x TE緩衝液稀釋75倍，以在RiboGreen®染料(ThermoFisher Scientific，目錄號R11491)之線性範圍內。將50 µl稀LNP與50 µl 1x TE緩衝液或含0.2% Triton X-100之1x TE緩衝液一式兩份地進一步混合。樣品在37℃下培育10分鐘，以使Triton完全破壞LNP且暴露總RNA以與RiboGreen®染料相互作用。藉由利用用於製備LNP之起始RNA溶液且根據與上面相同之步驟，製備用於標準曲線之樣品。稀RiboGreen®染料(100 μL，1xTE緩衝液中100倍，根據製造商之說明書)接著添加至各樣品且在缺乏光下在室溫下培育10分鐘。SpectraMax M5微盤讀取器(Molecular Devices)用於讀取樣品，其中激發波長、自動截止波長及發射波長分別設置為488 nm、515 nm及525 nm。使用以下方程式計算封裝效率(% EE)：

其中525 nm下螢光-triton為無Triton之樣品的平均螢光讀數，且525 nm下螢光+triton為有Triton之樣品的平均螢光讀數。使用線性標準曲線及具有triton值之樣品的平均螢光讀數，確定總RNA濃度。 相同程序可用於確定基於DNA之運載物組分的封裝效率。對於單鏈DNA，可使用Oligreen染料，且對於雙鏈DNA，可使用Picogreen染料。 各種LNP組合物之平均粒度、多分散性及%EE之值報導於下表1中。表 1. LNP 調配物資料之概述

