JP7385281B2 - 低抗原性細胞の製造方法 - Google Patents

低抗原性細胞の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7385281B2
JP7385281B2 JP2020500578A JP2020500578A JP7385281B2 JP 7385281 B2 JP7385281 B2 JP 7385281B2 JP 2020500578 A JP2020500578 A JP 2020500578A JP 2020500578 A JP2020500578 A JP 2020500578A JP 7385281 B2 JP7385281 B2 JP 7385281B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hla
cells
allele
base sequence
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020500578A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2019160077A1 (ja
Inventor
秋津 堀田
淮耕 徐
新 金子
博 王
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University
Original Assignee
Kyoto University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University filed Critical Kyoto University
Publication of JPWO2019160077A1 publication Critical patent/JPWO2019160077A1/ja
Priority to JP2023109941A priority Critical patent/JP2023126897A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7385281B2 publication Critical patent/JP7385281B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/001—Preparations to induce tolerance to non-self, e.g. prior to transplantation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Description

本発明は、低抗原性細胞の製造方法に関する。より具体的には、低抗原性細胞の製造方法、低抗原性細胞の検出用キット、細胞、ｇＲＮＡ、及び標的塩基配列の特定方法に関する。本願は、２０１８年２月１６日に、日本に出願された特願２０１８－０２６４２１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
ドナーの細胞を他人であるレシピエント（患者）に移植する他家移植の場合、免疫反応により移植細胞が拒絶されてしまう。
細胞の自己と非自己を見分けるために最も重要な役割を果たしているのがＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、ヒト白血球抗原）又は主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）と呼ばれる細胞表面タンパク質である。
ＨＬＡはクラスＩとクラスＩＩに分類されている。クラスＩのＨＬＡタンパク質は体内のほとんどの種類の細胞で発現している。クラスＩのＨＬＡタンパク質はβ２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｂ２Ｍ）とヘテロダイマーを形成して細胞表面へ発現し、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞に対してペプチドを提示し活性化を誘導する機能を担っている。提示する抗原ペプチドは内因性のものであり、８～１０アミノ酸の長さを持つものが多い。
ＨＬＡクラスＩに分類されるのは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、ＨＬＡ－Ｆ遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子の主に６つの遺伝子である。この他に、多数の偽遺伝子（ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｋ、ＨＬＡ－Ｌ、ＨＬＡ－Ｐ、ＨＬＡ－Ｔ、ＨＬＡ－Ｕ、ＨＬＡ－Ｖ、ＨＬＡ－Ｗ、ＨＬＡ－Ｘ、ＨＬＡ－Ｙ等）も知られている。これらの中で特に個人間での配列多様性が大きいのはＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子の３つであり、移植免疫において自己と非自己を識別するのに主要な役割を果たしている。
クラスＩＩのＨＬＡタンパク質は、主に、マクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞等の免疫細胞で発現している。クラスＩＩのＨＬＡタンパク質は、α鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成し、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞に対してペプチドを提示し活性化を誘導する機能を担っている。提示する抗原ペプチドは外因性のものであり、１５～２４アミノ酸の長さを持つものが多い。
ＨＬＡクラスＩＩに分類されるのは、ＨＬＡ－ＤＲ（α鎖：ＨＬＡ－ＤＲＡ、β鎖：ＨＬＡ－ＤＲＢ）、ＨＬＡ－ＤＱ（α鎖：ＨＬＡ－ＤＱＡ１、β鎖：ＨＬＡ－ＤＱＢ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（α鎖：ＨＬＡ－ＤＰＡ１又はＨＬＡ－ＤＰＡ２、β鎖：ＨＬＡ－ＤＰＢ１又はＨＬＡ－ＤＰＢ２）である。この他に多数の偽遺伝子（ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ）が存在することも知られている。
ＨＬＡ遺伝子はその配列多様性によって、細胞レベルで自己と非自己の認識に関わっている。他家移植の際、ＨＬＡのマッチングは免疫拒絶を軽減するためにも非常に重要である。例えば、造血幹細胞移植において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲの両アレル、すなわち合計８座のアレルにおける抗原性がなるべく一致したドナーを見つけ出して移植することが推奨されている。
また、腎臓移植等の生着率の成績を見ても、ＨＬＡ抗原性の一致度が高い程、生着効率が有意に高いことが報告されている。
一方で、細胞表面にＨＬＡ抗原が存在しないことによって誘導される免疫系も存在する。ＮＫ細胞は複数の抑制型受容体を発現している。例えば、ＨＬＡ－Ｅを認識してＮＫ細胞の働きを抑制するＣＤ９４とＮＫＧ２Ａの複合受容体は、ＨＬＡ－Ｅが存在しない細胞を見つけるとＮＫ細胞の活性化を誘導し、攻撃することが知られている。また、ＫＩＲ（Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｅｒ）と呼ばれる受容体ファミリーも存在し、細胞外ドメインの個数に応じて２Ｄと３Ｄに分類されるほか、細胞内ドメインの長さによって、Ｌ（ロング）とＳ（ショート）に分けられる。２ＤＬ１受容体はＨＬＡ－Ｃ２を、２ＤＬ２及び２ＤＬ３受容体はＨＬＡ－Ｃ１を、２ＤＬ４受容体はＨＬＡ－Ｇを、３ＤＬ１はＨＬＡ－Ｂｗ４を、３ＤＬ２はＨＬＡ－Ａ３又はＨＬＡ－Ａ１１を認識してＮＫ細胞の活性を抑制することが知られている。ＫＩＲには多型があり、例えば日本人のほぼすべて（９８％以上）が２ＤＬ１、２ＤＬ３、３ＤＬ４を持つが、２ＤＬ２を持つのは１５％程度と稀であると報告されている。
ところで、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞は、様々な細胞種へと分化可能な多能性を有することから、多能性幹細胞を各種細胞へと分化させたうえで患者に移植する、細胞治療や再生医療が注目されている。
実際に、ＥＳ細胞から神経細胞へと分化させ、骨髄損傷患者に移植した例や、ｉＰＳ細胞から網膜色素上皮細胞へと分化させ、加齢黄斑変性患者に移植した例等が報告されている。このような多能性幹細胞由来細胞を移植する際にも、移植する細胞と患者のＨＬＡ型を一致させることが重要であるとの報告がある。
しかしながら、多能性幹細胞は樹立に多大のコストと時間が必要なため、ＨＬＡ型が一致した細胞を患者ごとに用意することは困難であるという問題がある。この問題を解決する手段の一つとして、例えば、特許文献１には、クラスＩのＨＬＡタンパク質の細胞表面提示に必要なＢ２Ｍ遺伝子を欠失させた細胞が記載されている。
近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いるゲノム編集技術により、ｇＲＮＡの標的塩基配列依存的にゲノムＤＮＡに二本鎖ＤＮＡ切断（Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を誘導し、ゲノムＤＮＡの一部を削除することや、二本鎖ＤＮＡ切断誘導部位近辺と一部分相同配列を持つ鋳型ＤＮＡをＣａｓ９及びｇＲＮＡと共導入することにより任意のＤＮＡ断片を挿入することが可能となった。
しかしながら、ゲノム編集技術におけるＤＳＢ誘導は、標的配列に対して認識結合するｇＲＮＡの２０塩基程度のスペーサー塩基配列と３～５塩基程度のＰＡＭ配列と呼ばれる塩基配列によって決定される。このため、ｇＲＮＡの塩基配列が標的部位の塩基配列と一致しない限り、効率的なＤＳＢ誘導は困難である。
また、標的部位の塩基配列とよく似た塩基配列、例えば１塩基だけ異なる塩基配列が、標的部位以外にも存在する場合、誤って標的部位以外の部位にもＤＳＢを誘導してしまい、望まないゲノム配列変異を誘導してしまうリスク、いわゆるオフターゲット変異リスクが知られている。
国際公開第２０１２／１４５３８４号
特許文献１に記載された細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を欠失しているため、クラスＩのＨＬＡタンパク質が細胞表面に提示されない。このため、他家移植を行った場合の免疫反応が抑制されていると考えられる。しかしながら、ＨＬＡタンパク質が細胞表面に提示されないと、細胞の抗原提示能力が失われてしまう。細胞が抗原提示能力を失うと、Ｂ２Ｍ欠損細胞がウイルス等の感染を受けた場合や腫瘍化した場合等に、ウイルスや腫瘍由来の抗原を提示できなくなり、結果的にウイルス及び腫瘍の増殖の手助けをしてしまう恐れがある。また、ＨＬＡタンパク質が細胞表面に提示されていない細胞は、「ｍｉｓｓｉｎｇ ｓｅｌｆ」を認識するＮＫ細胞によって攻撃されてしまう。
そこで、ゲノム編集技術を用いて任意のＨＬＡ遺伝子だけを選択的に破壊することが考えられる。しかしながら、ＨＬＡ遺伝子は複数存在し、また多くの偽遺伝子を含め、お互いのＨＬＡ遺伝子の間で配列の相同性が高い。一方で、同じＨＬＡ遺伝子であっても、個人間での配列多様性が大きいため、あるＨＬＡ遺伝子配列にマッチする標的塩基配列を同定しても、それが別のドナー由来細胞でも使えるとは限らない。このため、ゲノム編集の適切な標的配列を決定することは容易ではない。また、従来のゲノム編集技術では、目的のゲノム編集がなされた細胞を探し出す手間が膨大であった。
本発明は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を製造する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を、ドナー細胞から製造する製造方法であって、前記ドナー細胞及び前記レシピエントのＨｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）アレルをそれぞれ決定することと、前記レシピエントに存在せず前記ドナー細胞に存在するＨＬＡアレルを特定することと、特定された前記ＨＬＡアレルを破壊又は改変し、前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を含む細胞集団を得ることと、を含み、前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しない細胞が前記低抗原性細胞である、製造方法。
［２］前記ドナー細胞及び前記レシピエントの前記ＨＬＡアレルをそれぞれ決定することにおいて決定される前記ＨＬＡアレルが、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルを含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を含む細胞集団を得ることの後に、前記細胞集団から前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を回収することを更に含み、前記回収することが、前記細胞集団にＨＬＡタンパク質発現誘導剤を接触させることと、前記ＨＬＡタンパク質発現誘導剤に接触した前記細胞集団における前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質の発現を指標として、前記細胞集団から前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を回収することと、を含む、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記ＨＬＡタンパク質発現誘導剤が、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、インターロイキン（ＩＬ）－４、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）－α又はＴＧＦ－βである、［３］に記載の製造方法。
［５］前記低抗原性細胞が多能性幹細胞である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ＨＬＡタンパク質発現誘導剤を含む、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞の検出用キット。
［７］前記ＨＬＡタンパク質発現誘導剤が、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－α又はＴＧＦ－βである、［６］に記載のキット。
［８］前記低抗原性細胞が多能性幹細胞である、［６］又は［７］に記載のキット。
［９］ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－α又はＴＧＦ－βからなるＨＬＡタンパク質発現誘導剤。
［１０］少なくとも１つのＨＬＡアレルが破壊又は改変され、少なくとも１種のＨＬＡタンパク質を発現可能な細胞。
［１１］前記ＨＬＡアレルが、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル又はＨＬＡ－Ｃアレルを含む、［１０］に記載の細胞。
［１２］レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞であり、破壊又は改変された前記ＨＬＡアレルが、前記レシピエントに存在しないＨＬＡアレルである、［１０］又は［１１］に記載の細胞。
［１３］多能性幹細胞である、［１０］～［１２］のいずれかに記載の細胞。
［１４］Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＩＩＴＡ）アレル、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ５（ＲＦＸ５）アレル、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＸＡＰ）アレル及びＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＸＡＮＫ）アレルのうち少なくとも１つのアレルが更に破壊又は改変されている、［１０］～［１３』のいずれかに記載の細胞。
［１５］ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルが破壊され、少なくとも１種のＨＬＡ－Ｃタンパク質を発現可能な、［１０］～［１４］のいずれかに記載の細胞。
［１６］前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質が、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレル及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１アレルからなる群より選択される１種のアレルにコードされるタンパク質である、［１５］に記載の細胞。
［１７］レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を、ドナー細胞から製造する製造方法であって、前記ドナー細胞のＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル及びＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つ以上を含むアレルを破壊又は改変すること、を含み、前記ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル又はＲＦＸＡＮＫアレルが破壊又は改変された細胞が前記低抗原性細胞である、製造方法。
［１８］前記低抗原性細胞が多能性幹細胞である、［１７］に記載の細胞。
［１９］ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル及びＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つ以上を含むアレルが破壊又は改変された細胞。
［２０］多能性幹細胞である、［１９］に記載の細胞。
［２１］全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に１つの標的とするＨＬＡハプロタイプにしかマッピングされず、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列を、標的塩基配列とするｇＲＮＡ。
［２２］前記標的塩基配列が、配列番号３、４、７、４５～５２、７２～２４５９のいずれかに記載の塩基配列、又は配列番号３、４、７、４５～５２、７２～２４５９のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる、［２１］に記載のｇＲＮＡ。
［２３］前記標的塩基配列が、配列番号３、４、７、４５～５２のいずれかに記載の塩基配列、又は配列番号３、４、７、４５～５２のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる、［２１］又は［２２］に記載のｇＲＮＡ。
［２４］前記標的塩基配列が、ＨＬＡ遺伝子のエクソン２又は３にマッピングされる、［２１］～［２３］のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
［２５］全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされ、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列を、標的塩基配列とするｇＲＮＡ。
［２６］前記標的塩基配列が、配列番号５３～５５、２４６０～８０１３のいずれかに記載の塩基配列、又は配列番号５３～５５、２４６０～８０１３のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる、［２５］に記載のｇＲＮＡ。
［２７］前記標的塩基配列が、配列番号５３～５５のいずれかに記載の塩基配列、又は配列番号５３～５５のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる、［２５］又は［２６］に記載のｇＲＮＡ。
［２８］前記標的塩基配列が、ＨＬＡ遺伝子のエクソン２又は３にマッピングされる、［２５］～［２７］のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
［２９］レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞をゲノム編集により製造するための標的塩基配列の特定方法であって、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、候補塩基配列をマッピングすることと、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、前記候補塩基配列をマッピングすることと、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に１つの標的とするＨＬＡハプロタイプにしかマッピングされず、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない前記候補塩基配列を、標的塩基配列として特定することと、を含む、方法。
［３０］レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞をゲノム編集により製造するための標的塩基配列の特定方法であって、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、候補塩基配列をマッピングすることと、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、前記候補塩基配列をマッピングすることと、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされ、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない前記候補塩基配列を、標的塩基配列として特定することと、を含む、方法。
本発明によれば、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を製造する技術を提供することができる。
（ａ）は、実験例１で抽出したｓｇＲＮＡが標的とするＨＬＡアレルをベン図で示したものである。（ｂ）は、実験例１で同定したｓｇＲＮＡが、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ｃアレルのどの場所を標的としているかを示した図である。 実験例２におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例３におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例４におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４における、ｉＰＳ細胞のＩＦＮ－γ処理とＨＬＡ－Ａタンパク質の発現量の解析のスケジュールを示す図である。 （ａ）は、実験例６におけるｓｇＲＮＡの標的部位及び標的塩基を示す図である。（ｂ）は、実験例６におけるＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイの結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例７におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例７における各クローンの塩基配列変異の割合を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例８におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例８におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例８において回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｂ）は、実験例８において回収した代表例なクローンの塩基配列である。 実験例９におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例９において回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｂ）は、実験例９において回収した代表例なクローンの塩基配列である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１０において回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｃ）は、実験例１０において回収した代表例なクローンの塩基配列である。 （ａ）は、実験例１１において回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｂ）は、実験例１１において回収した代表例なクローンの塩基配列である。 （ａ）は、実験例１１におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１１において回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｃ）は、実験例１１において回収した代表例なクローンの塩基配列である。 （ａ）は、実験例１２におけるｓｇＲＮＡの標的部位を示す図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例１２におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１２において回収したクローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｂ）は、実験例１２において回収したクローンの塩基配列である。 （ａ）は、実験例１３におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｂ）及び（ｄ）は、実験例１３において回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｃ）及び（ｅ）は、実験例１３において回収した代表例なクローンの塩基配列である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１４におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例１４において回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｄ）は、実験例１４において回収した代表例なクローンの塩基配列である。 （ａ）は、実験例１５におけるｓｇＲＮＡの標的部位を示す図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例１５におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１６における相同組換えを説明する模式図である。（ｃ）は、実験例１５におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１６における塩基配列の解析結果を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１７におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例１７における塩基配列の解析結果を示す図である。 （ａ）は、実験例１８におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１８における塩基配列の解析結果を示す図である。 （ａ）～（ｅ）は、実験例１９におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｆ）は、実験例２０におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例２１におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例２２の手順を示す模式図である。 （ａ）～（ｅ）は、実験例２２におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例２３の手順を示す模式図である。 実験例２３の結果を示すグラフである。 実験例２４の結果を示すグラフである。 実験例２５の結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は実験例２６におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例２６の結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｇ）は、実験例２７におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例２８の結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｆ）は、実験例２９の結果を示す位相差顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｆ）は、実験例３０の結果を示す位相差顕微鏡写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例３１におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例３１の結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例３２におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例３２の結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３３における実験スケジュールを説明した図である。（ｂ）は、実験例３３においてＥＢ由来血球様細胞の蛍光を撮影した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例３３におけるＥＢ由来血球様細胞の生存率を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３４におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３４の結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３５におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３５の結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例３６におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３７における実験スケジュールを説明した図である。（ｂ）は、実験例３７においてＥＢ由来血球様細胞の蛍光を撮影した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例３７におけるＥＢ由来血球様細胞の相対的生存率を示すグラフである。 実験例３８の結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３９で使用した５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＨＬＡハプロタイプ、及び、実験例３９で作製した、ＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＨＬＡハプロタイプを示す表である。（ｂ）は、実験例３９で得られた各クローンの塩基変異パターンを示す図である。（ｃ）は、実験例３９で得られた代表例なクローンの塩基配列である。 （ａ）～（ｄ）は、実験例４０におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例４１におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例４２の手順を説明する図である。 （ａ）は実験例４２におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４２で得られた各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例４２で得られた各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。 様々な人種におけるＨＬＣ－Ｃアレルのアレル頻度を示す表である。 実験例４３で得られた各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。 実験例４４で得られた各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例４５におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例４６におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例４７で得られた各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。 実験例４８で得られた各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。 実験例４９で得られた各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。
［拒絶反応が低減された低抗原性細胞の製造方法］
（第１実施形態）
第１実施形態の製造方法は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を、ドナー細胞から製造する製造方法であって、（ａ）前記ドナー細胞及び前記レシピエントのＨＬＡアレルをそれぞれ決定することと、（ｂ）前記レシピエントに存在せず前記ドナー細胞に存在するＨＬＡアレルを特定することと、（ｃ）特定された前記ＨＬＡアレルを破壊又は改変し、前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を含む細胞集団を得ることと、を含み、前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しない細胞が前記低抗原性細胞である、製造方法である。
実施例において後述するように、第１実施形態の製造方法によれば、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応（移植片対宿主病）が低減された低抗原性細胞を製造することができる。また、実施例において後述するように、第１実施形態の製造方法によって製造した低抗原性細胞は、レシピエントに他家移植した場合においても、レシピエントのＮＫ細胞によって攻撃されにくい。
本明細書において、ＨＬＡ遺伝子座を「ＨＬＡアレル」といい、細胞表面に提示されたＨＬＡタンパク質の抗原多様性を「ＨＬＡ型」という場合がある。以下、各工程について説明する。
（工程（ａ））
本工程において、ドナー細胞及びレシピエントのＨＬＡアレルをそれぞれ決定する。ドナー細胞は、ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物細胞であってもよい。また、ドナー細胞は多能性幹細胞であってもよいし、分化した細胞であってもよい。本明細書において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を意味する。
また、第１実施形態の製造方法により製造される低抗原性細胞は、ドナー細胞のＨＬＡアレルを破壊又は改変した細胞である。したがって、低抗原性細胞はドナー細胞と同様の多能性幹細胞であってもよいし、分化した細胞であってもよい。
また、レシピエントは、低抗原性細胞と同種の動物であることが好ましい。レシピエントは、実際に移植が予定された患者であってもよいし、将来レシピエントとなりうる仮想的なＨＬＡアレルを有するレシピエントであってもよい。
ＨＬＡアレルの決定は、ＰＣＲ－ｒＳＳＯ法（ＰＣＲ－ｒｅｖｅｒｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ－ＳＳＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）法、ＰＣＲ－ＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ）法、次世代シーケンス法等の従来行われている方法により行うことができ、市販のＨＬＡタイピングキット等を用いて行うことができる。また、全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）、エクソームシーケンス（ＷＥＳ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ等の次世代シーケンサーのシーケンスデータからＨＬＡタイピングを行うソフトウェアとして、ＨＬＡｒｅｐｏｒｔｅｒ、ＨＬＡ－ＰＲＧ、ｈｌａ－ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ、ＰＨＬＡＴ、Ｏｐｔｉｔｙｐｅ、ｎｅＸｔｙｐｅ、Ａｔｈｌａｔｅｓ、ＨＬＡｆｏｒｅｓｔ、ＳＯＡＰ－ＨＬＡ、ＨＬＡｍｉｎｅｒ、ｓｅｑ２ＨＬＡ、ＧＡＴＫ ＨＬＡ Ｃａｌｌｅｒ等が知られている。
本工程において決定されるＨＬＡアレルは、細胞移植を行った場合の拒絶反応に関連性が高いＨＬＡアレルであることが好ましく、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルを含むことが好ましい。
本工程において決定されるＨＬＡアレルは、更にＨＬＡ－ＤＲアレル、ＨＬＡ－ＤＱアレル、ＨＬＡ－ＤＰアレルを含んでいてもよく、更に他のＨＬＡアレルを含んでいてもよい。
（工程（ｂ））
本工程において、レシピエントに存在せずドナー細胞に存在するＨＬＡアレル（以下、「ドナー特異的ＨＬＡアレル」という場合がある。）を特定する。ドナー特異的ＨＬＡアレルは、ドナー細胞のＨＬＡアレル及びレシピエントのＨＬＡアレルを比較することにより特定することができる。
ＨＬＡアレルはゲノムＤＮＡ上にコードされた塩基配列であり、ＨＬＡタンパク質をコードしている。ＨＬＡタンパク質の血清学的な分類をＨＬＡ抗原型という。ＨＬＡ抗原型の特定方法としては、特定のＨＬＡ抗原型を認識する血清や抗体との反応性を解析する方法や、ＨＬＡアレルのＤＮＡ又はＨＬＡアレルから転写されたＲＮＡの塩基配列を、既存の対応表やＩＰＤ－ＩＭＧＴデータベース（https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）等と照合する方法等が挙げられる。
ＨＬＡ抗原型とは、一般的にはＨＬＡアレル表記（http://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html）の第１区域（２桁表記）の違いを指す場合もあるが、本明細書では、血清学的には同じＨＬＡ抗原型であってもアミノ酸配列が異なる場合（非同義置換）には異なるＨＬＡアレルであると判断する。
具体的には、ＨＬＡアレル表記の第１区域及び第２区域（４桁表記）の違いから同一のＨＬＡアレルであるか、異なるＨＬＡアレルであるかを判断する。そして、ＨＬＡアレル表記の第１区域及び第２区域が一致したＨＬＡアレルは同一のＨＬＡアレルであると判断する。また、ゲノム編集の標的配列を決定する場合等、ゲノムの塩基配列を区別する必要がある場合には、第３区域（アミノ酸変異を伴わない翻訳領域内部の塩基置換）や第４区域（翻訳領域外での塩基置換）の違いも考慮する場合がある。
（工程（ｃ））
レシピエントに存在しないＨＬＡ抗原型のＨＬＡタンパク質を有する細胞をレシピエントに他家移植すると、拒絶反応が生じて移植した細胞が拒絶されてしまう。そこで、本工程において、ドナー特異的ＨＬＡアレルを破壊又は改変し、前記ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質（以下、「ドナー特異的ＨＬＡタンパク質」という場合がある。）を発現しない細胞を含む細胞集団を得る。
ここで、ドナー特異的ＨＬＡタンパク質を発現しない細胞とは、ドナー細胞のＨＬＡアレルの破壊によって特定のＨＬＡタンパク質の発現が陰性となった細胞、又はドナー細胞のＨＬＡアレルの改変によって特定のＨＬＡ型から別のＨＬＡ型へと変化した細胞である。
本工程により得られた、ドナー特異的ＨＬＡタンパク質を発現しない細胞が低抗原性細胞である。なお、ドナー特異的ＨＬＡタンパク質が存在しない場合には、本工程は不要である。
第１実施形態の製造方法により製造される低抗原性細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子が破壊されていないことが好ましい。これにより、クラスＩのＨＬＡタンパク質が細胞表面に提示され、低抗原性細胞をレシピエントに他家移植した場合においても、レシピエントのＮＫ細胞によって攻撃されにくくなる。また、一部のＨＬＡが破壊されただけであり、残りのＨＬＡが抗原提示能力を保持しているため、当該細胞がウイルス感染した場合や腫瘍化した場合であっても、抗原提示能力を維持することが可能である。
《ゲノム編集》
実施例において後述するように、ドナー細胞のＨＬＡアレルの破壊又は改変は、例えばゲノム編集により行うことができる。ＨＬＡアレルの破壊は、ＨＬＡアレルを特異的に切断して二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導することにより行うことができる。ＤＳＢの修復過程で塩基が欠失又は付加されてフレームシフト変異が生じた場合、ＨＬＡアレルが破壊されて、ＨＬＡタンパク質が発現しなくなる。本明細書において、ＨＬＡアレルの破壊をＨＬＡアレルのノックアウトという場合がある。
また、ドナーＤＮＡの存在下でＨＬＡアレルを特異的に切断してＤＳＢを誘導することにより、ＤＳＢの修復過程で相同組換えを誘導し、ＨＬＡアレルを改変することができる。具体的には、例えば、実施例において後述するように、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７アレルをＨＬＡ－Ａ＊０１：０１アレルに改変すること等が可能である。
ドナーＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ切断の位置の前後を含む領域と配列同一性を有し、且つ所望のＨＬＡアレルをコードするものを使用するとよい。ドナーＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし、二本鎖ＤＮＡでもよい。また、ドナーＤＮＡは、単一の塩基配列を有するＤＮＡであってもよいし、複数の塩基配列を有するＤＮＡの混合物であってもよい。
ここで、配列同一性を有するとは、ドナーＤＮＡと標的となるゲノムＤＮＡの二本鎖切断の位置を含む領域との間で９０％以上の塩基配列が一致することを意味する。ドナーＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの二本鎖切断の位置を含む領域と９５％以上の塩基配列が一致することが好ましく、９９％以上の塩基配列が一致することがより好ましい。
ドナーＤＮＡは、５０～５，０００塩基程度の一本鎖ＤＮＡであってもよいし、５０～５，０００塩基対程度の二本鎖ＤＮＡであってもよい。ドナーＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである場合、ドナーＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの二本鎖のうちのいずれの鎖と配列同一性を有していてもよい。
《配列特異的ＤＮＡ切断酵素》
一般的に、ＤＳＢを誘導してゲノム編集を行うために利用する配列特異的ＤＮＡ切断酵素は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと人工ヌクレアーゼに大別される。配列特異的ＤＮＡ切断酵素はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであってもよく、人工ヌクレアーゼであってもよい。
配列特異的ＤＮＡ切断酵素は、ゲノムＤＮＡを標的配列特異的に切断して二本鎖切断を形成するものであれば特に制限されない。配列特異的ＤＮＡ切断酵素が認識する標的配列の長さは、例えば、１０～６０塩基程度であってよい。
また、配列特異的ＤＮＡ切断酵素は、例えばニッカーゼを複数組み合わせてＤＮＡを切断する態様であってもよい。ここで、ニッカーゼとは、二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖にニックを形成する酵素を意味する。例えば、ゲノムＤＮＡ上の近接した位置において、二本鎖ＤＮＡの双方の鎖にニックを形成することにより、二本鎖切断を形成することができる。
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとは、ガイドとなる短鎖ＲＮＡが標的配列に結合し、２つのＤＮＡ切断ドメイン（ヌクレアーゼドメイン）を有するヌクレアーゼをリクルートして配列特異的な切断を誘導する酵素である。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリータンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリータンパク質は大きくクラス１とクラス２に分類されており、クラス１の中にはタイプＩ、タイプＩＩＩ及びタイプＩＶが含まれ、クラス２の中にはタイプＩＩ、タイプＶ及びタイプＶＩが含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリータンパク質としては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃ２Ｃ２等が挙げられる。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリータンパク質のホモログであってもよく、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリータンパク質が改変されたものであってもよい。例えば、２つ存在する野生型のヌクレアーゼドメインの一方を不活性型に改変したニッカーゼ改変型のヌクレアーゼであってもよい。あるいは、標的特異性の向上したＣａｓ９－ＨＦやＨｉＦｉ－Ｃａｓ９、ｅＣａｓ９等であってもよい。
