CN117587070B - 一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用 - Google Patents

一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117587070B
CN117587070B CN202410082783.6A CN202410082783A CN117587070B CN 117587070 B CN117587070 B CN 117587070B CN 202410082783 A CN202410082783 A CN 202410082783A CN 117587070 B CN117587070 B CN 117587070B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
sgrna
mouse
mice
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202410082783.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117587070A (zh
Inventor
王皓毅
杜小明
高晖
朱萍霞
仵毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Lingfu Biotechnology Co ltd
Beijing Renyuan Xinsheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Lingfu Biotechnology Co ltd
Beijing Renyuan Xinsheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Lingfu Biotechnology Co ltd, Beijing Renyuan Xinsheng Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Lingfu Biotechnology Co ltd
Priority to CN202410082783.6A priority Critical patent/CN117587070B/zh
Publication of CN117587070A publication Critical patent/CN117587070A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117587070B publication Critical patent/CN117587070B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knockout animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本发明提供了一种用于生产人源化抗体的经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用。所述制备方法包括：（1）对非人哺乳动物进行内源重链免疫球蛋白基因座的破坏；（2）向步骤（1）所得非人哺乳动物中导入人源IGHV基因、人源IGHD基因、人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区。根据本发明的制备方法所制备的非人哺乳动物经抗原免疫后能够高效地产生人源化全抗体或单重链抗体或纳米抗体，具有较高的免疫效价，并且，本发明的制备方法能以较高的效率获得阳性动物，从而可以很容易制备不同抗体多样性的人源化小鼠，用多种品系小鼠实现纳米抗体序列多样性。

Description

一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用。
背景技术
在骆驼科动物和鲨鱼的体内会产生一种结构独特的抗体——单重链抗体(Heavy-chain-only)，这种抗体只由重链构成，其可变区片段分子量（15kDa）约为传统抗体(150-160kDa)的十分之一。单重链抗体的可变区片段也被称为纳米抗体（Nanobody）。纳米抗体在双特异性/多特异抗体开发、CAR- T细胞疗法等已获得了广泛应用，截至2023年1月，已经有4款基于纳米抗体的治疗药物上市，其中传奇生物开发的基于纳米抗体的BCMA CAR-T疗法获得了优秀的临床效果。此外，作为中和抗体开发的纳米抗体已有超过10个分子进入临床II/III期。纳米抗体的药物研发和应用依然处在比较早期的阶段，具有巨大的应用潜力和发展前景。
全人纳米抗体小鼠是用于纳米抗体药物开发的全人纳米抗体小鼠，基于自主研发的百KB至兆B(mega base pair,简称兆B)级别基因组片段人源化技术，实现了抗体重链基因的人源化，涵盖了人类主要重链可变区基因。使用HuNano Mouse可针对重大疾病直接筛选治疗用的全人纳米抗体、双功能抗体及CAR-T用等抗体基因序列。其产生的全人纳米抗体序列无需再经过体外人源化改造即可用于药物开发，节省了大量的时间和费用，更降低了后续药物开发的风险。使用全人纳米抗体小鼠已经成为了开发治疗性纳米抗体药物发展的必然趋势。
大片段(百Kb以上)基因人源化动物模型制备常用的技术有染色体工程、RMCE(recombinase-mediated cassette exchange)和单BAC转基因。染色体工程技术门槛高，研发周期长达5年左右，且依赖受体物种的胚胎干细胞，使用仅限于能够分离高效胚胎干细胞的物种，比如小鼠。RMCE技术每次重组到基因组上目的片段大小为200kb左右，如果要完成兆B级别的基因修饰，至少需要对胚胎干细胞进行5~6次基因重组，构建完成动物模型需要花费5年左右的时间。单BAC转基因的片段大小受BAC大小制约，一般单次转入基因为200kb，不能实现兆B基因转入。
此外，全人纳米抗体小鼠的免疫效价普遍比野生小鼠免疫效价低，这也意味着筛选到的抗体序列多样性少。
因此，如何提高全人纳米抗体小鼠的免疫效价并提高所产生抗体的多样性是本领域急需解决的技术问题。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够高效生产人源化抗体（包括全抗体、单重链抗体和纳米抗体）的、经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法，基于由该制备方法所产生的非人哺乳动物制备与抗原特异性结合的人源化抗体的方法，以及获得生物样品的方法。
根据本发明的经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法采用MBGE导入系统，可在短时间内（例如六个月内）制备出兆B级别基因组片段人源化的全人纳米抗体生产小鼠，并且单次注射获得阳性小鼠效率高达15%左右，从而可以很容易制备不同抗体多样性的人源化小鼠（例如，用多种品系小鼠提高纳米抗体序列多样性）；并且，所制备的非人哺乳动物具有很高的免疫效价，能够高效生产人源化抗体（包括全抗体、单重链抗体和纳米抗体）。
解决方案：为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种经遗传修饰的非人哺乳动物，所述非人哺乳动物包含在其内源重链免疫球蛋白基因座的破坏。
在一些优选的实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，其内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
在另一些优选的实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，其内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
如上所述经遗传修饰的非人哺乳动物可作为背景动物，通过向其导入适当的人源抗体基因，可以制备能够生产人源抗体的非人哺乳动物。
第二方面，本发明提供了如上第一方面所述经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
对非人哺乳动物进行内源重链免疫球蛋白基因座的破坏。
作为优选，所述非人哺乳动物为小鼠。
在一些优选的具体实施方案中，所述内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
进一步优选地，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，使得所述基因片段缺失；
其中，用于缺失小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA包括如SEQID NO:3所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
在另一些优选的具体实施方案中，所述内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
进一步优选地，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，使得所述基因片段缺失；
其中，用于缺失小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
第三方面，本发明提供了一种经遗传修饰的非人哺乳动物，所述非人哺乳动物包含在其内源重链免疫球蛋白基因座的破坏，并且，所述非人哺乳动物的内源重链免疫球蛋白基因座中包含人源IGHV基因、人源IGHD基因、人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区。
在一些优选的实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，其内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
在另一些优选的实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，其内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
在可行的实施方案中，所述人源IGHV基因至少包括以下18种人源IGHV基因：
hIGHV4-59、hIGHV3-53、hIGHV5-51、hIGHV3-49、hIGHV3-48、hIGHV1-46、hIGHV3-43、hIGHV4-39、hIGHV3-33、hIGHV4-30-2、hIGHV1-24、hIGHV3-23、hIGHV3-21、hIGHV3-11、hIGHV3-7、hIGHV4-4、hIGHV1-2、hIGHV6-1；
优选地，所述人源IGHV基因还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHV基因：hIGHV1-58、hIGHV1-45、hIGHV3-35、hIGHV4-28、hIGHV2-26、hIGHV3-20、hIGHV1-18、hIGHV3-15、hIGHV3-13、hIGHV5-10-1、hIGHV3-64D、hIGHV2-5、hIGHV7-4-1、hIGHV1-3；
