CN109906030B - 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了用于产生仅重链抗体(HcAb)的经基因修饰的非人动物和方法，其中所述经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中所述经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性基因片段。在一些实施方案中，提供了经基因修饰的小鼠，所述经基因修饰的小鼠包含经工程改造的IgH等位基因，所述经工程改造的IgH等位基因缺少编码Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的功能性内源基因片段。还提供了由所述经基因修饰的非人动物产生的HcAb或其衍生物。

Description

用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2016年11月4日提交的美国临时申请62/417,581的优先权权益，该临时申请的内容全部以引用方式并入本文。
提交序列表的ASCII文本文件
将以下以ASCII文本文件提交的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：786192000140SEQLIST.txt，记录日期：2017年11月3日，大小：11KB)。
技术领域
本发明涉及用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法。
背景技术
脊椎动物的常规抗体由配对的重(H)和轻(L)多肽链构成。缺少重链(HC)或轻链(LC)表达会导致B细胞发育停滞。有些物种诸如骆驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)、鲨鱼和银鲛产生不含L链的仅有HC的抗体(HcAb)作为其正常B细胞发育和组库的一部分。抗原结合位点(即，一种单一可变结构域(VHH))类似于常规抗体的VH。在骆驼科中，这些重链抗体(HcAb)属于IgG2和IgG3同种型，并且其可变结构域发生体细胞超突变。因此，骆驼科HcAb是亲和力成熟的并且可在抗原结合中发挥功能。
已生成含有重排单峰驼γ2a重链的转基因小鼠。单峰驼转基因被表达为仅重链抗体。参见Zou X.等人，Journal of Immunology,175:3769-3779(2005)。还已生成含有各种非重排嵌合HcAb基因座的小鼠。参见Janssens R.等人，PNAS,103(41):15130-15135(2006)。然而，转基因HcAb基因座中的有限数量的VH片段会使得一些抗原无法被这些小鼠识别，即便野生型小鼠有强效抗原应答。参见Janssens R.等人，PNAS,103(41):15130-15135(2006)；Drabe D.等人，Frontiers in Immunology,7(619):1-10(2016)；以及US8883150。轻链缺陷型小鼠中也会自发产生仅重链抗体，但在这些小鼠中，B细胞发育被阻滞在未成熟B细胞期。参见Zou X.等人，JEM,204(13):3271-3283(2007)。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文。
发明内容
本申请提供了用于产生仅重链抗体(HcAb)的经基因修饰的非人动物、方法和试剂盒。还提供了通过经基因修饰的非人动物和/或使用本文所述的方法产生的HcAb及其衍生物。
本申请的一个方面提供了经基因修饰的非人动物，该经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的有缺陷的剪接位点。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少内源Cγ基因的CH1外显子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少内源Cγ基因。
在根据如上所述任何一个经基因修饰的非人动物的一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含人V、D或J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgD、IgA和IgE蛋白。
在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，内源基因片段为约72.7kb长。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含不超过约250个核苷酸(诸如不超过约200或100个核苷酸)长的核苷酸序列，并且其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含选自SEQ ID NO:1-25的核苷酸序列。
在一些实施方案中，啮齿动物是大鼠。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，内源基因片段为约140kb长。
在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是兔。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ的功能性内源CH1外显子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ的内源CH1外显子。
本申请的一个方面提供了产生能够生成仅重链抗体(HcAb)的经基因修饰的非人动物的方法，该方法包括将一个或多个功能丧失型突变引入到非人动物的生殖系基因组中的内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的基因片段，从而提供经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，所述一个或多个突变包括紧接Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点的功能丧失型突变。在一些实施方案中，所述一个或多个突变包括Cγ基因或Cγ基因的CH1外显子的缺失。在一些实施方案中，非人动物是小鼠，并且其中该方法包括从内源IgH基因座缺失包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，非人动物是大鼠，并且其中该方法包括从内源IgH基因座缺失包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，非人动物是兔，并且其中该方法包括从内源IgH基因座缺失Cγ的内源CH1外显子。
在根据如上所述任何一种产生经基因修饰的非人动物的方法的一些实施方案中，该方法包括将所述一个或多个突变引入到非人动物的1-细胞胚胎中的内源IgH基因座；将胚胎植入代孕动物体内；以及使代孕动物繁殖以产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，通过CRISPR/Cas9基因组编辑将所述一个或多个突变引入到内源IgH基因座。在一些实施方案中，该方法包括将编码Cas 9的mRNA、靶向内源IgH基因座中的第一Cγ基因的CH1外显子上游的第一内含子(或5’UTR)的第一sgRNA以及靶向内源IgH基因座中的最后一个Cγ基因的CH1外显子下游的第一内含子的第二sgRNA注射到非人动物的1-细胞胚胎中；将该胚胎植入代孕动物体内；以及使代孕动物繁殖以产生经基因修饰的非人动物。
在一些实施方案中，提供了通过如上所述任何一种产生经基因修饰的非人动物的方法而产生的经基因修饰的非人动物。
在根据上述任何一个经基因修饰的非人动物的一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是能育的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有基本上正常的B细胞发育和成熟。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对抗原作出应答而表达多个IgG蛋白，其中所述多个IgG蛋白不包含轻链。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有基本上正常的V-D-J重组、基本上正常的经典转换重组(CSR)和基本上正常的体细胞超突变。
本申请的另一个方面提供了产生特异性结合目标抗原的仅重链抗体(HcAb)的方法，该方法包括：(a)使用抗原来免疫上述任何一个经基因修饰的非人动物；以及(b)从免疫的经基因修饰的非人动物获得特异性结合该抗原的HcAb，从而产生HcAb。在一些实施方案中，步骤(b)包括：(i)获得包含编码HcAb重链的核酸的细胞；(ii)从该细胞获得该核酸；以及(iii)在宿主细胞中表达该核酸以提供HcAb。在一些实施方案中，该方法还包括基于HcAb的CDR序列来产生嵌合HcAb。在一些实施方案中，该方法还包括HcAb的亲和力成熟。
本申请的一个方面提供了通过如上所述任何一种产生HcAb的方法来产生的仅重链抗体(HcAb)，以及从上述任何一个经基因修饰的非人动物分离的仅重链抗体(HcAb)。在一些实施方案中，HcAb为单克隆的。在一些实施方案中，HcAb为多克隆的。在一些实施方案中，提供了包含上述任何一个HcAb或其抗原结合片段的融合蛋白。
还提供了从上述任何一个经基因修饰的非人动物分离的B细胞，以及基于该B细胞产生的杂交瘤。
根据随后的具体实施方式和所附权利要求书，本发明的这些方面和其他方面以及优点将变得显而易见。应当理解，本文所述的各个实施方案的一种、一些或所有特性可组合，以形成本发明的其他实施方案。
附图说明
图1示出了小鼠染色体12以及12qF1(顶部)处的小鼠IgH基因座、野生型IgH基因座及经基因修饰的IgH基因座，该经基因修饰的IgH基因座具有编码IgG3、IgG1、IgG2b及IgG2c的CH1的基因片段的72.7kb缺失。
图2示出了T7E1测定法以确定单独gRNA的切割效力。gRNA-1、-2和-3靶向紧接小鼠IgH Cγ3基因的CH1外显子上游的内含子，并且gRNA-4、-5和-6靶向紧接小鼠IgH Cγ2c基因的CH1外显子下游的内含子。
图3示出了IgH基因座修饰小鼠的F0首建者的基因分型结果，这通过PCR来测定。经基因分型得出，44只F0小鼠中有25只呈IgH缺失阳性。示出了具有预期缺失的25只小鼠的基因分型PCR产物。
图4示出了取自单等位基因(+/-)和双等位基因(-/-)IgH缺失小鼠的小鼠血清的还原SDS-PAGE凝胶的免疫印迹图像。使用HRP缀合的抗小鼠IgG印迹该凝胶。
图5示出了取自经基因修饰的小鼠的脾和骨髓的细胞样品的流式细胞术分析结果。
图6A至图6D示出了由针对人PD-1免疫的经基因修饰的小鼠产生的仅重链抗体的PD-1结合的动力学分析。
图7示出了大鼠IgH基因座。
图8示出了兔IgH基因座。
具体实施方式
本申请提供了用于产生仅重链抗体(HcAb)的经基因修饰的非人动物、方法和试剂盒及其应用。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性基因片段。在一些实施方案中，提供了经基因修饰的小鼠，其中其每个内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座缺少包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，提供了经基因修饰的大鼠，其中其每个内源IgH基因座缺少包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，提供了经基因修饰的兔，其中其每个内源IgH基因座缺少Cγ的内源CH1外显子。
例如，使用CRISPR/Cas9合子基因组编辑方法，发明人从内源IgH基因座中精确敲除了小鼠基因组的大部分(约72.7kb)，该部分包含编码除IgG2c的CH2和CH3区之外的所有IgG的恒定区的基因片段。然而，整个小鼠免疫球蛋白可变区以及IgM、IgD、IgA和IgE的恒定区保持完整。令人惊讶的是，经免疫基因修饰的小鼠可存活且能育，其免疫系统类似于野生型小鼠。它们的B细胞经历了基本上正常的发育和成熟过程。对抗原激发作出应答，小鼠产生了功能性的仅重链抗体，这些抗体自然成熟并且对抗原具有高亲和力。
骆驼科产生自然成熟的功能性HcAb，另外，它们还产生包含重链和轻链的经典抗体。在本研究之前，已制备将产生HcAb的转基因和嵌合非人动物，但它们产生的是HcAb与具有重链和轻链的常规IgG的混合物。相比之下，本文所述的经基因修饰的非人动物能够使用完全内源重链可变组库来产生唯一为仅重链抗体的IgG分子。本文所述的经基因修饰的非人动物为发现和工程改造具有增强的抗原结合组库多样化和新型抗原受体特性的治疗性抗体提供了强大而通用的平台。
因此，本申请的一个方面提供了经基因修饰的非人动物，该经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的小鼠，该经基因修饰的小鼠包含在内源IgH基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段。
还提供了产生能够生成HcAb的经基因修饰的非人动物的方法、经基因修饰的非人胚胎、细胞以及用于制备经基因修饰的胚胎、细胞和动物的构建体。还提供了产生HcAb的方法、由经基因修饰的非人动物产生的HcAb及其衍生物、以及可用于本文所述方法的试剂盒和制品。
I.定义
除非另外指明，本发明涉及使用的科技术语将具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另有要求或明确指明，单数术语包括复数，复数术语也包括单数。
术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
术语“仅重链抗体”和“HcAb”在本文中可互换使用，是指功能性抗体，其包含重链，但缺少通常存在于经典抗体中的轻链。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HcAb。
如本文所用，“经典”或“常规”抗体是指具有重(H)链和轻(L)链两者的抗体。经典全长抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成。每个轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链间有所不同。每个重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每个重链在一端具有可变结构域(VH)，后接多个恒定结构域。每个轻链在一端具有可变结构域(VL)，并且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“恒定结构域”和“恒定区”在本文中可互换使用，是指免疫球蛋白分子的特定部分，该部分具有相对于免疫球蛋白的另一部分(即，包含抗原结合位点的可变结构域)更保守的氨基酸序列。经典全长抗体的恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称CH)以及轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可称为“VH”。仅重链抗体中的重链的可变结构域可称为“VHH”。轻链的可变结构域可称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最可变部分并且包含抗原结合位点。