T7E1 分析 在一些實例中使用T7E1分析來偵測基因組DNA中諸如插入、缺失及取代之突變事件，該等突變事件係在藉由Cas9使DNA裂解後經由非同源末端接合(NHEJ)產生(參見例如Cho等人, Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.Nature Biotechnology. 2013;31 ,230-232)。 CRISPR/Cas9所靶向之基因組DNA區藉由PCR擴增，在95℃下變性10分鐘，且接著藉由以0.5℃/秒之速度，將溫度自95℃緩慢下降至25℃來再次退火。DNA組合形成異源雙鏈表明擴增區中存在突變。接著將再次退火之異源雙鏈用噬菌體解離酶T7E1 (New England Biolabs)，在37℃下消化25分鐘或更長時間，以產生其中T7E1核酸酶識別錯配之雙鏈斷裂。使用片段分析器分析所得DNA片段且定量，以確定編輯效率近似值。對於編輯效率之定量分析，如本文中描述，使用下一代定序。 下一代定序 ( 「 NGS 」 ) 及靶向裂解效率之分析 為定量確定基因組中標靶位置處之編輯效率，利用深度定序鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。 在標靶位點(例如TTR、FVII)周圍設計PCR引子，且將相關基因組區域擴增。以下提供引子序列。根據製造商之方案(Illumina)進行其他PCR，以添加定序所需之化學作用。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子定序。在消除具有低品質評分之讀數後，將讀數與人類參考基因組(例如hg 38)比對。含有讀數之所得文檔映射至參考基因組(BAM文檔)，其中選擇與相關標靶區重疊之讀數，且計算野生型讀數數目對比含有插入、取代或缺失之讀數之數目。 編輯百分比(例如「編輯效率」或「編輯%」)定義為具有插入或缺失之序列讀數的總數/包括野生型之序列讀數的總數。 活體外 LNP 遞送 小鼠細胞株(Neuro2A及Hepa1.6)在補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中培養且以15,000個細胞/孔之密度塗鋪24小時，接著用LNP轉染18-24小時，接著如本文中所述來溶解及分析(例如報導體表現、T7E1分析、NGS)。使用膠原蛋白塗佈之96孔盤，將小鼠初代肝實質細胞(Invitrogen)在肝實質細胞盤培養基(Invitrogen)中在每孔15,000個細胞下培養。5小時後，移除盤培養基且用含有LNP及3%小鼠血清之肝實質細胞維持培養基替換(在37℃下預先培育5分鐘)。將細胞轉染42-48小時，接著如本文中所述來溶解及分析(例如T7E1分析、NGS)。對於細胞株與初代肝實質細胞，將LNP稀釋且添加至細胞，以每孔100 ng Cas9 mRNA及大約30 nM指導RNA起始，以半對數方式連續稀釋至每孔0.1 ng Cas9 mRNA及0.03 nM指導RNA。 活體內 LNP 遞送 在6-10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠用於各研究中。將動物稱重且根據體重分組，以基於組平均重量準備給藥溶液。經由側尾靜脈，以每隻動物0.2 mL之體積(每公斤體重大約10 mL)，給與LNP。在給藥後大約6小時，針對副作用，觀測動物。在投與後二十四小時量測體重，且在各時間點，藉由在異氟烷麻醉下用心臟穿刺來放血，將動物處死。將血液收集至血清分離管或如本文中所述，針對血漿，收集至含有緩衝檸檬酸鈉之管中。對於涉及活體內編輯之研究，自各動物之中葉或自三個獨立肝葉(例如右中、左中及左側肝葉)收集肝組織，以提取DNA且進行分析。對於一些研究，亦收集脾組織。 基因組 DNA 分離 使用Invitrogen PureLink Genomic DNA套組(目錄號K1820-02)，根據製造商之方案，自10 mg組織提取基因組DNA，該方案包括將組織在溶解緩衝液(大約200 μL/10 mg組織)中均化且使DNA沈澱。所有DNA樣品均標準化至100 ng/μL濃度，用於PCR及隨後NGS分析，如本文中所述。 運甲狀腺素蛋白 (TTR) ELISA 分析 如所指示，收集血液且分離血清。使用小鼠前白蛋白(運甲狀腺素蛋白) ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00111)測定總TTR血清含量。根據製造商之方案製備套組試劑及標準品。用1x分析稀釋劑將小鼠血清稀釋至10,000倍之最終稀釋液。此藉由進行兩個連續50倍稀釋，產生2,500倍稀釋來進行。進行最終4倍稀釋步驟，樣品總共稀釋10,000倍。將標準曲線稀釋液(各100 μL)及經稀釋之血清樣品添加至用捕捉抗體預先塗佈之ELISA盤之各孔。將盤在室溫下培育30分鐘，接著洗滌。添加酶-抗體結合物(每孔100 μL)，培育20分鐘。移除未結合之抗體結合物，且再洗滌盤，接著添加顯色受質溶液。將盤培育10分鐘，接著添加100 μL終止溶液，例如硫酸(大約0.3 M)。在SpectraMax M5盤式讀數器上，在450 nm之吸光度下，讀取盤。藉由SoftMax Pro軟體6.4.2版，使用四參數對數曲線擬合，針對標準曲線，計算血清TTR含量。調整最終血清值用於分析稀釋。 因子 -VII (FVII) 活性分析 如所指示，針對血漿收集血液。使用BIOPHEN FVII分析套組(Anaria Diagnostics，目錄號A221304)量測血漿因子VII活性水準。根據製造商之方案，製備套組試劑。藉由進行兩個連續50倍稀釋，產生2,500倍稀釋，用套組樣品稀釋緩衝液將血漿稀釋10,000倍。進行最終4倍稀釋步驟，樣品總共稀釋10,000倍。稀樣品(30 μL)添加至套組試劑1 (30 μL)。接著，將套組試劑2 (60 μL)添加至盤，隨後在37℃下培育7分鐘。接著將套組試劑3 (60 μL)添加至盤且盤在37℃下再培育5分鐘，接著添加乙酸(水中20% v/v，60 μL)以終止酶反應。在SoftMax M5盤式讀數器上，在405 nM下，讀取盤。FVII活性之相對值基於自對照動物之血漿製備之校準曲線計算且報導為媒劑對照百分比。 實例2. eGFP mRNA封裝之LNP的活體外遞送 如實例1中所述，製備包含編碼eGFP之mRNA (TriLink，目錄號L-6101)的LNP。各LNP製劑之組分包括CCD脂質(45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG或PEG2k-C11 (2 mol-%)。LNP-002、LNP-006、LNP-007、LNP-010及LNP-011包括脂質A作為CCD脂質，而LNP-012及LNP-013包括脂質B作為CCD脂質。LNP-002、LNP-010及LNP-012包括PEG2k-DMG，且LNP-006、LNP-007、LNP-011及LNP-013包括PEG2k-C11。LNP細節提供於表1中，包括平均粒度、多分散性及封裝效率。如實例1中所述，LNP遞送至小鼠肝實質細胞株(Hepa 1.6)，其中各LNP所遞送之eGFP mRNA總量為每孔100 ng或500 ng。將細胞與LNP一起培育大約18小時，且使用CytoFLEX細胞分析器(Beckman Coulter)量測eGFP表現。 如圖1中所示，觀測各調配物之eGFP表現。包含脂質A之LNP調配物(LNP-002、LNP-006、LNP-007、LNP-010及LNP-011)成功遞送eGFP mRNA。包含脂質B之LNP調配物(LNP-012及LNP-013)亦遞送eGFP mRNA。在此等實驗中包括PEG2k-C11及PEG2k-DMG隱形脂質之LNP均有效遞送，表明在活體外使用LNP將mRNA遞送至小鼠肝實質細胞株。 實例3. gLUC mRNA封裝之LNP的活體內遞送 包含編碼高斯螢光素酶(gLUC)之mRNA (TriLink，目錄號L-6123)之LNP如實例1中所述製備，且測試mRNA在活體內遞送至動物。各LNP製劑之組分包括CCD脂質(45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG (2 mol-%)。LNP-014包括脂質A，而LNP-015包括脂質B。此等調配物之細節提供於表1中，諸如平均粒度、多分散性及封裝效率。用各LNP調配物遞送0.1 mg/kg及0.3 mg/kg之gLUC mRNA劑量。24小時後處死動物，如實例1中所述，收集血液且分離血清。使用Pierce™高斯螢光素酶快速分析套組(ThermoFisher Scientific，目錄號16158)，根據製造商之方案，量測血清螢光素酶表現。 如圖2所示，與PBS對照相比，觀測到各動物之gLUC表現之劑量依賴性增加(各組n=5)。如藉由螢光素酶活性量測，包含脂質A或脂質B之LNP展示mRNA之有效活體內遞送及表現。 實例4. 使用Cas9 mRNA封裝之LNP (mRNA-LNP)與雙指導RNA封裝之LNP (dgRNA-LNP)的活體內遞送及編輯 在CD-1小鼠中測試用於遞送CRISPR/Cas RNA組分(例如gRNA及編碼Cas9之mRNA)以在肝中進行活體內編輯的LNP。在此等實驗中，分開調配dgRNA及mRNA。 如實例1中所述，分開用活體外轉錄之Cas9 mRNA及經化學修飾之dgRNA (靶向TTR或FVII)調配LNP。用於此實例之dgRNA係化學合成且來源於商業供應者，其中在構成雙指導之crRNA及trRNA之5'端與3'端的三個末端核苷酸之間具有硫代磷酸酯鍵。各LNP製劑之組分(LNP-093、LNP-094、LNP-095、LNP-096及LNP-097)包括CCD脂質(脂質A)(45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG (2 mol-%)。此等調配物之細節提供於表1中，包括平均粒度、多分散性及封裝效率。採用兩種不同給藥方案：(1) mRNA-LNP調配物(LNP-097)及dgRNA-LNP調配物(LNP-093、LNP-094、LNP-095或LNP-096)一起等份(按RNA重量)組合，且連續兩天給與所組合之調配物(每天給與1 mg /kg各RNA組分調配物，總共2 mg/kg)；或(2)連續兩天，給與mRNA-LNP (LNP-097)四小時後，給與dgRNA-LNP (LNP-093、LNP-094、LNP-095及LNP-096) (各調配物給與1 mg/kg)。各組中，在第一劑後5天，處死動物。除對照組比較(接收PBS之動物)之外，各實驗組具有內部定序對照，且如實例1中所述，在各動物(各組n=3)中，針對兩種標靶進行PCR反應，用於NGS分析。自肝分離基因組DNA，且如實例1中所述，藉由NGS分析。 如圖3A及3B所示，在使用共同給與(A1 (LNP-093/-097)或A2 (LNP-094/-097))或預先給與(A3 (LNP-093/-097))之給藥方案，接收靶向FVII之LNP的動物肝中觀測到活體內編輯(大約1.8%編輯- 2.8%編輯)。接收靶向TTR之LNP的動物展示在接收dgRNA與Cas9 mRNA (B1 (LNP-095/LNP-097)或B2 (LNP-096/-097))共同給與或當預先給與(B3 (LNP-095/-097)或B4 (LNP-096/-097))時之動物的肝中大約2%-4.5%編輯。如實例1中所述，所有動物均進行血清及血漿分析，其中在TTR之總血清含量或血漿FVII活性(未示)上無動物顯示統計顯著差異(與投與PBS之動物相比)。 實例5. 使用dgRNA-LNP及IVT sgRNA-LNP之活體外及活體內遞送及編輯 在與Cas9 mRNA-LNP共同給與之情況下，測試包含經化學修飾之dgRNA之LNP及包含活體外轉錄(IVT)之sgRNA之LNP的功效。 根據實例1調配LNP-115、LNP-116、LNP-117、LNP-120、LNP-121及LNP-123，且關於特定調配物之細節提供於表1中。使用如實例1中所述之程序，針對遞送至Neuro 2A細胞，測試此實例之調配物。 將LNP-121 (gRNA)及LNP-120 (Cas9 mRNA)混合在一起且分別以152 nM、76 nM及38 nM之gRNA濃度加每孔570 ng、285 ng及142 ng之mRNA投與；將LNP-123 (gRNA)及LNP-120混合在一起且分別以156 nM、78 nM及39 nM之gRNA濃度加每孔528 ng、264 ng及132 ng之mRNA投與；且將LNP-116 (gRNA)與LNP-120 (Cas9 mRNA)混合，且分別以124 nM、62 nM及31 nM之gRNA濃度加每孔460 ng、229 ng及114 ng之mRNA投與。LNP-121以198 nM、99 nM及49.5 nM之gRNA濃度投與； LNP-123以189 nM、94.5 nM及47 nM之gRNA濃度投與；且LNP-116以124 nM、62 nM及31 nM之gRNA濃度投與，且藉由LF2K，根據製造商之說明書，將Cas9 mRNA (每孔100 ng)添加至實驗。在涉及IVT sgRNA-LNP (LNP-123)與Cas9 mRNA共同給與之樣品中，使用LNP (LNP-120)或LF2K，以及經化學修飾之dgRNA，在測試濃度之gRNA (LNP-121)下，觀測到編輯。 接著活體內測試此實例中之調配物。如實例1中所述，連續兩天，向動物投與Cas9 mRNA-LNP與gRNA-LNP之一的混合物(每天向動物投與1 mg/kg各調配物)，其中一天僅給與一種調配物(各組n=5)。在第一劑後6天(或在僅接收單劑之組下，為7天)處死動物，且收集肝組織且藉由NGS分析，如實例1中所述。 如圖4A所示，單一及雙重給藥有效進行遞送。在單日接收一劑之組(LNP-121及LNP-120；圖4A中C)與當Cas9 mRNA-LNP與經化學修飾之dgRNA-LNP共同給與時連續數天接收兩劑之組(LNP-116及LNP-120，圖4A中之A；LNP-121及LNP-120，圖4B中之B)之間，無統計學差異。接收Cas9 mRNA-LNP與未修飾之IVT sgRNA-LNP (LNP-123及LNP-120，圖4B中之D)共同給與之動物與用於此實例中之dgRNA-LNP相比，呈現相對較低之編輯水準(圖4B)。此等實驗確定，當與Cas9 mRNA-LNP共同給與時，包含經修飾之dgRNA或IVT sgRNA之LNP允許活體外及活體內編輯。在此實驗中當使用包含IVT sgRNA之LNP時觀測到的活體內編輯之水準可受分離之IVT sgRNA中之雜質影響。 實例6. 使用經修飾之dgRNA-LNP或經修飾之sgRNA-LNP的活體外及活體內遞送及編輯 亦藉由與Cas9 mRNA-LNP共同給與，測試包含經化學修飾之dgRNA之LNP及包含活體外轉錄之sgRNA之LNP。 如實例1中所述，用經化學修飾之dgRNA (靶向TTR或FVII)、經化學修飾之sgRNA (靶向TTR或FVII)及IVT Cas9 mRNA調配LNP。用於此實例之dgRNA係化學合成且來源於商業供應者，其中在構成雙指導之crRNA及trRNA之5'端與3'端的三個末端核苷酸之間具有硫代磷酸酯鍵。用於此實例之sgRNA亦係化學合成且來源於商業供應者，其中在sgRNA之5'端及3'端及sgRNA之5'端及3'端的三個末端核苷酸之間具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵。各LNP製劑之組分包括CCD脂質(脂質A，45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG (2 mol-%)。LNP-136、LNP-137、LNP-138、LNP-139及LNP-140用於此等實驗。細節提供於表1中，包括平均粒度、多分散性及封裝效率。 如實例1中所述，針對遞送至Neuro 2A細胞，測試此實例之調配物。藉由直接添加各調配物至細胞培養基，產生表2中所列之濃度，將細胞用指導LNP及Cas9 mRNA LNP共同轉染，且使用如實例1中所述之T7E1分析，確定編輯%。圖5中，如表2中所述，標記表示調配物。表 2. 實例 6 中所用之調配物