进一步优选地，所述人源IGHV基因还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHV基因：hIGHV3-60、hIGHV3-57、hIGHV7-56、hIGHV4-55、hIGHV3-54、hIGHV3-52、hIGHV3-50、hIGHV3-47、hIGHV3-42、hIGHV3-41、hIGHV3-38、hIGHV3-37、hIGHV3-36、hIGHV7-34-1、hIGHV4-34、hIGHV3-33-2、hIGHV3-32、hIGHV3-30-2、hIGHV3-30、hIGHV3-29、hIGHV7-27、hIGHV3-25、hIGHV3-22、hIGHV3-19、hIGHV1-17、hIGHV3-16、hIGHV1-14、hIGHV1-12、hIGHV3-6。
在可行的实施方案中，所述人源IGHD基因至少包括以下15种人源IGHD基因：
IGHD1-1、IGHD3-3、IGHD6-6、IGHD1-7、IGHD3-10、IGHD6-13、IGHD1-14、IGHD2-15、IGHD3-16、IGHD5-18、IGHD6-19、IGHD1-20、IGHD3-22、IGHD1-26、IGHD7-27；
优选地，所述人源IGHD基因还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHD基因：IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD4-11、IGHD5-12、IGHD3-16、IGHD4-17、IGHD2-21、IGHD4-23、IGHD5-24、IGHD6-25；
进一步优选地，所述人源IGHD基因还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHD基因：IGHD3-3、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD5-18。
在可行的实施方案中，所述人源IGHJ基因为全部人源IGHJ基因；并且/或者，所述非人哺乳动物的内源IgHG2c基因为非人哺乳动物的内源完整IgHG2c基因，或者为缺失CH1结构域的内源IgHG2c基因区段。当所述非人哺乳动物的内源IgHG2c基因为非人哺乳动物的内源完整IgHG2c基因时，经抗原免疫后，其所产生的为人源化全抗体；当非人哺乳动物的内源IgHG2c基因为非人哺乳动物的缺失CH1结构域的内源IgHG2c基因区段时，经抗原免疫后，其所产生的为人源化单重链抗体。
作为优选，所述人源IGHV基因、人源IGHD基因和人源IGHJ基因之间可操作地连接并可进行VDJ重排；进一步优选地，可操作地连接和/或经过VDJ重排的所述人源IGHV基因、人源IGHD基因和人源IGHJ基因可操作地连接至非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区；
作为优选，在人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因之间存在人哺乳动物的内源IgHM的Switch区。
最优选地，所述非人哺乳动物的内源重链免疫球蛋白基因座中包含表13中所示的全部基因。
第四方面，本发明提供了如上第三方面所述经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）对非人哺乳动物进行内源重链免疫球蛋白基因座的破坏；
（2）向步骤（1）所得非人哺乳动物中导入人源IGHV基因、人源IGHD基因、人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区。
在可行的实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，并且步骤（1）所述内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段；
优选地，通过基因编辑技术如CRISPR-Cas9技术，使得如上所述基因片段缺失；
进一步优选地，用于缺失小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段的sgRNA包括如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
在另一些可行的实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，并且步骤（1）所述内源重链免疫球蛋白基因座的破坏包括以下基因片段的缺失：
小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段、小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段；
优选地，通过基因编辑技术如CRISPR-Cas9技术，使得如上所述基因片段缺失；
进一步优选地，用于缺失小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
在一些具体实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，并且步骤（2）中，
所述人源IGHV基因至少包括以下18种人源IGHV基因：
hIGHV4-59、hIGHV3-53、hIGHV5-51、hIGHV3-49、hIGHV3-48、hIGHV1-46、hIGHV3-43、hIGHV4-39、hIGHV3-33、hIGHV4-30-2、hIGHV1-24、hIGHV3-23、hIGHV3-21、hIGHV3-11、hIGHV3-7、hIGHV4-4、hIGHV1-2、hIGHV6-1；任选地，还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHV基因：hIGHV1-58、hIGHV1-45、hIGHV3-35、hIGHV4-28、hIGHV2-26、hIGHV3-20、hIGHV1-18、hIGHV3-15、hIGHV3-13、hIGHV5-10-1、hIGHV3-64D、hIGHV2-5、hIGHV7-4-1、hIGHV1-3；进一步任选地，还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHV基因：hIGHV3-60、hIGHV3-57、hIGHV7-56、hIGHV4-55、hIGHV3-54、hIGHV3-52、hIGHV3-50、hIGHV3-47、hIGHV3-42、hIGHV3-41、hIGHV3-38、hIGHV3-37、hIGHV3-36、hIGHV7-34-1、hIGHV4-34、hIGHV3-33-2、hIGHV3-32、hIGHV3-30-2、hIGHV3-30、hIGHV3-29、hIGHV7-27、hIGHV3-25、hIGHV3-22、hIGHV3-19、hIGHV1-17、hIGHV3-16、hIGHV1-14、hIGHV1-12、hIGHV3-6；
并且/或者，所述人源IGHD基因至少包括以下15种人源IGHD基因：
IGHD1-1、IGHD3-3、IGHD6-6、IGHD1-7、IGHD3-10、IGHD6-13、IGHD1-14、IGHD2-15、IGHD3-16、IGHD5-18、IGHD6-19、IGHD1-20、IGHD3-22、IGHD1-26、IGHD7-27；任选地，还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHD基因：IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD4-11、IGHD5-12、IGHD3-16、IGHD4-17、IGHD2-21、IGHD4-23、IGHD5-24、IGHD6-25；进一步任选地，还包括选自以下的一种、几种或全部人源IGHD基因：IGHD3-3、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD5-18；
并且/或者，所述人源IGHJ基因为全部人源IGHJ基因；
并且/或者，所述非人哺乳动物的内源IgHG2c基因为非人哺乳动物的内源完整IgHG2c基因，或者为缺失CH1结构域的内源IgHG2c基因区段。当所述非人哺乳动物的内源IgHG2c基因为非人哺乳动物的内源完整IgHG2c基因时，经抗原免疫后，其所产生的为人源化全抗体；当非人哺乳动物的内源IgHG2c基因为非人哺乳动物的缺失CH1结构域的内源IgHG2c基因区段时，经抗原免疫后，其所产生的为人源化单重链抗体。
在上述具体实施方案的优选方案中，步骤（2）中，通过以下方式导入所述人源IGHV基因、人源IGHD基因、人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区：
向经步骤（1）所得小鼠中导入：
（I）共包含全部所述人源IGHV基因、人源IGHD基因、人源IGHJ基因的n个BAC克隆；其中，n为3-8、优选4-7之间的整数，最优选地，n为4；所述n个BAC克隆之间彼此首尾有5kb~50kb基因同源序列，以便其通过同源的基因序列进行基因拼接（例如，第n个BAC克隆中的末尾10kb基因序列与第(n+1)个BAC克隆中的头部的10kb基因序列同源）；和，
（II）包含所述非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区的一个或数个BAC克隆。
进一步优选地，步骤（2）中，通过以下方式导入所述人源IGHV基因、人源IGHD基因、人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区：
向经步骤（1）所得小鼠中导入6个BAC克隆，其包括：
（i）共包含全部所述人源IGHV基因、人源IGHD基因的4个BAC克隆，
（ii）包含全部人源IGHD基因和全部人源IGHJ基因的1个BAC克隆，和
（iii）包含所述非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区的1个BAC克隆；
其中，（i）中的各个BAC克隆之间以及（i）和（ii）的BAC克隆之间彼此首尾有5kb~50kb基因同源序列、优选为有5kb~20kb基因同源序列，以便其通过重叠的基因序列进行基因拼接；
优选地，所述6个BAC克隆中所含基因如表13所示。
根据上述制备方法所制备的非人哺乳动物中，所述人源IGHV基因、人源IGHD基因和人源IGHJ基因之间可操作地连接并可进行VDJ重排，并且可操作地连接和/或经过VDJ重排的所述人源IGHV基因、人源IGHD基因和人源IGHJ基因可操作地连接至非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区；
并且/或者，在人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因之间存在人哺乳动物的内源IgHM的Switch区。
第五方面，本发明提供了一种制备与抗原特异性结合的人源化全抗体或单重链抗体或纳米抗体的方法，所述方法包括：
（1）将如上第三方面所述的经遗传修饰的非人哺乳动物或者通过如上第四方面所述制备方法制得的经遗传修饰的非人哺乳动物暴露于抗原；
（2）从步骤（1）所得非人哺乳动物收集B细胞，提取RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增抗体基因片段并将其克隆到噬菌体展示载体上；
（3）使步骤（2）所得噬菌体载体表达目的抗体，对噬菌体进行淘洗，富集表达目的抗体的噬菌体并使其表达，获得的目的抗体，即为人源化全抗体或单重链抗体；以及，
任选地，（4）克隆所得单重链抗体的可变区片段，获得人源化纳米抗体。
