KR20150027756A - Dna 수복, 변경 및 대체를 위한 도구로서의 초나선 미니벡터 - Google Patents

Dna 수복, 변경 및 대체를 위한 도구로서의 초나선 미니벡터 Download PDF

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KR20150027756A
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이 린 제히에드리히
조나단 포그
주니어 다니엘 제임스 카타네즈
낸시 메이젤
올리비에 훔베르트
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베일러 칼리지 오브 메디신
유니버시티 오브 워싱톤
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Abstract

일부 구체예에서, 본 개시 내용은 DNA 서열의 표적화 변경을 위한 조성물 및 이 조성물을 이용하여 표적화된 DNA 서열을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 생체내 또는 시험관내에서 세포 내의 표적화된 DNA 서열의 상동 유도(homology-directed) 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터(MiniVector)를 포함하며, 여기서 미니벡터는 세균 복제 기점과 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있고 크기가 약 2,500 염기쌍 이하이다.

Description

DNA 수복, 변경 및 대체를 위한 도구로서의 초나선 미니벡터{SUPERCOILED MINIVECTORS AS A TOOL FOR DNA REPAIR, ALTERATION AND REPLACEMENT}
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은, 2012년 5월 30일에 제출된 미국 가출원 제61/653,279호를 우선권으로 주장한다. 전술한 출원의 전체가 본원에 참고로서 인용된다.
정부 후원 연구에 관한 성명
본 발명은 미국 국립보건원으로부터의 승인 번호 R01-AI054830 및 RL1-GM084434로, 전체 또는 부분적으로 지원받았다. 정부는 본 발명에 있어서 일정한 권리를 갖는다.
분야
이 발명은 DNA 수복, 변경 또는 대체를 위한 도구로서의 핵산 서열을 포함하는 미니벡터(MiniVectorTM)를 이용하는 유전자 치료의 조성물 및 방법에 관한 것이다.
표적화 게놈 공학기술은, 세포 내에서 DNA를 따라 특정 부위에서 유도 방식으로 내인성 DNA를 편집 또는 대체하는 것을 포함한다. 유전자 수복 및 상동 유도(homology-directed) 유전자 변경의 상당한 잠재력에도 불구하고, 최근의 게놈 공학기술적 접근은 매우 낮은 효율의 수복 또는 편집을 제공하고 있으며, 해롭거나 불필요한 DNA 서열 및 결과를 유발할 잠재성이 있다. 따라서, 생물학적 환경에서 안정적이고 보다 많은 세포 형질감염 및 전이 유전자 발현을 가능하게 하는, 표적화 게놈 공학기술의 보다 효과적인 방법을 개발할 필요가 있다.
일부 구체예에서 본 개시 내용은 표적화된 DNA 서열의 변경을 위한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 비제한 구체예에서, 이러한 조성물은 생체내 또는 시험관내에서 세포 내의 표적화된 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터를 포함하며, 여기서 미니벡터는 세균 복제 기점 및 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있고 크기가 약 2,500 염기쌍 이하이다. 본 개시 내용의 추가 구체예에서, 표적화된 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형은 표적화된 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 주형 부분; 및 표적화된 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 주형 부분을 포함하며, 여기서 상기 핵산 주형의 비상보적인 부분은 표적화된 DNA 서열에 필요한 변경을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 1 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 더 포함한다.
다른 구체예에서, 본 개시 내용은 세포에서 표적 DNA 서열을 대체하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터를 형질감염시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 서열 주형은 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 부분; 및 표적 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 부분을 포함한다. 본 개시 내용의 관련 구체예에서, 핵산 주형의 비상보적인 부분은 원하는 변경을 포함한다. 추가의 구체예에서 상기 방법은, 비상보적인 부분을 제외하고, 핵산 서열 주형의 상보적인 영역을 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열과 염기쌍 형성(base pairing)시키는 것을 포함한다. 다른 추가 구체예에서, 상기 방법은 원하는 변경을 표적 DNA 서열에 서열 특이적 방식으로 도입시키는 것을 포함한다. 상기 방법의 관련 구체예에서, 미니벡터는 세균 복제 기점 및 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있다. 일부 구체예에서, 미니벡터는 크기가 약 2,500 염기쌍 이하이다.
일부 구체예에서, 본 개시 내용은 유전 질환 또는 다른 병태의 치료를 필요로 하는 대상에서 유전 질환 또는 다른 병태를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서는 표적 DNA 서열의 변경이 필요하다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 대상에게 핵산 서열 주형을 포함하는 치료 유효량의 미니벡터를 투여하는 것을 포함한다. 관련 구체예에서, 핵산 서열 주형은 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 부분; 및 표적 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 부분을 포함하며, 여기서 핵산 주형의 비상보적인 부분은 원하는 변경을 포함한다. 추가의 구체예에서 상기 방법은, 비상보적인 부분을 제외하고, 핵산 서열 주형의 상보적인 영역을 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열과 염기쌍 형성시키는 것을 포함한다. 상기 방법의 추가 구체예는 원하는 변경을 표적화된 DNA 서열에 서열 특이적 방식으로 도입시키는 것을 포함한다. 상기 방법의 관련 구체예에서, 미니벡터는 세균 복제 기점 및 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있다. 일부 구체예에서, 미니벡터는 크기가 약 2,500 염기쌍 이하이다.
본 개시 내용의 상기 목적 및 기타 목적, 특성 및 이점은, 첨부의 도면을 함께 참고시, 본 발명을 실시하기 위한 최선의 방식의 하기 상세한 설명으로부터 쉽게 이해된다.
본 발명의 목적과, 상기 기재된 것 및 다른 이점을 얻도록, 앞서 간략이 설명한 본 발명을, 첨부의 도면에 예시된 그의 특정 구체예를 참고하여 보다 구체적으로 설명할 것이다. 이들 도면이, 단지 본 발명의 일반적인 구체예를 나타내는 것임을 이해하고, 따라서 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 생각되어야 할 것이며, 본 발명을 첨부의 도면을 통해 추가의 특이점 및 상세 사항으로 설명할 것이다:
도 1은 DNA 변경을 위한 주형을 코딩하는 미니벡터의 제조를 도시한다.
도 2는 미니벡터 주형을 이용한 표적화된 게놈 편집을 도시한다.
도 3은 IL2Rγ 유전자의 변형을 위한 수복 주형으로서의 미니벡터를 이용한 아연 핑거(zinc finger) 매개형 유전자 편집의 예시적 구체예를 도시한다. 야생형, 내인성 IL2Rγ 유전자의 초기 서열을 라벨링하여 코작(Kozak) 서열 및 개시 코돈의 위치를 나타낸다. 수복 주형의 비상보적인 부분은, IL2Rγ 유전자로의 제한 부위의 삽입을 위한 추가된 서열을 도시한다. 도시된 바와 같이, 이 Xho 부위는 상기 유전자를 위한 개시 코돈 앞에 직접 코딩된다. 공여체 주형 상에서, 삽입될 Xhol 부위를 갖는 서열은 두 상동 암(homology arm)에 인접한다. 이들 상동 암은 편집에 표적화된 세포 게놈 내 부위의 좌측 및 우측의 DNA 서열에 상보적이다. 공여체 주형의 전장을 포함하는 미니벡터가 생성된다.
도 4의 A∼B는 PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 분석의 결과를 도시한다. 좌측의 세 레인(lane)은, 세 공여체 주형(등가 질량의 미니벡터, 플라스미드 또는 등가 몰의 미니벡터) 각각을 임의의 ZFN(도 4의 A) 없이 세포에 전달시킨 대조군이다. 그 다음의 레인들은, 전달된 플라스미드의 양과 비교하여 등가 질량 또는 등가 몰의 양으로 플라스미드계 공여체 주형 또는 미니벡터계 공여체 주형과 함께 ZFN을 전달하였을 때의 실험 결과를 도시한다(도 4의 A). 상부의 밀도에 대한 하부의 두 밴드의 밀도를 구할 때, 비절단 밴드는, 성공적으로 수복된 총 대립 유전자의 백분율의 측정치를 제공한다. 겔의 분석은, 미니벡터가 대립 유전자를 표적화하고 제한 부위를 삽입하는 것에 있어서 성공적이었음을 보여주었다(도 4의 B).