與所測試之dgRNA-LNP調配物相比，當使用與Cas9 mRNA-LNP共同轉染之化學修飾之sgRNA-LNP時，量測兩種標靶之編輯大量增加(圖5)。當靶向FVII及TTR時，與Cas9 mRNA-LNP (LNP-138及LNP139，圖5)共同轉染之經化學修飾之sgRNA-LNP在細胞中分別產生大約35%-50%及65%-70%編輯。 接著活體內測試此實例中之調配物。如實例1中所述，連續兩天，向動物投與Cas9 mRNA-LNP (LNP-140)與所測試之gRNA-LNP (LNP-136、LNP-137、LNP-138及LNP-139)之一的混合物，其中每天給與1 mg/kg各組分調配物(每天總共2 mg/kg)(各組n=5)。在第一劑後6天處死動物，且收集肝組織且藉由NGS分析，如實例1中所述。 圖6中，A1及A2表示投與調配物LNP-136與LNP-140之混合物；B1及B2表示投與調配物LNP-139與LNP-140之混合物；C1及C2表示投與調配物LNP-137與LNP-140之混合物；且D1及D2表示投與調配物LNP-138與LNP-140之混合物。如圖6所示，與使用dgRNA-LNP調配物所產生之編輯的量(大約2%編輯-5%編輯)相比，當使用與Cas9 mRNA-LNP共同給與之經化學修飾之sgRNA-LNP時，量測兩種標靶之編輯增加(大約10%編輯-32%編輯)。跨越兩個肝生檢，接收靶向TTR之dgRNA-LNP調配物的動物產生小於5%編輯，而sgRNA-LNP調配物引起超過20%之平均編輯% (在一動物中峰值超過30%)。類似地，跨越兩個肝生檢，接收靶向FVII之dgRNA-LNP調配物的動物顯示小於3%編輯，而sgRNA-LNP調配物引起大約10%之平均編輯% (在一動物中峰值超過12%)。 此等結果確定，用Cas9 mRNA及gRNA (dgRNA與sgRNA)分開調配之LNP在一起共同給與時實現活體內編輯，且當在gRNA-LNP前給與Cas9 mRNA-LNP時LNP實現活體內編輯。 實例7. 使用包含與Cas9 mRNA共同調配之sgRNA之LNP的活體外及活體內遞送及編輯 經調配以遞送一起封裝在LNP組合物中之Cas9 mRNA及sgRNA的LNP亦有效遞送CRISPR/Cas組分。 如實例1中所述，用IVT Cas9 mRNA以及經化學修飾之sgRNA (靶向TTR或FVII)調配LNP。按RNA組分之重量，mRNA:sgRNA之比率為大約1:1。用於此實例之sgRNA係化學合成且來源於商業供應者，其中在sgRNA之5'端及3'端及sgRNA之5'端及3'端的三個末端核苷酸之間分別具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵。各LNP製劑之組分包括CCD脂質(脂質A，45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG (2 mol-%)。LNP-152、LNP-153、LNP-154及LNP-155用於此等實驗，且此等調配物之細節提供於表1中，包括平均粒度、多分散性及封裝效率。 如實例1中所述，針對遞送至Neuro 2A細胞，測試此實例之調配物。細胞用調配物轉染且如實例1中所述，使用NGS確定編輯%。 圖7中，A表示投與LNP-152；B表示投與LNP-153；C表示投與LNP-154；D表示投與LNP-155；且E表示投與LNP-152與LNP-153之組合。各調配物投與300 ng Cas9 mRNA及93 nM gRNA；100 ng Cas9 mRNA及31 nM gRNA；30 ng Cas9 mRNA及10 nM gRNA；以及10 ng Cas9 mRNA及3 nM gRNA。如圖7所示，投與各LNP調配物產生強編輯效率，其中一些調配物使得超過80%細胞編輯(LNP-153及LNP-155)。將細胞用兩種靶向FVII之LNP調配物(LNP-152及LNP-153)之組合處理，此亦產生有效編輯(大約70%-90%編輯)，以及位於兩個遞送之sgRNA之間的FVII基因一部分切除(圖7，且資料未示)。 亦在活體內測試此實例中之調配物。動物如實例1中所述給與(各組n=4)。接收靶向FVII之LNP之處理組接收單劑(2 mg/kg)，其中處理組之一接收2 mg/kg (例如各1 mg/kg之LNP-152及LNP-153)之單一組合劑量(LNP-152及LNP-153)。接收靶向TTR之LNP的處理組接收兩劑(各2 mg/kg)，其中第二劑在第一劑後四天遞送(亦即第1劑在第1天，第2劑在第5天)。在第一劑後8天處死所有組中之動物，且收集血液及肝組織且如實例1中所述來分析。將各調配物投與四隻動物。 圖8A、8B及9中，A表示投與LNP-152；B表示投與LNP-153；且C表示投與LNP-152與LNP-153之組合。在四隻動物中測試各調配物。如圖8A及8B所示，測試之各LNP調配物產生強活體內編輯效率。對於用靶向TTR序列之LNP調配物處理的動物，一些動物超過50%之來自各生檢之肝細胞在標靶位點上呈現插缺，其中各處理組之總平均值(跨越所有動物之所有生檢)為45.2± 6.4% (LNP-154)及51.1± 3.7% (LNP-155) (圖8A)。 用靶向FVII序列之LNP處理的動物呈現肝生檢中一定編輯百分比範圍，其中對於接收靶向FVII序列之兩種LNP調配物的一隻動物，觀測到編輯最大值超過70%肝細胞自生檢樣品編輯(例如在標靶位點或標靶位點之間具有插缺或切除事件)。各處理組(LNP-152、LNP-153及LNP-152及LNP-153)之總平均值(跨越所有動物之所有生檢)分別為16.9 ± 6.5%、38.6 ± 13.2%及50.7 ± 15.0% (圖8B)。對於接收兩種靶向FVII之LNP的動物，藉由PCR偵測各sgRNA之標靶位點之間的介入基因組DNA之切除，以及在一或兩個標靶位點處之插缺(圖9)。 圖10及11中，A表示投與LNP-152；B表示投與LNP-153；C表示投與LNP-154；D表示投與LNP-155；且E表示投與LNP-152與LNP-153之組合。當在此實例中投與LNP調配物時觀測到的強活體內編輯亦引起表型改變。如圖10所示，在用靶向TTR序列之LNP處理的動物中(而非對照或經靶向FVII之LNP處理的動物中)觀測到血清TTR含量之大量降低(多達大約75%)。類似地，在用靶向FVII序列之LNP處理的動物中(而非對照或經靶向TTR之LNP處理的動物中)觀測到血漿FVII活性水準降低(圖11)。 實例8. 調配參數之變化 針對以下，測試經調配以遞送一起於一種調配物中之Cas9 mRNA及gRNA的LNP：(1)跨越一系列劑量；(2)改變mRNA:gRNA之比率；(3)針對單劑對比兩劑之功效；及(4) LNP是否為脾吸收且在脾中產生編輯。 如實例1中所述，用IVT Cas9 mRNA以及經化學修飾之sgRNA (靶向TTR)一起調配LNP。所測試之mRNA:sgRNA比率(按RNA組分之重量)為大約1:1 (LNP-169)、大約10:1 (LNP-170)或大約1:10 (LNP-171)。用於此實例之sgRNA在sgRNA之5'端及3'端及sgRNA之5'端及3'端的三個末端核苷酸之間分別具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵。各LNP製劑之組分包括脂質A (45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG (2 mol-%)。LNP-169、LNP-170及LNP-171用於此等實驗。細節提供於表1中，包括平均粒度、多分散性及封裝效率。 劑量反應研究 在此研究中，如實例1中所述，在第1天向動物給藥，其LNP-169劑量為0.1 mg/kg、0.5 mg/kg或2 mg/kg (各組n=5)。在第5天及第9天，收集血液，用於分析TTR血清含量。在第9天，在屍體解剖時收集肝及脾用於NGS分析，如實例1中所述。 如圖12A所示，所有三種劑量之投與均引起肝中顯著編輯效率，其中觀測到線性劑量反應，r² 值為0.9441。在最高劑量組(2 mg/kg)中，一隻動物中幾乎60%之肝細胞在TTR標靶位點編輯，其中該組平均約50%肝細胞編輯。當在投與後第5天及第9天量測時，投與最高劑量之各動物亦呈現血清TTR含量統計學上顯著之降低，其中血清TTR含量平均降低75% (與投與PBS之動物相比，圖12B)。 改變 mRNA:gRNA 之比率 如實例1中所述，在第1天，向動物投與mRNA:gRNA比率為1:1之LNP-169 (亦即1 mg/kg mRNA、1 mg/kg gRNA，總RNA劑量為2 mg/kg)、比率為10:1之LNP-170 (亦即1.8 mg/kg mRNA、0.18 mg/kg gRNA，總RNA劑量為1.98 mg/kg)或比率為1:10之LNP-171 (亦即0.18 mg/kg mRNA、1.8 mg/kg gRNA，總RNA劑量為1.98 mg/kg) (各組n=5)。(注意：接收1:1 mRNA:gRNA比率之劑量的組及資料為與以上此實例中之劑量反應研究中所述相同的組及資料)。在第5天及第9天，收集血液，且量測血清TTR含量。在第9天，在屍體解剖時收集肝及脾用於NGS分析，如實例1中所述。 如圖13A所示，投與LNP-169 (mRNA:gRNA比率為1:1)在一隻動物中TTR標靶位點引起幾乎60%之編輯，其中該組具有約50%編輯之平均值。接收1:10及10:1 LNP調配物之動物亦顯示編輯，其中在此實驗中接收LNP-171之組的平均編輯%顯示大約32%編輯，且接收LNP-170之組的平均編輯%顯示大約17%編輯。另外，如圖13B所示，在第5天，針對各處理組，偵測出血清TTR含量統計學上顯著之降低(與PBS對照相比)。至第9天，接收1:1 mRNA:sgRNA及1:10 mRNA:sgRNA之組保持血清TTR含量統計學上顯著之降低。 單劑對比兩劑 在此研究中，一組動物在第1天接收單劑LNP-169 (2 mg/kg)，而另一組接收兩劑LNP-169 (各2 mg/kg)，其中如實例1中所述，第一劑在第1天投與且第二劑在第5天投與(兩組n=5)。(注意：接收單劑LNP-169之組及資料為與以上此實例中之劑量反應及mRNA:gRNA比率研究中所述相同的組及資料)。如實例1中所述，在第5天，針對TTR血清水平自兩組收集血液(對於接收第二劑之組，在投與第二劑前)，且在第9天，在屍體解剖時再次收集。 如圖14A所示，在接收單劑LNP-169之組中，在一隻動物中觀測到TTR標靶位點幾乎60%之編輯，其中該組具有約50%編輯之平均值。在接收兩劑LNP-169之動物中實現類似平均數，其中標準偏差較低且組平均值大約TTR標靶位點之55%編輯。如圖14B所示，兩組呈現血清TTR含量顯著降低。 評估脾之吸收及脾中編輯 在屍體解剖時，收集以上研究中(此實例內)各動物之脾，以確定LNP是否指導至脾且為脾吸收，藉此進行基因編輯。自脾組織提取基因組DNA且如實例1中所述，進行NGS分析。 圖15中，A表示LNP-169，投與2 mg/kg，2劑；B表示LNP-169，mRNA:gRNA比率為1:1，0.1 mg/kg，單劑；C表示LNP-169，mRNA:gRNA比率為1:1，0.5 mg/kg，單劑；D表示LNP-169，mRNA:gRNA比率為1:1，2 mg/kg，單劑；E表示LNP-170，mRNA:gRNA比率為10:1，2 mg/kg，單劑；且F表示LNP-171，mRNA:gRNA比率為1:10，2 mg/kg，單劑。如圖15所示，在此等動物之脾中，與其肝相比，觀測到編輯顯著較少(少於大約2%細胞)。在此等研究中觀測到肝中大約50%編輯(例如接收LNP-169之彼等組中)。此等結果表明與脾相對比，本文中提供之LNP主要靶向肝。 實例9. 在(1)與Cas9 mRNA-LNP共同給與之經修飾之dgRNA-LNP與(2)包含Cas9 mRNA及經修飾之dgRNA一起於一種調配物中之LNP之間的比較活體內研究 經調配以遞送呈分開LNP或一起於一種調配物中之Cas9 mRNA及經修飾之dgRNA的LNP有效遞送CRISPR/Cas組分。 如實例1中所述，用IVT Cas9 mRNA與經化學修飾之dgRNA (靶向TTR)一起(LNP-174、LNP-175)或分開(LNP-172、LNP-173)調配LNP。在此實例中構成dgRNA之crRNA與trRNA在各RNA之5'端及3'端之三個末端核苷酸之間包含硫代磷酸酯鍵。各LNP製劑之組分包括CCD脂質(脂質A，45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG (2 mol-%)。LNP-172、LNP-173、LNP-174及LNP-175用於此等實驗。除了在用LNP調配前，LNP-175中構成dgRNA之crRNA及trRNA首先彼此預先退火外，LNP-174與LNP-175之組成一致。此藉由以下來實現：首先，將crRNA及trRNA在95℃下一起培育10分鐘，接著冷卻至室溫，且進行調配，如先前所述。關於LNP之其他細節提供於表1中，包括平均粒度、多分散性及封裝效率。 如實例1中所述，向動物給與2 mg/kg各LNP (各組n=5)。在投與後第8天，在屍體解剖時，收集肝，且分離基因組DNA且如實例1中所述，進行NGS分析。 圖16中，A表示投與dgRNA分離調配物(LNP-172及LNP-173)；B表示投與dgRNA共同調配物(LNP-174)；且C表示投與其中dgRNA預先退火之調配物(LNP-175)。如圖16所示，在來自各組之肝中偵測到編輯(大約4-6%編輯)。接收用Cas9 mRNA及dgRNA一起共同調配之LNP的動物及接收來自分開調配之LNP之mRNA及dgRNA的動物展示編輯。使用用dgRNA (與Cas9 mRNA一起或分開)調配之LNP量測的編輯效率基本上低於使用用sgRNA調配之LNP偵測到的編輯效率(參見例如實例6-8)。 實例10. LNP之ApoE結合及初代肝實質細胞之轉染 如實例8中證明，本文中提供之LNP有效為肝吸收，且脾僅較小程度地吸收。此實例提供關於初代肝實質細胞中ApoE介導之吸收的資料且提供測試LNP-ApoE結合之分析，該分析證明LNP結合ApoE。 LNP 遞送至初代肝實質細胞 除其他蛋白質之外，血清提供培養基中ApoE之來源，因此，測試LNP吸收至初代肝實質細胞是否需要血清(例如作為ApoE來源)。此藉由在活體外在存在及不存在血清下添加LNP至初代肝實質細胞來實現。 如實例1中所述，LNP遞送至小鼠初代肝實質細胞。在缺乏任何血清下，針對任何測試之LNP ，藉由T7E1分析未偵測到編輯(資料未示)。然而，當在轉染前LNP與3%小鼠血清一起培育時，LNP由肝實質細胞吸收，產生剪輯。代表性資料集展示於圖17中。在此實驗中，LNP-169 (靶向TTR)在3%小鼠血清中預先培育，接著以各種濃度添加至初代肝實質細胞。圖17中之標記在表3中定義且描述投與之LNP-169之濃度。如圖17所示，如藉由NGS量測，血清之添加引起在TTR標靶位點之編輯的劑量依賴性增加。此等結果表明血清中存在之ApoE介導肝實質細胞中LNP吸收。表 3. 投與之 LNP-169 之濃度

