CN103668470B - 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法 - Google Patents

一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103668470B
CN103668470B CN201210336604.4A CN201210336604A CN103668470B CN 103668470 B CN103668470 B CN 103668470B CN 201210336604 A CN201210336604 A CN 201210336604A CN 103668470 B CN103668470 B CN 103668470B
Authority
CN
China
Prior art keywords
identification module
connector element
dna
transcriptional activation
sticky end
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210336604.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103668470A (zh
Inventor
赵金龙
吴昭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Xuxu Technology Co.,Ltd.
Original Assignee
SHANGHAI SIDANSAI STEM CELL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI SIDANSAI STEM CELL TECHNOLOGY CO LTD filed Critical SHANGHAI SIDANSAI STEM CELL TECHNOLOGY CO LTD
Priority to CN201210336604.4A priority Critical patent/CN103668470B/zh
Priority to US13/965,469 priority patent/US9040677B2/en
Priority to EP16180856.3A priority patent/EP3118319B1/en
Priority to EP13837579.5A priority patent/EP2864483B8/en
Priority to PCT/CN2013/001045 priority patent/WO2014040370A1/en
Priority to US14/037,673 priority patent/US8748134B2/en
Publication of CN103668470A publication Critical patent/CN103668470A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103668470B publication Critical patent/CN103668470B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种DNA文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法，一种Tale连接单元库包括16组×n个双碱基识别模块和4组×m个单碱基识别模块，每个双碱基识别模块或单碱基识别模块两末端均有经二类限制性内切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端；DNA库包括与Tale连接单元库的连接单元数量相同的质粒，每个质粒包含一个碱基序列互异的连接单元，连接单元两末端与原始载体连接处有Bsa I酶切位点。采用本发明的DNA库用于构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒，识别模块的酶切和连接能在一个反应中进行，可实现一步将12-19个识别模块连接起来，速度快，效率高，操作简单，材料易于保存，成本低。

Description

一种DNA文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种Tale连接单元库、包含该Tale连接单元库中所有Tale连接单元的DNA文库以及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法。
背景技术
按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究，另一方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，其打靶效率非常低，通常只有10-6-10-8，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。
2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子(transcription activator-likeeffector，TALE)表现出DNA结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。
TALE与Fok1融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的di-residues(RVDs)位点。