术语“可变”是指这一事实：可变结构域的某些部分在各抗体之间存在广泛的序列差异并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变结构域上不是均匀分布的。它集中在轻链和重链可变结构域两者中被称为高变区(HVR)的三个区段中。一般来讲，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。仅重链抗体包含VH中的三个HVR(H1,H2,H3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，CDR具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其主要采用β-片构型，通过三个HVR连接，其形成连接环连接，并且在一些情况下形成β-片结构的一部分。每个链中的HVR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自其它链的HVR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用，术语“重链”是指包含至少重链可变区且具有或没有前导序列的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区且具有或没有前导序列的多肽。
如本文所用，术语“重链可变区”是指包含重链HVR1、框架(FR)2、HVR2、FR3和HVR3的区域。例如，重链可变区可包含重链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。
如本文所用，术语IgG“同种型”或“亚类”意指由其恒定区的化学和抗原特性定义的免疫球蛋白的任何亚类。示例性IgG亚类包括但不限于IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。在许多动物中，IgG由免疫球蛋白重链基因座中的Cγ基因编码。免疫球蛋白重链基因座在本文中也称为“IgH基因座”。不同IgG亚类由不同Cγ基因编码，包括例如Cγ编码IgG1，Cγ2a编码IgG2a，Cγ2b编码IgG2b，Cγ2c编码IgG2c，并且Cγ3编码IgG3。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将抗体(免疫球蛋白)归属于不同的类别。免疫球蛋白有五大类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些免疫球蛋白中的若干种可进一步被分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，并且在例如Abbas等人，Cellular and Mol.Immunology，第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中有所概述。抗体可以是更大的融合分子的一部分，该融合分子由抗体与一种或多种其他蛋白质或肽共价或非共价缔合而形成。
如本文所用，术语“轻链”是指包含至少轻链可变区且具有或没有前导序列的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区且具有或没有前导序列的多肽。
如本文所用，术语“轻链可变区”是指包含轻链HVR1、框架(FR)2、HVR2、FR3和HVR3的区域。在一些示例中，轻链可变区包含轻链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR1和/或FR4。
如本文所用，术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性示例性轻链恒定区包括λ和κ。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指呈其基本上完整形式的抗体，而不是如下所定义的抗体片段。这些术语特别是指具有含Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。在一些实施方案中，本文所述的抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的示例包括VH结构域；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自基本上同质抗体群的抗体，例如除了可以微量存在的可能突变(例如，天然存在的突变)之外，构成该群体的各个抗体相同。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括具有结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的过程来获得。例如，该选择过程可以是从多个克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库)中选择唯一克隆。应当理解，可进一步改变所选择的靶标结合序列，例如以改善对靶标的亲和力，使靶标结合序列人源化，改善其在细胞培养中的产生，减少其体内免疫原性，建立多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点还在于其通常不被其他免疫球蛋白污染。
如本文所用，“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链的一部分源自特定来源或物种，而重链的其余部分源自不同来源或物种。在一些实施方案中，嵌合抗体是指这样的抗体，其包含来自第一物种(诸如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的至少一个可变区和来自第二物种(诸如人、食蟹猴等)的至少一个恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个大鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个兔可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区来自第一物种，并且嵌合抗体的所有恒定区来自第二物种。
如本文所用，“人源化抗体”是指这样的抗体，其中非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸已被来自人可变区的对应氨基酸取代。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。
如本文所用，“HVR移植抗体”是指这样的人源化抗体，其中第一(非人)物种的一个或多个高变区(HVR)已被移植到第二(人)物种的框架区(FR)上。在一些示例中，如本文所用，“CDR移植抗体”是指这样的人源化抗体，其中第一(非人)物种的一个或多个互补决定区(CDR)已被移植到第二(人)物种的框架区(FR)上。
出于本文的目的，“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列，如下所定义。来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者其可包含氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化数是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由离解常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法来测量，包括本文所述的那些。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，相比之下，亲本抗体没有此类改变，此类改变使抗体对抗原的亲和力提高。在一些示例中，亲和力成熟的抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，相比之下，亲本抗体没有此类改变，此类改变使抗体对抗原的亲和力提高。
如本文所用，术语“基本上类似的”或“基本上相同的”表示两个或更多个数值之间足够高的相似性程度，使得本领域技术人员将这两个或更多个值之间的差异视为在所述值所度量的生物学特性的语境内具有很少或没有生物学和/或统计学意义。在一些实施方案中，两个或更多个基本上类似的值相差不超过约5％、10％、15％、20％、25％或50％中的任何一者。涉及到受试者中的过程的“基本上正常的”意指受试者中(诸如野生型动物中)的过程与对照基本上类似。
术语“前导序列”是指位于多肽的N-末端且有利于多肽从哺乳动物细胞分泌的氨基酸残基的序列。从哺乳动物细胞输出多肽后可切割前导序列，从而形成成熟蛋白。前导序列可为天然或合成的，并且它们对于所连接的蛋白质可以是异源或同源的。
术语“载体”用于描述这样的多核苷酸，其可被工程改造以包含可在宿主细胞中增殖的一个或多个克隆的多核苷酸。载体可包含以下的一个或多个元件：复制起点、调控目标多肽的表达的一个或多个调控序列(诸如启动子和/或增强子)、和/或一个或多个选择性标记基因(诸如抗生素抗性基因以及可用于比色测定法的基因，例如β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达目标多肽的载体。
“宿主细胞”是指可能或已经成为载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、
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细胞(Crucell)、293和CHO细胞以及它们的衍生物，诸如分别为293-6E和DG44细胞。
如本文所用，术语“分离的”是指已从通常与其一起天然存在或产生的至少一些组分分开的分子。例如，当多肽从产生该多肽的细胞的至少一些组分分开时，该多肽即称为“分离的”。在多肽由细胞表达后分泌的情况下，将包含该多肽的上清液从产生该多肽的细胞物理地分开被视为“分离”该多肽。类似地，在以下情况下多核苷酸称为“分离的”：该多核苷酸不是通常天然存在的较大多核苷酸(就DNA多核苷酸而言，诸如为基因组DNA或线粒体DNA)的一部分，或从产生该多核苷酸的细胞的至少一些组分分开(例如，就RNA多核苷酸而言)。因此，宿主细胞内的载体中所含的DNA多核苷酸可称为“分离的”。
应当理解，本文所述的本发明的实施方案包括“由…组成”和/或“基本由…组成”实施方案。
本文提及“约”的值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，关于“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所使用，提及“非”某个值或参数通常表示并描述“除该值或参数之外”的值或参数。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文所用，单数形式“一个”、“或”和“该”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。
II.经基因修饰的非人动物
本申请提供了产生仅重链抗体(即，缺少轻链的抗体)的经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不产生包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不产生任何经典IgG分子，即具有重链和轻链两者的抗体。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的非人动物，该经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
经基因修饰的非人动物的生殖系基因组可具有超过一个内源IgH基因座。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物的生殖系基因组是二倍体。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的，即，其中两个内源IgH基因座中只有一个包含经工程改造的IgH等位基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物包含生殖系基因组，该生殖系基因组包含第一内源IgH基因座处的第一经工程改造的IgH等位基因以及第二内源IgH基因座处的第二不同经工程改造的IgH等位基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的，即，其中两个内源IgH基因座中的每一个都包含经工程改造的IgH等位基因。
在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含内源IgH基因座中的一个或多个突变，其中所述一个或多个突变使编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的内源基因片段失效。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含选自以下的一个或多个突变：内源Cγ基因的CH1外显子的缺失、内源Cγ基因的缺失、紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点所发生的导致Cγ基因的mRNA转录物中的CH1外显子丢失的突变、以及它们的组合。所述一个或多个突变可为内源Cγ基因的CH1外显子、紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点、或内源Cγ基因中的一个或多个核苷酸残基的缺失、插入或置换突变。
在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少内源Cγ基因的CH1外显子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少每个内源Cγ基因的CH1外显子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少内源Cγ基因。在一些实施方案中，其中野生型非人动物中的内源IgH基因座包含两个或更多个内源Cγ基因，所述一个或多个突变包括除最下游内源Cγ基因之外的所有Cγ基因的缺失以及内源IgH基因座处的最下游内源Cγ基因的CH1外显子的缺失。如本文所用，涉及到基因座处的基因或基因簇的“下游”或“上游”由该基因座处的基因或基因簇的转录取向表征。上游基因或基因片段产生下游基因或基因片段的转录物5’端的转录物。
在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的有缺陷的剪接位点。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因中的每个内源Cγ基因具有紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的有缺陷的剪接位点。在一些实施方案中，有缺陷的剪接位点包含紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的5’剪接位点的共有序列的突变，诸如点突变。在一些实施方案中，有缺陷的剪接位点具有紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的5’剪接位点中的第一核苷酸(“+1”位)的点突变。在一些实施方案中，5’剪接位点的共有序列是GT。在一些实施方案中，有缺陷的剪接位点包含紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的5’剪接位点中的第一核苷酸处的G-A颠换突变(即，G(+1)-A(+1)突变)。有缺陷的剪接位点会导致Cγ基因的mRNA转录物中丢失CH1外显子。