ApoE 結合分析 將LNP與重組ApoE3 (ApoE之最常見形式)一起培育，接著經HPLC，使用鹽梯度，利用肝素親和管柱分離。HPLC操作中存在兩個峰組，對應於與ApoE3結合之LNP及未結合之LNP。未結合係未與ApoE3結合且可自由流過肝素管柱之游離LNP。結合係具有較長滯留時間之峰，其代表與肝素管柱結合且在鹽梯度中溶離之LNP/ApoE3複合物。為計算該結合，藉由將對應於LNP與ApoE3結合之峰面積作除法且將該數目除以兩種峰之面積總和，來計算結合峰面積之百分比。 如實例1中所述，用Cas9 mRNA以及經化學修飾之sgRNA調配LNP。用於此實例之sgRNA係化學合成且來源於商業供應者，其中在sgRNA之5'端及3'端及sgRNA之5'端及3'端的三個末端核苷酸之間分別具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵。各LNP製劑(LNP-169及LNP-171)之組分包括脂質A (45 mol-%)、膽固醇(44 mol-%)、DSPC (9 mol-%)及PEG2k-DMG (2 mol-%)。此等調配物之細節提供於表1中，包括平均粒度、多分散性及封裝效率。使用0.5 mg/mL之儲備ApoE3 (重組人類阿樸脂蛋白E3，R&D Systems，目錄號4144-AE-500)溶液，將ApoE3以25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL及300 μg/mL添加至LNP樣品。樣品在室溫下培育隔夜。 製備兩種緩衝液(各500 mL)；緩衝液A為20 mM Tris緩衝液，調至pH 8.0，且緩衝液B為20 mM Tris緩衝液，用1 M NaCl調至pH 8.0。用於HPLC分析之梯度及流速如下所述。

培育樣品隔夜後，藉由HPLC分析各樣品且如先前所述，計算結合峰之面積%。 如圖18所示，在增加量之ApoE3下，更多LNP (LNP-169 (藉由虛線表示)與LNP-171 (藉由實線表示))例如由於結合於ApoE3而結合於肝素管柱。此等結果指示LNP結合ApoE3。 實例11. 使用具有自DNA表現卡匣表現之sgRNA之LNP的活體外及活體內遞送及編輯 此實例證明使用負載Cas9 mRNA及編碼sgRNA之表現卡匣之LNP的基因編輯。 活體外 LNP 遞送 藉由對含有與靶向小鼠TTR之sgRNA連接之U6啟動子的DNA序列進行PCR擴增，製備編碼sgRNA之擴增子。各引子在5'端含有反向雙去氧T核苷酸，以防止DNA擴增子整合至基因組DNA。藉由苯酚/氯仿萃取，接著乙醇沈澱法，純化PCR產物。將DNA球粒乾燥且再懸浮於TE緩衝液中。 如實例1中所述，用IVT Cas9 mRNA (「mRNA-LNP」或LNP-178)或sgRNA表現卡匣(「DNA-LNP」或LNP-176)調配LNP。IVT Cas9 mRNA及sgRNA表現卡匣亦用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher)，根據製造商之說明書(分別「mRNA LF2K」或「DNA LF2K」)分開調配。藉由直接在各孔中細胞培養基中稀釋，根據以下方案，將調配物施加於小鼠Neuro2A細胞((100 ng Cas9 mRNA及100 ng sgRNA表現卡匣)： ● 共同遞送Cas9 mRNA及sgRNA表現卡匣； ● 在Cas9 mRNA前2小時投與sgRNA表現卡匣；及 ● 在sgRNA表現卡匣前2小時投與Cas9 mRNA。 轉染後，細胞培育48小時，且如實例1中所述，藉由T7E1分析，分析細胞溶解產物。如圖19所示，當在LNP中調配mRNA與DNA組分時，與用Lipofectamine 2000調配一種組分或另一組分時相比，觀測到更高TTR編輯百分比。 實例12. 活體外對比活體內編輯 如實例1中所述，調配Cas9 mRNA及靶向不同小鼠TTR序列之經化學修飾之sgRNA，且給與小鼠(2 mg/kg)。相同LNP製劑用於在活體外轉染小鼠初代肝實質細胞。此實例中之sgRNA係化學合成且來源於商業供應者，其中在sgRNA之5'端及3'端及sgRNA之5'端及3'端的三個末端核苷酸之間分別具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵。 表4. 實例12中所用之調配物

*** = 在5'端及3'端及5'端及3'端之三個末端核苷酸之間具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵的單指導格式 對於活體外研究，進行7點半對數劑量反應(起始於每孔100 ng)。轉染後48小時，收穫基因組DNA且藉由NGS量測編輯百分比。圖20展示此等活體外及活體內實驗之編輯百分比，表明在培養與活體內的初代肝實質細胞之間編輯效率相關。 因為除整體編輯效率之外，NGS亦提供特定定序結果，所以將序列特異性編輯型式與Neuro2A細胞相比。圖21展示證明在小鼠Neuro2A細胞(用Cas9 mRNA及gRNA轉染)與小鼠初代肝實質細胞(用含有Cas9 mRNA及gRNA之LNP轉染)之間插入及缺失型式有顯著差異的代表性資料。小鼠初代肝實質細胞之編輯型式非常類似於在活體內觀測到之編輯型式(用含有Cas9 mRNA及gRNA之LNP轉染)(圖22)。如圖22所示，在小鼠初代肝實質細胞中量測到之編輯的53.2%為缺失(主要為1 bp缺失)，且16.8%為插入(主要為1 bp插入)，總共70%編輯。在總共70%編輯中，64.5%編輯引起框移突變，佔所量測之總編輯的約92% (未示)。類似地，如自活體內基於LNP之Cas9 mRNA及gRNA遞送至小鼠肝細胞所觀測，展示編輯百分比及編輯類型之代表性資料：在活體內小鼠肝細胞中量測到之編輯的46.6%為缺失(再次，主要為1 bp缺失)且12.9%為插入(再次，主要為1 bp插入)，總共59.5%編輯。在總共59.5%編輯中，57.4%編輯引起框移突變，佔活體內所量測之編輯的約96% (未示)。 實例13. 藉由LNP遞送之CRISPR/Cas9組分的藥物動力學 如實例1中所述，調配含有Cas9 mRNA及靶向小鼠TTR之sgRNA的LNP-294。藉由HPLC證實mRNA與指導RNA之比率。如實例1中所述，向動物給與2 mg/kg各LNP (各組n=3)，且在以下時間點記下：5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、72小時及7天。在屍體解剖時，收集血漿、肝及脾，以用於Cas9 mRNA及指導RNA之含量的qPCR分析。圖23展示此等組分之血漿濃度，圖24展示肝中之濃度，且圖25展示脾中之濃度。針對血漿濃度，計算以下藥物動力學參數： 表5. 藥物動力學參數