实践中，TALEN技术大大提高了基因打靶效率，应用范围和可操作性，但如何把十几个高度重复的DNA的识别模块组装起来成为了TALEN广泛应用的一个限制因素。研究者们在怎样制作TALEN做出了各种各样的努力。有的采用化学合成的方法，有的采用两步分子克隆的方法，也有的采用一步分子克隆的方法。但都有各自的缺陷，因为需合成的DNA高度重复的序列化学合成非常困难，成本也非常高；两步法因为需两步连接所以材料成本、时间成本、测序成本都较高；现在公开的唯一一个可一步连接的方法最多只能连接14个识别模块，而自然界中常见的识别模块的长度为12-23，在实际应用中很多情况需要大于14个识别模块的TALEN，14个片段长度的限制不止影响此种方法应用，而且不利于TALEN特异性的提高，并且因其需要酶切，纯化，再连接造成操作繁琐，工艺流程复杂，酶切纯化后的DNA保存困难，特别是单链的尾巴容易降解。
以前有研究者用单模块连接TALEN，如连接18个识别模块，一个反应连接18个片段难度非常大，世界范围内还没有人能实现；以前也有建立在双模块基础上的研究，但其只能连接14个识别模块。
发明内容
本发明提供了一种转录激活子样效应因子(Tale)连接单元库，利用该连接单元库可以连接14个以上的识别模块。
一种转录激活子样效应因子连接单元库，包括16组×n个双碱基识别模块和4组×m个单碱基识别模块，每个双碱基识别模块或单碱基识别模块两末端均有经二类限制性内切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端，n表示每组双碱基识别模块的数量，m表示每组单碱基识别模块的数量；m≤n；
在同一组双碱基识别模块中，第i个双碱基识别模块的第二粘性末端与第i+1个双碱基识别模块的第一粘性末端互补；两组双碱基识别模块的粘性末端碱基序列一一对应相同，1≤i≤n-1；
在同一组单碱基识别模块中，第j个单碱基识别模块的第二粘性末端与第j+1个单碱基识别模块的第一粘性末端互补；一组单碱基识别模块的全部单碱基识别模块的粘性末端碱基序列与一组双碱基识别模块的部分或全部双碱基识别模块的粘性末端碱基序列一一对应相同，两组单碱基识别模块的粘性末端碱基序列一一对应相同，1≤j≤m-1。
本发明相当于对连接单元进行编号，双碱基识别模块为1、...、i、...、n，单碱基识别模块为1、...、j、...、m。
其中二类限制性内切酶(type IIs enzyme)，可以是Bsa I、BsmB1、BsmA1、Bbs1等，优选为Bsa I。
单个连接单元的结构如图5所示，粘性末端有4个碱基，沿5’-3’方向，正义链的第2～4个碱基编码亮氨酸，正义链的第1个碱基为甘氨酸密码子的最后一个碱基，正义链的最后两个碱基为甘氨酸密码子的前两个碱基，反义链的第1～3个碱基的互补序列编码亮氨酸。
当n大于等于7时，可以连接14个以上的识别模块，而当n等于9，m等于7时，最多可以连接19个识别模块。
本发明所述的单碱基识别模块是指该Tale连接单元编码的氨基酸能够识别碱基A、T、C、G。所述的双碱基识别模块是指Tale连接单元编码的氨基酸能够识别AA、AT、AC、AG、TT、TA、TC、TG、CC、CA、CT、CG、GG、GA、GT、GC。同一组的双碱基识别模块或单碱基识别模块识别同一对碱基或同一个碱基。
由于连接单元本身无法进行很好的保存和扩增，因此将连接单元插入相应的原始载体当中，构成环状结构，以便于保存和扩增。
本发明还提供了一种DNA文库，包括数量与权利要求1～6任一所述的转录激活子样效应因子连接单元库的连接单元数量相同的DNA片段，每个DNA片段包含一个碱基序列互异的连接单元，连接单元两末端与DNA片段的其余部分连接处有二类限制性内切酶酶切位点。也就是说，利用二类限制性内切酶(type IIs enzyme)对DNA片段进行酶切，就可以得到所述的Tale连接单元。
所述的DNA片段可以是重组质粒，也可以是PCR扩增产物，当选择为重组质粒时，原始载体可以是PMD18-T载体、topo、puc19、或puc18。
本发明又提供了一种构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法，包括：
(1)根据目的基因的靶序列确定识别模块，从所述的DNA文库中选取各识别模块对应的DNA片段；
(2)在同一体系内，采用二类限制性内切酶和DNA连接酶将各DNA片段中连接单元连接入带有DNA切割蛋白以及转录激活子样效应因子氨基酸序列框架N端和C端的载体中；
(3)用消化线性DNA的酶进行消化处理，得到转录激活子样效应因子核酸酶质粒。
该方法中，各识别模块之间能够顺序连接；同时，识别模块之间、识别模块与载体之间一旦连接上，就无法被二类限制性内切酶(type IIsenzyme)再切开，所以把几个片断和载体放在同一体系里，用二类限制性内切酶(type IIs enzyme)和DNA连接酶边切边连，即可一步把TALEN连接成功。
步骤(2)中，所述二类限制性内切酶(type IIs enzyme)可以为Bsa I。
所述的DNA连接酶可以为T4连接酶。
以20μL连接体系计为：载体：40-200ng；识别模块：20-200ng/识别模块；二类限制性内切酶：0.5-2μL；DNA连接酶：0.5-2ul μL；DNA连接酶缓冲液：2μL；双蒸水：补足至20μL。
连接程序优选为：37℃5min；16℃10min，15个循环；80℃，10min。
所述的带有DNA切割蛋白以及转录激活子样效应因子氨基酸序列框架N端和C端的载体(TALEN载体)的碱基序列可以如SEQ ID NO.41或42所示。
TALEN载体预先经二类限制性内切酶酶切，酶切产生的两个粘性末端分别与第1个双碱基识别模块或单碱基识别模块的第一粘性末端以及第i个双碱基识别模块或第j个单碱基识别模块的第二粘性末端互补。