Ｃａｓ９は、例えば、化膿性レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス等に由来するものが挙げられる。Ｃｐｆ１としては、例えば、アシダミノコッカス、ラクノスピラ、クラミドモナス、フランシセラ－ノビサイダ等に由来するものが挙げられる。
人工ヌクレアーゼは、標的配列に特異的に結合するように設計・作製されたＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼドメイン（制限酵素であるＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン等）とを有する人工制限酵素である。人工ヌクレアーゼとしては、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。
《配列特異的ＤＮＡ切断酵素の導入》
ドナー細胞に導入する配列特異的ＤＮＡ切断酵素として、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを用いる場合、標的塩基配列はｇＲＮＡによって決定される。ｇＲＮＡの詳細については後述する。ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態でドナー細胞に導入してもよいし、発現ベクターの形態でドナー細胞に導入し、細胞内で発現させてもよい。
ｇＲＮＡをＲＮＡの形態で調製する方法としては、ｇＲＮＡをコードする核酸断片の上流にＴ７等のプロモーターを付加したコンストラクトを作製して試験管内転写反応で合成する方法、化学合成する方法等が挙げられる。ｇＲＮＡを化学合成する場合、化学修飾されたＲＮＡを用いてもよい。
発現ベクターとしては、Ｈ１プロモーター又はＵ６プロモーター等のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからｇＲＮＡを転写するプラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターを用いてｇＲＮＡを発現させる場合には、ｇＲＮＡを恒常的に発現させてもよいし、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させてもよい。
続いて、Ｃａｓ９を用意する。Ｃａｓ９は、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターから発現する発現ベクターの形態でドナー細胞に導入してもよいし、精製タンパク質の形態でドナー細胞に導入してもよい。発現ベクターとしては、トランスポゾンベクター、ウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。
ｇＲＮＡ及びＣａｓ９のドナー細胞への導入は、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９がウイルスベクターの形態である場合にはドナー細胞の培地に添加するだけよい。ウイルスベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、バキュロウイルスベクター等が挙げられる。
ｇＲＮＡ及びＣａｓ９が、トランスポゾンベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等である場合や、ｇＲＮＡがＲＮＡであり、Ｃａｓ９が精製タンパク質である場合には、トランスフェクション試薬やエレクトロポレーション法によりドナー細胞に導入すればよい。
トランスフェクション試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ、ＲＮＡＭＡＸ（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＦｕＧＥＮＥ ６、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ(いずれもプロメガ社)等を利用することができる。
また、エレクトロポレーション法は、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン株式会社）、Ｎｅｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ロンザ社）等の機器を利用して行うことができる。
（工程（ｄ））
工程（ｃ）において、ドナー特異的ＨＬＡタンパク質を発現しない、低抗原性細胞を含む細胞集団を得ることができる。しかしながら、工程（ｃ）で得られる細胞集団は、目的とするＨＬＡアレルの破壊又は改変が行われた細胞（低抗原性細胞）以外にも、ＨＬＡアレルの破壊又は改変が行われなかった細胞、ＨＬＡアレルの破壊又は改変が不完全に行われた細胞等を含んでいる場合がある。そこで、工程（ｃ）の後に、ドナー特異的ＨＬＡタンパク質を発現しない細胞（低抗原性細胞）を回収する工程（ｄ）を更に実施してもよい。
工程（ｄ）は、低抗原性細胞を含む細胞集団にＨＬＡタンパク質の発現誘導剤（ＨＬＡタンパク質発現誘導剤）を接触させる工程と、前記ＨＬＡタンパク質発現誘導剤に接触した前記細胞集団における前記ドナー特異的ＨＬＡタンパク質の発現を指標として、前記細胞集団から前記ドナー特異的ＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を回収する工程とを含む。細胞集団にＨＬＡタンパク質発現誘導剤を接触させる工程は、例えば細胞集団の培地にＨＬＡタンパク質発現誘導剤を添加すること等により行うことができる。
本工程において、ドナー特異的ＨＬＡタンパク質の発現を指標として前記細胞集団からドナー特異的ＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を回収するとは、発現したＨＬＡタンパク質の存在を検出し、その存在又は不存在に基づいてドナー特異的ＨＬＡタンパク質を発現しない細胞を回収することであってよい。
ＨＬＡタンパク質発現誘導剤としては、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β等のサイトカインが挙げられる。これらの発現誘導剤は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。
上記のサイトカインは、ヒト細胞へ用いる場合にはヒト由来のサイトカインであることが好ましい。ヒトＩＦＮ－γタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０００６１０．２等であり、ヒトＩＦＮ－αタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０７６９１８．１、ＮＰ＿０００５９６．２、ＮＰ＿０６６５４６．１等であり、ヒトＩＦＮ－βタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００２１６７．１等であり、ヒトＩＬ－４タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０００５８０．１、ＮＰ＿７５８８５８．１、ＮＰ＿００１３４１９１９．１等であり、ヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０００７４９．２等であり、ヒトＴＧＦ－αタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１０９３１６１．１、ＮＰ＿００３２２７．１、ＮＰ＿００１２９５０８８．１、ＮＰ＿００１２９５０８７．１等であり、ヒトＴＧＦ－βタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０００６５１．３、ＸＰ＿０１１５２５５４４．１等である。
上記のサイトカインは、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導する活性を有している限り、上記の各アクセッション番号に記載されるアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。より具体的には、上記の各アクセッション番号に記載されるアミノ酸配列に対し、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。ここで、１若しくは数個のアミノ酸とは、例えば１～１０アミノ酸、例えば１～５アミノ酸、例えば１～３アミノ酸であってよい。上記のサイトカインは、更に、シグナルペプチドが除去されたアミノ酸配列を有していてもよい。
多能性幹細胞は、一般的に未分化状態において、ＨＬＡタンパク質を細胞表面に発現しておらずＨＬＡタンパク質の検出が困難であることが知られている。ＨＬＡタンパク質を提示させるためには分化誘導を行う必要がある。しかしながら、分化誘導プロセスは一般的に煩雑であり時間もかかる。また、一度分化誘導させた細胞は自発的に未分化状態に戻らないため、ＨＬＡタンパク質陰性の分化細胞集団を回収したとしても、それはもはや多能性幹細胞ではない。
これに対し、発明者らは、上述したＨＬＡタンパク質発現誘導剤を多能性幹細胞に作用させることにより、多能性幹細胞の多能性を維持したまま、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導することができることを明らかにした。
これにより、工程（ｄ）で得られた細胞集団におけるＨＬＡタンパク質の発現を誘導し、目的とするＨＬＡアレルの破壊又は改変が行われた多能性幹細胞（低抗原性細胞）を効率よく検出し、回収することができる。
例えば、細胞におけるＨＬＡタンパク質の発現を誘導させた後、細胞を抗ＨＬＡタンパク質抗体で染色することにより、フローサイトメーターでＨＬＡ発現細胞又は非発現細胞を区別してソーティングにて回収することができる。
あるいは、抗ＨＬＡタンパク質抗体を磁気ビーズに吸着させて、ＨＬＡタンパク質発現細胞に接触させ、磁気ビーズが結合した細胞を、磁力を用いて回収することもできる。
あるいは、培養皿上の特定のＨＬＡタンパク質を発現する細胞を抗ＨＬＡタンパク質抗体等で標識し、不要な目的外細胞を吸引又はレーザー照射等により除去し、目的とする低抗原性細胞のみを回収してもよい。
あるいは、培養皿上のＨＬＡタンパク質発現細胞に、目的外のＨＬＡタンパク質を認識するＴ細胞を混合し、目的外のＨＬＡタンパク質を発現している細胞だけを攻撃して除去し、目的とする低抗原性細胞のみを回収してもよい。
第１実施形態の製造方法は、ドナー細胞のＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル及びＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つのアレルを更に破壊又は改変する工程を更に含んでいてもよい。ＣＩＩＴＡ遺伝子は、Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒタンパク質をコードする遺伝子である。また、ＲＦＸ５遺伝子は、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ５タンパク質をコードする遺伝子である。また、ＲＦＸＡＰ遺伝子は、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子である。また、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子は、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子である。
ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子と共に、ＨＬＡクラスＩＩの転写活性化を制御する転写因子をコードしている。したがって、ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル、ＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つが破壊された細胞は、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質を発現せず、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が更に低減されている。
ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０００２４６．３、ＮＭ＿００１２８６４０２．１、ＮＭ＿００１２８６４０３．１等であり、ヒトＲＦＸ５遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０００４４９．３、ＮＭ＿００１０２５６０３．１等であり、ヒトＲＦＸＡＰ遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０００５３８．３等であり、ヒトＲＦＸＡＮＫ遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１２７８７２７．１、ＮＭ＿００１２７８７２８．１、ＮＭ＿００３７２１．３、ＮＭ＿１３４４４０．２等である。
（第２実施形態）
第２実施形態の製造方法は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を、ドナー細胞から製造する製造方法であって、前記ドナー細胞のＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル及びＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つ以上を含むアレルを破壊又は改変すること、を含み、前記ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル及びＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つ以上を含むアレルが破壊又は改変された細胞が前記低抗原性細胞である、製造方法である。本実施形態の製造方法は、ＨＬＡアレルを破壊しない点で上述した第１実施形態の製造方法と主に異なる。
上述したように、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子及びＲＦＸＡＮＫ遺伝子の発現は、クラスＩＩのＨＬＡタンパク質の発現に必須であることが知られている。したがって、ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル、ＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つが破壊された細胞は、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質を発現せず、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減されている。
第２実施形態の製造方法において、ドナー細胞は上述したものと同様の多能性幹細胞であってもよいし、分化した細胞であってもよい。
また、レシピエントは、低抗原性細胞と同種の動物であることが好ましい。レシピエントは、実際に移植が予定された患者であってもよいし、将来レシピエントとなりうる仮想的なＨＬＡアレルを有するレシピエントであってもよい。
また、上述したように、Ｂ２Ｍアレルを破壊した細胞は、ＨＬＡアレルが野生型であってもＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しない。第２実施形態の製造方法は、ドナー細胞のＢ２Ｍアレルを破壊する工程を更に含んでいてもよい。
ドナー細胞のＣＩＩＴＡアレル又はＢ２Ｍアレルの破壊は、例えばゲノム編集により行うことができる。ゲノム編集については上述したものと同様である。
［低抗原性細胞の検出用キット］
１実施形態において、本発明は、ＨＬＡタンパク質発現誘導剤を含む、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞の検出用キットを提供する。本実施形態のキットにより低抗原性細胞を検出して回収することができる。したがって、本実施形態のキットは、低抗原性細胞の回収用キットであるということもできる。
本実施形態のキットにおいて、ＨＬＡタンパク質発現誘導剤は、上述したものと同様であり、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β等のサイトカインが挙げられる。本実施形態のキットは、これらの発現誘導剤のうち１種を単独で含んでいてもよいし、２種以上を含んでいてもよい。
本実施形態のキットにおいて、低抗原性細胞は多能性幹細胞であってもよい。実施例において後述するように、本実施形態のキットによれば、低抗原性細胞が多能性幹細胞である場合においても、低抗原性細胞の多能性を維持したまま、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導することができる。
［細胞］
（第１実施形態）
第１実施形態に係る細胞は、少なくとも１つのＨＬＡアレルが破壊又は改変され、少なくとも１種のＨＬＡタンパク質を発現可能な細胞である。第１実施形態の細胞は多能性幹細胞であってもよいし、分化した細胞であってもよい。第１実施形態の細胞において、破壊又は改変された少なくとも１つのＨＬＡアレルはクラスＩ ＨＬＡアレルであることが好ましい。
多能性幹細胞は、通常ＨＬＡタンパク質の発現が弱い。ここで、発現が弱いとは、例えば、抗ＨＬＡタンパク質抗体で細胞を染色してフローサイトメトリー解析を行った場合に、ＨＬＡタンパク質の発現を明確に検出できないことを意味する。
しかしながら、実施例において後述するように、多能性幹細胞にＨＬＡタンパク質発現誘導剤を接触させると、ＨＬＡタンパク質の発現が増強される。第１実施形態の細胞において、「少なくとも１種のＨＬＡタンパク質を発現可能」とは、細胞が、多能性幹細胞等の、通常ＨＬＡタンパク質の発現が弱い細胞である場合であっても、例えば、上述したＨＬＡタンパク質発現誘導剤を接触させることにより、ＨＬＡタンパク質の発現が増強される細胞であることを意味する。また、第１実施形態の細胞は、分化し、ＨＬＡタンパク質を発現した細胞であってもよい。
実施例において後述するように、例えば、Ｂ２Ｍアレルを破壊した細胞は、ＨＬＡアレルが野生型であってもＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しない。第１実施形態の細胞はこのような細胞を含まないものとする。
第１実施形態の細胞において、破壊又は改変されたＨＬＡアレルは、クラスＩ ＨＬＡアレルを含むことが好ましく、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル又はＨＬＡ－Ｃアレルを含むことが好ましい。
第１実施形態の細胞は、少なくとも１種のクラスＩ ＨＬＡタンパク質を発現するため、レシピエントに他家移植した場合においても、レシピエントのＮＫ細胞によって攻撃されにくくなる。ここで、少なくとも１種のクラスＩ ＨＬＡタンパク質としては、ＨＬＡ－Ｃタンパク質、ＨＬＡ－Ｅタンパク質、ＨＬＡ－Ｇタンパク質等が挙げられる。第１実施形態の細胞は、一部のＨＬＡが破壊されただけであり、残りのＨＬＡが抗原提示能力を保持しているため、当該細胞がウイルス感染した場合や腫瘍化した場合であっても、抗原提示能力を維持することが可能である。
第１実施形態の細胞は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞であり、破壊又は改変された前記ＨＬＡアレルが、前記レシピエントに存在しないＨＬＡアレルであってもよい。上記の低抗原性細胞は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減されている。
第１実施形態の低抗原性細胞は、レシピエントと同種の細胞であることが好ましく、ヒト細胞であってもよく非ヒト動物細胞であってもよい。レシピエントは、実際に移植が予定された患者であってもよいし、将来レシピエントとなりうる仮想的なＨＬＡアレルを有するレシピエントであってもよい。
第１実施形態の細胞は、ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル及びＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つ以上を含むアレルが更に破壊又は改変されていてもよい。上述したように、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子及びＲＦＸＡＮＫ遺伝子の発現はクラスＩＩのＨＬＡタンパク質の発現に必須であることが知られている。したがって、ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル、ＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つが破壊された細胞は、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質を発現せず、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が更に低減されている。
（第２実施形態）
第２実施形態に係る細胞は、ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル及びＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つ以上を含むアレルが破壊又は改変された細胞である。上述したように、ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル、ＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つ以上を含むアレルが破壊又は改変された細胞は、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質を発現せず、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞である。
第２実施形態に係る細胞は、ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現していてもよい。第２実施形態の細胞が、レシピエントへの他家移植に有用な場合がある。
第２実施形態の細胞は多能性幹細胞であってもよいし、分化した細胞であってもよい。また、上述したように、Ｂ２Ｍアレルを破壊した細胞は、ＨＬＡアレルが野生型であってもＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しない。第２実施形態の細胞は、ＣＩＩＴＡアレル、ＲＦＸ５アレル、ＲＦＸＡＰアレル、ＲＦＸＡＮＫアレルのうち少なくとも１つに加えてＢ２Ｍアレルが更に破壊されていてもよい。
第２実施形態の低抗原性細胞は、レシピエントと同種の細胞であることが好ましく、ヒト細胞であってもよく非ヒト動物細胞であってもよい。レシピエントは、実際に移植が予定された患者であってもよいし、将来レシピエントとなりうる仮想的なＨＬＡアレルを有するレシピエントであってもよい。
（低抗原性細胞の用途）
上述した、第１実施形態及び第２実施形態の細胞は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞である。そこで、細胞治療や再生医療に利用することができる。
低抗原性細胞が多能性幹細胞である場合には、例えば、神経細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、腎細胞、造血幹細胞、細胞傷害性Ｔ細胞等に分化させたうえで、患者に移植してもよい。
また、低抗原性細胞に遺伝子導入を行ったうえで患者に移植してもよい。例えば、多能性幹細胞をＴ細胞に分化させたうえでキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を遺伝子導入し、ＣＡＲ－Ｔ細胞として癌患者等に移植すること等が挙げられる。
［標的塩基配列の特定方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞をゲノム編集により製造するための標的塩基配列の特定方法であって、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、候補塩基配列をマッピングすることと、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、前記候補塩基配列をマッピングすることと、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に１つの標的とするＨＬＡハプロタイプにしかマッピングされず、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない前記候補塩基配列を、標的塩基配列として特定することとを含む方法を提供する。
第１実施形態の方法により、後述する第１実施形態のｇＲＮＡの標的塩基配列を特定することができる。後述するように、第１実施形態のｇＲＮＡは、特定のＨＬＡハプロタイプ特異的にＤＳＢを誘導することができ、オフターゲット変異導入のリスクも低い。
上述したように、ＨＬＡ遺伝子は多くの偽遺伝子を持ち、お互いのＨＬＡ遺伝子配列の相同性が高いうえ、個人間での配列多様性が大きい。このため、配列特異的ＤＮＡ切断酵素を用いたゲノム編集の適切な標的塩基配列を決定することは容易ではない。
ＨＬＡ遺伝子特異的な配列特異的ＤＮＡ切断酵素の標的塩基配列の特定は、例えば、次のようにして行うことができる。まず、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データ（既知の全ＨＬＡ遺伝子の塩基配列データ）を入手する。全ＨＬＡ遺伝子の塩基配列データは、例えば、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）から入手することができる。本データベースには、２０１７年７月現在、１２，５４４件のＨＬＡクラスＩ遺伝子の塩基配列と４，６２２件のＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の塩基配列が登録されている。
続いて、各ＨＬＡアレルの塩基配列から、使用する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の標的となる塩基配列を抽出する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを配列特異的ＤＮＡ切断酵素として用いる場合、３～５塩基程度のＰＡＭ配列（例えば、化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９の場合「ＮＧＧ」、アシダミノコッカス由来のＣｐｆ１の場合「ＴＴＴＮ」）を含む、ｇＲＮＡの標的塩基配列として利用可能な塩基配列を抽出し、候補塩基配列とする。
本実施形態の方法において、標的塩基配列はＰＡＭ配列を含むものとする。ＰＡＭ配列を含む標的塩基配列の長さは、配列特異的ＤＮＡ切断酵素により異なる。例えば、配列特異的ＤＮＡ切断酵素が化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９である場合、ＰＡＭ配列を含む標的塩基配列の長さは、１９～３３塩基であることが好ましく、２０～２４塩基であることがより好ましい。また、配列特異的ＤＮＡ切断酵素がアシダミノコッカス由来のＣｐｆ１である場合、ＰＡＭ配列を含む標的塩基配列の長さは、２０～３４塩基であることが好ましく、約２４塩基であることがより好ましい。
続いて、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、ＰＡＭ配列を含む候補塩基配列をマッピングする。
マッピングとは、リファレンス塩基配列（ここでは全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データを意味する。）上の、クエリー塩基配列（ここでは候補塩基配列を意味する。）の配列同一性が高い位置を特定する操作である。クエリー塩基配列とリファレンス塩基配列との配列同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることが更に好ましく、１００％であることが特に好ましい。
ここで、リファレンス塩基配列に対する、クエリー塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、リファレンス塩基配列及びクエリー塩基配列をアラインメントする。続いて、リファレンス塩基配列及びクエリー塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／クエリー塩基配列の総塩基数×１００ （１）
実施例において後述するように、マッピングは、例えば、Ｂｏｗｔｉｅプログラム（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）を用いて行うことができる。また、マッピングは、ＢＷＡ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、ＳＯＡＰ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、ＴｏｐＨａｔ等の、Ｂｏｗｔｉｅプログラム以外の配列相同性（配列同一性）検索プログラムを用いて行ってもよい。
続いて、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、前記候補塩基配列をマッピングする。全ゲノムＤＮＡの塩基配列データとしては、リファレンス・ヒトゲノム配列（Ｈｇ１９）等を用いることができる。また、マッピングには、Ｂｏｗｔｉｅプログラムや、Ｂｏｗｔｉｅプログラム以外の配列相同性検索プログラムを用いることができる。
続いて、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に１つの標的とするＨＬＡハプロタイプにしかマッピングされず、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない候補塩基配列を、標的塩基配列として特定する。ここで、標的とするＨＬＡハプロタイプとは、破壊又は改変する対象のＨＬＡハプロタイプを意味する。
実施例において後述するように、第１実施形態の方法により特定した標的塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡ（後述する第１実施形態のｇＲＮＡ）は、標的とする特定のＨＬＡハプロタイプ特異的にＤＳＢを誘導することができ、オフターゲット変異導入のリスクも低い。
ＨＬＡ遺伝子は８つのエクソンで構成されていることが多いが、標的塩基配列は、ＨＬＡ遺伝子のタンパク質コード領域を標的とすることが好ましい。標的塩基配列は、ＨＬＡタンパク質の細胞外ドメインをコードするエクソン１、２、３又は４を標的とすることが好ましく、エクソン２又は３を標的とすることが特に好ましい。
あるいは、標的塩基配列を２箇所に設定すると、その間の塩基配列を大きく削除することも可能である。これを利用するために、ＨＬＡ遺伝子のタンパク質をコードする遺伝子領域を含むように、２つ以上の標的塩基配列を設計してもよい。
また、標的塩基配列は、ＨＬＡ遺伝子以外の別のゲノム領域やミトコンドリアＤＮＡを標的としないものであることが好ましい。また、数塩基のミスマッチを許容した場合においても、ＨＬＡ遺伝子以外の領域を標的とする箇所が少ない標的塩基配列を選択することが好ましい。
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞をゲノム編集により製造するための標的塩基配列の特定方法であって、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、候補塩基配列をマッピングすることと、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対して、前記候補塩基配列をマッピングすることと、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされ、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない前記候補塩基配列を、標的塩基配列として特定することとを含む方法を提供する。
第２実施形態の方法は、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされる候補塩基配列を標的塩基配列として特定する点において、上述した第１実施形態の方法と主に異なる。
第２実施形態の方法において、候補塩基配列、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データ、全ゲノムＤＮＡの塩基配列データ、マッピングについては、上述した第１実施形態の方法と同様である。
本実施形態の方法により、後述する第２実施形態のｇＲＮＡの標的塩基配列を特定することができる。後述するように、第２実施形態のｇＲＮＡは、複数の標的とするＨＬＡ遺伝子（又はアレル）を切断することができる。このため、複数のＨＬＡ遺伝子を破壊又は改変する場合に必要なｇＲＮＡの種類を減らすことができる。これにより、ｇＲＮＡを作製するコストを減らすことができる。また、使用するｇＲＮＡの種類を減らすことにより、オフターゲット変異導入のリスクも減らすことができる。
［ｇＲＮＡ］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に１つの標的とするＨＬＡハプロタイプにしかマッピングされず、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列を、標的塩基配列とするｇＲＮＡを提供する。
第１実施形態のｇＲＮＡは、特定のＨＬＡハプロタイプ特異的にＤＳＢを誘導することができ、オフターゲット変異導入のリスクも低い。
本実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体であってもよいし、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせた単一の合成ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。いずれの構造のｇＲＮＡであっても標的塩基配列特異的にＤＳＢを誘導することができる。
標的塩基配列は、上述した方法により特定されたものであることが好ましい。上述したように、本明細書では、標的塩基配列は、ＰＡＭ配列を含む塩基配列である。そこで、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列をｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡのスペーサー塩基配列に用いる。
本実施形態のｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである場合、ｓｇＲＮＡの塩基配列は次の塩基配列とすることができる。
まず、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計する。スキャフォールド配列としては、例えば配列番号３９に記載の塩基配列を使用することができるがこれに限定されない。
配列番号３９に記載の塩基配列は、スキャフォールド配列として機能する限り、配列番号３９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であってもよい。ここで、１若しくは数個の塩基とは、例えば１～１０塩基、例えば１～５塩基、例えば１～３塩基であってよい。
設計したｓｇＲＮＡは化学合成等により調製することができる。ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡとして調製して直接ドナー細胞に導入してもよいし、ＤＮＡとして調製して発現ベクターに組み込み、発現ベクターの形態でドナー細胞に導入し、細胞内で発現させてもよい。
ｓｇＲＮＡを細胞内で発現させる場合、Ｕ６プロモーターやＨ１プロモーター等のポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いることができる。この場合、転写効率を向上させるために、ｓｇＲＮＡの５’末端の塩基配列をＧ又はＧＧに変更してもよい。ｓｇＲＮＡの５’末端の塩基配列をＧ又はＧＧに変更しても、Ｃａｓ９の切断活性にはほとんど影響がでない。
例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’」（配列番号６２）である場合、標的塩基配列を特異的に切断するｓｇＲＮＡの塩基配列は「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’」（配列番号６３）とすることができる。
本実施形態のｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体であってもよい。また、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、直接ドナー細胞に導入してもよいし、発現ベクターの形態でドナー細胞に導入し、細胞内で発現させてもよい。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを細胞内で発現させる場合、Ｕ６プロモーターやＨ１プロモーター等のポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いることができる。この場合、転写効率を向上させるために、ｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の塩基配列をＧ又はＧＧに変更してもよい。ｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の塩基配列をＧ又はＧＧに変更しても、Ｃａｓ９の切断活性にはほとんど影響がでない。
本実施形態のｇＲＮＡがｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体である場合、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの塩基配列は次の塩基配列とすることができる。
まず、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、ｃｒＲＮＡの塩基配列とする。例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’」（配列番号６２）である場合、ｃｒＲＮＡの塩基配列は「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’」（配列番号６４）とすることができる。また、ｔｒａｃｒＲＮＡの塩基配列は、例えば、「5’-CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’」（配列番号６５）とすることができる。
ｃｒＲＮＡの塩基配列は、ｃｒＲＮＡとして機能する限り、配列番号６４に記載の塩基配列に対して変異を有していてもよい。より具体的には、配列番号６４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であってもよい。ここで、１若しくは数個の塩基とは、例えば１～１０塩基、例えば１～５塩基、例えば１～３塩基であってよい。
また、ｔｒａｃｒＲＮＡの塩基配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして機能する限り、配列番号６５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であってもよい。ここで、１若しくは数個の塩基とは、例えば１～１０塩基、例えば１～５塩基、例えば１～３塩基であってよい。
設計したｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、化学合成等により調製することができる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮＡとして調製して直接ドナー細胞に導入してもよいし、ＤＮＡとして調製して発現ベクターに組み込み、発現ベクターの形態でドナー細胞に導入し、細胞内で発現させてもよい。
具体的な第１実施形態のｇＲＮＡとしては、配列番号３、４、７、４５～５２、７２～２４５９のいずれかに記載の塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡ、又は、配列番号３、４、７、４５～５２、７２～２４５９のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡが挙げられる。ここで、１若しくは数個の塩基とは、例えば１～１０塩基、例えば１～５塩基、例えば１～３塩基であってよい。例えば、スペーサー配列の５’末端を２～３塩基短くすることでＤＮＡへの結合能力を下げ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の配列認識特異性を高めることができる。
中でも、配列番号３、４、７、４５～５２のいずれかに記載の塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡ、又は、配列番号３、４、７、４５～５２のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡが好ましい。実施例において後述するように、これらの塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡにより、ＨＬＡハプロタイプ特異的にＨＬＡアレルを破壊又は改変し、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を製造することができる。
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされ、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列を、標的塩基配列とするｇＲＮＡを提供する。
具体的な第２実施形態のｇＲＮＡとしては、配列番号５３～５５、２４６０～８０１３のいずれかに記載の塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡ、又は、配列番号５３～５５、２４６０～８０１３のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡが挙げられる。ここで、１若しくは数個の塩基とは、例えば１～１０塩基、例えば１～５塩基、例えば１～３塩基であってよい。例えば、スペーサー配列の５’末端を２～３塩基短くすることでＤＮＡへの結合能力を下げ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の配列認識特異性を高めることができる。
中でも、配列番号５３～５５のいずれかに記載の塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡ、又は、配列番号５３～５５のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を標的塩基配列とするｇＲＮＡが好ましい。
また、上述したように、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの転写効率を向上させるために、ｇＲＮＡの５’末端の塩基配列をＧ又はＧＧに変更してもよい。
例えばＨＬＡ－Ａアレルに着目した場合、ＨＬＡ－Ａアレルには父親由来のＨＬＡ－Ａ遺伝子と母親由来のＨＬＡ－Ａ遺伝子の２つの遺伝子が存在し、それぞれＨＬＡ－Ａ遺伝子が異なる場合もあれば同一の場合もある。ＨＬＡ－Ａの抗原提示能力等を保持したい場合、一方のＨＬＡ－Ａ遺伝子だけを切断してノックアウトを誘導し、反対側のＨＬＡ－Ａ遺伝子は残す必要がある。あるいは、完全ノックアウトを誘導したい場合には、双方のＨＬＡ－Ａ遺伝子を切断する必要がある。
一般的に、２つの遺伝子をＣＲＩＳＰＲ－ｇＲＮＡの標的にする場合、２つのｇＲＮＡをデザインして別々にＤＮＡ切断を誘導することが一般的である。このため、複数のＨＬＡ遺伝子をノックアウトする場合、それぞれのＨＬＡ遺伝子に特異的なｇＲＮＡを用いることが考えられる。
これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、ＨＬＡ遺伝子が相互にＤＮＡ配列相同性が高いという特徴を利用して、１つのｇＲＮＡで複数のＨＬＡ遺伝子（例えばＨＬＡ－Ａ遺伝子の父親由来配列と母親由来配列の両方、あるいは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子とＨＬＡ－Ｂ遺伝子）の切断誘導が可能なｇＲＮＡを探索した所、このようなｇＲＮＡ配列を複数同定することができた。
実施例において後述するように、第２実施形態のｇＲＮＡを利用することにより、複数のＨＬＡ遺伝子（又はアレル）を切断する場合に必要なｇＲＮＡの種類を減らすことができる。これにより、ｇＲＮＡを作製するコストを減らすことができる。また、使用するｇＲＮＡの種類を減らすことにより、オフターゲット変異導入のリスクも減らすことができる。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－α又はＴＧＦ－βを有効成分とする、多能性幹細胞の多能性を維持したままＨＬＡタンパク質の発現を誘導する、ＨＬＡタンパク質発現誘導剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞の多能性を維持したままＨＬＡタンパク質の発現を誘導する方法であって、多能性幹細胞の培地にＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－α又はＴＧＦ－βを添加する工程を備える方法を提供する。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ｇＲＮＡの設計）
ＨＬＡ遺伝子は配列の個人差が大きく、一方でＨＬＡ遺伝子間の相同性が高いことから、特定のＨＬＡハプロタイプだけを切断するｇＲＮＡの塩基配列を設計することは困難であった。具体的には、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１アレルだけを認識するｇＲＮＡであって、他のＨＬＡ－ＡアレルやＨＬＡ－Ａ以外のＨＬＡ遺伝子、他のゲノム領域を認識しないｇＲＮＡ配列を設計することは困難であった。
そこで、次の方法により、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルを認識するｇＲＮＡの標的塩基配列を決定した。まず、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）から、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列を含む「hla_gen.fasta」ファイルをダウンロードして入手した。