骆驼科(诸如骆驼、单峰驼和美洲驼)产生IgG2和IgG3同种型的重链抗体(HcAb)。在HcAb转录物中，由于共有剪接信号丢失，恒定区的第一结构域CH1被剪切掉。从肝基因组文库获得的骆驼γ恒定重链基因的组织似乎是迄今为止测序的所有其他哺乳动物γ基因特有的，其中四聚体和同型二聚体骆驼科IgG源自相同IgH基因座。每个IgG编码基因包含转换、CH1、铰链、CH2、CH3、M1和M2外显子。与患有重链疾病的小鼠和人中的IgH基因座不同，编码HcAb的骆驼γ基因包含没有重大结构缺陷的完全VDJ区，并且对应的CH1外显子是完整的。然而，序列分析揭示，紧接CH1外显子之后的剪接位点有缺陷，这是由于点突变，尤其是G(+1)-A(+1)颠换突变似乎是有害的。此类数据表明，剪接共有信号丢失是骆驼γ仅重链免疫球蛋白中的整个CH1结构域去除的原因。参见Nguyen V.K.等人，Molecular Immunology36(1999)515-524。此外，未在骆驼科中发现IgM类的HcAb。编码骆驼科外周血B细胞中存在的IgG和IgM的膜形态的cDNA的分析与带同型二聚体IgG的B细胞的发育经过IgM(+)期(这类似于常规IgG的情况)的概念最相符。
因此，在一些实施方案中，提供了经基因修饰的非人动物，该经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因包含选自以下的一个或多个突变：内源Cγ基因的CH1外显子的缺失、内源Cγ基因的缺失、紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点所发生的导致Cγ基因的mRNA转录物中的CH1外显子丢失的突变、以及它们的组合。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的非人动物，该经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因包含紧接每个内源Cγ基因的CH1外显子之后的有缺陷的剪接位点(诸如G(+1)-A(+1)颠换突变)。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的非人动物，该经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少每个内源Cγ基因的CH1外显子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的非人动物，该经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少除最下游内源Cγ基因的CH2和CH3外显子之外的所有内源Cγ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性重链可变区，包括V、D和J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源重链可变区，包括V、D和J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因，诸如重排V、D和J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含非重排V、D和J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含全套非重排内源V、D和J基因。
在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不包含不同物种的外源重链可变区，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含未改变的内源重链可变区。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不是包含来自不同物种的重链可变区的嵌合IgH构建体。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含人V、D或J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含来源于天然存在的VHH基因座(诸如骆驼科VHH基因座)的基因。
在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物在其生殖系基因组中不包含任何外源序列，诸如人或骆驼科IgH基因片段。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物在其生殖系基因组中不包含人V、D或J基因片段。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物在其生殖系基因组中不包含骆驼科V、D或J基因片段。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不包含编码人源化或骆驼科源化可变区的任何基因，诸如产生具有人或骆驼科特性或序列的CDR或FR的重排或非重排基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不包含编码人恒定区(诸如人铰链、CH2和/或CH3区)的基因。
在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如有利于外源序列插入到基因组中的重组位点或同源臂。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含用于选择经工程改造的细胞的报告基因，诸如荧光报告基因或抗生素抗性基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含通过非同源末端连接引入的随机核苷酸。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含除通过DNA修复引入的随机插入和缺失之外的外源序列。
在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含一个或多个外源序列。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含用于选择经工程改造的细胞的报告基因，诸如荧光报告基因或抗生素抗性基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含有利于外源序列插入到基因组中的重组位点或同源臂。
在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因仅具有对Cγ基因的CH1外显子的修饰。在一些实施方案中，该修饰不包含编码IgG的铰链区的基因的突变，诸如缺失或功能丧失型突变。在一些实施方案中，该修饰不包含Cγ基因的CH2或CH3外显子的突变，诸如缺失或功能丧失型突变。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因没有Cμ基因的CH1外显子的突变或修饰。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有在内源IgH基因座处编码IgM的CH1的功能性基因片段。
在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有编码其他重链恒定同种型(诸如IgM、IgD、IgE和/或IgA)的完全功能性基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性Cμ、Cδ、Cε和/或Cα基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因具有野生型Cμ、Cδ、Cε和/或Cα基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含内源Cμ、Cδ、Cε和/或Cα基因的任何突变。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性(诸如野生型)Cμ基因。在一些实施方案中，内源IgH基因座具有完整内源Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性(诸如野生型)Cμ、Cδ、Cε和Cα基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgD、IgA和IgE蛋白。
在一些实施方案中，向经基因修饰的非人动物中的内源IgH基因座引入微小变化促进了动物的健康，包括正常B细胞发育和成熟。在一些实施方案中，向经基因修饰的非人动物中的内源IgH基因座引入微小变化减少或避免了外源序列对动物的免疫原性。在一些实施方案中，向经基因修饰的非人动物中的内源IgH基因座引入微小变化保留了内源IgH基因座的正常功能，包括V-D-J重组、经典转换重组(CSR)和体细胞超突变。
在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有一个或多个完全功能性轻链基因座，诸如λ轻链基因座和/或κ轻链基因座。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有未改变的内源轻链基因座。在一些实施方案中，未向经基因修饰的非人动物的内源轻链基因座引入突变。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物的λ和/或κ轻链可变区基因座有功能，未被沉默。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达野生型λ轻链和/或野生型κ轻链。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达包含轻链的功能性IgM分子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物表达包含轻链的功能性IgA、IgD和/或IgE分子。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物没有外源轻链基因或基因簇。
先前制备的可产生仅重链抗体的经基因修饰的动物与本文所述的经基因修饰的动物的差异表现在许多方面。一些转基因动物是通过模拟天然产生HcAb的物种(例如，骆驼科和某些鱼类)中的IgH基因座来制备的。例如，制备了缺少编码IgM和IgG两者的恒定区基因中的CH1外显子的转基因动物，同时将骆驼科或骆驼科源化VHH或VHH样重链可变区或人重链可变基因引入到经工程改造的IgH基因座。推测起来，使IgM和IgG CH1结构域发生缺失是为了防止内源天然抗体的形成以与经基因修饰的IgH基因座处的骆驼科源化抗体形成进行竞争。推测起来，添加VHH基因片段是为了模拟重链抗体形成以及CH1缺失。在其他研究中，将外源IgH基因座构建体引入到转基因非人动物的基因组。将人或骆驼科V、D和J基因与经工程改造而缺失一个或多个CH1外显子的鼠重链恒定区基因组合。参见例如美国专利8754287。另一种方法依赖于可重排形成功能性轻链基因的功能性κ或λ基因片段的缺失以及任何功能性重排轻链基因的缺失。这些轻链缺陷型动物产生大量编码包含CH1结构域的重链的RNA。迄今为止已知的经基因工程改造的动物都不能唯一产生具有全套内源重链可变组库的仅重链IgG分子，同时保持动物中的B细胞发育和成熟过程不受干扰。
经基因修饰的非人动物可以是适用于抗体产生的任何物种。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是哺乳动物，包括但不限于啮齿动物、猿、猫、犬、马、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物以及哺乳类宠物。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是啮齿动物。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是小鼠。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠是近交小鼠。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠是远交小鼠。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠为C57BL/6J品系、129S1/SvImJ品系、BALB/c品系、CBA/J品系、DBA/2J品系、C3H.SW(H-2b)品系、NOD/ShiLtJ品系、AKR/J(AKR)品系、A/J、FvB/NJ品系、C3H/HeJ(C3H)品系、B6品系、ICR品系、C58/J(C58)品系、CBA/J品系或MRL/Mpl品系。其他合适的近交品系和远交品系包括但不限于CD-1品系、Swiss Webster。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是大鼠。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物是兔。
不同动物物种在其内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有不同生殖系组织和基因。已对许多物种的IgH基因座进行了测序。小鼠、大鼠和兔中的IgH基因座的基因位置和外显子/内含子组织可见于例如worldwide web.imgt.org/IMGTrepertoire/LocusGenes。
例如，小鼠的内源IgH基因座跨越小鼠参考基因组中的染色体12(12F2)上的约2.3Mb。在具有IGH1-b等位基因的近交小鼠中，存在四个IgG亚类，包括IgG3、IgG1、IgG2b和IgG2c，它们的恒定区分别由Cγ3、Cγ1、Cγ2b和Cγ2c编码。内源IgH基因座中的IgG恒定区基因从最上游到最下游的顺序如下：Cγ3、Cγ1、Cγ2b和Cγ2c。其他小鼠品系产生IgG2a亚类分子，而不是IgG2c亚类，并且IgG2a亚类的重链区由Cγ2a基因编码。每个Cγ基因从5’到3’包含：5’UTR、CH1外显子、内含子、铰链(H)外显子、内含子、CH2外显子、内含子、CH3外显子(或CH3-CHS外显子)、内含子、终止密码子以及多聚腺苷酸信号。受体剪接位点紧接每个外显子的上游(5’)定位，并且供体剪接位点紧接每个外显子的下游(3’)定位。C57BL/6J品系中的小鼠IgH基因座的每个Cγ基因之间的内源位点中的基因间片段如下：Cγ3-34kb-Cγ1-21kb-Cγ2b-15kb-Cγ2c。包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段为约72.7kb。从小鼠基因组缺失这样大的内源片段在技术上富有挑战性，并且从小鼠基因组缺失72.7kb片段的影响是不可预见的。