步骤(3)中，所述的消化线性质粒的质粒酶可以为Plasmid-Safe核酸酶。因为连接时会有连接不完全现象，只连接上部分片段，这种连接不完全的线性DNA会通过重组的方式降低连接的效率，因此，在转化之前用可以消化线性DNA的酶Plasmid-SafeTM ATP-Dependent DNase(Epicentre，货号：E3105K)进行消化处理，可以消化线性DNA，提高连接效率。
本发明以20个识别模块为基础，通过设计合适的引物，可以构建得到含有172个连接单元(含有能识别一个或两个碱基的识别模块、二类限制性内切酶位点)的DNA文库；通过该DNA文库，可以把识别模块的酶切和连接放在一个反应中进行，避免了识别模块酶切后的纯化、再连接步骤，提高了生产效率，改进了生产工艺，可以实现一步将12-19个识别模块快速连接起来，得到连接转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)质粒。
本发明方法使用的识别单元是质粒或质粒的PCR产物，避免了保存酶切产物中遇到的末端单链尾巴破坏和降解的问题，且操作步骤更简单，更节约成本。
附图说明
图1为包含172个识别单元的DNA文库示意图；
图2为最终载体pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-pA示意图；
图3为最终载体pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA示意图；
图4为19个识别模块连接时的连接步骤示意图；
图5为本发明连接单元的结构示意图。
图6为不同数量的识别碱基的相应单双模的选择块示意图；
图7为实施例2中的电泳图；其中，中间为1kb的DNA Marker，marker左面为连接二的酶切图，右面为连接一的酶切图；
具体实施方式
以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1TALENs识别模块之间的连接及重组载体的构建
1、20个识别模块(modular)的获得
(1)合成分别识别4个单碱基A、T、C、G以及16个双碱基AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC、GG的20个识别模块NI、NG、HD、NN、NI-NI、NI-NG、NI-HD、NI-NN、NG-NI、NG-NG、NG-HD、NG-NN、HD-NI、HD-NG、HD-HD、HD-NN、NN-NI、NN-NG、NN-HD、NN-NN，序列见表1，分别如SEQ ID NO：1-20所示。
表1
2.将基本模块加上酶切位点和接头制作172个质粒库
(1)PCR扩增添加酶切识别序列和连接接头
以F1、R1；F2、R2；F3、R3；F4、R4；F5、R5；F6、R6；F7、R7；F8、R8；F9、R9为引物，以含有16个双模块的T载体为模板做PCR，共16×9＝144个；
以F1、R1；F2、R2；F3、R3；F4、R4；F5、R5；F6、R6；F7R7为引物，以含有4个单模块的T载体为模板做PCR，共4×7＝28个；
共144+28＝172个。
PCR体系：Plasmid：1ul；Primers：0.1ul+0.1ul；Buffr：1.5ul；dNTP：0.8ul；Mgso4：0.35ul；水：11.48ul；DNA聚合酶：1单位。
PCR程序：95度2min；95度15s，55.8度30s，68度22s，36个循环；68度1min。
F1、R1；F2、R2；F3、R3；F4、R4；F5、R5；F6、R6；F7、R7；F8、R8；F9、R9引物的序列见表2，分别如SEQ ID NO：21-38所示。18条引物都带有Bsa I酶切识别序列GGTCTCN‘NNNN。这个酶属于type IIsenzymes，同一个酶切识别序列可以产生多个粘性识别末端，理论上可以产生44个粘性识别末端，再加上每个模块的结尾和开头Gly密码子4种，Leu密码子6种的限制，利用一个type IIs enzyme可以产生24种接头。选取其中的10种设计了引物，除了F1与R9外，Fn可与Rn-1的粘性末端相连，而不能与其他引物上的粘性末端相连(n为3-9的整数)。
表2
  TALE-F1   AATGGACGACCCGGCTTGATAggtctcCTGACCCCAGAGCAGGTCGTGG
  TALE-R1 CATCACAGGTAGCTCGCTGGAggtctcT TAAACCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F2   ATCGATCGATCGCGATCGATCggtctcGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R2   GCAGCCACGGCTAGCTTAAGCggtctcTGAGGCCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F3   ATCGATCGATCGCGATCGATCggtctcGCCTACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R3   GAACCGCCGTCTTACGTAGAGggtctcTTAATCCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F4   TTTAGCCCGTACCGTAGCCTAggtctcGATTAACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R4   TTGCACCGGTATCGTCGAGGCggtctcTAAGTCCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F5   