TW202235617A - 用於減少細胞中ii類mhc之組合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於降低細胞中之II類MHC蛋白表現之組合物及方法，其包含基因修飾CIITA以用於例如授受細胞轉移療法中。
Description
下調II類MHC之能力對於許多活體內及離體應用至關重要，例如當使用同種異體細胞(源自供體)進行移植及/或例如在活體外產生不會活化T細胞之細胞群體時。特定言之，將同種異體細胞轉移至個體中係細胞療法領域非常有興趣的。同種異體細胞之使用由於接受個體之免疫細胞排斥問題而受到限制，該等免疫細胞將移植細胞識別為外來的且發動攻擊。為避免免疫排斥問題，基於細胞之療法集中於自體方法，該等方法使用個體自身之細胞作為療法之細胞來源，此為耗時且昂貴的方法。
通常，同種異體細胞之免疫排斥由供體與接受體之間的主要組織相容複合體(MHC)分子失配產生。在人類群體內，MHC分子以各種形式存在，包括例如編碼不同形式之MHC蛋白的任何給定MHC基因之許多遺傳變異體，亦即對偶基因。MHC分子之主要類別稱為I類MHC及II類MHC。I類MHC分子(例如人類中之HLA-A、HLA-B及HLA-C)表現於所有有核細胞上且呈遞抗原以活化細胞毒性T細胞(CD8+ T細胞或CTL)。II類MHC分子(例如人類中之HLA-DP、HLA-DQ及HLA-DR)僅在某些細胞類型(例如B細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞)上表現且呈遞抗原以活化輔助T細胞(CD4+ T細胞或Th細胞)，進而向B細胞提供信號以產生抗體。
例如個體之間的MHC對偶基因之微小差異會導致接受體中之T細胞變得活化。在T細胞發育期間，個體之T細胞庫對自身MHC分子具有耐受性，但識別另一個體之MHC分子之T細胞可在循環中持續存在且稱為同種異體反應性T細胞。同種異體反應性T細胞可例如藉由在體內存在另一個體的表現MHC分子之細胞而變得活化，引起例如移植物抗宿主疾病及移植排斥反應。
用於降低同種異體細胞對排斥反應之易感性的方法及組合物係令人感興趣的，包括例如降低細胞之MHC蛋白表現以避免接受體T細胞反應。實務上，基因修飾同種異體細胞以移植至個體中之能力受到在多重基因編輯以降低所有MHC蛋白表現的同時要避免其他有害接受體免疫反應之要求的妨礙。舉例而言，儘管耗竭I類MHC蛋白之策略可能會減少CTL活化，但在表面上缺乏I類MHC之細胞易於由免疫系統之自然殺手(NK)細胞溶解，因為NK細胞活化係藉由I類MHC特異性抑制受體調節。耗竭II類MHC分子之基因編輯策略亦已證實係困難的，尤其在某些細胞類型中，原因包括低編輯效率及低細胞存活率，阻礙了作為細胞療法之實際應用。
因此，需要用於修飾同種異體細胞之改良方法及組合物以克服接受體免疫排斥問題及與產生更安全移植細胞所需之多重基因修飾相關的技術難題。
本發明提供具有降低或消除的II類MHC表面表現之工程化細胞。工程化細胞包含CIITA基因(II類主要組織相容複合體反式活化子)中之基因修飾，可適用於細胞療法。本發明進一步提供藉由基因修飾CIITA基因來降低或消除細胞中II類MHC蛋白之表面表現的組合物及方法。CIITA蛋白充當轉錄活化子(活化II類MHC啟動子)且對II類MHC蛋白表現至關重要。在一些實施例中，本發明進一步提供藉由基因修飾B2M (β-2-微球蛋白)來降低或消除細胞中I類MHC蛋白之表面表現的組合物及方法。B2M蛋白與I類MHC分子形成雜二聚體且為細胞表面上之I類MHC蛋白表現所需。本發明進一步提供藉由細胞表現NK細胞抑制劑分子，以降低或消除NK細胞之裂解活性。在一些實施例中，方法及組合物進一步提供例如編碼靶向受體、在細胞表面上表現之其他多肽或自細胞分泌之多肽之外源核酸的插入。因此，在一些實施例中，工程化細胞適用作「細胞工廠」，用於在接受體中分泌外源蛋白。在一些實施例中，工程化細胞適用作授受細胞療法。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現，該工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的修飾。在一些實施例中，一個核苷酸為A。在一些實施例中，一個核苷酸為G。在一些實施例中，基因修飾包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的修飾。在一些實施例中，一個核苷酸為G。在一些實施例中，一個核苷酸為T。在一些實施例中，基因修飾包含剪接位點邊界核苷酸之修飾。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現，該工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234。在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173及chr16:10916450-10916470。
在一些實施例中，提供一種組合物，該組合物包含：a)包含引導序列之CIITA引導RNA，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割；其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，該組合物包含：a)CIITA引導RNA (gRNA)，該gRNA包含i)選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 1-101之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%、90%或85%一致之導引序列；或iv)包含表1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列；或v)來自(iv)之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，該組合物包含：a)CIITA引導RNA，其為單引導RNA (sgRNA)，該sgRNA包含i)選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 1-101之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%、90%或85%一致之導引序列；或iv)包含表1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列；或v)來自(iv)之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列。
在一些實施例中，提供一種製造工程化細胞之方法，該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，該方法包含使細胞與本文提供之任何實施例的組合物接觸。在一些實施例中，組合物包含CIITA引導RNA，該RNA包含選自以下之核苷酸：SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100及SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，組合物包含CIITA引導RNA，該RNA包含選自以下之核苷酸：SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98及SEQ ID NO: 100。
在一些實施例中，提供一種相對於未經修飾細胞降低工程化細胞中II類MHC蛋白之表面表現的方法，該方法包含使細胞與本文提供之任何實施例的組合物接觸。
本申請案根據35 U.S.C. 119(e)主張2020年12月11日申請之美國臨時申請案第63/124,064號及2020年12月23日申請之美國臨時申請案第63/130,106號之權益；該等申請案之揭示內容各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供工程化細胞，以及用於基因修飾細胞以製備適用於例如授受細胞轉移(ACT)療法之工程化細胞及工程化細胞群體的方法及組合物。本文所提供之本發明藉由提供用於基因修飾CIITA以降低細胞表面上II類MHC蛋白之表現的方法及組合物來克服先前方法之某些障礙。在一些實施例中，本發明提供工程化細胞，其由於CIITA基因中之基因修飾而具有降低或消除的II類MHC之表面表現。在一些實施例中，本發明提供用於降低或消除II類MHC蛋白之表現的組合物及方法及進一步降低細胞對免疫排斥之易感性的組合物及方法。舉例而言，在一些實施例中，方法及組合物包含藉由基因修飾CIITA來降低或消除II類MHC蛋白之表面表現，及降低或消除I類MHC蛋白之表面表現及/或藉由基因修飾將編碼NK細胞抑制劑分子或靶向受體或其他多肽(表現於細胞表面上或分泌的)之外源核酸插入細胞中。藉由本文所揭示之方法產生的工程化細胞組合物具有所需特性，包括例如降低的MHC分子表現、降低的活體外及活體內免疫原性、增加的存活率及增加的與更多移植個體之基因相容性。
術語「約」或「大約」意謂如由一般熟習此項技術者所測定之特定值的可接受之誤差，其部分地取決於如何量測或測定該值、或變化程度不會實質上影響所述標的物之特性，或在此項技術中所接受之容限內，例如在10%、5%、2%或1%內。因此，除非有相反指示，否則本說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。
I. 定義
除非另外說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
如本文所用，術語「或其組合」係指在該術語前面所列項之所有排列及組合。舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下中之至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情況下順序為重要的，則亦包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。繼續此實例，明確地包括含有一或多個項或術語之重複的組合，諸如BB、AAA、AAB、BBC、CBBA、CABA等等。熟習此項技術者應理解，除非另外自上下文顯而易知，否則通常不存在對任何組合中之項目或項之數目的限制。
如本文所用，術語「套組」係指相關組分，諸如一或多種多核苷酸或組合物及一或多種相關材料，諸如遞送裝置(例如注射器)、溶劑、溶液、緩衝劑、說明書或乾燥劑之封裝組。
如本文所用，「同種異體」細胞係指源自與接受個體相同種類之供體個體的細胞，其中供體個體及接受個體具有基因相異性，例如一或多個基因座處的基因不一致。因此，例如，細胞相對於待投與該細胞之個體為同種異體的。如本文所用，自供體移出或分離、將不再引入至原始供體中之細胞被視為同種異體細胞。
如本文所用，「自體」細胞係指源自相同個體的細胞，稍後將向該個體再引入材料。因此，例如，若細胞自個體移出且其隨後再引入至相同個體中，則其視為自體的。
如本文所用，「β2M」或「B2M」係指「β-2微球蛋白」之核酸序列或蛋白質序列；人類基因具有寄存編號NC_000015 (範圍44711492..44718877)，參考GRCh38.p13。B2M蛋白與有核細胞表面上雜二聚體形式之I類MHC分子相關，且為I類MHC蛋白表現所需。
如本文所使用，「
CIITA」或「CIITA」或「C2TA」係指「II類主要組織相容複合體反式活化子」之核酸序列或蛋白質序列；人類基因具有寄存編號NC_000016.10 (範圍10866208..10941562)，參考GRCh38.p13。細胞核中之CIITA蛋白充當II類MHC基因轉錄之正調節因子且為II類MHC蛋白表現所需。
如本文所用，「MHC」或「MHC分子」或「MHC蛋白」或「MHC複合物」係指一個主要組織相容複合體分子(或複數個)，且包括例如I類MHC及II類MHC分子。在人類中，MHC分子稱為「人類白血球抗原」複合物或「HLA分子」或「HLA蛋白」。術語「MHC」及「HLA」之使用不意欲為限制性的；如本文所用，術語「MHC」可用於指人類MHC分子，亦即HLA分子。因此，術語「MHC」及「HLA」在本文中可互換使用。
如本文所用，HLA-A蛋白之上下文中的術語「HLA-A」係指I類MHC蛋白分子，其為由重鏈(由HLA-A基因編碼)及輕鏈(亦即β-2微球蛋白)組成之異二聚體。如本文所用，在核酸之上下文中的術語「HLA-A」或「HLA-A基因」係指編碼HLA-A蛋白分子之重鏈的基因。HLA-A基因亦稱為「HLA I類組織相容，A α鏈」；人類基因具有寄存編號NC_000006.12 (29942532..29945870)。已知HLA-A基因跨群體具有數千種不同型式(亦稱為「對偶基因」) (且個體可接受HLA-A基因之兩種不同對偶基因)。HLAA對偶基因之公共資料庫(包括序列資訊)可在IPD-IMGT/HLA: https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/訪問。HLA-A之所有對偶基因均由術語「HLA-A」及「HLA-A基因」涵蓋。
如本文在核酸之上下文中所用之術語「HLA-B」係指編碼HLA-B蛋白分子之重鏈的基因。HLA-B基因亦稱為「HLA I類組織相容，B α鏈」；人類基因具有寄存編號NC_000006.12 (31353875..31357179)。
如本文在核酸之上下文中所用的術語「HLA-C」係指編碼HLA-C蛋白分子之重鏈的基因。HLA-C基因亦稱為「HLA I類組織相容，C α鏈」；人類基因具有寄存編號NC_000006.12 (31268749..31272092)。
如本文所用，術語「基因體座標內」包括給定基因體座標範圍的邊界。舉例而言，若給出chr6:29942854- chr6:29942913，則涵蓋座標chr6:29942854- chr6:29942913。在整個本申請案中，參考之基因體座標係基於來自基因體參考聯合會(Genome Reference Consortium)之人類基因體的GRCh38(亦稱為hg38)組裝中之基因體註釋，該基因體參考聯合會可在國家生物技術資訊中心網站上獲得。用於在一個組裝與另一組裝之間轉化基因體座標的工具及方法為此項技術中已知且可用於將本文中提供之基因體座標轉化為人類基因體之另一組裝中之對應座標，包括轉化為由同一機構或使用相同演算法產生之早期組裝(例如自GRCh38至GRCh37)，及轉化由不同機構或演算法產生之組裝(例如自GRCh38至NCBI33，藉由國際人類基因體定序聯合會(International Human Genome Sequencing Consortium)產生)。此項技術中已知之可用方法及工具包括但不限於可在國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information website)網站獲得的NCBI Genome Remapping Service、可在UCSC Genome Brower網站獲得的UCSC LiftOver及可在Ensembl.org網站獲得的Assembly Converter。
如本文所用，術語「同型接合」係指具有特定基因之兩個相同對偶基因。
如本文所用，「剪接位點」係指構成受體剪接位點或供體剪接位點(下文所定義)或此項技術中已知為剪接位點之一部分的任何其他核苷酸的三個核苷酸。參見例如Burset等人, Nucleic Acids Research 28(21):4364-4375 (2000) (描述哺乳基因體中之典型及非典型剪接位點)。構成「受體剪接位點」之三個核苷酸在內含子之3'及邊界核苷酸(亦即，AG之外顯子3'之第一核苷酸)處為兩個保守殘基(例如，人類中之AG)。受體剪接位點之「剪接位點邊界核苷酸」在下圖中指定為「Y」，且亦可在本文中稱為「受體剪接位點邊界核苷酸」或「剪接受體位點邊界核苷酸」。術語「受體剪接位點」、「剪接受體位點」、「受體剪接序列」或「剪接受體序列」可在本文中互換使用。
構成「供體剪接位點」之三個核苷酸為內含子之5'端處的兩個保守殘基(例如，人類中之GT (基因)或GU (在RNA中，諸如前mRNA))及邊界核苷酸(亦即，GT之外顯子5'的第一個核苷酸)。供體剪接位點之「剪接位點邊界核苷酸」在下圖中指定為「X」，且亦可在本文中稱為「供體剪接位點邊界核苷酸」或「剪接供體位點邊界核苷酸」。術語「供體剪接位點」、「剪接供體位點」、「供體剪接序列」或「剪接供體序列」可在本文中互換使用。
如本文所用，「剪接位點區域」包括剪接位點處之核苷酸，以及鄰近剪接位點之核苷酸。
如本文所用，術語「個體」意欲包括可引發免疫反應之活的生物體，包括例如哺乳動物、靈長類動物、人類。
「聚核苷酸(polynucleotide)」及「核酸(nucleic acid)」在本文中用以指包含含氮雜環鹼基或鹼基類似物沿主鏈連接在一起之核苷或核苷類似物的多聚化合物，其包括習知RNA、DNA、混合RNA-DNA及為其類似物之聚合物。核酸「主鏈(backbone)」可由多個鍵聯構成，其包括糖-磷酸二酯鍵、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯鍵或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖，或具有取代(例如2'甲氧基或2'鹵基取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他經修飾之尿苷)、肌核苷、嘌呤或嘧啶之衍生物(例如N
4-甲基去氧鳥苷、去氮嘌呤或氮雜嘌呤、去氮嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位處具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位處具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O
6-甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O
4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般論述，參見
The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams等人編, 第11版, 1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括針對聚合物位置之含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習知組分與取代(例如具有2'甲氧基鍵聯之習知鹼基，或含有習知鹼基與一或多個鹼基類似物的聚合物)。核酸包括「鎖核酸」(LNA)、含有一或多種LNA核苷酸單體之類似物，該等單體具有模擬糖構形之鎖定於RNA中的雙環呋喃醣單元，其會增強對互補RNA及DNA序列之雜合親和性(Vester及Wengel, 2004,
Biochemistry43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且不同之處可為在RNA中存在尿嘧啶或其類似物及在DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物。
「引導RNA」、「gRNA」及簡稱「引導物」可在本文中互換地用於指例如將經RNA引導之DNA結合劑導引至目標DNA的引導物，且可為單一引導RNA或crRNA與trRNA (亦稱為tracrRNA)之組合。例示性gRNA包括經修飾或未經修飾形式之II類Cas核酸酶引導RNA。crRNA及trRNA可以單一RNA分子(單引導RNA，sgRNA)或以兩個獨立RNA股(雙引導RNA，dgRNA)形式締合。「引導RNA」或「gRNA」係指各類型。trRNA可為天然存在之序列，或與天然存在之序列相比具有修飾或變異之trRNA序列。
如本文所用，「引導序列」係指引導RNA中與目標序列互補且用以藉由經RNA引導之DNA結合劑將引導RNA導引至目標序列以供結合或修飾(例如裂解)的序列。「引導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔序列」。引導序列之長度可為20個鹼基對，例如在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (亦即Spy Cas9 (SpCas9))及相關Cas9同源物/直系同源物之情況下。較短或較長序列亦可用作例如長度為15、16、17、18、19、21、22、23、24或25個核苷酸之引導物。在一些實施例中，目標序列處於例如基因中或染色體上，且與引導序列互補。在一些實施例中，引導序列與其對應目標序列之間的互補性或一致性之程度可為約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，引導序列與目標區域可為100%互補或一致的。在其他實施例中，引導序列及目標區域可含有至少一個失配。舉例而言，引導序列及目標序列可含有1、2、3或4個失配，其中目標序列之總長度為至少17、18、19、20個或更多個鹼基對。在一些實施例中，引導序列及目標區域可含有1至4個失配，其中引導序列包含至少17、18、19、20個或更多個核苷酸。在一些實施例中，引導序列及目標區域可含有1、2、3或4個失配，其中引導序列包含20個核苷酸。
經RNA引導之DNA結合劑之目標序列包括基因體DNA之正及負股(亦即既定序列及序列之反向互補序列)，此係因為經RNA引導之DNA結合劑之核酸受質為雙股核酸。因此，在引導序列據稱「與靶序列互補」之情況下，應理解，引導序列可導引引導RNA結合至目標序列之反向補體。因此，在一些實施例中，在引導序列結合目標序列之反向互補序列之情況下，引導序列與目標序列(例如不包括PAM之目標序列)之某些核苷酸具有一致性，不同之處在於在引導序列中U取代T。
如本文所用，「經RNA引導之DNA結合劑」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或此類複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性具有序列特異性且依賴於RNA序列。例示性經RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」亦稱作「Cas蛋白」，其涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶。如本文所用，「2類Cas核酸酶」為具有經RNA引導之DNA結合活性的單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A變異體)，其進一步具有經RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性，及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人, Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源且含有RuvC樣核酸酶域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如Zetsche，表S1及表S3。參見例如Makarova等人,
Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人,
Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，術語「編輯劑」係指包含能夠在DNA序列內進行修飾之多肽的試劑。在一些實施例中，編輯劑為裂解酶，諸如Cas9裂解酶。在一些實施例中，編輯劑能夠使DNA分子內之鹼基脫胺。在一些實施例中，編輯劑能夠使DNA中之胞嘧啶(C)脫胺。在一些實施例中，編輯劑為包含與胞苷去胺酶融合之經RNA引導之切口酶的融合蛋白。在一些實施例中，編輯劑為包含與APOBEC3A去胺酶(A3A)融合之經RNA引導之切口酶的融合蛋白。在一些實施例中，編輯劑包含與APOBEC3A去胺酶(A3A)融合之Cas9切口酶。在一些實施例中，編輯劑為包含與胞苷去胺酶域融合之經RNA引導之切口酶及UGI的融合蛋白。在一些實施例中，編輯劑缺乏UGI。
如本文所用，「胞苷去胺酶」意謂能夠具有胞苷去胺酶活性之多肽或多肽複合物，其催化胞苷或去氧胞苷之水解脫胺作用，通常產生尿苷或去氧尿苷。胞苷去胺酶涵蓋胞苷去胺酶超家族中之酶，且特定言之APOBEC家族之酶(酶之APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4及APOBEC3)、活性誘導之胞苷去胺酶(AID或AICDA)及CMP去胺酶(參見例如Conticello等人，Mol. Biol. Evol. 22:367-77，2005；Conticello，Genome Biol. 9:229，2008；Muramatsu等人，J. Biol. Chem. 274: 18470-6, 1999)；Carrington等人，Cells 9:1690 (2020))。
如本文所用，術語「APOBEC3」係指APOBEC3蛋白，諸如由人類APOBEC3基因座之七個基因(A3A-A3H)中之任一者表現的APOBEC3蛋白。APOBEC3可具有催化DNA或RNA編輯活性。已描述APOBEC3A之胺基酸序列(UniPROT寄存ID: p31941)且作為SEQ ID NO: 40包括在本文中。在一些實施例中，APOBEC3蛋白為人類APOBEC3蛋白及/或野生型蛋白。變異體包括具有與野生型APOBEC3蛋白相差一個或若干個突變(亦即取代、缺失、插入)，諸如一個或若干個單點取代之序列的蛋白。舉例而言，可使用縮短之APOBEC3序列，例如藉由使若干N-端或C-端胺基酸，較佳使序列C-端之一個至四個胺基酸缺失。如本文所用，術語「變異體」係指與APOBEC3參考序列同源的對偶基因變異體、剪接變異體及天然或人工突變體。變異體為「功能性的」，因為其顯示DNA或RNA編輯之催化活性。在一些實施例中，APOBEC3 (諸如人類APOBEC3A)具有野生型胺基酸位置57 (如在野生型序列中編號)。在一些實施例中，APOBEC3 (諸如人類APOBEC3A)在胺基酸位置57 (如在野生型序列中編號)具有天冬醯胺。
如本文所用，「切口酶」為在雙股DNA中產生單股斷裂(亦稱為「切口」)之酶，亦即切割DNA雙螺旋之一股但不切割另一股。如本文所用，「經RNA引導之DNA切口酶」意謂具有DNA切口酶活性之多肽或多肽複合物，其中DNA切口酶活性為序列特異性的且取決於RNA之序列。例示性經RNA引導之DNA切口酶包括Cas切口酶。Cas切口酶包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶的切口酶形式。2類Cas切口酶包括變異體，其中兩個催化域中之僅一者失活，其具有經RNA引導之DNA切口酶活性。2類Cas切口酶包括例如Cas9 (例如SpyCas9之H840A、D10A或N863A變異體)、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人, Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源且含有RuvC樣蛋白域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如Zetsche，表S1及表S3。「Cas9」涵蓋釀膿鏈球菌(Spy)Cas9、本文所列之Cas9之變異體及其等效物。參見例如Makarova等人, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指包含來自至少兩種不同蛋白之蛋白域的雜合多肽。一種蛋白可位於融合蛋白之胺基端(N端)部分或羧基端(C端)蛋白處，因此分別形成「胺基端融合蛋白」或「羧基端融合蛋白」。本文所提供之任一蛋白可藉由此項技術中已知之任何方法產生。舉例而言，本文所提供之蛋白可經由重組蛋白表現及純化來產生，其尤其適合於包含肽連接子之融合蛋白。重組蛋白表現及純化之方法為熟知的，且包括由Green及Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))描述之彼等方法，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。
如本文所用之術語「連接子」係指連接兩個相鄰分子或部分之化學基團或分子。通常，連接子位於兩個基團、分子或其他部分之間或由兩個基團、分子或其他部分側接，且經由共價鍵彼此連接。在一些實施例中，連接子為一個胺基酸或複數個胺基酸(例如肽或蛋白質)，諸如16個胺基酸殘基之「XTEN」連接子或其變異體(參見例如實例；及Schellenberger等人，A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接子包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 900)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 901)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 902)。在一些實施例中，連接子為包含選自SEQ ID NO: 903-971之一或多個序列的肽連接子。
如本文所用，術語「尿嘧啶醣苷酶抑制劑」或「UGI」係指能夠抑制尿嘧啶-DNA醣苷酶(UDG)鹼基切除修復酶之蛋白質。
如本文所用，基因之「開讀框」或「ORF」係指由一系列密碼子組成的序列，該等密碼子指定該基因編碼之蛋白質的胺基酸序列。ORF開始於起始密碼子(例如DNA中之ATG或RNA中之AUG)且以終止密碼子結束，例如DNA中之TAA、TAG或TGA或RNA中之UAA、UAG或UGA)。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指引導RNA以及經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、切口酶或dCas DNA結合劑(例如Cas9)。在一些實施例中，引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9導引至目標序列，且該引導RNA與目標序列雜交且該結合劑結合於目標序列；在結合劑為裂解酶或切口酶之情況下，結合之後進行裂解或切口。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配，則第一序列被視為「包含與第二序列具有至少X%一致的序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，此係因為第二序列之全部三個位置均存在匹配，因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(一般而言，尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)的存在不會造成聚核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同補體(例如對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全體而言，為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為補體)。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為任何經修飾之尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被視為與AUG 100%一致，因為兩者與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對演算法為所屬領域中熟知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)及尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)演算法。熟習此項技術者應理解何種演算法選擇及參數設置適合於待對準之給定序列對；對於具有一般類似長度及針對胺基酸之＞50%預期一致性或針對核苷酸之＞75%預期一致性的序列而言，由EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的尼德曼-翁施演算法介面之具有預設設置的尼德曼-翁施演算法通常為適合的。
「mRNA」在本文中用於指聚核苷酸且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框架(亦即可充當用於藉由核糖體及胺基醯化tRNA進行之轉譯之受質)。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，其包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。
如本文所用，「插入/缺失」係指由多種核苷酸組成之插入/缺失突變，該等核苷酸例如在目標核酸中之雙股斷裂(DSB)位點處插入或缺失。
如本文所用，細胞上蛋白質之表現「降低或消除」係指相對於未經修飾細胞而言，蛋白質之表現部分或完全損失。在一些實施例中，藉由流動式細胞測量術量測細胞上蛋白質之表面表現，且相對於未經修飾細胞，具有「降低或消除的」表面表現，如藉由用針對蛋白質之相同抗體染色後螢光信號的減少所證明。藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞具有「降低或消除的」蛋白質表面表現之細胞可稱作對於彼蛋白質之表現為「陰性的」，如藉由類似於用同型對照抗體染色之細胞的螢光信號所證明。「降低或消除的」蛋白質表現係利用熟習此項技術者已知之適當對照，藉由此項技術中之其他已知技術來量測。
如本文所用，「減弱」係指特定基因產物(例如蛋白質、mRNA或兩者)之表現降低，例如相較於未經編輯之靶序列之表現。蛋白質之減弱可藉由偵測來自樣品，諸如所關注之組織、體液或細胞群體之蛋白質的總細胞量來量測。其亦可藉由量測蛋白質之替代物、標記或活性來量測。用於量測mRNA之減弱之方法為已知的，且包括對自所關注樣品分離之mRNA進行分析。在一些實施例中，「減弱」可指一些特定基因產物之表現缺失，例如經轉錄之mRNA的量下降或由細胞或細胞群體(包括活體內群體，諸如組織中所發現之彼等者)表現之蛋白質的量下降。
如本文所用，「基因剔除(knockout)」係指細胞中之特定基因或特定蛋白質之表現缺失。基因剔除可導致表現降低至分析之偵測水準以下。基因剔除可偵測細胞、組織或細胞群體中蛋白質之總細胞量來量測。
如本文所用，「目標序列」或「基因體目標序列」係指目標基因中與gRNA之引導序列具有互補性的核酸序列。目標序列與引導序列之相互作用導引經RNA引導之DNA結合劑結合，且在目標序列中潛在地切口或裂解(視試劑活性而定)。
如本文所用，「治療(treatment)」係指投與或施用用於個體之疾病或病症的治療劑，且包括抑制疾病、遏制其發展、減輕疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀，包括症狀復發。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例在附圖中加以說明。儘管本發明結合所說明之實施例加以描述，但應理解其不意欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋所有替代例、潤飾及等效物，其可包括於如隨附申請專利範圍及所包括之實施例所定義的本發明內。
在詳細描述本教示內容之前，應瞭解，本發明不限於特定組合物或方法步驟，因而可加以改變。應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。因此，舉例而言，提及「結合物(a conjugate)」包括複數個結合物且提及「細胞(a cell)」包括複數個細胞及其類似物。
數值範圍包括界定該範圍之數字。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，實測值及可量測值應理解為近似值。此外，「包含(comprise/comprises/comprising)」、「含有(contain/contains/containing)」及「包括(include/includes/including)」之使用不希望具有限制性。應理解，前述一般描述與詳細描述僅為例示性及解釋性的且並不限制教示內容。
除非說明書中具體指出，否則本說明書中敍述「包含」各種組分之實施例亦設想為「由所敍述組分組成」或「基本上由所敍述組分組成」；本說明書中敍述「由各種組分組成」之實施例亦設想為「包含」所敍述組分或「基本上由所敍述組分組成」；且本說明書中敍述「基本上由各種組分組成」之實施例亦設想為「由所敍述組分組成」或「包含」所敍述組分(此互換性並不適用於此等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另外明確說明，否則術語「或(or)」以包括性意義使用，亦即等於「及/或(and/or)」。
本文所用之章節標題僅出於組織目的而不應解釋為以任何方式限制所需主題。在以引用的方式併入之任何材料與本說明書中所定義之任何術語或本說明書之任何其他表述內容相矛盾之情況下，以本說明書為準。儘管本發明之教示係與各種實施例結合描述，但並不意欲使本發明之教示限制於此類實施例。相反，如熟習此項技術者將瞭解，本教示內容涵蓋各種替代方案、修改及等效物。
II. 經基因修飾之細胞 A. 工程化細胞組合物
本發明提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞組合物。在一些實施例中，工程化細胞組合物包含CIITA基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，具有降低的II類MHC表現之工程化細胞適用於授受細胞轉移療法。在一些實施例中，工程化細胞在細胞基因體中包含額外基因修飾以產生同種異體移植目的所需之細胞。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10877360-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的修飾。在一些實施例中，基因修飾包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的修飾，其中一個核苷酸為腺嘌呤(A)。在一些實施例中，基因修飾包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的修飾，其中一個核苷酸為鳥嘌呤(G)。在一些實施例中，基因修飾包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的修飾。在一些實施例中，基因修飾包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的修飾，其中該一個核苷酸為鳥嘌呤(G)。在一些實施例中，基因修飾包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的修飾，其中一個核苷酸為胸腺嘧啶(T)。在一些實施例中，基因修飾包含剪接位點邊界核苷酸之修飾。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞在CIITA基因中包含基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10903873-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr:16:10906485-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10908130-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173及chr16:10916450-10916470。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476及chr16:10918504-10918524。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10908132-10908152內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10908131-10908151內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10916456-10916476內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含選自以下之基因體內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含以下基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470及chr16:10922153-10922173。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238及chr16:10923219-10923239。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10923218-10923238內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10923219-10923239內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173及chr16:10916450-10916470。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476及chr16:10918504-10918524。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10908132-10908152內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10908131-10908151內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10916456-10916476內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470及chr16:10922153-10922173。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238及chr16:10923219-10923239。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10923218-10923238內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10923219-10923239內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少10個連續核苷酸：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少10個連續核苷酸：chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少10個連續核苷酸：chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少10個連續核苷酸：chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234。在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173及chr16:10916450-10916470。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476及chr16:10918504-10918524。在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含基因體座標chr16:10908132-10908152內之至少5個連續核苷酸：在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含基因體座標chr16:10908131-10908151內之至少5個連續核苷酸：在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含基因體座標chr16:10916456-10916476內之至少5個連續核苷酸：在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之至少5個連續核苷酸：在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，去胺酶為APOBEC3去胺酶，諸如APOBEC3A (A3A)。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470及chr16:10922153-10922173。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，去胺酶為APOBEC3去胺酶，諸如APOBEC3A (A3A)。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238及chr16:10923219-10923239。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，去胺酶為APOBEC3去胺酶，諸如APOBEC3A (A3A)。
在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含基因體座標:10918504-10918524內之至少5個連續核苷酸：在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含基因體座標chr16:10923218-10923238內之至少5個連續核苷酸：在一些實施例中，提供一種工程化細胞，其藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除II類MHC之表面表現，該目標序列包含基因體座標chr16:10923219-10923239內之至少5個連續核苷酸：在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，去胺酶為APOBEC3去胺酶，諸如APOBEC3A (A3A)。
在一些實施例中，對於基因體座標之各給定範圍，範圍可涵蓋指定座標之任一端上的+/-10個核苷酸。對於基因體座標之各給定範圍，範圍可涵蓋指定座標之任一端上的+/-5個核苷酸。舉例而言，若給出chr16:10923222-10923242，則在一些實施例中，基因體目標序列或基因修飾可落入chr16:10923212-10923252內。
在一些實施例中，基因體座標之給定範圍可包含DNA之兩股(亦即，正(+)股及負(-)股)上之目標序列。
CIITA基因中之基因修飾進一步描述於本文中。在一些實施例中，CIITA基因中之基因修飾包含目標序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或脫胺中之任何一或多者。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾不活化剪接位點。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含剪接位點核苷酸處之插入。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含剪接位點核苷酸之缺失。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含剪接位點核苷酸之取代。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含剪接位點核苷酸之脫胺。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含如本文所述之CIITA基因中之基因修飾，且其中細胞進一步具有降低或消除的HLA-A之表面表現。在一些實施例中，工程化細胞包含HLA-A基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，工程化細胞包含消除工程化細胞表面上HLA-A蛋白之表現的基因修飾。
本文所述之工程化人類細胞可包含HLA-A基因之任何HLA-A對偶基因中的基因修飾。HLA基因位於染色體6中稱為HLA超基因座之基因體區域中；此項技術中已報導數百個HLA-A對偶基因(參見例如Shiina等人, Nature 54:15-39 (2009)。HLA-A對偶基因之序列為此項技術中可獲得的(參見例如用於檢索特定HLA-A對偶基因之序列的IPD-IMGT/HLA資料庫https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html)。
在以上實施例中之任一者中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞之HLA-A表現藉由結合至HLA-A基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞之HLA-A表現藉由結合至HLA-A基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞之HLA-A表現藉由結合至HLA-A基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞之HLA-A表現藉由結合至HLA-A基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞之HLA-A表現藉由結合至HLA-A基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173及chr16:10916450-10916470，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173及chr16:10916450-10916470，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞之HLA-A表現藉由結合至HLA-A基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239，且其中細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞之HLA-A表現藉由結合至HLA-A基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步具有降低或消除的I類MHC之表面表現。在一些實施例中，工程化細胞包含β-2-微球蛋白(B2M)基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含降低工程化細胞表面上I類MHC蛋白之表現的基因修飾。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步包含外源核酸。在一些實施例中，外源核酸編碼表現於工程化細胞之表面上的靶向受體。在一些實施例中，靶向受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，靶向受體為通用CAR (UniCar)。在一些實施例中，靶向受體為T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，靶向受體為WT1 TCR。在一些實施例中，靶向受體為雜合CAR/TCR。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域及TCR之次單元)。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR)。在一些實施例中，外源核酸編碼由工程化細胞分泌之多肽(亦即可溶性多肽)。在一些實施例中，外源核酸編碼治療多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼酶。在一些實施例中，外源核酸編碼細胞介素。在一些實施例中，外源核酸編碼趨化因子。在一些實施例中，外源核酸編碼融合蛋白。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，其中細胞進一步具有降低或消除的I類MHC之表面表現，且其中該細胞進一步包含外源核酸。在一些實施例中，工程化細胞包含β-2-微球蛋白(B2M)基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含降低工程化細胞表面上I類MHC蛋白之表現的基因修飾。在一些實施例中，外源核酸編碼表現於工程化細胞之表面上的靶向受體。在一些實施例中，靶向受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，靶向受體為通用CAR (UniCar)。在一些實施例中，靶向受體為T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，靶向受體為WT1 TCR。在一些實施例中，靶向受體為雜合CAR/TCR。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域及TCR之次單元)。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR)。在一些實施例中，外源核酸編碼由工程化細胞分泌之多肽(亦即可溶性多肽)。在一些實施例中，外源核酸編碼治療多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼酶。在一些實施例中，外源核酸編碼細胞介素。在一些實施例中，外源核酸編碼趨化因子。在一些實施例中，外源核酸編碼融合蛋白。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902662-chr16:10923285內之外顯子的至少一個核苷酸，其中細胞進一步具有降低或消除的HLA-A之表面表現，且其中該細胞進一步包含外源核酸。在一些實施例中，工程化細胞包含HLA-A基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含降低工程化細胞表面上HLA-A蛋白之表現的基因修飾。在一些實施例中，外源核酸編碼表現於工程化細胞之表面上的靶向受體。在一些實施例中，靶向受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，靶向受體為通用CAR (UniCar)。在一些實施例中，靶向受體為T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，靶向受體為WT1 TCR。在一些實施例中，靶向受體為雜合CAR/TCR。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域及TCR之次單元)。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR)。在一些實施例中，外源核酸編碼由工程化細胞分泌之多肽(亦即可溶性多肽)。在一些實施例中，外源核酸編碼治療多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼酶。在一些實施例中，外源核酸編碼細胞介素。在一些實施例中，外源核酸編碼趨化因子。在一些實施例中，外源核酸編碼融合蛋白。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步具有相對於未經修飾細胞降低或消除的內源性TCR蛋白表現。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步包含外源核酸，且進一步具有相對於未經修飾細胞降低或消除的內源性TCR蛋白表現。在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步具有降低或消除的I類MHC之表面表現，且其中該細胞進一步具有相對於未經修飾細胞降低或消除的內源性TCR蛋白表現。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步包含外源核酸，且其中該細胞進一步具有降低或消除的I類MHC之表面表現，且其中該細胞進一步具有相對於未經修飾細胞降低或消除的內源性TCR蛋白表現。在一些實施例中，工程化細胞具有相對於未經修飾細胞降低或消除的TRAC蛋白表現。在一些實施例中，工程化細胞具有相對於未經修飾細胞降低或消除的TRBC蛋白表現。在一些實施例中，工程化細胞包含β-2-微球蛋白(B2M)基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含降低工程化細胞表面上I類MHC蛋白之表現的基因修飾。在一些實施例中，外源核酸編碼表現於工程化細胞之表面上的靶向受體。在一些實施例中，靶向受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，靶向受體為通用CAR (UniCar)。在一些實施例中，靶向受體為T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，靶向受體為WT1 TCR。在一些實施例中，靶向受體為雜合CAR/TCR。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域及TCR之次單元)。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR)。在一些實施例中，外源核酸編碼由工程化細胞分泌之多肽(亦即可溶性多肽)。在一些實施例中，外源核酸編碼治療多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼酶。在一些實施例中，外源核酸編碼細胞介素。在一些實施例中，外源核酸編碼趨化因子。在一些實施例中，外源核酸編碼融合蛋白。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現的工程化細胞，其包含CIITA基因中之基因修飾，其中該修飾包含基因體座標chr16:10902662-chr16:10923285內之外顯子的至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步包含外源核酸，且其中該細胞進一步具有降低或消除的HLA-A之表面表現，且其中該細胞進一步具有相對於未經修飾細胞降低或消除的內源性TCR蛋白表現。在一些實施例中，工程化細胞具有相對於未經修飾細胞降低或消除的TRAC蛋白表現。在一些實施例中，工程化細胞具有相對於未經修飾細胞降低或消除的TRBC蛋白表現。在一些實施例中，工程化細胞包含HLA-A基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含降低工程化細胞表面上HLA-A蛋白之表現的基因修飾。在一些實施例中，外源核酸編碼表現於工程化細胞之表面上的靶向受體。在一些實施例中，靶向受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，靶向受體為通用CAR (UniCar)。在一些實施例中，靶向受體為T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，靶向受體為WT1 TCR。在一些實施例中，靶向受體為雜合CAR/TCR。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域及TCR之次單元)。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR)。在一些實施例中，外源核酸編碼由工程化細胞分泌之多肽(亦即可溶性多肽)。在一些實施例中，外源核酸編碼治療多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼酶。在一些實施例中，外源核酸編碼細胞介素。在一些實施例中，外源核酸編碼趨化因子。在一些實施例中，外源核酸編碼融合蛋白。
工程化細胞可為本文所揭示之例示性細胞類型中之任一者。在一些實施例中，工程化細胞為免疫細胞。在一些實施例中，工程化細胞為造血幹細胞(HSC)。在一些實施例中，工程化細胞為誘導多能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，工程化細胞為單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞或顆粒球。在一些實施例中，工程化細胞為單核球。在一些實施例中，工程化細胞為巨噬細胞。在一些實施例中，工程化細胞為肥大細胞。在一些實施例中，工程化細胞為樹突狀細胞。
在一些實施例中，工程化細胞為顆粒球。在一些實施例中，工程化細胞為淋巴細胞。在一些實施例中，工程化細胞為T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為CD4+ T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為CD8+ T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為記憶T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為B細胞。在一些實施例中，工程化細胞為血漿B細胞。在一些實施例中，工程化細胞為記憶B細胞。
在一些實施例中，工程化細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，HLA-B對偶基因選自以下HLA-B對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02。
在一些實施例中，HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，HLA-B對偶基因選自以下HLA-B對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02；且HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，工程化細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因係選自以下HLA-B及HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02及HLA-C*07:02；HLA-B*08:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:02及HLA-C*05:01；HLA-B*35:01及HLA-C*04:01；HLA-B*40:01及HLA-C*03:04；HLA-B*57:01及HLA-C*06:02；HLA-B*14:02及HLA-C*08:02；HLA-B*15:01及HLA-C*03:03；HLA-B*13:02及HLA-C*06:02；HLA-B*44:03及HLA-C*16:01；HLA-B*38:01及HLA-C*12:03；HLA-B*18:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:03及HLA-C*04:01；HLA-B*51:01及HLA-C*15:02；HLA-B*49:01及HLA-C*07:01；HLA-B*15:01及HLA-C*03:04；HLA-B*18:01及HLA-C*12:03；HLA-B*27:05及HLA-C*02:02；HLA-B*35:03及HLA-C*04:01；HLA-B*18:01及HLA-C*05:01；HLA-B*52:01及HLA-C*12:02；HLA-B*51:01及HLA-C*14:02；HLA-B*37:01及HLA-C*06:02；HLA-B*53:01及HLA-C*04:01；HLA-B*55:01及HLA-C*03:03；HLA-B*44:02及HLA-C*07:04；HLA-B*44:03及HLA-C*07:01；HLA-B*35:02及HLA-C*04:01；HLA-B*15:01及HLA-C*04:01；以及HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*07:02及HLA-C*07:02。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*08:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*44:02及HLA-C*05:01。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*35:01及HLA-C*04:01。
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之任一種工程化細胞。在一些實施例中，醫藥組合物包含本文所揭示之任一種工程化細胞的群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少65%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少70%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少80%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少90%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少91%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少92%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少93%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少94%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少95%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少97%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少98%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少99%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。
在一些實施例中，提供用於向有需要之個體投與本文所揭示之工程化細胞或醫藥組合物的方法。在一些實施例中，提供用於向個體投與作為ACT療法之本文所揭示之工程化細胞或醫藥組合物的方法。在一些實施例中，提供用於向個體投與作為癌症治療之本文所揭示之工程化細胞或醫藥組合物的方法。在一些實施例中，提供用於向個體投與作為自體免疫疾病治療之本文所揭示之工程化細胞或醫藥組合物的方法。在一些實施例中，提供用於向個體投與作為感染性疾病治療之本文所揭示之工程化細胞或醫藥組合物的方法。
B. 用於降低或消除II類MHC之表面表現的方法及組合物
本發明提供藉由基因修飾CIITA基因而相對於未經修飾細胞降低或消除細胞上II類MHC蛋白質之表面表現的方法及組合物。所得經基因修飾之細胞在本文中亦稱為工程化細胞。在一些實施例中，已經基因修飾之(或工程化)細胞可為使用本文所提供之方法或組合物進行進一步基因修飾之起始細胞。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，具有降低的II類MHC表現之細胞適用於授受細胞轉移療法。在一些實施例中，CIITA基因之編輯與額外基因修飾組合以產生同種異體移植目的所需之細胞。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表面表現，其包含使細胞與含有包含引導序列之CIITA引導RNA的組合物接觸，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，細胞(亦即，工程化細胞)表面上之II類MHC蛋白表現由此降低。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，方法包含製造工程化細胞，該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，該等方法包含使細胞與含有包含引導序列之CIITA引導RNA的組合物接觸，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，細胞(亦即，工程化細胞)表面上之II類MHC蛋白表現由此降低。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，方法包含基因修飾細胞以降低或消除II類MHC蛋白之表面表現，其包含使細胞與含有包含引導序列之CIITA引導RNA的組合物接觸，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，細胞(亦即，工程化細胞)表面上之II類MHC蛋白表現由此降低。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，方法包含不活化CIITA中之剪接位點，其包含使細胞與含有包含引導序列之CIITA引導RNA的組合物接觸，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，細胞(亦即，工程化細胞)表面上之II類MHC蛋白表現由此降低。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，方法包含在CIITA中誘導DSB或單股斷裂(SSB)，其包含使細胞與含有包含引導序列之CIITA引導RNA的組合物接觸，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，細胞(亦即，工程化細胞)表面上之II類MHC蛋白表現由此降低。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，方法包含降低細胞中CIITA蛋白之表現，其包含將組合物遞送至細胞，包含使細胞與含有包含引導序列之CIITA引導RNA的組合物接觸，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，細胞(亦即，工程化細胞)表面上之II類MHC蛋白表現由此降低。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，降低細胞表面上II類MHC蛋白之表現的方法包含使細胞與本文所揭示之CIITA引導RNA中之任何一或多者接觸。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，提供含有包含引導序列之CIITA引導RNA的組合物，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，組合物進一步包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，組合物包含經RNA引導之DNA結合劑，該結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，組合物進一步包含尿嘧啶醣苷酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，組合物包含經RNA引導之DNA結合劑，該經RNA引導之DNA結合劑藉由CIITA基因體目標序列產生胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)之轉化。在一些實施例中，組合物包含經RNA引導之DNA結合劑，該經RNA引導之DNA結合劑藉由CIITA基因體目標序列產生腺苷(A)向鳥嘌呤(G)之轉化。
在一些實施例中，提供由本文所述之方法產生之工程化細胞。在一些實施例中，由本文所述之方法及組合物產生之工程化細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，方法產生包含II類MHC表現經降低之工程化細胞的組合物。在一些實施例中，方法產生包含CIITA蛋白表現經降低之工程化細胞的組合物。在一些實施例中，方法產生包含細胞核中之CIITA含量經降低之工程化細胞的組合物。在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞表現CIITA蛋白之截短形式。在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞不產生可偵測CIITA蛋白。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞，工程化細胞具有降低的II類MHC表現、降低的CIITA蛋白及/或降低的細胞核中之CIITA含量。在一些實施例中，如在含有CD4+ T細胞之活體外細胞培養分析中所量測，相比於未經修飾細胞，由本文所揭示之方法產生之工程化細胞自CD4+ T細胞引發之反應降低。
在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的修飾。在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10903873-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr:16:10906485-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，提供由本文所揭示之方法或組合物產生之工程化細胞，其中細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，且其中細胞包含基因修飾，該基因修飾包含基因體座標chr16:10908130-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，提供由包含醫藥學上可接受之載劑的本文所揭示之組合物產生之細胞。在一些實施例中，提供包含本文所揭示之細胞的組合物。
1. CIITA引導RNA
本文所提供之方法及組合物揭示適用於降低細胞表面上II類MHC蛋白質之表現的CIITA引導RNA。在一些實施例中，此類引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至CIITA基因體目標序列，且可在本文中稱為「CIITA引導RNA」。在一些實施例中，CIITA引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至人類CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10903873-chr:10923242內之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr:16:10906485-chr:10923242內之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10908130-chr:10923242內之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列靶向包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，剪接受體位點之一個核苷酸為A。在一些實施例中，剪接受體位點之一個核苷酸為G。在一些實施例中，一個核苷酸為剪接受體位點之剪接位點邊界核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列靶向包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，剪接供體位點之一個核苷酸為G。在一些實施例中，剪接供體位點之一個核苷酸為U/T。在一些實施例中，一個核苷酸為剪接供體位點之剪接位點邊界核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10903873-chr:10923242內之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr:16:10906485-chr:10923242內之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10908130-chr:10923242內之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離受體剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離供體剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。
在一些實施例中，方法及組合物揭示一種CIITA引導RNA，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割。在其中經RNA引導之DNA切割劑為Cas9之實施例中，切割或「切割位點」出現在相對於原間隔序列相鄰模體(PAM)序列之第三鹼基處。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離受體剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中切割位點位於受體剪接位點邊界核苷酸之3'。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離受體剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中切割位點位於受體剪接位點邊界核苷酸之5'。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離供體剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中切割位點位於供體剪接位點邊界核苷酸之3'。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包含CIITA引導RNA，其包含引導序列，該引導序列導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離供體剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割，其中切割位點位於供體剪接位點邊界核苷酸之5'。
在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離受體剪接位點邊界核苷酸4個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離受體剪接位點邊界核苷酸3個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離受體剪接位點邊界核苷酸2個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離受體剪接位點邊界核苷酸1個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在受體剪接位點邊界核苷酸處之CIITA基因中進行切割。
在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離供體剪接位點邊界核苷酸4個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離供體剪接位點邊界核苷酸3個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離供體剪接位點邊界核苷酸2個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在距離供體剪接位點邊界核苷酸1個核苷酸或更少的CIITA基因中進行切割。在一些實施例中，CIITA引導物包含引導序列，其導引經RNA引導之DNA結合劑，以在供體剪接位點邊界核苷酸處之CIITA基因中進行切割。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含本文所述之CIITA引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，提供一種含有包含引導序列之CIITA單引導RNA (sgRNA)的組合物，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含本文所述之CIITA sgRNA及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，提供一種含有包含引導序列之CIITA雙引導RNA (dgRNA)的組合物，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割，其中CIITA引導物靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的基因體目標。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含本文所述之CIITA dgRNA及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
例示性CIITA引導序列如下
表 1中所示(SEQ ID NO: 1-101與對應引導RNA序列SEQ ID NO: 200-300及301-401)。
表
1.