在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠在内源IgH基因座处包含经工程改造的IgH等位基因，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码Cγ3、Cγ1、Cγ2b和Cγ2c/Cγ2a的每个CH1外显子的功能性基因片段。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含紧接Cγ3、Cγ1、Cγ2b和/或Cγ2c/Cγ2a的CH1外显子之后的有缺陷的剪接位点(诸如G(+1)-A(+1)颠换突变)。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ3、Cγ1、Cγ2b和/或Cγ2c/Cγ2a的CH1外显子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ3、Cγ1和/或Cγ2b基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c/Cγ2a的CH1外显子的内源基因片段，该基因片段为约72.7kb长。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含不超过约500个核苷酸(诸如不超过约400、300、250、200、150、100、75或50个核苷酸中的任一者)长的核苷酸序列，并且其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO:27(TATCCTACATGCTCTTTGCAGAAC)和SEQ ID NO:28(AGACCAGCCAGGATCAGCAGCCAT)。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含选自SEQ ID NO:1-25的核苷酸序列。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠包含完全完好无损的内源小鼠重链免疫球蛋白可变区基因，包括约150-170个IGHV基因、17-20个IGHD基因以及4个IGHJ基因。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的小鼠，该经基因修饰的小鼠包含在内源IgH基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含不超过约250个核苷酸(诸如不超过约200或100个核苷酸)长的核苷酸序列，并且其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含选自SEQ ID NO:1-25的核苷酸序列。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
大鼠的内源IgH基因座位于褐家鼠基因组中的染色体6q32-33上，其跨越约4.9Mb。大鼠表达四个IgG亚类，包括IgG2c、IgG2a、IgG1和IgG2b，它们的恒定区分别由Cγ2c、Cγ2a、Cγ1和Cγ2b编码。内源IgH基因座中的IgG恒定区基因从最上游到最下游的顺序如下：Cγ2c、Cγ2a、Cγ1和Cγ2b。包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段为约140kb。
在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠在内源IgH基因座处包含经工程改造的IgH等位基因，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码Cγ2c、Cγ2a、Cγ1和Cγ2b的每个CH1外显子的功能性基因片段。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含紧接Cγ2c、Cγ2a、Cγ1和/或Cγ2b的CH1外显子之后的有缺陷的剪接位点(诸如G(+1)-A(+1)颠换突变)。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ2c、Cγ2a、Cγ1和/或Cγ2b的CH1外显子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ2c、Cγ2a和/或Cγ1基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠包含完全完好无损的内源大鼠重链免疫球蛋白可变区基因，包括约350个IGHV基因、20个IGHD基因以及5个IGHJ基因。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的大鼠，该经基因修饰的大鼠包含在内源IgH基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
兔的内源IgH基因座位于穴兔基因组中的染色体20上。兔表达单个IgG亚类，其恒定区由Cγ基因编码。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的兔，该经基因修饰的兔包含在内源IgH基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ的内源CH1外显子。在一些实施方案中，提供了经基因修饰的兔，该经基因修饰的兔包含在内源IgH基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因包含紧接Cγ的CH1外显子之后的有缺陷的剪接位点(诸如G(+1)-A(+1)颠换突变)。在一些实施方案中，经基因修饰的兔对于经工程改造的IgH等位基因是杂合的。在一些实施方案中，经基因修饰的兔对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的兔不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的兔具有完全功能性内源轻链基因座。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。在一些实施方案中，经基因修饰的兔表达野生型IgM、IgA、IgD和IgE蛋白。
可使用本领域的任何已知基因组编辑方法(包括但不限于同源重组方法)或使用序列特异性核酸内切酶(包括但不限于CRISPR/cas、锌指核酸酶(ZFN)、TALEN基因组编辑方法和大范围核酸酶)来制备经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，通过CRISPR/Cas合子基因组编辑方法产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，通过使用CRISPR/Cas基因组编辑方法从内源IgH基因座缺失内源基因片段来产生经基因修饰的非人动物。
可在分离的胚胎干(ES)细胞或胚胎中进行基因组编辑。例如，可将定制的序列特异性核酸内切酶体系(诸如CRISPR/cas、ZFN、TALEN或大范围核酸酶)体外注射到ES细胞或胚胎(例如，1-细胞胚胎)中以引发基因组编辑。还可以同时将可在切割的靶基因座处整合的供体核酸注射到ES细胞或胚胎中。供体核酸可包含经工程改造的IgH等位基因。可在适用于制备ES细胞来源小鼠的条件下将ES细胞的克隆用作非人动物的胚胎中的供体ES细胞。任选地，可使用报告基因或选择标记来选择经基因修饰的ES细胞或经基因修饰的ES胚胎。可将经基因修饰的胚胎植入代孕动物体内以产生首建者后代。可使用本领域的已知方法(诸如IgH基因座的PCR和测序)来筛选首建者后代，从而选择具有经工程改造的IgH等位基因的已成功修饰的非人动物。首建者后代可进一步繁殖而产生对于经工程改造的IgH等位基因同源的经基因修饰的非人动物。
CRISPR/Cas(成簇规律间隔短回文重复序列)体系利用RNA指导的DNA结合和靶DNA的序列特异性切割。向导RNA(gRNA)包含与基因组PAM(前间区序列邻近基序)位点和恒定RNA支架区上游的靶基因组DNA序列互补的约20-25(诸如20)个核苷酸。在某些实施方案中，靶序列与PAM相关联，该PAM是CRISPR复合物所识别的短序列。PAM的确切序列和长度要求根据所使用的CRISPR酶而有所不同，但PAM通常是与前间区序列(即，靶序列)相邻的2-5bp序列。PAM序列的示例是本领域已知的，并且技术人员将能够鉴定与给定CRISPR酶一起使用的另外PAM序列。例如，可通过在输入序列及输入序列的反向互补链上搜索5′-Nx-NGG-3’来鉴定来自酿脓链球菌的Cas9的靶位点(具有PAM序列NGG)。在某些实施方案中，本文所用的基因组PAM位点是NGG、NNG、NAG、NGGNG或NNAGAAW。其他PAM序列以及用于鉴定PAM序列的方法是本领域已知的，例如如美国专利8,697,359中公开，该专利的公开内容以引用方式并入本文以用于所有目的。示例性II型CRISPR体系是来自酿脓链球菌SF370的II型CRISPR基因座，该基因座包含四个基因Cas9、Casl、Cas2和Csnl的聚簇以及两个非编码RNA元件、tracrRNA和由非重复序列的短段(间隔区，各有约30bp)间隔开的重复序列(正向重复序列)的特征性阵列。在一些实施方案中，使用酿脓链球菌Cas9(SpCas9)并且对应PAM是NGG。在一些方面，来自不同细菌菌株的不同Cas9酶使用不同PAM序列。可基于非人动物中的内源IgH基因座的序列来鉴定适用于修饰(诸如缺失或置换)的靶标。可使用本领域的已知方法来设计对应gRNA。
Cas(CRISPR相关)蛋白结合gRNA并结合与gRNA结合的靶DNA，并且在PAM位点上游的限定位置中引入双链断裂。CRISPR-Cas体系已用于编辑、调控和靶向基因组，例如，如Sander和Joung,2014Nature Biotechnology 32(4):347-55中所公开。CRISPR和/或Cas及使用方法的另外描述可见于WO 2007025097、US 20100093617、US 20130011828、US 13/960,796、US 8,546,553、WO 2010011961、US 20140093941、US 20100076057、US20110217739、WO 2010075424、WO 2013142578、WO 2013141680、US 20130326645、WO2013169802、US 20140068797、WO 2013176772、WO 2013181440、US 20130330778、WO2013188037、WO 2013188522、WO 2013188638、WO 2013192278、WO 2014018423、CN103388006、WO 2014022702、US 20140090113、WO 2014039872、WO 2014065596、US 8,697,359和CN 103725710，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
ZFN是由DNA结合锌指蛋白结构域和效应物核酸酶结构域构成的重组蛋白。锌指蛋白结构域是识别并结合特异性DNA序列的遍在蛋白结构域(例如，与转录因子相关)。“指”结构域之一可由约三十个氨基酸构成，这些氨基酸包括与锌络合的不变组氨酸残基。虽然迄今为止已鉴定了超过10,000种锌指序列，但通过锌指结构域中的靶向氨基酸置换形成新的锌指蛋白而进一步扩充了锌指蛋白的组库，这些锌指蛋白被设计为识别特异性目标核苷酸序列。例如，已使用噬菌体展示库针对所需的序列特异性来筛选锌指组合文库(Rebar等人，Science 263:671-673(1994)；Jameson等人，Biochemistry 33:5689-5695(1994)；Choo等人，PNAS 91:11163-11167(1994)，这些文献中的每一篇均并入本文，如同其全部内容在此阐述)。然后可将具有所需序列特异性的锌指蛋白连接到效应物核酸酶结构域，例如，如US6,824,978中所述，诸如PCT申请公布WO1995/09233和WO1994018313中描述的Fokl。
转录激活因子样效应物核酸内切酶(TALEN)包含结合特异性核苷酸序列的TAL效应物结构域以及催化靶位点处的双链断裂的核酸内切酶结构域。TALEN及制备和使用方法的示例由PCT专利申请公布WO2011072246和WO 2013163628以及美国申请公布US20140073015Al描述。TALEN可用于在靶向基因组基因座处引入位点特异性双链断裂。在两个独立TALEN结合附近DNA序列时产生位点特异性双链断裂，从而允许Fokl的二聚化以及靶DNA的切割。TALEN推动了基因组编辑的发展，因为它们具有较高的成功率和有效的基因修饰。该DNA切割可刺激天然DNA修复机制，从而引起两种可能修复通路之一：同源介导修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)通路。TALEN可被设计为靶向任何基因，包括涉及遗传性疾病的基因。
在一些实施方案中，通过向非人动物的生殖系基因组中的内源IgH基因座处编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的内源基因片段引入一个或多个功能丧失型突变来产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，所述一个或多个突变包括紧接Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点的功能丧失型突变(诸如G(+1)-A(+1)颠换突变)。在一些实施方案中，所述一个或多个突变包括Cγ基因或Cγ基因的CH1外显子的缺失。在一些实施方案中，将所述一个或多个突变顺序地引入到非人动物的内源IgH基因座。在一些实施方案中，从内源IgH基因座缺失包含除最下游Cγ基因的CH2和CH3外显子之外的所有Cγ基因的内源基因片段。在一些实施方案中，所述一个或多个突变包括紧接Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点的突变、Cγ基因的缺失以及Cγ基因的CH1外显子的缺失的组合。
因此，在一些实施方案中，提供了产生能够生成仅重链抗体(HcAb)的经基因修饰的非人动物的方法，该方法包括将一个或多个功能丧失型突变引入到非人动物的生殖系基因组中的内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的基因片段，从而提供经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，所述一个或多个突变选自紧接Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点的功能丧失型突变、Cγ基因的缺失、Cγ基因的CH1外显子的缺失以及它们的组合。在一些实施方案中，其中非人动物是小鼠，通过从内源IgH基因座缺失包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段来产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，其中非人动物是大鼠，通过缺失包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段来产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，其中非人动物是兔，通过缺失Cγ的内源CH1外显子来产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，通过CRISPR/Cas9基因组编辑将所述一个或多个突变引入到内源IgH基因座。
在一些实施方案中，通过合子基因组编辑将所述一个或多个突变引入到非人动物的内源IgH基因座。在一些实施方案中，该方法包括将所述一个或多个突变引入到非人动物的1-细胞胚胎中的内源IgH基因座；将胚胎植入代孕动物体内；以及使代孕动物繁殖以产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，该方法包括将序列特异性核酸内切酶或编码该核酸内切酶的核酸(例如，mRNA或DNA)和任何对应向导核酸注射到1-细胞胚胎以引发基因组编辑。
在一些实施方案中，提供了产生能够生成仅重链抗体(HcAb)的经基因修饰的非人动物的方法，该方法包括将编码Cas 9的mRNA、靶向内源IgH基因座中的第一Cγ基因的CH1外显子上游的第一内含子或5’UTR的第一sgRNA以及靶向内源IgH基因座中的最后一个Cγ基因的CH1外显子下游的第一内含子的第二sgRNA注射到非人动物的1-细胞胚胎中；将该胚胎植入代孕动物体内；以及使代孕动物繁殖以产生经基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，其中非人动物是小鼠，第一Cγ基因是Cγ3，并且最后一个Cγ基因是Cγ2c(或Cγ2a)。在一些实施方案中，其中非人动物是大鼠，第一Cγ基因是Cγ2c，并且最后一个Cγ基因是Cγ2b。在一些实施方案中，其中非人动物是兔，该方法包括将编码Cas 9的mRNA、靶向内源IgH基因座中的Cγ基因的CH1外显子上游的第一内含子或5’UTR的第一sgRNA以及靶向内源IgH基因座中的Cγ基因的CH1外显子下游的第一内含子的第二sgRNA注射到兔的1-细胞胚胎中。
提供了使用本文所述的任何方法产生的经基因修饰的非人动物。还提供了用于产生经基因修饰的非人动物的方法中的组合物、gRNA和经工程改造的IgH等位基因构建体。
本文所述的经基因修饰的非人动物具有以下的一个或多个特征：(1)经基因修饰的非人动物对抗原作出应答而表达多个IgG蛋白，其中所述多个IgG蛋白不包含轻链；(2)经基因修饰的非人动物是能育的；(3)经基因修饰的非人动物具有基本上正常的B细胞发育和成熟；以及(4)经基因修饰的非人动物具有基本上正常的V-D-J重组、基本上正常的经典转换重组(CSR)和基本上正常的体细胞超突变。
IgG分子可使用本领域已知的各种方法来表征，包括例如尺寸排阻色谱、动态光散射以及非还原或还原条件下的SDS-PAGE电泳分析。仅重链IgG分子没有轻链，因此尺寸小于具有重链和轻链两者的常规IgG分子。可通过免疫印迹或ELISA来检测轻链。
可通过对产仔数进行计数来确定动物的生育力。可使用本领域的已知方法来确定经基因修饰的非人动物的免疫健康和发育状况。还可使用诸如利用骨髓、脾和/或血液样品的流式细胞术分析、免疫组织化学法、ELISA、免疫印迹或PCR检测的方法来评估B细胞发育和成熟状况。处于不同发育期的B细胞通过其细胞表面生物标记来表征。例如，小鼠的祖B细胞是c-kit+B22+，前B细胞是CD43+B220+，未成熟B细胞是B220+CD43-，并且成熟B细胞是CD21/35+。用于评估B细胞发育的其他可用细胞标记包括但不限于CD138和CD19。可使用来自产生成熟抗体的B细胞的RNA样品，通过RT-PCR来检测和评估V-D-J重组、经典转换重组(CSR)和体细胞超突变。
本文还提供了经基因修饰的细胞和非人胚胎。在一些实施方案中，提供了经基因修饰的非人细胞，该经基因修饰的非人细胞包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段。在一些实施方案中，该细胞选自非人胚胎干(ES)细胞、多能细胞、全能细胞或iPS细胞。在一些实施方案中，该细胞选自小鼠ES细胞、大鼠ES细胞或兔ES细胞。
在一些实施方案中，提供了经基因修饰的非人胚胎，该经基因修饰的非人胚胎包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段。在一些实施方案中，非人胚胎处于1-细胞期。在一些实施方案中，非人胚胎是小鼠胚胎、大鼠胚胎或兔胚胎。
在一些实施方案中，提供了包含经基因修饰的供体细胞的非人胚胎，该经基因修饰的供体细胞包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段。在一些实施方案中，非人胚胎是小鼠胚胎、大鼠胚胎或兔胚胎，并且供体细胞分别是小鼠ES细胞、大鼠ES细胞或兔ES细胞。
III.产生仅重链抗体的方法
本申请还提供了使用本文所述的任何一个经基因修饰的非人动物来产生仅重链抗体的方法。
在一些实施方案中，提供了产生特异性结合目标抗原的仅重链抗体(HcAb)的方法，该方法包括：(a)使用抗原来免疫经基因修饰的非人动物，其中经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段；以及(b)从免疫的经基因修饰的非人动物获得特异性结合该抗原的HcAb，从而产生HcAb。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含选自以下的一个或多个突变：内源Cγ基因的CH1外显子的缺失、内源Cγ基因的缺失、紧接内源Cγ基因的CH1外显子之后的剪接位点所发生的导致Cγ基因的mRNA转录物中的CH1外显子丢失的突变、以及它们的组合。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的非人动物具有完全功能性内源轻链基因座。
在一些实施方案中，提供了产生特异性结合目标抗原的仅重链抗体的方法，该方法包括：(a)使用抗原来免疫经基因修饰的小鼠，其中经基因修饰的小鼠包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段；以及(b)从免疫的经基因修饰的非人动物获得特异性结合该抗原的HcAb，从而产生HcAb。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因包含不超过约250个核苷酸(诸如不超过约200或100个核苷酸)长的核苷酸序列，并且其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的小鼠具有完全功能性内源轻链基因座。
在一些实施方案中，提供了产生特异性结合目标抗原的仅重链抗体的方法，该方法包括：(a)使用抗原来免疫经基因修饰的大鼠，其中经基因修饰的大鼠包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段；以及(b)从免疫的经基因修饰的非人动物获得特异性结合该抗原的HcAb，从而产生HcAb。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的大鼠具有完全功能性内源轻链基因座。
在一些实施方案中，提供了产生特异性结合目标抗原的仅重链抗体的方法，该方法包括：(a)使用抗原来免疫经基因修饰的兔，其中经基因修饰的兔包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中经工程改造的IgH等位基因缺少Cγ的内源CH1外显子；以及(b)从免疫的经基因修饰的非人动物获得特异性结合该抗原的HcAb，从而产生HcAb。在一些实施方案中，经基因修饰的兔对于经工程改造的IgH等位基因是纯合的。在一些实施方案中，经基因修饰的兔不表达包含轻链的IgG分子。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。在一些实施方案中，经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列，诸如人或骆驼科V、D或J基因。在一些实施方案中，经基因修饰的兔具有完全功能性内源轻链基因座。
从经基因修饰的非人动物获得的HcAb可为单克隆或多克隆的。在一些实施方案中，从经基因修饰的非人动物获得的HcAb经受进一步的选择、亲和力成熟和/或工程改造。在一些实施方案中，该方法包括：(i)获得包含编码HcAb重链的核酸的细胞；(ii)从该细胞获得该核酸；以及(iii)在宿主细胞中表达该核酸以提供HcAb。在一些实施方案中，该核酸经过工程改造以提供HcAb的衍生物，诸如基于HcAb的CDR序列的嵌合HcAb、HcAb的抗原结合片段、或包含HcAb或其抗原结合片段的融合蛋白。
HcAb的示例性衍生物包括但不限于包含与单个靶抗原的两个表位特异性结合的两个HcAb的VH结构域的双特异性构建体；包含与两个不同靶抗原结合的两个HcAb的VH结构域的双特异性构建体；包含靶向三个不同靶表位或抗原的三个或更多个HcAb的VH结构域的三特异性或多特异性构建体；包含与其他功能蛋白融合的HcAb的VH结构域的融合构建体，所述其他功能蛋白例如为激素、细胞因子、生长因子、凝血/凝结因子、酶、毒素、趋化因子、抗体、抗体片段和其他支架、荧光蛋白、转录因子、细胞受体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、B细胞受体、NK细胞受体、巨噬细胞受体、检查点抑制剂以及肽等；包含与蛋白、肽、小分子、药物等缀合的HcAb或HcAb的VH的HcAb缀合物；包含与其他有机物质缀合的HcAb或HcAb的VH的颗粒或纳米颗粒；以及包含HcAb、HcAb的VH结构域或其融合蛋白的基因治疗载体构建体。
本文还提供了通过本文所述方法产生的HcAb、从本文所述经基因修饰的非人动物分离的HcAb、HcAb的衍生物(诸如融合蛋白和抗原结合片段)以及用于执行本文所述的任何一种方法的组合物、试剂盒和制品。HcAb及其衍生物可用于多种应用，包括用作治疗人疾病和病症的治疗剂。
单克隆HcAb
单克隆抗体指得自基本上同质的抗体的群体，即除了可以微量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体相同。例如，单克隆抗体可使用首次由Kohler等人，Nature，256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，将如上所述将小鼠或其它合适的宿主动物(诸如仓鼠)免疫以诱发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。另选地，淋巴细胞可在体外免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice，第59-103页(Academic Press，1986)。
免疫试剂将通常包括抗原蛋白或其融合变体。一般来讲，如果需要人源细胞，则使用周围血液淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，AcademicPress(1986)，第59-103页。
无限增殖化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，具体地讲啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将如此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，所述培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这是方式HGPRT缺陷型细胞生长的物质。
优选的无限增殖化骨髓瘤细胞是有效融合，通过所选抗体生成细胞支持抗体的稳定、高水平产生，并且对培养基(诸如HAT培养基)敏感的那些细胞。其中，优选的是鼠骨髓瘤系，诸如来源于购自Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego，Calif.USA)的MOPC-21和MPC-11小鼠中路的那些，和购自American Type Culture Collection(Manassas，Va.USA.)的SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
对于针对抗原的单克隆抗体的产生，测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。优选，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合确定，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。
可对于针对期望抗原的单克隆抗体的存在来测定培养杂交瘤细胞的培养基。优选，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定来确定，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联测定(ELISA)来确定。此类技术和测定法是本领域已知的。例如，可通过Munson等人，Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定产生具有期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆体可通过限制性稀释程序亚克隆并通过标准方法生长(Goding，同上)。用于该目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可作为哺乳动物的肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如琼脂糖蛋白质A、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，将由亚克隆体分泌的单克隆抗体适当地与培养基、腹水或血清分离。
还在此提供了从本文所述经基因修饰的非人动物分离的B细胞，以及基于该B细胞产生的杂交瘤。
单克隆抗体还可通过重组DNA法，诸如描述于美国专利4,816,567中并如上所述的那些来制备。编码单克隆抗体的DNA容易使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和测序。杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到不产生免疫球蛋白的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5:256-262(1993)和Pliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
为了使一些分泌性蛋白大量表达和分泌，可能需要来自异源蛋白的前导序列。在一些实施方案中，采用异源前导序列可为有利的，因为当在分泌过程中在ER中去除前导序列时，所得的成熟多肽可保持不变。可能需要添加异源前导序列，才能表达和分泌一些蛋白。
某些示例性前导序列例如在新加坡国立大学生物化学系(Department ofBiochemistry,National University of Singapore)维护的在线前导序列数据库中有所描述。参见Choo等人，BMC Bioinformatics,6:249(2005)；以及PCT公布WO 2006/081430。
嵌合HcAb
在一些实施方案中，制备了基于经基因修饰的非人动物所产生的HcAb的嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利4,816,567；以及Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中有所描述。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠或兔的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类或亚类已从亲本抗体发生改变。嵌合抗体包含其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区为选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人IgG恒定区。可能希望针对Fc效应子功能来修饰来自经基因修饰的非人动物的HcAb，例如，以便修改(例如，增强或消除)抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，降低或消除了HcAb的Fc效应子功能。在一些实施方案中，当效应子功能是期望的时，产生包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的嵌合抗体。在一些实施方案中，当效应子功能不是期望的时，产生包含人IgG4或IgG2重链恒定区的嵌合抗体。
人源化HcAb
在一些实施方案中，制备了基于经基因修饰的非人动物所产生的HcAb的人源化抗体。人源化抗体可用作治疗分子，因为人源化抗体可减少或消除对非人抗体的人免疫应答(诸如人抗小鼠抗体(HAMA)应答)，这些非人抗体可引起对抗体治疗剂的免疫应答，并降低该治疗剂的疗效。
在一些实施方案中，从经基因修饰的非人动物产生的HcAb被人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般来讲，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)来源于HcAb，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被置换为来自非人抗体(例如，作为HVR残基来源的抗体)的对应残基，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如在Almagro和Fransson，(2008)Front.Biosci.13:1619-1633中有所综述，并且例如在以下文献中进一步描述：Riechmann等人，(1988)Nature332:323-329；Queen等人，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，(2005)Methods 36:25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述“表面再塑”)；Dall′Acqua等人，(2005)Methods 36:43-60(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，(2005)Methods36:61-68及Klimka等人，(2000)Br.J.Cancer,83:252-260(描述FR改组的“导向选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，(1993)J.Immunol.151:2296)；来源于特定轻链或重链可变区亚群的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；以及Presta等人，(1993)J.Immunol,151:2623)；人成熟(体细胞突变)框架区或人生殖系框架区(参见例如Almagro和Fransson，(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人，(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684及Rosok等人，(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。
抗体片段
在一些实施方案中，制备了基于由经基因修饰的非人动物所产生的HcAb的抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段，诸如抗原结合片段而不是完整抗体是有利的。较小的片段尺寸允许快速清除，并且可导致对实体肿瘤的改善的访问。
已开发各种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段来源于完整抗体的蛋白水解消化(参见，例如，Morimoto等人，j Biochem Biophys.Method.24:107-117(1992)；和Brennan等人，science 229：81(1985))。然而，这些片段现在可直接由重组宿主细胞产生。
双特异性抗体和多特异性抗体
双特异性抗体(BsAb)是对至少两种不同表位，包括在相同或另一种蛋白质上的那些表位具有结合特异性的抗体。另选地，一个臂可结合靶抗原，并且另一个臂可与结合白细胞上的触发分子(诸如，T细胞受体分子(例如，CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγR1(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的臂组合，以便将细胞防御机制融合并定位到靶抗原表达细胞上。双特异性抗体也可用于将细胞毒性试剂定位到表达靶抗原的细胞。此类抗体具有结合期望的抗原的一个臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素、抗-干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的另一个臂。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，包括化学连接和重组方法。例如，在一种方法中，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链的至少一部分、CH2和CH3区。可将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA插入到表达载体中，并且在合适的宿主生物体中表达。
根据描述于WO 96/27011或美国专利5,731,168中的另一种方法，抗体分子对之间的界面可工程化以最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似尺寸的补偿“腔体”。这提供了比其它不希望的最终产物诸如同源二聚体增加的异源二聚体收率的机制。
还描述了用于由重组细胞培养物直接制备和分离二价抗体片段的各种技术。例如，使用亮氨酸拉链产生二价异二聚体。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同源二聚体在铰链区处还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异源二聚体。在一些实施方案中，来自不同HcAb的两个VH结构域彼此发生基因融合以提供双特异性抗体。
设想了具有超过两种化合价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)。
HcAb缀合物
在一些实施方案中，从经基因修饰的非人动物分离的HcAb缀合到标签和/或细胞毒性剂。如本文所用，标签是有利于抗体的检测和/或有利于与抗体结合的分子的检测的部分。非限制性示例性标签包括但不限于放射性同位素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素、表位标签、金属结合标签等。本领域技术人员可根据预期应用来选择合适的标签。
如本文所用，细胞毒性剂是降低一个或多个细胞的增殖能力的部分。当例如因为细胞经历细胞凋亡或以其他方式死亡，细胞无法继续通过细胞周期和/或无法分裂，细胞分化等而致使细胞增殖的能力变弱时，该细胞便具有降低的增殖能力。非限制性示例性细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素、毒素和化学治疗剂。本领域技术人员可根据预期应用来选择合适的细胞毒素。
在一些实施方案中，在体外使用化学方法将标签和/或细胞毒性剂缀合到抗体。非限制性示例性化学缀合方法是本领域已知的，并且包括可从例如Thermo Scientific LifeScience Research Produces(前身是Pierce；Rockford,Ill.)、Prozyme(Hayward,Calif.)、SACRI Antibody Services(Calgary,Canada)、AbD Serotec(Raleigh,N.C.)等商购获得的服务、方法和/或试剂。在一些实施方案中，当标签和/或细胞毒性剂是多肽时，标签和/或细胞毒性剂可与至少一个抗体链一起从同一表达载体表达以产生包含与抗体链融合的标签和/或细胞毒性剂的多肽。本领域技术人员可根据预期应用来选择适用于将标签和/或细胞毒性剂缀合到抗体的方法。
其他氨基酸序列修饰
在一些实施方案中，设想了对从经基因修饰的非人动物分离的HcAb的氨基酸序列进行的修饰。例如，期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或置换。为了得到最终构建体，可进行缺失、插入和置换的任何组合，只要最终构建体具有期望的特征即可。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置。
用于鉴定作为诱变的优选位置的抗体特定残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells in Science,244:1081-1085(1989)所述的。在此，鉴定靶残基的残基或组(例如带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)代替，以影响氨基酸抗原的相互作用。然后，通过在置换位点处或对置换位点引入另外的或其它变体来改善展示出对置换的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，尽管预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点处突变的性能，在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并针对期望的活性筛选表达的抗体变体。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，其长度范围从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶(例如ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
另一种类型的变体是氨基酸置换变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。对于置换诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也设想了FR改变。
实施例
以下实施例旨在仅对本发明进行举例说明并且因此不应被视为以任何方式限制本发明。以下实施例作为说明且不作为限制来提供。
实施例1：由经基因修饰的小鼠产生仅重链抗体
使用CRISPR/Cas9基因编辑技术产生示例性经基因修饰的小鼠，这些小鼠缺失了内源IgH基因座处编码Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的7.2kb内源基因片段。经基因修饰的小鼠可存活、能育且具有正常B细胞发育。经基因修饰的小鼠对抗原激发作出应答而唯一产生HcAb。
细胞中CRISPR/Cas9介导的小鼠基因组中的大片段缺失
鼠免疫球蛋白重链(IgH)基因座由八个不同恒定(C)基因组成，除了Cδ之外，这些基因中的大多数都包含细胞因子诱导型启动子以及高度重复转换(S)区。这些恒定基因定位在重链可变区和D J区的下游。通过CRISPR/Cas9介导的基因组缺失(例如，图1)对IgG基因座进行工程改造。体系首先被设计为靶向小鼠IgH基因座的IgG恒定区，然后选择紧接在Cγ恒定区的CH1外显子的上游且在IgG2c的CH1外显子的下游的侧翼CRISPR/Cas9靶向序列。在选择酿脓链球菌Cas9的前间区序列邻近基序(PAM,5′-NGG(SEQ ID NO:26))和候选gRNA之后，将gRNA克隆进载体pX330以生成pX330-gRNA，其指导Cas9和gRNA在哺乳动物细胞中的表达。
用pX330-gRNA转染小鼠neuro2A细胞，然后在转染后48小时收集经转染的neuro2A细胞。使用T7E1测定法测量每个gRNA在Cas9靶向过程中的效率，该测定法定性地测量因通过非同源末端连接(NHEJ)的修复而发生的双链断裂(DSB)产生频率。如图2所示，发现所测试的gRNA位点具有不同程度的Cas9切割效率。为了开展靶向WT细胞的免疫球蛋白基因座的后续实验，基于其高活性，选择了一对gRNA：靶向IgG3的CH1外显子上游的内含子的一个gRNA，以及靶向IgG2c的CH1外显子下游的一个gRNA。
将所选择的一对pX330-gRNA共转染到neuro2A细胞中。使用被设计为位于缺失区域侧翼的引物来执行基因组巢式PCR。预期PCR产物的大小证实，在小鼠细胞中，所选择的一对Cas9/gRNA有效地使小鼠IgH基因座的IgG3、IgG1、IgG2b的恒定区及IgG2c的CH1外显子(为72.7kb长)缺失。
通过Cas9/gRNA有效生成IgH突变型小鼠
在小鼠细胞系中的Cas9介导的基因组编辑的体外分析之后，评估所选择的一对Cas9/gRNA在生成突变型小鼠时的效率和特异性。将Cas9 mRNA与所选择的一对sgRNA一起注射到1-细胞小鼠胚胎中，所述所选择的一对sgRNA靶向IgG3的CH1外显子上游的第一内含子以及IgG2c基因组DNA的CH1外显子下游的紧邻内含子(即，跨越72.7kb的区域)。
如图3所示，在44只F0幼崽之中，通过PCR基因分型及后续的测序证实了25只首建者，编辑效率为56.8％。经基因分型得出，在这25只首建者小鼠中，有13只小鼠具有双等位基因缺失并且12只小鼠具有单等位基因缺失。
为了通过桑格测序验证CRISPR编辑结果，通过TA克隆将来自25只经基因组修饰的小鼠的经凝胶纯化的巢式基因分型PCR产物克隆进pGEM-T Easy载体(Promega，目录号A1360)。送交质粒DNA以进行桑格测序，从而确定经编辑的小鼠中的DNA序列。表1中示出了小鼠的序列。测序结果表明，在所有25只首建者中，该对sgRNA的靶位点之间的区域(其跨越约72.7kb)发生缺失。
表1来自25只经基因组修饰的小鼠的基因分型PCR产物(图3)的桑格测序结果证实缺失了72.7kb IgH基因片段。
Figure BDA0002049144380000391
Figure BDA0002049144380000401
Figure BDA0002049144380000411
Figure BDA0002049144380000421
IgH突变型小鼠中的仅重链IgG产生
通过尾静脉采血来收集IgH突变型小鼠的血清。使用HRP缀合的山羊抗IgG亚类2c特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号115-035-208)，通过免疫印迹分析来检测重链IgG的存在。
如图4所示，在10周龄IgH突变型小鼠的血浆中检测到分子量减小的可溶性仅重链IgG蛋白。这些数据表明，恒定区的所有CH1结构域发生缺失使得免疫球蛋白重链能够在不存在轻链的情况下分泌。此外，重链自身足以支持IgH突变型小鼠的B细胞发育和成熟。这些IgG基因座修饰的小鼠允许有效产生抗原特异性IgG仅重链抗体以用于生物医学研究和治疗应用。
IgH突变型小鼠具有正常B细胞发育
通过流式细胞术分析来评估经基因修饰的小鼠的B细胞发育。使用B细胞标记CD19和血浆细胞标记CD138来分析来自经基因修饰的小鼠的脾和骨髓的细胞样品。如图5所示，在脾和骨髓样品中均检测到表达仅重链IgG2c分子的B细胞，这表明经基因修饰的动物中的B细胞和血浆细胞正常增殖、分化和成熟。
对抗原激发的强免疫应答以及抗免疫检查点分子的高亲和力仅重链抗体的产生
在第1天使用重组人PD-1和过表达全长人PD-1的HEK293T细胞连同佐剂一起免疫经基因修饰的小鼠，然后在第14天、第21天和第28天加强免疫。在首次免疫之后的14、21和31天采集血清样品。使用BLI技术(OctetRed 96)和生物素酰化人PD-1包被的链霉亲和素传感器(ForteBio)来确定免疫动物中的PD-1特异性仅重链抗体的效价和亲和力。如图6A至图6D所示，在首次免疫后的14天生成了抗人PD-1的极高亲和力仅重链抗体(图6A，Kd＝1.33nM)。这些抗体的亲和力在第21天继续增加到50pmol(图6B)并且在第31天<1pmol(图6C)。图6D示出了阳性对照-抗人PD-1的多克隆抗体(AF1086,R&D Systems)的动力学分析。
讨论
本实施例中描述的经基因组修饰的小鼠产生了仅重链抗体，这些仅重链抗体在开发治疗性抗体、嵌合抗原受体(CAR)以及免疫细胞疗法所用的T细胞受体样(TCR-L)结合子方面具有巨大的应用潜力。Cas9 mRNA和一对优化的gRNA向1-细胞期受精卵母细胞中的细胞质注射生成了内源IgH基因座修饰的小鼠。在这些示例性小鼠中，敲除了所有IgG恒定区外显子，但IgH基因座中的IgG2c CH2 CH3及IgM IgD IgA和IgE基因座除外。这些小鼠在免疫激发后生成了IgG2c仅重链抗体(HcAb)。