AAGCATGGATCGCAAGGGTTGggtctcGACTTACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R5   GGGTTGCGCTCGCAATTACCGggtctcTAAGGCCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F6   CGAAATCCGACCGGATGCCTAggtctcGCCTTACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R6   GCCATCGCGTCGCACGAAGCTggtctcTTAGTCCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F7   ATAGCTGGTAGGGCTACGGGCggtctcGACTAACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R7   GAACGACCCCTGACAGTCGTTggtctcTGAGCCCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F8   CGATATCGATCGCCTTACGCggtctcGGCTACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R8   CGCCACATATATAGCGCGTCCggtctcTTAGCCCGTGCGCTTGGCAC
  TALE-F9   GTGTGACGGCTAGCCTAGTAggtctcGGCTAACCCCAGAGCAGGTCGTG
  TALE-R9   GCTTGCGGATCGATAGCATGGggtctcTGAGTCCGTGCGCTTGGCAC
注：小写字母为Bsa I酶切识别序列。
(2)将172个PCR产物进行胶回收纯化，连接入PMD18-T体系
将20个基本模块片段连入PMD18-T载体(购自Takara)，连接方法为：①取PCR产物2.7μl；②加入3μl  solution 1和0.3ul  PMD18-T载体；③16℃，2h；④转化DH5a感受态细胞，涂布卡纳霉素平板；⑤挑取克隆、小量提取质粒、PCR鉴定、测序，最后得到连接到载体PMD18-T中的带有Bsa I酶切位点和不同接头的172个质粒库。最后得到172质粒库示意图如图1所示。
PCR库的获得
首先用引物assem-F、assem-R，以172个质粒库为模板PCR，得到172个PCR库。引物所结合的位置分别在识别模块的上下游400bp左右处，加上识别模块PCR片段大小约为1050bp(双模块)或950bp(单模块)。
表3
  assem-F(SEQ ID NO：39)  TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAAC
  assem-R(SEQ ID NO：40)  TGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACG
PCR扩增体系(50μl)为：DNA模板(Template)：0.5μl(约50ng)；引物(Primer)：每个0.3μl(50μM)；pfx酶(Invitrogen)：0.25μl；10×缓冲液(buffer)：5μl；dNTP：2.5μl(2.5μM)；mgso4：1ul；ddH2O：40.15μl。
PCR程序：95℃2min；95℃15s，68℃30s，68℃50s，36个循环；68℃，5min。
PCR产物纯化：将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定浓度。使用天根公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)纯化PCR片段，纯化后在进行琼脂糖凝胶电泳标定各个产物的浓度。
(3)酶切两个TALEN载体pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-pA；pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA，示意图见图2和图3，序列分别为SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。TALEN载体中转录激活子样效应因子氨基酸序列框架N端和C端序列分别如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示；在连接TALEN前需要预先用Bsa I酶切两个TALEN载体，得到能与识别模块连接的接头，胶回收后，电泳标定浓度。
N端序列：
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATCCACGGggtaccCATGgTAGATTTGAGAACTTTGGGATATTCACAGCAGCAGCAGGAAAAGATCA AGCCCAAAGTGAGGTCGACAGTGGGGCAGCATCAGGAAGGGCTGGTGGGTCATGGGTTTACACATGCCCACATCGTAGCCTTGTCGCAGCACCCTGCAGCCCTTGGCACGGTCGCCGTCAAGTACCAGGACATGATTGCGGCGTTGCCGGAAGCCACACATGAGGCGATCGTCGGTGTGGGGAAACAGTGGAGCGGAGCCCGAGCGCTTGAGGCCCTGTTGACGGTCGCGGGAGAGCTGAGAGGGCCTCCCCTTCAGCTGGACACGGGCCAGTTGCTGAAGATCGCGAAGCGGGGAGGAGTCACGGCGGTCGAGGCGGTGCACGCGTGGCGCAATGCGCTCACGGGAGCACCCCTCAACCTGACCgagaccC