도 5a ∼ 5c는 미니벡터 공여체에 의한 표적화 유전자 교정을 도시한다. 미니벡터 공여체 주형은 GFP 유전자의 온전한 3' 영역을, 상류 작용성 PPGK 프로모터(도 5a)(좌측) 또는 동일한 프로모터의 절단된 형태(도 5a)(우측)와 함께 담지하였다. 수복을 위한 염색체 표적은 GFP 발현을 방지하기 위한, I-Anil 부위(황색 삼각형) 및 두 인-프레임(in-frame) N 말단 종결 코돈(적색 선)을 담지하는 전사된 GFP 유전자였다(도 5b)(상측). 이 DNA 표적은 HEK293T 세포의 염색체에서 통합된다. 성공적인 상동 유도 수복은 GFP 유전자를 교정하여, 염색체에 GFP 유전자의 기능성 복제물을 함유하는 GFP+ 세포를 생성한다(도 5b)(하측). 형질감염 3일 후 HEK293 세포에 대해서 유세포 분석을 실시하였다. GFP+ 세포(도 5c)(하측 열) 및 동정된 BFP+ 세포 집단 중의 BFP+ 세포(도 5c)(상측 열)를 정량하는 데이터를 도시한다. 형질감염된 BFP+ 세포의 백분율은 상측에 표시한다(BFP+ 세포, I-Anil을 발현함). GFP+와 같이 동정된 BFP+ 세포의 백분율(HDR에 의해 성공적으로 교정됨)도 역시 도시한다(도 5c)(하측). I-Anil로 형질도입되지 않은 대조군으로부터의 데이터는 예상한 바와 같은 BFP 발현을 보여준다(도 5c)(좌측).
전술한 일반적인 설명과 이하의 상세한 설명 모두가 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며, 청구되는 바와 같이 본 발명을 한정하는 것은 아님이 이해될 것이다. 이 출원에서, 달리 구체적으로로 명시하지 않은 한, 단수형의 사용은 복수형을 포함하며, 단어 "한" 또는 "하나"는 "하나 이상"을 의미하고, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 및 다른 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함된"의 사용은, 한정하는 것이 아니다. 또한, "성분" 또는 "구성요소"와 같은 용어는, 달리 구체적으로 명시하지 않은 한, 한 단위를 포함하는 성분 또는 구성요소와, 하나 초과의 단위를 포함하는 성분 또는 구성요소 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 섹션의 제목은 단지 구성을 위한 것이며, 기술한 주제를 한정하는 것으로 여겨서는 안 된다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 논문을 포함하나 이에 한정되지 않는, 이 출원에 언급된 모든 문헌, 또는 문헌의 일부분은, 임의의 목적을 위해 그 전체가 참고로서 본원에 특별히 인용된다. 인용된 문헌 및 유사물 중 하나 이상이, 이 출원에서의 정의와 모순되게 용어를 정의하는 경우, 이 출원이 우선한다.
본 개시 내용은, 내재된 세포의 DNA 수복 기작을 이용하여 DNA를 편집하거나 변경하기 위한, 표적화 DNA 공학기술의 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 방법은, 표적 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 주형으로서 미니벡터를 이용한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은, 임의의 식물 또는 동물 세포, 예컨대 포유류 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 생체내 또는 시험관내의 임의의 세포에서, 임의의 DNA 서열을 표적화하기 위해서 이용될 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은, 체세포 및 줄기 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 세포 유형과 이용될 수 있다.
표적화 DNA 공학기술은, 세포 내에서 DNA를 따라 특정 부위에서 유도 방식으로 세포 내의 내인성 DNA를 편집 또는 대체하는 것을 포함한다. 게놈 편집 또는 표적화된 DNA 편집은 효모, 곤충, 무척추동물, 포유동물, 어류, 설치류, 인간, 식물, 박테리아, 곤충 등을 포함하는 임의의 유기체 또는 세포에서 수행될 수 있다.1, 2, 8, 12 또한, 표적화된 DNA 편집은 줄기 세포 및 체세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 세포 유형에서 수행될 수 있다. 편집될 내인성 DNA는 게놈, 미토콘드리아 또는 색소체 DNA일 수 있다.13
게놈 편집 또는 표적화 DNA 공학기술은 치료 목적으로, 예컨대 유전자 돌연변이의 수복에 이용될 수 있거나, 기초 연구에서, 예를 들어 특정 유전자의 기능을 연구하기 위해 이용될 수 있다.9∼11 또한, 식물, 조류, 박테리아 및 고세균류의 게놈 편집은 식품 및 바이오 연료의 개발을 위한 새로운 접근법으로서 탐구되고 있다.1 표적화된 DNA 편집 또는 대체를 통한 유전자 변형은, 작물에서는 보통 발견되지 않는 특성, 예컨대 제초제 또는 해충에 대한 내성을 포함하는 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는 식물, 또는 영양적으로 균형이 잡힌 식품 또는 사료를 제조하는 효율적이고 제어된 방법을 제공한다.
유전자 치료는, 질환에 연류된, 결함이 있는 유전자 또는 다른 DNA 서열을 교정, 수복 또는 변경하기 위해, 질환을 앓는 기관 또는 세포에 DNA 또는 RNA를 전달하는 것을 포함한다. 이는 다수의 상이한 접근을 통해 성취될 수 있다. 질환 상태가 누락되거나 비기능성인 유전자 또는 다른 DNA 서열의 결과인 경우, 유전자의 기능성 복제물이 질환 유전자좌에 전달될 수 있다. 유전자 발현은, RNA 간섭(RNAi) 및 RNA 활성화 기술, 예컨대 저분자 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 저분자 활성화 RNA(small activating RNA: saRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA: shRNA) 및 마이크로RNA(microRNA: miRNA)를 이용하여 조절할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시 내용은 관심 서열의 수복, 변경, 대체, 부가, 삭제, 복제 또는 역위를 위한 표적화 DNA 공학기술에 DNA 미니벡터를 이용하는 방법에 적용된다.
DNA 수복 메카니즘
세포는, 임의의 이중 또는 단일 가닥 DNA 손상의 수복을 시도하기 위한 고유의 메카니즘을 가진다. 세포 수복 메카니즘은 자연 요인으로 인한 임의의 DNA 손상을 수복하도록 진화되었다. 게놈, 미토콘드리아, 엽록체 또는 염색체외의 DNA 서열을 변경, 수복, 대체, 부가, 삭제, 복제 및 역위시키는 몇몇 방법이 있다. 이들 방법들은 모두 DNA 상동성에 의존한다.
한 방법은, DNA 상동 재조합에서 사용될 수 있는 주형을 세포에 공급하는 것을 포함한다. 이 유형의 재조합은 상동성을 갖는 DNA의 절편에 의존한다. 이 현상의 빈도는 결함이 있는 서열 부근의 DNA 손상[일반적으로 이중 가닥 절단 또는 닉(nick)]의 유도에 의해 증가되며, 따라서, 주형은 재조합에 사용되어, 결함이 있는 서열을 주형에 의해 코딩되는 목표의 서열로 수정 또는 변경할 것이다. 이중 가닥 절단은 서열 특이적 엔도뉴클레아제, 예컨대 메가뉴클레아제(meganuclease), 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TAL 뉴클레아제에 의해 유도될 수 있다. 닉은 서열 특이적 니킹(nicking) 엔도뉴클레아제에 의해 생성될 수 있다.
DNA 서열을 수복 또는 변경하는 다른 방법은 게놈, 미토콘드리아, 엽록체 또는 염색체외의 서열을 주형으로 교환하는 효소를 이용하는 것이다. 첫 번째 방법에서와 같이 주형을 복제하는 것보다는, 이 방법에서는, 효소, 예컨대 DRAP가 주형을 이용하여 게놈, 미토콘드리아, 엽록체 또는 과잉 염색체(들)를 상동 영역에 대해 탐색한다. 상동 영역이 매칭될 경우, DRAP는 주형과 표적 서열 모두에 두 세트의 이중 가닥 절단을 생성하며, "플립-인(flip-in)" 메카니즘으로 게놈, 미토콘드리아, 엽록체 또는 염색체외의 서열을 주형으로 교환한다.