除了常规抗体之外，骆驼科(单峰驼、骆驼和美洲驼)和一些鱼类(诸如鲨鱼)还天然产生仅重链抗体(HcAb)。之所以产生这些缺少CH1结构域的HcAb，是因为CH1剪接位点中存在突变，从而导致IgG mRNA中剪切掉CH1外显子。缺少功能性轻链基因的小鼠分泌HcAb，但B细胞发育会受到影响。先前已生成具有经工程改造的缺少功能性CH1的骆驼科或人IgH转基因片段的转基因小鼠以在小鼠中产生HcAb。然而，这些转基因动物具有以下缺点：1)由于IgM或Ig L链基因座缺失而使B细胞发育受到影响；2)VH组库有限；和/或3)常规IgG和HcAb混合在一起。
本实施例中描述的经基因修饰的小鼠克服了所有这些限制，因此允许以最高丰度在体内生成亲和力成熟的、纯的仅重链IgG并且允许使用完全的小鼠内源VH组库。本文所述经基因修饰的小鼠的优点包括但不限于：
1。IgG同种型IgG1、IgG3、IgG2b的全部恒定区外显子以及IgG2c的CH1外显子(跨越小鼠IgH基因座的72.7kb区域)在这些小鼠中发生基因缺失，从而留下具有CH2和CH3完整外显子的IgG2c。这些小鼠仅仅生成亲和力成熟的仅重链IgG，没有常规IgG的任何污染。
2。本文所述的经基因修饰的小鼠具有正常B淋巴细胞发育和成熟、正常V-D-J重组、正常经典转换重组(CSR)以及正常体细胞超突变。在这些小鼠中，仅在IgG基因座的恒定区中进行基因组修饰，而所有其他区域(包括完全IgVH组库、小鼠D和J区、IgM、IgD、IgA、IgE的所有恒定结构域外显子、以及L链基因座和小鼠IgH调控基因组序列)都保持完整。
3。本文所述的经基因修饰的小鼠表达小鼠重链可变结构域的完全组库。由于IgHV基因座所含的功能性V基因是整个人IgH V基因座的2.5倍(110对44)，因此本文所述的小鼠能够生成比任何其他人IgH转基因小鼠更加多样化的抗体组库。
实施例2：用于产生仅重链抗体的经基因修饰的大鼠
使用CRISPR/Cas9基因编辑技术产生示例性经基因修饰的大鼠，这些大鼠缺失了内源IgH基因座处编码Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的140kb内源基因片段。经基因修饰的大鼠可存活、能育且具有正常B细胞发育。经基因修饰的大鼠对抗原激发作出应答而唯一产生HcAb。
细胞中CRISPR/Cas9介导的大鼠基因组中的大片段缺失
使用CRISPR/Cas9介导的基因组缺失(例如，图7)对大鼠基因组中的IgG基因座进行工程改造。体系首先被设计为靶向大鼠IgH基因座的IgG恒定区，然后选择紧接在Cγ2c恒定区的CH1外显子的上游且在IgG2b的CH1外显子的下游的侧翼CRISPR/Cas9靶向序列。在选择酿脓链球菌Cas9的前间区序列邻近基序(PAM,5′-NGG(SEQ ID NO:26))和候选gRNA之后，将gRNA克隆进载体pX330以生成pX330-gRNA，其指导Cas9和gRNA在大鼠细胞中的表达。
大鼠免疫球蛋白重链(IgH)基因座由八个不同恒定(C)基因组成，除了Cδ之外，这些基因中的大多数都包含细胞因子诱导型启动子以及高度重复转换(S)区。这些恒定基因定位在重链可变区和D J区的下游。用pX330-gRNA转染大鼠成纤维细胞，然后在转染后48小时收集经转染的成纤维细胞。使用T7E1测定法测量每个gRNA在Cas9靶向过程中的效率，该测定法定性地测量因通过非同源末端连接(NHEJ)的修复而发生的双链断裂(DSB)产生频率。发现所测试的gRNA位点具有不同程度的Cas9切割效率。为了开展靶向WT细胞的免疫球蛋白基因座的后续实验，基于其高活性，选择了一对gRNA：靶向Cγ2c的CH1外显子上游的内含子的一个gRNA，以及靶向Cγ2b的CH1外显子下游的一个gRNA。
将所选择的一对pX330-gRNA共转染到大鼠成纤维细胞中。使用被设计为位于缺失区域侧翼的引物来执行基因组巢式PCR。预期PCR产物的大小证实，在大鼠细胞中，所选择的一对Cas9/gRNA有效地使大鼠IgH基因座的Cγ2c、Cγ2a Cγ1的恒定区及Cγ2c的CH1外显子(为140kb长)缺失。
通过Cas9/gRNA有效生成IgH突变型大鼠
在大鼠细胞系中的Cas9介导的基因组编辑的体外分析之后，评估所选择的一对Cas9/gRNA在生成突变型大鼠时的效率和特异性。将Cas9 mRNA与所选择的一对sgRNA一起注射到1-细胞大鼠胚胎中，所述所选择的一对sgRNA靶向Cγ2c的CH1外显子上游的第一内含子以及Cγ2b基因组DNA的CH1外显子下游的紧邻内含子(即，跨越140kb的区域)。
使用PCR对F0幼崽进行基因分型，并且通过PCR基因分型及后续的桑格测序来证实预期有140kb缺失的首建者。
实施例3：用于产生仅重链抗体的经基因修饰的兔
使用CRISPR/Cas9基因编辑技术产生示例性经基因修饰的兔，这些兔缺失了内源IgH基因座处Cγ的CH1外显子(登录号：AY386696；核苷酸55580-555868)。经基因修饰的兔可存活、能育且具有正常B细胞发育。经基因修饰的兔对抗原激发作出应答而唯一产生HcAb。
细胞中CRISPR/Cas9介导的兔基因组中的大片段缺失
兔免疫球蛋白重链(IgH)基因座由17个不同恒定(C)基因组成，包括Cμ、Cε、13Cα，但只有一个Cγ。这些恒定基因定位在重链可变区和D J区的下游。通过CRISPR/Cas9介导的基因组缺失(例如，图8)对Cγ基因座进行工程改造。体系首先被设计为靶向兔IgH基因座的Cγ恒定区，然后选择紧接在Cγ恒定区的CH1外显子的上游且在Cγ的CH1外显子的下游的侧翼CRISPR/Cas9靶向序列。在选择前间区序列邻近基序和候选gRNA之后，将gRNA克隆进载体pX330以生成pX330-gRNA，其指导Cas9和gRNA在兔细胞中的表达。
用pX330-gRNA转染兔成纤维细胞，然后在转染后48小时收集经转染的成纤维细胞。使用T7E1测定法测量每个gRNA在Cas9靶向过程中的效率，该测定法定性地测量因通过非同源末端连接(NHEJ)的修复而发生的双链断裂(DSB)产生频率。发现所测试的gRNA位点具有不同程度的Cas9切割效率。为了开展靶向WT细胞的免疫球蛋白基因座的后续实验，基于其高活性，选择了一对gRNA：靶向Cγ的CH1外显子上游的内含子的一个gRNA，以及靶向Cγ的CH1外显子下游的一个gRNA。
将所选择的一对pX330-gRNA共转染到兔成纤维细胞中。使用被设计为位于缺失区域侧翼的引物来执行基因组巢式PCR。预期PCR产物的大小证实，在兔细胞中，所选择的一对Cas9/gRNA有效地使兔IgH基因座的Cγ的CH1外显子缺失。
通过Cas9/gRNA有效生成IgH突变型兔
在兔细胞系中的Cas9介导的基因组编辑的体外分析之后，评估所选择的一对Cas9/gRNA在生成突变型兔时的效率和特异性。将Cas9 mRNA与所选择的一对sgRNA一起注射到1-细胞兔胚胎中，所述所选择的一对sgRNA靶向Cγ的CH1外显子上游的第一内含子以及Cγ基因组DNA的CH1外显子(约288个核苷酸)下游的紧邻内含子。
使用PCR对F0幼崽进行基因分型，并且通过PCR基因分型及后续的桑格测序来证实预期有CH1外显子缺失的首建者。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文。
序列表
<110> 安健基因公司
崔立斌
孙晓林
<120> 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
<130> 786192000140
<140> 尚未受让
<141> 与本申请同时提交
<150> US 62/417,581
<151> 2016-11-04
<160> 28
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctctgtaga accctggcat 60
ccttgtagga ccaaggctga actcctccag gtgcctgaat ccagctgtct gataacctca 120
ctctaaggcc ttagcctagc tagaccagcc aggatcagca gccatcacca ggaaagggaa 180
cttagcccag aagagaagga gatactgcct ctgactccct ct 222
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> n = A、T、C或G
<400> 2
gctatatgat gccctgncct aggtgatgta tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtagga ataatcactt agttagccta gctagaccag ccaggatcag cagccatcac 120
caggaaaggg aacttagccc agaagagaag gagatactgc ctctgactcc ctct 174
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<223> n = A、T、C或G
<400> 3
atatgatgcc ctgacctagg tgatatatcc tacatgctct ttgcagaacc ctggcatccn 60
tgnaggatct gaggccttag actagctaga ccagccagga tcagcagcca tcatcaggaa 120
agggaactta tccccgagga aaaggaaatg ccgcctcnga ctccct 166
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 28
<223> n = A、T、C或G
<400> 4
tgctatatga tgccctgacc taggtganat atcctacatg ctctttgcag aaccctggca 60
tccttgtagg agggctgaac tcctccaggt gcctgaatcc agctgtctga taacctcaca 120
aggccttagc ctagctagac cagccaggat cagcagccat caccaggaaa gggaacttag 180
cccagaagag aaggagatac tgcctctgac tccctct 217
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<212> DNA
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtagga tttaaagcca agctaagacc agagcctctc caaatttatg aggccacaga 120
tatcagaaac cctcacacat cctcctttct tgcagccaaa acaacagccc cntcggtcnn 180
tccactgnnc cctgtgtgtg gaggggcatc cccctcaatc atcataacnt 230
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<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
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<223> n = A、T、C或G
<400> 6
gctatatgat gcccngacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga acccntgttc 60
atcnaangat gttatcaaac agctggattc aggcacctgg aggagttcag cctagctaga 120
ccagccagga tcagcagcca tcaccaggaa agggaactta gcccagaaga gaaggagata 180
ctgcctctga ctccctct 198
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtagcc tagctagacc agccaggatc agcagccatc accaggaaag ggaacttagc 120
ccagaagaga aggagatact gcctctgact ccctct 156
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<212> DNA
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<223> n = A、T、C或G
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgttgac acgggttaat tctcttttaa ttataatagc actattttcc ttgcctctgc 120
tttcattgaa gtaaattaac accaatgctc aattcattct tactcccagg tcctttctgg 180
tctttccatc tctcctgtac actaccttcc acaatcccct gctcaaactc tgagagttac 240
cccaccactc ttctgtgggt caactcaggc tacttcatgc cctcatagga ggattcccct 300
cctgccttat atgctcccag ctgatcctcc aggtgcctga atccagctgt ctgataacct 360
cagaccagcc aggatcagca gccatcacca ngaaagggaa cttagcccag aagagaagga 420
gatactgcct ctgactccct ct 442
<210> 9
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
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140
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccntgaaagg ncttagccta gctagaccag ccaggatcag canannnnan nannaaaggg 120
aacttagccc aaaanagaan gagatactgc ctctgactcc ctct 164
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<220>
<223> 合成构建体
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggggc 60
tgttgttgta gctgcaagat aggaggatga gtgaggttat cagacagctg gattcaggca 120
cctggaggag ttcagcctag ctagaccagc caggatcagc agccatcacc aggaaaggga 180
acttagccca gaagagaagg agatactgcc tctgactccc tct 223
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtctag accagccagg atcagcagcc atcaccagga aagggaactt agcccagaag 120
agaaggagat actgcctctg actccctct 149
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<223> 合成构建体