第六方面，本发明提供了一种制备与抗原特异性结合的人源化单重链抗体或纳米抗体的方法，所述方法包括：
（1）将如上第三方面所述的经遗传修饰的非人哺乳动物或者通过如上第四方面所述制备方法制得的经遗传修饰的非人哺乳动物暴露于抗原，然后收集B细胞；
（2）对步骤（1）所收集的B细胞中编码免疫球蛋白重链可变区和任选地轻链可变区的核酸进行测序，获得人源化单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸序列或者人源化纳米抗体的重链可变区的核酸序列；
（3）根据步骤（2）所得序列，表达与所述抗原特异性结合的人源化全抗体或单重链抗体；以及，
任选地，（4）克隆所得单重链抗体的可变区片段，获得人源化纳米抗体。
第七方面，本发明提供了一种获得生物样品的方法，所述方法包括：
（1）将如上述第三方面所述的经遗传修饰的非人哺乳动物或者通过如上述第四方面所述制备方法制得的经遗传修饰的非人哺乳动物暴露于抗原；
（2）从所述动物收集生物样品。
作为优选，所述生物样品是脾组织、脾细胞或B细胞。
第八方面，本发明提供了一种生物样品，其通过如上述第七方面所述方法获得。
第九方面，本发明提供了一种sgRNA组合物，所述sgRNA组合物包括：用于缺失小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段的sgRNA，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA，以及用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA。
作为优选，所述用于缺失小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段的sgRNA包括如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的sgRNA；
作为优选，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；
作为优选，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
第十方面，本发明提供了一种sgRNA组合物，所述sgRNA组合物包括：用于缺失小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA，以及用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA。
作为优选，所述用于缺失小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示的sgRNA；
作为优选，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；
作为优选，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA包括如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
第十一方面，本发明提供了一种CRISPR-Cas9基因编辑系统，所述CRISPR-Cas9基因编辑系统包括如上第九方面或第十方面所述的sgRNA组合物和Cas9蛋白。
第十二方面，本发明提供了一种基因敲除载体，所述基因敲除载体包括编码如上第九方面或第十方面所述的sgRNA组合物中的sgRNA的DNA序列。
第十三方面，本发明提供了一种小鼠胚胎干细胞，所述小鼠胚胎干细胞包含如上第十二方面所述的基因敲除载体。
有益效果：根据本发明所述制备方法制备的经遗传修饰的非人哺乳动物具有较高的免疫效价，在经抗原免疫后能够高效地产生人源化单重链抗体或纳米抗体，是一种高效的人源化全抗体或单重链抗体或纳米抗体生产平台；此外，本发明所述非人哺乳动物的制备方法获得阳性动物的效率较高（达15%左右），从而可以很容易制备不同抗体多样性的人源化小鼠，用多种品系小鼠实现纳米抗体序列多样性。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为实施例1中的删除小鼠IgHM基因的CH1区域的sgRNA的靶点示意图；其中，五星符号分别表示上、下游靶点的位置。
图2为实施例1中的删除小鼠IgHM基因的CH1区域的sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳图。
图3为实施例1中的用以检测F2代及其后代纯合鼠的基因删除情况的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到4代表检测小鼠克隆号、“+”代表纯合子阳性对照、“+/-”代表杂合子对照、“-”代表野生鼠对照、“H2O”代表水对照。
图4为实施例2中的删除小鼠抗体基因轻链Igκc的sgRNA的靶点示意图。
图5为实施例2中的删除小鼠抗体基因轻链Igκc的sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳图。
图6为实施例2中的用以检测F2代及其后代纯合鼠的基因删除情况的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到5代表检测小鼠克隆号、“+”代表纯合子阳性对照、 “-”代表野生鼠对照、“H2O”代表水对照。
图7为实施例3中的删除小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA的靶点示意图；其中，五星符号分别表示上、下游靶点的位置。
图8为实施例3中的删除小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，“5’Guide RNA”表示在Iglc2位置处的GuideRNA、“3’Guide RNA”表示在Iglc1位置处的GuideRNA。
图9为实施例3中的用以检测F2代及其后代纯合鼠的基因删除情况的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到6代表检测小鼠克隆号、“+”代表纯合子阳性对照、“+/-”代表杂合子对照、“-”代表野生鼠对照、“H2O”代表水对照。
图10为实施例4中的删除小鼠抗体基因重链IgHM的CH1到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA的靶点示意图；其中，五星符号分别表示上、下游靶点的位置。
图11为实施例4中的删除小鼠抗体基因重链IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，“5’Guide RNA”表示在IgM位置处的GuideRNA、“3’GuideRNA”表示在IgHA位置处的GuideRNA。
图12为实施例4中的用以检测F2代及其后代纯合鼠的基因删除情况的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到5代表检测小鼠克隆号、“+”代表纯合子阳性对照、“-”代表野生鼠对照、“H2O”代表水对照。
图13为实施例5中的用以鉴定基因敲除小鼠的IgM（A）、IgK（B）和IgL（C）基因删除情况的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到9代表检测小鼠克隆号、“+”代表纯合子阳性对照、“+/-”代表杂合子对照、“-”代表野生鼠对照、“H2O”代表水对照。
图14为实施例6中的用以鉴定基因敲除小鼠的IgA（A）、IgK（B）和IgL（C）基因删除情况的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到3代表检测小鼠克隆号、“+”代表纯合子阳性对照、“-”代表野生鼠对照、“H2O”代表水对照。
图15为实施例7中的用以鉴定F2代IgM-KL-hIgHD小鼠的基因型的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到11对应表11中引物序号、“M”对应鉴定IgM的PCR条带、“K”对应鉴定IgK的PCR条带、“L”对应鉴定IgL的PCR条带。
图16为实施例8中的用以鉴定F2代IgA-KL-hIgHD小鼠的基因型的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，数字1到11对应表11中引物序号、“A”对应鉴定IgA的PCR条带、“K”对应鉴定IgK的PCR条带、“L”对应鉴定IgL的PCR条带。
图17A-C为实施例9中的三只IgM纯合小鼠经OVA抗原免疫的效价检测结果图。
图18为实施例9中的经OVA抗原免疫的IgM基因敲除小鼠的血清在还原条件下的蛋白质印迹实验结果图；其中，泳道1代表免疫后的C57BL/6野生型小鼠血清样本，泳道2代表免疫后的IgM CH1 ko杂合型小鼠血清样本，泳道3代表免疫后的IgM CH1 ko纯合型小鼠血清样本，各泳道上面的条带代表IgM重链。
图19为实施例9中的经OVA抗原免疫的IgM基因敲除小鼠的脾细胞的RT-PCR检测结果图，其中，A图为所挑取克隆的菌落PCR结果图，B图为所挑取克隆的部分测序结果图。
图20为实施例10中的IgA纯合小鼠分别经OVA（A）和CRP（B）抗原免疫的效价检测结果图。
图21为实施例10中的经CRP抗原免疫的IgA纯合小鼠的血清在还原条件下的蛋白质印迹实验结果图；其中，泳道1和泳道2分别为免疫后的C57BL/6小鼠血清样本，泳道3为免疫后的IgA纯合小鼠血清样本。
图22为实施例10中的经CRP抗原免疫的IgA纯合小鼠的脾细胞的RT-PCR检测结果图，其中，A图为所挑取克隆的菌落PCR结果图，B图为所挑取克隆的部分测序结果图。
图23为实施例11中的IgM-KL（A）和IgA-KL（B）纯合小鼠经OVA抗原免疫的效价检测结果图。
图24A-C分别为实施例11中的经OVA抗原免疫的IgM、IgM-KL、IgA和IgA-KL四种小鼠的血清的考马斯亮蓝染色结果图（A），血清中Kappa链的免疫印迹结果图（B），以及血清中Lamda链的免疫印迹结果图（C）。
图25为实施例12中的IgM-KL-hIgHD纯合小鼠经GCC-mFc蛋白免疫的效价检测结果图。
图26为实施例12中的经GCC-mFc蛋白免疫的IgM-KL-hIgHD纯合小鼠的血清蛋白质印迹实验结果图；其中，标记为#3492、#3493、#3304的泳道为经GCC-mFc抗原免疫后的IgM-KL-hIgHD纯合小鼠的血清样本，标记为#3347的泳道为未免疫的C57BL/6小鼠的血清样本。
图27为实施例12中的IgM-KL-hIgHD纯合小鼠的脾细胞的RT-PCR产物检测结果图，其中，第1排和第2排为未免疫的IgM-KL-hIgHD小鼠样品的PCR产物，第3排和第4排为经GCC-mFc免疫的IgM-KL-hIgHD样品的PCR产物。
图28为实施例13中的IgA-KL-hIgHD纯合小鼠经CD93蛋白免疫的效价检测结果图。
图29为实施例13中的经CD93蛋白免疫的IgA-KL-hIgHD纯合小鼠的血清蛋白质印迹实验结果图；其中，标记为#3756、#3577的泳道为经CD93抗原免疫后的IgA-KL-hIgHD纯合小鼠的血清样本，标记为#3702、#3706的泳道为经CD93抗原免疫后的IgA-KL小鼠的血清样本，标记为#10252的泳道为未免疫的C57BL/6小鼠的血清样本。
图30为实施例14中的IgA-KL-hIgHD纯合小鼠的脾细胞的RT-PCR产物检测结果图，其中，A图为未免疫的IgA-KL-hIgHD小鼠样品的PCR产物，B图为经CD93蛋白免疫的IgA-KL-hIgHD样品的PCR产物。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