続いて、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列から、「NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG」（配列番号４０）と一致する塩基配列を、ＳｐＣａｓ９のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の標的塩基配列の候補として抽出した。
続いて、各候補の塩基配列を全ＨＬＡハプロタイプの塩基配列に対してＢｏｗｔｉｅプログラム（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）を用いてマッピングし、各候補の塩基配列がどのＨＬＡ遺伝子に何カ所マッピングするかを解析した。なお、同様の操作はＢｏｗｔｉｅプログラム以外の配列相同性検索プログラムを用いて行うこともできる。
続いて、Ｂｏｗｔｉｅプログラムの結果をもとに、各ｓｇＲＮＡが、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル又はＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つのみに結合する場合、並びに、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｃアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレル、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレル等の２つ以上のＨＬＡアレルに結合する場合に分類した。
続いて、全ての候補の塩基配列をリファレンス・ヒトゲノム配列（Ｈｇ１９）に対してＢｏｗｔｉｅを用いてマッピングし、ＨＬＡアレル以外のゲノム領域へとマッピングされるかどうかの確認を行った。その結果、ＨＬＡアレルのみにマッピングされる候補の塩基配列を目的の標的塩基配列として抽出した。
図１（ａ）は、本実験例で抽出した標的塩基配列が、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ｃアレルのいずれを標的とするかをベン図で示したものである。図中の数字は、ｓｇＲＮＡの標的塩基配列の数を示す。その結果、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル又はＨＬＡ－Ｃアレルのいずれか１つのみを標的とするｓｇＲＮＡの標的塩基配列、並びに、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｃアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレル、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレル等の２つ以上のＨＬＡアレルを標的とするｓｇＲＮＡの標的塩基配列を多数決定することができた。
図１（ｂ）は、本実験例で同定したｓｇＲＮＡの標的塩基配列が、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ｃアレルのどの場所を標的としているかを示した図である。図１（ｂ）中、線で連結されたボックスは各ＨＬＡ遺伝子のエクソンを示し、ＨＬＡ－Ａアレルは左側にエクソン１が、ＨＬＡ－ＢアレルとＨＬＡ－Ｃアレルは右側にエクソン１が存在する。また、「［＋］ｓｔｒａｎｄ ｓｇＲＮＡｓ」はプラス鎖ＤＮＡを標的とする標的塩基配列を示し、「［－］ｓｔｒａｎｄ ｓｇＲＮＡｓ」はマイナス鎖ＤＮＡを標的とする標的塩基配列を示し、「Ｕｎｉｑｕｅ ｋ－ｍｅｒｓ」はヒトゲノム上で一箇所しか存在しない１０～１６ｍｅｒの塩基配列（「ｋ－ｍｅｒ配列」という。）の集合を示す。
この結果、Ｕｎｉｑｕｅ ｋ－ｍｅｒｓのピークが高い部位に、多数のｓｇＲＮＡ標的配列を見出すことができたことが明らかとなった。なお、プラス鎖ＤＮＡ又はマイナス鎖ＤＮＡのどちらにも相当数の標的塩基配列を見出すことができた。
配列番号３、４、７、４５～５２、７２～２４５９に、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に１つの標的とするＨＬＡハプロタイプにしかマッピングされず、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列として抽出された塩基配列を示す。また、下記表１に、一例として、一部の塩基配列について、標的とするＨＬＡアレルの数及び標的とするＨＬＡアレルを示す。
Figure 0007385281000001
また、配列番号５３～５５、２４６０～８０１３に、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされ、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列として抽出された塩基配列を示す。また、下記表２に、一例として、一部の塩基配列について、標的とするＨＬＡアレルの数及び標的とするＨＬＡアレルを示す。
Figure 0007385281000002
また、下記表３に、全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされ、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列として抽出された標的塩基配列について、標的とするＨＬＡアレルの数及び抽出された標的塩基配列の数を示す。
Figure 0007385281000003
［実験例２］
（ｉＰＳ細胞の刺激によるＨＬＡタンパク質の発現誘導１）
未分化ｉＰＳ細胞を刺激してＨＬＡタンパク質の発現を誘導することを試みた。具体的には、ｉＰＳ細胞の培地に１００ｎｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α、又は５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γを添加して４８時間処理後、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（品番：３１１４１８、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。
図２は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。その結果、ＩＦＮ－γを添加するとＨＬＡタンパク質の発現が上昇することが明らかとなった。
［実験例３］
（ｉＰＳ細胞の刺激によるＨＬＡタンパク質の発現誘導２）
ｉＰＳ細胞の培地に１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γを添加して４８時間処理後、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（品番：３１１４１８、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。
図３は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。その結果、ＩＦＮ－γを添加するとＨＬＡタンパク質の発現が上昇することが明らかとなった。その結果、いずれの濃度においても、ＩＦＮ－γを添加するとＨＬＡタンパク質の発現が上昇することが明らかとなった。
［実験例４］
（ｉＰＳ細胞の刺激によるＨＬＡタンパク質の発現誘導３）
ｉＰＳ細胞の培地に５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γを添加し、４時間、８時間、１６時間、２４時間、及び４８時間処理後、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（品番：７４００８２、ＢＤ社）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質の発現を検討した。
図４（ａ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）は、ｉＰＳ細胞のＩＦＮ－γ処理とＨＬＡ－Ａタンパク質の発現量の解析のスケジュールを示す図である。その結果、ＩＦＮ－γ処理時間を長くするほどＨＬＡタンパク質の発現が高くなることが明らかとなった。また、更なる検討の結果、ｉＰＳ細胞をＩＦＮ－γで４８時間処理した後、培地からＩＦＮ－γを除去して７日後においてもＨＬＡタンパク質の発現が持続していることが明らかとなった。
［実験例５］
（細胞のＨＬＡハプロタイプ決定）
以下の方法により、各細胞のＨＬＡハプロタイプ（両親から受け継いだ各ＨＬＡアレルの対）を決定した。
６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞及び１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞については、まず、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＷＥＳ（Ｗｈｏｌｅ Ｅｘｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）解析結果、及び、１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＷＧＳ（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）解析結果に基づいて、それぞれＦＡＳＴＱ配列ファイルを作成した。
続いて、各ＦＡＳＴＱ配列ファイルをリファレンス・ヒトゲノム配列（Ｈｇ１９）に対してマッピングし、ＢＡＭファイルをそれぞれ作成した。続いて、ソフトウェア（名称「ＨＬＡ－ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ」、https://pypi.python.org/pypi/hla-genotyper/0.4.2b1）を用いて上記の各ＢＡＭファイルを解析し、各細胞のＨＬＡハプロタイプを決定した。
また、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞については、抽出したゲノムＤＮＡをＨＬＡ研究所（http://hla.or.jp/）に送付し、蛍光ビーズ法（ＰＣＲ－ｒＳＳＯ／Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によるＨＬＡハプロタイプ決定を行った。また、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞については、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞と同様のＨＬＡハプロタイプ決定も行った。
また、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）については、販売先（ＣＴＬ社、Ｗａｋｏ社）がＨＬＡハプロタイプ情報を提供しているものを使用した。
［実験例６］
（ｓｇＲＮＡのゲノム切断活性の検討）
実験例１で同定した標的塩基配列を標的とするｓｇＲＮＡの中から、Ａ＊０２：０７アレルだけを切断し、Ａ＊３２：０１アレルとは塩基配列が一致しないｓｇＲＮＡである、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号３に示す。）、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ２（標的塩基配列を配列番号４に示す。）及びＡ０２０７－ｅｘ３－ｇ４（標的塩基配列を配列番号７に示す。）を選択した。
なお、以下の各実験例で使用した各ｓｇＲＮＡの塩基配列は、それぞれのｓｇＲＮＡの標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列の３’側に、配列番号３９に記載のスキャフォールド配列を連結した塩基配列であった。例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’」（配列番号６２）であった場合、使用したｓｇＲＮＡの塩基配列は「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’」（配列番号６３）であった。また、以下の各実験例では、各ｓｇＲＮＡを発現ベクターの形態で細胞に導入し、細胞内で発現させて使用した。
図５（ａ）はＨＬＡ－Ａのエクソン３の領域に見出されたｓｇＲＮＡの標的部位及び標的塩基を示す図である。図５（ａ）中、ボックスはＨＬＡ－Ａ＊０２：０７遺伝子のエクソンを示し、矢印は各ｓｇＲＮＡの標的塩基配列の位置を示す。また、図５（ａ）には野生型のＡ＊０２：０７アレルの塩基配列、及び野生型のＡ＊３２：０１アレルの塩基配列も示す。両アレルで配列が異なる部分を大文字で示し、ｓｇＲＮＡのＰＡＭ配列を下線で示す。
続いて、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ１、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ２及びＡ０２０７－ｅｘ３－ｇ４を、精製Ｃａｓ９タンパク質と共に下記表４のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞にそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションは市販のキット（型式「ＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＸ」、品番：ＣＭＡＸ００００３、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。
Figure 0007385281000004
続いて、ゲノムＤＮＡを抽出後、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイにより、各細胞における遺伝子変異導入効率を検討した。Ｔ７ＥＩアッセイは次のようにして行った。
まず、ＨＬＡ－Ａ２領域のＡ＊０２：０７アレルを特異的に増幅するプライマーを用いてＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲには、下記表５に示すプライマーを使用した。
Figure 0007385281000005
続いて、ＰＣＲ産物を精製し、精製後のＰＣＲ産物（４００ｎｇ）に１／１０容量の１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ社）バッファーを添加し、９５℃で５分間加熱して二本鎖ＤＮＡを熱変性した後、徐々に温度を下げることにより再アニーリングした。より具体的には、９５℃から８５℃まで－２℃／秒で冷却し、８５℃から２５℃まで－０．１℃／秒で冷却した。
続いて、再アニール後のＰＣＲ産物に１０単位のＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０３０２Ｓ、ＮＥＢ社）を添加し、３７℃で１５分間処理した。続いて、反応液量の１／１０容量の０．２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液を添加することによりＴ７ＥＩの活性を停止させ、その後サンプルは低温（氷上）を維持した。
続いて、Ｔ７ＥＩ処理したＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動し、切断バンドと未切断バンドのＤＮＡシグナル強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した。
図５（ｂ）は各ｓｇＲＮＡを用いた場合のゲノムＤＮＡ変異導入効率をＴ７ＥＩアッセイで解析した結果を示す。図５（ｂ）中、「Ｔ７ＥＩ」はＴ７エンドヌクレアーゼＩを示し、「－」は添加しなかったことを示し、「＋」は添加したことを示す。また、「ｅｘ３－ｇ１」はＡ０２０７－ｅｘ３－ｇ１を導入した結果であることを示し、「ｅｘ３－ｇ２」はＡ０２０７－ｅｘ３－ｇ２を導入した結果であることを示し、「ｅｘ３－ｇ４」はＡ０２０７－ｅｘ３－ｇ４を導入した結果であることを示し、「ＤＭＤ＃１」は陽性対照として使用した、ジストロフィン遺伝子に特異的なｓｇＲＮＡを導入した結果であることを示す。また、矢頭はＴ７ＥＩにより切断されたバンドを示す。
その結果、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ４ ｓｇＲＮＡが最もゲノム切断活性が高いことが明らかとなった。
［実験例７］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト１）
《ＨＬＡタンパク質の発現の確認》
ＨＬＡの細胞表面での発現を確認するために、ＨＬＡ抗原型Ａ２を持つｉＰＳ細胞株を２株（１３８３Ｄ２株及び４０４Ｃ２株）選択した。また、ＨＬＡ抗原型Ａ２を持たないｉＰＳ細胞株として６０４Ｂ１株を選択した。合計３株の未分化ｉＰＳ細胞に対して、サイトカイン未処理の場合と５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間処理した場合において、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（品番：７４００８２、ＢＤ社）を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
図６（ａ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。その結果、ＩＦＮ－γ処理によって、１３８３Ｄ２細胞及び４０４Ｃ２細胞においてＨＬＡ－Ａ２の特異的な発現が確認できた。
《ＨＬＡアレル特異的ノックアウト》
続いて、上述したｓｇＲＮＡである、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号３に示す。）、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ２（標的塩基配列を配列番号４に示す。）及びＡ０２０７－ｅｘ３－ｇ４（標的塩基配列を配列番号７に示す。）を、精製Ｃａｓ９タンパク質と共に１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞にそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションは市販のキット（型式「ＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＸ」、品番：ＣＭＡＸ００００３、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。
また、ＨＬＡ遺伝子を破壊しないコントロールのｓｇＲＮＡとして、Ｘ染色体上のジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子をターゲットとするｓｇＲＮＡ－ＤＭＤ＃１（標的塩基配列を配列番号６１に示す。）を用いた。
続いて、トランスフェクションした各ｉＰＳ細胞をそれぞれ２つのウェル中で継代し、一方のウェルはサイトカイン未処理のまま維持し、もう一方のウェルは培地に５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γを添加して４８時間処理した。その後、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（品番：７４００８２、ＢＤ社）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
図６（ｂ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。その結果、ゲノム切断活性が最も大きかったＡ０２０７－ｅｘ３－ｇ４ ｓｇＲＮＡを用いた場合に、最も多くのＨＬＡ－Ａ２抗原が破壊された細胞が出現することが明らかとなった。
《ｓｇＲＮＡの標的部位の塩基配列の解析》
続いて、ｓｇＲＮＡ（Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ４）を導入した１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、Ａ＊０２：０７アレルを特異的に増幅し、Ａ＊３２：０１アレルを増幅しないプライマーを用いてＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行いｓｇＲＮＡのターゲット部位を増幅した。Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲには、下記表６に示すプライマーを使用した。
Figure 0007385281000006
続いて、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングでｐＧＥＭ－Ｔ－Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングした。続いて、大腸菌コロニーを２１株回収し、サンガーシーケンスにより塩基配列を決定した。その結果、１１株は野生型の塩基配列を有していたが、１０株（欠損４株と挿入６株）には何らかの挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）を生じたことが明らかとなった。
また、ｓｇＲＮＡ（Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ４）を導入した１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞を、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（品番：７４００８２、ＢＤ社）で染色し、フローサイトメーターにてＨＬＡ－Ａ２抗原が陰性となった細胞をソートした。ソートしたｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、標的アレルであるＡ＊０２：０７アレルを特異的に増幅するプライマー（上述）をそれぞれ用いてのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。また、標的ではないＡ＊３２：０１アレルを特異的に増幅するプライマーをそれぞれ用いてＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。Ａ＊３２：０１アレルのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲには、下記表７に示すプライマーを使用した。
Figure 0007385281000007
続いて、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングでｐＧＥＭ－Ｔ－Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングした。大腸菌コロニーを１６株（Ａ＊０２：０７アレル）及び１９株（Ａ＊３２：０１アレル）回収し、サンガーシーケンスにより塩基配列を決定した。続いて、決定した塩基配列に基づいて、配列に欠損があるクローン数、挿入があるクローン数、そして配列変化の無かったクローン数を計測した。
その結果、Ａ＊０２：０７アレルには、１６株の全てのサブクローンにおいて、何らかの挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じていた。一方、Ａ＊３２：０１アレルは、１９株の全てのサブクローンにおいて野生型の塩基配列であることが確認された。
図７は、ｉＰＳ細胞１３８３Ｄ２株にｓｇＲＮＡを導入してゲノム編集を誘導した後、ＨＬＡ－Ａ２抗原発現によるソーティングを行わなかった場合と、ＨＬＡ－Ａ２抗原発現が陰性となった細胞群をソーティングした場合のゲノムＤＮＡ変異導入効率を示すグラフである。
その結果、ＨＬＡ抗原陰性細胞を分取することにより、Ａ＊０２：０７ターゲットアレルがゲノム編集された細胞の割合が上昇することが明らかとなった。また、非ターゲットアレルであるＨＬＡ－Ａ＊３２：０１アレルには、全く変異が導入されていないことが確認された。
［実験例８］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト２）
下記表８のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、下記表９に示す仮想的なＨＬＡハプロタイプを持つレシピエントＡに他家移植を行う場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を作製した。なお、下記表９に示すＨＬＡハプロタイプは、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿１９４」、ＣＴＬ社）のＨＬＡハプロタイプである。
表８及び表９に示すように、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞にはＡ＊０１：０１アレル、Ｂ＊０７：０２アレルが存在する。そして、これらのＨＬＡアレルは、レシピエントＡには存在しない。このため、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞又は６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞をレシピエントに移植すると、レシピエントＡの持つＴ細胞によって攻撃されて免疫拒絶が起こってしまう。
そこで、拒絶反応を低減するためには、レシピエントＡに存在せずドナー細胞に存在するＨＬＡアレルである、Ａ＊０１：０１アレルとＢ＊０７：０２アレルを破壊して、ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しないようにすればよい。
Figure 0007385281000008
Figure 0007385281000009
上記の実験例１で同定したｓｇＲＮＡの中から、Ａ＊０１：０１アレルだけを切断し、Ａ＊２４：０２アレルとは塩基配列が一致しないｓｇＲＮＡ２つ（Ａ０１０１－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号４５に示す。）及びＡ０１０１－ｅｘ３－ｇ２（標的塩基配列を配列番号４６に示す。））と、Ｂ＊０７：０２アレルだけを切断し、Ｂ＊３７：０１アレルとは配列が一致しないｓｇＲＮＡ２つ（Ｂ０７０２－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号４７に示す。）、Ｂ０７０２－ｅｘ２－ｇ２（標的塩基配列を配列番号４８に示す。））を選択した。
続いて、上記各ｓｇＲＮＡをインビトロ転写反応により合成し、精製Ｃａｓ９タンパク質と共に６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞にそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションは市販のキット（型式「ＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＸ」、品番：ＣＭＡＸ００００３、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。
ｓｇＲＮＡの導入によりＡ＊０１：０１アレル又はＢ＊０７：０２アレルが切断され、その修復の過程で遺伝子変異が生じると、Ａ＊０１：０１アレル又はＢ＊０７：０２アレルがノックアウトされ、ＨＬＡ－Ａ１タンパク質又はＨＬＡ－Ｂ７タンパク質を欠失した細胞が得られる。
続いて、各ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激し、ＨＬＡタンパク質を発現誘導した。続いて、各ｉＰＳ細胞を、抗ＨＬＡ－Ａ１抗体（型式「ａｂ３３８８３」、ａｂｃａｍ社）又は抗ＨＬＡ－Ｂ７抗体（型式「ＭＣＡ９８６」、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で染色し、フローサイトメトリーでＨＬＡタンパク質陰性細胞の割合を解析した。
図８（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図８（ａ）は、Ａ＊０１：０１アレルを破壊したｉＰＳ細胞におけるＨＬＡ－Ａ１タンパク質の発現量を測定した結果であり、図８（ｂ）は、Ｂ＊０７：０２アレルを破壊したｉＰＳ細胞におけるＨＬＡ－Ｂ７タンパク質の発現量を測定した結果である。図８（ａ）及び（ｂ）中、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の結果を示す。
その結果、ｓｇＲＮＡとしてＡ０１０１－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号４５に示す。）を使用した場合、１１．２％の細胞がＨＬＡ－Ａ１タンパク質を欠失したことが明らかとなった。また、ｓｇＲＮＡとしてＡ０１０１－ｅｘ３－ｇ２（標的塩基配列を配列番号４６に示す。）を使用した場合、１８．９％の細胞がＨＬＡ－Ａ１タンパク質を欠失したことが明らかとなった。この結果から、Ａ０１０１－ｅｘ３－ｇ２がよりノックアウト効率の高いｓｇＲＮＡであることが明らかとなった。
また、ｓｇＲＮＡとしてＢ０７０２－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号４７に示す。）を使用した場合、１１．６％の細胞がＨＬＡ－Ｂ７タンパク質を欠失したことが明らかとなった。また、ｓｇＲＮＡとしてＢ０７０２－ｅｘ２－ｇ２（標的塩基配列を配列番号４８に示す。）を使用した場合、０．７％の細胞がＨＬＡ－Ｂ７タンパク質を欠失したことが明らかとなった。この結果から、Ｂ０７０２－ｅｘ２－ｇ１がよりノックアウト効率の高いｓｇＲＮＡであることが明らかとなった。
この結果から、ノックアウト効率の高かったＡ０１０１－ｅｘ３－ｇ２とＢ０７０２－ｅｘ２－ｇ１を選択し、Ａ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルの双方のノックアウトを行った。具体的には、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞に、選択した２種類のｓｇＲＮＡを精製Ｃａｓ９タンパク質と共にトランスフェクションした。トランスフェクションは市販のキット（型式「ＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＸ」、品番：ＣＭＡＸ００００３、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激し、ＨＬＡタンパク質を発現誘導した。続いて、ｉＰＳ細胞を抗ＨＬＡ－Ａ１抗体（型式「ａｂ３３８８３」、ａｂｃａｍ社）及び抗ＨＬＡ－Ｂ７抗体（型式「ＭＣＡ９８６」、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
図９（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図９（ａ）中、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。また、図９（ｂ）中、「Ａ０１０１－ｅｘ３－ｇ２」及び「Ｂ０７０２－ｅｘ２－ｇ１」は、これらの２つのｓｇＲＮＡを共導入してＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルの双方をノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
また、ＨＬＡ－Ａ１タンパク質及びＨＬＡ－Ｂ７タンパク質の双方が陰性である細胞集団から単細胞ソーティングを行い、１５株のサブクローンを回収した。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡであるＡ０１０１－ｅｘ３－ｇ２の標的部位（エクソン３）を含む領域、及びＢ０７０２－ｅｘ２－ｇ１の標的部位（エクソン２）を含む領域をそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１０（ａ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１０（ａ）中、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。例えば「－５ｂｐ」は５塩基の欠損を有していたことを示し、「＋１８ｂｐ」は１８塩基の挿入を有していたことを示す。図１０（ｂ）では、代表例として２株（＃８及び＃１０）の塩基配列を示す。
その結果、１５株中１１株のクローンにおいて、Ａ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルの双方に何らかの挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたことが明らかとなった。Ｉｎｄｅｌ変異が生じた１１株のクローンの中から、フレームシフト変異を生じた２株（＃８及び＃１０）を選択し、以下の実験に使用した。
［実験例９］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト３）
下記表１０のＨＬＡハプロタイプを持つ５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、下記表１１に示す仮想的なＨＬＡハプロタイプを持つレシピエントＢに他家移植を行う場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を作製した。なお、下記表１１に示すＨＬＡハプロタイプは、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「２０１０１１３２０３」、Ｗａｋｏ社）のＨＬＡハプロタイプである。
表１０及び表１１に示すように、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞にはＢ＊０７：０２アレル、Ｃ＊０７：０２アレルが存在する。そして、これらのＨＬＡアレルは、レシピエントＢには存在しない。このため、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞又は５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞をレシピエントに移植すると、レシピエントＢの持つＴ細胞によって攻撃されて免疫拒絶が起こってしまう。
そこで、拒絶反応を低減するためには、レシピエントＢに存在せずドナー細胞に存在するＨＬＡアレルである、Ｂ＊０７：０２アレルとＣ＊０７：０２アレルを破壊して、ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しないようにすればよい。
Figure 0007385281000010
Figure 0007385281000011
ｓｇＲＮＡとして、Ｂ＊０７：０２アレル特異的なＢ０７０２－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号４７に示す。）及びＣ＊０７：０２アレル特異的なＣ０７０２－ｅｘ３－ｇ３（標的塩基配列を配列番号４９に示す。）を用いた。また、トランスフェクションに市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を使用した以外は実験例７と同様にして、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ＊０７：０２アレル及びＣ＊０７：０２アレルの双方のノックアウトを行った。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激し、ＨＬＡタンパク質を発現誘導した。続いて、ｉＰＳ細胞を抗ＨＬＡ－Ｂ７抗体（型式「ＭＣＡ９８６」、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
図１１はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図１１中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｂ０７０２－ｅｘ２－ｇ１」及び「Ｃ０７０２－ｅｘ３－ｇ３」は、これらのｓｇＲＮＡを導入してＢ＊０７：０２アレル及びＣ＊０７：０２アレルの双方をノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
また、ＨＬＡ－Ｂ７タンパク質が陰性である細胞集団から単細胞ソーティングを行い、２８株のサブクローンを回収した。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡであるＢ０７０２－ｅｘ２－ｇ１の標的部位（エクソン２）を含む領域、及びＣ０７０２－ｅｘ３－ｇ３の標的部位（エクソン３）を含む領域をそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１２は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１２（ａ）中、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。図１２（ｂ）では、代表例として３株（＃２、＃１１及び＃２６）の塩基配列を示す。
その結果、複数のクローンにおいて、Ｂ＊０７：０２アレル及びＣ＊０７：０２アレルの双方に何らかの挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたことが明らかとなった。Ｉｎｄｅｌ変異が生じたクローンの中から、３株（＃２、＃１１及び＃２６）を選択し、以下の実験に使用した。
［実験例１０］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト４）
下記表１２のＨＬＡハプロタイプを持つ５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、下記表１３に示す仮想的なＨＬＡハプロタイプを持つレシピエントＣに他家移植を行う場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を作製した。なお、下記表１３に示すＨＬＡハプロタイプは、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿２６６」、ＣＴＬ社）のＨＬＡハプロタイプである。
表１２、１３に示すように、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞にはＢ＊５２：０１アレル、Ｃ＊１２：０２アレルが存在する。そして、これらのＨＬＡアレルは、レシピエントＣには存在しない。このため、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞又は５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞をレシピエントＣに移植すると、レシピエントＣの持つＴ細胞によって攻撃されて免疫拒絶が起こってしまう。
そこで、拒絶反応を低減するためには、レシピエントＣに存在せずドナー細胞に存在するＨＬＡアレルである、Ｂ＊５２：０１アレルとＣ＊１２：０２アレルを破壊して、ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しないようにすればよい。
Figure 0007385281000012
Figure 0007385281000013
ｓｇＲＮＡとして、Ｃ＊１２：０２アレル特異的なＣ１２０２－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５０に示す。）を用いた点と、細胞のソーティングを行わなかった点以外は実験例９と同様にして、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＣ＊１２：０２アレルのノックアウトを行い、１７株のサブクローンを得た。なお、細胞のソーティングを行わなかったのは、抗ＨＬＡ－Ｃ１２のアレル特異的抗体が入手できなかったためである。
続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡであるＣ１２０２－ｅｘ３－ｇ１の標的部位（エクソン３）を含む領域を増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１３（ａ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１３（ａ）中、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、ｓｇＲＮＡの標的部位付近に何らかの挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたことが明らかとなった。Ｉｎｄｅｌ変異が生じたクローンの中から、フレームシフト変異を生じた＃１細胞を選択した。
続いて、Ｃ＊１２：０２アレルがノックアウトされた＃１細胞に、ｓｇＲＮＡとしてＢ＊５２：０１アレル特異的なＢ５２０１－ｅｘ３－ｇ２（標的塩基配列を配列番号５１に示す。）を導入してＢ＊５２：０１アレルのノックアウトを行い、１２株のサブクローン（クローン＃１－１～＃１－１２）を得た。なお、細胞のソーティングを行わなかったのは、抗ＨＬＡ－Ｂ５２のアレル特異的抗体が入手できなかったためである。
続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡであるＢ５２０１－ｅｘ３－ｇ２の標的部位（エクソン３）を含む領域を増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１３（ｂ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１３（ｂ）中、「Ｍｕｔ」は置換変異を有していたことを示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示す。その結果、ｓｇＲＮＡの標的部位付近に何らかの変異が生じたことが明らかとなった。図１３（ｃ）では、代表例として株＃１－１の塩基配列を示す。
［実験例１１］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト５）
下記表１４のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、下記表１５で示す仮想的なＨＬＡハプロタイプを持つレシピエントＣに他家移植を行う場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を作製した。なお、下記表１５に示すＨＬＡハプロタイプは、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿２６６」、ＣＴＬ社）のＨＬＡハプロタイプである。
表１４、１５に示すように、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞には、Ａ＊０１：０１アレル、Ｂ＊３７：０１アレル及びＣ＊０６：０２アレルが存在する。そして、これらのＨＬＡアレルは、レシピエントＣには存在しない。このため、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞又は６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞をレシピエントに移植すると、レシピエントの持つＴ細胞によって攻撃されて免疫拒絶が起こってしまう。
そこで、拒絶反応を低減するためには、レシピエントＣに存在せずドナー細胞に存在するＨＬＡアレルである、Ａ＊０１：０１アレル、Ｂ＊３７：０１アレル及びＣ＊０６：０２アレルを破壊して、ドナー細胞に特異的なＨＬＡタンパク質を発現しないようにすればよい。
Figure 0007385281000014
Figure 0007385281000015
ｓｇＲＮＡとして、Ａ＊０１：０１アレル特異的なＡ０１０１－ｅｘ３－ｇ２（標的塩基配列を配列番号４６に示す。）を用いて、実験例９と同様にして、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレルをノックアウトした。続いて、この細胞に、Ｃ＊０６：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡであるＣ０６０２－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５２に示す。）を導入してＣ＊０６：０２アレルのノックアウトを行い、９株のサブクローンを得た。
続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡであるＡ０１０１－ｅｘ３－ｇ２の標的部位（エクソン３）を含む領域、及びＣ０６０２－ｅｘ３－ｇ１の標的部位（エクソン３）を含む領域をそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１４（ａ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１４（ａ）中、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、ｓｇＲＮＡの標的部位付近に何らかの挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたクローンが得られた。図１４（ｂ）では、Ｉｎｄｅｌ変異が生じたクローンの中から、フレームシフト変異を生じたクローン＃３を代表例として塩基配列を示す。
続いて、Ａ＊０１：０１アレル及びＣ＊０６：０２アレルがノックアウトされたクローン＃３に、ｓｇＲＮＡとしてＨＬＡ－Ｂアレル特異的なＢ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５３に示す。）を導入してＢ＊３７：０１アレルのみがノックアウトされたクローンの取得を試みた。なお、Ｂ－ｅｘ２－ｇ１はＢ＊３７：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルの両方を標的とするｓｇＲＮＡである。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激し、ＨＬＡタンパク質を発現誘導した。続いて、ｉＰＳ細胞を抗ＨＬＡ－Ｂ７抗体（型式「ＭＣＡ９８６」、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
図１５（ａ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図１５（ａ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｂ－ｅｘ２－ｇ１」は、このｓｇＲＮＡを導入してＨＬＡ－ＢアレルをノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