C端序列：
ggtctcAACTCACGCCTGAGCAGGTAGTGGCTATTGCATCCAATggaGGGGGCAGACCCGCACTGGAGTCAATCGTGGCCCAGCTTTCGAGGCCGGACCCCGCGCTGGCCGCACTCACTAATGATCATCTTGTAGCGCTGGCCTGCCTCGGCGGACGACCCGCCTTGGATGCGGTGAAGAAGGGGCTCCCGCACGCGCCTGCATTGATTAAGCGGACCAACAGAAGGATTCCCGAGAGGACATCACATCGAGTGGCA
(4)TALEN的连接
上文已说明过除了F1与R9外(F1与载体左端连接，R9与载体右端连接)，Fn可与Rn-1的粘性末端相连，而不能与其他引物上的粘性末端相连。另外识别模块之间，识别模块与载体之间一旦连接上无法被Bsa I在切开，所以把几个片段和载体放在同一体系里，用Bsa I和T4连接酶边切边连，即可一步把TALEN连接成功。
下面以19个识别模块的连接为例，说明连接策略。因最后一个可以识别碱基T的半个模块已在载体上，所以只要连18个模块即可，连接示意图见图4。首先选择与靶位点相对应的9个模块再加上TALEN的载体，用Bsa I和T4连接酶边切边连。
连接体系为：
Vector：150ng
Modulars：50ng/modular
Bsa I  (NEB)：1ul
T4Ligase(fermentas)：1ul
T4Buffer(NEB)：2ul
H2O：补足20ul
连接程序为：37℃5min；16℃10min，15个循环；80℃，10min。
连接步骤见图4。因为连接时会有连接不完全，只连接上1-8个片段，这种连接不完全的线性DNA会通过重组的方式降低连接的效率，所以在转化之前用可以消化线性化DNA的酶Plasmid-SafeTM ATP-DependentDNase(Epicentre，货号：E3105K)消化线性质粒，体系为：
在20ul酶连体系的基础上加1ul plasmid-safe nuclease和0.5ulATP，于37℃消化1h。
取10ul转化Trans-T1感受态，挑克隆，小抽，BamH1/Pst1酶切鉴定，酶切出的较小的片段大小应为连入片段大小加上550bp。把酶切正确的质粒送测序，测序正确即可得到正确的TALEN质粒。测序引物如下表：
表4
  Sequence-F(SEQ ID NO：45)  CTCCCCTTCAGCTGGACAC
  Sequence-R(SEQ ID NO：46)  AGCTGGGCCACGATTGAC
Dayl：
连接：4.5h
plasmid-safe nuclease消化：1h
转化：1h
Day2：
挑克隆30min
摇菌：6h(Trans-T1生长较快)
小抽，酶切鉴定送测序：1.5h
Day3：
比对序列
得到确认正确的质粒只需要3天，并且同时，本发明方法使用的识别单元是质粒或质粒的PCR产物，避免了保存酶切产物中遇到的末端单链尾巴破坏和降解的问题，且操作步骤更简单，更节约成本。
同样地，如果是所需的识别碱基是12-18，而不是19，相应的把靠前端双模块换成单模块，每换一个既可减少一个识别模块。不同数量的识别碱基的相应单双模的选择块见图6。
实施例2
连接可识别碱基
片段一：CGCGCGCGCGCGCGCGCGT(SEQ ID NO：47)，片段二CCCACTCCCCATCCAGT(SEQ ID NO：48)的TALEN。
(1)首先从PCR库中选择所需的识别模块：
CGCGCGCGCGCGCGCGCGT选择模块CG-1、CG-2、CG-3、CG-4、CG-5、CG-6、CG-7、CG-8、CG-9；此连接载体为pEF1a-NLS-TALEbackbone-Fok1(R)-pA
CACTCCCCATCCAGT选择模块C-1、A-2、C-3、TC-4、CC-5、CA-6、TC-7、CA-8、GT-9。此连接载体为pEF1a-NLS-TALEbackbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA
(2)按照以下连接体系：
Vector：150ng
Modulars：50ng/modular
Bsa I(NEB)：1ul
T4Ligase(fermentas)：1ul
T4Buffer(NEB)：2ul
H2O：补足20ul
连接程序为：37℃5min；16℃10min，15个循环；80℃，10min。
(3)然后plasmid-safenuclease消化：1h。
(4)转化Trans-T1感受态，挑克隆，小抽，BamH1\EcoR1酶切鉴定，电泳后凝胶图见图7。
图中，酶切正确的条带分别为：连接一：3.1k和2.2k；连接二：4.2k和3.7k；如图：中间为1kb的DNA Marker，marker左面为连接二的酶切图，右面为连接一的酶切图。连接一和连接二的成功率分别为70％和80％。将酶切正确的15个克隆送测序，结果显示酶切正确的克隆，测序全部正确。说明此方法进行连接效率高，简单，高效。

Claims (11)

1.一种转录激活子样效应因子连接单元库，其特征在于，包括16组×n个双碱基识别模块和4组×m个单碱基识别模块，每个双碱基识别模块或单碱基识别模块两末端均有经二类限制性内切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端，n表示每组双碱基识别模块的数量，m表示每组单碱基识别模块的数量；m、n为不为零的自然数，且m≤n；
在同一组双碱基识别模块中，第i个双碱基识别模块的第二粘性末端与第i+1个双碱基识别模块的第一粘性末端互补；两组双碱基识别模块的粘性末端碱基序列一一对应相同，1≤i≤n-1；