此外，以下实施例中，所用小鼠为C57BL/6小鼠，购自维通利华，构建起始小鼠周龄为4到6周龄，体重为18g到22g左右。
实施例1：删除小鼠IgHM基因的CH1区域（下文中也称为“IgM基因”）的sgRNA的设计、基因敲除小鼠（下文中简称为“IgM小鼠”或“IgM纯合小鼠”）的制备与鉴定。
为了删除小鼠IgHM基因的CH1区域，在小鼠IgHM基因的第1个外显子上选取上下游各1个靶点，每个靶点各设计1条sgRNA。sgRNA的靶点示意图见图1，其中，图中的五星符号分别表示上下游靶点的位置。设计的2条sgRNA的序列及其靶点序列见表1。
1.IgM小鼠的构建；
1.1具体步骤包括：sgRNA引物设计、sgRNA体外转录、小鼠胚胎注射和阳性鼠鉴定。
1.2实验试剂：
MEGAshortscript™ Kit；
MEGAclear™ Kit；
Purification for Large Scale Transcription Reactions；
1.3sgRNA引物设计；
表1
1.4sgRNA转录模板制备；
1.4.1Taq-mix PCR体系见表2，每个样品扩增20μL×2管。
表2
1.4.2Touchdown程序见表3。
表3
PCR产物用回收试剂盒进行回收，并用于下一步实验，体外转录。
1.5体外转录；
1.5.1转录体系见表4。
表4
；
将上述转录体系放到37℃恒温培养箱中孵育18h，并用MEGAclear™ Kit
Purification for Large Scale Transcription Reactions试剂盒回收。
1.5.2sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳如图2所示。
1.6将含有上述sgRNA和Cas9蛋白的细胞植入宿主动物体内：
小鼠促排卵、体外受精并培育受精卵，然后将sgRNA和Cas9蛋白混合、电转小鼠受精卵或者采用显微注射的方法将Cas9蛋白（或Cas9 mRNA，可商购）与sgRNA一起注射进入小鼠受精卵。
将上述受精卵细胞植入代孕母鼠体内，可生产F0代嵌合体鼠。通过提取鼠尾基因组DNA、PCR扩增和对PCR扩增产物进行分析，检测F0代小鼠中发生了敲除的个体。
上述PCR扩增中，PCR引物mIghM-teko-1F和mIghM-teko-1R设计在删除序列的两端，其序列见表5。
表5
；
对PCR扩增产物的分析包括琼脂糖凝胶电泳分析和测序分析，从而确认是否删除了靶序列。
根据PCR产物的测序结果分析确认，删除序列的长度为323bp，所以用上述引物扩增的PCR产物，根据片段的大小既能检测删除基因也能检测野生型基因，其中，对于野生型基因和删除了靶序列的基因而言，用引物mIghM-teko-1F和mIghM-teko-1R扩增出的目的条带大小分别为907bp和584bp（结果未显示）。
挑选基因正确敲除的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。
1.7繁殖杂合、纯合的基因敲除小鼠：
将靶基因敲除的F0代小鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因敲除阳性F1代杂合子小鼠；再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因敲除阳性F2代纯合子鼠，即IgM纯合型小鼠。对获得的F2代及其后代纯合鼠进行基因型鉴定，方法与上述步骤（1.6）的相同，同时，以经测序鉴定的纯合子阳性鼠、杂合子小鼠分别作为纯合子阳性对照（标记为“+”的泳道）、杂合子对照（标记为“+/-”的泳道），此外还设置野生型小鼠对照（标记为“-”的泳道）以及不加DNA模板的阴性对照（也称“水对照”），其结果如图3所示。
图3显示，经过上述程序，确实获得了IgM纯合型小鼠。
实施例2：删除小鼠抗体基因轻链Igκc（下文也称为“IgK基因”）的sgRNA的设计、基因敲除小鼠（下文中简称为“IgK小鼠”或“IgK纯合小鼠”）的制备与鉴定。
为了敲除小鼠Igκc基因，在小鼠Igκc基因的外显子上选取1个靶点，并且针对此靶点设计1条sgRNA。sgRNA的靶点示意图见图4，设计的1条sgRNA的序列及其靶点序列见表3。
2.IgK小鼠的构建：
2.1具体步骤包括：sgRNA引物设计、sgRNA体外转录、小鼠胚胎注射和阳性鼠鉴定。
2.2实验试剂：
MEGAshortscript™ Kit；
MEGAclear™ Kit；
Purification for Large Scale Transcription Reactions；
2.3sgRNA引物设计；
表6
；
2.4sgRNA转录模板制备；
2.4.1Taq-mix PCR体系见以上表2，每个样品扩增20μL×2管。
2.4.2Touchdown程序见以上表3。
PCR产物用回收试剂盒进行回收，并用于下一步实验，体外转录。
2.5体外转录；
2.5.1转录体系见以上表4。
将上述转录体系放到37℃恒温培养箱中孵育18h，并用MEGAclear™ Kit
Purification for Large Scale Transcription Reactions试剂盒回收。
2.5.2IgK-sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳如图5所示。图5显示，经上述转录程序后，获得了单一的转录产物，即为IgK-sgRNA，可用于后续的导入程序。
2.6向宿主动物受精卵导入所述sgRNA和Cas9蛋白：
小鼠促排卵、体外受精并培育受精卵，然后将sgRNA和Cas9蛋白混合、电转小鼠受精卵或者采用显微注射的方法将Cas9蛋白（或Cas9 mRNA，可商购）与sgRNA一起注射进入小鼠受精卵。
将上述受精卵细胞植入代孕母鼠体内，可生产F0代嵌合体鼠。通过提取鼠尾基因组DNA、PCR扩增和对PCR扩增产物进行分析，检测F0代小鼠中发生了敲除的个体。
上述PCR扩增中，PCR引物KC-nF和KC-nR设计在删除序列的两侧，其序列见表7。
表7
；
对PCR扩增产物的分析包括琼脂糖凝胶电泳分析和测序分析，从而确认是否删除了靶序列。根据PCR产物的测序结果分析确认，删除序列的长度为76bp，所以用上述引物扩增的PCR产物，根据片段的大小既能检测删除基因也能检测野生型基因，其中，对于野生型基因和删除了靶序列的基因而言，用引物KC-nF和KC-nR扩增出的目的条带大小分别为299bp和223bp（结果未显示）。
挑选基因正确敲除的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。
2.7繁殖杂合、纯合的基因敲除小鼠：
将靶基因敲除的F0代小鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因敲除阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因敲除阳性F2代纯合子鼠，即Igκc敲除的纯合型小鼠。对获得的F2代及其后代纯合鼠进行基因型鉴定，方法与上述步骤（2.6）的相同，其结果如图6所示。
图6显示，经过上述程序，确实获得了IgK纯合小鼠。
实施例3：删除小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段（下文也称为“IgL基因”）的sgRNA的设计、基因敲除小鼠（下文中简称为“IgL小鼠”或“IgL纯合小鼠”）的制备与鉴定。
为了删除小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段，在小鼠Iglc2基因的外显子上游选取1个靶点，在小鼠Iglc1基因的外显子下游选取1个靶点，每个靶点各设计1条sgRNA。sgRNA的靶点示意图见图7，其中，图中的五星符号分别表示上下游靶点的位置。设计的2条sgRNA的序列及其靶点序列见表8。
3.IgL小鼠的构建：
3.1具体步骤包括：sgRNA引物设计、sgRNA体外转录、小鼠胚胎注射和阳性鼠鉴定。
3.2实验试剂：
MEGAshortscript™ Kit；
MEGAclear™ Kit；
Purification for Large Scale Transcription Reactions；
3.3sgRNA引物设计；
表8
；
3.4sgRNA转录模板制备；
3.4.1Taq-mix PCR体系见以上表2，每个样品扩增20μL×2管。
3.4.2Touchdown程序见以上表3。
PCR产物用回收试剂盒进行回收，并用于下一步实验，体外转录。
3.5体外转录；
3.5.1转录体系见以上表4。
将上述转录体系放到37℃恒温培养箱中孵育18h，并用MEGAclear™ Kit
Purification for Large Scale Transcription Reactions试剂盒回收。
3.5.2sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳如图8所示。图8显示，经上述转录程序后，分别获得了单一的转录产物，即为如上所述、基于上、下游靶点设计的2条sgRNA，可用于后续的导入程序。
3.6向宿主动物受精卵导入所述sgRNA和Cas9蛋白：
小鼠促排卵、体外受精并培育受精卵，然后将sgRNA和Cas9蛋白混合、电转小鼠受精卵或者采用显微注射的方法将Cas9蛋白（或Cas9 mRNA，可商购）与sgRNA一起注射进入小鼠受精卵。
将上述受精卵细胞植入代孕母鼠体内，可生产F0代嵌合体鼠。通过提取鼠尾基因组DNA、PCR扩增和对PCR扩增产物进行分析，检测F0代小鼠中发生了敲除的个体。
上述PCR扩增中，PCR引物LC2-nF1和IgL-R2设计在删除序列的两侧，其序列见表9。
表9
引物 序列（5>3’）
LC2-nF1 GGTGAGGAAAAGGAAAAAGTGCC（SEQ ID NO:16）
IgL-R CAAATCCCAAAGTCTGGTTCTGAAG（SEQ ID NO:17）
LC1-nF2l GCTTGTACCCAGAAGGCATAGATT（SEQ ID NO:18）
对PCR扩增产物的分析包括琼脂糖凝胶电泳分析和测序分析，从而确认是否删除了靶序列。根据PCR产物测序结果分析确认，删除序列的长度约为137kb，所以用上述引物扩增基因敲除小鼠的PCR产物大小为1170bp。PCR引物LC1-nF2l设计在删除序列上靠近3’端位置，引物LC1-nF2l和IgL-R2用于检测未发生基因删除的目的片段，其PCR产物大小为1424bp。根据PCR产物片段的大小，也可以确认其是野生型基因还是删除了靶序列的基因。
挑选基因正确敲除的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。
3.7繁殖杂合、纯合的基因敲除小鼠：
将靶基因敲除的F0代小鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因敲除阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因敲除阳性F2代纯合子鼠，即Igκc敲除的纯合型小鼠。对获得的F2代及其后代纯合鼠进行基因型鉴定，方法与上述步骤（3.6）的相同，其结果如图9所示。
图9显示，经过上述程序，确实获得了IgL纯合小鼠。
实施例4：删除小鼠抗体基因重链IgHM到IgHA-CH1之间的片段（下文中也称为“IgA基因”）的sgRNA的设计、基因敲除小鼠（下文中简称为“IgA小鼠”或“IgA纯合小鼠”）的制备与鉴定。