また、ＨＬＡ－Ｂ７タンパク質が陽性である細胞集団から単細胞ソーティングを行い、１２株のサブクローン（クローン＃３－１～＃３－１２）を回収した。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡであるＢ－ｅｘ２－ｇ１の標的部位（エクソン２）を含む領域の、標的としたＢ＊３７：０１アレル及び標的としなかったＢ＊０７：０２アレルをそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１５（ｂ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１５（ｂ）中、「Ｍｕｔ」は置換変異を有していたことを示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、ｓｇＲＮＡの標的部位付近に何らかの挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたクローンが得られた。図１５（ｃ）では、Ｂ＊３７：０１アレルのみにＩｎｄｅｌ変異が生じたクローンの中から、２株（クローン＃３－１１及び＃３－１２）を代表例として塩基配列を示す。
［実験例１２］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト６）
下記表１６のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ｃアレルの３遺伝子座全てをノックアウトした細胞を作製した。図１６（ａ）は本実験例で使用したｓｇＲＮＡの標的部位を示す図である。
Figure 0007385281000016
ｓｇＲＮＡとして、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルの双方を標的とすることができるＢＣ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５４に示す。）を用いて、実験例９と同様にして、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＢ＊０７：０２アレル、Ｂ＊３７：０１アレル、Ｃ＊０６：０２アレル及びＣ＊０７：０２アレルをノックアウトした。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を検討した。図１６（ｂ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図１６（ｂ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「ＢＣ－ｅｘ２－ｇ１」は、このｓｇＲＮＡを導入してＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ｃアレルの双方をノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
続いて、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の双方が陰性である細胞集団をソーティングして回収した。続いて、回収した細胞集団に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の両アレルを標的とすることができるＡ－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５５に示す。）を導入し、Ａ＊０１：０１アレル及びＡ＊２４：０２アレルをノックアウトした。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を検討した。図１６（ｃ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図１６（ｃ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ａ－ｅｘ３－ｇ１」は、このｓｇＲＮＡを導入してＨＬＡ－ＡアレルをノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
続いて、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の全てが陰性である細胞集団の単細胞ソーティングを行い、８株のサブクローンを回収した。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡの標的部位を含む領域をそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１７（ａ）は、回収したクローンのうちの１つ（クローン＃１）の塩基変異パターンを示す図である。図１７（ａ）中、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、Ａ＊０１：０１アレル、Ａ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊３７：０１アレル、Ｃ＊０６：０２アレル及びＣ＊０７：０２アレルの全てに挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたクローンが得られたことが確認された。図１７（ｂ）は、クローン＃１の各ＨＬＡアレルの塩基配列を示す。図１７（ｂ）中、「ＷＴ」は野生型の塩基配列を示す。
［実験例１３］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト７）
下記表１７のＨＬＡハプロタイプを持つ５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルがノックアウトされており、ＨＬＡ－Ｃアレルの一方のみがノックアウトされた細胞を作製した。
Figure 0007385281000017
ｓｇＲＮＡとして、ＨＬＡ－Ａアレルを標的とすることができるＡ－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５５に示す。）と、ＨＬＡ－Ｂアレルを標的とすることができるＢ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５３に示す。）を用いて、実験例９と同様にして、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル及びＢ＊５２：０１アレルをノックアウトした。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａ２４抗原、ＨＬＡ－Ｂ７抗原の発現を検討した。図１８（ａ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
続いて、ＨＬＡ－Ａ２４抗原及びＨＬＡ－Ｂ７抗原の双方が陰性である細胞集団の単細胞ソーティングを行い、１０株のサブクローンを回収した。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡの標的部位を含む領域をそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１８（ｂ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１８（ｂ）中、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示し、「？」は確定できなかったことを示す。その結果、Ａ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル及びＢ＊５２：０１アレルの全てに挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたことが明らかとなったクローン＃３を選択した。図１８（ｃ）に、クローン＃３の塩基配列を示す。
続いて、クローン＃３に、Ｃ＊１２：０２アレル特異的なＣ１２０２－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５０に示す。）を導入し、Ｃ＊１２：０２アレルをノックアウトした。続いて、４株のサブクローン（クローン＃３－１～＃３－４）を回収した。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、Ｃ＊０７：０２アレル及びＣ＊１２：０２アレルをそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
図１８（ｄ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１８（ｄ）中、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であることを示し、「－」は欠失変異を有することを示す。その結果、Ｃ＊０７：０２アレルが残存しており、Ｃ＊１２：０２アレルに挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたクローンが３株（クローン＃３－１、＃３－２、及び＃３－３）得られたことが確認された。図１８（ｅ）に、代表例としてクローン＃３－１の塩基配列を示す。
［実験例１４］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト８）
下記表１８のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをノックアウトした細胞を作製した。
Figure 0007385281000018
ｓｇＲＮＡとして、ＨＬＡ－Ａアレルを標的とすることができるＡ－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５５に示す。）と、ＨＬＡ－Ｂアレルを標的とすることができるＢ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５３に示す。）を用いて、実験例９と同様にして、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル、Ａ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル及びＢ＊３７：０１アレルをノックアウトした。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａ２４抗原及びＨＬＡ－Ｂ７抗原の発現を検討した。図１９（ａ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図１９（ａ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ａ－ｅｘ２－ｇ１」及び「Ｂ－ｅｘ２－ｇ１」は、これらのｓｇＲＮＡを導入してＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレルの双方をノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
続いて、ＨＬＡ－Ａ２４抗原及びＨＬＡ－Ｂ７抗原の双方が陰性である細胞集団をソーティングして回収し、更に、ＨＬＡ－Ａ１抗原の発現を検討した。図１９（ｂ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図１９（ｂ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「ＨＬＡ－Ａ２４，Ｂ７（－）ｓｏｒｔｅｄ」はソートしたＨＬＡ－Ａ２４抗原及びＨＬＡ－Ｂ７抗原の双方が陰性である細胞集団の解析結果であることを示す。
続いて、ＨＬＡ－Ａ１抗原が陰性である細胞集団をソーティングして回収し、２３株のサブクローンを回収した。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、使用したｓｇＲＮＡの標的部位を含む領域をそれぞれ増幅するＰＣＲ反応を行った後、サンガーシーケンスにより７株の塩基配列を解析した。
図１９（ｃ）は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図１９（ｃ）中、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、Ａ＊０１：０１アレル、Ａ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル及びＢ＊３７：０１アレルの全てに挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が生じたクローンが６株得られたことが明らかとなった。代表例としてクローン＃４の塩基配列を図１９（ｄ）に示す。
［実験例１５］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト９）
下記表１９のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ｃアレルの３遺伝子座全てをノックアウトした細胞を作製した。図２０（ａ）は本実験例で使用したｓｇＲＮＡの標的部位を示す図である。
Figure 0007385281000019
ｓｇＲＮＡとして、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルの双方を標的とすることができるＢＣ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５４に示す。）を用いて、実験例９と同様にして、１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＢ＊１５：０２アレル、Ｂ＊５１：０１アレル、Ｃ＊０８：０１アレル及びＣ＊１４：０２アレルをノックアウトした。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を検討した。図２０（ｂ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２０（ｂ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「ＢＣ－ｅｘ２－ｇ１」は、このｓｇＲＮＡを導入してＨＬＡ－Ｂアレル、ＨＬＡ－Ｃアレルの双方をノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
続いて、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の双方が陰性である細胞集団をソーティングして回収した。続いて、回収した細胞集団に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の両アレルを標的とすることができるＡ－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５５に示す。）を導入し、Ａ＊０２：０７アレル及びＡ＊３２：０１アレルをノックアウトした。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を検討した。
図２０（ｃ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２０（ｃ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ａ－ｅｘ３－ｇ１」は、このｓｇＲＮＡを導入してＨＬＡ－ＡアレルをノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。その結果、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の全てが陰性である細胞集団の存在が確認された。
［実験例１６］
（ＨＬＡアレルの改変）
下記表２０のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＡ＊０２：０７アレルを、ゲノム編集によりＡ＊０１：０１アレルに改変する検討を行った。
Figure 0007385281000020
まず、いずれもｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターである、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを、１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞に導入し、終濃度１～１５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｃａｔ．Ｎｏ．２９４５５－５４、ナカライテスク）又は終濃度１００～２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０６８７－０１０、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた約５日間の薬剤選択により、染色体安定導入細胞集団を得た。
二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターは、発現誘導及び細胞内局在の双方を制御することができるＣａｓ９の発現ベクターである（Ishida et al., Site-specifc randomization of the endogenous genome by a regulatable CRISPR-Cas9 piggyBac system in human cells, Sci. Rep., 8: 310, 2018）。本実験例では、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を細胞の培地に添加することにより、Ｃａｓ９タンパク質とグルココルチコイド受容体（ＧＲ）との融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ＧＲタンパク質」という。）の発現を誘導することができ、細胞の培地にデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を添加することにより、Ｃａｓ９－ＧＲを核内に移行させることができる二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターを使用した。また、ｓｇＲＮＡとしては、Ａ０２０７－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号３に示す。）を使用した。
図２１（ａ）及び（ｂ）は、本実験例による相同組換えを説明する模式図である。続いて、相同組換えを誘導するために、Ａ＊０１：０１アレルのエクソン１～３を含む領域をコードする一本鎖ＤＮＡ（標的塩基配列を配列番号５６に示す。）を作製した。
具体的には、まず、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ａ＊０１：０１アレルのエクソン１の上流６７塩基からエクソン３の下流１２４７塩基の部分を、下記表２１に示すプライマーを用いたＰＣＲで増幅し、ｐＥＮＴＲプラスミドへと組み込み、ｐＥＮＴＲベクターを作製した。
Figure 0007385281000021
続いて、このプラスミドＤＮＡをニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｓｒＤＩ酵素（型番「Ｒ０６４８Ｓ」、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で処理し、ホルムアミド変性条件下でアガロース電気泳動を行い、相当するＤＮＡバンドを切り出して精製し、目的の一本鎖ＤＮＡドナー（ｌｓｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒ、配列番号５６）を調製した。
続いて、１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞に、二本鎖ＤＮＡ状態であるｐＥＮＴＲベクター（ｄｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒ）又は調製した一本鎖ＤＮＡ（ｌｓｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒ、配列番号５６）をそれぞれ導入し、Ｄｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加し、ゲノム編集による相同組換えを誘導した。
続いて、各ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａ２抗原及びＨＬＡ－Ａ１抗原の発現を検討した。
図２１（ｃ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２０（ｃ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ Ｄｏｘ／Ｄｅｘ」はＣａｓ９発現を誘導しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「ｄｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒ」は、二本鎖ＤＮＡのドナーを導入して相同組換えを誘導したｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「ｌｓｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒ」は、一本鎖ＤＮＡのドナーを導入して相同組換えを誘導したｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
その結果、Ａ２抗原が陰性でＡ１抗原が陽性となった割合は、二本鎖ＤＮＡをドナーとして用いた場合は０．２％であったのに対し、一本鎖ＤＮＡをドナーとして用いた場合には１．６％であった。
続いて、一本鎖ＤＮＡドナーを用いた相同組換えによりＡ２抗原が陰性となり、かつＡ１抗原が陽性となった細胞集団をフローサイトメトリーでソーティングし、細胞集団のまま、及び単細胞ソーティング後のサブクローンについて、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の塩基配列を解析した。
図２２（ａ）は、細胞集団のまま塩基配列を解析した結果を示す図である。図２２（ａ）中、「Ｂｕｌｋ」は細胞集団のまま解析した結果であることを示す。その結果、Ａ＊０２：０７遺伝子座の一部（特にエクソン２とエクソン３の５’側）がＡ＊０１：０１遺伝子に改変された細胞が混在していることが明らかとなった。
また、図２２（ｂ）は、単細胞ソーティングした代表的なサブクローン（クローン＃２）について塩基配列を解析した結果を示す図である。その結果、Ａ＊０２：０７遺伝子座の一部がＡ＊０１：０１遺伝子に改変されたことが明らかとなった。
［実験例１７］
（Ｂ２ＭノックアウトｉＰＳ細胞の作製１）
１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞にＣａｓ９を発現するプラスミドベクターとＢ２Ｍ特異的なｓｇＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｇＲＮＡとしては、Ｂ２Ｍ－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５９に示す。）及びＢ２Ｍ－ｇ２（標的塩基配列を配列番号６０に示す。）を使用した。
続いて、５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激した細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体で染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
図２３（ａ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２３（ａ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－ｇ１」、「Ｂ２Ｍ－ｇ２」は、このｓｇＲＮＡを導入してＢ２ＭアレルをノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
その結果、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の全てが陰性である細胞集団の割合は、ｓｇＲＮＡとしてＢ２Ｍ－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５９に示す。）を使用した場合、２．８％であった。また、ｓｇＲＮＡとしてＢ２Ｍ－ｇ２（標的塩基配列を配列番号６０に示す。）を使用した場合、６．９％であった。
続いて、Ｂ２Ｍ－ｇ２ ｓｇＲＮＡの導入により得られた、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの全てが陰性である細胞集団から単細胞ソーティングにより、クローン＃１及び＃２の２株のサブクローンを得た。
得られた２株のサブクローンを再びＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行った。図２３（ｂ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２３（ｂ）中、「Ｂ２Ｍ－ＫＯ＃１」はクローン＃１の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－ＫＯ＃２」はクローン＃２の結果であることを示す。その結果、いずれのクローンにおいても、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの全てが陰性であることが確認された。
続いて、クローン＃１のＢ２Ｍ遺伝子をＰＣＲ増幅して塩基配列を確認し、挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が導入されたことを確認した。図２３（ｃ）にクローン＃１のＢ２Ｍアレルの塩基配列を示す。図２３（ｃ）中「ＷＴ」は野生型の塩基配列を示す。
［実験例１８］
（Ｂ２ＭノックアウトｉＰＳ細胞の作製２）
６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞に対し、実験例１７と同様の操作を行い、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした。ｓｇＲＮＡとしては、Ｂ２Ｍ－ｇ２（標的塩基配列を配列番号６０に示す。）を使用した。
続いて、５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激した細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体で染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
図２４（ａ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２４（ａ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－ｇ２」は、このｓｇＲＮＡを導入してＢ２Ｍアレルをノックアウトしたことを示す。その結果、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の全てが陰性である細胞集団が得られたことが明らかとなった。
続いて、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの全てが陰性である細胞集団から単細胞ソーティングにより、クローン＃１、＃２、＃３及び＃４の４株のサブクローンを得た。
続いて、これらのサブクローンのＢ２Ｍ遺伝子をＰＣＲ増幅して塩基配列を確認した。図２４（ｂ）は塩基配列の解析結果を示す図である。その結果、いずれのサブクローンにおいても挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が導入されたことが確認された。
［実験例１９］
（Ｔ細胞活性化試験１）
（１）下記表２２のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例８で作製した、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃８、（３）同クローン＃１０、（４）下記表２３のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞、（５）実験例１８で作製した、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、それぞれ胚様体（ＥＢ）由来血球様細胞に分化誘導した。
Figure 0007385281000022
Figure 0007385281000023
続いて、下記表２４のＨＬＡハプロタイプを持つ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿１９４」、ＣＴＬ社、上述したレシピエントＡに相当する。）からソーティングにより回収したＣＤ８陽性Ｔ細胞をＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色し、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの存在下で上記の（１）～（５）の各細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と８日間共培養した。
Figure 0007385281000024
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図２５（ａ）～（ｅ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２５（ａ）～（ｅ）は、それぞれ、上記（１）～（５）の各細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と共培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果である。その結果、各ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原を特異的に認識するＴ細胞集団だけが増殖し、ＣＦＳＥが陰性となったことが確認された。
［実験例２０］
（Ｔ細胞活性化試験２）
（１）下記表２５のＨＬＡハプロタイプを持つ５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例９で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ＊０７：０２アレル及びＣ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃２、（３）同クローン＃１１、（４）同クローン＃２６、（５）下記表２６のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞、（６）実験例１８で作製した、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。
Figure 0007385281000025
Figure 0007385281000026
続いて、下記表２７のＨＬＡハプロタイプを持つ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「２０１０１１３２０３」、Ｗａｋｏ社、上述したレシピエントＢに相当する。）からソーティングにより回収したＣＤ８陽性Ｔ細胞をＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色し、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの存在下で上記の（１）～（６）の各細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と８日間共培養した。
Figure 0007385281000027
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図２６（ａ）～（ｆ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２６（ａ）～（ｆ）は、それぞれ、上記（１）～（６）の各細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と共培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果である。その結果、各ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原を特異的に認識するＴ細胞集団が増殖し、ＣＦＳＥが陰性となったことが確認された。
［実験例２１］
（Ｔ細胞活性化試験３）
（１）下記表２８のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１１で作製した、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル、Ｂ＊３７：０１アレル及びＣ＊０６：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１１、（３）同クローン＃３－１２、（４）下記表２９のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞、（５）実験例１８で作製した、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。
Figure 0007385281000028
Figure 0007385281000029
続いて、下記表３０のＨＬＡハプロタイプを持つ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿２６６」、ＣＴＬ社、上述したレシピエントＣに相当する。）からソーティングにより回収したＣＤ８陽性Ｔ細胞をＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色し、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの存在下で上記の（１）～（５）の各細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と８日間共培養した。
Figure 0007385281000030
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図２７（ａ）～（ｅ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２７（ａ）～（ｅ）は、それぞれ、上記（１）～（５）の各細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と共培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果である。その結果、各ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原を特異的に認識するＴ細胞集団が増殖し、ＣＦＳＥが陰性となったことが確認された。
［実験例２２］
（ＨＬＡ抗原反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製）
６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原に反応性を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞を調製した。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）由来のＴ細胞には、多様な抗原を認識するＴ細胞が混在している。これらのＴ細胞のうち、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原に反応性を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激して増殖させ、回収した。
図２８は本実験例の手順を示す模式図である。図２８に示すように、まず、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞をＥＢ由来血球様細胞に分化させた。ＥＢ由来血球様細胞はＣＤ４５陽性白血球細胞を含む。続いて、ＰＢＭＣに含まれるＣＤ８陽性Ｔ細胞をＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色し、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの存在下で６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と８日間共培養した。
続いて、共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図２９（ａ）～（ｅ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
図２９（ａ）はＰＢＭＣ細胞集団を他家（アロ）であるＰＢＭＣ細胞集団と共培養した結果を示し、図２９（ｂ）はＰＢＭＣ細胞集団を６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と共培養した結果を示し、図２９（ｃ）はＰＢＭＣ細胞集団のみを培養した結果を示し、図２９（ｄ）はＰＢＭＣ細胞集団からソーティングにより回収したＣＤ８陽性Ｔ細胞を６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞と共培養した結果を示し、図２９（ｅ）はＰＢＭＣ細胞集団からソーティングにより回収したＣＤ８陽性Ｔ細胞のみを培養した結果を示す。その結果、不適合であるＨＬＡ抗原を特異的に認識するＴ細胞集団が増殖し、ＣＦＳＥが陰性となったことが確認された。
続いて、図２９（ｄ）に示す、ＣＦＳＥが陰性となったＣＤ８陽性Ｔ細胞をソーティングして回収し、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原に反応性を有するＴ細胞を得た。
［実験例２３］
（Ｔ細胞傷害性試験１）
図３０は、本実験例の手順を示す模式図である。まず、（１）下記表３１のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例８で作製した、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃８、（３）同クローン＃１０、（４）実験例１７で作製した、Ｂ２Ｍをノックアウトした１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、それぞれ心筋細胞に分化誘導した。
Figure 0007385281000031
続いて、各心筋細胞をＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、後述する５１Ｃｒリリースアッセイを行うために、培地に５１Ｃｒ（クロム）を添加して各心筋細胞に取り込ませた。
続いて、各心筋細胞の培地に、実験例２２で調製した６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原に反応性を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞を様々な割合で添加し、各心筋細胞が攻撃されたか否かを検討した。すなわち、エフェクター細胞として実験例２２で調製したＨＬＡ抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を、ターゲット細胞として上述したｉＰＳ細胞由来心筋細胞を使用した。添加するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の割合は、心筋細胞１に対して、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０とした。
心筋細胞がＣＤ８陽性細胞に攻撃されると、細胞が傷害を受け、細胞内から５１Ｃｒが放出される。そこで、培地中に放出された５１Ｃｒを測定することにより、各心筋細胞が攻撃されたか否かを判断することができる。これを５１Ｃｒリリースアッセイという。５１Ｃｒでラベル後、何も処理しなかった心筋細胞の上清に含まれる５１Ｃｒの量を０％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓと定義し、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）によって５１Ｃｒでラベルした心筋細胞を処理して死滅させた際に上清中に放出された５１Ｃｒの量から、通常の培地で５１Ｃｒラベル心筋細胞を培養した際に上清中に放出された５１Ｃｒの量引いた値を１００％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓと定義した。
図３１は、各心筋細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図３１中、「＊」は、Ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は、上記（１）の６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞の結果であることを示し、「Ａ１－Ｂ７－＃８」は、上記（２）のクローン＃８から分化誘導した心筋細胞の結果であることを示し、「Ａ１－Ｂ７－＃１０」は、上記（３）のクローン＃１０から分化誘導した心筋細胞の結果であることを示し、「１３８３Ｄ２－Ｂ２Ｍ－＃１」は、上記（４）のＢ２Ｍをノックアウトした１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）から分化誘導した心筋細胞の結果であることを示す。
その結果、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させると傷害の程度が上昇することが明らかとなった。
これに対し、Ｂ２Ｍをノックアウトした１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。同様に、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトした、クローン＃８及び＃１０から分化誘導した心筋細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。
この結果は、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、分化誘導して他家移植した場合の拒絶反応を低減させることができることを示す。
また、上記の（２）～（４）の各ｉＰＳ細胞を心筋細胞に分化誘導できたことは、ＩＦＮ－γ処理により、多能性幹細胞の多能性を維持したまま、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導することができることを示す。
［実験例２４］
（Ｔ細胞傷害性試験２）
実験例２３と同様の（１）～（４）のｉＰＳ細胞をＥＢ由来血球様細胞に分化誘導し、５１Ｃｒリリースアッセイを行った。
まず、（１）６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例７で作製した、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃８、（３）同クローン＃１０、（４）実験例１８で作製した、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。なお、ＥＢ由来血球様細胞は血球細胞を含む。
続いて、各ＥＢ由来血球様細胞の培地に、実験例２２で調製した６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ抗原に反応性を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞を様々な割合で添加し、各ＥＢ由来血球様細胞が攻撃されたか否かを検討した。すなわち、エフェクター細胞として実験例２１で調製したＨＬＡ抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を、ターゲット細胞として上述した各ＥＢ由来血球様細胞を使用した。添加するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の割合は、ＥＢ由来血球様細胞１に対して、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０とした。
図３２は、各ＥＢ由来血球様細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図３２中、「＊」は、Ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は、上記（１）の６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ａ１－Ｂ７－＃８」は、上記（２）のクローン＃８から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ａ１－Ｂ７－＃１０」は、上記（３）のクローン＃１０から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「６０４Ｂ１－Ｂ２Ｍ－＃１」は、上記（４）のＢ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示す。
その結果、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させると傷害の程度が上昇することが明らかとなった。
これに対し、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。同様に、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトした、クローン＃８及び＃１０から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。
この結果は、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、分化誘導して他家移植した場合の拒絶反応を低減させることができることを示す。
また、上記の（２）～（４）の各ｉＰＳ細胞をＥＢ由来血球様細胞に分化誘導できたことは、ＩＦＮ－γ処理により、多能性幹細胞の多能性を維持したまま、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導することができることを示す。
［実験例２５］
（Ｔ細胞傷害性試験３）