在同一组单碱基识别模块中，第j个单碱基识别模块的第二粘性末端与第j+1个单碱基识别模块的第一粘性末端互补；一组单碱基识别模块的全部单碱基识别模块的粘性末端碱基序列与一组双碱基识别模块的部分或全部双碱基识别模块的粘性末端碱基序列一一对应相同，两组单碱基识别模块的粘性末端碱基序列一一对应相同，1≤j≤m-1。
2.如权利要求1所述的转录激活子样效应因子连接单元库，其特征在于，所述二类限制性内切酶为BsaⅠ。
3.如权利要求1所述的转录激活子样效应因子连接单元库，其特征在于，6≤n≤7。
4.如权利要求1所述的转录激活子样效应因子连接单元库，其特征在于，n大于7。
5.如权利要求4所述的转录激活子样效应因子连接单元库，其特征在于，n＝9，m＝7。
6.一种构建DNA文库的方法，其特征在于，将权利要求1-5任一项所述的连接单元插入相应的原始载体中，构成环状结构并形成DNA文库；所述的DNA文库包括数量与权利要求1-5任一所述的转录激活子样效应因子连接单元库的连接单元数量相同的DNA片段，每个DNA片段包含一个碱基序列互异的连接单元，连接单元两末端与DNA片段的其余部分连接处有二类限制性内切酶酶切位点。
7.如权利要求6所述的构建DNA文库的方法，其特征在于，所述DNA片段为重组质粒或PCR扩增产物。
8.如权利要求7所述的构建DNA文库的方法，其特征在于，所述重组质粒的原始载体为PMD18-T载体。
9.一种构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法，包括：
(1)根据目的基因的靶序列确定识别模块，从如权利要求6所述的方法构建的DNA文库中选取各识别模块对应的DNA片段；
(2)在同一体系内，采用二类限制性内切酶和DNA连接酶将各DNA片段中连接单元连接入带有DNA切割蛋白基因以及转录激活子样效应因子氨基酸序列框架N端和C端的载体中；
(3)用消化线性DNA的酶进行消化处理，得到转录激活子样效应因子核酸酶质粒。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的带有DNA切割蛋白以及转录激活子样效应因子氨基酸序列框架N端和C端的载体的碱基序列如SEQ ID NO.41或42所示。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，以20μL连接体系计为：载体：40-200ng；识别模块：20-200ng/识别模块；二类限制性内切酶：0.5-2μL；DNA连接酶：0.5-2μL；DNA连接酶缓冲液：2μL；双蒸水：补足至20μL。
CN201210336604.4A 2012-09-12 2012-09-12 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法 Active CN103668470B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210336604.4A CN103668470B (zh) 2012-09-12 2012-09-12 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法
US13/965,469 US9040677B2 (en) 2012-09-12 2013-08-13 Transcription activator-like effector assembly
EP16180856.3A EP3118319B1 (en) 2012-09-12 2013-09-06 Transcription activator-like effector assembly
EP13837579.5A EP2864483B8 (en) 2012-09-12 2013-09-06 Transcription activator-like effector assembly
PCT/CN2013/001045 WO2014040370A1 (en) 2012-09-12 2013-09-06 Transcription Activator-Like Effector Assembly
US14/037,673 US8748134B2 (en) 2012-09-12 2013-09-26 Transcription activator-like effector assembly

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210336604.4A CN103668470B (zh) 2012-09-12 2012-09-12 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103668470A CN103668470A (zh) 2014-03-26
CN103668470B true CN103668470B (zh) 2015-07-29

Family

ID=50233643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210336604.4A Active CN103668470B (zh) 2012-09-12 2012-09-12 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US9040677B2 (zh)
EP (2) EP2864483B8 (zh)
CN (1) CN103668470B (zh)
WO (1) WO2014040370A1 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103668470B (zh) * 2012-09-12 2015-07-29 上海斯丹赛生物技术有限公司 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法