为了删除小鼠抗体基因重链的IgHM到IgHA-CH1之间的片段，在小鼠IgHM基因的外显子上游选取1个靶点，在小鼠IgHA基因的1号外显子下游选取1个靶点，每个靶点各设计1条sgRNA。sgRNA的靶点示意图见图10，其中，图中的五星符号分别表示上下游靶点的位置。设计的2条sgRNA的序列及其靶点序列见表10。
4.IgA小鼠的构建：
4.1具体步骤包括：sgRNA引物设计、sgRNA体外转录、小鼠胚胎注射和阳性鼠鉴定。
4.2实验试剂：
4.2.1MEGAshortscript™ Kit；
4.2.2MEGAclear™ Kit；
Purification for Large Scale Transcription Reactions；
4.3sgRNA引物设计；
表10
4.4sgRNA转录模板制备；
4.4.1Taq-mix PCR体系见以上表2，每个样品扩增20μL×2管。
4.4.2Touchdown程序见以上表3。
PCR产物用回收试剂盒进行回收，并用于下一步实验，体外转录。
4.5体外转录；
4.5.1转录体系见以上表4。
将上述转录体系放到37℃恒温培养箱中孵育18h，并用MEGAclear™ Kit
Purification for Large Scale Transcription Reactions试剂盒回收。
4.5.2IgA-sgRNA转录产物琼脂糖凝胶电泳如图11所示。图11显示，经上述转录程序后，分别获得了单一的转录产物，即为如上所述、基于上、下游靶点设计的2条sgRNA，可用于后续的导入程序。
4.6向宿主动物受精卵导入所述sgRNA和Cas9蛋白：
小鼠促排卵、体外受精并培育受精卵，然后将sgRNA和Cas9蛋白混合、电转小鼠受精卵或者采用显微注射的方法将Cas9蛋白（或Cas9 mRNA，可商购）与sgRNA一起注射进入小鼠受精卵。
将上述受精卵细胞植入代孕母鼠体内，可生产F0代嵌合体鼠。通过提取鼠尾基因组DNA、PCR扩增和对PCR扩增产物进行凝胶电泳和测序分析，检测F0代小鼠中发生了敲除的个体。
上述PCR扩增中，PCR引物IgA-KO-1F和IgA-KO/WT-1R设计在删除序列的两侧，其序列见表11。
表11
；
对PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析和测序分析，从而确认是否删除了靶序列。
根据PCR产物测序结果分析确认，删除序列的长度约为163kb。用上述引物扩增基因敲除小鼠的PCR产物大小为1170bp。PCR引物IgA-KO/WT-1R设计在删除序列上靠近3’端位置，引物IgA-WT-1F和IgA-KO/WT-1R用于检测未发生基因删除的目的片段，其PCR产物大小为724bp。根据PCR产物片段的大小，也可以确认其是野生型基因还是删除了靶序列的基因。
挑选基因正确敲除的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。
4.7繁殖杂合、纯合的基因敲除小鼠：
将靶基因敲除的F0代小鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因敲除阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因敲除阳性F2代纯合子鼠，即IgA敲除的纯合型小鼠。对获得的F2代及其后代纯合鼠进行基因型鉴定，方法与上述步骤（4.6）的相同，同时，以经测序鉴定的纯合子阳性鼠小鼠作为纯合子阳性对照（即，标记为“+”的泳道），此外还设置野生型小鼠对照（即，标记为“-”的泳道）以及不加DNA模板的阴性对照（也称“水对照”），其结果如图12所示。
图12显示，经过上述程序，确实获得了IgA纯合小鼠。
实施例5：IgM、IgK和IgL三基因敲除小鼠（本文中简称为“IgM-KL小鼠”）的制备与鉴定。
将实施例1所制备的IgM纯合小鼠与实施例2所制备的IgK纯合小鼠交配，获得IgM-IgK杂合小鼠；同步地，将实施例1所制备的IgM纯合小鼠与实施例3所制备的IgL纯合小鼠交配，获得IgM-IgL杂合小鼠；然后，将所获得的IgM-IgK杂合小鼠与IgM-IgL杂合小鼠进行交配，获得IgM(+/+)IgK(+/-)IgL(+/-)小鼠；最后，使IgM(+/+)IgK(+/-)IgL(+/-)小鼠自交，获得IgM(+/+)IgK(+/+)IgL(+/+)小鼠，将其命名为IgM-KL小鼠。
通过提取鼠尾基因组DNA、进行PCR扩增并对扩增产物进行凝胶电泳分析，以确定目的品系鼠。鉴定IgM、IgK和IgL基因删除的引物分别如实施例1、2和3中所记载的，同时，以经测序鉴定的相应敲除基因的纯合子阳性鼠、杂合子小鼠分别作为纯合子阳性对照（标记为“+”的泳道）、杂合子对照（标记为“+/-”的泳道），此外还设置野生型小鼠对照（标记为“-”的泳道）以及不加DNA模板的阴性对照（也称“水对照”），基因型鉴定结果如图13A、13B、13C所示。
图13A、13B、13C显示，经过上述程序，确实获得了IgM、IgK和IgL三基因敲除小鼠。
实施例6：IgA、IgK和IgL三基因敲除小鼠（本文中简称为“IgA-KL小鼠”）的制备与鉴定。
将实施例5所制备的IgM-KL纯合小鼠与实施例4所制备的IgA纯合小鼠交配，获得IgA-KL杂合小鼠；然后，使所获得的IgA-KL杂合小鼠自交，获得IgA(+/+)IgK(+/+)IgL(+/+)小鼠，将其命名为IgA-KL小鼠。
通过提取鼠尾基因组DNA、进行PCR扩增并对扩增产物进行凝胶电泳分析，以确定目的品系鼠。鉴定IgA和IgK缺失的引物分别如实施例4和实施例2中所记载的，鉴定IgL缺失的引物如以下表12所示，同时，以经测序鉴定的相应敲除基因的纯合子阳性鼠作为纯合子阳性对照（标记为“+”的泳道），此外还设置野生型小鼠对照（标记为“-”的泳道）以及不加DNA模板的阴性对照（也称“水对照”），基因型鉴定结果如图14A、14B、14C所示。
表12
；
图14A-C显示，经过上述程序，确实获得了IgA、IgK和IgL三基因敲除小鼠。
实施例7：本发明的经遗传修饰的小鼠IgM-KL-hIgHD小鼠的制备与鉴定。
本实施例中，向实施例5所制备的IgM-KL小鼠中导入携带所有待导入的人源或鼠源抗体基因序列的6个BAC，以制备IgM-KL-hIgHD小鼠和IgA-KL-hIgHD小鼠。6个BAC分别称为CH17-268I9、CTD-3054M17、CTD-2548B8-CZ、RP11-965B13、CH17-185P21-CZ和RP23-351J19 –CZ；其中，CH17-268I9、CTD-3054M17、CTD-2548B8-CZ和RP11-965B13四个BAC共携带约70个V基因，CH17-185P21-CZ包含了人的完整D区基因和J区基因，RP23-351J19 -CZ包含鼠源的IgHG2c（生产传统抗体时，为完整的IgHG2c区段；生产纳米抗体时，为缺失CH1的IgHG2c区段；本实施例中，导入的是缺失CH1的IgHG2c区段）、IgHE、IgHA和LCR区(35kb)（各BAC所携带基因的详细信息见表13）；上述两部分之间（即，人源J区与鼠源IgHG2c基因之间）通过鼠IgHM的Switch区连接。
以上所用6个BAC克隆中，CH17-268I9、CTD-3054M17和RP11-965B13为从英潍捷基(上海)贸易有限公司购买的原始BAC克隆菌株，CTD-2548B8-CZ、RCH17-185P21-CZ和RP23-351J19-CZ则是在其各自的原始BAC克隆菌株（即，CTD-2548B8、RCH17-185P21和RP23-351J19，也购自英潍捷基(上海)贸易有限公司）基础上进行了改造后获得的菌株，具体改造方式如下。
首先，将空白的BAC菌株制备成电转感受态，先将pKD46-Tet质粒(武汉淼灵生物科技有限公司，P7957)电转到感受态中。用OverLap-PCR或酶切连接的方法构建待重组片段（分别如SEQ ID NO:76-78所示），将携带pKD46-Tet质粒的BAC菌制备成电转感受态，再将待重组片段电转到感受态中，通过相应的抗生素进行筛选，以及菌落PCR验证阳性克隆，最后将BAC从菌中提取并进行Fast-NGS测序确认。
表13、各BAC所携带基因的详细信息
；
表13中，“mIgHG2c-CH1”代表去除了CH1区段的mIgHG2c基因序列。
具体程序如下：
（1）向实施例5所制备的IgM-KL小鼠中导入携带所有待导入的人源抗体基因序列的6个BAC；具体地，先将BAC质粒提取出来，再用相应的限制性内切酶将BAC骨架切掉并纯化，将纯化后的BAC基因按照等摩尔量混合制备成注射液，再将注射液通过原核注射到受精卵的雄原核中，最后移植到代孕鼠中，获得转入人源抗体基因的F0代小鼠；然后，对所导入的抗体基因序列进行PCR鉴定，所用引物如表14所示。
表14
/>
（2）将步骤（1）所得导入人源抗体基因序列的F0代小鼠与IgM-KL纯合小鼠交配获得F1代杂合小鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性的F1代杂合子小鼠；然后，使F1代杂合小鼠互相交配，获得基因重组阳性的F2代纯合子小鼠，即为IgM-KL-hIgHD纯合型小鼠。对获得的F2代纯合小鼠进行基因型鉴定的方法与上述步骤（1）的相同。同时对IgM-KL背景鼠进行PCR检测，鉴定方法同实施例5。
结果如图15所示。
上述结果显示，所有上述基因导入成功，即，本实施例成功获得了IgM-KL-hIgHD小鼠。
实施例8：本发明的经遗传修饰的小鼠IgA-KL-hIgHD小鼠的制备与鉴定。
本实施例中，将实施例7所制备的IgM-KL-hIgHD小鼠与IgA-KL纯合小鼠进行交配，获得F1代小鼠为IgA-KL-hIgHD杂合小鼠，使F1代杂合小鼠互相交配，获得的F2代阳性纯合小鼠，即为IgA-KL-hIgHD小鼠。
F2代IgA-KL-hIgHD小鼠的基因型鉴定结果如图16所示。
上述结果显示，所有上述基因导入成功，即，本实施例成功获得了IgA-KL-hIgHD小鼠。
实施例9：IgM基因编辑小鼠的表型检测。
（一）IgM纯合小鼠的抗原免疫反应与效价检测：
用OVA（鸡卵清蛋白，购自北京博尔西科技有限公司）作为抗原分别免疫3只IgM纯合小鼠（由实施例1制备），具体程序如下：
选择6-8周龄鼠，抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不化，即可做小鼠皮下多点注射，初次免疫注射剂量为50μg/只小鼠，注射体积0.2mL/只小鼠。
初次免疫2周后，皮下第二次免疫，抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化后，对小鼠皮下多点注射，注射剂量减为25μg/只小鼠，注射体积0.2mL/只小鼠。
分别于第0、17和24天采血，用山羊抗小鼠IgM多抗包板，用生物素标记抗原及HRP-Streptavidin检测血清中IgM抗体效价，三只IgM纯合小鼠的抗原免疫效价实验结果分别见图17A、17B、17C。
由图17A-C可知，3只IgM纯合小鼠经OVA三免后，血清的IgM抗体效价有所上升，但整体效价非常低。
（二）经CRP免疫的IgM基因敲除小鼠的血清蛋白质印迹实验：
按照CNBr-activated SepharoseTM 4B（购自GE公司，货号17043001）产品使用说明，制备CRP（即，人C反应蛋白，购自佰桥瑞景）抗原亲和柱料，1.5mg CRP抗原制备CRP-Sepharose填料体积定为1.5mL。