다른 DNA 수복 시스템은 전이효소(transposase), 재조합효소 또는 인테그라아제를 포함한다. 트랜스포존 시스템, 예컨대 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 전이효소는 또한, 잘라내기와 붙여넣기 메카니즘(cut and paste mechanism)을 통해 상동 재조합을 성취할 수 있다. 인테그라아제 시스템, 예컨대 HIV 인테그라아제는, 상동 재조합을 통해 서열을 부가, 삭제, 복제 또는 역위시킬 수 있다. 이들 세포 수복 메카니즘은 역위, 삽입, 결실, 점 돌연변이, 복제 또는 전좌를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 내인성 DNA 서열의 표적화된 원하는 DNA 변경을 유도하는 데에 활용될 수 있다.
수복 주형의 전달
유전자 치료가 상당한 치료적 잠재력이 있고, 유전자 치료에 적합한 후보자로서 확인된 다수의 질환이 있음에도 불구하고, 이 분야는 지금까지는 크게 성공적이지 못했다. 이들 실패는 DNA 전달과 연관된 복잡함의 결과이다. 수복 주형을 도입하기 위한 몇몇 접근법이 평가되어 왔다. 수복 주형은 단일 가닥의 선형 DNA, 이중 가닥의 선형 DNA, 이중 가닥 플라스미드 또는 단일 가닥 플라스미드로서 도입될 수 있다. 또한, 수복 주형은 네이키드 DNA(naked DNA)로서 전달되거나 바이러스형 전달 비히클 내에 팩킹될 수 있다.1, 4
가장 일반적인 DNA 전달 방법은 바이러스 벡터를 이용한다. 바이러스 벡터에 있어서 전달 효율은 높다. 그러나, 바이러스 벡터는 한정적인 치료 잠재성을 갖는데, 유독성, 면역 및 염증 반응과, 표적화 및 투여량 조절의 어려움을 비롯한, 임상 시험에서 관찰되는 문제들 때문이다. 또한, 알려지지 않은 장기적 효과로, 벡터가 게놈으로 통합된다는 타당한 우려가 있고, 바이러스가 자신의 능력을 회복하여 질환을 야기할 수 있는 가능성이 있다.
따라서, 많은 노력이 비바이러스성 벡터 시스템, 예컨대 플라스미드 DNA로 향하였다. 선형 DNA 주형은 플라스미드를 이용하여 전달할 수 있다. 이들 벡터는 생산과 보관이 간단해서 매력적이며, 세포에서 안정적으로 유지될 수 있다. 그러나, 플라스미드 벡터의 상당한 부분은, 상동 암 또는 공여체 수복 주형의 구성요소가 아니다. 이는, 플라스미드가 박테리아 균주에서 번식되므로, 플라스미드의 유지를 위해서 박테리아 DNA 서열, 특히 원핵 복제 기점 및 항생물질 내성 마커를 함유해야 하기 때문이다. 이들 박테리아 서열의 존재는 다수의 아주 심각하고 나쁜 영향을 준다. 가장 특히는, 플라스미드가 얼마나 작게 제조될 수 있는가를 제한한다. 수천개 염기쌍의 큰 플라스미드는, 매우 낮은 효율로 형질감염된다. 또한, 이들의 큰 크기는, 정맥내 전달에 의한 도입시에 혈류에서, 또는 전달과 관련된 유체역학적 전단력(예컨대, 분무 주입)에 이들이 민감하게 한다. 전단 유도형 분해는, 유전자 치료에 비바이러스성 벡터를 이용하는 것에 있어서의 최근의 성공 부재에 적어도 부분적으로는 책임이 있는 생물 활성 소실을 초래한다. 다양한 양이온성 및 리포솜 형질감염 시약이 이러한 형질감염과의 문제들을 시도 및 해소하도록 설계되었으나, 이들은 세포 독성의 문제를 겪는다. 또한, 수지상 세포 및 T-세포를 비롯한 다수의 인간 세포는, 최근의 플라스미드 벡터로는 효율적으로 형질감염시킬 수 없다.
DNA 벡터의 크기를 감소시키는 것은 세포 형질감염 효율을 증가시키는 합당한 접근으로 보인다. 플라스미드 상의 박테리아 서열이 물리적으로 제거되고, 그 결과로 생성된, 치료 서열만을 함유하는 짧은 선형 DNA 단편이 종래의 플라스미드 벡터보다 더 용이하게 세포로 도입되는 것을 생각해볼 수 있다. 그러나, 선형 DNA 주형은 불안정하며 세포에 의해 급속이 분해된다. 또한, 선형 DNA의 말단은 고반응성이며, 조절되지 않는 DNA 수복 및 재조합 과정을 촉발하고, 또한 고유의 면역 반응 및 세포 독성 또는 아포토시스를 촉발한다.
따라서, 유전자 수복 및 상동 유도 유전자 변경의 상당한 잠재력에도 불구하고, 최근의 접근은 매우 낮은 효율의 수복 또는 편집 양상을 제공하며, 유해하거나 불필요한 DNA 서열 및 결과를 도입할 가능성이 있다. 따라서, 생물학적 환경에서 안정적이고, 보다 많은 세포 형질감염 및 전이 유전자 발현이 가능한 유전자 표적화 요법에 대한 요구가 있다.
미니벡터
본 개시 내용은 상동 유도 수복, 변경 또는 대체에 주형으로 사용하기 위한 미니벡터에 관한 것이다. DNA 미니벡터(∼ 250 bp만큼 작음)는, 일반적으로 플라스미드로의 형질감염이 어려운 세포 유형, 예컨대 부유 세포, T-세포, 수지상 세포를 비롯하여 시험된 모든 세포 유형에서 현저한 형질감염 효율을 보인다. 이 발명의 이용은, 유전자 대체 요법에서 및 인간 질환 세포의 유전자 재프로그래밍(genetic reprogramming)에 있어서 큰 잠재력이 있다. 돌연변이되거나, 수복을 필요로 하거나, 변경 또는 대체될 필요가 있거나, 부가, 삭제, 복제 또는 역위될 필요가 있는 게놈, 미토콘드리아, 엽록체 또는 염색체외의 서열은, 유전자 대체로 알려진 공정시에 삽입("플립 인") 또는 통합된 DNA 단편으로서 또는 DNA 교정을 위한 주형으로서의 미니벡터를 이용하여 생체내에서 교정될 수 있다.
미니벡터를 생성하기 위한 초나선 미니벡터 및 방법은, 그 전체가 본원에 참고로서 인용된 미국 출원 번호 제11/448,590호[미국 공개 번호: US 20070020659 Al; 명칭: "Generation of Minicircle DNA with Physiological Supercoiling"; 저술: Zechiedrich 등]에 기술되어 있다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같은 "미니벡터" 또는 초나선 DNA 벡터 시스템도 역시, 그 전체가 본원에 참고로서 인용된 미국 출원 번호 제12/905,612호[미국 공개 번호: US 20110160284 Al; 명칭: "Supercoiled MiniVectors for Gene Therapy Applications"; 저술: Zechiedrich 등]에 이미 기재되어 있다.
본 개시 내용의 구체예는 상동 유도 수복, 변경 또는 대체에 주형으로서 사용하기 위한, 박테리아 서열이 거의 완전히 없는 비바이러스성 유전자 치료 벡터인 작은 초나선 DNA 미니벡터를 제공한다. 이들의 작은 크기 때문에, 이들 미니벡터는 높은 효율로 형질감염된다. 박테리아 서열의 부재는 이중 가닥 및 초나선, 생리 활성 형태의 필요한 DNA 서열만을 함유하는 최적의 공여체 주형 설계를 가능하게 한다.
한 구체예에서, 본 개시 내용은 세포 생체내 또는 시험관내에서, 표적화된 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터에 관한 것이다. 본 개시 내용의 일부 구체예에서, 전술한 조성물의 핵산 서열 주형은 표적화된 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 주형 부분; 및 표적화된 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 주형 부분을 포함할 수 있다. 관련 구체예에서, 핵산 주형의 비상보적인 부분은 표적화된 DNA 서열에 필요한 변경을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 발견은, 미니벡터가 표적화 게놈 편집 또는 수복에 이점이 있음을 입증한다.