CN107429241A (zh) 2014-08-14 2017-12-01 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Dna敲入系统
WO2016118560A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for assembling nucleic acid constructs
CN104673832B (zh) * 2015-02-09 2019-08-09 江苏大学附属医院 一种组装tale/talen模块的方法
CN104694539A (zh) * 2015-03-09 2015-06-10 上海市同济医院 一种利用talen技术构建可敲除小鼠cramp基因质粒的方法
JP2018513681A (ja) 2015-03-31 2018-05-31 エクセリゲン サイエンティフィック, インコーポレイテッドExeligen Scientific, Inc. 細胞または生物のゲノムへのＤＮＡ配列の標的化組み込みのためのＣａｓ９レトロウイルスインテグラーゼおよびＣａｓ９レコンビナーゼ系
CN105838691B (zh) * 2016-04-18 2018-07-06 浙江大学 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
CN107312788B (zh) * 2016-04-26 2020-07-28 中国科学院动物研究所 一种tale重复序列载体的构建方法
CN109906030B (zh) 2016-11-04 2022-03-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
EP4252759A3 (en) 2018-05-11 2023-11-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center T cell receptors targeting pik3ca mutations and uses thereof
KR20230017783A (ko) 2020-04-28 2023-02-06 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 시험관내 세포 전달 방법
US20240052341A1 (en) 2020-09-01 2024-02-15 64-X, Inc. Mammalian cells and methods for engineering the same
CR20230303A (es) 2020-12-11 2023-09-01 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir el mhc de clase ii en una célula
TW202239959A (zh) 2020-12-23 2022-10-16 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中hla-a之組合物及方法
AU2021410751A1 (en) 2020-12-23 2023-07-13 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying ciita in a cell
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
WO2022221697A1 (en) 2021-04-17 2022-10-20 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
CR20230534A (es) 2021-04-17 2024-02-12 Intellia Therapeutics Inc Composiciones de nanopartículas lipídicas
TW202309034A (zh) 2021-04-17 2023-03-01 美商英特利亞醫療公司 Dna依賴性蛋白質激酶抑制劑以及其組合物及用途
WO2023122805A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vestaron Corporation Sorbitol driven selection pressure method
WO2023205148A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
TW202409271A (zh) 2022-06-16 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中之ｍｈｃ １類之組成物及方法
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012093833A2 (en) * 2011-01-03 2012-07-12 Toolgen Incorporation Genome engineering via designed tal effector nucleases
KR101982360B1 (ko) * 2011-04-05 2019-05-24 셀렉티스 콤팩트 tale-뉴클레아제의 발생 방법 및 이의 용도
CN103668470B (zh) * 2012-09-12 2015-07-29 上海斯丹赛生物技术有限公司 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2864483B1 (en) 2017-02-15
