TW202409271A - 用於減少細胞中之ｍｈｃ １類之組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供用於減少細胞中之MHC I類蛋白表現之組成物及方法，其包括對MHC I類進行遺傳修飾以用於例如過繼性細胞轉移療法。
Description
下調MHC I類之能力對於許多
活體內及
離體效用至關重要，例如，在使用同種異體細胞(源自供體)進行移植時，或例如用於活體外產生不會活化T細胞之細胞群體時。具體而言，將同種異體細胞轉移至個體中係細胞治療領域廣泛關注的。由於接受個體之免疫細胞排斥之問題，同種異體細胞之使用受到限制，該等免疫細胞將移植細胞識別為外源並發起攻擊。為避免免疫排斥問題，基於細胞之療法集中於自體方法，該等方法使用個體之自身細胞作為療法之細胞來源，該方法係耗時且昂貴的。
通常，同種異體細胞之免疫排斥係由供體與接受者之間的主要組織相容性複合物(MHC)分子之錯配引起。在人類群體內，MHC分子以各種形式存在，包括例如編碼不同形式之MHC蛋白之任一給定MHC基因之多種遺傳變異體，即對偶基因。MHC分子之主要類別稱為MHC I類及MHC II類。MHC I類分子(例如，人類中之HLA-A、HLA-B及HLA-C)在所有有核細胞上表現且呈遞抗原以活化細胞毒性T細胞(CD8+ T細胞或CTL)。MHC II類分子(例如，人類中之HLA-DP、HLA-DQ及HLA-DR)僅在某些細胞類型上表現(例如，B細胞、樹突細胞及巨噬細胞)且呈遞抗原以活化輔助T細胞(CD4+ T細胞或Th細胞)，該等輔助T細胞進而向B細胞提供信號以產生抗體。
微小差異(例如個體之間的MHC對偶基因之錯配)可導致接受者中之T細胞變得活化。在T細胞發育期間，個體之T細胞譜對其自身MHC分子產生耐受性，但識別另一個體之MHC分子之T細胞可持續存在於循環中且稱為同種異體反應性T細胞。同種異體反應性T細胞可變得活化，例如藉由在體內表現MHC分子之另一個體細胞之存在，引起 例如移植物抗宿主病及移植排斥。
儘管使供體與接受者之間的HLA類型完全匹配理論上可作為減少移植排斥之方式，但鑑於群體中HLA對偶基因之多樣性，此一方法對於完全匹配例如10個對偶基因中之10個(
即，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1中之每一者皆有2個對偶基因)在邏輯上及實踐上具有挑戰性。
用於降低同種異體細胞對排斥之易感性之方法及組成物受到關注，包括例如減少細胞之MHC蛋白表現以避免接受T細胞反應。在實踐中，對同種異體細胞進行遺傳修飾以移植至個體中之能力受到需要多個基因編輯以減少所有MHC蛋白表現、同時避免其他有害接受者免疫反應的限制。舉例而言，儘管清除MHC I類蛋白之策略可能減少CTL之活化，但表面缺乏MHC I類之細胞易於被免疫系統之自然殺手(NK)細胞溶解，此乃因NK細胞活化係由MHC I類特異性抑制受體調控。此外，儘管若干組已研究不同MHC I類組分之NK保護效應，但在該領域中仍存在一些不一致。參見例如Keystone 2022 presentation 「Multiplex Base Editing Mitigates CAR-T Cell Allorejection」，Beam Therapeutics - Workshop: Therapeutic Applications session, 2022年4月29日(「Keystone Presentation」)。舉例而言，Keystone Presentation得出結論，保留HLA-A而非HLA-B或HLA-C提供活體外針對NK殺傷之保護，而其他組已顯示，HLA-C在抑制NK活性方面至關重要(Xu等人，2019, Cell Stem Cell 24, 566-578)。另外，早期研究表明，HLA-E及HLA-G提供一些但非完全保護。因此，安全地減少或消除MHC I類之表現已證實具有挑戰性。
出於包括低編輯效率及低細胞存活率在內之原因，清除MHC II類分子之基因編輯策略亦已證實係困難的，尤其在某些細胞類型中，此阻止作為細胞療法之實際應用。
因此，業內需要改良之方法及組成物來修飾同種異體細胞以克服接受者免疫排斥之問題及與產生更安全之移植細胞所需之多種遺傳修飾相關之技術困難。
本揭示案提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其中該細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的，或其中該細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現且係HLA-C同型接合的。因此，本文所揭示之經工程改造之人類細胞提供針對同種異體細胞轉移及MHC I類相容性問題之「部分匹配」方法。使用具有減少或消除的HLA-B表現且係HLA-A及HLA-C同型接合、或具有減少或消除的HLA-A及HLA-B表現且係HLA-C同型接合之細胞限制提供覆蓋群體中之大多數接受者之療法所需的供體數量，此乃因所揭示之部分匹配方法僅需要一個匹配之HLA-A對偶基因(而非兩個)及僅一個HLA-C對偶基因(而非兩個)，或僅需要一個匹配之HLA-C對偶基因(而非兩個)。令人驚奇的是，本文所揭示之相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的僅HLA-B蛋白表面表現或HLA-A及HLA-B蛋白表面表現的經工程改造之人類細胞展示持久性，且防止NK介導之排斥，尤其是與具有減少或消除的B2M表現之經工程改造細胞相比而言。本揭示案提供用於產生該等經工程改造之人類細胞之方法及組成物，該等經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的僅HLA-B蛋白表面表現或HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的或僅係HLA-C同型接合的。在一些實施例中，本揭示案提供經工程改造之人類細胞，以及產生經工程改造之人類細胞之方法及組成物，其中該細胞進一步具有細胞表面上減少或消除的MHC II類蛋白表現，例如，其中該細胞具有CIITA基因之遺傳修飾。在一些實施例中，本揭示案提供細胞之進一步工程改造，包括減少或消除內源T細胞受體蛋白(例如TRAC、TRBC)之表現，並引入外源核酸，例如編碼在細胞表面上表現之多肽或細胞分泌之多肽的外源核酸。因此，本揭示案由此提供出於多種期望過繼性細胞療法目的對人類細胞進行遺傳工程改造之靈活平台。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。亦提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6:31354623-31357108或31354497- 31357157，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含(i) HLA-A基因之遺傳修飾，其中HLA-A基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854-chr6:29942913及chr6:29943518-chr6:29943619，及(ii) HLA-B基因之遺傳修飾，其中HLA-B基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6:31354623-31357108或31354497-31357157，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355349-31355369；chr6:31355348-31355368；或chr6:31355145-31355165。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355414-31355434。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368、chr6:31355349-31355369、chr6:31355192-31355212、chr6:31355347-31355367、chr6:31355340-31355360、chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355349-31355369或chr6:31355348-31355368。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355192-31355212或chr6:31355347-31355367。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；或chr6:31355340-31355360。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；chr6:31355469-31355493；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355361-31355385；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355356-31355380；chr6:31355366-31355390；chr6:31355417-31355441；chr6:31357078-31357102；chr6:31355460-31355484；chr6:31355415-31355439；chr6:31355166-31355190；chr6:31355378-31355402；chr6:31355401-31355425；chr6:31356262-31356286；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；或chr6:31356426-31356450。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；chr6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6: 31356386-31356410。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355182-31355202；chr6:31355349-31355369；chr6:31355348-31355368；或chr6:31355145-31355165。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355414-31355434。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368、chr6:31355349-31355369、chr6:31355192-31355212、chr6:31355347-31355367、chr6:31355340-31355360、chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355349-31355369或chr6:31355348-31355368。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355192-31355212或chr6:31355347-31355367。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；或chr6:31355340-31355360。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：
chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；chr6:31355469-31355493；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355361-31355385；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355356-31355380；chr6:31355366-31355390；chr6:31355417-31355441；chr6:31357078-31357102；chr6:31355460-31355484；chr6:31355415-31355439；chr6:31355166-31355190；chr6:31355378-31355402；chr6:31355401-31355425；chr6:31356262-31356286；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；或chr6:31356426-31356450。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；chr6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
本文提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6: 31356386-31356410。
本文提供製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，該方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含(a) HLA-B指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
本文提供製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞係HLA-C同型接合的，該方法包括使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含(a) HLA-A指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 301-590之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表4、表5B或表6中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列；或與表5A或表7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b)第一RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；及使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含(a) HLA-B指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
本文提供相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中之HLA-B蛋白之表面表現的方法，其包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含：(a) HLA-B指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
本文提供相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中之HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現的方法，其包括使細胞與組成物接觸，包括：使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含(a) HLA-A指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 301-590之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表4、表5B或表6中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列；或與表5A或表7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b)第一RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；及使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含(a) HLA-B指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
本文提供向有需要之接受個體投與經工程改造細胞之方法，該方法包括：(a)確定接受個體之HLA-A及HLA-C對偶基因；(b)選擇如前述實施例中任一者之經工程改造細胞或細胞群體，或藉由如前述實施例中任一者之方法產生之經工程改造細胞或細胞群體，其中經工程改造細胞包含與接受個體相同之HLA-A或HLA-C對偶基因中之至少一者；(c)向接受個體投與經選擇之經工程改造細胞。
本文提供向有需要之接受個體投與經工程改造細胞之方法，該方法包括(a)確定接受個體之HLA-C對偶基因；(b)選擇如前述實施例中任一者之經工程改造細胞或細胞群體，或藉由如前述實施例中任一者之方法產生之經工程改造細胞或細胞群體，其中經工程改造細胞包含與接受個體相同之HLA-C對偶基因中之至少一者；(c)向接受個體投與經選擇之經工程改造細胞。
在申請專利范圍及圖式通篇中提供並闡述其他實施例。
相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 USC 119(e)主張於2022年6月16日提出申請之美國臨時申請案第63/352,991號及於2023年4月4日提出申請之美國臨時申請案第63/494,208號的權益，該等臨時申請案中每一者皆以全文引用方式併入本文中。 電子序列表之引用
本申請案含有序列表，其已以XML檔案格式以電子方式提交且以全文引用方式併入本文中。該XML檔案創建於2023年6月13日，命名為「01155-0054-00PCT_SL.xml」，且大小為14,122,813個位元組。
本揭示案提供可用於例如過繼性細胞轉移(ACT)療法之經工程改造之人類細胞，以及對人類細胞進行遺傳修飾以製造經工程改造之人類細胞的方法及組成物。本揭示案提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。另外，本揭示案提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其中該細胞係HLA-C同型接合的。因此，本文所揭示之經工程改造之人類細胞提供針對與同種異體細胞轉移相關之困難之「部分匹配」解決方案。
在一些實施例中，本揭示案提供因HLA-B基因之遺傳修飾而具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其中該細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。在一些實施例中，本揭示案提供相對於未經修飾之細胞減少或消除HLA-B蛋白表現之組成物及方法，以及降低細胞對免疫排斥之易感性之組成物及方法。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞不易被NK細胞溶解，其係使用減少或消除MHC I類蛋白表現之其他方法觀察到之問題。在一些實施例中，該等方法及組成物包括藉由用基因編輯系統對HLA-B進行遺傳修飾、並藉由遺傳修飾將編碼靶向受體或其他多肽(在細胞表面上表現或分泌)之外源核酸插入細胞中來減少或消除HLA-B蛋白之表面表現。藉由本文所揭示之方法產生之經工程改造之細胞組成物具有期望性質，包括例如減少或消除的HLA-B表現、降低的
活體外及
活體內免疫原性、增加的存活率及增加的與更大移植個體之遺傳相容性。
在一些實施例中，本揭示案提供因HLA-A及HLA-B基因之遺傳修飾而具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其中該細胞係HLA-C同型接合的。在一些實施例中，本揭示案提供相對於未經修飾之細胞減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白表現之組成物及方法，以及降低細胞對免疫排斥之易感性之組成物及方法。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞不易被NK細胞溶解，其係使用減少或消除MHC I類蛋白表現之其他方法觀察到之問題。在一些實施例中，該等方法及組成物包括藉由用基因編輯系統對HLA-A及HLA-B進行遺傳修飾、並藉由遺傳修飾將編碼靶向受體或其他多肽(在細胞表面上表現或分泌)之外源核酸插入細胞中來減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現。藉由本文所揭示之方法產生之經工程改造之細胞組成物具有期望性質，包括例如減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現、降低的
活體外及
活體內免疫原性、增加的存活率及增加的與更大移植個體之遺傳相容性。
術語「約」或「大約」意指如熟習此項技術者確定之特定值之可接受之誤差，其部分地取決於量測或確定該值之方式，或不會實質上影響所述標的物性質之變化程度，或在此項技術中可接受之公差內，例如在10%、5%、2%或1%內。因此，除非指示相反之情形，否則以下說明書及所附申請專利范圍中所述之數值參數係近似值，其可端視尋求獲得之期望性質而變化。至少且並不試圖將等效準則之應用限於申請專利范圍之范圍，每一數值參數應至少根據所報導有效數位之數量且藉由應用普通捨入技術來解釋。
本文提供以下經編號之實施例：
實施例1係相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-A基因之遺傳修飾及HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
實施例2係相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-A基因之遺傳修飾及HLA-B基因之遺傳修飾，其中(i) HLA-A基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:29942854-chr6:29942913及chr6:29943518-chr6: 29943619；及(b) chr6:29942540-29945459；(ii) HLA-B基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6: 31354497-31357157；其中該細胞係HLA-C同型接合的。
實施例3係相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
實施例4係相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6: 31354497-31357157；其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
實施例5係如實施例1至4中任一者之經工程改造之人類細胞，其中該細胞具有減少或消除的至少一種HLA-B對偶基因表現，該至少一種HLA-B對偶基因選自：HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B40、HLA-B44、HLA-B15、HLA-B14、HLA-B18及HLA-B51。
實施例6係如實施例1、2或5中任一者之經工程改造之人類細胞，其中該細胞具有減少或消除的至少一種HLA-A對偶基因表現，該至少一種HLA-A對偶基因選自：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A29、HLA-A26、HLA-A33及HLA-A24。
實施例7係如實施例1至6中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355596或(b) chr6:31355203-31356461。
實施例8係如實施例1至7中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200;chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
實施例9係如實施例1至8中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
實施例10係如實施例1至9中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355349-31355369；chr6:31355348-31355368；或chr6:31355145-31355165。
實施例11係如實施例1至10中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355414-31355434。
實施例12係如實施例1至11中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
實施例13係如實施例1至12中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368、chr6:31355347-31355367、chr6:31355349-31355369、chr6:31355192-31355212、chr6:31355340-31355360、chr6:31355409-31355429。
實施例14係如實施例1至13中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(i) chr6:31355349-31355369或chr6:31355348-31355368；(ii) chr6:31355192-31355212或chr6:31355347-31355367；(iii) chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355409-31355429；或(iv) chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；或chr6:31355340-31355360。
實施例15係如實施例1至14中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
實施例16係如實施例1至15中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355361-31355385；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355356-31355380；chr6:31355366-31355390；chr6:31355417-31355441；chr6:31357078-31357102；chr6:31355460-31355484；chr6:31355415-31355439；chr6:31355166-31355190；chr6:31355378-31355402；chr6:31355401-31355425；chr6:31356262-31356286；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
實施例17係如實施例1至16中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；ch6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；或chr6:31356426-31356450。
實施例18係如實施例1至17中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；ch6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。
實施例19係如實施例1至18中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。
實施例20係如實施例1至19中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6:31356386-31356410。
實施例21係如實施例1至2及5至20中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
實施例22係如實施例1至2及5至21中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942864-29942884；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29942891-29942915；chr6:29944471-29944495；chr6:29944470-29944494。
實施例23係如實施例1至2及5至22中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633。
實施例24係相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或chr6:31355347-31355367；chr6:31355182-31355202；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
實施例25係相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含(i) HLA-A基因之遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；chr6:29944026-29944046；chr6:29934330-29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140-29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858-29943878、chr6:29944478-29944498及chr6:29944850-29944870；或(b) chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；及chr6:29944470-29944494；及(ii) HLA-B基因之遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或chr6:31355347-31355367；chr6:31355182-31355202；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；及chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
實施例26係如實施例24或25中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6:31355390-31355414。
實施例27係如實施例24至26中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A之遺傳修飾或HLA-B之遺傳修飾包含基因體坐標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個鄰接核苷酸，或其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。
實施例28係如實施例24至27中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A之遺傳修飾或HLA-B之遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6個、7個、8個、9個或10個鄰接核苷酸。
實施例29係如實施例24至28中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A之遺傳修飾或HLA-B之遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
實施例30係如實施例1至29中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355348-31355368；或chr6:31355347-31355367；chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200;chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429。
實施例31係如實施例1至30中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
實施例32係如實施例1至2、5至23及25至31中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-A基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；chr6:29944026-29944046；chr6:29934330-29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140-29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858-29943878及chr6:29944478-29944498、chr6:29944850-29944870。
實施例33係如實施例1、2、5至23及25至32中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-A基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；及chr6:29944470-29944494。
實施例34係如實施例1、2、5至23及25至33中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-A基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915或chr6:29942609-29942633。
實施例35係如實施例30至34中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A基因體靶序列或HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。
實施例36係如實施例30至35中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A基因體靶序列或HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
實施例37係如實施例30至36中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A基因體靶序列或HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸。
實施例38係如實施例30至36中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-A基因體靶序列或HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個鄰接核苷酸。
實施例39係如實施例1至38中任一者之經工程改造細胞，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
實施例40係如實施例1至39中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*08:01；HLA-C*03:02；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:10；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:04；HLA-C*04:01；HLA-C*17:01；HLA-C*01:02；及HLA-C*02:02。
實施例41係如實施例1至40中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-C對偶基因係HLA-C*07:02。
實施例42係如實施例1至40中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-C對偶基因係HLA-C*07:01。
實施例43係如實施例1至40中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-C對偶基因係HLA-C*05:01。
實施例44係如實施例1至40中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-C對偶基因係HLA-C*04:01。
實施例45係如實施例1至40中任一者之經工程改造細胞，其中HLA-C對偶基因係HLA-C*06:02。
實施例46係如實施例3至24及26至45中任一者之經工程改造細胞，其中經工程改造細胞係HLA-A同型接合的，HLA-A對偶基因選自以下HLA-A對偶基因中之任一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*11:01；HLA-A*26:01；HLA-A*68:01；HLA-A*29:02；HLA-A*31:01；HLA-A*32:01；HLA-A*30:02；HLA-A*25:01；HLA-A*33:01；HLA-A*02:02；HLA-A*74:01；HLA-A*02:02；HLA-A*29:01；HLA-A*02:03；HLA-A*02:05；HLA-A*24:07；HLA-A*11:02；HLA-A*36:01；HLA-A*02:22；HLA-A*34:02；HLA-A*01:03；HLA-A*24:02；HLA-A*02:07；HLA-A*23:01；HLA-A*30:01；HLA-A*33:03；HLA-A*02:06；HLA-A*34:02；及HLA-A*68:02。
實施例47係如實施例3至24及26至45中任一者之經工程改造細胞，其中經工程改造細胞係HLA-A同型接合的且其中經工程改造細胞係HLA-C同型接合的，其中HLA-A對偶基因選自以下HLA-A對偶基因中之任一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*11:01；HLA-A*26:01；HLA-A*68:01；HLA-A*29:02；HLA-A*31:01；HLA-A*32:01；HLA-A*30:02；HLA-A*25:01；HLA-A*33:01；HLA-A*02:02；HLA-A*74:01；HLA-A*02:02；HLA-A*29:01；HLA-A*02:03；HLA-A*02:05；HLA-A*24:07；HLA-A*11:02；HLA-A*36:01；HLA-A*02:22；HLA-A*34:02；HLA-A*01:03；HLA-A*24:02；HLA-A*02:07；HLA-A*23:01；HLA-A*30:01；HLA-A*33:03；HLA-A*02:06；HLA-A*34:02；及HLA-A*68:02；且HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*08:01；HLA-C*03:02；HLA-C*16:01；HLA-C*15:02；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:10；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*17:01；HLA-C*01:02；及HLA-C*02:02。
實施例48係如實施例1至47中任一者之經工程改造細胞，其中該細胞具有減少或消除的MHC II類蛋白表面表現。
實施例49係如實施例1至48中任一者之經工程改造細胞，其中該細胞具有選自以下之基因之遺傳修飾：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
實施例50係如實施例1至49中任一者之經工程改造細胞，其中該細胞具有CIITA基因之遺傳修飾。
實施例51係如實施例1至50中任一者之經工程改造細胞，其中該細胞具有減少或消除的TRAC蛋白表面表現。
實施例52係如實施例1至51中任一者之經工程改造細胞，其中該細胞具有減少或消除的TRBC蛋白表面表現。
實施例53係如實施例1至52中任一者之經工程改造細胞，其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個鄰接核苷酸，或其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。
實施例54係如實施例1至53中任一者之經工程改造細胞，其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6個、7個、8個、9個或10個鄰接核苷酸。
實施例55係如實施例1至54中任一者之經工程改造細胞，其中遺傳修飾包含插入/缺失。
實施例56係如實施例1至55中任一者之經工程改造細胞，其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
實施例57係醫藥組成物，其包含如實施例1至56中任一者之經工程改造細胞。
實施例58係細胞群體，其包含如實施例1至57中任一者之經工程改造細胞。
實施例59係醫藥組成物，其包含如實施例58之細胞群體。
實施例60係如實施例58之群體或如實施例59之醫藥組成物，其中細胞群體係至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% HLA-A陰性或HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。
實施例61係如實施例58至60中任一者之群體或醫藥組成物，其中至少65%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
實施例62係如實施例58至61中任一者之群體或醫藥組成物，其中細胞群體係至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% CIITA陰性，如藉由流式細胞術所量測。
實施例63係如實施例58至62中任一者之群體或醫藥組成物，其中細胞群體係至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%內源TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。
實施例64係向有需要之個體投與如實施例1至63中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物的方法。
實施例65係向個體投與如實施例1至63中任一者之經工程改造細胞、細胞群體或醫藥組成物作為過繼性細胞轉移(ACT)療法的方法。
實施例66係治療疾病或病症之方法，其包括向有需要之個體投與如實施例1至63中任一者之經工程改造細胞、細胞群體或醫藥組成物。
實施例67係組成物，其包含HLA-B指導RNA，其中HLA-B指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91、101-164、167-176、178-185之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；iii.與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；iv.結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
實施例68係組成物，其包含HLA-B指導RNA及HLA-A指導RNA，其中HLA-B指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；iii.與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；iv.結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列，且其中HLA-A指導RNA包含：i.選自SEQ ID No: 576、571、301-570、572-575、577-590之指導序列；或ii.選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或iii.與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或iv.結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表4-7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
實施例69係製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，該方法包括：使細胞與組成物接觸，該組成物包含(i) HLA-B指導RNA及(ii)視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中HLA-B指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91、101-164、167-176、178-185之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；iii.與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；iv.結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
實施例70係相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中之HLA-B蛋白之表面表現的方法，其包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含(i) HLA-B指導RNA及(ii)視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中HLA-B指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；iii.與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；iv.結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
實施例71係製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞係HLA-C同型接合的，該方法包括：(a)使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含HLA-B指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中HLA-B指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列；或ii.選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或iii.與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；iv.結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；及(b)使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含HLA-A指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中HLA-A指導RNA包含：i.選自SEQ ID No: 576、571、301-570、572-575、577-590之指導序列；或ii.選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或iii.與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或iv.結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或與表4-7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
實施例72係相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中之HLA-A蛋白及HLA-B蛋白之表面表現的方法，其包括(a)使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含HLA-B指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中HLA-B指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；iii.與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；iv.結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；及(b)使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含HLA-A指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中HLA-A指導RNA包含：i.選自SEQ ID No: 576、571、301-570、572-575、577-590之指導序列；或ii.選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或iii.與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或iv.結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或v.與表4-7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
實施例73係如實施例1至72中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係SpyCas9，且HLA-B指導RNA包含：(i)選自SEQ ID NO: 13、74、1-12、14-73、75-91之指導序列；或(ii)為選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iii)為選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸的指導序列；或(iv)結合包含表2中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例74係如實施例1至72中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係NmeCas9，且HLA-B指導RNA包含：(i)選自SEQ ID NO: 165、166、177、101-164、167-176及178-185之指導序列；或(ii)為選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iii)為選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iv)結合包含表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列。
實施例75係如實施例1至72中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係NmeCas9，且HLA-B指導RNA包含：(i)選自SEQ ID NO: 165、166、163、164、169及177之指導序列；或(ii)為選自SEQ ID NO: 165、166、163、164及177之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iii)與選自SEQ ID NO: 165、166、163、164及177之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列。
實施例76係如實施例67至75中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾。
實施例77係如實施例67至76中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，其中至少一種修飾包括2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。
實施例78係如實施例67至77中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
實施例79係如實施例67至78中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸。
實施例80係如實施例67至79中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含指導RNA之5’端之前五個核苷酸中之一或多者處之修飾。
實施例81係如實施例67至80中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含指導RNA之3’端之後五個核苷酸中之一或多者處之修飾。
實施例82係如實施例67至81中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含指導RNA之前四個核苷酸之間的PS鍵。
實施例83係如實施例67至82中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含指導RNA之後四個核苷酸之間的PS鍵。
實施例84係如實施例67至83中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含指導RNA之5’端之前三個核苷酸處的2’-O-Me修飾之核苷酸。
實施例85係如實施例67至84中任一者之組成物或方法，其中HLA-B指導RNA或HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含指導RNA之3’端之後三個核苷酸處的2’-O-Me修飾之核苷酸。
實施例86係如實施例67至85中任一者之方法，其進一步包括相對於未經修飾之細胞減少或消除該細胞中之MHC II類蛋白之表面表現，例如藉由使細胞與靶向選自以下之基因之基因編輯系統接觸來達成：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
實施例87係如實施例67至86中任一者之方法，其進一步包括使細胞與CIITA指導RNA接觸。
實施例88係如實施例67至87中任一者之方法，其進一步包括相對於未經修飾之細胞減少或消除該細胞中之TCR蛋白之表面表現。
實施例89係如實施例67至88中任一者之方法，其進一步包括使細胞與外源核酸接觸。
實施例90係如實施例89之方法，其進一步包括使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸。
實施例91係如實施例89之方法，其進一步包括使細胞與編碼細胞分泌之多肽之外源核酸接觸。
實施例92係如實施例89之方法，其進一步包括使細胞與DNA依賴性蛋白激酶抑制劑(DNAPKi)接觸。
實施例93係如實施例92之方法，其中DNAPKi係化合物1。
實施例94係如實施例1至93中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係同種異體細胞。
實施例95係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係原代細胞。
實施例96係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係CD4+ T細胞。
實施例97係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係CD8+ T細胞。
實施例98係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係記憶T細胞。
實施例99係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係B細胞。
實施例100係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係血漿B細胞。
實施例101係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係記憶B細胞。
實施例102係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係自然殺手(NK)細胞。
實施例103係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係巨噬細胞。
實施例104係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係幹細胞。
實施例105係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係多能幹細胞(PSC)。
實施例106係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係造血幹細胞(HSC)。
實施例107係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係誘導多能幹細胞(iPSC)。
實施例108係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係間葉幹細胞(MSC)。
實施例109係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係神經幹細胞(NSC)。
實施例110係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係角膜緣幹細胞(LSC)。
實施例111係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係前驅細胞，例如內皮前驅細胞或神經前驅細胞。
實施例112係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係組織特異性原代細胞。
實施例113係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞選自：軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。
實施例114係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係活化細胞。
實施例115係如實施例1至94中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係非活化細胞。
實施例116係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽係抗體或抗體片段。
實施例117係如實施例1至116中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽係全長IgG抗體。
實施例118係如實施例1至116中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽係單鏈抗體。
實施例119係如實施例1至118中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽係中和抗體。
實施例120係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽係酶。
實施例121係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽係細胞介素。
實施例122係如實施例1至121中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽係融合蛋白。
實施例123係如實施例1至122中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼細胞分泌之多肽之外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中分泌多肽包含可溶性受體。
實施例124係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體係T細胞受體(TCR)。
實施例125係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體係經遺傳修飾之TCR。
實施例126係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體係WT1 TCR。
實施例127係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體係CAR。
實施例128係如實施例1至115中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體係通用CAR。
實施例129係如實施例1至127中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體係抗CD30 CAR。
實施例130係如實施例1至129中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體係增殖誘導配位體(APRIL)。
實施例131係如實施例1至129中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中細胞係使用基因編輯系統來工程改造。
實施例132係如實施例131之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中基因編輯系統包含轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)。
實施例133係如實施例131之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中基因編輯系統包含鋅指核酸酶。
實施例134係如實施例131之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
實施例135係如實施例67至134中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。
實施例136係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌(S. pyogenes) Cas9。
實施例137係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎雙球菌(N. meningitidis) Cas9，視情況地Nme2Cas9。
實施例138係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係嗜熱鏈球菌(S. thermophilus) Cas9。
實施例139係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係金黃色葡萄球菌(S. aureus) Cas9。
實施例140係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係新澤西弗朗西斯菌(F. novicida)之Cpf1。
實施例141係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係胺基酸球菌屬物種(Acidaminococcus sp)之Cpf1。
實施例142係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係毛螺菌科細菌(Lachnospiraceae bacterium) ND2006之Cpf1。
實施例143係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係Cas12a。
實施例144係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係CasX。
實施例145係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係Mad7核酸酶。
實施例146係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係ARCUS核酸酶。
實施例147係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係A至G鹼基編輯子。
實施例148係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑係C至T鹼基編輯子。
實施例149係如實施例67至135中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑或由核酸編碼之RNA指導之DNA結合劑包含胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶。
實施例150係如實施例1至149中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係由包含C至T鹼基編輯子或A至G鹼基編輯子之鹼基編輯系統工程改造。
實施例151係如前述實施例中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中鹼基編輯系統包含含有胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶之多肽、或編碼該多肽之核酸。
實施例152係如實施例149或151之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中胞苷去胺酶包含APOBEC3A去胺酶(A3A)。
實施例153係如實施例151之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中多肽包含與SEQ ID NO: 811或976至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
實施例154係如實施例151之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中編碼多肽之核酸包含與SEQ ID NO: 804或SEQ ID NO: 822至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之序列。
實施例155係如實施例148至154中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中鹼基編輯系統在不同於包含胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶之多肽之多肽中進一步包括尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)。
實施例156係如實施例148至152之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中包含胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶之多肽進一步包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)。
實施例157係如實施例156之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中多肽包含與SEQ ID NO: 977、978、979及980中之任一者至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
實施例158係如實施例67至157中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA或HLA-B指導RNA在載體中提供至細胞。
實施例159係如實施例67至158中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中RNA指導之DNA結合劑在載體中、視情況地在與HLA-A指導RNA或HLA-B指導RNA相同之載體中提供至細胞。
實施例160係如實施例87至159中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中外源核酸在載體中提供至細胞。
實施例161係如實施例158至160中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中載體係病毒載體。
實施例162係如實施例158至160中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中載體係非病毒載體。
實施例163係如實施例158至160中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中載體係慢病毒載體。
實施例164係如實施例158至160中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中載體係反轉錄病毒載體。
實施例165係如實施例158至160中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中載體係AAV。
實施例166係如實施例67至165中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中指導RNA在脂質奈米粒子(LNP)中提供至細胞。
實施例167係如實施例67至166中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中指導RNA在與RNA指導之DNA結合劑相同之脂質奈米粒子(LNP)中提供至細胞。
實施例168係如實施例87至167中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中外源核酸在脂質奈米粒子(LNP)中提供至細胞。
實施例169係如實施例87至168中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中外源核酸整合至細胞之基因體中。
實施例170係如實施例87至169中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中外源核酸藉由同源重組(HR)整合至細胞之基因體中。
實施例171係如實施例87至170中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中外源核酸整合至細胞基因體中之安全港基因座中。
實施例172係如實施例87至171中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中外源核酸藉由非同源末端接合(NHEJ)整合至細胞之基因中。
實施例173係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 3、13、18、32、36、39、48-56、58、64-71、73-74、80-82、86及88-91之指導序列。
實施例174係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 3、13、36、39、49-56、64-71、74、80-82、88及90-91之指導序列。
實施例175係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 13、39、49、52、65、74、82及91之指導序列。
實施例176係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 3、39及49-52之指導序列。
實施例177係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 3、36、39、49、50、51及52之指導序列。
實施例178係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 39、49及52之指導序列。
實施例179係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 49、52-54、55、56、64、65、67-71、73-74、80-82及90之指導序列。
實施例180係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 49、51、74、81及82之指導序列。
實施例181係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、107、114、117、118、125-129、137、138、141、143、144、145、159、160、163、164、165、166、169、171、172、173、176、177、178、179及180之指導序列。
實施例182係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 65及74之指導序列。
實施例183係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 49、52-54、56、64-65、67-71、73-74、80-82、88及90-91之指導序列。
實施例184係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 74、82及91之指導序列。
實施例185係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 3、13、18、32、36、39、48-56、58、64-71、73-74、80-82、86及88-90之指導序列。
實施例186係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 3。
實施例187係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 13。
實施例188係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 18。
實施例189係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 32。
實施例190係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 36。
實施例191係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 39。
實施例192係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 48。
實施例193係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 49。
實施例194係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 50。
實施例195係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 51。
實施例196係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 52。
實施例197係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 53。
實施例198係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 54。
實施例199係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 55。
實施例200係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 56。
實施例201係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 58。
實施例202係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 64。
實施例203係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 65。
實施例204係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 66。
實施例205係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 67。
實施例206係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 68。
實施例207係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 69。
實施例208係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 70。
實施例209係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 71。
實施例210係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 73。
實施例211係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 74。
實施例212係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 80。
實施例213係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 81。
實施例214係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 82。
實施例215係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 86。
實施例216係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 88。
實施例217係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 89。
實施例218係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 90。
實施例219係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 91。
實施例220係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、107、114、117、118、125-129、133、137、138、141、143、144、145、159、160、163、164、165、166、169、171、172、173、176、177、178、179及180之指導序列。
實施例221係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、117、118、125-128、133、137-138、141、143-144、159、163、164、165、166、169、171、173、177、178及180之指導序列。
實施例222係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、106、114、117-118、125-128、133、137-138、141、143-144、159、163、164、165、166、169、171、173、177、178及180之指導序列。
實施例223係如實施例67至181172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、117-118、125-128、137-138、144、159、163、164、165、166、169、177、178及180之指導序列。
實施例224係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、117、127、137-138、163、164、165、166、169及177之指導序列。
實施例225係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、107、117、125-129、137、138、141、143、144、145、159、160、163、164、165、166、169、171、172、173、176、177、178、179及180之指導序列。
實施例226係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含含有SEQ ID NO: 163-166、169及177中之任一者之序列之指導序列。
實施例227係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 101。
實施例228係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 103。
實施例229係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 106。
實施例230係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 107。
實施例231係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 117。
實施例232係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 125。
實施例233係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 126。
實施例234係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 127。
實施例235係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 128。
實施例236係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 129。
實施例237係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 137。
實施例238係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 138。
實施例239係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 141。
實施例240係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 143。
實施例241係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 144。
實施例242係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 145。
實施例243係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 159。
實施例244係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 160。
實施例245係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 163。
實施例246係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 164。
實施例247係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 165。
實施例248係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 166。
實施例249係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 169。
實施例250係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 171。
實施例251係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 172。
實施例252係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 173。
實施例253係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 176。
實施例254係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 177。
實施例255係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 178。
實施例256係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 179。
實施例257係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 180。
實施例258係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2186-2191中之任一者之序列。
實施例259係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2186。
實施例260係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2187。
實施例261係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2188。
實施例262係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2189。
實施例263係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2190。
實施例264係如實施例67至172中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2191。
實施例265係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 313或314。
實施例266係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 314。
實施例267係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 315。
實施例268係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 316。
實施例269係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 317。
實施例270係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 318。
實施例271係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 326。
實施例272係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 337。
實施例273係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 338。
實施例274係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 339。
實施例275係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 341。
實施例276係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 343。
實施例277係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 345。
實施例278係如實施例67至264中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 362。
實施例279係如實施例67至257中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 576。
實施例280係如實施例67至257中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 571。
實施例281係如實施例1至280中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於表現對癌細胞表現之多肽具有特異性之TCR。
實施例282係如實施例1至281中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於作為過繼性細胞轉移(ACT)療法投與個體。
實施例283係如實施例1至282中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於治療患有癌症之個體。
實施例284係如實施例1至283中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於治療患有傳染病之個體。
實施例285係如實施例1至284中任一者之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於治療患有自體免疫疾病之個體。
實施例286係細胞庫，其包含：(a)如實施例1至56、73至75、94至285中任一者之經工程改造細胞，或藉由如實施例69至285中任一者之方法產生之經工程改造細胞；及(b)包含記載細胞庫中之供體細胞之HLA-A及HLA-C對偶基因之資訊的目錄。
實施例287係如實施例286之細胞庫，其中細胞庫包含至少3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個或40個供體細胞，與細胞庫中之其他供體細胞相比，該等供體細胞具有HLA-A及HLA-C對偶基因之獨特組合。
實施例288係向有需要之接受個體投與經工程改造細胞之方法，該方法包括：(a)確定接受個體之HLA-A及HLA-C對偶基因；(b)選擇如實施例1至56、58、60至63、73至75、94至285之經工程改造細胞或細胞群體，或藉由如實施例69至285中任一者之方法產生之經工程改造細胞或細胞群體，其中經工程改造細胞包含與接受個體相同之HLA-A或HLA-C對偶基因中之至少一者；(c)向接受個體投與經選擇之經工程改造細胞。
實施例289係如實施例288之方法，其中個體具有經工程改造細胞之HLA-A及HLA-C對偶基因。
實施例290係如實施例1至285中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其用於向部分匹配之個體投與過繼性細胞轉移(ACT)療法，其中部分匹配之個體具有經工程改造細胞或細胞群體之HLA-A及HLA-C對偶基因。
實施例291係如實施例64至290中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中經工程改造細胞或細胞群體包含與個體共享之HLA-A及HLA-C對偶基因。
實施例292係如實施例64至290中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中經工程改造細胞或細胞群體之HLA-A及HLA-C對偶基因係由匹配個體之一或多個HLA-A及HLA-C對偶基因之對偶基因組成。
實施例293係如前述實施例64至290中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中經工程改造細胞或細胞群體之HLA-C對偶基因係由匹配個體之一或兩個HLA-C對偶基因之對偶基因組成。
實施例294係細胞庫，其包含：(a)如實施例1至56、73至75、94至285中任一者之經工程改造細胞，或藉由如實施例69至285中任一者之方法產生之經工程改造細胞；及(b)包含記載細胞庫中之供體細胞之HLA-C對偶基因之資訊的目錄。
實施例295係向有需要之接受個體投與經工程改造細胞之方法，該方法包括：(a)確定接受個體之HLA-C對偶基因；(b)選擇如實施例1至56、58、60至63、73至75、94至285中任一者之經工程改造細胞或細胞群體，或藉由如實施例69至285中任一者之方法產生之經工程改造細胞或細胞群體，其中經工程改造細胞對於接受個體之HLA-C對偶基因中之一者係同型接合的；(c)向接受個體投與經選擇之經工程改造細胞。
實施例296係如實施例295之方法，其中個體對於經工程改造細胞之HLA-C對偶基因係同型接合或異型接合的。
實施例297係如實施例1至285中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其用於向部分匹配之個體投與過繼性細胞轉移(ACT)療法，其中部分匹配之個體對於經工程改造細胞或細胞群體之HLA-C對偶基因係同型接合或異型接合的。
實施例298係如實施例64至297中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中經工程改造細胞或細胞群體包含與個體共享之HLA-C對偶基因。
實施例299係如實施例64至298中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中經工程改造細胞或細胞群體之HLA-C對偶基因係由匹配個體之一或多個HLA-C對偶基因之對偶基因組成。
實施例300係如實施例64至299中任一者之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中經工程改造細胞或細胞群體之HLA-C對偶基因係由匹配個體之一或兩個HLA-C對偶基因之對偶基因組成。
A. 定義
除非另有說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
如本文所用，術語「或其組合」係指術語之前所列術語之所有排列及組合。舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下中之至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若順序在特定上下文中至關重要，則亦包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。繼續此實例，明確包括含有一或多個項目或術語之重複之組合，例如BB、AAA、AAB、BBC、CBBA、CABA等。熟習此項技術者應理解，除非根據上下文另外顯而易見，否則通常不會限制任一組合中項目或術語之數量。
如本文所用，術語「套組」係指相關組分(例如一或多種多核苷酸或組成物)及一或多種相關材料(例如遞送裝置(例如注射器)、溶劑、溶液、緩衝液、說明書或乾燥劑)之包裝集合。
如本文所用之「同種異體」細胞係指源自與接受個體相同之物種之供體個體之細胞，其中供體個體及接受個體具有遺傳相異性，例如一或多個基因座處之基因係不同的。因此，例如，細胞對於欲投與細胞之個體係同種異體的。如本文所用，自供體取出或分離且將不會再引入原始供體中之細胞視為同種異體細胞。
如本文所用之「自體」細胞係指衍生自與隨後將再引入材料之個體相同之個體之細胞。因此，例如，若細胞取自個體且其隨後將再引入同一個體中，則該細胞視為自體的。
如本文所用之「β2M」或「B2M」係指「β-2微球蛋白」之核酸序列或蛋白質序列；人類基因具有登錄號NC_000015 (範圍44711492..44718877)，參考GRCh38.p13。B2M蛋白與MHC I類分子締合為有核細胞表面上之異二聚體且為MHC I類蛋白表現所必需。
如本文所用之「
CIITA」或「CIITA」或「C2TA」係指「II類主要組織相容性複合物反式活化劑」之核酸序列或蛋白質序列；人類基因具有登錄號NC_000016.10 (範圍10866208..10941562)，參考GRCh38.p13。細胞核中之CIITA蛋白充當MHC II類基因轉錄之正調控劑且為MHC II類蛋白表現所必需。
如本文所用，「MHC」或「MHC分子」或「MHC蛋白」或「MHC複合物」係指主要組織相容性複合物分子(或複數)，且包括例如MHC I類及MHC II類分子。在人類中，MHC分子稱為「人類白血球抗原」複合物或「HLA分子」或「HLA蛋白」。使用術語「MHC」及「HLA」不欲具有限制性；如本文所用，術語「MHC」可用於指人類MHC分子，
即HLA分子。因此，術語「MHC」及「HLA」在本文中可互換使用。
如本文在HLA-A蛋白上下文中所用之術語「HLA-A」係指MHC I類蛋白分子，其係由重鏈(由HLA-A基因編碼)及輕鏈(
即β-2微球蛋白)組成之異二聚體如本文在核酸上下文中所用之術語「HLA-A」或「HLA-A基因」係指編碼HLA-A蛋白分子之重鏈之基因。HLA-A基因亦稱為「I類HLA組織相容性A α鏈」；人類基因具有登錄號 NC_000006.12 (29942532..29945870)。已知HLA-A基因在群體中具有HLA-A基因之數千種不同的基因型形式(且個體可接受HLA-A基因之兩種不同的對偶基因)。HLA-A對偶基因(包括序列資訊)之公共資料庫可登錄IPD-IMGT/HLA：www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/。術語「HLA-A」及「HLA-A基因」涵蓋HLA-A之所有對偶基因。
如本文在HLA-B蛋白上下文中所用之術語「HLA-B」係指MHC I類蛋白分子，其係由重鏈(由HLA-B基因編碼)及輕鏈(
即β-2微球蛋白)組成之異二聚體。如本文在核酸上下文中所用之「HLA-B」係指編碼HLA-B蛋白分子之重鏈之基因。HLA-B亦稱為「I類HLA組織相容性B α鏈」；人類基因具有登錄號NC_000006.12 (31353875..31357179)。已知HLA-B基因在群體中具有HLA-B基因之數千種不同的基因型形式(且個體可接受HLA-A基因之兩種不同的對偶基因)。HLA-B對偶基因(包括序列資訊)之公共資料庫可登錄IPD-IMGT/HLA：www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/。術語「HLA-B」及「HLA-B基因」涵蓋HLA-B之所有對偶基因。
如本文在核酸上下文中所用之「HLA-C」係指編碼HLA-C蛋白分子之重鏈之基因。HLA-C亦稱為「I類HLA組織相容性C α鏈」；人類基因具有登錄號NC_000006.12 (31268749..31272092)。
如本文所用，術語「基因體坐標內」包括給定基因體坐標範圍之邊界。舉例而言，若給出chr6:29942854-chr6:29942913，則涵蓋坐標chr6:29942854-chr6:29942913。在本申請案通篇中，所提及基因體坐標係基於基因體參考協會(Genome Reference Consortium)之人類基因體GRCh38 (亦稱為hg38)組裝體中之基因體注釋，可在國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)網站上獲得。用於在一種組裝體與另一組裝體之間轉化基因體坐標之工具及方法為此項技術中已知且可用於將本文所提供之基因體坐標轉化成另一人類基因體組裝體中之相應坐標，包括轉化成藉由相同機構或使用相同算法產生之早期組裝體(例如，自GRCh38轉化成GRCh37)，及藉由不同機構或算法產生之組裝體之轉化(例如，自GRCh38轉化成NCBI33，由國際人類基因體定序聯盟(International Human Genome Sequencing Consortium)產生)。此項技術中已知之可獲得之方法及工具包括(但不限於)NCBI Genome Remapping Service，可在國家生物技術資訊中心網站獲得；UCSC LiftOver，可在UCSC Genome Brower網站獲得；及Assembly Converter，可在Ensembl.org網站獲得。
如本文所用，術語「同型接合」係指具有特定基因之兩個相同之對偶基因。
如本文所用，HLA 「對偶基因」可指命名為HLA-A、HLA-B或HLA-C之基因，其中指定「HLA-A」、「HLA-B」或「HLA-C」後之名稱之前四個數位(或由冒號隔開之前兩組數位，例如HLA-A*
02:101 :01:02N，其中前兩組數位係加粗且傾斜的)。如此項技術中已知，前四個數位(或由冒號隔開之前兩組數位)指定對偶基因之蛋白質。舉例而言，HLA-A*02:01及HLA-A*01:02係不同的HLA-A對偶基因。每一對偶基因存在其他基因型，例如HLA-A*02:01:02:01。給定對偶基因之其他基因型視為相同的對偶基因，例如HLA-A*02:01:02:01及HLA-A*02:01係相同的對偶基因。因此，當HLA對偶基因相同時(即，當對偶基因具有由冒號隔開之相同之前四個數位或相同之前兩組數位時)，該等對偶基因係同型接合的。
「匹配」或「匹配的」係指供體與接受者之間共享之對偶基因，例如相同之對偶基因。
「多核苷酸」及「核酸」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物之多聚體化合物，該等核苷或核苷類似物具有沿主鏈連接在一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習用RNA、DNA、混合RNA-DNA及其類似物之聚合物。核酸「主鏈」可由多種鍵聯組成，包括以下中之一或多者：糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如2’甲氧基或2’鹵化物取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習用鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾之尿苷，例如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他尿苷)；肌苷；嘌呤或嘧啶之衍生物(例如，N
4-甲基去氧鳥苷、去氮雜嘌呤或氮雜嘌呤、去氮雜嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位具有取代基之嘧啶鹼基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲基胺基嘌呤、O
6-甲基鳥嘌呤、4-硫-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O
4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。關於一般論述參見
The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams等人編輯，第11版，1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括聚合物位置之含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習用RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習用組分及取代(例如，具有2’甲氧基鍵聯之習用鹼基，或含有習用鹼基及一或多種鹼基類似物之聚合物)。核酸包括「鎖核酸」(LNA)，一種含有一或多個LNA核苷酸單體之類似物，該一或多個LNA核苷酸單體具有鎖定於模擬RNA之糖構形中之雙環呋喃糖單元，其增強對互補RNA及DNA序列之雜交親和力(Vester及Wengel, 2004,
Biochemistry43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同之糖部分且可因在RNA中存在尿嘧啶或其類似物且在DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物而不同。
「指導RNA」、「gRNA」及簡稱「指導物」在本文中可互換使用且係指例如將RNA指導之DNA結合劑引導至靶DNA之指導物且可為單指導RNA或crRNA及trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。例示性gRNA包括呈經修飾或未經修飾形式之II類Cas核酸酶指導RNA。crRNA及trRNA可締合為單一RNA分子(單指導RNA，即sgRNA)或兩個單獨RNA股(雙指導RNA，即dgRNA)。「指導RNA」或「gRNA」係指每一類型。trRNA可為天然存在之序列，或與天然存在之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。
如本文所用，「指導序列」係指指導RNA內與靶序列互補且用於將指導RNA引導至靶序列以供RNA指導之DNA結合劑結合或修飾(例如，裂解)之序列。「指導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔體序列」。指導序列之長度可為20個核苷酸，例如在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (
即Spy Cas9 (SpCas9))及相關Cas9同源物/異種同源物之情形下。亦可使用更短或更長之序列作為指導物，例如長度為15個、16個、17個、18個、19個、21個、22個、23個、24個或25個核苷酸。在一些實施例中，靶序列處於例如基因中或染色體上，且與指導序列互補。在一些實施例中，指導序列與其相應靶序列之間的互補或一致程度可為約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，指導序列及靶區域可為100%互補或一致的。在其他實施例中，指導序列及靶區域可含有至少一個錯配。舉例而言，指導序列及靶序列可含有1個、2個、3個或4個錯配，其中靶序列之總長度係至少17個、18個、19個、20個或更多個核苷酸。在一些實施例中，指導序列及靶區域可含有1-4個錯配，其中指導序列包含至少17個、18個、19個、20個或更多個核苷酸。在一些實施例中，指導序列及靶區域可含有1個、2個、3個或4個錯配，其中指導序列包含20個核苷酸。
因此，在
腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides) (
即Nme Cas9 (NmeCas9))及相關Cas9同源物/異種同源物之情形下，指導序列之長度可為19個、20個、21個、較佳地22個、23個或24個核苷酸，或長度可為20-25個核苷酸。在一些實施例中，靶序列處於例如基因中或染色體上，且與指導序列互補。在一些實施例中，指導序列與其相應靶序列之間的互補或一致程度係至少80%、85%，較佳地90%或95%。在一些實施例中，指導序列及靶區域可為100%互補或一致的。在其他實施例中，指導序列及靶區域可含有至少一個錯配，即一個核苷酸不一致或不互補，此端視參考序列而定。舉例而言，指導序列及靶序列可含有1-2個、較佳地不超過1個錯配，其中靶序列之總長度係19個、20個、21個、22個，較佳地23個或24個或更多個核苷酸。在一些實施例中，指導序列及靶區域可含有1-2個錯配，其中指導序列包含至少24個或更多個核苷酸。在一些實施例中，指導序列及靶區域可含有1-2個錯配，其中指導序列包含24個核苷酸。亦即，指導序列及靶區域可形成具有至少2×或更多個鹼基對之雙鏈體區域。在某些實施例中，雙鏈體區域可包括1-2個錯配，使得指導股及靶序列不完全互補。錯配位置為此項技術中已知，如例如PAM遠端錯配往往比PAM近端匹配具有更佳耐受性中所提供。其他位置之錯配耐受性為此項技術中已知(參見例如Edraki等人，2019. Mol. Cell, 73:1-13)。
RNA指導之DNA結合劑之靶序列包括基因體DNA之正股及負股(
即，給定序列及該序列之反向互補序列)，此乃因RNA指導之DNA結合劑之核酸受質係雙股核酸。因此，當稱指導序列「與靶序列互補」時，應理解指導序列可引導指導RNA結合至靶序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，當指導序列結合靶序列之反向互補序列時，指導序列與靶序列(例如，不包括PAM之靶序列)之某些核苷酸一致，指導序列中U對T之取代除外。
如本文所用，「RNA指導之DNA結合劑」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物或該複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性係序列特異性且取決於PAM及指導RNA序列之存在。例示性RNA指導之DNA結合劑包 括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用之「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。dCas DNA結合劑可為包含非功能核酸酶結構域(RuvC或HNH結構域)之無活性核酸酶。在一些實施例中，Cas裂解酶或Cas切口酶包括經修飾以允許例如經由與FokI結構域融合而進行DNA裂解之dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶。
如本文所用，「2類Cas核酸酶」係具有RNA指導之DNA結合活性之單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如，Spy Cas9之H840A或D10A變異體，以及Nme Cas9 (例如Nme2 Cas9)之D16A及H588A)，其進一步具有RNA指導之DNA裂解酶或切口酶活性，及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性係不活化的。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如，K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9係同源的，且含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用方式併入。參見例如Zetsche，表S1及S3。參見例如Makarova等人，Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人，Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
已自
腦膜炎雙球菌獲得若干Cas9異種同源物(Esvelt等人，NAT. METHODS，第10卷，2013, 1116 - 1121；Hou等人，PNAS，第110卷，2013，第15644 - 15649頁) (Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9)。Nme2Cas9異種同源物在哺乳動物細胞中有效地發揮功能，識別N4CC PAM，且可用於與同源gRNA一起進行活體內編輯(Ran等人，NATURE，第520卷，2015，第186 - 191頁；Kim等人，NAT. COMMUN.，第8卷，2017，第14500頁)。Nme2Cas9可具有特異性及選擇性，例如能夠降低脫靶編輯(Lee等人，MOL. THER.，第24卷，2016，第645 - 654頁；Kim等人，2017)。亦參見例如WO/2020081568 (例如，第28頁及第42頁)，闡述Nme2Cas9 D16A切口酶，該文獻之內容以全文引用方式併入本文中。在通篇中，「NmeCas9」或「Nme Cas9」係通用的且涵蓋任一類型之NmeCas9，包括Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9。
如本文所用，術語「編輯子」係指包含能夠在DNA序列內製造修飾之多肽之劑。在一些實施例中，編輯子係裂解酶，例如Cas9裂解酶。在一些實施例中，編輯子能夠使DNA分子內之鹼基去胺基，且其可稱為鹼基編輯子。在一些實施例中，編輯子能夠使DNA中之胞嘧啶(C)去胺基。在一些實施例中，編輯子為融合蛋白，其包含與胞苷去胺酶融合的RNA指導之切口酶。在一些實施例中，編輯子為融合蛋白，其包含與APOBEC3A去胺酶(A3A)融合的RNA指導之切口酶。在一些實施例中，編輯子包含融合至APOBEC3A去胺酶(A3A)之Cas9切口酶。在一些實施例中，編輯子係包含融合至胞苷去胺酶及UGI之RNA指導之切口酶之融合蛋白。在一些實施例中，編輯子缺少UGI。
如本文所用，「胞苷去胺酶」意指能夠具有胞苷去胺酶活性、催化胞苷或去氧胞苷之水解去胺基、通常產生尿苷或去氧尿苷之多肽或多肽複合物。胞苷去胺酶涵蓋胞苷去胺酶超家族中之酶，且具體而言APOBEC家族之酶(APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4及APOBEC3亞組之酶)、活化誘導之胞苷去胺酶(AID或AICDA)及CMP去胺酶(參見例如Conticello等人，Mol. Biol. Evol. 22:367-77, 2005；Conticello, Genome Biol. 9:229, 2008；Muramatsu等人，J. Biol. Chem. 274: 18470-6, 1999；Carrington等人，Cells 9:1690 (2020))。