実験例２４とは異なるｉＰＳ細胞を用いた点以外は実験例２４と同様の検討を行った。まず、（１）下記表３２のＨＬＡハプロタイプを持つ５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例９で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ＊０７：０２アレルおよびＣ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃２、（３）同クローン＃１１、（４）同クローン＃２６、（５）実験例１８で作製した、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。なお、ＥＢ由来血球様細胞は血球細胞を含む。
Figure 0007385281000032
続いて、各ＥＢ由来血球様細胞の培地に、下記表３３のＨＬＡハプロタイプを持つ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「２０１０１１３２０３」、Ｗａｋｏ社、上述したレシピエントＢに相当する。）由来のエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞を様々な割合で添加し、各ＥＢ由来血球様細胞が攻撃されたか否かを検討した。エフェクター細胞として、実験例２０の図２６（ａ）に示す、ＣＦＳＥが陰性となったＰＢＭＣ中のＣＤ８陽性Ｔ細胞をソーティングして用いた。また、ターゲット細胞が上述した各ＥＢ由来血球様細胞である。添加するエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞数の割合は、ＥＢ由来血球様細胞１に対して、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０とした。
Figure 0007385281000033
図３３は、各ＥＢ由来血球様細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図３３中、「＊」は、Ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は、上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｂ７－Ｃ７－＃２」は、上記（２）のクローン＃２から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｂ７－Ｃ７－＃１１」は、上記（３）のクローン＃１１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｂ７－Ｃ７－＃２６」は、上記（４）のクローン＃２６から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「６０４Ｂ１－Ｂ２Ｍ－＃１」は、上記（５）のＢ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示す。
その結果、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させると傷害の程度が上昇することが明らかとなった。
これに対し、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。同様に、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ＊０７：０２アレル及びＣ＊０７：０２アレルをノックアウトした、クローン＃２、＃１１及び＃２６から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。
この結果は、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、分化誘導して他家移植した場合の拒絶反応を低減させることができることを示す。
また、上記の（２）～（５）の各ｉＰＳ細胞をＥＢ由来血球様細胞に分化誘導できたことは、ＩＦＮ－γ処理により、多能性幹細胞の多能性を維持したまま、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導することができることを示す。
［実験例２６］
（Ｔ細胞傷害性試験４）
下記表３４のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、及び、実験例１８で作製した、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、下記表３５のＨＬＡハプロタイプを持つ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿２６６」、ＣＴＬ社、上述したレシピエントＣに相当する。）をＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）でラベリングしたものと混合し、７日間共培養した。
Figure 0007385281000034
Figure 0007385281000035
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図３４（ａ）及び（ｂ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図３４（ａ）及び（ｂ）中、「６０４Ｂ１－Ｂ２Ｍ－＃１」は、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）と共培養したＰＢＭＣの結果であることを示し、「６０４Ｂ１」は、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣの結果であることを示す。
その結果、図３４（ａ）に示すように、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）と共培養したＰＢＭＣには、ＣＤ８陽性、ＣＳＦＥ陰性のＴ細胞が１１．３％含まれていた。また、図３４（ｂ）に示すように、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣには、ＣＤ８陽性、ＣＳＦＥ陰性のＴ細胞が２１．３％含まれていた。続いて、図３４（ｂ）に示す、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣから、ＣＤ８陽性かつＣＳＦＥ陰性の細胞を、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞としてソーティングして回収した。
続いて、（１）６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１１で作製した、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル、Ｂ＊３７：０１アレルおよびＣ＊０６：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１１、（３）同クローン＃３－１２を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。なお、ＥＢ由来血球様細胞は血球細胞を含む。
続いて、各ＥＢ由来血球様細胞の培地に、回収したエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞を様々な割合で添加し、各ＥＢ由来血球様細胞が攻撃されたか否かを検討した。すなわち、ターゲット細胞が上記（１）～（３）の各細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞である。添加するエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞数の割合は、ＥＢ由来血球様細胞１に対して、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０とした。
図３４（ｃ）は、各ＥＢ由来血球様細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図３４（ｃ）中、「＊」は、Ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は、上記（１）の６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ａ１－Ｂ３７－Ｃ６－＃３－１１」は、上記（２）のクローン＃３－１１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ａ１－Ｂ３７－Ｃ６－＃３－１２」は、上記（３）のクローン＃３－１２から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示す。
その結果、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させると傷害の程度が上昇することが明らかとなった。
これに対し、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル、Ｂ＊３７：０１アレルおよびＣ＊０６：０２アレルをノックアウトした、クローン＃３－１１及び＃３－１２から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。
この結果は、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、分化誘導して他家移植した場合の拒絶反応を低減させることができることを示す。
また、上記の（２）～（３）の各ｉＰＳ細胞をＥＢ由来血球様細胞に分化誘導できたことは、ＩＦＮ－γ処理により、多能性幹細胞の多能性を維持したまま、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導することができることを示す。
［実験例２７］
（ＮＫ細胞反応性試験１）
（１）下記表３６のＨＬＡハプロタイプを持つ６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例８で作製した、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃８、（３）同クローン＃１０、（４）下記表３７のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞、（５）実験例１８で作製した、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化させた。なお、ＥＢ由来血球様細胞はＣＤ４５陽性白血球細胞を含む。
Figure 0007385281000036
Figure 0007385281000037
また、下記表３８のＨＬＡハプロタイプを持つＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿１９４」、ＣＴＬ社、上述したレシピエントＡに相当する。）からＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）をソーティングにより回収した。続いて、回収したＮＫ細胞を、抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下で、分化させた各ＣＤ４５陽性白血球細胞と共培養した。この結果、ＮＫ細胞が活性化するとＣＤ１０７ａ陽性となる。共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、活性化したＮＫ細胞の割合を測定した。
Figure 0007385281000038
図３５（ａ）～（ｇ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図３５（ａ）はＮＫ細胞のみを培養して解析した結果である。図３５（ｂ）は６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞と共培養したＮＫ細胞を解析した結果である。図３５（ｃ）は６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃８から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞と共培養したＮＫ細胞を解析した結果である。図３５（ｄ）は同クローン＃１０から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞と共培養したＮＫ細胞を解析した結果である。図３５（ｅ）は１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞と共培養したＮＫ細胞を解析した結果である。図３５（ｆ）はＢ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞と共培養したＮＫ細胞を解析した結果である。図３５（ｇ）は、陽性対照として、ＨＬＡ抗原を発現していないことが知られているＫ５６２細胞と共培養したＮＫ細胞を解析した結果である。
その結果、Ｋ５６２細胞と共培養したＮＫ細胞は、５．９％が活性化したことが明らかとなった。また、ＨＬＡ抗原を発現していない、Ｂ２Ｍをノックアウトした６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞と共培養したＮＫ細胞は、３．２％が活性化したことが明らかとなった。
これに対し、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル及びＢ＊０７：０２アレルをノックアウトしたクローン＃８及び＃１０では、もう片方のＡ＊２４：０２アレルとＢ＊３７：０１アレルの発現が残っており、そこから分化誘導したＥＢ由来血球様細胞と共培養したＮＫ細胞は、活性化が抑制されたことが明らかとなった。
すなわち、Ｂ２Ｍをノックアウトした細胞は、ＮＫ細胞に有意に攻撃されるのに対し、一部のＨＬＡアレルを残存させた細胞は、ＮＫ細胞による攻撃を回避することができることが明らかとなった。
［実験例２８］
（多能性確認試験１）
１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞及び６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞について、（１）未処理の状態、（２）５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間処理した直後、及び（３）５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間処理してから５日後、の各細胞をそれぞれ用意し、ｍＲＮＡを抽出した。続いて、Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｓｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ社）を用いてｃＤＮＡを合成後、多能性幹細胞で特異的に発現しているヒトＮＡＮＯＧ ｃＤＮＡを増幅するプライマー、及び、ｍＲＮＡ総量のコントロールとして、ヒトＡＣＴＢ ｃＤＮＡを増幅するプライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。
ヒトＮＡＮＯＧ ｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー、及び、ヒトＡＣＴＢ ｃＤＮＡの増幅に用いたプライマーを下記表３９に示す。
Figure 0007385281000039
図３６はＮＡＮＯＧ遺伝子の発現量を測定した定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。ＮＡＮＯＧ遺伝子の発現量を、「未処理」の１３８３Ｄ２細胞における、ＡＣＴＢ遺伝子に対するＮＡＮＯＧ遺伝子の発現量を１とした相対値として示した。
図３６中、「未処理」はＩＦＮ－γで処理せず、通常の未分化維持条件で培養したｉＰＳ細胞の結果であることを示し、「ＩＦＮ直後」はＩＦＮ－γで４８時間処理した直後の細胞の結果であることを示し、「５日後」はＩＦＮ－γで４８時間処理してから５日後の細胞の結果であることを示す。
その結果、多能性マーカーとして広く用いられているＮＡＮＯＧの発現量は、ｉＰＳ細胞をＩＦＮ－γで４８時間処理しても低下しないことが明らかとなった。この結果は、ｉＰＳ細胞をＩＦＮ－γで処理しても多能性が維持されることを示す。
［実験例２９］
（多能性確認試験２）
（１）６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１１で作製した６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル、Ｂ＊３７：０１アレル、Ｃ＊０６：０２アレルを破壊したクローン＃３－１１、（３）同クローン＃３－１２、（４）実験例１８で作製した６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子を破壊したクローン＃１、（５）１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞、（６）実験例１７で作製した１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子を破壊したクローン＃１を、それぞれ未分化維持条件下で培養し、各細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。
未分化維持条件での培養は、培地にＡＫ０３Ｎ培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ社）を用い、細胞マトリックスに、型式「ｉＭａｔｒｉｘ－５１１」（Ｎｉｐｐｉ社）を用いて行った。
図３７（ａ）～（ｆ）は、それぞれ上記（１）～（５）の各細胞を位相差顕微鏡で撮影した写真である。スケールバーは１ｍｍである。
その結果、ＨＬＡアレルやＢ２Ｍアレルを破壊し、ＩＦＮ－γ処理を行ったｉＰＳ細胞も、未分化多能性幹細胞に特徴的な扁平コロニーを形成して増殖することが明らかとなった。この結果は、ｉＰＳ細胞をＩＦＮ－γで処理しても多能性が維持されていることを示す。この結果はまた、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルやＢ２Ｍアレルを破壊しても多能性が維持されていることを示す。
［実験例３０］
（多能性確認試験３）
（１）６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１１で作製した６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル、Ｂ＊３７：０１アレル、Ｃ＊０６：０２アレルを破壊したクローン＃３－１１、（３）同クローン＃３－１２、（４）実験例１８で作製した６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子を破壊したクローン＃１、（５）１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞、（６）実験例１７で作製した１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子を破壊したクローン＃１を、それぞれ血球分化誘導条件下で培養し、ＥＢ由来血球様細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。
ｉＰＳ細胞の血球分化誘導は次のようにして行った、まず、未分化ｉＰＳ細胞を超低接着培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、Ｙ－２７６３３を含むＡＫ０３Ｎ培地でＥＢ（胚葉体）を２日間形成させた。続いて、ヒトｂＦＧＦ（オリエンタル酵母社）、ヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－Ｓｅｌｅｎｉｕｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＧｌｕｔａＭａｘ－Ｉ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｅｓｑｕｉｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｙｄｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社）、１－Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＭＴＧ、ナカライテスク社）及びヒトＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含むＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で更に３日間培養した後、ヒトＢＭＰ４を除去し、ヒトＳＣＦを添加して２日間培養した。続いて、ヒトＦｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）及びヒトＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を加えて培養した。その結果、ＥＢ由来血球様細胞が生成された。
図３８（ａ）～（ｆ）は、それぞれ分化誘導２２日目の上記（１）～（５）の各ＥＢ由来血球様細胞を位相差顕微鏡で撮影した写真である。スケールバーは１ｍｍである。
その結果、ＨＬＡアレルやＢ２Ｍアレルを破壊し、ＩＦＮ－γ処理を行ったｉＰＳ細胞も、血球様細胞へと分化誘導が可能であることが明らかとなった。この結果は、ｉＰＳ細胞をＩＦＮ－γで処理しても多能性が維持されていることを示す。この結果はまた、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルやＢ２Ｍアレルを破壊しても多能性が維持されていることを示す。
［実験例３１］
（Ｔ細胞傷害性試験５）
（１）実験例１７で作製した、下記表４０のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（クローン＃１）、（２）下記表４１のＨＬＡハプロタイプを持つ５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞を、ＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色し、下記表４２のＨＬＡハプロタイプを持つ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿２７５」、ＣＴＬ社）と７日間共培養した。
Figure 0007385281000040
Figure 0007385281000041
Figure 0007385281000042
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図３９（ａ）及び（ｂ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図３９（ａ）及び（ｂ）中、「１３８３Ｄ２ Ｂ２Ｍ－ＫＯ＃１」は、Ｂ２Ｍをノックアウトした１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）と共培養したＰＢＭＣの結果であることを示し、「５８５Ａ１－ＷＴ」は、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣの結果であることを示す。
その結果、図３９（ａ）に示すように、Ｂ２Ｍをノックアウトした１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）と共培養したＰＢＭＣには、ＣＤ８陽性、ＣＳＦＥ陰性のＴ細胞が存在しなかった。また、図３９（ｂ）に示すように、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣには、活性化されてＣＳＦＥ陰性となったＣＤ８陽性Ｔ細胞が２４．４％含まれていた。続いて、図３９（ｂ）に示す、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣから、ＣＤ８陽性かつＣＳＦＥ陰性の細胞を、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞としてソーティングして回収した。
続いて、（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（３）同クローン＃３－３、（４）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。なお、ＥＢ由来血球様細胞は血球細胞を含む。
続いて、各ＥＢ由来血球様細胞の培地に、回収したエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞を様々な割合で添加し、各ＥＢ由来血球様細胞が攻撃されたか否かを検討した。すなわち、ターゲット細胞が上記（１）～（４）の各細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞である。添加するエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞数の割合は、ＥＢ由来血球様細胞１に対して、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０とした。
図３９（ｃ）は、各ＥＢ由来血球様細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図３９（ｃ）中、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－３」は上記（３）のクローン＃３－３から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（４）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示す。
その結果、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させると傷害の程度が上昇することが明らかとなった。
これに対し、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトした、クローン＃３－１及び＃３－３から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞、及び、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。
この結果は、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、分化誘導して他家移植した場合の拒絶反応を低減させることができることを更に支持するものである。
［実験例３２］
（Ｔ細胞傷害性試験６）
（１）実験例１７で作製した、下記表４３のＨＬＡハプロタイプを持つ１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（クローン＃１）、（２）下記表４４のＨＬＡハプロタイプを持つ５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞を、下記表４５のＨＬＡハプロタイプを持つ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）をＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色したものと７日間共培養した。
Figure 0007385281000043
Figure 0007385281000044
Figure 0007385281000045
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図４０（ａ）及び（ｂ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図４０（ａ）及び（ｂ）中、「１３８３Ｄ２ Ｂ２Ｍ－ＫＯ＃１」はＢ２Ｍをノックアウトした１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）と共培養したＰＢＭＣの結果であることを示し、「５８５Ａ１－ＷＴ」は５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣの結果であることを示す。
その結果、図４０（ａ）に示すように、Ｂ２Ｍをノックアウトした１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞（クローン＃１）と共培養したＰＢＭＣには、ＣＤ８陽性、ＣＳＦＥ陰性のＴ細胞が存在しなかった。また、図４０（ｂ）に示すように、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣには、活性化されてＣＳＦＥ陰性となったＣＤ８陽性Ｔ細胞が１１．７％含まれていた。続いて、図４０（ｂ）に示す、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞と共培養したＰＢＭＣから、ＣＤ８陽性かつＣＳＦＥ陰性の細胞を、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞としてソーティングして回収した。
続いて、（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（３）同クローン＃３－３、（４）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。なお、ＥＢ由来血球様細胞は血球細胞を含む。
続いて、各ＥＢ由来血球様細胞の培地に、回収したエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞を様々な割合で添加し、各ＥＢ由来血球様細胞が攻撃されたか否かを検討した。すなわち、ターゲット細胞が上記（１）～（４）の各細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞である。添加するエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞数の割合は、ＥＢ由来血球様細胞１に対して、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０とした。
図４０（ｃ）は、各ＥＢ由来血球様細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図４０（ｃ）中、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－３」は上記（３）のクローン＃３－３から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（４）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示す。
その結果、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させると傷害の程度が上昇することが明らかとなった。
これに対し、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトした、クローン＃３－１及び＃３－３から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞、及び、１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を上昇させても傷害を受けないことが明らかとなった。
この結果は、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、分化誘導して他家移植した場合の拒絶反応を低減させることができることを更に支持するものである。
［実験例３３］
（細胞移植実験１）
（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。続いて、各ＥＢ由来血球様細胞をルシフェラーゼでラベルした。
続いて、実験開始の１時間前に、腹腔内投与により、免疫不全マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧ）、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）に各細胞をそれぞれ移植した。続いて、実験開始時に、実験例３２と同様にして調製した、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）由来のエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞又は培地（対照）を更に腹腔内投与した。
続いて、細胞移植時（Ｔ細胞注射前）、実験開始から５時間後、１日後、３日後、７日後に、各マウスにルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを投与し、ＩＶＩＳイメージングシステム（商品名「ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」、ＳＰＩ社）を用いて、ルシフェラーゼでラベルしたＥＢ由来血球様細胞の蛍光を撮影し、移植した細胞の生存率を測定した。
図４１（ａ）は実験スケジュールを説明した図である。また、図４１（ｂ）は、各マウスにおけるＥＢ由来血球様細胞の蛍光を撮影した結果を示す写真である。また、図４１（ｃ）は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞をマウスに投与した場合の各ＥＢ由来血球様細胞の生存率を、Ｔ細胞注射前の蛍光強度を１００％として算出した結果を示す相対的生存曲線のグラフである。
図４１（ｂ）及び（ｃ）中、「ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｍｏｃｋ」は対照として培地を投与した結果であることを示し、「Ｔ細胞」は末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）由来のエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞を投与した結果であることを示す。
その結果、図４１（ｃ）に示すように、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の投与後生存率が低下することが確認された。これに対し、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトした、クローン＃３－１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞の投与後でも高い生存率を維持することが明らかとなった。
この結果は、ｉＰＳ細胞のＨＬＡアレルを破壊することにより、分化誘導して他家移植した場合の拒絶反応を低減させることができることを更に支持するものである。
［実験例３４］
（ＮＫ細胞反応性試験２）
（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（３）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）を用意した。下記表４６に５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡハプロタイプを示し、下記表４７に１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＨＬＡハプロタイプを示す。
Figure 0007385281000046
Figure 0007385281000047
また、下記表４８のＨＬＡハプロタイプを持つＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿２７５」、ＣＴＬ社）からＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）をソーティングにより回収した。続いて、回収したＮＫ細胞を、抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下で、上述の（１）～（３）の各細胞と共培養した。この結果、ＮＫ細胞が活性化するとＣＤ１０７ａ陽性となる。共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、活性化したＮＫ細胞の割合を測定した。
Figure 0007385281000048
図４２（ａ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図４２（ａ）中、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（３）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞の結果であることを示す。
その結果、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした細胞と比較して、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞及びクローン＃３－１では、ＮＫ細胞の活性化を有意に抑制することができたことが明らかとなった。続いて、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした細胞で活性化したＮＫ細胞をソーティングして回収した。
続いて、（４）ＨＬＡ抗原を発現していないことが知られているＫ５６２細胞、（５）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）、（６）後述する実験例４７で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルをノックアウトした細胞（クローン＃３－５、ＨＬＡ－Ｅ、Ｆ、Ｇアレルは残存している。）、（７）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（８）同クローン＃３－３、（９）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをノックアウトした細胞（クローン＃３、ＨＬＡ－Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇアレルは残存している。）、（１０）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の各細胞に対し、活性化したＮＫ細胞を様々な割合で添加し、５１Ｃｒリリースアッセイを行った。
すなわち、エフェクター細胞として上述の活性化したＮＫ細胞を、ターゲット細胞として上述の（４）～（１０）の各細胞を使用した。添加するＮＫ細胞数の割合は、ターゲット細胞１に対して、０．３３、１、３とした。
図４２（ｂ）は上述の（４）～（１０）の各細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図４２（ｂ）中、「＊」はＰ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「Ｋ５６２」は上記（４）のＫ５６２細胞の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（５）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞の結果であることを示し、「Ａ－Ｂ－Ｃ－＃５」は上記（６）のＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルをノックアウトした細胞（クローン＃３－５）の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（７）のクローン＃３－１の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－３」は上記（８）のクローン＃３－３の結果であることを示し、「Ａ－Ｂ－＃３」は上記（９）のＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをノックアウトした細胞（クローン＃３）の結果であることを示し、「５８５Ａ１－ＷＴ」は上記（１０）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の結果であることを示す。
その結果、ＨＬＡ－Ｃアレルを残存させた細胞は、Ｂ２Ｍをノックアウトした細胞及びＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルをノックアウトした細胞と比較して、ＮＫ細胞による攻撃を有意に回避することができることが明らかとなった。
［実験例３５］
（ＮＫ細胞反応性試験３）
（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（３）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）を用意した。下記表４９に５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡハプロタイプを示し、下記表５０に１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＨＬＡハプロタイプを示す。
Figure 0007385281000049
Figure 0007385281000050
また、下記表５１のＨＬＡハプロタイプを持つＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）からＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）をソーティングにより回収した。続いて、回収したＮＫ細胞を、抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下で、上述の（１）～（３）の各細胞と共培養した。この結果、ＮＫ細胞が活性化するとＣＤ１０７ａ陽性となる。共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、活性化したＮＫ細胞の割合を測定した。
Figure 0007385281000051
図４３（ａ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図４３（ａ）中、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（３）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞の結果であることを示す。
その結果、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした細胞と比較して、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞及びクローン＃３－１では、ＮＫ細胞の活性化を有意に抑制することができたことが明らかとなった。続いて、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした細胞で活性化したＮＫ細胞をソーティングして回収した。
続いて、（４）ＨＬＡ抗原を発現していないことが知られているＫ５６２細胞、（５）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）、（６）後述する実験例４７で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルをノックアウトした細胞（クローン＃３－５、ＨＬＡ－Ｅ、Ｆ、Ｇアレルは残存している。）、（７）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（８）同クローン＃３－３、（９）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをノックアウトした細胞（クローン＃３、ＨＬＡ－Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇアレルは残存している。）、（１０）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の各細胞に対し、活性化したＮＫ細胞を様々な割合で添加し、５１Ｃｒリリースアッセイを行った。
すなわち、エフェクター細胞として上述の活性化したＮＫ細胞を、ターゲット細胞として上述の（４）～（１０）の各細胞を使用した。添加するＮＫ細胞数の割合は、ターゲット細胞１に対して、０．３３、１、３とした。
図４３（ｂ）は上述の（４）～（１０）の各細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図４３（ｂ）中、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「Ｋ５６２」は上記（４）のＫ５６２細胞の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（５）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞の結果であることを示し、「Ａ－Ｂ－Ｃ－＃５」は上記（６）のＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルをノックアウトした細胞（クローン＃５）の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（７）のクローン＃３－１の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－３」は上記（８）のクローン＃３－３の結果であることを示し、「Ａ－Ｂ－＃３」は上記（９）のＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをノックアウトした細胞（クローン＃３）の結果であることを示し、「５８５Ａ１－ＷＴ」は上記（１０）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の結果であることを示す。
その結果、ＨＬＡ－Ｃアレルを残存させた細胞は、Ｂ２Ｍをノックアウトした細胞及びＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルをノックアウトした細胞と比較して、ＮＫ細胞による攻撃を有意に回避することができることが明らかとなった。
［実験例３６］
（ＮＫ細胞反応性試験４）