例示性
CIITA
引導序列。
| 引導物 ID | 引導序列之 SEQ ID NO | 引導序列 | 例示性 Mod 序列(四個末端U殘基視情況存在且可包括0、1、2、3、4或更多個U) (SEQ ID NO: 200-300) | 例示性全序列(SEQ ID NO: 301-401) | 基因體座標 |
| G018021 | 1 | UCCUACCUGUCAGAGCCCCA | mU*mC*mC*UACCUGUCAGAGCCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UCCUACCUGUCAGAGCCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10877360-10877380 |
| G018022 | 2 | GAGCCCCAAGGUAAAAAGGC | mG*mA*mG*CCCCAAGGUAAAAAGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GAGCCCCAAGGUAAAAAGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10877372-10877392 |
| G018023 | 3 | AGCCCCAAGGUAAAAAGGCC | mA*mG*mC*CCCAAGGUAAAAAGGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | AGCCCCAAGGUAAAAAGGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10877373-10877393 |
| G018024 | 4 | UUUCCCGGCCUUUUUACCUU | mU*mU*mU*CCCGGCCUUUUUACCUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UUUCCCGGCCUUUUUACCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10877379-10877399 |
| G018025 | 5 | CUUUCCCGGCCUUUUUACCU | mC*mU*mU*UCCCGGCCUUUUUACCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CUUUCCCGGCCUUUUUACCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10877380-10877400 |
| G018026 | 6 | ACACUGUGAGCUGCCUGGGA | mA*mC*mA*CUGUGAGCUGCCUGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | ACACUGUGAGCUGCCUGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895275-10895295 |
| G018027 | 7 | CACACUGUGAGCUGCCUGGG | mC*mA*mC*ACUGUGAGCUGCCUGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CACACUGUGAGCUGCCUGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895276-10895296 |
| G018028 | 8 | GUGGCACACUGUGAGCUGCC | mG*mU*mG*GCACACUGUGAGCUGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GUGGCACACUGUGAGCUGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895280-10895300 |
| G018029 | 9 | GAGAUUGAGCUCUACUCAGG | mG*mA*mG*AUUGAGCUCUACUCAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GAGAUUGAGCUCUACUCAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895409-10895429 |
| G018030 | 10 | AGAUUGAGCUCUACUCAGGU | mA*mG*mA*UUGAGCUCUACUCAGGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | AGAUUGAGCUCUACUCAGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895410-10895430 |
| G018031 | 11 | CAGGUGGGCCCUCCUCCCUC | mC*mA*mG*GUGGGCCCUCCUCCCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CAGGUGGGCCCUCCUCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895425-10895445 |
| G018032 | 12 | CGGAAGAGACCAGAGGGAGG | mC*mG*mG*AAGAGACCAGAGGGAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CGGAAGAGACCAGAGGGAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895437-10895457 |
| G018033 | 13 | UACCGGAAGAGACCAGAGGG | mU*mA*mC*CGGAAGAGACCAGAGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UACCGGAAGAGACCAGAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895440-10895460 |
| G018034 | 14 | AGGGAGGCUUAUGCCAAUAU | mA*mG*mG*GAGGCUUAUGCCAAUAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | AGGGAGGCUUAUGCCAAUAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895742-10895762 |
| G018035 | 15 | GGCUUAUGCCAAUAUCGGUG | mG*mG*mC*UUAUGCCAAUAUCGGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GGCUUAUGCCAAUAUCGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10895747-10895767 |
| G018036 | 16 | UGACUGCGCUUUUCCUUGUC | mU*mG*mA*CUGCGCUUUUCCUUGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UGACUGCGCUUUUCCUUGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10898642-10898662 |
| G018037 | 17 | GACUGCGCUUUUCCUUGUCU | mG*mA*mC*UGCGCUUUUCCUUGUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GACUGCGCUUUUCCUUGUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10898643-10898663 |
| G018038 | 18 | GCUUUUCCUUGUCUGGGCAG | mG*mC*mU*UUUCCUUGUCUGGGCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GCUUUUCCUUGUCUGGGCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10898649-10898669 |
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| G018081 | 61 | CUGUGUCACCCGUUUCAGGU | mC*mU*mG*UGUCACCCGUUUCAGGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CUGUGUCACCCGUUUCAGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10908131-10908151 |
| G018082 | 62 | UGUGUCACCCGUUUCAGGUG | mU*mG*mU*GUCACCCGUUUCAGGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UGUGUCACCCGUUUCAGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10908132-10908152 |
| G018083 | 63 | CACCCGUUUCAGGUGGGGUG | mC*mA*mC*CCGUUUCAGGUGGGGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CACCCGUUUCAGGUGGGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10908137-10908157 |
| G018084 | 64 | ACCCGUUUCAGGUGGGGUGA | mA*mC*mC*CGUUUCAGGUGGGGUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | ACCCGUUUCAGGUGGGGUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10908138-10908158 |
| G018085 | 65 | CCCGUUUCAGGUGGGGUGAG | mC*mC*mC*GUUUCAGGUGGGGUGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CCCGUUUCAGGUGGGGUGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10908139-10908159 |
| G018086 | 66 | GUCUGAGGCCCUCCCUCCAC | mG*mU*mC*UGAGGCCCUCCCUCCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GUCUGAGGCCCUCCCUCCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10909006-10909026 |
| G018087 | 67 | UCUGAGGCCCUCCCUCCACA | mU*mC*mU*GAGGCCCUCCCUCCACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UCUGAGGCCCUCCCUCCACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10909007-10909027 |
| G018088 | 68 | CAAGGCAGCCCUGUGGAGGG | mC*mA*mA*GGCAGCCCUGUGGAGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CAAGGCAGCCCUGUGGAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10909018-10909038 |
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| G018093 | 73 | CUUCUCGUCCUGGAGAGAAC | mC*mU*mU*CUCGUCCUGGAGAGAACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CUUCUCGUCCUGGAGAGAACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10910176-10910196 |
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| G018095 | 75 | ACCCUUGCUCUUUGCCUCCU | mA*mC*mC*CUUGCUCUUUGCCUCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | ACCCUUGCUCUUUGCCUCCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10915547-10915567 |
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| G018097 | 77 | UGCUCUUUGCCUCCUAGGCU | mU*mG*mC*UCUUUGCCUCCUAGGCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UGCUCUUUGCCUCCUAGGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10915552-10915572 |
| G018098 | 78 | CCUGAGACAGGGCCCAGCCU | mC*mC*mU*GAGACAGGGCCCAGCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CCUGAGACAGGGCCCAGCCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10915567-10915587 |
| G018099 | 79 | AUCUGAUUCCACCUGCAGCC | mA*mU*mC*UGAUUCCACCUGCAGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | AUCUGAUUCCACCUGCAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10916348-10916368 |
| G018100 | 80 | CAGCGCAUCCAGGCUGCAGG | mC*mA*mG*CGCAUCCAGGCUGCAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CAGCGCAUCCAGGCUGCAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10916359-10916379 |
| G018101 | 81 | ACUCAGCGCAUCCAGGCUGC | mA*mC*mU*CAGCGCAUCCAGGCUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | ACUCAGCGCAUCCAGGCUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10916362-10916382 |
| G018102 | 82 | AAACCCUCAAGUGAGUGAGC | mA*mA*mA*CCCUCAAGUGAGUGAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | AAACCCUCAAGUGAGUGAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10916449-10916469 |
| G018103 | 83 | AACCCUCAAGUGAGUGAGCU | mA*mA*mC*CCUCAAGUGAGUGAGCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | AACCCUCAAGUGAGUGAGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10916450-10916470 |
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| G018106 | 86 | CAGACUGCGGGGACACAGUG | mC*mA*mG*ACUGCGGGGACACAGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CAGACUGCGGGGACACAGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10918423-10918443 |
| G018107 | 87 | CUGCAUCCCUGCUCAGGCUA | mC*mU*mG*CAUCCCUGCUCAGGCUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CUGCAUCCCUGCUCAGGCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10918504-10918524 |
| G018108 | 88 | CCUGCUCAGGCUAAGGUGAG | mC*mC*mU*GCUCAGGCUAAGGUGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CCUGCUCAGGCUAAGGUGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10918511-10918531 |
| G018109 | 89 | CUGCUCAGGCUAAGGUGAGU | mC*mU*mG*CUCAGGCUAAGGUGAGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CUGCUCAGGCUAAGGUGAGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10918512-10918532 |
| G018110 | 90 | CAGCACCUGACCGGUAUCCG | mC*mA*mG*CACCUGACCGGUAUCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CAGCACCUGACCGGUAUCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10918539-10918559 |
| G018111 | 91 | GUACAAGCUGUCGGAAACAG | mG*mU*mA*CAAGCUGUCGGAAACAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GUACAAGCUGUCGGAAACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10922153-10922173 |
| G018112 | 92 | GGAGACGCUGGCGUAAGUCC | mG*mG*mA*GACGCUGGCGUAAGUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GGAGACGCUGGCGUAAGUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10922478-10922498 |
| G018113 | 93 | GGCGUAAGUCCAGGCAACCC | mG*mG*mC*GUAAGUCCAGGCAACCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GGCGUAAGUCCAGGCAACCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10922487-10922507 |
| G018114 | 94 | CUCCACCCACCAGGGUUGCC | mC*mU*mC*CACCCACCAGGGUUGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CUCCACCCACCAGGGUUGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10922499-10922519 |
| G018115 | 95 | UGAGUCCCAUCCCCCCUUGC | mU*mG*mA*GUCCCAUCCCCCCUUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UGAGUCCCAUCCCCCCUUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10923205-10923225 |
| G018116 | 96 | CCACAUCCUGCAAGGGGGGA | mC*mC*mA*CAUCCUGCAAGGGGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | CCACAUCCUGCAAGGGGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10923214-10923234 |
| G018117 | 97 | GCGUCCACAUCCUGCAAGGG | mG*mC*mG*UCCACAUCCUGCAAGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GCGUCCACAUCCUGCAAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10923218-10923238 |
| G018118 | 98 | GGCGUCCACAUCCUGCAAGG | mG*mG*mC*GUCCACAUCCUGCAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GGCGUCCACAUCCUGCAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10923219-10923239 |
| G018119 | 99 | GGGCGUCCACAUCCUGCAAG | mG*mG*mG*CGUCCACAUCCUGCAAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GGGCGUCCACAUCCUGCAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10923220-10923240 |
| G018120 | 100 | UGGGCGUCCACAUCCUGCAA | mU*mG*mG*GCGUCCACAUCCUGCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | UGGGCGUCCACAUCCUGCAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10923221-10923241 |
| G018121 | 101 | GUGGGCGUCCACAUCCUGCA | mG*mU*mG*GGCGUCCACAUCCUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | GUGGGCGUCCACAUCCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | chr16:10923222-10923242 |
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於指示經2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列為選自SEQ ID NO: 1-101之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%一致之引導序列。
在一些實施例中，CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列包含
表 1中所列之基因體座標之至少10個連續核苷酸±10個核苷酸。如本文所用，基因體座標之至少10個連續核苷酸±10個核苷酸意謂例如基因體座標內之至少10個連續核苷酸，其中基因體座標包括在
表 1中所列之範圍之5'方向上的10個核苷酸及3'方向上的10個核苷酸。舉例而言，CIITA引導RNA可包含基因體座標chr16:10877360-10877380內或chr16:10877350-10877390內之10個連續核苷酸，包括此等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列為包含
表 1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列與選自以下序列之序列至少95%、90%或85%一致：為包含
表 1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸之序列的17、18、19或20個連續核苷酸。
在一些實施例中，CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列包含
表 1中所列之基因體座標之至少15個連續核苷酸±10個核苷酸。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列包含表1中所列之基因體座標之至少20個連續核苷酸±10個核苷酸。
在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 22。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 24。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 29。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 36。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 37。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 38。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 39。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 40。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 41。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 42。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 43。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 44。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 46。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 47。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 49。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 50。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO:51。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 52。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 53。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 54。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 57。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 59。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 62。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 63。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 64。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 67。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 69。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 71。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 72。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 73。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 74。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 75。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 76。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 77。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 79。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 80。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 81。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 82。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 83。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 84。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 85。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 86。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 87。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 88。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 89。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 90。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 91。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 92。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 93。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 94。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 95。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 96。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 97。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 98。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 99。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 100。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 101。
在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自以下之核苷酸：SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100及SEQ ID NO: 101。
本文提供CIITA引導RNA之其他實施例，包括例如對引導RNA之例示性修飾。
2. 對CIITA之基因修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物對細胞中之CIITA基因中之剪接位點的至少一個核苷酸進行基因修飾。由於CIITA蛋白調節II類MHC之表現，在一些實施例中，對CIITA之基因修飾改變CIITA蛋白之產生，且因此降低經基因修飾之細胞(或工程化細胞)之表面上的II類MHC蛋白表現。基因修飾涵蓋由與基因編輯系統接觸而產生之修飾群體(例如，由Cas9及CIITA引導RNA產生之編輯群體，或由BC22及CIITA引導RNA產生之編輯群體)。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10903873-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr:16:10906485-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10908130-chr:10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476及chr16:10918504-10918524。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10908132-10908152內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10908131-10908151內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10916456-10916476內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512、chr16:10906487-10906507。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470及chr16:10922153-10922173。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238及chr16:10923219-10923239。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10923218-10923238內之剪接位點的至少一個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10923219-10923239內之剪接位點的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
在一些實施例中，對CIITA之修飾包含目標序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或脫胺中之任何一或多者。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含目標序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含目標序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之缺失。在其他實施例中，對CIITA之修飾包含目標序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之插入。在其他實施例中，對CIITA之修飾包含目標序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含插入/缺失，其一般在此項技術中定義為小於1000個鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含引起目標序列中之讀框轉移突變的插入/缺失。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含目標序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含由併入模板核酸產生的核苷酸插入、缺失或取代中之一或多者。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含目標序列中供體核酸之插入。在一些實施例中，對CIITA之修飾並非暫時的。
在一些實施例中，剪接位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，剪接受體位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，剪接供體位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，受體剪接位點邊界核苷酸經修飾。在一些實施例中，供體剪接位點邊界核苷酸經修飾。在一些實施例中，剪接受體位點之保守核苷酸中之一者經修飾。在一些實施例中，剪接受體位點之保守核苷酸A經修飾。在一些實施例中，剪接受體位點之保守核苷酸G經修飾。在一些實施例中，剪接供體位點之保守核苷酸中之一者經修飾。在一些實施例中，剪接供體位點之保守核苷酸G經修飾。在一些實施例中，剪接供體位點之保守核苷酸T經修飾。
在一些實施例中，位於距離受體剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離受體剪接位點邊界核苷酸4個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離受體剪接位點邊界核苷酸3個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離受體剪接位點邊界核苷酸2個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離受體剪接位點邊界核苷酸1個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。
在一些實施例中，位於距離供體剪接位點邊界5個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離供體剪接位點邊界核苷酸4個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離供體剪接位點邊界核苷酸3個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離供體剪接位點邊界核苷酸2個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。在一些實施例中，位於距離供體剪接位點邊界核苷酸1個核苷酸或更少的核苷酸經修飾。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物使用經RNA引導之DNA結合劑(例如Cas酶)修飾細胞中CIITA之剪接位點。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑切割距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑切割距離剪接位點邊界核苷酸4個核苷酸或更少的CIITA，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑切割距離剪接位點邊界核苷酸3個核苷酸或更少的CIITA，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑切割距離剪接位點邊界核苷酸2個核苷酸或更少的CIITA，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑切割距離剪接位點邊界核苷酸1個核苷酸或更少的CIITA，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑切割剪接位點邊界核苷酸處之CIITA，其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。在一些實施例中，剪接位點邊界核苷酸為受體剪接位點邊界核苷酸。在一些實施例中，剪接位點邊界核苷酸為供體剪接位點邊界核苷酸。
在一些實施例中，對CIITA之基因修飾使剪接位點不活化，亦即，剪接不在經修飾之剪接位點處發生。在一些實施例中，對CIITA之基因修飾使剪接受體位點不活化。在一些實施例中，對CIITA之基因修飾使剪接供體位點不活化。
在一些實施例中，對CIITA之剪接位點之基因修飾移除剪接位點之所有三個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾移除剪接位點之2個核苷酸。在一些實施例中，基因修飾移除剪接位點之1個核苷酸。在一些實施例中，對CIITA之剪接位點之基因修飾移除剪接受體位點之1或2個核苷酸。在一些實施例中，對CIITA之剪接位點之基因修飾移除剪接供體位點之1或2個核苷酸。在一些實施例中，剪接位點之至少1個核苷酸經缺失。在一些實施例中，剪接位點之至少2個核苷酸經缺失。在一些實施例中，受體剪接位點邊界核苷酸經缺失。在一些實施例中，供體剪接位點邊界核苷酸經缺失。
在一些實施例中，對CIITA之基因修飾導致使用框外終止密碼子。在一些實施例中，對CIITA之基因修飾導致剪接期間之外顯子跳躍。在一些實施例中，對CIITA之基因修飾導致細胞之CIITA蛋白表現降低。在一些實施例中，對CIITA之基因修飾導致細胞核中之CIITA減少。在一些實施例中，對CIITA之剪接位點之修飾導致細胞表面上之II類MHC蛋白表現降低。
在一些實施例中，對CIITA之基因修飾產生CIITA蛋白之截短形式。在一些實施例中，經截短之CIITA蛋白不結合至GTP。在一些實施例中，經截短之CIITA蛋白不定位至細胞核。在一些實施例中，相比於野生型CIITA蛋白與調節II類MHC表現相關之活性，CIITA蛋白(例如CIITA蛋白之截短形式)之活性受損。在一些實施例中，細胞表面上之II類MHC表現由於CIITA蛋白活性受損而降低。在一些實施例中，細胞表面上之II類MHC表現由於CIITA蛋白活性受損而不存在。
3. CIITA引導RNA之功效
CIITA引導RNA之功效可藉由此項技術中可用之技術測定，該等技術評估目標細胞中引導RNA之編輯效率、CIITA蛋白及/或mRNA之含量及/或II類MHC之含量。在一些實施例中，細胞表面上HLA-A蛋白之降低或消除可藉由與未經修飾細胞(或「相對於未經修飾細胞」)比較來測定。工程化細胞或細胞群體亦可與未經修飾細胞群體進行比較。
在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測細胞中CIITA蛋白之含量來測定。CIITA蛋白之含量可藉由例如細胞溶解物及使用抗CIITA抗體之西方墨點來偵測。在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測細胞核中CIITA蛋白之含量來測定。在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測細胞中CIITA mRNA之含量來測定。CIITA mRNA之含量可藉由例如RT-PCR來偵測。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞，目標細胞中CIITA蛋白及/或CIITA mRNA含量降低指示有效的剪接位點CIITA引導RNA。
「未經修飾細胞」(unmodified cell/unmodified cells)係指實驗或測試中相同細胞類型之對照細胞(control cell/control cells)，其中「未經修飾之」對照細胞尚未與CIITA引導物接觸(亦即，非工程化細胞)。因此，未經修飾細胞(unmodified cell/unmodified cells)可為尚未與引導RNA接觸之細胞，或已與不靶向CIITA之引導RNA接觸之細胞。
在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測目標細胞之II類MHC蛋白表現的降低或消除來測定。CIITA蛋白充當反式活化子，活化II類MHC啟動子，且對II類MHC蛋白質之表現至關重要。在一些實施例中，可在目標細胞之表面上偵測II類MHC蛋白表現。在一些實施例中，II類MHC蛋白表現係藉由流動式細胞測量術量測。在一些實施例中，針對II類MHC蛋白之抗體(例如抗HLA-DR、-DQ、-DP)可用於偵測II類MHC蛋白表現，例如藉由流動式細胞測量術。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞(或未經修飾細胞群體)，細胞(或細胞群體)表面上II類MHC蛋白的降低或消除指示有效CIITA引導RNA。在一些實施例中，已與根據流動式細胞測量術對II類MHC蛋白呈陰性之特定CIITA引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑接觸的細胞(或細胞群體)指示有效CIITA引導RNA。
在一些實施例中，II類MHC蛋白表現在使用本文所揭示之方法及組合物的細胞群體中降低或消除。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體經富集(例如藉由FACS或MACS)且為至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體未經富集(例如藉由FACS或MACS)且為至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少65% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少70% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少80% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少90% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少91% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少92% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少93% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少94% II類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效(亦即引導RNA之效力)與(例如由Cas9產生之)基因體目標序列中之切割位點相對於CIITA中之剪接位點邊界核苷酸之間的距離有關。在一些實施例中，距離(以切割位點與剪接位點邊界核苷酸之間的核苷酸數目計算)與II類MHC表現之損失之間存在相關性。在一些實施例中，剪接位點邊界核苷酸與切割位點(例如，由Cas9產生)之間的距離愈短，目標細胞之II類MHC表現的降低愈大。在一些實施例中，CIITA中之剪接位點邊界核苷酸與基因體目標序列中之切割位點之間的距離為5個核苷酸或更少、4個核苷酸或更少、3個核苷酸或更少、2個核苷酸或更少或1個核苷酸或更少。在一些實施例中，切割位點位於剪接位點邊界核苷酸之5'。在一些實施例中，切割位點位於剪接位點邊界核苷酸之3'。在一些實施例中，CIITA剪接位點邊界為受體剪接位點邊界核苷酸。在一些實施例中，CIITA剪接位點邊界為供體剪接位點邊界核苷酸。
在一些實施例中，有效CIITA引導RNA可藉由量測活體外或活體內免疫細胞(例如CD4+ T細胞)對經基因修飾之目標細胞的反應來測定。CD4+ T細胞反應可藉由量測CD4+ T細胞之活化反應(例如CD4+ T細胞增殖)、活化標記之表現及/或細胞介素產生(IL-2、IL-12、IFN-γ)之分析(例如流動式細胞測量術、ELISA)來評估。CD4+ T細胞之反應可在活體外細胞培養分析中評估，其中經基因修飾之細胞與包含CD4+ T細胞之細胞共培養。舉例而言，經基因修飾之細胞可例如與PBMC、包含CD4+ T細胞之經純化CD3+ T細胞、經純化CD4+ T細胞或CD4+ T細胞株共培養。由經基因修飾之細胞引發之CD4+ T細胞反應可與由未經修飾細胞引發之反應進行比較。CD4+ T細胞之反應降低指示有效CIITA引導RNA。
CIITA引導RNA之功效亦可藉由細胞在編輯後之存活期來評估。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少一週至六週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少一週至十二週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少兩週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少三週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少四週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少五週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少六週。經基因修飾之細胞之活力可使用標準技術來量測，包括例如藉由量測細胞死亡、藉由流動式細胞測量術live/dead染色或細胞增殖。
C. 用於減少或消除II類MHC及額外修飾之方法及組合物 1. I類MHC基因剔除
在一些實施例中，提供藉由如本文所揭示地基因修飾CIITA來降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現的方法，其中該等方法進一步提供相對於未經修飾細胞降低或消除細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一種方法中，I類MHC蛋白表現藉由基因修飾B2M基因而降低或消除。在一些實施例中，I類MHC蛋白表現藉由使細胞與B2M引導RNA接觸而降低或消除。在另一方法中，I類MHC蛋白HLA-A之表現係藉由基因修飾HLA-A而降低或消除，藉此降低或消除人類細胞中HLA-A之表面表現，其中人類細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。因此，在一些實施例中，HLA-A蛋白表現係藉由使人類細胞與HLA-A引導RNA接觸而降低或消除，其中人類細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，所得細胞為同種異體細胞。
在一些實施例中，方法包含降低細胞表面上II類MHC蛋白之表現，其包含基因修飾CIITA，包含使細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與B2M引導RNA接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。在一些實施例中，方法進一步包含在B2M目標序列中誘導DSB或SSB。在一些實施例中，由此藉由細胞降低B2M表現。在一些實施例中，由此藉由細胞降低I類MHC蛋白表現。
在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與B2M引導RNA接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。在一些實施例中，方法進一步包含在B2M目標序列中誘導DSB或SSB。在一些實施例中，由此藉由細胞降低B2M表現。在一些實施例中，由此藉由細胞降低I類MHC蛋白表現。
在一些實施例中，方法包含在CIITA中誘導DSB或SSB，其包含使細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與B2M引導RNA接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。在一些實施例中，方法進一步包含在B2M目標序列中誘導DSB或SSB。在一些實施例中，由此藉由細胞降低B2M表現。在一些實施例中，由此藉由細胞降低I類MHC蛋白表現。
在一些實施例中，方法包含降低細胞中CIITA蛋白之表現，其包含將組合物遞送至包含本文所揭示之CIITA引導RNA的細胞，該方法進一步包含使該細胞與B2M引導RNA接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。在一些實施例中，方法進一步包含在B2M目標序列中誘導DSB或SSB。在一些實施例中，由此藉由細胞降低B2M表現。在一些實施例中，由此藉由細胞降低I類MHC蛋白表現。
在一些實施例中，B2M引導RNA靶向人類B2M基因。
在一些實施例中，B2M引導RNA包含SEQ ID NO: 701。在一些實施例中，B2M引導RNA包含引導序列，該引導序列為SEQ ID NO: 701之至少17、18、19或20個連續核苷酸。在一些實施例中，B2M引導RNA包含與SEQ ID NO: 701至少95%、90%或85%一致之引導序列。
本文提供B2M引導RNA之其他實施例，包括例如對引導RNA之例示性修飾。
在一些實施例中，B2M引導RNA之功效係藉由量測相對於未經修飾細胞，細胞中B2M蛋白之含量來測定。在一些實施例中，B2M引導RNA之功效係藉由量測由細胞表現之B2M蛋白之含量來測定。在一些實施例中，針對B2M蛋白之抗體(例如抗B2M)可用於藉由例如流動式細胞測量術來偵測B2M蛋白之含量。在一些實施例中，藉由量測細胞中B2M mRNA之含量(例如藉由RT-PCR)來測定B2M引導RNA之功效。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞中B2M蛋白之含量，B2M蛋白或B2M mRNA之含量的降低或消除指示有效B2M引導RNA。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞(或未經修飾細胞群體)，根據流動式細胞測量術對B2M蛋白呈陰性之細胞(或細胞群體)指示有效B2M引導RNA。在一些實施例中，已與根據流動式細胞測量術對I類MHC蛋白呈陰性之特定B2M引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑接觸的細胞(或細胞群體)指示有效B2M引導RNA。
在一些實施例中，B2M引導RNA之功效係藉由量測細胞表面上I類MHC蛋白之含量來測定。在一些實施例中，I類MHC蛋白含量係藉由流動式細胞測量術(例如用針對HLA-A、HLA-B或HLA-C之抗體)量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少65% MHC I陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少70% MHC I陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少80% I類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少90% MHC I陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少95% MHC I陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少100% I類MHC陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在一些實施例中，方法包含相對於未經修飾細胞降低或消除工程化細胞中II類MHC蛋白之表面表現，其包含使該細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含藉由基因編輯系統降低或消除細胞之HLA-A表現，該基因編輯系統結合至HLA-A基因體目標序列，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，方法包含相對於未經修飾細胞降低或消除工程化細胞中II類MHC蛋白之表面表現，其包含使該細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含藉由基因編輯系統降低或消除細胞之HLA-A表現，該基因編輯系統結合至HLA-A基因體目標序列，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少10個連續核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29942864-29942884。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29942868-29942888。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29942876-29942896。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29942877-29942897。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29942883-29942903。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29943126-29943146。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29943528-29943548。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29943529-29943549。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29943530-29943550。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29943537-29943557。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29943549-29943569。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29943589-29943609。在一些實施例中，HLA-A基因體座標選自chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，方法包含相對於未經修飾細胞降低或消除工程化細胞中II類MHC蛋白之表面表現，其包含使該細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與HLA-A引導RNA接觸。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含選自SEQ ID NO: 2001-2095之引導序列(與對應引導RNA序列SEQ ID NO: 1811-1905及1906-2000) (參見下
表 2)。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供製造工程化細胞之方法，該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，該等方法包含：a.使該細胞與CIITA引導RNA接觸，其中引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-117之引導序列；及b.使該細胞與HLA-A引導RNA接觸，其中HLA-A引導RNA包含選自SEQ ID NO: 2001-2095中之任一者的引導序列(與對應引導RNA序列SEQ ID NO: 1811-1905及1906-2000) (參見下
表 2)；及c.視情況使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸；其中相對於未經修飾細胞，該細胞在該細胞中具有降低或消除的HLA-A之表面表現。在一些實施例中，方法包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
例示性HLA-A引導RNA提供於
表 2中(引導序列SEQ ID NO: 2001-2095 (與對應引導RNA序列SEQ ID NO: 1811-1905及1906-2000)。
表
2.
例示性
HLA-A
引導
RNA
| 引導物ID | 引導序列之SEQ ID NO | 引導序列 | 例示性全序列(SEQ ID NOs: 1811-1905) | 例示性Mod 序列(四個末端U殘基視情況存在且可包括0、1、2、3、4或更多個U) (SEQ ID NO: 1906-2000) | 基因體座標 |
| G018983 | 2001 | UGGAGGGCCUGAUGUGUGUU | UGGAGGGCCUGAUGUGUGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mG*AGGGCCUGAUGUGUGUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945290-29945310 (與hg38=2失配) |
| G018984 | 2002 | GCCUGAUGUGUGUUGGGUGU | GCCUGAUGUGUGUUGGGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mC*UGAUGUGUGUUGGGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945296-29945316 (與hg38=2失配) |
| G018985 | 2003 | CCUGAUGUGUGUUGGGUGUU | CCUGAUGUGUGUUGGGUGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mU*GAUGUGUGUUGGGUGUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945297-29945317 (與hg38=1失配) |
| G018986 | 2004 | CCCAACACCCAACACACAUC | CCCAACACCCAACACACAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mC*AACACCCAACACACAUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945300-29945320 (與hg38=1失配) |
| G018965 | 2005 | UCAGGAAACAUGAAGAAAGC | UCAGGAAACAUGAAGAAAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mC*mA*GGAAACAUGAAGAAAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29890117-29890137 |
| G019018 | 2006 | AGGCGCCUGGGCCUCUCCCG | AGGCGCCUGGGCCUCUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mG*CGCCUGGGCCUCUCCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29927058-29927078 |
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| G018989 | 2094 | GGAUGUAUUGAGCAUGCGAU | GGAUGUAUUGAGCAUGCGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mA*UGUAUUGAGCAUGCGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945362-29945382 |
| G018963 | 2095 | AACAUGAAGAAAGCAGGUGU | AACAUGAAGAAAGCAGGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mA*mC*AUGAAGAAAGCAGGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31382543-31382563 |
在一些實施例中，HLA-A引導RNA之功效係藉由量測細胞表面上HLA-A蛋白之含量來測定。在一些實施例中，HLA-A蛋白含量係藉由流動式細胞測量術(例如使用針對HLA-A2及/或HLA-A3之抗體)量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少65% HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少70% HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少80% HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少90% HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少95% HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體為至少100% HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在一些實施例中，B2M引導RNA或HLA-A引導物之功效可藉由量測相比於未經修飾細胞，活體外或活體內免疫細胞(例如CD8+ T細胞)對經基因修飾之目標細胞之反應來測定。舉例而言，CD8+ T細胞之反應降低表明有效B2M引導RNA或HLA-A。CD8+ T細胞反應可藉由量測CD8+ T細胞活化反應(例如CD8+ T細胞增殖)、活化標記之表現及/或細胞介素產生(IL-2、IFN-γ、TNF-α)之分析(例如流動式細胞測量術、ELISA)來評估。CD8+ T細胞反應可在活體外或活體內評估。在一些實施例中，CD8+ T細胞反應可藉由在活體外共培養經基因修飾之細胞與CD8+ T細胞來評估。在一些實施例中，CD8+ T細胞活性可在活體內模型，例如嚙齒動物模型中評估。在活體內模型中，例如經基因修飾之細胞可與CD8+ T細胞一起投與；經基因修飾之細胞的存活指示避免CD8+ T細胞溶解之能力。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活超過1、2、3、4、5或6週或更多週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活至少一週至六週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活至少兩週至四週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活至少四週至六週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活超過六週。
在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC表現及降低或消除的I類MHC表現。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白表現、降低或消除的CIITA蛋白表現、及/或降低或消除的細胞核中之CIITA含量、及/或降低或消除的I類MHC蛋白表現。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白表現、降低或消除的CIITA蛋白表現、及/或降低或消除的細胞核中之CIITA含量、及/或降低或消除的B2M蛋白表現。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白表現、降低或消除的CIITA蛋白表現、及/或降低或消除的細胞核中之CIITA含量、及降低或消除的B2M mRNA含量。在一些實施例中，細胞自CD8+ T細胞引發降低或消除的反應。
在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC表現及降低或消除的HLA-A表現，其中細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白表現、降低或消除的CIITA蛋白表現、及/或降低或消除的細胞核中之CIITA含量、及/或降低或消除的HLA-A蛋白表現。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白表現、降低或消除的CIITA蛋白表現、及/或降低或消除的細胞核中之CIITA含量、及/或消除或降低的HLA-A蛋白表現。在一些實施例中，細胞自CD8+ T細胞引發降低或消除的反應。
在一些實施例中，提供工程化細胞，其中細胞在細胞表面上具有降低或消除的II類MHC及I類MHC蛋白之表現，其中細胞包含CIITA中之基因修飾，且其中細胞包含B2M中之修飾。在一些實施例中，同種異體細胞自CD4+ T細胞引發降低的反應且自CD8+ T細胞引發降低的反應。
在一些實施例中，提供工程化細胞，其中細胞在細胞表面上具有降低或消除的II類MHC及HLA-A蛋白之表現，其中細胞包含CIITA中之基因修飾，且其中細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，其中細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，提供工程化細胞，其中細胞在細胞表面上具有降低或消除的II類MHC及HLA-A蛋白之表現，其中細胞包含CIITA中之基因修飾，且其中細胞包含HLA-A基因中之基因修飾。在一些實施例中，細胞對HLA-B及HLAC為同型接合的。在一些實施例中，細胞自CD4+ T細胞引發降低的反應且自CD8+ T細胞引發降低的反應。
2. 外源核酸
在一些實施例中，本發明提供用於藉由如本文所揭示地基因修飾CIITA來降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現的方法及組合物，其中該等方法及組合物進一步提供工程化細胞對外源核酸之表現。
a) NK細胞抑制劑基因敲入
在一些實施例中，本發明提供用於藉由如本文所揭示地基因修飾CIITA來降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現的方法，其中該等方法進一步提供細胞對外源核酸之表現，其中外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子表現於細胞表面上，由此避免NK細胞活性(例如NK細胞對細胞之溶解)。在一些實施例中，經基因修飾之細胞避免NK細胞溶解之能力使得細胞能夠經受授受細胞轉移療法。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸接觸。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含修飾CIITA，其包含使該細胞與包含所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸及B2M引導RNA接觸，藉此降低或消除細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含用以下各者對細胞進行基因修飾：一或多種包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物、B2M引導RNA、編碼NK細胞抑制劑分子之核酸及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸接觸。在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸及B2M引導RNA接觸，藉此降低細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，方法包含在CIITA中誘導DSB或SSB，其包含使細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸接觸。在一些實施例中，方法包含在CIITA中誘導DSB或SSB，其包含使細胞與包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸及B2M引導RNA接觸，藉此降低細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞中CIITA蛋白之表現，其包含遞送包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物，該方法進一步包含使細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸接觸。在一些實施例中，方法包含降低細胞中CIITA蛋白之表現，其包含遞送包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物，該方法進一步包含使細胞與編碼NK細胞抑制劑分子之核酸及B2M引導RNA接觸，藉此降低細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子與NK細胞上之抑制性受體結合。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子與對I類MHC具有特異性之抑制性受體結合。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子與對I類MHC不具有特異性之抑制性受體結合。NK細胞抑制性受體包括例如KIR (人類)、CD94-NKG2A雜二聚體(人類/小鼠)、Ly49 (小鼠)、2B4、SLAMF6、NKFP-B、TIGIT、KIR2DL4。
在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子與NKG2A結合。
在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子為I類MHC分子。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子為經典I類MHC分子。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子為非經典I類MHC分子。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子為HLA分子。NK細胞抑制劑分子包括例如HLA-C、HLA-E、HLA-G、Cd1、CD48、SLAMF6、Clr-b及CD155。
在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子為HLA-E。
在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子為融合蛋白。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子為包含HLA-E之融合蛋白。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子包含B2M。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子包含HLA-E及B2M。在一些實施例中，融合蛋白包括連接子。在一些實施例中，HLA-E構築體提供於載體中。在一些實施例中，包含HLA-E構築體之載體為慢病毒載體。在一些實施例中，HLA-E構築體經由慢病毒轉導遞送至細胞。
在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子插入至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子藉由同源重組(HR)整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子藉由鈍端插入整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子藉由非同源末端接合整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子整合至細胞基因體中之安全港基因座中。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子整合至TRAC基因座、B2M基因座、AAVS1基因座及/或CIITA基因座中之一者中。在一些實施例中，NK細胞抑制劑分子在脂質核酸組裝組合物中提供至細胞。在一些實施例中，脂質核酸組裝組合物為脂質奈米粒子(LNP)。
在一些實施例中，方法產生自NK細胞引發降低之反應的工程化細胞。NK細胞反應可在活體外或活體內評估。在一些實施例中，NK細胞活性可藉由活體外共培養經基因修飾之細胞與NK細胞來評估。在一些實施例中，NK細胞活性可在活體內模型，例如嚙齒動物模型中評估。在活體內模型中，例如經基因修飾之細胞可與NK細胞一起投與；經基因修飾之細胞的存活指示避免NK細胞溶解之能力。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在NK細胞存在下活體內存活超過1、2、3、4、5或6週或更多週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在NK細胞存在下活體內存活至少一週至六週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在NK細胞存在下活體內存活至少兩週至四週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在NK細胞存在下活體內存活至少四週至六週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在NK細胞存在下活體內存活超過六週。
在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞具有降低或消除的II類MHC表現且包含編碼NK細胞抑制劑分子之核酸。在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞在細胞表面上具有降低或消除的II類MHC表現及NK細胞抑制劑分子表現。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞具有降低或消除的II類MHC表現且自NK細胞引發降低的反應。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白表現，降低或消除的CIITA蛋白表現及/或降低或消除的細胞核中之CIITA含量，且自NK細胞引發降低的反應，且具有降低或消除的I類MHC蛋白表現。在一些實施例中，細胞自CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及/或NK細胞引發降低的反應。
在一些實施例中，提供同種異體細胞，其中細胞在細胞表面上具有降低或消除的II類MHC及I類MHC蛋白表現，其中細胞包含如本文所揭示之CIITA中之修飾，其中細胞包含B2M中之修飾，且其中細胞包含編碼NK細胞抑制劑分子之核酸。在一些實施例中，同種異體細胞自CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及/或NK細胞引發降低的反應。
b) 靶向受體及其他細胞表面表現之多肽；分泌多肽
在一些實施例中，本發明提供藉由如本文所揭示地基因修飾CIITA來降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現的方法，其中該等方法進一步提供一或多種外源核酸(例如抗體、嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、細胞介素或細胞介素受體、趨化因子或趨化因子受體、酶、融合蛋白或其他類型之細胞表面結合或可溶性多肽)之表現。在一些實施例中，外源核酸編碼表現於細胞表面上之蛋白質。舉例而言，在一些實施例中，外源核酸編碼表現於細胞表面上之靶向受體(本文中進一步描述)。在一些實施例中，經基因修飾之細胞可充當用於表現由外源核酸編碼之分泌多肽的「細胞工廠」，包括例如作為用於活體內連續產生多肽的來源(如本文中進一步描述)。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與外源核酸接觸。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與外源核酸及B2M引導RNA接觸，藉此降低或消除細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA基因之剪接位點，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與外源核酸、細胞表面表現之(例如靶向受體)多肽或可溶性(例如分泌)多肽及B2M引導RNA接觸，藉此降低或消除細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含使細胞與超過一種外源核酸接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與外源核酸接觸。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與外源核酸及HLA-A引導RNA接觸，藉此降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現，包含基因修飾CIITA基因之剪接位點，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與外源核酸、細胞表面表現之(例如靶向受體)多肽或可溶性(例如分泌)多肽及HLA-A引導RNA接觸，藉此降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含使細胞與超過一種外源核酸接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含用以下各者對細胞進行基因修飾：一或多種包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物、B2M引導RNA、編碼NK細胞抑制劑分子之核酸、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白及I類MHC蛋白之表現，包含用以下各者對細胞進行基因修飾：一或多種包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物、B2M引導RNA、編碼NK細胞抑制劑分子之核酸、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與外源核酸接觸。在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與外源核酸及B2M引導物接觸，藉此降低細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與外源核酸、編碼NK細胞抑制劑之核酸及B2M引導RNA接觸，藉此降低細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與外源核酸及編碼NK細胞抑制劑之核酸接觸。在一些實施例中，方法包含使細胞與超過一種外源核酸接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與外源核酸接觸。在一些實施例中，方法包含使CIITA中之剪接位點不活化，其包含使細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與外源核酸及HLA-A引導物接觸，藉此降低細胞表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含使細胞與超過一種外源核酸接觸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，外源核酸編碼表現於細胞表面上之多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼可溶性多肽。如本文所用，「可溶性」多肽係指由細胞分泌之多肽。在一些實施例中，可溶性多肽為治療多肽。在一些實施例中，可溶性多肽為抗體。在一些實施例中，可溶性多肽為酶。在一些實施例中，可溶性多肽為細胞介素。在一些實施例中，可溶性多肽為趨化因子。在一些實施例中，可溶性多肽為融合蛋白。
在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體片段(例如Fab、Fab2)。在一些實施例中，外源核酸編碼全長抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼單鏈抗體(例如scFv)。在一些實施例中，抗體為IgG、IgM、IgD、IgA或IgE。在一些實施例中，抗體為IgG抗體。在一些實施例中，抗體為IgG1抗體。在一些實施例中，抗體為IgG4抗體。在一些實施例中，重鏈恆定區含有已知降低效應功能之突變。在一些實施例中，重鏈恆定區含有已知增強效應功能之突變。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體為單域抗體(例如，僅VH域之抗體)。
在一些實施例中，外源核酸編碼中和抗體。中和抗體中和其目標抗原之活性。在一些實施例中，抗體為針對病毒抗原之中和抗體。在一些實施例中，抗體中和目標病毒抗原，阻斷病毒感染細胞之能力。在一些實施例中，基於細胞之中和分析可用於量測抗體之中和活性。特定細胞及讀數將視中和抗體之目標抗原而定。抗體之半數最大有效濃度(EC
50)可在基於細胞之中和分析中量測，其中較低EC
50指示更有效中和抗體。
在一些實施例中，外源核酸編碼結合至與疾病或病症(參見例如第IV部分中所述之疾病及病症)相關之抗原的抗體。
在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之多肽(亦即，細胞表面結合蛋白)。在一些實施例中，外源核酸編碼靶向受體。「靶向受體」為存在於細胞(例如T細胞)表面上之受體，以允許細胞結合至目標位點，例如生物體中之特定細胞或組織。在一些實施例中，靶向受體為CAR。在一些實施例中，靶向受體為通用CAR (UniCAR)。在一些實施例中，靶向受體為TCR。在一些實施例中，靶向受體為TRuC。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR) (例如，表現於B細胞上)。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。
在一些實施例中，靶向受體包括嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)及經由內部信號傳導域中之至少一個跨膜域可操作地連接的細胞表面分子受體，該內部信號傳導域能夠在細胞外受體部分結合時活化T細胞。在一些實施例中，CAR係指細胞外抗原識別域，例如scFv、VHH、奈米抗體；可操作地連接於細胞內信號傳導域，其在抗原結合時活化T細胞。CAR由四個區域構成：抗原識別域、胞外鉸鏈區、跨膜域及細胞內T細胞信號傳導域。此類受體為此項技術中熟知的(參見例如WO2020092057、WO2019191114、WO2019147805、WO2018208837)。亦涵蓋用於識別各種抗原之通用CAR (UniCAR) (參見例如EP 2 990 416 A1)及促進免疫細胞經由轉接子分子與目標細胞結合之反向通用CAR (RevCAR) (參見例如WO2019238722)。CAR可靶向抗體可發展成的任何抗原且通常針對呈現於待靶向之細胞或組織之表面上的分子。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域及TCR (例如TRuC)之次單元。(參見Baeuerle等人 Nature Communications 2087 (2019))。
在一些實施例中，外源核酸編碼TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼經基因修飾之TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼對由癌細胞表現之多肽具有特異性之經基因修飾之TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼對威爾姆斯氏腫瘤基因(WT1)抗原具有特異性之靶向受體。在一些實施例中，外源核酸編碼WT1特異性TCR (參見例如WO2020/081613A1)。
在一些實施例中，外源性核酸經插入至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸藉由同源重組(HR)整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸藉由鈍端插入整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸藉由非同源末端接合整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸整合至細胞基因體中之安全港基因座中。在一些實施例中，外源核酸整合至TRAC基因座、B2M基因座、AAVS1基因座及/或CIITA基因座中之一者中。在一些實施例中，外源核酸在脂質核酸組裝組合物中提供至細胞。在一些實施例中，脂質核酸組裝組合物為脂質奈米粒子(LNP)。
在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞具有降低或消除的II類MHC表現且包含外源核酸。在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞具有降低或消除的II類MHC表現且分泌及/或表現由整合至細胞基因體中之外源核酸編碼的多肽。在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白表現、降低或消除的CIITA蛋白表現及/或降低或消除的細胞核中之CIITA含量，且自NK細胞引發降低的反應，且具有降低的I類MHC蛋白表現，且分泌及/或表現由整合至細胞基因體中之外源核酸編碼之多肽。在一些實施例中，工程化細胞自CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞引發降低的反應。
在一些實施例中，提供工程化細胞，其中細胞在細胞表面上具有降低或消除的II類MHC及I類MHC蛋白之表現，其中細胞包含如本文所揭示之CIITA中之修飾，其中細胞包含B2M中之修飾，其中細胞包含編碼NK細胞抑制劑分子之外源核酸，且其中細胞進一步包含編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。在一些實施例中，工程化細胞自CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞引發降低的反應。
在實施例中，提供工程化細胞，其中細胞在細胞表面上具有降低或消除的II類MHC及HLA-A蛋白之表現，其中細胞包含如本文所揭示之CIITA中之修飾，其中細胞包含HLA-A基因中之修飾，其中細胞進一步包含編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。在一些實施例中，工程化細胞自CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞引發降低的反應。
在一些實施例中，本發明提供藉由如本文所揭示地基因修飾CIITA來降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現的方法，其中該等方法進一步提供降低一或多個額外目標基因(例如TRAC、TRBC)之表現。在一些實施例中，額外基因修飾提供將經基因修飾之細胞用於授受細胞轉移應用的進一步優勢。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與引導RNA接觸，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因(例如除CIITA或B2M或HLA-A以外之基因)中之目標序列，藉此降低或消除另一基因之表現。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，及B2M引導RNA，藉此降低或消除細胞表面上I類MHC蛋白之表現。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低或消除另一基因之表現，及編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低另一基因之表現；B2M引導RNA，藉此降低細胞表面上I類MHC蛋白之表現；及編碼NK細胞抑制劑之外源核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低另一基因之表現；及HLA-A引導RNA，藉此降低細胞表面上HLA-A蛋白之表現。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低或消除另一基因之表現；B2M引導RNA，藉此降低或消除細胞表面上I類MHC蛋白之表現；及編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列；編碼NK細胞抑制劑分子之外源核酸；及編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低另一基因之表現；HLA-A引導RNA，藉此降低細胞表面上HLA-A蛋白之表現；及編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含基因修飾CIITA，其包含使該細胞與包含如本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使該細胞與以下各者接觸：引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低或消除另一基因之表現；B2M引導RNA，該RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低或消除細胞表面上I類MHC蛋白之表現；編碼NK細胞抑制劑分子之外源核酸；及編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。在一些實施例中，方法進一步包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑接觸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含用以下各者對細胞進行基因修飾：一或多種包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物；B2M引導RNA；編碼NK細胞抑制劑分子之核酸；編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸；引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低或消除另一基因之表現；及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上II類MHC蛋白之表現，包含用以下各者對細胞進行基因修飾：一或多種包含本文所揭示之CIITA引導RNA的組合物；HLA-A引導RNA；編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸；引導RNA，該引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列，藉此降低或消除另一基因之表現；及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，額外目標基因為TRAC。在一些實施例中，額外目標基因為TRBC。
D. 例示性細胞類型
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物對細胞進行基因修飾。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，細胞為人類細胞。在一些實施例中，經基因修飾之細胞被稱為工程化細胞。工程化細胞係指包含工程化基因修飾之細胞(或細胞後代)，例如已與基因編輯系統接觸且經基因編輯系統基因修飾。術語「工程化細胞」及「經基因修飾之細胞」通篇可互換使用。工程化細胞可為本文所揭示之例示性細胞類型中之任一者。
在一些實施例中，細胞為免疫細胞。如本文所用，「免疫細胞」係指免疫系統之細胞，包括例如淋巴球(例如T細胞、B細胞、自然殺手細胞(「NK細胞」及NKT細胞或iNKT細胞))、單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞或顆粒球(例如嗜中性球、嗜酸性球及嗜鹼性球)。在一些實施例中，細胞為原代免疫細胞。在一些實施例中，免疫系統細胞可選自CD3
+、CD4
+及CD8
+T細胞、調節T細胞(Treg)、B細胞、NK細胞及樹突狀細胞(DC)。在一些實施例中，免疫細胞為同種異體的。
在一些實施例中，該細胞為淋巴球。在一些實施例中，該細胞為適應性免疫細胞。在一些實施例中，該細胞為T細胞。在一些實施例中，細胞為B細胞。在一些實施例中，該細胞為NK細胞。在一些實施例中，淋巴球為同種異體的。
如本文所用，T細胞可定義為表現T細胞受體(「TCR」或「αβ TCR」或「γδ TCR」)之細胞，然而，在一些實施例中，T細胞之TCR可經基因修飾以降低其表現(例如藉由對TRAC或TRBC基因之基因修飾)，因此蛋白質CD3之表現可用作藉由標準流動式細胞測量術方法鑑別T細胞之標記。CD3為與TCR相關之多次單元信號傳導複合物。因此，T細胞可稱為CD3+。在一些實施例中，T細胞為表現CD3+標記及CD4+或CD8+標記之細胞。在一些實施例中，T細胞為同種異體的。
在一些實施例中，T細胞表現醣蛋白CD8且因此根據標準流動式細胞測量術方法為CD8+，且可稱為「細胞毒性」T細胞。在一些實施例中，T細胞表現醣蛋白CD4且因此根據標準流動式細胞測量術方法為CD4+，且可稱為「輔助」T細胞。CD4+ T細胞可分化成亞群且可稱為Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、T調節(「Treg」)細胞或T濾泡性輔助細胞(「Tfh」)。各CD4+亞群釋放可具有促炎或消炎功能、存活或保護功能之特定細胞介素。T細胞可藉由CD4+或CD8+選擇方法自個體分離。
在一些實施例中，該T細胞為記憶T細胞。在體內，記憶T細胞遇到抗原。記憶T細胞可位於周圍淋巴樣器官(中樞記憶T細胞)或最近感染之組織(效應記憶T細胞)中。記憶T細胞可為CD8+ T細胞。記憶T細胞可為CD4+ T細胞。
如本文所用，「中樞記憶T細胞」可定義為經歷抗原之T細胞，且例如可表現CD62L及CD45RO。中樞記憶T細胞可藉由亦表現CCR7之中樞記憶T細胞偵測為CD62L+及CD45RO+，因此可藉由標準流動式細胞測量術方法偵測為CCR7+。
如本文所用，「早期幹細胞記憶T細胞」 (或「Tscm」)可定義為表現CD27及CD45RA之T細胞，且因此藉由標準流動式細胞測量術方法為CD27+及CD45RA+。Tscm不表現CD45同功異型物CD45RO，因此若此同功異型物藉由標準流動式細胞測量術方法進行染色，則Tscm將進一步為CD45RO-。因此，CD45RO- CD27+細胞亦為早期幹細胞記憶T細胞。Tscm細胞進一步表現CD62L及CCR7，因此可藉由標準流動式細胞測量術方法偵測為CD62L+及CCR7+。已展示早期幹細胞記憶T細胞與細胞療法產品之持久性及治療功效增加相關。
在一些實施例中，細胞為B細胞。如本文所用，「B細胞」可定義為表現CD19及/或CD20，及/或B細胞成熟抗原(「BCMA」)之細胞，且因此B細胞藉由標準流動式細胞測量術方法為CD19+，及/或CD20+，及/或BCMA+。藉由標準流動式細胞測量術方法，B細胞對於CD3及CD56進一步為陰性的。B細胞可為漿細胞。B細胞可為記憶B細胞。B細胞可為初始B細胞。B細胞可為IgM+，或具有類別轉換之B細胞受體(例如IgG+或IgA+)。在一些實施例中，B細胞為同種異體的。
在一些實施例中，細胞為單核細胞，諸如來自骨髓或周邊血液。在一些實施例中，細胞為周邊血液單核細胞(「PBMC」)。在一些實施例中，細胞為PBMC，例如淋巴球或單核球。在一些實施例中，細胞為周邊血液淋巴細胞(「PBL」)。在一些實施例中，單核細胞為同種異體的。
包括ACT及/或組織再生療法中所用之細胞，諸如幹細胞、先驅細胞及原代細胞。舉例而言，幹細胞包括多能幹細胞(PSC)；誘導多能幹細胞(iPSC)；胚胎幹細胞(ESC)；間葉幹細胞(MSC，例如自骨髓(BM)、周邊血液(PB)、胎盤、臍帶(UC)或脂肪分離)；造血幹細胞(HSC；例如自BM或UC分離)；神經幹細胞(NSC)；組織特異性前驅細胞幹細胞(TSPSC)；及角膜緣幹細胞(LSC)。前驅細胞及原代細胞包括單核細胞(MNC，例如自BM或PB分離)；內皮先驅細胞(EPC，例如自BM、PB及UC分離)；神經先驅細胞(NPC)；及組織特異性原代細胞或自其衍生之細胞(TSC)，包括軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。亦包括用於器官或組織移植之細胞，諸如胰島細胞、心肌細胞、甲狀腺細胞、胸腺細胞、神經元細胞、皮膚細胞及視網膜細胞。
在一些實施例中，細胞為人類細胞，諸如自人類個體分離之細胞。在一些實施例中，細胞自人類供體PBMC或白血球採集物分離。在一些實施例中，細胞來自患有病狀、病症或疾病之個體。在一些實施例中，細胞來自具有埃-巴二氏病毒(「EBV」)之人類供體。
在一些實施例中，離體進行該等方法。如本文所用，「離體」係指活體外方法，其中細胞能夠轉移至個體中，例如作為ACT療法。在一些實施例中，離體方法為涉及ACT療法細胞或細胞群體之活體外方法。
在一些實施例中，細胞來自細胞株。在一些實施例中，細胞株衍生自人類個體。在一些實施例中，細胞株為類淋巴母細胞細胞株(「LCL」)。細胞可經冷凍保存及解凍。細胞可先前尚未經冷凍保存。
在一些實施例中，細胞來自細胞庫。在一些實施例中，細胞經基因修飾且隨後轉移至細胞庫中。在一些實施例中，細胞自個體移出，離體進行基因修飾，且轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經基因修飾之細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經基因修飾之免疫細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，經基因修飾之免疫細胞群體包含第一及第二亞群，其中第一及第二亞群具有至少一個共同基因修飾且至少一個不同基因修飾被轉移至細胞庫中。
在一些實施例中，當細胞對HLA-B為同型接合時，HLA-B對偶基因選自以下HLA-B對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02。
在一些實施例中，當細胞對HLA-C為同型接合時，HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B對偶基因選自以下HLA-B對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02；且HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因係選自以下HLA-B及HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02及HLA-C*07:02；HLA-B*08:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:02及HLA-C*05:01；HLA-B*35:01及HLA-C*04:01；HLA-B*40:01及HLA-C*03:04；HLA-B*57:01及HLA-C*06:02；HLA-B*14:02及HLA-C*08:02；HLA-B*15:01及HLA-C*03:03；HLA-B*13:02及HLA-C*06:02；HLA-B*44:03及HLA-C*16:01；HLA-B*38:01及HLA-C*12:03；HLA-B*18:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:03及HLA-C*04:01；HLA-B*51:01及HLA-C*15:02；HLA-B*49:01及HLA-C*07:01；HLA-B*15:01及HLA-C*03:04；HLA-B*18:01及HLA-C*12:03；HLA-B*27:05及HLA-C*02:02；HLA-B*35:03及HLA-C*04:01；HLA-B*18:01及HLA-C*05:01；HLA-B*52:01及HLA-C*12:02；HLA-B*51:01及HLA-C*14:02；HLA-B*37:01及HLA-C*06:02；HLA-B*53:01及HLA-C*04:01；HLA-B*55:01及HLA-C*03:03；HLA-B*44:02及HLA-C*07:04；HLA-B*44:03及HLA-C*07:01；HLA-B*35:02及HLA-C*04:01；HLA-B*15:01及HLA-C*04:01；以及HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*07:02及HLA-C*07:02。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*08:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*44:02及HLA-C*05:01。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*35:01及HLA-C*04:01。
III. 基因編輯系統之細節
各種適合之基因編輯系統可用於製造本文所揭示之工程化細胞，包括但不限於CRISPR/Cas系統；鋅指核酸酶(ZFN)系統；及轉錄活化子樣效應物核酸酶(TALEN)系統。一般而言，基因編輯系統涉及使用經工程改造之裂解系統以誘導目標DNA序列中之雙股斷裂(DSB)或切口(例如單股斷裂或SSB)。裂解或鏈裂可經由使用諸如經工程改造之ZFN、TALEN之特異性核酸酶，或使用具有經工程改造之引導RNA之CRISPR/Cas系統以引導目標DNA序列之特異性裂解或鏈裂而發生。此外，基於阿爾古系統(Argonaute system)(例如來自嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)，稱為『TtAgo』，參見Swarts等人(2014) Nature 507(7491): 258-261)開發靶向核酸酶，該系統亦可具有用於基因編輯及基因療法中之潛力。
在一些實施例中，基因編輯系統為TALEN系統。轉錄活化子樣效應物核酸酶(TALEN)為可經工程化以切割DNA之特定序列的限制酶。其藉由使TAL效應子DNA結合域與DNA裂解域(切割DNA股之核酸酶)融合而製得。轉錄活化子樣效應物(TALE)可經工程化以結合至所需DNA序列，以促進特定位置處之DNA裂解(參見例如Boch, 2011, Nature Biotech)。限制酶可引入細胞中，用於原位基因編輯，一種稱為用工程化核酸酶進行基因編輯之技術。其中使用之此類方法及組合物為此項技術中已知的。參見例如WO2019147805、WO2014040370、WO2018073393，其內容特此全文併入。
在一些實施例中，基因編輯系統為鋅指系統。鋅指核酸酶(ZFN)為藉由將鋅指DNA結合域融合至DNA裂解域產生之人工限制酶。鋅指域可經工程化以靶向特定的所需DNA序列，從而使得鋅指核酸酶能夠靶向複雜基因體內的獨特序列。來自II型限制性核酸內切酶FokI之非特異性裂解域通常用作ZFN中之裂解域。裂解藉由內源性DNA修復機制修復，允許ZFN精確改變高等生物之基因體。其中使用之此類方法及組合物為此項技術中已知的。參見例如WO2011091324，其內容特此全文併入。
在一些實施例中，基因編輯系統為CRISPR/Cas系統，包括例如包含引導序列及經RNA引導之DNA結合劑之CRISPR引導RNA，且在本文中進一步描述。
A. CRISPR引導RNA
本文提供適用於修飾目標序列之引導序列，例如使用包含所揭示之引導序列的引導RNA與經RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)。
本文所揭示之引導序列中之每一者可進一步包含額外核苷酸以形成crRNA，例如在其3'端處之引導序列後具有以下例示性核苷酸序列：呈5'至3'定向之GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 170)。在sgRNA之情況下，以上引導序列可進一步包含額外核苷酸以形成sgRNA，例如在引導序列之3'端之後具有以下例示性核苷酸序列：呈5'至3'定向之GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 171)或GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 172，其為不具有四個末端U之SEQ ID NO: 171)。在一些實施例中，SEQ ID NO: 171之四個末端U不存在。在一些實施例中，僅存在SEQ ID NO: 171之四個末端U中之1、2或3者。
在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 1-101之引導序列中之任一者及額外核苷酸以形成crRNA，例如在其3'端處之引導序列後具有以下例示性核苷酸序列：呈5'至3'定向之GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 173)。SEQ ID NO: 173參考野生型引導RNA保守序列缺少8個核苷酸：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 172)。
引導RNA可進一步包含trRNA。在本文所述之各組合物及方法實施例中，crRNA及trRNA可締合為單一RNA (sgRNA)或可處於單獨RNA (dgRNA)上。在sgRNA之情形下，crRNA與trRNA組分可共價連接，例如經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵。在一些實施例中，crRNA及/或trRNA序列可稱為引導RNA之「支架」或「保存部分」。
在本文所述之組合物、用途及方法實施例中之各者中，引導RNA可包含呈「雙引導RNA」或「dgRNA」形式之兩個RNA分子。dgRNA包含有包含crRNA之第一RNA分子，該crRNA包含例如
表 1中所示之引導序列；及包含trRNA之第二RNA分子。第一及第二RNA分子可不共價連接，但可經由crRNA與trRNA之部分之間的鹼基配對形成RNA雙螺旋。
在本文中所述之組合物、用途及方法實施例中之每一者中，引導RNA可包含呈「單引導RNA」或「sgRNA」形式之單個RNA分子。sgRNA可包含與trRNA共價連接之crRNA (或其一部分)，其包含
表 1中所示之引導序列。sgRNA可包含
表 1中所示之引導序列之17、18、19或20個連續核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由連接子共價連接。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA與trRNA之部分之間的鹼基配對形成莖-環結構。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由一或多個不為磷酸二酯鍵之鍵共價連接。
在一些實施例中，trRNA可包含來源於天然產生之CRISPR/Cas系統的trRNA序列之全部或一部分。在一些實施例中，trRNA包含經截短或經修飾之野生型trRNA。trRNA之長度視所用CRISPR/Cas系統而定。在一些實施例中，trRNA包含以下或由以下組成：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超過100個核苷酸。在一些實施例中，trRNA可包含某些二級結構，諸如一或多種髮夾結構或莖環結構或一或多種隆突結構。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含一或多個包含
表 1中之任一引導序列的引導RNA。在一些實施例中，提供一種包含一或多個引導RNA之組合物，該一或多個引導RNA包含
表 1中之任一引導序列，其中SEQ ID NO: 170、171、172或173之核苷酸在其3'端處跟隨引導序列。在一些實施例中，根據SEQ ID NO: 300之修飾模式修飾包含
表 1中之任一引導序列的一或多個引導RNA，其中SEQ ID NO: 170、171、172或173之核苷酸在其3'端處跟隨引導序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含一或多個包含
表 1中之任一引導序列的引導RNA。在一個態樣中，提供包含一或多個gRNA之組合物，其包含與SEQ ID NO: 1-101之核酸中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之引導序列。
在其他實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個，例如至少兩個包含選自
表 1中所示之任何兩個或更多個引導序列之引導序列的gRNA。在一些實施例中，組合物包含至少兩個gRNA，其各自包含與
表 1中所示之任一引導序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的引導序列。
在一些實施例中，本發明之引導RNA組合物經設計以識別(例如雜交至) CIITA中之目標序列。舉例而言，CIITA目標序列可藉由包含引導RNA之所提供Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，諸如Cas裂解酶之經RNA引導之DNA結合劑可藉由引導RNA導引至CIITA中之目標序列，其中引導RNA之引導序列與目標序列雜交，且諸如Cas裂解酶之經RNA引導之DNA結合劑裂解目標序列。
在一些實施例中，一或多個引導RNA之選擇係基於CIITA內之目標序列而確定。在一些實施例中，包含一或多個引導序列之組合物包含根據來自人類參考基因體hg38之座標與
表 1中所示之對應基因體區域互補的引導序列。其他實施例之引導序列可與CIITA內任何
表 1中所列之基因體座標鄰近的序列互補。舉例而言，其他實施例之引導序列可與包含
表 1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列互補。
不受任何特定理論束縛，目標基因之某些區域中之修飾(例如由於核酸酶介導之DSB而發生之插入/缺失所產生之框移突變)可能比其他區域中之突變更難以耐受，因此DSB之位置為可引起蛋白質減弱之量或類型的重要因素。在一些實施例中，與目標基因內之目標序列互補或具有互補性之gRNA用於將經RNA引導之DNA結合劑導引至目標基因中之特定位置。
在一些實施例中，引導序列與存在於目標基因中之目標序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%或80%一致。在一些實施例中，引導序列與存在於人類
CIITA基因中之目標序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%或80%一致。
在一些實施例中，目標序列可與引導RNA之引導序列互補。在一些實施例中，引導RNA之引導序列與其對應目標序列之間的互補性或一致性程度可為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，gRNA之目標序列及引導序列可為100%互補或一致的。在其他實施例中，gRNA之目標序列及引導序列可含有至少一個失配。舉例而言，gRNA之目標序列及引導序列可含有1、2、3或4個失配，其中引導序列之總長度為20。在一些實施例中，gRNA之目標序列及引導序列可含有1-4個失配，其中引導序列為20個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物或調配物包含mRNA，其包含編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如如本文所述之Cas核酸酶之開放閱讀框架(ORF)。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼諸如Cas核酸酶之經RNA引導之DNA結合劑之ORF之mRNA。
B. gRNA之修飾
在一些實施例中，gRNA (例如，sgRNA、短sgRNA、dgRNA或crRNA)經修飾。在本文所述之gRNA的上下文中，術語「經修飾」或「修飾」包括上文所描述之修飾，包括例如(a)端修飾，例如5'端修飾或3'端修飾，包括5'或3'保護端修飾；(b)核鹼基(或「鹼基」)修飾，包括鹼基置換或移除；(c)糖修飾，包括2'、3'及/或4'位置處之修飾；(d)核苷間連接修飾；及(e)主鏈修飾，其可包括磷酸二酯鍵及/或核糖之修飾或置換。核苷酸在指定位置之修飾包括緊接著核苷酸之糖之3'之磷酸二酯鍵的修飾或置換。因此，舉例而言，包含5'端之第一糖與第二糖之間的硫代磷酸酯之核酸被視為包含位置1處之修飾。術語「經修飾之gRNA」通常指一種gRNA，其鹼基、糖及磷酸二酯鍵或主鏈部分(包括核苷酸磷酸酯)中之一或多者之化學結構具有修飾，全部如本文中所詳述及例示。
其他描述及例示性修飾模式提供於2019年12月12日公佈之WO2019/237069的表1中，該案之全部內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，gRNA包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多個YA位點處之修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶包含修飾(包括改變緊接嘧啶之糖之3'之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤包含修飾(包括改變緊接腺嘌呤之糖3'之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包含修飾，諸如糖、鹼基或核苷間鍵聯修飾。YA修飾可為本文所闡述之任何類型的修飾。在一些實施例中，YA修飾包含硫代磷酸酯、2'-OMe或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾包含嘧啶修飾，包含硫代磷酸酯、2'-OMe、2'-H、肌苷或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾在含有一或多個YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)。在一些實施例中，YA修飾在含有YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)，其中YA修飾位於YA位點遠端。
在一些實施例中，gRNA之引導序列(或引導區)包含1、2、3、4、5或更多個可包含YA修飾之YA位點(「引導區YA位點」)。在一些實施例中，位於相對於5'末端之5'端之5端、6端、7端、8端、9端或10端的一或多個YA位點(其中「5端」等係指相對於引導區之3'端的位置5，亦即，引導區中之最多3'核苷酸)包含YA修飾。經修飾之引導區YA位點包含YA修飾。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸之20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內。舉例而言，若經修飾之引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸之10個核苷酸內且引導區之長度為20個核苷酸，則經修飾之引導區YA位點中之經修飾核苷酸位於位置11-20中之任一位置。在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點位於相對於5'末端之5'端的核苷酸4、5、6、7、8、9、10或11處或其之後。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點不同於5'端修飾。舉例而言，sgRNA可包含如本文所述之5'端修飾且進一步包含經修飾之引導區YA位點。替代地，sgRNA可包含未經修飾之5'端及經修飾之引導區YA位點。或者，短sgRNA可包含經修飾之5'端及未修飾之引導區YA位點。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸不包含的修飾。舉例而言，若核苷酸1至3包含硫代磷酸酯，核苷酸4僅包含2'-OMe修飾，且核苷酸5為YA位點之嘧啶且包含硫代磷酸酯，則經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸(核苷酸4)不包含的修飾(硫代磷酸酯)。在另一實例中，若核苷酸1至3包含硫代磷酸酯，且核苷酸4為YA位點之嘧啶且包含2'-OMe，則經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸(核苷酸1至3中之任一者)不包含的修飾(2'-OMe)。若未修飾之核苷酸位於經修飾之引導區YA位點5'，則亦始終滿足此條件。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點包含如上文針對YA位點所述的修飾。gRNA之引導區可根據任何實施例修飾，其包含本文所闡述之經修飾引導區。在可行的情況下，本發明在別處闡述的任何實施例可以與任一前述實施例組合。
在一些實施例中，gRNA之5'及/或3'端區經修飾。
在一些實施例中，3'末端區域中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可稱為「3'端修飾」。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含以下中之任何一或多者：選自2'-O-甲基(2'-O-Me)經修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)經修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)經修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵、反向無鹼基經修飾之核苷酸或其組合的經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端之1、2、3、4、5、6或7個核苷酸的修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含一個PS鍵聯，其中該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後三個核苷酸之間的兩個PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸之間的四個PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後2、3、4、5、6或7個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中，包含3'端修飾的gRNA包含或進一步包含3'尾，其中該3'尾包含存在於3'尾中之任何一或多個核苷酸的修飾。在一些實施例中，3'尾完全被修飾。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10個核苷酸，視情況其中此等核苷酸中之任一者或多者經修飾。在一些實施例中，提供包含3'保護端修飾之gRNA。在一些實施例中，3'尾包含1至約20個核苷酸、1至約15個核苷酸、1至約10個核苷酸、1至約5個核苷酸、1至約4個核苷酸、1至約3個核苷酸，及1至約2個核苷酸。在一些實施例中，gRNA不包含3'尾。
在一些實施例中，5'末端區經修飾，例如gRNA中前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可稱為「5'端修飾」。在一些實施例中，5'末端區域中之前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，5'端之末端(亦即，前) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中的至少一者經修飾。在一些實施例中，gRNA之5'及3'端區(例如末端)兩者均經修飾。在一些實施例中，僅gRNA之5'端區經修飾。在一些實施例中，gRNA保守部分中僅3'末端區(加或減3'尾)經修飾。在一些實施例中，gRNA包含在gRNA之5'末端區之前7個核苷酸之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，gRNA包含在3'末端區之7個末端核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，5'末端區之前4個核苷酸中之2、3或4者，及/或3'末端區之末端4個核苷酸中之2、3或4者經修飾。在一些實施例中，5'末端區之前4個核苷酸中的2、3或4者經由硫代磷酸酯(PS)鍵連接。在一些實施例中，對5'末端及/或3'末端之修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)或2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾。在一些實施例中，修飾包含對核苷酸之2'-氟(2'-F)修飾。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，修飾包含倒轉無鹼基核苷酸。在一些實施例中，修飾包含保護端修飾。在一些實施例中，修飾包含超過一個修飾，其選自保護端修飾、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-氟(2'-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯，及反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，涵蓋等效修飾。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾及3'端修飾之gRNA。在一些實施例中，gRNA包含不在5'或3'端處之經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾的短sgRNA，其中上莖修飾包含上部莖區域中之US1至US12中之任一者或多者的修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾之sgRNA，其中上莖修飾包含對上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾的sgRNA，其中上莖修飾包含YA位點中之1、2、3、4或5個YA修飾。在一些實施例中，上莖修飾包含2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸及/或其組合。本文所述之其他修飾，諸如5'端修飾及/或3'端修飾可與上莖修飾組合。
在一些實施例中，sgRNA包含髮夾區中之修飾。在一些實施例中，髮夾區修飾包含至少一個經修飾之核苷酸，其選自2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸及/或其組合。在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾1區中。在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾2區中。在一些實施例中，髮夾修飾包含YA位點中之1、2或3個YA修飾。在一些實施例中，髮夾修飾包含至少1、2、3、4、5或6個YA修飾。本文所述之其他修飾，諸如上莖修飾、5'端修飾及/或3'端修飾可與髮夾區中之修飾組合。
在一些實施例中，gRNA包含經取代且視情況經縮短之髮夾1區，其中以下核苷酸對中之至少一者在經取代且視情況經縮短之髮夾1中經沃森-克里克配對(Watson-Crick pairing)核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10及/或H1-4及H1-9。「沃森-克里克配對核苷酸」包括能夠形成沃森-克里克鹼基對之任何對，包括A-T、A-U、T-A、U-A、C-G及G-C對，及包括具有相同鹼基配對偏好之前述核苷酸中之任一者的經修飾型式的對。在一些實施例中，髮夾1區缺乏H1-5至H1-8中之任一者或兩者。在一些實施例中，髮夾1區缺乏以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10及/或H1-4及H1-9。在一些實施例中，髮夾1區缺乏髮夾1區之1至8個核苷酸。在任一前述實施例中，缺乏核苷酸可使得經華特生-克里克配對核苷酸(H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9)取代之一或多個核苷酸對在gRNA中形成鹼基對。
在一些實施例中，gRNA進一步包含缺乏至少1個核苷酸之上莖區，例如美國申請案第62/946,905號之表7中指示的經縮短之上莖區中之任一者，該案之內容以全文引用之方式併入本文中或描述於本文中之其他地方，該等上莖區可與本文所述之經縮短或經取代之髮夾1區中之任一者組合。
在一些實施例中，本文所述之gRNA進一步包含連接區，其中該連接區缺少至少一個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾之」gRNA或「經化學修飾之」gRNA，用於描述代替或外加典型A、G、C及U殘基使用之一或多種非天然及/或天然存在之組分或組態的存在。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)磷酸二酯主鏈鍵聯中之非鍵聯磷酸氧中之一或兩者及/或鍵聯磷酸氧中之一或多者之改變，例如置換(例示性主鏈修飾)；(ii)核糖成分，例如核糖上之2'羥基之改變，例如置換(例示性糖修飾)；(iii)用「脫磷酸」連接子批量置換磷酸酯部分(例示性主鏈修飾)；(iv)天然存在之核鹼基之修飾或置換，包括用非典型核鹼基(例示性鹼基修飾)；(v)核糖-磷酸酯主鏈之置換或修飾(例示性主鏈修飾)；(vi)寡核苷酸之3'端或5'端之修飾，例如末端磷酸酯基團之移除、修飾或置換或部分、帽或連接子之結合(此類3'或5'帽修飾可包含糖及/或主鏈修飾)；及(vii)糖之修飾或置換(例示性糖修飾)。
化學修飾(諸如以上列出之彼等)可經組合以得到經修飾之gRNA，其包含可具有兩個、三個、四個或更多個修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)。舉例而言，經修飾之殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每一鹼基經修飾，例如所有鹼基均具有諸如硫代磷酸酯基團之經修飾之磷酸酯基團。在某些實施例中，gRNA分子之所有或基本上所有磷酸酯基經硫代磷酸酯基置換。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之5'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之3'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。
在一些實施例中，gRNA包含一、二、三個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA中至少5% (例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)之位置為經修飾之核苷或核苷酸。
在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾之殘基之磷酸酯基可藉由用不同取代基置換一或多個氧而經修飾。此外，經修飾之殘基，例如存在於經修飾之核酸中之經修飾之殘基可包括用如本文所描述之經修飾之磷酸酯基批量置換未經修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾可包括產生不帶電連接子或具有不對稱電荷分佈之帶電連接子的變化。
經修飾之磷酸酯基的實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。
亦可構築可模擬核酸之骨架，其中磷酸酯連接子及核糖經核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置換。此類修飾可包含主鏈修飾及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可藉由替代骨架繫栓。實例可包括但不限於N-嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。
經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括對糖基之一或多個修飾，亦即糖修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如經多個不同「氧基」或「去氧」取代基置換。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，因為羥基可不再經去質子化以形成2'-烷氧離子。2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH
2CH
2O)
nCH
2CH
2OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20之整數。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，該修飾用氟置換2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖」核酸，其中2'羥基可例如藉由C
1-6伸烷基或C
1-6伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中例示性橋可包括亞甲基、伸丙基、乙醚或胺基橋。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「解鎖」核酸(UNA)，其中核糖環缺乏C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE) (OCH
2CH
2OCH
3，例如PEG衍生物)。
「去氧」2'修飾可包括氫(亦即，去氧核糖，例如在部分dsRNA之突出部分處)；鹵基(例如溴基、氯基、氟基或碘基)；胺基(其中胺基可為例如NH
2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳胺基、二雜芳胺基或胺基酸)；NH(CH
2CH
2NH)
nCH
2CH
2-胺基(其中胺基可例如如本文所描述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；及可視情況經例如如本文所描述之胺基取代的烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基。
糖修飾可包含亦可含有一或多個碳之糖基，其具有與核糖中之對應碳相反的立體化學組態。因此，經修飾之核酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。經修飾之核酸亦可包括無鹼基糖。此等無鹼基糖亦可進一步在一或多個組成性糖原子處經修飾。經修飾之核酸亦可包括一或多種呈L形式之糖，例如L-核苷。
可併入至經修飾之核酸中之本文中所描述之經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括經修飾之鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。此等核鹼基可經修飾或完全置換以得到可併入至經修飾之核酸中之經修飾之殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如天然存在之鹼基衍生物及合成鹼基衍生物。
在採用雙引導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者可含有修飾。此類修飾可處於crRNA及/或tracr RNA之一或兩個末端處。在包含sgRNA之實施例中，sgRNA之一端或兩端處之一或多個殘基可經化學修飾，或整個sgRNA可經化學修飾。某些實施例包含5'端修飾。某些實施例包含3'端修飾。在某些實施例中，gRNA分子之單股突出端中之一或多個或所有核苷酸為去氧核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA包含2018年6月14日公佈之WO2018/107028 A1中所揭示之修飾模式中之一者，該案之內容特此以全文引用之方式併入。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於指示經2'-O-Me修飾之核苷酸。術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於指示經2'-F取代之核苷酸。「*」可用於描述PS修飾。術語A*、C*、U*或G*可用於指示經PS鍵連接至後續(例如3')核苷酸之核苷酸。術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於指示已經2'-O-Me取代且經PS鍵連接至下一個(例如3')核苷酸之核苷酸。
C. 核糖核蛋白複合物
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個gRNA之組合物，該一或多個gRNA包含來自
表 1之一或多個引導序列及經RNA引導之DNA結合劑，例如核酸酶，諸如Cas核酸酶，諸如Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱作雙股核酸內切酶活性。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌及其他原核生物(參見例如下一段中之清單)之II型CRISPR系統之彼等者及其經修飾(例如工程化或突變型)形式。參見例如US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶之其他實例包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物或其Cas10、Csm1或Cmr2次單元；及I型CRISPR系統之級聯複合物或其Cas3次單元。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自IIA型、IIB型或IIC型系統。關於各種CRISPR系統及Cas核酸酶之論述，參見例如Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL. 9:467-477 (2011)；Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL, 13: 722-36 (2015)；Shmakov等人, MOLECULAR CELL, 60:385-397 (2015)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之切口酶經修飾或衍生自Cas蛋白，諸如2類Cas核酸酶(其可例如為II型、V型或VI型Cas核酸酶)。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白質及其修飾。
可衍生Cas核酸酶或Cas切口酶之非限制性例示性菌種包括釀膿鏈球菌(
Streptococcus pyogenes)、嗜熱鏈球菌(
Streptococcus thermophilus)、鏈球菌屬、金黃色葡萄球菌(
Staphylococcus aureus)、無害李氏菌(
Listeria innocua)、加氏乳桿菌(
Lactobacillus gasseri)、新兇手弗朗西斯氏菌(
Francisella novicida)、產琥珀酸沃廉菌(
Wolinella succinogenes)、華德薩特菌(
Sutterella wadsworthensis)、伽馬變形菌(
Gammaproteobacterium)、奈瑟氏腦膜炎菌(
Neisseria meningitidis)、空腸彎曲桿菌(
Campylobacter jejuni)、多殺巴斯德菌(
Pasteurella multocida)、產琥珀酸纖維桿菌(
Fibrobacter succinogene)、深紅紅螺菌(
Rhodospirillum rubrum)、達松維爾擬諾卡氏菌(
Nocardiopsis dassonvillei)、始旋鏈黴菌(
Streptomyces pristinaespiralis)、產綠色鏈黴菌(
Streptomyces viridochromogenes)、產綠色鏈黴菌、粉紅鏈孢囊菌(
Streptosporangium roseum)、粉紅鏈孢囊菌、嗜酸熱脂環桿菌(
Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌(
Bacillus pseudomycoides)、砷還原芽孢桿菌(
Bacillus selenitireducens)、西伯利亞微小桿菌(
Exiguobacterium sibiricum)、戴白氏乳桿菌(
Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳桿菌(
Lactobacillus salivarius)、布氏乳桿菌(
Lactobacillus buchneri)、齒垢密螺旋體(
Treponema denticola)、海洋微顫菌(
Microscilla marina)、伯克霍爾德氏細菌(
Burkholderiales bacterium)、食萘極地單胞菌(
Polaromonas naphthalenivorans)、單胞菌屬(
Polaromonas sp.)、瓦氏鱷球藻(
Crocosphaera watsonii)、鱷球藻屬、銅綠微囊藻(
Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬(
Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋桿菌(
Acetohalobium arabaticum)、根制氨菌(
Ammonifex degensii)、熱解纖維素菌(
Caldicelulosiruptor becscii)、脫硫假絲酵母(
Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(
Clostridium botulinum)、艱難梭菌(
Clostridium difficile)、大芬戈爾德菌(
Finegoldia magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(
Natranaerobius thermophilus)、嗜熱丙酸厭氧腸狀菌(
Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜溫硫桿菌(
Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(
Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色異著色菌(
Allochromatium vinosum)、海桿菌屬、嗜鹽亞硝化球菌(
Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亞硝化球菌(
Nitrosococcus watsoni)、遊海假交替單胞菌(
Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纖線桿菌(
Ktedonobacter racemifer)、變異念珠藻(
Anabaena variabilis)、泡沫節球藻(
Nodularia spumigena)、念珠藻屬(
Nostoc sp.)、極大節旋藻(
Arthrospira maxima)、鈍頂節旋藻(
Arthrospira platensis)、節旋藻屬、螺旋藻屬(
Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(
Microcoleus chthonoplastes)、顫藻屬(
Oscillatoria sp.)、運動石袍菌(
Petrotoga mobilis)、非洲高熱桿菌(
Thermosipho africanus)、巴氏鏈球菌(
Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(
Neisseria cinerea)、紅嘴鷗彎曲桿菌(
Campylobacter lari)、食清潔劑細小棒菌(
Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒狀桿菌(
Corynebacterium diphtheria)、胺基酸球菌屬(
Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌(
Lachnospiraceae bacterium) ND2006及海洋無核氯菌(
Acaryochloris marina)。
在一些實施例中，Cas核酸酶為來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自奈瑟氏腦膜炎菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他實施例中，Cas核酸酶為來自以下之Cpf1核酸酶：土拉熱弗朗西絲菌(
Francisella tularensis)、毛螺科菌、瘤胃溶纖維丁酸弧菌(
Butyrivibrio proteoclasticus)、佩氏細菌(
Peregrinibacteria bacterium)、帕庫氏菌(
Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌(
Smithella)、胺基酸球菌屬、白蟻甲烷支原體菌候選種(
Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真桿菌(
Eubacterium eligens)、牛眼莫拉菌(
Moraxella bovoculi)、稻田鉤端螺旋體
(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉單胞菌(
Porphyromonas crevioricanis)、解糖腖普雷沃菌(
Prevotella disiens)或獼猴卟啉單胞菌(
Porphyromonas macacae)。在某些實施例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬或毛螺科菌之Cpf1核酸酶。
在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶為來自奈瑟氏腦膜炎菌之Cas9核酸酶之切口酶形式。參見例如WO/2020081568，其描述Nme2Cas9 D16A切口酶融合蛋白。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他實施例中，Cas切口酶衍生自來自以下之Cpf1核酸酶：土拉熱弗朗西絲菌、毛螺科菌、瘤胃溶纖維丁酸弧菌、佩氏細菌、帕庫氏菌、史密斯氏菌、胺基酸球菌屬、白蟻甲烷支原體菌候選種、挑剔真桿菌、牛眼莫拉菌、稻田鉤端螺旋體、狗口腔卟啉單胞菌、解糖腖普雷沃菌或獼猴卟啉單胞菌。在某些實施例中，Cas切口酶衍生自來自胺基酸球菌屬或毛螺菌科之Cpf1核酸酶。如其他地方所論述，切口酶可藉由使兩個催化域中之一者不活化而衍生自核酸酶，例如藉由使核溶解所必需之活性位點殘基(諸如Spy Cas9中之D10、H840或N863)突變。熟習此項技術者將熟悉容易地鑑別其他Cas蛋白中之相應殘基的技術，諸如序列比對及結構比對，其將在下文詳細論述。
在一些實施例中，gRNA連同經RNA引導之DNA結合劑一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA連同Cas核酸酶一起稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含第I型、第II型或第III型組分。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自第II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白質。在一些實施例中，gRNA連同Cas9一起稱為Cas9 RNP。
野生型Cas9具有兩個核酸酶域：RuvC及HNH。RuvC域裂解非目標DNA股，且HNH域裂解目標DNA股。在一些實施例中，Cas9蛋白包含多於一個RuvC域及/或多於一個HNH域。在一些實施例中，Cas9蛋白為野生型Cas9。在組合物、用途及方法實施例中之每一者中，Cas誘導目標DNA中之雙股斷裂。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中該蛋白質之一個域或區經不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶的域置換。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在其他實施例中，Cas核酸酶或Cas切口酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為第I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶來自第III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑具有單股切口酶活性，亦即可切割一個DNA股以產生單股斷裂，該單股斷裂亦稱為「切口」。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶為在dsDNA中產生切口，亦即切割DNA雙螺旋體之一個股但不切割另一股之酶。在一些實施例中，Cas切口酶為其中例如藉由催化域中之一或多種變化(例如點突變)使核酸內切酶活性位點不活化之Cas核酸酶(例如上文所論述之Cas核酸酶)之型式。關於Cas切口酶及例示性催化域改變之論述，參見例如美國專利第8,889,356號。在一些實施例中，Cas切口酶，諸如Cas9切口酶具有失活的RuvC或HNH域。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑經修飾而僅含有一個功能核酸酶域。舉例而言，藥劑蛋白質可經修飾以使得核酸酶域中之一者經突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶。在一些實施例中，使用具有非活性RuvC域之切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶。在一些實施例中，使用具有非活性HNH域之切口酶。
在一些實施例中，Cas蛋白質核酸酶域中之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見例如Zetsche等人 (2015)
Cell10月22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含HNH核酸酶域或類HNH核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見例如Zetsche等人 (2015)。其他例示性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A(基於新兇手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。
在一些實施例中，編碼切口酶之mRNA將與一對分別與目標序列之有義股及反義股互補之引導RNA組合提供。在此實施例中，引導RNA將切口酶導引至靶序列且藉由在靶序列之相對股上產生切口而引入DSB(亦即雙切口)。在一些實施例中，使用雙重切口可改良特異性且減少脫靶效應。在一些實施例中，連同目標DNA之相對股之兩個個別引導RNA使用切口酶以在目標DNA中產生雙切口。在一些實施例中，連同經選擇以非常接近之兩個個別引導RNA使用切口酶以在目標DNA中產生雙切口。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑缺乏裂解酶及切口酶活性。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽為dCas9多肽。在一些實施例中，缺乏裂解酶及切口酶活性之經RNA引導之DNA結合劑或dCas DNA結合多肽為其中例如藉由催化域之一或多種改變(例如點突變)，使核酸內切酶活性位點不活化的Cas核酸酶之形式(例如上文所論述之Cas核酸酶)。參見例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含一或多個異源功能域(例如為或包含融合多肽)。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3去胺酶。在一些實施例中，APOBEC3去胺酶為APOBEC3A (A3A)。在一些實施例中，A3A為人類A3A。在一些實施例中，A3A為野生型A3A。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，mRNA進一步包含將定序編碼A3A與定序編碼經RNA引導之切口酶之序列連接的連接子。在一些實施例中，連接子為有機分子、基團、聚合物或化學部分。在一些實施例中，連接子為肽連接子。在一些實施例中，肽連接子為具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個或更多個胺基酸之任何胺基酸伸長段。在一些實施例中，肽連接子為16個殘基之「XTEN」連接子或其變異體(參見例如實例；及Schellenberger等人，A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接子包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 900)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 901)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 902)。在一些實施例中，肽連接子包含選自SEQ ID NO: 903-913之一或多個序列。
在一些實施例中，異源功能域可促進將經RNA引導之DNA結合劑輸送至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定域信號(NLS)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1-10個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下，NLS可在經RNA引導之DNA結合劑序列之N端或C端處融合。其亦可插入經RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與多於一個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情形下，兩個NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑與在羧基端處融合之兩個NLS序列(例如SV40)融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個NLS連接在N端處且一個連接在C端處。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單聯(monopartite)序列，諸如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 600)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 601)。在一些實施例中，NLS可為諸如核質蛋白之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO: 602)之雙聯序列。在一特定實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 600) NLS可在經RNA引導之DNA結合劑之C端處融合。一或多個連接子視情況包括在融合位點處。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含編輯劑。例示性編輯劑為BC22n，其包括藉由XTEN連接子與釀膿鏈球菌-D10A Cas9切口酶融合之智人APOBEC3A，及編碼BC22n之mRNA。提供編碼BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 804)。
在一些實施例中，異源功能域可能夠修改經RNA引導之DNA結合劑的細胞內半衰期。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑之半衰期可得以提高。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑之半衰期可得以降低。在一些實施例中，異源功能域可能能夠增加經RNA引導之DNA結合劑的穩定性。在一些實施例中，異源功能域可能能夠降低經RNA引導之DNA結合劑的穩定性。在一些實施例中，異源功能域可充當蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶，諸如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶蛋白酶介導。在一些實施例中，異源功能域可包含PEST序列。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可藉由添加泛素或多泛素鏈來修飾。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白質(UBL)。泛素樣蛋白質之非限制性實例包括小泛素樣修飾因子(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦被稱作干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關修飾因子-1 (URM1)、神經元-前驅細胞-細胞表現之發育下調蛋白-8 (NEDD8，在釀酒酵母中被稱作Rub1)、人類白血球抗原F相關(FAT10)、自噬-8 (ATG8)及自噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素摺疊修飾因子-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能域可為標記域。標記域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、抗原決定基標籤及報導基因序列。在一些實施例中，標記域可為螢光蛋白。適合螢光蛋白之非限制實例包括綠色螢光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、祖母綠(Emerald)、Azami綠(Azami Green)、單Azami綠(Monomeric Azami Green)、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、藍寶石色(Sapphire)、T-藍寶石色(T-sapphire))、強化型藍螢光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi強化型藍(Midoriishi-Cyan))、紅色螢光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRed單色、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed單色、HcRed串色、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira橙色(Kusabira-Orange)、單體Kusabira橙色(Monomeric Kusabira-Orange)、mTangerine、tdTomato)或任何其他適合之螢光蛋白。在其他實施例中，標記域可為純化標籤及/或抗原決定基標籤。非限制性之例示性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、殼質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His、8×His、生物素羧基載體蛋白質(BCCP)、聚His及調鈣蛋白。非限制性之例示性報導基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在其他實施例中，異源功能域可將經RNA引導之DNA結合劑靶向至特定細胞器、細胞型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能域可將經RNA引導之DNA結合劑靶向至粒線體。
在其他實施例中，異源功能域可為效應子域，諸如編輯域。當經RNA引導之DNA結合劑導引至其目標序列時，例如當Cas核酸酶藉由gRNA導引至目標序列時，效應子(諸如編輯劑)域可修飾或影響目標序列。在一些實施例中，效應子(諸如編輯劑)域可選自核酸結合域、核酸酶域(例如非Cas核酸酶域)、表觀遺傳修飾域、轉錄活化域或轉錄抑制子域。在一些實施例中，異源功能域為核酸酶，諸如FokI核酸酶。參見例如美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源功能域為轉錄活化子或抑制子。參見例如Qi等人, 「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression」,
Cell152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人, 「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors」,
Nat. Methods10:973-6 (2013)；Mali等人, 「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering」,
Nat. Biotechnol.31:833-8 (2013)；Gilbert等人, 「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes」,
Cell154:442-51 (2013)。因此，經RNA引導之DNA結合劑基本上變成可使用引導RNA引導以結合所需目標序列之轉錄因子。
D. 測定引導RNA之功效
在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分(例如，經RNA引導之DNA結合劑)一起遞送或表現時，測定引導RNA之功效。在一些實施例中，引導RNA與經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白，例如Cas9一起表現。在一些實施例中，將引導RNA遞送至已穩定表現RNA引導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之細胞株中或在該細胞株中表現。在一些實施例中，引導RNA作為RNP之一部分遞送至細胞。在一些實施例中，將引導RNA與編碼經RNA引導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之mRNA一起遞送至細胞中。
如本文所述，使用本文所揭示之經RNA引導之DNA核酸酶及引導RNA可引起DSB、SSB及/或位點特異性結合，其導致DNA或前mRNA中之核酸修飾，在藉由細胞機制修復時，該核酸修飾可產生呈插入/缺失(insertion/deletion、indel)突變形式之誤差。歸因於插入/缺失之多種突變改變閱讀框架、引入過早終止密碼子或誘導外顯子跳躍，且因此產生非功能性蛋白質。
在一些實施例中，基於活體外模型來測定特定引導RNA的功效。在一些實施例中，活體外模型為T細胞株。在一些實施例中，活體外模型為HEK293 T細胞。在一些實施例中，活體外模型為穩定地表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，活體外模型為類淋巴母細胞細胞株。在一些實施例中，活體外模型為原代人類T細胞。在一些實施例中，活體外模型為原代人類B細胞。在一些實施例中，活體外模型為原代人類周邊血液淋巴球。在一些實施例中，活體外模型為原代人類周邊血液單核細胞。
在一些實施例中，活體外模型中發生缺失或插入之脫靶位點數目例如藉由分析來自經Cas9 mRNA及引導RNA活體外轉染之細胞之基因體DNA來測定。在一些實施例中，此類測定包含分析來自經Cas9 mRNA、引導RNA及供體寡核苷酸活體外轉染之細胞之基因體DNA。用於此類測定之例示性程序提供於以下工作實例中。
在一些實施例中，在用於引導RNA選擇過程之多個活體外細胞模型上測定特定gRNA之功效。在一些實施例中，與所選引導RNA針對細胞株的資料進行比較。在一些實施例中，使用多個細胞模型進行交叉篩選。
在一些實施例中，基於活體內模型來測定特定引導RNA的功效。在一些實施例中，活體內模型為嚙齒動物模型。在一些實施例中，嚙齒動物模型為表現目標基因之小鼠。在一些實施例中，嚙齒動物模型為表現
CIITA基因之小鼠。在一些實施例中，嚙齒動物模型為表現人類
CIITA基因之小鼠。在一些實施例中，嚙齒動物模型為表現
B2M基因之小鼠。在一些實施例中，嚙齒動物模型為表現人類
B2M基因之小鼠。在一些實施例中，活體內模型為非人類靈長類動物，例如食蟹獼猴。
在一些實施例中，藉由中靶裂解效率評估引導RNA之功效。在一些實施例中，藉由目標位置，例如CIITA或B2M處之編輯百分比量測引導RNA之功效。在一些實施例中，深度定序可用於鑑別藉由基因編輯引入之修飾(例如插入、缺失)的存在。插入/缺失百分比可根據次世代定序「NGS」計算。
在一些實施例中，藉由目標細胞類型之基因體內之脫靶序列處之插入/缺失的數目及/或頻率來量測引導RNA之功效。在一些實施例中，提供有效引導RNA，其在細胞群體中及/或相對於目標位點處之插入/缺失產生頻率在脫靶位點以極低頻率(例如＜5%)產生插入/缺失。因此，本發明提供引導RNA，其並不展現目標細胞類型(例如T細胞或B細胞)中之脫靶插入/缺失形成，或其在細胞群體中及/或相對於目標位點處之插入/缺失產生頻率產生＜5%之脫靶插入/缺失形成頻率。在一些實施例中，本發明提供並不展現目標細胞類型(例如T細胞或B細胞)中之任何脫靶插入/缺失形成之引導RNA。在一些實施例中，例如如藉由一或多種本文所述方法所評估，提供在少於5個脫靶位點產生插入/缺失之引導RNA。在一些實施例中，例如如藉由一或多種本文所述方法所評估，提供在少於或等於4、3、2或1個脫靶位點產生插入/缺失之引導RNA。在一些實施例中，脫靶位點不出現在目標細胞(例如T細胞或B細胞)基因體中之蛋白質編碼區中。
在一些實施例中，線性擴增用於偵檢基因編輯事件，諸如目標DNA中插入/缺失(「插入缺失」)突變、易位及同源定向修復(HDR)事件的形成。舉例而言，可使用具有獨特序列標記之引物的線性擴增且分離標記之擴增產物(稱為「UnIT」，或「獨特識別符標籤化」方法)。
在一些實施例中，藉由目標細胞類型內之染色體重排之數目來量測引導RNA之功效。Kromatid dGH分析可用於偵測染色體重排，包括例如易位、相互易位、易位至脫靶染色體、缺失(亦即，由於編輯事件而在細胞複製週期中丟失片段之染色體重排)。在一些實施例中，目標細胞類型具有小於10、小於8、小於5、小於4、小於3、小於2或小於1個染色體重排。在一些實施例中，目標細胞類型不具有染色體重排。
E. gRNA組合物之遞送
脂質奈米粒子(LNP)為用於遞送核苷酸及蛋白質承載物之熟知手段，且可用於遞送本文所揭示之引導RNA、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP遞送核酸、蛋白質、或核酸連同蛋白質。
在一些實施例中，本發明包含向個體遞送本文所揭示之gRNA中之任一者之方法，其中gRNA調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含一種包含所揭示之任一種gRNA及LNP的組合物。在一些實施例中，組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，LNP包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包含十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯(亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)或另一可離子化脂質。參見例如WO/2017/173054及其中所描述之參考文獻之脂質。在一些實施例中，LNP包含莫耳比為約4.5、5.0、5.5、6.0或6.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)。在一些實施例中，在LNP脂質之情形下，術語陽離子型及可離子化可互換，例如其中可離子化脂質取決於pH而為陽離子型的。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA調配為LNP以用於製備供治療疾病或病症用之藥劑。
電穿孔為遞送承載物之熟知方式，且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA。在一些實施例中，電穿孔可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含向離體細胞遞送本文所揭示之gRNA中之任一者之方法，其中gRNA調配為LNP或不調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，單獨或在一或多個載體上經編碼之本文所述之引導RNA組合物係在脂質奈米粒子中調配或經由脂質奈米粒子投與；參見例如WO/2017/173054及WO 2019/067992，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明包含DNA或RNA載體，其編碼包含本文所述之引導序列中之任何一或多者的引導RNA中之任一者。在一些實施例中，除引導RNA序列之外，載體進一步包含不編碼引導RNA之核酸。不編碼引導RNA之核酸包括但不限於啟動子、增強子、調節序列及編碼經RNA引導之DNA核酸酶(其可為諸如Cas9之核酸酶)之核酸。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼sgRNA之核苷酸序列及編碼經RNA引導之DNA核酸酶(其可為Cas核酸酶，諸如Cas9或Cpf1)之mRNA。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA之核苷酸序列及編碼經RNA引導之DNA核酸酶(其可為Cas蛋白，諸如Cas9)之mRNA。在一個實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(亦即，Spy Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含或由以下組成：側接來自天然產生之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分的引導序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA組成之核酸可進一步構成載體序列，其中該載體序列包含或由以下組成：不會與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起經天然發現的核酸。
IV. 治療方法及用途
本文所述之任一工程化細胞及組合物可用於治療如本文所述之多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，經基因修飾之細胞(工程化細胞)及/或經基因修飾之細胞(工程化細胞)群體及組合物可用於治療多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，涵蓋治療本文所述之任一疾病或病症之方法，其包含投與本文所述之任何一或多種組合物。
在一些實施例中，本文所述之方法及組合物可用於治療需要遞送治療劑之疾病或病症。在一些實施例中，本發明提供一種在個體中提供免疫療法之方法，該方法包括向個體投與有效量之如本文所述之工程化細胞(或工程化細胞群體)，例如任何前述細胞態樣及實施例之細胞。
在一些實施例中，方法包含向個體投與組合物，該組合物包含在本文中描述為授受細胞轉移療法之工程化細胞。在一些實施例中，工程化細胞為同種異體細胞。
在一些實施例中，方法包含向個體投與包含本文所述之工程化細胞的組合物，其中該細胞產生、分泌及/或表現適用於治療個體之疾病或病症的多肽(例如靶向受體)。在一些實施例中，細胞充當細胞工廠以產生可溶性多肽。在一些實施例中，細胞充當細胞工廠以產生抗體。在一些實施例中，細胞在活體內連續分泌多肽。在一些實施例中，細胞在活體內移植之後持續分泌多肽，持續至少1、2、3、4、5或6週。在一些實施例中，細胞在活體內移植之後持續分泌多肽，持續超過6週。在一些實施例中，可溶性多肽(例如抗體)由細胞以每天至少10
2、10
3、10
4、10
5、10
6、10
7或10
8個複本之濃度產生。在一些實施例中，多肽為抗體且由細胞以每天至少10
8個複本之濃度產生。
在該等方法之一些實施例中，方法包括在向個體投與有效量之如本文所述之工程化細胞(engineered cell/engineered cells)，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞之前，投與淋巴球耗竭劑或免疫抑制劑。在另一態樣中，本發明提供一種製備工程化細胞(例如工程化細胞群體)之方法。
免疫療法為藉由活化或抑止免疫系統進行之疾病治療。經設計以引發或擴增免疫反應之免疫療法歸類為活化免疫療法。已表明基於細胞之免疫療法對於治療一些癌症有效。免疫效應細胞，諸如淋巴球、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺手細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、T輔助細胞、B細胞或其先驅細胞，諸如造血幹細胞(HSC)或誘導多能幹細胞(iPSC)可經程式化以響應於腫瘤細胞表面上表現之異常抗原而起作用。因此，癌症免疫療法允許免疫系統之組分破壞腫瘤或其他癌細胞。亦已證明基於細胞之免疫療法有效地治療自體免疫疾病或移植排斥反應。免疫效應細胞，諸如調節T細胞(Treg)或間葉幹細胞可經程式化以響應於正常組織表面上所表現之自體抗原或移植抗原而起作用。
在一些實施例中，本發明提供一種製備工程化細胞(例如工程化細胞群體)之方法。工程化細胞群體可用於免疫療法。
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體的方法，其包括投與藉由製備本文所述之細胞的方法，例如前述細胞製備方法之態樣及實施例中之任一者之方法製備的工程化細胞。
在一些實施例中，工程化細胞可用於治療癌症、感染性疾病、發炎性疾病、自體免疫疾病、心血管疾病、神經疾病、眼科疾病、腎病、肝病、肌肉骨胳疾病、紅血球疾病或移植排斥反應。在一些實施例中，工程化細胞可用於細胞移植，例如移植至心臟、肝臟、肺、腎臟、胰臟、皮膚或大腦。(參見例如Deuse等人, Nature Biotechnology 37:252-258 (2019))。
在一些實施例中，工程化細胞可用作包含同種異體幹細胞療法之細胞療法。在一些實施例中，細胞療法包含誘導多能幹細胞(iPSC)。iPSC可經誘導以分化為其他細胞類型，包括例如β胰島細胞、神經元及血細胞。在一些實施例中，細胞療法包含造血幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包含可發育為骨、軟骨、肌肉及脂肪細胞之間葉幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包含眼幹細胞。在一些實施例中，同種異體幹細胞移植包含同種異體骨髓移植。在一些實施例中，幹細胞包含多能幹細胞(PSC)。在一些實施例中，幹細胞包含誘導胚胎幹細胞(ESC)。
本文所揭示之工程化細胞適合於例如藉由引入進一步編輯或修飾之基因或對偶基因而進行進一步工程化。在一些實施例中，多肽為野生型或變異型TCR。本發明之細胞亦可適合於藉由引入編碼例如靶向受體(例如TCR、CAR、UniCAR)之外源核酸而進行進一步工程化。CAR亦稱為嵌合免疫受體、嵌合T細胞受體或人工T細胞受體。
在一些實施例中，細胞療法為轉殖基因T細胞療法。在一些實施例中，細胞療法包含靶向轉殖基因T細胞之威爾姆斯氏腫瘤1 (WT1)。在一些實施例中，細胞療法包含市售T細胞療法，諸如CAR T細胞療法之靶向受體或編碼靶向受體之供體核酸。當前存在許多批准用於細胞療法之靶向受體。本文所提供之細胞及方法可與此等已知構築體一起使用。包括用作細胞療法之靶向受體構築體的商業批准細胞產品包括例如Kymriah® (替沙津魯(tisagenlecleucel))；Yescarta® (阿基侖賽(axicabtagene ciloleucel))；Tecartus™ (布萊奧妥(brexucabtagene autoleucel))；肽貝魯塞(Tabelecleucel) (Tab-cel®)；Viralym-M (ALVR105)；及Viralym-C。
在一些實施例中，方法提供向個體投與工程化細胞，其中該投與為注射。在一些實施例中，方法提供向個體投與工程化細胞，其中該投與為血管內注射或輸注。在一些實施例中，方法提供向個體投與工程化細胞，其中該投與為單次劑量。
在一些實施例中，方法提供減輕與用本文所揭示之組合物治療之個體疾病相關的徵象或症狀。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過一週的反應。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過兩週的反應。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過三週的反應。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過一個月的反應。
在一些實施例中，方法提供向個體投與工程化細胞，且其中該個體對所投與細胞具有反應，包含與藉由細胞療法治療之疾病相關的徵象或症狀減輕。在一些實施例中，個體具有持續超過一週的反應。在一些實施例中，個體具有持續超過一個月的反應。在一些實施例中，個體具有持續至少1-6週的反應。
實例
提供以下實例以說明某些所揭示實施例且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。
實例1. 一般方法 1.1. 次世代定序(「NGS」)及中靶裂解效率分析
使用QuickExtract™ DNA提取溶液(Lucigen，目錄號QE09050)根據製造商之方案提取基因體DNA。
為了定量地測定基因體中之目標位置處之編輯效率，使用深度定序來鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。圍繞所關注基因(例如CIITA)內之目標位點設計PCR引子，且擴增所關注基因體區域。按本領域中之標準進行引子序列設計。
根據製造商之方案(Illumina)進行額外PCR以添加用於定序之化學物質。擴增子在Illumina MiSeq儀器上定序。在排除品質分數低之讀段之後，將讀段與人類參考基因體(例如hg38)比對。將與所關注目標區域重疊之讀段重新與局部基因體序列比對以改良該比對。接著計算野生型讀段之數目相對於含有C至T突變、C至A/G突變或插入/缺失之讀段之數目。在以所預測之Cas9裂解位點為中心的20 bp區域中對插入及缺失進行評分。插入/缺失百分比定義為在20 bp評分區域內插入或缺失一或多個鹼基之定序讀段之總數目除以定序讀段(包括野生型)之總數目。在包括20 bp sgRNA目標序列上游10 bp及下游10 bp之40 bp區域中對C至T突變或C至A/G突變進行評分。C至T編輯百分比定義為在40 bp區內具有一或多個C至T突變之定序讀段之總數目除以定序讀段(包括野生型)之總數目。類似地計算C至A/G突變之百分比。
1.2. T細胞培養基製備。
下文使用之T細胞培養基組合物描述於此處及
表 3中。「X-VIVO基礎培養基」由X-VIVO™ 15培養基、1% Penstrep、50 µM β-巰基乙醇、10 mM NAC組成。除上文所提及之組分以外，使用之其他可變培養基組分為：1.血清(胎牛血清(FBS))；及2.細胞介素(IL-2、IL-7、IL-15)，亦描述於
表 3中。T細胞培養基組分描述於下
表 3中。
表 3. T 細胞培養基。
1.3. 製備脂質奈米粒子。
| 基礎培養基 | 血清 | 細胞介素 | 培養基編號 |
| XVIVO™ 15 (Lonza，BE02-060Q) 1% Pen-Strep 50 µMβ-巰基乙醇 10 mM N-乙醯基L-胱胺酸(NAC) | 5%人類血清AB (Gemini Bio Products，100-512) | 5 ng/mL rh-IL2 5 ng/mL rh-IL7 200 U/mL rh IL-15 | 1 |
| 5 ng/mL rh-IL2 200 U/mL rh IL-15 | 2 | ||
| RPMI (Corning) 2 mM L-麩醯胺酸 1% Pen-Strep 100 µM非必需胺基酸 1mM丙酮酸鈉 10 mM HEPES 55 µM β-巰基乙醇 | 10%胎牛血清 | 5 ng/mL rh-IL2 | 11 |
| RPMI 1640 (Corning) 1X Glutamax 1% Pen-Strep, 100 uM非必需胺基酸 1 mM丙酮酸鈉 10 mM HEPES緩衝液 55 uM β-巰基乙醇 | 10%胎牛血清 | 無細胞介素 | 18 |
| 100 U/mL rhIL-2 2.5ng/mL rIL-7 2.5ng/mL rIL-15 | 19 | ||
| RPMI 1640 (Corning) 22mM Glutamax 1%Pen-Strep, 100 uM非必需胺基酸 1mM丙酮酸鈉 10 mM HEPES緩衝液 22 uM β-巰基乙醇 | 10%胎牛血清 | 100U/mL rhIL-2 | 20 |
以各種莫耳比將脂質組分溶解於100%乙醇中。將RNA承載物(例如Cas9 mRNA及gRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中，產生大致0.45 mg/mL之RNA承載物濃度。
脂質核酸組裝體含有莫耳比分別為50:38:9:3之可離子化脂質A (十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。脂質核酸組裝體用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:1之gRNA與mRNA之比調配。
使用交叉流技術，利用含脂質之乙醇與兩個體積之RNA溶液及一個體積之水的衝擊射流混合來製備脂質奈米粒子(LNP)。經由混合交叉使含脂質之乙醇與兩個體積之RNA溶液混合。經由線內T形件將第四水流與十字管之輸出流混合(參見WO2016010840，圖2)。將LNP在室溫(RT)下保持1小時，且進一步用水稀釋(大約1:1 v/v)。使用切向流過濾在平板濾筒(Sartorius，100kD MWCO)上濃縮LNP，且隨後使用PD-10去鹽管柱(GE)將其緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖，pH 7.5 (TSS)中。或者，視情況使用100 kDa Amicon旋轉過濾器濃縮LNP，且使用PD-10去鹽管柱(GE)將其緩衝液交換至TSS中。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾。將最終LNP儲存於4℃或-80℃下直至進一步使用。
1.4. 核酸酶mRNA之活體外轉錄(「IVT」)
含有N1-甲基假-U之封端及聚腺苷酸化mRNA係藉由使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶之活體外轉錄產生。藉由在以下條件下與XbaI一起在37℃下培育2小時來線性化含有T7啟動子、轉錄序列及聚腺苷酸化區域之質體DNA：200 ng/µL質體、2 U/µL XbaI (NEB)及1×反應緩衝液。藉由在65℃下加熱反應物20分鐘來使XbaI不活化。由酶及緩衝鹽純化經線性化之質體。用於產生經修飾mRNA之IVT反應係藉由在37℃下在以下條件下培育1.5-4小時來進行：50 ng/µL線性化質體；各2-5 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)；10-25 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠類核糖核酸酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液。將TURBO DNA酶(ThermoFisher)添加至0.01 U/µL之最終濃度，且將反應物再培育30分鐘以移除DNA模板。根據製造商之方案使用MegaClear Transcription Clean-up套組(ThermoFisher)或RNeasy Maxi套組(Qiagen)純化mRNA。經由沈澱方案(在一些情況下，其後接著為基於HPLC之純化)來純化mRNA。簡言之，在DNA酶消化之後，使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱來純化mRNA。對於經HPLC純化之mRNA，在LiCl沈澱及復原之後，藉由RP-IP HPLC純化mRNA (參見例如Kariko等人, Nucleic Acids Research, 2011, 第39卷, 第21期 e142)。合併選用於彙集之級分且如上文所述藉由乙酸鈉/乙醇沈澱來脫鹽。在另一替代方法中，mRNA用LiCl沈澱法純化，隨後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測260 nm處之吸光度(Nanodrop)測定RNA濃度，且藉由毛細電泳法用Bioanlayzer (Agilent)來分析轉錄物。
根據SEQ ID No: 801-803 (參見
表 19中之序列)，自編碼開放閱讀框架之質體DNA產生釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。根據SEQ ID No: 804-805，自編碼開放閱讀框架之質體DNA產生BC22n mRNA。根據SEQ ID No: 806，自編碼開放閱讀框架之質體DNA產生BC22 mRNA。根據SEQ ID No: 807-808，自編碼開放閱讀框架之質體DNA產生UGI mRNA。當針對RNA在下文提及SEQ ID NO: 801-808時，應理解，T應替換為U (其為如上文所述之N1-甲基假尿苷)。實例中所用之信使RNA包括5'帽及3'聚腺苷酸化區域，例如至多100 nt，且在下
表 19中藉由SEQ ID NO: 801-808鑑別。
實例2. CIITA引導RNA之篩選。
藉由評估II類MHC細胞表面表現之損失，篩選CIITA引導RNA在T細胞中之功效。在藉由RNP電穿孔進行CIITA編輯之後分析對II類MHC蛋白呈陰性之T細胞的百分比(「MHC II陰性%」)。
2.1. T細胞之RNP電穿孔。
使用Cas9核糖核蛋白(RNP)電穿孔評估Cas9編輯活性。在解凍之後，泛CD3+ T細胞(StemCell，HLA-A*02.01/ A*03.01)以0.5×10
6個細胞/毫升之密度平盤培養於由以下各者構成之T細胞RPMI培養基中：RPMI 1640 (Invitrogen，目錄號22400-089)，含有5% (v/v)胎牛血清、1× Gluatmax (Gibco，目錄號35050-061)、50 µM 2-巰基乙醇、100 µM非必需胺基酸(Invitrogen，目錄號11140-050)、1 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES緩衝液、1%之青黴素-鏈黴素及100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)。T細胞用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化。細胞在RNP轉染之前在T細胞RPMI培養基中擴增72小時。
將CIITA靶向sgRNA自其儲存盤取出，且在95℃下變性2分鐘，隨後在室溫下冷卻10分鐘。製備20 μM sgRNA及10 μM重組Cas9-NLS蛋白(SEQ ID NO: 800)之RNP混合物且在25℃下培育10分鐘。5 µL RNP混合物與100,000個細胞在20 µL P3電穿孔緩衝液(Lonza)中組合。將22 µL RNP/細胞混合物轉移至Lonza shuttle 96孔電穿孔盤之相應孔中。用製造商之脈衝碼對細胞一式兩份地電穿孔。電穿孔後立即將T細胞RPMI培養基添加至細胞中。隨後如實例1中所描述在編輯後2天培養且收集電經穿孔之T細胞用於NGS定序。
2.2. 流動式細胞測量術。
編輯後第10天，T細胞藉由流動式細胞測量術進行表型分型以測定II類MHC蛋白表現。簡言之，將T細胞在靶向HLA-DR、DQ、DP-PE之抗體(BioLegend®目錄號361704)及同型對照-AF647 (BioLegend®目錄號400234)的混合物中培育。隨後洗滌細胞，在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo套裝軟體進行分析。基於大小、形狀、活力及II類MHC表現圈選T細胞。如實例1中所述，對DNA樣品進行PCR及後續NGS分析。
2.3. CIITA引導RNA篩選之結果。
表 4A顯示對II類MHC細胞表面表現呈陰性之T細胞的平均百分比。對照1及對照2分別靶向B2M及TRAC以用於I類MHC之比較性表現。對於各引導物，示出具有spCas9之切割位點的基因體座標，以及受體剪接位點邊界核苷酸或供體剪接位點邊界核苷酸與切割位點之間的距離(核苷酸數) (在
表 4A中稱為與切割位點之距離)。無圓括號之數值展示在剪接位點邊界核苷酸與切割位點之間的5'方向上之核苷酸之數目，而圓括號中之數值展示在剪接位點邊界核苷酸與切割位點之間的3'方向上之核苷酸之數目。
表 4B展示NGS分析之結果。
表 4A ： CIITA 引導 RNA 篩選。
表4B- CIITA NGS分析。
實例3. 使用BC22篩選CIITA引導RNA
| 引導物 | SEQ ID NO | 平均II 類MHC 陰性% | SD | 目標序列 | 切割位點 | 與切割位點之距離(bp) | 基因體位置 | 基因體座標 |
| G018021 | 1 | 35.20 | 3.11 | UCCUACCUGUCAGAGCCCCA | 10,877,378 | 4 | 外顯子1終點 | chr16:10877360-10877380 |
| G018022 | 2 | 26.50 | 2.97 | GAGCCCCAAGGUAAAAAGGC | 10,877,390 | (8) | 外顯子1終點 | chr16:10877372-10877392 |
| G018023 | 3 | 27.15 | 5.16 | AGCCCCAAGGUAAAAAGGCC | 10,877,391 | (9) | 外顯子1終點 | chr16:10877373-10877393 |
| G018024 | 4 | 30.40 | 2.55 | UUUCCCGGCCUUUUUACCUU | 10,877,382 | - | 外顯子1終點 | chr16:10877379-10877399 |
| G018025 | 5 | 30.40 | 1.84 | CUUUCCCGGCCUUUUUACCU | 10,877,383 | (1) | 外顯子1終點 | chr16:10877380-10877400 |
| G018026 | 6 | 39.50 | 5.09 | ACACUGUGAGCUGCCUGGGA | 10,895,278 | 4 | 外顯子2起點 | chr16:10895275-10895295 |
| G018027 | 7 | 38.70 | 0.28 | CACACUGUGAGCUGCCUGGG | 10,895,279 | 3 | 外顯子2起點 | chr16:10895276-10895296 |
| G018028 | 8 | 40.45 | 2.48 | GUGGCACACUGUGAGCUGCC | 10,895,283 | (1) | 外顯子2起點 | chr16:10895280-10895300 |
| G018029 | 9 | 36.70 | 2.83 | GAGAUUGAGCUCUACUCAGG | 10,895,427 | 1 | 外顯子2終點 | chr16:10895409-10895429 |
| G018030 | 10 | 67.35 | 4.60 | AGAUUGAGCUCUACUCAGGU | 10,895,428 | - | 外顯子2終點 | chr16:10895410-10895430 |
| G018031 | 11 | 26.85 | 5.45 | CAGGUGGGCCCUCCUCCCUC | 10,895,443 | (15) | 外顯子2終點 | chr16:10895425-10895445 |
| G018032 | 12 | 12.30 | 2.26 | CGGAAGAGACCAGAGGGAGG | 10,895,440 | (12) | 外顯子2終點 | chr16:10895437-10895457 |
| G018033 | 13 | 31.45 | 2.33 | UACCGGAAGAGACCAGAGGG | 10,895,443 | (15) | 外顯子2終點 | chr16:10895440-10895460 |
| G018034 | 14 | 85.75 | 4.74 | AGGGAGGCUUAUGCCAAUAU | 10,895,760 | 4 | 外顯子3終點 | chr16:10895742-10895762 |
| G018035 | 15 | 80.00 | 2.97 | GGCUUAUGCCAAUAUCGGUG | 10,895,765 | (1) | 外顯子3終點 | chr16:10895747-10895767 |
| G018036 | 16 | 40.75 | 8.56 | UGACUGCGCUUUUCCUUGUC | 10,898,660 | 10 | 外顯子4起點 | chr16:10898642-10898662 |
| G018037 | 17 | 46.15 | 0.50 | GACUGCGCUUUUCCUUGUCU | 10,898,661 | 9 | 外顯子4起點 | chr16:10898643-10898663 |
| G018038 | 18 | 62.95 | 7.00 | GCUUUUCCUUGUCUGGGCAG | 10,898,667 | 3 | 外顯子4起點 | chr16:10898649-10898669 |
| G018039 | 19 | 43.85 | 3.04 | CCAGUUCCGCUGCCCAGACA | 10,898,661 | 9 | 外顯子4起點 | chr16:10898658-10898678 |
| G018040 | 20 | 29.65 | 3.47 | GACCUGAAGCACUGGAAGCC | 10,901,554 | 4 | 外顯子6終點 | chr16:10901536-10901556 |
| G018041 | 21 | 31.00 | 2.83 | GCACUGGAAGCCAGGUGUGC | 10,901,562 | (4) | 外顯子6終點 | chr16:10901544-10901564 |
| G018042 | 22 | 41.40 | 2.83 | CACUGGAAGCCAGGUGUGCA | 10,901,563 | (5) | 外顯子6終點 | chr16:10901545-10901565 |
| G018043 | 23 | 30.30 | 0.71 | GGAAGCCAGGUGUGCAGGGC | 10,901,567 | (9) | 外顯子6終點 | chr16:10901549-10901569 |
| G018044 | 24 | 25.90 | 0.28 | AGCCAGGUGUGCAGGGCAGG | 10,901,570 | (12) | 外顯子6終點 | chr16:10901552-10901572 |
| G018045 | 25 | 37.30 | 3.39 | GCCCACCUGCCCUGCACACC | 10,901,560 | (2) | 外顯子6終點 | chr16:10901557-10901577 |
| G018046 | 26 | 44.30 | 8.77 | GGGCUCAGCUGUGAGGAAGU | 10,902,028 | 10 | 外顯子7起點 | chr16:10902025-10902045 |
| G018047 | 27 | 42.15 | 5.73 | GGGGCUCAGCUGUGAGGAAG | 10,902,029 | 9 | 外顯子7起點 | chr16:10902026-10902046 |
| G018048 | 28 | 37.15 | 6.58 | GACCAGAUUCCCAGUAUGUU | 10,902,189 | (5) | 外顯子7終點 | chr16:10902171-10902191 |
| G018049 | 29 | 34.30 | 5.66 | CCAGAUUCCCAGUAUGUUAG | 10,902,191 | (7) | 外顯子7終點 | chr16:10902173-10902193 |
| G018050 | 30 | 31.90 | 8.63 | CAGAUUCCCAGUAUGUUAGG | 10,902,192 | (8) | 外顯子7終點 | chr16:10902174-10902194 |
| G018051 | 31 | 30.50 | 5.66 | UCCCAGUAUGUUAGGGGGCU | 10,902,197 | (13) | 外顯子7終點 | chr16:10902179-10902199 |
| G018052 | 32 | 38.25 | 3.75 | UCCAAGCCCCCUAACAUACU | 10,902,186 | (2) | 外顯子7終點 | chr16:10902183-10902203 |
| G018053 | 33 | 34.20 | 6.08 | CUCCAAGCCCCCUAACAUAC | 10,902,187 | (3) | 外顯子7終點 | chr16:10902184-10902204 |
| G018054 | 34 | 37.20 | 3.82 | AAAGGCACUGCAAGAGACAA | 10,902,647 | 11 | 外顯子8起點 | chr16:10902644-10902664 |
| G018055 | 35 | 54.80 | 4.24 | UCCAGUAUAUUCAUCUACCA | 10,902,797 | 4 | 外顯子8終點 | chr16:10902779-10902799 |
| G018056 | 36 | 35.30 | 3.11 | UUCAUCUACCAUGGUGAGUG | 10,902,806 | (5) | 外顯子8終點 | chr16:10902788-10902808 |
| G018057 | 37 | 35.35 | 4.17 | UCAUCUACCAUGGUGAGUGC | 10,902,807 | (6) | 外顯子8終點 | chr16:10902789-10902809 |
| G018058 | 38 | 29.30 | 4.38 | CAUCUACCAUGGUGAGUGCG | 10,902,808 | (7) | 外顯子8終點 | chr16:10902790-10902810 |
| G018059 | 39 | 24.75 | 1.06 | ACCAUGGUGAGUGCGGGGCC | 10,902,813 | (12) | 外顯子8終點 | chr16:10902795-10902815 |
| G018060 | 40 | 34.75 | 5.02 | GCCAGGCCCCGCACUCACCA | 10,902,802 | (1) | 外顯子8終點 | chr16:10902799-10902819 |
| G018061 | 41 | 33.95 | 0.64 | CCACUCUCCACCCCCAAUGU | 10,903,726 | 5 | 外顯子9起點 | chr16:10903708-10903728 |
| G018062 | 42 | 60.40 | 3.54 | CUCCACCCCCAAUGUAGGUG | 10,903,731 | - | 外顯子9起點 | chr16:10903713-10903733 |
| G018063 | 43 | 33.05 | 8.56 | CACCUCACCUACAUUGGGGG | 10,903,721 | 10 | 外顯子9起點 | chr16:10903718-10903738 |
| G018064 | 44 | 35.55 | 7.00 | GGGCACCUCACCUACAUUGG | 10,903,724 | 7 | 外顯子9起點 | chr16:10903721-10903741 |
| G018065 | 45 | 46.45 | 2.19 | UGGGGCACCUCACCUACAUU | 10,903,726 | 5 | 外顯子9起點 | chr16:10903723-10903743 |
| G018066 | 46 | 50.95 | 2.19 | CUGGGGCACCUCACCUACAU | 10,903,727 | 4 | 外顯子9起點 | chr16:10903724-10903744 |
| G018067 | 47 | 40.75 | 2.19 | ACCUCCCGAGCAAACAUGAC | 10,903,891 | 4 | 外顯子9終點 | chr16:10903873-10903893 |
| G018068 | 48 | 33.90 | 2.83 | CCGAGCAAACAUGACAGGUA | 10,903,896 | (1) | 外顯子9終點 | chr16:10903878-10903898 |
| G018069 | 49 | 29.25 | 1.91 | GUACCUCUCACAGGCCCUAA | 10,903,908 | (13) | 外顯子9終點 | chr16:10903905-10903925 |
| G018070 | 50 | 20.85 | 1.48 | AGUACCUCUCACAGGCCCUA | 10,903,909 | (14) | 外顯子9終點 | chr16:10903906-10903926 |
| G018071 | 51 | 24.30 | 6.08 | GACGUCUUGUGCUCUGGAGA | 10,904,739 | 5 | 外顯子10起點 | chr16:10904736-10904756 |
| G018072 | 52 | 33.90 | 5.37 | AACAAGCUUCCAAAAUGGCC | 10,904,808 | 4 | 外顯子10終點 | chr16:10904790-10904810 |
| G018073 | 53 | 23.45 | 2.62 | GAGAUCCCGCAUCACUCACC | 10,904,814 | (2) | 外顯子10終點 | chr16:10904811-10904831 |
| G018074 | 54 | 68.40 | 1.56 | GCCCCUGGCCUUUGCAGAGC | 10,906,499 | - | 外顯子11起點 | chr16:10906481-10906501 |
| G018075 | 55 | 54.70 | 3.54 | ACCGGCUCUGCAAAGGCCAG | 10,906,488 | 11 | 外顯子11起點 | chr16:10906485-10906505 |
| G018076 | 56 | 51.45 | 6.29 | CACCGGCUCUGCAAAGGCCA | 10,906,489 | 10 | 外顯子11起點 | chr16:10906486-10906506 |
| G018077 | 57 | 55.90 | 0.14 | CCACCGGCUCUGCAAAGGCC | 10,906,490 | 9 | 外顯子11起點 | chr16:10906487-10906507 |
| G018078 | 58 | 83.65 | 3.04 | CUGCUCCACCGGCUCUGCAA | 10,906,495 | 4 | 外顯子11起點 | chr16:10906492-10906512 |
| G018079 | 59 | 19.25 | 2.62 | UCAGCUGUGUCACCCGUUUC | 10,908,145 | 4 | 外顯子11終點 | chr16:10908127-10908147 |
| G018080 | 60 | 63.90 | 4.53 | GCUGUGUCACCCGUUUCAGG | 10,908,148 | 1 | 外顯子11終點 | chr16:10908130-10908150 |
| G018081 | 61 | 91.10 | 0.42 | CUGUGUCACCCGUUUCAGGU | 10,908,149 | - | 外顯子11終點 | chr16:10908131-10908151 |
| G018082 | 62 | 93.60 | 2.26 | UGUGUCACCCGUUUCAGGUG | 10,908,150 | (1) | 外顯子11終點 | chr16:10908132-10908152 |
| G018083 | 63 | 21.50 | 2.97 | CACCCGUUUCAGGUGGGGUG | 10,908,155 | (6) | 外顯子11終點 | chr16:10908137-10908157 |
| G018084 | 64 | 44.00 | 3.39 | ACCCGUUUCAGGUGGGGUGA | 10,908,156 | (7) | 外顯子11終點 | chr16:10908138-10908158 |
| G018085 | 65 | 32.95 | 0.92 | CCCGUUUCAGGUGGGGUGAG | 10,908,157 | (8) | 外顯子11終點 | chr16:10908139-10908159 |
| G018086 | 66 | 83.30 | 4.38 | GUCUGAGGCCCUCCCUCCAC | 10,909,024 | 5 | 外顯子12起點 | chr16:10909006-10909026 |
| G018087 | 67 | 67.95 | 2.76 | UCUGAGGCCCUCCCUCCACA | 10,909,025 | 4 | 外顯子12起點 | chr16:10909007-10909027 |
| G018088 | 68 | 61.70 | 0.14 | CAAGGCAGCCCUGUGGAGGG | 10,909,021 | 8 | 外顯子12起點 | chr16:10909018-10909038 |
| G018089 | 69 | 26.10 | 0.28 | GCUCAAGGCAGCCCUGUGGA | 10,909,024 | 5 | 外顯子12起點 | chr16:10909021-10909041 |
| G018090 | 70 | 86.75 | 0.07 | CGCUCAAGGCAGCCCUGUGG | 10,909,025 | 4 | 外顯子12起點 | chr16:10909022-10909042 |
| G018091 | 71 | 84.20 | 1.56 | UGUGCAGACUCAGAGGUGAG | 10,909,190 | (3) | 外顯子12終點 | chr16:10909172-10909192 |
| G018092 | 72 | 39.65 | 8.98 | UAACAUUGCCUGUUCUCUCC | 10,910,183 | 5 | 外顯子13起點 | chr16:10910165-10910185 |
| G018093 | 73 | 29.55 | 5.59 | CUUCUCGUCCUGGAGAGAAC | 10,910,179 | 9 | 外顯子13起點 | chr16:10910176-10910196 |
| G018094 | 74 | 70.65 | 11.24 | UUCCGAGGAACUUCUCGUCC | 10,910,189 | (1) | 外顯子13起點 | chr16:10910186-10910206 |
| G018095 | 75 | 41.25 | 0.50 | ACCCUUGCUCUUUGCCUCCU | 10,915,565 | 5 | 外顯子14起點 | chr16:10915547-10915567 |
| G018096 | 76 | 24.35 | 4.03 | UUGCUCUUUGCCUCCUAGGC | 10,915,569 | 1 | 外顯子14起點 | chr16:10915551-10915571 |
| G018097 | 77 | 55.05 | 8.98 | UGCUCUUUGCCUCCUAGGCU | 10,915,570 | - | 外顯子14起點 | chr16:10915552-10915572 |
| G018098 | 78 | 33.60 | 2.55 | CCUGAGACAGGGCCCAGCCU | 10,915,570 | - | 外顯子14起點 | chr16:10915567-10915587 |
| G018099 | 79 | 72.60 | 1.41 | AUCUGAUUCCACCUGCAGCC | 10,916,366 | 1 | 外顯子15起點 | chr16:10916348-10916368 |
| G018100 | 80 | 62.90 | 5.37 | CAGCGCAUCCAGGCUGCAGG | 10,916,362 | 5 | 外顯子15起點 | chr16:10916359-10916379 |
| G018101 | 81 | 85.70 | 4.38 | ACUCAGCGCAUCCAGGCUGC | 10,916,365 | 2 | 外顯子15起點 | chr16:10916362-10916382 |
| G018102 | 82 | 55.75 | 5.59 | AAACCCUCAAGUGAGUGAGC | 10,916,467 | (8) | 外顯子15終點 | chr16:10916449-10916469 |
| G018103 | 83 | 28.00 | 0.57 | AACCCUCAAGUGAGUGAGCU | 10,916,468 | (9) | 外顯子15終點 | chr16:10916450-10916470 |
| G018104 | 84 | 85.30 | 8.34 | GGCCCAGCUCACUCACUUGA | 10,916,458 | 1 | 外顯子15終點 | chr16:10916455-10916475 |
| G018105 | 85 | 89.90 | 1.70 | AGGCCCAGCUCACUCACUUG | 10,916,459 | - | 外顯子15終點 | chr16:10916456-10916476 |
| G018106 | 86 | 30.25 | 2.05 | CAGACUGCGGGGACACAGUG | 10,918,426 | 14 | 外顯子16起點 | chr16:10918423-10918443 |
| G018107 | 87 | 89.90 | 0.28 | CUGCAUCCCUGCUCAGGCUA | 10,918,522 | 4 | 外顯子16終點 | chr16:10918504-10918524 |
| G018108 | 88 | 86.10 | 6.22 | CCUGCUCAGGCUAAGGUGAG | 10,918,529 | (3) | 外顯子16終點 | chr16:10918511-10918531 |
| G018109 | 89 | 86.55 | 2.19 | CUGCUCAGGCUAAGGUGAGU | 10,918,530 | (4) | 外顯子16終點 | chr16:10918512-10918532 |
| G018110 | 90 | 31.30 | 5.52 | CAGCACCUGACCGGUAUCCG | 10,918,542 | (16) | 外顯子16終點 | chr16:10918539-10918559 |
| G018111 | 91 | 26.65 | 2.76 | GUACAAGCUGUCGGAAACAG | 10,922,156 | 11 | 外顯子17起點 | chr16:10922153-10922173 |
| G018112 | 92 | 81.95 | 2.33 | GGAGACGCUGGCGUAAGUCC | 10,922,496 | (6) | 外顯子18終點 | chr16:10922478-10922498 |
| G018113 | 93 | 22.50 | 0.85 | GGCGUAAGUCCAGGCAACCC | 10,922,505 | (15) | 外顯子18終點 | chr16:10922487-10922507 |
| G018114 | 94 | 36.05 | 4.74 | CUCCACCCACCAGGGUUGCC | 10,922,502 | (12) | 外顯子18終點 | chr16:10922499-10922519 |
| G018115 | 95 | 31.40 | 4.67 | UGAGUCCCAUCCCCCCUUGC | 10,923,223 | 5 | 外顯子19起點 | chr16:10923205-10923225 |
| G018116 | 96 | 22.80 | 1.84 | CCACAUCCUGCAAGGGGGGA | 10,923,217 | 11 | 外顯子19起點 | chr16:10923214-10923234 |
| G018117 | 97 | 34.50 | 3.82 | GCGUCCACAUCCUGCAAGGG | 10,923,221 | 7 | 外顯子19起點 | chr16:10923218-10923238 |
| G018118 | 98 | 43.30 | 3.82 | GGCGUCCACAUCCUGCAAGG | 10,923,222 | 6 | 外顯子19起點 | chr16:10923219-10923239 |
| G018119 | 99 | 25.35 | 1.77 | GGGCGUCCACAUCCUGCAAG | 10,923,223 | 5 | 外顯子19起點 | chr16:10923220-10923240 |
| G018120 | 100 | 62.60 | 4.24 | UGGGCGUCCACAUCCUGCAA | 10,923,224 | 4 | 外顯子19起點 | chr16:10923221-10923241 |
| G018121 | 101 | 35.35 | 4.46 | GUGGGCGUCCACAUCCUGCA | 10,923,225 | 3 | 外顯子19起點 | chr16:10923222-10923242 |
| 無引導物 (僅細胞) | 105 | 22.95 | 1.20 | |||||
| G000529 (對照1) | 700 | 26.40 | 2.69 | GGCCACGGAGCGAGACAUCU | chr15:44711544-44711564 | |||
| G010036 (對照2) | 107 | 20.00 | 2.97 | ACACAAAUACCAGUCCAGCG | chr18:50681533-50681553 |
| 引導物 ID | Seq ID NO | 引子組 1 | 引子組 2 | ||
| 平均編輯 % | SD 編輯 % | 平均編輯 % | SD 編輯 % | ||
| G018021 | 1 | 56.80 | 14.28 | 48.55 | 7.85 |
| G018022 | 2 | 43.45 | 2.76 | 29.85 | 5.30 |
| G018023 | 3 | 68.55 | 5.44 | 32.30 | 0.85 |
| G018024 | 4 | 26.65 | 2.05 | ||
| G018025 | 5 | 57.00 | 2.55 | 31.75 | 1.06 |
| G018026 | 6 | 50.40 | 0.42 | 38.65 | 6.72 |
| G018027 | 7 | 39.00 | 14.00 | 25.40 | 0.14 |
| G018028 | 8 | 28.45 | 8.84 | 29.75 | 5.44 |
| G018029 | 9 | 9.35 | 1.20 | ||
| G018030 | 10 | 21.65 | 1.48 | ||
| G018031 | 11 | 18.65 | 3.46 | ||
| G018032 | 12 | 9.65 | 2.62 | ||
| G018033 | 13 | 35.80 | 30.40 | 1.27 | |
| G018034 | 14 | 46.05 | 23.69 | 57.05 | 2.90 |
| G018035 | 15 | 48.15 | 14.21 | 48.55 | 8.41 |
| G018036 | 16 | 46.75 | 19.02 | ||
| G018037 | 17 | 50.15 | 13.08 | ||
| G018038 | 18 | 44.40 | 21.92 | ||
| G018039 | 19 | 45.00 | 21.92 | ||
| G018040 | 20 | 7.95 | 5.16 | 5.10 | 3.54 |
| G018041 | 21 | 23.85 | 13.51 | 9.60 | 6.51 |
| G018042 | 22 | 52.10 | 18.67 | 38.75 | 13.79 |
| G018043 | 23 | 41.10 | 5.09 | 16.35 | 7.57 |
| G018044 | 24 | 72.45 | 4.74 | 19.15 | 12.80 |
| G018045 | 25 | 25.70 | 11.46 | 27.70 | 6.65 |
| G018046 | 26 | 39.50 | 24.61 | 30.65 | 13.36 |
| G018047 | 27 | 36.10 | 22.63 | 23.25 | 8.27 |
| G018048 | 28 | 32.75 | 15.34 | ||
| G018049 | 29 | 38.05 | 6.15 | ||
| G018050 | 30 | 35.95 | 0.35 | ||
| G018051 | 31 | 28.60 | 3.82 | ||
| G018052 | 32 | 40.45 | 4.03 | ||
| G018053 | 33 | 38.20 | 8.06 | ||
| G018054 | 34 | 48.30 | 12.30 | 39.40 | 5.37 |
| G018055 | 35 | 59.20 | 46.50 | 7.64 | |
| G018056 | 36 | 66.50 | 36.15 | 15.63 | |
| G018057 | 37 | 37.20 | 32.80 | 12.02 | |
| G018058 | 38 | 56.00 | 12.30 | ||
| G018059 | 39 | 6.35 | 2.47 | ||
| G018060 | 40 | 48.35 | 9.26 | ||
| G018061 | 41 | 45.15 | 20.29 | 50.65 | 6.86 |
| G018062 | 42 | 45.75 | 11.24 | 37.90 | 9.76 |
| G018063 | 43 | 40.00 | 9.76 | 34.65 | 1.20 |
| G018064 | 44 | 58.30 | 0.99 | 50.75 | 0.92 |
| G018065 | 45 | 52.95 | 7.99 | 49.75 | 0.21 |
| G018066 | 46 | 51.55 | 15.77 | 47.65 | 2.05 |
| G018067 | 47 | 63.30 | 32.40 | 13.01 | |
| G018068 | 48 | 45.75 | 7.14 | 40.75 | 1.63 |
| G018069 | 49 | 51.20 | 3.96 | 45.40 | 2.69 |
| G018070 | 50 | 37.85 | 13.79 | 49.00 | 4.95 |
| G018071 | 51 | 24.20 | 9.50 | 13.44 | |
| G018072 | 52 | 41.30 | |||
| G018073 | 53 | 31.05 | 2.19 | 43.20 | 2.40 |
| G018074 | 54 | 29.05 | 12.09 | 29.00 | 3.39 |
| G018075 | 55 | 31.30 | 30.75 | 7.85 | |
| G018076 | 56 | 34.30 | 3.54 | 32.40 | 2.97 |
| G018077 | 57 | 32.00 | 10.89 | 33.55 | 1.34 |
| G018078 | 58 | 38.05 | 7.42 | 38.30 | 9.48 |
| G018079 | 59 | 0.10 | 0.00 | 0.10 | 0.00 |
| G018080 | 60 | 25.30 | 2.12 | 29.75 | 1.34 |
| G018081 | 61 | 24.80 | 19.23 | 15.95 | 2.47 |
| G018082 | 62 | 27.05 | 20.44 | 18.55 | 7.28 |
| G018083 | 63 | 0.35 | 0.07 | ||
| G018084 | 64 | 30.30 | 17.39 | 20.35 | 1.77 |
| G018085 | 65 | 37.80 | 26.16 | 22.70 | 8.49 |
| G018086 | 66 | 36.90 | 26.02 | 39.35 | 6.01 |
| G018087 | 67 | 46.95 | 19.87 | 41.15 | 2.47 |
| G018088 | 68 | 27.50 | 0.57 | 34.40 | 0.00 |
| G018089 | 69 | 70.75 | 23.55 | 60.70 | 6.08 |
| G018090 | 70 | 49.85 | 29.63 | 35.05 | 4.17 |
| G018091 | 71 | 62.70 | 23.76 | 0.00 | |
| G018092 | 72 | 11.25 | 0.49 | ||
| G018093 | 73 | 12.15 | 4.03 | ||
| G018094 | 74 | 18.40 | 15.84 | ||
| G018095 | 75 | 6.35 | 8.98 | ||
| G018096 | 76 | 1.55 | 0.35 | ||
| G018097 | 77 | 15.60 | 1.27 | ||
| G018098 | 78 | 12.30 | 3.11 | ||
| G018099 | 79 | 36.60 | 8.34 | ||
| G018100 | 80 | ||||
| G018101 | 81 | 0.00 | 0.00 | ||
| G018102 | 82 | 4.00 | 1.84 | ||
| G018103 | 83 | 6.45 | 0.78 | ||
| G018104 | 84 | 27.40 | 0.28 | ||
| G018105 | 85 | 37.30 | 25.88 | ||
| G018106 | 86 | 14.65 | 1.48 | ||
| G018107 | 87 | 22.00 | 19.66 | ||
| G018108 | 88 | 10.65 | 5.73 | ||
| G018109 | 89 | 63.50 | 8.91 | ||
| G018110 | 90 | 33.45 | 16.62 | ||
| G018111 | 91 | 19.50 | 5.66 | ||
| G018112 | 92 | 30.85 | 0.21 | ||
| G018113 | 93 | ||||
| G018114 | 94 | 6.70 | 5.09 | ||
| G018115 | 95 | 0.00 | 0.00 | ||
| G018116 | 96 | ||||
| G018117 | 97 | ||||
| G018118 | 98 | ||||
| G018119 | 99 | ||||
| G018120 | 100 | ||||
| G018121 | 101 | ||||
| G000529 | 700 | 43.30 | |||
| G010036 | 107 |
使用BC22篩選CIITA引導RNA，BC22係一種鹼基轉化編輯核酸酶，其包括Cas9D10A切口酶、人類APOBEC3A去胺酶及尿嘧啶醣苷酶抑制劑之融合物。此構築體之特徵編輯為胞嘧啶向胸腺嘧啶之轉化，而非Cas9裂解酶之典型插入/缺失。T細胞中之功效係藉由II類MHC細胞表面表現之損失評估。在藉由mRNA及引導物電穿孔進行CIITA編輯之後分析對II類MHC蛋白呈陰性之T細胞的百分比。
3.1. T細胞之mRNA電穿孔。
解凍後，將自商業獲得之白血球採集物(StemCell)分離之泛CD3+ T細胞以0.5×10
6個細胞/毫升之密度平盤培養於來自
表 3之培養基20中。用Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 (ThermoFisher)活化T細胞。細胞在mRNA轉染之前在T細胞中擴增72小時。
將CIITA sgRNA (
表 4A)自其儲存盤取出，且在95℃下變性2分鐘，隨後在室溫下冷卻10分鐘。用含100,00個T細胞之P3緩衝液(Lonza)及10 ng/μL編碼UGI之mRNA (SEQ ID No: 807)、10 ng/μL編碼BC22之mRNA (SEQ ID No: 806)及2 μM sgRNA來製備五十微升電穿孔混合物。將此混合物轉移至Lonza shuttle 96孔電穿孔盤之對應孔中。使用Lonza shuttle 96w，使用製造商之脈衝碼在重複孔中對細胞進行電穿孔。電穿孔後立即將培養基20添加至細胞中。隨後在編輯後10天培養及收集電穿孔之T細胞用於NGS定序及流動式細胞測量術。如
實例 2中所述地進行流動式細胞測量術。如
實例 1中所述，對DNA樣品進行PCR及後續NGS分析。
表 5展示對II類MHC之細胞表面表現呈陰性之T細胞的平均百分比以及平均編輯百分比。
表 5 ： 使用 BC22 之 CIITA 引導篩選。
3.4. 引導位置相對於II類MHC蛋白減弱
| 引導物 | SEQ ID NO | 平均II 類MHC 陰性% | SD | 平均C- 至-T 編輯% | SD |
| G018021 | 1 | 38.65 | 0.21 | 87.55 | 0.21 |
| G018022 | 2 | 23.05 | 0.64 | 88.15 | 0.64 |
| G018023 | 3 | 25.00 | 0.71 | 84.05 | 0.78 |
| G018024 | 4 | 24.85 | 1.63 | 87.20 | 0.57 |
| G018025 | 5 | 23.05 | 2.76 | 84.95 | 0.92 |
| G018026 | 6 | 35.65 | 2.90 | 71.00 | 0.71 |
| G018027 | 7 | 30.65 | 1.06 | 75.00 | 0.85 |
| G018028 | 8 | 25.20 | 3.11 | 75.50 | 0.71 |
| G018029 | 9 | 24.00 | 0.28 | 5.70 | 0.57 |
| G018030 | 10 | 24.60 | 0.00 | 38.65 | 1.77 |
| G018031 | 11 | 22.85 | 0.07 | 59.70 | 4.38 |
| G018032 | 12 | 20.15 | 1.63 | 21.75 | 0.21 |
| G018033 | 13 | 21.05 | 1.34 | 64.85 | 1.06 |
| G018034 | 14 | 72.90 | 2.69 | 74.00 | 1.13 |
| G018035 | 15 | 47.00 | 0.28 | 73.70 | 0.28 |
| G018036 | 16 | 22.90 | 0.28 | 36.25 | 0.78 |
| G018037 | 17 | 21.90 | 2.26 | 49.30 | 2.26 |
| G018038 | 18 | 20.90 | 1.84 | 58.00 | 6.65 |
| G018039 | 19 | 62.55 | 4.60 | 67.45 | 2.05 |
| G018040 | 20 | 20.15 | 2.62 | 11.60 | 0.14 |
| G018041 | 21 | 22.25 | 2.33 | 17.15 | 0.49 |
| G018042 | 22 | 34.80 | 0.28 | 47.25 | 0.78 |
| G018043 | 23 | 31.20 | 2.97 | 36.15 | 0.78 |
| G018044 | 24 | 33.15 | 1.34 | 31.65 | 0.92 |
| G018045 | 25 | 22.75 | 1.20 | 66.35 | 1.20 |
| G018046 | 26 | 31.65 | 5.44 | 79.10 | 1.70 |
| G018047 | 27 | 28.20 | 4.38 | 75.55 | 0.35 |
| G018048 | 28 | 41.00 | 2.83 | 64.75 | 1.34 |
| G018049 | 29 | 28.95 | 4.17 | 53.25 | 1.48 |
| G018050 | 30 | 31.00 | 3.11 | 75.35 | 0.78 |
| G018051 | 31 | 27.90 | 4.10 | 50.80 | |
| G018052 | 32 | 20.90 | 1.27 | 74.25 | 0.78 |
| G018053 | 33 | 21.75 | 0.92 | 52.90 | 1.41 |
| G018054 | 34 | 39.95 | 0.21 | 82.50 | 0.57 |
| G018055 | 35 | 23.50 | 2.97 | 71.25 | 0.92 |
| G018056 | 36 | 24.85 | 2.05 | 77.20 | 3.11 |
| G018057 | 37 | 23.30 | 0.99 | 68.55 | 1.06 |
| G018058 | 38 | 25.45 | 0.64 | 67.15 | 0.78 |
| G018059 | 39 | 24.55 | 0.49 | 4.80 | |
| G018060 | 40 | 22.50 | 2.26 | 91.65 | 0.64 |
| G018061 | 41 | 22.50 | 0.71 | 73.60 | 0.57 |
| G018062 | 42 | 24.65 | 0.07 | 72.75 | 0.78 |
| G018063 | 43 | 34.80 | 0.14 | 68.85 | 0.49 |
| G018064 | 44 | 24.95 | 2.33 | 76.75 | 2.62 |
| G018065 | 45 | 26.60 | 0.71 | 70.35 | 0.07 |
| G018066 | 46 | 24.35 | 4.88 | 70.65 | 0.35 |
| G018067 | 47 | 86.65 | 1.20 | 83.80 | 0.42 |
| G018068 | 48 | 50.50 | 2.55 | 82.10 | 0.14 |
| G018069 | 49 | 24.50 | 1.98 | 83.95 | 0.21 |
| G018070 | 50 | 25.55 | 0.64 | 82.35 | 0.49 |
| G018071 | 51 | 32.25 | 0.49 | 70.40 | 0.28 |
| G018072 | 52 | 23.65 | 3.32 | 74.45 | 1.63 |
| G018073 | 53 | 22.65 | 2.76 | 75.90 | 1.84 |
| G018074 | 54 | 21.60 | 2.97 | 50.50 | 0.99 |
| G018075 | 55 | 88.30 | 1.56 | 87.05 | 0.07 |
| G018076 | 56 | 88.45 | 0.64 | 87.45 | 0.35 |
| G018077 | 57 | 69.15 | 2.47 | 78.65 | 1.48 |
| G018078 | 58 | 71.35 | 4.17 | 88.35 | 0.64 |
| G018079 | 59 | 39.15 | 8.27 | 73.75 | 1.34 |
| G018080 | 60 | 32.85 | 0.07 | 57.45 | 1.77 |
| G018081 | 61 | 37.90 | 1.27 | 77.30 | 3.82 |
| G018082 | 62 | 36.75 | 1.91 | 77.05 | 3.18 |
| G018083 | 63 | 37.65 | 1.06 | 49.50 | 0.71 |
| G018084 | 64 | 45.25 | 3.75 | 77.35 | 0.49 |
| G018085 | 65 | 45.75 | 2.19 | 75.00 | 1.13 |
| G018086 | 66 | 18.85 | 1.06 | 77.85 | 0.21 |
| G018087 | 67 | 18.45 | 2.05 | 77.00 | 1.56 |
| G018088 | 68 | 42.20 | 4.38 | 90.10 | 0.28 |
| G018089 | 69 | 34.30 | 3.25 | 88.70 | 1.41 |
| G018090 | 70 | 39.70 | 3.39 | 90.20 | 0.28 |
| G018091 | 71 | 85.60 | 1.56 | 82.30 | 1.13 |
| G018092 | 72 | 26.70 | 3.96 | 56.65 | 0.78 |
| G018093 | 73 | 74.05 | 1.48 | 80.95 | 1.63 |
| G018094 | 74 | 36.10 | 1.41 | 72.25 | 0.92 |
| G018095 | 75 | 25.75 | 3.46 | 91.70 | 1.27 |
| G018096 | 76 | 27.15 | 3.32 | 16.60 | 1.13 |
| G018097 | 77 | 28.90 | 1.70 | 49.40 | 0.28 |
| G018098 | 78 | 28.40 | 0.57 | 16.65 | 2.76 |
| G018099 | 79 | 26.75 | 0.64 | 84.50 | 1.13 |
| G018100 | 80 | 87.80 | 0.00 | 85.05 | 0.49 |
| G018101 | 81 | 81.10 | 2.26 | 85.50 | 4.53 |
| G018102 | 82 | 72.25 | 0.35 | 64.50 | 0.71 |
| G018103 | 83 | 80.90 | 1.56 | 71.50 | 0.14 |
| G018104 | 84 | 26.00 | 4.53 | 82.95 | 1.77 |
| G018105 | 85 | 24.85 | 1.48 | 86.30 | 0.14 |
| G018106 | 86 | 85.25 | 1.20 | 81.40 | 2.26 |
| G018107 | 87 | 94.33 | 0.06 | 87.10 | 0.99 |
| G018108 | 88 | 55.25 | 0.64 | 85.75 | 1.63 |
| G018109 | 89 | 44.40 | 0.71 | 84.85 | 0.64 |
| G018110 | 90 | 26.05 | 0.49 | 76.15 | 2.19 |
| G018111 | 91 | 81.55 | 0.07 | 83.35 | 0.49 |
| G018112 | 92 | 33.05 | 1.91 | 75.30 | 1.41 |
| G018113 | 93 | 32.85 | 1.06 | 80.25 | 3.32 |
| G018114 | 94 | 33.60 | 3.54 | 64.40 | 1.84 |
| G018115 | 95 | 23.95 | 2.05 | 55.45 | 2.33 |
| G018116 | 96 | 68.10 | 2.12 | 53.30 | 2.26 |
| G018117 | 97 | 93.25 | 0.20 | 86.10 | 0.71 |
| G018118 | 98 | 92.96 | 0.42 | 84.00 | 0.14 |
| G018119 | 99 | 57.80 | 2.12 | 44.60 | 2.69 |
| G018120 | 100 | 89.40 | 0.28 | 84.15 | 1.91 |
| G018121 | 101 | 75.85 | 0.49 | 75.00 | 0.99 |
表 6及
圖 2展示使用Cas9及BC22之II類MHC的基因剔除%與切割位點至剪接位點邊界核苷酸之距離的關係。
對於各引導物，示出具有SpCas9之剪切位點之基因體座標，以及受體剪接位點邊界核苷酸或供體剪接位點邊界核苷酸與剪切位點之間的距離(核苷酸數)。正數值展示在剪接位點邊界核苷酸與剪切位點之間的5'方向上之核苷酸之數目，而負數值展示在剪接位點邊界核苷酸與剪切位點之間的3'方向上之核苷酸之數目。
表 6 ： 引導位置相對於蛋白質減弱效率
實例4. 使用反式UGI在T細胞中進行編輯。 4.1 T細胞中之編輯
| 引導物 | 與切割位點之距離(bp) | BC22 | Cas9 | ||
| 平均II類MHC陰性% | SD | 平均II類MHC陰性% | SD | ||
| G018075 | 11 | 88.3 | 1.56 | 54.7 | 3.54 |
| G018076 | 10 | 88.45 | 0.64 | 51.45 | 6.29 |
| G018077 | 9 | 69.15 | 2.48 | 55.9 | 0.14 |
| G018078 | 4 | 71.35 | 4.17 | 83.65 | 3.04 |
| G018081 | 0 | 37.9 | 1.27 | 91.1 | 0.42 |
| G018082 | -1 | 36.75 | 1.91 | 93.6 | 2.26 |
| G018084 | -7 | 45.25 | 3.75 | 44 | 3.39 |
| G018085 | -8 | 45.75 | 2.19 | 32.95 | 0.92 |
在CIITA基因座處用反式UGI及BC22n或Cas9編輯T細胞以評估編輯類型對II類MHC抗原之影響。BC22n係一種鹼基轉化編輯核酸酶，其包括Cas9D10A切口酶、人類APOBEC3A去胺酶之融合物。此構築體之特徵編輯為胞嘧啶向胸腺嘧啶之轉化，而非Cas9裂解酶之典型插入/缺失。
健康人類供體血球分離術為商業獲得的(Hemacare)，且細胞在LOVO裝置上經洗滌且再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中。使用CD4及CD8磁珠(Miltenyi BioTec目錄號130-030-401/130-030-801)，使用CliniMACS® Plus及CliniMACS® LS拋棄式套組，經由陽性選擇分離T細胞。將T細胞等分至小瓶中且冷凍保存於Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)及Plasmalyte A (Baxter目錄號2B2522X)之1:1調配物中以供將來使用。解凍後，T細胞以1.0×10
6個細胞/毫升之密度平盤培養於由以下各者構成之T細胞基礎培養基中：X-VIVO 15™無血清造血細胞培養基(Lonza Bioscience)，含有5% (v/v)胎牛血清、50 µM 2-巰基乙醇、10 mM N-乙醯基-L-(+)-半胱胺酸、10 U/mL青黴素-鏈黴素，外加1×細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2、5 µg/mL重組人類介白素-7及5 µg/mL重組人類介白素-15)。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。細胞在電穿孔之前在含有TransAct™之T細胞基礎培養基中擴增72小時。
4.2. T細胞之電穿孔
在無菌水中製備含有編碼Cas9、BC22n (SEQ ID NO: 804)或UGI (SEQ ID NO: 807)之mRNA的溶液。將50 µM CIITA sgRNA (G018076及G018117) (分別為SEQ ID NO: 56及97)自其儲存盤取出，且在95℃下變性2分鐘，隨後在冰上冷卻。活化後七十二小時，收集T細胞，離心，且以12.5×10
6個T細胞/毫升之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza)中。對於待電穿孔之各孔，將1×10
5個T細胞與200 ng編輯mRNA、200 ng UGI mRNA及20 pmol sgRNA在最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中混合。此混合物一式三份轉移至96孔Nucleofector™盤中且使用製造商之脈衝碼電穿孔。經電穿孔之T細胞緊接著在不含細胞介素之80 µL T細胞基礎培養基中靜置10分鐘，隨後轉移至含有額外100 µL補充有2X細胞介素之T細胞基礎培養基的新平底96孔盤中。所得盤在37℃下培育4天。96小時後，將T細胞以1:3稀釋至含1X細胞介素之新鮮T細胞基礎培養基中。隨後將電穿孔之T細胞再培養3天且收集用於流動式細胞測量術分析、NGS定序及轉錄組學。如實例1中所述地進行NGS分析。
4.3. 流動式細胞測量術及NGS定序。
編輯後第7天，T細胞藉由流動式細胞測量術進行表型分型以測定II類MHC蛋白表現。簡言之，在靶向HLA-DR、DQ、DP-PE之抗體(BioLegend®目錄號361704)及同型對照-PE (BioLegend®目錄號400234)的混合液中培育T細胞。隨後洗滌細胞，在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo套裝軟體進行分析。基於大小、形狀、活力及II類MHC表現圈選T細胞。如實例1中所述，對DNA樣品進行PCR及後續NGS分析。
表 7及
圖 1A、
圖 1B 及圖 6A展示CIITA基因編輯。對於Cas9及BC22n條件，總編輯均接近完成，超過95%。
表 7及
圖 1C 、表 1D 及圖 6B展示在藉由UGI mRNA與Cas9或BC22n mRNA之組合進行電穿孔之後，II類MHC陰性細胞之平均百分比。
表 7 以總 NGS 讀段之百分比呈現之 T 細胞中之 CIITA 編輯 ； II 類 MHC 陰性之平均百分比的流動式細胞測量術評估。
實例5. T細胞中之基因表現分析。 5.1. 全轉錄組定序。
| 編輯劑 | 引導物 | % C- 至-T | % C- 至-A/G | % 插入/ 缺失 | % II 類MHC 陰性 | |||||
| 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | N | ||
| Cas9 | G018117 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 98.0 | 0.2 | 70.3 | 1.5 | 3 |
| G018118 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 97.5 | 0.5 | 73.7 | 0.5 | 3 | |
| G018120 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.0 | 92.3 | 0.3 | 83.1 | 1.1 | 3 | |
| G018076 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 98.3 | 0.1 | 62.8 | 1.1 | 3 | |
| G018100 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 98.9 | 0.2 | 84.1 | 1.3 | 3 | |
| G018091 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 99.4 | 0.2 | 96.2 | 0.4 | 3 | |
| 無引導物 | 未報導 | 10.5 | 0.0 | 1 | ||||||
| BC22n | G018117 | 95.7 | 0.2 | 2.3 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 99.2 | 0.1 | 3 |
| G018118 | 95.8 | 0.3 | 2.3 | 0.1 | 1.2 | 0.3 | 99.0 | 0.1 | 3 | |
| G018120 | 95.7 | 0.5 | 2.6 | 0.4 | 0.7 | 0.1 | 99.0 | 0.1 | 3 | |
| G018076 | 96.5 | 0.4 | 1.2 | 0.2 | 1.1 | 0.3 | 98.5 | 0.2 | 3 | |
| G018100 | 90.7 | 0.3 | 2.8 | 0.3 | 5.1 | 0.7 | 95.7 | 0.6 | 3 | |
| G018091 | 95.4 | 0.6 | 2.8 | 0.1 | 1.1 | 0.3 | 98.7 | 0.2 | 3 | |
| 無引導物 | 未報導 | 10.8 | 0.0 | 1 |
編輯後第7天，收集實例4中用G018117 (SEQ ID NO: 97)及G018078 (SEQ ID NO: 58)處理之T細胞且將其保存在-80℃下以供將來處理。遵循製造商之方案，使用Direct-zol RNA microprep套組(Zymo Research，目錄號R2062)自TRIzol™試劑中之樣品提取總RNA。經純化RNA樣品在NanoDrop™ 8000分光光度計(Thermo Fisher Scientific)中定量且使用無核酸酶水稀釋至41.67 ng/µL。自
圖 1中所展示之各一式三份實驗中，隨機選擇每組兩個樣品用於轉錄組分析。根據製造商說明書，使用NEBNext® rRNA耗竭套組(New England Biolabs，目錄號E6350L)耗竭500 ng (12 µL)經純化總RNA之核糖體RNA (rRNA)組分。遵循製造商之方案，使用NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs，目錄號E7765S)將耗竭rRNA之樣品轉化為雙股DNA文庫。在Qubit 4螢光計中定量擴增之文庫，且藉由毛細管電泳獲得各文庫之平均片段大小。以4 nM之等莫耳濃度彙集文庫，且在NextSeq550定序平台(Illumina)中使用高輸出300-循環套組(Illumina，目錄號20024908)進行配對末端定序。
5.2. 用於差異基因表現分析之資料處理。
產生呈FASTQ格式之定序讀數且使用bcl2fastq程式(Illumina, v2.20)解多工。若每一索引讀數與樣品索引之間的漢明距離(Hamming, R.W. Bell Syst. Tech. J. 29, 147-160)小於或等於一，則將讀數分配至樣品。用FastQC程式(v0.11.9) (Andrews S. Babraham Inst.)檢驗定序品質。藉由用Bowtie2 (v2.3.5.1) (Langmead, B.及Salzberg, S.L. Nat. Methods 9, 357-359)將所有讀數與人類rRNA序列(GenBank U13369.1)比對來鑑別核糖體RNA讀數。使用Salmon (v0.14.1) (Patro R.,等人Nat. Methods 14, 417-419)與非核糖體RNA讀數進行轉錄組定量。使用DESeq2 (v1.26.0) (Love, M.I.,等人Genome Biol. 15, 550)對Salmon之輸出進行差異基因表現分析。經Benjamini-Hochberg調整後p值小於0.05之基因或轉錄本被測定為差異性表現。使用Metascape (Zhou, Y.,等人Nat. Comm. 10, 1523)依據基因本體來分析差異表現基因之清單。使用BioGrid、InWeb_IM及OmniPath8資料庫(Li, T.,等人Nat. Methods 14, 61-64；Stark, C.,等人Nucleic Acids Res. 34, 535-539；Türei, D.,等人Nat. Methods 13, 966-967)測定蛋白質-蛋白質相互作用。使用分子複合物偵測(MCODE)演算法鑑別密集連接之網路(Bader, G.D.,等人BMC Bioinformatics 4, 1-27)且保留依據p值之三個最佳評分項作為對應網路組件的功能描述。
相比於用編碼Cas9之mRNA (SEQ ID NO: 809)處理之樣品，用BC22n mRNA (SEQ ID NO: 806)電穿孔之T細胞顯示II類MHC基因及HLA相關CD74基因之顯著較強下調(
表 8及
表 9)。觀測到對I類MHC基因之最小影響(
表 10及
表 11)。就總轉錄組範圍內之差異基因表現事件而言，當與Cas9 mRNA相比時，用BC22n mRNA處理產生較少差異表現基因(調整後p值＜0.05)。在用sgRNA G0 18076 (SEQ ID NO: 56)電穿孔之T細胞中，分別觀測到Cas9及BC22n mRNA處理之總共553及65個差異基因表現事件(
圖 7A 及圖 7B)。在用sgRNA G018117 (SEQ ID NO: 97)電穿孔之T細胞中觀測到類似趨勢，在分別用Cas9及BC22n mRNA處理時，其顯示303及30個差異基因表現事件(
圖 7C 及 圖 7D)。當相比於用Cas9 mRNA與sgRNA G018076 (SEQ ID NO: 56) (
圖 8A(Cas9)及
圖 8B(BC22n))及sgRNA G018117 (SEQ ID NO: 97) (
圖 8C(Cas9)及
圖 8D(BC22n))處理時，在用BC22n mRNA處理之T細胞中，在差異表現基因清單中鑑定較少蛋白質-蛋白質相互作用網路。
表 8. T 細胞 中 II 類 MHC 基因之差異基因表現(ns = 不顯著，* = 調整後p值＜0.05，** = 調整後p值＜0.01，*** = 調整後p值＜0.001)。關於轉錄本定量資料，參看表9。
| G018076 sgRNA | G018117 sgRNA | |||||||
| Cas9 相對於對照 | BC22n 相對於對照 | Cas9 相對於對照 | BC22n 相對於對照 | |||||
| 基因 | 倍數變化 | 調整後p 值 | 倍數變化 | 調整後p 值 | 倍數變化 | 調整後p 值 | 倍數變化 | 調整後p 值 |
| CD74 | 0.446 | *** | 0.116 | *** | 0.360 | *** | 0.100 | *** |
| HLA-DMA | 0.457 | *** | 0.150 | *** | 0.356 | *** | 0.146 | *** |
| HLA-DMB | 0.363 | *** | 0.113 | *** | 0.267 | *** | 0.091 | *** |
| HLA-DOA | 0.450 | *** | 0.299 | *** | 0.420 | *** | 0.280 | *** |
| HLA-DPA1 | 0.474 | *** | 0.181 | *** | 0.385 | *** | 0.170 | *** |
| HLA-DPB1 | 0.381 | *** | 0.087 | *** | 0.300 | *** | 0.073 | *** |
| HLA-DQA1 | 0.316 | *** | 0.017 | *** | 0.214 | *** | 0.009 | *** |
| HLA-DQA2 | 0.215 | *** | 0.007 | *** | 0.221 | *** | 0.011 | *** |
| HLA-DQB1 | 0.383 | *** | 0.069 | *** | 0.290 | *** | 0.069 | *** |
| HLA-DQB1-AS1 | 0.323 | *** | 0.102 | *** | 0.311 | *** | 0.097 | *** |
| HLA-DRA | 0.288 | *** | 0.004 | *** | 0.205 | *** | 0.002 | *** |
| HLA-DRB1 | 0.287 | *** | 0.029 | *** | 0.207 | *** | 0.027 | *** |
| HLA-DRB3 | 0.268 | *** | 0.012 | *** | 0.219 | *** | 0.004 | *** |
| HLA-DRB4 | 0.282 | *** | 0.024 | *** | 0.224 | *** | 0.026 | *** |
表 9. T 細胞中 II 類 MHC 基因表現之轉錄本定量。每個方格含有每一百萬個mRNA分子中來自給定基因之轉錄本之平均數目。關於統計顯著性，請參看表8。
| 引導物 | 無 | G0188117 | G018076 | ||
| mRNA | UGI | Cas9 UGI | BC22n UGI | Cas9 UGI | BC22n UGI |
| CD74 | 385 | 154 | 38 | 174 | 45 |
| HLA-DMA | 27 | 11 | 4 | 12 | 4 |
| HLA-DMB | 11 | 3 | 1 | 4 | 1 |
| HLA-DOA | 3 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| HLA-DPA1 | 70 | 30 | 12 | 34 | 13 |
| HLA-DPB1 | 16 | 5 | 1 | 6 | 1 |
| HLA-DQA1 | 12 | 3 | 0 | 4 | 0 |
| HLA-DQA2 | 3 | 1 | 0 | 1 | 0 |
| HLA-DQB1 | 60 | 19 | 4 | 23 | 4 |
| HLA-DQB1-AS1 | 9 | 3 | 1 | 3 | 1 |
| HLA-DRA | 120 | 27 | 0 | 35 | 1 |
| HLA-DRB1 | 117 | 27 | 3 | 34 | 3 |
| HLA-DRB3 | 17 | 4 | 0 | 5 | 0 |
| HLA-DRB4 | 13 | 3 | 0 | 4 | 0 |
表 10. 用不同 mRNA 組合及 CIITA sgRNA 處理後 7 天收集之 T 細胞中 I 類 HLA 基因之差異基因表現。(ns = 不顯著，* = 調整後p值＜0.05，** = 調整後p值＜0.01，*** = 調整後p值＜0.001)。關於轉錄本定量資料，參看表11。
| G018076 sgRNA | G018117 sgRNA | |||||||
| Cas9 相對於對照 | BC22n 相對於對照 | Cas9 相對於對照 | BC22n 相對於對照 | |||||
| 基因 | 倍數變化 | 調整後p 值 | 倍數變化 | 調整後p 值 | 倍數變化 | 調整後p 值 | 倍數變化 | 調整後p 值 |
| HLA-A | 0.995 | ns | 0.910 | * | 0.969 | ns | 0.926 | ns |
| HLA-B | 1.001 | ns | 0.881 | ** | 1.043 | ns | 0.913 | ns |
| HLA-C | 1.013 | ns | 0.917 | ns | 0.995 | ns | 0.922 | ns |
| HLA-E | 0.925 | ns | 0.919 | ns | 0.870 | *** | 0.949 | ns |
| HLA-F | 0.897 | ns | 0.812 | ** | 0.930 | ns | 0.891 | ns |
表 11. T 細胞中 I 類 HLA 基因表現之轉錄本定量。每個方格含有每一百萬個mRNA分子中來自給定基因之轉錄本之平均數目。關於統計顯著性，請參看表12。
實例6. BC22n:UGI比固定之T細胞中之LNP滴定。
| 引導物 | 無 | G0188117 | G018076 | ||
| mRNA | UGI | Cas9 UGI | BC22n UGI | Cas9 UGI | BC22n UGI |
| HLA-A | 880 | 947 | 797 | 887 | 814 |
| HLA-B | 457 | 528 | 407 | 463 | 409 |
| HLA-C | 479 | 528 | 430 | 490 | 445 |
| HLA-E | 166 | 161 | 154 | 156 | 155 |
| HLA-F | 68 | 70 | 59 | 61 | 56 |
使用LNP遞送至活化人類T細胞，用Cas9或BC22n評估單靶點及多靶點編輯之效力。
6.1. T細胞製備。
健康人類供體血球分離術為商業獲得的(Hemacare)，且細胞在LOVO裝置上經洗滌且再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中。使用CD4及CD8磁珠(Miltenyi BioTec目錄號130-030-401/130-030-801)，使用CliniMACS® Plus及CliniMACS® LS拋棄式套組，經由陽性選擇分離T細胞。將T細胞等分至小瓶中且冷凍保存於Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)及Plasmalyte A (Baxter目錄號2B2522X)之1:1調配物中以供將來使用。解凍後，T細胞以1.0×10
6個細胞/毫升之密度平盤培養於由以下各者構成之T細胞基礎培養基中：X-VIVO 15™無血清造血細胞培養基(Lonza Bioscience)，含有5% (v/v)胎牛血清、50 µM 2-巰基乙醇、10 mM N-乙醯基-L-(+)-半胱胺酸、10 U/mL青黴素-鏈黴素，外加1×細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2、5 ng/mL重組人類介白素-7及5 ng/mL重組人類介白素-15)。T細胞用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化。細胞在LNP轉染之前在T細胞基礎培養基中擴增72小時。
6.2. T細胞編輯。
如實例1中所述，各RNA物種，亦即UGI mRNA、sgRNA或編輯mRNA分別在LNP中調配。編輯mRNA編碼BC22n (SEQ ID NO: 805)或Cas9。單獨或組合使用靶向B2M (G015995) (SEQ ID NO: 704)、TRAC (G016017) (SEQ ID NO: 705)、TRBC1/2 (G016206) (SEQ ID NO: 706)及CIITA (G018117) (SEQ ID NO: 97)之引導物。編碼UGI之信使RNA (SEQ ID NO: 807)係在實驗之Cas9及BC22n組中遞送以標準化脂質量。先前實驗已確立，UGI mRNA在與Cas9 mRNA一起使用時不影響總編輯或編輯概況。如
表 12中所述，對於編輯mRNA、引導RNA及UGI mRNA，LNP分別混合至6:3:2之固定總mRNA重量比。在
表 12中所述之4引導物實驗中，將個別引導物稀釋4倍以維持總體6:3編輯mRNA:引導物重量比及允許與基於總脂質遞送之個別引導物效力進行比較。將LNP混合物在37℃下在用6%食蟹獼猴血清(Bioreclamation IVT，目錄號CYN220760)替代胎牛血清之T細胞基礎培養基中培育5分鐘。
活化後七十二小時，T細胞經洗滌且懸浮於基礎T細胞培養基中。將預培育LNP混合物以1×10e5個T細胞/孔添加至各孔中。在實驗期間，在37℃下將T細胞與5% C02一起培育。在活化後6天及8天及活化後第十天更換T細胞培養基，收集細胞以藉由NGS及流動式細胞測量術進行分析。如同
實例 1進行NGS。
表 12及
圖 3A- 圖 3D描述當個別引導物用於編輯時T細胞之編輯概況。在所有測試之引導物中，總編輯及C至T編輯展示與BC22n mRNA、UGI mRNA及引導物之量增加的直接、劑量反應關係。插入/缺失及C轉化為A或G與劑量逆相關，其中較低劑量導致較高百分比之此等突變。在經Cas9編輯之樣品中，總編輯及插入/缺失活性隨總RNA劑量而增加。
表
12.
總讀段百分比形式之編輯
-
單引導物遞送。
| 引導物 | 編輯劑 | 總RNA (ng) | C- 至-T % | C- 至-A/G % | 插入/ 缺失% | N | |||
| 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | ||||
| G015995 B2M | BC22n | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 1.5 | 0.1 | 0.2 | 0.0 | 2 |
| 8.6 | 49.5 | 3.5 | 7.7 | 0.6 | 6.0 | 0.4 | 2 | ||
| 17.2 | 68.5 | 1.7 | 6.7 | 1.3 | 4.3 | 0.1 | 2 | ||
| 34.4 | 79.0 | 0.9 | 5.7 | 0.3 | 3.8 | 0.0 | 2 | ||
| 68.8 | 88.2 | 0.8 | 4.6 | 0.0 | 2.5 | 0.2 | 2 | ||
| 137.5 | 90.6 | 1.8 | 4.1 | 0.4 | 2.2 | 0.5 | 2 | ||
| 275.0 | 92.6 | 0.8 | 3.7 | 0.3 | 2.2 | 0.3 | 2 | ||
| 550.0 | 95.2 | 0.4 | 2.8 | 0.0 | 1.6 | 0.2 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 1.5 | 0.2 | 0.2 | 0.0 | 2 | |
| 8.6 | 0.3 | 0.0 | 1.2 | 0.1 | 23.7 | 2.1 | 2 | ||
| 17.2 | 0.3 | 0.0 | 0.9 | 0.1 | 41.1 | 0.2 | 2 | ||
| 34.4 | 0.3 | 0.0 | 0.6 | 0.0 | 59.4 | 0.6 | 2 | ||
| 68.8 | 0.2 | 0.1 | 0.4 | 0.0 | 76.8 | 1.2 | 2 | ||
| 137.5 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.0 | 88.2 | 2.0 | 2 | ||
| 275.0 | 0.1 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 95.1 | 0.5 | 2 | ||
| 550.0 | 0.1 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 97.5 | 0.3 | 2 | ||
| G016017 TRAC | BC22n | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 2.2 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 2 |
| 8.6 | 34.6 | 1.1 | 5.6 | 0.8 | 6.6 | 0.2 | 2 | ||
| 17.2 | 51.3 | 0.8 | 5.7 | 0.1 | 6.7 | 1.0 | 2 | ||
| 34.4 | 66.9 | 2.6 | 5.4 | 0.2 | 4.7 | 0.4 | 2 | ||
| 68.8 | 79.0 | 0.6 | 4.4 | 0.7 | 4.5 | 0.9 | 2 | ||
| 137.5 | 89.2 | 0.4 | 3.6 | 0.9 | 2.5 | 0.2 | 2 | ||
| 275.0 | 92.8 | 0.9 | 2.9 | 0.0 | 2.3 | 0.0 | 2 | ||
| 550.0 | 94.5 | 1.3 | 3.4 | 1.0 | 1.6 | 0.2 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 2.3 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 2 | |
| 8.6 | 0.2 | 0.0 | 2.1 | 0.2 | 20.7 | 0.5 | 2 | ||
| 17.2 | 0.1 | 0.0 | 1.4 | 0.0 | 34.6 | 0.7 | 2 | ||
| 34.4 | 0.1 | 0.0 | 1.5 | 0.4 | 49.8 | 0.4 | 2 | ||
| 68.8 | 0.1 | 0.0 | 1.0 | 0.0 | 62.3 | 0.1 | 2 | ||
| 137.5 | 0.1 | 0.0 | 0.6 | 0.1 | 77.0 | 0.1 | 2 | ||
| 275.0 | 0.0 | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 87.8 | 0.2 | 2 | ||
| 550.0 | 0.0 | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 93.8 | 0.6 | 2 | ||
| G016206 TRBC1/2 | BC22n | 0.0 | 0.4 | 0.1 | 0.6 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 2 |
| 8.6 | 23.7 | 1.3 | 6.1 | 0.0 | 6.1 | 0.8 | 2 | ||
| 17.2 | 42.4 | 2.2 | 6.8 | 0.1 | 6.8 | 0.3 | 2 | ||
| 34.4 | 60.1 | 2.2 | 5.7 | 0.3 | 5.9 | 0.7 | 2 | ||
| 68.8 | 73.2 | 4.2 | 4.3 | 0.1 | 4.7 | 1.1 | 2 | ||
| 137.5 | 81.7 | 0.8 | 3.6 | 0.2 | 3.7 | 0.4 | 2 | ||
| 275.0 | 91.0 | 1.7 | 2.3 | 0.1 | 2.8 | 0.8 | 2 | ||
| 550.0 | 93.6 | 1.9 | 2.0 | 0.2 | 1.7 | 0.6 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 1 | |
| 8.6 | 0.3 | 0.2 | 0.5 | 0.1 | 8.1 | 0.2 | 2 | ||
| 17.2 | 0.3 | 0.1 | 0.7 | 0.1 | 14.9 | 0.6 | 2 | ||
| 34.4 | 0.2 | 0.0 | 0.8 | 0.0 | 24.1 | 0.0 | 1 | ||
| 68.8 | 0.2 | 0.0 | 0.4 | 0.0 | 35.9 | 0.0 | 1 | ||
| 137.5 | 0.2 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 48.6 | 2.1 | 2 | ||
| 275.0 | 0.1 | 0.0 | 0.4 | 0.0 | 63.8 | 0.0 | 1 | ||
| 550.0 | 未分析 | ||||||||
| G018117 CIITA | BC22n | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 2.7 | 0.1 | 0.3 | 0.0 | 2 |
| 8.6 | 14.5 | 1.5 | 3.8 | 0.3 | 3.5 | 0.3 | 2 | ||
| 17.2 | 28.1 | 0.6 | 3.5 | 0.3 | 3.9 | 1.0 | 2 | ||
| 34.4 | 45.9 | 0.4 | 3.3 | 0.4 | 3.6 | 0.0 | 2 | ||
| 68.8 | 62.8 | 5.3 | 3.6 | 0.1 | 3.7 | 1.2 | 2 | ||
| 137.5 | 78.9 | 1.3 | 2.7 | 0.1 | 2.7 | 0.7 | 2 | ||
| 275.0 | 86.3 | 1.8 | 2.6 | 0.1 | 2.0 | 0.1 | 2 | ||
| 550.0 | 92.3 | 1.2 | 2.6 | 0.2 | 1.1 | 0.2 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 2.8 | 0.1 | 0.3 | 0.0 | 2 | |
| 8.6 | 0.3 | 0.0 | 2.5 | 0.0 | 6.0 | 0.2 | 2 | ||
| 17.2 | 0.2 | 0.0 | 2.4 | 0.1 | 11.2 | 1.6 | 2 | ||
| 34.4 | 0.2 | 0.0 | 2.1 | 0.0 | 20.8 | 0.3 | 2 | ||
| 68.8 | 0.2 | 0.0 | 1.9 | 0.1 | 33.2 | 0.4 | 2 | ||
| 137.5 | 0.1 | 0.0 | 1.3 | 0.1 | 51.2 | 0.0 | 2 | ||
| 275.0 | 0.1 | 0.0 | 0.9 | 0.2 | 64.5 | 0.9 | 2 | ||
| 550.0 | 0.1 | 0.0 | 0.6 | 0.0 | 78.4 | 1.1 | 2 |
表 13及
圖 4A- 圖 4D以總讀段之百分比描述了當同時使用四個引導物進行編輯時，T細胞之編輯概況。在此組實驗中，各導引物以與單導引物編輯實驗相比25%之濃度使用。總共，T細胞同時暴露於6種不同LNP (編輯mRNA、UGI mRNA、4個引導物)。相比於用Cas9編輯，用BC22n及反式UGI編輯使得各基因座之最大總編輯百分比更高。
表
13.
總讀段百分比形式之編輯
-
多引導物遞送。
| 分析之基因座 | 編輯劑 | 總RNA (ng) | C- 至-T % | C- 至-A/G % | 插入/ 缺失% | N | |||
| 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | ||||
| G015995 B2M | BC22n | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 1.5 | 0.2 | 0.2 | 0.0 | 2 |
| 8.6 | 27.3 | 0.2 | 3.8 | 0.1 | 2.6 | 0.1 | 2 | ||
| 17.2 | 47.2 | 2.2 | 4.1 | 0.4 | 3.0 | 0.1 | 2 | ||
| 34.4 | 61.2 | 3.0 | 3.9 | 0.1 | 2.6 | 0.3 | 2 | ||
| 68.8 | 81.4 | 0.1 | 2.9 | 0.1 | 1.4 | 0.1 | 2 | ||
| 137.5 | 90.0 | 1.1 | 2.6 | 0.3 | 1.3 | 0.5 | 2 | ||
| 275.0 | 94.7 | 0.1 | 2.2 | 0.1 | 0.8 | 0.0 | 2 | ||
| 550.0 | 95.9 | 0.9 | 2.9 | 1.0 | 0.4 | 0.3 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 1.4 | 0.1 | 0.2 | 0.0 | 2 | |
| 8.6 | 0.3 | 0.0 | 1.4 | 0.0 | 5.0 | 0.1 | 2 | ||
| 17.2 | 0.3 | 0.0 | 1.3 | 0.0 | 10.5 | 0.4 | 2 | ||
| 34.4 | 0.3 | 0.0 | 1.1 | 0.0 | 19.3 | 0.6 | 2 | ||
| 68.8 | 0.3 | 0.0 | 0.9 | 0.0 | 34.4 | 0.1 | 2 | ||
| 137.5 | 0.2 | 0.0 | 0.7 | 0.0 | 51.1 | 1.3 | 2 | ||
| 275.0 | 0.2 | 0.1 | 0.5 | 0.0 | 68.0 | 0.1 | 2 | ||
| 550.0 | 0.3 | 0.1 | 0.4 | 0.1 | 76.7 | 2.0 | 2 | ||
| G016017 TRAC | BC22n | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 1.9 | 0.6 | 0.2 | 0.0 | 2 |
| 8.6 | 12.1 | 1.3 | 4.3 | 0.2 | 2.4 | 0.2 | 2 | ||
| 17.2 | 25.7 | 2.2 | 4.2 | 0.5 | 3.8 | 0.7 | 2 | ||
| 34.4 | 44.7 | 1.4 | 4.7 | 1.0 | 3.0 | 0.3 | 2 | ||
| 68.8 | 64.2 | 1.9 | 4.4 | 0.6 | 2.5 | 0.1 | 2 | ||
| 137.5 | 79.3 | 1.1 | 3.6 | 0.4 | 2.1 | 0.1 | 2 | ||
| 275.0 | 90.7 | 0.0 | 3.0 | 0.1 | 1.5 | 0.0 | 2 | ||
| 550.0 | 93.3 | 0.6 | 2.4 | 0.1 | 0.9 | 0.4 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 2.1 | 0.2 | 0.1 | 0.0 | 2 | |
| 8.6 | 0.2 | 0.1 | 2.3 | 0.2 | 6.1 | 0.2 | 2 | ||
| 17.2 | 0.1 | 0.0 | 1.8 | 0.2 | 11.5 | 0.5 | 2 | ||
| 34.4 | 0.1 | 0.0 | 2.0 | 0.4 | 21.0 | 0.4 | 2 | ||
| 68.8 | 0.1 | 0.0 | 1.4 | 0.0 | 33.5 | 0.1 | 2 | ||
| 137.5 | 0.1 | 0.0 | 1.2 | 0.1 | 47.5 | 0.5 | 2 | ||
| 275.0 | 0.1 | 0.0 | 0.9 | 0.1 | 64.8 | 0.2 | 2 | ||
| 550.0 | 0.1 | 0.0 | 0.6 | 0.1 | 76.1 | 1.3 | 2 | ||
| G016206 TRBC1/2 | BC22n | 0.0 | 無資料 | ||||||
| 8.6 | 11.6 | 0.3 | 2.6 | 0.2 | 2.8 | 0.3 | 2 | ||
| 17.2 | 23.4 | 0.4 | 3.6 | 0.3 | 2.6 | 0.5 | 2 | ||
| 34.4 | 38.5 | 1.4 | 3.7 | 0.2 | 2.9 | 0.7 | 2 | ||
| 68.8 | 55.6 | 1.7 | 2.3 | 0.4 | 2.4 | 0.0 | 2 | ||
| 137.5 | 72.4 | 1.2 | 1.8 | 0.5 | 1.7 | 0.5 | 2 | ||
| 275.0 | 85.1 | 1.0 | 1.9 | 0.5 | 1.7 | 0.6 | 2 | ||
| 550.0 | 89.8 | 2.8 | 2.2 | 0.1 | 0.9 | 0.3 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 0.6 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 1 | |
| 8.6 | 0.2 | 0.1 | 0.7 | 0.1 | 2.3 | 0.3 | 2 | ||
| 17.2 | 0.3 | 0.0 | 0.7 | 0.3 | 4.2 | 0.4 | 2 | ||
| 34.4 | 0.1 | 0.0 | 0.5 | 0.1 | 6.6 | 0.5 | 2 | ||
| 68.8 | 0.4 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 12.3 | 0.0 | 1 | ||
| 137.5 | 0.2 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 17.8 | 0.0 | 1 | ||
| 275.0 | 0.1 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 33.0 | 0.0 | 1 | ||
| 550.0 | 0.3 | 0.2 | 0.3 | 0.0 | 43.3 | 1.7 | 2 | ||
| G018117 CIITA | BC22n | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 2.6 | 0.1 | 0.3 | 0.0 | 2 |
| 8.6 | 4.6 | 0.9 | 3.1 | 0.2 | 0.8 | 0.2 | 2 | ||
| 17.2 | 10.5 | 0.2 | 2.9 | 0.1 | 1.1 | 0.2 | 2 | ||
| 34.4 | 18.8 | 0.3 | 2.9 | 0.2 | 1.6 | 0.2 | 2 | ||
| 68.8 | 35.1 | 0.6 | 2.7 | 0.2 | 1.6 | 0.7 | 2 | ||
| 137.5 | 52.9 | 0.2 | 2.9 | 0.3 | 1.5 | 0.0 | 2 | ||
| 275.0 | 71.9 | 2.4 | 2.5 | 0.3 | 1.3 | 0.1 | 2 | ||
| 550.0 | 81.1 | 1.9 | 2.6 | 0.1 | 1.1 | 0.6 | 2 | ||
| Cas9 | 0.0 | 0.3 | 0.0 | 2.7 | 0.1 | 0.3 | 0.0 | 2 | |
| 8.6 | 0.2 | 0.0 | 2.6 | 0.2 | 1.4 | 0.0 | 2 | ||
| 17.2 | 0.2 | 0.0 | 2.5 | 0.0 | 2.1 | 0.3 | 2 | ||
| 34.4 | 0.3 | 0.0 | 2.5 | 0.0 | 3.9 | 0.1 | 2 | ||
| 68.8 | 0.2 | 0.0 | 2.5 | 0.2 | 7.7 | 0.6 | 2 | ||
| 137.5 | 0.2 | 0.0 | 2.2 | 0.1 | 13.3 | 0.2 | 2 | ||
| 275.0 | 0.1 | 0.0 | 1.9 | 0.0 | 26.7 | 1.3 | 2 | ||
| 550.0 | 0.1 | 0.0 | 1.7 | 0.1 | 42.3 | 0.3 | 2 |
活化後第10天，T細胞藉由流動式細胞測量術進行表型分型以測定編輯是否導致細胞表面蛋白損失。簡言之，將T細胞在以下抗體之混合物中培育：B2M-FITC (BioLegend，目錄號316304)、CD3-AF700 (BioLegend，目錄號317322)、HLA DR DQ DP-PE (BioLegend，目錄號361704)及DAPI (BioLegend，目錄號422801)。將一子組未編輯之細胞與同型對照-PE (BioLegend®目錄號400234)一起培育。隨後洗滌細胞，在Cytoflex儀器(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo套裝軟體進行分析。基於大小、形狀、活力及抗原表現圈選T細胞。
表 14及
圖 5A- 圖 5H將表型分型結果報導為對抗體結合呈陰性之細胞的百分比。BC22n及Cas9樣品兩者之抗原陰性細胞的百分比隨著總RNA增加而以劑量反應性方式增加。對於所有測試之引導物，相比於經Cas9編輯之細胞，經BC22n編輯之細胞展示類似或更高的蛋白質剔除。在多編輯細胞中，相比於Cas9與反式UGI，BC22n與反式UGI展示顯著更高百分比的抗原陰性細胞。舉例而言，在550 ng之最高總RNA劑量下之BC22n編輯樣品展示84.2%缺乏所有三種抗原之細胞，而Cas9編輯僅產生46.8%此類三重基因剔除細胞。對於僅用一個引導物處理之樣品，DNA編輯與抗原減少之間的相關性為穩定的。當比較C至T轉化與抗原剔除時，BC22n之R平方量測值為0.93。當比較插入/缺失與抗原剔除時，Cas9之R平方量測值為0.95。
表 14. 流動式細胞測量術資料 - 抗原陰性細胞百分比 (n=2) 。
實例7：NK細胞活體內殺滅小鼠模型中B2M基因剔除T細胞之HLA-E保護。
| 引導物 | 表型 | 總RNA (ng) | BC22n | Cas9 | ||
| 平均值% | SD | 平均值% | SD | |||
| G015995 B2M | B2M neg | 550.0 | 95.7 | 0.1 | 91.3 | 0.6 |
| 275.0 | 94.4 | 0.4 | 89.3 | 0.1 | ||
| 137.5 | 91.2 | 0.1 | 82.1 | 3.3 | ||
| 68.8 | 83.9 | 0.4 | 68.7 | 3.3 | ||
| 34.4 | 75.7 | 1.4 | 53.4 | 0.2 | ||
| 17.2 | 60.8 | 2.0 | 30.7 | 1.3 | ||
| 8.6 | 44.0 | 2.3 | 13.9 | 2.0 | ||
| 0.0 | 14.1 | 4.1 | 9.9 | 1.9 | ||
| G015995 G016017 G016206 G018117 | B2M neg | 550.0 | 94.4 | 0.1 | 74.2 | 0.4 |
| 275.0 | 91.3 | 0.1 | 65.2 | 0.1 | ||
| 137.5 | 84.3 | 0.2 | 45.4 | 1.9 | ||
| 68.8 | 72.7 | 0.4 | 24.5 | 0.8 | ||
| 34.4 | 56.2 | 1.2 | 14.1 | 2.3 | ||
| 17.2 | 38.5 | 0.2 | 9.9 | 0.8 | ||
| 8.6 | 20.6 | 0.7 | 7.6 | 2.4 | ||
| 0.0 | 14.1 | 4.1 | 9.9 | 1.9 | ||
| G016017 TRAC | CD3 neg | 550.0 | 97.3 | 0.3 | 94.8 | 0.4 |
| 275.0 | 96.0 | 0.2 | 87.0 | 4.9 | ||
| 137.5 | 91.9 | 0.2 | 72.7 | 0.9 | ||
| 68.8 | 85.7 | 0.5 | 65.6 | 0.1 | ||
| 34.4 | 76.6 | 0.8 | 51.7 | 3.0 | ||
| 17.2 | 61.8 | 1.7 | 35.7 | 1.1 | ||
| 8.6 | 42.1 | 0.7 | 20.1 | 1.5 | ||
| 0.0 | 1.0 | 0.1 | 0.9 | 0.1 | ||
| G016206 TRBC1/2 | CD3 neg | 550.0 | 97.9 | 0.1 | 86.6 | 0.3 |
| 275.0 | 96.0 | 0.1 | 77.3 | 0.1 | ||
| 137.5 | 90.4 | 0.8 | 59.4 | 0.4 | ||
| 68.8 | 82.9 | 0.1 | 40.6 | 1.2 | ||
| 34.4 | 71.9 | 1.5 | 27.0 | 1.6 | ||
| 17.2 | 53.4 | 0.3 | 16.1 | 0.1 | ||
| 8.6 | 32.6 | 0.6 | 7.9 | 0.4 | ||
| 0.0 | 0.8 | 0.0 | 0.9 | 0.4 | ||
| G015995 G016017 G016206 G018117 | CD3 neg | 550.0 | 98.3 | 0.2 | 84.2 | 0.1 |
| 275.0 | 96.3 | 0.1 | 74.6 | 0.5 | ||
| 137.5 | 90.4 | 0.3 | 57.4 | 1.0 | ||
| 68.8 | 81.3 | 0.3 | 39.4 | 0.1 | ||
| 34.4 | 66.3 | 1.6 | 25.6 | 0.8 | ||
| 17.2 | 48.2 | 1.0 | 15.3 | 0.5 | ||
| 8.6 | 27.3 | 0.7 | 8.6 | 0.5 | ||
| 0.0 | 0.9 | 0.1 | 0.9 | 0.2 | ||
| G018117 CIITA | HLA DR DP DQ neg | 550.0 | 95.7 | 0.4 | 72.0 | 0.1 |
| 275.0 | 92.5 | 1.1 | 65.6 | 0.4 | ||
| 137.5 | 85.2 | 0.6 | 55.5 | 0.6 | ||
| 68.8 | 74.5 | 1.1 | 48.9 | 0.0 | ||
| 34.4 | 65.8 | 3.7 | 40.7 | 0.6 | ||
| 17.2 | 49.9 | 0.1 | 36.2 | 0.6 | ||
| 8.6 | 41.6 | 0.8 | 34.2 | 1.3 | ||
| 0.0 | 30.1 | 1.6 | 35.2 | 0.4 | ||
| G015995 G016017 G016206 G018117 | HLA DR DP DQ neg | 550.0 | 88.0 | 0.2 | 52.8 | 1.1 |
| 275.0 | 81.2 | 0.2 | 46.4 | 0.4 | ||
| 137.5 | 70.4 | 1.3 | 39.9 | 1.8 | ||
| 68.8 | 60.0 | 0.4 | 39.1 | 3.3 | ||
| 34.4 | 48.8 | 0.6 | 37.7 | 2.9 | ||
| 17.2 | 43.0 | 4.2 | 37.5 | 0.6 | ||
| 8.6 | 37.8 | 2.1 | 35.0 | 0.0 | ||
| 0.0 | 33.0 | 1.9 | 37.3 | 2.1 | ||
| G015995 G016017 G016206 G018117 | B2M neg CD3 neg HLA DR DP DQ neg | 550.0 | 84.2 | 0.0 | 46.8 | 1.1 |
| 275.0 | 76.2 | 0.0 | 37.8 | 0.2 | ||
| 137.5 | 63.0 | 1.3 | 23.4 | 2.4 | ||
| 68.8 | 48.2 | 0.2 | 10.8 | 0.9 | ||
| 34.4 | 31.5 | 1.1 | 3.6 | 0.9 | ||
| 17.2 | 17.8 | 1.7 | 1.1 | 0.2 | ||
| 8.6 | 6.4 | 0.0 | 0.4 | 0.1 | ||
| 0.0 | 0.1 | 0.0 | 0.1 | 0.0 |
向雌性NOG-hIL-15小鼠移植1.5×10
6個原代NK細胞，接著注射含有螢光素酶+/- HLA-E之野生型T細胞或B2M基因剔除T細胞，以測試HLA-E保護注射之T細胞免受活體內NK細胞殺滅。
7.1. 螢光素酶及HLA-E慢病毒之順序感染。
此實例解釋含有螢光素酶+/- HLA-E之野生型或B2M
-/-T細胞的生產。電穿孔之野生型及B2M
-/-T細胞首先經螢光素酶慢病毒(Imanis Life Sciences；目錄號LV050L)感染。B2M
-/-T細胞隨後依序經HLA-E慢病毒(LVP112)感染。藉由在150μl螢光素酶慢病毒中感染1×10
6個細胞來進行螢光素酶感染，該慢病毒補充有350μl培養基編號18且在37℃下以1000XG離心60分鐘。在用HLA-E慢病毒對B2M
-/-HLA-E進行第二輪感染之前，將細胞在培養基編號2中靜置2小時，其後用含60 μl HLA-E病毒之440 μl培養基編號18感染1×10
6個細胞。WT螢光素酶
+T細胞及B2M
-/-螢光素酶
+細胞組未接受任何病毒，而是僅在培養基編號18中旋轉，以使不同組中之條件保持類似。感染後，將細胞再懸浮且在24孔G-Rex盤中合併為其指定組且引入至多7mL培養基編號19，如
表 3中所述。在培養物中每2天添加新鮮細胞介素。
7.2. 製備含有螢光素酶+/- HLA-E之野生型及B2M-/- T細胞。
自Stemcell Technologies接收新鮮的健康人類周邊血液白血球分離包，且將細胞再懸浮於PBS中且洗滌一次。接著將細胞集結粒再懸浮於氯化銨RBC溶解緩衝液(Stemcell Technologies；目錄號07800)中15分鐘，隨後用PBS洗滌。PBMC計數在溶解後測定，且根據製造商之方案使用EasySep人類T細胞分離套組(Stemcell Technologies，目錄號17951)進行T細胞分離。將分離之CD3+ T細胞再懸浮於Cryostor CS10培養基(Stemcell Technologies，目錄號07930)中且在液氮中冷凍，直至進一步使用。
7.3. T細胞中之sgRNA電穿孔。
使用引導物G000193 (100µM)、重組Cas9-NLS蛋白(50µM)及反應緩衝液(1×)調配RNP以進行B2M基因剔除。單一引導物G000193首先在95℃下變性2分鐘，接著在冰上冷卻10分鐘。在PCR管中將6µl 50µM Cas9與18µl 1×反應緩衝液及6µl變性G000193引導物混合，以使最終體積為30µl。如下地調配RNP：在25℃下培育10分鐘，接著置於冰上直至進一步使用。解凍後，CD3+T細胞以0.5×10
6個細胞/毫升之密度平盤培養於培養基編號19中，該培養基含有IL-2 (100U/ml)(Peprotech，目錄號200-02)、IL-7 (2.5ng/ml) (Stemcell；目錄號78053.1)及IL-15 (2.5ng/ml)(Stemcell；目錄號78031.1)。細胞用Transact (1:100稀釋，Miltenyi Biotec；目錄號130-111-160)刺激48小時。刺激後，將10×10
6個細胞離心且再懸浮於80 μl P3電穿孔緩衝液(Lonza；目錄號V4XP-3024)中，接著添加25µl RNP且使用脈衝碼為EO-115之Lonza電穿孔器在比色管中進行電穿孔。野生型T細胞僅在P3緩衝液中進行模擬電穿孔之類似過程。
7.4. 製備經純化之螢光素酶+、HLA-E+、I類MHC-T細胞。
在感染後第7天，收集細胞且用FACS緩衝液洗滌且使用Human Tru Stain Fc Block (Biolegend)阻斷5分鐘，接著用抗人類MHC-I APC抗體(純系編號W6/，Biolegend)單獨染色或與抗人類HLA-E BV421抗體(純系編號3D12，Biolegend)共染色30分鐘。針對WT螢光素酶
+T細胞、B2M
-/-螢光素酶
+T細胞及B2M
-/-HLA-E
+螢光素酶
+T細胞，使用BD FACS Aria分別對僅GFP
+、GFP
+/MHC-I
-、GFP
+/MHC-I
-/HLA-E
+進行圈選來分選細胞。收集之細胞經洗滌且再懸浮於中培養基編號19中，且轉移至6孔G-Rex。細胞用1:100稀釋之另一輪Transact刺激48小時。刺激48小時後，經刺激之T細胞洗掉Transact且再懸浮於中培養基編號19中，且在每2天添加新鮮細胞介素之G-Rex盤中培養。
7.5. 製備注射用T細胞。
在第二次刺激後10天，在用PBS洗滌且再懸浮於用於向NOG-IL15小鼠注射之HBSS溶液中之後，注射T細胞。
7.6. HLA-E對活體內B2M基因剔除T細胞之保護作用。
NK細胞用HBSS (Gibco，目錄號14025-092)洗滌且以10×10
6個細胞/毫升再懸浮，以便以150 µL注射。小鼠最初分成兩組：(1)未注射之NOG/IL-15小鼠，對照組(n=1)；及(2) 150萬個原代NK細胞(n=2)。額外六組接受以下治療：(3)僅野生型T細胞(n=4)；(4)僅B2M
-/-T細胞(n=4)；(5)僅B2M
-/-HLA-E T細胞(n=4)，(6) 150萬個原代NK細胞+野生型T細胞(n=5)；(7) 150萬個原代NK細胞+B2M
-/-T細胞(n = 5)；及(8) 150萬個原代NK細胞+B2M
-/-HLA-E T細胞(n=5)。用27號針經由尾部靜脈注射NK細胞溶液。
小鼠在NK細胞注射後28天接種野生型、B2M
-/-或B2M
-/-+ HLA-E T細胞。以6×10
6個細胞/150 µL體積之濃度製備細胞。
進行IVIS成像以藉由IVIS光譜鑑定螢光素酶陽性T細胞。在T細胞注射之後6小時、24小時、48小時、4天、6天、8天、11天、18天、25天、29天、33天、50天、55天、61天、74天及90天進行IVIS成像。根據製造商之建議，藉由以10 µL /g體重，每隻動物約150 µL腹膜內注射D-螢光素使小鼠準備進行成像。動物經麻醉且接著置於IVIS成像單元中。可視化係在曝光時間設定為自動、視野D、中等分格及F/stop設定為1之情況下進行的。
圖 9A展示在T細胞注射後90天，HLA-E保護B2M KO T細胞免受NK細胞溶解。
圖 9B展示在T細胞注射後90天時程內，HLA-E保護B2M KO T細胞免受NK細胞侵害。
圖 9C展示HLA-E在重複研究之30天時程內之保護作用。
實例8：類淋巴母細胞細胞株中之CIITA編輯。
包含CIITA引導RNA之脂質奈米粒子(LNP)用於編輯兩種類淋巴母細胞細胞株(LCL)。LCL係藉由用埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus，EBV)感染來自人類供體之周邊血液淋巴球(PBL)而產生。已證明此過程在活體外永生化人類靜息B細胞，從而產生增殖活躍的B細胞群體，該群體對B細胞標記CD19呈陽性且對T細胞標記CD3以及NK細胞標記CD56呈陰性(Neitzel H. A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum Genet. 1986;73(4):320-6)。
類淋巴母細胞細胞株GM26200及GM20340係獲自Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ, USA)。LCL在具有L-麩醯胺酸及15% FBS之RPMI-1640中生長。在LNP接觸時，細胞經4 ng/ml IL-4 (R&D System目錄號204-IL-010)、1 ng/mL IL-40 (R&D System目錄號6245-CL-050)、25 ng/ml BAFF (R&D System目錄號2149-BF-010)活化。靶向B2M之LNP以50/10/38.5/1.5可離子化脂質B、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG之比調配，如
實例 1.3中所述。靶向ATTR之LNP以莫耳比分別為50:38.5:9:3之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。用Cas9 mRNA及CIITA gRNA調配之LNP在37℃下與食蟹獼猴(
M. fascicularis/cynomolgus monkey)血清(BioReclamationIVT，目錄號CYN197452)一起以6% (v/v)預培育約5分鐘，遞送至類淋巴母細胞。LNP處理後六天，收集一半細胞用於NGS定序，且在一天後收集另一半細胞用於流動式細胞測量術分析。根據以下進行NGS分析：根據製造商之方案，使用基因體DNA，該基因體DNA使用QuickExtract™ DNA Extraction Solution (Lucigen，目錄號QE09050)提取。
如同
實例 1.1進行NGS分析。
進行流動式細胞測量術。對於流動式細胞測量術分析，將細胞在FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA)中洗滌。接著將細胞在室溫(RT)下用Human TruStain FcX (Biolegend®目錄號422302)阻斷5分鐘，且在4℃下與1:200稀釋之APC或PE結合抗體一起培育30分鐘。培育後，細胞經洗滌且再懸浮於含有live-dead標記7AAD (1:1000稀釋；Biolegend
®目錄號420404)之緩衝液中。細胞藉由流動式細胞測量術，例如使用Beckman Coulter CytoflexS™處理，且使用FlowJo™套裝軟體進行分析。
實例9. CIITA、B2M及TRAC基因編輯後染色體易位之定向基因體雜交分析
藉由用KromaTiD (Longmont, CO)進行之定向基因體雜交(dGH™)對用電穿孔或脂質奈米粒子(LNP)處理以遞送Cas9 mRNA及sgRNA之T細胞分析染色體結構變化，包括易位。
9.1. 電穿孔處理。
關於電穿孔處理，如下地分離及冷凍保存T細胞：商業上獲得T細胞(例如人類周邊血液CD4
+CD45RA
+T細胞，冷凍，Stem Cell Technology，目錄號70029)或自白血球採集物內部製備T細胞。對於內部製備，藉由陰性選擇使用EasySep人類T細胞分離套組(Stem Cell Technology，目錄號17951)遵循製造商之方案分離T細胞。將T細胞冷凍保存於Cryostor® CS10冷凍培養基(目錄號07930)中以供將來使用。冷凍保存之T細胞經解凍且在如
表 3中所述之培養基編號1中靜置隔夜。
靜置之T細胞經電穿孔以遞送核糖核蛋白(RNP)複合物，其含有分別靶向CIITA及B2M基因之引導物G013674 (SEQ ID NO: 702)或G000529(SEQ ID NO: 701)。簡言之，藉由培育重組Cas9-NLS蛋白(50 µM儲備液)與sgRNA (100 µM)至20 µM Cas9與40 µM sgRNA (1:2 Cas9蛋白與引導物比率)之最終濃度來製備儲備RNP。培養之T細胞以1×10
6個細胞收集，再懸浮於100 µL緩衝液P3 (Lonza，目錄號V4SP-3960)中且與12.5 µL RNP一起培育至各2 µM之最終濃度。隨後使用Lonza 4D-Nucleofector™5對T細胞進行電穿孔。收集電穿孔之細胞且在如
表 3中所述之培養基編號1中靜置48小時。隨後，收集T細胞，將其在如
表 3中所述之培養基編號1中再懸浮至1×10
6個細胞/毫升之密度，且用1/100稀釋度之T細胞TransAct™試劑(Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160)活化。T細胞活化後四十八小時，如上文所述用包括靶向TRAC之G012086 (SEQ ID NO: 703)的Cas9-RNP對T細胞進行電穿孔。將三重編輯之T細胞重新轉移至如
表 3中所述之培養基編號1且擴增以供將來分析。
擴增後，細胞穿過磁性活化細胞分選(MACS)耗竭過程，以根據製造商之方案使用抗生物素微珠(Miltenyi Biotec，目錄號130-090-485)方案針對I類MHC (Miltenyi Biotec，目錄號130-120-431)、II類MHC (Miltenyi Biotec，130-104-823)及CD3-生物素(Miltenyi Biotec，目錄號130-098-612)選擇三重剔除細胞。收集陰性選擇之細胞用於流動式細胞測量術分析及NGS分析。
實例 3.3及
1.1中所述之方案用於此等分析。
9.2. 依序及同時LNP處理。
對於LNP處理，如同
實例 3.1地分離及冷凍保存T細胞。解凍後，T細胞用製造商之方案所推薦的T細胞TransAct™ (Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160)活化，且在37℃下培養24-72小時，如下文所規定。
對於同時LNP處理，T細胞在活化後72小時用三種LNP處理，該等LNP遞送編碼Cas9之mRNA (SEQ ID NO: 809)及分別靶向B2M、TRAC及CIITA之sgRNA G000529 (SEQ ID NO: 701)、G012086 (SEQ ID NO: 703)及G013674 (SEQ ID NO: 702)。將LNP在37℃下與食蟹獼猴血清一起預培育5分鐘且以每100,000個T細胞100 ng總RNA承載物給藥。在24小時LNP暴露之後，細胞經洗滌且再懸浮於如
表 3中所述之培養基編號11中，且在37℃下培養5天。
對於依序LNP處理，T細胞在活化後24小時用單一LNP處理，該LNP遞送編碼Cas9之mRNA (SEQ ID NO: 809)及靶向B2M之G000529 (SEQ ID NO: 701)，如上文針對同時LNP處理所描述。在洗滌及再懸浮之後，在活化後48小時添加單一LNP，該LNP遞送編碼Cas9之mRNA (SEQ ID NO: 809)及靶向CIITA之G013674 (SEQ ID NO: 702)。最後，在洗滌及再懸浮之後，在活化後72小時添加單一LNP，該LNP遞送編碼Cas9之mRNA (SEQ ID NO: 809)及靶向TRAC之G012086 (SEQ ID NO: 703)。在暴露於最終LNP 24小時之後，細胞經洗滌且再懸浮於如
表 3中所述之培養基編號11中，且在37℃下培養5天。
LNP處理之T細胞穿過MACS三陰性選擇過程且對此等樣品進行進一步流動式細胞測量術分析(如
實例 3.2中所述)及NGS分析(如
實例 1.1中所述)，如針對電穿孔細胞所描述。
在MACS處理之前及之後，藉由NGS來分析經處理及未經處理之細胞的編輯百分比(如
實例 1.1中所述)，且藉由流動式細胞測量術分析其蛋白質表現(如
實例 3.3中所述)。以下流動式細胞測量術試劑分別用作B2M、CIITA及TRAC之基因編輯的表型讀數：FITC抗人類β2-微球蛋白抗體(Biolegend®，目錄號316304)、APC抗人類CD3抗體(Biolegend®，目錄號300412)、PE抗人類HLA-DR、DP、DQ抗體(Biolegend®，目錄號361716)。NGS編輯結果顯示於
表 15及
圖 10A(在MAC之前)、
圖 10B(在MAC之後)中。流動式細胞測量術結果顯示於
表 16及
圖 11A(在MAC之前)、
圖 11B(在MAC之後)中。
表
15.
藉由
NGS
之
編輯分析。
| 條件 | B2M % 編輯 | CIITA % 編輯 | TRAC % 編輯 | |||
| MACS | 之前 | 之後 | 之前 | 之後 | 之前 | 之後 |
| 未處理 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.1 |
| 同時LNP | 97.3 | 99.3 | 96.5 | 98.2 | 97.3 | 98.6 |
| 依序LNP | 97.0 | 99.4 | 99.6 | 99.8 | 98.2 | 98.5 |
| RNP EP | 98.0 | 99.1 | 98.7 | 99.4 | 96.7 | 99.4 |
表 16. 流動式細胞測量術分析。
9.3. 用於染色體結構重排之Kromatid dGH™分析。
| 條件 | B2M % 陰性 | II 類MHC % 陰性 | CD3 % 陰性 | |||
| MACS | 之前 | 之後 | 之前 | 之後 | 之前 | 之後 |
| 未處理 | 0.2 | 0.2 | 29.4 | 32.8 | 0.3 | 0.2 |
| 同時LNP | 87.9 | 98.4 | 56.5 | 95.0 | 91.7 | 98.3 |
| 依序LNP | 93.2 | 97.6 | 67.0 | 91.8 | 89.0 | 97.6 |
| RNP EP | 85.4 | 99.9 | 59.6 | 89.4 | 93.1 | 100 |
根據KromaTiD之方案製備工程化T細胞用於dGH程序。簡言之，在添加KromaTiD提供之5 µM BrdU及1 µM BrdC的情況下，將T細胞培養17小時。以10 µl/ml之濃度添加乙醯甲基秋水仙素(Colcemid)後再維持4小時。藉由離心收集細胞，在室溫下在75 mM KCl低滲溶液中培育30分鐘，且在3:1甲醇:乙酸溶液中固定。
三組螢光原位雜交(FISH)探針經設計以將用於工程化此等T細胞之引導物的基因體目標位點括在一起，該等T細胞位於獨立染色體上。KromaTiD使用其專有的dGH FISH對每個樣品之200個中期擴散進行成像，且對染色體結構重排之擴散進行評分。無染色體結構重排之細胞展示3對顏色匹配、相鄰的FISH信號。當在細胞中鑑別出目標位點之FISH信號為零時，對「缺失」進行評分，表明染色體重排，其中片段在細胞複製週期中由於編輯事件的發生而丟失。對於各對相鄰、顏色不匹配的FISH信號進行「相互易位」評分，表明兩個Cas9靶向分裂之間(例如B2M與TRAC目標位點之間)的易位。「脫靶染色體易位」展示單一FISH信號，表明Cas9靶向裂解位點與未標記染色體位點之間的融合。
「複雜易位」指示FISH信號不包括於相互易位及脫靶位點易位中。總易位計算為相互易位、基因體中之脫靶染色體/位點易位及複雜易位的總和。
表 17及
圖 12展示藉由此方法針對各條件鑑別之染色體重排。
表 17. 藉由 Kromatid dGH 分析之易位分析。
實例10：脫靶分析 10.1. 生物化學脫靶分析。
| 染色體重排事件： | 未處理 | 依序LNP | 同時LNP | RNP EP |
| 總易位 | 1 | 0 | 7 | 13 |
| 相互易位 | 0 | 0 | 2 | 3 |
| 脫靶染色體易位 | 1 | 0 | 3 | 9 |
| 複雜易位 | 0 | 0 | 2 | 1 |
| 缺失 | 0 | 8 | 6 | 30 |
生物化學方法(參見例如Cameron等人,
Nature Methods. 6, 600-606; 2017)用於使用靶向
CIITA之特定引導物來確定由Cas9裂解之潛在脫靶基因體位點。在此實驗中，使用自淋巴母細胞細胞株NA24385 (Coriell Institute)純化之基因體DNA以及具有已知脫靶特徵之三個對照引導物篩選了兩種靶向人類CIITA之sgRNA。在生物化學分析中使用192 nM及64 nM之引導物濃度偵測到的潛在脫靶位點數目展示於
表 18中。
表 18 ： 生物化學脫靶分析。
10.2. 用於驗證潛在脫靶位點之靶向定序。
| SEQ ID NO: | 靶標 | 位點數目 | |
| 71 | G018091 | CIITA | 603 |
| 80 | G018100 | CIITA | 291 |
| 100 | G018120 | CIITA | 203 |
| 707 | G000644 | EMX1 | 440 |
| 708 | G000645 | VEGFA | 6384 |
| 709 | G000646 | RAG1B | 144 |
| SEQ ID NO: | 靶標 | 位點數目 | |
| 14 | G018034 | CIITA | 14 |
| 15 | G018035 | CIITA | 3 |
| 58 | G018078 | CIITA | 49 |
| 61 | G018081 | CIITA | 9 |
| 62 | G018082 | CIITA | 23 |
| 66 | G018086 | CIITA | 353 |
| 81 | G018101 | CIITA | 13 |
| 84 | G018104 | CIITA | 38 |
| 85 | G018105 | CIITA | 93 |
| 87 | G018107 | CIITA | 36 |
| 88 | G018108 | CIITA | 56 |
| 89 | G018109 | CIITA | 73 |
| 707 | G000644 | EMX1 | 276 |
| 708 | G000645 | VEGFA | 3259 |
| 709 | G000646 | RAG1B | 32 |
藉由偵測分析，諸如上文所用之生物化學方法預測之潛在脫靶位點可使用鑑別之潛在脫靶位點的靶向定序來評估，以確定是否偵測到該位點處之脫靶裂解。
在一種方法中，將所關注之Cas9及sgRNA (例如用於評估之具有潛在脫靶位點之sgRNA)引入至初級T細胞中。接著將T細胞溶解且使用側接潛在脫靶位點之引子產生用於NGS分析之擴增子。某一水準之插入/缺失之鑑別可驗證潛在脫靶位點，而在潛在脫靶位點發現之插入/缺失之缺乏可表明所用脫靶預測分析之假陽性。
實例11：藉由BC22n在T細胞中進行之CIITA引導RNA篩選
使用C至T鹼基編輯篩選不同sgRNA在人類T細胞中剔除CIITA基因之效力。在用mRNA及不同sgRNA電穿孔之後的CIITA編輯後，分析了對II類MHC及/或CD74蛋白表現呈陰性之T細胞的百分比。
11.1 T細胞製備
健康人類供體血球分離術為商業上獲得的(Hemacare)，且細胞經洗滌且再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中進行處理。使用Straight from Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組，人類(Miltenyi Biotec目錄號130-122-352)經由陽性選擇分離T細胞。T細胞經等分且在Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)中冷凍保存以供將來使用。
解凍後，將T細胞以1.0×10^6個細胞/毫升之密度平盤培養於由以下各者構成之T細胞生長培養基(TCGM)中：CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充物(ThermoFisher目錄號A1048501)、5%人類AB血清(GeminiBio，目錄號100-512)、1×青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES、200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)。T細胞在此培養基中靜置24小時，此時其經以1:100體積比添加之T Cell TransAct™，人類試劑(Miltenyi，目錄號130-111-160)活化。T細胞在電穿孔之前活化48小時。
11.2 藉由RNA電穿孔進行之T細胞編輯
在P3緩衝液中製備含有編碼BC22n (SEQ ID NO: 804或805)及UGI (SEQ ID NO: 807或808)之mRNA的溶液。將一百µM CIITA靶向sgRNA自其儲存盤中取出，且在95℃下變性2分鐘，且在室溫下培育5分鐘。活化後四十八小時，收集T細胞，離心，且以12.5×10^6個T細胞/毫升之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza)中。對於電穿孔，將1×10^5個T細胞與20 ng/µL BC22n mRNA、20 ng/µL UGI mRNA及20 pmol sgRNA (如表1中所述)在最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中混合。將此混合物一式兩份地轉移至96孔Nucleofector™盤中且使用製造商之脈衝碼電穿孔。經電穿孔之T細胞緊接著在不含細胞介素之80 µL CTS Optimizer T細胞生長培養基中靜置15分鐘，隨後轉移至含有額外80 µL補充有2X細胞介素之CTS Optimizer T細胞生長培養基的新平底96孔盤中。將所得盤在37℃下培育10天。在電穿孔後第4天，細胞在2個U形底盤中以1:2分裂。收集一個盤用於NGS定序，而另一個盤補充有含1X細胞介素之CTS Optimizer新鮮培養基。此盤在第7天用於流動式細胞測量術。
11.3 流動式細胞測量術及NGS定序
編輯後第7天，藉由流動式細胞測量術分析T細胞以測定CD74及HLA-DR、DP、DQ之表面表現。簡言之，將T細胞與在細胞染色緩衝液(BioLegend，目錄號420201)中稀釋之抗體的混合物一起在4℃下培育30分鐘。針對CD3 (BioLegend，目錄號317336)、CD4 (BioLegend，目錄號317434)、CD8 (BioLegend，目錄號301046)及Viakrome (Beckman Coulter，目錄號C36628)之抗體以1:100稀釋，且針對HLA II-DR (BioLegend，目錄號327018)、HLA II-DP (BD Biosciences，目錄號750872)、HLA II-DQ (BioLegend，目錄號561504)及CD74 (BioLegend，目錄號326808)之抗體以1:50稀釋。隨後洗滌細胞，再懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中且在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上進行處理。使用FlowJo套裝軟體分析流動式細胞測量術資料。基於大小、形狀、活力、CD8、HLA II-DP、HLA II-DQ、HLA II-DR及CD74表現圈選T細胞。
表 19 ： 用 BC22n 對 CIITA 進行基因體編輯後對表面蛋白呈陰性之細胞的百分比。 (n=2)
| 引導物ID | %HLA II-DP- | %HLA II-DQ- | %HLA II-DR- | %CD74- | ||||
| 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | |
| G000502 | 68.70 | 3.54 | 76.30 | 4.24 | 76.70 | 3.96 | 66.25 | 5.87 |
| G018021 | 76.60 | 0.99 | 84.00 | 0.57 | 84.65 | 0.49 | 76.85 | 0.07 |
| G018022 | 60.00 | 3.39 | 72.20 | 1.13 | 73.25 | 1.34 | 60.35 | 2.62 |
| G018023 | 64.80 | 2.97 | 74.35 | 0.07 | 75.85 | 0.35 | 63.85 | 2.33 |
| G018024 | 64.10 | 1.70 | 74.80 | 1.84 | 74.90 | 1.98 | 63.75 | 4.03 |
| G018025 | 63.85 | 6.15 | 73.50 | 6.08 | 74.90 | 6.36 | 63.75 | 6.72 |
| G018026 | 72.15 | 4.17 | 81.35 | 0.92 | 82.55 | 1.48 | 73.00 | 0.71 |
| G018027 | 82.40 | 0.99 | 81.45 | 1.91 | 82.40 | 2.26 | 72.35 | 3.32 |
| G018028 | 78.25 | 0.49 | 78.40 | 0.00 | 80.05 | 0.49 | 67.90 | 2.40 |
| G018029 | 75.60 | 3.11 | 74.80 | 0.14 | 76.95 | 0.07 | 64.15 | 2.05 |
| G018030 | 76.70 | 1.56 | 76.35 | 3.46 | 77.80 | 3.54 | 66.65 | 5.44 |
| G018031 | 81.40 | 3.96 | 84.00 | 1.13 | 82.40 | 0.42 | 75.55 | 0.49 |
| G018032 | 77.00 | 2.97 | 79.70 | 0.14 | 79.30 | 0.42 | 70.35 | 0.92 |
| G018033 | 81.15 | 3.04 | 82.05 | 0.35 | 81.60 | 0.57 | 73.20 | 1.27 |
| G018034 | 96.87 | 0.43 | 93.49 | 0.88 | 92.67 | 0.99 | 92.96 | 1.63 |
| G018035 | 94.39 | 0.64 | 88.20 | 1.13 | 88.64 | 2.03 | 83.70 | 2.97 |
| G018036 | 73.80 | 0.28 | 76.45 | 2.19 | 77.55 | 2.90 | 65.30 | 3.82 |
| G018037 | 71.80 | 0.14 | 72.25 | 5.16 | 73.85 | 5.73 | 61.40 | 7.64 |
| G018038 | 70.25 | 7.85 | 74.95 | 1.06 | 75.65 | 2.05 | 63.65 | 2.62 |
| G018039 | 94.72 | 0.49 | 91.67 | 0.05 | 91.17 | 0.51 | 89.20 | 0.99 |
| G018040 | 77.30 | 1.13 | 81.70 | 0.42 | 81.60 | 0.57 | 72.35 | 0.64 |
| G018041 | 75.10 | 1.70 | 80.15 | 0.35 | 80.15 | 0.21 | 70.50 | 0.85 |
| G018042 | 89.35 | 0.49 | 86.60 | 0.14 | 87.90 | 0.14 | 80.50 | 0.00 |
| G018043 | 85.50 | 1.13 | 84.00 | 1.56 | 84.95 | 0.35 | 77.55 | 0.64 |
| G018044 | 88.20 | 0.99 | 89.01 | 1.57 | 89.25 | 0.78 | 83.95 | 2.19 |
| G018045 | 76.15 | 1.34 | 82.35 | 2.33 | 81.60 | 2.26 | 72.50 | 3.25 |
| G018046 | 87.20 | 0.42 | 88.65 | 0.21 | 89.00 | 0.57 | 82.80 | 1.27 |
| G018047 | 79.95 | 1.63 | 84.60 | 2.12 | 84.25 | 2.76 | 76.25 | 3.61 |
| G018048 | 88.50 | 2.12 | 88.00 | 1.13 | 89.50 | 0.42 | 81.60 | 0.14 |
| G018049 | 81.40 | 3.25 | 81.40 | 4.24 | 82.60 | 5.23 | 74.00 | 5.66 |
| G018050 | 77.75 | 0.49 | 78.60 | 0.85 | 80.85 | 0.07 | 70.25 | 0.35 |
| G018051 | 81.20 | 1.56 | 81.95 | 1.48 | 84.20 | 1.13 | 73.55 | 3.04 |
| G018052 | 76.30 | 1.56 | 81.70 | 1.27 | 81.10 | 1.56 | 70.90 | 2.69 |
| G018053 | 77.25 | 1.06 | 81.40 | 0.85 | 82.35 | 1.06 | 71.55 | 1.63 |
| G018054 | 90.23 | 0.14 | 89.00 | 0.99 | 89.25 | 0.64 | 84.50 | 0.28 |
| G018055 | 73.80 | 3.39 | 79.20 | 0.99 | 79.85 | 1.06 | 67.80 | 1.41 |
| G018056 | 73.40 | 2.97 | 83.15 | 0.35 | 83.15 | 0.78 | 73.15 | 0.78 |
| G018057 | 73.95 | 1.63 | 81.40 | 2.97 | 81.45 | 1.91 | 71.30 | 3.11 |
| G018058 | 73.40 | 3.25 | 80.90 | 0.99 | 81.05 | 0.07 | 69.15 | 0.35 |
| G018059 | 75.15 | 4.17 | 81.70 | 0.14 | 81.55 | 0.07 | 71.10 | 1.13 |
| G018060 | 75.90 | 2.69 | 81.30 | 0.28 | 81.55 | 0.78 | 72.05 | 1.91 |
| G018061 | 71.65 | 2.05 | 81.60 | 1.41 | 80.65 | 1.06 | 72.00 | 1.41 |
| G018062 | 70.75 | 2.33 | 75.05 | 0.64 | 76.30 | 1.56 | 64.65 | 2.33 |
| G018063 | 78.45 | 0.92 | 80.95 | 0.92 | 82.20 | 0.85 | 72.50 | 0.14 |
| G018064 | 76.15 | 0.78 | 82.50 | 0.00 | 82.90 | 0.28 | 73.90 | 0.28 |
| G018065 | 77.65 | 0.21 | 82.60 | 0.42 | 83.85 | 0.35 | 74.05 | 0.07 |
| G018066 | 72.60 | 0.00 | 82.30 | 0.28 | 83.05 | 0.64 | 73.60 | 0.14 |
| G018067 | 97.57 | 0.81 | 98.24 | 0.19 | 97.73 | 0.28 | 98.83 | 0.04 |
| G018068 | 89.05 | 0.64 | 90.79 | 0.52 | 90.81 | 1.02 | 87.20 | 1.27 |
| G018069 | 75.90 | 2.55 | 81.55 | 0.92 | 82.15 | 0.35 | 71.85 | 1.20 |
| G018070 | 75.30 | 1.27 | 82.05 | 1.20 | 82.15 | 0.64 | 71.20 | 0.42 |
| G018071 | 77.40 | 3.39 | 83.35 | 1.77 | 84.75 | 1.91 | 74.65 | 0.92 |
| G018072 | 72.05 | 1.63 | 81.45 | 0.78 | 81.95 | 1.91 | 71.95 | 2.62 |
| G018073 | 72.35 | 0.07 | 79.30 | 1.13 | 79.25 | 2.19 | 69.40 | 2.26 |
| G018074 | 67.25 | 2.05 | 75.25 | 0.49 | 76.40 | 0.57 | 64.35 | 0.35 |
| G018075 | 96.86 | 1.46 | 97.33 | 0.14 | 96.08 | 0.31 | 98.35 | 0.04 |
| G018076 | 94.26 | 4.87 | 97.96 | 0.21 | 97.57 | 0.15 | 98.55 | 0.06 |
| G018077 | 74.75 | 2.76 | 81.65 | 0.35 | 82.25 | 0.21 | 72.25 | 1.34 |
| G018078 | 94.30 | 0.48 | 94.87 | 0.31 | 95.03 | 0.06 | 93.43 | 0.24 |
| G018079 | 86.00 | 1.56 | 89.55 | 0.35 | 89.80 | 0.28 | 84.25 | 0.78 |
| G018080 | 80.50 | 3.96 | 85.50 | 1.70 | 85.45 | 1.63 | 78.35 | 0.78 |
| G018081 | 79.85 | 1.06 | 86.05 | 1.20 | 86.00 | 0.85 | 78.70 | 0.57 |
| G018082 | 80.10 | 0.14 | 83.10 | 0.42 | 84.05 | 1.20 | 75.65 | 1.91 |
| G018083 | 86.75 | 1.34 | 89.50 | 0.28 | 89.35 | 0.21 | 84.55 | 0.21 |
| G018084 | 84.60 | 3.25 | 87.35 | 1.34 | 87.95 | 0.92 | 82.00 | 1.27 |
| G018085 | 86.95 | 2.76 | 90.35 | 2.05 | 90.03 | 1.03 | 86.30 | 2.26 |
| G018086 | 68.15 | 1.34 | 78.60 | 0.42 | 75.95 | 0.07 | 66.25 | 0.92 |
| G018087 | 61.40 | 2.26 | 74.35 | 2.33 | 72.65 | 2.62 | 61.85 | 1.63 |
| G018088 | 88.80 | 0.85 | 91.11 | 0.28 | 91.88 | 0.11 | 87.60 | 1.41 |
| G018089 | 81.75 | 4.17 | 89.00 | 1.83 | 89.28 | 1.53 | 83.75 | 1.77 |
| G018090 | 81.65 | 1.20 | 90.11 | 0.29 | 89.98 | 0.25 | 85.35 | 1.34 |
| G018091 | 97.02 | 0.49 | 98.63 | 0.03 | 98.15 | 0.12 | 98.98 | 0.08 |
| G018092 | 71.40 | 5.23 | 81.90 | 0.71 | 82.40 | 0.85 | 73.45 | 0.92 |
| G018093 | 94.15 | 1.20 | 96.36 | 0.21 | 96.36 | 0.02 | 95.70 | 0.18 |
| G018094 | 77.50 | 2.12 | 84.55 | 1.63 | 85.25 | 1.48 | 76.50 | 0.14 |
| G018095 | 69.50 | 0.00 | 83.05 | 0.07 | 82.70 | 0.14 | 73.90 | 0.99 |
| G018096 | 69.25 | 0.21 | 83.50 | 0.99 | 83.45 | 1.06 | 75.25 | 2.05 |
| G018097 | 68.55 | 4.74 | 81.60 | 2.83 | 82.20 | 1.84 | 73.25 | 3.75 |
| G018098 | 66.65 | 0.21 | 78.85 | 0.21 | 79.75 | 0.21 | 68.75 | 1.20 |
| G018099 | 65.05 | 3.18 | 73.70 | 4.95 | 74.55 | 4.31 | 62.40 | 4.53 |
| G018100 | 95.51 | 0.40 | 95.99 | 0.19 | 95.62 | 0.92 | 96.21 | 0.18 |
| G018101 | 93.00 | 0.33 | 93.70 | 0.01 | 94.03 | 0.25 | 93.11 | 0.28 |
| G018102 | 96.55 | 0.33 | 96.31 | 0.64 | 96.34 | 0.08 | 96.58 | 0.08 |
| G018103 | 96.92 | 1.46 | 97.58 | 0.02 | 97.53 | 0.08 | 98.36 | 0.40 |
| G018104 | 72.00 | 0.99 | 82.45 | 2.19 | 82.70 | 1.84 | 73.40 | 2.12 |
| G018105 | 71.60 | 1.98 | 82.20 | 0.71 | 81.80 | 0.28 | 73.30 | 0.00 |
| G018106 | 92.49 | 1.33 | 98.62 | 0.06 | 97.03 | 0.43 | 98.96 | 0.04 |
| G018107 | 96.55 | 1.25 | 98.14 | 0.56 | 97.53 | 0.70 | 98.98 | 0.08 |
| G018108 | 85.50 | 0.42 | 88.00 | 0.71 | 89.35 | 0.92 | 83.40 | 1.56 |
| G018109 | 84.10 | 1.56 | 84.55 | 2.19 | 86.90 | 1.27 | 79.75 | 3.32 |
| G018110 | 67.65 | 3.04 | 75.15 | 0.49 | 77.50 | 0.99 | 65.35 | 1.48 |
| G018111 | 96.49 | 0.35 | 96.85 | 1.05 | 95.24 | 1.32 | 97.03 | 0.52 |
| G018112 | 68.60 | 5.09 | 76.65 | 4.88 | 77.30 | 4.53 | 66.60 | 4.38 |
| G018113 | 72.75 | 3.89 | 79.60 | 3.54 | 80.15 | 2.76 | 70.30 | 3.96 |
| G018114 | 70.80 | 2.26 | 80.05 | 2.47 | 81.25 | 1.77 | 71.65 | 2.62 |
| G018115 | 62.40 | 1.41 | 77.40 | 0.57 | 76.90 | 1.27 | 67.00 | 1.56 |
| G018116 | 96.05 | 0.89 | 98.01 | 0.39 | 96.99 | 0.42 | 98.32 | 0.21 |
| G018117 | 96.93 | 1.27 | 97.63 | 0.52 | 97.19 | 0.87 | 98.96 | 0.25 |
| G018118 | 97.25 | 0.51 | 97.71 | 0.25 | 96.94 | 0.44 | 98.91 | 0.26 |
| G018119 | 94.78 | 1.02 | 96.29 | 1.11 | 95.57 | 1.05 | 97.00 | 1.20 |
| G018120 | 96.04 | 1.87 | 97.61 | 0.06 | 97.42 | 0.56 | 98.94 | 0.07 |
| G018121 | 95.26 | 0.62 | 97.12 | 0.41 | 96.44 | 0.23 | 97.85 | 0.45 |
在編輯後第4天，對DNA樣品進行PCR及後續NGS分析，如實例1中所述。表20展示用BC22n編輯之T細胞中之CIITA編輯結果。
表 20 ： 在 CIITA 基因座處用 BC22n 之 平均編輯百分比。 (n=2)
實例12：在T細胞中篩選與BC22n呈劑量-反應之CIITA sgRNA
| 引導物ID | %C 至T | %C 至A/G | % 插入/ 缺失 | |||
| 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | |
| G000502 | 84.63 | 2.39 | 0.82 | 0.19 | 1.26 | 0.37 |
| G018021 | 91.14 | 2.38 | 2.45 | 0.52 | 3.22 | 2.60 |
| G018022 | 93.68 | 3.27 | 1.83 | 0.33 | 1.46 | 0.10 |
| G018023 | 92.37 | 1.73 | 2.25 | 0.07 | 2.31 | 0.52 |
| G018024 | 96.06 | 1.54 | 0.41 | 0.37 | 0.97 | 0.07 |
| G018025 | 96.88 | 0.78 | 0.63 | 0.12 | 0.43 | 0.06 |
| G018026 | 89.15 | 1.37 | 1.66 | 0.04 | 7.20 | 1.31 |
| G018027 | 88.89 | 3.13 | 1.02 | 0.04 | 5.37 | 2.62 |
| G018028 | 91.28 | 2.09 | 0.59 | 0.24 | 2.96 | 2.02 |
| G018029 | 22.86 | 0.72 | 0.43 | 0.07 | 0.17 | 0.02 |
| G018030 | 79.89 | 2.66 | 0.36 | 0.51 | 0.18 | 0.25 |
| G018031 | 90.43 | 1.35 | 0.47 | 0.38 | 1.52 | 0.07 |
| G018032 | 64.78 | 2.64 | 1.39 | 0.69 | 1.06 | 0.50 |
| G018033 | 88.94 | 0.84 | 1.98 | 0.29 | 1.97 | 0.44 |
| G018034 | 89.00 | 1.56 | 1.09 | 0.11 | 6.23 | 0.88 |
| G018035 | 95.10 | 1.59 | 0.50 | 0.25 | 0.66 | 0.17 |
| G018036 | 83.69 | 0.01 | 1.91 | 0.30 | 0.53 | 0.20 |
| G018037 | 94.50 | 0.54 | 1.64 | 0.03 | 1.18 | 0.23 |
| G018038 | 90.91 | 0.00 | 1.11 | 0.00 | 3.74 | 0.00 |
| G018039 | 94.88 | 0.00 | 0.60 | 0.00 | 0.41 | 0.00 |
| G018040 | 44.77 | 1.52 | 0.33 | 0.14 | 0.50 | 0.03 |
| G018041 | 66.56 | 2.05 | 0.60 | 0.30 | 0.27 | 0.20 |
| G018042 | 90.79 | 1.10 | 1.28 | 0.47 | 1.64 | 0.35 |
| G018043 | 94.94 | 0.55 | 0.57 | 0.03 | 0.40 | 0.06 |
| G018044 | 91.71 | 1.61 | 0.89 | 0.40 | 1.25 | 0.20 |
| G018045 | 90.26 | 1.59 | 1.46 | 0.54 | 3.91 | 1.89 |
| G018046 | 94.59 | 1.33 | 0.76 | 0.05 | 2.03 | 0.64 |
| G018047 | 93.84 | 1.32 | 0.46 | 0.08 | 2.03 | 0.64 |
| G018048 | 95.20 | 2.58 | 0.54 | 0.52 | 0.62 | 0.30 |
| G018049 | 89.68 | 2.09 | 0.17 | 0.23 | 0.45 | 0.30 |
| G018050 | 95.74 | 0.65 | 0.31 | 0.22 | 0.84 | 0.39 |
| G018051 | 92.47 | 0.90 | 0.54 | 0.76 | 0.73 | 0.31 |
| G018052 | 93.14 | 0.85 | 1.39 | 0.91 | 0.85 | 0.78 |
| G018053 | 78.88 | 3.77 | 0.74 | 0.13 | 0.52 | 0.34 |
| G018054 | 92.69 | 1.11 | 0.79 | 0.10 | 2.55 | 0.46 |
| G018055 | 89.68 | 1.52 | 0.48 | 0.57 | 1.05 | 0.36 |
| G018056 | 94.00 | 1.10 | 0.45 | 0.14 | 1.85 | 0.99 |
| G018057 | 89.87 | 0.49 | 0.72 | 0.04 | 1.31 | 0.31 |
| G018058 | 91.04 | 0.77 | 0.59 | 0.12 | 1.46 | 0.28 |
| G018059 | 49.64 | 3.56 | 0.46 | 0.19 | 1.56 | 0.43 |
| G018060 | 97.65 | 0.65 | 1.22 | 0.17 | 1.13 | 0.47 |
| G018061 | 92.52 | 0.29 | 0.89 | 0.33 | 2.76 | 0.52 |
| G018062 | 88.19 | 0.72 | 0.84 | 0.18 | 6.65 | 0.41 |
| G018063 | 92.94 | 0.63 | 1.54 | 0.20 | 0.94 | 0.38 |
| G018064 | 94.14 | 1.12 | 1.38 | 0.31 | 0.97 | 0.09 |
| G018065 | 93.20 | 1.50 | 1.32 | 0.57 | 0.91 | 0.23 |
| G018066 | 91.62 | 0.45 | 1.69 | 0.06 | 0.45 | 0.17 |
| G018067 | 92.72 | 1.43 | 3.06 | 0.48 | 0.42 | 0.15 |
| G018068 | 93.33 | 0.49 | 0.62 | 0.08 | 0.27 | 0.06 |
| G018069 | 93.83 | 0.77 | 0.94 | 0.33 | 0.99 | 0.07 |
| G018070 | 94.61 | 0.57 | 0.59 | 0.08 | 1.33 | 0.35 |
| G018071 | 87.61 | 0.46 | 0.26 | 0.22 | 1.10 | 0.29 |
| G018072 | 92.86 | 0.84 | 1.76 | 0.04 | 0.34 | 0.06 |
| G018073 | 87.03 | 0.52 | 1.48 | 0.33 | 0.40 | 0.15 |
| G018074 | 80.06 | 11.41 | 0.42 | 0.13 | 0.46 | 0.24 |
| G018075 | 92.85 | 0.27 | 0.59 | 0.37 | 0.61 | 0.08 |
| G018076 | 95.88 | 1.59 | 0.56 | 0.38 | 0.61 | 0.30 |
| G018077 | 0.23 | 0.12 | 0.55 | 0.26 | 0.13 | 0.08 |
| G018078 | 94.97 | 1.42 | 0.48 | 0.16 | 0.44 | 0.22 |
| G018079 | 89.45 | 1.79 | 0.38 | 0.26 | 0.81 | 0.47 |
| G018080 | 80.86 | 3.14 | 0.22 | 0.15 | 0.58 | 0.35 |
| G018081 | 93.61 | 0.63 | 0.17 | 0.14 | 0.91 | 0.44 |
| G018082 | 93.15 | 1.21 | 0.16 | 0.07 | 1.80 | 0.50 |
| G018083 | 78.69 | 0.88 | 0.29 | 0.13 | 2.73 | 0.50 |
| G018084 | 81.88 | 0.70 | 0.43 | 0.19 | 1.39 | 0.60 |
| G018085 | 93.17 | 1.26 | 0.44 | 0.16 | 2.62 | 0.43 |
| G018086 | 95.03 | 1.07 | 0.61 | 0.20 | 1.39 | 0.44 |
| G018087 | 94.37 | 1.49 | 1.07 | 0.79 | 1.41 | 0.21 |
| G018088 | 91.62 | 1.31 | 1.01 | 0.43 | 1.91 | 0.99 |
| G018089 | 94.41 | 1.17 | 0.75 | 0.41 | 3.04 | 1.52 |
| G018090 | 93.66 | 0.82 | 0.54 | 0.28 | 3.12 | 0.96 |
| G018091 | 96.82 | 0.00 | 0.60 | 0.00 | 0.77 | 0.00 |
| G018092 | 90.55 | 1.58 | 0.74 | 0.27 | 2.02 | 0.34 |
| G018093 | 94.46 | 0.49 | 1.13 | 0.13 | 0.96 | 0.28 |
| G018094 | 82.55 | 5.17 | 0.55 | 0.11 | 12.35 | 6.02 |
| G018095 | 94.60 | 0.85 | 1.94 | 0.68 | 0.75 | 0.21 |
| G018096 | 54.68 | 0.62 | 1.99 | 0.16 | 0.38 | 0.12 |
| G018097 | 91.89 | 2.73 | 0.96 | 0.89 | 1.01 | 0.80 |
| G018098 | 70.42 | 0.00 | 0.35 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| G018099 | 96.84 | 0.16 | 0.43 | 0.10 | 0.64 | 0.16 |
| G018100 | 93.24 | 1.08 | 0.77 | 0.20 | 3.07 | 0.06 |
| G018101 | 92.34 | 0.51 | 2.16 | 0.73 | 3.06 | 0.06 |
| G018102 | 91.87 | 0.99 | 0.42 | 0.34 | 0.61 | 0.16 |
| G018103 | 94.50 | 1.22 | 0.59 | 0.22 | 1.25 | 0.53 |
| G018104 | 94.14 | 0.76 | 0.31 | 0.14 | 1.09 | 0.65 |
| G018105 | 95.51 | 0.98 | 0.42 | 0.14 | 0.82 | 0.21 |
| G018106 | 94.77 | 0.90 | 1.12 | 0.18 | 2.15 | 0.28 |
| G018107 | 94.66 | 0.57 | 0.80 | 0.03 | 2.09 | 0.04 |
| G018108 | 94.77 | 1.14 | 1.23 | 0.70 | 1.55 | 0.96 |
| G018109 | 94.40 | 1.37 | 1.06 | 0.91 | 1.80 | 0.67 |
| G018110 | 92.19 | 1.30 | 1.86 | 0.34 | 4.04 | 0.77 |
| G018111 | 91.96 | 3.12 | 0.72 | 0.17 | 5.54 | 3.11 |
| G018112 | 91.54 | 1.34 | 0.80 | 0.15 | 5.69 | 0.44 |
| G018113 | 96.42 | 0.45 | 0.43 | 0.22 | 1.40 | 0.35 |
| G018114 | 95.95 | 0.89 | 0.79 | 0.32 | 0.27 | 0.20 |
| G018115 | 92.89 | 1.00 | 0.59 | 0.16 | 1.10 | 0.40 |
| G018116 | 91.94 | 0.57 | 0.99 | 0.54 | 0.61 | 0.24 |
| G018117 | 95.48 | 1.10 | 0.62 | 0.31 | 0.55 | 0.31 |
| G018118 | 96.20 | 0.38 | 0.43 | 0.31 | 0.46 | 0.17 |
| G018119 | 83.25 | 1.31 | 0.43 | 0.08 | 0.44 | 0.25 |
| G018120 | 97.00 | 0.72 | 0.42 | 0.26 | 0.38 | 0.20 |
| G018121 | 95.42 | 0.58 | 0.50 | 0.13 | 0.42 | 0.15 |
進一步分析實例11中鑑定之所選CIITA sgRNA在T細胞中在多個引導物濃度下之鹼基編輯功效。如下地分析各者之效力：藉由NGS分析基因體編輯功效或藉由流動式細胞測量術分析對HLA-DR、DP、DQ之表面蛋白質表現的破壞。
12.1 T細胞製備
健康人類供體血球分離術為商業上獲得的(Hemacare)，且細胞經洗滌且再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中進行處理。使用Straight from Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組，人類(Miltenyi Biotec目錄號130-122-352)經由陽性選擇分離T細胞。T細胞經等分且在Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)中冷凍保存以供將來使用。
解凍後，將T細胞以1.0×10^6個細胞/毫升之密度平盤培養於由以下各者構成之T細胞生長培養基(TCGM)中：CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充物(ThermoFisher目錄號A1048501)、5%人類AB血清(GeminiBio，目錄號100-512)、1×青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES、200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素15 (Peprotech，目錄號200-15)。T細胞在此培養基中靜置24小時，此時其經以1:100體積比添加之T Cell TransAct™人類試劑(Miltenyi，目錄號130-111-160)活化。T細胞在電穿孔之前活化48小時。
12.2 藉由RNA電穿孔進行之T細胞編輯
在P3緩衝液中製備含有編碼BC22n (SEQ ID NO: 804或805)及UGI (SEQ ID NO: 807或808)之mRNA的溶液。將100 µM CIITA靶向sgRNA自其儲存盤中取出，且在95℃下變性2分鐘，且在室溫下培育5分鐘。活化後四十八小時，收集T細胞，離心，且以12.5×10^
6個T細胞/毫升之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza)中。在96孔PCR盤中自60 pmol開始，一式兩份地在P3電穿孔緩衝液中以1:2比率連續稀釋各sgRNA。稀釋後，將1×10^
5個T細胞、20 ng/µL BC22n mRNA及20 ng/µL UGI mRNA與sgRNA盤混合以製備最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液。將此混合物轉移至4個對應96孔Nucleofector™盤中且使用製造商之脈衝碼進行電穿孔。經電穿孔之T細胞緊接著在不含細胞介素之80 µL CTS Optimizer T細胞生長培養基中靜置15分鐘，隨後轉移至含有額外80 µL補充有2X細胞介素之CTS OpTmizer T細胞生長培養基的新平底96孔盤中。將所得盤在37℃下培育7天。在電穿孔後第4天，細胞在兩個U形底盤中以1:2分裂，且收集一個盤用於NGS定序，而另一個盤補充有含1X細胞介素之CTS Optimizer新鮮培養基。此盤在第7天用於流動式細胞測量術。
12.3 流動式細胞測量術及NGS定序
編輯後第7天，藉由流動式細胞測量術分析T細胞以測定HLA-DR、DP、DQ之表面表現。簡言之，將T細胞與在細胞染色緩衝液(BioLegend，目錄號420201)中稀釋之抗體的混合物一起在4℃下培育30分鐘。針對CD3 (BioLegend，目錄號317336)、CD4 (BioLegend，目錄號317434)、CD8 (BioLegend，目錄號301046)及Viakrome (Beckman Coulter，目錄號C36628)之抗體以1:100稀釋，且針對HLA II-DR、DP、DQ (BioLegend，目錄號361714)之抗體以1:50稀釋。隨後洗滌細胞，再懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中且在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上進行處理。使用FlowJo套裝軟體分析流動式細胞測量術資料。基於大小、形狀、活力、CD8及HLA-DR、DP、DQ圈選T細胞。
表 21展示CIITA編輯結果及在用BC22n進行鹼基編輯之後T細胞中對HLA-DR、DP、DQ呈陰性之T細胞百分比。
表 21 ： 編輯百分比及在用 BC22n 鹼基編輯劑進行 CIITA 編輯之後的 HLA II-DP 、 DQ 、 DR 陰性細胞 百分比
實例13. 對CIITA剪接引導物之脫靶分析
| C＞T | % HLA II-DR 、DP 、DQ | % CD74 | ||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | |
| G018067 | 60 | 95.58% | 0.35% | 2 | 99.40 | 0.00 | 2 | 91.45 | 1.34 | 2 |
| 30 | 94.13% | 0.08% | 2 | 98.90 | 0.42 | 2 | 91.75 | 1.63 | 2 | |
| 15 | 91.49% | 0.05% | 2 | 95.95 | 0.21 | 2 | 89.45 | 0.07 | 2 | |
| 7.5 | 77.17% | 1.50% | 2 | 83.95 | 0.92 | 2 | 76.6 | 0.57 | 2 | |
| 3.75 | 56.15% | 1.07% | 2 | 71.00 | 0.71 | 2 | 63.65 | 4.03 | 2 | |
| 1.88 | 32.76% | 0.32% | 2 | 57.65 | 3.46 | 2 | 50.6 | 3.39 | 2 | |
| 0.94 | 17.47% | 0.95% | 2 | 50.85 | 3.04 | 2 | 46.1 | 3.82 | 2 | |
| 0 | 0.41% | 0.01% | 2 | 49.45 | 5.16 | 2 | 47.85 | 1.91 | 2 | |
| G018075 | 60 | 96.12% | 1.35% | 2 | 98.25 | 0.07 | 2 | 92 | 1.27 | 2 |
| 30 | 94.07% | 3.53% | 2 | 97.45 | 1.06 | 2 | 88.65 | 2.76 | 2 | |
| 15 | 92.08% | 0.90% | 2 | 97.10 | 0.14 | 2 | 87.25 | 2.05 | 2 | |
| 7.5 | 83.76% | 3.28% | 2 | 90.65 | 0.21 | 2 | 80.1 | 2.69 | 2 | |
| 3.75 | 67.35% | 2.13% | 2 | 78.85 | 0.21 | 2 | 67.1 | 2.97 | 2 | |
| 1.88 | 42.66% | 2.51% | 2 | 63.65 | 0.07 | 2 | 52.55 | 2.33 | 2 | |
| 0.94 | 25.54% | 0.32% | 2 | 56.55 | 3.75 | 2 | 43.1 | 3.25 | 2 | |
| 0 | 0.23% | 0.02% | 2 | 48.70 | 1.84 | 2 | 42.1 | 0.42 | 2 | |
| G018091 | 60 | 97.80% | ND | 2 | 99.65 | 0.21 | 2 | 92.2 | 0.57 | 2 |
| 30 | 96.32% | 0.91% | 2 | 97.50 | 0.28 | 2 | 88.7 | 1.7 | 2 | |
| 15 | 84.48% | 2.73% | 2 | 91.90 | 0.71 | 2 | 82.1 | 0.71 | 2 | |
| 7.5 | 76.56% | 0.49% | 2 | 78.05 | 1.63 | 2 | 64.15 | 0.35 | 2 | |
| 3.75 | 52.08% | 1.50% | 2 | 67.00 | 1.56 | 2 | 46.8 | 1.84 | 2 | |
| 1.88 | 30.00% | 2.36% | 2 | 58.80 | 2.55 | 2 | 40.7 | 2.4 | 2 | |
| 0.94 | 15.01% | 1.12% | 2 | 50.70 | 2.26 | 2 | 33 | 2.83 | 2 | |
| 0 | 0.00% | 0.00% | 2 | 47.90 | 1.70 | 2 | 39 | 0 | 2 | |
| G018100 | 60 | 95.55% | 0.47% | 2 | 94.30 | 0.57 | 2 | 85.3 | 2.69 | 2 |
| 30 | 95.22% | 1.02% | 2 | 91.75 | 0.78 | 2 | 79.1 | 0.85 | 2 | |
| 15 | 93.33% | 0.49% | 2 | 90.80 | 0.99 | 2 | 77.1 | 0.28 | 2 | |
| 7.5 | 88.77% | 0.15% | 2 | 84.40 | 0.85 | 2 | 69.9 | 1.56 | 2 | |
| 3.75 | 71.03% | 4.26% | 2 | 75.20 | 2.40 | 2 | 54.4 | 0.57 | 2 | |
| 1.88 | 46.87% | 1.95% | 2 | 63.80 | 0.28 | 2 | 45.7 | 0.28 | 2 | |
| 0.94 | 27.20% | 0.21% | 2 | 54.80 | 1.56 | 2 | 36.5 | 2.4 | 2 | |
| 0 | 0.17% | 0.04% | 2 | 52.25 | 1.63 | 2 | 42.8 | 0 | 2 | |
| G018102 | 60 | 93.32% | 0.10% | 2 | 93.00 | 0.14 | 2 | 84.65 | 0.64 | 2 |
| 30 | 77.08% | 2.22% | 2 | 80.40 | 1.84 | 2 | 68.7 | 2.55 | 2 | |
| 15 | 52.42% | 1.28% | 2 | 70.50 | 0.28 | 2 | 55.4 | 0.85 | 2 | |
| 7.5 | 31.87% | 0.20% | 2 | 58.80 | 4.53 | 2 | 39.4 | 4.38 | 2 | |
| 3.75 | 16.76% | 0.26% | 2 | 56.85 | 1.63 | 2 | 33.65 | 0.07 | 2 | |
| 1.88 | 8.18% | 0.06% | 2 | 54.15 | 0.21 | 2 | 30.35 | 0.92 | 2 | |
| 0.94 | 4.12% | 0.66% | 2 | 52.25 | 3.32 | 2 | 32.2 | 0.57 | 2 | |
| 0 | 0.28% | 0.12% | 2 | 50.00 | 3.68 | 2 | 42.45 | 4.17 | 2 | |
| G018103 | 60 | 96.34% | 0.21% | 2 | 98.85 | 0.07 | 2 | 89.2 | 2.12 | 2 |
| 30 | 90.93% | 0.17% | 2 | 95.15 | 0.92 | 2 | 84.95 | 0.07 | 2 | |
| 15 | 80.01% | 0.34% | 2 | 87.95 | 1.63 | 2 | 76.7 | 0.14 | 2 | |
| 7.5 | 59.92% | 0.48% | 2 | 70.90 | 2.97 | 2 | 56.45 | 3.18 | 2 | |
| 3.75 | 36.07% | 1.23% | 2 | 62.05 | 2.33 | 2 | 44.65 | 0.49 | 2 | |
| 1.88 | 19.59% | 2.15% | 2 | 58.65 | 2.76 | 2 | 38.2 | 1.41 | 2 | |
| 0.94 | 7.98% | 0.08% | 2 | 52.75 | 0.07 | 2 | 33.25 | 2.62 | 2 | |
| 0 | 0.22% | 0.03% | 2 | 50.95 | 0.64 | 2 | 43.1 | 2.69 | 2 | |
| G018107 | 60 | ND | ND | 2 | 99.50 | 0.14 | 2 | 89.05 | 0.07 | 2 |
| 30 | ND | ND | 2 | 99.05 | 0.07 | 2 | 91.1 | 0.85 | 2 | |
| 15 | ND | ND | 2 | 97.05 | 0.64 | 2 | 90 | 3.25 | 2 | |
| 7.5 | ND | ND | 2 | 90.45 | 0.07 | 2 | 83.25 | 2.76 | 2 | |
| 3.75 | ND | ND | 2 | 79.60 | 0.99 | 2 | 72.3 | 2.4 | 2 | |
| 1.88 | ND | ND | 2 | 66.20 | 2.26 | 2 | 58.7 | 4.81 | 2 | |
| 0.94 | ND | ND | 2 | 53.40 | 1.41 | 2 | 45.55 | 3.89 | 2 | |
| 0 | ND | ND | 2 | 51.65 | 2.05 | 2 | 47.35 | 4.03 | 2 | |
| G018111 | 60 | 96.87% | 0.26% | 2 | 95.65 | 0.49 | 2 | 92.45 | 0.35 | 2 |
| 30 | 95.44% | 0.07% | 2 | 89.40 | 0.71 | 2 | 86.5 | 0.42 | 2 | |
| 15 | 89.11% | 0.91% | 2 | 81.35 | 0.07 | 2 | 75.75 | 2.62 | 2 | |
| 7.5 | 71.93% | 0.55% | 2 | 70.05 | 3.32 | 2 | 61.15 | 0.21 | 2 | |
| 3.75 | 47.48% | 0.33% | 2 | 56.45 | 5.02 | 2 | 48.5 | 0.14 | 2 | |
| 1.88 | 25.72% | 1.46% | 2 | 59.00 | 3.11 | 2 | 44.95 | 0.07 | 2 | |
| 0.94 | 12.27% | 0.79% | 2 | 51.30 | 3.39 | 2 | 42.3 | 0.99 | 2 | |
| 0 | 0.15% | 0.01% | 2 | 51.00 | 3.25 | 2 | 45.1 | 1.41 | 2 | |
| G018116 | 60 | 86.65% | 0.01% | 2 | 92.95 | 0.35 | 2 | 87.7 | 0.42 | 2 |
| 30 | 62.59% | 0.13% | 2 | 79.90 | 1.84 | 2 | 69.75 | 2.9 | 2 | |
| 15 | 40.44% | 1.09% | 2 | 69.90 | 0.71 | 2 | 60.15 | 1.34 | 2 | |
| 7.5 | 23.19% | 2.46% | 2 | 60.35 | 4.74 | 2 | 45.45 | 0.92 | 2 | |
| 3.75 | 10.65% | 0.83% | 2 | 55.45 | 1.91 | 2 | 40.2 | 1.41 | 2 | |
| 1.88 | 5.63% | 0.47% | 2 | 56.85 | 1.06 | 2 | 40.75 | 0.64 | 2 | |
| 0.94 | 1.93% | 0.33% | 2 | 57.80 | 3.96 | 2 | 40 | 0.14 | 2 | |
| 0 | 0.19% | 0.10% | 2 | 50.55 | 0.21 | 2 | 47 | 1.41 | 2 | |
| G018117 | 60 | 98.01% | 0.17% | 2 | 99.65 | 0.07 | 2 | 93.65 | 0.49 | 2 |
| 30 | 97.14% | 0.69% | 2 | 99.20 | 0.14 | 2 | 92.35 | 0.07 | 2 | |
| 15 | 93.65% | 0.39% | 2 | 97.75 | 0.64 | 2 | 91.55 | 0.21 | 2 | |
| 7.5 | 81.77% | 0.50% | 2 | 91.60 | 0.42 | 2 | 81.85 | 0.35 | 2 | |
| 3.75 | 56.56% | 2.70% | 2 | 80.55 | 3.46 | 2 | 69.25 | 3.32 | 2 | |
| 1.88 | 33.70% | 3.00% | 2 | 69.30 | 1.13 | 2 | 56.8 | 2.69 | 2 | |
| 0.94 | 17.14% | 0.83% | 2 | 60.40 | 1.84 | 2 | 48.25 | 1.34 | 2 | |
| 0 | 0.18% | 0.01% | 2 | 51.95 | 2.76 | 2 | 46.5 | 1.13 | 2 | |
| G018118 | 60 | 98.36% | 0.27% | 2 | 99.65 | 0.07 | 2 | 94.35 | 0.49 | 2 |
| 30 | 97.70% | 0.19% | 2 | 99.45 | 0.21 | 2 | 88.35 | 8.13 | 2 | |
| 15 | 94.59% | 1.64% | 2 | 98.30 | 0.14 | 2 | 90.45 | 0.21 | 2 | |
| 7.5 | 83.77% | 2.47% | 2 | 92.80 | 1.13 | 2 | 81.2 | 0.57 | 2 | |
| 3.75 | 64.07% | 0.54% | 2 | 81.25 | 1.06 | 2 | 71.5 | 1.56 | 2 | |
| 1.88 | 40.72% | 2.16% | 2 | 70.65 | 2.90 | 2 | 61.15 | 3.18 | 2 | |
| 0.94 | 22.33% | 3.64% | 2 | 63.90 | 0.85 | 2 | 51.05 | 2.76 | 2 | |
| 0 | 0.14% | 0.02% | 2 | 52.95 | 1.48 | 2 | 47.85 | 1.77 | 2 | |
| G018120 | 60 | 98.22% | 0.32% | 2 | 99.10 | 0.14 | 2 | 91.65 | 0.78 | 2 |
| 30 | 96.96% | 0.43% | 2 | 99.15 | 0.07 | 2 | 89.1 | 0.57 | 2 | |
| 15 | 93.71% | 0.19% | 2 | 97.05 | 0.21 | 2 | 88.15 | 0.64 | 2 | |
| 7.5 | 82.19% | 1.50% | 2 | 90.25 | 0.78 | 2 | 80 | 0.99 | 2 | |
| 3.75 | 61.25% | 1.50% | 2 | 80.30 | 1.56 | 2 | 66.45 | 1.77 | 2 | |
| 1.88 | 37.98% | 1.29% | 2 | 68.85 | 0.78 | 2 | 52.75 | 3.04 | 2 | |
| 0.94 | 18.96% | 0.67% | 2 | 59.85 | 0.64 | 2 | 47.25 | 2.19 | 2 | |
| 0 | 0.17% | 0.02% | 2 | 49.60 | 0.57 | 2 | 46.1 | 0.99 | 2 | |
| G018121 | 60 | 97.55% | 0.01% | 2 | 97.25 | 0.35 | 2 | 87.45 | 0.35 | 2 |
| 30 | 92.24% | 0.98% | 2 | 92.50 | 0.71 | 2 | 83.6 | 3.96 | 2 | |
| 15 | 78.58% | 0.52% | 2 | 84.90 | 0.28 | 2 | 76.85 | 2.9 | 2 | |
| 7.5 | 57.37% | 0.50% | 2 | 73.75 | 3.04 | 2 | 64.5 | 3.25 | 2 | |
| 3.75 | 35.06% | 0.53% | 2 | 60.70 | 0.00 | 2 | 50.5 | 3.25 | 2 | |
| 1.88 | 18.80% | 2.81% | 2 | 61.00 | 1.41 | 2 | 45.95 | 4.31 | 2 | |
| 0.94 | 9.25% | 0.17% | 2 | 56.95 | 4.31 | 2 | 42.8 | 1.7 | 2 | |
| 0 | 0.21% | 0.00% | 2 | 47.45 | 3.04 | 2 | 44.55 | 1.34 | 2 |
篩選來自實例10之T細胞以驗證靶向CIITA之脫靶基因體位點且係根據Integrated DNA Technologies，IDT rhAmpSeq rhPCR方案進行。在此實驗中，篩選3種靶向CIITA之sgRNA以驗證脫靶概況。靶向CIITA引導物(G018082、G018081及G018034)之sgRNA之經驗證脫靶位點的數目展示於
表 22中。若p值小於0.05%插入/缺失，則驗證脫靶位點。在針對靶向G018082之sgRNA所鑑定之108個脫靶位點中，驗證0個位點。在針對靶向G018081之sgRNA所鑑定之111個脫靶位點中，驗證3個位點。在針對靶向G018034之sgRNA所鑑定之120個脫靶位點中，驗證0個位點。
表 22. CIITA 剪接引導物之脫靶位點驗證
額外實施例
| gRNA ID | 靶標 | 引導序列 | (SEQ ID NO) | 脫靶位點 | 驗證之位點 |
| G018082 | CIITA | UGUGUCACCCGUUUCAGGUG | 62 | 108 | 0 |
| G018081 | CIITA | CUGUGUCACCCGUUUCAGGU | 61 | 111 | 3 |
| G018034 | CIITA | AGGGAGGCUUAUGCCAAUAU | 14 | 120 | 0 |
本發明進一步包括以下實施例。
實施例1為一種工程化細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現，該工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例2為如實施例1之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的修飾。
實施例3為實施例2之工程化細胞，其中該一個核苷酸為A。
實施例4為如實施例2之工程化細胞，其中該一個核苷酸為G。
實施例5為如實施例1之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的修飾。
實施例6為如實施例5之工程化細胞，其中該一個核苷酸為G。
實施例7為如實施例5之工程化細胞，其中該一個核苷酸為T。
實施例8為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接位點邊界核苷酸之修飾。
實施例9為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少5個連續核苷酸。
實施例10為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。
實施例11為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
實施例12為如實施例1之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10903873-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例13為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr:16:10906485-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例14為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10908130-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例15為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
實施例16為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。
實施例17為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476及chr16:10918504-10918524。
實施例18為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10908132-10908152內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例19為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10908131-10908151內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例20為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10916456-10916476內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例21為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例22為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。
實施例23為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470及chr16:10922153-10922173。
實施例24為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238及chr16:10923219-10923239。
實施例25為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例26為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10923218-10923238內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例27為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10923219-10923239內之剪接位點的至少一個核苷酸。
實施例28為一種工程化細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現，該工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
實施例29為如實施例28之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
實施例30為如實施例28之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。
實施例31為如實施例28之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476及chr16:10918504-10918524。
實施例32為如實施例28之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。
實施例33為如實施例28之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470及chr16:10922153-10922173。
實施例34為如實施例28之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238及chr16:10923219-10923239。
實施例35為如實施例28至34中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。
實施例36為如實施例28至35中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。
實施例37為如實施例28至36中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
實施例38為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
實施例39為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
實施例40為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
實施例41為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
實施例42為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
實施例43為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。
實施例44為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476及chr16:10918504-10918524。
實施例45為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含基因體座標chr16:10908132-10908152內之至少5個連續核苷酸。
實施例46為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含基因體座標chr16:10908131-10908151內之至少5個連續核苷酸。
實施例47為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含基因體座標chr16:10916456-10916476內之至少5個連續核苷酸。
實施例48為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之至少5個連續核苷酸。
實施例49為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。
實施例50為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470及chr16:10922153-10922173。
實施例51為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238及chr16:10923219-10923239。
實施例52為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含基因體座標chr16:10918504-10918524內之至少5個連續核苷酸。
實施例53為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含基因體座標chr16:10923218-10923238內之至少5個連續核苷酸。
實施例54為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含基因體座標chr16:10923219-10923239內之至少5個連續核苷酸。
實施例55為如實施例38至54中任一項之工程化細胞，其中該CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。
實施例56為如實施例38至55中任一項之工程化細胞，其中該CIITA基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
實施例57為如實施例38至56中任一項之工程化細胞，其中該基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。
實施例58為如實施例57之工程化細胞，其中該經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
實施例59為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾使剪接位點不活化。
實施例60為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接位點核苷酸處之缺失。
實施例61為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接位點核苷酸處之取代。
實施例62為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞進一步具有降低或消除的I類MHC之表面表現。
實施例63為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞包含β-2-微球蛋白(B2M)基因中之基因修飾。
實施例64為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例65為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞進一步包含外源核酸。
實施例66為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中工程化細胞包含編碼表現於工程化細胞之表面上之靶向受體的外源核酸。
實施例67為如實施例66之工程化細胞，其中該靶向受體為CAR。
實施例68為如實施例66之工程化細胞，其中該靶向受體為TCR。
實施例69為如實施例66之工程化細胞，其中該靶向受體為WT1 TCR。
實施例70為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中工程化細胞進一步包含編碼由工程化細胞分泌之多肽的外源核酸。
實施例71為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為人類細胞。
實施例72為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為免疫細胞。
實施例73為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞或顆粒球。
實施例74為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為淋巴球。
實施例75為如實施例74之工程化細胞，其中該工程化細胞為T細胞。
實施例76為如實施例75之工程化細胞，其中該工程化細胞相對於未經修飾細胞進一步具有降低或消除的內源性T細胞受體(TCR)蛋白表現。
實施例77為如實施例76之工程化細胞，其中該細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的TRAC蛋白表現。
實施例78為如實施例76至77中任一項之工程化細胞，其中該細胞相對於未經修飾細胞具有降低的TRBC蛋白表現。
實施例79為一種醫藥組合物，其包含如前述實施例中任一項之工程化細胞。
實施例80為一種細胞群體，其包含如前述實施例中任一項之工程化細胞。
實施例81為一種包含細胞群體之醫藥組合物，其中該細胞群體包含如前述實施例中任一項之工程化細胞。
實施例82為如實施例80之細胞群體或如實施例81之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少65% II類MHC陰性。
實施例83為如實施例80之細胞群體或如實施例81之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少70% II類MHC陰性。
實施例84為如實施例80之細胞群體或如實施例81之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少80% II類MHC陰性。
實施例85為如實施例80之細胞群體或如實施例81之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少90% II類MHC陰性。
實施例86為如實施例80之細胞群體或如實施例81之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少92% II類MHC陰性。
實施例87為如實施例80之細胞群體或如實施例81之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少93% II類MHC陰性。
實施例88為如實施例80之細胞群體或如實施例81之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少94% II類MHC陰性。
實施例89為如實施例80至88中任一項之細胞群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少95%內源性TCR蛋白陰性。
實施例90為如實施例80至89中任一項之細胞群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少97%內源性TCR蛋白陰性。
實施例91為如實施例80至90中任一項之細胞群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少98%內源性TCR蛋白陰性。
實施例92為如實施例80至91中任一項之細胞群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少99%內源性TCR蛋白陰性。
實施例93為一種向有需要之個體投與如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物的方法。
實施例94為一種將如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物作為授受細胞轉移(ACT)療法向個體投與的方法。
實施例95為一種組合物，其包含：a)包含引導序列之CIITA引導RNA，該引導序列i)靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或ii)引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割；其中CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。
實施例96為一種組合物，其包含：a)CIITA引導RNA (gRNA)，該gRNA包含i)選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 1-101之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%、90%或85%一致之導引序列；或iv)包含表1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列；或v)來自(iv)之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列。
實施例97為一種組合物，其包含：a)CIITA引導RNA，其為單引導RNA (sgRNA)，該sgRNA包含i)選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 1-101之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%、90%或85%一致之導引序列；或iv)包含表1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列；或v)來自(iv)之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列。
實施例98為如實施例95至97中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。
實施例99為如實施例95至98中任一項之組合物，其進一步包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
實施例100為如實施例99之組合物，其中編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸為編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA。
實施例101為如實施例99至100中任一項之組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑包含釀膿鏈球菌Cas9。
實施例102為如實施例99至101中任一項之組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。
實施例103為如實施例99至101中任一項之組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。
實施例104為如實施例103之組合物，其中經RNA引導之切口酶為釀膿鏈球菌Cas9切口酶。
實施例105為如實施例102至104中任一項之組合物，其進一步包含尿嘧啶醣苷酶抑制劑(UGI)。
實施例106為如實施例102至105中任一項之組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑藉由CIITA基因體目標序列產生胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)之轉化。
實施例107為如實施例102至105中任一項之組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑藉由CIITA基因體目標序列產生腺嘌呤(A)向鳥嘌呤(G)之轉化。
實施例108為如實施例99至107中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA靶向包含剪接受體位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。
實施例109為如實施例108之組合物，其中該一個核苷酸為A。
實施例110為如實施例108之組合物，其中該一個核苷酸為G。
實施例111為如實施例108之組合物，其中該一個核苷酸為剪接受體位點處之剪接位點邊界核苷酸。
實施例112為如實施例99至107中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA靶向包含剪接供體位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。
實施例113為如實施例112之組合物，其中該一個核苷酸為G。
實施例114為如實施例112之組合物，其中該一個核苷酸為T。
實施例115為如實施例112之組合物，其中該一個核苷酸為剪接供體位點處之剪接位點邊界核苷酸。
實施例116為如實施例99至115中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸4個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割。
實施例117為如實施例99至115中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸3個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割。
實施例118為如實施例99至117中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸2個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割。
實施例119為如實施例99至118中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸1個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割。
實施例120為如實施例99至119中任一項之組合物，其中CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列引導經RNA引導之DNA結合劑，以在剪接位點邊界核苷酸處之CIITA基因體目標序列中進行切割。
實施例121為一種製造工程化細胞之方法，該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，該方法包含使細胞與如實施例99至120中任一項之組合物接觸。
實施例122為一種相對於未經修飾細胞降低工程化細胞中之II類MHC蛋白之表面表現的方法，其包含使細胞與如實施例99至120中任一項之組合物接觸。
實施例123為如實施例121至122中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除細胞中I類MHC蛋白之表面表現。
實施例124為如實施例121至122中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除細胞中B2M蛋白之表面表現。
實施例125為如實施例121至122中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除細胞中HLA-A蛋白之表面表現。
實施例126為如實施例122至125中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除細胞中TCR蛋白之表面表現。
實施例127為如實施例122至126中任一項之方法，其進一步包含使細胞與外源核酸接觸。
實施例128為如實施例127之方法，其進一步包含使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸。
實施例129為如實施例127之方法，其進一步包含使該細胞與編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸接觸。
實施例130為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為同種異體細胞。
實施例131為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為原代細胞。
實施例132為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為CD4+ T細胞。
實施例133為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為CD8+ T細胞。
實施例134為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為記憶T細胞。
實施例135為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為B細胞。
實施例136為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為漿B細胞。
實施例137為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為記憶B細胞。
實施例138為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為造血幹細胞(HSC)。
實施例139為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為活化細胞。
實施例140為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為非活化細胞。
實施例141為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子。
實施例142為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子，其中該NK細胞抑制劑分子結合至NK細胞上之抑制性受體。
實施例143為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子，其中該NK細胞抑制劑分子結合至NK細胞上之NKG2A。
實施例144為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子，其中NK細胞抑制劑分子為非經典I類MHC分子。
實施例145為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子，其中該NK細胞抑制劑分子為HLA-E。
實施例146為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子，其中該NK細胞抑制劑分子為融合蛋白。
實施例147為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子，其中該NK細胞抑制劑分子為包含HLA-E及B2M之融合蛋白。
實施例148為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為抗體或抗體片段。
實施例149為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為全長IgG抗體。
實施例150為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為單鏈抗體。
實施例151為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為中和抗體。
實施例152為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為治療多肽。
實施例153為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為酶。
實施例154為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為細胞介素。
實施例155為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為趨化因子。
實施例156為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為融合蛋白。
實施例157為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為T細胞受體(TCR)。
實施例158為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源性核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源性核酸接觸，其中靶向受體為經基因修飾之TCR。
實施例159為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為WT1 TCR。
實施例160為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為CAR。
實施例161為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA在載體中提供至細胞。
實施例162為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中經CIITA RNA引導之DNA結合劑在載體中，視情況在與CIITA引導RNA相同的載體中提供至該細胞。
實施例163為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該外源核酸在載體中提供至該細胞。
實施例164為如實施例163之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為病毒載體。
實施例165為如實施例163之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為非病毒載體。
實施例166為如實施例164之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為慢病毒載體。
實施例167為如實施例164之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為AAV。
實施例168為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中引導RNA在脂質核酸組裝組合物中，視情況在與經RNA引導之DNA結合劑相同的脂質核酸組裝組合物中提供至細胞。
實施例169為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該外源核酸在脂質核酸組裝組合物中提供至該細胞。
實施例170為如實施例168或169之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中脂質核酸組裝組合物為脂質奈米粒子(LNP)。
實施例171為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中外源核酸整合至細胞之基因體中。
實施例172為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該外源核酸係藉由同源重組(HR)整合至該細胞之基因體中。
實施例173為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中外源核酸係整合至細胞基因體中之安全港基因座中。
實施例174為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 1。
實施例175為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 2。
實施例176為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 3。
實施例177為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 4。
實施例178為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 5。
實施例179為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 6。
實施例180為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 7。
實施例181為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 8。
實施例182為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 9。
實施例183為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 10。
實施例184為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 11。
實施例185為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 12。
實施例186為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 13。
實施例187為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 14。
實施例188為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 15。
實施例189為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 16。
實施例190為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 17。
實施例191為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 18。
實施例192為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 19。
實施例193為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 20。
實施例194為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 21。
實施例195為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 22。
實施例196為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 23。
實施例197為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 24。
實施例198為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 25。
實施例199為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 26。
實施例200為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 27。
實施例201為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 28。
實施例202為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 29。
實施例203為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 30。
實施例204為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 31。
實施例205為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 32。
實施例206為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 33。
實施例207為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 34。
實施例208為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 35。
實施例209為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 36。
實施例210為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 37。
實施例211為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 38。
實施例212為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 39。
實施例213為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 40。
實施例214為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 41。
實施例215為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 42。
實施例216為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 43。
實施例217為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 44。
實施例218為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 45。
實施例219為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 46。
實施例220為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 47。
實施例221為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 48。
實施例222為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 49。
實施例223為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 50。
實施例224為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 51。
實施例225為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 52。
實施例226為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 53。
實施例227為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 54。
實施例228為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 55。
實施例229為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 56。
實施例230為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 57。
實施例231為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 58。
實施例232為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 59。
實施例233為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 60。
實施例234為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 61。
實施例235為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 62。
實施例236為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 63。
實施例237為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 64。
實施例238為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 65。
實施例239為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 66。
實施例240為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 67。
實施例241為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 68。
實施例242為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 69。
實施例243為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 70。
實施例244為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 71。
實施例245為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 72。
實施例246為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 73。
實施例247為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 74。
實施例248為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 75。
實施例249為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 76。
實施例250為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 77。
實施例251為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 78。
實施例252為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 79。
實施例253為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 80。
實施例254為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 81。
實施例255為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 82。
實施例256為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 83。
實施例257為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 84。
實施例258為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 85。
實施例259為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 86。
實施例260為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 87。
實施例261為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 88。
實施例262為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 89。
實施例263為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 90。
實施例264為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 91。
實施例265為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 92。
實施例266為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 93。
實施例267為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 94。
實施例268為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 95。
實施例269為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 96。
實施例270為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 97。
實施例271為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 98。
實施例272為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 99。
實施例273為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 100。
實施例274為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含SEQ ID NO: 101。
實施例275為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾。
實施例276為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其中該至少一個修飾包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
實施例277為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
實施例278為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
實施例279為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之5'端之前五個核苷酸中之一或多者處之修飾。
實施例280為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之3'端之最後五個核苷酸中之一或多者處之修飾。
實施例281為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之前四個核苷酸之間的PS鍵。
實施例282為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之最後四個核苷酸之間的PS鍵。
實施例283為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之5'端之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。
實施例284為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之3'端之最後三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。
實施例285為如前述實施例中任一項之工程化細胞或細胞群體，其包含基因修飾，包括在CIITA引導RNA所靶向之基因體區域內之插入/缺失。
實施例286為如前述實施例中任一項之工程化細胞或細胞群體，其包含基因修飾，包括在CIITA引導RNA所靶向之基因體區域內之C至T取代或A至G取代。
實施例287為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於表現對由癌細胞表現之多肽具有特異性的TCR。
實施例288為如前述實施例中任一者之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於作為授受細胞轉移(ACT)療法向個體投與。
實施例289為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於治療患有癌症之個體。
實施例290為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於治療患有感染性疾病之個體。
實施例291為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於治療患有自體免疫疾病之個體。
實施例292為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因修飾包含插入/缺失。
實施例293為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因修飾包含C至T取代。
實施例294為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因修飾包含A至G取代。
實施例295為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
實施例296為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：a) chr6:29942854至chr6:29942913及b) chr6:29943518至chr6: 29943619。
實施例297為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞進一步包含HLAA基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6:29942903。
實施例298為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29943528至chr6:29943609。
實施例299為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLA-A基因中之基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
實施例300為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中HLAA基因中之基因修飾包含在選自以下之基因體座標內的插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
實施例301為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞之HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
實施例302為一種製造工程化細胞之方法，該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白及HLA-A蛋白之表面表現，該方法包含：a)使該細胞與CIITA引導RNA接觸，其中引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列；b)使該細胞與HLA-A引導RNA接觸，其中HLA-A引導RNA包含選自SEQ ID NO: 2001-2095中之任一者的引導序列；及c)視情況使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸；藉此相對於未經修飾細胞降低或消除細胞中II類MHC蛋白及HLA-A蛋白之表面表現。
實施例303為如前一實施例之方法，其包含使細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸，視情況其中該經RNA引導之DNA結合劑包含釀膿鏈球菌Cas9。
實施例304為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-B選自以下HLA-B對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02。
實施例305為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-C選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
實施例306為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-B對偶基因選自以下HLA-B對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02；且HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
實施例307為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-B及HLA-C對偶基因選自以下HLA-B及HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-B*07:02及HLA-C*07:02；HLA-B*08:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:02及HLA-C*05:01；HLA-B*35:01及HLA-C*04:01；HLA-B*40:01及HLA-C*03:04；HLA-B*57:01及HLA-C*06:02；HLA-B*14:02及HLA-C*08:02；HLA-B*15:01及HLA-C*03:03；HLA-B*13:02及HLA-C*06:02；HLA-B*44:03及HLA-C*16:01；HLA-B*38:01及HLA-C*12:03；HLA-B*18:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:03及HLA-C*04:01；HLA-B*51:01及HLA-C*15:02；HLA-B*49:01及HLA-C*07:01；HLA-B*15:01及HLA-C*03:04；HLA-B*18:01及HLA-C*12:03；HLA-B*27:05及HLA-C*02:02；HLA-B*35:03及HLA-C*04:01；HLA-B*18:01及HLA-C*05:01；HLA-B*52:01及HLA-C*12:02；HLA-B*51:01及HLA-C*14:02；HLA-B*37:01及HLA-C*06:02；HLA-B*53:01及HLA-C*04:01；HLA-B*55:01及HLA-C*03:03；HLA-B*44:02及HLA-C*07:04；HLA-B*44:03及HLA-C*07:01；HLA-B*35:02及HLA-C*04:01；HLA-B*15:01及HLA-C*04:01；及HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。
實施例308為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*07:02及HLA-C*07:02。
實施例309為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*08:01及HLA-C*07:01。
實施例310為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*44:02及HLA-C*05:01。
實施例311為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-B及HLA-C對偶基因為HLA-B*35:01及HLA-C*04:01。
表
23.
額外序列
在下表及通篇中，術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」用於指示已經2'-O-Me修飾之核苷酸。在下表中，「*」用於描繪PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示經PS鍵連接至下一個(例如3')核苷酸之核苷酸。應理解，若相對於RNA提及DNA序列(包含Ts)，則Ts應經Us (取決於上下文，其可經修飾或未經修飾)置換，且反之亦然。在下表中，使用單胺基酸字母編碼提供肽序列。
| SEQ ID NO | 序列 | |
| G000529 gRNA | 701 | mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G013674 gRNA | 702 | mU*mU*mC*UAGGGGCCCCAACUCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G012086 gRNA | 703 | mA*mG*mA*GUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G015995 gRNA | 704 | mU*mU*mA*CCCCACUUAACUAUCUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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| G000646 gRNA | 709 | mG*mA*mC*UUGUUUUCAUUGUUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 重組Cas9-NLS胺基酸序列 | 800 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV |
| 編碼Sp. Cas9之ORF | 801 | ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG |
| 編碼Sp. Cas9之ORF | 802 | ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA |
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| BC22n之胺基酸序列 | 811 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV* |
| 具有Hibit標籤之BC22n之胺基酸序列 | 812 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKVSESATPESVSGWRLFKKIS |
| BC22之胺基酸序列 | 813 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV |
| UGI之胺基酸序列 | 814 | MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE |
| 例示性XTEN | 900 | SGSETPGTSESATPES |
| 例示性XTEN | 901 | SGSETPGTSESA |
| 例示性XTEN | 902 | SGSETPGTSESATPEGGSGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 903 | GGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 904 | EAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 905 | EAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 906 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 907 | GGGGSGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 908 | GGGGSEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 909 | EAAAKEAAAKEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 910 | EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 911 | GGGGSEAAAKEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 912 | EAAAKEAAAKGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 913 | EAAAKEAAAKGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 914 | GGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 915 | GGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 916 | EAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 917 | SEGSA |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 918 | SEGSAGTST |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 919 | GGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 920 | GGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 921 | EAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 922 | EAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 923 | SEGSAGTSTESEGSA |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 924 | GGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 925 | GGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 926 | GGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 927 | EAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 928 | EAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 929 | SEGSAGTSTESEGSAGTSTE |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 930 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 931 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 932 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 933 | GGGGSEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 934 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 935 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 936 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 937 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 938 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 939 | EAAAKEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 940 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 941 | EAAAKEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 942 | SEGSAGTSTESEGSAGTSTESEGSA |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 943 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 944 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 945 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 946 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 947 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 948 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 949 | GGGGSGGGGSEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 950 | GGGGSGGGGSEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 951 | GGGGSEAAAKGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 952 | GGGGSEAAAKGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 953 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 954 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 955 | GGGGSEAAAKEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 956 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 957 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 958 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 959 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 960 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 961 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 962 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 963 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 964 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 965 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 966 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 967 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 968 | EAAAKEAAAKEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 969 | EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接子之胺基酸序列 | 970 | EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接子之胺基酸序列SGGS | 971 | SGGS |
| 編碼BC22n之mRNA | 972 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACUCCGGCUCCGAGACCCCCGGCACCUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGCCAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG 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| 編碼具有Hibit標籤之BC22n的mRNA | 973 | 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| 編碼BC22之mRNA | 974 | 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| 編碼UGI之mRNA | 975 | GGGAGACCCAAGCUGGCUAGCUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGGACCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAGGAGGAAGCACAAACCUGUCGGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAUCGAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAUCGGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAUCGACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAUCGGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACUCGAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGUGAUAGUCUAGACAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGUCUAG |
圖1A-D展示T細胞篩選之結果，該篩選藉由流動式細胞測量術針對Cas9 (圖1C)及BC22 (圖1D)比較CIITA引導RNA之編輯(圖1A (對於Cas9裂解酶(Cas9))及圖1B (去胺酶(BC22))與對II類MHC之細胞表面表現呈陰性之T細胞的平均百分比(% MHC II陰性)。
圖2展示使用Cas9及BC22之若干導引物的對II類MHC之細胞表面表現呈陰性之T細胞之平均百分比(% MHC II陰性)與展示為鹼基對(「bp」)之切割位點至剪接位點邊界核苷酸之距離的關係。正數值指示位於切割位點之3'的剪接位點邊界核苷酸，而負數值指示位於切割位點之5'的剪接位點邊界核苷酸。
圖3A-3D展示當改變BC22n (如本文所用，「BC22n」係指無UGI之BC22) mRNA及Cas9 mRNA之含量時，呈總讀段%形式之T細胞編輯概況。細胞經個別引導RNA G015995 (圖3A)、G016017 (圖3B)、G016206 (圖3C)及G018117 (圖3D)編輯。
圖4A-4D展示當同時使用四種引導RNA進行編輯時，在改變BC22n mRNA及Cas9 mRNA之含量時呈總讀段%形式之T細胞編輯概況。對於由G015995 (圖4A)、G016017 (圖4B)、G016206 (圖4C)及G018117 (圖4D)靶向之四個基因座中之每一者展示多引導遞送之總讀段的百分比。
圖5A-5H展示呈對抗體結合呈陰性之細胞%形式的表型分型結果，其中BC22n及Cas9樣品之總RNA均增加(如表14中所示)。圖5A展示當B2M引導物G015995用於編輯時，B2M陰性細胞之百分比。圖5B展示當多引導物用於編輯時，B2M陰性細胞之百分比。圖5C展示當TRAC引導物G016017用於編輯時，CD3陰性細胞之百分比。圖5D展示當TRBC引導物G016206用於編輯時，CD3陰性細胞之百分比。圖5E展示當多個引導物用於編輯時，CD3陰性細胞之百分比。圖5F展示當CIITA引導物G018117用於編輯時，II類MHC陰性細胞之百分比。圖5G展示當多個引導物用於編輯時，II類MHC陰性細胞之百分比。圖5H展示當多個引導物用於編輯時，三(B2M、CD3、MHC II)陰性細胞之百分比。
圖6A-6B展示在用不同mRNA構築體及CIITA靶向sgRNA處理之後的T細胞(圖6A)及藉由對用不同mRNA構築體及CIITA引導RNA處理之T細胞進行流動式細胞測量術分析而評估之II類MHC陰性細胞(圖6B)中之編輯概況。
圖7A-7D展示散佈圖，該等散佈圖展示用第一引導物UGI mRNA及Cas9 mRNA (圖7A)或BC22n mRNA (圖7B)，或第二引導物UGI mRNA及Cas9 mRNA (圖7C)或BC22n mRNA (圖7D)處理之T細胞中之統計顯著(* = 調整後p值 ＜ 0.05)差異基因表現事件(黑點)。
圖8A-8D展示在用第一引導物UGI mRNA及Cas9 mRNA (圖8A)或BC22n mRNA (圖8B)，或第二引導物UGI mRNA及Cas9 mRNA (圖8C)或BC22n mRNA (圖8D)處理之T細胞中，在差異性表現基因之清單中富集的蛋白質-蛋白質相互作用網路。
圖9A-9C展示在藉由活體內成像系統(IVIS)之NK細胞殺滅鼠類模型中，B2M基因剔除T細胞及B2M基因剔除/HLA-E T細胞在注射後90天(圖9A)、90天時程內(圖9B)及30天時程內(圖9C)之存活率；IVIS信號定量為平均輻射強度。展示個別小鼠(1至8)之資料點。
圖10A-10B展示在磁性細胞分離(MACS
®)處理之前(圖10A)及在MACS
®處理之後(圖10B)，根據NGS定序，T細胞中之CIITA、B2M及TRAC的編輯百分比。
圖11A-11B展示在MACS
®處理之前(圖11A)及在MACS
®處理之後(圖11B)，藉由流動式細胞測量術，對II類MHC、B2M及TRAC之細胞表面表現呈陰性之T細胞的平均百分比。
圖12展示根據KromaTiD dGH分析，用電穿孔、同時LNP方法或依序LNP方法處理之經基因修飾細胞中之染色體結構變化。
<![CDATA[<110> 美商英特利亞醫療公司(INTELLIA THERAPEUTICS, INC.)]]>
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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
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Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
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Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
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Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
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Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
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Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
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Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
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Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
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<![CDATA[<210> 801]]>
<![CDATA[<211> 4140]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
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atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg atgggcagtc 60
atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa cacagacaga 120
cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga aacagcagaa 180
gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa cagaatctgc 240
tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccacaga 300
ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gatcttcgga 360
aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca cctgagaaag 420
aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc actggcacac 480
atgatcaagt tcagaggaca cttcctgatc gaaggagacc tgaacccgga caacagcgac 540
gtcgacaagc tgttcatcca gctggtccag acatacaacc agctgttcga agaaaacccg 600
atcaacgcaa gcggagtcga cgcaaaggca atcctgagcg caagactgag caagagcaga 660
agactggaaa acctgatcgc acagctgccg ggagaaaaga agaacggact gttcggaaac 720
ctgatcgcac tgagcctggg actgacaccg aacttcaaga gcaacttcga cctggcagaa 780
gacgcaaagc tgcagctgag caaggacaca tacgacgacg acctggacaa cctgctggca 840
cagatcggag accagtacgc agacctgttc ctggcagcaa agaacctgag cgacgcaatc 900
ctgctgagcg acatcctgag agtcaacaca gaaatcacaa aggcaccgct gagcgcaagc 960
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cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agagcaagaa cggatacgca 1080
ggatacatcg acggaggagc aagccaggaa gaattctaca agttcatcaa gccgatcctg 1140
gaaaagatgg acggaacaga agaactgctg gtcaagctga acagagaaga cctgctgaga 1200
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gcaatcctga gaagacagga agacttctac ccgttcctga aggacaacag agaaaagatc 1320
gaaaagatcc tgacattcag aatcccgtac tacgtcggac cgctggcaag aggaaacagc 1380
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agcggagaac agaagaaggc aatcgtcgac ctgctgttca agacaaacag aaaggtcaca 1680
gtcaagcagc tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgacag cgtcgaaatc 1740
agcggagtcg aagacagatt caacgcaagc ctgggaacat accacgacct gctgaagatc 1800
atcaaggaca aggacttcct ggacaacgaa gaaaacgaag acatcctgga agacatcgtc 1860
ctgacactga cactgttcga agacagagaa atgatcgaag aaagactgaa gacatacgca 1920
cacctgttcg acgacaaggt catgaagcag ctgaagagaa gaagatacac aggatgggga 1980
agactgagca gaaagctgat caacggaatc agagacaagc agagcggaaa gacaatcctg 2040
gacttcctga agagcgacgg attcgcaaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100
agcctgacat tcaaggaaga catccagaag gcacaggtca gcggacaggg agacagcctg 2160
cacgaacaca tcgcaaacct ggcaggaagc ccggcaatca agaagggaat cctgcagaca 2220
gtcaaggtcg tcgacgaact ggtcaaggtc atgggaagac acaagccgga aaacatcgtc 2280
atcgaaatgg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340
atgaagagaa tcgaagaagg aatcaaggaa ctgggaagcc agatcctgaa ggaacacccg 2400
gtcgaaaaca cacagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca gaacggaaga 2460
gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aacagactga gcgactacga cgtcgaccac 2520
atcgtcccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtcct gacaagaagc 2580
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<![CDATA[<223> 合成]]>
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aaggagctgc tgggcatcac catcatggag cggtcctcct tcgagaagaa ccccatcgac 3540
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auggacaaga aguacuccau cggccuggac aucggcacca acuccguggg cugggccgug 60
aucaccgacg aguacaaggu gcccuccaag aaguucaagg ugcugggcaa caccgaccgg 120
cacuccauca agaagaaccu gaucggcgcc cugcuguucg acuccggcga gaccgccgag 180
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uaccugcagg agaucuucuc caacgagaug gccaaggugg acgacuccuu cuuccaccgg 300
cuggaggagu ccuuccuggu ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc caucuucggc 360
aacaucgugg acgagguggc cuaccacgag aaguacccca ccaucuacca ccugcggaag 420
aagcuggugg acuccaccga caaggccgac cugcggcuga ucuaccuggc ccuggcccac 480
augaucaagu uccggggcca cuuccugauc gagggcgacc ugaaccccga caacuccgac 540
guggacaagc uguucaucca gcuggugcag accuacaacc agcuguucga ggagaacccc 600
aucaacgccu ccggcgugga cgccaaggcc auccuguccg cccggcuguc caagucccgg 660
cggcuggaga accugaucgc ccagcugccc ggcgagaaga agaacggccu guucggcaac 720
cugaucgccc ugucccuggg ccugaccccc aacuucaagu ccaacuucga ccuggccgag 780
gacgccaagc ugcagcuguc caaggacacc uacgacgacg accuggacaa ccugcuggcc 840
cagaucggcg accaguacgc cgaccuguuc cuggccgcca agaaccuguc cgacgccauc 900
cugcuguccg acauccugcg ggugaacacc gagaucacca aggccccccu guccgccucc 960
augaucaagc gguacgacga gcaccaccag gaccugaccc ugcugaaggc ccuggugcgg 1020
cagcagcugc ccgagaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa cggcuacgcc 1080
ggcuacaucg acggcggcgc cucccaggag gaguucuaca aguucaucaa gcccauccug 1140
gagaagaugg acggcaccga ggagcugcug gugaagcuga accgggagga ccugcugcgg 1200
aagcagcgga ccuucgacaa cggcuccauc ccccaccaga uccaccuggg cgagcugcac 1260
gccauccugc ggcggcagga ggacuucuac cccuuccuga aggacaaccg ggagaagauc 1320
gagaagaucc ugaccuuccg gauccccuac uacgugggcc cccuggcccg gggcaacucc 1380
cgguucgccu ggaugacccg gaaguccgag gagaccauca cccccuggaa cuucgaggag 1440
gugguggaca agggcgccuc cgcccagucc uucaucgagc ggaugaccaa cuucgacaag 1500
aaccugccca acgagaaggu gcugcccaag cacucccugc uguacgagua cuucaccgug 1560
uacaacgagc ugaccaaggu gaaguacgug accgagggca ugcggaagcc cgccuuccug 1620
uccggcgagc agaagaaggc caucguggac cugcuguuca agaccaaccg gaaggugacc 1680
gugaagcagc ugaaggagga cuacuucaag aagaucgagu gcuucgacuc cguggagauc 1740
uccggcgugg aggaccgguu caacgccucc cugggcaccu accacgaccu gcugaagauc 1800
aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgag gagaacgagg acauccugga ggacaucgug 1860
cugacccuga cccuguucga ggaccgggag augaucgagg agcggcugaa gaccuacgcc 1920
caccuguucg acgacaaggu gaugaagcag cugaagcggc ggcgguacac cggcuggggc 1980
cggcuguccc ggaagcugau caacggcauc cgggacaagc aguccggcaa gaccauccug 2040
gacuuccuga aguccgacgg cuucgccaac cggaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100
ucccugaccu ucaaggagga cauccagaag gcccaggugu ccggccaggg cgacucccug 2160
cacgagcaca ucgccaaccu ggccggcucc cccgccauca agaagggcau ccugcagacc 2220
gugaaggugg uggacgagcu ggugaaggug augggccggc acaagcccga gaacaucgug 2280
aucgagaugg cccgggagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacuc ccgggagcgg 2340
augaagcgga ucgaggaggg caucaaggag cugggcuccc agauccugaa ggagcacccc 2400
guggagaaca cccagcugca gaacgagaag cuguaccugu acuaccugca gaacggccgg 2460
gacauguacg uggaccagga gcuggacauc aaccggcugu ccgacuacga cguggaccac 2520
aucgugcccc aguccuuccu gaaggacgac uccaucgaca acaaggugcu gacccggucc 2580
gacaagaacc ggggcaaguc cgacaacgug cccuccgagg agguggugaa gaagaugaag 2640
aacuacuggc ggcagcugcu gaacgccaag cugaucaccc agcggaaguu cgacaaccug 2700
accaaggccg agcggggcgg ccuguccgag cuggacaagg ccggcuucau caagcggcag 2760
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uacucccugu ucgagcugga gaacggccgg aagcggaugc uggccuccgc cggcgagcug 3660
cagaagggca acgagcuggc ccugcccucc aaguacguga acuuccugua ccuggccucc 3720
cacuacgaga agcugaaggg cucccccgag gacaacgagc agaagcagcu guucguggag 3780
cagcacaagc acuaccugga cgagaucauc gagcagaucu ccgaguucuc caagcgggug 3840
auccuggccg acgccaaccu ggacaaggug cuguccgccu acaacaagca ccgggacaag 3900
cccauccggg agcaggccga gaacaucauc caccuguuca cccugaccaa ccugggcgcc 3960
cccgccgccu ucaaguacuu cgacaccacc aucgaccgga agcgguacac cuccaccaag 4020
gaggugcugg acgccacccu gauccaccag uccaucaccg gccuguacga gacccggauc 4080
gaccuguccc agcugggcgg cgacggcggc ggcuccccca agaagaagcg gaaggugucc 4140
gaguccgcca cccccgaguc cguguccggc uggcggcugu ucaagaagau cuccuga 4197
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acaaucaugg aaagaagcag cuucgaaaag aacccgaucg acuuccugga agcaaaggga 4200
uacaaggaag ucaagaagga ccugaucauc aagcugccga aguacagccu guucgaacug 4260
gaaaacggaa gaaagagaau gcuggcaagc gcaggagaac ugcagaaggg aaacgaacug 4320
gcacugccga gcaaguacgu caacuuccug uaccuggcaa gccacuacga aaagcugaag 4380
ggaagcccgg aagacaacga acagaagcag cuguucgucg aacagcacaa gcacuaccug 4440
gacgaaauca ucgaacagau cagcgaauuc agcaagagag ucauccuggc agacgcaaac 4500
cuggacaagg uccugagcgc auacaacaag cacagagaca agccgaucag agaacaggca 4560
gaaaacauca uccaccuguu cacacugaca aaccugggag caccggcagc auucaaguac 4620
uucgacacaa caaucgacag aaagagauac acaagcacaa aggaaguccu ggacgcaaca 4680
cugauccacc agagcaucac aggacuguac gaaacaagaa ucgaucugag ccagcuggga 4740
ggagacagcg gaggaagcac aaaccugagc gacaucaucg aaaaggaaac aggaaagcag 4800
cuggucaucc aggaaagcau ccugaugcug ccggaagaag ucgaagaagu caucggaaac 4860
aagccggaaa gcgacauccu gguccacaca gcauacgacg aaagcacaga cgaaaacguc 4920
augcugcuga caagcgacgc accggaauac aagccguggg cacuggucau ccaggacagc 4980
aacggagaaa acaagaucaa gaugcugagc ggaggaagcc cgaagaagaa gagaaagguc 5040
uaa 5043
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augggaccga agaagaagag aaaggucgga ggaggaagca caaaccuguc ggacaucauc 60
gaaaaggaaa caggaaagca gcuggucauc caggaaucga uccugaugcu gccggaagaa 120
gucgaagaag ucaucggaaa caagccggaa ucggacaucc ugguccacac agcauacgac 180
gaaucgacag acgaaaacgu caugcugcug acaucggacg caccggaaua caagccgugg 240
gcacugguca uccaggacuc gaacggagaa aacaagauca agaugcugug a 291
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augaccaacc uguccgacau caucgagaag gagaccggca agcagcuggu gauccaggag 60
uccauccuga ugcugcccga ggagguggag gaggugaucg gcaacaagcc cgaguccgac 120
auccuggugc acaccgccua cgacgagucc accgacgaga acgugaugcu gcugaccucc 180
gacgcccccg aguacaagcc cugggcccug gugauccagg acuccaacgg cgagaacaag 240
aucaagaugc uguccggcgg cuccaagcgg accgccgacg gcuccgaguu cgaguccccc 300
aagaagaagc ggaaggugga guga 324
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Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
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Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
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Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
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Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
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His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
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Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
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Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
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Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
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Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
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Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
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Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
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Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
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Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
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725 730 735
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Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
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Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
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Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro
450 455 460
Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu
465 470 475 480
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile
485 490 495
Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp
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Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys
515 520 525
Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln
530 535 540
Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys
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Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr
565 570 575
Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro
580 585 590
Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn
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Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile
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Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln
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Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys
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Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly
660 665 670
Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr
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Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu
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1130 1135 1140
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Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
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Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val
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Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp
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His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn
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Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn
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Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg
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Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn
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Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala
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Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
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His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
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Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys
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Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys
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Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu
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Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu
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Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg
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Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala
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Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu
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Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu
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Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser
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Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys
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Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met
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Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala
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Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu
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Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val
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Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys Met
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Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
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gggaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccggaucugc caccauggag gccucccccg 60
ccuccggccc ccggcaccug auggaccccc acaucuucac cuccaacuuc aacaacggca 120
ucggccggca caagaccuac cugugcuacg agguggagcg gcuggacaac ggcaccuccg 180
ugaagaugga ccagcaccgg ggcuuccugc acaaccaggc caagaaccug cugugcggcu 240
ucuacggccg gcacgccgag cugcgguucc uggaccuggu gcccucccug cagcuggacc 300
ccgcccagau cuaccgggug accugguuca ucuccugguc ccccugcuuc uccuggggcu 360
gcgccggcga ggugcgggcc uuccugcagg agaacaccca cgugcggcug cggaucuucg 420
ccgcccggau cuacgacuac gacccccugu acaaggaggc ccugcagaug cugcgggacg 480
ccggcgccca gguguccauc augaccuacg acgaguucaa gcacugcugg gacaccuucg 540
uggaccacca gggcugcccc uuccagcccu gggacggccu ggacgagcac ucccaggccc 600
uguccggccg gcugcgggcc auccugcaga accagggcaa cuccggcucc gagacccccg 660
gcaccuccga guccgccacc cccgaguccg acaagaagua cuccaucggc cuggccaucg 720
gcaccaacuc cgugggcugg gccgugauca ccgacgagua caaggugccc uccaagaagu 780
ucaaggugcu gggcaacacc gaccggcacu ccaucaagaa gaaccugauc ggcgcccugc 840
uguucgacuc cggcgagacc gccgaggcca cccggcugaa gcggaccgcc cggcggcggu 900
acacccggcg gaagaaccgg aucugcuacc ugcaggagau cuucuccaac gagauggcca 960
agguggacga cuccuucuuc caccggcugg aggaguccuu ccugguggag gaggacaaga 1020
agcacgagcg gcaccccauc uucggcaaca ucguggacga gguggccuac cacgagaagu 1080
accccaccau cuaccaccug cggaagaagc ugguggacuc caccgacaag gccgaccugc 1140
ggcugaucua ccuggcccug gcccacauga ucaaguuccg gggccacuuc cugaucgagg 1200
gcgaccugaa ccccgacaac uccgacgugg acaagcuguu cauccagcug gugcagaccu 1260
acaaccagcu guucgaggag aaccccauca acgccuccgg cguggacgcc aaggccaucc 1320
uguccgcccg gcuguccaag ucccggcggc uggagaaccu gaucgcccag cugcccggcg 1380
agaagaagaa cggccuguuc ggcaaccuga ucgcccuguc ccugggccug acccccaacu 1440
ucaaguccaa cuucgaccug gccgaggacg ccaagcugca gcuguccaag gacaccuacg 1500
acgacgaccu ggacaaccug cuggcccaga ucggcgacca guacgccgac cuguuccugg 1560
ccgccaagaa ccuguccgac gccauccugc uguccgacau ccugcgggug aacaccgaga 1620
ucaccaaggc cccccugucc gccuccauga ucaagcggua cgacgagcac caccaggacc 1680
ugacccugcu gaaggcccug gugcggcagc agcugcccga gaaguacaag gagaucuucu 1740
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ucuacaaguu caucaagccc auccuggaga agauggacgg caccgaggag cugcugguga 1860
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gcgacauccu gguccacaca gcauacgacg aaagcacaga cgaaaacguc augcugcuga 5040
caagcgacgc accggaauac aagccguggg cacuggucau ccaggacagc aacggagaaa 5100
acaagaucaa gaugcugagc ggaggaagcc cgaagaagaa gagaaagguc uaauagucua 5160
gacaucacau uuaaaagcau cucagccuac caugagaaua agagaaagaa aaugaagauc 5220
aauagcuuau ucaucucuuu uucuuuuucg uugguguaaa gccaacaccc ugucuaaaaa 5280
acauaaauuu cuuuaaucau uuugccucuu uucucugugc uucaauuaau aaaaaaugga 5340
aagaaccucg agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagcgaaaaa aaaaaaaaaa 5400
aaaaaaaaaa aaaaaccgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaau 5458
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gggagaccca agcuggcuag cucccgcagu cggcguccag cggcucugcu uguucgugug 60
ugugucguug caggccuuau ucggauccgc caccauggga ccgaagaaga agagaaaggu 120
cggaggagga agcacaaacc ugucggacau caucgaaaag gaaacaggaa agcagcuggu 180
cauccaggaa ucgauccuga ugcugccgga agaagucgaa gaagucaucg gaaacaagcc 240
ggaaucggac auccuggucc acacagcaua cgacgaaucg acagacgaaa acgucaugcu 300
gcugacaucg gacgcaccgg aauacaagcc gugggcacug gucauccagg acucgaacgg 360
agaaaacaag aucaagaugc ugugauaguc uagacaucac auuuaaaagc aucucagccu 420
accaugagaa uaagagaaag aaaaugaaga ucaauagcuu auucaucucu uuuucuuuuu 480
cguuggugua aagccaacac ccugucuaaa aaacauaaau uucuuuaauc auuuugccuc 540
uuuucucugu gcuucaauua auaaaaaaug gaaagaaccu cgagucuag 589
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acagaagaug uggcuagagg 20
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ccucuagcca caucuucugu 20
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cccacagaag auguggcuag 20
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gucagauccc acagaagaug 20
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aucuucugug ggaucugacc 20
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cccaggcagu gacagugccc 20
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cugggcacug ucacugccug 20
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ccugggcacu gucacugccu 20
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cccugggcac ugucacugcc 20
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uuggguguug ggcggaacag 20
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uggauguauu gagcaugcga 20
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ggauguauug agcaugcgau 20
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aacaugaaga aagcaggugu 20
Claims (87)
- 一種工程化細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現，該工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之剪接位點的至少一個核苷酸。
- 如請求項1之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接受體位點之至少一個核苷酸之修飾，視情況其中該一個核苷酸為A或G。
- 如請求項1之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接供體位點之至少一個核苷酸之修飾，視情況其中該一個核苷酸為G或T。
- 如請求項1至3中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含剪接位點邊界核苷酸之修飾。
- 如請求項1至4中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少5、6、7、8、9或10個連續核苷酸。
- 如請求項1至5中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
- 如請求項1至6中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234。
- 如請求項1至7中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
- 如請求項1至8中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。
- 一種工程化細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC之表面表現，該工程化細胞包含CIITA基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
- 如請求項10之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234。
- 如請求項10之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
- 如請求項10之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之剪接位點的至少一個核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。
- 如請求項10至13中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含該等基因體座標內之至少5、6、7、8、9或10個連續核苷酸。
- 如請求項10至14中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含該等基因體座標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
- 如請求項1至15中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10895410-10895430、chr16:10898649-10898669、chr16:10898658-10898678、chr16:10902171-10902191、chr16:10902173-10902193、chr16:10902174-10902194、chr16:10902179-10902199、chr16:10902183-10902203、chr16:10902184-10902204、chr16:10902644-10902664、chr16:10902779-10902799、chr16:10902788-10902808、chr16:10902789-10902809、chr16:10902790-10902810、chr16:10902795-10902815、chr16:10902799-10902819、chr16:10903708-10903728、chr16:10903713-10903733、chr16:10903718-10903738、chr16:10903721-10903741、chr16:10903723-10903743、chr16:10903724-10903744、chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
- 如請求項1至16中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10903873-10903893、chr16:10903878-10903898、chr16:10903905-10903925、chr16:10903906-10903926、chr16:10904736-10904756、chr16:10904790-10904810、chr16:10904811-10904831、chr16:10906481-10906501、chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
- 如請求項1至17中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10906485-10906505、chr16:10906486-10906506、chr16:10906487-10906507、chr16:10906492-10906512、chr16:10908127-10908147、chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
- 如請求項1至18中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908130-10908150、chr16:10908131-10908151、chr16:10908132-10908152、chr16:10908137-10908157、chr16:10908138-10908158、chr16:10908139-10908159、chr16:10909006-10909026、chr16:10909007-10909027、chr16:10909018-10909038、chr16:10909021-10909041、chr16:10909022-10909042、chr16:10909172-10909192、chr16:10910165-10910185、chr16:10910176-10910196、chr16:10910186-10910206、chr16:10915547-10915567、chr16:10915551-10915571、chr16:10915552-10915572、chr16:10915567-10915587、chr16:10916348-10916368、chr16:10916359-10916379、chr16:10916362-10916382、chr16:10916449-10916469、chr16:10916450-10916470、chr16:10916455-10916475、chr16:10916456-10916476、chr16:10918423-10918443、chr16:10918504-10918524、chr16:10918511-10918531、chr16:10918512-10918532、chr16:10918539-10918559、chr16:10922153-10922173、chr16:10922478-10922498、chr16:10922487-10922507、chr16:10922499-10922519、chr16:10923205-10923225、chr16:10923214-10923234、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923220-10923240、chr16:10923221-10923241及chr16:10923222-10923242。
- 如請求項1至19中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430及chr16:10908130-10908150。
- 如請求項1至20中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026及chr16:10922478-10922498。
- 如請求項1至21中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512及chr16:10906487-10906507。
- 如請求項1至22中任一項之工程化細胞，其中該II類MHC表現藉由結合至CIITA基因體目標序列之基因編輯系統而降低或消除，該目標序列包含選自以下之基因體座標內之至少5個連續核苷酸：chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906485-10906505、chr16:10916359-10916379、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10922153-10922173、chr16:10916450-10916470、chr16:10923222-10923242、chr16:10916449-10916469及chr16:10923214-10923234。
- 如請求項16至23中任一項之工程化細胞，其中該CIITA基因體目標序列包含該等基因體座標內之至少10個或至少15個連續核苷酸。
- 如請求項16至24中任一項之工程化細胞，其中該基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑。
- 如請求項1至25中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞進一步具有降低或消除的I類MHC之表面表現。
- 如請求項1至26中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞包含β-2-微球蛋白(B2M)基因中之基因修飾。
- 如請求項1至27中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞包含HLA-A基因中之基因修飾。
- 如請求項1至28中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞包含編碼表現於該工程化細胞之表面上之靶向受體的外源核酸。
- 如請求項29之工程化細胞，其中該靶向受體為CAR、T細胞受體(TCR)或WT1 TCR。
- 如請求項1至30中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞進一步包含編碼由該工程化細胞分泌之多肽的外源核酸。
- 如請求項1至31中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為T細胞且相對於未經修飾細胞進一步具有降低或消除的內源性T細胞受體(TCR)蛋白表現。
- 如請求項32之工程化細胞，其中該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的TRAC蛋白或TRBC蛋白表現。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至33中任一項之工程化細胞。
- 一種細胞群體，其包含如請求項1至33中任一項之工程化細胞。
- 一種包含細胞群體之醫藥組合物，其中該細胞群包含如請求項1至33中任一項之工程化細胞。
- 如請求項35之細胞群體或如請求項34或36之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少93%、至少94%或至少95% II類MHC陰性。
- 如請求項34至37中任一項之細胞群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少95%、至少97%、至少98%或至少99%內源性TCR蛋白陰性。
- 一種向有需要之個體投與如請求項1至38中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物的方法。
- 一種作為授受細胞轉移(ACT)療法向個體投與如請求項1至39中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物的方法。
- 一種組合物，其包含： 包含引導序列之CIITA引導RNA，該引導序列 a. 靶向包含剪接位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列，或 b. 引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸5個核苷酸或更少的CIITA基因體目標序列中進行切割； 其中該CIITA引導RNA靶向包含基因體座標chr16:10902171-10923242內之至少10個連續核苷酸的CIITA基因體目標序列。
- 一種組合物，其包含： a. CIITA引導RNA (gRNA)，該gRNA包含 i. 選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列；或 ii. 選自SEQ ID NO: 1-101之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或 iv. 包含表1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列；或 v. 來自(iv)之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或 vi. 與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列。
- 一種組合物，其包含： a. CIITA引導RNA，其為單引導RNA (sgRNA)，該sgRNA包含 i. 選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列；或 ii. 選自SEQ ID NO: 1-101之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 1-101之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或 iv. 包含表1中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列；或 v. 來自(iv)之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸；或 vi. 與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列。
- 如請求項41至43中任一項之組合物，其進一步包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸。
- 如請求項44之組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區域。
- 如請求項44之組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。
- 如請求項45或46之組合物，其進一步包含尿嘧啶醣苷酶抑制劑(UGI)。
- 如請求項45至47中任一項之組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑藉由該CIITA基因體目標序列產生胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)之轉化。
- 如請求項45至47中任一項之組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑藉由該CIITA基因體目標序列產生腺嘌呤(A)向鳥嘌呤(G)之轉化。
- 如請求項41至47中任一項之組合物，其中該CIITA引導RNA靶向包含剪接受體位點或剪接供體位點之至少一個核苷酸的CIITA基因體目標序列。
- 如請求項50之組合物，其中該一個核苷酸為該剪接受體位點處之該剪接位點邊界核苷酸或該剪接供體位點處之該剪接位點邊界核苷酸。
- 如請求項41至51中任一項之組合物，其中該CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列引導經RNA引導之DNA結合劑，以在距離剪接位點邊界核苷酸4個核苷酸或更少、3個核苷酸或更少、2個核苷酸或更少或1個核苷酸的CIITA基因體目標序列中進行切割。
- 如請求項41至52中任一項之組合物，其中該CIITA引導RNA包含引導序列，該引導序列引導經RNA引導之DNA結合劑，以在剪接位點邊界核苷酸處之CIITA基因體目標序列中進行切割。
- 一種製造工程化細胞之方法，該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白之表面表現，該方法包含使細胞與如請求項41至53中任一項之組合物接觸。
- 一種相對於未經修飾細胞降低工程化細胞中之II類MHC蛋白之表面表現的方法，其包含使細胞與如請求項41至53中任一項之組合物接觸。
- 如請求項54或55之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中I類MHC蛋白之表面表現。
- 如請求項54至56中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中B2M蛋白之表面表現。
- 如請求項54至57中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中HLA-A蛋白之表面表現。
- 如請求項54至58中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中TCR蛋白之表面表現。
- 如請求項54至59中任一項之方法，其進一步包含使該細胞與外源核酸接觸。
- 如請求項60之方法，其進一步包含使該細胞與編碼靶向受體或由該細胞分泌之多肽的外源核酸接觸。
- 如請求項1至61中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使該細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子。
- 如請求項1至62中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含外源核酸或使該細胞與外源核酸接觸，其中該外源核酸編碼NK細胞抑制劑分子，其中該NK細胞抑制劑分子結合至NK細胞上之抑制性受體，該NK細胞抑制劑分子結合至NK細胞上之NKG2A，該NK細胞抑制劑分子為非經典I類MHC分子，該NK細胞抑制劑分子為HLA-E，該NK細胞抑制劑分子為融合蛋白，或該NK細胞抑制劑分子為包含HLA-E及B2M之融合蛋白。
- 如請求項1至63中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為抗體或抗體片段。
- 如請求項1至64中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為全長IgG抗體、單鏈抗體、中和抗體。
- 如請求項1至65中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為治療多肽。
- 如請求項1至66中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中所分泌之多肽為酶、細胞介素或趨化因子。
- 如請求項1至67中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為T細胞受體(TCR)、WT1 TCR或CAR。
- 如請求項1至68中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該CIITA引導RNA、該經CIITA RNA引導之DNA結合劑及/或該外源核酸在載體中提供至該細胞，視情況其中該CIITA引導RNA及該經CIITA RNA引導之DNA結合劑在同一載體中提供。
- 如請求項69之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為慢病毒載體。
- 如請求項69之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為AAV。
- 如請求項1至71中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該引導RNA或該外源核酸在脂質核酸組裝組合物中，視情況在與經RNA引導之DNA結合劑相同的脂質核酸組裝組合物中提供至該細胞。
- 如請求項72之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該脂質核酸組裝組合物為脂質奈米粒子(LNP)。
- 如請求項41至73中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中該CIITA引導RNA包含選自以下之核苷酸：SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 82及SEQ ID NO: 96。
- 如請求項41至74中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其中該CIITA引導RNA包含至少一個修飾，其中該至少一個修飾包括(i) 2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸，(ii)核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵，(iii) 2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸，(iv)該引導RNA之5'端之前五個核苷酸中之一或多者處之修飾，(v)該引導RNA之3'端之最後五個核苷酸中之一或多者處之修飾，(vi)該引導RNA之前四個核苷酸之間的PS鍵，(vii)該引導RNA之最後四個核苷酸之間的PS鍵，(viii)該引導RNA之5'端之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸，(ix)該引導RNA之3'端之最後三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸，或(i)-(ix)中之一或多者之組合。
- 如請求項41至75中任一項之工程化細胞或細胞群體，其包含基因修飾，該基因修飾包括在該CIITA引導RNA所靶向之基因體區域內之插入/缺失。
- 如請求項41至75中任一項之工程化細胞或細胞群體，其包含基因修飾，該基因修飾包括在該CIITA引導RNA所靶向之基因體區域內之C至T取代或A至G取代。
- 如請求項1至77中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於表現對由癌細胞表現之多肽具有特異性之TCR。
- 如請求項1至78中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於作為授受細胞轉移(ACT)療法向個體投與。
- 如請求項1至79中任一項之工程化細胞、細胞群體、組合物、醫藥組合物或方法，其用於治療患有癌症、感染性疾病或自體免疫疾病之個體。
- 如請求項1至80中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因修飾包含插入/缺失。
- 如請求項1至81中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因修飾包含C至T取代。
- 如請求項1至82中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因修飾包含A至G取代。
- 如請求項1至83中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
- 如請求項1至84中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的，且其中該HLA-A基因中之該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸： a. chr6:29942854至chr6:29942913，及 b. chr6:29943518至chr6: 29943619。
- 如請求項1至85中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞進一步包含HLA-A基因中之基因修飾，且其中該HLA-A基因中之該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864至chr6: 29942903或chr6:29943528至chr6:29943609。
- 一種製造工程化細胞之方法，該工程化細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除的II類MHC蛋白及HLA-A蛋白之表面表現，該方法包含： a. 使該細胞與CIITA引導RNA接觸，其中該引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-101之引導序列； b. 使該細胞與HLA-A引導RNA接觸，其中該HLA-A引導RNA包含選自SEQ ID NO: 2001-2095中之任一者的引導序列；及 c. 視情況使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸接觸； 藉此相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中II類MHC蛋白及HLA-A蛋白之表面表現。
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