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtaggc cttagcctag ctagaccagc caggatcagc agccatcacc aggaaaggga 120
acttagccca gaagagaagg agatactgcc tctgactccc tct 163
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctagcta 60
gaccagccag gatcagcagc catcaccagg aaagggaact tagcccagaa gagaaggaga 120
tactgcctct gactccctct 140
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<223> 合成构建体
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ctatatgatg ccctgaccta ggtgatatat cctacatgct ctttgcagaa ccctggcatc 60
cttgtaggat ctaaggcctt agcctagcta gaccagccag gatcagcagc catcaccaaa 120
aatgggaact tggcccagaa gagaaggaga tactgcctct gactccctct 170
<210> 15
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 65, 91, 93, 104, 110, 116, 127, 136, 138, 143, 154, 169,
181, 185
<223> n = A、T、C或G
<400> 15
gatgccctga cctaggtgat atatcctaca tgctctttgc agaaccctgg catccttgta 60
ggatngctag atcagccagg ataggcagag ncnccatcag agancgtcan cacccntggg 120
aacttgncca atggcngnag aanatactgc ctcngactcc gtcgaatcnc tggtgaactc 180
ncggnagcct gcccgtcgac catatgggag agctcc 216
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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tagcctagct agaccagcca ggatcagcag ccatcaccag gaaagggaac ttagcccaga 120
agagaaggag atactgcctc tgactccctc t 151
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
tatatgatgc cctgacctag gtgatatatc ctacatgctc tttgcagaac cctgaggtta 60
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<210> 18
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga acccttagcc 60
tagctagacc agccaggatc agcagccatc accaggaaag ggaacttagc ccagaagaga 120
aggagatact gcctctgact ccctct 146
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<220>
<223> 合成构建体
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ccttgtagcc tagctagacc agccaggatc agcagccatc accaggaaag ggaacttagc 120
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<220>
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agaagagaag gagatactgc ctctgactcc ctct 154
<210> 21
<211> 154
<212> DNA
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gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttagccta gctagaccag ccaggatcag cagccatcac caggaaaggg aacttagccc 120
agaagagaag gagatactgc ctctgactcc ctct 154
<210> 22
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n = A、T、C或G
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aactctannn cttaggggan agggatcaga atctgcaggg gagctggaac aggtaaagat 60
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accccaggag gtaaccccaa cagggatgtc tgggagctca ggtcagactt gcatcaaaag 180
cacaggggaa ggataggtgg tagaagggtt ccaatccatc ctgctagacc agccaggatc 240
agcagccaac accaggaaag ggaacttagc ccagaagaga aggagatact gcctctgact 300
ccctct 306
<210> 23
<211> 171
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 27
<223> n = A、T、C或G
<400> 23
gctatatgat gccctgacct aggtganata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtagga tctaaggcct tagcctagct agaccagcca ggatcagcag ccatcaccag 120
gaaagggaac ttagcccaga agagaaggag atactgcctc tgactccctc t 171
<210> 24
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtaggc ctagctagac cagccaggat cagcagccat caccaggaaa gggaacttag 120
cccagaagag aaggagatac tgcctctgac tccctct 157
<210> 25
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
gctatatgat gccctgacct aggtgatata tcctacatgc tctttgcaga accctggcat 60
ccttgtagga tctaaggcct tagcctagct agaccagcca ggatcagcag ccatcaccag 120
gaaagggaac ttagcccaga agagaaggag atactgcctc tgactccctc t 171
<210> 26
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> n = A、T、C或G
<400> 26
ngg 3
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
tatcctacat gctctttgca gaac 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
agaccagcca ggatcagcag ccat 24

Claims (32)

1.一种产生特异性结合目标抗原的仅重链抗体(HcAb)的方法，包括：
(a)免疫一种经基因修饰的非人动物，所述经基因修饰的非人动物包含在内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中所述经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段；其中所述经基因修饰的非人动物是小鼠，和其中所述经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段；和
(b)从所述免疫的经基因修饰的非人动物获得特异性结合所述抗原的HcAb，从而产生所述HcAb。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经基因修饰的非人动物不表达包含轻链的IgG分子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因不包含重排基因。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的非人动物对于所述经工程改造的IgH等位基因是纯合的。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因不包含编码不同物种的重链可变区的外源基因片段。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因不是包含来自不同物种的编码重链可变区基因片段的嵌合IgH构建体。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因不包含人V、D或J基因。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因不包含骆驼科V、D或J基因。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因不包含外源序列。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因包含完全功能性Cμ基因。
11.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的非人动物表达野生型IgM、IgD、IgA和IgE蛋白。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述内源基因片段为约72.7kb长。
13.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因包含不超过250个核苷酸长的核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:27和SEQID NO:28。
14.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的IgH等位基因包含选自SEQ ID NO:1-25的核苷酸序列。
15.一种产生特异性结合目标抗原的仅重链抗体(HcAb)的方法，包括：
(a)免疫一种经基因修饰的非人动物，所述经基因修饰的非人动物包含在内源IgH基因座处具有经工程改造的IgH等位基因的生殖系基因组，其中所述经工程改造的IgH等位基因缺少编码所有内源IgG亚类的CH1结构域的功能性内源基因片段；其中所述经基因修饰的非人动物是大鼠，和其中所述经工程改造的IgH等位基因缺少包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段；和
(b)从所述免疫的经基因修饰的非人动物获得特异性结合所述抗原的HcAb，从而产生所述HcAb。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述经基因修饰的非人动物是能育的。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的非人动物具有基本上正常的B细胞发育和成熟。
18.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：
(i)获得包含编码所述HcAb的所述重链的核酸的细胞；
(ii)从所述细胞获得所述核酸；以及
(iii)在宿主细胞中表达所述核酸以提供所述HcAb。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括基于所述HcAb的CDR序列来产生嵌合HcAb。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括所述HcAb的亲和力成熟。
21.一种产生能够生成仅重链抗体(HcAb)的经基因修饰的非人动物的方法，所述方法包括从非人动物的生殖系基因组中的内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座中删除包含Cγ3、Cγ1、Cγ2b及Cγ2c的CH1外显子的内源基因片段，其中所述非人动物是小鼠，从而提供所述经基因修饰的非人动物。
22.一种产生能够产生仅重链抗体(HcAb)的基因修饰的非人动物的方法，包括从非人动物的生殖系基因组中的内源免疫球蛋白重链(IgH)基因座中删除包含Cγ2c、Cγ2a、Cγ1及Cγ2b的CH1外显子的内源基因片段，其中所述非人动物是大鼠，从而提供所述经基因修饰的非人动物。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，包括将一个或多个突变引入到非人动物的1-细胞胚胎中的所述内源IgH基因座；将所述胚胎植入代孕动物体内；以及使所述代孕动物繁殖以产生所述经基因修饰的非人动物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中通过CRISPR/Cas9基因组编辑将一个或多个突变引入到所述内源IgH基因座。
25.根据权利要求24所述的方法，包括将编码Cas 9的mRNA、靶向所述内源IgH基因座中的第一Cγ基因的所述CH1外显子上游的第一内含子的第一sgRNA以及靶向所述内源IgH基因座中的最后一个Cγ基因的所述CH1外显子下游的第一内含子的第二sgRNA注射到非人动物的1-细胞胚胎中；将所述胚胎植入代孕动物体内；以及使所述代孕动物繁殖以产生所述经基因修饰的非人动物。
26.一种仅重链抗体(HcAb)，所述仅重链抗体通过根据权利要求1-20中任一项所述的方法产生。
27.一种仅重链抗体(HcAb)，所述仅重链抗体分离自根据权利要求1-20中任一项所述的经基因修饰的非人动物。
28.根据权利要求26或27所述的HcAb，其中所述HcAb为单克隆的。
29.根据权利要求26或27所述的HcAb，其中所述HcAb为多克隆的。
30.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含根据权利要求26-29中任一项所述的HcAb，或所述HcAb的抗原结合片段。
31.一种B细胞，所述B细胞分离自根据权利要求1-20中任一项所述的经基因修饰的非人动物。
32.一种杂交瘤，所述杂交瘤基于根据权利要求31所述的B细胞来产生。
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