（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（３）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）、（４）ＨＬＡ抗原を発現していないことが知られているＫ５６２細胞を用意した。下記表５２に５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡハプロタイプを示し、下記表５３に１３８３Ｄ２ ｉＰＳ細胞のＨＬＡハプロタイプを示す。
Figure 0007385281000052
Figure 0007385281000053
また、下記表５４のＨＬＡハプロタイプを持つＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿１１８」、ＣＴＬ社）及び下記表５５のＨＬＡハプロタイプを持つＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿２６６」、ＣＴＬ社）からＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）をソーティングによりそれぞれ回収した。続いて、回収したＮＫ細胞を、抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下で、上述の（１）～（４）の各細胞と共培養した。この結果、ＮＫ細胞が活性化するとＣＤ１０７ａ陽性となる。共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、活性化したＮＫ細胞の割合を測定した。
Figure 0007385281000054
Figure 0007385281000055
図４４（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図図４４（ａ）は上記表５４のＨＬＡハプロタイプを持つＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿１１８」、ＣＴＬ社）由来のＮＫ細胞の結果を示し、図４４（ｂ）は上記表５５のＨＬＡハプロタイプを持つＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿２６６」、ＣＴＬ社）由来のＮＫ細胞の結果を示す。図４４（ａ）及び（ｂ）中、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（３）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞の結果であることを示し、「Ｋ５６２」は上記（４）のＫ５６２細胞の結果であることを示す。
その結果、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした細胞と比較して、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞及びクローン＃３－１では、ＮＫ細胞の活性化を有意に抑制することができたことが明らかとなった。
［実験例３７］
（細胞移植実験２）
（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトした細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。続いて、各ＥＢ由来血球様細胞をルシフェラーゼでラベルした。
続いて、実験開始の１時間前に、腹腔内投与により、免疫不全マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧ）、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）に各細胞をそれぞれ移植した。続いて、実験開始時に、実験例３４、３５と同様にして調製した、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）由来の活性化ＮＫ細胞又は培地（対照）を更に腹腔内投与した。下記表５６にＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）のＨＬＡハプロタイプを示す。
Figure 0007385281000056
続いて、細胞移植時（ＮＫ細胞注射前）、実験開始から５時間後、１日後、３日後、５日後、７日後に、各マウスにルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを投与し、ＩＶＩＳイメージングシステム（商品名「ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」、ＳＰＩ社）を用いて、ルシフェラーゼでラベルしたＥＢ由来血球様細胞の蛍光を撮影し、移植した細胞の生存率を測定した。
図４５（ａ）は実験スケジュールを説明した図である。また、図４５（ｂ）は、各マウスにおけるＥＢ由来血球様細胞の蛍光を撮影した結果を示す写真である。また、図４５（ｃ）は、ＮＫ細胞をマウスに投与した場合の各ＥＢ由来血球様細胞の生存率を、ＮＫ細胞注射前の蛍光強度を１００％として算出し、更に各測定時間における相対的生存率を下記式（Ｆ１）により算出した結果を示すグラフである。図４５（ｃ）中、縦軸の単位は（％）である。
相対的生存率（％）＝ＮＫ細胞投与群の生存率（％）／対照群の生存率（％）×１００ …（Ｆ１）
図４５（ｂ）及び（ｃ）中、「Ｂ２Ｍ－」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｍｏｃｋ」は対照として培地を投与した結果であることを示し、「ＮＫ細胞」は末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）由来の活性化ＮＫ細胞を投与した結果であることを示す。
その結果、図４５（ｃ）に示すように、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、ＮＫ細胞の投与後生存率が低下することが確認された。これに対し、クローン＃３－１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は、活性化ＮＫ細胞の投与後でも、より高い生存率を維持する傾向が認められた。
この結果は、ＨＬＡアレルを一部残存させることにより、他家移植した場合のＮＫ細胞による攻撃を低減させることができることを更に支持するものである。
［実験例３８］
（Ｔ細胞及びＮＫ細胞による傷害性試験）
（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１、（３）後述する実験例４６で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞（サブクローニングしていないバルクの細胞）を、それぞれＥＢ由来血球様細胞に分化誘導した。
続いて、各ＥＢ由来血球様細胞の培地に、実験例３１と同様にして、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿２７５」、ＣＴＬ社）からソーティングして回収したエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞及び実験例３４と同様にしてＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿２７５」、ＣＴＬ社）からソーティングして回収した活性化ＮＫ細胞を様々な割合で添加し、５１Ｃｒリリースアッセイを行った。
すなわち、ターゲット細胞が上記（１）～（３）の各細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞であり、エフェクター細胞が上述のＣＤ８陽性Ｔ細胞及び活性化ＮＫ細胞である。添加するエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞数の割合は、ＥＢ由来血球様細胞１に対して、１、３、９とした。また、添加する活性化ＮＫ細胞数の割合は、ＥＢ由来血球様細胞１に対して、０．３３、１、３とした。
図４６は、各ＥＢ由来血球様細胞が傷害を受けて溶解した割合を示すグラフである。図４６中、「＊」はＰ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｃ７＃３－１」は上記（２）のクローン＃３－１から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－」は上記（３）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示す。
その結果、各ＥＢ由来血球様細胞にエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞を単独で混合すると、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞のみが傷害を受けることが確認された。
また、各ＥＢ由来血球様細胞に活性化ＮＫ細胞を単独で混合すると、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞のみが傷害を受けることが確認された。
また、各ＥＢ由来血球様細胞に、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞及び活性化ＮＫ細胞の双方を混合すると、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞及びＢ２Ｍアレルをノックアウトした細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の双方が傷害を受けるが、Ｃ７＃３－１細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞は傷害の程度が有意に抑制されたことが明らかとなった。
この結果は、ドナー細胞に存在し、レシピエント細胞に存在しないＨＬＡアレルを破壊し且つドナー細胞とレシピエント細胞で一致するＨＬＡアレルを残存させることにより、エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞及び活性化ＮＫ細胞の双方による傷害をいずれも低減させることができることを示すものである。
［実験例３９］
（ＣＩＩＴＡ遺伝子ノックアウトｉＰＳ細胞の作製）
ＣＩＩＴＡ遺伝子は、Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒタンパク質をコードする遺伝子である。上述したように、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現はクラスＩＩのＨＬＡタンパク質の発現に必須であることが知られている。
実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１（以下、「５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞」という場合がある。）のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした。
図４７（ａ）は、５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞及びＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＨＬＡハプロタイプを示す表である。ＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトすることにより、クラスＩＩのＨＬＡタンパク質である、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ等を欠損させることができる。
具体的には、５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞に、精製Ｃａｓ９タンパク質と共に、ＣＩＩＴＡアレルを切断するｓｇＲＮＡである、ＣＩＩＴＡ－ｅｘ３ｇ５（標的塩基配列を配列番号８０１７に示す。）をトランスフェクションし、２８株のサブクローンを得た。トランスフェクションは市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を用いて行った。
続いて、各サブクローンのゲノムのＣＩＩＴＡアレルの塩基配列を解析した。図４７（ｂ）は、各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。図４７（ｂ）中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。
その結果、図４７（ｂ）に示すように、２８株のサブクローンのうち１５株に、少なくとも一方のＣＩＩＴＡアレルに欠失変異又は挿入変異が導入されたことが確認された。図４７（ｃ）では、代表例としてクローン＃３－１－３の塩基配列を示す。
［実験例４０］
（ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化試験）
健常人ボランティア＃２１由来の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からソーティングによりＣＤ４陽性Ｔ細胞を回収し、ＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色した。
続いて、上記のＣＤ４陽性Ｔ細胞を、（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１（以下、「５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞」という場合がある。）、（３）実験例３９で作製した、５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした細胞（クローン＃３－１－３）を混合して１週間共培養した。また、比較のために、（４）上記のＣＤ４陽性Ｔ細胞のみを単独で１週間培養した群も用意した。
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図４８（ａ）～（ｄ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図４８（ａ）～（ｄ）中、「Ｍｏｃｋ」は上記（４）のＣＤ４陽性Ｔ細胞のみを単独で培養した結果であることを示し、「５８５Ａ１－ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞の結果であることを示し、「５８５Ａ１－Ｃ７＃３－１」は上記（２）の５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞の結果であることを示し、「５８５Ａ１－Ｃ７＋ＣＩＩＴＡ－＃３－１－３」は上記（３）の５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした細胞（クローン＃３－１－３）の結果であることを示す。
その結果、図４８（ａ）に示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のみを単独で培養しても、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は活性化されないことが明らかとなった。
また、図４８（ｂ）に示すように、健常人ボランティア＃２１由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞と５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞を共培養すると４５．６％のＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化されてＣＦＳＥ陰性となったことが明らかとなった。
また、図４８（ｃ）に示すように、健常人ボランティア＃２１由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞と５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞を共培養すると４９．２％のＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化されてＣＦＳＥ陰性となったことが明らかとなった。
また、図４８（ｄ）に示すように、健常人ボランティア＃２１由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞と５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした細胞（クローン＃３－１－３）を共培養しても、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は活性化されないことが明らかとなった。
［実験例４１］
（ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化試験）
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）をＣＦＳＥ（ケイマンケミカル社）で染色した。下記表５７にＰＢＭＣ（型式「ＬＰ＿３２９」、ＣＴＬ社）のＨＬＡハプロタイプを示す。
Figure 0007385281000057
続いて、上記のＰＢＭＣを、（１）５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞、（２）実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル、Ｂ＊５２：０１アレル、及びＣ＊１２：０２アレルをノックアウトしたクローン＃３－１（以下、「５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞」という場合がある。）、（３）実験例３９で作製した、５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした細胞（クローン＃３－１－３）、（４）同クローン＃３－１－６の各細胞から分化させたＥＢ由来血球様細胞、及び、（５）ＨＬＡ抗原を発現していないことが知られているＫ５６２細胞を混合して１週間共培養した。また、比較のために、（６）上記のＰＢＭＣのみを単独で１週間培養した群も用意した。
共培養後にフローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥの蛍光を検討した。図４９（ａ）～（ｃ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図４９（ａ）～（ｃ）中、「Ｍｏｃｋ」は上記（６）のＰＢＭＣのみを単独で培養した結果であることを示し、「５８５Ａ１－ＷＴ」は上記（１）の５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「５８５Ａ１－Ｃ７＃３－１」は上記（２）の５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「５８５Ａ１－Ｃ７＋ＣＩＩＴＡ－＃３－１－３」は上記（３）の５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした細胞（クローン＃３－１－３）から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「５８５Ａ１－Ｃ７＋ＣＩＩＴＡ－＃３－１－６」は上記（４）の５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした細胞（クローン＃３－１－６）から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞の結果であることを示し、「Ｋ５６２」は上記（５）のＫ５６２細胞の結果であることを示す。
その結果、図４９（ａ）に示すように、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞に反応し、５１．０％のＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されてＣＦＳＥ陰性となったことが明らかとなった。これに対し、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞以外の細胞と共培養しても、２％以下のＣＤ８陽性Ｔ細胞しか活性化されないことが明らかとなった。
また、図４９（ｂ）に示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞及び５８５Ａ１－Ｃ７残存細胞から分化誘導したＥＢ由来血球様細胞に反応し、それぞれ４９．２％及び２６．７％のＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化されてＣＦＳＥ陰性となったことが明らかとなった。これに対し、その他の細胞と共培養しても、２％以下のＣＤ４陽性Ｔ細胞しか活性化されないことが明らかとなった。
また、図４９（ｃ）に示すように、ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞に反応し、７９．２％のＮＫ細胞が活性化されてＣＦＳＥ陰性となったことが明らかとなった。これに対し、その他の細胞と共培養しても、７％以下のＮＫ細胞しか活性化されないことが明らかとなった。
［実験例４２］
（ＨＬＡ－Ｃ７残存ＣＩＩＴＡ欠損ｉＰＳ細胞の作製）
日本人において、第３位のＨＬＡアレル頻度をホモに有するｉＰＳストック細胞（Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞）から、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＣＩＩＴＡアレルをノックアウトした。ノックアウトは１段階及び２段階のゲノム編集によりそれぞれ行った。下記表５８にＦｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞のＨＬＡハプロタイプを示す。
Figure 0007385281000058
図５０（ａ）～（ｃ）は、本実験例の手順を説明する図である。図５０（ａ）は、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＣＩＩＴＡアレルを１段階でノックアウトした手順を説明する図である。また、図５０（ｂ）及び（ｃ）は、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＣＩＩＴＡアレルを２段階でノックアウトした手順を説明する図である。
１段階でのノックアウトでは、まず、図５０（ａ）に示すように、Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞に、ＨＬＡ－Ａアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＡ－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５５に示す。）、ＨＬＡ－Ｂアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＢ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５３に示す。）、及び、ＣＩＩＴＡアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＣＩＩＴＡ－ｅｘ３ｇ５（標的塩基配列を配列番号８０１７に示す。）及び精製Ｃａｓ９タンパク質をトランスフェクションした。トランスフェクションは市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を用いて行った。
続いて、ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａ２４抗原及びＨＬＡ－Ｂ７抗原の発現を検討した。図５１（ａ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図５１（ａ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ＴＦ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「ＨＬＡ－Ａ－ｅｘ３ｇ１」は、Ａ－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５５に示す。）を導入した結果であることを示し、「ＨＬＡ－Ｂ－ｅｘ２ｇ１」は、Ｂ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５３に示す。）を導入した結果であることを示し、ＣＩＩＴＡ－ｅｘ３ｇ５（標的塩基配列を配列番号８０１７に示す。）はＣＩＩＴＡ－ｅｘ３ｇ５を導入した結果であることを示す。
続いて、ＨＬＡ－Ａ２４抗原及びＨＬＡ－Ｂ７抗原の双方が陰性である細胞集団をソーティングして回収し、１５株のサブクローンを得た。続いて、各サブクローンのゲノムのＨＬＡ－Ａ２４アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル及びＣＩＩＴＡアレルの塩基配列を解析した。図５１（ｂ）は、各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。図５１（ｂ）中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示し、「Ｎ．Ｄ．」は塩基配列を決定しなかったことを示す。また、サブクローン名における「ＡＢＴｏ」は、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＣＩＩＴＡアレルをノックアウトしたことを意味する。
その結果、図５１（ｂ）に示すように、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル、ＣＩＩＴＡアレルの全てに挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が検出された、クローン＃１、＃２、＃３、＃６、＃１３、＃１５を得た。
２段階でのノックアウトでは、まず、図５０（ｂ）に示すように、Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞に、ＨＬＡ－Ａアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＡ－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５５に示す。）、ＨＬＡ－Ｂアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＢ－ｅｘ２－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５３に示す。）及び精製Ｃａｓ９タンパク質をトランスフェクションし、１７株のサブクローンを得た。トランスフェクションは市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を用いて行った。
続いて、各サブクローンのゲノムのＨＬＡ－Ａ２４アレル及びＨＬＡ－Ｂ７アレルの塩基配列を解析した。図５２（ａ）は、各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。図５２（ａ）中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示し、「Ｍｕｔ．」は置換変異を有していたことを示す。また、サブクローン名における「ＡＢｏ」は、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをノックアウトしたことを意味する。
その結果、図５２（ａ）に示すように、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレルの双方に挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が検出された、クローン＃１４を得た。
続いて、図５０（ｃ）に示すように、得られたクローン＃１４にＣＩＩＴＡアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＣＩＩＴＡ－ｅｘ３ｇ５（標的塩基配列を配列番号８０１７に示す。）及び精製Ｃａｓ９タンパク質をトランスフェクションし、１２株のサブクローンを得た。トランスフェクションは市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を用いて行った。
続いて、各サブクローンのゲノムのＣＩＩＴＡアレルの塩基配列を解析した。図５２（ｂ）は、各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。図５２（ｂ）中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示し、「Ｎ．Ｄ．」は塩基配列を決定しなかったことを示す。また、サブクローン名における「ＡＢｏ＿Ｔｏ」は、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをノックアウトして一度サブクローニングした後、ＣＩＩＴＡアレルをノックアウトしたことを意味する。
その結果、図５２（ｂ）に示すように、ＣＩＩＴＡの双方のアレルにフレームシフト変異となる挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ変異）が検出された、クローン＃１４－３、＃１４－４、＃１４－６、＃１４－１２を得た。
図５３は、様々な人種におけるＨＬＣ－Ｃアレルのアレル頻度を示す表である。図５３中、「ＪＰＮ」は日本人を示し、「ＥＵＲ」は欧州系アメリカ人を示し、「ＡＦＡ」はアフリカ系アメリカ人を示し、「ＡＰＩ」はアジア人を示し、「ＨＩＳ」はヒスパニックを示す。また、「アレル頻度」は、各人種におけるアレルの頻度（％）を示し、「ランク」は頻度の高い順からの順番を示す。
図５３に示すように、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１の１２種類の細胞を作製すれば、上記のいずれの人種においても９３％以上の人口をカバーすることができる。
すなわち、ＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルを欠失し、上記の１２種類のいずれかのＨＬＡ－Ｃアレルを有する細胞、あるいは、ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＣＩＩＴＡアレルを欠失し、上記の１２種類のいずれかのＨＬＡ－Ｃアレルを有する細胞は、細胞治療や再生医療用の細胞として非常に有用である。ここで、細胞は、細胞治療に用いられる細胞であれば特に限定されず、多能性幹細胞であってもよいし、分化した細胞であってもよい。具体的には、例えば、ｉＰＳ細胞、Ｔ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞等であってよい。
［実験例４３］
（Ｂ２ＭノックアウトｉＰＳ細胞の作製３）
実験例４１でも使用したｉＰＳストック細胞（Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞）から、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトした。
Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞に、Ｂ２Ｍアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＢ２Ｍ－ｇ２（標的塩基配列を配列番号６０に示す。）及び精製Ｃａｓ９タンパク質をトランスフェクションし、５株のサブクローンを得た。トランスフェクションは市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を用いて行った。
続いて、各サブクローンのゲノムのＢ２Ｍアレルの塩基配列を解析した。図５４は、各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。図５４中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。また、サブクローン名における「Ｍｏ」は、Ｂ２Ｍアレルをノックアウトしたことを意味する。
その結果、図５４に示すように、Ｂ２Ｍアレルにフレームシフト変異を生じたクローン＃１及び＃３を得た。
［実験例４４］
（Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックアウトｉＰＳ細胞の作製）
実験例４１でも使用したｉＰＳストック細胞（Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞）から、Ｂ２Ｍアレル及びＣＩＩＴＡアレルを同時にノックアウトした。
Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５ ｉＰＳ細胞に、Ｂ２Ｍアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＢ２Ｍ－ｇ２（標的塩基配列を配列番号６０に示す。）、ＣＩＩＴＡアレルを標的とすることができるｓｇＲＮＡであるＣＩＩＴＡ－ｅｘ３ｇ５（標的塩基配列を配列番号８０１７に示す。）及び精製Ｃａｓ９タンパク質をトランスフェクションし、１９株のサブクローンを得た。トランスフェクションは市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を用いて行った。
続いて、各サブクローンのゲノムのＢ２Ｍアレル及びＣＩＩＴＡアレルの塩基配列を解析した。図５５は、各サブクローンの塩基変異パターンを示す図である。図５５中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。また、サブクローン名における「ＭＴｏ」は、Ｂ２Ｍアレル及びＣＩＩＴＡアレルを１段階でノックアウトしたことを意味する。
その結果、図５５に示すように、Ｂ２Ｍアレル及びＣＩＩＴＡアレルの双方にフレームシフト変異を生じたクローン＃８を得た。
また、クローン＃２は、Ｂ２Ｍアレルの片方のみがノックアウトされ、ＣＩＩＴＡアレルは両方ノックアウトされていることが明らかとなった。そこで、実質的にＣＩＩＴＡアレルのみがノックアウトされた細胞株としてクローン＃２を得た。
［実験例４５］
（Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックアウトｉＰＳ細胞におけるＨＬＡタンパク質の発現の検討）
実験例４４で作製した、Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５－ＭＴｏ＃２ ｉＰＳ細胞におけるＨＬＡ－ＡＢＣタンパク質の発現を検討した。
まず、Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５－ＭＴｏ＃２ ｉＰＳ細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激した後、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（品番：３１１４１８、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社）で染色してフローサイトメトリー解析を行い、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を検討した。
図５６（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図５６（ａ）中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。また、図１６（ｂ）中、「Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５－ＭＴｏ＃２」はＦｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５－ＭＴｏ＃２ ｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
その結果、Ｆｆ－Ｘｔ－２８ｓ０５－ＭＴｏ＃２ ｉＰＳ細胞は、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現能を維持していることが明らかとなった。
［実験例４６］
（Ｂ２ＭノックアウトｉＰＳ細胞の作製４）
５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞にＣａｓ９を発現するプラスミドベクターとＢ２Ｍ特異的なｓｇＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｇＲＮＡとしては、Ｂ２Ｍ－ｇ２（標的塩基配列を配列番号６０に示す。）を使用した。
続いて、５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間刺激した細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体で染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
図５７はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図５７中、「Ｎｏ ｓｔａｉｎ」は抗体で染色しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｎｏ ＴＦ」はｓｇＲＮＡを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果であることを示し、「Ｂ２Ｍ－ｇ２」は、このｓｇＲＮＡを導入してＢ２ＭアレルをノックアウトしたｉＰＳ細胞の解析結果であることを示す。
その結果、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の全てが陰性である細胞集団の割合は２７．０％であった。続いて、Ｂ２Ｍ－ｇ２ ｓｇＲＮＡの導入により得られた、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの全てが陰性である細胞集団をソーティングにより回収した。ここではサブクローニングは行わなかった。
［実験例４７］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト１０）
５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル及びＨＬＡ－Ｃアレルをノックアウトした細胞を作製した。具体的には、実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル及びＢ＊５２：０１アレルをノックアウトした細胞（クローン＃３）に、精製Ｃａｓ９タンパク質、Ｃ＊０７：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡ及びＣ＊１２：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡをトランスフェクションした。
Ｃ＊０７：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡとして、Ｃ０７０２－ｅｘ３－ｇ３（標的塩基配列を配列番号４９に示す。）を使用した。また、Ｃ＊１２：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡとして、Ｃ１２０２－ｅｘ３－ｇ１（標的塩基配列を配列番号５０に示す。）を使用した。トランスフェクションには、市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を使用した。
その後、サブクローニングを行い、６株のサブクローンを得た。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレル及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレルの塩基配列を、サンガーシーケンスにより解析した。
図５８は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図５８中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＨＬＡ－Ｃ０７」はＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレルを示し、「ＨＬＡ－Ｃ１２」はＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレルを示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は欠失変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、クローン＃３－４、＃３－５、＃３－６、＃３－７では、ＨＬＡ－Ｃの両アレルがノックアウトされたことが確認された。
［実験例４８］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト１１）
実験例１３で作製した、５８５Ａ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル及びＢ＊５２：０１アレルをノックアウトした細胞（クローン＃３）に、精製Ｃａｓ９タンパク質及びＣ＊０７：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡをトランスフェクションした。
Ｃ＊０７：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡとして、Ｃ０７０２－ｅｘ３－ｇ３（標的塩基配列を配列番号４９に示す。）を使用した。トランスフェクションには、市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を使用した。
その後、サブクローニングを行い、６株のサブクローンを得た。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレル及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレルの塩基配列を、サンガーシーケンスにより解析した。
図５９は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図５９中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＨＬＡ－Ｃ０７」はＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレルを示し、「ＨＬＡ－Ｃ１２」はＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレルを示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、クローン＃３－１、＃３－２、＃３－３、＃３－５、＃３－６は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレルがノックアウトされ、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレルのみ残存したクローンであることが確認された。
図５３を参照しながら上述したように、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１の１２種類の細胞を用意すれば、日本人、欧州系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア人、ヒスパニックのいずれの人種においても９３％以上の人口をカバーすることができる。
本実験例で作製した細胞は、これらの１２種類の細胞の１つとして使用することができる。
［実験例４９］
（ＨＬＡアレル特異的ノックアウト１２）
実験例１４で作製した、６０４Ｂ１ ｉＰＳ細胞のＡ＊０１：０１アレル、Ａ＊２４：０２アレル、Ｂ＊０７：０２アレル及びＢ＊３７：０１アレルをノックアウトした細胞（クローン＃４）に、精製Ｃａｓ９タンパク質及びＣ＊０７：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡをトランスフェクションした。
Ｃ＊０７：０２アレル特異的なｓｇＲＮＡとして、Ｃ０７０２－ｅｘ３－ｇ３（標的塩基配列を配列番号４９に示す。）を使用した。トランスフェクションには、市販のキット（商品名「４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」、型式「Ｖ４ＸＰ－４０３２」、ロンザ社）を使用した。
その後、サブクローニングを行い、１１株のサブクローンを得た。続いて、各サブクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２アレル及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレルの塩基配列を、サンガーシーケンスにより解析した。
図６０は、回収した各クローンの塩基変異パターンを示す図である。図６０中、「Ｃｌｏｎｅ ＩＤ」はサブクローン名を示し、「ＨＬＡ－Ｃ０６」はＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２アレルを示し、「ＨＬＡ－Ｃ０７」はＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレルを示し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列であったことを示し、「－」は挿入変異を有していたことを示し、「＋」は挿入変異を有していたことを示す。その結果、クローン＃４－２、＃４－６、＃４－１０、＃４－１１は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレルがノックアウトされ、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２アレルのみ残存したクローンであることが確認された。
図５３を参照しながら上述したように、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１の１２種類の細胞を用意すれば、日本人、欧州系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア人、ヒスパニックのいずれの人種においても９３％以上の人口をカバーすることができる。
本実験例で作製した細胞は、これらの１２種類の細胞の１つとして使用することができる。
本発明によれば、レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を製造する技術を提供することができる。

Claims (9)

  1. ＨＬＡ－Ａタンパク質及びＨＬＡ－Ｂタンパク質を発現せず、少なくとも１種のＨＬＡ－Ｃタンパク質を発現する細胞であって、前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質が、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２アレル及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１アレルからなる群より選択される１種のアレルにコードされるタンパク質である、細胞。
  2. ＨＬＡ－Ａアレル、ＨＬＡ－Ｂアレル、及びＨＬＡ－Ｃアレルのうち少なくとも１種のＨＬＡアレルがホモである、請求項１に記載の細胞。
  3. 多能性幹細胞である、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＩＩＴＡ）アレル、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ５（ＲＦＸ５）アレル、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＸＡＰ）アレル及びＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＸＡＮＫ）アレルのうち少なくとも１つのアレルが更に破壊又は改変されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
  5. ドナー細胞のＨＬＡ－Ａアレル及びＨＬＡ－Ｂアレルをゲノム編集により破壊する工程を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞の製造方法。
  6. 前記ゲノム編集が、前記ドナー細胞に配列特異的ＤＮＡ切断酵素を導入して行われる、請求項５に記載の製造方法。
  7. 前記配列特異的ＤＮＡ切断酵素がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓであり、前記ゲノム編集が、前記ドナー細胞にｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを導入して行われる、請求項６に記載の製造方法。
  8. 前記ドナー細胞が多能性幹細胞である、請求項５～７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 前記ｇＲＮＡが、
    全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に１つの標的とするＨＬＡハプロタイプにしかマッピングされず、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列を、標的塩基配列とするｇＲＮＡであって、前記標的塩基配列が、配列番号３、４、７、４５～５２のいずれかに記載の塩基配列、若しくは、配列番号３、４、７、４５～５２のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるｇＲＮＡであるか、又は、
    全ＨＬＡハプロタイプのゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合に２つ以上の標的とするＨＬＡハプロタイプにマッピングされ、ＨＬＡアレル以外の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データに対してマッピングした場合にマッピングされない塩基配列を、標的塩基配列とするｇＲＮＡであって、前記標的塩基配列が、配列番号５３～５５のいずれかに記載の塩基配列、若しくは、配列番号５３～５５のいずれかに記載の塩基配列の５’末端において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるｇＲＮＡである、請求項７に記載の製造方法。
JP2020500578A 2018-02-16 2019-02-15 低抗原性細胞の製造方法 Active JP7385281B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023109941A JP2023126897A (ja) 2018-02-16 2023-07-04 低抗原性細胞の製造方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018026421 2018-02-16
JP2018026421 2018-02-16
PCT/JP2019/005524 WO2019160077A1 (ja) 2018-02-16 2019-02-15 低抗原性細胞の製造方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023109941A Division JP2023126897A (ja) 2018-02-16 2023-07-04 低抗原性細胞の製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2019160077A1 JPWO2019160077A1 (ja) 2021-03-18
JP7385281B2 true JP7385281B2 (ja) 2023-11-22

Family

ID=67618722

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020500578A Active JP7385281B2 (ja) 2018-02-16 2019-02-15 低抗原性細胞の製造方法
JP2023109941A Pending JP2023126897A (ja) 2018-02-16 2023-07-04 低抗原性細胞の製造方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023109941A Pending JP2023126897A (ja) 2018-02-16 2023-07-04 低抗原性細胞の製造方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20200407693A1 (ja)
EP (1) EP3754018A4 (ja)
JP (2) JP7385281B2 (ja)
KR (1) KR20200122306A (ja)
CN (1) CN111757932A (ja)
CA (1) CA3091136A1 (ja)
IL (1) IL276597A (ja)
SG (1) SG11202007563XA (ja)
WO (1) WO2019160077A1 (ja)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109456943A (zh) * 2017-09-06 2019-03-12 亘喜生物科技（上海）有限公司 通用型嵌合抗原受体t细胞制备技术
CN112481310B (zh) * 2019-09-12 2023-06-02 华东师范大学 靶向hla-i类分子的通用型car-t细胞及其应用
CN115087732A (zh) * 2020-02-07 2022-09-20 学校法人顺天堂 来自人T细胞来源的iPS细胞的细胞毒性T细胞
WO2021163191A1 (en) * 2020-02-10 2021-08-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for rapid cloning and expression of hla class i cells
TWI761837B (zh) * 2020-05-20 2022-04-21 國立中央大學 通用人類誘導多能性幹細胞及其生成方法
CA3185067A1 (en) * 2020-05-26 2021-12-02 Kouichi Tamura Hypoimmunogenic cells
WO2022140586A2 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing hla-a in a cell
EP4306634A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 Riken Method for producing hypoimmunogenic retinal pigment epithelial cells
WO2023047524A1 (ja) 2021-09-24 2023-03-30 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 改変ヒト人工多能性幹細胞の製造方法
WO2023191063A1 (ja) * 2022-04-01 2023-10-05 株式会社Logomix 遺伝子工学、細胞工学、および細胞医薬に適した細胞およびその製造方法
TW202409271A (zh) * 2022-06-16 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中之ｍｈｃ １類之組成物及方法
WO2023245109A2 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genomic editing

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016513460A (ja) 2013-03-12 2016-05-16 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｌａを修飾するための方法および組成物
WO2016201047A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
WO2016183041A3 (en) 2015-05-08 2017-01-05 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
JP2017523813A (ja) 2014-08-06 2017-08-24 カレッジ オブ メディシン ポチョン チャ ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション Ｈｌａをコードする遺伝子のヌクレアーゼ媒介編集により作製される免疫適合性細胞

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140134195A1 (en) 2011-04-20 2014-05-15 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Beta-2 microglobulin-deficient cells
CN106103475B (zh) * 2014-03-11 2021-01-12 塞勒克提斯公司 产生同种异体移植相容的t细胞的方法
CN107208055B (zh) * 2015-01-17 2021-06-15 浙江大学 引起免疫原性反应降低的被修饰细胞
JP2018026421A (ja) 2016-08-09 2018-02-15 株式会社東芝 磁気記憶装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016513460A (ja) 2013-03-12 2016-05-16 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｌａを修飾するための方法および組成物
JP2017523813A (ja) 2014-08-06 2017-08-24 カレッジ オブ メディシン ポチョン チャ ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション Ｈｌａをコードする遺伝子のヌクレアーゼ媒介編集により作製される免疫適合性細胞
WO2016183041A3 (en) 2015-05-08 2017-01-05 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
WO2016201047A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation

Also Published As

Publication number Publication date
EP3754018A1 (en) 2020-12-23
SG11202007563XA (en) 2020-09-29
IL276597A (en) 2020-09-30
US20200407693A1 (en) 2020-12-31
JPWO2019160077A1 (ja) 2021-03-18
WO2019160077A1 (ja) 2019-08-22
KR20200122306A (ko) 2020-10-27
EP3754018A4 (en) 2021-11-24
CN111757932A (zh) 2020-10-09
JP2023126897A (ja) 2023-09-12
CA3091136A1 (en) 2019-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7385281B2 (ja) 低抗原性細胞の製造方法
US11590171B2 (en) Targeted replacement of endogenous T cell receptors
US20240117383A1 (en) Selection by essential-gene knock-in
JP2022539453A (ja) 抗原特異的人工免疫制御性Ｔ（ａｉｒＴ）細胞
Kitano et al. Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 system and detailed evaluation for clinical application
US20230416747A1 (en) Safe harbor loci
US20220017715A1 (en) Compositions and Methods for Efficacy Enhancement of T-Cell Based Immunotherapy
CN117795065A (zh) 使用细胞穿透crispr-cas系统在原代免疫细胞中进行基因编辑
WO2022143783A1 (en) Methods of identifying t-cell modulating genes
WO2023191063A1 (ja) 遺伝子工学、細胞工学、および細胞医薬に適した細胞およびその製造方法
EP4112720A1 (en) Genetically modified megakaryocyte, modified platelet, and methods respectively for producing said genetically modified megakaryocyte and said modified platelet
US20240209314A1 (en) T cells comprising an unrearranged t cell receptor (tcr) gene locus and methods of use thereof
WO2022093846A1 (en) Safe harbor loci
Yang et al. In situ correction of various β-thalassemia mutations in human hematopoietic stem cells
EP4347810A2 (en) Ciita targeting zinc finger nucleases
Scott The Role of TOX in T Cell Differentiation and Function
Ferreira Transcriptional Control of Maternal-Fetal Immune Tolerance

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200612

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201223

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210819

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220920

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20221107

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230119

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20230119

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230404

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230704

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230804

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20230824

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231017

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231102

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7385281

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150