미니벡터는 생체내 인테그라아제 매개의 부위 특이적 재조합에 의해 이 콜라이(E. coli)에서 얻을 수 있다. 이것은, 예를 들어 단지 전이 유전자 발현 카세트(프로모터 및 핵산 서열을 포함하며, 여기서 핵산 서열은, 예를 들어 표적화된 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 주형임)를 갖는 핵산 분자를 함유하고, 중요하게는 박테리아 유래의 서열을 함유하지 않는다(Mali et al., 2013; Alexander BL et al., 2007; Alton et al., 2007).
표적화된 DNA 변경에 사용되는 미니벡터는 약 100 염기쌍(bp) ∼ 약 2.5 킬로 베이스(kb), 예컨대 약 200 bp ∼ 약 2.2 kb, 예를 들어 약 300 bp ∼ 약 2.0 kb, 예를 들어 약 400 bp ∼ 약 1.9 kb, 예를 들어 약 500 bp ∼ 약 1.8 kb, 예를 들어 약 600 bp ∼ 약 1.7 kb, 예를 들어 약 700 bp ∼ 약 1.6 kb, 예를 들어 약 800 bp ∼ 약 1.5 kb, 예를 들어 약 900 bp ∼ 약 1.4 kb, 예를 들어 약 1 kb ∼ 약 1.3 kb, 예를 들어 약 1.1 kb ∼ 약 1.2 kb 크기의, 이중 가닥인 원형 DNA 분자일 수 있다. 미니벡터는 약 100 bp 이하의 크기 증가로 제조될 수 있다.
본 개시 내용의 구체예에서, 전술한 조성물의 미니벡터는 세균 복제 기점과 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있을 수 있다. 관련 구체예에서, 미니벡터는 크기가 약 2,500 염기쌍 이하일 수 있다. 일부 구체예에서, 미니벡터는 화학적 부분, 변형된 올리고뉴클레오티드 및/또는 변형된 백본을 더 포함할 수 있다.
미니벡터는, 예를 들어 필요에 따라 화학적 부분을 이용하여 라벨링할 수 있다. 대표적인 라벨에는 플루오레세인, 비오틴, 콜레스테롤, 염료, 변형된 염기 및 변형된 백본이 있다. 대표적인 염료에는 6-카르복시플루오레세인, 5-/6-카르복시로다민, 5-/6-카르복시테트라메틸로다민, 6-카르복시-2'-,4-,4'-,5'-,7-,7'-헥사클로로플루오레세인, 6-카르복시-2'-,4-,7-,7'-테트라클로로플루오레세인, 6-카르복시-4'-,5'-디클로로-2'-,7'-디메톡시플루오레세인, 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산, Cascade Blue, Marina Blue, Pacific Blue, Cy3, Cy5, Cy3.5, Cy5.5, IRDye700, IRDye800, BODIPY dye, Texas Red, Oregon Green, Rhodamine Red, Rhodamine Green이 있다. 추가의 변형은 또한, 변형된 염기(예를 들어 2-아미노푸린, 메틸화 염기), 또는 변형된 백본[예를 들어, 포스포로티오에이트(여기서, 비가교 산소 중 하나가 황으로 치환됨); 2'-0-메틸-RNA-올리고뉴클레오티드; 메틸-포스페이트 올리고뉴클레오티드]을 포함할 수 있다. 화학적 부분 및/또는 변형된 염기 및/또는 변형된 백본을 포함하는 다중 라벨은, 필요할 경우 동시에 사용될 수 있다. 뉴클레오티드를 라벨링하는 방법은, 예를 들어 문헌["Nucleic Acid Probe Technology" by Robert E. Farrell; RNA Methodologies (Third Edition), 2005, pp. 285-316; 및 "Enzymatic Labeling of Nucleic Acids" by Stanley Tabor and Ann Boyle, in Current Protocols in Immunology 2001 May; Chapter 10:Unit 10.10]에 기재되어 있다. 이들 참고문헌의 교시 내용은 그 전체가 본원에 참고로서 인용되어 있다.
뉴클레아제
상기 언급한 바와 같이, 표적화 DNA 공학기술은 다수의 상이한 목적의 결과를 위해, 예를 들어 돌연변이의 수복, 돌연변이의 도입, 신규한 유전자의 도입, 세포의 재프로그램, DNA 서열 일부분의 삭제, 유전자 발현 패턴의 변경 등을 위해 필요할 수 있다(Perez-Pinera et al., 2012). 이 과정은 일반적으로 조작된 부위 특이적 뉴클레아제의 사용을 수반할 수 있다. 본 개시 내용의 예시적 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 전술한 미니벡터의 핵산 서열 주형의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 다른 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 별개의 미니벡터, 플라스미드, 전령 RNA 또는 바이러스에 의해 코딩되거나, 단백질로서 전달될 수 있다.
이들 조작된 뉴클레아제는, 각각 별개의 기능을 갖는 2개의 융합된 도메인을 함유할 수 있다. 제1 도메인(DNA 결합 도메인)은, 특정 DNA 서열을 인식하고 그에 결합되도록 조작될 수 있다. 제2 도메인은 DNA에서 이중 또는 단일 가닥 절단을 만들 수 있는 효소 또는 뉴클레아제로 구성될 수 있다. 세포에 도입되었을 때, 조작된 뉴클레아제는, 표적화된 서열이 존재할 경우에 세포 DNA에 결합할 수 있다. 결합시, 뉴클레아제는 DNA의 백본에 분할 또는 절단을 야기할 수 있다. 따라서, 분할은, 뉴클레아제 도메인의 조작된 활성에 기초하여, 이중 나선의 양쪽 가닥 모두에 영향을 미치도록 설계될 수 있고(이중 가닥 절단, DSB), 또는 오직 하나의 가닥에만 영향을 미치도록 설계될 수 있다(단일 가닥 절단, SSB). 뉴클레아제 그 자체는 DNA를 비특이적으로 분할하나, DNA 결합 도메인에 융합될 경우에는 이 뉴클레아제 활성이 특정 부위로 유도될 것이다. 따라서, 이 조작된 뉴클레아제는 부위 특이적 뉴클레아제로도 일컬어진다(Jensen et al., 2011; Joung and Sander, 2013; Perez-Pinera et al., 2012). 재조합을 통한 상동 수복은, 임의의 조작된 뉴클레아제의 부재 하에서도 일어날 수 있으며, 또는 비특이적 뉴클레아제로 수행할 수 있음을 주지해야 한다(Jensen et al., 2011). 그러나, 부위 특이적 뉴클레아제가 없는 상동 재조합 매개식 유전자 편집의 속도는 매우 낮다(Mali & Cheng, 2012; Parekh-Olmedo et al., 2005; Perez-Pinera et al., 2012).
많은 유형의 조작된 뉴클레아제가 개발되었다. 예를 들어, 첫 번째이고 가장 연구가 많이된 것은 뉴클레아제에 융합된 아연 핑거 결합 도메인에 기초한 것이었으며, 이것은 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN)로도 일컬어진다(Carrol, 2008; Jensen et al., 2011; Joung & Sander, 2013; Perez-Pinera., 2012). 다른 접근법은, 전사 활성화 인자-유사 이펙터(TALE) 유래의 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 이용하여 TALEN(또는 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제)을 생성한다(Joung & Sander, 2013; Perez-Pinera., 2012). 추가적인 접근법은 포유류 및 다른 비-박테리아 유기체에서의 게놈 편집을 위해 수정된 박테리아 시스템을 이용한다. 이 시스템에서는, CRIPSR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) RNA가 CRISPR-연관(Cas) 단백질과 함께 작용하여 CRISPR RNA 서열과 일치하는 DNA 서열의 분할을 유도한다. 한 예에서, Cas9 단백질은, 분할시킬 목표의 DNA 서열을 표적화하는 CRISPR RNA에 융합시켰다(Mali et al., 2013). 이들 부위 특이적 뉴클레아제 시스템 중 어느 하나 또는 이들의 조합은 공여체, 또는 DNA 주형과 조합되어, 목표한 바와 같이 이후의 수복을 유도할 수 있다.
조작된 뉴클레아제에 의해 인공적 절단이 발생할 경우, 이들 세포 수복 메카니즘은, 역위, 삽입, 결실, 점 돌연변이, 복제 또는 전좌를 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 수의 변경을 내인성 DNA 서열에 발생시키기 위해서 수복 과정을 유도하는 데에 활용될 수 있다(Joung and Sander, 2013; Perez-Pinera et al., 2012; Parekh-Olmedo, Ferrara, Brachman, & Kmiex, 2005). 소정의 결과를 향한 수복 현상을 유도하기 위해서, 조작된 뉴클레아제와 함께 주형 DNA 가닥이 세포에 도입될 수도 있다. 이 주형 가닥은 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 매개되는 유도된 DNA 분할 현상의 부위 또는 그 부근의 세포 DNA를 보완하거나 그에 상동성인 부분을 가질 것 이다. 한 예에서, 주형 가닥은 이중 가닥 절단의 어느 측 상의 DNA 서열에 상보적인 2개의 상동 영역을 가질 수 있다. 이들 상동 암 사이에, 수복 후의 세포 DNA의 원하는 최종 서열에 해당하는 주형 영역이 존재할 수 있다. 주형 영역은 한 예에서, 내인성 DNA에 삽입될 핵산 서열을 코딩할 수 있다. 다르게는, 이것은 핵산 서열에 대한 단일 점 돌연변이 또는 임의의 수의 다른 변경을 코딩할 수 있다(Joung and Sander, 2013; Perez-Pinera et al., 2012; Jensen et al., 2011).
조작된 뉴클레아제 외에도, DNA 결합 도메인은 다르게는, 인테그라아제 또는 재조합효소 도메인에 융합되어 수복 주형으로의 부위 특이적 재조합을 유도할 수 있다(Perez-Pinera et al., 2012). 다른 구체예에서, 전이효소 또는 재조합효소-매개의 유전자 변경은 슬리핑 뷰티 트랜스포존과 같은 시스템을 이용하여 수복 주형으로 실시할 수 있다(Richardson et al., 2002).
한 구체예에서, 이 개시 내용은 생체내 또는 시험관내에서 세포 내의 표적화된 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터를 포함하는 DNA 서열의 표적화된 변경을 위한 조성물을 제공한다. 한 예시적인 구체예에서, 변경될 표적화된 DNA 서열은 세포 내의 게놈, 미토콘드리아 또는 색소체 DNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 포유류, 원핵, 진핵, 고세균류 또는 식물 세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 세포는 체세포 , 배아 세포 또는 줄기 세포일 수 있다.
본 개시 내용의 일부 구체예에서, 전술한 조성물의 핵산 서열 주형은 표적화된 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 주형 부분; 및 표적화된 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 주형 부분을 포함할 수 있다. 관련 구체예에서, 핵산 주형의 비상보적인 부분은 표적화된 DNA 서열에 필요한 변경을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서 본 개시 내용은 생체내 또는 시험관내에서 표적화된 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 전술한 조성물은 1 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 더 포함한다. 일부 구체예에서 본 개시 내용은 전술한 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 개시 내용의 예시적인 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 미니벡터의 핵산 서열 주형의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 다른 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 별개의 미니벡터, 플라스미드, 전령 RNA 또는 바이러스에 의해 코딩되거나, 단백질로서 전달될 수 있다. 부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 및 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CAS(CRISPR associated) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 단일 가닥 절단을 유도할 수 있다. 다른 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 이중 가닥 절단을 유도할 수 있다. 본 개시 내용의 구체예에서, 상동 유도 수복, 변경 또는 대체는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전이효소 또는 재조합효소에 의해 매개될 수 있다.
본 개시 내용의 다른 구체예는, 전술한 조성물(들)을 이용하는, 세포에서 표적 DNA 서열을 변경하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터를 형질감염시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 서열 주형은 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 부분; 및 표적 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 부분을 포함할 수 있다. 관련 구체예에서, 핵산 주형의 비상보적인 부분은 원하는 변경을 포함할 수 있다. 상기 방법은, 비상보적인 부분을 제외하고, 핵산 서열 주형의 상보적인 영역을 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열과 염기쌍 형성시키는 것; 및 원하는 변경을 표적 DNA 서열에 서열 특이적 방식으로 도입시키는 것을 더 포함한다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 1 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 부위 특이적 뉴클레아제는 미니벡터의 핵산 주형의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제를 제공하는 단계는 부위 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 별개의 미니벡터, 플라스미드, 전령 RNA 또는 바이러스, 또는 단백질을 동시형질감염시키는 것을 포함할 수 있다. 부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 및 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) / CAS(CRISPR associated) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 단일 가닥 절단을 유도할 수 있다. 다른 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 이중 가닥 절단을 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 DNA의 변경은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전이효소 또는 재조합효소에 의해 매개된다.
또 다른 구체예에서, 본 개시 내용은 유전 질환 또는 다른 병태의 치료를 필요로 하는 대상에서, 유전 질환 또는 다른 병태를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 표적 DNA 서열의 변경이 필요하다. 한 구체예에서, 상기 대상은 포유동물 또는 식물일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 대상에게 치료 유효량의 전술한 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 1 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 동시투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 미니벡터의 핵산 주형의 일부분에 의해 코딩된다. 다른 구체예에서, 동시투여는 부위 특이적 뉴클레아제 를 코딩하는 별개의 미니벡터, 플라스미드, 전령 RNA 또는 바이러스를 제공하는 것, 또는 단백질을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 및 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) / CAS(CRISPR associated) 시스템으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 단일 가닥 절단을 유도할 수 있다. 다른 구체예에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 이중 가닥 절단을 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 DNA의 변경은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전이효소 또는 재조합효소에 의해 매개된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 가능한 변화 및 변형을 생각해 볼 수 있다. 예를 들어, 세포 위치(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체 또는 염색체외 대 핵)를 조절하기 위해, 미니벡터를 "태그"하거나 원하는 세포 위치에 인도하는 특별한 DNA 서열을 포함시킬 수 있다. 혼합된 세포 집단(예를 들어, 살아있는 마우스의 폐 섬유아세포)에서 특정 세포를 표적화하기 위해, 다양한 부분(에피토프, 지방산, 특별한 단백질 서열 등)을 미니벡터에 부착하여, 예를 들어 상기 부분에 결합하거나 DNA가 상기 부분에 부착되었을 때 DNA를 보다 도입시킬 수 있는 수용기를 갖는 세포로 이들을 표적화할 수 있다. 미니벡터는 단백질 또는 중합체와 같은 표적화 부분 또는 형질감염제와 같은 전달 비히클과 비공유결합으로 복합화될 수도 있다.
용도 및 장점
최근의 플라스미드 벡터는 상당히 크며(>5 kb), 따라서 다음과 같은 이유로 새로운 용도에는 적합하지 않다: (i) 크기: 벡터는 관심의 서열을 갖고 더욱 커짐; (ii) 형질감염 효율: 플라스미드는 수복을 위한 세포 내에 주형 DNA가 약간 전달되거나 전달되지 않는, 부족한 형질감염을 가짐; 및 (iii) 비특이적 DNA: 박테리아 서열은 문제가 있으며, 전이 유전자의 침묵화를 유발할 수 있음. DNA 미니벡터는 훨씬 작으며, 보다 높은 형질감염, 증가된 안정성, 및 침묵화 경향이 낮은 향상된 DNA 수복 주형의 전달의 장점을 제공한다.
치료 용도 이외에, 유전자 또는 DNA 대체, 수복 및 변경은 비치료적 용도에도 이용될 수 있다. 예를 들어, 이것은 형질 전환 유기체, 예컨대 넉 아웃 마우스를 제조하는 데에 사용되거나, 예컨대 세포주의 불멸화를 위해 세포를 변경하는 데에 사용될 수 있다. 이들 형질 전환 세포 및 유기체는, 질환 모델로서 및 DNA 기능 연구에서, 유용할 수 있다. 또한, 형질 전환 유기체는, 예를 들어 농업에서 상업적으로 유용할 수 있으며, 여기서 유전자의 변경, 수복, 삽입, 결실, 복제 또는 역위는 질환 또는 해충 내성과 같은 신규의 유익한 특성을 제공할 수 있다. 이들 용도 전체에 있어, 미니벡터는, 이들의 향상된 형질감염 효율 및 합성의 용이성으로 인해, 종래의 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 비해 향상된 플랫폼을 제공한다. 또한, 미니벡터는, 모든 무관한 서열(박테리아 기점 및 항생물질 내성)이 제거되어 숙주 DNA에의 상동 결합을 방해할 수 없기 때문에, 보다 양호한 수복 주형을 제공할 것으로 기대할 수 있다.
추가 구체예
이하, 본 개시 내용의 다양한 구체예 및 이들 구체예를 뒷받침하는 실험 결과들을 언급할 것이다. 출원인은, 본원의 개시 내용이 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 청구한 주제의 범위를 어떠한 식으로도 한정하려는 의도가 아닌 것임을 명시한다.
실시예 1
미니벡터를 이용한 뉴클레오펙션(nucleofection) 및 표적화 유전자 편집
미니벡터가 ZFN 매개의 표적화된 유전자 편집에 있어서 공여체 주형의 역할을 할 수 있음을 입증하기 위해, 쉽게 검출되고 정량화할 수 있는 세포 게놈 DNA 변화를 일으키도록 변형을 설계한 실험을 수행하였다. 공여체 주형은 IL2Rγ 유전자의 제1 부분에 상보적인 2개의 상동 영역으로 설계된다. 두 상동 영역의 사이는 Xhol 제한 효소에 의해 인식될 수 있는 부위를 함유하는 주형 서열이다. 초기의 개념 증명 실험은, DNA를 전달하기 위해 Lonza, NucleofectorTM 형질감염 시스템을 이용하는 K562 세포(비부착형, 백혈병 세포주)로 실시하여다. 그러나, 임의의 접근법(형질감염제, 전기 천공법 등)이 세포에의 DNA 전달에 이용될 수 있음을 주지해야 한다. DNA 및 ZFN의 뉴클레오펙션 후, 세포의 게놈 DNA를 회수 및 분석하였다. Xhol 부위의 삽입을 확인하기 위해, 적절한 프라이머로 PCR를 이용하여, 편집을 위해 표적화된 DNA 서열을 함유하는 게놈 DNA의 세그먼트를 증폭시켰다. 이어서, 이 증폭 PCR 생성물을 Xhol 효소로 제한 소화시켰다(도 3). 겔 상에서 주행시킬 경우, PCR 생성물은 큰 단일 밴드(비절단형, 따라서 비편집됨)로 잔재하거나, 유사한 두 밴드(절단형, 따라서 공여체 주형으로 성공적으로 편집됨)로서 주행할 것이다. 작은 두 밴드에 대한 큰 밴드의 비율은 성공적인 유전자 표적화의 정량적 평가가 가능하게 하였다. 실험에서는, 공여체 주형을 종래의 플라스미드, 또는 미니벡터 상에 전달시켰다. 보다 작은 미니벡터는, 보다 큰 플라스미드에 등가 질량의 양으로 사용될 경우, 보다 많은 주형 분자를 제공할 것이다. 따라서, 2가지 투여량의 미니벡터, 즉 미니벡터의 등가 몰량을 전달하기 위해 산출한, 등가 질량의 양의 미니벡터와 낮은 투여량의 것을 플라스미드 주형과 비교하였다.
세포 배양 방법
K562 세포(인간의 불멸화된 골수성 백혈병 세포주, ATCC)를 37℃ 및 5% C02로 항온 처리되는 RPMI 배지에서 유지하였다. 배지를 2∼3일마다 교환하고, 세포 농도가 1×106 세포/mL에 도달할 경우 계대배양을 실시하였다. 실험을 준비하기 위해, 세포를 200,000 세포/mL로 나누고, 200,000 ∼ 500,000 세포/ml로 3일간 유지하여 그 기간 동안 세포가 로그 기 생장(log phase growth)이도록 하였다.
미니벡터 및 플라스미드 DNA의 뉴클레오펙션 방법
6웰 플레이트에, 웰당 3 ml RPMI 배지를 37℃로 예비 가온하였다. 각각에 샘플에 대하여, 1×106 세포를 800 RPM 및 5℃로 스핀 다운(spin down)하였다. 1 ml의 뉴클레오펙션 용액 II(Lonza)를 1 분액의 뉴클레오펙션 용액 I(Lonza)과 조합하여 뉴클레오펙션 용액을 제조하였다. 세포 펠릿을 1×106 세포당 100 ㎕ 뉴클레오펙션 용액으로 재부유시켰다. 재부유된 세포에, 미니벡터 또는 플라스미드 DNA의 샘플을 첨가하고 잘 혼합하였다. 세포와 DNA의 최종 혼합물(약 100 ∼ 110 ㎕ 부피)을 블루-탑(blue-top) 형질감염 큐벳(Lonza)에 첨가하였다. 프로그램 2-16을 이용하는 2D NucleofectorTM(Lonza)로 뉴클레오펙션을 실시하였다. 시작 전에 큐벳을 벤치 탑(bench top) 상에서 탭핑함으로써, 샘플이 큐벳의 저부에 완전히 위치하도록 하였음을 주지하라. 뉴클레오펙션이 완료된 직후, 500 ㎕의 미온 배지를 큐벳에 첨가하였다. 마지막으로 샘플을 큐벳에서 예비 가온한 6웰 플레이트로 옮겼다. 또한 큐벳도 500 ㎕의 배지로 헹구고, 웰에 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 37℃ 및 5% C02로 3 ∼ 14 일간 배양하였다.
뉴클레오펙션 후 3일째에, 세포를 FACS로 분석하여 형질감염 효율을 측정하였다. 뉴클레오펙션 후 14일째에, 공지된 방법(Urnov et al., 2005; Zou et al., 2009)을 이용하여 세포로부터 gDNA를 수거하였다. 관심의 게놈 유전자좌를 표적화하고, 적절하게 설계된 프라이머로 PCR에 의해 증폭시켰다. 이어서, 게놈 편집이 성공적일 경우에, 삽입된 제한 부위를 절단하는 제한 효소 Xhol(NEB)로 PCR 생성물을 소화시켰다. 각각의 샘플의 소화된 PCR 생성물을 PAGE에 의해 최종적으로 분석하여 표적화된 대립 유전자의 백분율을 구하였다. 표적화된 대립 유전자의 백분율은 절단 밴드 대 비절단 밴드의 밀도를 비교함으로써 산출하였다.
미니벡터 및 플라스미드를 이용한 표적화 유전자 편집의 결과
PAGE를 이용하여 세포 집단 내의 표적화된 대립 유전자의 백분율을 구하였다. 표적화 게놈 편집이 성공적일 경우, Xhol 제한 효소에 대한 제한 부위가 IL2Rγ 유전자의 표적화된 DNA 내에 생성되었다. DNA의 이 표적화된 영역을 적절한 프라이머로 PCR에 의해 증폭시킨 다음, Xhol 효소로 제한 소화시켰다. 겔 상에서 주행시켰을 때, 변형되지 않은 상기 대립 유전자의 PCR 생성물은 큰 단일 밴드로서 주행하였는데, 이들이 제한 부위를 함유하지 않고 효소에 의해 절단되지 않았기 때문이다. 대조적으로, 표적화되고 공여체 주형으로 수복된 임의의 대립 유전자는 2개의 짧은 밴드로서 주행하였는데, PCR 생성물이 상기 효소에 의해 인식되고 절단되었기 때문이다. 미니벡터는 공여체 주형의 제공에 있어 성공적이었으며, 제한 부위로 대립 유전자의 6% ∼ 7%를 변형시켰다(도 4).
실시예 2
미니벡터계 공여체 주형 및 메가뉴클레아제를 이용한 표적화 유전자 교정
표준 분석을 이용하여, 표적화 유전자 교정(TGC)을 위한, 호밍 엔도뉴클레아제(희귀 절단 메가뉴클레아제)와 함께, 공여체 주형의 역할을 하는 미니벡터의 능력을 입증하였다(Humbert and Maizels, 2012). 유전자 교정은, PGK(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터의 제어 하에서, 안정적으로 통합되었으나 돌연변이형의 고순도 녹색 형광 단백질(eGFP) 유전자를 담지하도록 조작된 HEK293T 세포(인간 배아 신장 세포)로 세포 배양 시스템에 성취하였다. 이 돌연변이형의 eGFP 유전자는 2개의 인-프레임 N 말단 종결 코돈을 담지하여, 세포주에서의 형광 리포터 단백질(GFP)의 발현을 방지한다. 완전 작용성 eGFP 발현 카세트(종결 코돈이 결여되어 있는 PGK 프로모터 및 eGFP 유전자 모두)를 위한 주형을 제공하는 미니벡터가 생성되었다. 따라서 이 미니벡터는, 세포 게놈에서 발현 카세트에 상보적인 DNA 영역, 및 상보적이지 않은 세포에서 표적화 DNA 서열에 상응하는 작은 영역을 함유하였는데, 이것이 두 종결 코돈을 함유하지 않았기 때문이다. 본원에서는 2가지 형태의 공여체 주형 미니벡터를 시험하였으며, 하나는 PGK 프로모터의 전장을 갖는 것(긴 좌측 상동 암)이고 다른 하나는 절단된 PGK 프로모터 서열(짧은 좌측 상동 암)을 갖는 것이었다. 양쪽 형태 모두 개별적으로 HEK293 세포의 배양물로 형질감염시켰다. 동시에, 세포를 통합-결핍 렌티바이러스 벡터로 형질도입하여 희귀 절단 뉴클레아제(I-Anil, 메가뉴클레아제 일족 중 하나)를 전달하였으며, 이것은 eGFP 유전자 내의 두 종결 코돈의 위치 부근의 20 bp 표적 부위에 이중 가닥 절단을 생성하였다. 성공적인 상동 유도 수복(HDR)이 일어나면, eGFP 유전자가 교정되고, 세포는 GFP 리포터(GFP+)의 발현을 개시한다.
별개의 형광 단백질 리포터 시스템을 이용하여, 바이러스에 의해 성공적으로 형질도입되었고 I-Anil 뉴클레아제를 생성하는 세포를 확인하였다. 이 시스템을 위해, T2A 펩티드 번역 연결제를 통해 I-Anil 뉴클레아제를 mTagBFP(단량체 청색 형광 단백질)에 연결시켰다. 이에 의해, I-Anil 단백질과 mTagBFP 리포터 단백질 모두가, 동일한 개방형 해독 프레임으로부터 동시에 발현되었다. 상기 두 단백질은 T2A 펩티드에서 분할 현상에 의해 번역후 분리됨으로써, 적절한 단백질 접힘 및 작용성를 허용하였다. 따라서, 청색 형광 단백질(BFP+)을 발현하는 세포가 역시 I-Anil 뉴클레아제를 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 모든 실험에 있어서, 세포 집단은 유세포 분석으로 분석하였다. 프로토콜은 앞서 기술한 바와 같이 따랐다(Humbert and Maizels, 2012).
방법
HEK293 세포를 10%로 우태아 혈청(FBS)을 공급한 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)에서 부착 집단으로서 배양하고, 37℃ 및 5% C02로 항온 처리하였다. 배지 2∼3일마다 보충하고, 세포를 집밀도가 80%에 가까워졌을 때 계대배양하였다. 세포를 미니벡터 공여체 주형으로 형질감염시키고, 동시에 mTagBFP 리포터 및 I-Anil 메가뉴클레아제를 코딩하는 통합-결핍 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 형질감염 후 3일째에, 세포를 수거하고, 유세포 분석에 의해 분석하여, 어떤 집단이 형광 리포터 단백질에 양성인지 확인하였다.
결과
예상한 바와 같이, I-Anil 발현의 부재시에는 수복이 없음이 나타났다(도 5c, 상측 왼쪽). I-Anil을 발현하는 세포(BFP+)에서는, 온전한 PGK 프로모터를 담지하는 미니벡터가, 형질감염된 세포의 3.9%에서 표적화 유전자 교정을 지지하였다. 이는, 종래의 플라스미드 공여체로의 수복의 빈도에 필적하는 것이다. PGK 프로모터의 절단된 형태를 갖는 미니벡터 공여체를 이용하는 표적화 유전자 교정의 빈도는 10배 낮았으며(0.4%); 종래의 벡터는 전장 프로모터에 대해 유사한 의존도를 보인다(도 5c).
본원에 기술한 구체예는, 예시적인 것으로 여겨져야 하며, 본 개시 내용의 나머지를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 여겨져서는 안된다. 구체예를 제시하고 설명하면서, 본 발명의 개념 및 교시 내용을 벗어나지 않고 당업자에 의해 그의 다수의 변화 및 변형이 이루어질 수 있을 것이다. 따라서, 보호의 범위는 상기 기술한 설명에 의해 제한되지 않고, 청구범위(청구범위의 주제의 모든 균등 범위를 포함)에 의해서만 한정된다. 본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개 공보의 개시 내용은 이에 의해, 본원에 개시된 것들과 일치하고 그를 보충하는 절차적인 사항 또는 다른 상세 사항을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 인용된다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

Claims (35)

  1. DNA 서열의 표적화된 변경을 위한 조성물로서,
    생체내 또는 시험관내에서 세포 내의 표적화된 DNA 서열의 상동 유도(homology-directed) 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터(MiniVector)를 포함하고,
    상기 미니벡터는, 세균 복제 기점과 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있고 크기가 약 2,500 염기쌍 이하인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 표적화된 DNA 서열의 상동 유도 수복, 변경 또는 대체를 위한 핵산 서열 주형이,
    변경될 표적화된 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 주형 부분; 및
    변경될 표적화된 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 주형 부분으로서, 상기 핵산 주형의 비상보적인 부분이 표적화된 DNA 서열에 필요한 변경을 포함하는 것인 주형 부분
    을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 변경될 표적화된 DNA 서열이 세포 내의 게놈, 미토콘드리아 또는 색소체 DNA인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 1 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 더 포함하는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 미니벡터의 핵산 서열 주형의 일부분에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가, 별개의 미니벡터, 플라스미드, 전령 RNA 또는 바이러스에 의해 코딩되거나, 단백질로서 전달되는 것인 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc finger nuclease), 전사-활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: transcription-activator-like effector nuclease), 메가뉴클레아제(meganuclease), 및 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) / CAS(CRISPR associated) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 단일 가닥 절단을 유도하는 것인 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 이중 가닥 절단을 유도하는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상동 유도 수복, 변경 또는 대체가, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템(sleeping beauty transposon system)을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전이효소(transposase) 또는 재조합효소에 의해 매개되는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 미니벡터가 화학적 부분, 변형된 올리고뉴클레오티드 및/또는 변형된 백본을 더 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 세포가 포유류, 원핵, 진핵, 고세균류 또는 식물의 세포인 조성물.
  13. 제1항의 조성물을 포함하는 세포.
  14. 제13항에 있어서, 포유류, 원핵, 진핵, 고세균류 또는 식물의 세포인 세포.
  15. 제1항의 조성물을 포함하는 키트.
  16. 제4항의 조성물을 포함하는 키트.
  17. 세포에서 표적 DNA 서열을 변경하는 방법으로서,
    a) 핵산 서열 주형을 포함하는 미니벡터를 형질감염시키는 단계로서, 상기 핵산 서열 주형이, 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 부분; 및 표적 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 부분을 포함하고, 상기 핵산 주형의 비상보적인 부분이 원하는 변경을 포함하는 것인 단계;
    b) 비상보적인 부분을 제외하고, 핵산 서열 주형의 상보적인 영역을 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열과 염기쌍 형성(base pairing)시키는 단계; 및
    c) 원하는 변경을 표적 DNA 서열에 서열 특이적 방식으로 도입시키는 단계
    를 포함하며,
    상기 미니벡터는, 세균 복제 기점 및 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있고 크기가 약 2,500 염기쌍 이하인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 1 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 미니벡터의 핵산 주형의 일부분에 의해 코딩되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제를 제공하는 단계가, 이 부위 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 별개의 미니벡터, 플라스미드, 전령 RNA 또는 바이러스, 또는 단백질을 동시형질감염시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 및 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) / CAS(CRISPR associated) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 단일 가닥 절단을 유도하는 것인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 이중 가닥 절단을 유도하는 것인 방법.
  24. 제17항에 있어서, 표적 DNA의 변경이, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전이효소 또는 재조합효소에 의해 매개되는 것인 방법.
  25. 제17항에 있어서, 미니벡터가 화학적 부분, 변형된 올리고뉴클레오티드 및/또는 변형된 백본을 더 포함하는 것인 방법.
  26. 유전 질환 또는 다른 병태의 치료를 필요로 하는 대상에서 유전 질환 또는 다른 병태를 치료하는 방법으로서,
    표적 DNA 서열의 변경이 필요하며,
    a) 대상에게 핵산 서열 주형을 포함하는 치료 유효량의 미니벡터를 투여하는 단계로서, 상기 핵산 서열 주형이, 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열에 상보적인 1 이상의 부분; 및 표적 DNA 서열에 상보적이지 않은 1 이상의 부분을 포함하고, 상기 핵산 주형의 비상보적인 부분이 원하는 변경을 포함하는 것인 단계;
    b) 비상보적인 부분을 제외하고, 핵산 서열 주형의 상보적인 영역을 표적 DNA 서열 부근의 핵산 서열과 염기쌍 형성시키는 단계; 및
    c) 원하는 변경을 표적화된 DNA 서열에 서열 특이적 방식으로 도입시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 미니벡터는, 세균 복제 기점 및 항생물질 선별 유전자가 모두 결여되어 있고 크기가 약 2,500 염기쌍 이하인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 1 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 동시투여하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 미니벡터의 핵산 주형의 일부분에 의해 코딩되는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 동시투여는 부위 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 별개의 미니벡터, 플라스미드, 전령 RNA 또는 바이러스, 또는 단백질을 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 및 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) / CAS(CRISPR associated) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 단일 가닥 절단을 유도하는 것인 방법.
  32. 제27항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가, 표적 DNA 서열에서 하나 이상의 이중 가닥 절단을 유도하는 것인 방법.
  33. 제26항에 있어서, 표적 DNA의 변경이, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전이효소 또는 재조합효소에 의해 매개되는 것인 방법.
  34. 제26항에 있어서, 미니벡터가 화학적 부분, 변형된 올리고뉴클레오티드 및/또는 변형된 백본을 더 포함하는 것인 방법.
  35. 제26항에 있어서, 대상이 포유동물 또는 식물인 방법.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180127358A (ko) * 2016-03-15 2018-11-28 막스-델부뤽-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 인 데어 헬름홀츠-게마인샤프트 증강된 슬리핑 뷰티 트랜스포존, 키트 및 전위 방법
US10669558B2 (en) 2016-07-01 2020-06-02 Microsoft Technology Licensing, Llc Storage through iterative DNA editing
US10892034B2 (en) 2016-07-01 2021-01-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Use of homology direct repair to record timing of a molecular event
US11359234B2 (en) 2016-07-01 2022-06-14 Microsoft Technology Licensing, Llc Barcoding sequences for identification of gene expression

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2023-10-31 Univ California Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
KR102006880B1 (ko) 2012-12-06 2019-08-02 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
ES2901396T3 (es) 2013-03-14 2022-03-22 Caribou Biosciences Inc Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
WO2014182700A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
EP3418379B1 (en) 2013-09-18 2020-12-09 Kymab Limited Methods, cells & organisms
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
US11318206B2 (en) 2014-03-28 2022-05-03 Aposense Ltd Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
AU2015237746B2 (en) * 2014-03-28 2020-01-30 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
CN106574246A (zh) 2014-04-10 2017-04-19 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 用于细胞免疫治疗的方法和组合物
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US11071289B2 (en) 2014-08-14 2021-07-27 Biocytogen Boston Corp DNA knock-in system
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
CN105821072A (zh) * 2015-01-23 2016-08-03 深圳华大基因研究院 用于DNA组装的CRISPR-Cas9系统及DNA组装方法
CA2994829A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific car t-cells for solid tumor targeting
CA2999500A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
US11530253B2 (en) 2016-02-25 2022-12-20 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by CRISPR/CAS9 technology
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CN109642232A (zh) 2016-06-01 2019-04-16 Kws种子欧洲股份公司 用于基因组改造的杂合核酸序列
IL264565B1 (en) 2016-08-03 2024-03-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CA3039935A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Limagrain Europe Nucleic acid encoding sm1 resistance to orange wheat blossom midge and method of use
JP2019530464A (ja) 2016-10-14 2019-10-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基エディターのａａｖ送達
WO2018144097A1 (en) 2016-11-04 2018-08-09 Akeagen Llc Genetically modified non-human animals and methods for producing heavy chain-only antibodies
JP7091357B2 (ja) 2016-12-12 2022-06-27 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） 哺乳動物細胞における薬物リガンドの誘導による導入遺伝子の発現に対する感受性が増強されたキメラ転写因子バリアント
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CA3049640A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110914310A (zh) 2017-03-10 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器
US20180305701A1 (en) 2017-03-14 2018-10-25 Baylor College Of Medicine Targeting minivectors to specific tissue using shape
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CA3078280A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Biogemma Improved yield in plants by overexpressing a trehalose-6 phosphate synthase
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
WO2019086510A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Vilmorin & Cie Wheat comprising male fertility restorer alleles
US20200048716A1 (en) 2017-11-03 2020-02-13 Twister Biotech, Inc Using minivectors to treat ovarian cancer
BR112020008919A2 (pt) * 2017-11-21 2020-10-20 Monsanto Technology Llc plantas modificadas com traços aprimorados
GB201805865D0 (en) 2018-04-09 2018-05-23 Innes John Centre Genes
WO2019226650A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Modernatx, Inc. Delivery of dna
EP3920687A1 (en) 2019-02-06 2021-12-15 Vilmorin & Cie New gene responsible for cytoplasmic male sterility
WO2020191239A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP3993612A1 (en) 2019-07-05 2022-05-11 Limagrain Europe Method for increasing yield in plants
FR3099178A1 (fr) 2019-07-24 2021-01-29 Soltis Tournesol à teneur élevée en acide oléique et procédé d’obtention
TW202124722A (zh) 2019-09-18 2021-07-01 美商英特佳樂帝克醫療公司 合成dna載體及其使用方法
CN112779266A (zh) 2019-11-06 2021-05-11 青岛清原化合物有限公司 在生物体内创制新基因的方法及应用
US20230123128A1 (en) * 2020-04-03 2023-04-20 Progenitor Life Sciences Targeting tapasin and tap complex to improve cellular immune-compatibility
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
JP2023527875A (ja) 2020-06-01 2023-06-30 モダーナティエックス・インコーポレイテッド フェニルアラニンヒドロキシラーゼバリアント及びその使用
WO2022240806A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Modernatx, Inc. Non-viral delivery of dna for prolonged polypeptide expression in vivo
US20240100189A1 (en) 2021-09-10 2024-03-28 Twister Biotech, Inc Using minivectors to treat idiopathic pulmonary fibrosis
US20240093226A1 (en) 2021-09-10 2024-03-21 Baylor College Of Medicine Ultrapure minivectors for gene therapy

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1100201A (en) * 1999-10-28 2001-05-08 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of in vivo gene transfer using a sleeping beauty transposon system
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
CA2777835A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Baylor College Of Medicine Supercoiled minicircle dna for gene therapy applications
WO2012064970A1 (en) * 2010-11-12 2012-05-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Site-directed integration of transgenes in mammals
WO2013158309A2 (en) * 2012-04-18 2013-10-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-disruptive gene targeting

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180127358A (ko) * 2016-03-15 2018-11-28 막스-델부뤽-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 인 데어 헬름홀츠-게마인샤프트 증강된 슬리핑 뷰티 트랜스포존, 키트 및 전위 방법
US10669558B2 (en) 2016-07-01 2020-06-02 Microsoft Technology Licensing, Llc Storage through iterative DNA editing
US10892034B2 (en) 2016-07-01 2021-01-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Use of homology direct repair to record timing of a molecular event
US11359234B2 (en) 2016-07-01 2022-06-14 Microsoft Technology Licensing, Llc Barcoding sequences for identification of gene expression

Also Published As

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