圖26A展示血漿及組織中sgRNA與Cas9 mRNA之相對比率。 亦量測經處理之小鼠中的細胞介素誘發。對於此分析，藉由尾靜脈切割，收集大約50-100 μL血液，用於量測血清細胞介素。使血液在室溫下凝固大約2小時，接著在1000×g下離心10分鐘，接著收集血清。量測IL-6、TNF-α、IFN-α及MCP-1之基於Luminex之磁珠多路分析(Affymetrix ProcartaPlus，目錄號Exp040-00000-801)用於在所收集樣品中進行細胞介素分析。根據製造商之方案，製備套組試劑及標準品。使用所提供之樣品稀釋劑，將小鼠血清稀釋4倍，且將50 μL添加至含有50 μL稀抗體塗佈之磁珠的孔。盤在室溫下培育2小時，接著洗滌。將稀生物素抗體(50 μL)添加至珠粒且在室溫下培育1小時。將珠粒再次洗滌，接著添加50 μL稀抗生蛋白鏈菌素-PE至各孔，接著培育30分鐘。再一次洗滌珠粒，接著懸浮在100 μL洗滌緩衝液中，且在Bio-Plex 200儀器(Bio-Rad)上讀取。使用Bioplex Manager第6.1版分析套裝軟體，分析資料，其中使用五參數對數曲線擬合，針對標準曲線，計算細胞介素濃度。圖27展示所處理小鼠隨著時間過去之血漿細胞介素含量。如圖27所示，各細胞介素在處理後2-4小時之間具有可量測之增加，且至12-24小時，各返回基線。 根據實例1，三個不同指導序列分開調配，且注射至小鼠(n=3)中以確定脂質A之藥物動力學型態。藉由LC/MS量測小鼠肝及血漿中之脂質A水準。圖26B展示隨著時間過去脂質A之血漿及肝濃度。肝中之T_max 在投與30分鐘內實現，而血漿及肝中之T_1/2 在LNP投與大約5-6小時內實現。 實例14. 針對活體內編輯之反應的持續時間 如實例1中所述，調配Cas9 mRNA及靶向小鼠TTR序列之經化學修飾之sgRNA： 表6. LNP 402之調配物資訊

如實例1中所述，將LNP給與小鼠(單劑，3 mg/kg、1 mg/kg或0.3 mg/kg)。在給藥後1週、2週、4週、9週、13週及16週，量測一群小鼠之血清TTR含量，且在給藥後1週、2週、9週及16週，量測肝TTR編輯。為量測肝TTR編輯，自來自特定一群動物之各動物的中葉收集肝組織樣品，用於DNA提取及分析。使用基於珠粒之提取套組MagMAX-96 DNA多樣品套組(ThermoFisher，目錄號4413020)，根據製造商之方案，自10 mg組織提取基因組DNA，該方案包括將組織在溶解緩衝液(大約400 μL/10 mg組織)中均化且使DNA沈澱。所有DNA樣品均標準化至100 ng/μL濃度，用於PCR及隨後NGS分析。 此實例中之sgRNA係化學合成且來源於商業供應者，其中2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵如以下表示(m=2'-OMe；*=硫代磷酸酯)： sg282： mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU。 圖28展示隨著時間過去之小鼠血清TTR含量，且圖29A展示如藉由NGS量測之對應編輯百分比。圖29B展示如藉由NGS量測，至給藥後16週，隨著時間過去之小鼠血清TTR含量與對應編輯百分比。 實例15. 使用mRNA製劑之調配物 如實例1中所述，使用僅沈澱及HPLC純化方案，製備Cas9 mRNA。使用HPLC純化之mRNA (LNP492)調配LNP，且與使用僅沈澱加工之mRNA調配的LNP (LNP490、LNP494)相比。使用不同合成貨號之僅沈澱mRNA，製備LNP494之Cas9 mRNA運載物。 表7. 實例15中所用之調配物

向小鼠給與0.5或1 mg/kg如實例1活體內LNP遞送中所述之各調配物。如實例14中所述，用於此實例之sgRNA為sg282。 圖30展示給藥後4小時之小鼠血清細胞介素活性。圖31展示小鼠血清TTR濃度水準，且圖32展示小鼠肝TTR編輯水準。 表8. 圖30、31及32中之圖標記

實例16. 冷凍調配物 以約4.5之脂質A與RNA磷酸(N:P)之莫耳比，調配LNP。使脂質奈米粒子組分以下列莫耳比溶解於100%乙醇中：45 mol-% (12.7 mM)脂質A；44 mol-% (12.4 mM)膽固醇；9 mol-% (2.53 mM) DSPC；及2 mol-% (0.563 mM) PEG2k-DMG。使RNA運載物溶解於50 mM乙酸鹽緩衝液pH 4.5，產生大約0.45 mg/mL之RNA運載物濃度。對於此研究，使用實例14中描述之sg282。 表9. 實例16中所用之LNP調配物

藉由使用Precision Nanosystems NanoAssemblr^TM Benchtop儀器，根據製造商之方案，對脂質及RNA溶液進行微流體混合，來形成LNP (LNP 493、LNP 496)。在混合期間，使用有差別之流速，維持2:1比率之水性與有機溶劑。混合後，收集LNP，在50 mM Tris緩衝液pH 7.5中稀釋。使用0.2 μm無菌過濾器過濾經調配之LNP。所得濾液與在50 mM Tris緩衝液(pH 7.5)中製備之10% w/v蔗糖、90 mM NaCl以1:1混合。5% w/v蔗糖、45 mM NaCl、50 mM Tris緩衝液之最終LNP調配物儲存在4℃及 -80℃下1.5天，直至給藥之日。 向小鼠投與0.5及1 mg/kg LNP (在投與前一小時，冷凍調配物在25℃下解凍)。圖33展示小鼠血清TTR濃度水準，且圖34展示給藥後小鼠肝TTR編輯水準。 表10. 圖33及34中之圖標記

此實例中之sgRNA係化學合成且來源於商業供應者，其中2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵如以下表示(m=2'-OMe；*=硫代磷酸酯)： sg396： mG*mC*mU*GCCAGGAACCUACAUUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU. 實例17：替代LNP調配方法 以約4.5之脂質A與RNA磷酸(N:P)之莫耳比，調配LNP。使脂質奈米粒子組分以下列莫耳比溶解於100%乙醇中：45 mol-% (12.7 mM)脂質A；44 mol-% (12.4 mM)膽固醇；9 mol-% (2.53 mM) DSPC；及2 mol-% (0.563 mM) PEG2k-DMG。使RNA運載物溶解於乙酸鹽緩衝液(最終濃度為25 mM乙酸鈉，pH 4.5)或檸檬酸鹽緩衝液(最終濃度為25 mM檸檬酸鈉、100 mM NaCl，pH 5)，產生大約0.45 mg/mL之RNA運載物濃度。對於此研究，使用實例14中描述之sg282。 藉由使用Precision Nanosystems NanoAssemblr^TM Benchtop儀器，根據製造商之方案，對脂質及RNA溶液進行微流體混合，或交叉流動混合，來形成LNP。使用NanoAssemblr製備來製備LNP563及LNP564，其中在混合期間使用有差別之流速，水相8 mL/min及有機相4 mL/min，維持水性與有機溶劑2:1比率。混合後，收集LNP，且在50 mM Tris緩衝液pH 7.5中1:1稀釋。LNP在50 mM Tris pH 7.5中滲析隔夜且第二天使用0.2 μm無菌過濾器過濾。濃縮所得濾液且與在50 mM Tris緩衝液(pH 7.5)中製備之10% w/v蔗糖、90 mM NaCl以1:1混合。5% w/v蔗糖、45 mM NaCl、50 mM Tris緩衝液之最終LNP調配物儲存在4℃及-80℃下1.5天，直至給藥之日。 表11. 用於實例17之LNP之調配物資訊

*Cas9 1xNLS，無HA標籤 LNP561及LNP562係使用交叉流動技術製備，注射泵用於0.45 mg/mL RNA之兩種注射器，一種注射器為含有有機相之脂質且一種注射器為水。將此等在可變管道長度下以40 mL/min混合，將水相及有機相推過0.5 mm交叉縫隙(peek cross)，且此輸出引入連接至水管之1 mm三通中。LNP在室溫下培育一小時，接著用水1:1稀釋。簡言之，LNP及水藉由注射泵以25 mL/min引入1 mm三通。 為純化及濃縮，使用切向流過濾。一般對於此程序，來自Sartorius之Vivaflow 50濾筒用500 mL水填裝，接著使用Pall Minimate系統，以60 mL/min之饋送速率，引入LNP。將滲透管線夾緊以維持約1.7 mL/min之固定流速。一旦濃縮LNP，則在真空下，以80 mL/min之饋送速率，引入15倍體積之PBS或5%蔗糖、45 mM NaCl、50 mM Tris pH 7.5。將滲透管線夾緊以維持1.9 mL/min之流速。一旦完成滲濾，則濃縮LNP，且收集於無菌之無去氧核糖核酸酶、核糖核酸酶之收集管且對於PBS調配物，儲存在4℃下，或對於TSS (亦即Tris、蔗糖及鹽)調配物，儲存在4℃或-80℃下，直至給藥之日。 向小鼠投與1.0及2 mg/kg LNP (在投與前一小時，冷凍調配物在25℃下解凍)。圖35展示小鼠血清TTR濃度水準，而圖36展示給與不同調配物後小鼠肝TTR編輯水準。 表12. 圖35及36中之圖標記

實例18. LNP遞送至更高級物種 類似於實例14中描述之調配物，製備調配物。在某些實驗中，sgRNA經與sg282中相同之化學修飾進行修飾，但具有對大鼠TTR序列具特異性之靶向序列。觀測到大鼠肝中有效編輯。該實驗中2 mg/kg (總運載物)劑量及5 mg/kg (總運載物)劑量耐受良好。含有編碼GFP之mRNA的類似調配物在1 mg/kg及3 mg/kg之劑量下亦為非人類靈長類動物耐受良好。 序列 以上實例之描述之序列如下列出(自5'至3'之聚核苷酸序列)： Cas9 mRNA (Cas9編碼序列為粗體；HA標籤為粗體加下劃線；2xNLS加下劃線)： GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCUCGGCUUACCCAUACGACGUGCCUGACUACGCC UCGCUCGGAUCGGGCUCC CCCAAAAAGAAACGGAAGGUG GACGGAUCC CCGAAAAAGAAGAGAAAGGUG GACUCCGGAUGA GAAUUAUGCAGUCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG 表11中提及且實例17中所用之『Cas9 1xNLS』，無HA標籤： GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG tr001 (trRNA)： AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU cr002 (靶向FVII之crRNA；靶向序列加下劃線)：AGGGCUCUUGAAGAUCUCCC GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG sg001 (靶向FVII之sgRNA；靶向序列加下劃線)：AGGGCUCUUGAAGAUCUCCC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU cr003 (靶向TTR之crRNA；靶向序列加下劃線)：CCAGUCCAGCGAGGCAAAGG GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG sg006 (藉由IVT製成之靶向TTR之sgRNA；靶向序列加下劃線)： GGCCAGUCCAGCGAGGCAAAGG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU sg003 (靶向TTR之sgRNA；靶向序列加下劃線)：CCAGUCCAGCGAGGCAAAGG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU sg007 (靶向FVII之sgRNA；靶向序列加下劃線)：CUCAGUUUUCAUAACCCAGG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU sg002 (靶向FVII之sgRNA；靶向序列加下劃線)：CAGGGCUCUUGAAGAUCUCC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU sg004 (靶向TTR之sgRNA；靶向序列加下劃線)：CUUUCUACAAGCUUACCCAG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU sg005 (靶向TTR之sgRNA；靶向序列加下劃線)：UUACAGCCACGUCUACAGCA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU * = 硫代磷酸酯鍵 m = 2'OMe tr002 (trRNA)： A*A*C*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*U*U*U cr004 (靶向FVII之crRNA；靶向序列加下劃線)：A*G*G*GCUCUUGAAGAUCUCCC GUUUUAGAGCUAUGCUGUU*U*U*G cr005 (靶向TTR之crRNA；靶向序列加下劃線)：C*C*A*GUCCAGCGAGGCAAAGG GUUUUAGAGCUAUGCUGUU*U*U*G sg008 (靶向FVII之sgRNA；靶向序列加下劃線)：mA*mG*mG*GCUCUUGAAGAUCUCCC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U sg009 (靶向TTR之sgRNA；靶向序列加下劃線)：mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U sg010 (靶向FVII之sgRNA；靶向序列加下劃線)：mC*mU*mC*AGUUUUCAUAACCCAGG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U sg002 (靶向FVII之sgRNA；靶向序列加下劃線)：mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U sg011 (靶向TTR之sgRNA；靶向序列加下劃線)：mC*mU*mU*UCUACAAGCUUACCCAG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U sg012 (靶向TTR之sgRNA；靶向序列加下劃線)：mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U ec001 (表現卡匣-用於表現靶向TTR之sgRNA之擴增子；U6啟動子為黑體，靶向序列加下劃線；構築體在各5'端含有反向雙去氧T)： GCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGGGCCTATTTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC GCTTTCTACAAGCTTACCCAG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTA 用於由cr001靶向之FVII標靶位點之NGS分析的引子對： 正向： CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATCCAGTGTGGCTGTTTCCATTC 反向： GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTACACAAGAGCAGGCACGAGATG 用於由cr002及sg001靶向之FVII標靶位點之NGS分析的引子對： 正向： CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGCACATGAGACCTTCTGTTTCTC 反向： GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACATAGGTGTGACCCTCACAATC 用於由sg002靶向之FVII標靶位點之NGS分析的引子對： CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGCACATGAGACCTTCTGTTTCTC 反向： GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACATAGGTGTGACCCTCACAATC 用於由cr003及sg003靶向之TTR標靶位點之NGS分析的引子對： 正向： CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGT 反向： GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAAGGCACTTCTTCTTTATCTAAGGT 用於由sg004靶向之TTR標靶位點之NGS分析的引子對： 正向： CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTGGAGAATCCAAATGTCCTC 反向： GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTAGGAATTAAACCTGTGTCTCTTAC 用於由sg005靶向之TTR標靶位點之NGS分析的引子對： 正向： CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTTTGTTCCAGAGTCTATCACCG 反向： GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACACGAATAAGAGCAAATGGGAAC 用於sg004表現卡匣之PCR擴增之引子對： /5InvddT/ = 反向雙去氧T 正向： /5InvddT/GCTGCAAGGCGATTAAGTTG 反向： /5InvddT/TAGCTCACTCATTAGGCACC表 13. 小鼠 TTR 指導序列

表 14. 人類 TTR 指導序列 .

圖1展示在各種LNP調配物以每孔遞送100 ng及500 ng eGFP mRNA之量遞送至小鼠肝實質細胞(Hepa1.6)後GFP之表現。 圖2展示小鼠中在以變化劑量投與各種LNP調配物，產生劑量依賴性反應後的gLUC表現。 圖3A展示小鼠中在投與各種LNP調配物後靶向因子VII之編輯效率。 圖3B展示小鼠中在投與各種LNP調配物後靶向TTR之編輯效率。 圖4A展示小鼠中在根據各種給藥方案遞送其中gRNA及Cas9 mRNA分開調配之各種LNP調配物後靶向TTR之編輯效率。 圖4B展示小鼠中在遞送其中gRNA及Cas9 mRNA分開調配之LNP調配物後靶向TTR之編輯效率。 圖5展示細胞中在投與其中gRNA及Cas9 mRNA分開調配之各種LNP調配物後靶向因子VII或TTR之編輯效率。 圖6展示小鼠中在投與其中gRNA及Cas9 mRNA分開調配之各種LNP調配物後靶向因子VII或TTR之編輯效率。 圖7展示細胞中在投與其中gRNA及Cas9 mRNA一起調配且以各種濃度遞送之各種LNP調配物後之編輯效率。 圖8A展示小鼠中在投與各種LNP調配物後靶向TTR之編輯效率。 圖8B展示小鼠中在投與各種LNP調配物後靶向因子VII之編輯效率。 圖9展示自投與各種LNP調配物之動物收集的位點切除之DNA的PCR擴增。 圖10展示投與其中gRNA及Cas9 mRNA一起調配之各種LNP調配物的小鼠之血清TTR含量。 圖11展示小鼠中在動物投與其中gRNA及Cas9 mRNA一起調配之各種LNP調配物後的相對因子VII活性。 圖12A展示小鼠中在以各種劑量投與LNP-169，產生劑量依賴性反應後靶向TTR之編輯效率。 圖12B展示小鼠中各天在以各種劑量投與LNP-169，產生劑量依賴性反應後的血清TTR含量。 圖13A展示小鼠中在投與其中Cas9 mRNA與sgRNA之比率變化之各種LNP調配物後靶向TTR之編輯效率。 圖13B展示小鼠中在分開兩天，在投與其中Cas9 mRNA與sgRNA之比率變化之各種LNP調配物後的血清TTR含量。 圖14A展示小鼠中在投與一劑或兩劑LNP-169後靶向TTR之編輯效率。 圖14B展示小鼠中在投與一劑或兩劑LNP-169後第九天的血清TTR含量。 圖15展示小鼠中在投與各種LNP調配物後脾中靶向TTR之編輯效率。 圖16展示小鼠中在投與各種LNP調配物後靶向TTR之編輯效率。 圖17展示初代小鼠肝實質細胞中在小鼠血清存在下在遞送各種濃度之LNP-169至細胞後，靶向TTR之編輯效率。 圖18展示ApoE對LNP之結合隨著存在之ApoE之量增加而增加。 圖19展示其中指導RNA呈DNA表現卡匣遞送之各種LNP調配物的編輯效率。 圖20展示在初代肝實質細胞培養物與小鼠中活體內肝細胞之間，編輯效率相關。 圖21展示在Neuro 2A活體外細胞株對比初代小鼠肝實質細胞中編輯之獨特修復譜。 圖22展示在初代小鼠肝實質細胞對比活體內小鼠肝細胞中編輯之類似修復譜。 圖23展示作為時間之函數的Cas9 mRNA及指導RNA之血漿濃度。 圖24展示肝組織中作為時間之函數的Cas9 mRNA及指導RNA之濃度。 圖25展示脾組織中作為時間之函數的Cas9 mRNA及指導RNA之濃度。 圖26A展示血漿及組織中作為時間之函數的Cas9 mRNA及指導RNA之相對濃度。 圖26B展示作為時間之函數的血漿及組織中脂質A之濃度。 圖27展示投與LNP後作為時間之函數的血漿細胞介素含量之改變。 圖28展示在投與LNP後隨著時間過去之小鼠血清TTR含量。 圖29A展示在投與LNP後小鼠中隨著時間過去之TTR編輯。 圖29B展示在投與LNP後小鼠中隨著時間過去之TTR編輯及血清TTR含量。 圖30展示在投與含有不同mRNA製劑之LNP後小鼠血清細胞介素含量。 圖31展示在投與含有不同mRNA製劑之LNP後小鼠血清TTR濃度水準。 圖32展示在投與含有不同mRNA製劑之LNP後隨著時間過去之TTR編輯水準。 圖33展示在投與儲存在-80℃或4℃下之LNP後小鼠血清TTR濃度水準。 圖34展示在投與儲存在-80℃或4℃下之LNP後小鼠TTR編輯水準。 圖35展示在投與各種調配物後小鼠血清濃度水準。 圖36展示在投與各種調配物後小鼠肝TTR編輯水準。

<110> 美商英特利亞醫療公司(INTELLIA THERAPEUTICS,INC.)

<120> CRISPR/CAS組分之脂質奈米粒子調配物

<130> 12793.0004-00304

<140> TW 106110909

<141> 2017-03-30

<150> US 62/468,300

<151> 2017-03-07

<150> US 62/433,228

<151> 2016-12-12

<150> US 62/375,776

<151> 2016-08-16

<150> US 62/315,602

<151> 2016-03-30

<160> 164

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 猿猴病毒40

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 猿猴病毒40

<400> 2

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<221> 來源

<223> /note="未知之描述：

核質蛋白雙向NLS序列"

<400> 3

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /note="人工序列之描述：合成

6xHis標籤"

<400> 4

<210> 5

<211> 8

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8xHis標籤"

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<221> 來源

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<220>

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<220>

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<220>

<221> 來源

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<220>

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<400> 164

Claims (31)

1. 一種脂質奈米粒子(LNP)組合物，其包含：編碼Cas核酸酶之mRNA；指導RNA核酸；可電離脂質；輔助脂質；中性脂質；及隱形脂質；其中該可電離脂質選自下列：脂質A [十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯]；脂質B [雙(癸酸)((5-((二甲基胺基)甲基)-1,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛-8,1-二基)酯；脂質C [(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-雙(十八-9,12-二烯酸)2-((4-(((3-(二甲基胺基)丙氧基)羰基)氧基)十六醯基)氧基)丙-1,3-二酯]；及脂質D [3-辛基十一酸3-(((3-(二甲基胺基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛醯基氧基)十三烷酯]。
2. 如請求項1之LNP組合物，其中該編碼Cas核酸酶之mRNA為2類Cas核酸酶mRNA；且該指導RNA核酸為單指導RNA(sgRNA)或編碼sgRNA。
3. 如請求項1之LNP組合物，其中該指導RNA核酸為sgRNA。
4. 如請求項1之LNP組合物，其中該指導RNA核酸為編碼sgRNA之表現卡匣。
5. 如請求項1之LNP組合物，其中該LNP組合物包含第一LNP及第二LNP；該mRNA係封裝在該第一LNP中，以及該指導RNA核酸係封裝在該第二LNP中。
6. 如請求項1之LNP組合物，其中該mRNA及該指導RNA核酸共同封裝在該LNP組合物中。
7. 如請求項1之LNP組合物，其進一步包含至少一種模板核酸。
8. 如請求項1之LNP組合物，其中該mRNA係Cas9核酸酶mRNA。
9. 如請求項8之LNP組合物，其中該Cas9核酸酶mRNA係人類密碼子優化之Cas9核酸酶。
10. 如請求項1之LNP組合物，其中該可電離脂質為脂質A。
11. 如請求項1之LNP組合物，其中該輔助脂質係選自類固醇、固醇及烷基間苯二酚。
12. 如請求項1之LNP組合物，其中該輔助脂質選自膽固醇、5-十七基間苯二酚及膽固醇半琥珀酸酯。
13. 如請求項1之LNP組合物，其中該中性脂質係不帶電或兩性離子脂質。
14. 如請求項1之LNP組合物，其中該中性脂質選自DSPC及DMPE。
15. 如請求項1之LNP組合物，其中該隱形脂質係具有連接於脂質部分之親水性頭基的脂質。
16. 如請求項1之LNP組合物，其中該隱形脂質選自PEG2k-DMG及PEG2k-C11。
17. 如請求項1之LNP組合物，其中至少一種LNP包含脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。
18. 如請求項1之LNP組合物，其中至少一種LNP包含脂質B、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。
19. 如請求項1之LNP組合物，其中該LNP組合物包含約30mol-%至約60mol-%之量的該可電離脂質。
20. 如請求項1之LNP組合物，其中該LNP組合物包含約30mol-%至約60mol-%之量的該輔助脂質。
21. 如請求項1之LNP組合物，其中該可電離脂質包含胺；且該可電離脂質胺與該RNA磷酸之莫耳比為約3至約5。
22. 如請求項1之LNP組合物，其中該LNP具有約75nm至約150nm之粒度。
23. 如請求項1之LNP組合物，其中該mRNA及該指導RNA核酸係以約70%至約100%之封裝效率封裝在該LNP組合物中。
24. 如請求項1至23中任一項之LNP組合物，其係用於在肝細胞中編輯基因。
25. 一種經基因工程改造之肝細胞，其用如請求項1至23中任一項之LNP組合物製備。
26. 一種如請求項1至23中任一項之LNP組合物用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於藉由使肝細胞或ApoE結合細胞與該LNP組合物接觸以基因編輯該肝細胞或ApoE結合細胞。
27. 如請求項26之用途，其中該醫藥品係用於基因編輯肝細胞，且其中 使該肝細胞與該LNP組合物接觸包含遞送該LNP組合物至該肝細胞。
28. 如請求項26之用途，其中該醫藥品係用於基因編輯ApoE結合細胞，且其中使該ApoE結合細胞與該LNP組合物接觸包含遞送該LNP組合物至該ApoE結合細胞。
29. 如請求項26之用途，其中該肝細胞為肝實質細胞。
30. 如請求項26之用途，其中該肝細胞為幹細胞。
31. 如請求項26之用途，其中該LNP達到至少80%之編輯效率。

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