用CRP免疫6-8周龄的C57BL/6野生型小鼠（购自维通利华）、IgM杂合型小鼠（实施例1中制备的F1代杂合小鼠）和IgM纯合小鼠（实施例1中制备的F2代纯合小鼠）各一只（免疫过程同OVA免疫），第三次免疫后第7天取小鼠血液20-50μL，室温放置约30min凝血，离心后收集血清。每个样品分别取1μL，加入100μL PBS，加入10μL CRP-Sepharose填料，室温反应60min后，6000rpm离心30秒，弃上清。用PBS清洗填料3次，用10μL PBS重悬煮沸，12%SDS-PAGE电泳，转膜PVDF封闭后，用山羊抗小鼠IgM抗体（Sigma，ISO2-1KT）反应并进一步显色，结果见图18。
由图18可见，CRP抗原免疫后，C57BL/6野生型小鼠（泳道1）、IgM CH1 ko杂合型小鼠（泳道2）、IgM CH1 ko纯合型小鼠血清（泳道3）均检测到与抗原CRP特异性反应的IgM抗体，在还原条件下，纯合型小鼠IgM重链大小为60KD，明显小于野生型小鼠IgM重链78KD，证明IgM小鼠品系敲除CH1结构域成功。
（三）经CRP免疫的IgM基因敲除小鼠的RT-PCR检测：
将上述（二）中经CRP抗原三免后的IgM纯合型小鼠取脾细胞，用Trizol提取总RNA并反转录得到cDNA，使用IgM亚型抗体特异性引物扩增可变区及与之相连接的部分CH2基因，上游引物为MHV1-12混合引物，下游引物为IgHM-CH2-R4，所用引物及其序列如表15，其中，可变碱基S、Y、R、W、M、K如本领域中所定义，具体地，S为G或C，Y为C或T，R为A或G，W为A或T，M为A或C，K为G或T。
表15
；
PCR反应体系如表16。
表16
PCR反应程序见表17。
表17
将PCR扩增产物连接至pEASY®-Blunt Zero Cloning载体，转化TOP10菌株并涂板（氨苄抗性），挑取一个克隆进行菌落PCR，结果如图19A所示。将这个阳性克隆进行测序，由测序结果可知，IgM纯合型小鼠中表达的IgM抗体重链可变区FR4直接与CH2（起始氨基酸序列AVAEMN）相连，结果如图19B所示，这说明：基因组IgM CH1外显子敲除成功。
实施例10：IgA基因编辑小鼠的表型检测。
（一）IgA纯合小鼠的抗原免疫反应与效价检测：
分别用CRP（人C反应蛋白）和OVA（鸡卵清蛋白）作为抗原免疫IgA纯合型小鼠（由实施例4制备）。免疫方法如下：
选择6-8周龄鼠，抗原蛋白加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不化，即可做小鼠皮下多点注射用。初次免疫注射剂量为50μg/只小鼠，注射体积0.2mL/只小鼠；初次免疫后，每2周进行后续皮下免疫，抗原蛋白加等体积弗氏不完全佐剂乳化后，对小鼠皮下多点注射，注射剂量减为25μg/只小鼠，注射体积0.2mL/只小鼠。
血清效价检测方法如下：将抗原蛋白稀释成2μg/mL，取100μL加入聚苯乙烯酶联检测板包板，用Biotin-山羊抗小鼠IgA（Abcam，ab97231）检测血清中与抗原蛋白结合的特异性IgA抗体。
结果如图20A和图20B所示，其显示：抗原蛋白第三次免疫后第8天采血，ELISA检测血清效价显示，IgA-CH1-KO纯合型小鼠体内基本未出现特异性与抗原蛋白结合的IgA抗体，其中血清效价均未超过1：400。
（二）经CRP免疫的IgA纯合小鼠的血清蛋白质印迹实验：
按照CNBr-activated SepharoseTM 4B（购自GE公司，货号17043001）产品使用说明，制备CRP抗原亲和柱料，1.5mg CRP抗原制备CRP-Sepharose填料体积定为1.5mL。
用CRP（人C反应蛋白）免疫6-8周龄的C57BL/6野生型小鼠2只和IgA纯合小鼠（由实施例4制备）1只，免疫过程同上述第（一）部分；第三次免疫后第7天取小鼠血液20-50μL，室温放置约30min凝血，离心后收集血清。每个样品分别取2μL血清，加入100μL PBS，加入10μLCRP-Sepharose填料，室温反应60min后，6000rpm离心30秒，弃上清。用PBS清洗填料3次，用10μL PBS重悬煮沸，12%SDS-PAGE电泳，转膜PVDF封闭后，用goat anti mouse IgG Fc HRP(JACKSON，115-035-071)反应并进一步显色。
按照本申请的设计，由于小鼠IgM、IgD、IgG、IgE的基因被敲除，并且IgA重链的CH1基因被敲除，用抗原蛋白免疫IgA小鼠只会产生IgA重链抗体（不含CH1结构域），IgA单独一条重链分子量大约在40KD左右。抗原蛋白免疫后的C57BL/6野生型小鼠和IgA纯合小鼠所产生的抗体经过分离、电泳、显色等步骤后，结果如图21所示。图21为小鼠血清在还原条件下的蛋白印迹，其中，泳道1和泳道2为免疫后的C57BL/6小鼠血清样本，泳道3为免疫后的IgA纯合小鼠血清样本；该结果显示，IgA纯合小鼠所产生的抗体与预期一致，证明小鼠基因组IgHM的CH1到IgHA-CH1之间的基因序列敲除成功。
（三）经CRP免疫的IgA纯合小鼠的脾细胞的RT-PCR检测：
将上述（二）中经CRP抗原三免后的IgA纯合型小鼠取脾细胞，用Trizol提取总RNA并反转录得到cDNA，使用IgA亚型抗体特异性引物扩增可变区及与之相连接的部分CH2基因，上游引物为MHV1-12混合引物（各引物的序列参见以上表15），下游引物为IgHA-CH2-R3（其序列为：CTGCATCCTTCCCAGTGGAG，即SEQ ID NO:61）。
PCR反应体系如以上表16所示（除了下游引物不同外）。
PCR反应程序同以上表17。
将PCR扩增产物连接至pEASY®-Blunt Zero Cloning载体，转化TOP10菌株并涂板（氨苄抗性），挑取4个克隆进行菌落PCR，结果如图22A所示。将这4个阳性克隆送测序，部分测序结果如图22B所示，由该部分测序结果可知，IgA纯合型小鼠中表达的IgA抗体重链可变区FR4直接与CH2（起始氨基酸序列GPPPPCPPCPP，SEQ ID NO:75）相连，这说明小鼠基因组IgHM的CH1到IgHA-CH1之间的基因序列敲除成功。
实施例11：IgM-KL&IgA-KL纯合小鼠的表型检测。
（一）IgM-KL&IgA-KL纯合小鼠的抗原免疫反应与效价检测：
用OVA（鸡卵清蛋白）分别免疫野生型C57BL/6、IgM-KL纯合小鼠（由实施例5制备）、IgA纯合小鼠（由实施例4制备，作为对照）和IgA-KL（由实施例6制备）纯合型基因敲除小鼠，具体程序如下：
选择6-8周龄鼠，抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不化，即可做小鼠皮下多点注射，初次免疫注射剂量为50μg/只小鼠，注射体积0.2mL/只小鼠。
初次免疫2周后，皮下第二次免疫，抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化后，对小鼠皮下多点注射，注射剂量减为25μg/只小鼠，注射体积0.2mL/只小鼠。
血清效价检测方法如下：将抗原蛋白稀释成2μg/mL，取100μL加入聚苯乙烯酶联检测板包板，IgM-KL小鼠用山羊抗小鼠IgM抗体（Sigma，ISO2-1KT），IgA-KL小鼠用Biotin-山羊抗小鼠IgA（Abcam，ab97231）检测血清中与抗原蛋白结合的特异性IgA抗体。
结果如图23A和图23B所示，其显示：抗原蛋白第三次免疫后第8天采血，ELISA检测血清效价显示，IgM-KL和IgA-KL纯合型小鼠体内基本未出现特异性与抗原蛋白结合的抗体，其中血清效价均未超过1：400。
（二）经OVA免疫的IgM-KL&IgA-KL纯合小鼠的血清蛋白质印迹实验：
取使用OVA进行三免后的IgM、IgM-KL、IgA和IgA-KL四种小鼠的血清进行考马斯亮蓝染色，检查其蛋白丰度。结果见图24A。
各组试验中血清样品上样量均为0.5μL，煮沸变性后，将样品点到12%SDS-PAGE胶进行电泳，转膜PVDF封闭后，之后使用铼博（上海）生化科技有限公司的山羊抗小鼠Kappa多抗（HRP*Polyclonal Goat Anti-Mouse Kappa, C030214）以及山羊抗小鼠Lamda多抗（HRP*Polyclonal Goat Anti-Mouse Lamda, C030213）检测上述小鼠血清内的轻链蛋白表达情况。结果见图24B和24C。
由图24B和24C可见，抗原免疫后，IgM（泳道1）、IgA小鼠（泳道3）均检测到与抗原OVA特异性反应的Kappa和Lamda抗体，IgM-KL（泳道2）和IgA-KL小鼠（泳道4）均没有检测到与抗原OVA特异性反应的Kappa和Lamda抗体，证明IgM-KL和IgA-KL小鼠中轻链蛋白敲除完全。
实施例12：IgM-KL-hIgHD纯合小鼠的表型检测。
（一）IgM-KL-hIgHD纯合小鼠的抗原免疫反应与效价检测：
用GCC-mFc蛋白免疫IgM-KL-hIgHD纯合小鼠，选择6-8周龄鼠，抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不化，即可做小鼠皮下多点注射，初次免疫注射剂量为100μg/只小鼠，注射体积200μL/只小鼠。
初次免疫2周后，皮下第二次免疫，抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化后，对小鼠皮下多点注射，注射剂量减为50μg/只小鼠，注射体积200μL/只小鼠。具体免疫方案如表18。
表18
血清效价检测方法如下：将抗原蛋白稀释成2μg/mL，取100μL加入聚苯乙烯酶联检测板包板，IgM-KL-hIgHD小鼠用goat anti mouse IgG Fc HRP(JACKSON，115-035-071)抗体检测血清中与抗原蛋白结合的特异性人源化纳米抗体。
结果如图25所示，抗原蛋白第五次免疫后第7天采血，ELISA检测血清效价显示，IgM-KL-hIgHD纯合型小鼠体内出现特异性与抗原蛋白结合的抗体，其中血清效价均超过1：24000。
（二）经GCC-mFc免疫的IgM-KL-hIgHD纯合小鼠的血清蛋白质印迹实验：
取使用GCC-mFc进行五免后的IgM-KL-hIgHD(#3492、#3493、#3304)和未免疫的C57BL/6小鼠（#3347）的血清进行Western实验，目的是验证IgM-KL-hIgHD纯合鼠中是否有人鼠嵌合单重链抗体表达。
各组试验中血清样品上样量均为0.5μL，煮沸变性后,将样品点到12%SDS-PAGE胶进行电泳,转膜PVDF封闭后，之后使用goat anti mouse IgG Fc HRP(JACKSON，115-035-071)检测上述小鼠血清内的人鼠嵌合纳米抗体蛋白表达情况。结果见图26。
由图26可见，GCC-mFc抗原免疫后的IgM-KL-hIgHD(#3492、#3493、#3304)均检测到与抗原GCC-mFc特异性反应的人鼠嵌合纳米抗体，未免疫的C57BL/6小鼠（#3347）检测到小鼠完整抗体蛋白，证明IgM-KL-hIgHD小鼠中有人鼠嵌合单重链抗体表达。
（三）IgM-KL-hIgHD纯合小鼠中人可变区基因V(D)J重排：
1)通过NGS测序分析小鼠中重链可变区的基因序列；
选择一只未免疫和一只经GCC-mFc免疫的IgM-KL-hIgHD纯合小鼠，分别取小鼠的脾细胞用于提取RNA，再用逆转录试剂盒(Takara，6110A)将RNA逆转录成cDNA。用人源V基因的10条引物分别与人源J基因的3条特异引物组合，以样本的cDNA为模板进行PCR扩增，以获得重链可变区序列片段然后测序。人源基因特异性引物序列如表19所示。
表19