US20140073014A1 (en) 2014-03-13
EP3118319B1 (en) 2019-05-22
EP2864483A1 (en) 2015-04-29
WO2014040370A1 (en) 2014-03-20
EP2864483A4 (en) 2015-06-10
EP3118319A1 (en) 2017-01-18
US9040677B2 (en) 2015-05-26
EP2864483B8 (en) 2017-04-26
US20140073015A1 (en) 2014-03-13
CN103668470A (zh) 2014-03-26
US8748134B2 (en) 2014-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103668470B (zh) 一种dna文库及构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒的方法
CN109136248B (zh) 多靶点编辑载体及其构建方法和应用
CN106434737A (zh) 基于CRISPR/Cas9技术的单子叶植物基因敲除载体及其应用
CN110358767B (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用
BR112012016033A8 (pt) Métodos de aumento de produção de semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, tolerância à deficiência de nitrogênio, eficiência no uso de nitrogênio e/ou redução do tempo de florescimento de uma planta, e, para produzir uma planta transgênica
Rieder et al. Experimental tools to identify RNA-protein interactions in Helicobacter pylori
PH12020551957A1 (en) Codon-optimized acid alpha-glucosidase expression cassettes and methods of using same
CN101935670B (zh) 一种多引物直接退火构建rna干扰载体的方法
CN103695452B (zh) 一种多模块dna文库及转录激活子样效应因子核酸酶质粒的构建方法
CN103497966B (zh) 一种单模块DNA文库及TALENs识别模块的连接方法
CN105087632B (zh) 一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用
CN104178477A (zh) 一种基因合成的方法
CN104212827A (zh) 不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法
CN102206634A (zh) Dna分子克隆快速连接载体的构建方法及其涉及的dna分子
CN102627690B (zh) 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
CN101805747B (zh) 一种重复模块基因拼接方法
CN101333538B (zh) 一种前t载体及其制备与应用
US20200377909A1 (en) Directed genome engineering using enhanced targeted editing technologies
CN102618566B (zh) 一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法
CN103194483A (zh) 一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法
CN102776211A (zh) 黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因
CN107312788A (zh) 一种tale重复序列载体的构建方法
CN104726482A (zh) 一种免酶切原核线性表达载体及基因快速表达方法
CN106318961A (zh) 一种多dna片段载体的构建方法及其应用
CN102311968A (zh) 一种t载体及其构建方法与其前t载体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211206

Address after: 201203 floor 3, building 1, No. 6055, Jinhai Road, Fengxian District, Shanghai

Patentee after: Shanghai Xuxu Technology Co.,Ltd.

Address before: 201203 room 239, building 1, Lane 720, Cailun Road, Zhangjiang High Tech Park, Pudong New Area, Shanghai

Patentee before: SHANGHAI SIDANSAI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

TR01 Transfer of patent right