如本文所用，術語「APOBEC3」係指APOBEC3蛋白，諸如由人類APOBEC3基因座之七個基因(A3A-A3H)中的任一個表現的APOBEC3蛋白。APOBEC3可具有催化DNA或RNA編輯活性。APOBEC3A之胺基酸序列已闡述(UniPROT登錄ID：p31941)且以SEQ ID NO: 799包括在本文中。在一些實施例中，APOBEC3蛋白係人類APOBEC3蛋白或野生型蛋白質。變異體包括具有與野生型APOBEC3蛋白相差一或若干突變(即取代、缺失、插入，例如一或若干單點取代)之序列的蛋白質。例如，可使用縮短的APOBEC3序列，例如藉由缺失若干N端或C端胺基酸，較佳地序列C端之1至4個胺基酸。如本文所用，術語「變異體」係指與APOBEC3參考序列同源之對偶基因變異體、剪接變異體以及天然或人工突變體。變異體為「功能性的」，此乃因其顯示出DNA或RNA編輯之催化活性。在一些實施例中，APOBEC3 (諸如人類APOBEC3A)具有野生型胺基酸位置57 (如在野生型序列中所編號)。在一些實施例中，APOBEC3 (例如人類APOBEC3A)在胺基酸位置57 (如在野生型序列中所編號)具有天冬醯胺。
如本文所用，「切口酶」係在雙股DNA中產生單股斷裂(亦稱為「切口」)、即切割DNA雙螺旋之一個股而非另一股之酶。如本文所用，「RNA指導之DNA切口酶」意指具有DNA切口酶活性之多肽或多肽複合物，其中DNA切口酶活性具有序列特異性且取決於RNA之序列。例示性RNA指導之DNA切口酶包括Cas切口酶。Cas切口酶包括以下切口酶形式：III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶。2類Cas切口酶包括其中兩個催化結構域之僅一個不活化之變異體，其具有RNA指導之DNA切口酶活性。2類Cas切口酶包括其中HNH或RuvC催化結構域不活化之多肽，例如Cas9，例如Cas9 (例如，SpyCas9之H840A、D10A或N863A變異體或NmeCas9之D16A變異體)。
腦膜炎雙球菌之HNH或HNH樣核酸酶結構域或RuvC或RuvC樣結構域中之例示性胺基酸取代包括Nme2Cas9 D16A (HNH切口酶)及Nme2Cas9 H588A (RuvC切口酶)、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如、K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9係同源的，且含有RuvC樣蛋白結構域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用方式併入。參見例如Zetsche，表S1及S3。「Cas9」涵蓋化膿性鏈球菌(Spy) Cas9、本文所列Cas9之變異體及其等同物。參見例如Makarova等人，Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人，Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指包含來自至少兩種不同蛋白質之蛋白質結構域之雜合多肽。一種蛋白質可位於融合蛋白之胺基端(N端)部分或羧基端(C端)蛋白處，從而分別形成「胺基端融合蛋白」或「羧基端融合蛋白」。本文所提供之任一蛋白質可藉由此項技術中已知之任一方法產生。舉例而言，本文所提供之蛋白質可經由尤其適用於包含包含肽連接體之融合蛋白之重組蛋白表現及純化來產生。重組蛋白之表現及純化方法係熟知的，並且包括Green及Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))中所述之彼等方法，該文獻之全部內容以引用方式併入本文中。
如本文所用，術語「連接體」係指連接兩個相鄰分子或部分之化學基團或分子。通常，連接體位於兩個基團、分子或其他部分之間或側接有兩個基團、分子或其他部分且經由共價鍵彼此連接。在一些實施例中，連接體係胺基酸或複數個胺基酸(例如肽或蛋白質)，例如16胺基酸殘基「XTEN」連接體或其變異體(參見例如實例；及Schellenberger等人，A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接體包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 900)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 901)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 902)。
如本文所用，術語「尿嘧啶糖苷酶抑制劑」或「UGI」係指能夠抑制尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)鹼基切除修復酶之蛋白質。
如本文所用，基因之「開放閱讀框」或「ORF」係指由指定基因編碼之蛋白質之胺基酸序列之一系列密碼子組成之序列。ORF開始於起始密碼子(例如，DNA中之ATG或RNA中之AUG)且終止於終止密碼子，例如DNA中之TAA、TAG或TGA或RNA中之UAA、UAG或UGA。
如本文所用，「核糖核蛋白」 (RNP)或「RNP複合物」係指指導RNA以及RNA指導之DNA結合劑，例如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶，或dCas DNA結合劑(例如，Cas9)。在一些實施例中，指導RNA將RNA指導之DNA結合劑(例如Cas9)指導至靶序列，且指導RNA與靶序列雜交且該劑結合至靶序列；在該劑係裂解酶或切口酶之情形下，結合之後可進行裂解或切割。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對表明整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配，則第一序列視為「包含具有與第二序列至少X%一致性之序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，此乃因第二序列之所有三個位置皆存在匹配，故比對將給出100%一致性。RNA與DNA之間的差異(通常尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(例如經修飾尿苷)之存在不會導致多核苷酸之間的一致性或互補性之差異，只要相關核苷酸(例如胸苷、尿苷或經修飾尿苷)具有相同之互補序列即可(例如，所有胸苷、尿苷或經修飾尿苷之腺苷；另一實例係胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，其皆具有鳥苷或經修飾鳥苷作為互補序列)。因此，例如，序列5’-AXG (其中X係任一經修飾尿苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)視為與AUG 100%一致之原因在於二者與同一序列(5’-CAU)完全互補。例示性比對演算法係在此項技術中眾所周知的Smith-Waterman及Needleman-Wunsch演算法。熟習此項技術者將理解選擇哪一種演算法及參數設置適於欲比對之給定序列對；對於具有大體上類似長度且預期胺基酸一致性＞50%或核苷酸一致性＞75%的序列，EBI在www.ebi.ac.uk網路伺服器上提供之Needleman-Wunsch演算法介面之帶有默認設置之Needleman-Wunsch演算法通常係適當的。
「mRNA」在本文中用於指多核苷酸且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框(
即，可充當核糖體及胺基醯化tRNA之轉譯受質)。mRNA可包含包括核糖殘基或其類似物(例如，2’-甲氧基核糖殘基)之磷酸酯-糖主鏈。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2’-甲氧基核糖殘基或其組合組成。
如本文所用，「插入/缺失」係指由例如在靶核酸中之雙股斷裂(DSB)位點處插入、缺失或插入及缺失之多個核苷酸組成之插入或缺失突變。如本文所用，當插入/缺失形成產生插入時，插入係DSB位點處之隨機插入且通常並不由模板序列引導或基於模板序列。
如本文所用，細胞上「減少或消除的」蛋白質表現係指相對於未經修飾之細胞，蛋白質表現之部分或完全喪失。在一些實施例中，細胞上蛋白質之表面表現係藉由流式細胞術量測且相對於未經修飾之細胞具有「減少」或「消除的」表面表現，如藉由在用針對蛋白質之相同抗體染色時螢光信號之減少所證實。藉由流式細胞術，相對於未經修飾之細胞具有「減少」或「消除的」蛋白質表面表現之細胞可稱為對該蛋白質之表現呈「陰性」，如藉由與用同型對照抗體染色之細胞相似之螢光信號所證實。蛋白質表現之「減少」或「消除」可藉由本領域中之其他已知技術及熟習此項技術者已知之適當對照來量測。
如本文所用，「敲低」係指例如與未經編輯之靶序列之表現相比，特定基因產物(例如蛋白質、mRNA或二者)之表現減少。蛋白質敲低可藉由偵測樣品(例如組織、流體或所關注細胞群體)之蛋白質之總細胞量來量測。其亦可藉由量測蛋白質之替代物、標誌物或活性來量測。用於量測mRNA敲低之方法為已知且包括分析自所關注樣品分離之mRNA。在一些實施例中，「敲低」可指特定基因產物表現之一定損失，例如所轉錄mRNA量之減少或由細胞或細胞群體(包括
活體內群體，例如在組織中發現之彼等群體)表現之蛋白質量之減少。
如本文所用，「敲除」(或「KO」)係指細胞中特定基因或特定蛋白質表現之喪失。敲除可使表現減少至分析之偵測水準之下。敲除可藉由偵測細胞、組織或細胞群體中蛋白質之總細胞量來量測。
如本文所用，「靶序列」或「基因體靶序列」係指靶基因中與gRNA之指導序列具有互補性之核酸序列。靶序列與指導序列之相互作用引導RNA指導之DNA結合劑在靶序列內結合且潛在地進行切割或裂解(取決於劑之活性)。
如本文所用，「治療」係指用於個體之疾病或病症之治療劑之任何投與或施用，且包括抑制疾病、阻止其發展、減輕疾病之一或多個症狀、治愈疾病或預防疾病之一或多個症狀，包括症狀之復發。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例圖解說明於附圖中。儘管本發明係結合所圖解說明之實施例來闡述，但應理解其不欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲覆蓋所有替代、修改及等效內容，該等替代、修改及等效內容包括在如由所附申請專利范圍及所包括實施例定義之本發明內。
在詳細闡述本教示之前應理解，本揭示案並不限於具體組成物或製程步驟，因此可發生變化。應注意，除非上下文另外明確指明，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，例如，對「結合物」之提及包括複數種結合物，且對「細胞」之提及包括複數個細胞及諸如此類。
數字範圍包括定義範圍之數字。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，量測及可量測值應理解為近似值。另外，使用「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有(contain)」、「含有(contains)」、「含有(containing)」、「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(including)」不欲具有限制性。應理解，前述一般描述及詳細描述僅具有例示性及解釋性且並不限制教示。
除非本說明書中具體注明，否則本說明書中列舉「包含」各個組分之實施例亦預期為「由所列舉組分組成」或「基本上由所列舉組分組成」；本說明書中列舉「由各個組分組成」之實施例亦預期為「包含所列舉組分」或「基本上由所列舉組分組成」；且本說明書中列舉「基本上由各個組分組成」之實施例亦預期為「由所列舉組分組成」或「包含所列舉組分」(此可互換性並不適用於在申請專利范圍中使用該等術語)。除非上下文另有明確指示，否則術語「或」係以包涵之含義使用，
即等效於「及/或」。
本文中所用之部分標題僅用於組織目的且不應理解為以任何方式限制期望標的物。在以引用方式併入之任一材料與本說明書中所定義之任一術語或本說明書之任何其他明確內容發生衝突之情況下，以本說明書為準。儘管本教示係結合不同實施例來闡述，但本教示不欲限於該等實施例。相反，如熟習此項技術者應瞭解，本教示涵蓋各種替代、修改及等效內容。
B. 經遺傳修飾之細胞 1. 經工程改造之人類細胞組成物
本揭示案提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞組成物，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。另外，本揭示案提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞組成物，其包含(i) HLA-A基因之遺傳修飾及(ii) HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-C同型接合的。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，具有減少或消除的HLA-B表現或HLA-A及HLA-B表現之經工程改造之人類細胞可用於過繼性細胞轉移療法。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞包含細胞基因體之額外遺傳修飾(例如，減少或消除MHC II類蛋白，或減少或消除內源T細胞受體(TCR)蛋白，或引入用於表現之外源核酸)，以產生適於同種異體移植目的之細胞。
在一些實施例中，經工程改造之人類細胞係同種異體細胞療法。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞轉移至具有與經工程改造之人類細胞相同之HLA-A對偶基因之接受者。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞轉移至具有與經工程改造之人類細胞相同之HLA-C對偶基因之接受者。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞轉移至具有與經工程改造之人類細胞相同之HLA-A及HLA-C對偶基因之接受者。因此，本文所揭示之經工程改造之人類細胞提供與接受者之部分HLA匹配，由此降低不良免疫反應之風險。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6:31357084-31354647；其中該細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-A及HLA-B基因之遺傳修飾，(i)其中HLA-A之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854-chr6:29942913及chr6:29943518-chr6: 29943619；及(ii)其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6: 31354623-31357108或31354497-31357157；且其中該細胞係HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，對於基因體坐標之每一給定範圍，範圍可涵蓋指定坐標任一端之+/- 10個核苷酸。舉例而言，若給出chr6:29942854-chr6: 29942913，則在一些實施例中，基因體靶序列或遺傳修飾可在chr6:29942844-chr6:29942923內。在一些實施例中，對於基因體坐標之每一給定範圍，範圍可涵蓋該範圍任一端之+/- 5個核苷酸。
在一些實施例中，基因體坐標之給定範圍可包含DNA雙股(
即正(+)股及負(-)股)上之靶序列。
HLA-A或HLA-B基因之遺傳修飾進一步闡述於本文中。在一些實施例中，HLA-A或HLA-B基因之遺傳修飾包含靶序列中之至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺基中之任一或多者。
本文所述之經工程改造之人類細胞可包含HLA-B基因之任一HLA-B對偶基因之遺傳修飾或HLA-A基因之任一HLA-A對偶基因之遺傳修飾。HLA基因位於基因體區域中之染色體6中，稱為HLA超基因座；此項技術中已報導數百個HLA-A及HLA-B對偶基因(參見例如Shiina等人，Journal of Human Genetics 54:15-39 (2009))。此項技術中可獲得HLA-A及HLA-B對偶基因之序列(參見例如用於檢索具體HLA-A及HLA-B對偶基因之序列之IPD-IMGT/HLA資料庫https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html)。
在一些實施例中，細胞具有減少或消除的至少一種HLA-A對偶基因表現，該至少一種HLA-A對偶基因選自：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11及HLA-A24。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-A1表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-A2表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-A3表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-A11表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-A24表現。
在一些實施例中，細胞具有減少或消除的至少一種HLA-B對偶基因表現，該至少一種HLA-B對偶基因選自：HLA-B7、HLA-B8、HLA-B13、HLA-B21、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B41、HLA-B42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-B46、HLA-B47、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B56、HLA-B67、HLA-B73、HLA-B81及HLA-B83。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B7表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B8表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B13表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B21表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B27表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B35表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B37表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B38表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B39表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B40表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B41表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B42表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B44表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B45表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B46表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B47表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B48表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B49表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B50表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B51表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B52表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B56表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B57表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B67表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B73表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B81表現。在一些實施例中，細胞具有減少或消除的HLA-B83表現。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355349-31355369；chr6:31355348-31355368；或chr6:31355145-31355165。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355414-31355434。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368、chr6:31355349-31355369、chr6:31355192-31355212、chr6:31355347-31355367、chr6:31355340-31355360、chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355349-31355369或chr6:31355348-31355368。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355192-31355212或chr6:31355347-31355367。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；或chr6:31355340-31355360。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；及chr6:31355469-31355493。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355361-31355385；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355356-31355380；chr6:31355366-31355390；chr6:31355417-31355441；chr6:31357078-31357102；chr6:31355460-31355484；chr6:31355415-31355439；chr6:31355166-31355190；chr6:31355378-31355402；chr6:31355401-31355425；chr6:31356262-31356286；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；或chr6:31356426-31356450。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；chr6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6: 31356386-31356410。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355145-31356401或(b) chr6:31357084-31354647。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-A及HLA-B基因之遺傳修飾，其中HLA-A之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942854-chr6:29942913及chr6:29943518-chr6:29943619；且其中HLA-B之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355145-31356401或(b) chr6:31357084-31354647。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355182-31355202；chr6:31355349-31355369；chr6:31355348-31355368；或chr6:31355145-31355165。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355414-31355434。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368、chr6:31355349-31355369、chr6:31355192-31355212、chr6:31355347-31355367、chr6:31355340-31355360、chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355349-31355369或chr6:31355348-31355368。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355192-31355212或chr6:31355347-31355367。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；或chr6:31355340-31355360。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；chr6:31355469-31355493；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355361-31355385；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355356-31355380；chr6:31355366-31355390；chr6:31355417-31355441；chr6:31357078-31357102；chr6:31355460-31355484；chr6:31355415-31355439；chr6:31355166-31355190；chr6:31355378-31355402；chr6:31355401-31355425；chr6:31356262-31356286；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；或chr6:31356426-31356450。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205- 31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441- 31355465。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6: 31356386-31356410。在一些實施例中，細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180- 31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157- 31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204- 31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191- 31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409- 31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791，其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180- 31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157- 31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204- 31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191- 31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409- 31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791；其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180- 31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157- 31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204- 31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191- 31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409- 31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791，其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6個、7個、8個、9個或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少7個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少8個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少9個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180- 31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157- 31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204- 31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191- 31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409- 31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791；其中遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；及chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379- 31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356- 31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417- 31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378- 31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469- 31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390- 31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222- 31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425- 31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437- 31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764- 31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436- 31356460；或chr6:31356767-31356791。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。由於對偶基因多態性，在一些實施例中，靶序列可包含hg38基因體序列之1個、2個或3個錯配。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑，例如釀膿鏈球菌Cas9、
腦膜炎雙球菌Cas9、或包含釀膿鏈球菌或
腦膜炎雙球菌Cas9切口酶之鹼基編輯子。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑，例如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；chr6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑，例如
腦膜炎雙球菌Cas9或Nme2Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429；在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑，例如包含去胺酶及釀膿鏈球菌Cas9切口酶之鹼基編輯子。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr6:31355145-31356401或(b) chr6:31357084-31354647。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含以下基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；及chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355182-31355202內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355348-31355368內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355180-31355200內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355145-31355165內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355349-31355369內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355157-31355177內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356381-31356401內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356380-31356400內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355204-31355224內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355205-31355225內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355185-31355205內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355191-31355211內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355192-31355212內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355190-31355210內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355193-31355213內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355198-31355218內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355320-31355340內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355319-31355339內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355178-31355198內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355347-31355367內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355432-31355452內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355340-31355360內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355576-31355596內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355410-31355430內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355419-31355439內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355414-31355434內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355409-31355429內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356777-31356801內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355492-31355516內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355491-31355515內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標31355469-31355493內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標31355460-31355484內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標31355419-31355443內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標31355415-31355439內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355417-31355441內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355401-31355425內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355390-31355414內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標31355379-31355403內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標31355378-31355402內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355369-31355393內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr 6:31355361-31355385內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr 6:31355366-31355390內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr 6:31355356-31355380內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355221-31355245內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355222-31355246內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355205-31355229內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355446-31355470內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356425-31356449內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355441-31355465內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355203-31355227內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356437-31356461內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356426-31356450內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356763-31356787內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356764-31356788內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356762-31356786內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31355204-31355228內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356436-31356460內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含基因體坐標chr6:31356767-31356791內之至少5個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，HLA-B基因體靶序列包含基因體坐標內之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，基因編輯系統包含轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)。在一些實施例中，基因編輯系統包含鋅指核酸酶。在一些實施例中，基因編輯系統包含CRISPR/Cas系統，例如2類系統。在一些實施例中，基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
例示性RNA指導之DNA結合劑顯示於下
表 1A中。
表1A. 例示性RNA指導之DNA結合劑。
*基於去胺酶-SpyCas9切口酶之例示性鹼基編輯子。如顯而易見，鹼基編輯子特異性(包括PAM)將隨著其切口酶而變化。
| RNA 指導之DNA 結合劑 | PAM | 指導物長度 |
| 來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶 | NGG | 20 bp |
| 來自 腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶 | NNNNG[A/C]TT | 20 bp |
| 來自 嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)之Cas9核酸酶 | NNAGAAW | 20 bp |
| Cas9核酸酶來自 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | NNG(A/G)(A/G)T | 20 bp |
| 來自 新澤西弗朗西斯菌 (Francisella novicida)之Cpf1核酸酶 | TTTN | 23 bp |
| 來自 胺基酸球菌屬物種之Cpf1核酸酶 | TTTV | 23 bp |
| 來自 毛螺菌科細菌之Cpf1核酸酶 | TTTV | 23 bp |
| C至T鹼基編輯子* | NGG | 20 bp |
| A至G鹼基編輯子* | NGG | 20 bp |
| Cas12a | 與Cpf1相同 | |
| CasX | TTCN | 20 bp |
| NME2 | NNNNCC | 24 bp |
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸包括Cas9蛋白。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑選自以下中之一者：釀膿鏈球菌Cas9、
腦膜炎雙球菌Cas9 (例如Nme2Cas9)、
嗜熱鏈球菌Cas9、
金黃色葡萄球菌Cas9、
新澤西弗朗西斯菌Cpf1、
胺基酸球菌屬物種Cpf1、
毛螺菌科細菌Cpf1、C至T鹼基編輯子、A至G鹼基編輯子、Cas12a、Mad7核酸酶、ARCUS核酸酶及CasX。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含選自以下中之一者之多肽：釀膿鏈球菌Cas9、
腦膜炎雙球菌Cas9 (例如Nme2Cas9)、
嗜熱鏈球菌Cas9、
金黃色葡萄球菌Cas9、
新澤西弗朗西斯菌Cpf1、
胺基酸球菌屬物種Cpf1、
毛螺菌科細菌Cpf1、C至T鹼基編輯子、A至G鹼基編輯子、Cas12a及CasX。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係
腦膜炎雙球菌Cas9，例如Nme2Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係
嗜熱鏈球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係
金黃色葡萄球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係來自
新澤西弗朗西斯菌之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係來自
胺基酸球菌屬物種之 Cpf1 。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係來自
毛螺菌科細菌 ND2006之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係C至T鹼基編輯子。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係A至G鹼基編輯子。在一些實施例中，鹼基編輯子包含去胺酶及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸包括APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶係SpyCas9切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶包含NmeCas9切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係Cas12a。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係CasX。
在任一上述實施例中，C包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係鹼基編輯子。在一些實施例中，鹼基編輯子包含C至T去胺酶及RNA指導之切口酶，例如釀膿鏈球菌Cas9切口酶。在一些實施例中，鹼基編輯子包含A至G去胺酶及RNA指導之切口酶，例如釀膿鏈球菌Cas9切口酶。
在任一上述實施例中，基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係
腦膜炎雙球菌或Nme2 Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係鹼基編輯子。在一些實施例中，鹼基編輯子包含C至T去胺酶及RNA指導之切口酶，例如
腦膜炎雙球菌或Nme2 Cas9切口酶。在一些實施例中，鹼基編輯子包含A至G去胺酶及RNA指導之切口酶，例如
腦膜炎雙球菌或Nme2 Cas9切口酶。
在一些實施例中，基因編輯系統進一步包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)，且UGI及鹼基編輯子包含在單一多肽中。在一些實施例中，基因編輯系統包含UGI，且UGI及鹼基編輯子包含在不同多肽中。在一些實施例中，鹼基編輯子包含胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，胞苷去胺酶、RNA指導之切口酶及UGI包含在單一多肽中。在一些實施例中，胞苷去胺酶、RNA指導之切口酶及UGI包含在不同多肽中。在一些實施例中，胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶包含在單一多肽中，且其中UGI包含在不同多肽中。
在一些實施例中，當經工程改造細胞係HLA-A同型接合時，HLA-A對偶基因選自以下HLA-A對偶基因中之任一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*11:01；HLA-A*26:01；HLA-A*68:01；HLA-A*29:02；HLA-A*31:01；HLA-A*32:01；HLA-A*30:02；HLA-A*25:01；HLA-A*33:01；HLA-A*02:02；HLA-A*74:01；HLA-A*02:02；HLA-A*29:01；HLA-A*02:03；HLA-A*02:05；HLA-A*24:07；HLA-A*11:02；HLA-A*36:01；HLA-A*02:22；HLA-A*34:02；HLA-A*01:03；HLA-A*24:02；HLA-A*02:07；HLA-A*23:01；HLA-A*30:01；HLA-A*33:03；HLA-A*02:06；HLA-A*34:02；及HLA-A*68:02。
在一些實施例中，當經工程改造細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*08:01；HLA-C*03:02；HLA-C*16:01；HLA-C*15:02；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:10；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*17:01；HLA-C*01:02；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，當經工程改造細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*03:04。在一些實施例中，當經工程改造細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*06:02。在一些實施例中，當經工程改造細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*01:02。在一些實施例中，當經工程改造細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*08:01。在一些實施例中，當經工程改造細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*03:02。
在一些實施例中，經工程改造細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，HLA-A及HLA-C對偶基因對選自以下：HLA-A*01:01及HLA-C*07:01；HLA-A*02:01及HLA-C*07:02；HLA-A*02:01及HLA-C*05:01；HLA-A*03:01及HLA-C*07:02；HLA-A*02:01及HLA-C*04:01；HLA-A*02:01及HLA-C*03:04；HLA-A*01:01及HLA-C*06:02；HLA-A*03:01及HLA-C *04:01；HLA-A*02:01及HLA-C*07:01；HLA-A*24:02及HLA-C*04:01；HLA-A*29:02及HLA-C*16:01；HLA-A*02:01及HLA-C*06:02；HLA-A*24:02及HLA-C*07:02；HLA-A*26:01及HLA-C*12:03；HLA-A*11:01及HLA-C*04:01；HLA-A*25:01及HLA-C*12:03；HLA-A*02:01及HLA-C*02:02；HLA-A*24:02及HLA-C*03:03；HLA-A*30:01及HLA-C*06:02；HLA-A*02:01及HLA-C*01:02；HLA-A*11:01及HLA-C*07:02；HLA-A*03:01及HLA-C*07:01；HLA-A*23:01及HLA-C*04:01；HLA-A*24:02及HLA-C*07:01；HLA-A*31:01及HLA-C*03:04；HLA-A*33:01及HLA-C*08:02；HLA-A*02:01及HLA-C*03:03；HLA-A*11:01及HLA-C*01:02；HLA-A*01:01及HLA-C*04:01；HLA-A*03:01及HLA-C*06:02。
本文所揭示之HLA-A及HLA-C對偶基因對累積覆蓋約81%之群體。HLA-A及HLA-C對偶基因對之累積頻率顯示於下
表 1B中。
表1B. 群體中HLA-A及HLA-C對偶基因之累積頻率。
| 累積頻率 | 對偶基因 |
| 0.136 | HLA-A*01:01及HLA-C*07:01 |
| 0.231 | HLA-A*02:01及HLA-C*07:02 |
| 0.299 | HLA-A*02:01及HLA-C*05:01 |
| 0.361 | HLA-A*03:01及HLA-C*07:02 |
| 0.417 | HLA-A*02:01及HLA-C*04:01 |
| 0.460 | HLA-A*02:01及HLA-C*03:04 |
| 0.493 | HLA-A*01:01及HLA-C*06:02 |
| 0.524 | HLA-A*03:01及HLA-C*04:01 |
| 0.554 | HLA-A*02:01及HLA-C*07:01 |
| 0.579 | HLA-A*24:02及HLA-C*04:01 |
| 0.600 | HLA-A*29:02及HLA-C*16:01 |
| 0.621 | HLA-A*02:01及HLA-C*06:02 |
| 0.640 | HLA-A*24:02及HLA-C*07:02 |
| 0.657 | HLA-A*26:01及HLA-C*12:03 |
| 0.673 | HLA-A*11:01及HLA-C*04:01 |
| 0.686 | HLA-A*25:01及HLA-C*12:03 |
| 0.698 | HLA-A*02:01及HLA-C*02:02 |
| 0.710 | HLA-A*24:02及HLA-C*03:03 |
| 0.720 | HLA-A*30:01及HLA-C*06:02 |
| 0.730 | HLA-A*02:01及HLA-C*01:02 |
| 0.740 | HLA-A*11:01及HLA-C*07:02 |
| 0.749 | HLA-A*03:01及HLA-C*07:01 |
| 0.758 | HLA-A*23:01及HLA-C*04:01 |
| 0.766 | HLA-A*24:02及HLA-C*07:01 |
| 0.773 | HLA-A*31:01及HLA-C*03:04 |
| 0.780 | HLA-A*33:01及HLA-C*08:02 |
| 0.787 | HLA-A*02:01及HLA-C*03:03 |
| 0.794 | HLA-A*11:01及HLA-C*01:02 |
| 0.800 | HLA-A*01:01及HLA-C*04:01 |
| 0.806 | HLA-A*03:01及HLA-C*06:02 |
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現，係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的MHC II類蛋白表面表現。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有減少或消除MHC II類蛋白之表面表現之基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有CIITA基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有HLA-DR基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有HLA-DQ基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有HLA-DP基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有RFX基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有CREB基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有核因子(NF)-γ基因之遺傳修飾。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，係HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的MHC II類蛋白表面表現。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有減少或消除MHC II類蛋白之表面表現之基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有CIITA基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有HLA-DR基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有HLA-DQ基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有HLA-DP基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有RFX基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有CREB基因之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之人類細胞具有核因子(NF)-γ基因之遺傳修飾。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現，係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的TRAC蛋白表面表現。在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現，係HLA-A及HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的TRBC蛋白表面表現。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現，係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的TRAC蛋白表面表現。在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，係HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的TRBC蛋白表面表現。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，係HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的TRAC蛋白表面表現。在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，係HLA-C同型接合的，進一步具有減少或消除的TRBC蛋白表面表現。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355145-31356401或(b) chr6: 31357084-31354647，且其中經工程改造細胞進一步包含減少或消除MHC II類蛋白之表面表現之基因之遺傳修飾。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355596或(b) chr6:31355203-31356461，且其中經工程改造細胞進一步包含CIITA基因之遺傳修飾。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355596或(b) chr6: 31355203-31356461，且其中經工程改造細胞進一步包含TRAC基因之遺傳修飾。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6: 31355182-31355596或(b) chr6: chr6:31355203-31356461，且其中經工程改造細胞進一步包含TRBC基因之遺傳修飾。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA- B基因之遺傳修飾，其中遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174；chr631355145-31356401或(b) chr6:chr6:31355203- 31356461，且其中經工程改造細胞進一步包含外源核酸。在一些實施例中，經工程改造細胞包含編碼在經工程改造細胞表面上表現之靶向受體之外源核酸。在一些實施例中，靶向受體係CAR或通用CAR。在一些實施例中，靶向受體係TCR。在一些實施例中，靶向受體係WT1 TCR。在一些實施例中，靶向受體係受體之配位體。在一些實施例中，靶向受體係雜合CAR/TCR。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別結構域(例如，癌症抗原識別結構域)及TCR之次單元。在一些實施例中，靶向受體係細胞介素受體。在一些實施例中，靶向受體係趨化介素受體。在一些實施例中，靶向受體係B細胞受體(BCR)。在一些實施例中，經工程改造細胞進一步包含編碼經工程改造細胞分泌之多肽(即可溶性多肽)之外源核酸。在一些實施例中，外源核酸編碼治療性多肽。在一些實施例中，分泌多肽係抗體。在一些實施例中，分泌多肽係酶。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體，編碼細胞介素。在一些實施例中，外源核酸編碼趨化介素。在一些實施例中，外源核酸編碼融合蛋白。
經工程改造之人類細胞可為本文所揭示之任一例示性細胞類型。另外，由於MHC I類分子在所有有核細胞上表現，故經工程改造之人類細胞可為任一有核細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係免疫細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係幹細胞，例如造血幹細胞(HSC)。在一些實施例中，經工程改造細胞係誘導多能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，經工程改造細胞係間葉幹細胞(MSC)。在一些實施例中，經工程改造細胞係神經幹細胞(NSC)。在一些實施例中，經工程改造細胞係角膜緣幹細胞(LSC)。在一些實施例中，經工程改造細胞係前驅細胞，例如內皮前驅細胞或神經前驅細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係組織特異性原代細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞選自：軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突細胞或顆粒球。在一些實施例中，經工程改造細胞係單核球。在一些實施例中，經工程改造細胞係巨噬細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係肥大細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係樹突細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係顆粒球。在一些實施例中，經工程改造細胞係淋巴球。在一些實施例中，經工程改造細胞係T細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係CD4+ T細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係CD8+ T細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係記憶T細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係B細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係血漿B細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係記憶B細胞。在一些實施例中，經工程改造細胞係巨噬細胞。
在一些實施例中，本揭示案提供醫藥組成物，其包含本文所揭示之經工程改造之人類細胞中之任一者。在一些實施例中，醫藥組成物包含本文所揭示之經工程改造細胞中之任一者之群體。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少65% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少70% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少80% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少90% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少91%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少92% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少93% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少94% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。
在一些實施例中，細胞群體係至少94% HLA-A陰性或至少94% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少95% HLA-A陰性或至少95% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少96% HLA-A陰性或至少96% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少97% HLA-A陰性或至少97% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少98% HLA-A陰性或至少98% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少99% HLA-A陰性或至少98% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。
在一些實施例中，細胞群體係至少94% HLA-A陰性及至少94% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少95% HLA-A陰性及至少95% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少96% HLA-A陰性及至少96% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少97% HLA-A陰性及至少97% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少98% HLA-A陰性及至少98% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少99% HLA-A陰性及至少98% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。
在一些實施例中，至少92%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或92%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少93% HLA-A陰性或至少93% HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，至少93%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或至少93%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。在一些實施例中，至少94%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或至少94%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。在一些實施例中，至少95%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或至少95%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。在一些實施例中，至少96%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或至少96%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。在一些實施例中，至少96%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或至少97%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。在一些實施例中，至少96%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或至少98%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。在一些實施例中，至少96%之細胞群體包含HLA-A基因之遺傳修飾或至少99%之細胞群體包含HLA-B基因之遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
在一些實施例中，細胞群體係至少95% CIITA陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少96% CIITA陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少97% CIITA陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少98% CIITA陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，細胞群體係至少99% CIITA陰性，如藉由流式細胞術所量測。
在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少95%內源TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少97%內源TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少98%內源TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少99%內源TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造細胞之群體係至少99.5%內源TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。
在一些實施例中，提供向有需要之個體投與本文所揭示之經工程改造之人類細胞或醫藥組成物的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之人類細胞或醫藥組成物作為ACT療法的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之人類細胞或醫藥組成物作為癌症治療的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之人類細胞或醫藥組成物作為自體免疫疾病治療的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之人類細胞或醫藥組成物作為傳染病治療的方法。
C. 用於減少或消除 HLA-B 之表面表現之方法及組成物
本揭示案提供藉由對HLA-B基因進行遺傳修飾相對於未經修飾之細胞減少或消除HLA-B蛋白之表面表現的方法及組成物。本揭示案亦提供藉由對HLA-A及HLA-B基因進行遺傳修飾相對於未經修飾之細胞減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現的方法及組成物。所得經遺傳修飾之細胞在本文中亦可稱為經工程改造細胞。在一些實施例中，已經遺傳修飾(或工程改造)之細胞可為使用本文所提供之方法或組成物進一步遺傳修飾之起始細胞。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，具有減少或消除的僅HLA-B蛋白表面表現或HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之細胞可用於過繼性細胞轉移療法。在一些實施例中，HLA-A或HLA-B基因之編輯與額外遺傳修飾組合以產生同種異體移植目的所需之細胞。
在一些實施例中，該等方法包括相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中HLA-B蛋白之表面表現，其包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含(a)指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑選自以下中之一者：釀膿鏈球菌Cas9、
腦膜炎雙球菌Cas9 (例如Nme2Cas9)、
嗜熱鏈球菌Cas9、
金黃色葡萄球菌Cas9、
新澤西弗朗西斯菌Cpf1、
胺基酸球菌屬物種Cpf1、
毛螺菌科細菌Cpf1、C至T鹼基編輯子、A至G鹼基編輯子、Cas12a及CasX。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含選自以下中之一者之多肽：釀膿鏈球菌Cas9、
腦膜炎雙球菌Cas9 (例如Nme2Cas9)、
嗜熱鏈球菌Cas9、
金黃色葡萄球菌Cas9、
新澤西弗朗西斯菌Cpf1、
胺基酸球菌屬物種Cpf1、
毛螺菌科細菌Cpf1、C至T鹼基編輯子、A至G鹼基編輯子、Cas12a及CasX。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係釀膿鏈球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係
腦膜炎雙球菌Cas9，例如Nme2Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係
嗜熱鏈球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係
金黃色葡萄球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係來自
新澤西弗朗西斯菌之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係來自
胺基酸球菌屬物種之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係來自
毛螺菌科細菌 ND2006之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係C至T鹼基編輯子。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係A至G鹼基編輯子。在一些實施例中，鹼基編輯子包含去胺酶及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶係SpyCas9切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶包含NmeCas9切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas12a。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係CasX。在一些實施例中，HLA-A蛋白之表面表現(
即經工程改造細胞)由此減少或消除。
在一些實施例中，該等方法包括相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現，其包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含(a) HLA-A指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 301-590之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表4、表5B或表6中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表5A或表7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b)第一RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；及使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含(a) HLA-B指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑選自以下中之一者：釀膿鏈球菌Cas9、
腦膜炎雙球菌Cas9 (例如Nme2Cas9)、
嗜熱鏈球菌Cas9、
金黃色葡萄球菌Cas9、
新澤西弗朗西斯菌Cpf1、
胺基酸球菌屬物種Cpf1、
毛螺菌科細菌Cpf1、C至T鹼基編輯子、A至G鹼基編輯子、Cas12a及CasX。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含選自以下中之一者之多肽：釀膿鏈球菌Cas9、
腦膜炎雙球菌Cas9 (例如Nme2Cas9)、
嗜熱鏈球菌Cas9、
金黃色葡萄球菌Cas9、
新澤西弗朗西斯菌Cpf1、
胺基酸球菌屬物種Cpf1、
毛螺菌科細菌Cpf1、C至T鹼基編輯子、A至G鹼基編輯子、Cas12a及CasX。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係釀膿鏈球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係
腦膜炎雙球菌Cas9，例如Nme2Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係
嗜熱鏈球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係
金黃色葡萄球菌Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係來自
新澤西弗朗西斯菌之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係來自
胺基酸球菌屬物種之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係來自
毛螺菌科細菌 ND2006之Cpf1。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係C至T鹼基編輯子。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係A至G鹼基編輯子。在一些實施例中，鹼基編輯子包含去胺酶及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶係SpyCas9切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶包含NmeCas9切口酶。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas12a。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係CasX。在一些實施例中，HLA-A蛋白之表面表現(
即經工程改造細胞)由此減少或消除。
在一些實施例中，該等方法包括製造相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，該等方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含(a)指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌或
腦膜炎雙球菌(例如Nme2) Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係釀膿鏈球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，HLA-A B蛋白之表面表現(
即經工程改造細胞)由此減少或消除。
在一些實施例中，該等方法包括製造相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，該等方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含(a) HLA-A指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 301-590之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表4、表5B及表6中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表5A或表7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b)第一RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；及使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含(a) HLA-B指導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌或
腦膜炎雙球菌(例如Nme2) Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係釀膿鏈球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，HLA-B蛋白之表面表現(
即經工程改造細胞)由此減少或消除。
在一些實施例中，減少或消除HLA-A或HLA-B蛋白之表面表現之方法包括使細胞與本文所揭示之HLA-A或HLA-B指導RNA中之任一或多者接觸。
在一些實施例中，提供組成物，其包含a) HLA-B指導RNA，其包含：(i)選自SEQ ID NO: 1-91或101-185之指導序列；或(ii).選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或(iv)結合包含
表 2-3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%、80%、75%或70%一致之指導序列；及視情況地b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，組成物進一步包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，組成物包含RNA指導之DNA結合劑，其係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係釀膿鏈球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。
在一些實施例中，組成物進一步包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑使用HLA-A或HLA-B基因體靶序列產生胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)轉化。在一些實施例中，組成物包含RNA指導之DNA結合劑，其使用HLA-A或HLA-B基因體靶序列產生腺苷(A)至鳥嘌呤(G)轉化。
在一些實施例中，提供藉由本文所述之方法產生之經工程改造之人類細胞。在一些實施例中，藉由本文所述之方法及組成物產生之經工程改造之人類細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，該等方法產生組成物，其包含具有減少或消除的HLA-A或HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞。在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法產生之經工程改造之人類細胞引發與未經修飾之細胞相比CD8+ T細胞減少的反應，如在含有CD8+ T細胞之
活體外細胞培養分析中所量測。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，提供由包含醫藥學上可接受之載劑之本文所揭示組成物產生之細胞。在一些實施例中，提供包含本文所揭示細胞之組成物。
1. HLA-B 指導 RNA
本文所提供之方法及組成物揭示可用於減少或消除HLA-B蛋白之表面表現之指導RNA。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至HLA-A基因體靶序列且在本文中可稱為「HLA-B指導RNA」。在一些實施例中，HLA-B指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類HLA-B基因體靶序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-91之指導序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-185之指導序列。
在一些實施例中，提供組成物，其包含本文所述之HLA-B指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，提供組成物，其包含含有選自SEQ ID NO: 1-91或101-185之指導序列之HLA-B單指導RNA (sgRNA)。在一些實施例中，提供組成物，其包含本文所述之HLA-B sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，提供組成物，其包含含有選自SEQ ID NO: 1-91或101-185之指導序列之HLA-B雙指導RNA (dgRNA)。在一些實施例中，提供組成物，其包含本文所述之HLA-B dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 1-91或101-185中之任一者之指導序列。例示性HLA-B指導序列顯示於下
表 2(SEQ ID NO: 1-91)及
表 3 (SEQ ID NO: 101-185)中。
在一些實施例中，HLA-A gRNA係sgRNA，其包含如下
表 2(SEQ ID NO: 1001-1091及2001-2091)、
表 3 (SEQ ID NO: 1101-1185及2101-2185)及
表 3A(SEQ ID NO: 2186-2191)中所顯示之序列。
表2. 例示性HLA-B Spy指導RNA
表3. 例示性
腦膜炎雙球菌(Nme) HLA-B指導RNA
* 此表中所揭示之指導序列可未經修飾，用該表中所顯示之例示性修飾模式修飾，或用本文所揭示或此項技術中可獲得之不同修飾模式修飾。
表
3A. 其他例示性 腦膜炎雙球菌 (Nme) HLA-B 指導 RNA
* 此表中所揭示之指導序列可未經修飾，用該表中所顯示之例示性修飾模式修飾，或用本文所揭示或此項技術中可獲得之不同修飾模式修飾。
| 指導物ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1001-1091) | 例示性指導RNA 修飾之序列(SEQ ID NO: 2001-2091) | 基因體坐標(hg38) |
| G022008 | 1 | CCAGCCUGGACGCAGGCACC | CCAGCCUGGACGCAGGCACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mA*GCCUGGACGCAGGCACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355718-31355738 |
| G022009 | 2 | AGGCGCUUUGCAUCUCUCAU | AGGCGCUUUGCAUCUCUCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mG*CGCUUUGCAUCUCUCAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355616-31355636 |
| G022010 | 3 | AACAAUGCCCACGAUGGGGA | AACAAUGCCCACGAUGGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mA*mC*AAUGCCCACGAUGGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355182-31355202 |
| G022011 | 4 | CCAGACACCAGCCUGGACGC | CCAGACACCAGCCUGGACGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mA*GACACCAGCCUGGACGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355711-31355731 |
| G022012 | 5 | CCAUCUCCUAUAGGUCGCCG | CCAUCUCCUAUAGGUCGCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mA*UCUCCUAUAGGUCGCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356120-31356140 |
| G022013 | 6 | CUUCUCUCUAGGACAAUUAA | CUUCUCUCUAGGACAAUUAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mU*CUCUCUAGGACAAUUAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31270893-31270913 |
| G022014 | 7 | CCCCAUCUCCUAUAGGUCGC | CCCCAUCUCCUAUAGGUCGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mC*CAUCUCCUAUAGGUCGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356122-31356142 |
| G022015 | 8 | GGAUCUCGGACCCGGAGACU | GGAUCUCGGACCCGGAGACUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mA*UCUCGGACCCGGAGACUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354563-31354583 |
| G022016 | 9 | CUUCCUCCCAGUCCCCUCAC | CUUCCUCCCAGUCCCCUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mU*CCUCCCAGUCCCCUCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354682-31354702 |
| G022017 | 10 | CUCCUGUCCCACGUCUCCUG | CUCCUGUCCCACGUCUCCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mC*CUGUCCCACGUCUCCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355900-31355920 |
| G022018 | 11 | CCAUUUUCCUCCUCUUCUCG | CCAUUUUCCUCCUCUUCUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mA*UUUUCCUCCUCUUCUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356086-31356106 |
| G022019 | 12 | GGUUCCCAAGGCUGCUGCAG | GGUUCCCAAGGCUGCUGCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mU*UCCCAAGGCUGCUGCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356623-31356643 |
| G022020 | 13 | ACAUGCCAUGUACAGCAUGA | ACAUGCCAUGUACAGCAUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mA*UGCCAUGUACAGCAUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355348-31355368 |
| G022021 | 14 | CGGUUCCCAAGGCUGCUGCA | CGGUUCCCAAGGCUGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mG*UUCCCAAGGCUGCUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355899-31355919 |
| G022022 | 15 | AACGCGCCUGGGGCUCUCGC | AACGCGCCUGGGGCUCUCGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mA*mC*GCGCCUGGGGCUCUCGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356539-31356559 |
| G022023 | 16 | UGGUGGGGGUGGGAGUGUGG | UGGUGGGGGUGGGAGUGUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mG*UGGGGGUGGGAGUGUGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31357031-31357051 |
| G022024 | 17 | GAGUCUCUGAGCGGGGAACA | GAGUCUCUGAGCGGGGAACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mG*UCUCUGAGCGGGGAACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355713-31355733 |
| G022025 | 18 | GGGAGGAGCGAGGGGACCGC | GGGAGGAGCGAGGGGACCGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mG*AGGAGCGAGGGGACCGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355180-31355200 |
| G022026 | 19 | UGAGGGGACUGGGAGGAAGC | UGAGGGGACUGGGAGGAAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mA*GGGGACUGGGAGGAAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356601-31356621 |
| G022027 | 20 | CUGCGUCCAGGCUGGUGUCU | CUGCGUCCAGGCUGGUGUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mG*CGUCCAGGCUGGUGUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31270992-31271012 |
| G022028 | 21 | CCUCGACCGGCGAGAGCCCC | CCUCGACCGGCGAGAGCCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mU*CGACCGGCGAGAGCCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356548-31356568 |
| G022029 | 22 | AACACGAGGAAAGCAAGUGU | AACACGAGGAAAGCAAGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mA*mC*ACGAGGAAAGCAAGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354795-31354815 |
| G022030 | 23 | ACUUUACCUCCACUCAGAUC | ACUUUACCUCCACUCAGAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mU*UUACCUCCACUCAGAUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355803-31355823 |
| G022031 | 24 | UCUGCUCCUGAUCUGAGUGG | UCUGCUCCUGAUCUGAGUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mC*mU*GCUCCUGAUCUGAGUGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356486-31356506 |
| G022032 | 25 | AUCUCGGACCCGGAGACUCG | AUCUCGGACCCGGAGACUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mU*mC*UCGGACCCGGAGACUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354820-31354840 |
| G022033 | 26 | CCUGGGGCUCUCGCCGGUCG | CCUGGGGCUCUCGCCGGUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mU*GGGGCUCUCGCCGGUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356545-31356565 |
| G022034 | 27 | CUGGUCACAUGGGUGGUCCU | CUGGUCACAUGGGUGGUCCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mG*GUCACAUGGGUGGUCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356501-31356521 |
| G022035 | 28 | CUCCUAUAGGUCGCCGGGGA | CUCCUAUAGGUCGCCGGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mC*CUAUAGGUCGCCGGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356116-31356136 |
| G022036 | 29 | GUAAAGUGACUCAGAAGUGC | GUAAAGUGACUCAGAAGUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mU*mA*AAGUGACUCAGAAGUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355816-31355836 |
| G022037 | 30 | ACACAGGGGCUAACGCAGCC | ACACAGGGGCUAACGCAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mA*CAGGGGCUAACGCAGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354983-31355003 |
| G022038 | 31 | AUACUUCUGGAAAUUCCUUU | AUACUUCUGGAAAUUCCUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mU*mA*CUUCUGGAAAUUCCUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354748-31354768 |
| G022039 | 32 | GUCCUAGCAGUUGUGGUCAU | GUCCUAGCAGUUGUGGUCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mU*mC*CUAGCAGUUGUGGUCAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355150-31355170 |
| G022040 | 33 | CCCAUCUCCUAUAGGUCGCC | CCCAUCUCCUAUAGGUCGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mC*AUCUCCUAUAGGUCGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356121-31356141 |
| G022041 | 34 | CGACCUAUAGGAGAUGGGGA | CGACCUAUAGGAGAUGGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mA*CCUAUAGGAGAUGGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356123-31356143 |
| G022042 | 35 | GAAGUAUGACUACAGACCCA | GAAGUAUGACUACAGACCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mA*GUAUGACUACAGACCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354761-31354781 |
| G022043 | 36 | CUCCGAUGACCACAACUGCU | CUCCGAUGACCACAACUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mC*CGAUGACCACAACUGCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355145-31355165 |
| G022044 | 37 | AGUUGUGGUCAUCGGAGCUG | AGUUGUGGUCAUCGGAGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mU*UGUGGUCAUCGGAGCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355142-31355162 |
| G022045 | 38 | UACUUCUGGAAAUUCCUUUU | UACUUCUGGAAAUUCCUUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mA*mC*UUCUGGAAAUUCCUUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31354747-31354767 |
| G022046 | 39 | CACAUGCCAUGUACAGCAUG | CACAUGCCAUGUACAGCAUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mA*mC*AUGCCAUGUACAGCAUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355349-31355369 |
| G022047 | 40 | GGAGCGAGGGGACCGCAGGC | GGAGCGAGGGGACCGCAGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mA*GCGAGGGGACCGCAGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31357027-31357047 |
| G022048 | 41 | AGGAAAAGUCACGGUUCCCA | AGGAAAAGUCACGGUUCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mG*AAAAGUCACGGUUCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355888-31355908 |
| G022049 | 42 | GAGCCUUCCCCAUCUCCUAU | GAGCCUUCCCCAUCUCCUAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mG*CCUUCCCCAUCUCCUAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356129-31356149 |
| G022050 | 43 | GACUCCCCAUCCCCCACGUA | GACUCCCCAUCCCCCACGUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mC*UCCCCAUCCCCCACGUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356636-31356656 |
| G022051 | 44 | CCCGGCGACCUAUAGGAGAU | CCCGGCGACCUAUAGGAGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mC*GGCGACCUAUAGGAGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356118-31356138 |
| G022052 | 45 | ACGGUUCCCAAGGCUGCUGC | ACGGUUCCCAAGGCUGCUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mG*GUUCCCAAGGCUGCUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355898-31355918 |
| G022053 | 46 | GGGAGUCGUGACCUGCGCCC | GGGAGUCGUGACCUGCGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mG*AGUCGUGACCUGCGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31356649-31356669 |
| G022054 | 47 | GAGCGAGGGGACCGCAGGCG | GAGCGAGGGGACCGCAGGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mG*CGAGGGGACCGCAGGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31357026-31357046 |
| G022055 | 48 | CCUGGCUGUCCUAGCAGUUG | CCUGGCUGUCCUAGCAGUUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mU*GGCUGUCCUAGCAGUUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31355157-31355177 |
| G027488 | 49 | ACAUGCCAUGUACAGCAUGA | ACAUGCCAUGUACAGCAUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mA*mC*mA*UGCCAUGUACAGCAUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355348-31355368 |
| G027489 | 50 | AACAAUGCCCACGAUGGGGA | AACAAUGCCCACGAUGGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mA*mA*mC*AAUGCCCACGAUGGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355182-31355202 |
| G027490 | 51 | CUCCGAUGACCACAACUGCU | CUCCGAUGACCACAACUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mU*mC*CGAUGACCACAACUGCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355145-31355165 |
| G027491 | 52 | CACAUGCCAUGUACAGCAUG | CACAUGCCAUGUACAGCAUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mA*mC*AUGCCAUGUACAGCAUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355349-31355369 |
| G027973 | 53 | CCGGACGGGCGCCUCCUCCG | CCGGACGGGCGCCUCCUCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mG*GACGGGCGCCUCCUCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31356381-31356401 |
| G027974 | 54 | CGGACGGGCGCCUCCUCCGC | CGGACGGGCGCCUCCUCCGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mG*mG*ACGGGCGCCUCCUCCGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31356380-31356400 |
| G027975 | 55 | GAGCCGUCUUCCCAGUCCAC | GUGGACUGGGAAGACGGCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mU*mG*GACUGGGAAGACGGCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355204-31355224 |
| G027976 | 56 | AGAGCCGUCUUCCCAGUCCA | UGGACUGGGAAGACGGCUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mU*mG*mG*ACUGGGAAGACGGCUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355205-31355225 |
| G027977 | 57 | GUACGGCUGCGACGUGGGGC | GUACGGCUGCGACGUGGGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mU*mA*CGGCUGCGACGUGGGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31356400-31356420 |
| G027978 | 58 | CCGUCCCCAUCGUGGGCAUU | AAUGCCCACGAUGGGGACGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mA*mA*mU*GCCCACGAUGGGGACGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355185-31355205 |
| G027979 | 59 | UCGCUGCUGUGAUGUGUAGG | UCGCUGCUGUGAUGUGUAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mU*mC*mG*CUGCUGUGAUGUGUAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355119-31355139 |
| G027980 | 60 | UGGUCGCUGCUGUGAUGUGU | UGGUCGCUGCUGUGAUGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mU*mG*mG*UCGCUGCUGUGAUGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355122-31355142 |
| G027981 | 61 | CCAGGCAGCGACAGUGCCCA | CCAGGCAGCGACAGUGCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mA*GGCAGCGACAGUGCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31354510-31354530 |
| G027982 | 62 | GGCAGCGACAGUGCCCAGGG | CCCUGGGCACUGUCGCUGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mC*UGGGCACUGUCGCUGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31354507-31354527 |
| G027983 | 63 | UCCAGGCAGCGACAGUGCCC | UCCAGGCAGCGACAGUGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mU*mC*mC*AGGCAGCGACAGUGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31354511-31354531 |
| G027984 | 64 | AGUCCACCGUCCCCAUCGUG | CACGAUGGGGACGGUGGACUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mA*mC*GAUGGGGACGGUGGACUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355191-31355211 |
| G027985 | 65 | CAGUCCACCGUCCCCAUCGU | CAGUCCACCGUCCCCAUCGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mA*mG*UCCACCGUCCCCAUCGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355192-31355212 |
| G027986 | 66 | GUCCACCGUCCCCAUCGUGG | CCACGAUGGGGACGGUGGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mA*CGAUGGGGACGGUGGACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355190-31355210 |
| G027987 | 67 | CCAGUCCACCGUCCCCAUCG | CCAGUCCACCGUCCCCAUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mA*GUCCACCGUCCCCAUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355193-31355213 |
| G027988 | 68 | UCUUCCCAGUCCACCGUCCC | GGGACGGUGGACUGGGAAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mG*mG*ACGGUGGACUGGGAAGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355198-31355218 |
| G027989 | 69 | CGAAGCCCCUCACCCUGAGA | CGAAGCCCCUCACCCUGAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mG*mA*AGCCCCUCACCCUGAGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355320-31355340 |
| G027990 | 70 | GAAGCCCCUCACCCUGAGAU | GAAGCCCCUCACCCUGAGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mA*mA*GCCCCUCACCCUGAGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355319-31355339 |
| G027991 | 71 | UCCCCAUCGUGGGCAUUGUU | AACAAUGCCCACGAUGGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mA*mA*mC*AAUGCCCACGAUGGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355182-31355202 |
| G027992 | 72 | AGUUGUGGUCAUCGGAGCUG | AGUUGUGGUCAUCGGAGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mA*mG*mU*UGUGGUCAUCGGAGCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355142-31355162 |
| G027993 | 73 | CAUCGUGGGCAUUGUUGCUG | CAGCAACAAUGCCCACGAUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mA*mG*CAACAAUGCCCACGAUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355178-31355198 |
| G027994 | 74 | CAUGCCAUGUACAGCAUGAG | CAUGCCAUGUACAGCAUGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mA*mU*GCCAUGUACAGCAUGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355347-31355367 |
| G027995 | 75 | GGCUGUCCUAGCAGUUGUGG | CCACAACUGCUAGGACAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mA*CAACUGCUAGGACAGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355154-31355174 |
| G027996 | 76 | AUCGUGGGCAUUGUUGCUGG | CCAGCAACAAUGCCCACGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mA*GCAACAAUGCCCACGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355177-31355197 |
| G027997 | 77 | CCCAUCGUGGGCAUUGUUGC | CCCAUCGUGGGCAUUGUUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mC*AUCGUGGGCAUUGUUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355180-31355200 |
| G027998 | 78 | CCUGGCUGUCCUAGCAGUUG | CCUGGCUGUCCUAGCAGUUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mU*GGCUGUCCUAGCAGUUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355157-31355177 |
| G027999 | 79 | CGUGGGCAUUGUUGCUGGCC | CGUGGGCAUUGUUGCUGGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mG*mU*GGGCAUUGUUGCUGGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355175-31355195 |
| G028000 | 80 | AGCAGUUGUGGUCAUCGGAG | CUCCGAUGACCACAACUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mU*mC*CGAUGACCACAACUGCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355145-31355165 |
| G028001 | 81 | CUUGUGGAGACCAGACCAGC | CUUGUGGAGACCAGACCAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mU*mU*GUGGAGACCAGACCAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355432-31355452 |
| G028002 | 82 | UGUACAGCAUGAGGGGCUGC | GCAGCCCCUCAUGCUGUACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mC*mA*GCCCCUCAUGCUGUACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355340-31355360 |
| G028003 | 83 | UCGUGGGCAUUGUUGCUGGC | GCCAGCAACAAUGCCCACGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mC*mC*AGCAACAAUGCCCACGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355176-31355196 |
| G028004 | 84 | GUCCUAGCAGUUGUGGUCAU | GUCCUAGCAGUUGUGGUCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mU*mC*CUAGCAGUUGUGGUCAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355150-31355170 |
| G028005 | 85 | GUGUCUCUCACAGCUUGAAA | GUGUCUCUCACAGCUUGAAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mU*mG*UCUCUCACAGCUUGAAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31354480-31354500 |
| G028006 | 86 | UCAGACCCCCCAAAGACACA | UGUGUCUUUGGGGGGUCUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mU*mG*mU*GUCUUUGGGGGGUCUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355576-31355596 |
| G028007 | 87 | CUCCUCAGACGCCGAGAUGC | CUCCUCAGACGCCGAGAUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mU*mC*CUCAGACGCCGAGAUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31357154-31357174 |
| G028008 | 88 | GAGAUAGAACCUUCCAGAAG | GAGAUAGAACCUUCCAGAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mA*mG*AUAGAACCUUCCAGAAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355410-31355430 |
| G028009 | 89 | GACCAGCAGGAGAUAGAACC | GGUUCUAUCUCCUGCUGGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mG*mG*mU*UCUAUCUCCUGCUGGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355419-31355439 |
| G028010 | 90 | GCAGGAGAUAGAACCUUCCA | UGGAAGGUUCUAUCUCCUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mU*mG*mG*AAGGUUCUAUCUCCUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355414-31355434 |
| G028011 | 91 | AGAUAGAACCUUCCAGAAGU | AGAUAGAACCUUCCAGAAGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mA*mG*mA*UAGAACCUUCCAGAAGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr6:31355409-31355429 |
| 指導物ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1101-1185) | 例示性指導RNA 修飾之序列(SEQ ID NO: 2101-2185) | 基因體坐標(hg38) |
| G028789 | 101 | CUUCUGGAGAAGAGCAGAGAUACA | CUUCUGGAGAAGAGCAGAGAUACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mCmUGGmAmGAmAGmAGCAGmAGAUmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355361-31355385 |
| G028790 | 102 | CACAUGCCAUGUACAGCAUGAGGG | CACAUGCCAUGUACAGCAUGAGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmUGCmCmAUmGUmACAGCmAUGAmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355339-31355363 |
| G028791 | 103 | CACUGACCUGGCAGCGGGAUGGCG | CACUGACCUGGCAGCGGGAUGGCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmGACmCmUGmGCmAGCGGmGAUGmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355469-31355493 |
| G028792 | 104 | CCAUGUACAGCAUGAGGGGCUGCC | CCAUGUACAGCAUGAGGGGCUGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmGUAmCmAGmCAmUGAGGmGGCUmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355333-31355357 |
| G028793 | 105 | CUUACACGCAGCCUGAGAGUAGCU | CUUACACGCAGCCUGAGAGUAGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mAmCACmGmCAmGCmCUGAGmAGUAmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31354627-31354651 |
| G028794 | 106 | AGCUGCCCACUUCUGGAAGGUUCU | AGCUGCCCACUUCUGGAAGGUUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mUmGCCmCmACmUUmCUGGAmAGGUmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355401-31355425 |
| G028795 | 107 | CUUCCAGAAGUGGGCAGCUGUGGU | CUUCCAGAAGUGGGCAGCUGUGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mCmCAGmAmAGmUGmGGCAGmCUGUmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355390-31355414 |
| G028796 | 108 | CCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUCGG | CCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUCGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmCUCmAmGGmGUmGAGGGmGCUUmCGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355317-31355341 |
| G028797 | 109 | CAUCUCAGGGUGAGGGGCUUCGGC | CAUCUCAGGGUGAGGGGCUUCGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mU*mCmUCAmGmGGmUGmAGGGGmCUUCmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355318-31355342 |
| G028798 | 110 | CAGCAUGAGGGGCUGCCGAAGCCC | CAGCAUGAGGGGCUGCCGAAGCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mCmAUGmAmGGmGGmCUGCCmGAAGmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355326-31355350 |
| G028799 | 111 | CCCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUCG | CCCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mAmUCUmCmAGmGGmUGAGGmGGCUmUCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355316-31355340 |
| G028800 | 112 | AUGUACAGCAUGAGGGGCUGCCGA | AUGUACAGCAUGAGGGGCUGCCGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mG*mUmACAmGmCAmUGmAGGGGmCUGCmCGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355331-31355355 |
| G028801 | 113 | CAUGUACAGCAUGAGGGGCUGCCG | CAUGUACAGCAUGAGGGGCUGCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mU*mGmUACmAmGCmAUmGAGGGmGCUGmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355332-31355356 |
| G028802 | 114 | AGAUCACCCAGCGCAAGUGGGAGG | AGAUCACCCAGCGCAAGUGGGAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mUmCACmCmCAmGCmGCAAGmUGGGmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356262-31356286 |
| G028803 | 115 | CAGAUCACCCAGCGCAAGUGGGAG | CAGAUCACCCAGCGCAAGUGGGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mAmUCAmCmCCmAGmCGCAAmGUGGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356263-31356287 |
| G028804 | 116 | GCCUCCCACUUGCGCUGGGUGAUC | GCCUCCCACUUGCGCUGGGUGAUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mUmCCCmAmCUmUGmCGCUGmGGUGmAUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356267-31356291 |
| G028805 | 117 | CCCAAUACUCCGGCCCCUCCUGCU | CCCAAUACUCCGGCCCCUCCUGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mAmAUAmCmUCmCGmGCCCCmUCCUmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356777-31356801 |
| G028806 | 118 | CACUCACCGGCCCAGGUCUCGGUC | CACUCACCGGCCCAGGUCUCGGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmCACmCmGGmCCmCAGGUmCUCGmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31357078-31357102 |
| G028807 | 119 | UAGAGCAGGAGGGGCCGGAGUAUU | UAGAGCAGGAGGGGCCGGAGUAUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mG*mAmGCAmGmGAmGGmGGCCGmGAGUmAUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356774-31356798 |
| G028808 | 120 | CCGGCCCAGGUCUCGGUCAGGGCC | CCGGCCCAGGUCUCGGUCAGGGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mGmCCCmAmGGmUCmUCGGUmCAGGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31357084-31357108 |
| G028809 | 121 | ACCACUUACACGCAGCCUGAGAGU | ACCACUUACACGCAGCCUGAGAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mAmCUUmAmCAmCGmCAGCCmUGAGmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31354623-31354647 |
| G028810 | 122 | CCACUUACACGCAGCCUGAGAGUA | CCACUUACACGCAGCCUGAGAGUAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mCmUUAmCmACmGCmAGCCUmGAGAmGUAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31354624-31354648 |
| G028811 | 123 | UAUCUGCGGAGCCACUCCACGCAC | UAUCUGCGGAGCCACUCCACGCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mU*mCmUGCmGmGAmGCmCACUCmCACGmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356201-31356225 |
| G028812 | 124 | AGCCUGAGAGUAGCUCCCUCCUUU | AGCCUGAGAGUAGCUCCCUCCUUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mCmUGAmGmAGmUAmGCUCCmCUCCmUUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31354636-31354660 |
| G028813 | 125 | CCUGAGUUUGGUCCUCGCCAUCCC | CCUGAGUUUGGUCCUCGCCAUCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmAGUmUmUGmGUmCCUCGmCCAUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355460-31355484 |
| G028814 | 126 | GUGUAUCUCUGCUCUUCUCCAGAA | GUGUAUCUCUGCUCUUCUCCAGAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mUmAUCmUmCUmGCmUCUUCmUCCAmGAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355366-31355390 |
| G028815 | 127 | CUUCUCCAGAAGGCACCACCACAG | CUUCUCCAGAAGGCACCACCACAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mCmUCCmAmGAmAGmGCACCmACCAmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355379-31355403 |
| G028816 | 128 | UACAUGGCAUGUGUAUCUCUGCUC | UACAUGGCAUGUGUAUCUCUGCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mAmUGGmCmAUmGUmGUAUCmUCUGmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355356-31355380 |
| G028817 | 129 | UAUCUCUGCUCUUCUCCAGAAGGC | UAUCUCUGCUCUUCUCCAGAAGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mU*mCmUCUmGmCUmCUmUCUCCmAGAAmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355369-31355393 |
| G028818 | 130 | UGCUAGGACAGCCAGGCCAGCAAC | UGCUAGGACAGCCAGGCCAGCAACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mUmAGGmAmCAmGCmCAGGCmCAGCmAACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355161-31355185 |
| G028819 | 131 | GCUAGGACAGCCAGGCCAGCAACA | GCUAGGACAGCCAGGCCAGCAACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mAmGGAmCmAGmCCmAGGCCmAGCAmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355162-31355186 |
| G028820 | 132 | GCUCCGAUGACCACAACUGCUAGG | GCUCCGAUGACCACAACUGCUAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mCmCGAmUmGAmCCmACAACmUGCUmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355144-31355168 |
| G028821 | 133 | UCGUGGGCAUUGUUGCUGGCCUGG | UCGUGGGCAUUGUUGCUGGCCUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mG*mUmGGGmCmAUmUGmUUGCUmGGCCmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355166-31355190 |
| G028822 | 134 | GAUGACCACAACUGCUAGGACAGC | GAUGACCACAACUGCUAGGACAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mU*mGmACCmAmCAmACmUGCUAmGGACmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355149-31355173 |
| G028823 | 135 | GUCCUCGUUCAGGGCGAUGUAAUC | GUCCUCGUUCAGGGCGAUGUAAUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mC*mCmUCGmUmUCmAGmGGCGAmUGUAmAUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356326-31356350 |
| G028824 | 136 | CGCAGCCUGAGAGUAGCUCCCUCC | CGCAGCCUGAGAGUAGCUCCCUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mAmGCCmUmGAmGAmGUAGCmUCCCmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31354633-31354657 |
| G028825 | 137 | GGUCAGUGUGAUCUCCGCAGGGUA | GGUCAGUGUGAUCUCCGCAGGGUAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mCmAGUmGmUGmAUmCUCCGmCAGGmGUAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355491-31355515 |
| G028826 | 138 | GUCAGUGUGAUCUCCGCAGGGUAG | GUCAGUGUGAUCUCCGCAGGGUAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mC*mAmGUGmUmGAmUCmUCCGCmAGGGmUAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355492-31355516 |
| G028827 | 139 | UACAUCGCCCUGAACGAGGACCUG | UACAUCGCCCUGAACGAGGACCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mAmUCGmCmCCmUGmAACGAmGGACmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356317-31356341 |
| G028828 | 140 | GGCUCCCACUCCAUGAGGUAUUUC | GGCUCCCACUCCAUGAGGUAUUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mC*mUmCCCmAmCUmCCmAUGAGmGUAUmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356928-31356952 |
| G028829 | 141 | UCUUCUCCAGAAGGCACCACCACA | UCUUCUCCAGAAGGCACCACCACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mUmCUCmCmAGmAAmGGCACmCACCmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355378-31355402 |
| G028830 | 142 | AGCAUGAGGGGCUGCCGAAGCCCC | AGCAUGAGGGGCUGCCGAAGCCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mAmUGAmGmGGmGCmUGCCGmAAGCmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355325-31355349 |
| G028831 | 143 | AGACCAGACCAGCAGGAGAUAGAA | AGACCAGACCAGCAGGAGAUAGAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mCmCAGmAmCCmAGmCAGGAmGAUAmGAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355415-31355439 |
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| G032806 | 177 | UCCCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCA | UCCCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mCmAGAmGmCCmGUmCUUCCmCAGUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355205-31355229 |
| G032807 | 178 | CCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCACC | CCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmAGCmCmGUmCUmUCCCAmGUCCmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31355203-31355227 |
| G032808 | 179 | GUGUUCCGGUCCCAAUACUCCGGC | GUGUUCCGGUCCCAAUACUCCGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mUmUCCmGmGUmCCmCAAUAmCUCCmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356767-31356791 |
| G032809 | 180 | UGGAGGGUGUGAGACCCUGGCCCC | UGGAGGGUGUGAGACCCUGGCCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mAmGGGmUmGUmGAmGACCCmUGGCmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356426-31356450 |
| G032810 | 181 | CCGGCCCCUCCUGCUCUAUCCACG | CCGGCCCCUCCUGCUCUAUCCACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mGmCCCmCmUCmCUmGCUCUmAUCCmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356786-31356810 |
| G032811 | 182 | UCCCACUUGCGCUGGGUGAUCUGA | UCCCACUUGCGCUGGGUGAUCUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mCmACUmUmGCmGCmUGGGUmGAUCmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356270-31356294 |
| G032812 | 183 | CACAGACUGACCGAGAGAGCCUGC | CACAGACUGACCGAGAGAGCCUGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmGACmUmGAmCCmGAGAGmAGCCmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31356723-31356747 |
| G032813 | 184 | UGCUGGUCAUGGCGCCCCGAACCG | UGCUGGUCAUGGCGCCCCGAACCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mUmGGUmCmAUmGGmCGCCCmCGAAmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31357133-31357157 |
| G028919 | 185 | CACAUCAGAGCCCUGGGCACUGUC | CACAUCAGAGCCCUGGGCACUGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmUCAmGmAGmCCmCUGGGmCACUmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:31354497-31354521 |
| 指導物ID | 指導序列 | 例示性指導RNA 修飾之序列(SEQ ID NO: 2186-2191) |
| G034206 | CAAACUCAGGACACUGAGCUUGUG (SEQ ID NO: 163) | mC*mA*mA*mAmCUCmAmGGmACmACUGAmGCUUmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2186) |
| G034207 | UCAGGACACUGAGCUUGUGGAGAC (SEQ ID NO: 164) | mU*mC*mA*mGmGACmAmCUmGAmGCUUGmUGGAmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2187) |
| G034208 | UCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGAG (SEQ ID NO: 165) | mU*mC*mU*mGmGGAmAmAGmGAmGGGGAmAGAUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2188) |
| G034209 | CUCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGA (SEQ ID NO: 166) | mC*mU*mC*mUmGGGmAmAAmGGmAGGGGmAAGAmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2189) |
| G034210 | CUGGAGGGUGUGAGACCCUGGCCC (SEQ ID NO: 169) | mC*mU*mG*mGmAGGmGmUGmUGmAGACCmCUGGmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2190) |
| G034211 | UCCCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCA (SEQ ID NO: 177) | mU*mC*mC*mCmAGAmGmCCmGUmCUUCCmCAGUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2191) |
在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 1-91中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 3、13、18、32、36、39、48-56、58、64-71、73-73、80-82、86及88-91中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 3、13、36、39、49-56、64-71、74、80-82、88及90-91中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 13、39、49、52、65、74、82及91中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 3、39及49-52中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 3、36、39、49、50、51及52中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 39、49及52中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 49、52-54、55、56、64、65、67-71、73-74、80-82及90中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 49、51、74、81及82中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含SEQ ID NO: 13或74之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含SEQ ID NO: 13之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含SEQ ID NO: 74之指導序列。
在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 101-185中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、107、114、117、118、125-129、137、138、141、143、144、145、159、160、163、164、165、166、169、171、172、173、176、177、178、179及180中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 65及74中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 49、52-54、56、64-65、67-71、73-74、80-82、88及90-91中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-B gRNA包含選自SEQ ID NO: 74、82及91中之任一者之指導序列。
在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 1-91或101-185中之任一者之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、107、117、125-129、137、138、141、143、144、145、159、160、163、164、165、166、169、171、172、173、176、177、178、179及180中之任一者之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、117、118、125-128、133、137-138、141、143-144、159、163、164、165、166、169、171、173、177、178及180中之任一者之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 101、106、114、117-118、125-128、133、137-138、141、143-144、159、163、164、165、166、169、171、173、177、178及180中之任一者之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 101、117-118、125-128、137-138、144、159、163、164、165、166、169、177、178及180中之任一者之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 101、117、127、137-138、163、164、165、166、169及177中之任一者之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 163-166、169及177中之任一者之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 2186-2191中之任一者之序列。在一些實施例中，gRNA包含含有SEQ ID NO: 163之序列之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含含有SEQ ID NO: 164之序列之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含含有SEQ ID NO: 165之序列之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含含有SEQ ID NO: 166之序列之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含含有SEQ ID NO: 169之序列之指導序列。在一些實施例中，gRNA包含含有SEQ ID NO: 177之序列之指導序列。
在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含為選自SEQ ID NO: 1-91或101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 1-91或101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 1-91或101-185之序列至少95%一致之指導序列。
在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含含有
表 2-3中所列之基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的指導序列。如本文所用，基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸意指例如基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸，其中基因體坐標包括來自
表 2-3中所列之范圍之5’方向上之10個核苷酸及3’方向上之10個核苷酸。舉例而言，HLA-B指導RNA可包含基因體坐標(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417- 31355441；或chr6:31356386-31356410內之10個鄰接核苷酸，包括該等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含指導序列，該指導序列係包含
表 2中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸，或與包含
表 3中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含與序列至少95%、90%或85%一致之指導序列，該序列選自為包含
表 2中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸之序列，或與包含
表 3中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
在一些實施例中，
表 2-3指導RNA包含含有
表 2-3中所列之基因體坐標之至少15個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的指導序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含含有
表 2-3中所列之基因體坐標之至少20個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的指導序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 22。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 24。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 29。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 36。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 37。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 38。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 39。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 40。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 41。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 42。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 43。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 44。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 46。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 47。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 49。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 50。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 51。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 52。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 53。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 54。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 57。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 59。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 62。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 63。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 64。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 67。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 69。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 71。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 72。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 73。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 74。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 75。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 76。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 77。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 79。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 80。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 81。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 82。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 83。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 84。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 85。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 86。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 87。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 88。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 89。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 90。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 91。
在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 102。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 103。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 105。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 106。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 108。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 109。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 110。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 111。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 112。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 113。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 114。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 115。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 116。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 118。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 119。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 120。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 121。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 122。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 123。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 124。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 126。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 127。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 128。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 129。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 130。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 131。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 132。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 133。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 134。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 135。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 136。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 137。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 138。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 139。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 140。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 141。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 144。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 145。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 146。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 147。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 148。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 149。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 150。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 151。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 152。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 153。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 154。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 155。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 156。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 157。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 158。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 159。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 160。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 161。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 162。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 163。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 164。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 165。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 166。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 167。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 168。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 169。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 170。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 171。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 172。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 173。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 174。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 175。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 176。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 177。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 178。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 179。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 180。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 181。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 182。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 183。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 184。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 185。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2186。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2187。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2188。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2189。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2190。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2191。
本文提供HLA-B指導RNA之其他實施例，包括例如對指導RNA之例示性修飾。
2. 對 HLA-B 之遺傳修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中HLA-B基因之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。遺傳修飾涵蓋因與基因編輯系統接觸產生之修飾群體(例如由Cas9及HLA-B指導RNA產生之編輯群體，或由BC22及HLA-B指導RNA產生之編輯群體)。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355596或(b) chr6:31355203-31356461。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355145- 31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380- 31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191- 31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198- 31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355347- 31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355182-31355202；chr6:31355349-31355369；chr6:31355348- 31355368；或chr6:31355145-31355165。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381- 31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205- 31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347- 31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340- 31355360；或chr6:31355414-31355434。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381- 31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191- 31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198- 31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182- 31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145- 31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409-31355429。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349-31355369；chr6:31355192- 31355212；chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；及chr6:31355409- 31355429。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355349-31355369或chr6:31355348-31355368。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355192-31355212或chr6:31355347-31355367。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；或chr6:31355340-31355360。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355361-31355385；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355356-31355380；chr6:31355366-31355390；chr6:31355417-31355441；chr6:31357078-31357102；chr6:31355460-31355484；chr6:31355415-31355439；chr6:31355166-31355190；chr6:31355378-31355402；chr6:31355401-31355425；chr6:31356262-31356286；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；ch6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764-31356788。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379- 31355403；ch6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355221- 31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446- 31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441-31355465。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205- 31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441- 31355465。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180- 31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157- 31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204- 31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191- 31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；及chr6:31355409- 31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6: 31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6: 31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6: 31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6: 31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6: 31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355221-31355245；chr6: 31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6: 31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6: 31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6: 31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6: 31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6: 31355417-31355441；或chr6:31356386-31356410。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348- 31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31356381- 31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205- 31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340- 31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409- 31355429。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355182-31355202；chr6:31355349- 31355369；chr6:31355348-31355368；或chr6:31355145-31355165。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349- 31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204- 31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192- 31355212；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320- 31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178- 31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355414-31355434。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355349- 31355369；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355205- 31355225；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355193- 31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319- 31355339；chr6:31355182-31355202；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347- 31355367；chr6:31355145-31355165；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340- 31355360；chr6:31355410-31355430；chr6:31355414-31355434；或chr6:31355409- 31355429。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368、chr6:31355349- 31355369、chr6:31355192-31355212、chr6:31355347-31355367、chr6:31355340- 31355360、chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355349-31355369或chr6:31355348-31355368。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355192-31355212或chr6:31355347-31355367。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355347-31355367；chr6:31355340-31355360；或chr6:31355409-31355429。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355348-31355368；chr6:31355145-31355165；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；或chr6:31355340-31355360。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492- 31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361- 31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078- 31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415- 31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401- 31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222- 31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425- 31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437- 31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764- 31356788。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492- 31355516；chr6:31355361-31355385；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491- 31355515；chr6:31355356-31355380；chr6:31355366-31355390；chr6:31355417- 31355441；chr6:31357078-31357102；chr6:31355460-31355484；chr6:31355415- 31355439；chr6:31355166-31355190；chr6:31355378-31355402；chr6:31355401- 31355425；及chr6:31356262-31356286；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222- 31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425- 31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437- 31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；或chr6:31356764- 31356788。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492- 31355516；chr6:31355379-31355403；ch6:31355491-31355515；chr6:31355361- 31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078- 31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355221- 31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446- 31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31355203- 31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763- 31356787；或chr6:31356764-31356788。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31356777-31356801；chr6:31355492- 31355516；chr6:31355379-31355403；ch6:31355491-31355515；chr6:31355361- 31355385；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205- 31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6:31355441- 31355465。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222- 31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425- 31356449；或chr6:31355441-31355465。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:31355182-31355202；chr6:31355348- 31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349- 31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380- 31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185- 31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190- 31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320- 31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347- 31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576- 31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414- 31355434；及chr6:31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6: 31355492-31355516；chr6:31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6: 31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6: 31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366-31355390；chr6: 31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166-31355190；chr6: 31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262-31356286；chr6: 31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369-31355393；chr6: 31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205-31355229；chr6: 31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441-31355465；chr6: 31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426-31356450；chr6: 31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762-31356786；chr6: 31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6:31356767-31356791。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390- 31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6:31356386-31356410。
在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺基中之任一或多者。在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含在靶序列中插入1個、2個、3個、4個或5個或更多個核苷酸。在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含在靶序列中缺失1個、2個、3個、4個或5個或更多個核苷酸。在其他實施例中，對HLA-B之修飾包含在靶序列中插入1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸。在其他實施例中，對HLA-B之修飾包含在靶序列中缺失1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸。在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含插入/缺失，其在此項技術中通常定義為少於1000個鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含插入/缺失，其在靶序列中產生框移突變。在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含在靶序列中取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸。在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含因納入模板核酸產生之核苷酸之插入、缺失或取代中之一或多者。在一些實施例中，對HLA-B之修飾包含在靶序列中插入供體核酸。在一些實施例中，對HLA-B之修飾並非瞬時的。
3. HLA-A 指導 RNA
本文所提供之方法及組成物揭示可用於減少或消除HLA-A蛋白之表面表現之指導RNA。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至HLA-A基因體靶序列且在本文中可稱為「HLA-A指導RNA」。在一些實施例中，HLA-A指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類HLA-A基因體靶序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301-428、429-462、463-511及512-590之指導序列。用於減少或消除HLA-A蛋白之表面表現及用於HLA-A之遺傳修飾之指導RNA的進一步詳細描述提供於PCT/US2021/064930中，該專利之全部內容皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，提供組成物，其包含本文所述之HLA-A指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，提供組成物，其包含含有選自SEQ ID NO: 301-590之指導序列之HLA-A單指導RNA (sgRNA)。在一些實施例中，提供組成物，其包含本文所述之HLA-A sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，提供組成物，其包含含有選自SEQ ID NO: 301-590之指導序列之HLA-A雙指導RNA (dgRNA)。在一些實施例中，提供組成物，其包含本文所述之HLA-A dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 301-590中之任一者之指導序列。例示性HLA-A指導序列顯示於下
表 4(SEQ ID NO: 301-428)、
表 5A及
表 5B (SEQ ID NO: 429-482)以及
表 6(SEQ ID NO:483-498、500-511)及表7 (SEQ ID NO: 512-590)中。在一些實施例中，HLA-A gRNA係sgRNA，其包含如下
表 4(SEQ ID NO: 1301-1428及2301-2428)、
表 6(SEQ ID NO: 1483-1498、1500-1511、2483-2498、2500-2511)、
表 7(SEQ ID NO: 1512-1590及2512-2590)及
表 9A(SEQ ID NO: 3111及3112)中所顯示之序列。
表 4. 例示性Spy HLA-A指導RNA
* 此表中所揭示之指導序列可未經修飾，用該表中所顯示之例示性修飾模式修飾，或用本文所揭示或此項技術中可獲得之不同修飾模式修飾。
表5A. 其他例示性HLA-A指導序列
* 此表中所揭示之指導序列可未經修飾，或用本文所揭示或此項技術中可獲得之修飾模式修飾。
表6. 其他例示性HLA-A指導序列。
* 此表中所揭示之指導序列可未經修飾，用該表中所顯示之例示性修飾模式修飾，或用本文所揭示或此項技術中可獲得之不同修飾模式修飾。
表7. 其他例示性HLA-A Nme指導序列
| 指導物ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性全序列(SEQ ID NO: 1301-1428) | 例示性Mod 序列(四個末端U殘基係視情況存在的且可包括0個、1個、2個、3個、4個或更多個U) (SEQ ID NO: 2301-2428) | 基因體坐標(hg38) |
| G018983 | 301 | UGGAGGGCCUGAUGUGUGUU | UGGAGGGCCUGAUGUGUGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mG*AGGGCCUGAUGUGUGUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945290-29945310 (與hg38之錯配=2) |
| G018984 | 302 | GCCUGAUGUGUGUUGGGUGU | GCCUGAUGUGUGUUGGGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mC*UGAUGUGUGUUGGGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945296-29945316 (與hg38之錯配=2) |
| G018985 | 303 | CCUGAUGUGUGUUGGGUGUU | CCUGAUGUGUGUUGGGUGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mU*GAUGUGUGUUGGGUGUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945297-29945317 (與hg38之錯配=1) |
| G018986 | 304 | CCCAACACCCAACACACAUC | CCCAACACCCAACACACAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mC*AACACCCAACACACAUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945300-29945320 (與hg38之錯配=1) |
| G018965 | 305 | UCAGGAAACAUGAAGAAAGC | UCAGGAAACAUGAAGAAAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mC*mA*GGAAACAUGAAGAAAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29890117-29890137 |
| G019018 | 306 | AGGCGCCUGGGCCUCUCCCG | AGGCGCCUGGGCCUCUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mG*CGCCUGGGCCUCUCCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29927058-29927078 |
| G018937 | 307 | CGGGCUGGCCUCCCACAAGG | CGGGCUGGCCUCCCACAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mG*GCUGGCCUCCCACAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29934330-29934350 |
| G018990 | 308 | ACGGCCAUCCUCGGCGUCUG | ACGGCCAUCCUCGGCGUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mG*GCCAUCCUCGGCGUCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942541-29942561 |
| G018991 | 309 | GACGGCCAUCCUCGGCGUCU | GACGGCCAUCCUCGGCGUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mC*GGCCAUCCUCGGCGUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942542-29942562 |
| G018992 | 310 | GACGCCGAGGAUGGCCGUCA | GACGCCGAGGAUGGCCGUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mC*GCCGAGGAUGGCCGUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942543-29942563 |
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| G018963 | 395 | AACAUGAAGAAAGCAGGUGU | AACAUGAAGAAAGCAGGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mA*mC*AUGAAGAAAGCAGGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:31382543-31382563 |
| G021885 | 396 | UAGCCCACGGCGAUGAAGCG | UAGCCCACGGCGAUGAAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mA*mG*CCCACGGCGAUGAAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942815-29942835 |
| G021886 | 397 | GUAGCCCACGGCGAUGAAGC | GUAGCCCACGGCGAUGAAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mU*mA*GCCCACGGCGAUGAAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942816-29942836 |
| G021887 | 398 | CGUAGCCCACGGCGAUGAAG | CGUAGCCCACGGCGAUGAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mU*AGCCCACGGCGAUGAAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942817-29942837 |
| G021888 | 399 | CUUCAUCGCCGUGGGCUACG | CUUCAUCGCCGUGGGCUACGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mU*CAUCGCCGUGGGCUACGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942817-29942837 |
| G021889 | 400 | CGUGUCGUCCACGUAGCCCA | CGUGUCGUCCACGUAGCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mU*GUCGUCCACGUAGCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942828-29942848 |
| G021890 | 401 | UGGACGACACGCAGUUCGUG | UGGACGACACGCAGUUCGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mG*ACGACACGCAGUUCGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942837-29942857 |
| G021891 | 402 | GGAUGGAGCCGCGGGCGCCG | GGAUGGAGCCGCGGGCGCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mA*UGGAGCCGCGGGCGCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942885-29942905 |
| G021892 | 403 | GCGGGCGCCGUGGAUAGAGC | GCGGGCGCCGUGGAUAGAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mG*GGCGCCGUGGAUAGAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942895-29942915 |
| G021893 | 404 | UGCUCUAUCCACGGCGCCCG | UGCUCUAUCCACGGCGCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mC*UCUAUCCACGGCGCCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942896-29942916 |
| G021894 | 405 | GGCGCCGUGGAUAGAGCAGG | GGCGCCGUGGAUAGAGCAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mC*GCCGUGGAUAGAGCAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942898-29942918 |
| G021895 | 406 | GCGCCGUGGAUAGAGCAGGA | GCGCCGUGGAUAGAGCAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mG*CCGUGGAUAGAGCAGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942899-29942919 |
| G021896 | 407 | CGCCGUGGAUAGAGCAGGAG | CGCCGUGGAUAGAGCAGGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mC*CGUGGAUAGAGCAGGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942900-29942920 |
| G021897 | 408 | GUGGAUAGAGCAGGAGGGGC | GUGGAUAGAGCAGGAGGGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mU*mG*GAUAGAGCAGGAGGGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942904-29942924 |
| G021898 | 409 | GGCCCCUCCUGCUCUAUCCA | GGCCCCUCCUGCUCUAUCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mC*CCCUCCUGCUCUAUCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942905-29942925 |
| G021899 | 410 | AGCAGGAGGGGCCGGAGUAU | AGCAGGAGGGGCCGGAGUAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mC*AGGAGGGGCCGGAGUAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942912-29942932 |
| G021900 | 411 | GCAGGAGGGGCCGGAGUAUU | GCAGGAGGGGCCGGAGUAUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mA*GGAGGGGCCGGAGUAUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942913-29942933 |
| G021901 | 412 | GGAGUGGCUCCGCAGAUACC | GGAGUGGCUCCGCAGAUACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mA*GUGGCUCCGCAGAUACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943490-29943510 |
| G021902 | 413 | CUCCGCAGAUACCUGGAGAA | CUCCGCAGAUACCUGGAGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mC*CGCAGAUACCUGGAGAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943497-29943517 |
| G021903 | 414 | UCCGCAGAUACCUGGAGAAC | UCCGCAGAUACCUGGAGAACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mC*mC*GCAGAUACCUGGAGAACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943498-29943518 |
| G021904 | 415 | CAGAUACCUGGAGAACGGGA | CAGAUACCUGGAGAACGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mA*mG*AUACCUGGAGAACGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943502-29943522 |
| G021905 | 416 | UCCCGUUCUCCAGGUAUCUG | UCCCGUUCUCCAGGUAUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mC*mC*CGUUCUCCAGGUAUCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943502-29943522 |
| G021906 | 417 | GCGUCUCCUUCCCGUUCUCC | GCGUCUCCUUCCCGUUCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mG*UCUCCUUCCCGUUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943511-29943531 |
| G021907 | 418 | GAAGGAGACGCUGCAGCGCA | GAAGGAGACGCUGCAGCGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mA*GGAGACGCUGCAGCGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943520-29943540 |
| G021908 | 419 | AAGGAGACGCUGCAGCGCAC | AAGGAGACGCUGCAGCGCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mA*mG*GAGACGCUGCAGCGCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943521-29943541 |
| G021909 | 420 | AGAUCUACAGGCGAUCAGGG | AGAUCUACAGGCGAUCAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mA*UCUACAGGCGAUCAGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943566-29943586 |
| G021910 | 421 | UGAUCGCCUGUAGAUCUCCC | UGAUCGCCUGUAGAUCUCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mA*UCGCCUGUAGAUCUCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943569-29943589 |
| G021911 | 422 | GGGAGAUCUACAGGCGAUCA | GGGAGAUCUACAGGCGAUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mG*AGAUCUACAGGCGAUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943569-29943589 |
| G021912 | 423 | CGGGAGAUCUACAGGCGAUC | CGGGAGAUCUACAGGCGAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mG*GAGAUCUACAGGCGAUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943570-29943590 |
| G021913 | 424 | CGCCUGUAGAUCUCCCGGGC | CGCCUGUAGAUCUCCCGGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mC*CUGUAGAUCUCCCGGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943573-29943593 |
| G021914 | 425 | GGCCAGCCCGGGAGAUCUAC | GGCCAGCCCGGGAGAUCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mC*CAGCCCGGGAGAUCUACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943578-29943598 |
| G021915 | 426 | UCCCGGGCUGGCCUCCCACA | UCCCGGGCUGGCCUCCCACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mC*mC*CGGGCUGGCCUCCCACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943585-29943605 |
| G021916 | 427 | GGGCUGGCCUCCCACAAGGA | GGGCUGGCCUCCCACAAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mG*CUGGCCUCCCACAAGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943589-29943609 |
| G021917 | 428 | CUGAUCGCCUGUAGAUCUCC | CUGAUCGCCUGUAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mG*AUCGCCUGUAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943568-29943588 |
| SEQ ID NO | 指導序列 | PAM | RNA 指導之DNA 結合劑 | 基因體坐標(hg38) |
| 429 | AGGAUGGAGCCGCGGGCGCC | GTGGAT | 金黃色葡萄球菌Cas9 | chr6:29942884-29942904 |
| 430 | GGAAGGAGACGCUGCAGCGC | ACGGGT | 金黃色葡萄球菌Cas9 | chr6:29943519-29943539 |
| 431 | GACAGCGACGCCGCGAGCCA | GAGGAT | 金黃色葡萄球菌Cas9 | chr6:29942863-29942883 |
| 432 | CGGGAAGGAGACGCUGCAGC | TTCT | CasX | chr6:29943517-29943537 |
| 433 | CCGUGCGCUGCAGCGUCUCC | TTCC | CasX | chr6:29943523-29943543 |
| 434 | ACGCAGUUCGUGCGGUUCGACAGC | NNNNCC | NME2 | chr6:29942845-29942869 |
| 435 | UCGUGCGGUUCGACAGCGACGCCG | NNNNCC | NME2 | chr6:29942852-29942876 |
| 436 | CAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGAU | NNNNCC | NME2 | chr6:29942865-29942889 |
| 437 | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCU | NNNNCC | NME2 | chr6:29942891-29942915 |
| 438 | UCCUGCUCUAUCCACGGCGCCCGC | NNNNCC | NME2 | chr6:29942895-29942919 |
| 439 | CCGGCCCCUCCUGCUCUAUCCACG | NNNNCC | NME2 | chr6:29942903-29942927 |
| 440 | UCCGGCCCCUCCUGCUCUAUCCAC | NNNNCC | NME2 | chr6:29942904-29942928 |
| 441 | GGGAAGGAGACGCUGCAGCGCACG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943518-29943542 |
| 442 | AGACGCUGCAGCGCACGGGUACCA | NNNNCC | NME2 | chr6:29943525-29943549 |
| 443 | GCGCACGGGUACCAGGGGCCACGG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943535-29943559 |
| 444 | CACGGGUACCAGGGGCCACGGGGC | NNNNCC | NME2 | chr6:29943538-29943562 |
| 445 | ACGGGUACCAGGGGCCACGGGGCG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943539-29943563 |
| 446 | CAGGGGCCACGGGGCGCCUCCCUG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943547-29943571 |
| 447 | CAGGGAGGCGCCCCGUGGCCCCUG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943547-29943571 |
| 448 | UCAGGGAGGCGCCCCGUGGCCCCU | NNNNCC | NME2 | chr6:29943548-29943572 |
| 449 | CAGGCGAUCAGGGAGGCGCCCCGU | NNNNCC | NME2 | chr6:29943555-29943579 |
| 450 | ACAGGCGAUCAGGGAGGCGCCCCG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943556-29943580 |
| 451 | UACAGGCGAUCAGGGAGGCGCCCC | NNNNCC | NME2 | chr6:29943557-29943581 |
| 452 | GGGCGCCUCCCUGAUCGCCUGUAG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943558-29943582 |
| 453 | GGCGCCUCCCUGAUCGCCUGUAGA | NNNNCC | NME2 | chr6:29943559-29943583 |
| 454 | GAGAUCUACAGGCGAUCAGGGAGG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943563-29943587 |
| 455 | GGAGAUCUACAGGCGAUCAGGGAG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943564-29943588 |
| 456 | GGGAGAUCUACAGGCGAUCAGGGA | NNNNCC | NME2 | chr6:29943565-29943589 |
| 457 | CUGAUCGCCUGUAGAUCUCCCGGG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943568-29943592 |
| 458 | AUCGCCUGUAGAUCUCCCGGGCUG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943571-29943595 |
| 459 | UCGCCUGUAGAUCUCCCGGGCUGG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943572-29943596 |
| 460 | UUGUCUCCCCUCCUUGUGGGAGGC | NNNNCC | NME2 | chr6:29943595-29943619 |
| 461 | AUUGUCUCCCCUCCUUGUGGGAGG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943596-29943620 |
| 462 | CCCAAUUGUCUCCCCUCCUUGUGG | NNNNCC | NME2 | chr6:29943600-29943624 |
| 表5B ：例示性Spy HLA-A 指導序列 | ||||
| 463 | GGAUGGAGCCGCGGGCGCCG | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29942885-29942905 |
| 464 | GCGGGCGCCGUGGAUAGAGC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29942895-29942915 |
| 465 | UGCUCUAUCCACGGCGCCCG | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29942896-29942916 |
| 466 | GGCGCCGUGGAUAGAGCAGG | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29942898-29942918 |
| 467 | GCGCCGUGGAUAGAGCAGGA | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29942899-29942919 |
| 468 | CGCCGUGGAUAGAGCAGGAG | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29942900-29942920 |
| 469 | GUGGAUAGAGCAGGAGGGGC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29942904-29942924 |
| 470 | GCGUCUCCUUCCCGUUCUCC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943511-29943531 |
| 471 | GAAGGAGACGCUGCAGCGCA | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943520-29943540 |
| 472 | AAGGAGACGCUGCAGCGCAC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943521-29943541 |
| 473 | GCUGCAGCGCACGGGUACCA | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943529-29943549 |
| 474 | AGAUCUACAGGCGAUCAGGG | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943566-29943586 |
| 475 | CUGAUCGCCUGUAGAUCUCC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943568-29943588 |
| 476 | UGAUCGCCUGUAGAUCUCCC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943569-29943589 |
| 477 | GGGAGAUCUACAGGCGAUCA | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943569-29943589 |
| 478 | CGGGAGAUCUACAGGCGAUC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943570-29943590 |
| 479 | CGCCUGUAGAUCUCCCGGGC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943573-29943593 |
| 480 | GGCCAGCCCGGGAGAUCUAC | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943578-29943598 |
| 481 | UCCCGGGCUGGCCUCCCACA | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943585-29943605 |
| 482 | GGGCUGGCCUCCCACAAGGA | NGG | Spy+鹼基_編輯子 | chr6:29943589-29943609 |
| 指導物ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性 具有PAM 之指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1483-1498及1500-1511) | 例示性指導RNA 修飾之序列(四個末端U殘基係視情況存在的且可包括0個、1個、2個、3個、4個或更多個U) (SEQ ID NO: 2483-2498及2500-2511) | 基因體坐標(hg38) |
| G021857 | 483 | ACGACACUGAUUGGCUUCUC | ACGACACUGAUUGGCUUCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mG*ACACUGAUUGGCUUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29942469-29942489 |
| G021858 | 484 | ACCCCUCAUCCCCCACGGAC | ACCCCUCAUCCCCCACGGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mC*CCUCAUCCCCCACGGACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943058-29943078 |
| G021859 | 485 | GGCCCGUCCGUGGGGGAUGA | GGCCCGUCCGUGGGGGAUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mC*CCGUCCGUGGGGGAUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943063-29943083 |
| G021860 | 486 | GCCAGGUCGCCCACAGUCUC | GCCAGGUCGCCCACAGUCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mC*AGGUCGCCCACAGUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943080-29943100 |
| G021861 | 487 | GUUUAGGCCAAAAAUCCCCC | GUUUAGGCCAAAAAUCCCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mU*mU*UAGGCCAAAAAUCCCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943187-29943207 |
| G021862 | 488 | GGCCAAAAAUCCCCCCGGGU | GGCCAAAAAUCCCCCCGGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mG*mC*CAAAAAUCCCCCCGGGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943192-29943212 |
| G021863 | 489 | GACCAACCCGGGGGGAUUUU | GACCAACCCGGGGGGAUUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mC*CAACCCGGGGGGAUUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943197-29943217 |
| G021864 | 490 | CACGGGCCCAAGGCUGCUGC | CACGGGCCCAAGGCUGCUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mA*mC*GGGCCCAAGGCUGCUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943812-29943832 |
| G021865 | 491 | ACCCUCAUGCUGCACAUGGC | ACCCUCAUGCUGCACAUGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mC*CUCAUGCUGCACAUGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944349-29944369 |
| G021866 | 492 | CCUCUAGGACCUUAAGGCCC | CCUCUAGGACCUUAAGGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mU*CUAGGACCUUAAGGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944996-29945016 |
| G021867 | 493 | GCUCCUUUCUGGUAUCUCAC | GCUCCUUUCUGGUAUCUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mU*CCUUUCUGGUAUCUCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945018-29945038 |
| G021868 | 494 | GCUAUGGGGUUUCUUUGCAU | GCUAUGGGGUUUCUUUGCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mU*AUGGGGUUUCUUUGCAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945341-29945361 |
| G021869 | 495 | GCCUUUGCAGAAACAAAGUC | GCCUUUGCAGAAACAAAGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mC*UUUGCAGAAACAAAGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945526-29945546 |
| G021870 | 496 | UGGACCAACCGCCCUCCUGA | UGGACCAACCGCCCUCCUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mG*ACCAACCGCCCUCCUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944880-29944900 (與hg38之錯配=2) |
| G021871 | 497 | AGCCUCUCUGACCUUUAGCA | AGCCUCUCUGACCUUUAGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mC*CUCUCUGACCUUUAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | Na |
| G021872 | 498 | CGCCCUCCUGAAGGUCCUCA | CGCCCUCCUGAAGGUCCUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mG*mC*CCUCCUGAAGGUCCUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | Na |
| G021873 | 500 | CCGCCCUCCUGAAGGUCCUC | CCGCCCUCCUGAAGGUCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mC*mG*CCCUCCUGAAGGUCCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | Na |
| G021874 | 501 | UGGUUCCCUUUGACACACAC | UGGUUCCCUUUGACACACACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mG*UUCCCUUUGACACACACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29943794-29943814 (與hg38之錯配=3) |
| G021875 | 502 | GACCCUGCUAAAGGUCAGAG | GACCCUGCUAAAGGUCAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mC*CCUGCUAAAGGUCAGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | na |
| G021876 | 503 | AGGACCUUCAGGAGGGCGGU | AGGACCUUCAGGAGGGCGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mG*mG*ACCUUCAGGAGGGCGGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | na |
| G021877 | 504 | GCACACUUCUACCUGGGUCU | GCACACUUCUACCUGGGUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mC*mA*CACUUCUACCUGGGUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944671-29944691 (與hg38之錯配=3) |
| G021878 | 505 | GAGCCUCUCUGACCUUUAGC | GAGCCUCUCUGACCUUUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mG*CCUCUCUGACCUUUAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | na |
| G021879 | 506 | ACACUCCUCCAGCACACAUG | ACACUCCUCCAGCACACAUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mA*mC*mA*CUCCUCCAGCACACAUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944054-29944074 (與hg38之錯配=2) |
| G021880 | 507 | CUCUGACCUUUAGCAGGGUC | CUCUGACCUUUAGCAGGGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mU*mC*UGACCUUUAGCAGGGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | na |
| G021881 | 508 | CAAGAUAGCCACAUGUGUGC | CAAGAUAGCCACAUGUGUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mC*mA*mA*GAUAGCCACAUGUGUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944043-29944063 (與hg38之錯配=2) |
| G021882 | 509 | UCUGACCUUUAGCAGGGUCA | UCUGACCUUUAGCAGGGUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mC*mU*GACCUUUAGCAGGGUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944450-29944470 (與hg38之錯配=3) |
| G021883 | 510 | UGUAAAGGUGAGAGCCUGGA | UGUAAAGGUGAGAGCCUGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mU*mG*mU*AAAGGUGAGAGCCUGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29945274-29945294 (與hg38之錯配=1) |
| G021884 | 511 | GAAGGUCCCUGAGGACCUUC | GAAGGUCCCUGAGGACCUUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | mG*mA*mA*GGUCCCUGAGGACCUUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | chr6:29944859-29944879 (與hg38之錯配=3) |
| 指導物ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1512-1590) | 例示性指導RNA 修飾之序列(SEQ ID NO: 2512-2590) | 基因體坐標(hg38) |
| G028854 | 512 | CCUGGGUCUGGUCCUCCCCAUCCC | CCUGGGUCUGGUCCUCCCCAUCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmGGUmCmUGmGUmCCUCCmCCAUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944223-29944247 |
| G028855 | 513 | GUGGAGACCAGGCCUGCAGGGGAU | GUGGAGACCAGGCCUGCAGGGGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mGmAGAmCmCAmGGmCCUGCmAGGGmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944264-29944288 |
| G028856 | 514 | CCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCCC | CCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mUmGUCmCmUGmGGmUCUGGmUCCUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944229-29944253 |
| G028857 | 515 | UCCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCC | UCCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mGmUGUmCmCUmGGmGUCUGmGUCCmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944230-29944254 |
| G028858 | 516 | CACAUGGCAGGUGUAUCUCUGCUC | CACAUGGCAGGUGUAUCUCUGCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmUGGmCmAGmGUmGUAUCmUCUGmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944327-29944351 |
| G028859 | 517 | UGCUGCACAUGGCAGGUGUAUCUC | UGCUGCACAUGGCAGGUGUAUCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mUmGCAmCmAUmGGmCAGGUmGUAUmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944332-29944356 |
| G028860 | 518 | CCGCACGAACUGCGUGUCGUCCAC | CCGCACGAACUGCGUGUCGUCCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mCmACGmAmACmUGmCGUGUmCGUCmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942830-29942854 |
| G028861 | 519 | CGCACGAACUGCGUGUCGUCCACG | CGCACGAACUGCGUGUCGUCCACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mAmCGAmAmCUmGCmGUGUCmGUCCmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942829-29942853 |
| G028862 | 520 | GUGCGCUGCAGCGUCUCCUUCCCG | GUGCGCUGCAGCGUCUCCUUCCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mCmGCUmGmCAmGCmGUCUCmCUUCmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943511-29943535 |
| G028863 | 521 | CCGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCC | CCGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mAmGGAmUmGGmCCmGUCAUmGGCGmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942547-29942571 |
| G028864 | 522 | CGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCCC | CGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mA*mGmGAUmGmGCmCGmUCAUGmGCGCmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942548-29942572 |
| G028865 | 523 | AAGGUUCCAUCCCCUGCAGGCCUG | AAGGUUCCAUCCCCUGCAGGCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mGmUUCmCmAUmCCmCCUGCmAGGCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944266-29944290 |
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| G028867 | 525 | ACUUCUGGAAGGUUCCAUCCCCUG | ACUUCUGGAAGGUUCCAUCCCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mU*mUmCUGmGmAAmGGmUUCCAmUCCCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944274-29944298 |
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| G028869 | 527 | UCCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGGG | UCCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mGmUGUmCmCCmGGmCCCGGmCCGCmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942785-29942809 |
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| G028898 | 556 | ACCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGAC | ACCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mUmGGCmAmGCmGGmGAUGGmGGAGmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944219-29944243 |
| G028899 | 557 | CACUGACCUGGCAGCGGGAUGGGG | CACUGACCUGGCAGCGGGAUGGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmGACmCmUGmGCmAGCGGmGAUGmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944214-29944238 |
| G028900 | 558 | CCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGACC | CCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmGCAmGmCGmGGmAUGGGmGAGGmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944220-29944244 |
| G028901 | 559 | CCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGG | CCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmCUCmAmGGmGUmGAGGGmGCUUmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944366-29944390 |
| G028902 | 560 | UGGCCGUCAUGGCGCCCCGAACCC | UGGCCGUCAUGGCGCCCCGAACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mCmCGUmCmAUmGGmCGCCCmCGAAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942554-29942578 |
| G028903 | 561 | AUGUCCGCCGCGGUCCAAGAGCGC | AUGUCCGCCGCGGUCCAAGAGCGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mG*mUmCCGmCmCGmCGmGUCCAmAGAGmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943379-29943403 |
| G028904 | 562 | GGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCUC | GGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mAmCCCmGmUGmCGmCUGCAmGCGUmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943518-29943542 |
| G028905 | 563 | GGGAAGGAGACGCUGCAGCGCACG | GGGAAGGAGACGCUGCAGCGCACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mAmAGGmAmGAmCGmCUGCAmGCGCmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943518-29943542 |
| G028906 | 564 | GCGGGCGCCGUGGAUAGAGCAGGA | GCGGGCGCCGUGGAUAGAGCAGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mG*mGmGCGmCmCGmUGmGAUAGmAGCAmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942895-29942919 |
| G028907 | 565 | UCCUGCUCUAUCCACGGCGCCCGC | UCCUGCUCUAUCCACGGCGCCCGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mUmGCUmCmUAmUCmCACGGmCGCCmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942889-29942913 |
| G028908 | 566 | CCCCUGGUACCCGUGCGCUGCAGC | CCCCUGGUACCCGUGCGCUGCAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mCmUGGmUmACmCCmGUGCGmCUGCmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943523-29943547 |
| G028909 | 567 | UGGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCU | UGGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mUmACCmCmGUmGCmGCUGCmAGCGmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943519-29943543 |
| G028910 | 568 | CAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGGC | CAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mU*mCmUCAmGmGGmUGmAGGGGmCUUGmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944365-29944389 |
| G028911 | 569 | ACGCAGUUCGUGCGGUUCGACAGC | ACGCAGUUCGUGCGGUUCGACAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mG*mCmAGUmUmCGmUGmCGGUUmCGACmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942845-29942869 |
| G028912 | 570 | CGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCAG | CGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mCmCAGmGmUCmUGmGGUCAmGGGCmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942595-29942619 |
| G028913 | 571 | CACUCACCCGCCCAGGUCUGGGUC | CACUCACCCGCCCAGGUCUGGGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmCACmCmCGmCCmCAGGUmCUGGmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942609-29942633 |
| G028914 | 572 | CCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCA | CCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mCmCCAmGmGUmCUmGGGUCmAGGGmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942596-29942620 |
| G028915 | 573 | CCCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCC | CCCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mGmCCCmAmGGmUCmUGGGUmCAGGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942597-29942621 |
| G028916 | 574 | CAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGAU | CAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mCmGACmGmCCmGCmGAGCCmAGAGmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942865-29942889 |
| G028917 | 575 | CGCGAGCCAGAGGAUGGAGCCGCG | CGCGAGCCAGAGGAUGGAGCCGCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mGmAGCmCmAGmAGmGAUGGmAGCCmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942874-29942898 |
| G028918 | 576 | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCU | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mCmUAUmCmCAmCGmGCGCCmCGCGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942891-29942915 |
| G028919 | 577 | CACAUCAGAGCCCUGGGCACUGUC | CACAUCAGAGCCCUGGGCACUGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmUCAmGmAGmCCmCUGGGmCACUmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29945232-29945256 |
| G028920 | 578 | CAGACCCAGGACACGGAGCUCGUG | CAGACCCAGGACACGGAGCUCGUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mAmCCCmAmGGmACmACGGAmGCUCmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944243-29944267 |
| G028921 | 579 | CCAGGACACGGAGCUCGUGGAGAC | CCAGGACACGGAGCUCGUGGAGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmGACmAmCGmGAmGCUCGmUGGAmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944248-29944272 |
| G028922 | 580 | CUCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGA | CUCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mUmGGGmAmAAmAGmAGGGGmAAGGmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944471-29944495 |
| G028923 | 581 | UCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGAG | UCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mGmGGAmAmAAmGAmGGGGAmAGGUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944470-29944494 |
| G028924 | 582 | AGACGCUGCAGCGCACGGGUACCA | AGACGCUGCAGCGCACGGGUACCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mCmGCUmGmCAmGCmGCACGmGGUAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943525-29943549 |
| G028925 | 583 | UCCUUUUCUAUCUGUGGGAAGAAA | UCCUUUUCUAUCUGUGGGAAGAAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mUmUUUmCmUAmUCmUGUGGmGAAGmAAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 無法獲得。與人類基因體不完全對齊。 |
| G028926 | 584 | CACUGCCUGGGGUAGAACAAAAAC | CACUGCCUGGGGUAGAACAAAAACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmGCCmUmGGmGGmUAGAAmCAAAmAACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29945209-29945233 |
| G028927 | 585 | ACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGU | ACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mAmCCAmGmAGmCGmAGGCCmGGUGmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943008-29943032 |
| G028928 | 586 | CUACAACCAGAGCGAGGCCGGUGA | CUACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mA*mCmAACmCmAGmAGmCGAGGmCCGGmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943006-29943030 |
| G028929 | 587 | UACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAG | UACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mAmACCmAmGAmGCmGAGGCmCGGUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943007-29943031 |
| G028930 | 588 | CCAGAGCGAGGCCGGUGAGUGACC | CCAGAGCGAGGCCGGUGAGUGACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmAGCmGmAGmGCmCGGUGmAGUGmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943012-29943036 |
| G028933 | 589 | CCAUCCCGCUGCCAGGUCAGUGUG | CCAUCCCGCUGCCAGGUCAGUGUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmCCCmGmCUmGCmCAGGUmCAGUmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944206-29944230 |
| G028934 | 590 | GUAUCUGCGGAGCCACUCCACGCA | GUAUCUGCGGAGCCACUCCACGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mA*mUmCUGmCmGGmAGmCCACUmCCACmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943479-29943503 |
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301-590中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含為選自SEQ ID NO: 301-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 301-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 301-590之序列至少95%一致之指導序列。
在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 301-395中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 307、313-318、322、326、331、333、337-341、343、345、347、357、359、362、366、387中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 313-318、326、337-339、341、343、345、362中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 313-318中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 313-317中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 337-339、341、343及345中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 337-339中之任一者之指導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 523、565、571、576、580、581中之任一者之指導序列。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含含有表4-7中所列之基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的指導序列。如本文所用，基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸意指例如基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸，其中基因體坐標包括來自表4-7中所列之范圍之5’方向上之10個核苷酸及3’方向上之10個核苷酸。舉例而言，HLA-A指導RNA可包含基因體坐標chr6:29942864至chr6:29942903或chr6:29943528至chr6:29943609內之10個鄰接核苷酸，包括該等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列係包含表4、表5B及表6中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸，或與包含表5A及表7中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含與序列至少95%、90%或85%一致之指導序列，該序列選自為包含表4、表5B及表6中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸之序列，或與包含表5A及表7中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
在一些實施例中，指導RNA包含含有表4-7中所列之基因體坐標之至少15個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含含有表4-7中所列之基因體坐標之至少20個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的指導序列。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 301。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 302。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 303。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 304。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 305。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 306。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 307。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 308。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 309。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 310。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 311。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 312。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 313。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 314。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 315。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 316。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 317。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 318。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 319。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 320。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 321。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 322。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 323。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 324。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 325。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 326。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 327。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 328。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 329。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 330。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 331。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 332。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 333。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 334。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 335。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 336。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 337。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 338。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 339。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 340。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 341。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 342。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 343。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 344。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 345。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 346。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 347。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 348。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 349。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 350。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 351。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 352。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 353。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 354。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 355。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 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本文提供HLA-A指導RNA之其他實施例，包括例如對指導RNA之例示性修飾。
4. 對 HLA-A 之遺傳修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中HLA-A基因之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。遺傳修飾涵蓋因與基因編輯系統接觸產生之修飾群體(例如由Cas9及HLA-A指導RNA產生之編輯群體，或由BC22及HLA-A指導RNA產生之編輯群體)。用於HLA-A基因之遺傳修飾之方法及組成物提供於PCT/US2021/064930中，該專利之全部內容皆以引用方式併入本文中。
以下實施例係關於HLA-A基因之遺傳修飾：
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942854-chr6:29942913及chr6:29943518-chr6:29943619。
在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942864- chr6:29942903內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29943528- chr6:29943609內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含以下基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876- 29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
在一些實施例中，遺傳修飾包含以下基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942864-29942884；chr6:29944266- 29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29942609-29942633；chr6:29942891- 29942915；chr6:29944471-29944495；及chr6:29944470-29944494。
在一些實施例中，遺傳修飾包含以下基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942609-29942633；及chr6:29942891-29942915。
在一些實施例中，遺傳修飾包含以下基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530- 29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589- 29943609。
在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942876-29942897內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29943528- chr629943550內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876- 29942896及chr6:29942877-29942897。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530- 29943550。
在一些實施例中，遺傳修飾包含以下基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876- 29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126- 29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530- 29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589- 29943609；及chr6:29944026-29944046。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868- 29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883- 29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529- 29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549- 29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868- 29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883- 29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529- 29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549- 29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046、chr6:29934330- 29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140- 29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858- 29943878、chr6:29944478-29944498及chr6:29944850-29944870。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868- 29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883- 29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529- 29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549- 29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868- 29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883- 29942903；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530- 29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589- 29943609。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868- 29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883- 29942903。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529- 29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549- 29943569；及chr6:29943589-29943609。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29890117-29890137、chr6:29927058- 29927078、chr6:29934330-29934350、chr6:29942541-29942561、chr6:29942542- 29942562、chr6:29942543-29942563、chr6:29942543-29942563、chr6:29942550- 29942570、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876- 29942896、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883- 29942903、chr6:29943062-29943082、chr6:29943063-29943083、chr6:29943092- 29943112、chr6:29943115-29943135、chr6:29943118-29943138、chr6:29943119- 29943139、chr6:29943120-29943140、chr6:29943126-29943146、chr6:29943128- 29943148、chr6:29943129-29943149、chr6:29943134-29943154、chr6:29943134- 29943154、chr6:29943135-29943155、chr6:29943136-29943156、chr6:29943140- 29943160、chr6:29943142-29943162、chr6:29943143-29943163、chr6:29943188- 29943208、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530- 29943550、chr6:29943536-29943556、chr6:29943537-29943557、chr6:29943538- 29943558、chr6:29943549-29943569、chr6:29943556-29943576、chr6:29943589- 29943609、chr6:29943590-29943610、chr6:29943590-29943610、chr6:29943599- 29943619、chr6:29943600-29943620、chr6:29943601-29943621、chr6:29943602- 29943622、chr6:29943603-29943623、chr6:29943774-29943794、chr6:29943779- 29943799、chr6:29943780-29943800、chr6:29943822-29943842、chr6:29943824- 29943844、chr6:29943857-29943877、chr6:29943858-29943878、chr6:29943859- 29943879、chr6:29943860-29943880、chr6:29944026-29944046、chr6:29944077- 29944097、chr6:29944078-29944098、chr6:29944458-29944478、chr6:29944478- 29944498、chr6:29944597-29944617、chr6:29944642-29944662、chr6:29944643- 29944663、chr6:29944772-29944792、chr6:29944782-29944802、chr6:29944850- 29944870、chr6:29944907-29944927、chr6:29945024-29945044、chr6:29945097- 29945117、chr6:29945104-29945124、chr6:29945105-29945125、chr6:29945116- 29945136、chr6:29945118-29945138、chr6:29945119-29945139、chr6:29945124- 29945144、chr6:29945176-29945196、chr6:29945177-29945197、chr6:29945177- 29945197、chr6:29945180-29945200、chr6:29945187-29945207、chr6:29945188- 29945208、chr6:29945228-29945248、chr6:29945230-29945250、chr6:29945231- 29945251、chr6:29945232-29945252、chr6:29945308-29945328、chr6:29945361- 29945381、chr6:29945362-29945382及chr6:31382543-31382563。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942815-29942835、chr6:29942816- 29942836、chr6:29942817-29942837、chr6:29942817-29942837、chr6:29942828- 29942848、chr6:29942837-29942857、chr6:29942885-29942905、chr6:29942895- 29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899- 29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29942905- 29942925、chr6:29942912-29942932、chr6:29942913-29942933、chr6:29943490- 29943510、chr6:29943497-29943517、chr6:29943498-29943518、chr6:29943502- 29943522、chr6:29943502-29943522、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520- 29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943566-29943586、chr6:29943569- 29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573- 29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605、chr6:29943589- 29943609、chr6:29943568-29943588及chr6:29942815-29942835。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942884-29942904、chr6:29943519- 29943539、chr6:29942863-29942883。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29943517-29943537及chr6:29943523- 29943543。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942845-29942869、chr6:29942852- 29942876、chr6:29942865-29942889、chr6:29942891-29942915、chr6:29942895- 29942919、chr6:29942903-29942927、chr6:29942904-29942928、chr6:29943518- 29943542、chr6:29943525-29943549、chr6:29943535-29943559、chr6:29943538- 29943562、chr6:29943539-29943563、chr6:29943547-29943571、chr6:29943547- 29943571、chr6:29943548-29943572、chr6:29943555-29943579、chr6:29943556- 29943580、chr6:29943557-29943581、chr6:29943558-29943582、chr6:29943559- 29943583、chr6:29943563-29943587、chr6:29943564-29943588、chr6:29943565- 29943589、chr6:29943568-29943592、chr6:29943571-29943595、chr6:29943572- 29943596、chr6:29943595-29943619、chr6:29943596-29943620、chr6:29943600- 29943624。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942885-29942905、chr6:29942895- 29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899- 29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29943511- 29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943529- 29943549、chr6:29943566-29943586、chr6:29943568-29943588、chr6:29943569- 29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573- 29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605及chr6:29943589- 29943609。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942469-29942489、chr6:29943058- 29943078、chr6:29943063-29943083、chr6:29943080-29943100、chr6:29943187- 29943207、chr6:29943192-29943212、chr6:29943197-29943217、chr6:29943812- 29943832、chr6:29944349-29944369、chr6:29944996-29945016、chr6:29945018- 29945038、chr6:29945341-29945361、chr6:29945526-29945546。
在一些實施例中，遺傳修飾包含以下基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942876-29942897。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868- 29942888、chr6:29942876-29942896及chr6:29942877-29942897。
在一些實施例中，遺傳修飾包含以下基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29943528-chr629943550。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530-29943550。
在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺基中之任一或多者。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含在靶序列中插入1個、2個、3個、4個或5個或更多個核苷酸。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含在靶序列中缺失1個、2個、3個、4個或5個或更多個核苷酸。在其他實施例中，對HLA-A之修飾包含在靶序列中插入1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸。在其他實施例中，對HLA-A之修飾包含在靶序列中缺失1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含插入/缺失，其在此項技術中通常定義為少於1000個鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含插入/缺失，其在靶序列中產生框移突變。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含在靶序列中取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或25個或更多個核苷酸。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含因納入模板核酸產生之核苷酸之插入、缺失或取代中之一或多者。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含在靶序列中插入供體核酸。在一些實施例中，對HLA-A之修飾並非瞬時的。
5. HLA-A 及 HLA-B 指導 RNA 之功效
HLA-B指導RNA之功效可藉由評價指導RNA之編輯效率及HLA-A或HLA-B蛋白之表面表現之此項技術中可獲得之技術來確定。在一些實施例中，HLA-A或HLA-B蛋白之表面表現之減少或消除可藉由與未經修飾之細胞比較(或「相對於未經修飾之細胞」)來確定。經工程改造之細胞或細胞群體亦可與未經修飾之細胞群體進行比較。
「未經修飾之細胞」(或「多個未經修飾之細胞」)係指實驗或測試中相同類型之細胞之對照細胞(或多個對照細胞)，其中「未經修飾」之對照細胞尚未與HLA-A或HLA-B指導物接觸。因此，未經修飾之細胞(或多個未經修飾之細胞)可為尚未與指導RNA接觸之細胞或已與並不靶向HLA-A或HLA-B之指導RNA接觸之細胞。
在一些實施例中，HLA-A或HLA-B指導RNA之功效係藉由量測HLA-A或HLA-B蛋白之表面表現水準來確定。在一些實施例中，HLA-A或HLA-B蛋白水準係藉由流式細胞術(例如使用針對HLA-B7 / HLA-B8之抗體)來量測。HLA-A或HLA-B蛋白之表面表現可藉由如此項技術中通常已知之流式細胞術來量測。熟習此項技術者將熟悉藉由流式細胞術量測蛋白質(例如HLA-A或HLA-B蛋白)之表面表現之技術。藉由流式細胞術之HLA-A或HLA-B蛋白之表面表現水準之例示性量測論述於實例2-3及實例5-8中。在一些實施例中，細胞群體係富集的(例如藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% HLA-A或HLA-B陰性。在一些實施例中，細胞群體並非富集的(例如藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% HLA-A或HLA-B陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少65% HLA-A或HLA-B陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少70% HLA-A或HLA-B陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少80% HLA-A或HLA-B陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少90% HLA-A或HLA-B陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少95% MHC I陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少100% HLA-A或HLA-B陰性。
在一些實施例中，有效的HLA-A或HLA-B指導RNA可藉由量測
活體外或
活體內免疫細胞(例如CD8+ T細胞)對經遺傳修飾之靶細胞之反應來確定。舉例而言，來自CD8+ T細胞之反應降低指示有效的HLA-A或HLA-B指導RNA。CD8+ T細胞反應可藉由量測CD8+ T細胞之活化反應(例如CD8+ T細胞增殖)、活化標誌物之表現或細胞介素產生(IL-2、IFN-γ、TNF-α)之分析(例如流式細胞術、ELISA)來評估。可
活體外或
活體內評價CD8+ T細胞反應。在一些實施例中，可藉由
活體外共培養經遺傳修飾之細胞與CD8+ T細胞來評估CD8+ T細胞反應。在一些實施例中，可在
活體內模型(例如嚙齒類動物模型)中評估CD8+ T細胞活性。在
活體內模型中，例如，經遺傳修飾之細胞可與CD8+ T細胞一起投與；經遺傳修飾之細胞之存活期指示避免CD8+ T細胞溶解之能力。在一些實施例中，該等方法產生包含細胞之組成物，該細胞在CD8+ T細胞存在下
活體內存活大於1週、2週、3週、4週、5週或6週或更長時間。在一些實施例中，該等方法產生包含細胞之組成物，該細胞在CD8+ T細胞存在下
活體內存活至少1週至6週。在一些實施例中，該等方法產生包含細胞之組成物，該細胞在CD8+ T細胞存在下
活體內存活至少2至4週。在一些實施例中，該等方法產生包含細胞之組成物，該細胞在CD8+ T細胞存在下
活體內存活至少4至6週。在一些實施例中，該等方法產生包含細胞之組成物，該細胞在CD8+ T細胞存在下
活體內存活六週以上。
亦可藉由編輯後細胞之存活期來評價HLA-A或HLA-B指導RNA之功效。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少1週至6週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少兩週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少三週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少四週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少五週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少六週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少1週至12週。經遺傳修飾細胞之活力可使用標準技術來量測，包括例如藉由量測細胞死亡、藉由流式細胞術活/死細胞染色或細胞增殖來量測。
在一些實施例中，經工程改造細胞係根據具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現且係HLA-A同型接合及HLA-C同型接合之經工程改造人類細胞的持久性來評價。在一些實施例中，經工程改造細胞係根據具有減少或消除的HLA-A及HLA-B表現且係HLA-C同型接合之經工程改造人類細胞的持久性來評價。如本文所用，「持久性」係指在反應性或反應T細胞或NK細胞存在下，經工程改造細胞在
活體外或
活體內環境中存在之能力，例如在轉移至接受者中後
活體內存在之能力。在一些實施例中，經工程改造之人類T細胞防止NK介導之排斥。在一些實施例中，如本文所展示，在轉移至接受者中後至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天或至少90天，在NK細胞存在下活體內活的經工程改造細胞相對於在NK細胞不存在下活體內活的經工程改造細胞之比率係至少0.3:1或更大。在一些實施例中，如本文所展示，在轉移至接受者中後至少90天，在NK細胞存在下活體內活的經工程改造細胞相對於在NK細胞不存在下活體內活的經工程改造細胞之比率係至少0.4:1或更大、0.5:1或更大、0.6:1或更大、0.7:1或更大、0.8:1或更大、或0.9:1或更大。在一些實施例中，經工程改造之人類T細胞防止CD8+ T細胞介導之排斥。
在一些實施例中，經工程改造細胞可使用混合淋巴球反應(MLR)來評價。(參見例如DeWolf等人，Transplantation 100:1639-1649 (2017))。在一些實施例中，將經工程改造之人類細胞與經標記之未經編輯(非工程改造)之反應T細胞混合，且MLR分析藉由同種識別(
即，經由經工程改造之人類細胞表面上之錯配HLA分子)來量測反應T細胞活化之增殖。
D. 用於減少或消除 MHC II 類、其他修飾及經編輯細胞之方法及組成物
在一些實施例中，可在細胞中實施多重基因編輯。在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-B蛋白之表面表現，其包括對HLA-B基因進行遺傳修飾，包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含本文所揭示之HLA-B指導RNA；及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，該方法進一步包括與一或多種選自以下之組成物接觸：(a)將RNA指導之DNA結合劑引導至CIITA基因之指導RNA；(b)將RNA指導之DNA結合劑引導至細胞基因體中除HLA-B或CIITA外之基因座之指導RNA；及(c)用於插入細胞基因體中之供體核酸。
在一些實施例中，可在細胞中實施多重基因編輯。在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現，其包括對HLA-A及HLA-B基因進行遺傳修飾，包括使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含本文所揭示之HLA-A指導RNA；及視情況地第一RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；及使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含本文所揭示之HLA-B指導RNA；及視情況地第二RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；該方法進一步包括與一或多種選自以下之組成物接觸：(a)將RNA指導之DNA結合劑引導至CIITA基因之指導RNA；(b)將RNA指導之DNA結合劑引導至細胞基因體中除HLA-A及HLA-B或CIITA外之基因座之指導RNA；及(c)用於插入細胞基因體中之供體核酸。
在一些實施例中，可在細胞中實施多重基因編輯。在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現及減少或消除CIITA蛋白之表現，包括對HLA-A、HLA-B及CIITA基因進行遺傳修飾，包括使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含本文所揭示之HLA-A指導RNA；及視情況地第一RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；及使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含本文所揭示之HLA-B指導RNA；及視情況地第二RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；及使細胞與第三組成物接觸，該第三組成物包含本文所揭示之CIITA指導RNA；及視情況地第三RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸；該方法進一步視情況地包括與一或多種選自以下之組成物接觸：(a)將RNA指導之DNA結合劑引導至細胞基因體中除HLA-A、HLA-B及CIITA外之基因座(例如TRAC、TRBC1及/或TRBC2)之指導RNA；及(b)用於插入細胞基因體中之供體核酸。
在一些實施例中，提供用於細胞中之多重基因編輯之一或多種組成物。在一些實施例中，一或多種組成物包含本文所揭示之HLA-A指導RNA、本文所揭示之HLA-B指導RNA及本文所揭示之CIITA指導RNA；及視情況地(a)將RNA指導之DNA結合劑引導至細胞基因體中除HLA-A、HLA-B及CIITA外之基因座(例如TRAC、TRBC1及/或TRBC2)之指導RNA；及(b)用於插入細胞基因體中之供體核酸。
在一些實施例中，在本文所揭示之任一方法及組成物中，HLA-A指導RNA係包含本文所揭示之指導序列、例如選自SEQ ID NO: 301-590之指導序列之HLA-A指導RNA。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 571、576、1571、1576、2571、2576、3111及3112之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 571之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 576之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 1571之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 1576之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2571之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2576之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 3111之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 3112之序列。在一些實施例中，在本文所揭示之任一方法及組成物中，HLA-B指導RNA係包含本文所揭示之指導序列、例如選自SEQ ID NO: 1-91及101-185之指導序列之HLA-B指導RNA。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 13、74、163-166、169、177、1013、1074、1163-1166、1169、1177、2013、2074、2163-2166、2169、2177及2186-2191之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 13之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 74之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 163之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 164之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 165之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 166之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 169之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 177之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1013之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1074之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1163之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1164之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1165之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1166之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1169之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 1177之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2013之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2074之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2163之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2164之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2165之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2166之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2169之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2177之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2186之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2187之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2188之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2189之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2190之序列。在一些實施例中，HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 2191之序列。在一些實施例中，在本文所揭示之任一方法及組成物中，CIITA指導RNA係包含本文所揭示之指導序列、例如SEQ ID NO: 608或609之CIITA指導RNA。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 608、609、1608、1609、2608、2609、3116及3117之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 608之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 609之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 1608之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 1609之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 2608之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 2609之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 3116之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 3117之序列。在一些實施例中，在本文所揭示之任一方法及組成物中，將RNA指導之DNA結合劑引導至細胞基因體中除HLA-A、HLA-B及CIITA外之基因座之指導RNA包括TRAC指導RNA及/或TRBC指導RNA。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 605、606、613、1605、1606、1613、2605、2606、2613、3113及3114之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 605之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 606之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 613之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1605之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1606之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1613之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2605之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2606之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2613之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 3113之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 3114之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 607、1607、2607及3115之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 607之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 1607之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 2607之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 3115之序列。
在一些實施例中，提供藉由多重基因編輯方法或組成物獲得之經編輯細胞。在一些實施例中，經編輯細胞包含HLA-A基因之遺傳修飾、HLA-B基因之遺傳修飾及CIITA基因之遺傳修飾；及視情況地除HLA-A、HLA-B及CIITA外之基因(例如TRAC、TRBC1及/或TRBC2)之遺傳修飾。在一些實施例中，HLA-A基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；或chr6:29942609-29942633。在一些實施例中，HLA-A基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942891-29942915內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942609- 29942633內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355348-31355368；或chr6:31355347-31355367；或(b) chr6:31355221-31355245；chr6:31355222- 31355246；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425- 31356449；或chr6:31355441-31355465。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31355348-31355368內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31355347-31355367內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31355221-31355245內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31355222-31355246內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31355205-31355229內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31355446-31355470內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31356425-31356449內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，HLA-B基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr6:31355441-31355465內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10907504-10907528或chr16:10906643-10906667。在一些實施例中，CIITA基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr16:10907504-10907528內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr16:10906643-10906667內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，TRAC基因之遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr14:22550574-22550598或chr14:22550544-22550568。在一些實施例中，TRAC基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22550574-22550598內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，TRAC基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22550544-22550568內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，TRBC基因之遺傳修飾包含基因體坐標chr7:142792690-142792714內之至少一個核苷酸。
1. MHC II 類敲除
在一些實施例中，提供藉由對如本文所揭示之HLA-B進行遺傳修飾來減少或消除HLA-B之表面表現的方法，其中該等方法及組成物進一步提供相對於未經修飾之細胞，減少或消除MHC II類蛋白之表面表現。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由使細胞與CIITA指導RNA接觸來減少或消除。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供藉由對如本文所揭示之HLA-A及HLA-B基因進行遺傳修飾來減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現的方法，其中該等方法及組成物進一步提供相對於未經修飾之細胞，減少或消除MHC II類蛋白之表面表現。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由使細胞與CIITA指導RNA接觸來減少或消除。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，提供用於減少經工程改造之人類細胞上之MHC II類蛋白表面表現之方法。MHC II類表現受多種蛋白質之影響。(參見例如Crivello
等人，Journal Immunology 202:1895-1903 (2019)。) 舉例而言，CIITA蛋白用作轉錄活化劑(活化MHC II類啟動子)且為MHC II類蛋白表現所必需。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對選自以下之基因進行遺傳修飾來減少或消除：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對CIITA基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對HLA-DR基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對HLA-DQ基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對HLA-DP基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對RFX5基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對RFXB/ANK基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對RFXAP基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對CREB基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對NK-YA基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對NK-YB基因進行遺傳修飾來減少或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由對NK-YC基因進行遺傳修飾來減少或消除。
在一些實施例中，提供用於製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表現，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，該等方法進一步包括相對於未經修飾之細胞減少或消除該細胞中之MHC II類蛋白表面表現。在一些實施例中，該等方法包括使細胞與CIITA指導RNA接觸。
在一些實施例中，提供用於製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表現，其中該細胞係HLA-C同型接合的，該等方法進一步包括相對於未經修飾之細胞減少或消除該細胞中之MHC II類蛋白表面表現。在一些實施例中，該等方法包括使細胞與CIITA指導RNA接觸。
在一些實施例中，CIITA指導RNA之功效係藉由量測細胞中CIITA蛋白之水準來確定。CIITA蛋白之水準可藉由 例如細胞溶解物及使用抗CIITA抗體之西方墨點(western blot)來偵測。在一些實施例中，CIITA指導RNA之功效係藉由量測細胞核中CIITA蛋白之水準來確定。在一些實施例中，CIITA指導RNA之功效係藉由量測細胞中CIITA mRNA之水準來確定。CIITA mRNA之水準可藉由 例如RT-PCR來偵測。在一些實施例中，與未經修飾之細胞相比靶細胞中CIITA蛋白或CIITA mRNA水準之降低指示有效的CIITA指導RNA。
在一些實施例中，CIITA指導RNA之功效係藉由量測靶細胞對MHC II類蛋白表現之減少或消除來確定。CIITA蛋白用作反式活化劑，活化MHC II類啟動子，且為MHC II類蛋白表現所必需。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現可在靶細胞表面上偵測。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由流式細胞術量測。在一些實施例中，可使用針對MHC II類蛋白之抗體(例如抗HLA-DR、抗HLA-DQ、抗HLA-DP)來偵測MHC II類蛋白表現，例如藉由流式細胞術。在一些實施例中，與未經修飾之細胞(或未經修飾之細胞群體)相比，細胞(或細胞群體)表面上MHC II類蛋白之減少或消除指示有效的CIITA指導RNA。在一些實施例中，已與藉由流式細胞術對MHC II類蛋白呈陰性之特定CIITA指導RNA及RNA指導之DNA結合劑接觸之細胞(或細胞群體)指示有效的CIITA指導RNA。
在一些實施例中，使用本文所揭示之方法及組成物，細胞群體中之MHC II類蛋白表現減少或消除。在一些實施例中，細胞群體係富集的(例如藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% MHC II類陰性。在一些實施例中，細胞群體並非富集的(例如藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% MHC II類陰性。
在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少65% MHC II陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少70% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少80% MHC II陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少90% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少91% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少92% MHC II陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少93% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，相對於未經修飾之細胞群體，細胞群體係至少94% MHC II類陰性。
在一些實施例中，細胞群體引發來自
活體外或
活體內免疫細胞(例如CD4+ T細胞)之減少的反應。CD4+ T細胞反應可藉由量測CD4+ T細胞之活化反應(例如CD4+ T細胞增殖)、活化標誌物之表現或細胞介素產生(IL-2、IL-12、IFN-γ)之分析(例如流式細胞術、ELISA)來評估。可在其中經遺傳修飾之細胞與包含CD4+ T細胞之細胞共培養之
活體外細胞培養分析中評估CD4+ T細胞之反應。舉例而言，經工程改造細胞可與 例如PBMC、包含CD4+ T細胞之經純化CD3+ T細胞、經純化之CD4+ T細胞或CD4+ T細胞株共培養。自經工程改造細胞引發之CD4+ T細胞反應可與自未經修飾之細胞引發之反應進行比較。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中該細胞具有減少或消除的HLA-B及MHC II類蛋白表面表現，其中該細胞包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-A及HLA-C同型接合的，且其中該細胞包含CIITA基因之修飾。在一些實施例中，經工程改造細胞引發來自CD4+ T細胞之降低的反應且引發來自CD8+ T細胞之降低的反應。
在一些實施例中，提供經工程改造之人類細胞，其中該細胞具有減少或消除的HLA-A、HLA-B及MHC II類蛋白表面表現，其中該細胞包含HLA-A及HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-C同型接合的，且其中該細胞包含CIITA基因之修飾。在一些實施例中，經工程改造細胞引發來自CD4+ T細胞之降低的反應且引發來自CD8+ T細胞之降低的反應。
2. 外源核酸敲入
在一些實施例中，本揭示案提供藉由對如本文所揭示之HLA-B進行遺傳修飾來減少或消除HLA-B蛋白之表面表現之方法及組成物，其中該等方法及組成物進一步提供由外源核酸編碼之蛋白質(例如抗體、嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、細胞介素或細胞介素受體、趨化介素或趨化介素受體、酶、融合蛋白或其他類型之細胞表面結合多肽或可溶性多肽)之表現。在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之蛋白質。舉例而言，在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之靶向受體(本文進一步闡述)。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞可用作用於表現由外源核酸編碼之分泌多肽之「細胞工廠」，包括例如用作
活體內連續產生多肽之來源(如本文進一步闡述)。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，本揭示案提供藉由對如本文所揭示之HLA-A及HLA-B進行遺傳修飾來減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現之方法及組成物，其中該等方法及組成物進一步提供由外源核酸編碼之蛋白質(例如抗體、嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、細胞介素或細胞介素受體、趨化介素或趨化介素受體、酶、融合蛋白或其他類型之細胞表面結合多肽或可溶性多肽)之表現。在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之蛋白質。舉例而言，在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之靶向受體(本文進一步闡述)。在一些實施例中，靶向受體係CAR。在一些實施例中，靶向受體係通用CAR。在一些實施例中，靶向受體係抗CD30 CAR。在一些實施例中，抗CD30 CAR係國際申請案第PCT/US2023/018946號中所揭示之抗CD30 CAR中之任一者，該國際申請案之內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞可用作用於表現由外源核酸編碼之分泌多肽之「細胞工廠」，包括例如用作
活體內連續產生多肽之來源(如本文進一步闡述)。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，該等方法包括減少HLA-B蛋白之表面表現，其包括對HLA-B基因進行遺傳修飾，包括使細胞與包含本文所揭示之HLA-B指導RNA之組成物接觸，該方法進一步包括使細胞與外源核酸接觸。
在一些實施例中，該等方法包括減少HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現，其包括對HLA-A及HLA-B基因進行遺傳修飾，包括使細胞與包含本文所揭示之HLA-A指導RNA之第一組成物及包含本文所揭示之HLA-B指導RNA之第二組成物接觸，該方法進一步包括使細胞與外源核酸接觸。
在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-B蛋白之表面表現，其包括用一或多種組成物對細胞進行遺傳修飾，該一或多種組成物包含如本文所揭示之HLA-B指導RNA、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現，其包括用一或多種組成物對細胞進行遺傳修飾，該一或多種組成物包含含有如本文所揭示之HLA-A指導RNA之第一組成物、含有如本文所揭示之HLA-B指導RNA之第二組成物、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及一或多種RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-B蛋白及MHC II類蛋白之表面表現，其包括用一或多種組成物對細胞進行遺傳修飾，該一或多種組成物包含如本文所揭示之HLA-B指導RNA、CIITA指導RNA、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白及MHC II類蛋白之表面表現，其包括用一或多種組成物對細胞進行遺傳修飾，該一或多種組成物包含含有如本文所揭示之HLA-A指導RNA之第一組成物、含有如本文所揭示之HLA-B指導RNA之第二組成物、CIITA指導RNA、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及一或多種RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼可溶性多肽。如本文所用，「可溶性」多肽係指細胞分泌之多肽。在一些實施例中，可溶性多肽係治療性多肽。在一些實施例中，可溶性多肽係抗體。在一些實施例中，可溶性多肽係酶。在一些實施例中，可溶性多肽係細胞介素。在一些實施例中，可溶性多肽係趨化介素。在一些實施例中，可溶性多肽係融合蛋白。
在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體片段(例如Fab、Fab2)。在一些實施例中，外源核酸編碼全長抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼單鏈抗體(例如scFv)。在一些實施例中，抗體係IgG、IgM、IgD、IgA或IgE。在一些實施例中，抗體係IgG抗體。在一些實施例中，抗體係IgG1抗體。在一些實施例中，抗體係IgG4抗體。在一些實施例中，重鏈恆定區含有已知降低效應功能之突變。在一些實施例中，重鏈恆定區含有已知增強效應功能之突變。在一些實施例中，抗體係雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體係單結構域抗體(例如僅VH結構域抗體)。
在一些實施例中，外源核酸編碼中和抗體。中和抗體中和其靶抗原之活性。在一些實施例中，抗體係針對病毒抗原之中和抗體。在一些實施例中，抗體中和靶病毒抗原，從而阻斷病毒感染細胞之能力。在一些實施例中，可使用基於細胞之中和分析來量測抗體之中和活性。特定細胞及讀出將取決於中和抗體之靶抗原。可在基於細胞之中和分析中量測抗體之半最大有效濃度(EC
50)，其中更低之EC
50指示更強效之中和抗體。
在一些實施例中，外源核酸編碼結合至與疾病或病症(參見例如部分IV中所述之疾病及病症)相關之抗原之抗體。
在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之多肽(
即細胞表面結合蛋白)。在一些實施例中，外源核酸編碼靶向受體。「靶向受體」係存在於細胞(例如T細胞)表面上之受體，以允許細胞與靶位點(例如生物體中之特定細胞或組織)結合。在一些實施例中，靶向受體係CAR。在一些實施例中，靶向受體係通用CAR (UniCAR)。在一些實施例中，靶向受體係增殖誘導配位體(APRIL)。在一些實施例中，靶向受體係TCR。在一些實施例中，靶向受體係TRuC。在一些實施例中，靶向受體係B細胞受體(BCR) (例如，在B細胞上表現)。在一些實施例中，靶向受體係趨化介素受體。在一些實施例中，靶向受體係細胞介素受體。
在一些實施例中，靶向受體包括嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、及經由內部信號傳導結構域中之至少跨膜結構域可操作地連接之細胞表面分子的受體，該內部信號傳導結構域能夠在結合細胞外受體部分時活化T細胞。在一些實施例中，CAR係指細胞外抗原識別結構域，例如scFv、VHH、奈米抗體；該細胞外抗原識別結構域可操作地連接至細胞內信號傳導結構域，其在結合抗原時活化T細胞。CAR係由四個區域構成：抗原識別結構域、細胞外鉸鏈區、跨膜結構域及細胞內T細胞信號傳導結構域。該等受體為此項技術中所熟知(參見例如WO2020092057、WO2019191114、WO2019147805、WO2018208837)。亦預期用於識別不同抗原之通用CAR (UniCAR) (參見例如EP 2 990 416 A1)及促進免疫細胞經由適配體分子與靶細胞結合之反向通用CAR (RevCAR) (參見例如WO2019238722)。CAR可靶向可產生抗體之任何抗原且通常針對在欲靶向細胞或組織之表面上展示之分子。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別結構域(例如癌症抗原識別結構域及TCR之次單元(例如TRuC)。(參見 Baeuerle等人，Nature Communications 2087 (2019)。)
在一些實施例中，外源核酸編碼TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼經遺傳修飾之TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼對癌細胞表現之多肽具有特異性之經遺傳修飾之TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼特異性針對威爾姆氏腫瘤(Wilms’ tumor)基因(WT1)抗原之靶向受體。在一些實施例中，外源核酸編碼WT1特異性TCR (參見例如WO2020/081613A1)。
在一些實施例中，外源核酸插入靶細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸整合至靶細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸藉由同源重組(HR)整合至靶細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸藉由鈍端插入整合至靶細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸藉由非同源末端接合整合至靶細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸整合至細胞基因體中之安全港基因座中。在一些實施例中，外源核酸整合至TRAC基因座、B2M基因座、AAVS1基因座或CIITA基因座中之一者中。在一些實施例中，脂質核酸組裝組成物係脂質奈米粒子(LNP)。
在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造細胞之組成物，該經工程改造細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現且包含外源核酸。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造細胞之組成物，該經工程改造細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現且分泌或表現整合至細胞基因體中之外源核酸編碼之多肽。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造細胞之組成物，該經工程改造細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現或減少或消除的細胞核HLA-B水準，且具有減少或消除的MHC II類蛋白表面表現表現，並分泌或表現整合至細胞基因體中之外源核酸編碼之多肽。在一些實施例中，經工程改造細胞引發來自CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之降低的反應。
在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造細胞之組成物，該經工程改造細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現且包含外源核酸。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造細胞之組成物，該經工程改造細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現且分泌或表現整合至細胞基因體中之外源核酸編碼之多肽。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造細胞之組成物，該經工程改造細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現或減少或消除的細胞核HLA-A及HLA-B水準，且具有減少的MHC II類蛋白表面表現，並分泌或表現整合至細胞基因體中之外源核酸編碼之多肽。在一些實施例中，經工程改造細胞引發來自CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之降低的反應。
在一些實施例中，提供同種異體細胞，其中該細胞具有減少或消除的MHC II類及HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞包含如本文所揭示之HLA-B基因之修飾，其中該細胞包含CIITA基因之修飾，且其中該細胞進一步包含編碼多肽(例如，靶向受體)之外源核酸。
在一些實施例中，提供同種異體細胞，其中該細胞具有減少或消除的MHC II類、HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞包含如本文所揭示之HLA-A及HLA-B基因之修飾，其中該細胞包含CIITA基因之修飾，且其中該細胞進一步包含編碼多肽(例如，靶向受體)之外源核酸。
在一些實施例中，本揭示案提供藉由對如本文所揭示之HLA-B進行遺傳修飾來減少或消除HLA-B蛋白之表面表現的方法，其中該等方法進一步提供減少一或多種其他靶基因(例如TRAC、TRBC)之表現。在一些實施例中，其他遺傳修飾提供將經遺傳修飾之細胞用於過繼性細胞轉移應用之其他優點。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，本揭示案提供藉由對如本文所揭示之HLA-A及HLA-B進行遺傳修飾來減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現的方法，其中該等方法進一步提供減少一或多種其他靶基因(例如TRAC、TRBC)之表現。在一些實施例中，其他遺傳修飾提供將經遺傳修飾之細胞用於過繼性細胞轉移應用之其他優點。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，細胞係HLA-C同型接合的。
在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-B蛋白之表面表現，其包括用一或多種組成物對細胞進行遺傳修飾，該一或多種組成物包含如本文所揭示之HLA-B指導RNA、CIITA指導RNA、編碼多肽(例如，靶向受體)之外源核酸、將RNA指導之DNA結合劑引導至位於另一基因中之靶序列、由此減少或消除另一基因之表現的指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，另一靶基因係TRAC。在一些實施例中，另一靶基因係TRBC。
在一些實施例中，該等方法包括減少或消除HLA-A及HLA-B蛋白之表面表現，其包括用一或多種組成物對細胞進行遺傳修飾，該一或多種組成物包含如本文所揭示之HLA-B指導RNA、CIITA指導RNA、編碼多肽(例如，靶向受體)之外源核酸、將RNA指導之DNA結合劑引導至位於另一基因中之靶序列、由此減少或消除另一基因之表現的指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，另一靶基因係TRAC。在一些實施例中，另一靶基因係TRBC。
在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包括使細胞與DNA依賴性蛋白激酶抑制劑(DNAPKi)接觸，視情況地其中DNAPKi係化合物1或「DNAPKI化合物1」：9-(4,4-二氟環己基)-7-甲基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)胺基)-7,9-二氫-8H-嘌呤-8-酮，亦繪示為：
。
E. 例示性細胞類型
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對人類細胞進行遺傳修飾。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞稱為經工程改造細胞。經工程改造細胞係指包含經工程改造之遺傳修飾之細胞(或細胞之後代)，例如已與基因編輯系統接觸且經基因編輯系統遺傳修飾之細胞。術語「經工程改造細胞」及「經遺傳修飾之細胞」在通篇中可互換使用。經工程改造之人類細胞可為本文所揭示之任一例示性細胞類型。另外，由於MHC I類分子在所有有核細胞上表現，故經工程改造之人類細胞可為任一有核細胞。
在一些實施例中，當細胞係HLA-A同型接合時，HLA-A對偶基因選自以下HLA-A對偶基因中之任一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*11:01；HLA-A*26:01；HLA-A*68:01；HLA-A*29:02；HLA-A*31:01；HLA-A*32:01；HLA-A*30:02；HLA-A*25:01；HLA-A*33:01；HLA-A*02:02；HLA-A*74:01；HLA-A*02:02；HLA-A*29:01；HLA-A*02:03；HLA-A*02:05；HLA-A*24:07；HLA-A*11:02；HLA-A*36:01；HLA-A*02:22；HLA-A*34:02；HLA-A*01:03；HLA-A*24:02；HLA-A*02:07；HLA-A*23:01；HLA-A*30:01；HLA-A*33:03；HLA-A*02:06；HLA-A*34:02；及HLA-A*68:02。
在一些實施例中，當細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*08:01；HLA-C*03:02；HLA-C*16:01；HLA-C*15:02；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:10；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*17:01；HLA-C*01:02；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，當細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*03:04。在一些實施例中，當細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*06:02。在一些實施例中，當細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*01:02。在一些實施例中，當細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*08:01。在一些實施例中，當細胞係HLA-C同型接合時，HLA-C對偶基因係HLA-C*03:02。
在一些實施例中，當細胞係HLA-A同型接合及HLA-C同型接合時，HLA-A對偶基因選自以下HLA-A對偶基因中之任一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*11:01；HLA-A*26:01；HLA-A*68:01；HLA-A*29:02；HLA-A*31:01；HLA-A*32:01；HLA-A*30:02；HLA-A*25:01；HLA-A*33:01；HLA-A*02:02；HLA-A*74:01；HLA-A*02:02；HLA-A*29:01；HLA-A*02:03；HLA-A*02:05；HLA-A*24:07；HLA-A*11:02；HLA-A*36:01；HLA-A*02:22；HLA-A*34:02；HLA-A*01:03；HLA-A*24:02；HLA-A*02:07；HLA-A*23:01；HLA-A*30:01；HLA-A*33:03；HLA-A*02:06；HLA-A*34:02；及HLA-A*68:02；且HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*08:01；HLA-C*03:02；HLA-C*16:01；HLA-C*15:02；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:10；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*17:01；HLA-C*01:02；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，當細胞係HLA-A同型接合及HLA-C同型接合時，HLA-A及HLA-C對偶基因選自以下HLA-A及HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-A*01:01及HLA- C*07:01；HLA-A*02:01及HLA-C*07:02；HLA-A*02:01及HLA-C*05:01；HLA-A*03:01及HLA-C*07:02；HLA-A*02:01及HLA-C* 04:01；HLA-A*02:01及HLA-C*03:04；HLA-A*01:01及HLA-C*06:02；HLA-A* 03:01及HLA-C*04:01；HLA-A*02:01及HLA-C*07:01；HLA-A*24:02及HLA-C* 04:01；HLA-A*29:02及HLA-C*16:01；HLA-A*02:01及HLA-C*06:02；HLA-A* 24:02及HLA-C*07:02；HLA-A*26:01及HLA-C*12:03；HLA-A*11:01及HLA-C* 04:01；HLA-A*25:01及HLA-C*12:03；HLA-A*02:01及HLA-C* 02:02；HLA-A* 24:02及HLA-C*03:03；HLA-A*30:01及HLA-C*06:02；HLA-A* 02:01及HLA-C* 01:02；HLA-A*11:01及HLA-C*07:02；HLA-A*03:01及HLA-C*07:01；HLA-A* 23:01及HLA-C*04:01；HLA-A*24:02及HLA-C*07:01；HLA-A*31:01及HLA-C* 03:04；HLA-A*33:01及HLA-C*08:02；HLA-A*02:01及HLA-C*03:03；HLA-A* 11:01及HLA-C*01:02；HLA-A*01:01及HLA-C*04:01；HLA-A*03:01及HLA-C* 06:02。
在一些實施例中，細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*01:01及HLA- C*07:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*07:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*05:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*03:01及HLA-C*07:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*03:04。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*01:01及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*03:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*24:02及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*29:02及HLA-C*16:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*24:02及HLA-C*07:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*26:01及HLA-C*12:03。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*11:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*25:01及HLA-C*12:03。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*02:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*24:02及HLA-C*03:03。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*30:01及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*01:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*11:01及HLA-C*07:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*03:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*23:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*24:02及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*31:01及HLA-C*03:04。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*33:01及HLA-C*08:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*02:01及HLA-C*03:03。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*11:01及HLA-C*01:02。在一些實施例中，HLA-A及HLA-C對偶基因係HLA-A*01:01及HLA-C*04:01；HLA-A*03:01及HLA-C*06:02。
在一些實施例中，細胞係免疫細胞。如本文所用，「免疫細胞」係指免疫系統之細胞，包括例如淋巴球(例如T細胞、B細胞、自然殺手細胞(「NK細胞」及NKT細胞或iNKT細胞))、單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突細胞或顆粒球(例如嗜中性球、嗜酸性球及嗜鹼性球)。在一些實施例中，細胞係原代免疫細胞。在一些實施例中，免疫系統細胞可選自CD3
+、CD4
+及CD8
+T細胞、調控T細胞(Treg)、B細胞、NK細胞及樹突細胞(DC)。在一些實施例中，免疫細胞係同種異體的。
在一些實施例中，細胞係淋巴球。在一些實施例中，細胞係適應性免疫細胞。在一些實施例中，細胞係T細胞。在一些實施例中，細胞係B細胞。在一些實施例中，細胞係NK細胞。在一些實施例中，細胞係巨噬細胞。在一些實施例中，淋巴球係同種異體的。
如本文所用，T細胞可定義為表現T細胞受體(「TCR」或「αβ TCR」或「γδ TCR」)之細胞，然而，在一些實施例中，T細胞之TCR可經遺傳修飾以減少其表現(例如，藉由對TRAC或TRBC基因之遺傳修飾)，因此可使用CD3蛋白之表現作為藉由標準流式細胞術方法鑑別T細胞之標誌物。CD3係與TCR相關之多次單元信號傳導複合物。因此，T細胞可稱為CD3+。在一些實施例中，T細胞係表現CD3+標誌物及CD4+或CD8+標誌物之細胞。在一些實施例中，T細胞係同種異體的。
在一些實施例中，T細胞表現糖蛋白CD8且因此藉由標準流式細胞術方法係CD8+並可稱為「細胞毒性」 T細胞。在一些實施例中，T細胞表現糖蛋白CD4且因此藉由標準流式細胞術方法係CD4+並可稱為「輔助」T細胞。CD4+ T細胞可分化成多個亞組且可稱為Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、T調控(「Treg」)細胞或T濾泡性輔助細胞(「Tfh」)。每一CD4+亞組釋放可具有促發炎或抗發炎功能、存活或保護功能之特定細胞介素。T細胞可藉由CD4+或CD8+選擇方法自個體分離。
在一些實施例中，T細胞係記憶T細胞。在體內，記憶T細胞已遇到抗原。記憶T細胞可位於次級淋巴器官(中樞記憶T細胞)或最近感染之組織(效應記憶T細胞)中。記憶T細胞可為CD8+ T細胞。記憶T細胞可為CD4+ T細胞。
如本文所用，「中樞記憶T細胞」可定義為抗原經曆之T細胞，且例如可表現CD62L及CD45RO。中樞記憶T細胞可藉由偵測為CD62L+及CD45RO+。中樞記憶T細胞亦表現CCR7，因此可藉由標準流式細胞術方法偵測為CCR7+。
如本文所用，「早期幹細胞記憶T細胞」 (或「Tscm」)可定義為表現CD27及CD45RA、且因此藉由標準流式細胞術方法係CD27+及CD45RA+之T細胞。Tscm不表現CD45同種型CD45RO，因此若藉由標準流式細胞術方法對此同種型染色，則Tscm將進一步係CD45RO-。因此，CD45RO- CD27+細胞亦係早期幹細胞記憶T細胞。Tscm細胞進一步表現CD62L及CCR7，因此可藉由標準流式細胞術方法偵測為CD62L+及CCR7+。已顯示早期幹細胞記憶T細胞與細胞治療產品之增加的持久性及治療功效相關聯。
在一些實施例中，細胞係B細胞。如本文所用，「B細胞」可定義為表現CD19或CD20、或B細胞成熟抗原(「BCMA」)之細胞，且因此藉由標準流式細胞術方法，B細胞係CD19+或CD20+或BCMA+。藉由標準流式細胞術方法，B細胞進一步係CD3及CD56陰性。B細胞可為漿細胞。B細胞可為記憶B細胞。B細胞可為幼稚B細胞。B細胞可為IgM+或可具有類別轉換之B細胞受體(例如IgG+或IgA+)。在一些實施例中，B細胞係同種異體的。
在一些實施例中，細胞係單核細胞，例如來自骨髓或外周血。在一些實施例中，細胞係外周血單核細胞(「PBMC」)。在一些實施例中，細胞係PBMC，例如淋巴球或單核球。在一些實施例中，細胞係外周血淋巴球(「PBL」)。在一些實施例中，單核細胞係同種異體的。
包括ACT或組織再生療法中所用之細胞，例如幹細胞、前驅細胞及原代細胞。例如，幹細胞包括多能幹細胞(PSC)；誘導多能幹細胞(iPSC)；胚胎幹細胞(ESC)；間葉幹細胞(MSC，例如自骨髓(BM)、外周血(PB)、胎盤、臍帶(UC)或脂肪分離而來)；造血幹細胞(HSC；例如自BM或UC分離而來)；神經幹細胞(NSC)；組織特異性前驅幹細胞(TSPSC)；及角膜緣幹細胞(LSC)。前驅細胞及原代細胞包括單核細胞(MNC，例如自BM或PB分離而來)；內皮前驅細胞(EPC，例如自BM、PB及UC分離而來)；神經前驅細胞(NPC)；及組織特異性原代細胞或自其衍生之細胞(TSC)，包括軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。亦包括用於器官或組織移植之細胞，例如胰島細胞、心肌細胞、甲狀腺細胞、胸腺細胞、神經元細胞、皮膚細胞及視網膜細胞。
在一些實施例中，人類細胞係自人類個體分離而來。在一些實施例中，細胞係自人類供體PBMC或leukopak分離而來。在一些實施例中，細胞係來自患有疾患、病症或疾病之個體。在一些實施例中，細胞係來自具有愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus，「EBV」)之人類供體。
在一些實施例中，該等方法係
離體實施。如本文所用，「
離體」係指其中細胞能夠轉移至個體中(例如作為ACT療法)之
活體外方法。在一些實施例中，
離體方法係涉及ACT療法細胞或細胞群體之
活體外方法。
在一些實施例中，細胞係來自細胞株。在一些實施例中，細胞株衍生自人類個體。在一些實施例中，細胞株係淋巴母細胞樣細胞株(「LCL」)。細胞可冷凍保存及解凍。細胞先前可能未冷凍保存。
在一些實施例中，細胞係來自細胞庫。在一些實施例中，對細胞進行遺傳修飾且然後轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將細胞自個體取出，經
離體遺傳修飾，且轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經遺傳修飾之細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經遺傳修飾之免疫細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將包含第一及第二亞群之經遺傳修飾之免疫細胞群體轉移至細胞庫中，其中第一及第二亞群具有至少一種共同之遺傳修飾及至少一種不同的遺傳修飾。
F. 例示性基因編輯系統
可使用各種適宜基因編輯系統來製造本文所揭示之經工程改造細胞，包括(但不限於) CRISPR/Cas系統；鋅指核酸酶(ZFN)系統；及轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)系統。通常，基因編輯系統涉及使用經工程改造之裂解系統在靶DNA序列中誘導雙股斷裂(DSB)或切口(例如，單股斷裂或SSB)。裂解或切割可經由使用特定核酸酶(例如經工程改造之ZFN、TALEN)或使用具有經工程改造指導RNA之CRISPR/Cas系統指導靶DNA序列之特異性裂解或切割來進行。另外，基於Argonaute系統正在開發靶向核酸酶(例如，來自極端嗜熱菌(T. thermophilus)，稱為『TtAgo』，參見Swarts等人(2014) Nature 507(7491): 258-261)，其亦可具有用於基因編輯及基因療法之潛能。
在一些實施例中，基因編輯系統係TALEN系統。轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)係可經工程改造以切割特定DNA序列之限制酶。其係藉由將TAL效應DNA結合結構域融合至DNA裂解結構域(切割DNA股之核酸酶)來製成。轉錄活化劑樣效應物(TALE)可經工程改造以結合至期望DNA序列，以促進特定位置之DNA裂解(參見例如Boch, 2011, Nature Biotech)。可將限制酶引入細胞中，用於基因編輯或用於原位基因編輯，該技術稱為用經工程改造之核酸酶進行基因編輯。用於其中之該等方法及組成物為此項技術中已知。參見例如WO2019147805、WO2014040370、WO2018073393，該等專利之內容以全文引用方式併入本文中。
在一些實施例中，基因編輯系統係鋅指系統。鋅指核酸酶(ZFN)係藉由將鋅指DNA結合結構域融合至DNA裂解結構域產生之人工限制酶。鋅指結構域可經工程改造以靶向特定期望DNA序列，以使得鋅指核酸酶能夠靶向複雜基因體內之獨特序列。通常使用II型限制核酸內切酶FokI之非特異性裂解結構域作為ZFN中之裂解結構域。裂解由內源DNA修復機構修復，從而允許ZFN精確地改變高等生物體之基因體。用於其中之該等方法及組成物為此項技術中已知。參見例如WO2011091324，其內容以全文引用方式併入本文中。
在一些實施例中，基因編輯系統係CRISPR/Cas系統，包括例如包含指導序列及RNA指導之DNA結合劑之CRISPR指導RNA，且進一步闡述於本文中。
如本文所用，「RNA指導之DNA結合劑」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物或該複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性係序列特異性且取決於PAM及指導RNA序列之存在。例示性RNA指導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用之「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。dCas DNA結合劑可為包含非功能核酸酶結構域(RuvC或HNH結構域)之無活性核酸酶。在一些實施例中，Cas裂解酶或Cas切口酶包括經修飾以允許例如經由與FokI結構域融合而進行DNA裂解之dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶。
如本文所用，「2類Cas核酸酶」係具有RNA指導之DNA結合活性之單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如，Spy Cas9之H840A或D10A變異體，以及Nme Cas9 (例如Nme2 Cas9)之D16A及H588A)，其進一步具有RNA指導之DNA裂解酶或切口酶活性，及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性係不活化的。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如，K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9係同源的，且含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用方式併入。參見例如Zetsche，表S1及S3。參見例如Makarova等人，Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人，Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
在一些實施例中，基因編輯系統包含含有去胺酶及RNA指導之切口酶之鹼基編輯子。在一些實施例中，基因編輯系統包含含有胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶之鹼基編輯子。在一些實施例中，基因編輯系統包含DNA聚合酶。用於其中之基因編輯系統方法及組成物之進一步描述為此項技術中已知。參見例如於2021年12月10日提出申請之WO2019/067910、WO2021/188840A1、WO2019/051097及PCT/US2021/062922以及於2021年11月3日提出申請之美國臨時申請案第63/275,425號，該等申請案中每一者之內容以全文引用方式併入本文中。
用於本文所揭示之基因編輯系統之例示性核苷酸及多肽序列提供於下表9中。用於鑑別編碼本文所提供之多肽序列之替代性核苷酸序列(包括替代性天然存在之變異體)的方法為此項技術中已知。亦預期與該等核酸序列中之任一者或編碼本文所提供胺基酸序列之核酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。
G. CRISPR 指導 RNA
本文提供可用於修飾靶序列之指導序列，例如，使用包含具有RNA指導之DNA結合劑之所揭示指導序列之指導RNA (例如CRISPR/Cas系統)。指導序列顯示於表2、表3、表3A、表4、表5A、表5B、表6、表7及表9A (例如，SEQ ID NO: 1-91、101-185、301-498及500-590)中，與該等指導RNA靶向之基因體坐標一樣。
在一些實施例中，本文所提供之gRNA包含指導區(指導序列)及保守區，該保守區包含重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區，其中重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區中之一或多者係縮短的。在一些實施例中，gRNA係來自釀膿鏈球菌Cas9 (SpyCas9)。在一些實施例中，gRNA係來自
腦膜炎雙球菌Cas9 (NmeCas9)。
SpyCas9指導RNA之例示性保守區顯示於表8A中(SEQ ID NO: 600)。NmeCas9指導RNA之例示性保守區顯示於表8B中(SEQ ID NO: 3126)。第一列顯示核苷酸之編號；第二列顯示例示性序列；且第三(及第四)列顯示區域。關於sgRNA之「縮短」意指，其保守區缺少表8A-8B中所顯示之至少一個核苷酸，如下文詳細論述。
本文所揭示之每一SpyCas9指導RNA可進一步包含額外核苷酸，以例如與指導序列之3’端後之以下例示性核苷酸序列形成crRNA：5’至3’定向之GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 601)。在sgRNA之情形下，上述指導序列可進一步包含額外核苷酸(支架序列)，以例如與指導序列之3’端後之以下例示性核苷酸序列形成sgRNA：5’至3’定向之GUUUUAGAGCUAGAAA UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 602)或GUUUUAGAGCUAGAAAU AGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 603，其係不具四個末端U之SEQ ID NO: 602)。在一些實施例中，SEQ ID NO: 602之四個末端U不存在。在一些實施例中，僅存在SEQ ID NO: 602之四個末端U中之1者、2者或3者。
在一些實施例中，SpyCas9 sgRNA包含SpyCas9指導序列中之任一者(例如，SEQ ID NO: 1-91之HLA-B指導序列或SEQ ID NO: 301-428及463-511之HLA-A指導序列中之任一者)及額外核苷酸，以例如與指導序列之3’端後之以下例示性支架核苷酸序列形成crRNA：5’至3’定向之GUUUUAGAGCUA GAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 604)。SEQ ID NO: 604相對於以下野生型指導RNA保守序列缺少8個核苷酸：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 600)。其他例示性支架核苷酸序列提供於表9中。在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 1-91、301-428或463-511之指導序列中之任一者及表9中5’至3’定向之額外指導物支架序列，包括支架序列之經修飾形式，如顯示。
在一些實施例中，本文所提供之gRNA包含指導區及保守區，該保守區包含重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區，其中重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區中之一或多者係縮短的。在一些實施例中，gRNA係來自
腦膜炎雙球菌 Cas9(NmeCas9)。
在一些實施例中，指導RNA包含經修飾之sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含表2、表3、表3A、表4、表5A、表5B、表6、表7、表8A、表8B、表9及表9A中所提供之經修飾sgRNA序列之修飾模式中之任一者。在一些實施例中，保守區包含表8B、表9及表9A中之經修飾之保守區Nme指導RNA模體中之任一者，且其中保守區係指導區(指導序列)之3’端。在一些實施例中，保守區包含含有SEQ ID NO: 715-723中之任一者之經修飾序列，且其中保守區係指導區(指導序列)之3’端。在一些實施例中，指導RNA包含選自SEQ ID NO: 708及712-714中之任一者之核苷酸序列，其中N共同表示本文所揭示之任一指導序列，包括表3、表3A、表5A、表7及表9A中所提供之指導序列。在某些實施例中，N共同表示與表3、表3A、表5A、表7及表9A中所提供之指導序列中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致或互補之指導序列。在某些實施例中，N共同表示表3、表3A、表5A、表7及表9A中所提供之指導序列中之任一者。在某些實施例中，當N共同表示指導序列時，在(N)
20-25內，(N)
20-25之每一N可獨立地經修飾，例如，用2’-OMe修飾來修飾，視情況地進一步用PS修飾來修飾，具體而言在1個、2個或3個末端核苷酸處。在某些實施例中，(N)
20-25具有以下序列及修飾模式：mN*mN*mN*mNmNNNmNm NNmNNmNNNNNmNNNNmNNN。
NmeCas9單指導RNA (Nme sgRNA)之例示性保守區顯示於表8B中(SEQ ID NO: 3126)。第一列顯示核苷酸之編號；第二列顯示例示性序列；且第三(及第四)列顯示區域。關於sgRNA之「縮短」意指，其保守區缺少表8B中所顯示之至少一個核苷酸，如下文詳細論述。
在一些實施例中，NmeCas9 sgRNA包含本文所揭示之Nme Cas9指導序列中之任一者(例如，SEQ ID NO: 101-185)及額外核苷酸，以例如與指導序列之3’端後之以下例示性支架核苷酸序列形成crRNA：GUUGUAGCUCCCUUU CUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA (SEQ ID NO: 699)。
在一些實施例中，NmeCas9sgRNA包含SEQ ID NO: 101-185之指導序列中之任一者及額外核苷酸，以與指導序列之3’端後之以下核苷酸序列形成crRNA：GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAA GAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 701)；GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU (SEQ ID NO: 702)；GUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU (SEQ ID NO: 703)。
在一些實施例中，指導RNA係經化學修飾之指導RNA。在一些實施例中，指導RNA係經化學修飾之單指導RNA。經化學修飾之指導RNA可包含如
表 2-7中所顯示之一或多種修飾。經化學修飾之指導RNA可包含SEQ ID NO: 705-714中任一者之一或多個經修飾核苷酸。
在一些實施例中，指導RNA係包含SEQ ID NO: 705-714中所顯示之修飾模式之sgRNA。
在一些實施例中，指導RNA包含含有SEQ ID NO: 705、708、711、712、713或714中所顯示之修飾模式之sgRNA。在一些實施例中，指導RNA包含含有SEQ ID NO: 705、708、711、712、713或714之經修飾核苷酸之sgRNA，包括本文所揭示之指導序列(例如，SEQ ID NO: 1-91)。在一些實施例中，指導RNA係包含SEQ ID NO: 705、708、711、712、713或714之序列或與SEQ ID NO: 705、708、711、712、713或714至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列的sgRNA。
指導RNA可進一步包含trRNA。在本文所述之每一組成物及方法實施例中，crRNA及trRNA可締合為單RNA (sgRNA)或可處於單獨RNA上(dgRNA)。在sgRNA之上下文中，crRNA及trRNA組分可共價連接，例如經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵。在一些實施例中，crRNA或trRNA序列可稱為指導RNA之「支架」或「保守部分」。
在本文所述之組成物、用途及方法實施例中之每一者中，指導RNA可包含兩個RNA分子作為「雙指導RNA」或「dgRNA」。dgRNA包含第一RNA分子，其包含含有例如
表 2-3中所顯示之指導序列之crRNA；及包含trRNA之第二RNA分子。第一及第二RNA分子可不共價連接，但可經由crRNA及trRNA之部分之間的鹼基配對而形成RNA雙鏈體。
在本文所述之組成物、用途及方法實施例中之每一者中，指導RNA可包含單一RNA分子作為「單指導RNA」或「sgRNA」。sgRNA可包含共價連接至trRNA之crRNA (或其部分)，其包含
表 2-3中所顯示之指導序列。sgRNA可包含
表 2-3中所顯示之指導序列之17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA係經由連接體共價連接。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA及trRNA之部分之間的鹼基配對而形成莖環結構。在一些實施例中，crRNA與trRNA經由一或多個不是磷酸二酯鍵的鍵來共價連接。
在一些實施例中，trRNA可包含全部或部分源自天然存在之CRISPR/Cas系統的trRNA序列。在一些實施例中，trRNA包含截短或經修飾之野生型trRNA。trRNA之長度視使用之CRISPR/Cas系統而定。在一些實施例中，trRNA包含或由以下組成：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超過100個核苷酸。在一些實施例中，trRNA可包含某些二級結構，例如一或多個髮夾或莖環結構或一或多個凸起結構。
在一些實施例中，提供包含一或多種指導RNA之組成物，該一或多種指導RNA包含
表 2-3(對於HLA-B SpyCas9及NmeCas9指導物)及
表 4 、表 5B 及表 6(對於HLA-A SpyCas9指導物)以及表5A及表7 (對於HLA-A NmeCas9指導物)中任一者之指導序列。在一些實施例中，提供包含一或多種指導RNA之組成物，該一或多種指導RNA包含
表 2-3中任一者之指導序列，其中SEQ ID NO: 601-604之核苷酸跟隨在指導序列之3’端後。在一些實施例中，一或多種指導RNA係根據SEQ ID NO: 3003、3007-3009及3011-3014中任一者之修飾模式來修飾，該一或多種指導RNA包含
表 2-3(對於HLA-B SpyCas9及NmeCas9指導物)以及
表 4 、表 5B 及表 6(對於HLA-A SpyCas9指導物)中任一者之指導序列，其中SEQ ID NO: 601-604之核苷酸跟隨在指導序列之3’端後。
在一些實施例中，提供包含一或多種指導RNA之組成物，該一或多種指導RNA包含
表 2-3(對於HLA-B SpyCas9及NmeCas9指導物)以及
表 4 、表 5B 及表 6(對於HLA-A SpyCas9指導物
) 中任一者之指導序列。在一個態樣中，提供包含一或多種gRNA之組成物，其包含與SEQ ID NO: 1-91、301-428及463-511之核酸中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之指導序列。
在其他實施例中，提供包含至少一種、例如至少兩種gRNA之組成物，該等gRNA包含選自
表 2-3(對於HLA-B SpyCas9及NmeCas9指導物)以及
表 4 、表 5B 及表 6(對於HLA-A SpyCas9指導物)中所顯示之指導序列中之任兩者或更多者之指導序列。在一些實施例中，組成物包含至少兩種gRNA，其各自包含與
表 2-3(對於HLA-B SpyCas9及NmeCas9指導物)
以及表 4 、表 5B 及表 6(對於HLA-A SpyCas9及NmeCas9指導物)中所顯示之任一指導序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之指導序列。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別HLA-B中之靶序列(例如與其雜交)。舉例而言，HLA-B 靶序列可由包含指導RNA之所提供Cas裂解酶識別及裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)可由指導RNA引導至HLA-B中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交，且RNA指導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)裂解靶序列。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別HLA-A及HLA-B中之靶序列(或與其雜交)。舉例而言，HLA-A及HLA-B靶序列可由包含指導RNA之所提供Cas裂解酶識別及裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)可由指導RNA引導至HLA-A及HLA-B中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交，且RNA指導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)裂解靶序列。
在一些實施例中，一或多種HLA-B指導RNA之選擇係基於HLA-B內之靶序列來確定。在一些實施例中，根據來自人類參考基因體hg38之坐標，包含一或多條指導序列之組成物包含與
表 2-3中所顯示之相應基因體區域互補之指導序列。其他實施例之指導序列可與HLA-B內之
表 2-3 中之任一者中所列之基因體坐標附近的序列互補。舉例而言，其他實施例之指導序列可與包含
表 2-3中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列互補。
在一些實施例中，一或多種HLA-A指導RNA之選擇係基於HLA-A內之靶序列來確定。在一些實施例中，根據來自人類參考基因體hg38之坐標，包含一或多條指導序列之組成物包含與
表 4-7中所顯示之相應基因體區域互補之指導序列。其他實施例之指導序列可與HLA-A內之
表 4-7 中之任一者中所列之基因體坐標附近的序列互補。舉例而言，其他實施例之指導序列可與包含
表 4-7中所列之基因體坐標之10個鄰接核苷酸 ± 10個核苷酸的序列互補。不受限於任何特定理論，靶基因之某些區域中之修飾(例如，因核酸酶介導之DSB發生之插入/缺失產生之框移突變)可能不如其他區域中之突變耐受，因此DSB之位置係可能導致之蛋白質敲低之量或類型之重要因素。在一些實施例中，與靶基因內之靶序列互補或具有互補性之gRNA用於將RNA指導之DNA結合劑引導至靶基因中之特定位置。
在一些實施例中，指導序列與存在於靶基因中之靶序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%或80%一致。在一些實施例中，指導序列與存在於人類HLA-A或HLA-B基因中之靶序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%或80%一致。
在一些實施例中，靶序列可與指導RNA之指導序列互補。在一些實施例中，指導RNA之指導序列與其相應靶序列之間的互補或一致程度可為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，靶序列及gRNA之指導序列可為100%互補或一致的。在其他實施例中，靶序列及gRNA之指導序列可含有至少一個錯配。例如，靶序列及gRNA之指導序列可含有1、2、3或4個錯配，其中指導序列之總長度為20。在一些實施例中，靶序列及gRNA之指導序列可含有1-4個錯配，其中指導序列為20個核苷酸。
在一些實施例中，本文揭示之組成物或調配物包含含有開放閱讀框(ORF)之mRNA，該開放閱讀框編碼RNA指導之DNA結合劑，諸如本文所述之Cas核酸酶。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼RNA指導之DNA結合劑諸如Cas核酸酶之ORF的mRNA。
H. 經修飾之 gRNA 及 mRNA
在一些實施例中，gRNA (例如，sgRNA、短sgRNA、dgRNA或crRNA)經修飾。術語「經修飾」或「修飾」在本文所述之gRNA之上下文中包括上文所述之修飾，包括例如(a)末端修飾，例如5′末端修飾或3′末端修飾，包括5’或3’保護性末端修飾，(b)核鹼基(或「鹼基」)修飾，包括鹼基之替代或移除，(c)糖修飾，包括2′位、3′位或4′位之修飾，(d)核苷間鍵聯修飾，及(e)主鏈修飾，其可包括磷酸二酯鍵聯或核糖之修飾或替代。給定位置之核苷酸之修飾包括緊接核苷酸之糖之3’端之磷酸二酯鍵聯的修飾或替代。因此，例如，在5’端之第一與第二糖之間包含硫代磷酸酯之核酸視為包含位置1之修飾。術語「經修飾gRNA」通常係指具有對鹼基、糖及磷酸二酯鍵聯或主鏈部分(包括核苷酸磷酸酯)中一或多者之化學結構之修飾的gRNA，其皆如本文詳述及例示。
修飾之進一步描述及例示性模式提供於2019年12月12日公開之WO2019/237069之表1中，該專利之全部內容皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，gRNA包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個或更多個YA位點之修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶包含修飾(其包括改變緊接嘧啶糖之3’端之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤包含修飾(其包括改變緊接腺嘌呤糖之3’端之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包含修飾，例如糖、鹼基或核苷間鍵聯修飾。YA修飾可為本文所述之任一類型之修飾。在一些實施例中，YA修飾包含硫代磷酸酯、2’-OMe或2’-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾包含嘧啶修飾，其包括硫代磷酸酯、2’-OMe、2’-H、肌苷或2’-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾包含RNA雙鏈體區域內含有一或多個YA位點之雙環核糖類似物(例如，LNA、BNA或ENA)。在一些實施例中，YA修飾包含RNA雙鏈體區域內含有YA位點之雙環核糖類似物(例如，LNA、BNA或ENA)，其中YA修飾在YA位點之遠端。
在一些實施例中，gRNA之指導序列(或指導區)包含1個、2個、3個、4個、5個或更多個可包含YA修飾之YA位點(「指導區YA位點」)。在一些實施例中，位於5’末端之5’端之5端、6端、7端、8端、9端或10端的一或多個YA位點(其中「5端」等係指指導區之3’端之位置5，即指導區中最3’端之核苷酸)包含YA修飾。經修飾之指導區YA位點包含YA修飾。
在一些實施例中，經修飾之指導區YA位點處於指導區之3’末端核苷酸之20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個或9個核苷酸內。舉例而言，若經修飾之指導區YA位點處於指導區之3’末端核苷酸之10個核苷酸內且指導區之長度係20個核苷酸，則經修飾之指導區YA位點之經修飾核苷酸位於位置11-20中之任一者。在一些實施例中，經修飾之指導區YA位點位於5’末端之5’端之核苷酸4、5、6、7、8、9、10或11處或其後。
在一些實施例中，經修飾之指導區YA位點不為5’末端修飾。舉例而言，sgRNA可包含如本文所述之5’末端修飾且進一步包含經修飾之指導區YA位點。替代地，sgRNA可包含未經修飾之5’端及經修飾之指導區YA位點。替代地，短sgRNA可包含經修飾之5’端及未經修飾之指導區YA位點。
在一些實施例中，經修飾之指導區YA位點包含位於指導區YA位點5’端之至少一個核苷酸不包含之修飾。舉例而言，若核苷酸1-3包含硫代磷酸酯，核苷酸4僅包含2’-OMe修飾，且核苷酸5係YA位點之嘧啶並包含硫代磷酸酯，則經修飾之指導區YA位點包含位於指導區YA位點之5’端之至少一個核苷酸(核苷酸4)不包含之修飾(硫代磷酸酯)。在另一實例中，若核苷酸1-3包含硫代磷酸酯，且核苷酸4係YA位點之嘧啶並包含2’-OMe，則經修飾之指導區YA位點包含位於指導區YA位點之5’端之至少一個核苷酸(核苷酸1-3中之任一者)不包含之修飾(2’-OMe)。若未經修飾之核苷酸位於經修飾之指導區YA位點之5’端，則亦總是滿足此條件。
在一些實施例中，經修飾之指導區YA位點包含如上文針對YA位點所述之修飾。gRNA之指導區可根據包含本文所述之經修飾指導區之任一實施例來修飾。本揭示案別處所述之任何實施例可在可行程度上與任一前述實施例組合。
在一些實施例中，gRNA之5’或3’末端區域經修飾。
在一些實施例中，3’末端區域中之末端(即最後) 1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個核苷酸經修飾。在通篇中，此修飾可稱為「3’末端修飾」。在一些實施例中，3’末端區域中之末端(即最後) 1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個核苷酸包含一種以上之修飾。在一些實施例中，3’末端修飾包含或進一步包含以下中之任一或多者：經修飾之核苷酸，其選自2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。在一些實施例中，3’末端修飾包含或進一步包含gRNA之3’端之1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個核苷酸之修飾。在一些實施例中，3’末端修飾包含或進一步包含一個PS鍵聯，其中該鍵聯介於最後一個與倒數第二個核苷酸之間。在一些實施例中，3’末端修飾包含或進一步包含介於最後三個核苷酸之間的兩個PS鍵聯。在一些實施例中，3’末端修飾包含或進一步包含介於最後四個核苷酸之間的四個PS鍵聯。在一些實施例中，3’末端修飾包含或進一步包含介於最後2個、3個、4個、5個、6個或7個核苷酸中之任一或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中，包含3’末端修飾之gRNA包含或進一步包含3’尾，其中3’尾包含存在於3’尾中之任一或多個核苷酸之修飾。在一些實施例中，3’尾經完全修飾。在一些實施例中，3’尾包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個或1-10個核苷酸，視情況地其中該等核苷酸中之任一或多者經修飾。在一些實施例中，提供包含3’保護性末端修飾之gRNA。在一些實施例中，3’尾包含1個至約20個核苷酸、1個至約15個核苷酸、1個至約10個核苷酸、1個至約5個核苷酸、1個至約4個核苷酸、1個至約3個核苷酸及1個至約2個核苷酸。在一些實施例中，gRNA不包含3’尾。
在一些實施例中，5’末端區域經修飾，例如，gRNA之前1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個核苷酸經修飾。在通篇中，此修飾可稱為「5’末端修飾」。在一些實施例中，5’末端區域之前1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個核苷酸包含一種以上之修飾。在一些實施例中，5’端之末端(即，前) 1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中，gRNA之5’及3’末端區域(例如末端)皆經修飾。在一些實施例中，gRNA之僅5’末端區域經修飾。在一些實施例中，gRNA之保守部分之僅3’末端區域 (加上或減去3’尾)經修飾。在一些實施例中，gRNA包含gRNA之5’末端區域之前7個核苷酸中之1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個之修飾。在一些實施例中，gRNA包含3’末端區域之7個末端核苷酸中之1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個之修飾。在一些實施例中，5'末端區域之前4個核苷酸中之2個、3個或4個、或3'末端區域之末端4個核苷酸中之2個、3個或4個經修飾。在一些實施例中，5'末端區域之前4個核苷酸中之2個、3個或4個用硫代磷酸酯(PS)鍵連接。在一些實施例中，對5’末端或3’末端之修飾包含2’-O-甲基(2’-O-Me)或2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾。在一些實施例中，修飾包含對核苷酸之2’-氟(2’-F)修飾。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，修飾包含反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，修飾包含保護性末端修飾。在一些實施例中，修飾包含選自以下之一種以上之修飾：保護性末端修飾、2’-O-Me、2’-O-moe、2’-氟(2’-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯及反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，涵蓋等效修飾。
在一些實施例中，提供包含5’末端修飾及3’末端修飾之gRNA。在一些實施例中，gRNA包含不在5’端或3’端之經修飾核苷酸。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾之sgRNA，其中上莖修飾包含對上莖區中之US1-US12中任一或多者之修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾之sgRNA，其中上莖修飾包含上莖區中之至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或所有12個核苷酸之修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾之sgRNA，其中上莖修飾包含YA位點中之1個、2個、3個、4個或5個YA修飾。在一些實施例中，上莖修飾包含2’-OMe修飾之核苷酸、2’-O-moe修飾之核苷酸、2’-F修飾之核苷酸或其組合。本文所述之其他修飾(例如5’末端修飾或3’末端修飾)可與上莖修飾組合。
在一些實施例中，sgRNA包含髮夾區之修飾。在一些實施例中，髮夾區修飾包含至少一個選自以下之經修飾核苷酸：2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸或其組合。在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾1區中。在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾2區中。在一些實施例中，髮夾修飾包含YA位點中之1個、2個或3個YA修飾。在一些實施例中，髮夾修飾包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個YA修飾。本文所述之其他修飾(例如上莖修飾、5’末端修飾或3’末端修飾)可與髮夾區之修飾組合。
在一些實施例中，gRNA包含經取代及視情況地縮短之髮夾1區，其中以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況地縮短之髮夾1中經沃森-克裡克配對(Watson-Crick pairing)核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9。「沃森-克裡克配對核苷酸」包括能夠形成沃森-克裡克鹼基對之任一對，包括A-T、A-U、T-A、U-A、C-G及G-C對，以及包括具有相同鹼基配對偏好之任一前述核苷酸之經修飾形式之對。在一些實施例中，髮夾1區缺少H1-5至H1-8中之任一或兩者。在一些實施例中，髮夾1區缺少以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9。在一些實施例中，髮夾1區缺少髮夾1區之1-8個核苷酸。在任一前述實施例中，缺少的核苷酸可能使得經沃森-克裡克配對核苷酸(H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9)取代之一或多個核苷酸對在gRNA中形成鹼基對。
在一些實施例中，gRNA進一步包含缺少至少1個核苷酸之上莖區，例如WO/2021/119275 (其內容以全文引用方式併入本文中)之表7中所指示或本文別處所述之任一縮短之上莖區，其可與本文所述之任一縮短或經取代之髮夾1區組合。
在一些實施例中，本文所提供之sgRNA係短單指導RNA (短sgRNA)，例如包含含有髮夾區之sgRNA之保守部分，其中髮夾區缺少至少5-10個核苷酸或6-10個核苷酸。在一些實施例中，5-10個核苷酸或6-10個核苷酸係連續的。
在一些實施例中，短sgRNA缺少spyCas9 sgRNA之保守部分之至少核苷酸54-58 (AAAAA)。在一些實施例中，短sgRNA係缺少對應於如例如藉由逐對或結構比對確定之spyCas9之保守部分之核苷酸54-58 (AAAAA)的核苷酸之非spyCas9 sgRNA。
在一些實施例中，本文所述之短sgRNA包含含有髮夾區之保守部分，其中髮夾區缺少5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個核苷酸。在一些實施例中，缺少的核苷酸係5-10個缺少的核苷酸或6-10個缺少的核苷酸。在一些實施例中，缺少的核苷酸係連續的。在一些實施例中，缺少的核苷酸跨越髮夾1之至少一部分及髮夾2之一部分。在一些實施例中，5-10個缺少的核苷酸包含SEQ ID NO: 600之核苷酸54-58、54-61或53-60或由其組成。
在一些實施例中，本文所述之短sgRNA進一步包含連接區，其中連接區缺少至少一個核苷酸(例如，連接區中之1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個核苷酸)。在一些實施例中，短sgRNA缺少連接區中之每一核苷酸。
在一些實施例中，本文所述之SpyCas9短sgRNA包含NNNNNNNN NNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU (SEQ ID NO: 3002)之序列。
在一些實施例中，本文所述之短sgRNA包含如SEQ ID NO: 3003中所顯示之修飾模式：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU (SEQ ID NO: 3003)，其中除非另有指示，否則A、C、G、U及N分別係腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任一核糖核苷酸。m指示2’O-甲基修飾，且*指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
在某些實施例中，使用SEQ ID NO: 600 (「例示性SpyCas9 sgRNA-1」)作為實例，例示性SpyCas9 sgRNA-1進一步包括以下中之一或多者：
A. 縮短之髮夾1區，或經取代及視情況地縮短之髮夾1區，其中
1. 髮夾1中至少一個以下核苷酸對經沃森-克裡克配對核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10、或H1-4與H1-9，並且髮夾1區視情況地缺少
a. H1-5至H1-8中之任一或兩者，
b. 以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10、與H1-4與H1-9，或
c. 髮夾1區之1-8個核苷酸；或
2. 縮短之髮夾1區缺少6-8個核苷酸，較佳地6個核苷酸；且
a. 相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 600)，位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者缺失或經取代，或
b. 相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 600)，位置H1-6至H1-10中之一或多者經取代；或
3. 縮短之髮夾1區缺少5-10個核苷酸，較佳地5-6個核苷酸，且相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 600)，位置N18、H1-12或n中之一或多者經取代；或
B. 縮短之上莖區，其中縮短之上莖區缺少1-6個核苷酸且其中相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 600)，縮短之上莖區之6個、7個、8個、9個、10個或11個核苷酸包括少於或等於4個取代；或
C. 相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 600)在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中任一或多者處之取代，其中取代基核苷酸並非在腺嘌呤前之嘧啶，亦非在嘧啶後之腺嘌呤；或
D. 具有上莖區之例示性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 600)，其中上莖修飾包含對上莖區中之US1-US12中任一或多者之修飾，其中
1. 經修飾之核苷酸視情況地選自2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合；或
2. 經修飾之核苷酸視情況地包括2'-OMe修飾之核苷酸。
在某些實施例中，例示性SpyCas9 sgRNA-1或sgRNA，諸如包含例示性SpyCas9 sgRNA-1之sgRNA，進一步包括3'尾，例如1、2、3、4或更多個核苷酸之3'尾。在某些實施例中，該尾包括一或多個經修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾之核苷酸選自2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、及反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括2'-OMe修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括核苷酸之間的PS鍵聯。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸及核苷酸之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，本文所述之NmeCas9 gRNA進一步包含連接區，其中連接區缺少至少一個核苷酸。
在一些實施例中，選自SEQ ID NO 101-185之HLA-B NmeCas9 sgRNA包含含有重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區之保守部分，其中重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區中之一或多者係縮短的。
在一些實施例中，指導RNA係包含含有重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區之保守部分之Nme sgRNA，其中重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區中之一或多者係縮短的。在一些實施例中，本文所述之sgRNA進一步包含指導區及保守區，其中保守區包含以下中之一或多者：(a)縮短之重複/反重複區，其中該縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸，其中(i)相對於SEQ ID NO: 3126，核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失且視情況地核苷酸37-64中之一或多者經取代；及(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65；或(b)縮短之髮夾1區，其中縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況地2-8個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 3126，核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失且視情況地位置82-96中之一或多者經取代；且核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96；或(c)縮短之髮夾2區，其中縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況地2-16個核苷酸，其中(i)相對於SEQ ID NO: 3126，核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失且視情況地核苷酸113-134中之一或多者經取代；及(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135；其中相對於SEQ ID NO: 3126，核苷酸144-145中之一或兩者視情況地缺失；且其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA係sgRNA。
在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸1-4係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸5、8、9、11、13、18及22係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸1-5、8、9、11、13、18及22係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸1藉由硫代磷酸酯(PS)鍵聯連接至核苷酸2，核苷酸2藉由PS鍵聯連接至核苷酸3，及/或核苷酸3藉由PS鍵聯連接至核苷酸4。
在一些實施例中，核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，保守區之至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之重複/反重複區係缺少2-24個核苷酸之縮短之重複/反重複區，例如上文經編號實施例或表3、表3A、表5A、表7及表9A中所指示或本文別處所述之任一重複/反重複區，其可與本文所述之縮短之髮夾1區或髮夾2區中之任一者組合，包括(但不限於)上文經編號實施例中所指示及表3、表3A、表5A、表7及表9A之序列中所表示或本文別處所述之組合。在一些實施例中，位置49-52、87-90或122-125中之一或多者相對於SEQ ID NO: 3126經取代。在一些實施例中，位置49-52、87-90或122-125中之全部相對於SEQ ID NO: 3126經取代。在一些實施例中，表3、表3A、表5A、表7及表9A中所提供或本文所述之3’尾缺失。
在一些實施例中，gRNA之縮短之重複/反重複區缺少18個核苷酸。在一些實施例中，gRNA之縮短之重複/反重複區缺少22個核苷酸。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸36藉由6個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸36藉由7個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸36藉由8個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸36藉由9個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，相對於SEQ ID NO: 3126，核苷酸38-48及53-63缺失。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸38、41-48、53-60及63相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸36藉由6個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 3126缺失，且核苷酸36藉由核苷酸37、49-52及64連接至核苷酸65。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區中，核苷酸38、41-48、53-60及63相對於SEQ ID NO: 3126缺失，且核苷酸36藉由核苷酸37、39、40、49-52、61、62及64連接至核苷酸65。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區之上莖之核苷酸38-48及核苷酸53-63中之全部相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區之上莖之核苷酸39-48及核苷酸53-62中之全部相對於SEQ ID NO: 3126缺失，且核苷酸38及63經取代。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有14個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有15個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有16個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有17個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有18個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有19個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有20個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之重複/反重複區中，核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，在縮短之重複/反重複區與縮短之髮夾1區之間，核苷酸76藉由PS鍵聯連接至核苷酸77。
在一些實施例中，縮短之髮夾1區缺少2個核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾1區缺少21個核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾1區缺少2個核苷酸，且核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 3126缺失。在一些實施例中，縮短之髮夾1區缺少2個核苷酸，且核苷酸85及92相對於SEQ ID NO: 3126缺失。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區中，核苷酸81藉由12個核苷酸連接至核苷酸96。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區中，核苷酸81藉由12個核苷酸連接至核苷酸96。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區中，核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 3126缺失，且核苷酸81藉由核苷酸82-85、87-90及92-95連接至核苷酸96。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區中，核苷酸85及92相對於SEQ ID NO: 3126缺失，且核苷酸81藉由核苷酸82-84、86-91及93-95連接至核苷酸96。
在一些實施例中，縮短之髮夾1區具有長度為7個鹼基配對核苷酸之雙鏈體部分。在一些實施例中，縮短之髮夾1區具有長度為8個鹼基配對核苷酸之雙鏈體部分。
縮短之髮夾1區之莖之長度係7個鹼基配對核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾1區之核苷酸85-86及核苷酸91-92係缺失的。
在一些實施例中，縮短之髮夾1區具有13個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區中，核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，在縮短之髮夾1區與縮短之髮夾2區之間，核苷酸101係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，縮短之髮夾2缺少18個核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾2具有24個核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾2中，核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 3126缺失。在一些實施例中，縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，且核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 3126缺失。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區中，核苷酸112藉由4個核苷酸連接至核苷酸135。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區中，核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 3126缺失，且核苷酸112藉由核苷酸122-125連接至核苷酸135。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區中，核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 3126缺失。在一些實施例中，縮短之髮夾2區缺少18個核苷酸，且核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有28個核苷酸之長度。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區具有32個核苷酸之長度。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個之鹼基對。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過三個之鹼基對。
在一些實施例中，縮短之髮夾2區具有8個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾2區具有9個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾2區具有13個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區中，核苷酸104、110、111、122-125、142及143係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區中，核苷酸104、106-111、122-125、142及143係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，在縮短之髮夾2區中，核苷酸141藉由PS鍵聯連接至核苷酸142，及/或核苷酸142藉由PS鍵聯連接至核苷酸143。
在一些實施例中，指導RNA (gRNA)包含指導區及保守區，該保守區包含：
(a) 縮短之重複/反重複區，其中相對於SEQ ID NO: 3126，縮短之重複/反重複區缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 核苷酸38-48及53-63缺失；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；
(b) 縮短之髮夾1區，其中縮短之髮夾1缺少2個核苷酸，其中核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92相對於SEQ ID NO: 3126缺失；及
(c) 縮短之髮夾2區，其中縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 3126缺失；且其中核苷酸144-145相對於SEQ ID NO: 3126缺失；其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，指導RNA (gRNA)包含指導區及保守區，該保守區包含：
(a) 縮短之重複/反重複區，其中相對於SEQ ID NO: 3126，縮短之重複/反重複區缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 核苷酸38、41-48、53-60及63缺失；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；
(b) 縮短之髮夾1區，其中縮短之髮夾1缺少2個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 3126，核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失；
(c) 縮短之髮夾2區，其中縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 3126缺失；且
其中核苷酸144-145相對於SEQ ID NO: 3126缺失；
其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含指導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者： (a) 縮短之重複/反重複區，其中相對於SEQ ID NO: 3126，縮短之重複/反重複區缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 核苷酸37-48及53-64缺失；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；或
(b) 縮短之髮夾1區，其中縮短之髮夾1缺少2個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 3126，核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失；或
(c) 縮短之髮夾2區，其中縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 3126缺失；且
其中核苷酸144-145相對於SEQ ID NO: 3126缺失；
其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在其他實施例中，縮短之重複/反重複區，其中相對於SEQ ID NO: 3126，縮短之重複/反重複區缺少22個核苷酸。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UGAAAC之序列連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UUCGAAAGAC (SEQ ID NO: 3122)之序列連接至核苷酸65。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含： 指導序列，其包含：
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯；及
指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區，其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之重複/反重複區包含：
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區與縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯；
縮短之髮夾1區，其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾1區包含：
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區與縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區，其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾2區包含：
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間的PS鍵聯，
其中核苷酸144-145中之一或兩者視情況地相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含：
指導序列，其包含：
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯；及
指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區，其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之重複/反重複區包含：
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區，其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾1區包含：
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區與縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區，其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾2區包含：
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間的PS鍵聯，
其中核苷酸144-145中之一或兩者視情況地相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含：
指導序列，其包含：
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯；及
指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區，其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之重複/反重複區包含：
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區與縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯；
縮短之髮夾1區，其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾1區包含：
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區與縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區，其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾2區包含：
核苷酸104、106-111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間的PS鍵聯，
其中核苷酸144-145中之一或兩者視情況地相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含：
指導序列，其包含：
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯；及
指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區，其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之重複/反重複區包含：
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區，其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾1區包含：
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區與縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區，其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 3126缺失，該縮短之髮夾2區包含：
核苷酸104、106-111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間的PS鍵聯，
其中核苷酸144-145中之一或兩者視情況地相對於SEQ ID NO: 3126缺失。
在一些實施例中，先前實施例之指導RNA (gRNA)包含指導區及保守區，該保守區包含：
(a) 縮短之重複/反重複區，其中該縮短之重複/反重複區缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 核苷酸37-48及53-64相對於SEQ ID NO: 3126缺失；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；
(b) 縮短之髮夾1區，其中相對於SEQ ID NO: 3126，縮短之髮夾1缺少2個核苷酸，其中核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失；
(c) 縮短之髮夾2區，其中縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 3126缺失；且
(d) 其中核苷酸144-145相對於SEQ ID NO: 3126缺失；
其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在其他實施例中，縮短之重複/反重複區，其中相對於SEQ ID NO: 3126，縮短之重複/反重複區缺少22個核苷酸。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UGAAAC之序列連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UUCGAAAGAC (SEQ ID NO: 3122)之序列連接至核苷酸65。
在一些實施例中，sgRNA包含5’至3’定向之以下序列中之一者：(N)
20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAG AUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 3119)；(N)
20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAG AUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU (SEQ ID NO: 3120)；(N)
20-25GUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGU CGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU (SEQ ID NO: 3121)，其中除非另有指示，否則A、C、G、U及N分別係腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任一核糖核苷酸。在一些實施例中，N等於24。在一些實施例中，N等於25。
在一些實施例中，sgRNA之保守部分之至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，sgRNA包含含有5’至3’定向之以下序列中之一者之保守區：GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAm CAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU (SEQ ID NO: 707)；或
GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 710)；或
表9中所揭示之任何其他經修飾之保守區模體，包括SEQ ID NO: 715-723中之任一者，其中除非另有指示，否則A、C、G、U及N分別係腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任一核糖核苷酸。m指示2’O-甲基修飾，且*指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
在某些實施例中，HLA-B指導序列之長度係20-25個核苷酸((N)
20-25)，其中每一核苷酸可獨立地經修飾。在某些實施例中，指導物5’端之核苷酸1-3中之每一者獨立地經修飾。在某些實施例中，指導物5’端之核苷酸1-3中之每一者獨立地用2’-OMe修飾來修飾。在某些實施例中，指導物5’端之核苷酸1-3中之每一者獨立地用與相鄰核苷酸殘基之硫代磷酸酯鍵聯來修飾。在某些實施例中，指導物5’端之核苷酸1-3中之每一者獨立地用2’-OMe修飾及與相鄰核苷酸殘基之硫代磷酸酯鍵聯來修飾。
在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾之」 gRNA或「經化學修飾之」 gRNA，以闡述替代或除規範A、G、C及U殘基外使用之一或多種非天然或天然存在之組分或構形之存在。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)磷酸二酯主鏈鍵聯中非連接磷酸酯氧或一或多個連接之磷酸酯氧中之一或兩者之變化，例如替代(例示性主鏈修飾)；(ii)核糖之成分，例如核糖上之2'羥基之變化，例如替代(例示性糖修飾)；(iii)用「去磷酸」連接體批量替代磷酸酯部分(例示性主鏈修飾)；(iv)天然存在之核鹼基之修飾或替代，包括用不規範核鹼基修飾或替代(例示性鹼基修飾)；(v)核糖-磷酸酯主鏈之替代或修飾(例示性主鏈修飾)；(vi)寡核苷酸之3'端或5'端之修飾，例如末端磷酸酯基團之移除、修飾或替代或部分、帽或連接體之結合(該等3'或5'帽修飾可包含糖或主鏈修飾)；及(vii)糖之修飾或替代(例示性糖修飾)。
化學修飾(例如上文所列之彼等化學修飾)可進行組合以提供包含可具有兩種、三種、四種或更多種修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)之經修飾gRNA。舉例而言，經修飾殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每個鹼基經修飾，例如，所有鹼基具有經修飾之磷酸酯基團，例如硫代磷酸酯基團。在某些實施例中，gRNA分子之所有或基本上所有磷酸基團經硫代磷酸酯基團取代。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之5'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之3'端處或附近包含至少一個經修飾殘基。
在一些實施例中，gRNA包含一個、兩個、三個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾gRNA中至少5% (例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)之位置係經修飾之核苷或核苷酸。
在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾殘基之磷酸酯基團可藉由用不同取代基替代一或多個氧來修飾。另外，經修飾殘基(例如存在於經修飾核酸中之經修飾殘基)可包括用如本文所述之經修飾之磷酸酯基團批量替代未經修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾可包括產生不帶電連接體或具有不對稱電荷分佈之帶電連接體的變化。
經修飾磷酸酯基團之實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸鹽、硼烷磷酸酯、磷酸氫鹽、磷醯胺酯、磷酸烷基酯或磷酸芳基酯及磷酸三酯。
亦可構築可模擬核酸之支架，其中磷酸酯連接體及核糖經核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物替代。該等修飾可包含主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可由替代主鏈束縛。實例可以包括但不限於嗎啉代、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。
經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括對糖基之一或多種修飾，
即糖修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如經多個不同之「氧基」或「去氧」取代基替代。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，此乃因羥基可能不再去質子化以形成2'-烷氧化物離子。2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，即O(CH
2CH
2O)
nCH
2CH
2OR，其中R可為例如H或視情況地經取代之烷基，且n可為0至20之整數。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，其用氟化物替代2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖定」核酸(LNA)，其中2'羥基可例如藉由C
1-
6伸烷基或C
1-6伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中例示性橋可包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「解鎖」核酸(UNA)，其中核糖環缺少C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE)、(OCH
2CH
2OCH
3，例如PEG衍生物)。
「去氧」2'修飾可包括氫(
即去氧核糖，例如在部分dsRNA之突出部分)；鹵基(例如溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為例如NH
2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH
2CH
2NH)
nCH2CH
2-胺基(其中胺基可為例如如本文所述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫烷基；硫烷氧基；及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況地經 例如如本文所述之胺基取代。
糖修飾可包含亦可含有一或多個碳之糖基，該一或多個碳具有與核糖中相應碳之立體化學構形相反之立體化學構形。因此，經修飾之核酸可以包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。經修飾之核酸亦可包括無鹼基糖。該等無鹼基糖亦可在一或多個組成糖原子處進一步經修飾。經修飾之核酸亦可以包括一或多種L型糖，例如L-核苷。
可納入經修飾核酸中之本文所述之經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括經修飾鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。該等核鹼基可經修飾或經完全替代，以提供可納入經修飾核酸中之經修飾殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如鹼基之天然存在及合成衍生物。
在使用雙指導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者皆可含有修飾。該等修飾可處於crRNA或tracr RNA之一端或兩端。在包含sgRNA之實施例中，sgRNA之一端或兩端之一或多個殘基可經化學修飾，或整個sgRNA可經化學修飾。某些實施例包含5'末端修飾。某些實施例包含3'末端修飾。在某些實施例中，gRNA分子之單股突出中之一或多個或所有核苷酸係去氧核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA包含於2018年6月14日公開之WO2018/107028 A1中所揭示之一種修飾模式，該專利之內容以全文引用方式併入本文中。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示已經2’-F取代之核苷酸。「*」可用於繪示PS修飾。術語A*、C*、U*或G*可用於表示使用PS鍵連接至下一(例如3’)核苷酸之核苷酸。術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於表示已經2’-O-Me取代且使用PS鍵連接至下一(例如3’)核苷酸之核苷酸。
表 8A. 例示性 spyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 600)
表 8B. 例示性 NmeCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 3126)
I. 核糖核蛋白複合物
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| G | U | U | U | U | A | G | A | G | C | U | A | G | A | A | A | U | A | G | C | A | A | G | U | U | A | A | A | A | U |
| LS1-LS6 | B1-B2 | US1-US12 | B3-B6 | LS7-LS12 |
| 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 |
| A | A | G | G | C | U | A | G | U | C | C | G | U | U | A | U | C | A | A | C | U | U | G | A | A | A | A | A | G | U |
| 連接 | H1-1至H1-12 |
| 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 |
| G | G | C | A | C | C | G | A | G | U | C | G | G | U | G | C |
| N | H2-1至H2-15 |
| 1-24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 |
| NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | G | U | U | G | U | A | G | C | U | C | C | C | U | U | U | C | U | C | A | U | U | U | C | G |
| 下莖 | 上莖 | |||||||||||||||||||||||
| 指導區 | 重複/ 反重複區 |
| 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 |
| G | A | A | A | C | G | A | A | A | U | G | A | G | A | A | C | C | G | U | U | G | C | U | A | C | A | A | U | A |
| 環 | 上莖 | 下莖 | ||||||||||||||||||||||||||
| 重複/ 反重複區 |
| 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 |
| A | G | G | C | C | G | U | C | U | G | A | A | A | A | G | A | U | G | U | G | C | C | G | C | A | A | C | G | C | U | C |
| 莖 | 環 | 莖(96：未配對) | 下莖 | 凸起 | ||||||||||||||||||||||||||
| 髮夾1 | 髮夾2 |
| 109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 | 133 | 134 |
| U | G | C | C | C | C | U | U | A | A | A | G | C | U | U | C | U | G | C | U | U | U | A | A | G | G |
| 上莖 | 環 | 上莖 | |||||||||||||||||||||||
| 髮夾2 |
| 135 | 136 | 137 | 138 | 139 | 140 | 141 | 142 | 143 | 144 | 145 |
| G | G | C | A | U | C | G | U | U | U | A |
| 上莖 | 凸起 | 下莖 | ||||||||
| 髮夾2 | 尾 |
在一些實施例中，本揭示案提供包含一或多種gRNA之組成物，該一或多種gRNA包含
表 2-7之一或多條指導序列及RNA指導之DNA結合劑，例如核酸酶，例如Cas核酸酶，例如Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱為雙股核酸內切酶活性。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌及其他原核生物(參見例如下一段中之清單)之II型CRISPR系統之彼等Cas9核酸酶，及其經修飾(例如經工程改造或突變體)形式。參見例如US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶之其他實例包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物或其Cas10、Csm1或Cmr2次單元；及I型CRISPR系統之級聯複合物或其Cas3次單元。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自IIA型、IIB型或IIC型系統。關於各種CRISPR系統及Cas核酸酶之論述參見例如Makarova等人，Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011)；Makarova等人，Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015)；Shmakov等人，Molecular Cell
,60:385-397 (2015)。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶經修飾或衍生自Cas蛋白，例如2類Cas核酸酶(其可為例如II型、V型或VI型Cas核酸酶)。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白及其修飾。
可衍生出Cas核酸酶或Cas切口酶之非限制性例示性物種包括釀膿鏈球菌、嗜熱鏈球菌、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)、金黃色葡萄球菌、無害李斯特氏菌(Listeria innocua)、格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、新兇手弗朗西斯菌(Francisella novicida)、產琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、華德薩特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ變形菌綱(Gammaproteobacterium)、腦膜炎雙球菌、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、產琥珀酸纖維桿菌(Fibrobacter succinogene)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、綠色產色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、綠色產色鏈霉菌、玫瑰鏈孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰鏈孢囊菌、酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)、亞硒酸芽孢桿菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、佈氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、海洋微顫藍細菌(Microscilla marina)、伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘極地單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、極地單胞菌屬物種(Polaromonas sp.)、瓦氏鱷球藻(Crocosphaera watsonii)、藍藻屬物種(Cyanothece sp.)、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬物種(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋鹽桿菌(Acetohalobium arabaticum)、德根氏產氨菌(Ammonifex degensii)、熱解纖維素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金礦菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜熱丙酸球囊菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、長春花異色菌(Allochromatium vinosum)、海桿菌屬物種(Marinobacter sp.)、嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亞硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、嗜鹽浮游假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纖線桿菌(Ktedonobacter racemifer)、調查甲烷鹽菌(Methanohalobium evestigatum)、魚腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫節球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻屬物種(Nostoc sp.)、極大節螺藻(Arthrospira maxima)、鈍頂節螺藻(Arthrospira platensis)、節螺藻屬物種(Arthrospira sp.)、鞘絲藻屬物種(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、顫藻屬物種(Oscillatoria sp.)、運動石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色雙球菌(Neisseria cinerea)、海鷗彎曲菌(Campylobacter lari)、食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheria)、胺基酸球菌屬物種、毛螺菌科細菌ND2006及海洋單細胞藍藻(Acaryochloris marina)。
在一些實施例中，Cas核酸酶係來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自新兇手弗朗西斯菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌屬物種之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自毛螺菌科細菌ND2006之Cpf1核酸酶
。在其他實施例中，Cas核酸酶係來自土拉文氏桿菌
(Francisella tularensis) 、毛螺菌科細菌、瘤胃丁酸弧菌
(Butyrivibrio proteoclasticus) 、異域菌門細菌
(Peregrinibacteria bacterium) 、儉菌超門細菌
(Parcubacteria bacterium) 、史密斯氏菌屬
(Smithella) 、胺基酸球菌屬、候選白蟻鏈甲烷胞菌
(Candidatus Methanoplasma termitum) 、挑剔真桿菌
(Eubacterium eligens) 、牛眼莫拉氏菌
(Moraxella bovoculi)、稻田氏鉤端螺旋體
(Leptospira inadai) 、狗口腔卟啉單胞菌
(Porphyromonas crevioricanis) 、解糖腖普雷沃氏菌
(Prevotella disiens)或獼猴卟啉單胞菌
(Porphyromonas macacae)之Cpf1核酸酶。在某些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌屬或毛螺菌科之Cpf1核酸酶。
在一些實施例中，Cas切口酶衍生自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶係來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶之切口酶形式。參見例如WO/2020081568，其闡述Nme2Cas9 D16A切口酶融合蛋白。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自新兇手弗朗西斯菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自胺基酸球菌屬物種之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自毛螺菌科細菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他實施例中，Cas切口酶衍生自土拉文氏桿菌、毛螺菌科細菌、瘤胃丁酸弧菌、異域菌門細菌、儉菌超門細菌、史密斯氏菌屬、胺基酸球菌屬、候選白蟻鏈甲烷胞菌、挑剔真桿菌、牛眼莫拉氏菌、稻田氏鉤端螺旋體、狗口腔卟啉單胞菌、解糖腖普雷沃氏菌或獼猴卟啉單胞菌之Cpf1核酸酶。在某些實施例中，Cas切口酶衍生自胺基酸球菌屬或毛螺菌科之Cpf1核酸酶。如別處所論述，切口酶可藉由使兩個催化結構域中之一者不活化(例如藉由突變核溶解所需之活性位點殘基，例如Spy Cas9中N863之D10、H840)自核酸酶衍生而來。熟習此項技術者將熟悉容易地鑑別出其他Cas蛋白中之相應殘基之技術，例如序列比對及結構比對，其詳細論述於下文中。
在一些實施例中，gRNA連同RNA指導之DNA結合劑一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑為Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA連同Cas核酸酶一起被稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含I型、II型或III型成分。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白。在一些實施例中，gRNA連同Cas9一起稱為Cas9 RNP。
野生型Cas9有兩個核酸酶結構域：RuvC及HNH。RuvC結構域將非靶DNA股裂解，且HNH結構域將DNA之靶股裂解。在一些實施例中，Cas9蛋白包含多於一個RuvC結構域或多於一個HNH結構域。在一些實施例中，Cas9蛋白係野生型Cas9。在組成物、用途及方法實施例中之各者中，Cas誘導靶DNA中之雙股斷裂。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白質之一個結構域或區域由不同蛋白質之一部分替換。在一些實施例中，Cas核酸酶結構域可經來自不同核酸酶(例如Fok1)之結構域替代。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在其他實施例中，Cas核酸酶或Cas切口酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑具有單股切口酶活性，亦即可切割一條DNA股以產生單股斷裂，亦稱為「切口」。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶係在dsDNA中產生切口之酶，亦即，切割DNA雙螺旋之一條股但不切割另一條股。在一些實施例中，Cas切口酶係一種形式之Cas核酸酶(例如，上文所論述之Cas核酸酶)，其中核內溶解活性位點例如藉由催化結構域之一或多個變化(例如點突變)而不活化。關於Cas切口酶及例示性催化結構域變化之論述參見例如美國專利第8,889,356號。在一些實施例中，Cas切口酶(例如Cas9切口酶)具有不活化的RuvC或HNH結構域。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑經修飾為僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，劑蛋白可經修飾，使得一個核酸酶結構域突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC結構域的切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性RuvC結構域的切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH結構域的切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性HNH結構域的切口酶。
在一些實施例中，Cas蛋白核酸酶結構域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見，例如Zetsche等人(2015)
Cell10月22日:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可在HNH或HNH樣核酸酶結構域中包含胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶結構域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見，例如Zetsche等人(2015)。腦膜炎雙球菌之HNH或HNH樣核酸酶結構域或RuvC或RuvC樣結構域中之例示性胺基酸取代包括Nme2Cas9D16A (HNH切口酶)及Nme2Cas9H588A (RuvC切口酶)。其他例示性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西斯菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。
在一些實施例中，編碼切口酶之mRNA與分別同靶序列之有義股及反義股互補之一對指導RNA組合提供。在此實施例中，指導RNA將切口酶引導至靶序列並藉由在靶序列之相反股上產生切口(亦即，雙切口)引入DSB。在一些實施例中，使用雙切口可提高特異性並減少脫靶效應。在一些實施例中，切口酶與靶向相反DNA股之兩個單獨指導RNA一起使用以在靶DNA中產生雙切口。在一些實施例中，切口酶與兩個單獨指導RNA一起使用，這兩個指導RNA經選擇為非常接近以在靶DNA中產生雙切口。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑缺乏裂解酶及切口酶活性。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，但本質上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽為dCas9多肽。在一些實施例中，缺乏裂解酶及切口酶活性之RNA指導之DNA結合劑或dCas DNA結合多肽係一種形式之Cas核酸酶(例如上文所論述之Cas核酸酶)，其中其核內溶解活性位點 例如藉由其催化結構域之一或多個變化(例如點突變)而不活化。參見例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含一或多個異源功能結構域(例如，係或包含融合多肽)。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3去胺酶。在一些實施例中，APOBEC3去胺酶係APOBEC3A (A3A)。在一些實施例中，A3A係人類A3A。在一些實施例中，A3A係野生型A3A。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，mRNA進一步包含連接體以將編碼A3A之序列連接至編碼RNA指導之切口酶之序列。在一些實施例中，連接體係有機分子、基團、聚合物或化學部分。在一些實施例中，連接體係肽連接體。在一些實施例中，肽連接體係具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個或更多個胺基酸之任一段胺基酸。在一些實施例中，肽連接體係16殘基「XTEN」連接體或其變異體(參見例如實例；及Schellenberger等人，A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接體包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 900)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 901)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 902)。
在一些實施例中，肽連接體包含(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 910)、(G)
n、(EAAAK)
n(SEQ ID NO: 911)、(GGS)
n、SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 906)模體(參見例如Guilinger J P、Thompson D B、Liu D R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification.
Nat. Biotechnol.2014; 32(6): 577-82；全部內容皆以引用方式併入本文中)或(XP)
n模體或該等中任一者之組合，其中n獨立地係1與30之間的整數(SEQ DI NO: 3123)。參見WO2015089406，例如第[0012]段，其全部內容皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，肽連接體包含一或多條選自SEQ ID NO: 906-970之序列。
在一些實施例中，異源功能結構域可促進RNA指導之DNA結合劑運輸至細胞核中。舉例而言，異源功能結構域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與1-10個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與一個NLS融合。當使用一個NLS時，NLS可在RNA指導之DNA結合劑序列之N末端或C末端融合。在一些實施例中，NLS並不融合至C末端。其亦可插入RNA指導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與一個以上NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與2個、3個、4個或5個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情況下，兩個NLS可為相同(例如兩個SV40 NLS)或不同的。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑融合至在羧基末端融合之兩條NLS序列(例如SV40)。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個在N末端且一個在C末端。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單分序列，例如SV40 NLS，PKKKRKV (SEQ ID NO: 903)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 904)。在一些實施例中，NLS可為二分序列，例如核質蛋白之NLS，KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 905)。在特定實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 903) NLS可在RNA指導之DNA結合劑之C末端融合。在融合位點視情況地包括一或多個連接體。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含編輯子。例示性編輯子係BC22n，其包括藉由XTEN連接體融合至釀膿鏈球菌-D10A Cas9切口酶之
智人 (H. sapiens)APOBEC3A，及編碼BC22n之mRNA。提供編碼BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 804)。
在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠改變RNA指導之DNA結合劑之細胞內半衰期。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑的半衰期可增加。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑的半衰期可減少。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠提高RNA指導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠降低RNA指導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可充當蛋白質降解之訊號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶介導，例如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶。在一些實施例中，異源功能結構域可包含PEST序列。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可藉由添加泛素或多泛素鏈來修飾。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包括小泛素樣修飾物(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關修飾物-1 (URM1)、神經元前體細胞表現之發育下調蛋白-8 (NEDD8，在釀酒酵母
(S. cerevisiae)中亦稱為Rub1)、人類白血球抗原F相關蛋白(FAT10)、自噬-8 (ATG8)及自噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素折疊修飾物-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能結構域可為標誌物結構域。標誌物結構域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、表位標籤及報告基因序列。在一些實施例中，標誌物結構域可為螢光蛋白。適宜螢光蛋白之非限制性實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、單體Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed單體、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、單體Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他適宜螢光蛋白。在其他實施例中，標誌物結構域可為純化標籤或抗原決定基標籤。非限制性例示性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His (SEQ ID NO: 3124)、8×His (SEQ ID NO: 3125)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚-His及鈣調蛋白。非限制性例示性報告基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、山葵過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在另外的實施例中，異源功能結構域可將RNA指導之DNA結合劑靶向特定的細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能結構域可使RNA指導之DNA結合劑靶向粒線體。
在其他實施例中，異源功能結構域可為效應結構域，例如編輯子結構域。當將RNA指導之DNA結合劑引導至其靶序列時，例如，當Cas核酸酶藉由gRNA引導至靶序列時，諸如編輯子結構域之效應物可修飾或影響靶序列。在一些實施例中，諸如編輯子結構域之效應物可選自核酸結合結構域、核酸酶結構域(例如非Cas核酸酶結構域)、表觀遺傳修飾結構域、轉錄活化結構域或轉錄阻遏結構域。在一些實施例中，異源功能結構域係核酸酶，例如FokI核酸酶。參見，例如美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源功能結構域係轉錄活化劑或阻遏物。參見例如Qi等人，「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression」,
Cell152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人，「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors」,
Nat. Methods10:973-6 (2013)；Mali等人，「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering」,
Nat. Biotechnol.31:833-8 (2013)；Gilbert等人，「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes」,
Cell154:442-51 (2013)。因此，RNA指導之DNA結合劑基本上變成可使用指導RNA引導以結合期望靶序列之轉錄因子。
J. 指導 RNA 功效之測定
在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分(例如RNA指導之DNA結合劑)一起遞送或表現時，測定指導RNA之功效。在一些實施例中，指導RNA係與RNA指導之DNA結合劑(例如Cas蛋白，例如Cas9)一起表現。在一些實施例中，指導RNA遞送至已穩定表現RNA指導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之細胞株或在該細胞株中表現。在一些實施例中，指導RNA作為RNP之一部分遞送至細胞。在一些實施例中，指導RNA與編碼RNA指導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之mRNA一起遞送至細胞。
如本文所述，使用本文所揭示之RNA指導之DNA核酸酶及指導RNA可產生DSB、SSB或位點特異性結合，在DNA或前mRNA中產生核酸修飾，此可在由細胞機構修復時產生插入/缺失(插入/缺失)突變形式之錯誤。因插入/缺失所致之許多突變會改變閱讀框，引入未成熟終止密碼子，或引入外顯子跳躍，且因此產生非功能蛋白質。
在一些實施例中，特定指導RNA之功效係基於
活體外模型確定。在一些實施例中，
活體外模型係T細胞株。在一些實施例中，
活體外模型係HEK293 T細胞。在一些實施例中，
活體外模型係穩定表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，
活體外模型係淋巴母細胞樣細胞株。在一些實施例中，
活體外模型係原代人類T細胞。在一些實施例中，
活體外模型係原代人類B細胞。在一些實施例中，
活體外模型係原代人類外周血淋巴球。在一些實施例中，
活體外模型係原代人類外周血單核細胞。
在一些實施例中，在
活體外模型中發生缺失或插入之脫靶位點數係例如藉由分析用Cas9 mRNA及指導RNA
活體外轉染之細胞之基因體DNA來確定。在一些實施例中，該確定包括分析用Cas9 mRNA、指導RNA及供體寡核苷酸
活體外轉染之細胞之基因體DNA。該等確定之例示性程序提供於下文工作實例中。
在一些實施例中，在多個
活體外細胞模型中確定特定gRNA之功效用於指導RNA選擇過程。在一些實施例中，實施與所選指導RNA之細胞株數據比較。在一些實施例中，在多個細胞模型中實施交叉篩選。
在一些實施例中，根據靶控裂解效率來評估指導RNA之功效。在一些實施例中，根據靶位置(例如HLA-A、HLA-B或CIITA)之編輯%來量測指導RNA之功效。在一些實施例中，可利用深度測序來鑑別藉由基因編輯引入之修飾(例如插入、缺失)之存在。插入/缺失百分比可根據次世代定序「NGS」來計算。
在一些實施例中，根據靶細胞類型之基因體內脫靶序列處插入/缺失之數量或頻率來量測指導RNA之功效。在一些實施例中，提供有效的指導RNA，其在細胞群體中或相對於在靶位點產生插入/缺失之頻率以極低頻率(例如，＜5%)在脫靶位點產生插入/缺失。因此，本揭示案提供指導RNA，其在靶細胞類型(例如T細胞或B細胞)中並未展現脫靶插入/缺失形成，或其在細胞群體中或相對於在靶位點產生插入/缺失之頻率，產生＜5%之脫靶插入/缺失形成頻率。在一些實施例中，本揭示案提供指導RNA，其在靶細胞類型(例如T細胞或B細胞)中並未展現任何脫靶插入/缺失形成。在一些實施例中，提供指導RNA，其在少於5個脫靶位點產生插入/缺失，例如如藉由本文所述之一或多種方法所評估。在一些實施例中，提供指導RNA，其在少於或等於4個、3個、2個或1個脫靶位點產生插入/缺失，例如如藉由本文所述之一或多種方法所評估。在一些實施例中，脫靶位點並不出現在靶細胞(例如T細胞或B細胞)基因體中之蛋白質編碼區中。
在一些實施例中，使用線性擴增來偵測基因編輯事件，例如靶DNA中插入/缺失(「插入/缺失」)突變之形成、轉座及同源定向修復(HDR)事件。舉例而言，可使用用獨特序列標記之引子進行線性擴增及分離經標記之擴增產物(下文稱為「UnIT」或「獨特標識符標記」方法)。
在一些實施例中，指導RNA之功效係根據靶細胞類型內染色體重排之數量來量測。可使用Kromatid dGH分析來偵測染色體重排，包括例如轉座、交互轉座、轉座至脫靶染色體、缺失(
即染色體重排，其中片段因編輯事件所致在細胞複製週期中丟失)。在一些實施例中，靶細胞類型具有少於10次、少於8次、少於5次、少於4次、少於3次、少於2次或少於1次染色體重排。在一些實施例中，靶細胞類型不具染色體重排。
K. gRNA 組成物之遞送
脂質奈米粒子(LNP組成物)係熟知之遞送核苷酸及蛋白質貨物之方式且可用於遞送本文所揭示之指導RNA、組成物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP組成物遞送核酸、蛋白質或核酸以及蛋白質。
在一些實施例中，本發明包括將本文所揭示gRNA中之任一者遞送至個體之方法，其中gRNA調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包括組成物，其包含所揭示gRNA中之任一者及LNP。在一些實施例中，組成物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，LNP組成物包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP組成物包含十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯) (脂質A)或另一可離子化脂質。參見例如WO/2017/173054及本文所述之參考文獻之脂質。在一些實施例中，LNP組成物包含約4.5、5.0、5.5、6.0或6.5之陽離子脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比。在一些實施例中，術語陽離子及可離子化在LNP脂質之上下文中係可互換的，例如，其中可離子化脂質端視pH係陽離子的。
在一些實施例中，LNP包含脂質組分，且脂質組分包含：約35 mol%脂質A；約15 mol%中性脂質(例如，二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC))；約47.5 mol%輔助脂質(例如，膽固醇)；及約2.5 mol%隱形脂質(例如，1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲基聚氧基乙二醇2000 (PEG2k-DMG))，且其中LNP組成物之N/P比率係約3-7。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA調配為LNP組成物，用於製備用來治療疾病或病症之藥物。
電穿孔係熟知之遞送貨物之方式，且可使用任一電穿孔方法來遞送本文所揭示gRNA中之任一者。在一些實施例中，可使用電穿孔來遞送本文所揭示gRNA中之任一者及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包括將本文所揭示gRNA中之任一者遞送至
離體細胞之方法，其中gRNA調配為LNP或不調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，單獨或在一或多種載體上編碼之本文所述之指導RNA組成物調配於脂質奈米粒子中或經由脂質奈米粒子投與；參見例如WO/2017/173054及WO 2019/067992，該等專利之內容以全文引用方式併入。
在某些實施例中，本發明包括編碼任一指導RNA之DNA或RNA載體，該等指導RNA包含本文所述指導序列中之任一或多者。在一些實施例中，除指導RNA序列外，載體進一步包含不編碼指導RNA之核酸。不編碼指導RNA之核酸包括但不限於啟動子、強化子、調控序列及編碼RNA指導之DNA核酸酶(其可為核酸酶，諸如Cas9)的核酸。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA之一或多個核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼sgRNA之一或多個核苷酸序列及編碼RNA指導之DNA核酸酶(其可為Cas核酸酶，諸如Cas9或Cpf1)的mRNA。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA及編碼RNA指導之DNA核酸酶的mRNA之一或多條核苷酸序列，該RNA指導之DNA核酸酶可為Cas蛋白，例如Cas9。在一個實施例中，Cas9係來自釀膿鏈球菌(即Spy Cas9)。在一個實施例中，Cas9核酸酶係來自
腦膜炎雙球菌(即Nme Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含側接有天然存在之CRISPR/Cas系統之重複序列之全部或一部分的指導序列或由其組成。包含crRNA、trRNA或crRNA及trRNA或由其組成之核酸可進一步包含載體序列，其中載體序列包含不與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起天然發現之核酸或由其組成。
L. 治療方法及用途
如本文所述，本文所述之經工程改造人類細胞及組成物中之任一者可用於治療多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞(經工程改造細胞)或經遺傳修飾之細胞群體(多個經工程改造細胞)及組成物可用於治療多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，涵蓋治療本文所述之疾病或病症中之任一者之方法，其包括投與本文所述之任一或多種組成物。
在一些實施例中，本文所述之方法及組成物可用於治療需要遞送治療劑之疾病或病症。在一些實施例中，本發明提供在個體中提供免疫療法之方法，該方法包括向個體投與有效量之如本文所述之經工程改造細胞(或經工程改造細胞群體)，例如任一上文所提及細胞態樣及實施例之細胞。
在一些實施例中，該等方法包括向個體投與包含本文所述之經工程改造細胞之組成物作為過繼性細胞轉移療法。在一些實施例中，經工程改造細胞係同種異體細胞。
在一些實施例中，該等方法包括向個體投與包含本文所述之經工程改造細胞之組成物，其中細胞產生、分泌或表現可用於治療個體之疾病或病症之多肽(例如，靶向受體)。在一些實施例中，細胞充當產生可溶性多肽之細胞工廠。在一些實施例中，細胞充當產生抗體之細胞工廠。在一些實施例中，細胞在
活體內持續分泌多肽。在一些實施例中，細胞在
活體內移植後持續分泌多肽至少1週、2週、3週、4週、5週或6週。在一些實施例中，細胞在
活體內移植後持續分泌多肽長達6週。在一些實施例中，可溶性多肽(例如抗體)係以至少10
2、10
3、10
4、10
5、10
6、10
7或10
8拷貝/天之濃度由細胞產生。在一些實施例中，多肽係抗體且以至少10
8拷貝/天之濃度由細胞產生。
在方法之一些實施例中，該方法包括在向個體投與有效量之如本文所述之經工程改造細胞(或多個經工程改造細胞) (例如任一上文所提及細胞態樣及實施例之細胞)之前，投與淋巴清除劑或免疫抑制劑。在另一態樣中，本發明提供製備經工程改造細胞(例如經工程改造細胞群體)之方法。
免疫療法藉由活化或抑制免疫系統來治療疾病。經設計以引發或擴大免疫反應之免疫療法分類為活化免疫療法。已證實基於細胞之免疫療法可有效地治療一些癌症。免疫效應細胞(例如淋巴球、巨噬細胞、樹突細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、T輔助細胞、B細胞或其前驅細胞(例如造血幹細胞(HSC)或誘導多能幹細胞(iPSC)))可經程式化以因應在腫瘤細胞表面上表現之異常抗原而起作用。因此，癌症免疫療法允許免疫系統之組分破壞腫瘤或其他癌性細胞。亦已證實基於細胞之免疫療法可有效地治療自體免疫疾病或移植排斥。免疫效應細胞(例如調控T細胞(Treg)或間葉幹細胞)可經程式化以因應在正常組織表面上表現之自體抗原或移植抗原而起作用。
在一些實施例中，本發明提供製備經工程改造細胞(例如經工程改造細胞群體)之方法。經工程改造細胞群體可用於免疫療法。
在一些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之方法，其包括投與藉由本文所述之製備細胞之方法(例如製備細胞之方法之任一上文所提及態樣及實施例之方法)製備的經工程改造細胞。
在一些實施例中，經工程改造細胞可用於治療癌症、傳染病、發炎性疾病、自體免疫疾病、心血管疾病、神經疾病、眼科疾病、腎病、肝病、肌肉骨骼疾病、紅血球疾病或移植排斥。在一些實施例中，經工程改造細胞可用於細胞移植，例如移植至肝臟、肺、腎臟、胰臟、皮膚或腦。(參見例如Deuse等人，Nature Biotechnology 37:252-258 (2019)。)
在一些實施例中，經工程改造細胞可用作包括同種異體幹細胞療法之細胞療法。在一些實施例中，細胞療法包括誘導多能幹細胞(iPSC)。iPSC可經誘導以分化成其他細胞類型，包括例如心肌細胞、β胰島細胞、神經元及血球。在一些實施例中，細胞療法包括造血幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包括可發育成骨、軟骨、肌肉及脂肪細胞之間葉幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包括眼部幹細胞。在一些實施例中，同種異體幹細胞移植包括同種異體骨髓移植。在一些實施例中，幹細胞包括多能幹細胞(PSC)。在一些實施例中，幹細胞包括誘導胚胎幹細胞(ESC)。
本文所揭示之經工程改造之人類細胞適於例如藉由引入其他經編輯或經修飾之基因或對偶基因來進一步工程改造。本發明之細胞亦可適於藉由引入編碼例如靶向受體(例如TCR、CAR、UniCAR)之外源核酸來進一步工程改造。CAR亦稱為嵌合免疫受體、嵌合T細胞受體或人工T細胞受體。在一些實施例中，TCR係野生型或變異體TCR。
在一些實施例中，細胞療法係基因轉殖T細胞療法。在一些實施例中，細胞療法包括威爾姆氏腫瘤1 (WT1)靶向基因轉殖T細胞。在一些實施例中，細胞療法包括靶向受體或編碼市售T細胞療法(例如CAR T細胞療法)之靶向受體之供體核酸。業內存在多種靶向受體目前經批準用於細胞療法。本文所提供之細胞及方法可與該等已知構築物一起使用。包括用作細胞療法之靶向受體構築物之商業上批準之細胞產品包括例如Kymriah® (tisagenlecleucel)；Yescarta® (axicabtagene ciloleucel)；Tecartus™ (brexucabtagene autoleucel)；Tabelecleucel (Tab-cel®)；Viralym-M (ALVR105)；及Viralym-C。
在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造細胞，其中投與係注射。在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造細胞，其中投與係血管內注射或輸注。在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造細胞，其中投與係單一劑量。
在一些實施例中，該等方法提供減少與用本文所揭示之組成物治療之個體疾病相關的徵象或症狀。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組成物治療之反應持續一週以上。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組成物治療之反應持續兩週以上。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組成物治療之反應持續三週以上。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組成物治療之反應持續一個月以上。
在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造細胞，且其中個體對所投與細胞之反應包括減少與藉由細胞療法治療之疾病相關之徵象或症狀。在一些實施例中，個體之反應持續一週以上。在一些實施例中，個體之反應持續一個月以上。在一些實施例中，個體之反應持續至少1-6週。
VI. 表 9. 其他序列* 此表中所揭示之指導序列可未經修飾，用該表中所顯示之例示性修飾模式修飾，或用本文所揭示或此項技術中可獲得之不同修飾模式修飾。
VII. 表 9A. 其他例示性 Nme 指導 RNA
VIII. 實例
| 描述 | SEQ ID NO | 序列 |
| 例示性SpyCas9 sgRNA支架 | 600 | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC |
| 例示性SpyCas9 crRNA 3’序列 | 601 | GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 例示性SpyCas9 sgRNA支架 | 602 | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 例示性SpyCas9 sgRNA支架 | 603 | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC |
| 例示性SpyCas9 crRNA支架 | 604 | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC |
| 605-612 | 參見表9A | |
| 613-698 | 未使用 | |
| 例示性NmeCas9指導RNA支架 | 699 | GUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA |
| 例示性NmeCas9指導RNA | 700 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA |
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 3119 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 3120 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU |
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 3121 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU |
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 704 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUUCGAAAGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體(101聚物) | 705 | mN*mNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 706 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGm AmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 707 | GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體(101聚物) | 708 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 709 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGm AmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 710 | GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體(105聚物) | 711 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體(101聚物) | 712 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體(101聚物) | 713 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 縮短/經修飾之NmeCas9指導RNA模體(101聚物) | 714 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 715 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
| 指導物支架 | 716 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 717 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 718 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 719 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 720 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 721 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 722 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 指導物支架 | 723 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| 724-799 | 未使用 | |
| 重組Cas9-NLS胺基酸序列 | 800 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV |
| 編碼Spy Cas9之ORF | 801 | ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG |
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| 具有Hibit標籤之Spy Cas9之開放閱讀框 | 803 | AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUGA |
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| 具有Hibit標籤之BC22n之開放閱讀框 | 805 | AUGgaggccucccccgccuccggcccccggcaccugauggacccccacaucuucaccuccAACUUCAACAACggcAUCggccggCACAAGaccUACCUGUGCUACgagguggagcggCUGGACAACggcaccuccgugAAGAUGGACCAGCACcggggcUUCCUGCACAACCAGgccAAGAACCUGCUGUGCggcUUCUACggccggCACgccgagCUGcggUUCCUGGACCUGgugcccuccCUGCAGCUGGACcccgccCAGAUCUACcgggugaccUGGUUCAUCuccUGGucccccUGCUUCuccUGGggcUGCgccggcgaggugcgggccUUCCUGCAGgagAACaccCACgugcggCUGcggAUCUUCgccgcccggAUCUACGACUACGACcccCUGUACAAGgaggccCUGCAGAUGCUGcggGACgccggcgccCAGguguccAUCAUGaccUACGACgagUUCAAGCACUGCUGGGACaccUUCgugGACCACCAGggcUGCcccUUCCAGcccUGGGACggcCUGGACgagCACuccCAGgccCUGuccggccggCUGcgggccAUCCUGCAGAACCAGggcAACuccggcuccgagacccccggcaccuccgaguccgccacccccgaguccgacaagaaguacuccaucggccuggCcaucggcaccaacuccgugggcugggccgugaucaccgacgaguacaaggugcccuccaagaaguucaaggugcugggcaacaccgaccggcacuccaucaagaagaaccugaucggcgcccugcuguucgacuccggcgagaccgccgaggccacccggcugaagcggaccgcccggcggcgguacacccggcggaagaaccggaucugcuaccugcaggagaucuucuccaacgagauggccaagguggacgacuccuucuuccaccggcuggaggaguccuuccugguggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccaucuucggcaacaucguggacgagguggccuaccacgagaaguaccccaccaucuaccaccugcggaagaagcugguggacuccaccgacaaggccgaccugcggcugaucuaccuggcccuggcccacaugaucaaguuccggggccacuuccugaucgagggcgaccugaaccccgacaacuccgacguggacaagcuguucauccagcuggugcagaccuacaaccagcuguucgaggagaaccccaucaacgccuccggcguggacgccaaggccauccuguccgcccggcuguccaagucccggcggcuggagaaccugaucgcccagcugcccggcgagaagaagaacggccuguucggcaaccugaucgcccugucccugggccugacccccaacuucaaguccaacuucgaccuggccgaggacgccaagcugcagcuguccaaggacaccuacgacgacgaccuggacaaccugcuggcccagaucggcgaccaguacgccgaccuguuccuggccgccaagaaccuguccgacgccauccugcuguccgacauccugcgggugaacaccgagaucaccaaggccccccuguccgccuccaugaucaagcgguacgacgagcaccaccaggaccugacccugcugaaggcccuggugcggcagcagcugcccgagaaguacaaggagaucuucuucgaccaguccaagaacggcuacgccggcuacaucgacggcggcgccucccaggaggaguucuacaaguucaucaagcccauccuggagaagauggacggcaccgaggagcugcuggugaagcugaaccgggaggaccugcugcggaagcagcggaccuucgacaacggcuccaucccccaccagauccaccugggcgagcugcacgccauccugcggcggcaggaggacuucuaccccuuccugaaggacaaccgggagaagaucgagaagauccugaccuuccggauccccuacuacgugggcccccuggcccggggcaacucccgguucgccuggaugacccggaaguccgaggagaccaucacccccuggaacuucgaggaggugguggacaagggcgccuccgcccaguccuucaucgagcggaugaccaacuucgacaagaaccugcccaacgagaaggugcugcccaagcacucccugcuguacgaguacuucaccguguacaacgagcugaccaaggugaaguacgugaccgagggcaugcggaagcccgccuuccuguccggcgagcagaagaaggccaucguggaccugcuguucaagaccaaccggaaggugaccgugaagcagcugaaggaggacuacuucaagaagaucgagugcuucgacuccguggagaucuccggcguggaggaccgguucaacgccucccugggcaccuaccacgaccugcugaagaucaucaaggacaaggacuuccuggacaacgaggagaacgaggacauccuggaggacaucgugcugacccugacccuguucgaggaccgggagaugaucgaggagcggcugaagaccuacgcccaccuguucgacgacaaggugaugaagcagcugaagcggcggcgguacaccggcuggggccggcugucccggaagcugaucaacggcauccgggacaagcaguccggcaagaccauccuggacuuccugaaguccgacggcuucgccaaccggaacuucaugcagcugauccacgacgacucccugaccuucaaggaggacauccagaaggcccagguguccggccagggcgacucccugcacgagcacaucgccaaccuggccggcucccccgccaucaagaagggcauccugcagaccgugaaggugguggacgagcuggugaaggugaugggccggcacaagcccgagaacaucgugaucgagauggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacucccgggagcggaugaagcggaucgaggagggcaucaaggagcugggcucccagauccugaaggagcaccccguggagaacacccagcugcagaacgagaagcuguaccuguacuaccugcagaacggccgggacauguacguggaccaggagcuggacaucaaccggcuguccgacuacgacguggaccacaucgugccccaguccuuccugaaggacgacuccaucgacaacaaggugcugacccgguccgacaagaaccggggcaaguccgacaacgugcccuccgaggagguggugaagaagaugaagaacuacuggcggcagcugcugaacgccaagcugaucacccagcggaaguucgacaaccugaccaaggccgagcggggcggccuguccgagcuggacaaggccggcuucaucaagcggcagcugguggagacccggcagaucaccaagcacguggcccagauccuggacucccggaugaacaccaaguacgacgagaacgacaagcugauccgggaggugaaggugaucacccugaaguccaagcugguguccgacuuccggaaggacuuccaguucuacaaggugcgggagaucaacaacuaccaccacgcccacgacgccuaccugaacgccguggugggcaccgcccugaucaagaaguaccccaagcuggaguccgaguucguguacggcgacuacaagguguacgacgugcggaagaugaucgccaaguccgagcaggagaucggcaaggccaccgccaaguacuucuucuacuccaacaucaugaacuucuucaagaccgagaucacccuggccaacggcgagauccggaagcggccccugaucgagaccaacggcgagaccggcgagaucgugugggacaagggccgggacuucgccaccgugcggaaggugcuguccaugccccaggugaacaucgugaagaagaccgaggugcagaccggcggcuucuccaaggaguccauccugcccaagcggaacuccgacaagcugaucgcccggaagaaggacugggaccccaagaaguacggcggcuucgacucccccaccguggccuacuccgugcuggugguggccaagguggagaagggcaaguccaagaagcugaaguccgugaaggagcugcugggcaucaccaucauggagcgguccuccuucgagaagaaccccaucgacuuccuggaggccaagggcuacaaggaggugaagaaggaccugaucaucaagcugcccaaguacucccuguucgagcuggagaacggccggaagcggaugcuggccuccgccggcgagcugcagaagggcaacgagcuggcccugcccuccaaguacgugaacuuccuguaccuggccucccacuacgagaagcugaagggcucccccgaggacaacgagcagaagcagcuguucguggagcagcacaagcacuaccuggacgagaucaucgagcagaucuccgaguucuccaagcgggugauccuggccgacgccaaccuggacaaggugcuguccgccuacaacaagcaccgggacaagcccauccgggagcaggccgagaacaucauccaccuguucacccugaccaaccugggcgcccccgccgccuucaaguacuucgacaccaccaucgaccggaagcgguacaccuccaccaaggaggugcuggacgccacccugauccaccaguccaucaccggccuguacgagacccggaucgaccugucccagcugggcggcgacggcggcggcucccccaagaagaagcggaagguguccgaguccgccacccccgaguccguguccggcuggcggcuguucaagaagaucuccUgA |
| 編碼Spy Cas9之ORF | 806 | ATGgaggccTcccccgccTccggcccccggcaccTgaTggacccccacaTcTTcaccTccAACTTCAACAACggcATCggccggCACAAGaccTACCTGTGCTACgaggTggagcggCTGGACAACggcaccTccgTgAAGATGGACCAGCACcggggcTTCCTGCACAACCAGgccAAGAACCTGCTGTGCggcTTCTACggccggCACgccgagCTGcggTTCCTGGACCTGgTgcccTccCTGCAGCTGGACcccgccCAGATCTACcgggTgaccTGGTTCATCTccTGGTcccccTGCTTCTccTGGggcTGCgccggcgaggTgcgggccTTCCTGCAGgagAACaccCACgTgcggCTGcggATCTTCgccgcccggATCTACGACTACGACcccCTGTACAAGgaggccCTGCAGATGCTGcggGACgccggcgccCAGgTgTccATCATGaccTACGACgagTTCAAGCACTGCTGGGACaccTTCgTgGACCACCAGggcTGCcccTTCCAGcccTGGGACggcCTGGACgagCACTccCAGgccCTGTccggccggCTGcgggccATCCTGCAGAACCAGggcAACTccggcTccgagacccccggcaccTccgagTccgccacccccgagTccgacaagaagTacTccaTcggccTggCcaTcggcaccaacTccgTgggcTgggccgTgaTcaccgacgagTacaaggTgcccTccaagaagTTcaaggTgcTgggcaacaccgaccggcacTccaTcaagaagaaccTgaTcggcgcccTgcTgTTcgacTccggcgagaccgccgaggccacccggcTgaagcggaccgcccggcggcggTacacccggcggaagaaccggaTcTgcTaccTgcaggagaTcTTcTccaacgagaTggccaaggTggacgacTccTTcTTccaccggcTggaggagTccTTccTggTggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccaTcTTcggcaacaTcgTggacgaggTggccTaccacgagaagTaccccaccaTcTaccaccTgcggaagaagcTggTggacTccaccgacaaggccgaccTgcggcTgaTcTaccTggcccTggcccacaTgaTcaagTTccggggccacTTccTgaTcgagggcgaccTgaaccccgacaacTccgacgTggacaagcTgTTcaTccagcTggTgcagaccTacaaccagcTgTTcgaggagaaccccaTcaacgccTccggcgTggacgccaaggccaTccTgTccgcccggcTgTccaagTcccggcggcTggagaaccTgaTcgcccagcTgcccggcgagaagaagaacggccTgTTcggcaaccTgaTcgcccTgTcccTgggccTgacccccaacTTcaagTccaacTTcgaccTggccgaggacgccaagcTgcagcTgTccaaggacaccTacgacgacgaccTggacaaccTgcTggcccagaTcggcgaccagTacgccgaccTgTTccTggccgccaagaaccTgTccgacgccaTccTgcTgTccgacaTccTgcgggTgaacaccgagaTcaccaaggccccccTgTccgccTccaTgaTcaagcggTacgacgagcaccaccaggaccTgacccTgcTgaaggcccTggTgcggcagcagcTgcccgagaagTacaaggagaTcTTcTTcgaccagTccaagaacggcTacgccggcTacaTcgacggcggcgccTcccaggaggagTTcTacaagTTcaTcaagcccaTccTggagaagaTggacggcaccgaggagcTgcTggTgaagcTgaaccgggaggaccTgcTgcggaagcagcggaccTTcgacaacggcTccaTcccccaccagaTccaccTgggcgagcTgcacgccaTccTgcggcggcaggaggacTTcTaccccTTccTgaaggacaaccgggagaagaTcgagaagaTccTgaccTTccggaTccccTacTacgTgggcccccTggcccggggcaacTcccggTTcgccTggaTgacccggaagTccgaggagaccaTcacccccTggaacTTcgaggaggTggTggacaagggcgccTccgcccagTccTTcaTcgagcggaTgaccaacTTcgacaagaaccTgcccaacgagaaggTgcTgcccaagcacTcccTgcTgTacgagTacTTcaccgTgTacaacgagcTgaccaaggTgaagTacgTgaccgagggcaTgcggaagcccgccTTccTgTccggcgagcagaagaaggccaTcgTggaccTgcTgTTcaagaccaaccggaaggTgaccgTgaagcagcTgaaggaggacTacTTcaagaagaTcgagTgcTTcgacTccgTggagaTcTccggcgTggaggaccggTTcaacgccTcccTgggcaccTaccacgaccTgcTgaagaTcaTcaaggacaaggacTTccTggacaacgaggagaacgaggacaTccTggaggacaTcgTgcTgacccTgacccTgTTcgaggaccgggagaTgaTcgaggagcggcTgaagaccTacgcccaccTgTTcgacgacaaggTgaTgaagcagcTgaagcggcggcggTacaccggcTggggccggcTgTcccggaagcTgaTcaacggcaTccgggacaagcagTccggcaagaccaTccTggacTTccTgaagTccgacggcTTcgccaaccggaacTTcaTgcagcTgaTccacgacgacTcccTgaccTTcaaggaggacaTccagaaggcccaggTgTccggccagggcgacTcccTgcacgagcacaTcgccaaccTggccggcTcccccgccaTcaagaagggcaTccTgcagaccgTgaaggTggTggacgagcTggTgaaggTgaTgggccggcacaagcccgagaacaTcgTgaTcgagaTggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacTcccgggagcggaTgaagcggaTcgaggagggcaTcaaggagcTgggcTcccagaTccTgaaggagcaccccgTggagaacacccagcTgcagaacgagaagcTgTaccTgTacTaccTgcagaacggccgggacaTgTacgTggaccaggagcTggacaTcaaccggcTgTccgacTacgacgTggaccacaTcgTgccccagTccTTccTgaaggacgacTccaTcgacaacaaggTgcTgacccggTccgacaagaaccggggcaagTccgacaacgTgcccTccgaggaggTggTgaagaagaTgaagaacTacTggcggcagcTgcTgaacgccaagcTgaTcacccagcggaagTTcgacaaccTgaccaaggccgagcggggcggccTgTccgagcTggacaaggccggcTTcaTcaagcggcagcTggTggagacccggcagaTcaccaagcacgTggcccagaTccTggacTcccggaTgaacaccaagTacgacgagaacgacaagcTgaTccgggaggTgaaggTgaTcacccTgaagTccaagcTggTgTccgacTTccggaaggacTTccagTTcTacaaggTgcgggagaTcaacaacTaccaccacgcccacgacgccTaccTgaacgccgTggTgggcaccgcccTgaTcaagaagTaccccaagcTggagTccgagTTcgTgTacggcgacTacaaggTgTacgacgTgcggaagaTgaTcgccaagTccgagcaggagaTcggcaaggccaccgccaagTacTTcTTcTacTccaacaTcaTgaacTTcTTcaagaccgagaTcacccTggccaacggcgagaTccggaagcggccccTgaTcgagaccaacggcgagaccggcgagaTcgTgTgggacaagggccgggacTTcgccaccgTgcggaaggTgcTgTccaTgccccaggTgaacaTcgTgaagaagaccgaggTgcagaccggcggcTTcTccaaggagTccaTccTgcccaagcggaacTccgacaagcTgaTcgcccggaagaaggacTgggaccccaagaagTacggcggcTTcgacTcccccaccgTggccTacTccgTgcTggTggTggccaaggTggagaagggcaagTccaagaagcTgaagTccgTgaaggagcTgcTgggcaTcaccaTcaTggagcggTccTccTTcgagaagaaccccaTcgacTTccTggaggccaagggcTacaaggaggTgaagaaggaccTgaTcaTcaagcTgcccaagTacTcccTgTTcgagcTggagaacggccggaagcggaTgcTggccTccgccggcgagcTgcagaagggcaacgagcTggcccTgcccTccaagTacgTgaacTTccTgTaccTggccTcccacTacgagaagcTgaagggcTcccccgaggacaacgagcagaagcagcTgTTcgTggagcagcacaagcacTaccTggacgagaTcaTcgagcagaTcTccgagTTcTccaagcgggTgaTccTggccgacgccaaccTggacaaggTgcTgTccgccTacaacaagcaccgggacaagcccaTccgggagcaggccgagaacaTcaTccaccTgTTcacccTgaccaaccTgggcgcccccgccgccTTcaagTacTTcgacaccaccaTcgaccggaagcggTacaccTccaccaaggaggTgcTggacgccacccTgaTccaccagTccaTcaccggccTgTacgagacccggaTcgaccTgTcccagcTgggcggcgacggcggcggcTcccccaagaagaagcggaaggTgTgA |
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| UGI之開放閱讀框 | 808 | AUGACCAACCUGUCCGACAUCAUCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCUGGUGAUCCAGGAGUCCAUCCUGAUGCUGCCCGAGGAGGUGGAGGAGGUGAUCGGCAACAAGCCCGAGUCCGACAUCCUGGUGCACACCGCCUACGACGAGUCCACCGACGAGAACGUGAUGCUGCUGACCUCCGACGCCCCCGAGUACAAGCCCUGGGCCCUGGUGAUCCAGGACUCCAACGGCGAGAACAAGAUCAAGAUGCUGUCCGGCGGCUCCAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUGA |
| SEQ ID No. 801-802編碼之Cas9之胺基酸序列 | 809 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV |
| 具有Hibit標籤之Cas9之胺基酸序列 | 810 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKVSESATPESVSGWRLFKKIS |
| BC22n之胺基酸序列 | 811 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV* |
| 具有Hibit標籤之BC22n之胺基酸序列 | 812 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKVSESATPESVSGWRLFKKIS |
| 813 | 未使用 | |
| UGI之胺基酸序列 | 814 | MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE |
| 815-816 | 未使用 | |
| Cas9之開放閱讀框 | 817 | AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUG GUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG |
| BC22之開放閱讀框 | 818 | AUGGAAGCAAGCCCGGCAAGCGGACCGAGACACCUGAUGGACCCGCACAUCUUCACAAGCAACUUCAACAACGGAAUCGGAAGACACAAGACAUACCUGUGCUACGAAGUCGAAAGACUGGACAACGGAACAAGCGUCAAGAUGGACCAGCACAGAGGAUUCCUGCACAACCAGGCAAAGAACCUGCUGUGCGGAUUCUACGGAAGACACGCAGAACUGAGAUUCCUGGACCUGGUCCCGAGCCUGCAGCUGGACCCGGCACAGAUCUACAGAGUCACAUGGUUCAUCAGCUGGAGCCCGUGCUUCAGCUGGGGAUGCGCAGGAGAAGUCAGAGCAUUUCUGCAGGAAAACACACACGUCAGACUGAGAAUCUUCGCAGCAAGAAUCUAC GACUACGACCCGCUGUACAAGGAAGCACUGCAGAUGCUGAGAGACGCAGGAGCACAGGUCAGCAUCAUGACAUACGACGAAUUCAAGCACUGCUGGGACACAUUCGUCGACCACCAGGGAUGCCCGUUCCAGCCGUGGGACGGACUGGACGAACACAGCCAGGCACUGAGCGGAAGACUGAGAGCAAUCCUGCAGAACCAGGGAAACAGCGGAAGCGAAACACCGGGAACAAGCGAAAGCGCAACACCGGAAAGCGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCCAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUC GACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGAUCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACAGCGGAGGAAGCACAAACCUGAGCGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAAGCAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAAGCGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAAGCACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAAGCGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACAGCAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGAGCGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAA |
| UGI之開放閱讀框 | 819 | AUGGGACCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAGGAGGAAGCACAAACCUGUCGGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAUCGAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAUCGGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAUCGACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAUCGGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACUCGAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGUGA |
| 編碼UGI之mRNA | 821 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCAACCUGUCCGACAUCAUCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCUGGUGAUCCAGGAGUCCAUCCUGAUGCUGCCCGAGGAGGUGGAGGAGGUGAUCGGCAACAAGCCCGAGUCCGACAUCCUGGUGCACACCGCCUACGACGAGUCCACCGACGAGAACGUGAUGCUGCUGACCUCCGACGCCCCCGAGUACAAGCCCUGGGCCCUGGUGAUCCAGGACUCCAACGGCGAGAACAAGAUCAAGAUGCUGUCCGGCGGCUCCAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUGAUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
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| Nme1Cas9之開放閱讀框 | 823 | ATGGCAGCATTCAAGCCGAACTCGATCAACTACATCCTGGGACTGGACATCGGAATCGCATCGGTCGGATGGGCAATGGTCGAAATCGACGAAGAAGAAAACCCGATCAGACTGATCGACCTGGGAGTCAGAGTCTTCGAAAGAGCAGAAGTCCCGAAGACAGGAGACTCGCTGGCAATGGCAAGAAGACTGGCAAGATCGGTCAGAAGACTGACAAGAAGAAGAGCACACAGACTGCTGAGAACAAGAAGACTGCTGAAGAGAGAAGGAGTCCTGCAGGCAGCAAACTTCGACGAAAACGGACTGATCAAGTCGCTGCCGAACACACCGTGGCAGCTGAGAGCAGCAGCACTGGACAGAAAGCTGACACCGCTGGAATGGTCGGCAGTCCTGCTGCACCTGATCAAGCACAGAGGATACCTGTCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACAAGGAACTGGGAGCACTGCTGAAGGGAGTCGCAGGAAACGCACACGCACTGCAGACAGGAGACTTCAGAACACCGGCAGAACTGGCACTGAACAAGTTCGAAAAGGAATCGGGACACATCAGAAACCAGAGATCGGACTACTCGCACACATTCTCGAGAAAGGACCTGCAGGCAGAACTGATCCTGCTGTTCGAAAAGCAGAAGGAATTCGGAAACCCGCACGTCTCGGGAGGACTGAAGGAAGGAATCGAAACACTGCTGATGACACAGAGACCGGCACTGTCGGGAGACGCAGTCCAGAAGATGCTGGGACACTGCACATTCGAACCGGCAGAACCGAAGGCAGCAAAGAACACATACACAGCAGAAAGATTCATCTGGCTGACAAAGCTGAACAACCTGAGAATCCTGGAACAGGGATCGGAAAGACCGCTGACAGACACAGAAAGAGCAACACTGATGGACGAACCGTACAGAAAGTCGAAGCTGACATACGCACAGGCAAGAAAGCTGCTGGGACTGGAAGACACAGCATTCTTCAAGGGACTGAGATACGGAAAGGACAACGCAGAAGCATCGACACTGATGGAAATGAAGGCATACCACGCAATCTCGAGAGCACTGGAAAAGGAAGGACTGAAGGACAAGAAGTCGCCGCTGAACCTGTCGCCGGAACTGCAGGACGAAATCGGAACAGCATTCTCGCTGTTCAAGACAGACGAAGACATCACAGGAAGACTGAAGGACAGAATCCAGCCGGAAATCCTGGAAGCACTGCTGAAGCACATCTCGTTCGACAAGTTCGTCCAGATCTCGCTGAAGGCACTGAGAAGAATCGTCCCGCTGATGGAACAGGGAAAGAGATACGACGAAGCATGCGCAGAAATCTACGGAGACCACTACGGAAAGAAGAACACAGAAGAAAAGATCTACCTGCCGCCGATCCCGGCAGACGAAATCAGAAACCCGGTCGTCCTGAGAGCACTGTCGCAGGCAAGAAAGGTCATCAACGGAGTCGTCAGAAGATACGGATCGCCGGCAAGAATCCACATCGAAACAGCAAGAGAAGTCGGAAAGTCGTTCAAGGACAGAAAGGAAATCGAAAAGAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCAGCAGCAAAGTTCAGAGAATACTTCCCGAACTTCGTCGGAGAACCGAAGTCGAAGGACATCCTGAAGCTGAGACTGTACGAACAGCAGCACGGAAAGTGCCTGTACTCGGGAAAGGAAATCAACCTGGGAAGACTGAACGAAAAGGGATACGTCGAAATCGACCACGCACTGCCGTTCTCGAGAACATGGGACGACTCGTTCAACAACAAGGTCCTGGTCCTGGGATCGGAAAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGTACGAATACTTCAACGGAAAGGACAACTCGAGAGAATGGCAGGAATTCAAGGCAAGAGTCGAAACATCGAGATTCCCGAGATCGAAGAAGCAGAGAATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAAGACGGATTCAAGGAAAGAAACCTGAACGACACAAGATACGTCAACAGATTCCTGTGCCAGTTCGTCGCAGACAGAATGAGACTGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGTCTTCGCATCGAACGGACAGATCACAAACCTGCTGAGAGGATTCTGGGGACTGAGAAAGGTCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCACTGGACGCAGTCGTCGTCGCATGCTCGACAGTCGCAATGCAGCAGAAGATCACAAGATTCGTCAGATACAAGGAAATGAACGCATTCGACGGAAAGACAATCGACAAGGAAACAGGAGAAGTCCTGCACCAGAAGACACACTTCCCGCAGCCGTGGGAATTCTTCGCACAGGAAGTCATGATCAGAGTCTTCGGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAATTCGAAGAAGCAGACACACTGGAAAAGCTGAGAACACTGCTGGCAGAAAAGCTGTCGTCGAGACCGGAAGCAGTCCACGAATACGTCACACCGCTGTTCGTCTCGAGAGCACCGAACAGAAAGATGTCGGGACAGGGACACATGGAAACAGTCAAGTCGGCAAAGAGACTGGACGAAGGAGTCTCGGTCCTGAGAGTCCCGCTGACACAGCTGAAGCTGAAGGACCTGGAAAAGATGGTCAACAGAGAAAGAGAACCGAAGCTGTACGAAGCACTGAAGGCAAGACTGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCATTCGCAGAACCGTTCTACAAGTACGACAAGGCAGGAAACAGAACACAGCAGGTCAAGGCAGTCAGAGTCGAACAGGTCCAGAAGACAGGAGTCTGGGTCAGAAACCACAACGGAATCGCAGACAACGCAACAATGGTCAGAGTAGACGTCTTCGAAAAGGGAGACAAGTACTACCTGGTCCCGATCTACTCGTGGCAGGTCGCAAAGGGAATCCTGCCGGACAGAGCAGTCGTCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACTGGCAGCTGATCGACGACTCGTTCAACTTCAAGTTCTCGCTGCACCCGAACGACCTGGTCGAAGTCATCACAAAGAAGGCAAGAATGTTCGGATACTTCGCATCGTGCCACAGAGGAACAGGAAACATCAACATCAGAATCCACGACCTGGACCACAAGATCGGAAAGAACGGAATCCTGGAAGGAATCGGAGTCAAGACAGCACTGTCGTTCCAGAAGTACCAGATCGACGAACTGGGAAAGGAAATCAGACCGTGCAGACTGAAGAAGAGACCGCCGGTCAGATCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGATCGGAATTCGAATCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCGAATGA |
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| 編碼具有Hibit標籤之Nme2 Cas9之mRNA | 826 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
| 編碼Spy Cas9之ORF | 827 | ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA |
| 編碼Spy Cas9之ORF | 828 | aagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccaccATGGACGGCTCCGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCTCCGGCGGCGGCGAGGCCTCCCCCGCCTCCGGCCCCCGGCACCTGATGGACCCCCACATCTTCACCTCCAACTTCAACAACGGCATCGGCCGGCACAAGACCTACCTGTGCTACGAGGTGGAGCGGCTGGACAACGGCACCTCCGTGAAGATGGACCAGCACCGGGGCTTCCTGCACAACCAGGCCAAGAACCTGCTGTGCGGCTTCTACGGCCGGCACGCCGAGCTGCGGTTCCTGGACCTGGTGCCCTCCCTGCAGCTGGACCCCGCCCAGATCTACCGGGTGACCTGGTTCATCTCCTGGTCCCCCTGCTTCTCCTGGGGCTGCGCCGGCGAGGTGCGGGCCTTCCTGCAGGAGAACACCCACGTGCGGCTGCGGATCTTCGCCGCCCGGATCTACGACTACGACCCCCTGTACAAGGAGGCCCTGCAGATGCTGCGGGACGCCGGCGCCCAGGTGTCCATCATGACCTACGACGAGTTCAAGCACTGCTGGGACACCTTCGTGGACCACCAGGGCTGCCCCTTCCAGCCCTGGGACGGCCTGGACGAGCACTCCCAGGCCCTGTCCGGCCGGCTGCGGGCCATCCTGCAGAACCAGGGCAACTCCGGCTCCGAGACCCCCGGCACCTCCGAGTCCGCCACCCCCGAGTCCGCAGCGTTCAAACCAAATcccatcaactacatcctgggcctggccatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtagTGActagcaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattct |
| 829-899 | 未使用 | |
| 例示性XTEN連接體序列 | 900 | SGSETPGTSESATPES |
| 例示性XTEN連接體序列 | 901 | SGSETPGTSESA |
| 例示性XTEN連接體序列 | 902 | SGSETPGTSESATPEGGSGGS |
| 例示性NLS序列 | 903 | PKKKRKV |
| 例示性NLS序列 | 904 | PKKKRRV |
| 例示性二分NLS序列 | 905 | KRPAATKKAGQAKKKK |
| 例示性XTEN | 906 | SGSETPGTSESATPES |
| 例示性XTEN | 907 | SGSETPGTSESA |
| 例示性XTEN | 908 | SGSETPGTSESATPEGGSGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 909 | GGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 910 | GGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 911 | EAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 912 | SEGSA |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 913 | SEGSAGTST |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 914 | GGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 915 | GGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 916 | EAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 917 | EAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 918 | SEGSAGTSTESEGSA |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 919 | GGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 920 | GGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 921 | GGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 922 | EAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 923 | EAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 924 | SEGSAGTSTESEGSAGTSTE |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 925 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 926 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 927 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 928 | GGGGSEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 929 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 930 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 931 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 932 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 933 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 934 | EAAAKEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 935 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 936 | EAAAKEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 937 | SEGSAGTSTESEGSAGTSTESEGSA |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 938 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 939 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 940 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 941 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 942 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 943 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 944 | GGGGSGGGGSEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 945 | GGGGSGGGGSEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 946 | GGGGSEAAAKGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 947 | GGGGSEAAAKGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 948 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 949 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 950 | GGGGSEAAAKEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 951 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 952 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 953 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 954 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 955 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 956 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 957 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGSGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 958 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 959 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 960 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 961 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 962 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 963 | EAAAKEAAAKEAAAKGGGGSEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 964 | EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGGGGS |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 965 | EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 966 | GTKDSTKDIPETPSKD |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 967 | GRDVRQPEVKEEKPES |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 968 | EGKSSGSGSESKSTAG |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 969 | TPGSPAGSPTSTEEGT |
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 970 | GSEPATSGSETPGTST |
| 編碼BC22n之mRNA | 972 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACUCCGGCUCCGAGACCCCCGGCACCUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGCCAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
| 編碼具有HiBit標籤之BC22n之mRNA | 973 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACUCCGGCUCCGAGACCCCCGGCACCUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGCCAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
| 974 | 未使用 | |
| 編碼UGI之mRNA | 975 | GGGAGACCCAAGCUGGCUAGCUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGGACCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAGGAGGAAGCACAAACCUGUCGGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAUCGAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAUCGGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAUCGACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAUCGGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACUCGAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGUGAUAGUCUAGACAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGUCUAG |
| NLS-NLS-APOBEC3A-L070-Nme2D16A之例示性胺基酸序列 | 976 | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNGTKDSTKDIPETPSKDAAFKPNPINYILGLAIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
| BE3之胺基酸序列 | 977 | MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV |
| BE3之胺基酸序列 | 978 | MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV |
| 具有2× UGI之BC22之胺基酸序列 | 979 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFEPKKKRKV |
| BE4MAX蛋白之胺基酸序列 | 980 | MKRTADGSEFESPKKKRKVSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFEPKKKRKV** |
| CD30構築物(DNA) | 981 | ATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAGCCGGATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACACCATCCACTGGGTGCGGCGGCGGCCCGGCCACGACCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTGCAGCGACTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGACCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAACACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGCGGGCCGACTACGGCAACTACGAGTACACCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGTGATCGAGCTGACCCAGAGCCCCAAGTTCATGAGCACCAGCGTGGGCGACCGGGTGAACGTGACCTACAAGGCCAGCCAGAACGTGGGCACCAACGTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGGTGCTGATCTACAGCGCCAGCTACCGGTACAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGAGTACTTCTGCCAGCAGTACCACACCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGGAGCGACCCCGCCACCACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACAAGGACCCCAAGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGAGCCTGCGGGTGAAGTTCAGCCGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGGTAA |
| CD30構築物(胺基酸) | 982 | MDFQVQIFSFLLISASVIMSRMAQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRRRPGHDLEWIGYINPSSGCSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSVIELTQSPKFMSTSVGDRVNVTYKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIKRSDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* |
| CD30構築物信號肽(DNA) | 983 | ATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAGCCGGATGGCC |
| CD30構築物信號肽(胺基酸) | 984 | MDFQVQIFSFLLISASVIMSRMA |
| CD30構築物HRS3結合物(DNA) | 985 | CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACACCATCCACTGGGTGCGGCGGCGGCCCGGCCACGACCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTGCAGCGACTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGACCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAACACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGCGGGCCGACTACGGCAACTACGAGTACACCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGTGATCGAGCTGACCCAGAGCCCCAAGTTCATGAGCACCAGCGTGGGCGACCGGGTGAACGTGACCTACAAGGCCAGCCAGAACGTGGGCACCAACGTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGGTGCTGATCTACAGCGCCAGCTACCGGTACAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGAGTACTTCTGCCAGCAGTACCACACCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG |
| CD30構築物HRS3結合物(胺基酸) | 986 | QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRRRPGHDLEWIGYINPSSGCSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSVIELTQSPKFMSTSVGDRVNVTYKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIKR |
| CD30構築物CD8鉸鏈(DNA) | 987 | ACCACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC |
| CD30構築物CD8鉸鏈(胺基酸) | 988 | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD |
| CD30構築物CD28 TM (DNA) | 989 | TTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGAGC |
| CD30構築物CD28 TM (胺基酸) | 990 | FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS |
| CD30構築物CD3ζ (DNA) | 991 | CTGCGGGTGAAGTTCAGCCGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGG |
| CD30構築物CD3ζ (胺基酸) | 992 | LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
| B2M (G000529) | 993 | mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G021469 TRAC | 994 | mA*mU*mA*mUmCCAmGmAAmCCmCUGACmCCUGmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| G021475 TRAC | 995 | |
| mA*mA*mC*mCmCUGmAmUCmCUmCUUGUmCCCAmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | ||
| G021481 TRAC | 996 | |
| mG*mC*mC*mGmUGUmAmCCmAGmCUGAGmAGACmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | ||
| G028013 B2M | 997 | mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G018995 HLA-A | 998 | |
| mA*mC*mA*GCGACGCCGCGAGCCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | ||
| G012086 TRAC | 999 | |
| mA*mG*mA*GUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | ||
| 指導物支架 | 3002 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU |
| 指導物支架 | 3003 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU |
| 3004 | 未使用 | |
| 編碼UGI之mRNA序列 | 3005 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCAACCUGUCCGACAUCAUCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCUGGUGAUCCAGGAGUCCAUCCUGAUGCUGCCCGAGGAGGUGGAGGAGGUGAUCGGCAACAAGCCCGAGUCCGACAUCCUGGUGCACACCGCCUACGACGAGUCCACCGACGAGAACGUGAUGCUGCUGACCUCCGACGCCCCCGAGUACAAGCCCUGGGCCCUGGUGAUCCAGGACUCCAACGGCGAGAACAAGAUCAAGAUGCUGUCCGGCGGCUCCAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUGAUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
| 指導物支架90聚物 | 3006 | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC |
| 具有修飾之指導物支架90聚物 | 3007 | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 具有修飾之指導物支架90聚物 | 3008 | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC |
| 具有修飾之指導物支架88聚物 | 3009 | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 指導物支架88聚物 | 3010 | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC |
| 具有修飾之指導物支架88聚物 | 3011 | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 具有修飾之指導物支架88聚物 | 3012 | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC |
| 指導物支架 | 3013 | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 指導物支架 | 3014 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 3015-3018 | 未使用 | |
| G025420 TRAC | 3019 | mC*mU*mC*UCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| B2M (G000529)(完整，未經修飾) | 3100 | GGCCACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| G021469 TRAC (完整，未經修飾) | 3101 | AUAUCCAGAACCCUGACCCUGCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
| G021475 TRAC (完整，未經修飾) | 3102 | AACCCUGAUCCUCUUGUCCCACAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
| G021481 TRAC (完整，未經修飾) | 3103 | GCCGUGUACCAGCUGAGAGACUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
| G028013 B2M (完整，未經修飾) | 3104 | GGCCACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| G018995 HLA-A (完整，未經修飾) | 3105 | ACAGCGACGCCGCGAGCCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| G012086 TRAC (完整，未經修飾) | 3106 | AGAGUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| G000644 EMX1靶序列 | 3107 | GAGUCCGAGCAGAAGAAGAA |
| G000645 VEGFA靶序列 | 3108 | GACCCCCUCCACCCCGCCUC |
| G000646 RAG1B靶序列 | 3109 | GACUUGUUUUCAUUGUUCUC |
| G013675 CIITA靶序列 | 3110 | CCCCCGGACGGUUCAAGCAA |
| G013675 CIITA sgRNA | 3118 | mC*mC*mC*CCGGACGGUUCAAGCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 指導物ID | 靶 | 指導序列 | 例示性指導RNA全序列 | 例示性指導RNA修飾之序列 | 基因體坐標(hg38) |
| G034202 | HLA-A | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCU (SEQ ID NO: 576) | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1576) | mG*mC*mU*mCmUAUmCmCAmCGmGCGCCmCGCGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3111) | chr6:29942891-29942915 |
| G034617 | HLA-A | CACUCACCCGCCCAGGUCUGGGUC (SEQ ID NO: 571) | CACUCACCCGCCCAGGUCUGGGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1571) | mC*mA*mC*mUmCACmCmCGmCCmCAGGUmCUGGmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3112) | chr6:29942609-29942633 |
| G028943 | TRAC | AAAACCUGUCAGUGAUUGGGUUCC (SEQ ID NO: 605) | AAAACCUGUCAGUGAUUGGGUUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1605) | mA*mA*mA*mAmCCUmGmUCmAGmUGAUUmGGGUmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2605) | chr14:22550574-22550598 |
| G034982 | TRAC | AAAACCUGUCAGUGAUUGGGUUCC (SEQ ID NO: 605) | AAAACCUGUCAGUGAUUGGGUUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1605) | mA*mA*mA*mAmCCUmGmUCmAGmUGAUUmGGGUmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3113) | chr14:22550574-22550598 |
| G028939 | TRAC | UUAGGUUCGUAUCUGUAAAACCAA (SEQ ID NO: 606) | UUAGGUUCGUAUCUGUAAAACCAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1606) | mU*mU*mA*mGmGUUmCmGUmAUmCUGUAmAAACmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2606) | chr14:22550544-22550568 |
| G034981 | TRAC | UUAGGUUCGUAUCUGUAAAACCAA (SEQ ID NO: 606) | UUAGGUUCGUAUCUGUAAAACCAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1606) | mU*mU*mA*mGmGUUmCmGUmAUmCUGUAmAAACmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3114) | chr14:22550544-22550568 |
| G013006 | TRAC | CUCUCAGCUGGUACACGGCA (SEQ ID NO: 613) | CUCUCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 1613) | mC*mU*mC*UCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 2613) | chr14:22547524-22547544 |
| G028986 | TRBC1 | GUGUCCUACCAGCAAGGGGUCCUG (SEQ ID NO: 607) | GUGUCCUACCAGCAAGGGGUCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1607) | mG*mU*mG*mUmCCUmAmCCmAGmCAAGGmGGUCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2607) | chr7:142792690-142792714 |
| G034618 | TRBC1 | GUGUCCUACCAGCAAGGGGUCCUG (SEQ ID NO: 607) | GUGUCCUACCAGCAAGGGGUCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1607) | mG*mU*mG*mUmCCUmAmCCmAGmCAAGGmGGUCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3115) | chr7:142792690-142792714 |
| G026584 | CIITA | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCA (SEQ ID NO: 608) | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1608) | mU*mC*mA*mAmAGUmAmCCmCUmACAGGmAGGAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2608) | chr16:10907504-10907528 |
| G034201 | CIITA | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCA (SEQ ID NO: 608) | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1608) | mU*mC*mA*mAmAGUmAmCCmCUmACAGGmAGGAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3116) | chr16:10907504-10907528 |
| G029131 | CIITA | AGCUGCCGUUCUGCCCAGUCCGGG (SEQ ID NO: 609) | AGCUGCCGUUCUGCCCAGUCCGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1609) | mA*mG*mC*mUmGCCmGmUUmCUmGCCCAmGUCCmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2609) | chr16:10906643-10906667 |
| G034619 | CIITA | AGCUGCCGUUCUGCCCAGUCCGGG (SEQ ID NO: 609) | AGCUGCCGUUCUGCCCAGUCCGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1609) | mA*mG*mC*mUmGCCmGmUUmCUmGCCCAmGUCCmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3117) | chr16:10906643-10906667 |
| G021557 | VEGFA | GCAUGGGCAGGGGCUGGGGUGCAC (SEQ ID NO: 610) | GCAUGGGCAGGGGCUGGGGUGCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGG CCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1610) | mG*mC*mA*mUmGGGmCmAGmGGmGCUGGmGGUGmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2610) | chr6:43774288-43774312 |
| G021558 | VEGFA | GAAUGGCAGGCGGAGGUUGUACUG (SEQ ID NO: 611) | GAAUGGCAGGCGGAGGUUGUACUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1611) | mG*mA*mA*mUmGGCmAmGGmCGmGAGGUmUGUAmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2611) | chr6:43780852-43780876 |
| G021567 | VEGFA | GUGAGCAGGCACCUGUGCCAACAU (SEQ ID NO: 612) | GUGAGCAGGCACCUGUGCCAACAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 1612) | mG*mU*mG*mAmGCAmGmGCmACmCUGUGmCCAAmCAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2612) | chr6:43781113-43781137 |
提供以下實例以說明某些揭示實施例，不應解釋為以任何方式限制本揭露之範疇。
實例 1. 一般方法 1.1. T細胞培養基製備
此處闡述下文所用之T細胞培養基組成物。「TCAM培養基」包含含有2.5% (v/v)之人類AB血清、1% (v/v) Glutamax、1% (v/v) 10 1M HEPES緩衝液及1%青黴素(Penicillin)-鏈霉素(Streptomycin)之CTS OpTimizer T細胞擴增SFM。除上文所提及之組分外，培養基補充有100 U/mL之重組人類介白素-2、5 ng/mL之人類介白素-7及5 ng/mL之人類介白素-15。
1.2.脂質奈米粒子
之製備
將脂質組分以不同莫耳比溶解於100%乙醇中。將RNA貨物(例如，Cas9 mRNA及sgRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽緩衝液、100 mM NaCl (pH 5.0)中，產生大約0.45 mg/mL之RNA貨物濃度。
脂質核酸組裝體含有可離子化脂質A (十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3- (二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯)，以莫耳濃度計，脂質奈米粒子使用35%脂質A、47.5%膽固醇、15% DSPC及2.5% PEG2k-DMG。用約6之脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及以重量計1:2之gRNA對mRNA比率來調配脂質核酸組裝體。
脂質奈米粒子(LNP組成物)係使用橫流技術利用乙醇中之脂質與兩體積RNA溶液及一體積水之衝擊噴流混合來製備。乙醇中之脂質經由混合四通與兩體積之RNA溶液混合。第四股水流藉助直插式三通與四通之出口流混合(參見WO2016010840之圖2)。將LNP組成物在室溫(RT)下保持1小時，且進一步用水(大約1:1 v/v)稀釋。在平板柱(Sartorius, 100 kD MWCO)上使用切向流過濾濃縮LNP組成物且使用PD-10脫鹽管柱(GE)將緩衝液交換為50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)。替代地，視情況地使用100 kDa Amicon旋轉過濾器濃縮LNP且使用PD-10脫鹽管柱(GE)緩衝液交換至TSS中。然後使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。將最終LNP儲存在4℃或-80℃下直至進一步使用。
1.3. mRNA之活體外轉錄(「IVT」)
使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶藉由活體外轉錄產生含有N1-甲基假-U之加帽及多腺苷酸化mRNA。藉由使用以下條件與XbaI一起在37℃下培育2小時來線性化含有T7啟動子、轉錄序列及多腺苷酸化序列之質體DNA：200 ng/μL質體、2 U/μL XbaI (NEB)及1×反應緩衝液。藉由將反應物在65℃下加熱20 min使XbaI不活化。自酶及緩衝液鹽純化線性化質體。藉由將50 ng/μL線性化質體；各2-5 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)；10-25 mM ARCA (Trilink)；5 U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/μL鼠類RNase抑制劑(NEB)；0.004 U/μL無機大腸桿菌(E. coli)焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液在37℃下培育1.5-4小時來實施IVT反應以產生經修飾之mRNA。將TURBO DNase (ThermoFisher)添加至0.01 U/μL之最終濃度，且將反應物再培育30分鐘以移除DNA模板。根據製造商之方案，使用MegaClear轉錄清理套組(ThermoFisher)或RNeasy Maxi套組(Qiagen)純化mRNA。替代地，經由沈澱方案純化mRNA，在一些情形下，其後係基於HPLC之純化。簡言之，在DNase消化後，使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱純化mRNA。對於HPLC純化之mRNA，在LiCl沈澱及重建後，藉由RP-IP HPLC純化mRNA (參見，例如Kariko等人，Nucleic Acids Research, 2011, 第39卷, 第21期 e142)。將經選擇用於彙集之級分合併且如上文所述藉由乙酸鈉/乙醇沈澱脫鹽。在替代方法中，用LiCl沈澱方法純化mRNA，然後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測260 nm處之吸光度(Nanodrop)來確定RNA濃度，且藉由毛細管電泳藉由生物分析儀(Agilent)分析轉錄物。
自質體DNA產生釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA，該質體DNA編碼具有SEQ ID NO: 801-803及806中之一者之核酸序列(參見表9中之序列)的開放閱讀框。當下文針對RNA提及SEQ ID NO: 801-803及806時應理解，Ts應用Us (其係如上文所述之N1-甲基假尿苷)替代。實例中所用之信使RNA包括5’帽及3’多腺苷酸化區域，例如高達100個核苷酸，且具有
表 9中之SEQ ID NO: 801-803及806中之一者之核酸序列。
實例 2 ：用 Spy Cas9 篩選 HLA-B 指導 RNA
藉由評價HLA-B表面蛋白之損失，篩選經設計用於破壞HLA-B基因之100-nt經修飾sgRNA格式中之48個sgRNA在T細胞中之功效。供體具有B*07:02及B*07:02之HLA-B表型。在
HLA-B基因座處藉由電穿孔用Cas9核糖核蛋白(RNP)及每一測試指導物編輯後，藉由流式細胞術測定HLA-B7陰性細胞之百分比。
2.1. T細胞之RNP電穿孔
使用Cas9核糖核蛋白(RNP)之電穿孔評價Cas9編輯活性。解凍後，將Pan CD3+ T細胞(StemCell, HLA- B*07:02 / B*07:02)以0.5 × 10^6個細胞/mL之密度平鋪於T細胞RPMI培養基中，該等培養基由含有5% (v/v)之胎牛血清、1× Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)、50 µM 2-巰基乙醇、100 µM非必需胺基酸(Invitrogen，目錄號11140-050)、1 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈霉素及100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)之RPMI 1640 (Invitrogen，目錄號22400-089)構成。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。將細胞在T細胞RPMI培養基中擴增72小時，然後進行RNP轉染。
將HLA-B靶向sgRNA及對照B2M以及HLA-A靶向sgRNA自其儲存板移除且在95℃下變性2分鐘，然後在室溫下冷卻10分鐘。製備20 µM sgRNA及10 µM Cas9-NLS蛋白(SEQ ID NO: 800)之RNP混合物且在25℃下培育10分鐘。將5 µL RNP混合物與100,000個細胞合併於20 µL P3電穿孔緩衝液(Lonza)中。將22 µL RNP/細胞混合物轉移至Lonza shuttle 96孔電穿孔板之相應孔。使用製造商之脈波碼以一式兩份對細胞進行電穿孔。在電穿孔後立即將T細胞RPMI培養基添加至細胞中。
2.2. 流式細胞術
在編輯後第7天，藉由流式細胞術對T細胞進行表型分析以確定HLA-B基因座處編輯後之HLA-B蛋白表現。簡言之，在靶向對應於細胞供體基因型(HLA- B*07:02/B*07:02)之HLA-B7、B27 (Miltenyi，純系REA176, 130-120-234)表面蛋白之抗體中培育T細胞。隨後將細胞洗滌，在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo軟體包分析。基於大小、形狀、活力及HLA-B7表現對T細胞閘控。
表 10及
圖 1顯示在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B7陰性細胞之平均百分比。
表10 - 在HLA-B基因座處編輯後，T細胞HLA-B7陰性之平均百分比
實例3：NK細胞功能殺傷分析
| 指導物ID | 平均B7-% | SD B7-% |
| G022020 | 90.55 | 1.767767 |
| G022010 | 74.55 | 0.212132 |
| G022046 | 73.95 | 5.868986 |
| G022043 | 71.65 | 0.777817 |
| G022019 | 60.8 | 2.262742 |
| G022053 | 57.25 | 1.626346 |
| G022011 | 56.4 | 1.131371 |
| G022055 | 52.8 | 0.141421 |
| G022031 | 47.85 | 0.494975 |
| G022027 | 44.55 | 1.06066 |
| G022008 | 39.55 | 3.323402 |
| G022022 | 31.1 | 0.424264 |
| G022015 | 28.65 | 0.919239 |
| G022032 | 23.8 | 7.353911 |
| G022044 | 20.7 | 0.848528 |
| G022039 | 20.65 | 2.899138 |
| G022041 | 17.9 | 1.697056 |
| G022033 | 15.05 | 4.596194 |
| G022017 | 14.8 | 0.848528 |
| G022025 | 13.45 | 1.484924 |
| G022028 | 8.575 | 0.360624 |
| G022050 | 7.73 | 0.028284 |
| G022049 | 7.01 | 0.876812 |
| G022014 | 6.5 | 0.042426 |
| G022030 | 6.37 | 0.579828 |
| G022054 | 6.25 | 0.183848 |
| G022051 | 6.225 | 0.586899 |
| G022018 | 5.83 | 1.06066 |
| G022012 | 5.495 | 0.26163 |
| G022047 | 5.465 | 0.318198 |
| G022048 | 5.44 | 0.028284 |
| G022024 | 4.35 | 1.046518 |
| G022042 | 3.255 | 0.855599 |
| G022034 | 3.07 | 1.499066 |
| G022036 | 2.595 | 0.205061 |
| G022029 | 2.4 | 0.452548 |
| G022026 | 2.08 | 0.692965 |
| G022045 | 1.525 | 0.148492 |
| G022038 | 1.47 | 0.523259 |
| G022035 | 1.34 | 0.39598 |
| G022040 | 1.165 | 0.487904 |
| G022037 | 0.74 | 0.056569 |
| G022021 | 0.64 | 0.155563 |
| G022023 | 0.57 | 0.212132 |
| G022052 | 0.43 | 0.028284 |
| G022013 | 0.41 | 0.028284 |
| G022016 | 0.195 | 0.06364 |
| G022009 | 0.1845 | 0.120915 |
測試經編輯以破壞HLA-B (G022010及G022020)、HLA-A或B2M之T細胞抵抗自然殺手(NK)細胞介導之殺傷之能力。
3.1 流式細胞術
分析NK細胞介導之針對經工程改造T細胞之細胞毒性。為此，將T細胞與HLA-B/C匹配之CTV標記之NK細胞以10:1、5:1、2.5:1、1.25:1及0.625:1之效應物對靶比率(E:T)共培養21小時。用7AAD (BD Pharmingen，目錄號559925)對細胞染色，在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo軟體包分析。基於CTV陰性、大小以及形狀及活力對T細胞閘控。
表 11及
圖 2顯示在NK細胞激發後T細胞溶解之百分比。
表11 - NK細胞激發經工程改造之T細胞後之T細胞溶解百分比
實例4：HLA-B人類指導物之脫靶分析
| E:T | WT | HLA-A KO | HLA-B KO (010) | HLA-B KO (020) | B2M KO | |||||
| 平均值 | SD | 平均 | SD | 平均 | SD | 平均 | SD | 平均 | SD | |
| 基底 | 26.90 | 1.13 | 27.55 | 0.21 | 35.20 | 0.14 | 29.95 | 0.49 | 27.75 | 1.06 |
| 0.625至1 | 20.70 | 0.00 | 22.30 | 0.71 | 31.50 | 0.42 | 25.50 | 0.14 | 42.60 | 0.71 |
| 1.25至1 | 20.80 | 0.42 | 23.85 | 0.64 | 32.00 | 1.70 | 25.65 | 0.21 | 56.60 | 1.13 |
| 2.5至1 | 21.10 | 0.14 | 25.75 | 0.35 | 33.00 | 1.27 | 28.30 | 0.28 | 78.25 | 1.34 |
| 5至1 | 22.25 | 0.49 | 27.40 | 0.28 | 35.05 | 0.92 | 30.40 | 0.14 | 89.19 | 3.66 |
| 10至1 | 22.90 | 0.14 | 27.65 | 1.20 | 36.35 | 1.63 | 47.00 | 17.39 | 94.79 | 0.38 |
實施由靶向HLA-B之Cas9裂解之潛在脫靶基因體位點之篩選。(參見例如Cameron等人，
Nature Methods. 6, 600-606; 2017)。在本實驗中，使用自淋巴母細胞細胞株NA24385 (Coriell Institute)純化之基因體DNA篩選靶向人類HLA-B之2種sgRNA以及具有已知脫靶概況之靶向EMX1、VEGFA及RAG1B之三種對照指導物。用Quick CIP (NEB M0525)處理基因體DNA，然後運行SITE-Seq。在生物化學分析中，使用濃度為48 nM sgRNA及16 nM RNP之如
表 12中所顯示之sgRNA來偵測潛在脫靶位點數。該分析鑑別出所測試sgRNA之潛在脫靶位點。
表12. 脫靶分析
| gRNA ID | 靶 | 指導序列(SEQ ID NO:) | 脫靶位點計數 |
| G022010 | HLA-B | AACAAUGCCCACGAUGGGGA (SEQ ID NO: 3) | 37 |
| G022020 | HLA-B | ACAUGCCAUGUACAGCAUGA (SEQ ID NO: 13) | 24 |
| G000644 | EMX1 | GAGUCCGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 3107) | 58 |
| G000645 | VEGFA | GACCCCCUCCACCCCGCCUC (SEQ ID NO: 3108) | 793 |
| G000646 | RAG1B | GACUUGUUUUCAUUGUUCUC (SEQ ID NO: 3109) | 47 |
在已知脫靶偵測分析(例如上文所用之生物化學方法)中，通常藉由設計恢復大量潛在脫靶位點，以「撒開大網」用於可在其他情況下(例如在所關注原代細胞中)驗證之潛在位點。舉例而言，生物化學方法通常誇張潛在脫靶位點之數量，此乃因該分析利用無細胞環境之經純化之高分子量基因體DNA且依賴於所用Cas9 RNP之劑量。因此，藉由該等方法鑑別之潛在脫靶位點可使用經鑑別之潛在脫靶位點之靶向測序來驗證。
實例5：用Cas9再篩選HLA-B指導RNA
藉由評價HLA-B表面蛋白之損失，篩選經設計用於破壞HLA-B基因之100聚物或91聚物格式中之91 sgRNA在T細胞中之功效。供體具有B*07:02/B*08:01之HLA-B表型。在
HLA-B基因座處藉由HTP-LNP遞送及每一測試指導物編輯後，藉由流式細胞術測定HLA-B7陰性細胞或HLA-B8之百分比。
5.1. 使用HTP-LNP之細胞活化及轉染
在解凍後1天，將T細胞(StemCell, HLA- B*07:02 / B*08:01)以0.5 × 10^6個細胞/mL之密度平鋪於補充有以下細胞介素之TCAM培養基中：100 U/mL之IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之IL-7及5 ng/mL之IL-15。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。將每一指導物或對照指導物之HTP-LNP以2.5 ug/mL之濃度添加至96孔板中之各別孔中之細胞上。將ApoE3於TCAM中之溶液添加至所有孔中以製成ApoE3 2.5 µg/mL之最終濃度，且將板在37℃下培育。每2-3天將細胞板分開，且向每一重複板(以及原始板)補充補充有細胞介素之TCAM。
在用LNP轉染後8-11天，將板以500×g旋轉沈降5分鐘，吸出培養基，且將細胞染色用於流式細胞術讀出。
5.2. 流式細胞術
將T細胞重懸浮於100 µL FACS緩衝液之主混合物中，該FACS緩衝液含有對應於細胞供體HLA-A或HLA-B (HLA- B*07:02/B*08:01)基因型之靶向HLA-A2之抗體(Invitrogen，目錄號17-9876-43)、靶向HLA-A3之抗體(Invitrogen，目錄號12-5754-42)、靶向HLA-B7之抗體(Miltenyi，目錄號130-120-234)或靶向HLA-B8之抗體(Miltenyi，目錄號130-118-366)之1:100 v/v溶液。隨後洗滌細胞以移除任何過量未結合之抗體且在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上運行並使用FlowJo軟體包分析。基於大小、形狀、活力及HLA-B7、HLA-B8表現對T細胞閘控。
表 13 及表 14以及
圖 3A-C 及圖 3D-E顯示在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B陰性細胞之平均百分比。
表13 - 100聚物加四個91聚物中3個供體之HLA-B敲除之平均百分比
表14 - 91聚物格式中2個供體之HLA-B敲除之平均百分比
實例6：頂部HLA-B Spy裂解酶指導物之LNP劑量反應曲線
6.1 T細胞製備
| 指導物ID | 供體2 | 供體3 | 供體1 | |||
| 平均HLA-B KO% | SD HLA-B KO% | 平均HLA-B KO% | SD HLA-B KO% | 平均HLA-B KO% | SD HLA-B KO% | |
| G022008 (100聚物) | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
| G022009 (100聚物) | 0.605 | 0.262 | 1.165 | 0.177 | 1.155 | 0.078 |
| G022010 (100聚物) | 72.8 | 0.141 | 76.15 | 6.293 | 74.7 | 0.283 |
| G022011 (100聚物) | 37.5 | 0.849 | 11.44 | 3.055 | 19.1 | 2.121 |
| G022012 (100聚物) | 4.725 | 0.262 | 6.62 | 2.249 | 3.57 | 0.014 |
| G022013 (100聚物) | 0.73 | 0.156 | 2.905 | 0.629 | 0.99 | 0.382 |
| G022014 (100聚物) | 5.565 | 1.761 | 7.605 | 1.747 | 3.71 | 0.438 |
| G022015 (100聚物) | 0.345 | 0.29 | 1.84 | 1.344 | 0.66 | 0.085 |
| G022016 (100聚物) | 0.265 | 0.035 | 2.225 | 1.945 | 0.54 | 0.042 |
| G022017 (100聚物) | 5.535 | 1.379 | 10.115 | 1.817 | 2.82 | 0.099 |
| G022018 (100聚物) | 4.145 | 0.375 | 6.465 | 1.563 | 3.81 | 0.396 |
| G022019 (100聚物) | 44.4 | 1.273 | 47.1 | 3.111 | 38.2 | 1.414 |
| G022020 (100聚物) | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
| G022021 (100聚物) | 0.71 | 0.127 | 2.375 | 0.488 | 1.31 | 0.834 |
| G022022 (100聚物) | 14.35 | 1.768 | 20.55 | 4.596 | 9.715 | 0.969 |
| G022023 (100聚物) | 2.96 | 2.729 | 6.675 | 4.985 | 0.465 | 0.078 |
| G022024 (100聚物) | 3.615 | 0.163 | 7.515 | 0.955 | 3.425 | 0.742 |
| G022025 (100聚物) | 14.95 | 1.061 | 20.65 | 5.162 | 15.45 | 0.212 |
| G022026 (100聚物) | 2.965 | 0.29 | 3.31 | 0.509 | 0.775 | 0.262 |
| G022027 (100聚物) | 36.75 | 2.333 | 8.2 | 2.008 | 25.05 | 2.333 |
| G022028 (100聚物) | 8.4 | 1.344 | 14.4 | 3.394 | 7.72 | 0.396 |
| G022029 (100聚物) | 5.92 | 0.212 | 10.35 | 0.354 | 5.27 | 0.467 |
| G022030 (100聚物) | 6.795 | 1.365 | 10.095 | 1.846 | 6.33 | 0.311 |
| G022031 (100聚物) | 43.1 | 1.697 | 43.9 | 0.283 | 21.1 | 2.121 |
| G022032 (100聚物) | 27 | 0.99 | 12.85 | 0.212 | 25.1 | 3.394 |
| G022033 (100聚物) | 18.35 | 2.333 | 18.85 | 4.313 | 11.7 | 2.121 |
| G022034 (100聚物) | 5.22 | 0.354 | 11.195 | 4.108 | 4.785 | 1.28 |
| G022035 (100聚物) | 3.165 | 0.021 | 8.795 | 0.983 | 2.585 | 0.785 |
| G022036 (100聚物) | 4.37 | 0.99 | 8.395 | 1.110 | 3.5 | 0.792 |
| G022037 (100聚物) | 1.905 | 0.177 | 4.58 | 0.580 | 1.53 | 0.014 |
| G022038 (100聚物) | 0.305 | 0.035 | 1.01 | 0.042 | 1.05 | 0.82 |
| G022039 (100聚物) | 0.315 | 0.035 | 0.76 | 0.226 | 1.115 | 0.926 |
| G022040 (100聚物) | 6.35 | 0.552 | 10.12 | 1.103 | 4.965 | 0.177 |
| G022041 (100聚物) | 12.25 | 0.636 | 21.05 | 0.919 | 3.36 | 0.368 |
| G022042 (100聚物) | 3.34 | 2.164 | 7.72 | 2.051 | 1.875 | 0.29 |
| G022043 (100聚物) | 72.4 | 0.424 | 76 | 1.697 | 68.25 | 1.909 |
| G022044 (100聚物) | 14.3 | 1.273 | 21.65 | 0.919 | 17.95 | 1.768 |
| G022045 (100聚物) | 3.355 | 0.969 | 8.945 | 2.765 | 4.575 | 0.163 |
| G022046 (100聚物) | 92.75 | 1.061 | 97.4 | 0.849 | 85.5 | 1.838 |
| G022047 (100聚物) | 11.25 | 1.485 | 17.95 | 3.748 | 12.85 | 1.485 |
| G022048 (100聚物) | 4.13 | 0.622 | 10.31 | 2.814 | 4.765 | 1.025 |
| G022049 (100聚物) | 6.26 | 1.188 | 8.495 | 1.280 | 5.01 | 1.004 |
| G022050 (100聚物) | 0.195 | 0.092 | 0.985 | 0.643 | 0.995 | 0.417 |
| G022051 (100聚物) | 0.255 | 0.092 | 0.67 | 0.141 | 1.03 | 0.721 |
| G022052 (100聚物) | 0.155 | 0.049 | 0.78 | 0.382 | 0.845 | 0.276 |
| G022053 (100聚物) | 57.05 | 1.909 | 64.4 | 0.990 | 36.3 | 3.96 |
| G022054 (100聚物) | 7.855 | 1.096 | 10.18 | 1.867 | 6.04 | 0.849 |
| G022055 (100聚物) | 52.05 | 1.202 | 64.75 | 1.485 | 43.25 | 5.02 |
| G027488 (91聚物) | 92.55 | 0.354 | 95.3 | 1.697 | 85.65 | 0.778 |
| G027489 (91聚物) | 81.9 | 0.566 | 83.45 | 1.626 | 78.65 | 1.202 |
| G027490 (91聚物) | 80.35 | 0.071 | 84.75 | 0.636 | 79.2 | 1.838 |
| G027491 (91聚物) | 92 | 1.556 | 95.05 | 0.212 | 84.25 | 0.071 |
| G000529 B2M | 94.7 | 0.283 | 86.9 | 0 | 94.4 | 0.424 |
| G028013 B2M | N/A | N/A | N/A | N/A | 92.95 | 0.919 |
| G018995 HLA-A | 88.4 | 2.828 | N/A | N/A | 90.7 | 0 |
| G012086 TRAC | 97.5 | 0 | 92.4 | 0 | 90.4 | 0.283 |
| 指導物ID | 供體3 | 供體4 | ||
| 平均HLA-B KO% | SD HLA-B KO% | 平均HLA-B KO% | SD HLA-B KO% | |
| G027488 (91聚物) | 72.4 | 3.536 | 72.85 | 1.909 |
| G027488 (91聚物) | 77.35 | 0.495 | 77.85 | 0.778 |
| G027491 (91聚物) | 73.35 | 2.475 | 76.15 | 4.172 |
| G027973 (91聚物) | 78.6 | 2.687 | 88.1 | 3.111 |
| G027974 (91聚物) | 72.2 | 1.414 | 87.55 | 4.596 |
| G027975 (91聚物) | 74.2 | 2.687 | 69.95 | 1.202 |
| G027976 (91聚物) | 76.05 | 2.192 | 81.4 | 0.424 |
| G027977 (91聚物) | 12.65 | 15.203 | 1.415 | 0.898 |
| G027978 (91聚物) | 67.65 | 1.344 | 63.2 | 3.96 |
| G027979 (91聚物) | 6.46 | 2.093 | 5.725 | 0.007 |
| G027980 (91聚物) | 8.945 | 0.856 | 5.51 | 1.471 |
| G027981 (91聚物) | 41.9 | 8.202 | 30.95 | 3.889 |
| G027982 (91聚物) | 2.28 | 0.566 | 0.875 | 0.134 |
| G027983 (91聚物) | 23.05 | 0.495 | 22.6 | 4.525 |
| G027984 (91聚物) | 82.85 | 1.485 | 76.95 | 4.313 |
| G027985 (91聚物) | 91.5 | 0.99 | 88.45 | 7.566 |
| G027986 (91聚物) | 48.2 | 2.404 | 48.9 | 0.283 |
| G027987 (91聚物) | 77.3 | 1.131 | 78.05 | 0.636 |
| G027988 (91聚物) | 81.2 | 1.414 | 81.3 | 1.556 |
| G027989 (91聚物) | 79.65 | 3.748 | 76.3 | 4.243 |
| G027990 (91聚物) | 87.75 | 1.061 | 88.1 | 0.283 |
| G027991 (91聚物) | 80.45 | 4.313 | 83 | 2.546 |
| G027992 (91聚物) | 33.75 | 24.961 | 9.25 | 1.768 |
| G027993 (91聚物) | 75.85 | 1.202 | 76.5 | 1.273 |
| G027994 (91聚物) | 90.05 | 0.354 | 93.45 | 1.768 |
| G027995 (91聚物) | 17.4 | 14.001 | 16.3 | 3.677 |
| G027996 (91聚物) | 63.75 | 0.636 | 62.05 | 0.778 |
| G027997 (91聚物) | 43.7 | 4.101 | 39.8 | 2.121 |
| G027998 (91聚物) | 58.35 | 1.061 | 63.2 | 3.96 |
| G027999 (91聚物) | 3.78 | 0.424 | 1.77 | 0.24 |
| G028000 (91聚物) | 75.3 | 0 | 72.2 | 0.849 |
| G028001 (91聚物) | 83.85 | 1.344 | 85.8 | 0.141 |
| G028002 (91聚物) | 88.6 | 0.99 | 95.3 | 0.283 |
| G028003 (91聚物) | 57.45 | 3.182 | 50.9 | 2.121 |
| G028004 (91聚物) | 31.75 | 5.162 | 29.25 | 1.061 |
| G028005 (91聚物) | 10.13 | 1.937 | 5.19 | 0.75 |
| G028006 (91聚物) | 67.95 | 0.778 | 69.8 | 1.273 |
| G028007 (91聚物) | 34.5 | 18.95 | 14.1 | 1.556 |
| G028008 (91聚物) | 60.35 | 34.578 | 83.75 | 1.768 |
| G028009 (91聚物) | 46.9 | 0.283 | 49.9 | 3.96 |
| G028010 (91聚物) | 77.7 | 2.687 | 78.5 | 3.96 |
| G028011 (91聚物) | 3.675 | 0.247 | 97.15 | 0.212 |
| G000529 B2M | 94.4 | 0.424 | N/A | N/A |
| G028013 B2M | 92.95 | 0.919 | 96.85 | 0.636 |
| G018995 HLA-A | 90.7 | 0 | N/A | N/A |
| G012086 TRAC | 90.4 | 0.283 | N/A | N/A |
在解凍後1天，將T細胞(Cellex, HLA- B*07:02 / B*08:01)以0.5 × 10^6個細胞/mL之密度平鋪於補充有以下2×細胞介素之TCAM培養基中：200 U/mL之IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、10 ng/mL之IL-7及10 ng/mL之IL-15。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。製備含有4 × ApoE3 (10 ug/mL)之TCAM培養基且填充於Hamilton之儲器中。根據板佈局，向Hamilton相容性深孔稀釋塊之「第1行」中以一式兩份添加每一HLA-B LNP於TCAM (用於指導物G027488、G027489、G027490、G027491)中之1 mL 4×儲備溶液(20 µg/mL)。藉由將LNP儲備溶液及ApoE3培養基稀釋4倍以產生標準曲線之最高點(5 ug/mL LNP)，然後進行2倍連續稀釋以獲得12點DRC，在Hamilton上實施轉染。每孔中之ApoE3濃度保持恆定在2.5 µg/mL。藉由Hamilton添加至每孔中以獲得期望濃度之LNP + ApoE3培養基之總體積係100 µL。藉由在TCAM中將濃度為2.5 ug/mL之B2M LNP及濃度為2.5 ug/mL之ApoE3添加至細胞中，在不使用Hamilton之情況下手動實施B2M LNP之轉染。應注意，由於細胞係與2×細胞介素一起平鋪，故含有LNP及ApoE3之培養基不含細胞介素以產生細胞上細胞介素之1×最終濃度(100 U/mL之IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之IL-7及5 ng/mL之IL-15)。將板轉移至37℃培育器。每2-3天將細胞板分開且向每一重複板(以及原始板)補充補充有細胞介素之TCAM。
在用LNP轉染後9天，將板以500×g旋轉沈降5分鐘，吸出培養基，且將細胞染色用於流式細胞術讀出。
6.2 流式細胞術
如實例5.2中實施流式細胞術。
表 15及
表 16以及
圖 4A及
圖 4B顯示每一LNP劑量下之敲除%。
表15
表16
實例 7 ：用 Nme2 BC22n 及 Nme2 裂解酶篩選 HLA-B 指導物
| 指導物 | G027488 | G027489 | G027490 | ||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均 HLA-B*07:02 KO% | SD HLA-B*07:02 KO% | N | 平均 HLA-B*07:02 KO% | SD HLA-B*07:02 KO% | N | 平均 HLA-B*07:02 KO% | SD HLA-B*07:02 KO% | N |
| 5 | 81.20 | 1.27 | 2 | 85.25 | 1.63 | 2 | 64.65 | 1.06 | 2 |
| 2.5 | 83.80 | 2.12 | 2 | 88.30 | 1.41 | 2 | 63.50 | 2.40 | 2 |
| 1.25 | 88.25 | 0.21 | 2 | 87.20 | 1.70 | 2 | 65.35 | 1.48 | 2 |
| 0.625 | 89.65 | 0.92 | 2 | 87.05 | 0.49 | 2 | 64.65 | 3.89 | 2 |
| 0.313 | 77.35 | 0.64 | 2 | 86.15 | 0.35 | 2 | 66.15 | 3.32 | 2 |
| 0.156 | 14.25 | 0.78 | 2 | 70.05 | 1.91 | 2 | 62.70 | 1.41 | 2 |
| 0.078 | 1.13 | 0.37 | 2 | 32.60 | 0.42 | 2 | 36.60 | 4.95 | 2 |
| 0.039 | 0.53 | 0.44 | 2 | 5.92 | 0.22 | 2 | 8.01 | 3.52 | 2 |
| 0.02 | 0.22 | 0.21 | 2 | 1.02 | 0.01 | 2 | 1.90 | 0.07 | 2 |
| 0.01 | 0.62 | 0.16 | 2 | 0.33 | 0.04 | 2 | 0.40 | 0.11 | 2 |
| 0.005 | 0.38 | 0.06 | 2 | 0.31 | 0.00 | 2 | 0.29 | 0.18 | 2 |
| 0.002 | 0.28 | 0.10 | 2 | 0.12 | 0.00 | 2 | 0.13 | 0.01 | 2 |
| 指導物 | G027491 | G000529 B2M | |||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均 HLA-B*07:02 KO% | SD HLA-B*07:02 KO% | N | 平均 HLA-B*07:02 KO% | SD HLA-B*07:02 KO% | N | |||
| 5 | 76.25 | 2.47 | 2 | ||||||
| 2.5 | 79.80 | 0.14 | 2 | ||||||
| 1.25 | 87.00 | 0.71 | 2 | 93.5 | 1 | ||||
| 0.625 | 86.95 | 0.92 | 2 | ||||||
| 0.313 | 54.70 | 3.54 | 2 | ||||||
| 0.156 | 4.28 | 0.53 | 2 | ||||||
| 0.078 | 0.33 | 0.01 | 2 | ||||||
| 0.039 | 0.14 | 0.01 | 2 | ||||||
| 0.02 | 0.13 | 0.00 | 2 | ||||||
| 0.01 | 0.13 | 0.03 | 2 | ||||||
| 0.005 | 0.10 | 0.00 | 2 | ||||||
| 0.002 | 0.22 | 0.11 | 2 |
| 指導物 | G027488 | G027489 | G027490 | ||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均 HLA-B*08:01 KO% | SD HLA-B*08:01 KO% | N | 平均 HLA-B*08:01 KO% | SD HLA-B*08:01 KO% | N | 平均 HLA-B*08:01 KO% | SD HLA-B*08:01 KO% | N |
| 5 | 78.45 | 2.05 | 2 | 85.20 | 0.14 | 2 | 74.05 | 2.19 | 2 |
| 2.5 | 82.20 | 1.27 | 2 | 83.80 | 0.14 | 2 | 72.75 | 0.49 | 2 |
| 1.25 | 86.25 | 0.07 | 2 | 84.10 | 0.28 | 2 | 73.35 | 1.91 | 2 |
| 0.625 | 89.00 | 0.71 | 2 | 84.45 | 0.78 | 2 | 75.60 | 2.12 | 2 |
| 0.313 | 84.05 | 1.63 | 2 | 84.75 | 0.92 | 2 | 75.20 | 1.27 | 2 |
| 0.156 | 25.45 | 3.89 | 2 | 71.80 | 2.40 | 2 | 71.60 | 1.41 | 2 |
| 0.078 | 1.64 | 0.35 | 2 | 44.30 | 3.39 | 2 | 59.25 | 1.91 | 2 |
| 0.039 | 0.61 | 0.22 | 2 | 10.30 | 1.00 | 2 | 21.55 | 0.21 | 2 |
| 0.02 | 0.47 | 0.18 | 2 | 1.88 | 0.23 | 2 | 4.84 | 0.59 | 2 |
| 0.01 | 0.48 | 0.20 | 2 | 0.90 | 0.02 | 2 | 1.98 | 0.35 | 2 |
| 0.005 | 0.61 | 0.11 | 2 | 0.81 | 0.04 | 2 | 1.02 | 0.22 | 2 |
| 0.002 | 0.76 | 0.11 | 2 | 1.37 | 0.65 | 2 | 1.36 | 0.76 | 2 |
| 指導物 | G027491 | G000529 B2M | |||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均 HLA-B*08:01 KO% | SD HLA-B*08:01 KO% | N | 平均 HLA-B*08:01 KO% | SD HLA-B*08:01 KO% | N | |||
| 5 | 71.25 | 0.49 | 2 | ||||||
| 2.5 | 79.45 | 0.21 | 2 | ||||||
| 1.25 | 81.10 | 4.24 | 2 | 96.6 | 1 | ||||
| 0.625 | 84.00 | 1.84 | 2 | ||||||
| 0.313 | 66.45 | 1.06 | 2 | ||||||
| 0.156 | 10.75 | 0.64 | 2 | ||||||
| 0.078 | 1.24 | 0.27 | 2 | ||||||
| 0.039 | 0.73 | 0.08 | 2 | ||||||
| 0.02 | 1.09 | 0.52 | 2 | ||||||
| 0.01 | 0.95 | 0.23 | 2 | ||||||
| 0.005 | 0.78 | 0.25 | 2 | ||||||
| 0.002 | 0.72 | 0.13 | 2 |
在100 µM之固定濃度下篩選靶向HLA-B之57個sgRNA。使用靶向TRAC及B2M之sgRNA作為對照。用編碼UGI之mRNA (3490 ng/mL) (SEQ ID NO: 821)以及編碼Nme2 BC22n之mRNA (1709 ng/mL) (SEQ ID NO: 822)、編碼Nme2裂解酶之mRNA (1660 ng/mL) (SEQ ID NO: 825)或編碼Spy裂解酶之mRNA (2230 ng/mL) (SEQ ID NO: 827)對指導物進行電穿孔。
7.1 T 細胞製備
在商業上獲得健康人類供體血球分離(Hemacare)，且將細胞洗滌並重懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中進行處理。使用直接來自人類之Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組(Miltenyi Biotec目錄號130-122-352)，經由正向選擇分離T細胞。將T細胞分成等份且冷凍保存以進一步用於Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)。解凍後，將T細胞以1.0 × 10
6個細胞/mL之密度平鋪於T細胞生長培養基(TCGM)中，該等T細胞生長培養基由含有5%人類AB血清(GeminiBio，目錄號100-512)、1×青黴素-鏈霉素、1× Glutamax、10 mM HEPES、1×細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素15 (Peprotech，目錄號200-15))之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充物(ThermoFisher目錄號A1048501)構成。將T細胞在T細胞生長培養基中靜置24小時，此時將其用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160)活化。在電穿孔前48小時活化T細胞。
7.2 使用 RNA 電穿孔進行 T 細胞編輯
在HLA-B基因座處用Cas9 (SEQ ID NO: 827)、編碼Nme BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)編輯T細胞，以評價sgRNA編輯功效及相應的HLA-B7表現損失。
在P3電穿孔緩衝液(Lonza目錄號V4SP-3960)中製備含有編碼BC22n之mRNA (SEQ ID: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821) 之溶液。將
表 17中所包括之100 µM HLA-B靶向sgRNA自其儲存板移除且在95℃下變性2分鐘並在室溫下培育5分鐘。在活化後48小時，收穫T細胞，以500 g離心5分鐘，且以12.5 × 10
6個T細胞/mL之濃度重懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza目錄號V4SP-3960)中。對於欲進行電穿孔之每孔，將1 × 10
5個T細胞與20 ng/µL 之BC22n mRNA、20 ng/µL 之UGI mRNA及20 pmol之sgRNA在最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中混合。將此混合物以一式兩份轉移至96孔Nucleofector™板(製造商，目錄號) 且使用製造商之脈波碼進行電穿孔。立即將經電穿孔之T細胞在不含細胞介素之80 µL CTS Optimizer T細胞生長培養基(製造商，目錄號)中靜置15分鐘。靜置後，將T細胞轉移至平底96孔板(製造商，目錄號)，該等板含有補充有2×細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)/孔之80 µL CTS Optimizer T細胞生長培養基(製造商，目錄號)。將板在37℃下培育10天。
在電穿孔後第7天時，收集細胞用於流式細胞術分析。藉由第三方設施使用標準方法運行細胞之NGS分析。
[1] 7.3 流式細胞術
藉由流式細胞術對T細胞進行表型分析以確定 HLA-B7 蛋白表現。簡言之，將T細胞在4℃下與以1:200稀釋於細胞染色緩衝液中之針對CD3之抗體(BioLegend，目錄號316314)、針對CD4之抗體(BioLegend，目錄號317434)、針對CD8之抗體(BioLegend，目錄號301046)、針對Viakrome之抗體(Immunotech，目錄號C36628)、針對HLA B7之抗體(Milteny Biotech，目錄號130-120-234)的混合物一起培育30 min。隨後將細胞洗滌且重懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中。然後在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理細胞且使用FlowJo軟體包分析。基於大小、形狀、活力、CD8、CD3及HLA-B7表現對T細胞閘控。
表 17及
圖 5A顯示在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B7陰性細胞之平均百分比。
表 17- HLA-B 基因座處編輯後之平均 HLA-B7
-T
細胞 % 。
7.4 Nme2裂解酶篩選
| 指導物ID | %HLA-B7 -ve | 指導物ID | %HLA-B7 -ve | ||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
| G018995 HLA-A | 0.27 | 0.170 | 2 | G028828 | 2.13 | 0.834 | 2 |
| G021469 TRAC | 0.08 | 0.000 | 2 | G028829 | 3.375 | 0.940 | 2 |
| G021481 TRAC | 1.38 | 1.796 | 2 | G028830 | 0.32 | 0.297 | 2 |
| G028789 | 49.05 | 1.202 | 2 | G028831 | 32.05 | 0.636 | 2 |
| G028790 | 1.295 | 0.672 | 2 | G028832 | 74.9 | 9.334 | 2 |
| G028791 | 11.075 | 1.591 | 2 | G028833 | 7.215 | 5.353 | 2 |
| G028792 | 0.36 | 0.085 | 2 | G028834 | 0.27 | 0.198 | 2 |
| G028793 | 0.31 | 0.297 | 2 | G028835 | 0.185 | 0.078 | 2 |
| G028794 | 4.295 | 0.530 | 2 | G028836 | 0.415 | 0.120 | 2 |
| G028795 | 71.3 | 6.505 | 2 | G028837 | 0.29 | 0.099 | 2 |
| G028796 | 16.425 | 10.713 | 2 | G028838 | 0.45 | 0.042 | 2 |
| G028797 | 0.51 | 0.113 | 2 | G028839 | 6.69 | 0.990 | 2 |
| G028798 | 0.08 | 0.057 | 2 | G028840 | 2.1 | 0.594 | 2 |
| G028799 | 1.795 | 0.035 | 2 | G028841 | 0.135 | 0.106 | 2 |
| G028800 | 0.12 | 0.071 | 2 | G028842 | 0.06 | 0.042 | 2 |
| G028801 | 0.335 | 0.148 | 2 | G028843 | 0.185 | 0.035 | 2 |
| G028802 | 24.45 | 2.899 | 2 | G028931 | 0.065 | 0.035 | 2 |
| G028803 | 42.25 | 3.465 | 2 | G028932 | 0.12 | 0.028 | 2 |
| G028804 | 7.695 | 2.397 | 2 | ||||
| G028805 | 9.915 | 0.686 | 2 | ||||
| G028806 | 18.15 | 0.495 | 2 | ||||
| G028807 | 4.615 | 0.742 | 2 | ||||
| G028808 | 0.37 | 0.240 | 2 | ||||
| G028809 | 0.03 | 0.000 | 2 | ||||
| G028810 | 0.055 | 0.035 | 2 | ||||
| G028811 | 0.24 | 0.156 | 2 | ||||
| G028812 | 0.035 | 0.035 | 2 | ||||
| G028813 | 1.625 | 0.134 | 2 | ||||
| G028814 | 3.495 | 0.672 | 2 | ||||
| G028815 | 12.2 | 0.849 | 2 | ||||
| G028816 | 13.5 | 0.424 | 2 | ||||
| G028817 | 1.52 | 0.778 | 2 | ||||
| G028818 | 0.92 | 1.273 | 2 | ||||
| G028819 | 0.1 | 0.014 | 2 | ||||
| G028820 | 0.365 | 0.346 | 2 | ||||
| G028821 | 0.085 | 0.007 | 2 | ||||
| G028822 | 0.185 | 0.035 | 2 | ||||
| G028823 | 1.49 | 0.071 | 2 | ||||
| G028824 | 0.215 | 0.247 | 2 | ||||
| G028825 | 1.585 | 0.205 | 2 | ||||
| G028826 | 0.825 | 0.035 | 2 | ||||
| G028827 | 0.605 | 0.375 | 2 |
在100 µM之固定濃度下篩選55個靶向HLA-B之sgRNA。使用三個靶向TRAC之sgRNA及靶向B2M之sgRNA作為對照。供體具有B*07:02/B*08:01之HLA-B表型。在
HLA-B基因座處藉由HTP-LNP遞送及每一測試指導物編輯後，藉由流式細胞術測定HLA-B7陰性細胞或HLA-B8之百分比。
用HTP-LNP轉染T細胞且如實例5中實施流式細胞術。
表 18以及圖
5B 及圖
5C顯示HLA*B07:02或HLAB*08:01之敲除之平均百分比。
表18 - 在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B*07:02或HLA-B*08:01敲除之平均百分比
實例8：頂部HLA-A及HLA-B Nme2指導物之LNP劑量反應曲線(DRC)
| 指導物ID | HLA-B*07:02 KO% | HLA-B*08:01 KO% |
| 平均值 | 平均值 | |
| G000529 B2M | 93.25 | 92.95 |
| G028789 | 55.5 | 49.8 |
| G028790 | 1.08 | 0.68 |
| G028791 | 8.05 | 7.22 |
| G028792 | 1.73 | 1.39 |
| G028793 | 0.65 | 0.26 |
| G028794 | 10.8 | 11.6 |
| G028795 | 7.24 | 5.67 |
| G028796 | 3.45 | 2.88 |
| G028797 | 0.43 | 0.16 |
| G028798 | 1.69 | 0.22 |
| G028799 | 1.05 | 1.05 |
| G028800 | 0.67 | 0.44 |
| G028801 | 1.21 | 0.48 |
| G028802 | 5.09 | 9.4 |
| G028803 | 3.36 | 3.46 |
| G028804 | 0.44 | 0.13 |
| G028805 | 95.6 | 92.2 |
| G028806 | 35.7 | 33.6 |
| G028807 | 0.49 | 0.34 |
| G028808 | 0.79 | 0.17 |
| G028809 | 0.88 | 0.47 |
| G028810 | 0.42 | 0.83 |
| G028811 | 0.14 | 0.15 |
| G028812 | 0.38 | 0.17 |
| G028813 | 42.4 | 33.2 |
| G028814 | 34.3 | 35.3 |
| G028815 | 73.7 | 48.4 |
| G028816 | 49.4 | 35.7 |
| G028817 | 0.64 | 0.39 |
| G028818 | 0.46 | 0.32 |
| G028819 | 1.81 | 2.14 |
| G028820 | 2.45 | 3.88 |
| G028821 | 14.9 | 16.5 |
| G028822 | 3.47 | 1.71 |
| G028823 | 0.31 | 0.22 |
| G028824 | 2.77 | 2.47 |
| G028825 | 58.3 | 35.8 |
| G028826 | 92.1 | 57.2 |
| G028827 | 0.28 | 0.37 |
| G028828 | 0.89 | 1.01 |
| G028829 | 15.5 | 13.9 |
| G028830 | 6.77 | 0.15 |
| G028831 | 21.9 | 24.6 |
| G028832 | 34.9 | 34.1 |
| G028833 | 0.76 | 0.48 |
| G028834 | 0.21 | 0.3 |
| G028835 | 0.75 | 0.72 |
| G028836 | 0.5 | 0.49 |
| G028837 | 1.03 | 0.36 |
| G028838 | 0.82 | 0.21 |
| G028839 | 4.75 | 4.34 |
| G028840 | 0.68 | 0.21 |
| G028841 | 1.28 | 0.36 |
| G028842 | 1.31 | 0.19 |
| G028843 | 1.25 | 0.43 |
| G021469 TRAC | 0.42 | 0.63 |
| G021475 TRAC | 0.83 | 0.14 |
| G021481 TRAC | 0.19 | 0.12 |
對前導HLA-A及HLA-B sgRNA以及Nme2 BC22運行DRC以確定用於敲除HLA基因之最佳指導物。在T細胞中使用電穿孔，與固定濃度之編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821) (3490 ng/μL)及編碼Nme2 BC22n鹼基編輯子之mRNA (SEQ ID NO: 822) (1709 ng/μL)或編碼Spy裂解酶之mRNA (SEQ ID NO: 827) (2230 ng/μL)一起，在8點DRC中滴定sgRNA。然後藉由流式細胞術分析T細胞以確定編輯效率。如實例1中所述製備T細胞。
8.1 mRNA電穿孔
在P3緩衝液中製備含有編碼BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)之溶液。將100 µM HLA-B靶向sgRNA自其儲存板移除且在95℃下變性2分鐘並在室溫下培育5分鐘。在活化後48小時，收穫T細胞，離心，且以12.5 × 10^6個T細胞/mL之濃度重懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza目錄號V4SP-3960)中。如
表 19中所述，自5 µM開始，將每一sgRNA以1:2之比率以一式兩份連續稀釋於96孔PCR板中之P3電穿孔緩衝液中。稀釋後，將1 × 10^5個T細胞、20 ng/µL之BC22n mRNA及20 ng/µL之UGI mRNA與sgRNA板混合以製成最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液。將混合物轉移至兩個96孔Nucleofector™板。使用 Lonza shuttle 96w使用製造商之脈波碼以一式兩份對細胞進行電穿孔。在電穿孔後立即使細胞在不含細胞介素之80 µL TCGM中在37℃下恢復15分鐘。隨後在進一步補充有2×細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)/孔之TCGM中培養經電穿孔之T細胞。將板在37℃下培育10天。在編輯後第7天時，收集經編輯之T細胞用於流式細胞術分析。
8.2 流式細胞術
在第10天時，將細胞轉移至U底板，旋轉且重懸浮於主混合物中，該主混合物含有在FAC緩衝液中1:100最終濃度之針對PerCP/Cy5.5 CD3之抗體(BioLegend，目錄號317434)、針對BV421 CD4之抗體(BioLegend，目錄號317434)、針對BV785 CD8之抗體(BioLegend，目錄號301046)、針對HLA A2之抗體(BioLegend Inc.，目錄號343306)、以1:200稀釋之針對HLA B7之抗體(Miltenyi Biotec Inc.，目錄號130-120-234)及針對Viakrome之抗體(Immunotech，目錄號C36628)，且然後在4℃下培育30分鐘。培育後，將細胞洗滌且重懸浮於100 µL FAC緩衝液(PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA)中並藉由流式細胞術使用Beckman Coulter CytoflexS處理，且使用FlowJo軟體包分析。
表 19 及表 20以及
圖 6 及圖 7顯示每一sgRNA劑量下之編輯%。
表19- 使用各種劑量之sgRNA之CD8
+細胞之HLA-A2
-%之劑量反應曲線
表20- 使用各種劑量之sgRNA之CD8
+細胞 之HLA-B7
-%之劑量反應曲線
實例 9. 誘導多能幹細胞 (iPSC) 中之 HLA-B KO
| 指導物 | G028907 | G028913 | G028840 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 98.65 | 0.07 | 2 | 97.20 | 0.42 | 2 | 98.00 | 0.14 | 2 | ||||
| 2.5 | 98.25 | 0.21 | 2 | 96.15 | 0.07 | 2 | 97.30 | 0.28 | 2 | ||||
| 1.25 | 97.40 | 0.14 | 2 | 93.30 | 0.00 | 2 | 94.35 | 0.92 | 2 | ||||
| 0.625 | 95.70 | 0.42 | 2 | 90.85 | 0.92 | 2 | 90.00 | 0.99 | 2 | ||||
| 0.313 | 92.40 | 0.00 | 2 | 85.55 | 1.77 | 2 | 78.85 | 0.92 | 2 | ||||
| 0.078 | 80.20 | 3.25 | 2 | 68.25 | 3.75 | 2 | 55.95 | 0.35 | 2 | ||||
| 0 | 54.45 | 2.05 | 2 | 42.70 | 1.13 | 2 | 31.45 | 0.64 | 2 | ||||
| EC50 | 0.07038 | 0.08998 | 0.1289 | ||||||||||
| 指導物 | G028922 | G028918 | G028865 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 98.65 | 0.21 | 2 | 92.15 | 0.07 | 2 | 90.95 | 1.06 | 2 | ||||
| 2.5 | 95.00 | 0.99 | 2 | 89.45 | 1.20 | 2 | 90.20 | 1.27 | 2 | ||||
| 1.25 | 74.90 | 2.12 | 2 | 87.25 | 1.06 | 2 | 87.20 | 0.42 | 2 | ||||
| 0.625 | 54.20 | 0.42 | 2 | 83.40 | 0.71 | 2 | 81.35 | 1.34 | 2 | ||||
| 0.313 | 36.80 | 0.85 | 2 | 72.05 | 0.64 | 2 | 75.45 | 1.06 | 2 | ||||
| 0.078 | 18.60 | 0.42 | 2 | 48.80 | 0.85 | 2 | 55.60 | 2.26 | 2 | ||||
| 0 | 8.73 | 0.02 | 2 | 24.65 | 1.20 | 2 | 34.30 | 1.56 | 2 | ||||
| EC50 | 0.6028 | 0.1429 | 0.09631 | ||||||||||
| 指導物 | G028832 | G028795 | G028869 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 1.45 | 0.13 | 2 | 5.74 | 0.32 | 2 | 70.55 | 0.49 | 2 | ||||
| 2.5 | 0.71 | 0.03 | 2 | 2.99 | 0.76 | 2 | 61.75 | 0.92 | 2 | ||||
| 1.25 | 0.37 | 0.04 | 2 | 1.65 | 0.10 | 2 | 43.75 | 1.91 | 2 | ||||
| 0.625 | 0.33 | 0.04 | 2 | 0.96 | 0.03 | 2 | 25.45 | 0.92 | 2 | ||||
| 0.313 | 0.49 | 0.15 | 2 | 0.82 | 0.08 | 2 | 14.55 | 0.92 | 2 | ||||
| 0.078 | 0.29 | 0.08 | 2 | 0.39 | 0.01 | 2 | 6.20 | 0.33 | 2 | ||||
| 0 | 0.40 | 0.13 | 2 | 0.35 | 0.10 | 2 | 3.19 | 0.40 | 2 | ||||
| EC50 | 2.654 | 15.82 | 0.9213 | ||||||||||
| 指導物 | G000529 B2M | G018995 Spy Cas | G022020 Spy Cas | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 96.15 | 0.07 | 2 | 98.20 | 0.42 | 2 | 6.11 | 1.70 | 2 | ||||
| 2.5 | 94.85 | 0.49 | 2 | 97.80 | 0.00 | 2 | 6.39 | 3.83 | 2 | ||||
| 1.25 | 93.45 | 1.20 | 2 | 97.60 | 1.13 | 2 | 3.52 | 0.04 | 2 | ||||
| 0.625 | 90.55 | 0.07 | 2 | 96.10 | 0.42 | 2 | 2.04 | 0.66 | 2 | ||||
| 0.313 | 83.50 | 3.39 | 2 | 91.50 | 1.84 | 2 | 1.12 | 0.07 | 2 | ||||
| 0.078 | 57.60 | 4.67 | 2 | 75.10 | 0.00 | 2 | 0.69 | 0.16 | 2 | ||||
| 0 | 25.25 | 1.48 | 2 | 41.20 | 0.85 | 2 | 3.00 | 2.61 | 2 | ||||
| EC50 | 0.1087 | 0.09102 | 1.286 | ||||||||||
| 指導物 | G028907 | G028913 | G028840 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 85.15 | 0.35 | 2 | 16.35 | 0.21 | 2 | 14.20 | 1.84 | 2 | ||||
| 2.5 | 76.45 | 0.49 | 2 | 10.00 | 1.41 | 2 | 7.65 | 0.90 | 2 | ||||
| 1.25 | 59.25 | 0.64 | 2 | 4.87 | 0.23 | 2 | 3.69 | 1.02 | 2 | ||||
| 0.625 | 37.50 | 2.26 | 2 | 2.62 | 0.04 | 2 | 2.11 | 0.56 | 2 | ||||
| 0.313 | 22.65 | 0.92 | 2 | 1.27 | 0.25 | 2 | 1.34 | 0.11 | 2 | ||||
| 0.078 | 12.15 | 1.63 | 2 | 0.79 | 0.12 | 2 | 0.82 | 0.06 | 2 | ||||
| 0 | 5.44 | 0.15 | 2 | 0.43 | 0.08 | 2 | 0.64 | 0.08 | 2 | ||||
| EC50 | 0.8643 | 4.531 | 24.96 | ||||||||||
| 指導物 | G028922 | G028918 | G028865 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 39.00 | 0.28 | 2 | 0.63 | 0.01 | 2 | 0.52 | 0.06 | 2 | ||||
| 2.5 | 21.65 | 1.20 | 2 | 0.49 | 0.33 | 2 | 0.41 | 0.12 | 2 | ||||
| 1.25 | 9.60 | 0.13 | 2 | 0.47 | 0.03 | 2 | 0.20 | 0.14 | 2 | ||||
| 0.625 | 4.81 | 0.13 | 2 | 0.19 | 0.00 | 2 | 0.20 | 0.01 | 2 | ||||
| 0.313 | 3.08 | 0.62 | 2 | 0.21 | 0.16 | 2 | 0.20 | 0.09 | 2 | ||||
| 0.078 | 1.42 | 0.00 | 2 | 0.31 | 0.23 | 2 | 0.13 | 0.03 | 2 | ||||
| 0 | 1.42 | 1.19 | 2 | 0.21 | 0.13 | 2 | 0.09 | 0.08 | 2 | ||||
| EC50 | 5.494 | 1.217 | 0.03500 | ||||||||||
| 指導物 | G028832 | G028795 | G028869 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 87.05 | 1.77 | 2 | 91.75 | 1.34 | 2 | 80.80 | 1.70 | 2 | ||||
| 2.5 | 85.20 | 5.09 | 2 | 84.50 | 3.82 | 2 | 66.70 | 2.40 | 2 | ||||
| 1.25 | 82.60 | 1.84 | 2 | 74.40 | 1.27 | 2 | 45.70 | 2.55 | 2 | ||||
| 0.625 | 78.85 | 3.04 | 2 | 49.90 | 0.85 | 2 | 24.75 | 3.32 | 2 | ||||
| 0.313 | 73.50 | 0.42 | 2 | 31.05 | 2.19 | 2 | 15.30 | 0.85 | 2 | ||||
| 0.078 | 55.05 | 2.47 | 2 | 17.60 | 1.56 | 2 | 7.17 | 0.26 | 2 | ||||
| 0 | 34.85 | 1.63 | 2 | 7.86 | 0.65 | 2 | 3.25 | 0.13 | 2 | ||||
| EC50 | 0.1029 | 0.5729 | 1.205 | ||||||||||
| 指導物 | G000529 B2M | G018995 Spy Cas | G022020 Spy Cas | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5 | 96.15 | 0.07 | 2 | 1.74 | 0.25 | 2 | 92.70 | 1.70 | 2 | ||||
| 2.5 | 94.50 | 0.57 | 2 | 1.55 | 0.08 | 2 | 82.25 | 7.71 | 2 | ||||
| 1.25 | 93.20 | 0.99 | 2 | 1.94 | 0.28 | 2 | 67.45 | 7.42 | 2 | ||||
| 0.625 | 89.95 | 0.07 | 2 | 2.06 | 0.73 | 2 | 35.55 | 0.49 | 2 | ||||
| 0.313 | 82.85 | 3.46 | 2 | 1.82 | 0.36 | 2 | 15.90 | 1.41 | 2 | ||||
| 0.078 | 57.15 | 4.45 | 2 | 1.52 | 0.35 | 2 | 6.70 | 0.18 | 2 | ||||
| 0 | 24.80 | 1.41 | 2 | 1.12 | 0.01 | 2 | 4.84 | 1.07 | 2 | ||||
| EC50 | 0.1091 | 0.1053 | 0.8285 | ||||||||||
在單一KO實驗中使用HLA-B指導物G022020編輯誘導多能幹細胞。另外，在三重KO實驗中使用HLA-B指導物G022020、HLA-A指導物018995及CIITA指導物G013675 (CCCCCGGACGGUUCAAGCAA靶向序列；SEQ ID NO: 3110)編輯iPSC。結果顯示於下
表 21中。
表21. 使用HLA-B靶向指導RNA之iPSC中之編輯效率
實例 10 ：用 Nme2 BC22n 篩選 HLA-B 指導物
| ddPCR | 流式細胞術 | ||
| 效率 | HLA-B | 效率 | HLA-B |
| 單一KO | 77% | 單一KO | 83% |
| 三重KO | 79% | 三重KO | 71% |
在3 µg/mL之固定濃度下篩選28個靶向HLA-B之sgRNA。使用先前測試之靶向HLA-B之sgRNA (G028907)作為對照。指導物編碼UGI之mRNA (0.5 µg/mL) (SEQ ID NO: 821)及編碼Nme2 BC22n之mRNA (1 µg/mL) (SEQ ID NO: 828)係個別地使用LNP平行遞送。
10.1 T 細胞製備
在商業上獲得健康人類供體血球分離(Hemacare)，且將細胞洗滌並重懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中進行處理。使用直接來自人類之Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組(Miltenyi Biotec目錄號130-122-352)，經由正向選擇分離T細胞。將T細胞分成等份且冷凍保存以進一步用於Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)。解凍後，將T細胞以1.0 × 10
6個細胞/mL之密度平鋪於T細胞生長培養基(TCGM)中，該等T細胞生長培養基由含有5%人類AB血清(GeminiBio，目錄號100-512)、1×青黴素-鏈霉素、1× Glutamax、10 mM HEPES、1×細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素15 (Peprotech，目錄號200-15))之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充物(ThermoFisher目錄號A1048501)構成。將T細胞在T細胞生長培養基中靜置24小時，此時將其用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160)活化。在LNP處理前48小時活化T細胞。
10.2 使用 HTP LNP 進行 T 細胞編輯
在HLA-B基因座處用編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 828)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)編輯T細胞以評價sgRNA編輯功效以及相應的HLA-B7及HLA-B8表現損失。
在活化後48小時，收穫T細胞，以500 g離心5分鐘，且以1 × 10
6個T細胞/mL之密度重懸浮於T細胞生長培養基中並相應地平鋪於96孔板中。對於欲用LNP處理之每孔，將0.5 × 10
5個T細胞以2:1之比率與含有4 µg/mL Nme2 BC22n mRNA之LNP及含有2 µg/mL UGI mRNA之LNP混合，且以2:1之比率與含有12 µg/mL HLA-B sgRNA之LNP混合，最終體積為100 µL T細胞生長培養基。將板在37℃下培育10天。在解凍後第10天時，收集T細胞用於流式細胞術分析。
10.3
流式細胞術
藉由流式細胞術對T細胞進行表型分析以確定HLA-B7及HLA-B8蛋白表現。簡言之，將T細胞在4℃下與以1:100稀釋於細胞染色緩衝液中之針對CD3之抗體(BioLegend，目錄號317334)、針對CD4之抗體(BioLegend，目錄號300536)、針對CD8之抗體(BioLegend，目錄號344740)、針對Viakrome之抗體(Immunotech，目錄號C36628)、針對HLA-B7之抗體(Miltenyi Biotec，目錄號130-120-234)、針對HLA-B8之抗體(Miltenyi Biotec，目錄號130-118-366)、針對HLA-A2之抗體(eBioscience，目錄號17-9876-42)、針對HLA-A3之抗體(eBioscience，目錄號12-5754-42)、針對HLA-E之抗體(BioLegend，目錄號342612)及針對HLA-C之抗體(BD Pharmingen目錄號566372)的混合物一起培育30分鐘。隨後將細胞洗滌且重懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中。然後在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理細胞且使用FlowJo軟體包分析。基於大小、形狀、活力、CD8、CD3、HLA-E保留、HLA-C保留及HLA-B7及HLA-B8表現對T細胞閘控。
表 22及
圖 8A顯示在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B7陰性細胞之平均百分比。
表 23及
圖 8B顯示在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B8陰性細胞之平均百分比。
表 22- HLA-B 基因座處編輯後之平均 HLA-B7
-T
細胞 %
表 23- HLA-B 基因座處編輯後之平均 HLA-B8
-T
細胞 %
實例11：NK細胞功能殺傷分析
| 指導物ID | %HLA-B7 -ve | ||
| 平均值 | SD | N | |
| G032787 | 27.46 | 0.226274 | 2 |
| G032788 | 49.24 | 4.723473 | 2 |
| G032789 | 14.4 | 3.323402 | 2 |
| G032790 | 2.48 | 0.650538 | 2 |
| G032791 | 0.035 | 0.007071 | 2 |
| G032792 | 76.87 | 5.996266 | 2 |
| G032793 | 74.19 | 7.113494 | 2 |
| G032794 | 88.33 | 3.422397 | 2 |
| G032795 | 93.61 | 1.668772 | 2 |
| G032796 | 2.365 | 0.869741 | 2 |
| G028919 | 0.165 | 0.176777 | 2 |
| G032797 | 0.125 | 0.021213 | 2 |
| G032798 | 81.355 | 0.304056 | 2 |
| G032799 | 4.075 | 0.374767 | 2 |
| G032800 | 28.985 | 0.049497 | 2 |
| G032801 | 16.63 | 0.296985 | 2 |
| G032802 | 20.805 | 1.152584 | 2 |
| G032803 | 1.035 | 0.049497 | 2 |
| G032804 | 4.1 | 0.19799 | 2 |
| G032805 | 9.765 | 0.304056 | 2 |
| G032806 | 85.975 | 0.374767 | 2 |
| G032807 | 38.13 | 0.042426 | 2 |
| G032808 | 8.245 | 0.657609 | 2 |
| G032809 | 34.675 | 2.750645 | 2 |
| G032810 | 2.105 | 0.162635 | 2 |
| G032811 | 47.61 | 0.268701 | 2 |
| G032812 | 2.72 | 0.113137 | 2 |
| G032813 | 3.965 | 0.120208 | 2 |
| 指導物ID | HLA-B8% -ve | ||
| 平均值 | SD | N | |
| G032787 | 4.215 | 0.799031 | 2 |
| G032788 | 56.06 | 2.91328 | 2 |
| G032789 | 31.46 | 3.563818 | 2 |
| G032790 | 21.9 | 3.436539 | 2 |
| G032791 | 0.7 | 0.056569 | 2 |
| G032792 | 94.43 | 1.810193 | 2 |
| G032793 | 92.05 | 3.719382 | 2 |
| G032794 | 97.135 | 1.265721 | 2 |
| G032795 | 98.2 | 1.117229 | 2 |
| G032796 | 18.15 | 2.672864 | 2 |
| G028919 | 1.64 | 0.141421 | 2 |
| G032797 | 0.28 | 0.014142 | 2 |
| G032798 | 88.635 | 0.431335 | 2 |
| G032799 | 25.84 | 0.650538 | 2 |
| G032800 | 51.57 | 0.070711 | 2 |
| G032801 | 38.985 | 1.491995 | 2 |
| G032802 | 44.305 | 0.544472 | 2 |
| G032803 | 9.38 | 0.353553 | 2 |
| G032804 | 19.48 | 0.551543 | 2 |
| G032805 | 41.23 | 0.296985 | 2 |
| G032806 | 91.28 | 0.46669 | 2 |
| G032807 | 69.295 | 0.021213 | 2 |
| G032808 | 37.38 | 0.876812 | 2 |
| G032809 | 67.05 | 1.484924 | 2 |
| G032810 | 46.075 | 0.275772 | 2 |
| G032811 | 1.9 | 0.084853 | 2 |
| G032812 | 16.26 | 0.509117 | 2 |
| G032813 | 22.035 | 0.049497 | 2 |
測試在破壞CIITA、HLA-A、HLA-B或B2M之不同組合中編輯之T細胞抵抗自然殺手(NK)細胞介導之殺傷之能力。
11.1. 工程改造T細胞及純化
解凍後，將Pan CD3+ T細胞(StemCell, HLA-A*02:01:01；B*08:01: 01；C*07:01:01)以0.5 × 10
6個細胞/mL之密度平鋪於T細胞TCAM培養基中，該等培養基由含有2.5% (v/v)人類AB血清、1% (v/v) Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)及1% (v/v) 1M HEPES緩衝液(Gibco，目錄號15630080)、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)構成，且補充有100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)。
在第1天(解凍後1天)時，用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。如
表 24中所述，編輯T細胞以破壞 HLA-A、HLA-B或B2M基因。如
實例 1中所述調配含有Spy Cas9 mRNA及一個靶向B2M之sgRNA G000529、靶向HLA-A之sgRNA G018995或靶向HLA-B之sgRNA G027488、G027490、G027994、G028001及G028002的LNP組成物。將LNP組成物在37℃下在TCAM中與如上文所述補充有5 µg/ml重組人類ApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之細胞介素一起培育15分鐘。將等體積之LNP混合物添加至100萬個活化T細胞中以產生2.5 µg總LNP/mL (對於B2M LNP)；1.25 µg總LNP/mL (對於HLA-B LNP)及0.625 µg總LNP/mL (對於HLA-A LNP)之最終濃度。
表24 - 依序編輯及病毒轉導之順序
| 條件 | 第1 天 | 第2 天 |
| 未經編輯 | ||
| B2M KO | B2M LNP | |
| HLA-A KO | HLA-A LNP | |
| HLA-B KO (G027488) | HLA-B LNP | |
| HLA-B KO (G027490) | HLA-B LNP | |
| HLA-B KO (G027994) | HLA-B LNP | |
| HLA-B KO (G028001) | HLA-B LNP | |
| HLA-B KO (G028002) | HLA-B LNP | |
| HLA-A + HLA-B KO (G027488) | HLA-A LNP | HLA-B LNP |
| HLA-A + HLA-B KO (G027490) | HLA-A LNP | HLA-B LNP |
| HLA-A + HLA-B KO (G027994) | HLA-A LNP | HLA-B LNP |
| HLA-A + HLA-B KO (G028001) | HLA-A LNP | HLA-B LNP |
| HLA-A + HLA-B KO (G028002) | HLA-A LNP | HLA-B LNP |
在活化後1天(即第2天)，用LNP組成物編輯額外T細胞以破壞HLA-B基因(參見
表 24，第2天行)。使用含有Spy Cas9 mRNA及靶向HLA-B之sgRNA G027488、G027490、G027994、G028001及G028002的LNP組成物實施HLA-B編輯。將LNP組成物在37℃下在TCAM中與如上文所述補充有25 µg/ml重組人類ApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之細胞介素一起培育15分鐘。將等於1/10細胞體積之體積添加至含有大約100萬個細胞之每孔中以產生每一HLA-B LNP之1.25 µg總LNP/mL之最終濃度。
在活化後2天(即第3天)，將所有細胞轉移至GREX板(Wilson Wolf，目錄號80240M)以使用TCEM培養基擴增，該等TCEM培養基由含有5% (v/v) CTS™免疫細胞SR (Gibco，目錄號A2596101)、1% (v/v) Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)及1% (v/v) 1M HEPES緩衝液(Gibco，目錄號15630080)、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)構成，且補充有100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)。在第5天、第7天及第9天時，將GREX孔之一半培養基更換為補充有細胞介素之新鮮TCEM。
在活化後5天(即第6天)，藉由流式細胞術抗體對細胞染色以 確定B2M敲除後之HLA-A2表現(HLA-A+)、HLA-B8表現(HLA-B8+)及I類HLA表現(MHC I+)。將T細胞與靶向以下分子之抗體混合劑一起培育：HLA-A2 (Biolegend，目錄號343326)、HLA-B8 (Miltenyi Biotec，目錄號130-118-366)及B2M (Biolegend，目錄號316304)。隨後將細胞洗滌，且在Cytoflex LX儀器(Beckman Coulter)上使用FlowJo軟體包分析。
11.2 流式細胞術
分析NK細胞介導之針對經工程改造T細胞之細胞毒性。將T細胞與HLA-B/C匹配之CTV標記之NK細胞以8:1、4:1、2:1、1:1、0.5:1、0.25:1及0.125:1之效應物對靶比率(E:T)共培養21小時。用7AAD (BD Pharmingen，目錄號559925)對細胞染色，在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo軟體包分析。基於CTV陰性、大小以及形狀及活力對T細胞閘控。
表 25及
圖 9顯示在NK細胞激發後T細胞溶解之平均百分比。
表25 - NK細胞激發經工程改造之T細胞後之T細胞溶解百分比
實例 12 ：所選 HLA-B Nme2 BC22n 指導物之 LNP 劑量反應曲線 (DRC)
| NK:T | WT | B2M KO | HLA-A KO G018995 | HLA-B KO G027994 | n | ||||
| 平均值 | SD | 平均 | SD | 平均 | SD | 平均 | SD | ||
| 8 | 12.45 | 1.272792 | 83.78 | 0.19799 | 10 | 0.565685 | 29.4 | 0.424264 | 2 |
| 4 | 8.95 | 0.141421 | 83.29 | 0.226274 | 13.1 | 4.525483 | 24.85 | 0.353553 | 2 |
| 2 | 7.65 | 0.282843 | 82.34 | 2.545584 | 10.7 | 1.131371 | 21.65 | 1.06066 | 2 |
| 1 | 5.85 | 0.707107 | 78.07 | 2.291026 | 8.8 | 2.687006 | 19.45 | 0.494975 | 2 |
| 0.5 | 3.3 | 0.919239 | 48.6 | 3.606245 | 7.45 | 1.909188 | 14.5 | 1.131371 | 2 |
| 0.25 | 2.25 | 0.282843 | 23.95 | 7.919596 | 7.25 | 0.919239 | 8.4 | 0.848528 | 2 |
| 0.125 | 0.8 | 0.212132 | 16.05 | 11.45513 | 1.25 | 0.212132 | 5.05 | 0.919239 | 2 |
| (基底) 0 | 0 | 0.070711 | -5.225 | 7.389266 | 0 | 1.697056 | 0 | 0 | 2 |
| NK:T | HLA-B KO G028001 | HLA-A+ B KO G027994 | HLA-A+ B KO G028001 | n | |||
| 平均值 | SD | 平均 | SD | 平均 | SD | ||
| 8 | 44.25 | 1.979899 | 51.75 | 2.12132 | 61.6 | 0.070711 | 2 |
| 4 | 29.3 | 0.212132 | 46.85 | 2.545584 | 49.25 | 2.545584 | 2 |
| 2 | 19.7 | 1.484924 | 30.35 | 1.131371 | 34.85 | 3.676955 | 2 |
| 1 | 13.25 | 1.414214 | 23.85 | 1.555635 | 20.75 | 4.949747 | 2 |
| 0.5 | 8.9 | 1.626346 | 17.4 | 0.919239 | 15.5 | 7.2832 | 2 |
| 0.25 | 2 | 0.070711 | 14.65 | 6.788225 | 0.45 | 0.707107 | 2 |
| 0.125 | 4.35 | 5.23259 | 4.9 | 1.626346 | 9.1 | 14.21285 | 2 |
| (基底) 0 | 0 | 2.474874 | 0 | 0.353553 | 0 | 8.980256 | 2 |
對所選HLA-B sgRNA以及Nme2 BC22運行DRC以確定適於敲除HLA-B基因之指導物。在T細胞中使用LNP與固定濃度之編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 824) (3490 ng/μL)及編碼Nme2 BC22n鹼基編輯子之mRNA (SEQ ID NO: 828) (1709 ng/μL)一起，在8點DRC中滴定sgRNA。然後藉由流式細胞術分析T細胞以確定編輯效率。如實例1中所述製備T細胞。
12.1 使用 HPLC 純化之指導 LNP 進行 T 細胞編輯
在HLA-B基因座處用編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 828)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 824)編輯T細胞以評價sgRNA編輯功效以及相應的HLA-B7及HLA-B8表現損失。
在活化後48小時，將T細胞調整至T細胞生長培養基中1 × 10
6個T細胞/mL之濃度且相應地平鋪於96孔板中。對於欲用LNP處理之每孔，將0.5 × 10
5個T細胞以2:1之比率與含有10 µg/mL之Nme2 BC22n mRNA及HLA-B sgRNA之LNP；及含有0.4 µg/mL之UGI mRNA之LNP混合，最終體積為100 µL T細胞生長培養基。將板在37℃下培育10天，每隔一天更新培養基。在解凍後第10天時，收集T細胞用於流式細胞術分析。
12.2 流式細胞術
在第10天時，將細胞轉移至U底板，旋轉且重懸浮於主混合物中，該主混合物含有FAC緩衝液中1:100最終濃度之針對PerCP/Cy5.5 CD3之抗體(BioLegend，目錄號317336)、針對BV605 CD4之抗體(BioLegend，目錄號300536)、針對BV785 CD8之抗體(BioLegend，目錄號344740)、針對BV510 HLA A2之抗體(BioLegend Inc.，目錄號343320)、針對APC HLA A3之抗體(eBioscience，目錄號12-5754-42)、針對FITC HLA B7之抗體(Miltenyi Biotec Inc.，目錄號130-120-234)、針對FITC HLA B8之抗體(Miltenyi Biotec Inc.，目錄號130-118-366)及針對BV421 HLA-E之抗體(Biolegend，目錄號342612)、針對PE HLA-C之抗體(BD Pharmigen，目錄號566372)及針對Viakrome之抗體(Immunotech，目錄號C36628)，且然後在4℃下培育30分鐘。培育後，將細胞洗滌且重懸浮於100 µL FAC緩衝液(PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA)中並藉由流式細胞術使用Beckman Coulter CytoflexS處理，且使用FlowJo軟體包分析。
表 26A 及表 26B以及
圖 10A 及圖 10C顯示在HLA-B7同型接合或異型接合供體中在每一sgRNA劑量下之編輯%。
表 27A 及表 27B以及
圖 10B 及圖 10D顯示在HLA-B8同型接合或異型接合供體中在每一sgRNA劑量下之編輯%。
表 26A -HLA-B7同型接合供體中HLA-B7
-及CD8
+細胞%之劑量反應曲線
表 26B -HLA-B7異型接合供體中HLA-B7
-及CD8
+細胞%之劑量反應曲線
表 27A -HLA-B8同型接合供體中HLA-B8
-及CD8
+細胞%之劑量反應曲線
表 27B -HLA-B8異型接合供體中HLA-B8
-及CD8
+細胞%之劑量反應曲線
實例 13 ： HLA-B 人類指導物之脫靶分析
| 指導物 | G034206 | G034207 | G034208 | |||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | |||
| 5.83 | 89.65 | 0.13 | 2 | 85.47 | 1.44 | 2 | 96.39 | 0.17 | 2 | |||
| 1.46 | 84.24 | 1.87 | 2 | 82.77 | 0.01 | 2 | 95.17 | 0.13 | 2 | |||
| 0.36 | 45.40 | 2.73 | 2 | 43.17 | 0.74 | 2 | 63.27 | 2.40 | 2 | |||
| 0.09 | 1.83 | 0.42 | 2 | 2.40 | 0.08 | 2 | 2.95 | 0.49 | 2 | |||
| 0.02 | 0.43 | 0.10 | 2 | 0.46 | 0.06 | 2 | 0.53 | 0.19 | 2 | |||
| 0.005 | 0.52 | 0.18 | 2 | 0.52 | 0.32 | 2 | 0.50 | 0.43 | 2 | |||
| 0.001 | 0.48 | 0.15 | 2 | 0.39 | 0.11 | 2 | 0.37 | 0.23 | 2 | |||
| 0 | 0.43 | 0.02 | 2 | 0.30 | 0.06 | 2 | 0.49 | 0.23 | 2 | |||
| 指導物 | G034209 | G034210 | G034211 | |||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | |||
| 5.83 | 97.30 | 0.42 | 2 | 78.29 | 1.00 | 2 | 86.19 | 2.25 | 2 | |||
| 1.46 | 97.60 | 0.01 | 2 | 69.27 | 0.65 | 2 | 86.42 | 1.47 | 2 | |||
| 0.36 | 79.96 | 0.37 | 2 | 22.22 | 3.06 | 2 | 77.08 | 1.28 | 2 | |||
| 0.09 | 6.58 | 0.50 | 2 | 1.10 | 0.13 | 2 | 17.57 | 2.56 | 2 | |||
| 0.02 | 0.68 | 0.08 | 2 | 0.92 | 0.13 | 2 | 1.21 | 0.06 | 2 | |||
| 0.005 | 0.64 | 0.01 | 2 | 0.70 | 0.06 | 2 | 0.63 | 0.29 | 2 | |||
| 0.001 | 0.29 | 0.02 | 2 | 0.31 | 0.20 | 2 | 0.24 | 0.15 | 2 | |||
| 0 | 0.46 | 0.06 | 2 | 0.45 | 0.18 | 2 | 0.70 | 0.04 | 2 | |||
| 指導物 | G034206 | G034207 | G034208 | |||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | |||
| 5.83 | 96.82 | 0.08 | 2 | 95.45 | 0.01 | 2 | 99.55 | 0.07 | 2 | |||
| 1.46 | 92.36 | 1.27 | 2 | 92.25 | 0.88 | 2 | 98.53 | 0.32 | 2 | |||
| 0.36 | 41.46 | 0.18 | 2 | 51.70 | 1.21 | 2 | 62.67 | 4.94 | 2 | |||
| 0.09 | 2.02 | 0.45 | 2 | 2.06 | 0.37 | 2 | 4.28 | 0.81 | 2 | |||
| 0.02 | 0.20 | 0.06 | 2 | 0.15 | 0.02 | 2 | 0.35 | 0.04 | 2 | |||
| 0.005 | 0.13 | 0.08 | 2 | 0.11 | 0.01 | 2 | 0.14 | 0.02 | 2 | |||
| 0.001 | 0.18 | 0.01 | 2 | 0.18 | 0.03 | 2 | 0.15 | 0.08 | 2 | |||
| 0 | 0.11 | 0.01 | 2 | 0.21 | 0.08 | 2 | 0.17 | 0.01 | 2 | |||
| 指導物 | G034209 | G034210 | G034211 | |||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | |||
| 5.83 | 99.84 | 0.01 | 2 | 94.04 | 0.43 | 2 | 93.08 | 0.25 | 2 | |||
| 1.46 | 99.52 | 0.04 | 2 | 83.31 | 0.78 | 2 | 91.28 | 0.13 | 2 | |||
| 0.36 | 78.88 | 3.32 | 2 | 24.51 | 0.30 | 2 | 83.39 | 1.46 | 2 | |||
| 0.09 | 7.19 | 1.50 | 2 | 1.46 | 0.05 | 2 | 18.89 | 1.68 | 2 | |||
| 0.02 | 0.28 | 0.11 | 2 | 0.30 | 0.14 | 2 | 1.32 | 0.86 | 2 | |||
| 0.005 | 0.23 | 0.03 | 2 | 0.27 | 0.01 | 2 | 0.21 | 0.00 | 2 | |||
| 0.001 | 0.14 | 0.07 | 2 | 0.24 | 0.02 | 2 | 0.18 | 0.01 | 2 | |||
| 0 | 0.17 | 0.05 | 2 | 0.22 | 0.06 | 2 | 0.18 | 0.06 | 2 | |||
| 指導物 | G034206 | G034207 | G034208 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5.83 | 84.88 | 1.32 | 2 | 80.95 | 0.42 | 2 | 92.87 | 0.18 | 2 | ||||
| 1.46 | 71.55 | 2.94 | 2 | 67.64 | 1.03 | 2 | 83.77 | 1.66 | 2 | ||||
| 0.36 | 29.04 | 3.68 | 2 | 22.14 | 2.69 | 2 | 31.88 | 0.41 | 2 | ||||
| 0.09 | 0.29 | 0.10 | 2 | 0.21 | 0.06 | 2 | 0.40 | 0.04 | 2 | ||||
| 0.02 | 0.01 | 0.00 | 2 | 0.01 | 0.01 | 2 | 0.00 | 0.00 | 2 | ||||
| 0.005 | 0.01 | 0.01 | 2 | 0.02 | 0.03 | 2 | 0.02 | 0.02 | 2 | ||||
| 0.001 | 0.01 | 0.01 | 2 | 0.00 | 0.00 | 2 | 0.00 | 0.00 | 2 | ||||
| 0 | 0.01 | 0.00 | 2 | 0.00 | 0.00 | 2 | 0.05 | 0.01 | 2 | ||||
| 指導物 | G034209 | G034210 | G034211 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5.83 | 96.75 | 0.34 | 2 | 57.29 | 4.96 | 2 | 82.85 | 0.35 | 2 | ||||
| 1.46 | 93.01 | 0.52 | 2 | 38.65 | 0.18 | 2 | 79.35 | 0.54 | 2 | ||||
| 0.36 | 53.42 | 3.96 | 2 | 5.28 | 0.22 | 2 | 64.19 | 0.30 | 2 | ||||
| 0.09 | 1.17 | 0.16 | 2 | 0.04 | 0.01 | 2 | 6.25 | 0.87 | 2 | ||||
| 0.02 | 0.03 | 0.01 | 2 | 0.02 | 0.01 | 2 | 0.09 | 0.07 | 2 | ||||
| 0.005 | 0.01 | 0.01 | 2 | 0.02 | 0.03 | 2 | 0.02 | 0.01 | 2 | ||||
| 0.001 | 0.00 | 0.00 | 2 | 0.01 | 0.00 | 2 | 0.02 | 0.01 | 2 | ||||
| 0 | 0.00 | 0.00 | 2 | 0.00 | 0.00 | 2 | 0.01 | 0.01 | 2 | ||||
| 指導物 | G034206 | G034207 | G034208 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5.83 | 97.98 | 0.23 | 2 | 96.75 | 0.55 | 2 | 99.44 | 0.18 | 2 | ||||
| 1.46 | 94.16 | 0.66 | 2 | 92.78 | 0.26 | 2 | 98.16 | 0.11 | 2 | ||||
| 0.36 | 49.19 | 1.39 | 2 | 52.56 | 0.23 | 2 | 64.63 | 0.85 | 2 | ||||
| 0.09 | 3.25 | 0.48 | 2 | 1.89 | 0.11 | 2 | 5.70 | 0.64 | 2 | ||||
| 0.02 | 0.19 | 0.04 | 2 | 0.02 | 0.00 | 2 | 0.24 | 0.14 | 2 | ||||
| 0.005 | 0.11 | 0.06 | 2 | 0.04 | 0.01 | 2 | 0.07 | 0.07 | 2 | ||||
| 0.001 | 0.07 | 0.04 | 2 | 0.10 | 0.02 | 2 | 0.12 | 0.00 | 2 | ||||
| 0 | 0.14 | 0.01 | 2 | 0.17 | 0.11 | 2 | 0.16 | 0.05 | 2 | ||||
| 指導物 | G034209 | G034210 | G034211 | ||||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | 平均CD8 + 細胞% | SD CD8 + 細胞% | N | ||||
| 5.83 | 99.66 | 0.11 | 2 | 88.96 | 0.16 | 2 | 92.88 | 0.25 | 2 | ||||
| 1.46 | 99.31 | 0.04 | 2 | 72.50 | 0.57 | 2 | 91.49 | 0.72 | 2 | ||||
| 0.36 | 80.98 | 0.74 | 2 | 19.39 | 1.07 | 2 | 82.62 | 0.29 | 2 | ||||
| 0.09 | 10.34 | 0.35 | 2 | 1.59 | 0.06 | 2 | 24.49 | 0.51 | 2 | ||||
| 0.02 | 0.79 | 0.52 | 2 | 0.14 | 0.03 | 2 | 0.74 | 0.07 | 2 | ||||
| 0.005 | 0.13 | 0.13 | 2 | 0.14 | 0.01 | 2 | 0.13 | 0.05 | 2 | ||||
| 0.001 | 0.11 | 0.06 | 2 | 0.11 | 0.03 | 2 | 0.10 | 0.06 | 2 | ||||
| 0 | 0.14 | 0.01 | 2 | 0.17 | 0.11 | 2 | 0.16 | 0.05 | 2 | ||||
實施由靶向HLA-B之Cas9裂解之潛在脫靶基因體位點之篩選。(參見例如Cameron等人，
Nature Methods. 6, 600-606; 2017)。在本實驗中，使用自淋巴母細胞細胞株NA24385 (Coriell Institute)純化之基因體DNA篩選靶向人類HLA-B之6種sgRNA以及具有已知脫靶概況之靶向VEGFA之三種對照指導物。在生物化學分析中，使用濃度為192 nM sgRNA及64 nM RNP之如
表 28中所顯示之sgRNA來偵測潛在脫靶位點數。該分析鑑別出所測試sgRNA之潛在脫靶位點。
表 28. 脫靶分析
| gRNA ID | 靶 | 指導序列(SEQ ID NO:) | 脫靶位點計數 |
| G034206 | HLA-B | CAAACUCAGGACACUGAGCUUGUG (SEQ ID NO: 163) | 1 |
| G034207 | HLA-B | UCAGGACACUGAGCUUGUGGAGAC (SEQ ID NO: 164) | 1 |
| G034208 | HLA-B | UCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGAG (SEQ ID NO: 165) | 1 |
| G034209 | HLA-B | CUCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGA (SEQ ID NO: 166) | 1 |
| G034210 | HLA-B | CUGGAGGGUGUGAGACCCUGGCCC (SEQ ID NO: 169) | 3 |
| G034211 | HLA-B | UCCCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCA (SEQ ID NO: 177) | 2 |
| G021557 | VEGFA | GCAUGGGCAGGGGCUGGGGUGCAC (SEQ ID NO: 610) | 2 |
| G021558 | VEGFA | GAAUGGCAGGCGGAGGUUGUACUG (SEQ ID NO: 611) | 1 |
| G021567 | VEGFA | GUGAGCAGGCACCUGUGCCAACAU (SEQ ID NO: 612) | 1 |
在已知脫靶偵測分析(例如上文所用之生物化學方法)中，通常藉由設計恢復大量潛在脫靶位點，以「撒開大網」用於可在其他情況下(例如在所關注原代細胞中)驗證之潛在位點。舉例而言，生物化學方法通常誇張潛在脫靶位點之數量，此乃因該分析利用無細胞環境之經純化之高分子量基因體DNA且依賴於所用Cas9 RNP之劑量。因此，藉由該等方法鑑別之潛在脫靶位點可使用經鑑別之潛在脫靶位點之靶向測序來驗證。
實例 14 ：小鼠模型中經工程改造之 T 細胞之 活體內 NK 細胞殺傷
向雌性NOG-hIL-15小鼠植入1.5×10
6個原代NK細胞。在4週後注射含有螢光素酶且根據
表 29(B2M/HLA-A/HLA-B/TRAC/CIITA KO之不同組合)編輯之經工程改造T細胞以評價對經工程改造T細胞之免於NK細胞殺傷之保護。
14.1. 含有螢光素酶 +/-B2M/HLA-A/HLA-B/TRAC/CIITA KO 及 HD1 TCR 之 T 細胞之製備
在第0天時，在解凍後，將Pan CD3+ T細胞(StemCell, HLA-A*02:01: 01 A*11:01:01；B*08:01:01；C*07:01:01) 以1-1.5 × 10
6個細胞/mL之密度平鋪於T細胞TCAM培養基中，該等培養基由含有2.5% (v/v)人類AB血清、1% (v/v) Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)及1% (v/v) 10 1M HEPES緩衝液(Gibco，目錄號15630080)、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)構成，且補充有200 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)。
在第1天時，用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。
在第2天時，用慢病毒 - LV-SFFV-Luc2-P2A-EmGFP轉導細胞以0.5之MOI表現GFP/螢火蟲螢光素酶(Imanis，目錄號LV050L)。此係藉由將T細胞以500 × g離心5分鐘、將其以2E6個細胞/mL重懸並將其轉移至無菌1.5 mL Eppendorf管實施，使得每管接受0.5 mL中之1E6個細胞。將100 µL LV-SFFV-Luc2-P2A-EmGFP (Imanis，目錄號LV050L)添加至每管中且藉由將管在37℃下以1000 × g離心60分鐘實施轉導。離心後，將細胞合併且轉移回細胞培養瓶並在37℃培育器中靜置過夜。
在第3天時，如
表 29中所述，用LNP編輯T細胞以破壞HLA-A或CIITA基因。簡言之，如
實例 1中所述調配BC22 mRNA、UGI mRNA及靶向HLA-A之sgRNA G028918中之每一者或靶向CIITA之sgRNA G026584的LNP。將LNP組成物在TCAM中與如上文所述補充有20 µg/mL重組人類ApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之細胞介素一起培育。將等體積之LNP混合物添加至100萬個活化T細胞中以產生0.266 µg總LNP/mL (對於HLA-A LNP)及0.34 µg總LNP/mL (對於CIITA LNP)之最終濃度。
表 29- 依序編輯及病毒轉導之順序
| 條件 | 第3 天 | 第4 天 | 第8 天 |
| 未經編輯 | |||
| B2M+CIITA KO | CIITA LNP | B2M LNP | TRAC LNP |
| HLA-A+CIITA | HLA-A LNP、CIITA LNP | TRAC LNP | |
| HLA-B+CIITA | CIITA LNP | HLA-B LNP | TRAC LNP |
| HLA-A+HLA-B+CIITA | HLA-A LNP、CIITA LNP | TRAC LNP |
在第4天時，對每組之T細胞計數，以2 × 10
6個細胞/mL再平鋪且用LNP組成物編輯以破壞HLA-B或B2M基因(注明於表29之第4天行中)。此係使用與Nme2 BC22n mRNA及靶向HLA-B基因之sgRNA G032795或Spy Cas9 mRNA及靶向B2M基因之sgRNA G000529共調配之LNP實施。將LNP組成物在TCAM中與如上文所述補充有5 µg/mL重組人類ApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之細胞介素一起培育。將等於細胞體積之體積添加至含有約200萬個細胞之每孔中以產生1.25 µg總LNP/mL (對於HLA-B LNP)及2.5 µg總LNP/mL (對於B2M LNP)之最終濃度。
在第5天時，將所有細胞轉移至GREX板(Wilson Wolf，目錄號80240M)以使用TCAM培養基擴增，該等培養基由含有2.5% (v/v)人類AB血清、1% (v/v) Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)及1% (v/v) 10 1M HEPES緩衝液(Gibco，目錄號15630080)、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)構成，且補充有100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)。
在第7天時，在GFP+群體上分選每一T細胞組，且將細胞放回TCAM培養基中之培養物中，該等培養基由含有2.5% (v/v)人類AB血清、1% (v/v) Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)及1% (v/v) 10 1M HEPES緩衝液(Gibco，目錄號15630080)、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)構成，且補充有100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200至15)。
在第8天時，用 TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化分選之細胞，且用LNP調配物編輯以破壞TRAC基因。簡言之，如
實例 1中所述調配每一Nme2 BC22 mRNA (mRNA100418)、UGI mRNA (mRNA100032)及靶向TRAC之sgRNA G028939之LNP。將LNP組成物在TCAM中與如上文所述補充有20 µg/mL重組人類ApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之細胞介素一起培育。將等體積之LNP混合物添加至100萬個活化T細胞中以產生0.209 µg總LNP/mL (對於TRAC LNP)之最終濃度。
在第10天時，將所有細胞轉移至GREX板(Wilson Wolf，目錄號80240M)以使用TCAM培養基擴增，該等培養基由含有2.5% (v/v)人類AB血清、1% (v/v) Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)及1% (v/v) 10 1M HEPES緩衝液(Gibco，目錄號15630080)、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)構成，且補充有100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)。
在第12天及第14天時，將GREX孔之一半培養基更換為補充有細胞介素之新鮮TCEM。
在第17天時，藉由流式細胞術抗體對細胞之等份試樣染色以確定HLA-A2表現(HLA-A+)、HLA-B8表現(HLA-B8+)、敲除B2M後之I類HLA表現(MHC I+)、敲除CIITA後之II類HLA表現(MHC II+)及敲除TRAC後之CD3表現。將T細胞與靶向以下分子之抗體混合劑一起培育：HLA-A2 (B eBioscience，目錄號17-9876-42)、HLA-B8 (Miltenyi Biotec，目錄號130-118- 960)、CD3 (Biolegend，目錄號317334)、CD4 (Biolegend，目錄號300536)、CD8 (Biolegend，目錄號344740)、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ (II類HLA) (Biolegend，目錄號361712)、HLA-E (Biolegend，目錄號342612)及ViaKrome 808可固定活力染料(Beckman Coulter，目錄號C36628)。隨後將細胞洗滌，在Cytoflex LX儀器(Beckman Coulter)上使用FlowJo軟體包分析。使用CSB (幹細胞，100-0237)及CS10 (幹細胞，7930)之1:1稀釋物將剩餘細胞冷凍用於後續小鼠中之T細胞注射。
14.2. HLA-A 及 / 或 HLA-B 與 CIITA 敲除之 T 細胞顯示大於 B2M/CIITA KO T 細胞之免於 NK 殺傷之保護
藉由此項技術中已知之方法自leukopak分離NK細胞，用HBSS (Gibco，目錄號14025-092)洗滌且以10×10
6個細胞/mL重懸浮於150 µL HBSS中用於注射。藉由尾靜脈注射向30隻雌性NOG-hIL-15小鼠(Taconic)投用1.5 × 10
6個經分離之NK細胞。額外25隻雌性NOG-hIL-15充當NK非注射對照。
在NK細胞注射後27天，向小鼠注射如
表 29中所述之未經編輯或工程改造之T細胞。簡言之，在PBS中洗滌且以6.0 × 10
6個細胞/150 µL之濃度重懸浮於HBSS溶液中後，在第一次活化後16天注射經工程改造之T細胞。
實施活小鼠之IVIS成像以藉由IVIS光譜鑑別螢光素酶陽性T細胞。IVIS成像係在T細胞注射後24小時、7天、14天、16天、19天、22天、26天、29天、33天、36天、43天、49天及61天時進行。根據製造商之建議，用10 µL/g體重i.p.注射D-螢光素(約150 µL/動物)製備小鼠用於成像。將動物麻醉且然後置於IVIS成像單元中。實施可視化，其中曝光時間設定為自動，視野D，中等合併及F/光闌設定為1。
表 30及
圖 11顯示在注射後之不同時間點存在之表現螢光素酶之T細胞之總通量(光子/s)。在活體內，B2M編輯之細胞顯示對NK殺傷之敏感性，而HLA-A、HLA-B、TRAC及CIITA編輯之細胞(如表29中所顯示)顯示免於NK介導之溶解之保護。
表 30 - 在 T 細胞注射後之多個間隔，經處理小鼠中表現螢光素酶之 T 細胞之總通量 ( 光子 /s) 。
實例 15 ：小鼠模型中經工程改造之 T 細胞之 活體內 NK 細胞殺傷
| 組 | T 細胞注射後之天數 | 無NK 注射 | NK 注射 | ||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
| TRAC KO | 1 | 1.03E+08 | 1.70E+07 | 4 | 7.70E+07 | 1.04E+07 | 5 |
| 7 | 2.15E+08 | 1.36E+07 | 4 | 1.57E+08 | 2.85E+07 | 5 | |
| 14 | 2.66E+08 | 4.04E+07 | 4 | 3.01E+08 | 5.64E+07 | 5 | |
| 16 | 3.27E+08 | 4.84E+07 | 4 | 1.69E+08 | 4.40E+07 | 5 | |
| 19 | 2.57E+08 | 5.99E+07 | 4 | 2.22E+08 | 7.06E+07 | 5 | |
| 22 | 2.74E+08 | 3.40E+07 | 4 | 2.38E+08 | 1.19E+08 | 5 | |
| 26 | 2.33E+08 | 3.74E+07 | 4 | 2.45E+08 | 1.45E+08 | 5 | |
| 29 | 2.39E+08 | 5.41E+07 | 4 | 2.70E+08 | 1.46E+08 | 5 | |
| 33 | 1.85E+08 | 4.72E+07 | 4 | 2.42E+08 | 1.47E+08 | 5 | |
| 36 | 1.62E+08 | 1.71E+07 | 4 | 2.67E+08 | 1.51E+08 | 5 | |
| 43 | 2.05E+08 | 6.97E+07 | 4 | 3.45E+08 | 2.75E+08 | 5 | |
| 49 | 2.62E+08 | 1.85E+08 | 4 | 4.34E+08 | 3.66E+08 | 5 | |
| 61 | 2.07E+08 | 1.80E+08 | 4 | 2.63E+09 | 3.35E+09 | 5 | |
| B2M | 1 | 7.23E+07 | 1.05E+07 | 4 | 7.14E+06 | 1.44E+06 | 5 |
| 7 | 8.40E+07 | 1.00E+07 | 4 | 5.57E+06 | 7.80E+05 | 5 | |
| 14 | 1.07E+08 | 1.65E+07 | 4 | 4.06E+06 | 6.93E+05 | 5 | |
| 16 | 8.41E+07 | 2.04E+07 | 4 | 4.05E+06 | 5.02E+05 | 5 | |
| 19 | 1.38E+08 | 3.78E+07 | 4 | 2.96E+06 | 2.46E+05 | 5 | |
| 22 | 6.59E+07 | 1.77E+07 | 4 | 3.38E+06 | 4.43E+05 | 5 | |
| 26 | 5.09E+07 | 2.33E+07 | 4 | 3.26E+06 | 4.57E+05 | 5 | |
| 29 | 5.20E+07 | 1.76E+07 | 4 | 3.11E+06 | 5.11E+05 | 5 | |
| 33 | 4.86E+07 | 1.75E+07 | 4 | 2.65E+06 | 2.23E+05 | 5 | |
| 36 | 3.13E+07 | 7.28E+06 | 4 | 2.64E+06 | 2.87E+05 | 5 | |
| 43 | 3.96E+07 | 1.47E+07 | 4 | 2.10E+06 | 2.80E+05 | 5 | |
| 49 | 3.56E+07 | 3.23E+06 | 4 | 2.18E+06 | 2.29E+05 | 5 | |
| 61 | 1.94E+07 | 3.89E+06 | 4 | 1.86E+06 | 2.74E+05 | 5 | |
| HLA-A | 1 | 5.93E+07 | 5.19E+06 | 4 | 5.92E+07 | 1.01E+07 | 5 |
| 7 | 1.99E+08 | 2.97E+07 | 4 | 1.80E+08 | 4.31E+07 | 5 | |
| 14 | 3.23E+08 | 8.66E+07 | 4 | 3.01E+08 | 9.32E+07 | 5 | |
| 16 | 3.05E+08 | 9.72E+07 | 4 | 3.13E+08 | 8.01E+07 | 5 | |
| 19 | 1.88E+08 | 3.55E+07 | 4 | 3.41E+08 | 1.10E+08 | 5 | |
| 22 | 2.75E+08 | 2.41E+07 | 4 | 4.14E+08 | 1.68E+08 | 5 | |
| 26 | 1.89E+08 | 3.99E+07 | 4 | 3.24E+08 | 1.40E+08 | 5 | |
| 29 | 1.67E+08 | 4.29E+07 | 4 | 3.60E+08 | 1.65E+08 | 5 | |
| 33 | 1.67E+08 | 4.25E+07 | 4 | 3.03E+08 | 1.59E+08 | 5 | |
| 36 | 1.91E+08 | 5.23E+07 | 4 | 2.63E+08 | 1.43E+08 | 5 | |
| 43 | 1.17E+08 | 2.24E+07 | 4 | 2.62E+08 | 1.50E+08 | 5 | |
| 49 | 6.79E+07 | 1.14E+07 | 4 | 2.64E+08 | 1.27E+08 | 5 | |
| 61 | 6.99E+07 | 2.02E+07 | 4 | 4.09E+08 | 2.92E+08 | 5 | |
| HLA-B | 1 | 7.56E+07 | 4.17E+07 | 4 | 6.13E+07 | 8.43E+06 | 5 |
| 7 | 1.81E+08 | 1.85E+07 | 4 | 8.47E+07 | 1.53E+07 | 5 | |
| 14 | 1.04E+08 | 9.88E+06 | 4 | 9.54E+07 | 8.16E+06 | 5 | |
| 16 | 9.11E+07 | 5.68E+06 | 4 | 1.01E+08 | 2.80E+07 | 5 | |
| 19 | 1.90E+08 | 2.08E+07 | 4 | 7.30E+07 | 1.48E+07 | 5 | |
| 22 | 9.67E+07 | 3.17E+06 | 4 | 1.00E+08 | 2.37E+07 | 5 | |
| 26 | 1.08E+08 | 2.21E+07 | 4 | 7.96E+07 | 2.17E+07 | 5 | |
| 29 | 7.63E+07 | 1.59E+07 | 4 | 5.30E+07 | 8.34E+06 | 5 | |
| 33 | 5.77E+07 | 1.32E+07 | 4 | 7.60E+07 | 2.91E+07 | 5 | |
| 36 | 5.23E+07 | 9.16E+06 | 4 | 7.50E+07 | 3.48E+07 | 5 | |
| 43 | 5.72E+07 | 8.07E+06 | 4 | 8.64E+07 | 4.06E+07 | 5 | |
| 49 | 7.81E+07 | 3.27E+07 | 4 | 6.60E+07 | 3.65E+07 | 5 | |
| 61 | 4.10E+07 | 7.65E+06 | 4 | 6.60E+07 | 4.21E+07 | 5 | |
| HLA-AB | 1 | 6.89E+07 | 5.43E+06 | 4 | 8.32E+07 | 6.69E+06 | 5 |
| 7 | 8.96E+07 | 8.11E+06 | 4 | 1.53E+08 | 1.17E+08 | 5 | |
| 14 | 1.13E+08 | 1.06E+07 | 4 | 4.65E+08 | 6.03E+08 | 5 | |
| 16 | 7.28E+07 | 1.70E+07 | 4 | 6.94E+08 | 9.88E+08 | 5 | |
| 19 | 9.11E+07 | 2.35E+07 | 4 | 1.27E+09 | 2.15E+09 | 5 | |
| 22 | 1.20E+08 | 5.52E+07 | 4 | 2.58E+09 | 4.72E+09 | 5 | |
| 26 | 9.65E+07 | 5.94E+07 | 4 | 2.95E+09 | 5.40E+09 | 5 | |
| 29 | 8.27E+07 | 5.16E+07 | 4 | 3.10E+09 | 5.72E+09 | 5 | |
| 33 | 5.52E+07 | 3.10E+07 | 4 | 1.66E+08 | 1.11E+08 | 5 | |
| 36 | 7.34E+07 | 8.04E+07 | 4 | 1.47E+08 | 9.66E+07 | 5 | |
| 43 | 1.55E+08 | 2.13E+08 | 4 | 1.60E+08 | 9.99E+07 | 5 | |
| 49 | 2.02E+08 | 3.05E+08 | 4 | 1.29E+08 | 5.71E+07 | 5 | |
| 61 | 1.53E+09 | 2.56E+09 | 4 | 3.08E+08 | 3.14E+08 | 5 | |
| 僅NK | 1 | 8.88E+05 | 8.15E+04 | 5 | |||
| 7 | 9.56E+05 | 4.69E+04 | 5 | ||||
| 14 | 1.03E+06 | 9.95E+04 | 5 | ||||
| 16 | 1.28E+06 | 1.22E+05 | 5 | ||||
| 19 | 1.06E+06 | 5.24E+04 | 5 | ||||
| 22 | 1.38E+06 | 1.30E+05 | 5 | ||||
| 26 | 1.24E+06 | 1.03E+05 | 5 | ||||
| 29 | 1.14E+06 | 1.48E+05 | 5 | ||||
| 33 | 1.32E+06 | 1.81E+05 | 5 | ||||
| 36 | 1.24E+06 | 8.79E+04 | 5 | ||||
| 43 | 1.17E+06 | 9.95E+04 | 5 | ||||
| 49 | 1.25E+06 | 1.65E+05 | 5 | ||||
| 61 | 9.40E+05 | 3.32E+04 | 5 | ||||
| HBSS | 1 | 9.41E+05 | 7.08E+04 | 5 | |||
| 7 | 9.77E+05 | 9.09E+04 | 5 | ||||
| 14 | 8.80E+05 | 4.23E+04 | 5 | ||||
| 16 | 1.15E+06 | 7.44E+04 | 5 | ||||
| 19 | 8.56E+05 | 1.00E+05 | 5 | ||||
| 22 | 1.19E+06 | 2.02E+05 | 5 | ||||
| 26 | 1.19E+06 | 9.09E+04 | 5 | ||||
| 29 | 9.74E+05 | 8.72E+04 | 5 | ||||
| 33 | 1.07E+06 | 6.09E+04 | 5 | ||||
| 36 | 1.10E+06 | 8.36E+04 | 5 | ||||
| 43 | 9.89E+05 | 5.35E+04 | 5 | ||||
| 49 | 1.12E+06 | 1.46E+05 | 5 | ||||
| 61 | 9.24E+05 | 7.21E+04 | 5 |
向雌性NOG-hIL-15小鼠植入1.5 × 10
6個原代NK細胞。在4週後注射含有螢光素酶且根據
表 29(HLA-A/HLA-B/TRAC/CIITA KO之不同組合)編輯之經工程改造T細胞以評價對經工程改造T細胞之免於NK細胞殺傷之保護。
15.1. 含有螢光素酶 +/-B2M/HLA-A/HLA-B/TRAC/CIITA KO 及 HD1 TCR 之 T 細胞之製備
如實例14.1中製備T細胞，只是在第4天時，用與靶向HLA-B基因之Spy Cas9 mRNA gRNA G027994共調配之LNP實施編輯。
15.2. HLA-A 及 / 或 HLA-B 與 CIITA 敲除之 T 細胞顯示大於 B2M/CIITA KO T 細胞之免於 NK 殺傷之保護
如實例14.2中製備NK細胞及小鼠。
實施活小鼠之IVIS成像以藉由IVIS光譜鑑別螢光素酶陽性T細胞。IVIS成像係在T細胞注射後24小時、7天、14天、16天、19天、22天、26天、29天、33天、36天及40天時進行。如實例14.2中製備小鼠用於成像。
表 31及
圖 12顯示在注射後之不同時間點存在之表現螢光素酶之T細胞之總通量(光子/s)。在活體內，B2M編輯之細胞顯示對NK殺傷之敏感性，而HLA-A、HLA-B、TRAC及CIITA編輯之細胞(如表29中所顯示)顯示免於NK介導之溶解之保護。
表 31 -在T細胞注射後之所指示天數，經處理小鼠中表現螢光素酶之T細胞之總通量(光子/s)。
實例 16 ：具有雙重 / 三重敲除 (KO) 編輯並表現抗 CD30 CAR-T 之 T 細胞之功能分析16.1. 工程改造T細胞
| 組 | 天數 | 無NK 注射 | NK 注射 | ||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
| TRAC KO | 1 | 60237500 | 19287091 | 4 | 78610000 | 5481726 | 5 |
| 5 | 79142500 | 21375333 | 4 | 42522000 | 7716803 | 5 | |
| 8 | 48687500 | 4504023 | 4 | 50922000 | 5762317 | 5 | |
| 18 | 28987500 | 7896542 | 4 | 59024000 | 19425221 | 5 | |
| 22 | 38695000 | 11931246 | 4 | 69482000 | 23737977 | 5 | |
| 26 | 62917500 | 12062851 | 4 | 54070000 | 21862370 | 5 | |
| 29 | 59235000 | 17354556 | 4 | 1.05E+08 | 51444384 | 5 | |
| 33 | 70220000 | 18308445 | 4 | 81094000 | 30428047 | 5 | |
| 36 | 38415000 | 10687349 | 4 | 1.06E+08 | 50005246 | 5 | |
| 40 | 40777500 | 8983302 | 4 | 1.66E+08 | 1.14E+08 | 5 | |
| B2M | 1 | 61697500 | 3710178 | 4 | 4625200 | 1017123 | 5 |
| 5 | 40126000 | 7705511 | 4 | 2337400 | 244229.9 | 5 | |
| 8 | 66758000 | 14162942 | 4 | 2650600 | 417803.6 | 5 | |
| 18 | 44676000 | 16960004 | 4 | 2997800 | 477095.1 | 5 | |
| 22 | 56008000 | 25277849 | 4 | 2953600 | 344565 | 5 | |
| 26 | 71536000 | 36732385 | 4 | 2469720 | 916718.8 | 5 | |
| 29 | 64236000 | 29804451 | 4 | 3688200 | 846342.1 | 5 | |
| 33 | 64786000 | 33498350 | 4 | 2378200 | 408716.7 | 5 | |
| 36 | 70582000 | 38523286 | 4 | 2803200 | 512631 | 5 | |
| 40 | 59696000 | 33547829 | 4 | 2952000 | 459698.6 | 5 | |
| HLA-A | 1 | 1.03E+08 | 18126125 | 4 | 72340000 | 10886537 | 5 |
| 5 | 67105000 | 14635427 | 4 | 47038000 | 4848218 | 5 | |
| 8 | 68767500 | 7969433 | 4 | 40606000 | 10750222 | 5 | |
| 18 | 38107500 | 9255540 | 4 | 96062000 | 25313313 | 5 | |
| 22 | 56917500 | 7445550 | 4 | 1.1E+08 | 60299107 | 5 | |
| 26 | 44572500 | 8581807 | 4 | 2.89E+08 | 1.86E+08 | 5 | |
| 29 | 60602500 | 18917399 | 4 | 5.74E+08 | 5.45E+08 | 5 | |
| 33 | 83882500 | 30944594 | 4 | 6.68E+08 | 6.13E+08 | 5 | |
| 36 | 75797500 | 29148427 | 4 | 1.42E+09 | 1.44E+09 | 5 | |
| 40 | 1.09E+08 | 61468496 | 4 | 1.7E+09 | 1.83E+09 | 5 | |
| HLA-B | 1 | 75120000 | 13263039 | 4 | 95964000 | 11361716 | 5 |
| 5 | 1.14E+08 | 2656478 | 4 | 54178000 | 11174948 | 5 | |
| 8 | 1.53E+08 | 30114147 | 4 | 86706000 | 15060945 | 5 | |
| 18 | 1.12E+08 | 19480373 | 4 | 70712000 | 17193704 | 5 | |
| 22 | 1.29E+08 | 23319638 | 4 | 1.31E+08 | 28386687 | 5 | |
| 26 | 2.18E+08 | 1.76E+08 | 4 | 1.02E+08 | 36123989 | 5 | |
| 29 | 3.19E+08 | 4.79E+08 | 4 | 1.79E+08 | 1.28E+08 | 5 | |
| 33 | 4.15E+08 | 6.04E+08 | 4 | 3.96E+08 | 4.33E+08 | 5 | |
| 36 | 5.16E+08 | 7.64E+08 | 4 | 6.5E+08 | 7.98E+08 | 5 | |
| 40 | 8.16E+08 | 1.3E+09 | 4 | 1.2E+09 | 1.63E+09 | 5 | |
| HLA-AB | 1 | 54503800 | 31113691 | 4 | 40374000 | 5322889 | 5 |
| 5 | 79315000 | 10423954 | 4 | 41694000 | 7467100 | 5 | |
| 8 | 79832500 | 12777999 | 4 | 34938000 | 8491715 | 5 | |
| 18 | 55077500 | 14565978 | 4 | 64404000 | 21336274 | 5 | |
| 22 | 46923250 | 33468493 | 4 | 43546000 | 16951128 | 5 | |
| 26 | 52755000 | 25167748 | 4 | 54498000 | 15582203 | 5 | |
| 29 | 66772500 | 37915812 | 4 | 51224000 | 14570855 | 5 | |
| 33 | 64415000 | 41401597 | 4 | 54594000 | 25814216 | 5 | |
| 36 | 52932500 | 30505738 | 4 | 52580000 | 16331823 | 5 | |
| 40 | 56737500 | 39401755 | 4 | 61682000 | 21887079 | 5 | |
| 僅NK | 1 | 1659800 | 144107.5 | 5 | |||
| 5 | 1252000 | 143766 | 5 | ||||
| 8 | 1468667 | 21746.01 | 5 | ||||
| 18 | 1321667 | 85253.87 | 5 | ||||
| 22 | 1393333 | 114106.2 | 5 | ||||
| 26 | 1329000 | 97857.04 | 5 | ||||
| 29 | 1786000 | 227694.2 | 5 | ||||
| 33 | 1290667 | 190931.6 | 5 | ||||
| 36 | 1475000 | 197293.4 | 5 | ||||
| 40 | 1505333 | 81667.35 | 5 | ||||
| HBSS | 1 | 1335000 | 150939.7 | 5 | |||
| 5 | 1086560 | 154003 | 5 | ||||
| 8 | 1116000 | 43446.52 | 5 | ||||
| 18 | 1023540 | 60430.84 | 5 | ||||
| 22 | 1214800 | 96373.03 | 5 | ||||
| 26 | 1295000 | 109750.6 | 5 | ||||
| 29 | 1145520 | 120455 | 5 | ||||
| 33 | 1211400 | 60546.18 | 5 | ||||
| 36 | 1319200 | 85889.23 | 5 | ||||
| 40 | 1357000 | 112189.1 | 5 |
解凍(第0天)後，將CD4+ CD8+ T細胞(Cellex)以1:1 之比率以約1.2 × 10
6個細胞/mL之密度平鋪於T細胞活化培養基(TCAM)中，該等培養基由含有CTS補充物、2.5% (v/v)人類AB血清(Valley Biomedical, HP1022HI)、1× Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)以及200 IU/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之重組人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之重組人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)構成。將細胞在37℃培育器中培育過夜。
在解凍後24小時(第1天)，對細胞計數且以1 × 10
6個細胞/mL重懸浮於TCAM中。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化細胞。
如
表 32中所述編輯不同之T細胞組。簡言之，LNP組成物含有1) Nme2 BC22 mRNA及2)靶向HLA-A之sgRNA G034202；或靶向CIITA之sgRNA G034201；或靶向TRAC之sgRNA G025420；或靶向HLA-B之sgRNA G034209。單獨調配UGI mRNA LNP。參見闡述LNP調配物之
實例 1。
表 32- 編輯方案及病毒轉導
| 條件 | 第0 天 | 第1 天 | 第3 天 | 第5 天 |
| CD30 CAR雙重KO | 解凍 | TransAct | Nme2 BC22 HLA-A + CIITA + Spy Cas9 TRAC + AAV | GREX 6轉移 |
| CD30 CAR三重KO | 解凍 | TransAct | Nme2 BC22 HLA-A + CIITA + HLA-B + Spy Cas9 TRAC + AAV | GREX 6轉移 |
| 未經轉導/僅TCR KO | 解凍 | TransAct | Spy Cas9 TRAC | GREX 6轉移 |
| 未經編輯 | 解凍 | TransAct | GREX 6轉移 |
在第3天時，對細胞計數且以1 × 10
6個細胞/mL重懸浮於含有如上文所述之細胞介素之TCAM中。以2×濃度製備LNP、ApoE、AAV於TCAM中之混合物，使得當將等體積之LNP混合物添加至T細胞中時，每一HLA-A sgRNA、CIITA sgRNA或HLA-B sgRNA與BC22 mRNA共調配物LNP之濃度將為1.5 µg/mL，UGI mRNA LNP之濃度將為0.2 µg/mL，TRAC sgRNA LNP之濃度將為1 µg/mL，ApoE之濃度將為10 µg/mL，AAV之濃度將為 1E5 GC/細胞，且細胞之最終密度將為0.5 × 10
6個細胞/mL。將細胞在37℃培育器中培育過夜。
在轉染後24小時(第4天)，對細胞計數且再次達到 0.5 × 10
6個細胞/mL之密度。
在轉染後48小時(第5天)，在6孔GREX (Wilson Wolf，目錄號80240M)中之T細胞擴增培養基(TCEM)中培養細胞，該等培養基由含有CTS補充物、5% (v/v)人類AB血清(Valley Biomedical, HP1022HI)、1× Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)以及200 IU/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之重組人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之重組人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)構成。將細胞培養至第9天，且定期更換培養基。
另外，T細胞亦經工程改造以破壞B2M及CIITA，以產生該兩個基因之雙重KO。
解凍(第0天)後，將 供體DR26 T細胞(Cellex) 以約1.5 × 10
6個細胞/mL之密度平鋪於T細胞活化培養基(TCAM)中，該等培養基由含有CTS補充物、2.5% (v/v)人類AB血清(Valley Biomedical, HP1022HI)、1× Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)以及200 IU/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之重組人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之重組人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)構成。將細胞在37℃培育器中靜置過夜。
如
表 33中所述編輯不同之T細胞組。簡言之，LNP組成物含有靶向B2M之sgRNA G000529 (SEQ ID NO: 993)及靶向CIITA之sgRNA G013675 (SEQ ID NO: 3118)。
表 33 - 編輯及收穫之順序
| 條件 | 第0 天 | 第1 天 | 第2 天 | 第3 天 | 第8 天 |
| B2M + CIITA | 解凍 | TransAct + CIITA | B2M | 24孔Grex轉移 | 收穫 |
| 未經編輯 | 解凍 | TransAct | 24孔Grex轉移 | 收穫 |
在解凍後24hr (第1天)，對細胞計數且以2 × 10
6個細胞/mL重懸浮於含有如上文所述之細胞介素之TCAM中。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化細胞。以2×濃度製備LNP及ApoE3於TCAM中之混合物，使得當將等體積之LNP混合物添加至T細胞中時，CIITA sgRNA調配物LNP之濃度將為1.25 µg/mL，且ApoE之濃度將為2.5 µg/mL，並且細胞密度將為1 × 10
6個細胞/mL。將細胞在37℃培育器中培育過夜。
在第2天時，對細胞計數且再次達到 1 × 10
6個細胞/mL之密度。以10×濃度製備LNP及ApoE3於TCAM之混合物，使得當將等體積之LNP混合物添加至以1 × 10
6個細胞/mL重懸之T細胞中時，B2M之濃度將為2.5 µg/mL，且ApoE3之濃度將為2.5 µg/mL。將細胞在37℃培育器中培育過夜。
24小時後(在第3天時)，在24孔GREX (Wilson Wolf，目錄號80192M)中之T細胞擴增培養基(TCEM)中培養細胞，該等培養基由含有CTS補充物、5% (v/v)人類AB血清(Valley Biomedical, HP1022HI)、1× Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈霉素之CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)以及200 IU/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL之重組人類介白素-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL之重組人類介白素-15 (Peprotech，目錄號200-15)構成。將細胞培養至第8天，定期更換培養基且在第8天時冷凍。
實例16.2. 使用表現抗CD30 CAR-T細胞之經工程改造T細胞以及雙重及三重敲除編輯之腫瘤細胞l殺傷分析
如實例16.1中所述使用抗CD30 CAR構築物及不同編輯工程改造T細胞，且測試其對表現CD30之HH及MOLT-4腫瘤細胞株之細胞毒性。將HH細胞及MOLT-4細胞解凍且在培養物中維持至少7天，然後建立殺傷分析。將CD30 CAR-T細胞及對照T-細胞自液氮移除，解凍，且在預熱的T細胞培養基中靜置過夜。第二天，藉由首先將20,000個細胞/孔之HH或MOLT-4細胞接種於96孔板中之100 µL中來建立殺傷分析。對CD30-CAR T-細胞及對照T-細胞計數，離心，且重懸浮於不含任何細胞介素之T細胞培養基中。然後以3.3之E:T比率開始將其連續稀釋3倍，且然後稀釋至5點。然後將其添加至其各別孔中之靶細胞中且保持在37℃培育器中。
將Bright-Glo™螢光素酶分析系統(Promega，目錄號E2620)在室溫下在黑暗中預解凍。將殺傷分析板自培育器取出。將50 µL Bright-Glo™螢光素酶分析系統添加至每孔中並使板在振蕩器上短暫振蕩且然後在室溫下在黑暗中培育5分鐘。然後使用CLARIOstar板讀數器讀取板之發光。根據發光計算殺傷百分比，且T細胞對腫瘤細胞比率之平均值0作為0%殺傷。HH細胞之殺傷%結果顯示於表34及圖13A中，且MOLT-4細胞之殺傷%結果顯示於表35及圖13B中。
表 34 ：用於雙重及三重KO編輯之HH細胞之殺傷百分比
表 35 ：用於雙重及三重KO編輯之MOLT-4細胞之殺傷百分比
16.3. MLR 分析 將宿主 PBMC 及經工程改造之供體 T 細胞解凍及靜置
| 未經轉導 | 雙重KO | 三重KO | ||||
| E:T | 平均殺傷% | SD 殺傷% | 平均殺傷% | SD 殺傷% | 平均殺傷% | SD 殺傷% |
| 3.33 | 13.48 | 2.23 | 99.94 | 0.02 | 99.92 | 0.04 |
| 1.11 | 11.84 | 0.42 | 99.53 | 0.12 | 99.26 | 0.13 |
| 0.37 | 2.71 | 1.91 | 91.74 | 0.65 | 85.62 | 0.81 |
| 0.12 | -0.93 | 0.57 | 56.45 | 0.02 | 51.78 | 2.09 |
| 0.04 | -3.92 | 1.43 | 31.10 | 2.18 | 31.44 | 2.59 |
| 未經轉導 | 雙重KO | 三重KO | ||||
| E:T | 平均殺傷% | SD 殺傷% | 平均殺傷% | SD 殺傷% | 平均殺傷% | SD 殺傷% |
| 3.33 | 32.73 | 0.48 | 97.37 | 0.17 | 97.29 | 0.64 |
| 1.11 | 15.28 | 1.08 | 94.08 | 0.01 | 93.36 | 0.99 |
| 0.37 | 12.97 | 0.28 | 84.65 | 1.60 | 86.61 | 0.90 |
| 0.12 | 8.90 | 0.81 | 65.51 | 2.59 | 71.31 | 1.11 |
| 0.04 | 8.79 | 0.72 | 34.37 | 0.95 | 44.03 | 2.53 |
將如表36中所述之冷凍保存之宿主PBMC及經工程改造之供體T細胞以1.5×10
6個細胞/mL之細胞濃度解凍至T細胞生長培養基(TCGM)中，該等培養基由OpTmizer TCGM (Gibco, A1048501)、人類血清AB (GeminiBio, 100-512)、HEPES 1M (Gibco, 15630-080)、GlutaMAX補充物(Gibco, 35050-061)及青黴素-鏈霉素(Gibco, 15070-063)構成且進一步補充有100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。將細胞在37℃培育器中靜置過夜。
表 36- 供體T細胞編輯示意圖及宿主PBMC
使用經工程改造之供體 T 細胞及宿主 PBMC 建立分析
| 細胞類型 | 供體 | HLA-A | HLA-A | HLA-B | HLA-B | HLA-C | HLA-C | |
| 供體T細胞 | WT (未經編輯) | 供體1 | A*02:01 | A*02:01 | B*08:01 | B*08:01 | C*07:01 | C*07:01 |
| 三重KO (HLA-A/HLA-B/CIITA) | 供體1 | A*02:01 | A*02:01 | B*08:01 | B*08:01 | C*07:01 | C*07:01 | |
| 宿主PBMC | HLA-C匹配宿主 | 宿主1 | A*03:02 | A*03:02 | B*49:01 | B*49:01 | C*07:01 | C*07:01 |
| 自體 | 自體宿主(供體1) | A*02:01 | A*02:01 | B*08:01 | B*08:01 | C*07:01 | C*07:01 |
第二天，以5000雷德(程式C)照射如表36中所述之經工程改造供體T細胞且旋轉沈降，並將每組以1×10
6/mL重懸浮於不含細胞介素之TCGM中。宿主PBMC將如製造商之方案中所述使用來自miltenyi之CD56微珠進行CD56清除。然後使用Nexcelom Celleca細胞計數器對清除之CD56計數並在15 mL錐形管中收集期望數量之細胞且然後在離心機中以500×G旋轉沈降5分鐘，然後以1×10
6個細胞/mL重懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(Corning，目錄號21-040-CV)中。使每個供體之一瓶Cell Trace Violet (Thermo Fisher，目錄號C34571)達到室溫並使用20 μL DMSO復原以產生5 mM CTV之儲備溶液。將總共1000萬個宿主PBMC轉移至50 mL錐形管且用5 µM濃度之10 µL CTV染色並在37℃培育器中培育15分鐘。然後將經標記之宿主細胞以500×g旋轉沈降5分鐘。然後將CTV標記之宿主PBMC以1×10
6個細胞/mL重懸浮於預熱的TCGM培養基中，該等培養基由如實例16.1中所述之OpTimizer TCGM構成。對於3:1供體:宿主比率之供體+宿主共培養物，將50 µL宿主PBMC及150 µL供體T細胞添加至無菌96孔圓底板中之每孔中。將板轉移至37℃培育器且培育6天。在共培養後第6天時，將每孔之一半培養基(約100 μL)更換為新鮮培養基(不含細胞介素之TCGM)。
藉由流式細胞術之同種異體反應性讀出
在共培養後第8天時，對分析板染色且藉由流式細胞術分析。對於染色，將板以600 × g旋轉3分鐘，輕彈以移除培養基，且將Fc阻斷劑(Biolegend，目錄號422302)於FACS緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水(Corning，目錄號21-040-CV)、胎牛血清(Gibco，目錄號A3840201)、UltraPure 0.5M EDTA (Invitrogen，目錄號15575-020))中之100 μL 1:100 v/v溶液添加至每孔中。將細胞重懸浮於Fc阻斷劑中，且將板在室溫下培育5分鐘。將T細胞與靶向以下分子之抗體混合劑一起培育：CD3 (Biolegend，目錄號317336)、CD56 (Biolegend，目錄號362546)、CD4 (Biolegend，目錄號300518)、CD8 (Biolegend，目錄號344742)及ViaKrome 808可固定活力染料(Beckman Coulter，目錄號C36628)。以1:100 v/v稀釋製備每一抗體，且將100 μL之此抗體混合物添加至每一樣品孔中。藉由用鋁箔覆蓋保護板免於光且在2-8℃下培育20-30分鐘。染色後，將板以600 × g旋轉3分鐘，輕彈以移除培養基且用200 μL FACS緩衝液洗滌。再次洗滌板，且將細胞沈澱物重懸浮於60 μL FACS緩衝液中。向每孔中添加10 μL之Count Bright絕對計數珠粒且充分混合。使用70 μL總體積作為Cytoflex流式細胞儀上之停止規則，以快速模式運行且記錄板。圖15A及圖15B顯示由供體T細胞處理引起之宿主T細胞增殖之百分比。圖15A顯示，在自體背景下，與未經編輯之T細胞(UED)或經編輯之T細胞(三重KO)共培養之宿主T細胞顯示與單獨宿主T細胞相似之增殖。圖15B顯示與僅宿主對照相比，與未經編輯之T細胞(UED)共培養之宿主T細胞因HLA-A及B對偶基因之錯配(而C係匹配的)而顯示更高之增殖。另外，與三重KO經工程改造細胞相比，與未經編輯之T細胞(UED)共培養之宿主T細胞因HLA-A及B對偶基因之錯配(而C係匹配的)而顯示更高之增殖，其中HLA-A及HLA-B被破壞且HLA-C係匹配的。
活體外 NK 細胞殺傷分析
測試在如實例16.1中所述之破壞CIITA、HLA-A、HLA-B及/或B2M之不同組合中編輯之CD30-CAR T細胞抵抗自然殺手(NK)細胞介導之殺傷的能力。
將宿主PBMC及經工程改造之供體T細胞解凍及靜置
將如表36中所述之冷凍保存之NK細胞及供體T細胞以1.5 × 10
6個細胞/ml之細胞濃度解凍至T細胞生長培養基(TCGM)中，該等培養基由如實例16.3中所述之OpTmizer TCGM構成且進一步補充有100 U/mL之重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15) (用於T細胞)及500 U/mL之IL-2 (僅用於NK細胞)。將細胞在37℃培育器中靜置過夜。
如實例11.2中實施流式細胞術。表37顯示供體T細胞之基因型。表38及圖14顯示在NK細胞激發後T細胞溶解之平均百分比。
表 37- 供體T細胞及宿主NK細胞
表 38- NK細胞激發後之T細胞溶解
實例 17 ：分化 iPSC 細胞中之雙重及三重敲除編輯
| 細胞類型 | 供體 ID | HLA-A | HLA-A | HLA-B | HLA-B | HLA-C | HLA-C | |
| 供體T細胞 | WT | 供體1 | A*02:01 | A*02:01 | B*08:01 | B*08:01 | C*07:01 | C*07:01 |
| B2M+CIITA | 供體1 | A*02:01 | A*02:01 | B*08:01 | B*08:01 | C*07:01 | C*07:01 | |
| 三重KO (HLA-A/HLA-B/CIITA) | 供體1 | A*02:01 | A*02:01 | B*08:01 | B*08:01 | C*07:01 | C*07:01 |
| 未經編輯 | 未經轉導 | B2M/CIITA KO | 三重 KO | |||||
| E:T | 平均殺傷 % | SD 殺傷 % | 平均殺傷 % | SD 殺傷 % | 平均殺傷 % | SD 殺傷 % | 平均殺傷 % | SD 殺傷 % |
| 7.00 | 18.65 | 1.91 | 20.35 | 4.88 | 87.98 | 4.50 | 23.60 | 6.93 |
| 3.50 | 20.90 | 3.11 | 39.65 | 7.42 | 89.18 | 4.07 | 23.55 | 1.48 |
| 1.75 | 16.45 | 0.21 | 22.45 | 5.59 | 83.00 | 2.97 | 25.25 | 10.68 |
| 0.88 | 13.85 | 2.62 | 19.20 | 12.16 | 69.65 | 11.81 | 32.85 | 2.76 |
| 0.44 | 12.20 | 2.69 | 16.50 | 1.70 | 44.90 | 0.42 | 24.45 | 6.86 |
| 0.22 | 10.70 | 0.28 | 13.70 | 2.69 | 24.00 | 0.00 | 22.60 | 2.26 |
在CCRM (再生醫學商業化中心(Centre for Commercialization of Regenerative Medicine))使iPSC自人類PBMC再程式化。在多個純系表徵分析(包括多能性標誌物表現及核型分析)後，選擇單一iPSC純系用於CRISPR/Cas9介導之基因編輯。使用HLA-A指導物G018995、HLA-B指導物G022020及CIITA指導物G013675編輯所選iPSC細胞，以產生雙重敲除(HLA-A及CIITA DKO)或三重敲除(HLA-A、HLA-B及CIITA TKO)之樣品。
如下
表 39中所顯示，ddPCR數據顯示在大量iPSC細胞中在所有三個靶中之高編輯效率。
表 39- HLA-A、CIITA及HLA-B之編輯效率
| HLA-A編輯(%) | CIITA編輯(%) | HLA-B編輯(%) | |
| WT 未經編輯 | -5 | 0 | -8 |
| DKO | 87 | 84 | N/A |
| TKO | 87 | 84 | 79 |
在單細胞平鋪、純系擴增及純系表徵後，進一步選擇DKO或TKO iPSC純系以分化成心肌細胞或胰臟前驅細胞。亦在CCRM實施分化。
在CCRM驗證分化之心肌細胞及胰臟前驅細胞。簡言之，分析分化之心肌細胞之心臟標誌物。超過80%之來自不同組(野生型、DKO及TKO)之分化iPSC對心臟標誌物心肌肌鈣蛋白(cTNT)呈陽性。類似地，在分化後，觀察到超過80%之野生型或TKO細胞表現胰臟及十二指腸同源盒1 (PDX1)及NK6同源盒1 (NKX6.1)，其係驅動β細胞發育之兩種關鍵轉錄因子。該等數據表明，DKO或TKO iPSC具有與野生型iPSC相當之分化能力。
圖1顯示在HLA-B基因座處使用100聚物Spy指導物編輯後，HLA-B7陰性細胞之平均百分比。
圖2顯示在用各種Spy sgRNA編輯後，在NK細胞激發後，T細胞溶解之百分比。
圖3A-3E顯示在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B陰性細胞之平均百分比。圖3A-3C顯示在100聚物Spy指導物及四種91聚物Spy指導物中，三個供體之HLA-B-細胞之平均百分比。圖3D-3E顯示在HLA-B基因座處編輯後，在91聚物Spy指導物中，兩個供體之HLA-B-細胞之平均百分比。
圖4A-B顯示HLA-B敲除之平均百分比。圖4A顯示HLA-B*07:02敲除之平均百分比，且圖4B顯示HLA*B08:01敲除之平均百分比。
圖5A-C顯示在HLA-B基因座處用各種Nme sgRNA編輯後，HLA-B7陰性細胞之平均百分比。圖5A顯示使用Nme2 BC22n指導物之細胞中之HLA-B7陰性細胞。圖5B-C顯示用Nme2裂解酶指導物處理之細胞中之HLA-B7陰性細胞。圖5B顯示HLA-B*07:02敲除之平均百分比，且圖5C顯示HLA-B*08:01敲除之平均百分比。
圖6顯示用各種劑量之Nme sgRNA在HLA-B基因座處編輯後，CD8+細胞之HLA-A2-%之劑量反應曲線。
圖7顯示用各種劑量之Nme sgRNA在HLA-B基因座處編輯後，CD8+細胞之HLA-B7-%之劑量反應曲線。
圖8A顯示使用Nme2鹼基編輯子(去胺酶，亦稱為BC22n)使用候選指導物在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B7陰性細胞之平均百分比。使用G028907作為對照。
圖8B顯示使用Nme2鹼基編輯子(去胺酶，亦稱為BC22n)使用候選指導物在HLA-B基因座處編輯後，HLA-B8陰性細胞之平均百分比。使用G028907作為對照。
圖9顯示在用NK細胞激發HLA-A、HLA-B或HLA-A/B敲除之經工程改造T細胞後，T細胞溶解之百分比。
圖10A-10D顯示在HLA-B同型接合或異型接合供體中在每一sgRNA劑量下之編輯%。圖10A顯示HLA-B7同型接合供體中之HLA-B7-及CD8+細胞%。圖10B顯示HLA-B7同型接合供體中之HLA-B8-及CD8+細胞%。圖10C顯示HLA-B7異型接合供體中之HLA-B7-及CD8+細胞%。圖10D顯示HLA-B7異型接合供體中之HLA-B8-及CD8+細胞%。
圖11顯示在注射用HLA-A、HLA-B、CIITA、TRAC及/或B2M編輯之細胞後，在不同時間點存在之螢光素酶表現T細胞之總通量(光子/s)。
圖12顯示在注射用HLA-A、HLA-B、CIITA、TRAC及/或B2M編輯之細胞後，在不同時間點存在之螢光素酶表現T細胞之總通量(光子/s)。
圖13A及圖13B顯示腫瘤細胞中之殺傷百分比結果。圖13A顯示雙重及三重KO編輯之HH細胞中之殺傷百分比結果。圖13B顯示雙重及三重KO編輯之MOLT-4細胞中之殺傷百分比結果。
圖14顯示使用B2M/CIITA KO之不同編輯或對照、未經編輯或未經轉導之T細胞，NK細胞對T細胞之T細胞殺傷%結果。
圖15A及圖15B顯示當與經工程改造之供體T細胞共培養時，宿主T細胞增殖之百分比。
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Claims (112)
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其包含HLA-A基因之遺傳修飾及HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其包含HLA-A基因之遺傳修飾及HLA-B基因之遺傳修飾，其中(i)該HLA-A基因之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:29942854-chr6:29942913及chr6:29943518-chr6:29943619；及(b) chr6:29942540-29945459；(ii)該HLA-B基因之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6: 31354497-31357157；其中該細胞係HLA-C同型接合的。
- 一種相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
- 一種相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31354480-31357174或(b) chr6: 31354497-31357157；其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的。
- 如請求項1至4中任一項之經工程改造之人類細胞，其中該細胞具有減少或消除的至少一種HLA-B對偶基因表現，該至少一種HLA-B對偶基因選自：HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B40、HLA-B44、HLA-B15、HLA-B14、HLA-B18及HLA-B51。
- 如請求項1、2或5中任一項之經工程改造之人類細胞，其中該細胞具有減少或消除的至少一種HLA-A對偶基因表現，該至少一種HLA-A對偶基因選自：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A29、HLA-A26、HLA-A33及HLA-A24。
- 如請求項1至6中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-B基因之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355596或(b) chr6: 31355203-31356461。
- 如請求項1至7中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-B之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr6:31355182-31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；或chr6: 31355409-31355429；或(b) chr6:31356777-31356801；chr6:31355492- 31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6: 31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366- 31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166- 31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262- 31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369- 31355393；chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205- 31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441- 31355465；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426- 31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762- 31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6: 31356767-31356791。
- 如請求項1至8中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-B之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355348-31355368、chr6:31355347-31355367、chr6:31355349- 31355369、chr6:31355192-31355212、chr6:31355340-31355360、chr6:31355409- 31355429。
- 如請求項1至9中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-B之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:31355221-31355245；chr6:31355222-31355246；chr6:31355205- 31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；或chr6: 31355441-31355465。
- 如請求項1至2及5至10中任一項之經工程改造細胞，其中HLA-A之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876- 29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
- 如請求項1至2及5至11中任一項之經工程改造細胞，其中HLA-A之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942864- 29942884；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29942891- 29942915；chr6:29944471-29944495；chr6:29944470-29944494。
- 如請求項1至2及5至12中任一項之經工程改造細胞，其中HLA-A之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633。
- 一種相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現之經工程改造之人類細胞，其包含HLA-B基因之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或chr6:31355347-31355367；chr6:31355182- 31355202；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349- 31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380- 31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185- 31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190- 31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320- 31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；或chr6: 31355409-31355429；或(b) chr6:31355222-31355246；chr6:31355221- 31355245；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425- 31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31356777-31356801；chr6:31355492- 31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6: 31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366- 31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166- 31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262- 31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369- 31355393；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426- 31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762- 31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6: 31356767-31356791。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其包含(i) HLA-A基因之遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6: 29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529- 29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549- 29943569；chr6:29943589-29943609；chr6:29944026-29944046；chr6:29934330- 29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140- 29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858- 29943878、chr6:29944478-29944498及chr6:29944850-29944870；或(b) chr6: 29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；及chr6:29944470- 29944494；及(ii) HLA-B基因之遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6: 31355348-31355368；或chr6:31355347-31355367；chr6:31355182-31355202；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145-31355165；chr6:31355349- 31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381-31356401；chr6:31356380- 31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205-31355225；chr6:31355185- 31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192-31355212；chr6:31355190- 31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198-31355218；chr6:31355320- 31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178-31355198；chr6:31355432- 31355452；chr6:31355340-31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410- 31355430；chr6:31355419-31355439；chr6:31355414-31355434；及chr6: 31355409-31355429；或(b) chr6:31355222-31355246；chr6:31355221- 31355245；chr6:31355205-31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425- 31356449；chr6:31355441-31355465；chr6:31356777-31356801；chr6:31355492- 31355516；chr6: 31355379-31355403；chr6:31355491-31355515；chr6: 31355361-31355385；chr6:31355356-31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417-31355441；chr6:31355366- 31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378-31355402；chr6:31355166- 31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469-31355493；chr6:31356262- 31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390-31355414；chr6:31355369- 31355393；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437-31356461；chr6:31356426- 31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764-31356788；chr6:31356762- 31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436-31356460；或chr6: 31356767-31356791。
- 如請求項14或15中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-B之該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T取代或A至G取代：(a) chr6:31355348-31355368；或(b) chr6:31355390-31355414；chr6:31355417-31355441；或chr6: 31355390-31355414。
- 如請求項14至16中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-A之該遺傳修飾或該HLA-B之該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個鄰接核苷酸。
- 如請求項14至17中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-A之該遺傳修飾或該HLA-B之該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
- 如請求項1至18中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355348-31355368；或chr6:31355347-31355367；chr6:31355182- 31355202；chr6:31355348-31355368；chr6:31355180-31355200；chr6:31355145- 31355165；chr6:31355349-31355369；chr6:31355157-31355177；chr6:31356381- 31356401；chr6:31356380-31356400；chr6:31355204-31355224；chr6:31355205- 31355225；chr6:31355185-31355205；chr6:31355191-31355211；chr6:31355192- 31355212；chr6:31355190-31355210；chr6:31355193-31355213；chr6:31355198- 31355218；chr6:31355320-31355340；chr6:31355319-31355339；chr6:31355178- 31355198；chr6:31355347-31355367；chr6:31355432-31355452；chr6:31355340- 31355360；chr6:31355576-31355596；chr6:31355410-31355430；chr6:31355419- 31355439；chr6:31355414-31355434；chr6:31355409-31355429。
- 如請求項1至19中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-B表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-B基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:31355222-31355246；chr6:31355221-31355245；chr6:31355205- 31355229；chr6:31355446-31355470；chr6:31356425-31356449；chr6:31355441- 31355465；chr6:31356777-31356801；chr6:31355492-31355516；chr6:31355379- 31355403；chr6:31355491-31355515；chr6:31355361-31355385；chr6:31355356- 31355380；chr6:31355460-31355484；chr6:31357078-31357102；chr6:31355417- 31355441；chr6:31355366-31355390；chr6:31355415-31355439；chr6:31355378- 31355402；chr6:31355166-31355190；chr6:31355401-31355425；ch6:31355469- 31355493；chr6:31356262-31356286；chr6:31355419-31355443；chr6:31355390- 31355414；chr6:31355369-31355393；chr6:31355203-31355227；chr6:31356437- 31356461；chr6:31356426-31356450；chr6:31356763-31356787；chr6:31356764- 31356788；chr6:31356762-31356786；chr6:31355204-31355228；chr6:31356436- 31356460；或chr6:31356767-31356791。
- 如請求項1至2、5至13及15至20中任一項之經工程改造細胞，其中HLA-A表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-A基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876- 29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126- 29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530- 29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589- 29943609；chr6:29944026-29944046；chr6:29934330-29934350、chr6:29943115- 29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140-29943160、chr6:29943590- 29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858-29943878及chr6: 29944478-29944498、chr6:29944850-29944870。
- 如請求項1、2、5至13及15至21中任一項之經工程改造細胞，其中HLA-A表現藉由基因編輯系統減少或消除，該基因編輯系統結合至HLA-A基因體靶序列，該基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915或chr6:29942609-29942633。
- 如請求項19至22中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-A基因體靶序列或該HLA-B基因體靶序列包含該等基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。
- 如請求項1至23中任一項之經工程改造細胞，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
- 如請求項1至24中任一項之經工程改造細胞，其中該HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*08:01；HLA-C*03:02；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:10；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:04；HLA-C*04:01；HLA-C*17:01；HLA-C*01:02；及HLA-C*02:02。
- 如請求項3至14及16至25中任一項之經工程改造細胞，其中該經工程改造細胞係HLA-A同型接合的，該HLA-A對偶基因選自以下HLA-A對偶基因中之任一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*11:01；HLA-A*26:01；HLA-A*68:01；HLA-A*29:02；HLA-A*31:01；HLA-A*32:01；HLA-A*30:02；HLA-A*25:01；HLA-A*33:01；HLA-A*02:02；HLA-A*74:01；HLA-A*02:02；HLA-A*29:01；HLA-A*02:03；HLA-A*02:05；HLA-A*24:07；HLA-A*11:02；HLA-A*36:01；HLA-A*02:22；HLA-A*34:02；HLA-A*01:03；HLA-A*24:02；HLA-A*02:07；HLA-A*23:01；HLA-A*30:01；HLA-A*33:03；HLA-A*02:06；HLA-A*34:02；及HLA-A*68:02。
- 如請求項3至14及16至25中任一項之經工程改造細胞，其中該經工程改造細胞係HLA-A同型接合的且其中該經工程改造細胞係HLA-C同型接合的，其中該HLA-A對偶基因選自以下HLA-A對偶基因中之任一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*11:01；HLA-A*26:01；HLA-A*68:01；HLA-A*29:02；HLA-A*31:01；HLA-A*32:01；HLA-A*30:02；HLA-A*25:01；HLA-A*33:01；HLA-A*02:02；HLA-A*74:01；HLA-A*02:02；HLA-A*29:01；HLA-A*02:03；HLA-A*02:05；HLA-A*24:07；HLA-A*11:02；HLA-A*36:01；HLA-A*02:22；HLA-A*34:02；HLA-A*01:03；HLA-A*24:02；HLA-A*02:07；HLA-A*23:01；HLA-A*30:01；HLA-A*33:03；HLA-A*02:06；HLA-A*34:02；及HLA-A*68:02；且該HLA-C對偶基因選自以下HLA-C對偶基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*08:01；HLA-C*03:02；HLA-C*16:01；HLA-C*15:02；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:10；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*17:01；HLA-C*01:02；及HLA-C*02:02。
- 如請求項1至27中任一項之經工程改造細胞，其中該細胞具有減少或消除的MHC II類蛋白表面表現。
- 如請求項1至28中任一項之經工程改造細胞，其中該細胞具有選自以下之基因之遺傳修飾：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
- 如請求項1至29中任一項之經工程改造細胞，其中該細胞具有該CIITA基因之遺傳修飾。
- 如請求項1至30中任一項之經工程改造細胞，其中該細胞具有減少或消除的TRAC蛋白表面表現。
- 如請求項1至31中任一項之經工程改造細胞，其中該細胞具有減少或消除的TRBC蛋白表面表現。
- 如請求項1至32中任一項之經工程改造細胞，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個鄰接核苷酸。
- 如請求項1至33中任一項之經工程改造細胞，其中該遺傳修飾包含插入/缺失。
- 如請求項1至34中任一項之經工程改造細胞，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少一個C至T取代或至少一個A至G取代。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至35中任一項之經工程改造細胞。
- 一種細胞群體，其包含如請求項1至36中任一項之經工程改造細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項37之細胞群體。
- 如請求項37之群體或如請求項38之醫藥組成物，其中該細胞群體係至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% HLA-A陰性或HLA-B陰性，如藉由流式細胞術所量測。
- 如請求項37至39中任一項之群體或醫藥組成物，其中至少65%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之該細胞群體包含該HLA-A基因之該遺傳修飾或該HLA-B基因之該遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
- 如請求項37至40中任一項之群體或醫藥組成物，其中該細胞群體係至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% CIITA陰性，如藉由流式細胞術所量測。
- 如請求項37至41中任一項之群體或醫藥組成物，其中該細胞群體係至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%內源TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。
- 一種向有需要之個體投與如請求項1至42中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物的方法。
- 一種向個體投與如請求項1至42中任一項之經工程改造細胞、細胞群體或醫藥組成物作為過繼性細胞轉移(ACT)療法的方法。
- 一種治療疾病或病症之方法，其包括向有需要之個體投與如請求項1至42中任一項之經工程改造細胞、細胞群體或醫藥組成物。
- 一種組成物，其包含HLA-B指導RNA，其中該HLA-B指導RNA包含： i. 選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91、101-164、167-176、178-185之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸； iii. 與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列； iv. 結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
- 一種組成物，其包含HLA-B指導RNA及HLA-A指導RNA，其中該HLA-B指導RNA包含： i. 選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸； iii. 與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列； iv. 結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列，且 其中該HLA-A指導RNA包含： i. 選自SEQ ID No: 576、571、301-570、572-575、577-590之指導序列；或 ii. 選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或 iv. 結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表4-7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
- 一種製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞係HLA-A同型接合的及HLA-C同型接合的，該方法包括：使細胞與組成物接觸，該組成物包含(i) HLA-B指導RNA及(ii)視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-B指導RNA包含： i. 選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91、101-164、167-176、178-185之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸； iii. 與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列； iv. 結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
- 一種相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中之HLA-B蛋白之表面表現的方法，其包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含(i) HLA-B指導RNA及(ii)視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-B指導RNA包含： i. 選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸； iii. 與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列； iv. 結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
- 一種製造經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有減少或消除的HLA-A及HLA-B蛋白表面表現，其中該細胞係HLA-C同型接合的，該方法包括： (a) 使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含HLA-B指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-B指導RNA包含： i. 選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列；或 ii. 選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列； iv. 結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列； (b) 使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含HLA-A指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含： i. 選自SEQ ID No: 576、571、301-570、572-575、577-590之指導序列；或 ii. 選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或 iv. 結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 與表4-7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
- 一種相對於未經修飾之細胞減少人類細胞中之HLA-A蛋白及HLA-B蛋白之表面表現的方法，該方法包括 (a) 使細胞與第一組成物接觸，該第一組成物包含HLA-B指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-B指導RNA包含： i. 選自SEQ ID NO: 165、166、177、13、74、1-12、14-73、75-91及101-164、167-176、178-185之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸； iii. 與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列； iv. 結合包含表2或表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列，或與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；及 (b) 使細胞與第二組成物接觸，該第二組成物包含HLA-A指導RNA及視情況地RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含： i. 選自SEQ ID No: 576、571、301-570、572-575、577-590之指導序列；或 ii. 選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸；或選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 301-428及463-511之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或與選自SEQ ID NO: 429-462及512-590之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列；或 iv. 結合包含表4-7中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或 v. 與表4-7中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列。
- 如請求項46至51中任一項之組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係SpyCas9，且該HLA-B指導RNA包含：(i)選自SEQ ID NO: 13、74、1-12、14-73、75-91之指導序列；或(ii)為選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iii)為選自SEQ ID NO: 1-91之序列之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸的指導序列；或(iv)結合包含表2中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表2中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自SEQ ID NO: 1-91之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項46至51中任一項之組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係NmeCas9，且該HLA-B指導RNA包含：(i)選自SEQ ID NO: 165、166、177、101-164、167-176及178-185之指導序列；或(ii)為選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iii)為選自SEQ ID NO: 101-185之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iv)結合包含表3中所列之基因體區域之靶位點之指導序列；或(v)與表3中所列之基因體區域之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸互補之指導序列；或(vi)與選自SEQ ID NO: 101-185之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列。
- 如請求項1至51中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係NmeCas9，且該HLA-B指導RNA包含：(i)選自SEQ ID NO: 165、166、163、164、169及177之指導序列；或(ii)為選自SEQ ID NO: 165、166、163、164及177之序列之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸的指導序列；或(iii)與選自SEQ ID NO: 165、166、163、164及177之序列至少95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之指導序列。
- 如請求項46至54中任一項之組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA或該HLA-A指導RNA包含至少一種修飾。
- 如請求項46至55中任一項之組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA或該HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，其中該至少一種修飾包括2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。
- 如請求項46至56中任一項之組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA或該HLA-A指導RNA包含至少一種修飾，該至少一種修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
- 如請求項48至57中任一項之方法，其進一步包括相對於未經修飾之細胞減少或消除該細胞中之該MHC II類蛋白之表面表現，例如藉由使該細胞與靶向選自以下之基因之基因編輯系統接觸來達成：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
- 如請求項48至58中任一項之方法，其進一步包括使該細胞與CIITA指導RNA接觸。
- 如請求項48至59中任一項之方法，其進一步包括相對於未經修飾之細胞減少或消除該細胞中之TCR蛋白之表面表現。
- 如請求項48至60中任一項之方法，其進一步包括使該細胞與外源核酸接觸。
- 如請求項61之方法，其進一步包括使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸。
- 如請求項61之方法，其進一步包括使該細胞與編碼該細胞分泌之多肽之外源核酸接觸。
- 如請求項61之方法，其進一步包括使該細胞與DNA依賴性蛋白激酶抑制劑(DNAPKi)接觸。
- 如請求項64之方法，其中該DNAPKi係化合物1。
- 如請求項1至65中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係同種異體細胞。
- 如請求項1至66中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係幹細胞。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼該細胞分泌之多肽之外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中該分泌多肽係抗體或抗體片段。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼該細胞分泌之多肽之外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中該分泌多肽係酶。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼該細胞分泌之多肽之外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中該分泌多肽係細胞介素。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體係T細胞受體(TCR)。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體係經遺傳修飾之TCR。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體係WT1 TCR。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體係CAR。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體係通用CAR。
- 如請求項1至67中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體係抗CD30 CAR。
- 如請求項1至76中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該等細胞係使用基因編輯系統來工程改造。
- 如請求項77之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該基因編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
- 如請求項47至78中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。
- 如請求項1至79中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係由鹼基編輯系統工程改造，該鹼基編輯系統包含C至T鹼基編輯子或A至G鹼基編輯子。
- 如請求項80中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該鹼基編輯系統包含含有胞苷去胺酶及RNA指導之切口酶之多肽，或編碼該多肽之核酸。
- 如請求項81之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該胞苷去胺酶包含APOBEC3A去胺酶(A3A)。
- 如請求項46至82中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA或該HLA-B指導RNA在載體中提供至該細胞。
- 如請求項61至83中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該外源核酸在載體中提供至該細胞。
- 如請求項83或84之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係病毒載體。
- 如請求項83或84之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係非病毒載體。
- 如請求項46至86中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該指導RNA在脂質奈米粒子(LNP)中提供至該細胞。
- 如請求項61至87中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該外源核酸在脂質奈米粒子(LNP)中提供至該細胞。
- 如請求項46至88中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 13、74、3、18、32、36、39、48-56、58、64-71、73、80-82、86及88-91之指導序列。
- 如請求項46至89中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 13。
- 如請求項46至89中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 74。
- 如請求項46至89中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101、103、106、107、114、117、118、125-129、133、137、138、141、143、144、145、159、160、163、164、165、166、169、171、172、173、176、177、178、179及180之指導序列。
- 如請求項46至89中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含含有SEQ ID NO: 163-166、169及177中之任一者之序列之指導序列。
- 如請求項46至89中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 165。
- 如請求項46至89中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 166。
- 如請求項46至89中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其中該HLA-B指導RNA包含SEQ ID NO: 177。
- 如請求項46至96中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 576。
- 如請求項46至96中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 571。
- 如請求項1至98中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於表現對癌細胞表現之多肽具有特異性之TCR。
- 如請求項1至99中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於作為過繼性細胞轉移(ACT)療法投與個體。
- 如請求項1至100中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於治療患有癌症之個體。
- 如請求項1至101中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於治療患有傳染病之個體。
- 如請求項1至102中任一項之經工程改造細胞、細胞群體、醫藥組成物、組成物或方法，其用於治療患有自體免疫疾病之個體。
- 一種細胞庫，其包含：(a)如請求項1至35及66至103中任一項之經工程改造細胞，或藉由如請求項48至103中任一項之方法產生之經工程改造細胞；及(b)包含記載該細胞庫中之供體細胞之HLA-A及HLA-C對偶基因之資訊的目錄。
- 一種向有需要之接受個體投與經工程改造細胞之方法，該方法包括：(a)確定該接受個體之HLA-A及HLA-C對偶基因；(b)選擇如請求項1至33、37、66至103之經工程改造細胞或細胞群體，或藉由如請求項48至103中任一項之方法產生之經工程改造細胞或細胞群體，其中該經工程改造細胞包含與該接受個體相同之HLA-A或HLA-C對偶基因中之至少一者；(c)向該接受個體投與該經選擇之經工程改造細胞。
- 如請求項105之方法，其中該個體具有該經工程改造細胞之該等HLA-A及HLA-C對偶基因。
- 如請求項1至103中任一項之經工程改造細胞、組成物、醫藥組成物或方法，其用於向部分匹配之個體投與過繼性細胞轉移(ACT)療法，其中該部分匹配之個體具有該經工程改造細胞或細胞群體之該等HLA-A及HLA-C對偶基因。
- 如請求項43至45、100至103及105至107中任一項之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中該經工程改造細胞或細胞群體包含與該個體共享之HLA-A及HLA-C對偶基因。
- 如請求項43至45、100至103及105至108中任一項之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中該經工程改造細胞或細胞群體之該等HLA-A及HLA-C對偶基因係由匹配該個體之一或多個HLA-A及HLA-C對偶基因之對偶基因組成。
- 如前述請求項43至45、100至103及105至109中任一項之經工程改造細胞、群體、組成物、醫藥組成物或方法，其中該經工程改造細胞或細胞群體之該等HLA-C對偶基因係由匹配該個體之一或兩個HLA-C對偶基因之對偶基因組成。
- 一種細胞庫，其包含：(a)如請求項1至33、66至103中任一項之經工程改造細胞，或藉由如請求項48至103中任一項之方法產生之經工程改造細胞；及(b)包含記載該細胞庫中之供體細胞之HLA-C對偶基因之資訊的目錄。
- 一種向有需要之接受個體投與經工程改造細胞之方法，該方法包括：(a)確定該接受個體之HLA-C對偶基因；(b)選擇如請求項1至33、37及66至103中任一項之經工程改造細胞或細胞群體，或藉由如請求項48至103中任一項之方法產生之經工程改造細胞或細胞群體，其中該經工程改造細胞對於該接受個體之該等HLA-C對偶基因中之一者係同型接合的；(c)向該接受個體投與該經選擇之經工程改造細胞。
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