由于两个样本的PCR产物需要进行NGS测序及数据分析，所以需要在表16引物的5’端加入特异的barcode序列，故IgM-KL-hIgHD未免疫小鼠使用的F引物5’端加入AGTGCT，R引物5’端加入AGACTG；IgM-KL-hIgHD免疫小鼠使用的F引物5’端加入GTCTAA，R引物5’端加入ATTACT。用加入barcode序列的引物分别对IgM-KL-hIgHD的样品进行PCR扩增，如图27所示；图27中，第1排和第2排的PCR产物为IgM-KL-hIgHD未免疫样品的PCR产物，第3排和第4排的PCR产物为IgM-KL-hIgHD免疫样品的产物。
接下来，将PCR产物进行NGS测序。
2)NGS测序结果分析；
将测序结果与人免疫球蛋白序列通过生物信息学技术进行分析，以鉴定V(D)J重组后人V H、D H、J H基因的表达。IgM-KL-hIgHD未免疫小鼠样品的1323424个有效测序Reads中，结果检测到大部分V H基因区段、全部D H基因和全部J H基因片段的表达（表20）。这些基因区段中，有些V H基因位于恒定区附近，另一些远离恒定区。表20数据结果表明，hIgHD方案转入的人鼠嵌合纳米抗体基因上的人V H、D H和J H基因在IgM-KL背景鼠中可被重排并表达。
表20
同样，在IgM-KL-hIgHD免疫小鼠样品的1239828个有效测序Reads中，结果检测到大部分V H基因区段、全部D H基因和全部J H基因片段的表达(表21)。
表21
将表20和表21比较可知，免疫前后有些V H、D H和J H基因的比例明显上调或下降，表明此人源化纳米抗体小鼠对抗原免疫有很好的应答。
实施例13：IgA-KL-hIgHD纯合小鼠的表型检测。
（一）IgA-KL-hIgHD纯合小鼠的抗原免疫反应与效价检测：
用CD93蛋白免疫IgA-KL-hIgHD纯合小鼠和IgA-KL小鼠，选择6-8周龄鼠，抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不化，即可做小鼠皮下多点注射，初次免疫注射剂量为100μg/只小鼠，注射体积200μL/只小鼠。
初次免疫2周后，皮下第二次免疫，抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化后，对小鼠皮下多点注射，注射剂量减为50μg/只小鼠，注射体积200μL/只小鼠。具体免疫方案如表22。
表22. IgA-KL-hIgHD小鼠和IgA-KL小鼠的免疫方案
血清效价检测方法如下：将抗原蛋白稀释成2μg/mL，取100μL加入聚苯乙烯酶联检测板包板，IgA-KL-hIgHD与IgA-KL小鼠用goat anti mouse IgG Fc HRP(JACKSON，115-035-071)抗体检测血清中与抗原蛋白结合的特异性人源化纳米抗体。
如图28所示，抗原蛋白第五次免疫后第7天采血，ELISA检测血清效价显示，IgA-KL-hIgHD纯合型小鼠体内出现特异性与抗原蛋白结合的抗体，其中血清效价均超过1：72000。而IgA-KL背景小鼠无免疫效价，表明IgA-KL-hIgHD小鼠体内出现的抗体，均由转入的人源抗体基因序列hIgHD表达产生。
（二）经CD93的免疫IgA-KL-hIgHD纯合小鼠的血清蛋白质印迹实验：
取使用CD93进行五免后的IgA-KL-hIgHD(#3756、#3577)、IgA-KL(#3702、#3706)和未免疫的C57BL/6小鼠（#10252）的血清进行Western实验，目的是验证IgA-KL-hIgHD纯合鼠中是否有人鼠嵌合纳米抗体表达。
各组试验中血清样品上样量均为0.2μL，煮沸变性后,将样品点到12%SDS-PAGE胶进行电泳,转膜PVDF封闭后，之后使用goat anti mouse IgG Fc HRP(JACKSON，115-035-071)检测上述小鼠血清内的人鼠嵌合纳米抗体蛋白表达情况。结果见图29。
由图29可见，CD93抗原免疫后的IgA-KL-hIgHD(#3756、#3577)均检测到人鼠嵌合纳米抗体；CD93抗原免疫后的IgA-KL(#3702、#3706)没有检测到IgG抗体；未免疫的C57BL/6小鼠（#10252）检测到小鼠完整抗体蛋白，证明IgA-KL-hIgHD小鼠中有人鼠嵌合纳米抗体表达。
（三）IgA-KL-hIgHD纯合小鼠中人可变区基因V(D)J重排：
1)通过NGS测序分析小鼠中重链可变区的基因序列；
选择一只未免疫和一只经CD93免疫的IgA-KL-hIgHD纯合小鼠，分别取小鼠的脾细胞用于提取RNA，再用逆转录试剂盒(Takara，6110A)将RNA逆转录成cDNA。用人源V基因的10条引物分别与人源J基因的3条特异引物组合，以样本的cDNA为模板进行PCR扩增，以获得重链可变区序列片段然后测序。人源基因特异性引物序列如以上表19所示。
由于两个样本的PCR产物需要进行NGS测序及数据分析，所以需要在表19引物的5’端加入特异的barcode序列，故IgA-KL-hIgHD未免疫小鼠使用的F引物5’端加入ACAGAG，R引物5’端加入AGACTG；IgA-KL-hIgHD免疫小鼠使用的F引物5’端加入AGTGCT，R引物5’端加入TCCGGA。用加入barcode序列的引物分别对IgA-KL-hIgHD的样品进行PCR扩增，并将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图30A和30B所示，其分别代表IgA-KL-hIgHD未免疫样品的PCR产物和IgA-KL-hIgHD免疫样品的PCR产物。
接下来，将PCR产物进行NGS测序。
2)NGS测序结果分析；
将测序结果与人免疫球蛋白序列通过生物信息学技术进行分析，以鉴定V(D)J重组后人V H、D H、J H基因的表达。IgA-KL-hIgHD未免疫小鼠样品的895880个有效测序Reads中，结果检测到大部分V H基因区段、全部D H基因和全部J H 基因片段的表达(表23)。这些基因区段中，有些V H基因位于恒定区附近，另一些远离恒定区。表23数据结果表明，hIgHD方案转入的人鼠嵌合纳米抗体基因上的人V H、D H和J H基因在IgM-KL背景鼠中可被重排并表达。
表23
同样，在IgA-KL-hIgHD免疫小鼠样品的877915个有效测序Reads中，结果检测到大部分V H基因区段、全部D H基因和全部J H基因片段的表达(表24)。
表24
将表23和表24比较可知，免疫前后有些V H、D H和J H基因的比例明显上调或下降，表明此人源化纳米抗体小鼠对抗原免疫有很好的应答。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (19)

1.一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为小鼠，所述制备方法包括以下步骤：
对非人哺乳动物进行内源重链免疫球蛋白基因座的破坏；
其中，所述内源重链免疫球蛋白基因座的破坏为对以下基因片段的基因敲除：
小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段和小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除所述基因片段；
其中，用于缺失小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段的sgRNA为如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA为如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA为如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
3.一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为小鼠，所述制备方法包括以下步骤：
对非人哺乳动物进行内源重链免疫球蛋白基因座的破坏；
其中，所述内源重链免疫球蛋白基因座的破坏为对以下基因片段的基因敲除：
小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段、小鼠抗体基因轻链Igκc片段和小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除所述基因片段；
其中，用于缺失小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA为如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:6所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA为如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；和/或，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA为如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
5.一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为小鼠，所述制备方法包括以下步骤：
（1）根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，制备经遗传修饰的非人哺乳动物I；和
（2）通过以下方式，向步骤（1）所得经遗传修饰的非人哺乳动物I中导入人源IGHV基因、人源IGHD基因、人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区：
向经步骤（1）所得经遗传修饰的非人哺乳动物I中导入6个BAC克隆，所述6个BAC克隆中所含基因如下表所示：
；
其中，“mIgHG2c-CH1”代表去除了CH1区段的mIgHG2c基因序列。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述人源IGHV基因、人源IGHD基因和人源IGHJ基因之间可操作地连接并可进行VDJ重排，并且可操作地连接和/或经过VDJ重排的所述人源IGHV基因、人源IGHD基因和人源IGHJ基因可操作地连接至非人哺乳动物的内源IgHG2c基因、IgHE基因、IgHA基因和LCR区；
和/或，在人源IGHJ基因和非人哺乳动物的内源IgHG2c基因之间存在人哺乳动物的内源IgHM的Switch区。
7.一种制备与抗原特异性结合的人源化全抗体或单重链抗体或纳米抗体的方法，所述方法包括：
（1）将通过权利要求5或6所述制备方法制得的经遗传修饰的非人哺乳动物暴露于抗原；
（2）从步骤（1）所得非人哺乳动物收集B细胞，提取RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增抗体基因片段并将其克隆到噬菌体展示载体上；
（3）使步骤（2）所得噬菌体载体表达目的抗体，对噬菌体进行淘洗，富集表达目的抗体的噬菌体并使其表达，获得的目的抗体，即为人源化全抗体或单重链抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
（4）克隆所得单重链抗体的可变区片段，获得人源化纳米抗体。
9.一种制备与抗原特异性结合的人源化全抗体或单重链抗体或纳米抗体的方法，所述方法包括：
（1）将通过权利要求5或6所述制备方法制得的经遗传修饰的非人哺乳动物暴露于抗原，然后收集B细胞；
（2）对步骤（1）所收集的B细胞中编码免疫球蛋白重链可变区和任选地轻链可变区的核酸进行测序，获得人源化单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸序列或者人源化纳米抗体的重链可变区的核酸序列；
