JP2023552816A - 細胞内のｍｈｃクラスｉｉを低減する組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
例えば養子細胞移入療法で用いるために、細胞において、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減する組成物及び方法であって、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含む組成物及び方法。【選択図】図１Ａ
Description
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２０年１２月１１日に出願した米国特許仮出願第６３／１２４，０６４号及び２０２０年１２月２３日に出願した米国特許仮出願第６３／１３０，１０６（それぞれの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に対して利益を主張するものである。
本願は、電子形式の配列表とともに出願されている。その配列表は、２０２１年１２月１０日に作成した「２０２１－１２－１０＿０１１５５－００３４－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイル（サイズ：３９２，０８１バイト）として提供されている。電子形式の配列表内の情報は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
ＭＨＣクラスＩＩをダウンレギュレートする能力は、多くのｉｎ ｖｉｖｏ用途及びｅｘ ｖｉｖｏ用途、例えば、移植及び／または例えば、Ｔ細胞を活性化しない細胞集団のｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製に、同種異系細胞（ドナー由来の細胞）を使用する場合に不可欠である。特に、対象への同種異系細胞の移入には、細胞療法の分野で、大きな関心が寄せられている。同種異系細胞の利用は、移植細胞を外来物質として認識して攻撃を行う、レシピエント対象の免疫細胞による拒絶の問題により、限られている。免疫拒絶の問題を回避するために、細胞ベース療法では、対象自身の細胞を療法の細胞源として使用する自家移植のアプローチ、すなわち、時間とコストがかかるアプローチに着目してきた。
典型的には、同種異系細胞の免疫拒絶は、ドナーとレシピエントの間で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子がマッチしないことに起因する。ヒト集団において、ＭＨＣ分子は、例えば、いずれかの所定のＭＨＣ遺伝子の、多くの遺伝的バリアント、すなわち、異なる形態のＭＨＣタンパク質をコードするアレルを含め、様々な形態で存在する。ＭＨＣ分子の主なクラスは、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩという。ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ヒトのＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）は、すべての有核細胞上に発現し、抗原を提示して、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＴＬ）を活性化する。ＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ヒトのＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲ）は、特定の種類の細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞及びマクロファージ）のみで発現し、抗原を提示して、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＴｈ細胞）を活性化し、その結果、ヘルパーＴ細胞は、シグナルをＢ細胞に供給して、抗体を産生させる。
例えば、個体間でのＭＨＣアレルのわずかな違いは、レシピエントのＴ細胞を活性化させることができる。Ｔ細胞発生時に、個体のＴ細胞レパートリーは、自己のＭＨＣ分子に対しては免疫寛容状態となるが、別の個体のＭＨＣ分子を認識するＴ細胞は、循環血液中に存続でき、このＴ細胞は、同種反応性Ｔ細胞という。同種反応性Ｔ細胞は、例えば、ＭＨＣ分子を発現している別の個体の細胞が体内に存在することによって活性化して、例えば、移植片対宿主病及び移植片拒絶反応を引き起こすことがある。
例えば、ＭＨＣタンパク質の、細胞での発現を減少させて、レシピエントのＴ細胞応答を回避する方法及び組成物を含め、同種異系細胞の、拒絶反応に対する感受性を低下させる方法及び組成物に関心が寄せられている。実際には、対象に移植を行うために、同種異系細胞の遺伝子修飾を行う能力は、同時に、レシピエントの他の有害な免疫応答を回避しながら、複数の遺伝子を編集して、すべてのＭＨＣタンパク質の発現を減少させる必要性によって妨げられてきた。例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質を枯渇させる方策は、ＣＴＬの活性化を低下させることができる一方で、表面上にＭＨＣクラスＩがない細胞は、免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による溶解の影響を受けやすい。ＮＫ細胞の活性化は、ＭＨＣクラスＩ特異的な抑制性受容体が調節するからである。ＭＨＣクラスＩＩ分子を枯渇させる遺伝子編集策も、編集効率の低さ及び細胞生存率の低さを含む理由から、特に特定の種類の細胞において難しいことが分かっており、細胞療法としての実用が妨げられている。
したがって、レシピエントの免疫拒絶反応の問題、及びより安全な移植用細胞を作製するために必要な複数の遺伝子修飾に伴う技術的な問題を解消するために、同種異系細胞を修飾する方法及び組成物の改善に対するニーズが存在する。
本開示は、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除された操作細胞を提供する。その操作細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子（クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子）に遺伝子修飾を含み、この細胞は、細胞療法で有用であることがある。本開示はさらに、ＣＩＩＴＡ遺伝子を遺伝子修飾することによって、細胞において、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減または排除する組成物及び方法を適用する。ＣＩＩＴＡタンパク質は、転写活性化因子（ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを活性化する因子）として機能し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現に不可欠である。いくつかの実施形態では、本開示はさらに、Ｂ２Ｍ（β－２－ミクログロブリン）を遺伝子修飾することによって、細胞において、ＭＨＣクラスＩタンパク質の表面発現を低減または排除する組成物及び方法を提供する。Ｂ２Ｍタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ分子とヘテロ二量体を形成し、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に必要とされる。本開示はさらに、ＮＫ細胞の溶解活性を低減または排除する細胞によるＮＫ細胞阻害剤分子を発現させる。いくつかの実施形態では、それらの方法及び組成物はさらに、外来性核酸、例えば、ターゲティング受容体、細胞表面に発現するその他のポリペプチド、またはその細胞から分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸を挿入させる。すなわち、いくつかの実施形態では、その操作細胞は、レシピエントにおいて、外来性タンパク質を分泌する「細胞工場」として有用である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、養子細胞療法として有用である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の、少なくとも１つのスプライス部位のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの実施形態では、その１つのヌクレオチドは、Ａである。いくつかの実施形態では、その１つのヌクレオチドは、Ｇである。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの実施形態では、その１つのヌクレオチドは、Ｇである。いくつかの実施形態では、その１つのヌクレオチドは、Ｔである。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライス部位境界ヌクレオチドの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換、またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３及びｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ａ）ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物を提供し、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。
いくつかの実施形態では、ａ）ｉ）配列番号１～１０１から選択したガイド配列、ｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、ｉｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一なガイド配列、ｉｖ）表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列、ｖ）（ｉｖ）の配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、またはｖｉ）（ｖ）から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一であるガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ａ）ｉ）配列番号１～１０１から選択したガイド配列、ｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、ｉｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一なガイド配列、ｉｖ）表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列、ｖ）（ｉｖ）の配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、またはｖｉ）（ｖ）から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一であるガイド配列を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞を作製する方法であって、細胞と、本明細書に示されている実施形態のうちのいずれかの組成物とを接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その組成物は、配列番号４７、配列番号５５、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００及び配列番号１０１から選択したヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、配列番号４７、配列番号５５、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号１００から選択したヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、操作細胞において、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減する方法であって、細胞と、本明細書に示されている実施形態のうちのいずれかの組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
本開示は、例えば養子細胞移入（ＡＣＴ）療法に有用である操作細胞、ならびに、細胞を遺伝子修飾して、例えば養子細胞移入（ＡＣＴ）療法に有用である操作細胞及び操作細胞集団を作製する方法及び組成物を提供する。本明細書に示されている本開示は、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾して、細胞の表面上でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減する方法及び組成物を提供することによって、従来の方法の特定のハードルをなくす。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子における遺伝子修飾の結果、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する組成物及び方法、ならびに、さらに、細胞の、免疫拒絶反応に対する感受性を低下させる組成物及び方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、その方法及び組成物は、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減もしくは排除すること、ＭＨＣクラスＩタンパク質の表面発現を低減もしくは排除すること、及び／またはＮＫ細胞阻害剤分子、ターゲティング受容体、もしくはその他のポリペプチド（細胞表面上に発現するか、もしくは分泌されるポリペプチド）をコードする外来性核酸を、細胞に、遺伝子修飾によって挿入することを含む。本明細書に開示されている方法によって作製した操作細胞組成物は、例えば、ＭＨＣ分子の発現の低減、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性の低下、生存率の上昇、ならびに、より多くの移植対象との遺伝子適合性の上昇を含め、望ましい特性を有する。
「約」または「およそ」という用語は、当業者が求めた特定の値の許容誤差を意味し、その許容誤差は部分的には、その値を測定もしくは判定した方法、または記載されている事項の特性に実質的に影響を及ぼさないか、もしくは当該技術分野における公差内、例えば、１０％、５％、２％もしくは１％以内であるばらつきの程度によって決まる。したがって、特に反対の記載がない限り、以下の明細書及び添付の請求項に示されている数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。それぞれの数値パラメータは、最低限でも、かつ、特許請求の範囲への均等論の適用を制限する試みとしてではなく、報告されている有効数字の数を考慮して、かつ通常の四捨五入の技法を適用することによって、少なくとも解釈しなければならない。
Ｉ．定義
別段の記載のない限り、下記の用語及び語句は、本明細書で使用する場合、下記の意味を有するように意図されている。
別段の記載のない限り、下記の用語及び語句は、本明細書で使用する場合、下記の意味を有するように意図されている。
「またはこれらの組み合わせ」という用語は、本明細書で使用する場合、その用語の前に列挙されている用語のすべての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃまたはこれらの組み合わせ」とは、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むように意図されており、特定の文脈において、順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣまたはＣＡＢを含むようにも意図されている。この例を続けると、１つ以上の項目または用語が繰り返されたもの（ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＣＢＢＡ、ＣＡＢＡなど）を含む組み合わせも明示的に含まれる。文脈から明らかにそうでない場合を除き、典型的には、いずれかに組み合わせる項目または用語の数には制限がないことを当業者は理解するであろう。
本明細書で使用する場合、「キット」という用語は、関連する構成成分（１つ以上のポリヌクレオチドまたは組成物）と、１つ以上の関連する物質（送達器具（例えばシリンジ）、溶媒、溶液、緩衝液、説明書または乾燥剤など）がパッケージ化されたセットを指す。
「同種異系」細胞とは、本明細書で使用する場合、レシピエント対象と同じ種のドナー対象から得た細胞を指し、そのドナー対象とレシピエント対象には、遺伝子の相違が見られ、例えば、１つ以上の座位の遺伝子が同一ではない。すなわち、例えば、細胞は、その細胞の投与を受ける対象にとって同種異系である。本明細書で使用する場合、ドナーから取り出すか、または単離するかした細胞であって、元のドナーには再び導入しない細胞は、同種異系細胞とみなす。
「自家」細胞は、本明細書で使用する場合、同じ対象から採取した細胞であって、その細胞物質を後で再び導入することになる細胞を指す。すなわち、例えば、細胞は、対象から取り出して、後で同じ対象に再び導入する場合、自家とみなす。
「β２Ｍ」または「Ｂ２Ｍ」は、本明細書で使用する場合、「β－２ミクログロブリン」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、そのヒト遺伝子は、アクセッション番号がＮＣ＿００００１５である（範囲４４７１１４９２．．４４７１８８７７）（リファレンスＧＲＣｈ３８．ｐ１３）。Ｂ２Ｍタンパク質は、有核細胞の表面上で、ＭＨＣクラスＩ分子とヘテロ二量体として会合し、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に必要とされる。
「ＣＩＩＴＡ」または「Ｃ２ＴＡ」は、本明細書で使用する場合、「クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、そのヒト遺伝子は、アクセッション番号がＮＣ＿００００１６．１０である（範囲１０８６６２０８．．１０９４１５６２）（リファレンスＧＲＣｈ３８．ｐ１３）。核内のＣＩＩＴＡタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写の正のレギュレーターとして働き、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現に必要とされる。
本明細書で使用する場合、「ＭＨＣ」、「ＭＨＣ分子（複数可）」、「ＭＨＣタンパク質」または「ＭＨＣ複合体（複数可）」とは、主要組織適合性複合体分子（単数または複数）を指し、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子が挙げられる。ヒトでは、ＭＨＣ分子は、「ヒト白血球抗原」複合体、「ＨＬＡ分子」または「ＨＬＡタンパク質」という。「ＭＨＣ」及び「ＨＬＡ」という用語を使用していても、限定するようには意図されておらず、本明細書で使用する場合、「ＭＨＣ」という用語を用いて、ヒトＭＨＣ分子、すなわちＨＬＡ分子を指すこともある。したがって、「ＭＨＣ」及び「ＨＬＡ」という用語は、本明細書では同義的に用いられている。
「ＨＬＡ－Ａ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＨＬＡ－Ａタンパク質の文脈では、ＭＨＣクラスＩタンパク質分子を指し、その分子は、重鎖（ＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされる）及び軽鎖（すなわちβ－２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。「ＨＬＡ－Ａ」または「ＨＬＡ－Ａ遺伝子」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸の文脈では、ＨＬＡ－Ａタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、「ＨＬＡクラスＩ組織適合，Ａ α鎖」ともいい、そのヒト遺伝子は、アクセッション番号がＮＣ＿０００００６．１２（２９９４２５３２．．２９９４５８７０）である。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、その集団にわたって、何千もの異なる型（「アレル」ともいう）があることが知られている（個体は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の、２つの異なるアレルを受け取ることができる）。ＨＬＡ－Ａアレルに関する公共データベースは、配列情報を含め、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／で入手し得る。ＨＬＡ－Ａのアレルのすべては、「ＨＬＡ－Ａ」及び「ＨＬＡ－Ａ遺伝子」という用語に含まれる。
「ＨＬＡ－Ｂ」は、本明細書で使用する場合、核酸の文脈では、ＨＬＡ－Ｂタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ｂは、「ＨＬＡクラスＩ組織適合，Ｂ α鎖」ともいい、そのヒト遺伝子は、アクセッション番号がＮＣ＿０００００６．１２（３１３５３８７５．．３１３５７１７９）である。
「ＨＬＡ－Ｃ」は、本明細書で使用する場合、核酸の文脈では、ＨＬＡ－Ｃタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ｃは、「ＨＬＡクラスＩ組織適合，Ｃ α鎖」ともいい、そのヒト遺伝子は、アクセッション番号がＮＣ＿０００００６．１２（３１２６８７４９．．３１２７２０９２）である。
本明細書で使用する場合、「ゲノム座標内」という用語には、その所定のゲノム座標範囲の境界が含まれる。例えば、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３と示されている場合には、座標ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３が含まれる。本願全体を通じて、言及されているゲノム座標は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍのヒトゲノムのＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８ともいう）アセンブリーにおけるゲノムアノテーションに基づいており、このアセンブリーは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで入手可能である。一方のアセンブリーともう一方のアセンブリーとの間で、ゲノム座標を変換するツール及び方法は、当該技術分野において知られており、それらを用いて、同じ機関によって、または同じアルゴリズムを用いて作られた以前のアセンブリーへの変換（例えば、ＧＲＣｈ３８からＧＲＣｈ３７への変換）、及び異なる機関またはアルゴリズムによって作られたアセンブリーの変換（例えば、ＧＲＣｈ３８から、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって作られたＮＣＢＩ３３への変換）を含め、本明細書に示されているゲノム座標を、ヒトゲノムの別のアセンブリーにおける対応する座標に変換できる。当該技術分野において知られている利用可能な方法及びツールとしては、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｍａｐｐｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで入手可能）、ＵＣＳＣ ＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｅｒのウェブサイトで入手可能）、及びＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ（Ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇのウェブサイトで入手可能）が挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、「ホモ接合型」という用語は、特定の遺伝子の同一アレルを２つ有することを指す。
「スプライス部位」とは、本明細書で使用する場合、アクセプタースプライス部位もしくはドナースプライス部位（下に定義されている）を構成する３ヌクレオチド、または当該技術分野において知られているいずれかの他のヌクレオチドであって、スプライス部位の一部である他のヌクレオチドを指す。例えば、Ｂｕｒｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（２１）：４３６４－４３７５（２０００）（哺乳類動物ゲノムにおけるカノニカルなスプライス部位及び非カノニカルなスプライス部位を説明している）を参照されたい。「アクセプタースプライス部位」を構成する３ヌクレオチドは、イントロンの３’にある２つの保存された残基（例えば、ヒトではＡＧ）と、境界ヌクレオチド（すなわち、ＡＧの３’側のエキソンの最初のヌクレオチド）である。アクセプタースプライス部位の「スプライス部位境界ヌクレオチド」は、下記の図で「Ｙ」と表されており、本明細書では、「アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチド」または「スプライスアクセプター部位境界ヌクレオチド」ともいうこともある。「アクセプタースプライス部位」、「スプライスアクセプター部位」、「アクセプタースプライス配列」または「スプライスアクセプター配列」という用語は、本明細書では同義的に用いてよい。
「ドナースプライス部位」を構成する３ヌクレオチドは、イントロンの５’末端にある２つの保存された残基（例えば、ヒトにおけるＧＴ（遺伝子）またはＧＵ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡのようなＲＮＡの場合））と、境界ヌクレオチド（すなわち、ＧＴの５’側のエキソンの最初のヌクレオチド）である。ドナースプライス部位の「スプライス部位境界ヌクレオチド」は、下記の図では「Ｘ」と表されており、本明細書では、「ドナースプライス部位境界ヌクレオチド」または「スプライスドナー部位境界ヌクレオチド」ということもある。「ドナースプライス部位」、「スプライスドナー部位」、「ドナースプライス配列」または「スプライスドナー配列」という用語は、本明細書では同義的に用いてよい。
本明細書で使用する場合、「スプライス部位領域」には、スプライス部位のヌクレオチド、及びスプライス部位に近接しているヌクレオチドが含まれる。
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、例えば、哺乳類動物、霊長類動物、ヒトを含め、免疫応答を誘発できる生物を含むように意図されている。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書では、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡ混合物、及びこれらのアナログであるポリマーを含め、主鎖に沿って結合した含窒素複素環の塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む多量体化合物を指す目的で使用する。核酸の「主鎖」は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」、すなわちＰＮＡ。国際公開第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含め、様々な結合で構成されていることができる。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換基、例えば、２’メトキシ置換基または２’ハロゲン化物置換基を有する類似の化合物であることができる。含窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらのアナログ（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジンまたはＮ１－メチルシュードウリジンなどのような修飾ウリジン）、イノシン、プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザプリンまたはアザプリン、デアザピリミジンまたはアザピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば５－メチルシトシン）、２位、６位または８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン（米国特許第５，３７８，８２５号及び国際公開第ＷＯ９３／１３１２１号）であることができる。大まかな考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２）を参照されたい。核酸は、主鎖が、そのポリマーの位置（複数可）において、含窒素塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含むことができる（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基及び結合のみを含むこともできるし、または従来の構成成分と置換基の両方（例えば、２’メトキシ結合を有する従来の塩基、もしくは従来の塩基と、１つ以上の塩基アナログの両方を含むポリマー）を含むことができる。核酸には、「ロック核酸」（ＬＮＡ）、すなわち、ＲＮＡにおいてロックされた二環式フラノース単位であって、糖のコンホメーションを模している二環式フラノース単位を有するＬＮＡヌクレオチド単量体を１つ以上含むアナログ（相補的なＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性が増強される）（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）が含まれる。ＲＮＡとＤＮＡは、異なる糖部分を有し、ＲＮＡには、ウラシルまたはそのアナログが存在し、ＤＮＡには、チミンまたはそのアナログが存在することによって、異なることができる。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」及び単純に「ガイド」は、本明細書では、例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を標的ＤＮＡに誘導するガイドを指す目的で同義的に用いられており、シングルガイドＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）との組み合わせであることができる。例示的なｇＲＮＡとしては、修飾形態または非修飾形態のクラスＩＩ ＣａｓヌクレアーゼガイドＲＮＡが挙げられる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、１つのＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として、または２つの別個のＲＮＡ鎖（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）で会合していてよい。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、それぞれの種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然の配列、または天然の配列と比べて、修飾もしくは多様性を有するｔｒＲＮＡ配列であってよい。
本明細書で使用する場合、「ガイド配列」とは、ガイドＲＮＡ内の配列のうち、標的配列と相補的である配列を指し、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤によって結合または修飾（例えば切断）する標的配列に誘導するように機能する。「ガイド配列」は、「ターゲティング配列」または「スペーサー配列」ということもある。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９））及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合には、２０塩基対長であることができる。もっと短いかまたは長い配列、例えば、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長または２５ヌクレオチド長の配列も、ガイドとして使用できる。いくつかの実施形態では、その標的配列は、遺伝子内または染色体上にあり、例えば、ガイド配列と相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列と、その対応する標的配列との相補性または同一性の程度は、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域は、１００％相補的または同一であってよい。別の実施形態では、ガイド配列と標的領域は、ミスマッチを少なくとも１つ含んでよい。例えば、ガイド配列と標的配列は、ミスマッチを１個、２個、３個または４個含んでよく、その標的配列の全長は、少なくとも１７塩基対、１８塩基対、１９塩基対または２０塩基対以上である。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域は、ミスマッチを１～４個含んでよく、そのガイド配列は、少なくとも１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチド以上含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域は、ミスマッチを１個、２個、３個または４個含んでよく、そのガイド配列は、２０ヌクレオチドを含む。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのポジティブ鎖及びネガティブ鎖の両方（すなわち、所定の配列及びその配列の逆相補体）を含む。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の核酸基質は、二本鎖核酸であるからである。したがって、ガイド配列が「標的配列と相補的である」と言う場合には、そのガイド配列は、ガイドＲＮＡを誘導して、標的配列の逆相補体に結合することができると理解されたい。すなわち、いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合には、そのガイド配列は、そのガイド配列におけるＴからＵへの置換部分を除き、その標的配列の特定のヌクレオチド（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤」とは、ＲＮＡ結合活性及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチド複合体、またはこのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、そのＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、そのＲＮＡの配列によって決まる。例示的なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤としては、Ｃａｓクリバーゼ／Ｃａｓニッカーゼ、及びこれらの不活化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓヌクレアーゼ」（「Ｃａｓタンパク質」ともいう）には、Ｃａｓクリバーゼ、Ｃａｓニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が含まれる。Ｃａｓクリバーゼ／Ｃａｓニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤としては、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍ複合体またはＣｍｒ複合体、それらのＣａｓ１０サブユニット、Ｃｓｍ１サブユニットまたはＣｍｒ２サブユニット、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２のＣａｓヌクレアーゼが挙げられる。本明細書で使用する場合、「クラス２のＣａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２のＣａｓヌクレアーゼとしては、ＲＮＡ誘導型のＤＮＡクリバーゼ活性またはＤＮＡニッカーゼ活性をさらに有する、クラス２のＣａｓクリバーゼ／Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａバリアント、Ｄ１０ＡバリアントまたはＮ８６３Ａバリアント）と、クリバーゼ活性／ニッカーゼ活性が不活化されている、クラス２のｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が挙げられる。クラス２のＣａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａバリアント、Ｒ６６１Ａバリアント、Ｑ６９５Ａバリアント、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａバリアント、Ｍ６９４Ａバリアント、Ｑ６９５Ａバリアント、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａバリアント、Ｋ１００３Ａバリアント、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａバリアント、Ｋ１００３Ａバリアント、Ｒ１０６０Ａバリアント）というタンパク質、ならびにこれらの修飾体が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。Ｚｅｔｓｃｈｅの文献のＣｐｆ１配列は、参照により、その全体が援用される。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの文献の表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「エディター」という用語は、ＤＮＡ配列内に修飾を加えることができるポリペプチドを含む作用物質を指す。いくつかの実施形態では、エディターは、Ｃａｓ９クリバーゼのようなクリバーゼである。いくつかの実施形態では、エディターは、ＤＮＡ分子内の塩基を脱アミノ化できる。いくつかの実施形態では、エディターは、ＤＮＡにおけるシトシン（Ｃ）を脱アミノ化できる。いくつかの実施形態では、エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エディターは、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）に融合したＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エディターは、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）に融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、エディターは、シチジンデアミナーゼ及びＵＧＩに融合したＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エディターは、ＵＧＩが欠損している。
本明細書で使用する場合、「シチジンデアミナーゼ」とは、シチジンまたはデオキシシチジンの、加水分解による脱アミノ化を触媒して、典型的には、ウリジンまたはデオキシウリジンをもたらすシチジンデアミナーゼ活性が可能であるポリペプチドまたはポリペプチド複合体を意味する。シチジンデアミナーゼには、シチジンデアミナーゼスーパーファミリーの酵素、特に、ＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素（サブグループ酵素ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ４及びＡＰＯＢＥＣ３）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤまたはＡＩＣＤＡ）、ならびにＣＭＰデアミナーゼが含まれる（例えば、Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２２：３６７－７７，２００５、Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．９：２２９，２００８、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８４７０－６，１９９９）、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ ９：１６９０（２０２０）を参照されたい）。
本明細書で使用する場合、「ＡＰＯＢＥＣ３」という用語は、ヒトＡＰＯＢＥＣ３座位の７遺伝子（Ａ３Ａ－Ａ３Ｈ）のうちのいずれかによって発現したＡＰＯＢＥＣ３タンパク質のようなＡＰＯＢＥＣ３タンパク質を指す。ＡＰＯＢＥＣ３は、ＤＮＡまたはＲＮＡの編集触媒活性を有し得る。ＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、説明されており（ＵｎｉＰＲＯＴアクセッションＩＤ：ｐ３１９４１）、本明細書には、配列番号４０として含まれている。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質は、ヒトＡＰＯＢＥＣ３タンパク質及び／または野生型タンパク質である。バリアントには、１つまたは数個の一点置換のような１つまたは数個の変異（すなわち、置換、欠失、挿入）によって、野生型ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質と異なる配列を有するタンパク質が含まれる。例えば、数個のＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸、好ましくは、ＡＰＯＢＥＣ３配列のＣ末端の１～４アミノ酸を欠失させることによって、例えば、短縮型のＡＰＯＢＥＣ３配列を使用できるであろう。本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、アレルバリアント、スプライシングバリアント、及び天然または人工の変異体を指し、これらは、ＡＰＯＢＥＣ３参照配列と相同である。バリアントは、ＤＮＡ編集またはＲＮＡ編集の触媒活性を示すという点で「機能的」である。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３（ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａなど）は、野生型アミノ酸の５７位（野生型配列でナンバリングした場合）を有する。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３（ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａなど）は、アミノ酸の５７位（野生型配列でナンバリングした場合）に、アスパラギンを有する。
本明細書で使用する場合、「ニッカーゼ」は、二本鎖ＤＮＡにおいて一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を作る酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖は切断するが、もう一方の鎖は切断しない酵素である。本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡニッカーゼ」とは、ＤＮＡニッカーゼ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、そのＤＮＡニッカーゼ活性が、配列特異的であり、そのＲＮＡの配列によって決まるポリペプチドまたはポリペプチド複合体を意味する。例示的なＲＮＡ誘導型ＤＮＡニッカーゼとしては、Ｃａｓニッカーゼが挙げられる。Ｃａｓニッカーゼとしては、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍ複合体またはＣｍｒ複合体、それらのＣａｓ１０サブユニット、Ｃｓｍ１サブユニットまたはＣｍｒ２サブユニット、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２のＣａｓヌクレアーゼのニッカーゼ形態が挙げられる。クラス２のＣａｓニッカーゼには、２つの触媒ドメインのうちの１つのみが不活化されているバリアントが含まれ、それらのバリアントは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡニッカーゼ活性を有する。クラス２のＣａｓニッカーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９（例えば、ＳｐｙＣａｓ９のＨ８４０Ａバリアント、Ｄ１０ＡバリアントまたはＮ８６３Ａバリアント）、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａバリアント、Ｒ６６１Ａバリアント、Ｑ６９５Ａバリアント、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａバリアント、Ｍ６９４Ａバリアント、Ｑ６９５Ａバリアント、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａバリアント、Ｋ１００３Ａバリアント、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａバリアント、Ｋ１００３Ａバリアント、Ｒ１０６０Ａバリアント）というタンパク質、ならびにこれらの修飾体が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様タンパク質ドメインを含む。Ｚｅｔｓｃｈｅの文献のＣｐｆ１配列は、参照により、その全体が援用される。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの文献の表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。「Ｃａｓ９」には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９、本明細書に列挙されているＣａｓ９バリアント、及びそれらの等価物が含まれる。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。１つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に位置するので、それぞれ、「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」を形成し得る。本明細書に示されているタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって作製できる。例えば、本明細書に示されているタンパク質は、組み換えタンパク質の発現及び精製によって作製でき、この方法は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適する。組み換えタンパク質の発現及び精製の方法は周知であり、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））によって説明された方法が挙げられ、この文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
「リンカー」という用語は、本明細書で使用する場合、２つの隣接する分子または部分を連結する化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子またはその他の部分の間に位置するか、またはこれらに挟まれ、共有結合によって、各自に連結されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、１６アミノ酸残基である「ＸＴＥＮ」リンカーまたはそのバリアントのように、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である（例えば、実施例、及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｍａｎｎｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，１１８６－１１９０（２００９）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮリンカーは、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９００）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号９０１）またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９０２）という配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号９０３～９７１から選択した１つ以上の配列を含むペプチドリンカーである。
本明細書で使用する場合、「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「ＵＧＩ」という用語は、塩基除去修復酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を阻害できるタンパク質を指す。
本明細書で使用する場合、遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、その遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を指定する一連のコドンからなる配列を指す。ＯＲＦは、開始コドン（例えば、ＤＮＡではＡＴＧ、またはＲＮＡではＡＵＧ）で始まり、終止コドン、例えば、ＤＮＡではＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡ、またはＲＮＡではＵＡＡ、ＵＡＧもしくはＵＧＡで終わる。
本明細書で使用する場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」とは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリバーゼ、ＣａｓニッカーゼまたはｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えばＣａｓ９）のようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤と一緒になったガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９のようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を標的配列に誘導し、ガイドＲＮＡが、標的配列とハイブリダイズし、その結合剤が、標的配列に結合し、その結合剤が、クリバーゼまたはニッカーゼである場合には、結合の後に、切断するか、またはニックを入れることができる。
本明細書で使用する場合、第１の配列は、「第１の配列と第２の配列とのアラインメントにより、第２の配列の位置全体のＸ％以上が、第１の配列と一致すると示される場合に、第２の配列との同一性が少なくともＸ％である配列を含む」とみなす。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧとの同一性が１００％である配列を含む。アラインメントにより、第２の配列の３つの位置すべてと一致するという点で、１００％の同一性が得られるからである。ＲＮＡとＤＮＡの違い（概して、チミジンの代わりにウリジンが含まれるか、またはウリジンの代わりにチミジンが含まれる）、及び修飾ウリジンのようなヌクレオシドアナログの存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジンまたは修飾ウリジン）が、同じ相補体を有する（例えば、チミジン、ウリジンまたは修飾ウリジンのすべてにおけるアデノシン。別の例は、シトシン及び５－メチルシトシンであり、これらのいずれも、グアノシンまたは修飾グアノシンを相補体として有する）限りは、ポリヌクレオチド間での同一性または相補性の違いには寄与しない。したがって、例えば、５’－ＡＸＧという配列（Ｘは、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンのようないずれかの修飾ウリジンである）は、ＡＵＧと１００％同一であるとみなす。いずれも、同じ配列（５’－ＣＡＵ）と完全に相補的であるからである。例示的なアラインメントアルゴリズムは、当該技術分野において周知であるＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズムである。当業者は、アラインメントする所定の配列ペアには、どのようなアルゴリズム設定及びパラメーター設定の選択が適切であるか理解するであろう。長さが概ね同程度であり、アミノ酸の同一性が５０％超であるか、またはヌクレオチドの同一性が７５％超であると予測される配列には、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズムインターフェースがデフォルト設定であるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＥＢＩによって、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのウェブサーバーで供給されている）が、概ね適切である。
「ｍＲＮＡ」は、本明細書では、ポリヌクレオチドを指す目的で使用し、ポリペプチドに翻訳できるオープンリーディングフレームを含む（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳の基質として機能できる）。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログ、例えば２’－メトキシリボース残基を含む、リン酸－糖の主鎖を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのリン酸－糖の主鎖の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基またはこれらの組み合わせから本質的になる。
本明細書で使用する場合、「インデル」は、例えば、標的核酸の二本鎖切断（ＤＳＢ）部位で挿入されたか、または欠失されたかのいずれかである相当数のヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。
本明細書で使用する場合、細胞でのタンパク質の発現の「低減または排除」とは、そのタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて部分的または完全に欠損することを指す。いくつかの実施形態では、細胞でのタンパク質の表面発現は、フローサイトメトリーによって測定し、そのタンパク質に対する同じ抗体で染色したときに、蛍光シグナルが低下することによって立証された場合に、表面発現が、非修飾細胞と比べて「低減または排除」している。タンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて「低減または排除」されている細胞は、フローサイトメトリーによって、アイソタイプコントロール抗体で染色した細胞と同程度の蛍光シグナルによって立証された場合には、そのタンパク質の発現に関して「陰性」であるとしてよい。タンパク質発現の「低減または排除」は、当業者に知られている適切なコントロールとともに、当該分野において他の既知の技法によって測定できる。
本明細書で使用する場合、「ノックダウン」とは、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはこれらの両方）の発現を、例えば、未編集の標的配列の発現と比べて低減することを指す。タンパク質のノックダウンは、該当の組織、流体または細胞集団のような試料から採取したそのタンパク質の、細胞での総量を検出することによって測定できる。タンパク質のノックダウンは、そのタンパク質のサロゲート、マーカーまたは活性を測定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は知られており、該当試料から単離したｍＲＮＡを解析することが挙げられる。いくつかの実施形態では、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物の発現がいくらか欠損すること、例えば、細胞または細胞集団（組織内に見られるようなｉｎ ｖｉｖｏ集団を含む）によるｍＲＮＡ転写量の減少またはタンパク質発現量の減少を指すこともある。
本明細書で使用する場合、「ノックアウト」は、細胞において、特定の遺伝子からの発現または特定のタンパク質の発現が欠損することを指す。ノックアウトにより、発現を、アッセイの検出レベル未満に減少させることができる。ノックアウトは、細胞、組織または細胞集団において、細胞でのタンパク質の総量を検出することのいずれかによって測定できる。
本明細書で使用する場合、「標的配列」または「ゲノム標的配列」とは、ｇＲＮＡのガイド配列と相補性を有する、標的遺伝子の核酸の配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、その標的配列に結合して、（その結合剤の活性に応じて、）その標的配列内に潜在的にニックを入れるか、または切断するように誘導される。
本明細書で使用する場合、「治療」とは、対象における疾患または障害に対する治療剤をいずれかに投与または塗布することを指し、その疾患を阻害すること、その発症を阻止すること、その疾患の症状の１つ以上を軽減すること、その疾患を治癒させること、またはその疾患の症状（その症状の再発を含む）の１つ以上を予防することを含む。
以下では、本発明の特定の実施形態に詳細に言及していき、その例は、添付の図面に例示されている。本発明は、例示されている実施形態とともに説明されているが、それらの実施形態は、本発明をそれらの実施形態に限定するようには意図されていないことは理解されるであろう。それどころか、本発明は、代替物、修正形態及び等価物のすべてを網羅するように意図されており、これらは、添付の請求項及び含めた実施形態によって定義されているような本発明に含めてよい。
本発明の教示を詳細に説明する前に、所定の組成物またはプロセス工程は変動し得るので、本開示が、それらに限定されないことを理解されたい。本明細書及び添付の請求項で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」が付された単数形には、複数の言及物が含まれることに留意されたい。したがって、例えば、「コンジュゲート」という場合、複数のコンジュゲートが含まれ、「細胞」という場合、複数の細胞が含まれるなどである。
数字範囲には、その範囲を定義している数字が含まれる。測定値及び測定可能値は、有効数字、及び測定に伴う誤差を考慮した近似値であると理解されたい。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」が用いられている場合にも、限定するようには意図されていない。上記の大まかな説明及び詳細な説明のいずれも、例示的なものであり、説明のためのものに過ぎず、本発明の教示を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に具体的に示されていない限り、本明細書における実施形態のうち、様々な構成成分を「含む」とされている実施形態は、その示されている構成成分「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものとしても想定されており、本明細書における実施形態のうち、様々な構成成分「からなる」とされている実施形態は、示されているその構成成分を「含む」か、またはそれら「から本質的になる」ものとしても想定されており、本明細書における実施形態のうち、様々な構成成分「から本質的になる」とされている実施形態は、その示されている構成成分「からなる」か、またはそれらを「含む」ものとしても想定されている（この互換性は、請求項でこれらの用語が使用されている場合には適用されない）。「または」という用語は、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、包含的な意味で用いられており、すなわち、「及び／または」と同等に用いられている。
本明細書で用いられている、節の見出しは、系統立てるためのものに過ぎず、いかなる場合も、所望の主題を限定するものと解釈すべきではない。参照により援用されるいずれかの資料が、本明細書で定義したいずれかの用語または本明細書のいずれかの他の明示的な内容と矛盾する場合には、本明細書が優先される。本発明の教示が、様々な実施形態とともに説明されているが、本発明の教示が、それらの実施形態に限定されるようには意図されていない。それどころか、当業者には明らかであるように、本発明の教示には、様々な代替物、修正形態及び等価物が含まれる。
ＩＩ．遺伝子修飾された細胞
Ａ．操作細胞組成物
本開示は、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その操作細胞組成物は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減された操作細胞は、養子細胞移入療法に有用である。いくつかの実施形態では、同種異系移植の目的において望ましい細胞が得られるように、その操作細胞は、その細胞のゲノムに、追加の遺伝子修飾を含む。
Ａ．操作細胞組成物
本開示は、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その操作細胞組成物は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減された操作細胞は、養子細胞移入療法に有用である。いくつかの実施形態では、同種異系移植の目的において望ましい細胞が得られるように、その操作細胞は、その細胞のゲノムに、追加の遺伝子修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０８７７３６０－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み、その１つのヌクレオチドは、アデニン（Ａ）である。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み、その１つのヌクレオチドは、グアニン（Ｇ）である。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み、その１つのヌクレオチドは、グアニン（Ｇ）である。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み、その１つのヌクレオチドは、チミン（Ｔ）である。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、スプライス部位境界ヌクレオチドの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ：１６：１０９０６４８５－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３及びｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６及びｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０及びｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８及びｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３及びｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６及びｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０及びｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８及びｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、それらのゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３及びｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６及びｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）のようなデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３である。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０及びｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）のようなデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３である。
いくつかの実施形態では、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８及びｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）のようなデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３である。
いくつかの実施形態では、ゲノム座標：１０９１８５０４－１０９１８５２４内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が低減または排除されている操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列は、それらのゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）のようなデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３である。
いくつかの実施形態では、所定のゲノム座標範囲のそれぞれについては、範囲に、その指定の座標の、いずれかの末端の±１０ヌクレオチドが含まれることがある。所定のゲノム座標範囲のそれぞれについては、その範囲に、その範囲の、いずれかの末端の±５ヌクレオチドが含まれることがある。例えば、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２が示されている場合、いくつかの実施形態では、そのゲノム標的配列または遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９２３２１２－１０９２３２５２に含まれることがある。
いくつかの実施形態では、所定のゲノム座標範囲は、標的配列をＤＮＡの両方の鎖（すなわち、プラス（＋）鎖及びマイナス（－）鎖）に含んでよい。
ＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子修飾については、本明細書にさらに説明されている。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子修飾は、標的配列における少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、置換または脱アミノ化のうちのいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、スプライス部位を不活化する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、スプライス部位のヌクレオチドに挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、スプライス部位のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、スプライス部位のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、スプライス部位のヌクレオチドの脱アミノ化を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、本明細書に記載されているように、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その細胞はさらに、ＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞の表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を排除する遺伝子修飾を含む。
本明細書に記載されているヒト操作細胞は、遺伝子修飾を、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の、いずれかのＨＬＡ－Ａアレルに含んでよい。ＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ超遺伝子座という、ゲノム領域の６番染色体に位置し、当該技術分野では、数百個のＨＬＡ－Ａアレルが報告されている（例えばＳｈｉｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４：１５－３９（２００９を参照されたい）。ＨＬＡ－Ａアレルの配列は、当該技術分野において入手可能である（例えば、特定のＨＬＡ－Ａアレルの配列を検索するためのＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡのデータベースｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｌｅｌｅ．ｈｔｍｌを参照されたい）。
上記実施形態のいずれでも、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、さらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３及びｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３及びｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、ＭＨＣクラスＩの表面発現が低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、遺伝子修飾をβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞の表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する遺伝子修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、外来性核酸を含む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞の表面で発現するターゲティング受容体をコードする。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣａｒ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＷＴ１ ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン、及びＴＣＲのサブユニット）を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）である。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞によって分泌されるポリペプチド（すなわち可溶性ポリペプチド）をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、酵素をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、融合タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、ＭＨＣクラスＩの表面発現が低減または排除されており、その細胞はさらに、外来性核酸を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、遺伝子修飾をβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞の表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞の表面で発現するターゲティング受容体をコードする。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣａｒ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＷＴ１ ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン、及びＴＣＲのサブユニット）を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）である。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞によって分泌されるポリペプチド（すなわち可溶性ポリペプチド）をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、酵素をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、融合タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－ｃｈｒ１６：１０９２３２８５内のエキソンの、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、ＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除されており、その細胞はさらに、外来性核酸を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞の表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞の表面で発現するターゲティング受容体をコードする。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣａｒ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＷＴ１ ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン、及びＴＣＲのサブユニット）を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）である。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞によって分泌されるポリペプチド（すなわち可溶性ポリペプチド）をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、酵素をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、融合タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、内在性ＴＣＲタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、外来性核酸を含み、さらに、内在性ＴＣＲタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、ＭＨＣクラスＩの表面発現が低減または排除されており、その細胞はさらに、内在性ＴＣＲタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、外来性核酸を含み、その細胞はさらに、ＭＨＣクラスＩの表面発現が低減または排除されており、その細胞はさらに、内在性ＴＣＲタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＴＲＡＣタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＴＲＢＣタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、遺伝子修飾をβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞の表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞の表面で発現するターゲティング受容体をコードする。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣａｒ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＷＴ１ ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン、及びＴＣＲのサブユニット）を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）である。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞によって分泌されるポリペプチド（すなわち可溶性ポリペプチド）をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、酵素をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、融合タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含む操作細胞を提供し、その修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－ｃｈｒ１６：１０９２３２８５内のエキソンの、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、その細胞はさらに、外来性核酸を含み、その細胞はさらに、ＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除されており、その細胞はさらに、内在性ＴＣＲタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＴＲＡＣタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＴＲＢＣタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞の表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞の表面で発現するターゲティング受容体をコードする。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣａｒ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＷＴ１ ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン、及びＴＣＲのサブユニット）を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）である。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その操作細胞によって分泌されるポリペプチド（すなわち可溶性ポリペプチド）をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、酵素をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、融合タンパク質をコードする。
その操作細胞は、本明細書に開示されている例示的な種類の細胞のいずれかであってよい。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、単球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞または顆粒球である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、単球である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、マスト細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、樹状細胞である。
いくつかの実施形態では、その操作細胞は、顆粒球である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、メモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、血漿Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、メモリーＢ細胞である。
いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ｂアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２というＨＬＡ－Ｂアレルのいずれか１つから選択されている。
いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択されている。
いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ｂアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２というＨＬＡ－Ｂアレルのいずれか１つから選択されており、そのＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択されている。
いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている操作細胞のいずれか１つを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、本明細書に開示されている操作細胞のいずれか１つの、集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも６５％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも７０％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも８０％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９０％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９１％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９２％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９３％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９４％陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９５％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９７％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９８％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である操作細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９９％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である操作細胞の集団を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている操作細胞または医薬組成物を、必要とする対象に投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている操作細胞または医薬組成物を対象に、ＡＣＴ療法として投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている操作細胞または医薬組成物を対象に、がんの治療として投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている操作細胞または医薬組成物を対象に、自己免疫疾患の治療として投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている操作細胞または医薬組成物を対象に、感染症の治療として投与するための方法を提供する。
Ｂ．ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または排除するための方法及び組成物
本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を遺伝子修飾することによって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の、細胞での表面発現を、非修飾細胞と比べて低減または排除する方法及び組成物を提供する。得られる遺伝的修飾細胞は、本明細書では、操作細胞ということもある。いくつかの実施形態では、すでに遺伝子修飾された細胞（すなわち操作細胞）が、本発明で提供する方法または組成物を用いてさらに遺伝子修飾するための出発細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減された細胞は、養子細胞移入療法に有用である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子の編集を追加の遺伝子修飾と組み合わせて、同種異系移植の目的に望ましい細胞をもたらす。
本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を遺伝子修飾することによって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の、細胞での表面発現を、非修飾細胞と比べて低減または排除する方法及び組成物を提供する。得られる遺伝的修飾細胞は、本明細書では、操作細胞ということもある。いくつかの実施形態では、すでに遺伝子修飾された細胞（すなわち操作細胞）が、本発明で提供する方法または組成物を用いてさらに遺伝子修飾するための出発細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減された細胞は、養子細胞移入療法に有用である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子の編集を追加の遺伝子修飾と組み合わせて、同種異系移植の目的に望ましい細胞をもたらす。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の、細胞表面での表面発現を低減または排除することを含み、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物と、細胞とを接触させることを含み、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、その細胞とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、それによって、本発明の細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減される。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞を作製することを含み、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物と、細胞とを接触させることを含み、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、その細胞とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ領域を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、それによって、本発明の細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減される。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞を遺伝子修飾して、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減または排除することを含み、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物と、細胞とを接触させることを含み、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、その細胞とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ領域を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、それによって、本発明の細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減される。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物と、細胞とを接触させることを含み、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、その細胞とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ領域を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、それによって、本発明の細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減される。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡにおいてＤＳＢまたは一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導することを含み、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物と、細胞とを接触させることを含み、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、その細胞とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ領域を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、それによって、本発明の細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減される。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞でのＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減することを含み、組成物を細胞に送達することを含み、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物と、細胞とを接触させることを含み、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、その細胞とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ領域を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、それによって、本発明の細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減される。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減する方法は、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡのいずれか１つ以上と、細胞とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物を提供し、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、その組成物はさらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、Ｃａｓ９であるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ領域を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、その組成物はさらに、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、ＣＩＩＴＡゲノム標的配列で、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変換を行うＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、ＣＩＩＴＡゲノム標的配列で、アデノシン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への変換を行うＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法によって作製される操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法及び組成物によって作製される操作細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減されている操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減されている操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞核内のＣＩＩＴＡレベルが低下している操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、トランケート型のＣＩＩＴＡタンパク質を発現する操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、検出不可能なＣＩＩＴＡタンパク質を産生する操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質が低減されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡレベルが低下している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法によって作製される操作細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイで測定した場合に、非修飾細胞と比べて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、ゲノム座標ｃｈｒ：１６：１０９０６４８５－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法または組成物によって作製される操作細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が低減または排除されているとともに、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む遺伝子修飾を含む操作細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている組成物であって、薬学的に許容される担体を含む組成物によって作製される細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている細胞を含む組成物を提供する。
１．ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ
本発明で提供する方法及び組成物は、細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減するのに有用なＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを開示する。いくつかの実施形態では、このようなガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をＣＩＩＴＡゲノム標的配列に誘導し、本明細書では、「ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ」ということもある。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をヒトＣＩＩＴＡゲノム標的配列に誘導する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
本発明で提供する方法及び組成物は、細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減するのに有用なＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを開示する。いくつかの実施形態では、このようなガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をＣＩＩＴＡゲノム標的配列に誘導し、本明細書では、「ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ」ということもある。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をヒトＣＩＩＴＡゲノム標的配列に誘導する。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－ｃｈｒ：１０９２３２４２内の少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ：１６：１０９０６４８５－ｃｈｒ：１０９２３２４２内の少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－ｃｈｒ：１０９２３２４２内の少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、そのスプライスアクセプター部位の、１つのヌクレオチドは、Ａである。いくつかの実施形態では、そのスプライスアクセプター部位の、１つのヌクレオチドは、Ｇである。いくつかの実施形態では、その１つのヌクレオチドは、スプライスアクセプター部位のスプライス部位境界ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、そのスプライスドナー部位の、１つのヌクレオチドは、Ｇである。いくつかの実施形態では、そのスプライスドナー部位の、１つのヌクレオチドは、Ｕ／Ｔである。いくつかの実施形態では、その１つのヌクレオチドは、そのスプライスドナー部位のスプライス部位境界ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－ｃｈｒ：１０９２３２４２内の少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ：１６：１０９０６４８５－ｃｈｒ：１０９２３２４２内の少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－ｃｈｒ：１０９２３２４２内の少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。
いくつかの実施形態では、その方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを開示する。そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断剤がＣａｓ９である実施形態では、切断または「切断部位」は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列から３番目の塩基で行われる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、その切断部位は、そのアクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドの３’である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、その切断は、そのアクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドの５’である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、その切断は、そのドナースプライス部位境界ヌクレオチドの３’である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含み、その切断は、そのドナースプライス部位境界ヌクレオチドの５’である。
いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから４ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから３ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから２ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから１ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドにおいて、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから４ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから３ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから２ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから１ヌクレオチド以下において、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドにおいて、ＣＩＩＴＡ遺伝子の切断が行われるようにするガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む組成物を提供し、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣＩＩＴＡ ｓｇＲＮＡと、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を含む組成物を提供し、そのＣＩＩＴＡガイドは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むゲノム標的を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣＩＩＴＡ ｄｇＲＮＡと、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを含む組成物を提供する。
例示的なＣＩＩＴＡガイド配列は、下記の表１に記載されている（配列番号１～１０１と、対応するガイドＲＮＡ配列である配列番号２００～３００及び３０１～４０１）。
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されているヌクレオチドを示す目的で用いられていることがある。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択した配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％、９０％または８５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％同一であるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、表１に列挙されているゲノム座標の、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。本明細書で使用する場合、ゲノム座標の、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドとは、例えば、そのゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを意味し、そのゲノム座標は、表１に列挙されている範囲から５’方向の１０ヌクレオチド、及び３’方向の１０ヌクレオチドを含む。例えば、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０８７７３６０－１０８７７３８０またはｃｈｒ１６：１０８７７３５０－１０８７７３９０内の１０個の連続するヌクレオチド（これらの範囲の境界ヌクレオチドを含む）を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個または２０個の連続するヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列の、１７個、１８個、１９個または２０個の連続するヌクレオチドである配列から選択した配列と少なくとも９５％、９０％または８５％同一であるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、表１に列挙されているゲノム座標の、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、表１に列挙されているゲノム座標の、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号３９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号５９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号６９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号７９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号８９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９０を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号９９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１００を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１０１を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号４７、配列番号５５、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００及び配列番号１０１から選択したヌクレオチドを含む。
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの追加の実施形態は、例えば、ガイドＲＮＡに対する例示的な修飾を含め、本明細書に示されている。
２．ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、細胞において、ＣＩＩＴＡ遺伝子のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを遺伝子修飾する。ＣＩＩＴＡタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩの発現を調節するので、いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾によって、ＣＩＩＴＡタンパク質の産生を変化させることにより、遺伝子修飾された細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減する。遺伝子修飾には、遺伝子編集システムとの接触に起因する一連の修飾（例えば、Ｃａｓ９及びＣＩＩＴＡガイドＲＮＡに起因する一連の編集、またはＢＣ２２及びＣＩＩＴＡガイドＲＮＡに起因する一連の編集）が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、細胞において、ＣＩＩＴＡ遺伝子のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを遺伝子修飾する。ＣＩＩＴＡタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩの発現を調節するので、いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾によって、ＣＩＩＴＡタンパク質の産生を変化させることにより、遺伝子修飾された細胞（すなわち操作細胞）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減する。遺伝子修飾には、遺伝子編集システムとの接触に起因する一連の修飾（例えば、Ｃａｓ９及びＣＩＩＴＡガイドＲＮＡに起因する一連の編集、またはＢＣ２２及びＣＩＩＴＡガイドＲＮＡに起因する一連の編集）が含まれる。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ：１６：１０９０６４８５－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－ｃｈｒ：１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６及びｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０及びｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８及びｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列における少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、置換または脱アミノ化のうちのいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列における１個、２個、３個、４個または５個以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列における１個、２個、３個、４個または５個以上のヌクレオチドの欠失を含む。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個以上のヌクレオチドの挿入を含む。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、インデルを含み、インデルは概して、当該技術分野において、１０００塩基対（ｂｐ）未満の挿入または欠失として定義されている。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列において、フレームシフト変異をもたらすインデルを含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、鋳型核酸の導入に起因する、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、標的配列における、ドナー核酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する修飾は、一過性ではない。
いくつかの実施形態では、スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター部位の保存されたヌクレオチドの１つが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター部位の保存されたヌクレオチドＡが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター部位の保存されたヌクレオチドＧが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスドナー部位の保存されたヌクレオチドの１つが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスドナー部位の保存されたヌクレオチドＧが修飾される。いくつかの実施形態では、スプライスドナー部位の保存されたヌクレオチドＴが修飾される。
いくつかの実施形態では、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから４ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから３ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから２ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドから１ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。
いくつかの実施形態では、ドナースプライス部位の境界から５ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから４ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから３ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから２ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドから１ヌクレオチド以下に位置するヌクレオチドが修飾される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤（例えばＣａｓ酵素）を用いて、細胞において、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を修飾する。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下でＣＩＩＴＡを切断し、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、スプライス部位境界ヌクレオチドから４ヌクレオチド以下でＣＩＩＴＡを切断し、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、スプライス部位境界ヌクレオチドから３ヌクレオチド以下でＣＩＩＴＡを切断し、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、スプライス部位境界ヌクレオチドから２ヌクレオチド以下でＣＩＩＴＡを切断し、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、スプライス部位境界ヌクレオチドから１ヌクレオチド以下でＣＩＩＴＡを切断し、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、スプライス部位境界ヌクレオチドでＣＩＩＴＡを切断し、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、そのスプライス部位境界ヌクレオチドは、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、そのスプライス部位境界ヌクレオチドは、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、スプライス部位が不活化し、すなわち、その修飾スプライス部位では、スプライシングが行われない。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、スプライスアクセプター部位が不活化する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、スプライスドナー部位が不活化する。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのスプライス部位に対する遺伝子修飾により、スプライス部位の３ヌクレオチドのすべてが除去される。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾により、スプライス部位の２ヌクレオチドが除去される。いくつかの実施形態では、その遺伝子修飾により、スプライス部位の１ヌクレオチドが除去される。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのスプライス部位に対する遺伝子修飾により、そのスプライスアクセプター部位の１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドが除去される。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのスプライス部位に対する遺伝子修飾により、そのスプライスドナー部位の１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドが除去される。いくつかの実施形態では、スプライス部位の少なくとも１ヌクレオチドが欠失する。いくつかの実施形態では、スプライス部位の少なくとも２ヌクレオチドが欠失する。いくつかの実施形態では、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドが欠失する。いくつかの実施形態では、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドが欠失する。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、アウトオブフレームの終止コドンが利用される。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、スプライシングの際に、エキソンスキッピングが生じる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、ＣＩＩＴＡタンパク質の、その細胞による発現が低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、細胞核内のＣＩＩＴＡが減少する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのスプライス部位に対する修飾により、その細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減する。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡに対する遺伝子修飾により、トランケート型のＣＩＩＴＡタンパク質が生じる。いくつかの実施形態では、そのトランケート型のＣＩＩＴＡタンパク質は、ＧＴＰに結合しない。いくつかの実施形態では、そのトランケート型のＣＩＩＴＡタンパク質は、核に局在しない。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡタンパク質（例えばトランケート型のＣＩＩＴＡタンパク質）は、ＭＨＣクラスＩＩの発現の調節に関して、野生型ＣＩＩＴＡタンパク質の活性と比べて、活性が低下している。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質活性の低下により、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質活性の低下により、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現が見られない。
３．ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力は、当該技術分野において利用可能な技法のうち、標的細胞における、ガイドＲＮＡの編集効率、ＣＩＩＴＡタンパク質及び／またはＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベル、及び／またはＭＨＣクラスＩＩのレベルを評価する技法によって求めてよい。いくつかの実施形態では、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の低減または排除は、非修飾細胞との比較によって（すなわち「非修飾細胞と比べて」）求めてよい。操作細胞または細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してもよい。
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力は、当該技術分野において利用可能な技法のうち、標的細胞における、ガイドＲＮＡの編集効率、ＣＩＩＴＡタンパク質及び／またはＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベル、及び／またはＭＨＣクラスＩＩのレベルを評価する技法によって求めてよい。いくつかの実施形態では、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の低減または排除は、非修飾細胞との比較によって（すなわち「非修飾細胞と比べて」）求めてよい。操作細胞または細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してもよい。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力は、細胞におけるＣＩＩＴＡタンパク質のレベルを測定することによって求める。ＣＩＩＴＡタンパク質のレベルは、例えば、細胞溶解液、及び抗ＣＩＩＴＡ抗体を用いたウエスタンブロットによって検出してよい。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力は、細胞核内のＣＩＩＴＡタンパク質のレベルを測定することによって求める。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力は、細胞内のＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって求める。ＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベルは、例えばＲＴ－ＰＣＲによって検出してよい。いくつかの実施形態では、標的細胞内のＣＩＩＴＡタンパク質及び／またはＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベルが、非修飾細胞と比べて低下したことは、スプライス部位ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが有効であることを示している。
「非修飾細胞」（または「複数の非修飾細胞」）とは、実験または試験における、同じ種類の細胞のコントロール細胞（または複数のコントロール細胞）を指し、その「修飾されていない」コントロール細胞は、ＣＩＩＴＡガイドと接触させていない（すなわち非操作細胞）。したがって、非修飾細胞（または複数の非修飾細胞）は、ガイドＲＮＡと接触させていない細胞、またはＣＩＩＴＡを標的としないガイドＲＮＡと接触させた細胞であってよい。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力は、標的細胞によって発現したＭＨＣクラスＩＩタンパク質の低減または排除を測定することによって求める。ＣＩＩＴＡタンパク質は、トランス活性化因子として機能して、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを活性化し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現に不可欠である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現は、標的細胞の表面上で検出してよい。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現は、フローサイトメトリーによって測定する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する抗体（例えば、抗ＨＬＡ－ＤＲ，－ＤＱ，－ＤＰ）を用いて、例えばフローサイトメトリーによって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を検出してよい。いくつかの実施形態では、細胞（または細胞集団）の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質が、非修飾細胞（非修飾細胞集団）と比べて低減または排除されたことは、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが有効であることを示している。いくつかの実施形態では、特定のＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤と接触させた細胞（または細胞集団）であって、フローサイトメトリーによって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が陰性である細胞（または細胞集団）は、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが有効であることを示している。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物を用いて、細胞集団において、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、その細胞集団が（例えばＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって）エンリッチされており、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％または９４％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、（例えばＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって）エンリッチされておらず、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％または９４％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。
いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも６５％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも７０％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも８０％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９０％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９１％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９２％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９３％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９４％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力（すなわち、そのガイドＲＮＡの効能）は、ゲノム標的配列における切断部位（例えば、Ｃａｓ９によって作られる切断部位）と、ＣＩＩＴＡにおけるスプライス部位境界ヌクレオチドとの距離に関係する。いくつかの実施形態では、距離（切断部位と、スプライス部位境界ヌクレオチドとの間のヌクレオチド数として計算する）と、ＭＨＣクラスＩＩの発現の欠損との間に相関関係がある。いくつかの実施形態では、スプライス部位境界ヌクレオチドと、切断部位（例えば、Ｃａｓ９によって作られる切断部位）との距離が短いほど、標的細胞によって発現するＭＨＣクラスＩＩが大きく低減される。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡにおけるスプライス部位境界ヌクレオチドと、ゲノム標的配列における切断部位との距離は、５ヌクレオチド以下、４ヌクレオチド以下、３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下または１ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態では、その切断部位は、そのスプライス部位境界ヌクレオチドの５’である。いくつかの実施形態では、その切断部位は、そのスプライス部位境界ヌクレオチドの３’である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡスプライス部位の境界は、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡスプライス部位の境界は、ドナースプライス部位境界ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、有効なＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、遺伝子修飾した標的細胞に対する、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの免疫細胞（例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞）の応答を測定することによって求めてよい。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の応答は、（例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡによって）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化応答、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖、活性化マーカーの発現、及び／またはサイトカインの産生（ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ）を測定するアッセイによって評価してよい。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の応答は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む細胞と、遺伝子修飾した細胞とを共培養するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイで評価してよい。例えば、遺伝子修飾した細胞は、例えば、ＰＢＭＣ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む精製ＣＤ３＋ Ｔ細胞、精製ＣＤ４＋ Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞株と共培養してよい。遺伝子修飾した細胞から誘発されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を、非修飾細胞から誘発された応答と比較してよい。ＣＤ４＋ Ｔ細胞からの応答の低減は、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが有効であることを示している。
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの効力は、編集後の細胞の生存によっても評価してよい。いくつかの実施形態では、その細胞は、編集後に、少なくとも１週間～６週間生存する。いくつかの実施形態では、その細胞は、編集後に、少なくとも１週間～１２週間生存する。いくつかの実施形態では、その細胞は、編集後に、少なくとも２週間生存する。いくつかの実施形態では、その細胞は、編集後に、少なくとも３週間生存する。いくつかの実施形態では、その細胞は、編集後に、少なくとも４週間生存する。いくつかの実施形態では、その細胞は、編集後に、少なくとも５週間生存する。いくつかの実施形態では、その細胞は、編集後に、少なくとも６週間生存する。遺伝子修飾した細胞の生存率は、例えば、細胞死の測定、フローサイトメトリー、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色または細胞増殖によるものを含め、標準的な技法を用いて測定してよい。
Ｃ．ＭＨＣクラスＩＩの低減または排除、及び追加の修飾を行うための方法及び組成物
１．ＭＨＣクラスＩのノックアウト
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法を提供し、その方法はさらに、その細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を、非修飾細胞と比べて低減または排除する。ある１つのアプローチでは、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現は、Ｂ２Ｍ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現は、細胞と、Ｂ２ＭガイドＲＮＡとを接触させることによって低減または排除する。別のアプローチでは、ＭＨＣクラスＩタンパク質ＨＬＡ－Ａの発現は、ＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって低減または排除し、それにより、ヒト細胞でのＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、そのヒト細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。すなわち、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現は、ヒト細胞と、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡとを接触させることによって低減または排除し、そのヒト細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、得られる細胞は、同種異系細胞である。
１．ＭＨＣクラスＩのノックアウト
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法を提供し、その方法はさらに、その細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を、非修飾細胞と比べて低減または排除する。ある１つのアプローチでは、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現は、Ｂ２Ｍ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現は、細胞と、Ｂ２ＭガイドＲＮＡとを接触させることによって低減または排除する。別のアプローチでは、ＭＨＣクラスＩタンパク質ＨＬＡ－Ａの発現は、ＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって低減または排除し、それにより、ヒト細胞でのＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、そのヒト細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。すなわち、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現は、ヒト細胞と、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡとを接触させることによって低減または排除し、そのヒト細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、得られる細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、Ｂ２ＭガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、Ｂ２Ｍ標的配列でＤＳＢまたはＳＳＢを誘導することを含む。いくつかの実施形態では、それにより、Ｂ２Ｍの発現が、その細胞によって低減する。いくつかの実施形態では、それにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が、その細胞によって低減する。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡにおけるスプライス部位を不活化することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、Ｂ２ＭガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、Ｂ２Ｍ標的配列でＤＳＢまたはＳＳＢを誘導することを含む。いくつかの実施形態では、それにより、Ｂ２Ｍの発現が、その細胞によって低減する。いくつかの実施形態では、それにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が、その細胞によって低減する。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡでＤＳＢまたはＳＳＢを誘導することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、Ｂ２ＭガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、Ｂ２Ｍ標的配列でＤＳＢまたはＳＳＢを誘導することを含む。いくつかの実施形態では、それにより、Ｂ２Ｍの発現が、その細胞によって低減する。いくつかの実施形態では、それにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が、その細胞によって低減する。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞でのＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減することを含み、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物を細胞に送達することを含み、その方法はさらに、その細胞と、Ｂ２ＭガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、Ｂ２Ｍ標的配列でＤＳＢまたはＳＳＢを誘導することを含む。いくつかの実施形態では、それにより、Ｂ２Ｍの発現が、その細胞によって低減する。いくつかの実施形態では、それにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が、その細胞によって低減する。
いくつかの実施形態では、そのＢ２ＭガイドＲＮＡは、ヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とする。
いくつかの実施形態では、そのＢ２ＭガイドＲＮＡは、配列番号７０１を含む。いくつかの実施形態では、そのＢ２ＭガイドＲＮＡは、配列番号７０１の少なくとも１７個、１８個、１９個または２０個の連続するヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＢ２ＭガイドＲＮＡは、配列番号７０１と少なくとも９５％、９０％または８５％同一であるガイド配列を含む。
Ｂ２ＭガイドＲＮＡの追加の実施形態は、例えば、そのガイドＲＮＡに対する例示的な修飾を含め、本明細書に示されている。
いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭガイドＲＮＡの効力は、非修飾細胞と比べて、細胞でのＢ２Ｍタンパク質のレベルを測定することによって求める。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭガイドＲＮＡの効力は、その細胞によって発現したＢ２Ｍタンパク質のレベルを測定することによって求める。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体（例えば抗Ｂ２Ｍ）を用いて、例えばフローサイトメトリーによって、Ｂ２Ｍタンパク質のレベルを検出してよい。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭガイドＲＮＡの効力は、細胞内のＢ２Ｍ ｍＲＮＡのレベルを、例えばＲＴ－ＰＣＲによって測定することによって求める。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質またはＢ２Ｍ ｍＲＮＡのレベルが、非修飾細胞内のＢ２Ｍタンパク質のレベルと比べて低減または排除されたことは、Ｂ２ＭガイドＲＮＡが有効であることを示している。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーによって、Ｂ２Ｍタンパク質が、非修飾細胞（または非修飾細胞集団）と比べて陰性である細胞（または細胞集団）は、Ｂ２ＭガイドＲＮＡが有効であることを示している。いくつかの実施形態では、特定のＢ２ＭガイドＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤と接触させた細胞（または細胞集団）であって、フローサイトメトリーによってＭＨＣクラスＩタンパク質が陰性である細胞（または細胞集団）は、Ｂ２ＭガイドＲＮＡが有効であることを示している。
いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭガイドＲＮＡの効力は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質のレベルを測定することによって求める。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質のレベルは、（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃに対する抗体を用いる）フローサイトメトリーによって測定する。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも６５％ＭＨＣ Ｉ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも７０％ＭＨＣ Ｉ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも８０％ＭＨＣクラスＩ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９０％ＭＨＣ Ｉ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９５％ＭＨＣ Ｉ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも１００％ＭＨＣクラスＩ陰性である。
いくつかの実施形態では、その方法は、操作細胞でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を、非修飾細胞と比べて低減または排除することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現を低減または排除することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、操作細胞でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を、非修飾細胞と比べて低減または排除することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現を低減または排除することを含む。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ａゲノム座標は、ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、その方法は、操作細胞でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を、非修飾細胞と比べて低減または排除することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２００１～２０９５から選択したガイド配列を含む（対応するガイドＲＮＡは、配列番号１８１１～１９０５及び１９０６～２０００である）（下記の表２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞を作製する方法であって、ａ．細胞と、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡとを接触させること（そのガイドＲＮＡは、配列番号１～１１７から選択したガイド配列を含む）と、ｂ．その細胞と、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡとを接触させること（そのＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２００１～２０９５のいずれか１つから選択したガイド配列を含む（対応するガイドＲＮＡ配列は、配列番号１８１１～１９０５及び１９０６～２０００である）（下記の表２を参照されたい））と、ｃ．任意に、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを接触させることを含む方法を提供し、その細胞は、その細胞でのＨＬＡ－Ａの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている。いくつかの実施形態では、その方法は、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。
例示的なＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、表２（ガイド配列である配列番号２００１～２０９５（ならびに対応するガイドＲＮＡ配列である配列番号１８１１～１９０５及び１９０６－２０００）に示されている。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡの効力は、細胞表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質のレベルを測定することによって求める。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質のレベルは、（例えば、ＨＬＡ－Ａ２及び／またはＨＬＡ－Ａ３に対する抗体を用いる）フローサイトメトリーによって測定する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも６５％ＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも７０％ＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも８０％ＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９０％ＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも９５％ＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、非修飾細胞集団と比べて、少なくとも１００％ＨＬＡ－Ａ陰性である。
いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭガイドＲＮＡまたはＨＬＡ－Ａガイドの効力は、非修飾細胞と比べて、遺伝子修飾した標的細胞に対する、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの免疫細胞（例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞）の応答を測定することによって求めてよい。例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減は、Ｂ２ＭガイドＲＮＡまたはＨＬＡ－Ａが有効であることを示している。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化応答、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖、活性化マーカーの発現、及び／またはサイトカインの産生（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）を測定するアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ）によって評価してよい。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで評価してよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答は、遺伝子修飾した細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養することによって評価してよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性は、ｉｎ ｖｉｖｏモデル、例えば齧歯類動物モデルで評価してよい。ｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、例えば、遺伝子修飾した細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞とともに投与してよく、遺伝子修飾した細胞の生存は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞による溶解を回避する能力を示している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在下で、１週間超、２週間超、３週間超、４週間超、５週間超もしくは６週間超、またはそれ以上にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在下で、少なくとも１週間～６週間にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在下で、少なくとも２～４週間にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在下で、少なくとも４～６週間にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在下で、６週間超にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。
いくつかの実施形態では、その方法は、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されているとともに、ＭＨＣクラスＩの発現が低減または排除されている細胞を含む組成物を作製するものである。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡのレベルが低減もしくは排除されているか、及びまたはＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が排除低減されている細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡのレベルが低減もしくは排除されているか、及びまたはＢ２Ｍタンパク質の発現が排除低減されている細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡのレベルが低減もしくは排除されているとともに、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのレベルが低減もしくは排除されている細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減または排除を誘発する。
いくつかの実施形態では、その方法は、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されているとともに、ＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている細胞を含む組成物を作製し、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡのレベルが低減もしくは排除されているか、及びまたはＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が排除低減されている細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡのレベルが低減もしくは排除されているか、及び／またはＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が排除もしくは低減されている細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減または排除を誘発する。
いくつかの実施形態では、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が低減または排除されている操作細胞を提供し、その細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡに含み、その細胞は、修飾をＢ２Ｍに含む。いくつかの実施形態では、その同種異系細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
いくつかの実施形態では、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が低減または排除されている操作細胞を提供し、その細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡに含み、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が低減または排除されている操作細胞を提供し、その細胞は、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡに含み、その細胞は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡＣについてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
２．外来性核酸
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法及び組成物を提供し、その方法及び組成物はさらに、その操作細胞によって、外来性核酸を発現させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法及び組成物を提供し、その方法及び組成物はさらに、その操作細胞によって、外来性核酸を発現させる。
ａ）ＮＫ細胞阻害剤のノックイン
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法を提供し、その方法はさらに、その細胞によって、外来性核酸を発現させ、その外来性核酸は、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、細胞表面で発現し、それによって、ＮＫ細胞の活性（例えば、ＮＫ細胞による細胞溶解）を回避する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した細胞が、ＮＫ細胞による溶解を回避する能力により、その細胞は、養子細胞移入療法に適合しやすくなる。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法を提供し、その方法はさらに、その細胞によって、外来性核酸を発現させ、その外来性核酸は、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、細胞表面で発現し、それによって、ＮＫ細胞の活性（例えば、ＮＫ細胞による細胞溶解）を回避する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した細胞が、ＮＫ細胞による溶解を回避する能力により、その細胞は、養子細胞移入療法に適合しやすくなる。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを修飾することを含み、その細胞と、開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、Ｂ２ＭガイドＲＮＡ、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸、及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物によって、その細胞の遺伝子修飾を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡでＤＳＢまたはＳＳＢを誘導することを含み、細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡでＤＳＢまたはＳＳＢを誘導することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞でのＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物を送達することを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞でのＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減することを含み、本明細書に開示されているＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物を送達することを含み、その方法はさらに、その細胞と、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＮＫ細胞上の抑制性受容体に結合する。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＭＨＣクラスＩに特異的な抑制性受容体に結合する。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＭＨＣクラスＩに特異的ではない抑制性受容体に結合する。ＮＫ細胞抑制性受容体としては、例えば、ＫＩＲ（ヒト）、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体（ヒト／マウス）、Ｌｙ４９（マウス）、２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ６、ＮＫＦＰ－Ｂ、ＴＩＧＩＴ、ＫＩＲ２ＤＬ４が挙げられる。
いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＮＫＧ２Ａに結合する。
いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＭＨＣクラスＩ分子である。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、古典的ＭＨＣクラスＩ分子である。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子である。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＨＬＡ分子である。ＮＫ細胞阻害剤分子としては、例えば、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、Ｃｄ１、ＣＤ４８、ＳＬＡＭＦ６、Ｃｌｒ－ｂ及びＣＤ１５５が挙げられる。
いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＨＬＡ－Ｅである。
いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＨＬＡ－Ｅを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、Ｂ２Ｍを含む。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＨＬＡ－Ｅ及びＢ２Ｍを含む。いくつかの実施形態では、その融合タンパク質は、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ｅコンストラクトは、ベクターに供給されている。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ｅコンストラクトを含むベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、そのＨＬＡ－Ｅコンストラクトは、レンチウイルスの導入を介して、その細胞に送達する。
いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、標的細胞のゲノムに挿入する。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、相同組み換え（ＨＲ）によって、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、平滑末端挿入によって、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、非相同末端結合によって、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、その細胞のゲノムのセーフハーバー座位に組み込む。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、ＴＲＡＣ座位、Ｂ２Ｍ座位、ＡＡＶＳ１座位及び／またはＣＩＩＴＡ座位のうちの１つに組み込む。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞阻害剤分子は、脂質核酸アセンブリー組成物で、その細胞に供給する。いくつかの実施形態では、その脂質核酸アセンブリー組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＮＫ細胞からの応答の低減を誘発する操作細胞を作製する。ＮＫ細胞の応答は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで評価してよい。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の活性は、遺伝子修飾した細胞をＮＫ細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養することによって評価してよい。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の活性は、ｉｎ ｖｉｖｏモデル、例えば齧歯類動物モデルで評価してよい。ｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、例えば、遺伝子修飾した細胞をＮＫ細胞とともに投与してよく、遺伝子修飾した細胞の生存は、ＮＫ細胞による溶解を回避する能力を示している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＮＫ細胞の存在下で、１週間超、２週間超、３週間超、４週間超、５週間超もしくは６週間超、またはそれ以上にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＮＫ細胞の存在下で、少なくとも１～６週間にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＮＫ細胞の存在下で、少なくとも２～４週間にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＮＫ細胞の存在下で、少なくとも４～６週間にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＮＫ細胞の存在下で、６週間超にわたり生存する細胞を含む組成物を作製する。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されているとともに、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸を含む操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現及びＮＫ細胞阻害剤分子の発現が低減または排除されている操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されているとともに、ＮＫ細胞からの応答の低減を誘発する細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡのレベルが低減もしくは排除されており、ＮＫ細胞からの応答の低減を誘発し、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が低減または排除されている細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞からの応答の低減を誘発する。
いくつかの実施形態では、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が低減または排除されている同種異系細胞を提供し、その細胞は、本明細書に開示されているように、修飾をＣＩＩＴＡに含み、その細胞は、修飾をＢ２Ｍに含み、その細胞は、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、その同種異系細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞からの応答の低減を誘発する。
ｂ）ターゲティング受容体及び細胞表面で発現するその他のポリペプチド、分泌ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法を提供し、その方法はさらに、１つ以上の外来性核酸（例えば、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、サイトカインもしくはサイトカイン受容体、ケモカインもしくはケモカイン受容体、酵素、融合タンパク質、またはその他の種類の細胞表面結合ポリペプチドもしくは可溶性ポリペプチド）を発現させる。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、細胞表面で発現するタンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、細胞表面で発現するターゲティング受容体（本明細書でさらに説明されている）をコードする。いくつかの実施形態では、本発明の、遺伝子修飾した細胞は、例えば、（本明細書にさらに説明されているように、）ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで継続的に産生する供給源としての機能を含め、外来性核酸によってコードされる分泌ポリペプチドを発現する「細胞工場」として機能し得る。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法を提供し、その方法はさらに、１つ以上の外来性核酸（例えば、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、サイトカインもしくはサイトカイン受容体、ケモカインもしくはケモカイン受容体、酵素、融合タンパク質、またはその他の種類の細胞表面結合ポリペプチドもしくは可溶性ポリペプチド）を発現させる。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、細胞表面で発現するタンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、細胞表面で発現するターゲティング受容体（本明細書でさらに説明されている）をコードする。いくつかの実施形態では、本発明の、遺伝子修飾した細胞は、例えば、（本明細書にさらに説明されているように、）ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで継続的に産生する供給源としての機能を含め、外来性核酸によってコードされる分泌ポリペプチドを発現する「細胞工場」として機能し得る。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減または排除する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡ遺伝子のスプライス部位を遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、細胞表面発現ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）または可溶性ポリペプチド（例えば分泌ポリペプチド）、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減または排除する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その細胞と、２つ以上の外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ（ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が低減または排除する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡ遺伝子のスプライス部位を遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、細胞表面発現ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）または可溶性ポリペプチド（例えば分泌ポリペプチド）、及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ（ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が低減または排除する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その細胞と、２つ以上の外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、Ｂ２ＭガイドＲＮＡ、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする外来性核酸、ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸、及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物によって、その細胞の遺伝子修飾を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、Ｂ２ＭガイドＲＮＡ、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする外来性核酸、ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸、及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物によって、その細胞の遺伝子修飾を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、及びＢ２Ｍガイド（Ｂ２Ｍガイドによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、ＮＫ細胞阻害剤をコードする核酸、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、及びＮＫ細胞阻害剤をコードする核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その細胞と、２つ以上の外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡのスプライス部位を不活化することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、外来性核酸、及びＨＬＡ－Ａガイド（ＨＬＡ－Ａガイドによって、細胞表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その細胞と、２つ以上の外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、細胞表面で発現するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、可溶性ポリペプチドをコードする。本明細書で使用する場合、「可溶性」ポリペプチドとは、細胞によって分泌されるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、その可溶性ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、その可溶性ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、その可溶性ポリペプチドは、酵素である。いくつかの実施形態では、その可溶性ポリペプチドは、サイトカインである。いくつかの実施形態では、その可溶性ポリペプチドは、ケモカインである。いくつかの実施形態では、その可溶性ポリペプチドは、融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２）をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、完全長抗体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥである。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、その重鎖定常領域は、エフェクター機能を低減することが知られている変異を含む。いくつかの実施形態では、その重鎖定常領域は、エフェクター機能を増強することが知られている変異を含む。いくつかの実施形態では、その抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、その抗体は、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨドメインのみの抗体）である。
いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、中和抗体をコードする。中和抗体は、標的抗原の活性を中和する。いくつかの実施形態では、その抗体は、ウイルス抗原に対する中和抗体である。いくつかの実施形態では、その抗体は、標的ウイルス抗原を中和して、そのウイルスが細胞に感染する能力をブロックする。いくつかの実施形態では、細胞ベースの中和アッセイを用いて、抗体の中和活性を測定してよい。特定の細胞及びリードアウトは、中和抗体の標的抗原によって決まることになる。細胞ベースの中和アッセイで、抗体の半最大効果濃度（ＥＣ５０）を測定でき、ＥＣ５０が低いほど、中和抗体が強力であることを示している。
いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、疾患または障害（例えば、ＩＶ章に記載されている疾患及び障害を参照されたい）と関連する抗原に結合する抗体をコードする。
いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、細胞表面で発現するポリペプチド（すなわち、細胞表面結合タンパク質）をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ターゲティング受容体をコードする。「ターゲティング受容体」は、細胞、例えばＴ細胞の表面に存在して、その細胞を、標的部位、例えば、生物内の特異的な細胞または組織に結合させる受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ＴＲｕＣである。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（例えば、Ｂ細胞上に発現する受容体）である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、サイトカイン受容体である。
いくつかの実施形態では、ターゲティング受容体としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び細胞表面分子に対する受容体であって、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、少なくとも膜貫通ドメインを通じて機能可能に連結しており、細胞外の受容体部分が結合すると、Ｔ細胞を活性化できる受容体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲとは、細胞内シグナル伝達ドメインに機能可能に連結した細胞外の抗原認識ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ナノボディを指し、抗原が結合すると、Ｔ細胞を活性化する。ＣＡＲは、抗原認識ドメイン、細胞外のヒンジ領域、膜貫通ドメイン及び細胞内のＴ細胞シグナル伝達ドメインという４つの領域で構成される。このような受容体は、当該技術分野において周知である（例えば、ＷＯ２０２００９２０５７、ＷＯ２０１９１９１１１４、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１８２０８８３７を参照されたい）。様々な抗原を認識するユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣＡＲ）（例えば、ＥＰ２９９０４１６Ａ１を参照されたい）、及びアダプター分子を通じて、免疫細胞の、標的細胞への結合を促す逆転型ユニバーサルＣＡＲ（ＲｅｖＣＡＲ）（例えば、ＷＯ２０１９２３８７２２を参照されたい）も想定されている。ＣＡＲは、抗体を開発できるいずれの抗原も標的とすることができ、典型的には、標的とする細胞または組織の表面に提示された分子に誘導される。いくつかの実施形態では、そのターゲティング受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン、及びＴＣＲのサブユニット（例えばＴＲｕＣ）を含む。（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０８７（２０１９）を参照されたい。）
いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ＴＣＲをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、遺伝子修飾されたＴＣＲをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、遺伝子修飾されたＴＣＲであって、がん細胞が発現するポリペプチドに対する特異性を有するＴＣＲをコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）抗原に特異的なターゲティング受容体をコードする。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ＷＴ１特異的ＴＣＲ（例えばＷＯ２０２０／０８１６１３Ａ１を参照されたい）をコードする。
いくつかの実施形態では、外来性核酸は、標的細胞のゲノムに挿入する。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、相同組み換え（ＨＲ）によって、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、平滑末端挿入によって、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、非相同末端結合によって、標的細胞のゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、その細胞のゲノムのセーフハーバー座位に組み込む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、ＴＲＡＣ座位、Ｂ２Ｍ座位、ＡＡＶＳ１座位及び／またはＣＩＩＴＡ座位のうちの１つに組み込む。いくつかの実施形態では、その外来性核酸は、脂質核酸アセンブリー組成物で、その細胞に供給する。いくつかの実施形態では、その脂質核酸アセンブリー組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されているとともに、外来性核酸を含む操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されているとともに、その細胞のゲノムに組み込まれた外来性核酸によってコードされるポリペプチドを分泌及び／または発現する操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減もしくは排除されているか、及び／または細胞核内のＣＩＩＴＡのレベルが低減もしくは排除されており、ＮＫ細胞からの応答の低減を誘発し、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が低減されており、その細胞のゲノムに組み込まれた外来性核酸によってコードされるポリペプチドを分泌及び／または発現する操作細胞を含む組成物を作製する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
いくつかの実施形態では、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が低減または排除されている操作細胞を提供し、その細胞は、本明細書に開示されているように、修飾をＣＩＩＴＡに含み、その細胞は、修飾をＢ２Ｍに含み、その細胞は、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする外来性核酸を含み、その細胞はさらに、ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
実施形態では、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が低減または排除されている操作細胞を提供し、その細胞は、本明細書に開示されているように、修飾をＣＩＩＴＡに含み、その細胞は、修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、その細胞はさらに、ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているように、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除する方法を提供し、その方法はさらに、１つ以上の追加の標的遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ）の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、その追加の遺伝子修飾はさらに、その遺伝子修飾した細胞を、養子細胞移入の用途に使用する際に、利点をもたらす。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子（例えば、ＣＩＩＴＡ以外の遺伝子、すなわち、Ｂ２ＭまたはＨＬＡ－Ａ）にある標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、ＣＩＩＴＡ以外の遺伝子の発現を低減または排除するガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導するガイドＲＮＡ、及びＢ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減または排除する）とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その別の遺伝子の発現を低減または排除するガイドＲＮＡ、及びポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その別の遺伝子の発現を低減するガイドＲＮＡ、Ｂ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減する）、及びＮＫ細胞阻害剤をコードする外来性核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その別の遺伝子の発現を低減するガイドＲＮＡ、及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ（ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減する）とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その別の遺伝子の発現を低減または排除するガイドＲＮＡ、Ｂ２ＭガイドＲＮＡ（Ｂ２ＭガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減または排除する）、及びポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導するガイドＲＮＡ、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする外来性核酸、及びポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その別の遺伝子の発現を低減するガイドＲＮＡ、及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ（ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡによって、細胞表面でのＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減する）、ならびにポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＣＩＩＴＡを遺伝子修飾することを含み、その細胞と、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物とを接触させることを含み、その方法はさらに、その細胞と、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その追加の遺伝子の発現を低減または排除するガイドＲＮＡ、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を低減または排除するＢ２ＭガイドＲＮＡ、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする外来性核酸、及びポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、Ｂ２ＭガイドＲＮＡ、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする外来性核酸、ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その別の遺伝子の発現を低減または排除するガイドＲＮＡ、及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物によって、その細胞の遺伝子修飾を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されているようなＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、ポリペプチド（例えばターゲティング受容体）をコードする外来性核酸、別の遺伝子に位置する標的配列にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導し、それによって、その別の遺伝子の発現を低減または排除するガイドＲＮＡ、及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物によって、その細胞の遺伝子修飾を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、その追加の標的遺伝子は、ＴＲＡＣである。いくつかの実施形態では、その追加の標的遺伝子は、ＴＲＢＣである。
Ｄ．例示的な種類の細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、細胞の遺伝子修飾を行う。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した細胞は、操作細胞という。操作細胞とは、操作による遺伝子修飾を含む細胞（または細胞の子孫）であって、例えば、遺伝子編集システムと接触させて、その遺伝子編集システムによって遺伝子修飾した細胞を指す。「操作細胞」及び「遺伝子修飾した細胞」という用語は、全体を通じて、同義的に用いられている。その操作細胞は、本明細書に開示されている例示的な種類の細胞のいずれかであってよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及び組成物は、細胞の遺伝子修飾を行う。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した細胞は、操作細胞という。操作細胞とは、操作による遺伝子修飾を含む細胞（または細胞の子孫）であって、例えば、遺伝子編集システムと接触させて、その遺伝子編集システムによって遺伝子修飾した細胞を指す。「操作細胞」及び「遺伝子修飾した細胞」という用語は、全体を通じて、同義的に用いられている。その操作細胞は、本明細書に開示されている例示的な種類の細胞のいずれかであってよい。
いくつかの実施形態では、その細胞は、免疫細胞である。本明細書で使用する場合、「免疫細胞」は、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」及びＮＫＴ細胞もしくはｉＮＫＴ細胞））、単球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞、または顆粒球（例えば、好中球、好酸球及び好塩基球）を含め、免疫系の細胞を指す。いくつかの実施形態では、その細胞は、初代免疫細胞である。いくつかの実施形態では、その免疫系細胞は、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ならびに樹状細胞（ＤＣ）から選択してよい。いくつかの実施形態では、その免疫細胞は、同種異系である。
いくつかの実施形態では、その細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、その細胞は、養子免疫細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、そのリンパ球は、同種異系である。
本明細書で使用する場合、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」、または「αβ ＴＣＲ」もしくは「γδ ＴＣＲ」）を発現する細胞として定義できるが、しかしながら、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のＴＣＲを遺伝子修飾して、（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子またはＴＲＢＣ遺伝子への遺伝子修飾によって）その発現を低減してよく、したがって、標準的なフローサイトメトリー法によって、Ｔ細胞を特定するマーカーとして、タンパク質ＣＤ３の発現を使用してよい。ＣＤ３は、ＴＣＲと関連するマルチサブユニットなシグナル伝達複合体である。すなわち、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋と称することがある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋マーカーと、ＣＤ４＋マーカーまたはＣＤ８＋マーカーのいずれかを発現する細胞である。いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、同種異系である。
いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、糖タンパク質ＣＤ８を発現し、したがって、標準的なフローサイトメトリー法によってはＣＤ８＋であり、「細胞傷害性」Ｔ細胞と称することがある。いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、糖タンパク質ＣＤ４を発現し、したがって、標準的なフローサイトメトリー法によってはＣＤ４＋であり、「ヘルパー」Ｔ細胞と称することがある。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、サブセットに分化でき、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、制御性Ｔ（「Ｔｒｅｇ」）細胞または濾胞性Ｔヘルパー細胞（「Ｔｆｈ」）と称することがある。それぞれのＣＤ４＋サブセットは、催炎症性機能もしくは抗炎症性機能、または生存機能もしくは保護機能のいずれかを有することができる所定のサイトカインを放出する。Ｔ細胞は、対象から、ＣＤ４＋選択法またはＣＤ８＋選択法によって単離してよい。
いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、メモリーＴ細胞である。体内において、メモリーＴ細胞は、抗原と遭遇済みである。メモリーＴ細胞は、二次リンパ器官に位置することもできるし（セントラルメモリーＴ細胞）、または最近感染した組織に位置することもできる（エフェクターメモリーＴ細胞）。メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞であってよい。メモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞であってよい。
本明細書で使用する場合、「セントラルメモリーＴ細胞」は、抗原暴露歴のあるＴ細胞と定義でき、例えば、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯを発現し得る。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋として検出してよい。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７も発現するので、標準的なフローサイトメトリー法によって、ＣＣＲ７＋として検出してよい。
本明細書で使用する場合、「初期幹細胞メモリーＴ細胞」（または「Ｔｓｃｍ」）は、ＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＡを発現するＴ細胞として定義できるので、標準的なフローサイトメトリー法によっては、ＣＤ２７＋及びＣＤ４５ＲＡ＋である。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５アイソフォームであるＣＤ４５ＲＯを発現しないので、Ｔｓｃｍはさらに、標準的なフローサイトメトリー法によっては、このアイソフォームに対して染色した場合に、ＣＤ４５ＲＯ－となる。したがって、ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＤ２７＋細胞も、初期幹細胞メモリーＴ細胞である。Ｔｓｃｍ細胞はさらに、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７を発現するので、標準的なフローサイトメトリー法によって、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＣＲ７＋として検出し得る。初期幹細胞メモリーＴ細胞は、細胞療法製品の存続性及び治療効力の向上と相関することが示されている。
いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｂ細胞である。本明細書で使用する場合、「Ｂ細胞」は、ＣＤ１９及び／またはＣＤ２０及び／またはＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）を発現する細胞と定義できるので、Ｂ細胞は、標準的なフローサイトメトリー法によって、ＣＤ１９＋及び／またはＣＤ２０＋及び／またはＢＣＭＡ＋である。Ｂ細胞はさらに、標準的なフローサイトメトリー法によっては、ＣＤ３及びＣＤ５６が陰性である。そのＢ細胞は、形質細胞であってよい。そのＢ細胞は、メモリーＢ細胞であってよい。そのＢ細胞は、ナイーブＢ細胞であってよい。そのＢ細胞は、ＩｇＭ＋であってもよく、またはクラススイッチしたＢ細胞受容体（例えば、ＩｇＧ＋もしくはＩｇＡ＋）を有してもよい。いくつかの実施形態では、そのＢ細胞は、同種異系である。
いくつかの実施形態では、その細胞は、骨髄または末梢血に由来するような単核球である。いくつかの実施形態では、その細胞は、末梢血単核球（「ＰＢＭＣ」）である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＰＢＭＣ、例えば、リンパ球または単球である。いくつかの実施形態では、その細胞は、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）である。いくつかの実施形態では、その単核球は、同種異系である。
幹細胞、前駆細胞及び初代細胞のように、ＡＣＴ及び／または組織再生療法で使用する細胞が含まれる。幹細胞としては例えば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ、例えば、骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）、胎盤、臍帯（ＵＣ）または脂肪から単離したもの）、造血幹細胞（ＨＳＣ、例えば、ＢＭまたはＵＣから単離したもの）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、組織特異的前駆幹細胞（ＴＳＰＳＣ）、及び輪部幹細胞（ＬＳＣ）が挙げられる。前駆細胞及び初代細胞としては、単核球（ＭＮＣ、例えば、ＢＭまたはＰＢから単離したもの）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ、例えば、ＢＭ、ＰＢ及びＵＣから単離したもの）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）、ならびにこれらに由来する組織特異的な初代細胞または細胞（ＴＳＣ）（軟骨細胞、筋細胞及び角化細胞を含む）が挙げられる。膵島細胞、心筋細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、ニューロン細胞、皮膚細胞及び網膜細胞など、臓器移植または組織移植用の細胞も含まれる。
いくつかの実施形態では、その細胞は、ヒト対象から単離した細胞のようなヒト細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ヒトドナーのＰＢＭＣまたはロイコパックから単離する。いくつかの実施形態では、その細胞は、ある状態、障害または疾患である対象から得たものである。いくつかの実施形態では、その細胞は、エプスタインバーウイルス（「ＥＢＶ」）を持つヒトドナーから得たものである。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで行う。本明細書で使用する場合、「ｅｘ ｖｉｖｏ」とは、例えばＡＣＴ療法として、その細胞を対象に移入できるｉｎ ｖｉｔｒｏな方法を指す。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏな方法は、ＡＣＴ療法の細胞または細胞集団を伴うｉｎ ｖｉｔｒｏな方法である。
いくつかの実施形態では、その細胞は、細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、その細胞株は、ヒト対象から得られる。いくつかの実施形態では、その細胞株は、リンパ芽球様細胞株（「ＬＣＬ」）である。その細胞は、凍結保存して、解凍してもよい。その細胞は、事前に凍結保存していなくてもよい。
いくつかの実施形態では、その細胞は、細胞バンクに由来する。いくつかの実施形態では、その細胞は、遺伝子修飾してから、細胞バンクに送る。いくつかの実施形態では、その細胞は、対象から取り出し、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子修飾し、細胞バンクに送る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した細胞集団を細胞バンクに送る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した免疫細胞集団を細胞バンクに送る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した免疫細胞集団であって、第１のサブ集団及び第２のサブ集団を含み、その第１のサブ集団及び第２のサブ集団が、共通の遺伝子修飾を少なくとも１つと、異なる遺伝子修飾を少なくとも１つ有する集団を細胞バンクに送る。
いくつかの実施形態では、その細胞が、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であるときには、そのＨＬＡ－Ｂアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２というＨＬＡ－Ｂアレルのいずれか１つから選択する。
いくつかの実施形態では、その細胞が、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であるときには、そのＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択する。
いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２というＨＬＡ－Ｂアレルのいずれか１つから選択し、そのＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択する。
いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択する。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルは、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。
ＩＩＩ．遺伝子編集システムの詳細
様々な適切な遺伝子編集システムを用いて、本明細書に開示されている操作細胞を作製してよく、そのシステムとしては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムが挙げられるが、これらに限らない。概して、これらの遺伝子編集システムは、標的ＤＮＡ配列で、二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖切断、すなわちＳＳＢ）を誘導するために、操作した切断システムの使用を伴う。切断またはニッキングは、標的ＤＮＡ配列の特異的な切断またはニッキングを導くように、操作したＺＦＮ、ＴＡＬＥＮのような特異的なヌクレアーゼの使用を通じて、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、操作したガイドＲＮＡとともに用いて行うことができる。さらに、標的化ヌクレアーゼが、Ａｒｇｏｎａｕｔｅシステムに基づいて開発されており（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来。「ＴｔＡｇｏ」として知られる。Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照されたい）、遺伝子編集及び遺伝子療法で用いられる潜在性もあると思われる。
様々な適切な遺伝子編集システムを用いて、本明細書に開示されている操作細胞を作製してよく、そのシステムとしては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムが挙げられるが、これらに限らない。概して、これらの遺伝子編集システムは、標的ＤＮＡ配列で、二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖切断、すなわちＳＳＢ）を誘導するために、操作した切断システムの使用を伴う。切断またはニッキングは、標的ＤＮＡ配列の特異的な切断またはニッキングを導くように、操作したＺＦＮ、ＴＡＬＥＮのような特異的なヌクレアーゼの使用を通じて、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、操作したガイドＲＮＡとともに用いて行うことができる。さらに、標的化ヌクレアーゼが、Ａｒｇｏｎａｕｔｅシステムに基づいて開発されており（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来。「ＴｔＡｇｏ」として知られる。Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照されたい）、遺伝子編集及び遺伝子療法で用いられる潜在性もあると思われる。
いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ＴＡＬＥＮシステムである。転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの所定の配列を切断するように操作できる制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製する。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、所望のＤＮＡ配列に結合するように操作して、所定の位置でのＤＮＡ切断を促すことができる（例えばＢｏｃｈ，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈを参照されたい）。この制限酵素は、ｉｎ ｓｉｔｕでの遺伝子編集（操作したヌクレアーゼによる遺伝子編集として知られる技法）で使用するために、細胞に導入できる。この遺伝子編集で使用するためのこのような方法及び組成物は、当該技術分野において知られている。例えば、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１４０４０３７０、ＷＯ２０１８０７３３９３（これらの内容は、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、ジンクフィンガーシステムである。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって作製する人工の制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作して、ジンクフィンガーヌクレアーゼを複合体ゲノム内の特有の配列に導くことができる。典型的には、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩに由来する非特異的な切断ドメインをＺＦＮの切断ドメインとして使用する。切断部は、内在性のＤＮＡ修復機構によって修復して、ＺＦＮが、高等生物のゲノムを正確に変化させることができるようにする。この遺伝子編集で使用するためのこのような方法及び組成物は、当該技術分野において知られている。例えばＷＯ２０１１０９１３２４（この内容は、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、その遺伝子編集システムは、例えば、ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡと、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、本明細書にさらに説明されている。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ
本発明で提供するのは、例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とともに、開示されているガイド配列を含むガイドＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を用いて、標的配列を修飾するのに有用なガイド配列である。
本発明で提供するのは、例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とともに、開示されているガイド配列を含むガイドＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を用いて、標的配列を修飾するのに有用なガイド配列である。
本明細書に開示されているガイド配列のそれぞれはさらに、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドを含んでよく、例えば、ガイド配列の３’末端に、５’から３’への方向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１７０）という例示的なヌクレオチド配列が続く。ｓｇＲＮＡの場合には、上記のガイド配列はさらに、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチド（スキャフォールド配列）を含んでよく、例えば、ガイド配列の３’末端の後に、５’から３’への方向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１７１）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１７２。配列番号１７１の末端の４つのＵを含まない）という例示的なヌクレオチド配列が続く。いくつかの実施形態では、配列番号１７１の末端の４つのＵは存在しない。いくつかの実施形態では、配列番号１７１の末端の４つのＵのうちの１個、２個または３個のみが存在する。
いくつかの実施形態では、そのｓｇＲＮＡは、配列番号１～１０１のガイド配列のいずれか１つと、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチド、例えば、ガイド配列の３’末端の後に続くＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１７３）（５’から３’への方向）という例示的なスキャフォールドヌクレオチド配列とを含む。配列番号１７３は、野生型ガイドＲＮＡで保存されている配列、すなわちＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１７２）と比べて、８個のヌクレオチドを欠損している。
他の例示的なスキャフォールドヌクレオチド配列は、表２３に示されている。いくつかの実施形態では、本発明のｓｇＲＮＡは、配列番号１～１０１のガイド配列のいずれか１つと、表２３の追加のガイドスキャフォールド配列（５’から３’への方向）（示されているように、修飾型のスキャフォールド配列を含む）とを含む。
そのガイドＲＮＡはさらに、ｔｒＲＮＡを含んでよい。本明細書に記載されているそれぞれの組成物及び方法の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、１本のＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合していてもよいし、または別々のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）に存在してもよい。ｓｇＲＮＡの場合には、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成成分は、例えば、ホスホジエステル結合またはその他の共有結合によって共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列及び／またはｔｒＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの「スキャフォールド」または「保存部分」という場合もある。
本明細書に記載されている組成物、用途及び方法の実施形態のそれぞれでは、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」すなわち「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含んでよい。ｄｇＲＮＡは、例えば、表１に示されているガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子は、共有結合していなくてもよいが、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの一部の間の塩基対合によってＲＮＡ複合体を形成してよい。
本明細書に記載されている組成物、用途及び方法の実施形態のそれぞれでは、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として１つのＲＮＡ分子を含んでよい。そのｓｇＲＮＡは、表１に示されているガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部）が、ｔｒＲＮＡに共有結合したものを含んでよい。そのｓｇＲＮＡは、表１に示されているガイド配列の１７個、１８個、１９個または２０個の連続するヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、そのｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合されている。いくつかの実施形態では、本発明のｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの一部の間の塩基対合を介して、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して、共有結合されている。
いくつかの実施形態では、本発明のｔｒＲＮＡは、天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから得られるｔｒＲＮＡ配列の全部または一部を含んでよい。いくつかの実施形態では、そのｔｒＲＮＡは、トランケートまたは修飾した野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって決まる。いくつかの実施形態では、本発明のｔｒＲＮＡは、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個または１００個超のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本発明のｔｒＲＮＡは、例えば、１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造のような特定の二次構造を含んでよい。
いくつかの実施形態では、表１におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、表１におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物を提供し、そのガイド配列の３’末端の後に、配列番号１７０、１７１、１７２または１７３のヌクレオチドが続く。いくつかの実施形態では、表１におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡであって、そのガイド配列の３’末端の後に、配列番号１７０、１７１、１７２または１７３のヌクレオチドが続くガイドＲＮＡは、配列番号３００の修飾パターンに従って修飾されている。
いくつかの実施形態では、表１におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。一態様では、配列番号１～１０１の核酸のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％同一であるガイド配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを含む組成物を提供する。
別の実施形態では、表１に示されているガイド配列のいずれか２つ以上から選択したガイド配列を含む少なくとも１つ、例えば少なくとも２つのｇＲＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その組成物は、表１に示されているガイド配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％同一なガイド配列をそれぞれ含む少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のガイドＲＮＡ組成物は、ＣＩＩＴＡ内の標的配列を認識する（例えば、標的配列にハイブリダイズする）ように設計されている。例えば、そのＣＩＩＴＡ標的配列は、供給されたＣａｓクリバーゼ（ガイドＲＮＡを含む）によって認識及び切断されてよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓクリバーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、ガイドＲＮＡによって、ＣＩＩＴＡ内の標的配列に誘導させてよく、その際、そのガイドＲＮＡのガイド配列が、標的配列とハイブリダイズし、ＣａｓクリバーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、その標的配列を切断する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＣＩＩＴＡ内の標的配列に基づき決定する。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列を含む組成物は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８の座標に従って、表１に示されている対応するゲノム領域と相補的であるガイド配列を含む。さらなる実施形態のガイド配列は、表１のいずれかに列挙されている、ＣＩＩＴＡ内のゲノム座標のすぐ近傍の配列と相補的であってよい。例えば、さらなる実施形態のガイド配列は、表１に列挙されているゲノム座標の１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列と相補的であってよい。
いずれかの特定の理論に拘束されるものではないが、標的遺伝子の特定の領域における修飾（例えば、ヌクレアーゼの媒介によるＤＳＢの結果として生じるインデルに起因するフレームシフト変異）は、他の領域内の変異よりも許容性が低いことがあるので、ＤＳＢの位置は、生じ得るタンパク質ノックダウンの量または種類において重要な要因である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子内の標的配列と相補的であるか、または相補性を有するｇＲＮＡを用いて、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を、その標的遺伝子内の特定の位置に誘導する。
いくつかの実施形態では、そのガイド配列は、標的遺伝子に存在する標的配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％または８０％同一である。いくつかの実施形態では、そのガイド配列は、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子に存在する標的配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％または８０％同一である。
いくつかの実施形態では、標的配列は、そのガイドＲＮＡのガイド配列と相補的であってよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのガイド配列と、その対応する標的配列との相補性または同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、標的配列と、ｇＲＮＡのガイド配列は、１００％相補的または同一であってよい。別の実施形態では、標的配列と、ｇＲＮＡのガイド配列は、少なくとも１つのミスマッチを含んでよい。例えば、標的配列と、ｇＲＮＡのガイド配列は、１個、２個、３個または４個のミスマッチを含んでよく、そのガイド配列の全長は、２０である。いくつかの実施形態では、標的配列と、ｇＲＮＡのガイド配列は、１～４個のミスマッチを含んでよく、そのガイド配列は、２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている組成物または製剤は、本明細書に記載されているようなＣａｓヌクレアーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを提供、使用または投与する。
Ｂ．ｇＲＮＡの修飾
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短鎖ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を修飾する。「修飾された」または「修飾」という用語は、本明細書に記載されているｇＲＮＡの文脈では、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾または３’末端修飾（５’または３’の保護末端修飾を含む）、（ｂ）核酸塩基（または「塩基」）の修飾（塩基の置き換えまたは除去を含む）、（ｃ）糖の修飾（２’位、３’位及び／または４’位での修飾を含む）、（ｄ）ヌクレオシド間結合の修飾、ならびに（ｅ）主鎖の修飾（ホスホジエステル結合及び／またはリボース糖の修飾または置き換えを含むことができる）を含め、上記の修飾を含む。所定の位置のヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチドの糖の３’直後のホスホジエステル結合の修飾または置き換えを含む。すなわち、例えば、５’末端から１番目の糖と２番目の糖の間にホスホロチオエートを含む核酸は、１位に修飾を含むとみなす。「修飾ｇＲＮＡ」という用語は概して、塩基、糖、及びホスホジエステル結合または主鎖部分（ヌクレオチドのリン酸を含む）の１つ以上の、化学構造に対する修飾を有するｇＲＮＡを指し、いずれも、本明細書に詳述及び例示されている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短鎖ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を修飾する。「修飾された」または「修飾」という用語は、本明細書に記載されているｇＲＮＡの文脈では、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾または３’末端修飾（５’または３’の保護末端修飾を含む）、（ｂ）核酸塩基（または「塩基」）の修飾（塩基の置き換えまたは除去を含む）、（ｃ）糖の修飾（２’位、３’位及び／または４’位での修飾を含む）、（ｄ）ヌクレオシド間結合の修飾、ならびに（ｅ）主鎖の修飾（ホスホジエステル結合及び／またはリボース糖の修飾または置き換えを含むことができる）を含め、上記の修飾を含む。所定の位置のヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチドの糖の３’直後のホスホジエステル結合の修飾または置き換えを含む。すなわち、例えば、５’末端から１番目の糖と２番目の糖の間にホスホロチオエートを含む核酸は、１位に修飾を含むとみなす。「修飾ｇＲＮＡ」という用語は概して、塩基、糖、及びホスホジエステル結合または主鎖部分（ヌクレオチドのリン酸を含む）の１つ以上の、化学構造に対する修飾を有するｇＲＮＡを指し、いずれも、本明細書に詳述及び例示されている。
修飾のさらなる説明及び例示的なパターンは、２０１９年１２月１２日に公開されたＷＯ２０１９／２３７０６９（その全体は、参照により、本明細書に援用される）の表１に示されている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個以上のＹＡ部位に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンが、修飾を含む（そのピリミジンの糖の３’直後のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニンが、修飾を含む（そのアデニンの糖の３’直後のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン及びアデニンが、糖、塩基またはヌクレオシド間結合の修飾のような修飾を含む。ＹＡの修飾は、本明細書に定められている種類の修飾のいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、ＹＡの修飾は、ホスホロチオエート、２’－ＯＭｅまたは２’－フルオロの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡの修飾は、ホスホロチオエート、２’－ＯＭｅ、２’－Ｈ、イノシンまたは２’－フルオロの１つ以上を含む、ピリミジンの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡの修飾は、１つ以上のＹＡ部位を含むＲＮＡ複合体領域内の二環式リボースアナログ（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡの修飾は、ＹＡ部位を含むＲＮＡ複合体領域内の二環式リボースアナログ（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはＥＮＡ）を含み、そのＹＡの修飾は、そのＹＡ部位の遠位側である。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのガイド配列（またはガイド領域）は、ＹＡの修飾を含んでよい１個、２個、３個、４個または５個以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」）を含む。いくつかの実施形態では、５’末端の５’エンドから５番目のエンド、６番目のエンド、７番目のエンド、８番目のエンド、９番目のエンドまたは１０番目のエンド（「５番目のエンド」などは、ガイド領域の３’末端、すなわち、ガイド領域における一番最後の３’ヌクレオチドに向かって５番目の位置を指す）に位置する１つ以上のＹＡ部位が、ＹＡの修飾を含む。修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ＹＡの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、そのガイド領域の３’末端ヌクレオチドから２０ヌクレオチド以内、１９ヌクレオチド以内、１８ヌクレオチド以内、１７ヌクレオチド以内、１６ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、１４ヌクレオチド以内、１３ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内または９ヌクレオチドヌクレオチド以内である。例えば、修飾ガイド領域ＹＡ部位が、そのガイド領域の３’末端ヌクレオチドから１０ヌクレオチド以内であり、そのガイド領域が、２０ヌクレオチド長である場合には、その修飾ガイド領域ＹＡ部位の修飾ヌクレオチドは、１１～２０位のいずれかに位置する。いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端の５’エンドから４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチドまたは１１番目のヌクレオチドにあるか、そのヌクレオチドの後にある。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’エンドの修飾以外である。例えば、ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載されているような、５’エンドの修飾を含むことができ、さらに、修飾ガイド領域ＹＡ部位を含む。あるいは、ｓｇＲＮＡは、未修飾の５’エンドと、修飾ガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。あるいは、短鎖ｓｇＲＮＡは、未修飾の５’エンドと、未修飾のガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域のＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチドが含まない修飾を含む。例えば、１～３番目のヌクレオチドが、ホスホロチオエートを含み、４番目のヌクレオチドのみが、２’－ＯＭｅの修飾を含み、５番目のヌクレオチドが、ＹＡ部位のピリミジンであるとともに、ホスホロチオエートを含む場合には、その修飾ガイド領域ＹＡ部位は、そのガイド領域のＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチド（４番目のヌクレオチド）が含まない修飾（ホスホロチオエート）を含む。別の例では、１～３番目のヌクレオチドが、ホスホロチオエートを含み、４番目のヌクレオチドが、ＹＡ部位のピリミジンであるとともに、２’－ＯＭｅを含む場合には、その修飾ガイド領域ＹＡ部位は、そのガイド領域のＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチド（１～３番目のヌクレオチドのいずれか）が含まない修飾（２’－ＯＭｅ）を含む。未修飾のヌクレオチドが、修飾ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する場合には、この条件を常に満たす。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ＹＡ部位について上記されているような修飾を含む。ｇＲＮＡのガイド領域は、本明細書に定められている修飾ガイド領域を含むいずれかの実施形態に従って修飾してよい。本開示の他の箇所で定められているいずれの実施形態も、上記の実施形態のいずれかとともに実現可能である範囲で組み合わせてもよい。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端領域及び／または３’末端領域が修飾されている。
いくつかの実施形態では、３’末端領域内の末端（すなわち最後）の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドが修飾されている。全体を通じて、この修飾は、「３’末端の修飾」という場合もある。いくつかの実施形態では、３’末端領域内の末端（すなわち最後）の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’末端の修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、逆位脱塩基修飾ヌクレオチド、またはこれらの組み合わせから選択した修飾ヌクレオチドのいずれか１つ以上を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドの修飾を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端の修飾は、１つのＰＳ結合を含むか、またはさらに含み、その結合は、最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間の結合である。いくつかの実施形態では、３’末端の修飾は、最後の３ヌクレオチドの間に２つのＰＳ結合を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端の修飾は、最後の４ヌクレオチドの間に４つのＰＳ結合を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端の修飾は、最後の２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端の修飾を含むｇＲＮＡは、３’テールを含むか、またはさらに含み、その３’テールは、その３’テールに存在するヌクレオチドのいずれか１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、その３’テールは、完全に修飾されている。いくつかの実施形態では、その３’テールは、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１～２ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～６ヌクレオチド、１～７ヌクレオチド、１～８ヌクレオチド、１～９ヌクレオチドまたは１～１０ヌクレオチドを含み、任意に、これらのヌクレオチドのいずれか１つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態では、３’の保護末端修飾を含むｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、その３’テールは、１～約２０ヌクレオチド、１～約１５ヌクレオチド、１～約１０ヌクレオチド、１～約５ヌクレオチド、１～約４ヌクレオチド、１～約３ヌクレオチド及び１～約２ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、３’テールを含まない。
いくつかの実施形態では、５’末端領域が修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの最初の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドが修飾されている。全体を通じて、この修飾は、「５’末端の修飾」という場合がある。いくつかの実施形態では、５’末端領域の最初の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端の末端（すなわち最初）の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端領域及び３’末端領域（例えば末端）の両方が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端領域のみが修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの保存部分の３’末端領域（±３’テール）が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、そのｇＲＮＡの５’末端領域の最初の７ヌクレオチドの１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端領域の、７個の末端ヌクレオチドの１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個に修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端領域の最初の４ヌクレオチドの２個、３個もしくは４個、及び／または３’末端領域の末端の４ヌクレオチドの２個、３個もしくは４個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端領域の最初の４ヌクレオチドの２個、３個または４個は、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合している。いくつかの実施形態では、５’末端及び／または３’末端に対する修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾または２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、その修飾は、ヌクレオチドに対する、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、その修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、その修飾は、逆位脱塩基ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その修飾は、保護末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、その修飾は、保護末端修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｏ－ｍｏｅ、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、及び逆位脱塩基ヌクレオチドから選択した２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、等しい修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾と３’末端修飾を含むｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’末端または３’末端にはない修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、上部ステムの修飾を含むｓｇＲＮＡを提供し、その上部ステムの修飾は、上部ステム領域内のＵＳ１～ＵＳ１２のいずれか１つ以上に対する修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステムの修飾を含むｓｇＲＮＡを提供し、その上部ステムの修飾は、上部ステム領域内の少なくとも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチまたは１２ヌクレオチドすべての修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステムの修飾を含むｓｇＲＮＡを提供し、その上部ステムの修飾は、ＹＡ部位内の１個、２個、３個、４個または５個のＹＡの修飾を含む。いくつかの実施形態では、その上部ステムの修飾は、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’－Ｆ修飾ヌクレオチド及び／またはこれらの組み合わせを含む。５’末端修飾及び／または３’末端修飾など、本明細書に記載されている他の修飾を上部ステムの修飾と組み合わせてよい。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域の修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド及び／またはこれらの組み合わせから選択した少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域の修飾は、ヘアピン１領域内にある。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域の修飾は、ヘアピン２領域内にある。いくつかの実施形態では、ヘアピンの修飾は、ＹＡ部位内の１個、２個または３個のＹＡの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの修飾は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個または６個のＹＡの修飾を含む。上部ステムの修飾、５’末端修飾及び／または３’末端修飾など、本明細書に記載されている他の修飾をヘアピン領域内の修飾と組み合わせてよい。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、置換され、任意に短縮されたヘアピン１領域を含み、置換され、任意に短縮されたヘアピン１では、Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、及び／またはＨ１－４及びＨ１－９というヌクレオチド対の少なくとも１つが、ワトソン・クリック対合ヌクレオチドに置換されている。「ワトソン・クリック対合ヌクレオチド」には、Ａ－Ｔ、Ａ－Ｕ、Ｔ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ｇ及びＧ－Ｃという対、ならびに上記ヌクレオチドのいずれかのうちの修飾型であって、同じ塩基対合選択性を有する修飾型を含む対を含むワトソン・クリック塩基対を形成できるいずれかの対が含まれる。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、Ｈ１－５～Ｈ１－８のいずれか１つまたは２つを欠損している。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、及び／またはＨ１－４及びＨ１－９というヌクレオチド対の１つ、２つまたは３つを欠損している。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、そのヘアピン１領域の１～８ヌクレオチドを欠損している。上記実施形態のいずれかでは、欠損しているヌクレオチドは、ワトソン・クリック対合ヌクレオチドに置換された１つ以上のヌクレオチド対（Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、及び／またはＨ１－４及びＨ１－９）が、ｇＲＮＡで塩基対を形成するようになっていてよい。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはさらに、少なくとも１ヌクレオチドを欠損している上部ステム領域、例えば、米国特許出願第６２／９４６，９０５号（その内容は、参照により、全体が本明細書に援用される）の表７に示されているか、または本明細書の他の箇所に記載されている短縮型上部ステム領域のいずれかを含み、その上部ステム領域は、本明細書に記載されている短縮型ヘアピン１領域または置換ヘアピン１領域のいずれかと組み合わせてよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡはさらに、ネクサス領域を含み、そのネクサス領域は、少なくとも１つのヌクレオチドを欠損している。
いくつかの実施形態では、本発明で提供するｓｇＲＮＡは、例えば、ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む短鎖のシングルガイドＲＮＡ（短鎖ｓｇＲＮＡ）であり、そのヘアピン領域は、少なくとも５～１０ヌクレオチドまたは６～１０ヌクレオチドを欠損している。いくつかの実施形態では、その５～１０ヌクレオチドまたは６～１０ヌクレオチドは、連続している。
いくつかの実施形態では、短鎖ｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくとも５４～５８番目のヌクレオチド（ＡＡＡＡＡ）を欠損している。いくつかの実施形態では、短鎖ｓｇＲＮＡは、例えば、ペアワイズアラインメントまたは構造的アラインメントによって求めた場合に、ｓｐｙＣａｓ９の保存部分の５４～５８番目のヌクレオチド（ＡＡＡＡＡ）に対応するヌクレオチドを欠損している非ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている短鎖ｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域を含む保存部分を含み、そのヘアピン領域は、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチドまたは１２ヌクレオチドを欠損している。いくつかの実施形態では、その欠損しているヌクレオチドは、５～１０ヌクレオチドの欠損または６～１０ヌクレオチドの欠損である。いくつかの実施形態では、その欠損しているヌクレオチドは、連続している。いくつかの実施形態では、その欠損しているヌクレオチドは、少なくとも、ヘアピン１の一部分及びヘアピン２の一部分に及ぶ。いくつかの実施形態では、その５～１０個の欠損ヌクレオチドは、配列番号１７１の５４～５８番目、５４～６１番目または５３～６０番目のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている短鎖ｓｇＲＮＡはさらに、ネクサス領域を含み、そのネクサス領域は、少なくとも１ヌクレオチド（例えば、ネクサス領域内の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチド）を欠損している。いくつかの実施形態では、短鎖ｓｇＲＮＡは、ネクサス領域内の各ヌクレオチドを欠損している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＳｐｙＣａｓ９短鎖ｓｇＲＮＡは、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号９７６）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている短鎖ｓｇＲＮＡは、配列番号９７７：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵｍＧｍＣ＊ｍＵ（配列番号９７７）に示されているような修飾パターンを含み、この配列中、別段に示されていない限り、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシル、Ｎはいずれかのリボヌクレオチドである。ｍは、２’Ｏ－メチル修飾を示しており、＊は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示している。
特定の実施形態では、例として、配列番号１７２（「例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１」）を用いる場合、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１はさらに、
Ａ．短縮型ヘアピン１領域、または置換されかつ任意に短縮されたヘアピン１領域であって、
１．Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、またはＨ１－４及びＨ１－９というというヌクレオチド対の少なくとも１つが、ヘアピン１において、ワトソン・クリック対合ヌクレオチドに置換されおり、そのヘアピン１領域が任意に、
ａ．Ｈ１－５～Ｈ１－８のいずれか１つもしくは２つ、
ｂ．Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、ならびにＨ１－４及びＨ１－９というヌクレオチド対の１つ、２つもしくは３つ、または
ｃ．ヘアピン１領域の１～８ヌクレオチド、を欠損しているか、
２．その短縮型ヘアピン１領域が、６～８ヌクレオチド、好ましくは６ヌクレオチドを欠損しており、
ａ．Ｈ１－１位、Ｈ１－２位もしくはＨ１－３位の１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、欠失または置換されているか、または
ｂ．Ｈ１－６位～Ｈ１－１０位の１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、置換されているか、
３．その短縮型ヘアピン１領域が、５～１０ヌクレオチド、好ましくは５～６ヌクレオチドを欠損しており、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、Ｎ１８位、Ｈ１－１２位またはｎの１つ以上が、置換されているヘアピン１領域、
Ｂ．１～６ヌクレオチドを欠損している短縮型上部ステム領域であって、その短縮型上部ステム領域の６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチドまたは１１ヌクレオチドが、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、４個以下の置換を含む短縮型上部ステム領域、
Ｃ．例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）に対する、ＬＳ６、ＬＳ７、ＵＳ３、ＵＳ１０、Ｂ３、Ｎ７、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｈ２－２及びＨ２－１４のいずれか１つ以上における置換であって、その置換基ヌクレオチドが、アデニンの前にあるピリミジン、もしくはピリミジンの前にあるアデニンのいずれでもない置換、あるいは
Ｄ．上部ステム領域を有する例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）であって、その上部ステムの修飾が、その上部ステム領域内のＵＳ１～ＵＳ１２のいずれか１つ以上に対する修飾を含み、
１．その修飾ヌクレオチドが任意に、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、逆位脱塩基修飾ヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせから選択されているか、または
２．その修飾ヌクレオチドが任意に、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、
例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１のうちの１つ以上を含む。
Ａ．短縮型ヘアピン１領域、または置換されかつ任意に短縮されたヘアピン１領域であって、
１．Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、またはＨ１－４及びＨ１－９というというヌクレオチド対の少なくとも１つが、ヘアピン１において、ワトソン・クリック対合ヌクレオチドに置換されおり、そのヘアピン１領域が任意に、
ａ．Ｈ１－５～Ｈ１－８のいずれか１つもしくは２つ、
ｂ．Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、ならびにＨ１－４及びＨ１－９というヌクレオチド対の１つ、２つもしくは３つ、または
ｃ．ヘアピン１領域の１～８ヌクレオチド、を欠損しているか、
２．その短縮型ヘアピン１領域が、６～８ヌクレオチド、好ましくは６ヌクレオチドを欠損しており、
ａ．Ｈ１－１位、Ｈ１－２位もしくはＨ１－３位の１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、欠失または置換されているか、または
ｂ．Ｈ１－６位～Ｈ１－１０位の１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、置換されているか、
３．その短縮型ヘアピン１領域が、５～１０ヌクレオチド、好ましくは５～６ヌクレオチドを欠損しており、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、Ｎ１８位、Ｈ１－１２位またはｎの１つ以上が、置換されているヘアピン１領域、
Ｂ．１～６ヌクレオチドを欠損している短縮型上部ステム領域であって、その短縮型上部ステム領域の６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチドまたは１１ヌクレオチドが、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）と比べて、４個以下の置換を含む短縮型上部ステム領域、
Ｃ．例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）に対する、ＬＳ６、ＬＳ７、ＵＳ３、ＵＳ１０、Ｂ３、Ｎ７、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｈ２－２及びＨ２－１４のいずれか１つ以上における置換であって、その置換基ヌクレオチドが、アデニンの前にあるピリミジン、もしくはピリミジンの前にあるアデニンのいずれでもない置換、あるいは
Ｄ．上部ステム領域を有する例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号１７２）であって、その上部ステムの修飾が、その上部ステム領域内のＵＳ１～ＵＳ１２のいずれか１つ以上に対する修飾を含み、
１．その修飾ヌクレオチドが任意に、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、逆位脱塩基修飾ヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせから選択されているか、または
２．その修飾ヌクレオチドが任意に、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、
例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１のうちの１つ以上を含む。
特定の実施形態では、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１、または例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１を含むｓｇＲＮＡのようなｓｇＲＮＡはさらに、３’テール、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチドまたは４ヌクレオチド以上からなる３’テールを含む。特定の実施形態では、そのテールは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、その修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、及び逆位脱塩基修飾ヌクレオチド、またはこれらの組み合わせから選択されている。特定の実施形態では、その修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、その修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド間のＰＳ結合を含む。特定の実施形態では、その修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、及びヌクレオチド間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、化学修飾されている。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、カノニカルなＡ残基、Ｇ残基、Ｃ残基及びＵ残基の代わりに、またはこれらの残基に加えて用いられている１つ以上の非天然及び／または天然の構成成分またはコンフィギュレーションの存在を説明するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ぶ。修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドとしては、（ｉ）ホスホジエステル主鎖結合における結合していないリン酸酸素の１つもしくは両方、及び／または結合しているリン酸酸素の１つ以上の変更、例えば置き換え（例示的な主鎖修飾）、（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更、例えば置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の、「デホスホ」リンカーへの大幅な置き換え（例示的な主鎖修飾）、（ｉｖ）天然の核酸塩基の修飾または置き換え（非カノニカルな核酸塩基によるものを含む）（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース－リン酸主鎖の置き換えまたは修飾（例示的な主鎖修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換え、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション（３’キャップ修飾または５’キャップ修飾は、糖及び／または主鎖の修飾を含んでよい）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を挙げることができる。
上で列挙したような化学修飾を組み合わせて、２個、３個または４個以上の修飾を有することができるヌクレオシド及びヌクレオチド（総称して「残基」という）を含む修飾ｇＲＮＡをもたらすことができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの塩基のすべてが修飾されており、例えば、すべての塩基が、ホスホロチオエート基のような修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全部または実質的に全部が、ホスホロチオエート基に置き換えられている。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端または５’末端の近くに、少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端または３’末端の近くに、少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１個、２個または３個以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡにおける位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％）が、修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドである。
主鎖修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、その酸素の１つ以上を異なる置換基に置き換えることによって修飾できる。さらに、その修飾残基、例えば、修飾核酸に存在する修飾残基は、未修飾リン酸部分が、本明細書に記載されているような修飾リン酸基に大幅に置き換えられたものを含むことができる。いくつかの実施形態では、リン酸主鎖の主鎖修飾は、非荷電リンカー、または非対称な電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす変更を含むことができる。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられる。
核酸を模することができるスキャフォールドを構築することができ、そのリン酸リンカー及びリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドサロゲートまたはヌクレオチドサロゲートに置き換えられている。このような修飾は、主鎖及び糖の修飾を含んでよい。いくつかの実施形態では、その核酸塩基は、サロゲート主鎖によってテザリングできる。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン及びペプチド核酸（ＰＮＡ）のヌクレオシドサロゲートを挙げることができるが、これらに限らない。
その修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基に対する修飾、すなわち糖修飾における修飾を１つ以上含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）が修飾されていることでき、例えば、相当数の異なる「オキシ」置換基または「デオキシ」置換基に置き換えられていることができる。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基に対する修飾により、その核酸の安定性を高めることができる。ヒドロキシルを脱プロトン化して、２’－アルコキシドイオンを形成できなくなるからである。２’ヒドロキシル基の修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ。式中、「Ｒ」は例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であることができる）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは例えば、Ｈ、または任意に置換されたアルキルであることができ、ｎは、０～２０の整数であることができる）を挙げることができる。いくつかの実施形態では、その２’ヒドロキシル基の修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであることができる。いくつかの実施形態では、その２’ヒドロキシル基の修飾は、２’ヒドロキシル基がフッ化物に置き換えられている２’－フルオロ修飾であることができる。いくつかの実施形態では、その２’ヒドロキシル基の修飾は、例えば、Ｃ１－６アルキレン架橋またはＣ１－６ヘテロアルキレン架橋によって、２’ヒドロキシルを、同じリボース糖の４’炭素に連結できる「ロック」核酸（ＬＮＡ）を含むことができ、その例示的な架橋としては、メチレン架橋、プロピレン架橋、エーテル架橋またはアミノ架橋を挙げることができる。いくつかの実施形態では、その２’ヒドロキシル基の修飾は、そのリボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠損している「アンロック」核酸（ＵＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、その２’ヒドロキシル基の修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を含むことができる。
「デオキシ」による２’修飾は、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロまたはヨード）、アミノ（そのアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸であることができる）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（そのアミノは、例えば、本明細書に記載されているようなものであることができる）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（そのＲは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であることができる）、シアノ、メルカプト、アルキルチオアルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニル（例えば、本明細書に記載されているようなアミノに任意に置換されていてよい）を含むことができる。
その糖修飾は、リボース内の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素も含み得る糖基を含むことができる。すなわち、修飾核酸は、例えばアラビノースを糖として含むヌクレオチドを含むことができる。その修飾核酸は、脱塩基糖を含むことができる。これらの脱塩基糖は、構成要素である糖原子の１つ以上において、さらに修飾されていることができる。その修飾核酸は、Ｌ体である糖も１つ以上含むことができる（例えばＬ－ヌクレオシド）。
本明細書に記載されている修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドであって、修飾核酸に組み込むことができる修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、修飾塩基（核酸塩基ともいう）を含むことができる。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これらに限らない。これらの核酸塩基は、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基をもたらすように修飾されているか、または完全に置き換えられていることができる。ヌクレオチドの核酸塩基は独立して、プリン、ピリミジン、プリンアナログまたはピリミジンアナログから選択されていることができる。いくつかの実施形態では、その核酸塩基は、例えば、天然の塩基及び合成の塩基誘導体を含むことができる。
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡのそれぞれは、修飾を含むことができる。このような修飾は、そのｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒ ＲＮＡの一方の末端または両方の末端における修飾であってよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態では、そのｓｇＲＮＡの一方の末端または両方の末端における１つ以上の残基が、化学修飾されていてもよいし、またはｓｇＲＮＡ全体が、化学修飾されていてもよい。特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハング内のヌクレオチドの１つ以上または全部が、デオキシヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているｇＲＮＡは、２０１８年６月１４日に公開されたＷＯ２０１８／１０７０２８ Ａ１（その内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている修飾パターンの１つを含む。
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されているヌクレオチドを示す目的で用いられていることがある。「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」または「ｆＧ」という用語は、２’－Ｆに置換したヌクレオチドを示す目的で用いられていることがある。「＊」は、ＰＳ修飾を示す目的で用いられていることがある。Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊またはＧ＊という用語は、ＰＳ結合によって、次（例えば３’）のヌクレオチドに連結しているヌクレオチドを示す目的で用いられていることがある。「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」または「ｍＧ＊」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅに置換されているとともに、ＰＳ結合によって、次（例えば３’）のヌクレオチドに連結しているヌクレオチドを示す目的で用いられていることがある。
Ｃ．リボ核タンパク質複合体
いくつかの実施形態では、本開示は、表１の、１つ以上のガイド配列と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）のようなヌクレアーゼとを含む１つ以上のｇＲＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、クリバーゼ活性を有し、その活性は、二本鎖エンドヌクレアーゼ活性ということもできる。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びその他の原核生物のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、次の段落のリストを参照されたい）、ならびにそれらの修飾型（例えば、操作型または変異型）が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照されたい。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍ複合体もしくはＣｍｒ複合体、またはそれらのＣａｓ１０サブユニット、Ｃｓｍ１サブユニットもしくはＣｍｒ２サブユニット、及びタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体、またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、タイプＩＩＡシステム、タイプＩＩＢシステムまたはタイプＩＩＣシステムのＣａｓヌクレアーゼであってよい。様々なＣＲＩＳＰＲシステム及びＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ニッカーゼは、修飾されているか、またはクラス２のＣａｓヌクレアーゼ（例えば、タイプＩＩ、ＶまたはＶＩのＣａｓヌクレアーゼであってよい）のようなＣａｓタンパク質から得られる。クラス２のＣａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質及びＣ２ｃ３タンパク質、ならびにそれらの修飾体が挙げられる。
そのＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼの由来元であることができる非限定的な例示的種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓまたはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼから得られる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼから得られる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼのニッカーゼ型である。例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ Ｄ１６Ａニッカーゼ融合タンパク質について説明しているＷＯ／２０２００８１５６８を参照されたい。いくつかの実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼから得られる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼから得られる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼから得られる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼから得られる。さらなる実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓまたはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼから得られる。特定の実施形態では、そのＣａｓニッカーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼから得られる。他の箇所に論じられているように、ニッカーゼは、２つの触媒ドメインの１つを不活化することによって、例えば、核酸分解に不可欠な活性部位の残基（Ｓｐｙ Ｃａｓ９のＤ１０、Ｈ８４０またはＮ８６３など）を変異させることによって、ヌクレアーゼから得てよい。当業者は、他のＣａｓタンパク質における対応する残基を簡単に特定する技法（下に詳細に論じられている配列アラインメント及び構造的アラインメントなど）に精通しているであろう。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤と合わさったｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）という。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼと合わさったｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰという。いくつかの実施形態では、そのＲＮＰは、タイプＩ、タイプＩＩまたはタイプＩＩＩの構成成分を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９と合わさったｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰという。
野生型Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨという２つのヌクレアーゼドメインを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的のＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインは、ＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、２つ以上のＲｕｖＣドメイン及び／または２つ以上のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。本発明の組成物、用途及び方法の実施形態のそれぞれでは、Ｃａｓは、標的ＤＮＡで二本鎖切断を誘導する。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼを使用し、そのタンパク質の、１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の部分によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、異なるヌクレアーゼ（Ｆｏｋ１など）に由来するドメインに置き換えられていてよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
別の実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼは、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来してもよい。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体の構成成分であってもよい。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来してもよい。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有してよい。
いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有してよく、すなわち、１本のＤＮＡ鎖を切断して、一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を作ることができる。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡにニックを作る酵素、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、もう一方の鎖は切断しない酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の変更（例えば点変異）によって、エンドヌクレアーゼ活性部位が不活化されている型のＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で論じられているＣａｓヌクレアーゼ）である。Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメインの変更に関する考察については、例えば、米国特許第８，８８９，３５６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼのようなＣａｓニッカーゼは、不活化されたＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾されている。例えば、その結合剤のタンパク質は、その核酸切断活性を低減させる目的で、ヌクレアーゼドメインの１つが変異するか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されていてよい。いくつかの実施形態では、活性が低減されたＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが用いられている。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが用いられている。いくつかの実施形態では、活性が低減されたＨＮＨドメインを有するニッカーゼが用いられている。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼが用いられている。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性を低減または変化させる目的で、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸が、置換されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでよい。ＲｕｖＣドメインまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。いくつかの実施形態では、そのＣａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでよい。ＨＮＨドメインまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅらの上記文献（２０１５）を参照されたい。さらに例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）の配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、それぞれ、その標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖と相補的である一対のガイドＲＮＡと組み合わせて、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡを提供する。この実施形態では、それらのガイドＲＮＡが、そのニッカーゼを標的配列に誘導し、その標的配列の対向する鎖にニックを作ること（すなわちダブルニッキング）によって、ＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、ダブルニッキングの利用により、特異性を改善して、オフターゲット作用を低減することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの対向する鎖を標的とする２つの別々のガイドＲＮＡとともに、ニッカーゼを使用して、標的ＤＮＡにダブルニックを入れる。いくつかの実施形態では、近接するように選択されている２つの別々のガイドＲＮＡとともに、ニッカーゼを使用して、標的ＤＮＡにダブルニックを入れる。
いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、クリバーゼ活性及びニッカーゼ活性を欠損している。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、ＤＮＡ結合ポリペプチドであるｄＣａｓを含む。ｄＣａｓポリペプチドは、ＤＮＡ結合活性を有する一方で、触媒（クリバーゼ／ニッカーゼ）活性を本質的に欠損している。いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓポリペプチドは、ｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クリバーゼ活性及びニッカーゼ活性を欠損しているＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＤＮＡ結合ポリペプチドであるｄＣａｓは、例えば、その触媒ドメインにおける１つ以上の変更（例えば点変異）によって、そのエンドヌクレアーゼ活性部位が不活化されている型のＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で論じたＣａｓヌクレアーゼ）である。例えば、ＵＳ２０１４／０１８６９５８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１６６９８０Ａ１を参照されたい。
いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種の機能的ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。
いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）である。いくつかの実施形態では、そのＡ３Ａは、ヒトＡ３Ａである。いくつかの実施形態では、そのＡ３Ａは、野生型Ａ３Ａである。
いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのｍＲＮＡはさらに、Ａ３Ａをコードする配列と、ＲＮＡ誘導型ニッカーゼをコードする配列とを連結するリンカーを含む。いくつかの実施形態では、そのリンカーは、有機分子、基、ポリマーまたは化学部分である。いくつかの実施形態では、そのリンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、そのペプチドリンカーは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個または少なくとも５０個以上のアミノ酸を有するいずれかのアミノ酸領域である。いくつかの実施形態では、そのペプチドリンカーは、１６残基の「ＸＴＥＮ」リンカーまたはそのバリアントである（例えば、実施例、及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｍａｎｎｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，１１８６－１１９０（２００９）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＸＴＥＮリンカーは、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９００）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号９０１）またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９０２）という配列を含む。いくつかの実施形態では、そのペプチドリンカーは、配列番号９０３～９１３から選択した１つ以上の配列を含む。
いくつかの実施形態では、その異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の、細胞の核内への輸送を促進し得る。例えば、その異種の機能的ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、１～１０個のＮＬＳと融合されていてよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、１～５個のＮＬＳと融合されていてよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、１つのＮＬＳと融合されていてよい。１つのＮＬＳを使用する場合には、そのＮＬＳは、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端またはＣ末端で融合されていてよい。そのＮＬＳは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の配列内に挿入されていてもよい。別の実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、２個以上のＮＬＳと融合されていてよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、２個、３個、４個または５個のＮＬＳと融合されていてもよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合されていてもよい。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じであってもよいし（例えば、２個のＳＶ４０ ＮＬＳ）、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端で融合された２個のＮＬＳ配列（例えばＳＶ４０）に融合されている。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合されていてよく、１つは、Ｎ末端で連結しており、１つは、Ｃ末端で連結している。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合されていてよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳと融合されていなくてよい。いくつかの実施形態では、そのＮＬＳは、単節型配列（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号６０１）など）であってよい。いくつかの実施形態では、そのＮＬＳは、双節型配列（ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０２）など）であってよい。具体的な実施形態では、１つのＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）というＮＬＳが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤のＣ末端で融合されていてよい。１つ以上のリンカーが任意に、融合部位に含まれている。
いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、エディターを含む。例示的なエディターは、ＸＴＥＮリンカーによってＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ－Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９ニッカーゼに融合したＨ．ｓａｐｉｅｎｓ ＡＰＯＢＥＣ３Ａを含むＢＣ２２ｎ、及びＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡである。ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡは、提供されている（配列番号８０４）。
いくつかの実施形態では、異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の細胞内の半減期を改変できてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の半減期を長くしてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の半減期を短くしてよい。いくつかの実施形態では、異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の安定性を向上できてよい。いくつかの実施形態では、異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤の安定性を低減できてよい。いくつかの実施形態では、異種の機能的ドメインは、タンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用してよい。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼまたはプロテアーゼであるカルパインのようなタンパク質分解酵素によって媒介してよい。いくつかの実施形態では、異種の機能的ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖を加えることによって修飾してよい。いくつかの実施形態では、そのユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ（インターフェロン刺激遺伝子－１５（ＩＳＧ１５）としても知られる））、ユビキチン関連修飾因子－１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞発生発現ダウンレギュレーションタンパク質－８（ＮＥＤＤ８（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｕｂ１ともいう））、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー－８（ＡＴＧ８）、オートファジー－１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜アンカー型ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチンンフォールド修飾因子－１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質－５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、異種の機能的ドメインは、マーカードメインであってよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ及びレポーター遺伝子の配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、そのマーカードメインは、蛍光タンパク質であってよい。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）及びオレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、またはいずれかの他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。別の実施形態では、そのマーカードメインは、精製タグ及び／またはエピトープタグであってよい。非限定的な例示的タグとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリＨｉｓ及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的レポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態では、その異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を所定の細胞小器官、細胞種、組織または器官に導いてよい。いくつかの実施形態では、その異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をミトコンドリアに導いてよい。
さらなる実施形態では、その異種の機能的ドメインは、エディタードメインのようなエフェクタードメインであってよい。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を、その標的配列に誘導するとき、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをｇＲＮＡによって標的配列に誘導するときには、エディタードメインのようなエフェクターは、その標的配列を修飾するか、またはその標的配列に作用するかしてよい。いくつかの実施形態では、エディタードメインのようなエフェクターは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ以外のヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインから選択されていてよい。いくつかの実施形態では、その異種の機能的ドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼのようなヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照されたい。いくつかの実施形態では、その異種の機能的ドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－６ （２０１３）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８ （２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ １５４：４４２－５１（２０１３）を参照されたい。したがって、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤は本質的に、ガイドＲＮＡを用いて、所望の標的配列と結合するように誘導できる転写因子となる。
Ｄ．ガイドＲＮＡの効力の判定
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの効力は、他の構成成分（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤）とともに送達または発現させて、ＲＮＰを形成させたときに判定する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９のようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とともに発現させる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼをすでに安定的に発現する細胞株に送達するか、またはその細胞株において発現させる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞に、ＲＮＰの一部として送達する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞に、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとともに送達する。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの効力は、他の構成成分（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤）とともに送達または発現させて、ＲＮＰを形成させたときに判定する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９のようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤とともに発現させる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼをすでに安定的に発現する細胞株に送達するか、またはその細胞株において発現させる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞に、ＲＮＰの一部として送達する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞に、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとともに送達する。
本明細書に記載されているように、本明細書に開示されているＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの使用により、ＤＮＡまたはｐｒｅ－ｍＲＮＡに核酸修飾をもたらすＤＳＢ、ＳＳＢ及び／または部位特異的結合を起こすことができ、この核酸修飾は、細胞機構による修復時に、挿入／欠失（インデル）変異という形で、エラーを発生させることがある。インデルによる多くの変異により、リーディングフレームが変化したり、未成熟終止コドンが導入されたり、またはエキソンスキッピングが誘導されたりするので、非機能的なタンパク質が産生される。
いくつかの実施形態では、特定のガイドＲＮＡの効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルに基づいて判定する。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、Ｔ細胞株である。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、Ｃａｓ９を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９）である。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、リンパ芽球様細胞株である。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、初代ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、初代ヒトＢ細胞である。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、初代ヒト末梢血リンパ球である。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、初代ヒト末梢血単核球である。
いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びそのガイドＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションした細胞のゲノムＤＮＡを解析することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで欠失または挿入が生じるオフターゲット部位数を求める。いくつかの実施形態では、このような判定は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びドナーオリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションした細胞のゲノムＤＮＡを解析することを含む。このような判定のための例示的な手順は、下記の実施例に示されている。
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡの効力は、ガイドＲＮＡの選択プロセスの際に、複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルで求める。いくつかの実施形態では、選択したガイドＲＮＡとともに、データの細胞株比較を行う。いくつかの実施形態では、複数の細胞モデルでのクロススクリーニングを行う。
いくつかの実施形態では、特定のガイドＲＮＡの効力は、ｉｎ ｖｉｖｏモデルに基づいて判定する。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｖｏモデルは、齧歯類動物モデルである。いくつかの実施形態では、その齧歯類動物モデルは、標的遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態では、その齧歯類動物モデルは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態では、その齧歯類動物モデルは、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態では、その齧歯類動物モデルは、Ｂ２Ｍ遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態では、その齧歯類動物モデルは、ヒトＢ２Ｍ遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態では、そのｉｎ ｖｉｖｏモデルは、ヒト以外の霊長類動物、例えばカニクイザルである。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの効力は、オンターゲット切断効率によって評価する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの効力は、標的位置、例えば、ＣＩＩＴＡまたはＢ２Ｍの編集率（％）によって測定する。いくつかの実施形態では、ディープシーケンシングを用いて、遺伝子編集によって導入された修飾（例えば、挿入、欠失）の存在を特定してよい。インデル率（％）は、次世代シーケンシング「ＮＧＳ」から計算できる。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの効力は、標的細胞種のゲノム内のオフターゲット配列でのインデルの数及び／または頻度によって測定する。いくつかの実施形態では、細胞集団において、及び／または標的部位でのインデル作製頻度と比べて、オフターゲット部位でのインデル頻度が非常に低い（例えば５％未満）有効なガイドＲＮＡを提供する。すなわち、本開示は、標的細胞種（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）において、オフターゲットでのインデル形成が見られないか、あるいは細胞集団において、及び／または標的部位でのインデル作製頻度と比べて、オフターゲットでのインデル形成頻度が５％未満であるガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞種（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）において、オフターゲットでのいずれのインデル形成も見られないガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載されている１つ以上の方法によって評価した場合に、インデルが作られるのが５個未満のオフターゲット部位であるガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載されている１つ以上の方法によって評価した場合に、インデルが作られるのが４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のオフターゲット部位であるガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、その標的細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）のゲノムのタンパク質コード領域において、オフターゲット部位（複数可）は見られない。
いくつかの実施形態では、直線的増幅を用いて、標的ＤＮＡにおける挿入／欠失（「インデル」）変異の形成、転座及び相同配向型修復（ＨＤＲ）イベントのような遺伝子編集イベントを検出する。例えば、特有配列のタグ化プライマーを用いた直線的増幅と、タグ化された増幅産物の単離（以下では、「ＵｎＩＴ」または「固有識別子タグメンテーション」法という）を使用してよい。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの効力は、標的細胞種内の染色体再構成数によって測定する。ＫｒｏｍａｔｉｄのｄＧＨアッセイを用いて、例えば、転座、相互転座、オフターゲット染色体への転座、欠失（すなわち、細胞複製周期の際に、編集イベントにより、断片が喪失する染色体再構成）を含む染色体再構成を検出してもよい。いくつかの実施形態では、標的細胞種は、染色体再構成が、１０個未満、８個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である。いくつかの実施形態では、標的細胞種では、染色体再構成が見られない。
Ｅ．ｇＲＮＡ組成物の送達
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質のカーゴを送達するための周知の手段であり、本明細書に開示されているガイドＲＮＡ、組成物または医薬製剤を送達するのに用いてよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸、タンパク質、または核酸とタンパク質を送達する。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質のカーゴを送達するための周知の手段であり、本明細書に開示されているガイドＲＮＡ、組成物または医薬製剤を送達するのに用いてよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸、タンパク質、または核酸とタンパク質を送達する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されているｇＲＮＡのいずれか１つを対象に送達する方法を含み、そのｇＲＮＡは、ＬＮＰとして調合する。いくつかの実施形態では、そのＬＮＰは、ｇＲＮＡと、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、開示されているｇＲＮＡのいずれか１つと、ＬＮＰとを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、その組成物はさらに、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、そのＬＮＰは、カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、そのＬＮＰは、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）ともいう）または別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４及びその特許に記載されている参照文献の脂質を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質のアミンの、ＲＮＡのリン酸に対するモル比（Ｎ：Ｐ）が、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０または約６．５である。いくつかの実施形態では、カチオン性及びイオン化可能という用語は、ＬＮＰ脂質の文脈では、同義的であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じてカチオン性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているｇＲＮＡは、疾患または障害を治療する医薬の調製に用いるために、ＬＮＰとして調合されている。
エレクトロポレーションは、カーゴを送達するための周知の手段であり、本明細書に開示されているｇＲＮＡのいずれか１つの送達には、いずれのエレクトロポレーション手法を用いてもよい。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションを用いて、本明細書に開示されているｇＲＮＡのいずれか１つと、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを送達してよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されているｇＲＮＡのいずれか１つをｅｘ ｖｉｖｏ細胞に送達する方法を含み、そのｇＲＮＡは、ＬＮＰとして調合されているか、またはＬＮＰとして調合されていない。いくつかの実施形態では、そのＬＮＰは、ｇＲＮＡと、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているガイドＲＮＡ組成物のみ、または１つ以上のベクターでコードされるそのガイドＲＮＡ組成物は、脂質ナノ粒子中に調合するか、または脂質ナノ粒子によって投与する。例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４及びＷＯ２０１９／０６７９９２（それらの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているガイド配列のいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、プロモーター、エンハンサー、調節配列、及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９のようなヌクレアーゼであることができる）をコードする核酸が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のようなＣａｓヌクレアーゼであることができる）をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡとをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９のようなＣａｓタンパク質であることができる）をコードするｍＲＮＡとを含む。一実施形態では、そのＣａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する（すなわちＳｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのリピート配列の全部または一部に挟まれたガイド配列を含むか、またはそのガイド配列からなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、それらからなる核酸はさらに、ベクター配列を含んでよく、そのベクター配列は、天然では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡとともに見られない核酸を含むか、またはその核酸からなる。
ＩＶ．治療方法及び用途
本明細書に記載されている操作細胞及び組成物のいずれも、本明細書に記載されているように、様々な疾患及び障害を治療する方法で使用できる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した細胞（操作細胞）及び／または遺伝子修飾した細胞（操作細胞）の集団、ならびに組成物を、様々な疾患及び障害を治療する方法で使用してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている疾患または障害のいずれか１つを治療する方法であって、本明細書に記載されているいずれか１つ以上の組成物を投与することを含む方法が含まれる。
本明細書に記載されている操作細胞及び組成物のいずれも、本明細書に記載されているように、様々な疾患及び障害を治療する方法で使用できる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾した細胞（操作細胞）及び／または遺伝子修飾した細胞（操作細胞）の集団、ならびに組成物を、様々な疾患及び障害を治療する方法で使用してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている疾患または障害のいずれか１つを治療する方法であって、本明細書に記載されているいずれか１つ以上の組成物を投与することを含む方法が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法及び組成物を用いて、治療剤の送達が必要な疾患または障害を治療してよい。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において免疫療法を行う方法を提供し、その方法は、その対象に、本明細書に記載されているような操作細胞（または操作細胞集団）、例えば、上記の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞を有効量、投与することを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、対象に、本明細書に記載されている操作細胞を含む組成物を、養子細胞移入療法として投与することを含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、その方法は、対象に、本明細書に記載されている操作細胞を含む組成物を投与することを含み、その細胞は、対象の疾患または障害の治療に有用なポリペプチド（例えばターゲティング受容体）を産生、分泌及び／または発現する。いくつかの実施形態では、その細胞は、可溶性ポリペプチドを産生する細胞工場として作用する。いくつかの実施形態では、その細胞は、抗体を産生する細胞工場として作用する。いくつかの実施形態では、その細胞は、そのポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで継続的に分泌する。いくつかの実施形態では、その細胞は、移植後、そのポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間、継続的に分泌する。いくつかの実施形態では、その細胞は、移植後、そのポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで、６週間超、継続的に分泌する。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチド（例えば抗体）は、その細胞によって、１日当たりに少なくとも１０２コピー、１０３コピー、１０４コピー、１０５コピー、１０６コピー、１０７コピーまたは１０８コピーの濃度で産生される。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、抗体であり、その細胞によって、１日当たりに少なくとも１０８コピーの濃度で産生される。
その方法のいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、本明細書に記載されているような操作細胞（複数可）、例えば、上記の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞を有効量で投与する前に、リンパ球除去剤または免疫抑制剤を投与することを含む。別の態様では、本発明は、操作細胞（例えば操作細胞集団）を調製する方法を提供する。
免疫療法は、免疫系を活性化または抑制することによって、疾患を治療することである。免疫応答を誘発または増幅するように設計した免疫療法は、活性化免疫療法として分類される。細胞ベースの免疫療法は、いくつかのがんの治療に有効であることが示されている。リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、またはそれらの前駆体（造血幹細胞（ＨＳＣ）もしくは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）など）のような免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞の表面に発現した異常抗原に応答して作用するようにプログラムできる。したがって、がん免疫療法により、免疫系の構成成分が、腫瘍またはその他のがん細胞を破壊可能になる。細胞ベースの免疫療法は、自己免疫疾患または移植片拒絶反応の治療でも有効であることが示されている。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または間葉幹細胞のような免疫エフェクター細胞は、正常組織の表面に発現した自己抗原または移植抗原に応答して作用にするようにプログラムできる。
いくつかの実施形態では、本発明は、操作細胞（例えば操作細胞集団）を調製する方法を提供する。その操作細胞集団は、免疫療法に用いてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、治療の必要な対象を治療する方法であって、本明細書に記載されている細胞を調製する方法、例えば、細胞の調製方法の上記の態様及び実施形態のいずれかの方法によって調製した操作細胞を投与すること含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、その操作細胞を用いて、がん、感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、眼科疾患、腎疾患、肝疾患、筋骨格疾患、赤血球疾患または移植片拒絶反応を治療できる。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、皮膚または脳への細胞移植で使用できる。（例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７：２５２－２５８（２０１９）を参照されたい。）
いくつかの実施形態では、その操作細胞は、同種異系幹細胞療法を含む細胞療法として使用できる。いくつかの実施形態では、その細胞療法は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。ｉＰＳＣを導入して、例えば、β膵島細胞、ニューロン及び血液細胞を含む他の種類の細胞に分化させてよい。いくつかの実施形態では、その細胞療法は、造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、その幹細胞は、骨、軟骨、筋肉及び脂肪の細胞に発展できる間葉幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、その幹細胞は、眼幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、その同種異系幹細胞移植は、同種異系骨髄移植を含む。いくつかの実施形態では、その幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、その幹細胞は、誘導胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む。
本明細書に開示されている操作細胞は、例えば、さらに編集または修飾した遺伝子またはアレルの導入によって、さらに操作するのに適する。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、野生型ＴＣＲまたはバリアントＴＣＲである。本発明の細胞は、例えば、ターゲティング受容体、例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＵｎｉＣＡＲをコードする外来性核酸の導入によって、さらに操作するのにも適していることがある。ＣＡＲは、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られる。
いくつかの実施形態では、その細胞療法は、トランスジェニックＴ細胞療法である。いくつかの実施形態では、その細胞療法は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を標的とするトランスジェニックＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、その細胞療法は、商用のＴ細胞療法（ＣＡＲ Ｔ細胞療法など）のターゲティング受容体、またはターゲティング受容体をコードするドナー核酸を含む。細胞療法用に現在認可されているターゲティング受容体は、数多く存在する。本発明で提供する細胞及び方法は、これらの既知のコンストラクトとともに使用できる。細胞療法として用いられるターゲティング受容体コンストラクトを含む市販の認可済み細胞製品としては、例えば、Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標）（チサゲンレクルユーセル）、Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標）（アキシカブタジンシロルーセル）、Ｔｅｃａｒｔｕｓ（商標）（ブレクスカブタジェンアウトルーセル）、タベレクルーセル（Ｔａｂ－ｃｅｌ（登録商標））、Ｖｉｒａｌｙｍ－Ｍ（ＡＬＶＲ１０５）及びＶｉｒａｌｙｍ－Ｃが挙げられる。
いくつかの実施形態では、その方法は、本発明の操作細胞を対象に投与するためのものであり、その投与は、注射である。いくつかの実施形態では、その方法は、その操作細胞を対象に投与するためのものであり、その投与は、血管内への注射または注入である。いくつかの実施形態では、その方法は、その操作細胞を対象に投与するためのものであり、その投与は、単回投与である。
いくつかの実施形態では、その方法は、本明細書に開示されている組成物で治療する対象の疾患に関連する徴候または症状を軽減するためのものである。いくつかの実施形態では、その対象は、本明細書に開示されている組成物による治療に対する応答が、１週間超継続する。いくつかの実施形態では、その対象は、本明細書に開示されている組成物による治療に対する応答が、２週間超継続する。いくつかの実施形態では、その対象は、本明細書に開示されている組成物による治療に対する応答が、３週間超継続する。いくつかの実施形態では、その対象は、本明細書に開示されている組成物による治療に対する応答が、１カ月超継続する。
いくつかの実施形態では、その方法は、その操作細胞を対象に投与するためのものであり、その対象は、投与した細胞に対する応答であって、その細胞療法によって治療する疾患と関連する徴候または症状の軽減を含む応答が見られる。いくつかの実施形態では、その対象は、応答が、１週間超継続する。いくつかの実施形態では、その対象は、応答が、１カ月超継続する。いくつかの実施形態では、その対象は、応答が、少なくとも１～６週間継続する。
下記の実施例は、開示されている特定の実施形態を例示する目的で提供されており、いかなる場合も、本開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１．一般的な方法
１．１．次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の解析
ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
１．１．次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の解析
ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
ゲノム内の標的位置での編集効率を定量的に求めるために、ディープシーケンシングを用いて、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失の存在を特定した。対象となる遺伝子（例えばＣＩＩＴＡ）の標的部位周辺で、ＰＣＲプライマーを設計し、対象となるゲノム領域を増幅した。プライマー配列の設計は、当該技術分野で標準的であるようにして行った。
追加のＰＣＲをメーカーのプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って行って、シーケンシングのための化学物質を加えた。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑの装置でシーケンシングした。品質スコアが低いリードを除外した後、リードをヒト参照ゲノム（例えばｈｇ３８）にアラインメントした。対象となる標的領域と重複したリードを限局的なゲノム配列に再アラインメントして、アラインメントを向上させた。続いて、野生型リードの数と、ＣからＴへの変異、ＣからＡ／Ｇへの変異またはインデルを含むリードの数との比率を計算した。予測されるＣａｓ９切断部位を中心とする２０ｂｐ領域において、挿入及び欠失をスコア化した。インデルの割合（％）は、２０ｂｐのスコア化領域内において、１つ以上の塩基が挿入または欠失されたシーケンシングリードの総数を、シーケンシングリード（野生型を含む）の総数で除した値として定義されている。２０ｂｐのｓｇＲＮＡ標的配列から上流の１０ｂｐと下流の１０ｂｐを含む４０ｂｐの領域において、ＣからＴへの変異またはＣからＡ／Ｇへの変異をスコア化した。ＣからＴへの編集率（％）は、この４０ｂｐの領域に、いずれかのＣからＴへの変異を１つ以上有するシーケンシングリードの総数を、シーケンシングリード（野生型を含む）の総数で除した値として定義されている。ＣからＡ／Ｇへの変異の割合（％）も、同様にして計算した。
１．２．Ｔ細胞培養培地の調製
以下で使用したＴ細胞培養培地組成物は、本節及び表３に記載されている。「Ｘ－ＶＩＶＯ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉａ」は、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５ Ｍｅｄｉａ、１％のＰｅｎｓｔｒｅｐ、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮＡＣからなる。上記の構成成分に加えて、使用した他の様々な培地構成成分は、１．血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ））及び２．サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）であった（これらも、表３に記載されている）。Ｔ細胞培地構成成分は、下記の表３に記載されている。
以下で使用したＴ細胞培養培地組成物は、本節及び表３に記載されている。「Ｘ－ＶＩＶＯ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉａ」は、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５ Ｍｅｄｉａ、１％のＰｅｎｓｔｒｅｐ、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮＡＣからなる。上記の構成成分に加えて、使用した他の様々な培地構成成分は、１．血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ））及び２．サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）であった（これらも、表３に記載されている）。Ｔ細胞培地構成成分は、下記の表３に記載されている。
１．３．脂質ナノ粒子の調製
脂質構成成分を１００％のエタノールに様々なモル比で溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、ＲＮＡカーゴの濃度をおよそ０．４５ｍｇ／ｍＬにした。
脂質構成成分を１００％のエタノールに様々なモル比で溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、ＲＮＡカーゴの濃度をおよそ０．４５ｍｇ／ｍＬにした。
その脂質核酸アセンブリーには、イオン化可能なＬｉｐｉｄ Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートともいう））、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧが、モル比５０：３８：９：３でそれぞれ含まれていた。その脂質核酸アセンブリーは、脂質アミンの、ＲＮＡのリン酸に対する（Ｎ：Ｐ）モル比が約６、及びｇＲＮＡとｍＲＮＡとの重量比が１：１で調合した。
エタノール中の脂質と、２倍量のＲＮＡ溶液及び１倍量の水との衝突ジェット混合を利用したクロスフロー技法を用いて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製した。エタノール中の脂質は、ミキシングクロスを通じて、２倍量のＲＮＡ溶液と混合した。ライン内のミキシングＴを通じて、そのクロスの出口流と、４回目の水流を混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照されたい）。ＬＮＰを１時間、室温（ＲＴ）で保持し、さらに水で希釈した（およそ１：１（ｖ／ｖ））。平膜カートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）でのタンジェンシャルフローろ過を用いて、ＬＮＰを濃縮し、緩衝液は、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて、５０ｍＭのトリス、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース（ｐＨ７．５）（ＴＳＳ）に交換した。あるいは、ＬＮＰは任意に、１００ｋＤａのＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを用いて濃縮し、緩衝液は、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて、ＴＳＳに交換した。続いて、得られた混合物は、０．２μｍの滅菌フィルターを用いてろ過した。最終的なＬＮＰは、さらなる使用時まで、４℃または－８０℃で保存した。
１．４．ヌクレアーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（「ＩＶＴ」）
直鎖状プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって、キャッピング及びポリアデニル化されたｍＲＮＡであって、Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むｍＲＮＡを作製した。Ｔ７プロモーター、転写用配列及びポリアデニル化領域を含むプラスミドＤＮＡを、３７℃で２時間、ＸｂａＩとともに、２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）及び１×反応緩衝液という条件でインキュゲートすることによって直鎖状にした。その反応物を６５℃で２０分加熱することによって、ＸｂａＩを不活化した。その直鎖状プラスミドを酵素及び緩衝液塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを作製するためのＩＶＴ反応を、３７℃で１．５～４時間、５０ｎｇ／μＬの直鎖状プラスミド、それぞれ２～５ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＮ１－メチルシュード－ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）及び１×反応緩衝液という条件でインキュゲートすることによって行った。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を終濃度０．０１Ｕ／μＬまで加え、さらに３０分、その反応物をインキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐというキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉというキット（Ｑｉａｇｅｎ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ｍＲＮＡを精製した。あるいは、沈降プロトコールを用いて、ｍＲＮＡを精製した（場合によっては、その後に、ＨＰＬＣベースの精製を行った）。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅで消化後、ＬｉＣｌによる沈降、酢酸アンモニウムによる沈降及び酢酸ナトリウムによる沈降を用いて、ｍＲＮＡを精製した。ＨＰＬＣで精製したｍＲＮＡでは、ＬｉＣｌによる沈降及び再構成後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照されたい）。プール用に選択した画分を合わせ、上記のように、酢酸ナトリウム／エタノールによる沈降によって脱塩した。さらなる代替的な方法では、ＬｉＣｌによる沈降法でｍＲＮＡを精製してから、タンジェンシャルフローろ過によってさらに精製した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、ＲＮＡ濃度を求め、転写産物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって解析した。
直鎖状プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって、キャッピング及びポリアデニル化されたｍＲＮＡであって、Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むｍＲＮＡを作製した。Ｔ７プロモーター、転写用配列及びポリアデニル化領域を含むプラスミドＤＮＡを、３７℃で２時間、ＸｂａＩとともに、２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）及び１×反応緩衝液という条件でインキュゲートすることによって直鎖状にした。その反応物を６５℃で２０分加熱することによって、ＸｂａＩを不活化した。その直鎖状プラスミドを酵素及び緩衝液塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを作製するためのＩＶＴ反応を、３７℃で１．５～４時間、５０ｎｇ／μＬの直鎖状プラスミド、それぞれ２～５ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＮ１－メチルシュード－ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）及び１×反応緩衝液という条件でインキュゲートすることによって行った。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を終濃度０．０１Ｕ／μＬまで加え、さらに３０分、その反応物をインキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐというキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉというキット（Ｑｉａｇｅｎ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ｍＲＮＡを精製した。あるいは、沈降プロトコールを用いて、ｍＲＮＡを精製した（場合によっては、その後に、ＨＰＬＣベースの精製を行った）。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅで消化後、ＬｉＣｌによる沈降、酢酸アンモニウムによる沈降及び酢酸ナトリウムによる沈降を用いて、ｍＲＮＡを精製した。ＨＰＬＣで精製したｍＲＮＡでは、ＬｉＣｌによる沈降及び再構成後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照されたい）。プール用に選択した画分を合わせ、上記のように、酢酸ナトリウム／エタノールによる沈降によって脱塩した。さらなる代替的な方法では、ＬｉＣｌによる沈降法でｍＲＮＡを精製してから、タンジェンシャルフローろ過によってさらに精製した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、ＲＮＡ濃度を求め、転写産物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって解析した。
配列番号８０１～８０３（表１９の配列を参照されたい）によるオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを作製した。配列番号８０４～８０５によるオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡを作製した。配列番号８０６によるオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから、ＢＣ２２ ｍＲＮＡを作製した。配列番号８０７～８０８によるオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから、ＵＧＩ ｍＲＮＡを作製した。配列番号８０１～８０８は、ＲＮＡに関して、下記を参照するときには、ＴをＵ（上記のように、Ｎ１－メチルシュードウリジンであった）に置き換えるべき旨が理解される。実施例で使用したメッセンジャーＲＮＡは、５’キャップ及び３’ポリアデニル化領域を、例えば最長で１００ｎｔ含み、下記の表１９に、配列番号８０１～８０８によって定められている。
実施例２．ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡのスクリーニング
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡにおいて、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現の喪失を評価することによって、Ｔ細胞での効力についてスクリーニングした。ＲＮＰを用いたエレクトロポレーションによって、ＣＩＩＴＡを編集した後、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が陰性であるＴ細胞の割合（％）（「ＭＨＣＩＩ陰性率（％）」）を調べた。
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡにおいて、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現の喪失を評価することによって、Ｔ細胞での効力についてスクリーニングした。ＲＮＰを用いたエレクトロポレーションによって、ＣＩＩＴＡを編集した後、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が陰性であるＴ細胞の割合（％）（「ＭＨＣＩＩ陰性率（％）」）を調べた。
２．１．Ｔ細胞へのＲＮＰのエレクトロポレーション
Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のエレクトロポレーションを用いて、Ｃａｓ９の編集活性を評価した。５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１×Ｇｌｕａｔｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０６１）、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００ｕＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１１１４０－０５０）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン－ストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ２２４００－０８９）で構成されたＴ細胞ＲＰＭＩ培地中に、Ｐａｎ ＣＤ３＋ Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０３．０１）を、解凍後に、０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。細胞をＴ細胞ＲＰＭＩ培地中で７２時間増加させてから、ＲＮＰをトランスフェクションした。
Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のエレクトロポレーションを用いて、Ｃａｓ９の編集活性を評価した。５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１×Ｇｌｕａｔｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０６１）、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００ｕＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１１１４０－０５０）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン－ストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ２２４００－０８９）で構成されたＴ細胞ＲＰＭＩ培地中に、Ｐａｎ ＣＤ３＋ Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０３．０１）を、解凍後に、０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。細胞をＴ細胞ＲＰＭＩ培地中で７２時間増加させてから、ＲＮＰをトランスフェクションした。
ＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡを、その保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させてから、室温で１０分冷却した。２０ｕＭのｓｇＲＮＡと１０ｕＭの組み換えＣａｓ９－ＮＬＳタンパク質（配列番号８００）とのＲＮＰ混合物を調製し、２５℃で１０分インキュベートした。５μＬのＲＮＰ混合物を１００，０００細胞と、２０μＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中で合わせた。２２μＬのＲＮＰ／細胞ミックスを、Ｌｏｎｚａの９６ウェルシャトルエレクトロポレーションプレートの対応するウェルに移した。メーカーのパルスコードで、細胞に、ｄｕｐｌｉｃａｔｅでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション直後に、Ｔ細胞ＲＰＭＩ培地をその細胞に加えた。その後、エレクトロポレーションしたＴ細胞を培養し、編集から２日後に、実施例１に記載されているようなＮＧＳシーケンシングのために回収した。
２．２．フローサイトメトリー
編集から１０日後に、フローサイトメトリーによって、Ｔ細胞の表現型を調べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を判定した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ－ＰＥを標的とする抗体カクテル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号３６１７０４）及びアイソタイプコントロール－ＡＦ６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号４００２３４）で、Ｔ細胞をインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて解析した。Ｔ細胞を、サイズ、形、生存率及びＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいてゲーティングした。ＤＮＡ試料をＰＣＲにかけた後、実施例１に記載されているようにして、ＮＧＳ解析を行った。
編集から１０日後に、フローサイトメトリーによって、Ｔ細胞の表現型を調べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を判定した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ－ＰＥを標的とする抗体カクテル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号３６１７０４）及びアイソタイプコントロール－ＡＦ６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号４００２３４）で、Ｔ細胞をインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて解析した。Ｔ細胞を、サイズ、形、生存率及びＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいてゲーティングした。ＤＮＡ試料をＰＣＲにかけた後、実施例１に記載されているようにして、ＮＧＳ解析を行った。
２．３．ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡのスクリーニングの結果
表４Ａには、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現が陰性であるＴ細胞の割合（％）の平均が示されている。ＭＨＣクラスＩの発現の比較のために、コントロール１はＢ２Ｍを、コントロール２はＴＲＡＣを標的とする。それぞれのガイドにおいて、ｓｐＣａｓ９による切断部位のゲノム座標が、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドまたはドナースプライス部位境界ヌクレオチドと、切断部位との距離（ヌクレオチド数）（表４Ａでは、切断部位からの距離と称されている）とともに示されている。括弧が付されていない数値は、スプライス部位境界ヌクレオチドと切断部位との間の、５’方向でのヌクレオチド数を示しており、括弧内の数値は、スプライス部位境界ヌクレオチドと切断部位との間の、３’方向でのヌクレオチド数を示している。表４Ｂには、ＮＧＳ解析の結果が示されている。
表４Ａには、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現が陰性であるＴ細胞の割合（％）の平均が示されている。ＭＨＣクラスＩの発現の比較のために、コントロール１はＢ２Ｍを、コントロール２はＴＲＡＣを標的とする。それぞれのガイドにおいて、ｓｐＣａｓ９による切断部位のゲノム座標が、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドまたはドナースプライス部位境界ヌクレオチドと、切断部位との距離（ヌクレオチド数）（表４Ａでは、切断部位からの距離と称されている）とともに示されている。括弧が付されていない数値は、スプライス部位境界ヌクレオチドと切断部位との間の、５’方向でのヌクレオチド数を示しており、括弧内の数値は、スプライス部位境界ヌクレオチドと切断部位との間の、３’方向でのヌクレオチド数を示している。表４Ｂには、ＮＧＳ解析の結果が示されている。
実施例３．ＢＣ２２を用いた、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡのスクリーニング
ＢＣ２２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ、デアミナーゼであるヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ及びウラシルグリコシラーゼ阻害剤の融合物を含む塩基変換エディターヌクレアーゼ）を用いて、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡをスクリーニングした。このコンストラクトの特徴的な編集は、シトシンからチミンへの変換であり、Ｃａｓ９クリバーゼに特有のインデルではない。Ｔ細胞における効力は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現の喪失によって評価した。ｍＲＮＡ及びガイドをエレクトロポレーションすることによって、ＣＩＩＴＡを編集した後、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が陰性であるＴ細胞の割合（％）を調べた。
ＢＣ２２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ、デアミナーゼであるヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ及びウラシルグリコシラーゼ阻害剤の融合物を含む塩基変換エディターヌクレアーゼ）を用いて、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡをスクリーニングした。このコンストラクトの特徴的な編集は、シトシンからチミンへの変換であり、Ｃａｓ９クリバーゼに特有のインデルではない。Ｔ細胞における効力は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現の喪失によって評価した。ｍＲＮＡ及びガイドをエレクトロポレーションすることによって、ＣＩＩＴＡを編集した後、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が陰性であるＴ細胞の割合（％）を調べた。
３．１．Ｔ細胞へのｍＲＮＡのエレクトロポレーション
解凍後、市販のロイコパック（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）から単離したＰａｎ ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で、表３の培地２０において播種した。Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化した。細胞をＴ細胞において７２時間増加させてから、ｍＲＮＡをトランスフェクションした。
解凍後、市販のロイコパック（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）から単離したＰａｎ ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で、表３の培地２０において播種した。Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化した。細胞をＴ細胞において７２時間増加させてから、ｍＲＮＡをトランスフェクションした。
ＣＩＩＴＡ ｓｇＲＮＡ（表４Ａ）を、その保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させてから、室温で１０分冷却した。Ｐ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中の１００，００個のＴ細胞、ならびにＵＧＩをコードする１０ｎｇ／ｕＬのｍＲＮＡ（配列番号８０７）、ＢＣ２２をコードする１０ｎｇ／ｕＬのｍＲＮＡ（配列番号８０６）、及び２μＭのｓｇＲＮＡによって、５０マイクロリットルのエレクトロポレーションミックスを調製した。このミックスを、Ｌｏｎｚａの９６ウェルシャトルエレクトロポレーションプレートの対応するウェルに移した。Ｌｏｎｚａのシャトル９６ｗを用いて、メーカーのパルスコードを使用して、細胞をｄｕｐｌｉｃａｔｅウェルでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後に、培地２０を細胞に加えた。その後、エレクトロポレーションしたＴ細胞を培養し、編集から１０日後、ＮＧＳシーケンシング及びフローサイトメトリーのために回収した。実施例２に記載されているようにして、フローサイトメトリーを行った。ＤＮＡ試料をＰＣＲにかけた後、実施例１に記載されているようにして、ＮＧＳ解析を行った。
表５には、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩの発現が陰性であるＴ細胞の割合（％）の平均と、編集率（％）の平均が示されている。
３．４．ガイド位置と、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のノックダウンの比較
表６及び図２には、切断部位から、スプライス部位境界ヌクレオチドまでの距離に関連させて、Ｃａｓ９及びＢＣ２２を用いた場合のＭＨＣクラスＩＩノックアウト率（％）が示されている。
表６及び図２には、切断部位から、スプライス部位境界ヌクレオチドまでの距離に関連させて、Ｃａｓ９及びＢＣ２２を用いた場合のＭＨＣクラスＩＩノックアウト率（％）が示されている。
各ガイドについて、ｓｐＣａｓ９による切断部位のゲノム座標が、アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチドまたはドナースプライス部位境界ヌクレオチドと、切断部位との距離（ヌクレオチド数）とともに示されている。プラスの数値は、スプライス部位境界ヌクレオチドと切断部位との５’方向でのヌクレオチド数を示しており、マイナスの数値は、スプライス部位境界ヌクレオチドと切断部位との３’方向でのヌクレオチド数を示している。
実施例４．トランスのＵＧＩによる、Ｔ細胞の編集
４．１ Ｔ細胞の編集
Ｔ細胞をＣＩＩＴＡ座位で、トランスのＵＧＩ、及びＢＣ２２ｎまたはＣａｓ９のいずれかで編集して、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する編集の種類に及ぶ影響を評価した。ＢＣ２２ｎは、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ、デアミナーゼであるヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａの融合物を含む塩基変換エディターヌクレアーゼである。このコンストラクトの特徴的な編集は、シトシンからチミンへの変換であり、Ｃａｓ９クリバーゼに特有のインデルではない。
４．１ Ｔ細胞の編集
Ｔ細胞をＣＩＩＴＡ座位で、トランスのＵＧＩ、及びＢＣ２２ｎまたはＣａｓ９のいずれかで編集して、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する編集の種類に及ぶ影響を評価した。ＢＣ２２ｎは、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ、デアミナーゼであるヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａの融合物を含む塩基変換エディターヌクレアーゼである。このコンストラクトの特徴的な編集は、シトシンからチミンへの変換であり、Ｃａｓ９クリバーゼに特有のインデルではない。
健常なヒトドナーアフェレーシス産物の市販品を入手し（Ｈｅｍａｃａｒｅ）、ＬＯＶＯという装置で、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０７０－５２５）に再懸濁した。ＣＤ４及びＣＤ８の磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０３０－４０１／１３０－０３０－８０１）を用いて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｌｕｓ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＬＳという使い捨てキットを使用して、Ｔ細胞をポジティブ選択によって単離した。Ｔ細胞をバイアルに分注し、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒカタログ番号２Ｂ２５２２Ｘ）の１：１調合物で凍結保存した。解凍後、１×サイトカイン（２００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２、５μｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－７、及び５μｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－１５）に加えて、５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－（＋）－システイン、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンを含むＸ－ＶＩＶＯ １５（商標）無血清造血細胞培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で構成されたＴ細胞基礎培地中で、Ｔ細胞を１．０×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を含むＴ細胞基礎培地中で、細胞を７２時間増加させてから、エレクトロポレーションした。
４．２．Ｔ細胞へのエレクトロポレーション
Ｃａｓ９、ＢＣ２２ｎ（配列番号：８０４）またはＵＧＩ（配列番号８０７）をコードするｍＲＮＡを含む溶液を滅菌水中で調製した。５０μＭのＣＩＩＴＡ ｓｇＲＮＡ（Ｇ０１８０７６及びＧ０１８１１７）（それぞれ、配列番号５６及び９７）を保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させてから、氷上で冷却した。活性化から７２時間後、Ｔ細胞を回収し、遠心分離し、１２．５×１０６Ｔ細胞／ｍＬの濃度で、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。エレクトロポレーションする各ウェルにおいて、１×１０５個のＴ細胞を、２００ｎｇのエディターｍＲＮＡ、２００ｎｇのＵＧＩ ｍＲＮＡ及び２０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡと、最終体積２０ｕＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液中で混合した。このミックスをｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プレートに移し、メーカーのパルスコードを用いてエレクトロポレーションした。サイトカインを含まない８０μＬのＴ細胞基礎培地で、エレクトロポレーションしたＴ細胞をすぐに１０分静置してから、２×サイトカインを添加したＴ細胞基礎培地がさらに１００μＬ入った新しい９６ウェル平底プレートに移した。得られたプレートを３７℃で４日インキュベートした。９６時間後、１×サイトカインを含む新鮮なＴ細胞基礎培地で、Ｔ細胞を１：３で希釈した。その後、エレクトロポレーションしたＴ細胞をさらに３日培養し、フローサイトメトリー解析、ＮＧＳシーケンシング及びトランスクリプトミクスのために回収した。ＮＧＳ解析は、実施例１に記載されているようにして行った。
Ｃａｓ９、ＢＣ２２ｎ（配列番号：８０４）またはＵＧＩ（配列番号８０７）をコードするｍＲＮＡを含む溶液を滅菌水中で調製した。５０μＭのＣＩＩＴＡ ｓｇＲＮＡ（Ｇ０１８０７６及びＧ０１８１１７）（それぞれ、配列番号５６及び９７）を保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させてから、氷上で冷却した。活性化から７２時間後、Ｔ細胞を回収し、遠心分離し、１２．５×１０６Ｔ細胞／ｍＬの濃度で、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。エレクトロポレーションする各ウェルにおいて、１×１０５個のＴ細胞を、２００ｎｇのエディターｍＲＮＡ、２００ｎｇのＵＧＩ ｍＲＮＡ及び２０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡと、最終体積２０ｕＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液中で混合した。このミックスをｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プレートに移し、メーカーのパルスコードを用いてエレクトロポレーションした。サイトカインを含まない８０μＬのＴ細胞基礎培地で、エレクトロポレーションしたＴ細胞をすぐに１０分静置してから、２×サイトカインを添加したＴ細胞基礎培地がさらに１００μＬ入った新しい９６ウェル平底プレートに移した。得られたプレートを３７℃で４日インキュベートした。９６時間後、１×サイトカインを含む新鮮なＴ細胞基礎培地で、Ｔ細胞を１：３で希釈した。その後、エレクトロポレーションしたＴ細胞をさらに３日培養し、フローサイトメトリー解析、ＮＧＳシーケンシング及びトランスクリプトミクスのために回収した。ＮＧＳ解析は、実施例１に記載されているようにして行った。
４．３．フローサイトメトリー及びＮＧＳシーケンシング
編集から７日目に、Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリーによって調べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を判定した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ－ＰＥを標的とする抗体カクテル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号３６１７０４）及びアイソタイプコントロール－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号４００２３４）で、Ｔ細胞をインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて解析した。Ｔ細胞を、サイズ、形、生存率及びＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいてゲーティングした。ＤＮＡ試料をＰＣＲにかけた後、実施例１に記載されているようにして、ＮＧＳ解析を行った。表７、ならびに図１Ａ、１Ｂ及び６Ａに、ＣＩＩＴＡ遺伝子の編集が示されている。Ｃａｓ９条件及びＢＣ２２ｎ条件のいずれでも、全体の編集率は９５％超で、完全に近くなった。表７、ならびに図１Ｃ、１Ｄ及び６Ｂには、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡと組み合わせたＵＧＩ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした後のＭＨＣクラスＩＩ陰性細胞率（％）の平均が示されている。
編集から７日目に、Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリーによって調べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を判定した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ－ＰＥを標的とする抗体カクテル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号３６１７０４）及びアイソタイプコントロール－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号４００２３４）で、Ｔ細胞をインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて解析した。Ｔ細胞を、サイズ、形、生存率及びＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいてゲーティングした。ＤＮＡ試料をＰＣＲにかけた後、実施例１に記載されているようにして、ＮＧＳ解析を行った。表７、ならびに図１Ａ、１Ｂ及び６Ａに、ＣＩＩＴＡ遺伝子の編集が示されている。Ｃａｓ９条件及びＢＣ２２ｎ条件のいずれでも、全体の編集率は９５％超で、完全に近くなった。表７、ならびに図１Ｃ、１Ｄ及び６Ｂには、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡと組み合わせたＵＧＩ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした後のＭＨＣクラスＩＩ陰性細胞率（％）の平均が示されている。
実施例５．Ｔ細胞における遺伝子発現解析
５．１．全トランスクリプトームのシーケンシング
編集から７日目に、実施例４においてＧ０１８１１７（配列番号９７）及びＧ０１８０７８（配列番号５８）で処理したＴ細胞を回収し、将来の処理のために、－８０Ｃで保存した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｒ２０６２）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ＴＲＩｚｏｌ（商標）という試薬中の試料から、全ＲＮＡを抽出した。精製したＲＮＡ試料をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００という分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、ヌクレアーゼフリー水を用いて、４１．６７ｎｇ／ｕＬに希釈した。図１に示されているそれぞれのｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ実験物から、１群当たり２つの試料をトランスクリプトミクス解析のために無作為に選択した。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｒＲＮＡ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ６３５０Ｌ）をメーカーの説明書に従って用いて、精製済みの全ＲＮＡ５００ｎｇ（１２ｕＬ）のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）構成成分を枯渇させた。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ７７６５Ｓ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ｒＲＮＡ枯渇試料を二本鎖ＤＮＡライブラリーに変換した。増幅させたライブラリーをＱｕｂｉｔ４という蛍光光度計で定量し、各ライブラリーの断片サイズの平均をキャピラリー電気泳動によって得た。ライブラリーを４ｎＭの等モル濃度でプールし、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０のシーケンシングプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、高出力の３００サイクルキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号２００２４９０８）を用いて、ペアエンドシーケンシングを行った。
５．１．全トランスクリプトームのシーケンシング
編集から７日目に、実施例４においてＧ０１８１１７（配列番号９７）及びＧ０１８０７８（配列番号５８）で処理したＴ細胞を回収し、将来の処理のために、－８０Ｃで保存した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｒ２０６２）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ＴＲＩｚｏｌ（商標）という試薬中の試料から、全ＲＮＡを抽出した。精製したＲＮＡ試料をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００という分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、ヌクレアーゼフリー水を用いて、４１．６７ｎｇ／ｕＬに希釈した。図１に示されているそれぞれのｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ実験物から、１群当たり２つの試料をトランスクリプトミクス解析のために無作為に選択した。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｒＲＮＡ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ６３５０Ｌ）をメーカーの説明書に従って用いて、精製済みの全ＲＮＡ５００ｎｇ（１２ｕＬ）のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）構成成分を枯渇させた。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ７７６５Ｓ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ｒＲＮＡ枯渇試料を二本鎖ＤＮＡライブラリーに変換した。増幅させたライブラリーをＱｕｂｉｔ４という蛍光光度計で定量し、各ライブラリーの断片サイズの平均をキャピラリー電気泳動によって得た。ライブラリーを４ｎＭの等モル濃度でプールし、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０のシーケンシングプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、高出力の３００サイクルキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号２００２４９０８）を用いて、ペアエンドシーケンシングを行った。
５．２．遺伝子発現変動解析のためのデータ処理
ＦＡＳＴＱ形式のシーケンシングリードを生成し、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑというプログラム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ｖ２．２０）を用いて、デマルチプレックスした。各インデックスリードとサンプルインデックスとのハミング距離（Ｈａｍｍｉｎｇ，Ｒ．Ｗ．Ｂｅｌｌ Ｓｙｓｔ．Ｔｅｃｈ．Ｊ．２９，１４７－１６０）が１以内である場合に、リードを試料に割り当てた。シーケンシング品質をＦａｓｔＱＣプログラム（ｖ０．１１．９）（Ａｎｄｒｅｗｓ Ｓ．Ｂａｂｒａｈａｍ Ｉｎｓｔ．）で調べた。Ｂｏｗｔｉｅ２（ｖ２．３．５．１）（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，３５７－３５９）で、すべてのリードをヒトｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ１３３６９．１）にアラインメントすることによって、リボソームＲＮＡリードを特定した。Ｓａｌｍｏｎ（ｖ０．１４．１）（Ｐａｔｒｏ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，４１７－４１９）を非リボソームＲＮＡリードとともに用いて、トランスクリプトームの定量を行った。Ｓａｌｍｏｎの出力結果において、ＤＥＳｅｑ２（ｖ１．２６．０）（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０）を用いて、遺伝子発現変動の解析を行った。ベンジャミーニ－ホッホベルク法で補正したｐ値が０．０５未満である遺伝子または転写産物を、発現が変動するものと判定した。Ｍｅｔａｓｃａｐｅ（Ｚｈｏｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１０，１５２３）を用いて、遺伝子オントロジーの観点で、発現が変動する遺伝子のリストを解析した。ＢｉｏＧｒｉｄ、ＩｎＷｅｂ＿ＩＭ及びＯｍｎｉＰａｔｈ８のデータベース（Ｌｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，６１－６４、Ｓｔａｒｋ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４，５３５－５３９、Ｔｕｒｅｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３，９６６－９６７）を用いて、タンパク質間相互作用を求めた。分子複合体検出（ＭＣＯＤＥ）アルゴリズム（Ｂａｄｅｒ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ４，１－２７）を用いて、緊密に連結されるネットワークを特定し、ｐ値による３つの最良のスコア項目を、対応するネットワーク構成成分の機能説明として保持した。
ＦＡＳＴＱ形式のシーケンシングリードを生成し、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑというプログラム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ｖ２．２０）を用いて、デマルチプレックスした。各インデックスリードとサンプルインデックスとのハミング距離（Ｈａｍｍｉｎｇ，Ｒ．Ｗ．Ｂｅｌｌ Ｓｙｓｔ．Ｔｅｃｈ．Ｊ．２９，１４７－１６０）が１以内である場合に、リードを試料に割り当てた。シーケンシング品質をＦａｓｔＱＣプログラム（ｖ０．１１．９）（Ａｎｄｒｅｗｓ Ｓ．Ｂａｂｒａｈａｍ Ｉｎｓｔ．）で調べた。Ｂｏｗｔｉｅ２（ｖ２．３．５．１）（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，３５７－３５９）で、すべてのリードをヒトｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ１３３６９．１）にアラインメントすることによって、リボソームＲＮＡリードを特定した。Ｓａｌｍｏｎ（ｖ０．１４．１）（Ｐａｔｒｏ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，４１７－４１９）を非リボソームＲＮＡリードとともに用いて、トランスクリプトームの定量を行った。Ｓａｌｍｏｎの出力結果において、ＤＥＳｅｑ２（ｖ１．２６．０）（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０）を用いて、遺伝子発現変動の解析を行った。ベンジャミーニ－ホッホベルク法で補正したｐ値が０．０５未満である遺伝子または転写産物を、発現が変動するものと判定した。Ｍｅｔａｓｃａｐｅ（Ｚｈｏｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１０，１５２３）を用いて、遺伝子オントロジーの観点で、発現が変動する遺伝子のリストを解析した。ＢｉｏＧｒｉｄ、ＩｎＷｅｂ＿ＩＭ及びＯｍｎｉＰａｔｈ８のデータベース（Ｌｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，６１－６４、Ｓｔａｒｋ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４，５３５－５３９、Ｔｕｒｅｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３，９６６－９６７）を用いて、タンパク質間相互作用を求めた。分子複合体検出（ＭＣＯＤＥ）アルゴリズム（Ｂａｄｅｒ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ４，１－２７）を用いて、緊密に連結されるネットワークを特定し、ｐ値による３つの最良のスコア項目を、対応するネットワーク構成成分の機能説明として保持した。
Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０９）で処理した試料と比べて、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ（配列番号８０６）をエレクトロポレーションしたＴ細胞では、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、及びＨＬＡと関連するＣＤ７４遺伝子が有意に強くダウンレギュレーションされた（表８及び表９）。クラスＩ ＭＨＣ遺伝子に対する影響は、最小限であることが観察された（表１０及び表１１）。トランスクリプトームワイドな遺伝子発現変動イベントの点では、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡによる処理により、発現変動遺伝子は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの場合と比べて少なくなった（補正済みのｐ：０．０５未満）。ｓｇＲＮＡ Ｇ０１８０７６（配列番号５６）をエレクトロポレーションしたＴ細胞では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡによる処理では、合計５５３件の遺伝子発現変動イベント、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡによる処理では、６５件の遺伝子発現変動イベントが観察された（図７Ａ及び７Ｂ）。ｓｇＲＮＡ Ｇ０１８１１７（配列番号９７）をエレクトロポレーションしたＴ細胞でも、同様の傾向が観察され、遺伝子発現変動イベントは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡで処理した場合には３０３件、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡで処理した場合には３０件であった（図７Ｃ及び７Ｄ）。ｓｇＲＮＡ Ｇ０１８０７６（配列番号５６）（図８Ａ（Ｃａｓ９）及び８Ｂ（ＢＣ２２ｎ））、ならびにｓｇＲＮＡ Ｇ０１８１１７（配列番号９７）（図８Ｃ（Ｃａｓ９）及び８Ｄ（ＢＣ２２ｎ））の場合には、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡで処理したＴ細胞における発現変動遺伝子のリストでは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡで処理したＴ細胞と比べて、少ないタンパク質間相互作用ネットワークが特定された。
実施例６．固定比率のＢＣ２２ｎ及びＵＧＩを用いた、Ｔ細胞におけるＬＮＰの滴定
活性化ヒトＴ細胞へのＬＮＰの送達を用いて、Ｃａｓ９またはＢＣ２２ｎのいずれかにおいて、単一の標的及び複数の標的を編集する効能を評価した。
活性化ヒトＴ細胞へのＬＮＰの送達を用いて、Ｃａｓ９またはＢＣ２２ｎのいずれかにおいて、単一の標的及び複数の標的を編集する効能を評価した。
６．１．Ｔ細胞の調製
健常なヒトドナーアフェレーシス産物の市販品を入手し（Ｈｅｍａｃａｒｅ）、ＬＯＶＯという装置で、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０７０－５２５）に再懸濁した。ＣＤ４及びＣＤ８の磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０３０－４０１／１３０－０３０－８０１）を用いて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｌｕｓ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＬＳという使い捨てキットを使用して、Ｔ細胞をポジティブ選択によって単離した。Ｔ細胞をバイアルに分注し、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒカタログ番号２Ｂ２５２２Ｘ）の１：１調合物で凍結保存した。解凍後、１×サイトカイン（２００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２、５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－７、及び５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－１５）に加えて、５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－（＋）－システイン、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンを含むＸ－ＶＩＶＯ １５（商標）無血清造血細胞培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で構成されたＴ細胞基礎培地中で、Ｔ細胞を１．０×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。細胞をＴ細胞基礎培地中で７２時間増加させてから、ＬＮＰをトランスフェクションした。
健常なヒトドナーアフェレーシス産物の市販品を入手し（Ｈｅｍａｃａｒｅ）、ＬＯＶＯという装置で、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０７０－５２５）に再懸濁した。ＣＤ４及びＣＤ８の磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０３０－４０１／１３０－０３０－８０１）を用いて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｌｕｓ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＬＳという使い捨てキットを使用して、Ｔ細胞をポジティブ選択によって単離した。Ｔ細胞をバイアルに分注し、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒカタログ番号２Ｂ２５２２Ｘ）の１：１調合物で凍結保存した。解凍後、１×サイトカイン（２００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２、５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－７、及び５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－１５）に加えて、５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－（＋）－システイン、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンを含むＸ－ＶＩＶＯ １５（商標）無血清造血細胞培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で構成されたＴ細胞基礎培地中で、Ｔ細胞を１．０×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。細胞をＴ細胞基礎培地中で７２時間増加させてから、ＬＮＰをトランスフェクションした。
６．２．Ｔ細胞の編集
実施例１に記載されているようにして、それぞれのＲＮＡ種、すなわち、ＵＧＩ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡまたはエディターｍＲＮＡを別々にＬＮＰ中に調合した。エディターｍＲＮＡは、ＢＣ２２ｎ（配列番号８０５）またはＣａｓ９のいずれかをコードするものであった。Ｂ２Ｍを標的とするガイド（Ｇ０１５９９５）（配列番号７０４）、ＴＲＡＣを標的とするガイド（Ｇ０１６０１７）（配列番号７０５）、ＴＲＢＣ１／２を標的とするガイド（Ｇ０１６２０６）（配列番号７０６）、及びＣＩＩＴＡを標的とするガイド（Ｇ０１８１１７）（配列番号９７）を単独で、または組み合わせて使用した。実験のＣａｓ９アーム及びＢＣ２２ｎアームの両方で、ＵＧＩをコードするメッセンジャーＲＮＡ（配列番号８０７）を送達して、脂質量を標準化する。過去の実験で、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと使用した場合に、ＵＧＩ ｍＲＮＡが、全体の編集または編集プロファイルに影響を及ぼさないことは確立されている。表１２に示されているように、エディターｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びＵＧＩ ｍＲＮＡという全ｍＲＮＡの重量比が６：３：２で固定された状態で、ＬＮＰを混合した。表１２に記載されている、４つのガイドでの実験では、個々のガイドを４倍希釈して、すべてのエディターｍＲＮＡとガイドとの重量比を６：３に保持して、合計脂質送達量に基づいて、個々のガイドの効能を比較可能にする。６％カニクイザル血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ、カタログＣＹＮ２２０７６０）にウシ胎児血清を置換したＴ細胞基礎培地で、ＬＮＰ混合物を５分、３７℃でインキュベートした。
実施例１に記載されているようにして、それぞれのＲＮＡ種、すなわち、ＵＧＩ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡまたはエディターｍＲＮＡを別々にＬＮＰ中に調合した。エディターｍＲＮＡは、ＢＣ２２ｎ（配列番号８０５）またはＣａｓ９のいずれかをコードするものであった。Ｂ２Ｍを標的とするガイド（Ｇ０１５９９５）（配列番号７０４）、ＴＲＡＣを標的とするガイド（Ｇ０１６０１７）（配列番号７０５）、ＴＲＢＣ１／２を標的とするガイド（Ｇ０１６２０６）（配列番号７０６）、及びＣＩＩＴＡを標的とするガイド（Ｇ０１８１１７）（配列番号９７）を単独で、または組み合わせて使用した。実験のＣａｓ９アーム及びＢＣ２２ｎアームの両方で、ＵＧＩをコードするメッセンジャーＲＮＡ（配列番号８０７）を送達して、脂質量を標準化する。過去の実験で、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと使用した場合に、ＵＧＩ ｍＲＮＡが、全体の編集または編集プロファイルに影響を及ぼさないことは確立されている。表１２に示されているように、エディターｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びＵＧＩ ｍＲＮＡという全ｍＲＮＡの重量比が６：３：２で固定された状態で、ＬＮＰを混合した。表１２に記載されている、４つのガイドでの実験では、個々のガイドを４倍希釈して、すべてのエディターｍＲＮＡとガイドとの重量比を６：３に保持して、合計脂質送達量に基づいて、個々のガイドの効能を比較可能にする。６％カニクイザル血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ、カタログＣＹＮ２２０７６０）にウシ胎児血清を置換したＴ細胞基礎培地で、ＬＮＰ混合物を５分、３７℃でインキュベートした。
活性化から７２時間後、Ｔ細胞を洗浄し、基礎Ｔ細胞培地に懸濁した。事前にインキュベートしたＬＮＰミックスを、１×１０ｅ５個のＴ細胞／ウェルの各ウェルに加えた。Ｔ細胞を３７℃及び５％Ｃ０２で、実験期間にわたってインキュベートした。Ｔ細胞培地を、活性化から６日後及び８日後に変更し、活性化から１０日目に、ＮＧＳ及びフローサイトメトリーによる解析のために、細胞を回収した。ＮＧＳを、実施例１におけるようにして行った。
表１２及び図３Ａ～Ｄに、個々のガイドを編集に使用した場合のＴ細胞の編集プロファイルが記載されている。全編集、及びＣからＴへの編集により、試験したすべてのガイドにわたって、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ、ＵＧＩ ｍＲＮＡ及びガイドの量の増加と直接、用量応答性の関係があることが示された。インデル、及びＣからＡまたはＧへの変換は、用量とは逆相関しており、用量が少ないほど、これらの変異の割合（％）は高くなった。Ｃａｓ９で編集した試料では、全編集及びインデル活性は、ＲＮＡ総用量とともに増大する。
表１３及び図４Ａ～Ｄには、４つのガイドを同時に編集に使用した場合のＴ細胞の編集プロファイルが、合計リードに対する割合（％）で記載されている。この実験アームでは、各ガイドは、シングルガイドによる編集実験と比べて、２５％の濃度で使用する。合計で、Ｔ細胞を、６つの異なるＬＮＰ（エディターｍＲＮＡ、ＵＧＩ ｍＲＮＡ、４つのガイド）に同時に暴露した。ＢＣ２２ｎ及びトランスＵＧＩで編集すると、各座位において、Ｃａｓ９で編集した場合と比べて、全編集の割合（％）の最大値が高くなる。
活性化から１０日目に、Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリーによって調べて、編集により、細胞表面タンパク質が欠損したか判定した。簡潔に述べると、Ｂ２Ｍ－ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ３１６３０４）、ＣＤ３－ＡＦ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ３１７３２２）、ＨＬＡ ＤＲ ＤＱ ＤＰ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ３６１７０４）及びＤＡＰＩ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ４２２８０１）という抗体のミックス中で、Ｔ細胞をインキュベートした未編集細胞のサブセットをアイソタイプコントロール－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号４００２３４）とともにインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘという装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて解析した。Ｔ細胞を、サイズ、形、生存率及び抗原発現に基づいてゲーティングした。
表１４及び図５Ａ～Ｈには、表現型の解析結果が、抗体結合について陰性である細胞の割合（％）として報告されている。抗原陰性細胞の割合（％）は、ＢＣ２２ｎの試料及びＣａｓ９の試料のいずれでも、ＲＮＡ総量の増加とともに、用量応答的に上昇した。ＢＣ２２ｎで編集した細胞では、試験したすべてのガイドにおいて、Ｃａｓ９で編集した細胞と比べて、同等以上のタンパク質ノックアウトが見られた。複数編集の細胞では、ＢＣ２２ｎ及びトランスＵＧＩの場合に、抗原陰性細胞の割合（％）が、Ｃａｓ９及びトランスＵＧＩの場合よりも実質的に高かった。例えば、最大ＲＮＡ総用量５５０ｎｇでのＢＣ２２ｎ編集試料では、３つのすべての抗原が欠損していた細胞が８４．２％であったのに対して、Ｃａｓ９によって編集したところ、このようなトリプルノックアウト細胞は、４６．８％に過ぎなかった。１つのガイドのみで処理した試料では、ＤＮＡ編集と抗原減少との相関関係が強固であった。ＢＣ２２ｎは、ＣからＴへの変換と抗原ノックアウトを比較した場合に、Ｒ二乗測定値が０．９３であった。Ｃａｓ９は、インデルと抗原ノックアウトを比較した場合に、Ｒ二乗測定値が０．９５であった。
実施例７：ＮＫ細胞ｉｎ ｖｉｖｏ殺傷マウスモデルにおけるＢ２ＭノックアウトＴ細胞のＨＬＡ－Ｅ保護
雌ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに、１．５×１０６個の初代ＮＫ細胞を生着させた後に、ルシフェラーゼ±ＨＬＡ－Ｅを含む野生型Ｔ細胞またはＢ２ＭノックアウトＴ細胞のいずれかを注射して、注射したＴ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞による殺傷からＨＬＡ－Ｅを保護するかについて試験した。
雌ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに、１．５×１０６個の初代ＮＫ細胞を生着させた後に、ルシフェラーゼ±ＨＬＡ－Ｅを含む野生型Ｔ細胞またはＢ２ＭノックアウトＴ細胞のいずれかを注射して、注射したＴ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞による殺傷からＨＬＡ－Ｅを保護するかについて試験した。
７．１．ルシフェラーゼ及びＨＬＡ－Ｅレンチウイルスへの順次的な感染
この実施例には、ルシフェラーゼ±ＨＬＡ－Ｅを含む野生型Ｔ細胞またはＢ２Ｍ－／－ Ｔ細胞の作製が説明されている。まず、エレクトロポレーションする野生型Ｔ細胞及びＢ２Ｍ－／－ Ｔ細胞に、ルシフェラーゼレンチウイルス（Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＬＶ０５０Ｌ）を感染させた。その後、順次に、Ｂ２Ｍ－／－ Ｔ細胞に、ＨＬＡ－Ｅレンチウイルス（ＬＶＰ１１２）を感染させた。ルシフェラーゼの感染は、３５０ｕｌの培地番号１８を添加した１５０ｕｌのルシフェラーゼレンチウイルス中で、１×１０６個の細胞を感染させることによって行い、１０００×Ｇで６０分、３７℃で遠心分離した。Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅにおいて、ＨＬＡ－Ｅレンチウイルスで第２ラウンドの感染を行う前に、細胞を培地番号２中に２時間静置してから、１×１０６個の細胞を、４４０ｕｌの培地番号１８中の６０ｕｌのＨＬＡ－Ｅウイルスに感染させた。ＷＴルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞及びＢ２Ｍ－／－ルシフェラーゼ＋細胞の群には、いずれのウイルスも投与しなかったが、培地番号１８中で回転だけして、それぞれに異なる群にわたり、同様の条件を保持した。感染後、細胞を再懸濁し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレートにおいて合わせて、指定された群とし、表３に記載されているような、７ｍＬの培地番号１９に合わせた。培養の際には、２日置きに新鮮なサイトカインを加えた。
この実施例には、ルシフェラーゼ±ＨＬＡ－Ｅを含む野生型Ｔ細胞またはＢ２Ｍ－／－ Ｔ細胞の作製が説明されている。まず、エレクトロポレーションする野生型Ｔ細胞及びＢ２Ｍ－／－ Ｔ細胞に、ルシフェラーゼレンチウイルス（Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＬＶ０５０Ｌ）を感染させた。その後、順次に、Ｂ２Ｍ－／－ Ｔ細胞に、ＨＬＡ－Ｅレンチウイルス（ＬＶＰ１１２）を感染させた。ルシフェラーゼの感染は、３５０ｕｌの培地番号１８を添加した１５０ｕｌのルシフェラーゼレンチウイルス中で、１×１０６個の細胞を感染させることによって行い、１０００×Ｇで６０分、３７℃で遠心分離した。Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅにおいて、ＨＬＡ－Ｅレンチウイルスで第２ラウンドの感染を行う前に、細胞を培地番号２中に２時間静置してから、１×１０６個の細胞を、４４０ｕｌの培地番号１８中の６０ｕｌのＨＬＡ－Ｅウイルスに感染させた。ＷＴルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞及びＢ２Ｍ－／－ルシフェラーゼ＋細胞の群には、いずれのウイルスも投与しなかったが、培地番号１８中で回転だけして、それぞれに異なる群にわたり、同様の条件を保持した。感染後、細胞を再懸濁し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレートにおいて合わせて、指定された群とし、表３に記載されているような、７ｍＬの培地番号１９に合わせた。培養の際には、２日置きに新鮮なサイトカインを加えた。
７．２．ルシフェラーゼ±ＨＬＡ－Ｅを含む野生型Ｔ細胞及びＢ２Ｍ－／－ Ｔ細胞の調製
新鮮な健常なヒト末梢血白血球アフェレーシスパックをＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、細胞をＰＢＳに再懸濁し、１回洗浄した。続いて、細胞ペレットをＲＢＣ溶解緩衝液Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８００）に１５分、再懸濁してから、ＰＢＳで洗浄した。溶解後、ＰＢＭＣ数を求め、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）をメーカーのプロトコールに従って用いて、Ｔ細胞の単離を行った。単離したＣＤ３＋ Ｔ細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０という培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用時まで、液体窒素中で凍結した。
新鮮な健常なヒト末梢血白血球アフェレーシスパックをＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、細胞をＰＢＳに再懸濁し、１回洗浄した。続いて、細胞ペレットをＲＢＣ溶解緩衝液Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８００）に１５分、再懸濁してから、ＰＢＳで洗浄した。溶解後、ＰＢＭＣ数を求め、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）をメーカーのプロトコールに従って用いて、Ｔ細胞の単離を行った。単離したＣＤ３＋ Ｔ細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０という培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用時まで、液体窒素中で凍結した。
７．３．Ｔ細胞におけるｓｇＲＮＡのエレクトロポレーション
ガイドＧ０００１９３（１００μＭ）、組み換えＣａｓ９－ＮＬＳタンパク質（５０μＭ）、及び反応緩衝液（１×）を用いて、Ｂ２Ｍのノックアウトを行うために、ＲＮＰを調合した。まず、シングルガイドＧ０００１９３を９５℃で２分変性させてから、氷上で１０分冷却した。ＰＣＲチューブにおいて、６μｌの５０μＭ Ｃａｓ９を１８μｌの１×反応緩衝液及び６μｌの変性済みＧ０００１９３ガイドと混合して、最終体積を３０μｌにした。２５℃で１０分インキュゲートすることによって、ＲＮＰを調合し、さらなる使用時まで、氷上で静置した。解凍後、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）、ＩＬ－７（２．５ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７８０５３．１）及びＩＬ－１５（２．５ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７８０３１．１）を含む培地番号１９で、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を０．５×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞をＴｒａｎｓａｃｔ（１：１００希釈液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で４８時間刺激した。刺激後、１０×１０６細胞を遠心分離し、８０ｕｌのＰ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＰ－３０２４）に再懸濁してから、２５μｌのＲＮＰを加え、ＬｏｎｚａのエレクトロポレーターをパルスコードＥＯ－１１５で用いて、キュベットでエレクトロポレーションした。モックエレクトロポレーションのために、Ｐ３緩衝液のみで、野生型Ｔ細胞に同様のプロセスを行った。
ガイドＧ０００１９３（１００μＭ）、組み換えＣａｓ９－ＮＬＳタンパク質（５０μＭ）、及び反応緩衝液（１×）を用いて、Ｂ２Ｍのノックアウトを行うために、ＲＮＰを調合した。まず、シングルガイドＧ０００１９３を９５℃で２分変性させてから、氷上で１０分冷却した。ＰＣＲチューブにおいて、６μｌの５０μＭ Ｃａｓ９を１８μｌの１×反応緩衝液及び６μｌの変性済みＧ０００１９３ガイドと混合して、最終体積を３０μｌにした。２５℃で１０分インキュゲートすることによって、ＲＮＰを調合し、さらなる使用時まで、氷上で静置した。解凍後、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）、ＩＬ－７（２．５ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７８０５３．１）及びＩＬ－１５（２．５ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７８０３１．１）を含む培地番号１９で、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を０．５×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞をＴｒａｎｓａｃｔ（１：１００希釈液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で４８時間刺激した。刺激後、１０×１０６細胞を遠心分離し、８０ｕｌのＰ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＰ－３０２４）に再懸濁してから、２５μｌのＲＮＰを加え、ＬｏｎｚａのエレクトロポレーターをパルスコードＥＯ－１１５で用いて、キュベットでエレクトロポレーションした。モックエレクトロポレーションのために、Ｐ３緩衝液のみで、野生型Ｔ細胞に同様のプロセスを行った。
７．４．ルシフェラーゼ＋、ＨＬＡ－Ｅ＋、ＭＨＣクラスＩ－の精製Ｔ細胞の調製
感染から７日目に、細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｕ Ｓｔａｉｎ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、５分ブロックしてから、３０分、抗ヒトＭＨＣ－Ｉ ＡＰＣ抗体（クローン番号Ｗ６／、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で単独で染色するか、または抗ヒトＨＬＡ－Ｅ ＢＶ４２１抗体（クローン番号３Ｄ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とともに共染した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａを用いて、ＷＴルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞についてはＧＦＰ＋のみ、Ｂ２Ｍ－／－ ルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞についてはＧＦＰ＋／ＭＨＣ－Ｉ－、Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅ＋ルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞についてはＧＦＰ＋／ＭＨＣ－Ｉ－／ＨＬＡ－Ｅ＋にゲーティングを行うことによって、細胞をソーティングした。回収した細胞を洗浄し、培地番号１９に再懸濁し、６ウェルＧ－Ｒｅｘに移した。細胞を、１：１００の希釈率の別のラウンドのＴｒａｎｓａｃｔで、４８時間刺激した。刺激から４８時間後、刺激したＴ細胞から、Ｔｒａｎｓａｃｔを洗い流し、培地番号１９に再懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘプレートで培養し、２日置きに、新鮮なサイトカインを加えた。
感染から７日目に、細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｕ Ｓｔａｉｎ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、５分ブロックしてから、３０分、抗ヒトＭＨＣ－Ｉ ＡＰＣ抗体（クローン番号Ｗ６／、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で単独で染色するか、または抗ヒトＨＬＡ－Ｅ ＢＶ４２１抗体（クローン番号３Ｄ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とともに共染した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａを用いて、ＷＴルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞についてはＧＦＰ＋のみ、Ｂ２Ｍ－／－ ルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞についてはＧＦＰ＋／ＭＨＣ－Ｉ－、Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅ＋ルシフェラーゼ＋ Ｔ細胞についてはＧＦＰ＋／ＭＨＣ－Ｉ－／ＨＬＡ－Ｅ＋にゲーティングを行うことによって、細胞をソーティングした。回収した細胞を洗浄し、培地番号１９に再懸濁し、６ウェルＧ－Ｒｅｘに移した。細胞を、１：１００の希釈率の別のラウンドのＴｒａｎｓａｃｔで、４８時間刺激した。刺激から４８時間後、刺激したＴ細胞から、Ｔｒａｎｓａｃｔを洗い流し、培地番号１９に再懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘプレートで培養し、２日置きに、新鮮なサイトカインを加えた。
７．５．注射用のＴ細胞の調製
ＰＢＳで洗浄後、２回目の刺激から１０日後に、Ｔ細胞を注射し、ＮＯＧ－ＩＬ１５マウスに注射するために、ＨＢＳＳ溶液に再懸濁した。
ＰＢＳで洗浄後、２回目の刺激から１０日後に、Ｔ細胞を注射し、ＮＯＧ－ＩＬ１５マウスに注射するために、ＨＢＳＳ溶液に再懸濁した。
７．６．ｉｎ ｖｉｖｏにおける、Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞上のＨＬＡ－Ｅの保護作用
ＮＫ細胞をＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０９２）で洗浄し、１０×１０６細胞／ｍＬで、注射用に、１５０μＬに再懸濁した。マウスを最初に、（１）未注射のＮＯＧ／ＩＬ－１５マウスであるコントロール群（ｎ＝１）、及び（２）１５０万個の初代ＮＫ細胞（ｎ＝２）という２つの群に分けた。追加の６つの群に、（３）野生型Ｔ細胞のみ（ｎ＝４）、（４）Ｂ２Ｍ－／－ Ｔ細胞のみ（ｎ＝４）、（５）Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅ Ｔ細胞のみ（ｎ＝４）、（６）１５０万個の初代ＮＫ細胞＋野生型Ｔ細胞（ｎ＝５）、（７）１５０万個の初代ＮＫ細胞＋Ｂ２Ｍ－／－ Ｔ細胞（ｎ＝５）、及び（８）１５０万個の初代ＮＫ細胞＋Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅ Ｔ細胞（ｎ＝５）による処置を行った。ＮＫ細胞溶液は、尾静脈を介して、２７ゲージのニードルで注射した。
ＮＫ細胞をＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０９２）で洗浄し、１０×１０６細胞／ｍＬで、注射用に、１５０μＬに再懸濁した。マウスを最初に、（１）未注射のＮＯＧ／ＩＬ－１５マウスであるコントロール群（ｎ＝１）、及び（２）１５０万個の初代ＮＫ細胞（ｎ＝２）という２つの群に分けた。追加の６つの群に、（３）野生型Ｔ細胞のみ（ｎ＝４）、（４）Ｂ２Ｍ－／－ Ｔ細胞のみ（ｎ＝４）、（５）Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅ Ｔ細胞のみ（ｎ＝４）、（６）１５０万個の初代ＮＫ細胞＋野生型Ｔ細胞（ｎ＝５）、（７）１５０万個の初代ＮＫ細胞＋Ｂ２Ｍ－／－ Ｔ細胞（ｎ＝５）、及び（８）１５０万個の初代ＮＫ細胞＋Ｂ２Ｍ－／－ ＨＬＡ－Ｅ Ｔ細胞（ｎ＝５）による処置を行った。ＮＫ細胞溶液は、尾静脈を介して、２７ゲージのニードルで注射した。
マウスに、ＮＫ細胞の注射から２８日後に、野生型Ｔ細胞、Ｂ２Ｍ－／－ Ｔ細胞またはＢ２Ｍ－／－ ＋ＨＬＡ－Ｅ Ｔ細胞を接種した。細胞は、６×１０６細胞／体積１５０μＬの濃度で調製した。
ＩＶＩＳイメージングを行って、ルシフェラーゼ陽性Ｔ細胞をＩＶＩＳスペクトルによって特定した。ＩＶＩＳイメージングは、Ｔ細胞の注射から６時間後、２４時間後、４８時間後、４日後、６日後、８日後、１１日後、１８日後、２５日後、２９日後、３３日後、５０日後、５５日後、６１日後、７４日後及び９０日後に行った。Ｄ－ルシフェリンを、メーカーの推奨に従って、体重１ｇ当たり１０μＬ、マウス１匹当たり約１５０μＬで腹腔内注射して、マウスをイメージング用に準備した。マウスを麻酔してから、ＩＶＩＳイメージングユニットに置いた。可視化は、露光時間を自動に設定し、視野Ｄ、ミディアムビニング、及びＦ／ストップを１に設定して行った。
図９Ａには、Ｔ細胞注射から９０日後に、Ｂ２Ｍ ＫＯ Ｔ細胞のＨＬＡ－Ｅが、ＮＫ細胞による溶解から保護されていることが示されている。図９Ｂには、Ｔ細胞注射から９０日という経過時間にわたって、Ｂ２Ｍ ＫＯ Ｔ細胞のＨＬＡ－Ｅが、ＮＫ細胞から保護されていることが示されている。図９Ｃには、反復試験の、３０日という経過時間にわたる、ＨＬＡ－Ｅの保護作用が示されている。
実施例８：リンパ芽球様細胞株におけるＣＩＩＴＡ編集
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を用いて、２つのリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を編集する。ＬＣＬは、ヒトドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に感染させることによって発生させる。このプロセスは、ヒト休止Ｂ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで不死化させて、活発に増殖するＢ細胞集団であって、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９が陽性であるとともに、Ｔ細胞マーカーＣＤ３及びＮＫ細胞マーカーＣＤ５６が陰性であるＢ細胞集団をもたらすことが示されている（Ｎｅｉｔｚｅｌ Ｈ．Ａ ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｇｒｏｗｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９８６；７３（４）：３２０－６）。
ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を用いて、２つのリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を編集する。ＬＣＬは、ヒトドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に感染させることによって発生させる。このプロセスは、ヒト休止Ｂ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで不死化させて、活発に増殖するＢ細胞集団であって、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９が陽性であるとともに、Ｔ細胞マーカーＣＤ３及びＮＫ細胞マーカーＣＤ５６が陰性であるＢ細胞集団をもたらすことが示されている（Ｎｅｉｔｚｅｌ Ｈ．Ａ ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｇｒｏｗｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９８６；７３（４）：３２０－６）。
リンパ芽球様細胞株ＧＭ２６２００及びＧＭ２０３４０は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から得られる。Ｌ－グルタミン及び１５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０中で、ＬＣＬを成長させる。ＬＮＰとの接触時に、細胞を４ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍカタログ番号２０４－ＩＬ－０１０）、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍカタログ番号６２４５－ＣＬ－０５０）、２５ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍカタログ番号２１４９－ＢＦ－０１０）で活性化させる。Ｂ２Ｍを標的とするＬＮＰを、実施例１．３に記載されているように、５０／１０／３８．５／１．５という比のイオン化可能な脂質Ｂ、コレステロール、ＤＳＰＣ及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧで調合する。ＡＴＴＲを標的とするＬＮＰを、それぞれ５０：３８．５：９：３というモル比の脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧで調合した。脂質アミンの、ＲＮＡのリン酸に対するモル比（Ｎ：Ｐ）が約６、ｇＲＮＡとｍＲＮＡとの重量比が１：２で、脂質核酸アセンブリーを調合した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡとともに調合したＬＮＰを事前に、３７℃で約５分、６％（ｖ／ｖ）のＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）血清（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号ＣＹＮ１９７４５２）とともにインキュベートし、リンパ芽球様細胞に送達する。ＬＮＰによる処理から６日後に、半数の細胞をＮＧＳシーケンシングのために回収し、１日後に、残りの半分の細胞をフローサイトメトリー解析のために回収した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）をメーカーのプロトコールに従って用いて抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ＮＧＳ解析を下記に従って行う。
ＮＧＳ解析は、実施例１．１におけるようにして行う。
フローサイトメトリーを行う。フローサイトメトリー解析のために、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２ ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗浄する。続いて、その細胞をＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号４２２３０２）によって、室温（ＲＴ）で５分ブロックし、ＡＰＣコンジュゲート抗体またはＰＥコンジュゲート抗体とともに、１：２００の希釈率で３０分、４℃でインキュベートする。インキュベート後、その細胞を洗浄し、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄマーカー７ＡＡＤ（希釈率１：１０００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号４２０４０４）を含む緩衝液に再懸濁する。例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏｆｌｅｘＳ（商標）を用いて、その細胞をフローサイトメトリーによって処理し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）というソフトウェアパッケージを用いて解析する。
実施例９．ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ及びＴＲＡＣの遺伝子編集後の染色体転座についての指向性ゲノムハイブリダイゼーション解析
エレクトロポレーションまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で処理して、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを送達したＴ細胞において、転座を含む染色体構造変動を、ＫｒｏｍａＴｉＤ（Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ）による指向性ゲノムハイブリダイゼーション（ｄＧＨ（商標））によって解析した。
エレクトロポレーションまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で処理して、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを送達したＴ細胞において、転座を含む染色体構造変動を、ＫｒｏｍａＴｉＤ（Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ）による指向性ゲノムハイブリダイゼーション（ｄＧＨ（商標））によって解析した。
９．１．エレクトロポレーションによる処理
エレクトロポレーションによる処理のために、Ｔ細胞を単離し、下記のように凍結保存した。Ｔ細胞は、市販品を入手するか（例えばＨｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｆｒｏｚｅｎ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ７００２９）、または内部で、ロイコパックから調製した。内部調製の場合には、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ１７９５１）をメーカーのプロトコールに従って用いて、Ｔ細胞をネガティブ選択によって単離した。Ｔ細胞は、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０という凍結培地（カタログ番号０７９３０）で凍結保存した。凍結保存したＴ細胞を解凍し、一晩、表３に記載されているような培地番号１中で静置した。
エレクトロポレーションによる処理のために、Ｔ細胞を単離し、下記のように凍結保存した。Ｔ細胞は、市販品を入手するか（例えばＨｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｆｒｏｚｅｎ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ７００２９）、または内部で、ロイコパックから調製した。内部調製の場合には、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ１７９５１）をメーカーのプロトコールに従って用いて、Ｔ細胞をネガティブ選択によって単離した。Ｔ細胞は、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０という凍結培地（カタログ番号０７９３０）で凍結保存した。凍結保存したＴ細胞を解凍し、一晩、表３に記載されているような培地番号１中で静置した。
静置したＴ細胞にエレクトロポレーションを行って、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするガイドＧ０１３６７４（配列番号７０２）、またはＢ２Ｍ遺伝子を標的とするＧ０００５２９（配列番号７０１）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を送達した。簡潔に述べると、組み換えＣａｓ９－ＮＬＳタンパク質（５０μＭストック）をｓｇＲＮＡ（１００ｕＭ）と、２０μＭのＣａｓ９及び４０μＭのｓｇＲＮＡという終濃度（Ｃａｓ９タンパク質とガイドとの比率は１：２）でインキュゲートすることによって、ストックＲＮＰを調製した。培養したＴ細胞を１×１０６細胞で回収し、１００μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｐ３（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＳＰ－３９６０）に再懸濁し、１２．５μＬのＲＮＰとともに、それぞれ２μＭの終濃度までインキュベートした。その後、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）５を用いて、Ｔ細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションした細胞を回収し、４８時間、表３に記載されているような培地番号１中で静置した。その後、Ｔ細胞を回収し、１×１０６細胞／ｍＬの密度まで、表３に記載されているような培地番号１に再懸濁し、１／１００の希釈率のＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）という試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で活性化した。Ｔ細胞の活性化から４８時間後、Ｔ細胞に、上記のように、ＴＲＡＣを標的とするＧ０１２０８６（配列番号７０３）を含むＣａｓ９－ＲＮＰをエレクトロポレーションした。トリプル編集を行ったＴ細胞を、表３に記載されているような培地番号１に再度移し、将来の解析に備えて増加させた。
増加後、Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９０－４８５）のＭＨＣクラスＩ用（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１２０－４３１）、ＭＨＣクラスＩＩ用（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－１０４－８２３）及びＣＤ３－ビオチン用（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９８－６１２）のプロトコールをメーカーのプロトコールに従って用いて、トリプルノックアウト細胞を選択するために、細胞に対して、Ｍａｇｎｅｔｉｃ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）の枯渇プロセスを行った。ネガティブ選択を行った細胞をフローサイトメトリー解析及びＮＧＳ解析のために回収した。これらの解析には、実施例３．３及び１．１に記載されているプロトコールを使用した。
９．２．順次的及び同時のＬＮＰ処理
ＬＮＰによる処理のために、実施例３．１におけるようにして、Ｔ細胞を単離し、凍結保存した。解凍後、Ｔ細胞をＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で、メーカーのプロトコールによって推奨されているようにして活性化し、３７℃で２４～７２時間、下記に定められているようにして培養した。
ＬＮＰによる処理のために、実施例３．１におけるようにして、Ｔ細胞を単離し、凍結保存した。解凍後、Ｔ細胞をＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で、メーカーのプロトコールによって推奨されているようにして活性化し、３７℃で２４～７２時間、下記に定められているようにして培養した。
ＬＮＰによる同時処理では、活性化から７２時間後、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０９）と、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ Ｇ０００５２９（配列番号７０１）、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ Ｇ０１２０８６（配列番号７０３）、及びＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡ Ｇ０１３６７４（配列番号７０２）を送達する３つのＬＮＰで、Ｔ細胞を処理した。ＬＮＰは、カニクイザル血清とともに、３７℃で５分事前にインキュベートし、１００，０００個のＴ細胞当たり１００ｎｇのＲＮＡカーゴ総量で投与した。ＬＮＰへの暴露から２４時間後、細胞を洗浄し、表３に記載されているような培地番号１１に再懸濁し、３７℃で５日培養した。
ＬＮＰによる順次的な処理では、活性化から２４時間後に、ＬＮＰによる同時処理について上記したように、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０９）、及びＢ２Ｍを標的とするＧ０００５２９（配列番号７０１）を送達する単一のＬＮＰで、Ｔ細胞を処理した。洗浄及び再懸濁後、活性化から４８時間後に、Ｃａｓ９（配列番号８０９）をコードするｍＲＮＡ、及びＣＩＩＴＡを標的とするＧ０１３６７４（配列番号７０２）を送達する単一のＬＮＰを加えた。最後に、洗浄及び再懸濁後、活性化から７２時間後に、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０９）、及びＴＲＡＣを標的とするＧ０１２０８６（配列番号７０３）を送達する単一のＬＮＰを加えた。最後のＬＮＰへの暴露から２４時間後、細胞を洗浄し、表３に記載されているような培地番号１１に再懸濁し、３７℃で５日培養した。
ＬＮＰで処理したＴ細胞に対して、ＭＡＣＳのトリプルネガティブ選択プロセスを行い、さらに、エレクトロポレーションした細胞について記載されているようにして、これらの試料で、（実施例３．２に記載されているように）フローサイトメトリー解析と、（実施例１．１に記載されているように）ＮＧＳ解析を行った。
処理した細胞及び未処理細胞において、（実施例１．１に記載されているように）ＮＧＳによる編集率（％）と、（実施例３．３に記載されているように）フローサイトメトリーによるタンパク質発現を調べ、いずれも、ＭＡＣＳでの処理の前後に行った。ＦＩＴＣ抗ヒトβ２－ミクログロブリン抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）カタログ番号３１６３０４）というフローサイトメトリー試薬を、Ｂ２Ｍの遺伝子編集の表現型リードアウトとして、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）、カタログ番号３００４１２）を、ＣＩＩＴＡの遺伝子編集の表現型リードアウトとして、ＰＥ抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）、カタログ番号３６１７１６）を、ＴＲＡＣの遺伝子編集の表現型リードアウトとして使用した。ＮＧＳによる編集結果は、表１５及び図１０Ａ（ＭＡＣＳ前）、図１０Ｂ（ＭＡＣＳ後）に示されている。フローサイトメトリーの結果は、表１６及び図１１Ａ（ＭＡＣＳ前）、図１１Ｂ（ＭＡＣＳ後）に示されている。
９．３．染色体構造の再構成についてのＫｒｏｍａｔｉｄ ｄＧＨ（商標）解析
ｄＧＨの手順用に、ＫｒｏｍａＴｉＤのプロトコールに従って、操作Ｔ細胞を調製した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を１７時間、ＫｒｏｍａＴｉＤによって供給されているような５μＭのＢｒｄＵ及び１μＭのＢｒｄＣを加えた状態で培養した。コルセミドを１０μｌ／ｍｌの濃度で、さらに４時間加えた。細胞を遠心分離によって回収し、７５ｍＭのＫＣｌ低張溶液中で３０分、室温でインキュベートし、３：１のメタノール及び酢酸の溶液で固定した。
ｄＧＨの手順用に、ＫｒｏｍａＴｉＤのプロトコールに従って、操作Ｔ細胞を調製した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を１７時間、ＫｒｏｍａＴｉＤによって供給されているような５μＭのＢｒｄＵ及び１μＭのＢｒｄＣを加えた状態で培養した。コルセミドを１０μｌ／ｍｌの濃度で、さらに４時間加えた。細胞を遠心分離によって回収し、７５ｍＭのＫＣｌ低張溶液中で３０分、室温でインキュベートし、３：１のメタノール及び酢酸の溶液で固定した。
これらのＴ細胞を操作するのに用いるガイドのゲノム標的部位（別々の染色体に位置する）を挟むように、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブを３セット設計した。ＫｒｏｍａＴｉＤが、その独自のｄＧＨ ＦＩＳＨを用いて、１つの試料当たり２００個の分裂中期スプレッドをイメージングし、それらのスプレッドを、染色体構造の再構成についてスコア化した。染色体構造の再構成が行われなかった細胞では、色が一致した隣接ＦＩＳＨシグナル対が３つ見られた。細胞内で、標的部位のＦＩＳＨシグナルが特定されなかった場合（編集イベントが行われたことにより、細胞複製周期中に、断片が喪失した染色体再構成を示す）に、「欠失」のスコアとした。それぞれの隣接ＦＩＳＨシグナル対の色が不一致な場合（２つのＣａｓ９標的切断部間（例えば、Ｂ２Ｍ標的部位とＴＲＡＣ標的部位との間）の転座を示す）には、「相互転座」のスコアとした。「オフターゲット染色体への転座」では、１つのＦＩＳＨシグナルが見られた（Ｃａｓ９標的切断部位と非標識染色体部位との融合を示す）。
「複雑な転座」は、相互転座及びオフターゲット部位への転座に含まれないＦＩＳＨシグナルを示す。相互転座、オフターゲット染色体／オフターゲットゲノム部位への転座及び複雑な転座の合計として、転座総数を計算した。表１７及び図１２には、各条件において、この方法によって特定された染色体再構成が示されている。
実施例１０：オフターゲット解析
１０．１．生化学的なオフターゲット解析
生化学的な方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６，６００－６０６；２０１７を参照されたい）を用いて、ＣＩＩＴＡを標的とする特異的ガイドを使用して、Ｃａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を求めた。この実験では、リンパ芽球細胞株ＮＡ２４３８５（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から精製したゲノムＤＮＡを用いて、オフターゲットプロファイルが既知である３つのコントロールガイドとともに、ヒトＣＩＩＴＡを標的とする２つのｓｇＲＮＡをスクリーニングした。生化学的なアッセイにおいて、１９２ｎＭ及び６４ｎＭのＣａｓ９タンパク質というガイド濃度を用いて検出した潜在的なオフターゲット部位の数が、表１８に示されている。
１０．１．生化学的なオフターゲット解析
生化学的な方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６，６００－６０６；２０１７を参照されたい）を用いて、ＣＩＩＴＡを標的とする特異的ガイドを使用して、Ｃａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を求めた。この実験では、リンパ芽球細胞株ＮＡ２４３８５（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から精製したゲノムＤＮＡを用いて、オフターゲットプロファイルが既知である３つのコントロールガイドとともに、ヒトＣＩＩＴＡを標的とする２つのｓｇＲＮＡをスクリーニングした。生化学的なアッセイにおいて、１９２ｎＭ及び６４ｎＭのＣａｓ９タンパク質というガイド濃度を用いて検出した潜在的なオフターゲット部位の数が、表１８に示されている。
１０．２．潜在的なオフターゲット部位を検証するための標的化シーケンシング
上で用いた生化学的な方法のような検出アッセイによって予測された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的化シーケンシングを用いて、その部位でのオフターゲット切断が検出されるかを判断して、評価し得る。
上で用いた生化学的な方法のような検出アッセイによって予測された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的化シーケンシングを用いて、その部位でのオフターゲット切断が検出されるかを判断して、評価し得る。
ある１つのアプローチでは、対象とするＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ（例えば、評価用の潜在的なオフターゲット部位を有するｓｇＲＮＡ）を初代Ｔ細胞に導入する。続いて、そのＴ細胞を溶解し、潜在的なオフターゲット部位（複数可）を挟み込むプライマーを用いて、ＮＧＳ解析用のアンプリコンを作製する。特定のレベルで、インデルが特定されることで、潜在的なオフターゲット部位を検証でき、潜在的なオフターゲット部位にインデルが見られないことにより、使用したオフターゲット予測アッセイでは、偽陽性であったことを示すことができる。
実施例１１：ＢＣ２２ｎを用いた、Ｔ細胞でのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡスクリーニング
様々なｓｇＲＮＡにおいて、ＣからＴへの塩基編集を用いて、ｓｇＲＮＡが、ヒトＴ細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトする効能についてスクリーニングした。ｍＲＮＡ及び様々なｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることで、ＣＩＩＴＡを編集した後、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質及び／またはＣＤ７４タンパク質の発現が陰性であるＴ細胞の割合（％）を調べた。
様々なｓｇＲＮＡにおいて、ＣからＴへの塩基編集を用いて、ｓｇＲＮＡが、ヒトＴ細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトする効能についてスクリーニングした。ｍＲＮＡ及び様々なｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることで、ＣＩＩＴＡを編集した後、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質及び／またはＣＤ７４タンパク質の発現が陰性であるＴ細胞の割合（％）を調べた。
１１．１ Ｔ細胞の調製
健常なヒトドナーアフェレーシス産物の市販品（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を入手し、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－０７０－５２５）に再懸濁し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓという装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で処理した。Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－１２２－３５２）を用いて、Ｔ細胞をポジティブ選択によって単離した。Ｔ細胞を分注し、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ０７９３０）で凍結保存した。
健常なヒトドナーアフェレーシス産物の市販品（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を入手し、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－０７０－５２５）に再懸濁し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓという装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で処理した。Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－１２２－３５２）を用いて、Ｔ細胞をポジティブ選択によって単離した。Ｔ細胞を分注し、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ０７９３０）で凍結保存した。
解凍後、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ及びＴ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログＡ１０４８５０１）、５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ、カタログ１００－５１２）、１×ペニシリン－ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）及び５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）で構成されたＴ細胞成長培地（ＴＣＧＭ）において、Ｔ細胞を１．０×１０＾６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をこの培地中で、２４時間静置し、その時点に、Ｔ細胞を、１：１００の体積比で加えたＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ｈｕｍａｎという試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ１３０－１１１－１６０）で活性化した。Ｔ細胞を４８時間活性化してから、エレクトロポレーションを行った。
１１．２ ＲＮＡのエレクトロポレーションによるＴ細胞編集
ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０４または８０５）及びＵＧＩをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０７または８０８）を含む溶液をＰ３緩衝液中で調製した。ＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡを１００μＭ、保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させ、室温で５分インキュベートした。活性化から４８時間後、Ｔ細胞を回収し、遠心分離し、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に、１２．５×１０＾６ Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。エレクトロポレーションの際には、最終体積２０μＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液において、１×１０＾５ Ｔ細胞を２０ｎｇ／μＬのＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ、２０ｎｇ／μＬのＵＧＩ ｍＲＮＡ、及び２０ｐｍｏｌの、表１に記載されているようなｓｇＲＮＡと混合した。このミックスをｄｕｐｌｉｃａｔｅで９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プレートに移し、メーカーのパルスコードを用いてエレクトロポレーションした。サイトカインを含まない８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ中で、エレクトロポレーションしたＴ細胞を直ちに１５分静置してから、２×サイトカインを添加した、さらなる８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが入った新しい平底９６ウェルプレートに移した。得られたプレートを３７℃で１０日インキュベートした。エレクトロポレーションから４日目に、細胞を１：２で、２つのＵ底プレートに分けた。一方のプレートは、ＮＧＳシーケンシングのために回収し、もう一方のプレートには、１×サイトカインを含む新鮮なＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地を補充した。このプレートは、７日目に、フローサイトメトリーに使用した。
ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０４または８０５）及びＵＧＩをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０７または８０８）を含む溶液をＰ３緩衝液中で調製した。ＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡを１００μＭ、保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させ、室温で５分インキュベートした。活性化から４８時間後、Ｔ細胞を回収し、遠心分離し、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に、１２．５×１０＾６ Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。エレクトロポレーションの際には、最終体積２０μＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液において、１×１０＾５ Ｔ細胞を２０ｎｇ／μＬのＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ、２０ｎｇ／μＬのＵＧＩ ｍＲＮＡ、及び２０ｐｍｏｌの、表１に記載されているようなｓｇＲＮＡと混合した。このミックスをｄｕｐｌｉｃａｔｅで９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プレートに移し、メーカーのパルスコードを用いてエレクトロポレーションした。サイトカインを含まない８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ中で、エレクトロポレーションしたＴ細胞を直ちに１５分静置してから、２×サイトカインを添加した、さらなる８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが入った新しい平底９６ウェルプレートに移した。得られたプレートを３７℃で１０日インキュベートした。エレクトロポレーションから４日目に、細胞を１：２で、２つのＵ底プレートに分けた。一方のプレートは、ＮＧＳシーケンシングのために回収し、もう一方のプレートには、１×サイトカインを含む新鮮なＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地を補充した。このプレートは、７日目に、フローサイトメトリーに使用した。
１１．３ フローサイトメトリー及びＮＧＳシーケンシング
編集から７日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＣＤ７４、及びＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱの表面発現を求めた。簡潔に述べると、Ｔ細胞を３０分、４℃で、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０２０１）で希釈した抗体の混合物とともにインキュベートした。ＣＤ３に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３６）、ＣＤ４に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）、ＣＤ８に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４６）及びＶｉａｋｒｏｍｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ｃ３６６２８）を１：１００で希釈し、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＲに対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２７０１８）、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＰに対する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号７５０８７２）、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＱに対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号５６１５０４）及びＣＤ７４に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２６８０８）を１：５０で希釈した。その後、細胞を洗浄し、１００μＬの細胞染色緩衝液に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理した。ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて、フローサイトメトリーデータを解析した。Ｔ細胞をサイズ、形、生存率、ＣＤ８、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＰ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＱ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＲ及びＣＤ７４の発現に基づいてゲーティングした。
編集から７日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＣＤ７４、及びＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱの表面発現を求めた。簡潔に述べると、Ｔ細胞を３０分、４℃で、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０２０１）で希釈した抗体の混合物とともにインキュベートした。ＣＤ３に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３６）、ＣＤ４に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）、ＣＤ８に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４６）及びＶｉａｋｒｏｍｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ｃ３６６２８）を１：１００で希釈し、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＲに対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２７０１８）、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＰに対する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号７５０８７２）、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＱに対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号５６１５０４）及びＣＤ７４に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２６８０８）を１：５０で希釈した。その後、細胞を洗浄し、１００μＬの細胞染色緩衝液に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理した。ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて、フローサイトメトリーデータを解析した。Ｔ細胞をサイズ、形、生存率、ＣＤ８、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＰ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＱ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＲ及びＣＤ７４の発現に基づいてゲーティングした。
編集から４日目に、ＤＮＡ試料をＰＣＲにかけた後、実施例１に記載されているようにして、ＮＧＳ解析を行った。表２０には、ＢＣ２２ｎを用いて編集したＴ細胞でのＣＩＩＴＡ編集の結果が示されている。
実施例１２：ＢＣ２２ｎを用いた、Ｔ細胞におけるＣＩＩＴＡ ｓｇＲＮＡの用量応答性スクリーニング
実施例１１で特定された所定のＣＩＩＴＡ ｓｇＲＮＡにおいて、Ｔ細胞中での複数のガイド濃度における塩基編集効力についてさらに調べた。ゲノム編集効力についてＮＧＳによって、またはＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱという表面タンパク質の発現阻害についてフローサイトメトリーによって、それぞれの効能を調べた。
実施例１１で特定された所定のＣＩＩＴＡ ｓｇＲＮＡにおいて、Ｔ細胞中での複数のガイド濃度における塩基編集効力についてさらに調べた。ゲノム編集効力についてＮＧＳによって、またはＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱという表面タンパク質の発現阻害についてフローサイトメトリーによって、それぞれの効能を調べた。
１２．１ Ｔ細胞の調製
健常なヒトドナーアフェレーシス産物の市販品（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を入手し、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－０７０－５２５）に再懸濁し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓという装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で処理した。Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－１２２－３５２）を用いて、Ｔ細胞をポジティブ選択によって単離した。Ｔ細胞を分注し、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ０７９３０）で凍結保存した。
健常なヒトドナーアフェレーシス産物の市販品（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を入手し、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－０７０－５２５）に再懸濁し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓという装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で処理した。Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－１２２－３５２）を用いて、Ｔ細胞をポジティブ選択によって単離した。Ｔ細胞を分注し、将来の使用に備えて、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ０７９３０）で凍結保存した。
解凍後、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ及びＴ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログＡ１０４８５０１）、５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ、カタログ１００－５１２）、１×ペニシリン－ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）及び５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）で構成されたＴ細胞成長培地（ＴＣＧＭ）において、Ｔ細胞を１．０×１０＾６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をこの培地中で、２４時間静置し、その時点に、Ｔ細胞を、１：１００の体積比で加えたＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ｈｕｍａｎという試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ１３０－１１１－１６０）で活性化した。Ｔ細胞を４８時間活性化してから、エレクトロポレーションを行った。
１２．２ ＲＮＡのエレクトロポレーションによるＴ細胞編集
ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０４または８０５）及びＵＧＩをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０７または８０８）を含む溶液をＰ３緩衝液中で調製した。ＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡを１００μＭ、保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させ、室温で５分インキュベートした。活性化から４８時間後、Ｔ細胞を回収し、遠心分離し、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に、１２．５×１０＾６ Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、各ｓｇＲＮＡを１：２の比率で、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液にｄｕｐｌｉｃａｔｅで段階希釈した（６０ｐｍｏｌから開始）。希釈後、１×１０＾５ Ｔ細胞、２０ｎｇ／μＬのＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ及び２０ｎｇ／μＬのＵＧＩ ｍＲＮＡをｓｇＲＮＡプレートと混合して、最終体積２０μＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液を作製した。このミックスを４つの対応する９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プレートに移し、メーカーのパルスコードを用いてエレクトロポレーションした。サイトカインを含まない８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ中で、エレクトロポレーションしたＴ細胞を直ちに１５分静置してから、２×サイトカインを添加した、さらなる８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが入った新しい平底９６ウェルプレートに移した。得られたプレートを３７℃で７日インキュベートした。エレクトロポレーションから４日目に、細胞を１：２で、２つのＵ底プレートに分け、一方のプレートは、ＮＧＳシーケンシングのために回収し、もう一方のプレートには、１×サイトカインを含む新鮮なＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地を補充した。このプレートは、７日目に、フローサイトメトリーに使用した。
ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０４または８０５）及びＵＧＩをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０７または８０８）を含む溶液をＰ３緩衝液中で調製した。ＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡを１００μＭ、保存プレートから取り出し、２分、９５℃で変性させ、室温で５分インキュベートした。活性化から４８時間後、Ｔ細胞を回収し、遠心分離し、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に、１２．５×１０＾６ Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、各ｓｇＲＮＡを１：２の比率で、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液にｄｕｐｌｉｃａｔｅで段階希釈した（６０ｐｍｏｌから開始）。希釈後、１×１０＾５ Ｔ細胞、２０ｎｇ／μＬのＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ及び２０ｎｇ／μＬのＵＧＩ ｍＲＮＡをｓｇＲＮＡプレートと混合して、最終体積２０μＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液を作製した。このミックスを４つの対応する９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プレートに移し、メーカーのパルスコードを用いてエレクトロポレーションした。サイトカインを含まない８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ中で、エレクトロポレーションしたＴ細胞を直ちに１５分静置してから、２×サイトカインを添加した、さらなる８０μＬのＴ細胞成長培地ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが入った新しい平底９６ウェルプレートに移した。得られたプレートを３７℃で７日インキュベートした。エレクトロポレーションから４日目に、細胞を１：２で、２つのＵ底プレートに分け、一方のプレートは、ＮＧＳシーケンシングのために回収し、もう一方のプレートには、１×サイトカインを含む新鮮なＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地を補充した。このプレートは、７日目に、フローサイトメトリーに使用した。
１２．３ フローサイトメトリー及びＮＧＳシーケンシング
編集から７日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱの表面発現を求めた。簡潔に述べると、Ｔ細胞を３０分、４℃で、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０２０１）で希釈した抗体の混合物とともにインキュベートした。ＣＤ３に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３６）、ＣＤ４に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）、ＣＤ８に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４６）及びＶｉａｋｒｏｍｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ｃ３６６２８）を１：１００で希釈し、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＲ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＰ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＱに対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６１７１４）を１：５０で希釈した。その後、細胞を洗浄し、１００μＬの細胞染色緩衝液に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理した。ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて、フローサイトメトリーデータを解析した。Ｔ細胞をサイズ、形、生存率、ＣＤ８、及びＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱに基づいてゲーティングした。
編集から７日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱの表面発現を求めた。簡潔に述べると、Ｔ細胞を３０分、４℃で、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０２０１）で希釈した抗体の混合物とともにインキュベートした。ＣＤ３に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３６）、ＣＤ４に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）、ＣＤ８に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４６）及びＶｉａｋｒｏｍｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ｃ３６６２８）を１：１００で希釈し、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＲ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＰ、ＨＬＡ ＩＩ－ＤＱに対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６１７１４）を１：５０で希釈した。その後、細胞を洗浄し、１００μＬの細胞染色緩衝液に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘというフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理した。ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアパッケージを用いて、フローサイトメトリーデータを解析した。Ｔ細胞をサイズ、形、生存率、ＣＤ８、及びＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱに基づいてゲーティングした。
表２１には、ＢＣ２２ｎを用いた塩基編集後の、ＣＩＩＴＡ編集の結果、及びＴ細胞において、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱが陰性であるＴ細胞の割合（％）が示されている。
実施例１３．ＣＩＩＴＡスプライスガイドのオフターゲット解析
実施例１０のＴ細胞において、ＣＩＩＴＡを標的とするオフターゲットゲノム部位の妥当性についてスクリーニングし、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＤＴ ｒｈＡｍｐＳｅｑ ｒｈＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って行った。この実験では、ＣＩＩＴＡを標的とする３つのｓｇＲＮＡにおいて、オフターゲットプロファイルの妥当性についてスクリーニングした。ＣＩＩＴＡを標的とするガイドｓｇＲＮＡ（Ｇ０１８０８２、Ｇ０１８０８１及びＧ０１８０３４）において、検証されたオフターゲット部位の数が、表２２に示されている。ｐ値が０．０５パーセント未満のインデルである場合に、オフターゲット部位が立証された。Ｇ０１８０８２を標的とするｓｇＲＮＡにおいて特定された１０８個のオフターゲット部位のうち、０個の部位が立証された。Ｇ０１８０８１を標的とするｓｇＲＮＡにおいて特定された１１１個のオフターゲット部位のうち、３個の部位が立証された。Ｇ０１８０３４を標的とするｓｇＲＮＡにおいて特定された１２０個のオフターゲット部位のうち、０個の部位が立証された。
実施例１０のＴ細胞において、ＣＩＩＴＡを標的とするオフターゲットゲノム部位の妥当性についてスクリーニングし、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＤＴ ｒｈＡｍｐＳｅｑ ｒｈＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って行った。この実験では、ＣＩＩＴＡを標的とする３つのｓｇＲＮＡにおいて、オフターゲットプロファイルの妥当性についてスクリーニングした。ＣＩＩＴＡを標的とするガイドｓｇＲＮＡ（Ｇ０１８０８２、Ｇ０１８０８１及びＧ０１８０３４）において、検証されたオフターゲット部位の数が、表２２に示されている。ｐ値が０．０５パーセント未満のインデルである場合に、オフターゲット部位が立証された。Ｇ０１８０８２を標的とするｓｇＲＮＡにおいて特定された１０８個のオフターゲット部位のうち、０個の部位が立証された。Ｇ０１８０８１を標的とするｓｇＲＮＡにおいて特定された１１１個のオフターゲット部位のうち、３個の部位が立証された。Ｇ０１８０３４を標的とするｓｇＲＮＡにおいて特定された１２０個のオフターゲット部位のうち、０個の部位が立証された。
追加の実施形態
本開示はさらに、下記の実施形態を含む。
本開示はさらに、下記の実施形態を含む。
実施形態１は、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む操作細胞である。
実施形態２は、その遺伝子修飾が、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む、実施形態１に記載の操作細胞である。
実施形態３は、その１つのヌクレオチドが、Ａである、実施形態２に記載の操作細胞である。
実施形態４は、その１つのヌクレオチドが、Ｇである、実施形態２に記載の操作細胞である。
実施形態５は、その遺伝子修飾が、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む、実施形態１に記載の操作細胞である。
実施形態６は、その１つのヌクレオチドが、Ｇである、実施形態５に記載の操作細胞である。
実施形態７は、その１つのヌクレオチドが、Ｔである、実施形態５に記載の操作細胞である。
実施形態８は、その遺伝子修飾が、スプライス部位境界ヌクレオチドの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態９は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１０は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１１は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１２は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の操作細胞である。
実施形態１３は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ：１６：１０９０６４８５－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１４は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１５は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１６は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１７は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６及びｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１８は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態１９は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２０は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２１は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２２は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２３は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０及びｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２４は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８及びｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２５は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２６は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２７は、その遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態２８は、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む操作細胞である。
実施形態２９は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の操作細胞である。
実施形態３０は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の操作細胞である。
実施形態３１は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６及びｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の操作細胞である。
実施形態３２は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の操作細胞である。
実施形態３３は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０及びｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の操作細胞である。
実施形態３４は、その遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８及びｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の操作細胞である。
実施形態３５は、その遺伝子修飾が、上記のゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態３６は、その遺伝子修飾が、上記のゲノム座標内の少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態２８～３５のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態３７は、その遺伝子修飾が、上記のゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む、実施形態２８～３６のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態３８は、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態３９は、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４０は、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４１は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４２は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４３は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４４は、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６及びｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４５は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４６は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４７は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４８は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態４９は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５０は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０及びｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５１は、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８及びｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５２は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５３は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５４は、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、そのＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５５は、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列が、上記のゲノム座標内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態３８～５４のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５６は、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列が、上記のゲノム座標内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態３８～５５のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５７は、その遺伝子編集システムが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む、実施形態３８～５６のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態５８は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９タンパク質を含む、実施形態５７に記載の操作細胞である。
実施形態５９は、その遺伝子修飾が、スプライス部位を不活化する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６０は、その遺伝子修飾が、スプライス部位のヌクレオチドの欠失を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６１は、その遺伝子修飾が、スプライス部位のヌクレオチドの置換を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６２は、その操作細胞において、さらに、ＭＨＣクラスＩの表面発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６３は、遺伝子修飾をβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６４は、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６５は、さらに、外来性核酸を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６６は、その操作細胞の表面で発現するターゲティング受容体をコードする外来性核酸を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態６７は、そのターゲティング受容体が、ＣＡＲである、実施形態６６に記載の操作細胞である。
実施形態６８は、そのターゲティング受容体が、ＴＣＲである、実施形態６６に記載の操作細胞である。
実施形態６９は、そのターゲティング受容体が、ＷＴ１ ＴＣＲである、実施形態６６に記載の操作細胞である。
実施形態７０は、さらに、その操作細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態７１は、ヒト細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態７２は、免疫細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態７３は、単球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞または顆粒球である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態７４は、リンパ球である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態７５は、Ｔ細胞である、実施形態７４に記載の操作細胞である。
実施形態７６は、さらに、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている、実施形態７５に記載の操作細胞である。
実施形態７７は、ＴＲＡＣタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている、実施形態７６に記載の操作細胞である。
実施形態７８は、ＴＲＢＣタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減されている、実施形態７６～７７のいずれか１つに記載の操作細胞である。
実施形態７９は、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞を含む医薬組成物である。
実施形態８０は、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞を含む細胞集団である。
実施形態８１は、細胞集団を含む医薬組成物であって、その細胞集団が、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞を含む医薬組成物である。
実施形態８２は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも６５％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、実施形態８０に記載の細胞集団、または実施形態８１に記載の医薬組成物である。
実施形態８３は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも７０％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、実施形態８０に記載の細胞集団、または実施形態８１に記載の医薬組成物である。
実施形態８４は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも８０％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、実施形態８０に記載の細胞集団、または実施形態８１に記載の医薬組成物である。
実施形態８５は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９０％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、実施形態８０に記載の細胞集団、または実施形態８１に記載の医薬組成物である。
実施形態８６は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９２％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、実施形態８０に記載の細胞集団、または実施形態８１に記載の医薬組成物。
実施形態８７は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９３％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、実施形態８０に記載の細胞集団、または実施形態８１に記載の医薬組成物である。
実施形態８８は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９４％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、実施形態８０に記載の細胞集団、または実施形態８１に記載の医薬組成物である。
実施形態８９は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９５％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態８０～８８のいずれかに記載の細胞集団または医薬組成物である。
実施形態９０は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９７％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態８０～８９のいずれかに記載の細胞集団または医薬組成物である。
実施形態９１は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９８％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態８０～９０のいずれかに記載の細胞集団または医薬組成物である。
実施形態９２は、その細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定した場合に、少なくとも９９％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態８０～９１のいずれかに記載の細胞集団または医薬組成物である。
実施形態９３は、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団または医薬組成物を、必要とする対象に投与する方法である。
実施形態９４は、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団または医薬組成物を、対象に、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法として投与する方法である。
実施形態９５は、ａ）ｉ）スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、またはｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物であって、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする組成物である。
実施形態９６は、ａ）ｉ）配列番号１～１０１から選択したガイド配列、ｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、ｉｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一なガイド配列、ｉｖ）表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列、ｖ）（ｉｖ）の配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、またはｖｉ）（ｖ）から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一であるガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物である。
実施形態９７は、ａ）ｉ）配列番号１～１０１から選択したガイド配列、ｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、ｉｉｉ）配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一なガイド配列、ｉｖ）表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列、ｖ）（ｉｖ）の配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、またはｖｉ）（ｖ）から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一であるガイド配列を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを含む組成物である。
実施形態９８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである、実施形態９５～９７のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９９は、さらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、実施形態９５～９８のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１００は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡである、実施形態９９に記載の組成物である。
実施形態１０１は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を含む、実施形態９９～１００のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０２は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、デアミナーゼ領域を含む、実施形態９９～１０１のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０３は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む、実施形態９９～１０１のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０４は、そのＲＮＡ誘導型ニッカーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼである、実施形態１０３に記載の組成物である。
実施形態１０５は、さらに、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む、実施形態１０２～１０４のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０６は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列で、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変換を行う、実施形態１０２～１０５のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０７は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、そのＣＩＩＴＡゲノム標的配列で、アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への変換を行う、実施形態１０２～１０５のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、スプライスアクセプター部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする、実施形態９９～１０７のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０９は、その１つのヌクレオチドが、Ａである、実施形態１０８に記載の組成物である。
実施形態１１０は、その１つのヌクレオチドが、Ｇである、実施形態１０８に記載の組成物である。
実施形態１１１は、その１つのヌクレオチドが、そのスプライスアクセプター部位のスプライス部位境界ヌクレオチドである、実施形態１０８に記載の組成物である。
実施形態１１２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする、実施形態９９～１０７のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１３は、その１つのヌクレオチドが、Ｇである、実施形態１１２に記載の組成物である。
実施形態１１４は、その１つのヌクレオチドが、Ｔである、実施形態１１２に記載の組成物である。
実施形態１１５は、その１つのヌクレオチドが、そのスプライスドナー部位のスプライス部位境界ヌクレオチドである、実施形態１１２に記載の組成物である。
実施形態１１６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから４ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含む、実施形態９９～１１５のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから３ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含む、実施形態９９～１１５のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから２ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含む、実施形態９９～１１７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１１９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから１ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含む、実施形態９９～１１８のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドで、ＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含む、実施形態９９～１１９のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２１は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞を作製する方法であって、細胞と、実施形態９９～１２０のいずれかに記載の組成物とを接触させることを含む方法である。
実施形態１２２は、操作細胞において、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減する方法であって、細胞と、実施形態９９～１２０のいずれかに記載の組成物とを接触させることを含む方法である。
実施形態１２３は、さらに、その細胞において、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、実施形態１２１～１２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２４は、さらに、その細胞において、非修飾細胞と比べて、Ｂ２Ｍタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、実施形態１２１～１２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２５は、さらに、その細胞において、非修飾細胞と比べて、ＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、実施形態１２１～１２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２６は、さらに、その細胞において、非修飾細胞と比べて、ＴＣＲタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、実施形態１２２～１２５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２７は、さらに、その細胞と、外来性核酸とを接触させることを含む、実施形態１２２～１２６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２８は、さらに、その細胞と、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸とを接触させることを含む、実施形態１２７に記載の方法である。
実施形態１２９は、さらに、その細胞と、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸とを接触させることを含む、実施形態１２７に記載の方法である。
実施形態１３０は、その細胞が、同種異系細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３１は、その細胞が、初代細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３２は、その細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３３は、その細胞が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３４は、その細胞が、メモリーＴ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３５は、その細胞が、Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３６は、その細胞が、血漿Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３７は、その細胞が、メモリーＢ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３８は、その細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１３９は、その細胞が、活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４０は、その細胞が、非活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４１は、外来性核酸、またはその細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、その外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４２は、外来性核酸、またはその細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、その外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードし、そのＮＫ細胞阻害剤分子が、ＮＫ細胞上の抑制性受容体に結合する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４３は、外来性核酸、またはその細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、その外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードし、そのＮＫ細胞阻害剤分子が、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４４は、外来性核酸、またはその細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、その外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードし、そのＮＫ細胞阻害剤分子が、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４５は、外来性核酸、またはその細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、その外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードし、そのＮＫ細胞阻害剤分子が、ＨＬＡ－Ｅである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４６は、外来性核酸、またはその細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、その外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードし、そのＮＫ細胞阻害剤分子が、融合タンパク質である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４７は、外来性核酸、またはその細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、その外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードし、そのＮＫ細胞阻害剤分子が、ＨＬＡ－ＥとＢ２Ｍとを含む融合タンパク質である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４８は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、抗体または抗体断片である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１４９は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、完全長ＩｇＧ抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５０は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、一本鎖抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５１は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、中和抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５２は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５３は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、酵素である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５４は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、サイトカインである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５５は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、ケモカインである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５６は、その細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、またはその細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、その分泌されるポリペプチドが、融合タンパク質である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１５７は、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸、またはその細胞と、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸とを接触させることを含み、そのターゲティング受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１５８は、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸、またはその細胞と、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸とを接触させることを含み、そのターゲティング受容体が、遺伝子修飾されたＴＣＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１５９は、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸、またはその細胞と、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸とを接触させることを含み、そのターゲティング受容体が、ＷＴ１ ＴＣＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１６０は、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸、またはその細胞と、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸とを接触させることを含み、そのターゲティング受容体が、ＣＡＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１６１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡをその細胞に、ベクターで供給する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６２は、そのＣＩＩＴＡ ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をその細胞に、ベクターで、任意に、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと同じベクターで供給する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６３は、その外来性核酸をその細胞に、ベクターで供給する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６４は、そのベクターが、ウイルスベクターである、実施形態１６３に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６５は、そのベクターが、非ウイルスベクターである、実施形態１６３に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６６は、そのベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態１６４に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６７は、そのベクターが、ＡＡＶである、実施形態１６４のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６８は、そのガイドＲＮＡをその細胞に、脂質核酸アセンブリー組成物で、任意に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤と同じ脂質核酸アセンブリー組成物で供給する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１６９は、その外来性核酸をその細胞に、脂質核酸アセンブリー組成物で供給する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１７０は、その脂質核酸アセンブリー組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、実施形態１６８または１６９に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１７１は、その外来性核酸が、その細胞のゲノムに組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１７２は、その外来性核酸が、その細胞のゲノムに、相同組み換え（ＨＲ）によって組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１７３は、その外来性核酸が、その細胞のゲノムのセーフハーバー座位に組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態１７４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１７５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１７６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１７７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１７８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１７９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１８９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態１９９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２００は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号２９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２０９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号３９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２１９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号４９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２２９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号５９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２３９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号６９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２４９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号７９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２５９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２６９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号９９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１００を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号１０１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７５は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７６は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７７は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７８は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２７９は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、そのガイドＲＮＡの５’末端の最初の５ヌクレオチドの１つ以上に修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８０は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、そのガイドＲＮＡの３’末端の最後の５ヌクレオチドの１つ以上に修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８１は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、そのガイドＲＮＡの最初の４ヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８２は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、そのガイドＲＮＡの最後の４ヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８３は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを、そのガイドＲＮＡの５’末端の最初の３ヌクレオチドに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８４は、そのＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、その少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを、そのガイドＲＮＡの３’末端の最後の３ヌクレオチドに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８５は、先行実施形態のいずれかに記載のＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの標的となるゲノム領域内のインデルを含む遺伝子修飾を含む操作細胞または細胞集団である。
実施形態２８６は、先行実施形態のいずれかに記載のＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの標的となるゲノム領域内のＣからＴへの置換、またはＡからＧへの置換を含む遺伝子修飾を含む操作細胞または細胞集団である。
実施形態２８７は、がん細胞が発現するポリペプチドに対する特異性を有するＴＣＲを発現させるのに用いるための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８８は、対象に、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法として投与するのに用いるための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２８９は、がんである対象を治療するのに用いるための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２９０は、感染症である対象を治療するのに用いるための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２９１は、自己免疫疾患である対象を治療するのに用いるための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法である。
実施形態２９２は、その遺伝子修飾が、インデルを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態２９３は、その遺伝子修飾が、ＣからＴへの置換を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態２９４は、その遺伝子修飾が、ＡからＧへの置換を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態２９５は、その細胞が、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態２９６は、その細胞がさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、その細胞が、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾が、ａ）ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｂ）ｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態２９７は、その細胞がさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態２９８は、その細胞がさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態２９９は、その細胞がさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３００は、その細胞がさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、そのＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３０１は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、その細胞のＨＬＡ－Ａの発現が低減または排除されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３０２は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞の作製方法であって、ａ）細胞と、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡとを接触させること（そのガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む）、ｂ）細胞と、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡとを接触させること（そのＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２００１～２０９５のいずれか１つから選択したガイド配列を含む）、及びｃ）任意に、細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを接触させることによって、その細胞において、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む方法である。
実施形態３０３は、その方法が、その細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを接触させることを含み、任意に、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を含む、直前の実施形態に記載の方法である。
実施形態３０４は、そのＨＬＡ－Ｂが、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２というＨＬＡ－Ｂアレルのいずれか１つから選択されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３０５は、そのＨＬＡ－Ｃが、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３０６は、そのＨＬＡ－Ｂアレルが、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２というＨＬＡ－Ｂアレルのいずれか１つから選択されており、そのＨＬＡ－Ｃアレルが、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３０７は、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルが、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２というＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つから選択されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３０８は、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルが、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３０９は、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルが、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３１０は、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルが、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
実施形態３１１は、そのＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルが、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法である。
表２３．追加の配列
下記の表において、及び全体を通じて、「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されているヌクレオチドを示す目的で用いられている。下記の表では、「＊」は、ＰＳ修飾を示す目的で用いられている。本願では、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊またはＧ＊という用語は、ＰＳ結合によって、次（例えば３’）のヌクレオチドに連結しているヌクレオチドを示す目的で用いられていることがある。ＲＮＡに関して、ＤＮＡ配列（Ｔを含む）が言及されている場合には、Ｔは、Ｕ（文脈に応じて、修飾されていても、修飾されていなくてもよい）に置き換えるべきであり、ＤＮＡに関して、ＲＮＡ配列（Ｕを含む）が言及されている場合には、Ｕは、Ｔ（文脈に応じて、修飾されていても、修飾されていなくてもよい）に置き換えるべきであると理解されたい。下記の表では、ペプチド配列を示すのに、１文字のアミノ酸略号が用いられている。
Claims (87)
- ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子に含み、前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む前記操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、スプライスアクセプター部位の少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み、任意に、前記１つのヌクレオチドが、ＡまたはＧである、請求項１に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、スプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み、任意に、前記１つのヌクレオチドが、ＧまたはＴである、請求項１に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、スプライス部位境界ヌクレオチドの修飾を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ＭＨＣクラスＩＩの表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞であって、遺伝子修飾をＣＩＩＴＡ遺伝子にを含み、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内のインデル、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む、前記操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内のスプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個または１０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内の、少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、ｃｈｒ１６：１０８９８６４９－１０８９８６６９、ｃｈｒ１６：１０８９８６５８－１０８９８６７８、ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９０２１９１、ｃｈｒ１６：１０９０２１７３－１０９０２１９３、ｃｈｒ１６：１０９０２１７４－１０９０２１９４、ｃｈｒ１６：１０９０２１７９－１０９０２１９９、ｃｈｒ１６：１０９０２１８３－１０９０２２０３、ｃｈｒ１６：１０９０２１８４－１０９０２２０４、ｃｈｒ１６：１０９０２６４４－１０９０２６６４、ｃｈｒ１６：１０９０２７７９－１０９０２７９９、ｃｈｒ１６：１０９０２７８８－１０９０２８０８、ｃｈｒ１６：１０９０２７８９－１０９０２８０９、ｃｈｒ１６：１０９０２７９０－１０９０２８１０、ｃｈｒ１６：１０９０２７９５－１０９０２８１５、ｃｈｒ１６：１０９０２７９９－１０９０２８１９、ｃｈｒ１６：１０９０３７０８－１０９０３７２８、ｃｈｒ１６：１０９０３７１３－１０９０３７３３、ｃｈｒ１６：１０９０３７１８－１０９０３７３８、ｃｈｒ１６：１０９０３７２１－１０９０３７４１、ｃｈｒ１６：１０９０３７２３－１０９０３７４３、ｃｈｒ１６：１０９０３７２４－１０９０３７４４、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～１５のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０３８７８－１０９０３８９８、ｃｈｒ１６：１０９０３９０５－１０９０３９２５、ｃｈｒ１６：１０９０３９０６－１０９０３９２６、ｃｈｒ１６：１０９０４７３６－１０９０４７５６、ｃｈｒ１６：１０９０４７９０－１０９０４８１０、ｃｈｒ１６：１０９０４８１１－１０９０４８３１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０８１２７－１０９０８１４７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３７－１０９０８１５７、ｃｈｒ１６：１０９０８１３８－１０９０８１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１３９－１０９０８１５９、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０９０９０１８－１０９０９０３８、ｃｈｒ１６：１０９０９０２１－１０９０９０４１、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１０１６５－１０９１０１８５、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９１５５４７－１０９１５５６７、ｃｈｒ１６：１０９１５５５１－１０９１５５７１、ｃｈｒ１６：１０９１５５５２－１０９１５５７２、ｃｈｒ１６：１０９１５５６７－１０９１５５８７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５３９－１０９１８５５９、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０９２２４８７－１０９２２５０７、ｃｈｒ１６：１０９２２４９９－１０９２２５１９、ｃｈｒ１６：１０９２３２０５－１０９２３２２５、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２０－１０９２３２４０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１及びｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～１８のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～１９のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６及びｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～２０のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０７から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～２１のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９１６３５９－１０９１６３７９、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９及びｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４から選択したゲノム座標内の少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列に結合する遺伝子編集システムによって、前記ＭＨＣクラスＩＩの発現が低減または排除されている、請求項１～２２のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記ＣＩＩＴＡゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内の少なくとも１０個または少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記遺伝子編集システムが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を含む、請求項１６～２４のいずれか１項に記載の操作細胞。
- さらに、ＭＨＣクラスＩの表面発現が低減または排除されている、請求項１～２５のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 遺伝子修飾をβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記操作細胞の表面で発現するターゲティング受容体をコードする外来性核酸を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記ターゲティング受容体が、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＷＴ１ ＴＣＲである、請求項２９に記載の操作細胞。
- さらに、前記操作細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸を含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の操作細胞。
- 前記操作細胞が、Ｔ細胞であり、さらに、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている、請求項１～３１のいずれか１項に記載の操作細胞。
- ＴＲＡＣタンパク質またはＴＲＢＣタンパク質の発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている、請求項３２に記載の操作細胞。
- 請求項１～３３のいずれか１項に記載の操作細胞を含む医薬組成物。
- 請求項１～３３のいずれか１項に記載の操作細胞を含む細胞集団。
- 細胞集団を含む医薬組成物であって、前記細胞集団が、請求項１～３３のいずれか１項に記載の操作細胞を含む前記医薬組成物。
- フローサイトメトリーによって測定した場合に、前記細胞集団が、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％または少なくとも９５％ＭＨＣクラスＩＩ陰性である、請求項３５に記載の細胞集団、または請求項３４もしくは３６に記載の医薬組成物。
- フローサイトメトリーによって測定した場合に、前記細胞集団が、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％内在性ＴＣＲタンパク質陰性である、請求項３４～３７のいずれかに記載の細胞集団または医薬組成物。
- 請求項１～３８のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団または医薬組成物を、必要とする対象に投与する方法。
- 請求項１～３９のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団または医薬組成物を、対象に、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法として投与する方法。
- ａ．スプライス部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とするか、または
ｂ．ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから５ヌクレオチド以下であるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにする、
ガイド配列を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、
を含む組成物であって、
前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ゲノム座標ｃｈｒ１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする前記組成物。 - ａ．
ｉ．配列番号１～１０１から選択したガイド配列、
ｉｉ．配列番号１～１０１から選択した配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、
ｉｉｉ．配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一なガイド配列、
ｉｖ．表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列、
ｖ．（ｉｖ）の配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、または
ｖｉ．（ｖ）から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一であるガイド配列、を含むＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
を含む組成物。 - ａ．
ｉ．配列番号１～１０１から選択したガイド配列、
ｉｉ．配列番号１～１０１から選択した配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、
ｉｉｉ．配列番号１～１０１から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一なガイド配列、
ｉｖ．表１に列挙されているゲノム座標の、１０個の連続するヌクレオチド±１０ヌクレオチドを含む配列、
ｖ．（ｉｖ）の配列の、少なくとも１７個、１８個、１９個もしくは２０個の連続するヌクレオチド、または
ｖｉ．（ｖ）から選択した配列と少なくとも９５％、９０％もしくは８５％同一であるガイド配列、
を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、
を含む組成物。 - さらに、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、デアミナーゼ領域を含む、請求項４４に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、デアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡ誘導型ニッカーゼを含む、請求項４４に記載の組成物。
- さらに、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む、請求項４５または４６に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、前記ＣＩＩＴＡゲノム標的配列で、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変換を行う、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、前記ＣＩＩＴＡゲノム標的配列で、アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への変換を行う、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位の、少なくとも１つのヌクレオチドを含むＣＩＩＴＡゲノム標的配列を標的とする、請求項４１～４７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つのヌクレオチドが、前記スプライスアクセプター部位のスプライス部位境界ヌクレオチド、または前記スプライスドナー部位のスプライス部位境界ヌクレオチドである、請求項５０に記載の組成物。
- 前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドから４ヌクレオチド以下、３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下または１ヌクレオチドであるＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含む、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤を誘導して、スプライス部位境界ヌクレオチドで、ＣＩＩＴＡゲノム標的配列を切断させるようにするガイド配列を含む、請求項４１～５２のいずれか１項に記載の組成物。
- ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて低減または排除されている操作細胞を作製する方法であって、細胞と、請求項４１～５３のいずれか１項に記載の組成物とを接触させることを含む前記方法。
- 操作細胞において、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減する方法であって、細胞と、請求項４１～５３のいずれか１項に記載の組成物とを接触させることを含む前記方法。
- さらに、前記細胞において、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
- さらに、前記細胞において、非修飾細胞と比べて、Ｂ２Ｍタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、請求項５４～５６のいずれか１項に記載の方法。
- さらに、前記細胞において、非修飾細胞と比べて、ＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
- さらに、前記細胞において、非修飾細胞と比べて、ＴＣＲタンパク質の表面発現を低減または排除することを含む、請求項５４～５８のいずれか１項に記載の方法。
- さらに、前記細胞と、外来性核酸とを接触させることを含む、請求項５４～５９のいずれか１項に記載の方法。
- さらに、前記細胞と、ターゲティング受容体、または前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸とを接触させることを含む、請求項６０に記載の方法。
- 外来性核酸、または前記細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、前記外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードする、請求項１～６１のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 外来性核酸、または前記細胞と、外来性核酸とを接触させることを含み、前記外来性核酸が、ＮＫ細胞阻害剤分子をコードし、前記ＮＫ細胞阻害剤分子が、ＮＫ細胞上の抑制性受容体に結合するか、前記ＮＫ細胞阻害剤分子が、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合するか、前記ＮＫ細胞阻害剤分子が、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子であるか、前記ＮＫ細胞阻害剤分子が、ＨＬＡ－Ｅであるか、前記ＮＫ細胞阻害剤分子が、融合タンパク質であるか、または前記ＮＫ細胞阻害剤分子が、ＨＬＡ－ＥとＢ２Ｍとを含む融合タンパク質である、請求項１～６２のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、または前記細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、前記分泌されるポリペプチドが、抗体または抗体断片である、請求項１～６３のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、または前記細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、前記分泌されるポリペプチドが、完全長ＩｇＧ抗体、一本鎖抗体、中和抗体である、請求項１～６４のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、または前記細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、前記分泌されるポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、請求項１～６５のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外来性核酸、または前記細胞と、前記外来性核酸とを接触させることを含み、前記分泌されるポリペプチドが、酵素、サイトカインまたはケモカインである、請求項１～６６に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- ターゲティング受容体をコードする外来性核酸、または前記細胞と、ターゲティング受容体をコードする外来性核酸とを接触させることを含み、前記ターゲティング受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＷＴ１ ＴＣＲまたはＣＡＲである、請求項１～６７いずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法。
- 前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、前記ＣＩＩＴＡ ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤及び／または前記外来性核酸が、前記細胞に、ベクターで供給され、任意に、前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ及び前記ＣＩＩＴＡ ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤が、同じベクターで供給される、請求項１～６８のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６９に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記ベクターが、ＡＡＶである、請求項６９のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記ガイドＲＮＡまたは前記外来性核酸が、前記細胞に、脂質核酸アセンブリー組成物で、任意に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤と同じ脂質核酸アセンブリー組成物で供給される、請求項１～７１のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記脂質核酸アセンブリー組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項７２に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、配列番号８７、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００、配列番号５５、配列番号８０、配列番号４７、配列番号７１、配列番号９１、配列番号８３、配列番号１０１、配列番号８２及び配列番号９６から選択したヌクレオチドを含む、請求項４１～７３いずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法。
- 前記ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、前記少なくとも１つの修飾が、（ｉ）２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、（ｉｉｉ）２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、（ｉｖ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾、（ｖ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾、（ｖｉ）前記ガイドＲＮＡの最初の４ヌクレオチド間のＰＳ結合、（ｖｉｉ）前記ガイドＲＮＡの最後の４ヌクレオチド間のＰＳ結合、（ｖｉｉｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３ヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｘ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３ヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、または（ｉ）～（ｉｘ）のうちの１つ以上の組み合わせを含む、請求項４１～７４のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法。
- 請求項４１～７５のいずれか１項に記載のＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの標的となるゲノム領域内のインデルを含む遺伝子修飾を含む操作細胞または細胞集団。
- 請求項４１～７５のいずれか１項に記載のＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの標的となるゲノム領域内に、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む遺伝子修飾を含む操作細胞または細胞集団。
- がん細胞が発現するポリペプチドに対する特異性を有するＴＣＲを発現させるのに用いるための、請求項１～７７のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法。
- 対象に、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法として投与するのに用いるための、請求項１～７８のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法。
- がん、感染症または自己免疫疾患である対象を治療するのに用いるための、請求項１～７９のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物または方法。
- 前記遺伝子修飾が、インデルを含む、請求項１～８０のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記遺伝子修飾が、ＣからＴへの置換を含む、請求項１～８１のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記遺伝子修飾が、ＡからＧへの置換を含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型である、請求項１～８３のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- 前記細胞がさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂについてホモ接合型であり、ＨＬＡ－Ｃについてホモ接合型であり、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾が、
ａ．ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及び
ｂ．ｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９、
から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１～８４のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。 - 前記細胞がさらに、遺伝子修飾をＨＬＡ－Ａ遺伝子に含み、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３またはｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９から選択したゲノム座標内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１～８５のいずれか１項に記載の操作細胞、細胞集団、医薬組成物または方法。
- ＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現が、非修飾細胞と比べて、低減または排除されている操作細胞を作製する方法であって、
ａ．細胞と、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡとを接触させること（前記ガイドＲＮＡは、配列番号１～１０１から選択したガイド配列を含む）、
ｂ．前記細胞と、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡとを接触させること（前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２００１～２０９５のいずれか１つから選択したガイド配列を含む）、及び
ｃ．任意に、前記細胞と、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合剤をコードする核酸とを接触させること、
を含み、それによって、前記細胞において、非修飾細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除する前記方法。
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