（3）根据步骤（2）所得序列，表达与所述抗原特异性结合的人源化全抗体或单重链抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
（4）克隆所得单重链抗体的可变区片段，获得人源化纳米抗体。
11.一种获得生物样品的方法，所述方法包括：
（1）将通过权利要求5或6所述制备方法制得的经遗传修饰的非人哺乳动物暴露于抗原；
（2）从所述动物收集生物样品。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述生物样品是脾组织、脾细胞或B细胞。
13.一种生物样品，其通过权利要求12所述的方法获得。
14.一种sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物由以下sgRNA组成：用于缺失小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段的sgRNA，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA，以及用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA。
15.根据权利要求14所述的sgRNA组合物，其特征在于，所述用于缺失小鼠抗体基因重链IgHM的CH1片段的sgRNA为如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的sgRNA；和/或，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA为如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；和/或，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA为如SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的sgRNA。
16.一种sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物由以下sgRNA组成：用于缺失小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA，用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA，以及用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA。
17.根据权利要求16所述的sgRNA组合物，其特征在于，所述用于缺失小鼠抗体基因重链从IgHM到IgHA-CH1之间的片段的sgRNA为如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示的sgRNA；和/或，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igκc片段的sgRNA为如SEQ ID NO:3所示的sgRNA；和/或，所述用于缺失小鼠抗体基因轻链Igλ的IgLc2到IgLc1之间的片段的sgRNA为如SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示的sgRNA。
18.一种CRISPR-Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas9基因编辑系统包括如权利要求14-17任一项所述的sgRNA组合物和Cas9蛋白。
19.一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体包括编码如权利要求14-17任一项所述的sgRNA组合物中的sgRNA的DNA序列。
CN202410082783.6A 2024-01-19 2024-01-19 一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用 Active CN117587070B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410082783.6A CN117587070B (zh) 2024-01-19 2024-01-19 一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410082783.6A CN117587070B (zh) 2024-01-19 2024-01-19 一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117587070A CN117587070A (zh) 2024-02-23
CN117587070B true CN117587070B (zh) 2024-04-30

Family

ID=89910298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410082783.6A Active CN117587070B (zh) 2024-01-19 2024-01-19 一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117587070B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103917650A (zh) * 2011-08-05 2014-07-09 瑞泽恩制药公司 人源化的通用轻链小鼠
CN104994730A (zh) * 2013-02-20 2015-10-21 瑞泽恩制药公司 具有修饰的免疫球蛋白重链序列的非人类动物
CN108486125A (zh) * 2018-03-27 2018-09-04 重庆金迈博生物科技有限公司 一种核酸分子及其在制备人源单域抗体中的应用
CN109906030A (zh) * 2016-11-04 2019-06-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
CN111065650A (zh) * 2017-07-21 2020-04-24 特里安尼公司 单链VH-L1-Cκ-L2-CH1-抗体
CN112400022A (zh) * 2019-02-18 2021-02-23 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 具有人源化免疫球蛋白基因座的经遗传修饰的非人动物
CN113106101A (zh) * 2021-05-11 2021-07-13 广州欣意生物技术有限公司 一种nod遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法及应用
WO2022048604A1 (zh) * 2020-09-04 2022-03-10 北京仁源欣生生物科技有限公司 一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用
CN114763558A (zh) * 2021-01-14 2022-07-19 上海泰槿生物技术有限公司 重组基因组、非人哺乳动物细胞及其产生方法和用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2576914A (en) * 2018-09-06 2020-03-11 Kymab Ltd Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103917650A (zh) * 2011-08-05 2014-07-09 瑞泽恩制药公司 人源化的通用轻链小鼠
CN104994730A (zh) * 2013-02-20 2015-10-21 瑞泽恩制药公司 具有修饰的免疫球蛋白重链序列的非人类动物
CN109906030A (zh) * 2016-11-04 2019-06-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
CN111065650A (zh) * 2017-07-21 2020-04-24 特里安尼公司 单链VH-L1-Cκ-L2-CH1-抗体
CN108486125A (zh) * 2018-03-27 2018-09-04 重庆金迈博生物科技有限公司 一种核酸分子及其在制备人源单域抗体中的应用
CN112400022A (zh) * 2019-02-18 2021-02-23 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 具有人源化免疫球蛋白基因座的经遗传修饰的非人动物
WO2022048604A1 (zh) * 2020-09-04 2022-03-10 北京仁源欣生生物科技有限公司 一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用
CN114763558A (zh) * 2021-01-14 2022-07-19 上海泰槿生物技术有限公司 重组基因组、非人哺乳动物细胞及其产生方法和用途
CN113106101A (zh) * 2021-05-11 2021-07-13 广州欣意生物技术有限公司 一种nod遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Expression of heavy chain-only antibodies can support B-cell development in light chain knockout chickens;Benjamin Schusser等;《Eur J Immunol》;20160802;第46卷(第9期);第2137-2148页 *
GenBank: MF375491.1.GenBank: MF375491.1.2018,ORIGIN. *
Wang,P.等.GenBank: OK044122.1.GenBank: OK044122.1.2021,ORIGIN. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117587070A (zh) 2024-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240057572A1 (en) Animal Models and Therapeutic Molecules
US20200375158A1 (en) Animal Models and Therapeutic Molecules
HUE026229T2 (en) Common light chain mouse
EP4209591A1 (en) Method for preparing non-human mammal or progeny thereof, and use thereof
CN117587070B (zh) 一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用
EP3760721A1 (en) Nucleic acid molecule and application thereof in humanized antibody

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant