JP2019530464A - 核酸塩基エディターのａａｖ送達 - Google Patents

核酸塩基エディターのａａｖ送達 Download PDF

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Abstract

本明細書において提供されるのは、完全かつ機能的なCas9タンパク質または核酸塩基エディターを形成させるために、例えば組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）を介して、「スプリット型」Cas9タンパク質または核酸塩基エディターを細胞中に送達する方法である。Cas9タンパク質または核酸塩基エディターを、２つのセクションに分割して、各々を、インテイン系（例えば、それぞれdnaEnおよびdnaEcによりコードされる、インテイン−Ｎおよびインテイン−Ｃ）の一部に融合させる。共発現により、Cas9タンパク質または核酸塩基エディターの２つのセクションは、インテインにより媒介されるタンパク質のスプライシングを介して、一緒にライゲーションされる。スプリット型Cas9タンパク質または核酸塩基エディターの送達のための組み換えＡＡＶベクターおよび粒子、ならびに、かかるＡＡＶベクターおよび粒子を用いる方法もまた、提供される。

Description

関連出願
本願は、２０１６年１０月１４日に出願された米国仮出願U.S.S.N. 62/408,575、および２０１７年３月２３日に出願されたU.S.S.N. 62/475,780の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の優先権を主張し、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号R35 GM118062およびR01 EB022376下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
CRISPR／Cas9系を用いる正確なゲノムターゲティング技術は、最近、遺伝子治療を含む広範な用途において研究されてきた。遺伝子治療におけるCas9およびCas9に基づくゲノム編集剤の適用についての主要な限定要因は、Cas9のサイズ（＞４ｋｂ）であり、これが、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）を介するその効率的な送達を妨げている。
要旨
本明細書において記載されるのは、Cas9タンパク質または核酸塩基エディターを、例えば組み換えアデノ関連ウイルスベクターを介して、細胞に送達するための、系、組成物、キットおよび方法である。典型的には、Cas9タンパク質または核酸塩基エディターを、Ｎ末端部分およびＣ末端部分に「スプリット」する。Cas9タンパク質または核酸塩基エディターのＮ末端部分またはＣ末端部分を、それぞれ、インテイン系の１つのメンバーに融合させてもよい。生じる融合タンパク質は、別々のベクター（例えば、別々のｒＡＡＶベクター）上で１つの細胞中に送達されて共発現された場合に、連結されて、完全かつ機能的なCas9タンパク質または核酸塩基エディターを（例えば、インテインにより媒介されるタンパク質のスプライシングを介して）形成することができる。さらに提供されるのは、スプリット型Cas9タンパク質または核酸塩基エディターの高い発現レベルのための、送達ベクター中の調節エレメントの実験的な試験である。
本開示のいくつかの側面は、以下：（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；および（ｉｉ）Cas9タンパク質のＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む組成物を提供し、ここで、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している。
いくつかの態様において、Cas9タンパク質のＮ末端部分は、配列番号１のアミノ酸１〜５７３または１〜６３７に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質のＣ末端部分は、配列番号１のアミノ酸５７４〜１３６８または６３８〜１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む。いくつかの態様において、インテイン−Ｎは、配列番号３５０〜３５１および３５４〜３５５に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、インテイン−Ｃは、配列番号３５２〜３５３および３５６〜３５７に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に連結されたガイドＲＮＡ（gRNA）をコードするヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、転写ターミネーターをさらに含む。いくつかの態様において、転写ターミネーターは、bGH遺伝子、hGH遺伝子、またはSV40遺伝子からの転写ターミネーターである。いくつかの態様において、転写ターミネーターは、bGH遺伝子からの転写ターミネーターである。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、転写ターミネーターの５’に挿入されたウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。
いくつかの態様において、二分核定位シグナルは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３４４）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号３４５）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号３４６）、およびＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ（配列番号３４７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、二分核定位シグナルは、配列番号３４４に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、触媒として不活性なCas9（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）であり、ここで、（ｉ）の第１のヌクレオチド配列は、Cas9タンパク質のＮ末端部分のＮ末端に融合した核酸塩基修飾酵素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、触媒として不活性なCas9（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）であり、ここで、（ｉｉ）の第２のヌクレオチド配列は、Cas9タンパク質のＣ末端部分のＣ末端に融合した核酸塩基修飾酵素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの態様において、核酸塩基修飾酵素は、デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、シトシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、（ｉｉ）の第２のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の３’末端に融合したウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの態様において、（ｉ）の第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の５’末端においてウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、配列番号２９９〜３０２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とは、異なるベクター上にある。いくつかの態様において、異なるベクターの各々は、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）のゲノムである。いくつかの態様において、各々のベクターは、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされている。
本開示の他の側面は、以下：（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、第１の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子；および（ｉｉ）Cas9タンパク質のＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、第２の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、を含む組成物を提供し、ここで、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している。
本明細書において記載される組成物を含む細胞が提供される。いくつかの態様において、Cas9タンパク質のＮ末端部分と、Cas9タンパク質のＣ末端部分とは、一緒に連結されて、Cas9タンパク質を形成する。いくつかの態様において、細胞は、原核細胞である。いくつかの態様において、細胞は、細菌細胞である。いくつかの態様において、細胞は、真核細胞である。いくつかの態様において、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。
さらに提供されるのは、本明細書において記載される組成物のうちのいずれかを含むキットである。
本開示のいくつかの側面は、以下を含む組成物を提供する：（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合した核酸塩基エディターのＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；および（ｉｉ）核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列。
いくつかの態様において、インテイン−Ｎは、配列番号３５０〜３５１および３５４〜３５５に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、インテイン−Ｃは、配列番号３５２〜３５３および３５６〜３５７に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に連結されたガイドＲＮＡ（gRNA）をコードするヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、転写ターミネーターをさらに含む。いくつかの態様において、転写ターミネーターは、bGH遺伝子、hGH遺伝子、またはSV40遺伝子からの転写ターミネーターである。いくつかの態様において、転写の終末は、bGH遺伝子からのものである。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、転写ターミネーターの５’に挿入されたウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している。いくつかの態様において、二分核定位シグナルは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３４４）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号３４５）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号３４６）、およびＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ（配列番号３４７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、二分核定位シグナルは、配列番号３４４に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、触媒として不活性なCas9またはCas9ニッカーゼのＮ末端に融合したシトシンデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼは、APOBEC1、APOBEC3、AIDおよびpmCDA1からなる群より選択される。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、配列番号２９９〜３０２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とは、異なるベクター上にある。いくつかの態様において、異なるベクターの各々は、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）のゲノムである。いくつかの態様において、ベクターは、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされている。
本開示の他の側面は、以下：（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合した核酸塩基エディターのＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、第１の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子；および（ｉｉ）核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２の核酸を含む、第２の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を提供する。
本明細書において記載される組成物のうちのいずれかを含む細胞が提供される。いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＮ末端部分と核酸塩基エディターのＣ末端部分とは、一緒に連結されて、核酸塩基エディターを形成する。いくつかの態様において、細胞は、原核細胞である。いくつかの態様において、細胞は、細菌細胞である。いくつかの態様において、細胞は、真核細胞である。いくつかの態様において、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。
さらに提供されるのは、本明細書において記載される組成物のうちのいずれかを含むキットである。
本開示のさらに他の側面は、細胞を本明細書において記載される組成物のうちのいずれかと接触させることを含む方法を提供し、ここで、接触させることは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらし、およびここで、核酸塩基エディターのＮ末端部分と核酸塩基エディターのＣ末端部分とは、連結されて、核酸塩基エディターを形成する。
本開示のさらに他の側面は、それを必要とする対象に、本明細書において記載される組成物のうちのいずれかの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、疾患または障害を有する。
いくつかの態様において、疾患または障害は、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮溶解性角化症（ＥＨＫ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、４Ｊ型シャルコー・マリー・トゥース病、神経芽細胞腫（ＮＢ）、フォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）、先天性筋強直症、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、およびデスミン関連心筋症（ＤＲＭ）からなる群より選択される。
本発明のある態様の詳細は、以下に記載されるとおり、ある態様の詳細な説明において記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、定義、例、図面および請求の範囲から明らかであろう。
図面の簡単な説明
添付の図面は、本願の一部を構成し、本発明のいくつかの態様を説明し、記載と一緒に、本発明の原理を説明するために役立つ。
図１Ａは、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを用いる細胞中への送達のための「スプリット型核酸塩基エディター」を示すグラフである。図１Ａは、核酸塩基エディターがどのようにして２つの部分にスプリットされるかの模式図である。 図１Ｂは、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを用いる細胞中への送達のための「スプリット型核酸塩基エディター」を示すグラフである。図１Ｂは、ＡＡＶにより送達されるスプリット型核酸塩基エディターが、細胞中での２つの半分の発現の後で、タンパク質のスプライシングを受けて、全体として発現された核酸塩基エディターに匹敵する活性を有する完全な核酸塩基エディターを形成することができることを示す。 図１Ｃは、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを用いる細胞中への送達のための「スプリット型核酸塩基エディター」を示すグラフである。図１Ｃは、DnaEインテインにより媒介されるタンパク質のスプライシングを介する、２つの半分からの完全な核酸塩基エディターの形成を示す。
図２は、Ｕ１１１８細胞が、mCherryをコードする核酸を含むＡＡＶ２により効率的にトランスフェクトされたことを示す。様々なウイルス力価を試験し（４．５×１０１１ｖｇ／ｍｌ*において２．５〜１０μｌ）、全てが、Ｕ１１８細胞の効率的なトランスフェクションをもたらした。*ｖｇ／ｍｌは、１マイクロリットルあたりのウイルスゲノム含有粒子を意味する。
図３Ａは、Ｕ１１８およびＨＥＫ細胞におけるｒＡＡＶにより送達されたスプリット型核酸塩基エディターによる核酸塩基編集のハイスループットシークエンシング（ＨＴＳ）の結果を示すグラフである。脂質によりトランスフェクトされた核酸塩基エディターを、対照として用いた。PRNP遺伝子中のＲ３７を標的とするsgRNAを用い、PRNP遺伝子座をシークエンシングした。図３Ａは、ＨＴＳの読み値を示す。 図３Ｂは、Ｕ１１８およびＨＥＫ細胞におけるｒＡＡＶにより送達されたスプリット型核酸塩基エディターによる核酸塩基編集のハイスループットシークエンシング（ＨＴＳ）の結果を示すグラフである。脂質によりトランスフェクトされた核酸塩基エディターを、対照として用いた。PRNP遺伝子中のＲ３７を標的とするsgRNAを用い、PRNP遺伝子座をシークエンシングした。図３Ｂは、塩基編集の結果を要約する。
図４は、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶコンストラクトにおいて用いられる転写ターミネーターの最適化を示すグラフである。様々なサイズおよび起源の転写ターミネーターを試験した。bGH転写ターミネーターは、より長いターミネーター配列と比較して、比較的短く、効率的に転写を終結させる。したがって、それを、下流の実験において用いるために選択した。
図５Ａ〜５Ｂは、ヒトApoE4のｃＤＮＡを発現するマウスアストロサイトにおける、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶの長期（１５日間まで）の形質導入による、核酸塩基編集の結果を示すグラフである。標的塩基は、ApoE4中のアルギニン１１２およびアルギニン１５８についてのコドン中にあり、これは、塩基編集によりシステインに変換される。図５Ａは、マウスアストロサイトに１０１０ｖｇで形質導入した場合に、アルギニン１５８の編集は経時的に増大する一方で、アルギニン１１２の編集は最少であり続けることことを示す。アルギニン１５８配列についてのコドンのヌクレオチド配列３’は、隣接するNGG PAMを備え、SpCas9による高い活性を可能にする（ガイド配列ＧＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＡＣＣ、配列番号３４８による）が、一方、アルギニン１１２についてのコドンのヌクレオチド配列３’は、隣接するNAG PAMを含み、これは、高い活性を可能にしない（ガイド配列ＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧ、配列番号３４９による）。図５Ｂは、mCherryをコードするｒＡＡＶにより１０１０ｖｇで形質導入された細胞を示す（対照）。
図６は、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶコンストラクトにおける核移行シグナルの最適化の模式図である。核移行シグナルは、編集の必須条件として、再構成された核酸塩基エディターがゲノムＤＮＡと結合するために起きなければならない核内移行を制御し、プロセスにおける潜在的な律速段階である。この模式図は、ＮＬＳ（およびＮＬＳの最適化）が、核酸塩基エディターが核内に移行されるために重要であることを示す。
図７は、様々な核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む様々なｒＡＡＶスプリット型核酸塩基エディターコンストラクトを用いた塩基編集の結果を示すグラフである。
図８Ａ〜８Ｂは、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶを用いた、分離したマウス皮質ニューロンにおけるDNMT1遺伝子の編集を示すグラフである。
図９Ａ〜９Ｂは、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶ、または核酸塩基エディターをコードする脂質によりトランスフェクトされたＤＮＡのいずれかを用いた、マウスNeuro-2a細胞株におけるDNMT1遺伝子の編集を示すグラフである。
定義
本明細書および請求の範囲において用いられる場合、単数形態「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他を示さない限り、単数および複数の言及を含む。したがって、例えば、「剤（an agent）」への言及は、単一の剤および複数のかかる剤を含む。
本明細書において用いられる場合、用語「Cas9」、「Cas9タンパク質」、または「Cas9ヌクレアーゼ」とは、Cas9タンパク質（例えば多様な細菌種からのCas9ヌクレアーゼ）、そのフラグメント、バリアント（例えば触媒として不活性なCas9もしくはCas9ニッカーゼ）、または融合タンパク質（例えば別のタンパク質ドメインに融合したCas9）を含む、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを指す。Cas9ヌクレアーゼはまた、ときに、casn1ヌクレアーゼまたはCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連ヌクレアーゼとしても言及される。CRISPRは、可動遺伝要素（ウイルス、転位因子、および接合性プラスミド）に対する保護を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動因子に対して相補的な配列、および標的に侵入する核酸を含む。CRISPRクラスターは、転写され、CRISPR RNA（crRNA）へとプロセッシングされる。ＩＩ型CRISPR系において、プレcrRNAの正確なプロセッシングは、トランス活性化型小分子ＲＮＡ（trans-encoded small RNA：tracrRNA）、内在リボヌクレアーゼ３（rnc）およびCas9タンパク質を必要とする。tracrRNAは、リボヌクレアーゼ３により補助されるプレcrRNAのプロセッシングのためのガイドとして働く。その後、Cas9／crRNA／tracrRNAは、スペーサーに対して相補的な直鎖または環状dsDNA標的を、ヌクレオチド切断により切断する。本質的に、ＤＮＡの結合および切断は、典型的には、タンパク質および両方のＲＮＡを必要とする。しかし、単鎖ガイドＲＮＡ（「sgRNA」、または単に「gNRA」）は、crRNAとtracrRNAとの両方の側面を単一のＲＮＡ種に取り込むために操作することができる。Cas9タンパク質およびそれらのそれぞれのアミノ酸配列の非限定的な例を、例１において提供する。
ヌクレアーゼ不活化Cas9タンパク質は、交換可能に、「dCas9」タンパク質（ヌクレアーゼ−「dead」Cas9について）として言及され得る。不活性なＤＮＡ切断ドメインを有するCas9タンパク質（またはそのフラグメント）を作製するための方法は、公知である（例えば、本明細書において参考として援用されるJinek et al., Science. 337：816-821（2012）；Qi et al.,（2013）Cell. 28;152（5）：1173-83を参照）。例えば、Cas9のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを含むことが知られている。HNHサブドメインはgRNAに対して相補的な鎖を切断し、一方、RuvC1サブドメインは非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン中の変異は、Cas9のヌクレアーゼ活性をサイレントにし得る。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、S. pyogenesのCas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活化する（Jinek et al., Science. 337：816-821（2012）；Qi et al., Cell. 28;152（5）：1173-83（2013）。さらなる好適なヌクレアーゼ不活化dCas9ドメインは、本開示および当該分野における知識に基づいて、当業者には明らかであり、本開示の範囲内である。かかるさらなる例示的な好適なヌクレアーゼ不活化Cas9ドメインとして、これらに限定されないが、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０ＡおよびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメインが挙げられる（例えば、本明細書において参考として援用されるPrashant et al., Nature Biotechnology. 2013；31（9）：833-838を参照）。
いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、核酸塩基エディターの一部として用いられる。Cas9ニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡのうちの一本の鎖を切断することができる。Cas9ニッカーゼは、HNHドメインまたはRuvC1ドメインのいずれかに不活化変異を導入することにより作製することができる。例えば、HNHドメインを活性に保つ、すなわち、位置８４０における残基をヒスチジンとしたままで、不活化変異（Ｄ１０Ａ）をS. pyogenes Cas9のRuvC1ドメイン中に導入してもよい。かかるCas9バリアントは、gRNAにより定義される標的配列に基づく特異的な位置において、一本鎖ＤＮＡの切断（ニック）を作製することができる。当業者は、任意の既知のCas9タンパク質のRuvC1およびHNHドメインにおける触媒性残基を同定して、対応するdCas9またはnCas9を作製するために、不活化変異を導入することができる。
「スプリット型Cas9タンパク質」または「スプリット型Cas9」とは、２つの別々のヌクレオチド配列によりコードされるＮ末端部分（Ｎ末端の半分としてもまた言及される）およびＣ末端部分（Ｃ末端の半分としてもまた言及される）として提供される、Cas9タンパク質を指す。Cas9タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分に対応するポリペプチドを、組み合わせて（連結して）、完全なCas9タンパク質を形成させることができる。Cas9タンパク質は、異常な（disordered）リンカーにより連結された２ローブ（bi-lobed）構造からなることが知られている（例えば、本明細書において参考として援用されるNishimasu et al., Cell, Volume 156, Issue 5, pp. 935-949, 2014に記載のもの）。いくつかの態様において、「スプリット」は、２つのローブの間で起こり、各々が１つのローブを含むCas9タンパク質の２つの部分を生じる。
「インテイン」は、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスにおいて、自らを切除して、残りの部分（エクステイン）をペプチド結合により連結することができる、タンパク質のセグメントである。インテインはまた、「タンパク質イントロン」としても言及される。インテインが自らを切除してタンパク質の残りの部分を連結するプロセスは、本明細書において、「タンパク質スプライシング」または「インテインにより媒介されるタンパク質スプライシング」と称される。いくつかの態様において、前駆体タンパク質のインテイン（インテインにより媒介されるタンパク質スプライシングの前のタンパク質をふくむインテイン）は、２つの遺伝子に由来する。かかるインテインは、本明細書において、スプリット型インテインとして言及される。例えば、ラン藻類において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの触媒性サブユニットαであるDnaEは、２つの別々の遺伝子、dnaE-nおよびdnaE-cによりコードされる。dnaE-n遺伝子によりコードされるインテインは、本明細書において「インテイン−Ｎ」として言及される。dnaE-c遺伝子によりコードされるインテインは、本明細書において「インテイン−Ｃ」として言及される。
他のインテイン系もまた、用いることができる。例えば、dnaEインテイン、Cfa-NおよびCfa-Cインテインペアに基づく合成インテインが、記載されている（例えば、本明細書において参考として援用されるStevens et al., J Am Chem Soc. 2016 Feb 24;138（7）：2162-5において）。本開示に従って用いることができるインテインペアの非限定的な例として、以下が挙げられる：Cfa DnaEインテイン、Ssp GyrBインテイン、Ssp DnaXインテイン、Ter DnaE3インテイン、Ter ThyXインテイン、Rma DnaBインテイン、およびCne Prp8インテイン（例えば、本明細書において参考として援用される米国特許8,394,604に記載のもの）。
インテインの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
DnaEインテイン−Ｎ、ＤＮＡ：
TGCCTGTCATACGAAACCGAGATACTGACAGTAGAATATGGCCTTCTGCCAATCGGGAAGATTGTGGAGAAACGGATAGAATGCACAGTTTACTCTGTCGATAACAATGGTAACATTTATACTCAGCCAGTTGCCCAGTGGCACGACCGGGGAGAGCAGGAAGTATTCGAATACTGTCTGGAGGATGGAAGTCTCATTAGGGCCACTAAGGACCACAAATTTATGACAGTCGATGGCCAGATGCTGCCTATAGACGAAATCTTTGAGCGAGAGTTGGACCTCATGCGAGTTGACAACCTTCCTAAT（配列番号３５０）
DnaEインテイン−Ｎ、タンパク質：CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN（配列番号３５１）
DnaEインテイン−Ｃ、ＤＮＡ：
ATGATCAAGATAGCTACAAGGAAGTATCTTGGCAAACAAAACGTTTATGATATTGGAGTCGAAAGAGATCACAACTTTGCTCTGAAGAACGGATTCATAGCTTCTAAT（配列番号３５２）
インテイン−Ｃ：
MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN（配列番号３５３）
Cfa-N、ＤＮＡ：
TGCCTGTCTTATGATACCGAGATACTTACCGTTGAATATGGCTTCTTGCCTATTGGAAAGATTGTCGAAGAGAGAATTGAATGCACAGTATATACTGTAGACAAGAATGGTTTCGTTTACACACAGCCCATTGCTCAATGGCACAATCGCGGCGAACAAGAAGTATTTGAGTACTGTCTCGAGGATGGAAGCATCATACGAGCAACTAAAGATCATAAATTCATGACCACTGACGGGCAGATGTTGCCAATAGATGAGATATTCGAGCGGGGCTTGGATCTCAAACAAGTGGATGGATTGCCA（配列番号３５４）
Cfa-N、タンパク質：
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP（配列番号３５５）
Cfa-C、ＤＮＡ：
ATGAAGAGGACTGCCGATGGATCAGAGTTTGAATCTCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTAAAGATAATATCTCGAAAAAGTCTTGGTACCCAAAATGTCTATGATATTGGAGTGGAGAAAGATCACAACTTCCTTCTCAAGAACGGTCTCGTAGCCAGCAAC（配列番号３５６）
Cfa-C、タンパク質：
MKRTADGSEFESPKKKRKVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN（配列番号３５７）
スプリット型Cas9のＮ末端部分およびスプリット型Cas9のＣ末端部分の連結のために、インテイン−Ｎおよびインテイン−Ｃは、それぞれ、スプリット型Cas9のＮ末端部分およびスプリット型Cas9のＣ末端部分に融合させてもよい。例えば、いくつかの態様において、インテイン−Ｎをスプリット型Cas9のＮ末端部分のＣ末端に融合させて、すなわち、Ｎ−［スプリット型Cas9のＮ末端部分］−［インテイン−Ｎ］−Ｃの構造を形成させる。いくつかの態様において、インテイン−Ｃをスプリット型Cas9のＣ末端部分のＮ末端に融合させて、すなわち、Ｎ−［インテイン−Ｃ］−［スプリット型Cas9のＣ末端部分］−Ｃの構造を形成させる。インテインが融合しているタンパク質（例えばスプリット型Cas9）を連結させるための、インテイン媒介型タンパク質スプライシングの機構は、当該分野において公知であり、例えば、本明細書において参考として援用されるShah et al., Chem Sci. 2014；5（1）：446-461において記載されるとおりである。
本明細書において、「核酸塩基エディター」とは、ヌクレオチドの塩基を編集するタンパク質を指す。「編集する」とは、１つの核酸塩基の別のものへの変換（例えば、ＡをＧに、ＡをＣに、ＡをＴに、ＣをＴに、ＣをＧに、ＣをＡに、ＧをＡに、ＧをＣに、ＧをＴに、ＴをＡに、ＴをＣに、ＴをＧに）を指す。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、１）ヌクレオチド−、ヌクレオシド−、または核酸塩基−修飾酵素と、２）特異的な核酸配列に結合するようにプログラムされ得る核酸結合タンパク質との組み合わせを用いて、主に（例えば、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９９％より多く、９９．９％、または１００％）、ポリ核酸配列中の１つの核酸塩基の別の核酸塩基への変換（すなわち、移行またはトランスバージョン）をもたらす、巨大分子または巨大分子複合体である。
いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、それを標的配列に指向させる、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、dCas9またはnCas9などのプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン）を含む。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン（例えば、dCas9またはnCas9）に融合した、核酸塩基修飾酵素を含む。「核酸塩基修飾酵素」は、核酸塩基を修飾して、１つの核酸塩基を別のものに変換する酵素である（例えば、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼなどのデアミナーゼ）。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、核酸配列中のシトシン（Ｃ）塩基を標的として、Ｃをチミン（Ｔ）塩基に変換することができる。いくつかの態様において、ＣからＴへの編集は、デアミナーゼ、例えば、シトシンデアミナーゼにより行われる。他の型の塩基変換（例えば、アデノシン（Ａ）からグアニン（Ｇ）へ、ＣからＧへ）を行うことができる塩基エディターもまた、企図される。
ＣをＴに変換する核酸塩基エディターは、いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼを含む。「シトシンデアミナーゼ」は、化学反応「シトシン＋Ｈ２Ｏ−＞ウラシル＋ＮＨ３」または「５−メチル−シトシン＋Ｈ２Ｏ−＞チミン＋ＮＨ３」を触媒する酵素を指す。反応式から明らかであり得るとおり、かかる化学反応は、ＣからＵ／Ｔへの核酸塩基の変更をもたらす。遺伝子に関して、かかるヌクレオチドの変更または変異は、次いで、タンパク質の機能に影響、例えば機能の喪失または機能の獲得を及ぼし得る、タンパク質中のアミノ酸の変更をもたらし得る。いくつかの態様において、ＣからＴへの核酸塩基エディターは、シトシンデアミナーゼに融合したdCas9またはnCas9を含む。いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼドメインは、dCas9またはnCas9のＮ末端に融合している。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ、および／または核移行シグナルを阻害するドメインをさらに含む。かかる核酸塩基エディターは、当該分野において、例えば以下：米国特許9,068,179、２０１５年６月１８日に公開された米国特許出願公開US 2015/0166980；２０１５年６月１８日に公開されたUS 2015/0166981；２０１５年６月１８日に公開されたUS 2015/0166982；２０１５年６月１８日に公開されたUS 2015/0166984；および２０１５年６月１８日に公開されたUS2015/0165054；および２０１５年１０月２３日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/245,828；２０１６年７月１５日に出願されたU.S.S.N. 62/279,346；２０１６年３月２２日に出願されたU.S.S.N. 62/311,763；２０１６年４月１３日に出願されたU.S.S.N. 62/322,178；２０１６年６月３０日に出願されたU.S.S.N. 62/357,352；２０１６年８月３日に出願されたU.S.S.N. 62,370,700；２０１６年９月２２日に出願されたU.S.S.N. 62/398,490；および２０１６年１０月１４日に出願されたU.S.S.N. 62/408,686；２０１６年１０月２２日に出願されたＰＣＴ出願PCT/US2016/058344、２０１６年１０月２２日に出願された米国特許出願、U.S.S.N. 15/311,852；ならびに、Komor et al., Nature, Programmable editing of target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424（2016）において記載されており、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。
いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、ＡをＧに変換する。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼを含む。「アデノシンデアミナーゼ」は、プリン代謝に関与する酵素である。それは、食物からのアデノシンの分解のため、および組織における核酸のターンオーバーのために必要とされる。ヒトにおけるその主な機能は、免疫系の発達および維持である。アデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡに関して、加水分解によるアデノシンの脱アミノ化を触媒する（Ｇとして塩基対形成するイノシンを形成する）。ＤＮＡに対して作用する既知のアデノシンデアミナーゼは存在しない。代わりに、既知のアデノシンデアミナーゼ酵素は、ＲＮＡ（ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に対してのみ作用する。ＤＮＡ基質を受け入れてｄＡをデオキシイノシンに脱アミノ化する進化したデオキシアデノシンデアミナーゼ酵素、およびここでのアデノシン核酸塩基エディターにおける使用は、例えば、２０１６年８月３日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/370,684；２０１７年２月３日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/370,684、２０１７年３月２０日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/473,714、および２０１７年８月３日に出願されたＰＣＴ出願PCT/US2017/045381において記載されており、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。ＤＮＡを基質として受け入れる進化したアデノシンデアミナーゼの非限定的な例を、例１において提供する。
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、E. coliのTadA（配列番号３１４）である。ecTadAおよび修飾されたecTadAを含む核酸塩基エディターを発現するコンストラクト中に可能な変異を、表２において提供する。例示的なEcTadA変異体およびかかる変異体を含む核酸塩基エディターの配列を、例１において提供する。
表２．ＡからＧへの核酸塩基エディターについてのEcTadA変異体
いくつかの態様において、ＡからＧへの核酸塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合したdCas9またはnCas9を含む。かかる核酸塩基エディターは、２０１６年８月３日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/370,684；２０１７年２月３日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/370,684、２０１７年３月２０日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/473,714、および２０１７年８月３日に出願されたＰＣＴ出願PCT/US2017/045381において記載され、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
いくつかの態様において、ＡからＧへの核酸塩基エディターは、ＮＨ２−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［dCas9］−ＣＯＯＨの構造を含む。いくつかの態様において、第２のアデノシンデアミナーゼは、野生型ecTadA（配列番号３１４）である。いくつかの態様において、リンカーは、各々のドメインの間で用いられる。いくつかの態様において、リンカーは、３２アミノ酸長であり、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３８４）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｘ、Ｈ３６Ｘ、Ｎ３７Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｎ７２Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ｓ９７Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｇ１２５Ｘ、Ａ１４２Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、Ｋ１５７Ｘ、および／もしくはＫ１６１Ｘ変異の１つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼの１つ以上の対応する変異を含み、ここで、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｌ、Ｗ２３Ｒ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｐ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、および／またはＫ１５７Ｎ変異の１つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＨ３６Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｉ１５６ＸおよびＫ１５７Ｘから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなり、ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＨ３６Ｌ、Ｐ４８Ｓ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＨ３６Ｌ、Ｐ４８Ｓ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＨ３６Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ａ１４２Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｉ１５６ＸおよびＫ１５７Ｘから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなり、ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＨ３６Ｌ、Ｐ４８Ｓ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＨ３６Ｌ、Ｐ４８Ｓ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｘ、Ｈ３６Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ａ１４２Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｉ１５６ＸおよびＫ１５７Ｘから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなり、ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｌ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｌ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｘ、Ｈ３６Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ａ１４２Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｉ１５６ＸおよびＫ１５７Ｘから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなり、ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４における配列番号３１４におけるＷ２３Ｌ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｐ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｌ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｐ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｘ、Ｈ３６Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｉ１５６ＸおよびＫ１５７Ｘから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなり、ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｒ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｐ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３１４におけるＷ２３Ｒ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｐ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６ＦおよびＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含むか、またはこれらからなる。
いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、ＣをＧに変換する。かかる核酸塩基エディターは、本明細書において参考として援用される、２０１７年３月１０日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/470、２０１７年３月１０日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/470, 175において記載される。
非限定的な、例示的な核酸塩基エディターの型（ＣからＴへ、ＡからＧへ、およびＣからＧへの核酸塩基エディターを含む）およびそれらのそれぞれの配列を、例１において提供する。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、本明細書において記載される核酸塩基エディターのバリアントである。例えば、いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、本明細書において記載される核酸塩基エディターに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である（例示的な配列を、例１において提供する）。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれかよりも、長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれかよりも、長さが短いまたは長い（例えば、５００アミノ酸以下、４５０アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３５０アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２５０アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、５アミノ酸、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
「デアミナーゼ」は、例えば加水分解を通しての、分子からのアミン基の除去、または脱アミノ化を触媒する酵素を指す。いくつかの態様において、デアミナーゼは、それぞれ、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）への、デオキシシチジン（ｄＣ）からデオキシウリジン（ｄＵ）への、または５−メチル−シチジンからチミジン（Ｔ、５−メチル−Ｕ）への脱アミノ化を触媒する、シチジンデアミナーゼである。その後のＤＮＡ修復機構は、Komorら（Nature, Programmable editing of target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424（2016）、本明細書において参考として援用される）において記載されるように、ｄＵがＴにより置き換えられることを保証する。いくつかの態様において、デアミナーゼは、シトシンのウラシル（例えばＲＮＡにおいて）またはチミン（例えばＤＮＡにおいて）への変換を触媒および促進するシトシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡをＧに転換するアデノシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラットまたはマウスなどの生物からの天然に存在するデアミナーゼ。いくつかの態様において、デアミナーゼは、生物からの天然に存在するデアミナーゼのバリアントであり、バリアントは、天然に存在しない。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物からの天然に存在するデアミナーゼに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、本明細書において提供されるデアミナーゼのうちのいずれかよりも長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、デアミナーゼは、本明細書において提供されるデアミナーゼのうちのいずれかよりも、長さが短いまたは長い（例えば、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、５アミノ酸以下、２アミノ酸以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
「スプリット型核酸塩基エディター」とは、２つの別々の核酸によりコードされる、Ｎ末端部分（Ｎ末端の半分としてもまた言及される）およびＣ末端部分（Ｃ末端の半分としてもまた言及される）として提供される、核酸塩基エディターを指す。核酸塩基エディターのＮ末端部分およびＣ末端部分に対応するポリペプチドを組み合わせて、完全な核酸塩基エディターを形成させることができる。いくつかの態様において、dCas9またはnCas9を含む核酸塩基エディターについて、「スプリット」は、dCas9またはnCas9ドメインにおいて、スプリット型Cas9において本明細書に記載の部位において位置する。したがって、いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＮ末端部分は、スプリット型Cas9のＮ末端部分を含み、核酸塩基エディターのＣ末端部分は、スプリット型Cas9のＣ末端部分を含む。同様に、インテイン−Ｎまたはインテイン−Ｃは、核酸塩基エディターのＮ末端部分とＣ末端部分とを連結させて完全な核酸塩基エディターを形成させるために、それぞれ、Ｎ末端部分または核酸塩基エディターのＣ末端部分に融合していてもよい。
２つのタンパク質またはタンパク質ドメインは、２つのタンパク質または２つのタンパク質ドメインを連結してペプチド結合が形成される場合に、「融合している」とみなされる。いくつかの態様において、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）は、２つのタンパク質または２つのタンパク質ドメインの間に存在する。用語「リンカー」とは、本明細書において用いられる場合、２つの分子または部分、例えば融合タンパク質の２つのドメイン（例えばヌクレアーゼ不活化Cas9ドメインおよび核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）など）を連結する化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子もしくは他の部分の間にあるか、またはこれらに隣接して位置し、共有結合を介して互いに連結され、それにより２つを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、１つのアミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００アミノ酸の長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸の長さである。より長いまたはより短いリンカーもまた企図される。
「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）」とは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの活性を阻害するタンパク質をさす。本開示に従う使用のために好適なＵＧＩタンパク質として、例えば、Wang et al., J. Biol. Chem. 264：1163-1171（1989）； Lundquist et al., J. Biol. Chem. 272：21408-21419（1997）；Ravishankar et al., Nucleic Acids Res. 26：4880-4887（1998）；およびPutnam et al., J. Mol. Biol. 287：331-346（1999）において公開されるものが挙げられ、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。本開示のＩＵＧとして用いることができる非限定的な例示的なタンパク質、およびそれらのそれぞれの配列を、例１において提供する。いくつかの態様において、ＵＧＩは、生物からの天然に存在するデアミナーゼのバリアントであり、バリアントは、天然に存在しない。例えば、いくつかの態様において、ＵＧＩは、生物からの天然に存在するＵＧＩまたは本明細書において提供される任意のＵＧＩに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である（例えば、例１におけるもの）。いくつかの態様において、ＵＧＩは、本明細書において提供される任意のＵＧＩよりも、長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、本明細書において提供される任意のＵＧＩよりも、長さが短いまたは長い（例えば、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、５アミノ酸以下、２アミノ酸、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
gRNAは、CRISPR/Cas系の構成成分である。「gRNA」（ガイドリボ核酸）とは、本明細書において、CRISPRを標的とするＲＮＡ（crRNA）と、トランス活性化crRNA（tracrRNA）との融合を指し、Cas9ヌクレアーゼに対するターゲティングの特異性およびスカフォールディング／結合能力の両方を提供する。「crRNA」は、標的特異性を付与する細菌ＲＮＡであって、Cas9に結合するためにtracrRNAを必要とする。「tracrRNA」は、crRNAをCas9ヌクレアーゼに連結する細菌ＲＮＡであって、典型的には、任意のcrRNAに結合することができる。Cas DNA結合タンパク質の配列特異性は、標的ＤＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチド塩基対形成を有するgRNAにより決定される。ネイティブなgRNAは、標的となるべきＤＮＡ配列を特定する２０ヌクレオチド（ｎｔ）の特異性決定配列（ＳＤＳ）を含み、すぐ後に８０ｎｔのスカフォールド配列が続き、これが、gRNAをCas9に結合させる。いくつかの態様において、本開示のＳＤＳは、１５〜１００ヌクレオチドま以上の長さを有する。例えば、ＳＤＳは、１５〜９０、１５〜８５、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６５、１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、または１５〜２０ヌクレオチドの長さを有していてもよい。いくつかの態様において、ＳＤＳは、２０ヌクレオチド長である。例えば、ＳＤＳは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であってよい。標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部は、gRNAのＳＤＳに対して相補的である。Cas9が首尾よくＤＮＡ標的配列に結合するために、標的配列の領域は、gRNA配列のＳＤＳに対して相補的であって、すぐ後に、正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列（例えば、Cas9についてはＮＧＧ、およびCpf1についてはＴＴＮ、ＴＴＴＮまたはＹＴＮ）が続く。いくつかの態様において、ＳＤＳは、その標的配列に対して１００％相補的である。いくつかの態様において、ＳＤＳ配列は、その標的配列に対して１００％未満の相補性を有し、したがって、その標的配列に対して部分的に相補的であるとみなされる。例えば、ターゲティング配列は、その標的配列に対して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％相補的であってよい。いくつかの態様において、鋳型ＤＮＡまたは標的ＤＮＡのＳＤＳは、gRNAの相補的領域と、１、２、３、４または５ヌクレオチド異なっていてもよい。
ＳＤＳに加えて、gRNAは、そのCas9との結合のために必要とされるスカフォールド配列（ネイティブなCRISPR/Cas系中のtracrRNAに対応する）を含む（本明細書において、「gRNAハンドル」として言及される）。いくつかの態様において、gRNAは、構造５’−［ＳＤＳ］−［gRNAハンドル］−３’を含む。いくつかの態様において、スカフォールド配列は、５’−ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’のヌクレオチド配列を含む（配列番号３５８）。他の非限定的な、本開示に従って用いることができる好適なgRNAハンドル配列は、表１において列記される。
表１．ガイドＲＮＡハンドル配列
いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、約１５〜１２０ヌクレオチド長であって、標的配列に対して相補的な少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、標的配列に対して相補的な、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより長い連続するヌクレオチドの配列を含む。配列相補性は、アデニンとチミン（ＤＮＡ）またはウラシル（ＲＮＡ）の間、およびグアニンとシトシンとの間の、区別し得る相互作用を指す。
「プロトスペーサー隣接モチーフ」（PAM）は、典型的には、隣接して位置する（例えば、標的配列のうちの１０、９、８、７、６、５、４、３、３または１ヌクレオチド以内）ヌクレオチドの配列である。PAM配列は、PAM配列が標的配列に近接する場合（すなわち、PAM配列と標的配列との間に位置するヌクレオチドが存在しない場合）に、標的配列に対して「すぐに隣接する」。いくつかの態様において、PAM配列は、野生型PAM配列である。PAM配列の例として、限定することなく、ＮＧＧ、ＮＧＲ、ＮＮＧＲＲ（Ｔ／Ｎ）、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＧＧＡＧ、ＮＡＡＡＡＣ、ＡＷＧおよびＣＣが挙げられる。いくつかの態様において、PAM配列は、Streptococcus pyogenesから得られる（例えば、ＮＧＧまたはＮＧＲ）。いくつかの態様において、PAM配列は、Staphylococcus aureusから得られる（例えば、ＮＮＧＲＲ（Ｔ／Ｎ））。いくつかの態様において、PAM配列は、Neisseria meningitidisから得られる（例えば、ＮＮＮＮＧＡＴＴ）。いくつかの態様において、PAM配列は、Streptococcus thermophilusから得られる（例えば、ＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＡＧ）。いくつかの態様において、PAM配列は、Treponema denticolaから得られる（例えば、ＮＡＡＡＡＣ）。いくつかの態様において、PAM配列は、Escherichia coliから得られる（例えば、ＡＷＧ）。いくつかの態様において、PAM配列は、Pseudomonas auruginosaから得られる（例えば、ＣＣ）。他のPAM配列が企図される。PAM配列は、典型的には、標的配列から下流（すなわち３’）に位置するが、いくつかの態様においては、PAM配列は、標的配列から上流（すなわち５’）に位置してもよい。
「核移行シグナル」または「ＮＬＳ」は、核輸送による細胞の核中への移入のためのタンパク質を「タグ付け」されるアミノ酸配列を指す。典型的には、このシグナルは、タンパク質表面上で暴露される、正に荷電したリジンまたはアルギニンの１つ以上の短い配列からなる。１つ以上のＮＬＳを、タンパク質のＮまたはＣ末端に、または内部（例えば、２つのタンパク質ドメインの間）に付加することができる。例えば、１つ以上のＮＬＳは、核酸塩基エディターのＮまたはＣ末端に、または核酸塩基エディター中のCas9とデアミナーゼとの間に、付加することができる。いくつかの態様において、１、２、３、４、５、またはそれより多いＮＬＳを付加することができる。核移行配列は、当該分野において公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、ＮＬＳ配列は、２０００年１１日２３日に出願されたPlankら、PCT/EP2000/011690において記載され、これらの内容は、例示的な核移行配列のその開示について、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３７３）またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号３７４）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、Cas9とデアミナーゼとの間に挿入される。
ＮＬＳは、一分のものまたは二分のものとして分類することができる。一分ＮＬＳの非限定的な例は、SV40ラージＴ抗原における配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３７３）である。二分ＮＬＳは、典型的に、約１０アミノ酸のスペーサーにより分離された、２つの塩基性アミノ酸のクラスターを含む。二分ＮＬＳの１つの非限定的な例は、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（スペーサーに下線を付した）（配列番号３４４）である。いくつかの態様において、本開示に従って用いることができるＮＬＳは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３４４）のアミノ酸配列を含むヌクレオプラスミンのＮＬＳである。本開示に従って用いることができる他の二分ＮＬＳとして、限定することなく、以下が挙げられる：SV40の二分ＮＬＳ（ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３７５）、例えば、本明細書において参考として援用されるHodel et al., J Biol Chem. 2001 Jan 12;276（2）：1317-25に記載）；カナダプチン（Kanadaptin）二分ＮＬＳ（ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号３４５）、例えば、本明細書において参考として援用されるHubner et al., Biochem J. 2002 Jan 15;361（Pt 2）：287-96に記載）；インフルエンザＡ核タンパク質二分ＮＬＳ（ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号３４６）、例えば、本明細書において参考として援用されるKetha et al., BMC Cell Biology. 2008;9：22に記載）；およびZO-2二分ＮＬＳ（ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ（配列番号３４７）、例えば、本明細書において参考として援用されるQuirosら、Nusrat A編、Molecular Biology of the Cell. 2013;24（16）：2528-2543に記載）。
ＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、２つのコード配列が、「互いにインフレームである」場合に、ＮＬＳに融合するタンパク質（例えばCas9または核酸塩基エディター）をコードするヌクレオチド配列に「作動的に連結され」、２つの配列を融合させる単一のポリペプチドとして翻訳される。
本開示の核酸は、１つ以上の遺伝子要素を含んでもよい。「遺伝子要素」とは、核酸発現において役割を有する（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、または操作された核酸の別の生成物（例えば、ガイドＲＮＡ、タンパク質および／またはＲＮＡ干渉分子をコードするヌクレオチド配列）をコードする、特定のヌクレオチド配列を指す。
「プロモーター」とは、そこにおいて開始および核酸配列の残りの転写の速度が制御される、核酸配列の制御領域を指す。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節性のタンパク質および分子が結合することができる部分領域を含む。プロモーターは、構成的なもの、誘導性のもの、活性化可能なもの、抑制可能なもの、組織特異的なもの、または任意のそれらの組み合わせであってよい。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動するか、またはこれの転写を駆動する。本明細書において、プロモーターは、それがその配列の転写開始および／または発現を制御する（「駆動する」）ように調節する核酸配列に対して相対的に正確な機能的な位置および配向にある場合に、「作動的に連結する」とみなされる。
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得ることができるような、遺伝子または配列と天然に関連するものであってよい。かかるプロモーターは、「内在プロモーター」として言及される。いくつかの態様において、コード核酸配列は、組み換えまたは異種性のプロモーターの制御下に配置され、これは、コードされている配列にその天然の環境において通常では関連しないプロモーターを指す。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の細胞から単離されたプロモーター；および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサー、例えば異なる転写調節性領域の異なる要素を含むもの、および／または当該分野において公知の遺伝子操作の方法を通して発現を変化させる変異などを含んでもよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生成することに加えて、配列は、組み換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅技術を用いて生成してもよい。
いくつかの態様において、本開示に従って用いられるプロモーターは、「誘導性プロモーター」であって、これは、インデューサーシグナルの存在下において、これによる影響下において、またはこれによる接触下により、転写活性を調節する（例えば開始させるか活性化する）ことにより特徴づけられるプロモーターである。インデューサーシグナルは、内因性であっても、通常は外因性の条件（例えば、光）、化合物（例えば、化学的または非化学的化合物）またはタンパク質であって、誘導性プロモーターからの転写活性を制御することにおいて活性であるような方法において誘導性プロモーターと接触するものであってよい。したがって、核酸の「転写を調節するシグナル」とは、誘導性プロモーターに対して作用するインデューサーシグナルを指す。転写を調節するシグナルは、用いられる調節系に依存して、転写を活性化または不活化することができる。転写の活性化は、プロモーターが転写を駆動するように直接作用すること、またはプロモーターが転写を駆動することを妨げているリプレッサーを不活化することによりプロモーターに間接的に作用することを含み得る。逆に、転写の活性解除は、プロモーターが転写を妨げるように直接作用すること、またはその後でプロモーターに対して作用するリプレッサーを活性化することにより、プロモーターに対して間接的に作用することを含み得る。
「転写ターミネーター」は、転写を停止させる核酸配列である。転写ターミネーターは、一方向性であっても、二方向性であってもよい。ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的な停止に関与するＤＮＡ配列からなる。転写ターミネーター配列は、上流のプロモーターによる下流の核酸配列の転写活性化を妨げる。転写ターミネーターは、所望される発現レベルを達成するために、または特定の配列の転写を回避するために、in vivoで必要であり得る。転写ターミネーターは、それが連結している配列の転写を停止させることができる場合に、ヌクレオチド配列に対して「作動的に連結している」とみなされる。
最も一般的に用いられるターミネーターの型は、フォワードターミネーターである。通常では転写される核酸配列の上流に配置されると、フォワード転写ターミネーターは、転写を中断させる。いくつかの態様において、二方向性転写ターミネーターが提供され、これは通常、フォワードおよびリバース鎖の両方に対して、転写を停止させる。いくつかの態様において、逆転写ターミネーターが提供され、これは通常、リバース鎖飲みに対して転写を終結させる。
原核生物系において、ターミネーターは、通常、２つのカテゴリー（１）rho非依存性ターミネーターおよび（２）rho依存性ターミネーターに該当する。rho非依存性ターミネーターは、一般的に、いくつかのＴ塩基が続くＧ−Ｃ塩基対が豊富なステムループを形成する回文配列からなる。理論により拘束されることは望まないが、転写終結の従来のモデルは、ステムループがＲＮＡポリメラーゼを休止させ、ポリＡテイルの転写がＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖をほどいてＲＮＡポリメラーゼから解離させるものである。
真核生物系において、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるために新たな転写物の部位特異的切断を可能にする、特別なＤＮＡ配列を含んでもよい。これが、特化した内在ポリメラーゼにシグナル伝達して、約２００個のＡ残基のストレッチ（ポリＡ）を転写物の３’末端に付加させる。このポリＡテイルにより修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であり、より効率的に翻訳されると考えられる。したがって、真核生物に関連するいくつかの態様において、ターミネーターは、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含んでもよい。いくつかの態様において、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進する。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位の要素は、アウトプットされる核酸レベルを増強するため、および／または核酸の間のリードスルーを最小化するために働くことができる。
本開示に従う使用のためのターミネーターは、本明細書において記載されるか、当業者に公知の任意の転写のターミネーターを含む。ターミネーターの例として、限定することなく、例えばウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、ならびに例えばSV40ターミネーター、spy、yejM、secG-leuU、thrLABC、rrnB T1、hisLGDCBHAFI、metZWV、rrnC、xapR、aspAおよびarcAターミネーターなどのウイルス終結配列が挙げられる。いくつかの態様において、終結シグナルは、配列トランケーションからもたらされるものなどの転写または翻訳することができない配列であってもよい。
「ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）」とは、転写された場合に発現を増強する三次構造を作り出すＤＮＡ配列である。ウイルスベクターにより送達される遺伝子の発現を増強するために、分子生物学において一般的に用いられる。ＷＰＲＥは、ガンマ、アルファおよびベータ構成成分を有する、三要素の調節エレメントである。全長ＷＰＲＥ配列は、６０９ｂｐ長である：
GCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTATGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCG（配列番号３７６）。
「アデノ関連ウイルス」または「ＡＡＶ」とは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するウイルスである。野生型ＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ssDNA）であり、これはセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の各々の末端において１つずつの２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）、および２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＩＴＲの間のrepおよびcapを含む。rep ORFは、ＡＡＶの生活環のために必要とされるRepタンパク質をコードする４つのオーバーラップする遺伝子を含む。cap ORFは、キャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするオーバーラップする遺伝子を含み、これらは、一緒に相互作用してウイルスキャプシドを形成する。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、２つの異なる様式においてスプライシングすることができる、１つのｍＲＮＡ転写物から翻訳される：より長い、またはより短いイントロンを切除して、２つのｍＲＮＡのアイソフォーム：約２．３ｋｂおよび約２．６ｋｂ長のｍＲＮＡアイソフォームの形成をもたらすことができる。キャプシドは、約６０個々のキャプシドタンパク質サブユニットの、ＡＡＶゲノムを保護することができるエンベロープをもたないＴ−１正二十面体格子への超分子の集合体を形成する。成熟キャプシドは、約１：１：１０の比における、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる（それぞれ約８７、７３および６２ｋＤａの分子量）からなる。
ｒＡＡＶ粒子は、核酸ベクター（例えば組み換えゲノム）を含んでもよく、これは、最小限、以下を含んでもよい：（ａ）目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列（例えば、スプリット型Cas9もしくはスプリット型核酸塩基）または目的のＲＮＡ（例えばgRNA）、あるいは、Repタンパク質をコードする配列を含む１つ以上の核酸領域を含む、１つ以上の異種性核酸領域；および（ｂ）１つ以上の核酸領域（例えば異種性核酸領域）が隣接する逆位末端配列（ＩＴＲ）（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）を含む、１つ以上の領域。いくつかの態様において、核酸ベクターは、４ｋｂ〜５ｋｂのサイズ（例えば、４．２〜４．７ｋｂのサイズ）である。いくつかの態様において、核酸ベクターは、Repタンパク質をコードする領域をさらに含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、環状である。いくつかの態様において、核酸ベクターは、一本鎖である。いくつかの態様において、核酸ベクターは、二本鎖である。いくつかの態様において、二本鎖核酸ベクターは、例えば自己相補的ベクターであってよく、これは、当該核酸ベクターの別の領域に対して相補的な核酸ベクターの領域を含み、これが、核酸ベクターの二本鎖性の形成を開始させる。
用語「核酸」、および「ポリヌクレオチド」とは、本明細書において用いられる場合、核酸塩基および酸性部分（例えばヌクレオチドまたはヌクレオチドのポリマー）を含む化合物を指す。典型的には、ポリマー性核酸、例えば、３個以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、隣接するヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して互いに連結している直鎖状分子である。いくつかの態様において、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えばヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの態様において、「核酸」とは、３個以上の個々のヌクレオチド残基を含む、オリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」とは、交換可能に用いることができ、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３個のヌクレオチドのストリング）を指す。いくつかの態様において、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、天然に存在するもの、例えば、ゲノムに関して、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子であってよい。一方、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノム（例えば、操作されたウイルスベクター）、操作されたベクター、もしくはそのフラグメント、または任意に天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、例えば、ホスホジエステル骨格以外を有するアナログを含む。核酸は、天然のソースから精製しても、組み換え発現系を用いて産生させて任意に精製しても、化学的に合成するなどしてもよい。適切である場合には、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学修飾された塩基または糖、および骨格の修飾を有するアナログなどのヌクレオシドアナログを含んでもよい。核酸配列は、別段に示されない限り、５’から３’への方向において提示される。いくつかの態様において、核酸は、天然のヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）；挿入された塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれを含む。
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書において交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合により一緒に連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、任意のサイズ、構造または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長であろう。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合を指してもよい。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸のうちの１つ以上が、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、抱合、官能化もしくは他の修飾のためのリンカーなどの化学成分の付加により修飾されてもよい。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドはまた、単一の分子であっても、多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なるフラグメントであってもよい。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在するものであっても、組み換えまたは合成であっても、または任意のそれらの組み合わせであってもよい。用語「融合タンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含む、ハイブリッドポリペプチドを指す。１つのタンパク質は、融合タンパク質まのアミノ末端（Ｎ末端）部分、またはタンパク質のカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置して、それにより、それぞれ「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」を形成してもよい。タンパク質は、核酸編集タンパク質の異なるドメイン、例えば核酸結合ドメイン（例えばタンパク質の標的部位への結合を指揮するCas9のgRNA結合ドメイン）、および核酸切断ドメインまたは触媒性ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、タンパク質は、核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡとの複合体中のものであるか、またはこれと会合しているものである。本明細書において提供されるタンパク質のうちのいずれかは、当該分野において公知の任意の方法により生成することができる。例えば、本明細書において提供されるタンパク質は、組み換えタンパク質発現および精製を介して生成することができ、これは、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質のために特に好適である。組み換えタンパク質発現および精製のための方法は周知であり、本明細書において参考として援用されるGreenおよびSambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第４版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（2012））により記載されるものを含む。
用語「対象」とは、本明細書において用いられる場合、個々の生物、例えば個々の哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）である。いくつかの態様において、対象は、家畜化された動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコまたはイヌである。いくつかの態様において、対象は、研究動物である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子操作されており、例えば、遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、いずれの性別のものであってもよく、発達の任意の段階のものであってよい。
用語「組み換え」とは、本明細書においてタンパク質または核酸に関して用いられる場合、天然に存在しないが、人工操作の産物であるタンパク質まを指す。例えば、いくつかの態様において、組み換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然に存在する配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、または少なくとも７個の変異を含む、アミノ酸またはヌクレオチドの配列を含む。本明細書において記載される融合タンパク質（例えば、塩基エディター）は、組み換えにより作製される。組み換え技術は、当業者に知られている。
用語「薬学的に受入可能なキャリア」とは、身体の１つの部位（例えば、送達部位）から、別の部位（例えば、身体の器官、組織または部分）へ化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に受入可能な材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸）、あるいは材料を封入する溶媒を意味する。薬学的に受入可能なキャリアは、処方物の他の成分と適合可能であり、対象の組織にとって傷害性ではないという意味「受入可能」である（例えば、生理学的に適合性である、無菌、生理学的ｐＨなど）。
「治療有効量」とは、本明細書において用いられる場合、本開示において記載される各々の治療剤（例えば、核酸塩基エディター、ｒＡＡＶ）の、単独で、または１つ以上の他の治療剤と組み合わせての、対象に対して治療効果を付与するために必要とされる量を指す。有効量は、当業者により認識されるであろうが、処置されている特定の状態、状態の重篤度、年齢、身体条件、サイズ、性別および体重を含む個々の対象のパラメーター、処置の期間、同時治療（があればその）性質、投与の具体的な経路、および健康管理者の知識および専門的意見の範囲内の類似の要因に依存して、変化する。これらの要因は、当業者には周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。個々の構成成分またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最高の安全な用量が用いられることが一般に好ましい。当業者には理解されるであろうが、対象は、医学的理由、精神的理由のため、または実質的にあらゆる他の理由のために、より低い用量または耐容可能な用量を主張する場合がある。半減期などの経験的な配慮は、一般に、投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト化抗体または完全にヒトの抗体からの領域を含むポリペプチドなどのヒト免疫系に適合性の治療剤を、ポリペプチドの半減期を延長するために、およびポリペプチドが宿主の免疫系により攻撃されることを予防するために用いてもよい。
「それを必要とする対象」とは、疾患、疾患の兆候および／もしくは症状、または疾病素因を有する個体であって、当該疾患、疾患の症状または疾病素因を治癒するか、緩和するか、軽減するか、変化させるか、治療するか、寛解させるか、改善するか、またはこれに影響を及ぼすことを目的とするものを指す。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類である。いくつかの態様において、げっ歯類は、マウスである。いくつかの態様において、げっ歯類は、ラットである。いくつかの態様において、哺乳動物は、伴侶動物である。「伴侶動物」とは、ペットおよび他の家庭内動物を指す。伴侶動物の非限定的な例として、イヌおよびネコ；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびニワトリなどの家畜；ならびに、マウス、ラット、モルモットおよびハムスターなどの他の動物が挙げられる。
用語「処置」、「処置する」および「処置すること」とは、本明細書に記載の、疾患もしくは障害、またはその１つ以上の症状を、逆転させるか、緩和するか、その発症を遅延させるか、またはその進行を阻害することを目的とする、臨床的介入を指す。本明細書において用いられる場合、用語「処置」、「処置する」および「処置すること」とは、本明細書に記載の、疾患もしくは障害、またはその１つ以上の症状を、逆転させるか、緩和するか、その発症を遅延させるか、またはその進行を阻害することを目的とする、臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、１つ以上の症状が発症した後、および／または疾患が診断された後に、投与してもよい。他の態様において、処置は、例えば、症状の発症を予防または遅延させるために、または疾患の発症または進行を阻害するために、症状の不在下において投与してもよい。例えば、処置は、症状の発症の前に（例えば、症状の病歴を考慮して、および／または遺伝もしくは他の易罹患性の要因を考慮して）易罹患性の個体に投与してもよい。処置はまた、症状が消散した後に、例えばそれらの再発を予防するかまたはこれを遅延させるために、続けてもよい。
ある態様の詳細な説明
本明細書において提供されるのは、スプリット型Cas9タンパク質または核酸塩基エディターをコードする核酸を含む組成物（例えば、ベクター、組み換えウイルス）およびキット、ならびに、かかる核酸を用いて核酸塩基エディターまたはCas9タンパク質を細胞中に送達する方法である。核酸塩基エディターのＮ末端部分およびＣ末端部分またはCas9タンパク質は、別々の核酸上でコードされ、例えば組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ粒子）送達を介して、細胞中に送達される。
核酸塩基エディターまたはCas9タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分に対応するポリペプチドは、連結されて、例えばインテインにより媒介されるタンパク質のスプライシングを介して、完全な核酸塩基エディターまたはCas9タンパク質を形成してもよい。
したがって、本開示のいくつかの側面は、（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；および（ｉｉ）Cas9タンパク質のＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む組成物に関し、ここで、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナル（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している。
第１および第２のヌクレオチド配列によりコードされるCas9タンパク質は、本明細書において「スプリット型Cas9」として言及される。Cas9タンパク質は、異常なリンカーにより連結されるＮ末端ローブおよびＣ末端ローブを有することが知られている（例えば、Nishimasu et al., Cell, Volume 156, Issue 5, pp. 935-949, 2014において記載されるとおりであり、これは本明細書において参考として援用される）。いくつかの態様において、スプリット型Cas9タンパク質のＮ末端部分は、Cas9タンパク質のＮ末端ローブを含む。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、Cas9タンパク質のＣ末端ローブを含む。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、配列番号１におけるアミノ酸１−（５５０−６５０）に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む。「１−（５５０−６５０）」とは、アミノ酸１からの開始、およびアミノ酸５５０〜６５０の間（境界を含む）のどこかにおける編集を意味する。例えば、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、配列番号１におけるアミノ酸１〜５５０、１〜５５１、１〜５５２、１〜５５３、１〜５５４、１〜５５５、１〜５５６、１〜５５７、１〜５５８、１〜５５９、１〜５６０、１〜５６１、１〜５６２、１〜５６３、１〜５６４、１〜５６５、１〜５６６、１〜５６７、１〜５６８、１〜５６９、１〜５７０、１〜５７１、１〜５７２、１〜５７３、１〜５７４、１〜５７５、１〜５７６、１〜５７７、１〜５７８、１〜５７９、１〜５８０、１〜５８１、１〜５８２、１〜５８３、１〜５８４、１〜５８５、１〜５８６、１〜５８７、１〜５８８、１〜５８９、１〜５９０、１〜５９１、１〜５９２、１〜５９３、１〜５９４、１〜５９５、１〜５９６、１〜５９７、１〜５９８、１〜５９９、１〜６００、１〜６０１、１〜６０２、１〜６０３、１〜６０４、１〜６０５、１〜６０６、１〜６０７、１〜６０８、１〜６０９、１〜６１０、１〜６１１、１〜６１２、１〜６１３、１〜６１４、１〜６１５、１〜６１６、１〜６１７、１〜６１８、１〜６１９、１〜６２０、１〜６２１、１〜６２２、１〜６２３、１〜６２４、１〜６２５、１〜６２６、１〜６２７、１〜６２８、１〜６２９、１〜６３０、１〜６３１、１〜６３２、１〜６３３、１〜６３４、１〜６３５、１〜６３６、１〜６３７、１〜６３８、１〜６３９、１〜６４０、１〜６４１、１〜６４２、１〜６４３、１〜６４４、１〜６４５、１〜６４６、１〜６４７、１〜６４８、１〜６４９、または１〜６５０に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含んでもよい。いくつかの態様において、スプリット型Cas9タンパク質のＮ末端部分は、配列番号１のアミノ酸１〜５７３または１〜６３７に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む。。
スプリット型Cas9のＣ末端部分を、スプリット型Cas9のＮ末端部分に連結して、完全なCas9タンパク質を形成させることができる。いくつかの態様において、Cas9タンパク質のＣ末端部分は、Cas9タンパク質のＮ末端部分が終わるところから始まる。したがって、いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、配列番号１のアミノ酸（５５１−６５１）−１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む。「（５５１−６５１）−１３６８」とは、アミノ酸５５１〜６５１の間（境界を含む）のアミノ酸における開始、およびアミノ酸１３６８における編集を意味する。例えば、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、配列番号１のアミノ酸５５１〜１３６８、５５２〜１３６８、５５３〜１３６８、５５４〜１３６８、５５５〜１３６８、５５６〜１３６８、５５７〜１３６８、５５８〜１３６８、５５９〜１３６８、５６０〜１３６８、５６１〜１３６８、５６２〜１３６８、５６３〜１３６８、５６４〜１３６８、５６５〜１３６８、５６６〜１３６８、５６７〜１３６８、５６８〜１３６８、５６９〜１３６８、５７０〜１３６８、５７１〜１３６８、５７２〜１３６８、５７３〜１３６８、５７４〜１３６８、５７５〜１３６８、５７６〜１３６８、５７７〜１３６８、５７８〜１３６８、５７９〜１３６８、５８０〜１３６８、５８１〜１３６８、５８２〜１３６８、５８３〜１３６８、５８４〜１３６８、５８５〜１３６８、５８６〜１３６８、５８７〜１３６８、５８８〜１３６８、５８９〜１３６８、５９０〜１３６８、５９１〜１３６８、５９２〜１３６８、５９３〜１３６８、５９４〜１３６８、５９５〜１３６８、５９６〜１３６８、５９７〜１３６８、５９８〜１３６８、５９９〜１３６８、６００〜１３６８、６０１〜１３６８、６０２〜１３６８、６０３〜１３６８、６０４〜１３６８、６０５〜１３６８、６０６〜１３６８、６０７〜１３６８、６０８〜１３６８、６０９〜１３６８、６１０〜１３６８、６１１〜１３６８、６１２〜１３６８、６１３〜１３６８、６１４〜１３６８、６１５〜１３６８、６１６〜１３６８、６１７〜１３６８、６１８〜１３６８、６１９〜１３６８、６２０〜１３６８、６２１〜１３６８、６２２〜１３６８、６２３〜１３６８、６２４〜１３６８、６２５〜１３６８、６２６〜１３６８、６２７〜１３６８、６２８〜１３６８、６２９〜１３６８、６３０〜１３６８、６３１〜１３６８、６３２〜１３６８、６３３〜１３６８、６３４〜１３６８、６３５〜１３６８、６３６〜１３６８、６３７〜１３６８、６３８〜１３６８、６３９〜１３６８、６４０〜１３６８、６４１〜１３６８、６４２〜１３６８、６４３〜１３６８、６４４〜１３６８、６４５〜１３６８、６４６〜１３６８、６４７〜１３６８、６４８〜１３６８、６４９〜１３６８、６５０〜１３６８、または６５１〜１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含んでもよい。いくつかの態様において、スプリット型Cas9タンパク質のＣ末端部分は、配列番号１のアミノ酸５７４〜１３６８または６３８〜１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む。
Cas9バリアントはまた、本明細書において記載される方法を用いて細胞に送達してもよい。例えば、Cas9バリアントは、本明細書に記載の「スプリット型」であってもよい。Cas9バリアントは、本明細書において提供されるCas9配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一なアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、本明細書において提供されるCas9タンパク質のうちのいずれかよりも長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む（例えば、例１におけるもの）。いくつかの態様において、ＵＧＩは、本明細書において提供されるCas9タンパク質のうちのいずれかよりも長さが短いまたは長い（例えば、２００アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、１０アミノ酸、５アミノ酸以下、または２アミノ酸以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、本明細書において提供されるCas9配列のうちのいずれか１つの対応する部分に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一なアミノ酸配列を含む（例えば、例１におけるもの）。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、本明細書において提供されるCas9タンパク質のうちのいずれかの対応する部分よりも長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、本明細書において提供されるCas9タンパク質のうちのいずれかの対応する部分よりも、長さが短いまたは長い（例えば、２００アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、１０アミノ酸、５アミノ酸以下、または２アミノ酸以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、本明細書において提供されるCas9配列のうちのいずれか１つの対応する部分に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一なアミノ酸配列を含む（例えば、例１におけるもの）。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、本明細書において提供されるCas9タンパク質のうちのいずれかの対応する部分よりも長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、本明細書において提供されるCas9タンパク質のうちのいずれかの対応する部分よりも、長さが短いまたは長い（例えば、２００アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、１０アミノ酸、５アミノ酸以下、または２アミノ酸以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Cas9バリアントは、dCas9またはnCas9である。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、配列番号１中のＤ１０Ａ変異に対応する変異を含む。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、配列番号１中のＤ１０Ａ変異に対応する変異を含み、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、配列番号１中のＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む。いくつかの態様において、スプリット型Cas9のＮ末端部分は、配列番号１中のＤ１０Ａ変異に対応する変異を含み、スプリット型Cas9のＣ末端部分は、配列番号１中の位置８４０に対応する位置においてヒスチジンを含む。
いくつかの態様において、Cas9タンパク質のＮ末端部分とCas9タンパク質のＣ末端部分とを連結させるために、インテイン系を用いてもよい。いくつかの態様において、Cas9のＮ末端部分を、インテイン−Ｎに融合させる。いくつかの態様において、インテイン−Ｎを、Cas9のＮ末端部分のＣ末端に融合させて、ＮＨ２−［Cas9のＮ末端部分］−［インテイン−Ｎ］−ＣＯＯＨの構造を形成させる。いくつかの態様において、インテイン−Ｎは、dnaE-n遺伝子によりコードされる。いくつかの態様において、インテイン−Ｎは、配列番号３５０〜３５１および３５４〜３５５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9のＣ末端部分をインテイン−Ｃに融合させ、インテイン−Ｃを、Cas9のＣ末端部分のＮ末端に融合させて、ＮＨ２−［インテイン−Ｃ］−［Cas9のＣ末端部分］−ＣＯＯＨの構造を形成させる。いくつかの態様において、インテイン−Ｃは、dnaE-c遺伝子によりコードされる。いくつかの態様において、インテイン−Ｃは、配列番号３５２〜３５３および３５６〜３５７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他のスプリット型インテイン系もまた、本開示において用いることができ、当該分野において公知である。
スプリット型核酸塩基エディターを、本開示において用いてもよい。本開示のいくつかの側面は、（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合した核酸塩基エディターのＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；および（ｉｉ）核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、組成物に関する。
核酸塩基エディターのバリアントが企図される。例えば、核酸塩基エディターのバリアントはまた、本明細書に記載の「スプリット型」であってよい。核酸塩基エディターのバリアントは、本明細書において提供される核酸塩基エディター配列（配列番号Ｘ−Ｘ）のうちのいずれか１つに対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一なアミノ酸配列を含んでもよい。
いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＮ末端部分は、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれか１つの対応する部分に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一なアミノ酸配列を含む（例えば、例１におけるもの）。いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＮ末端部分は、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれかの対応する部分よりも、長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＮ末端部分は、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれかの対応する部分よりも、長さが短いまたは長い（例えば、２００アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、１０アミノ酸、５アミノ酸以下、または２アミノ酸以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＣ末端部分は、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれか１つの対応する部分に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一なアミノ酸配列を含む（例えば、例１におけるもの）。いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＣ末端部分は、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれかの対応する部分よりも、長さが短いまたは長い（例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＣ末端部分は、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれかの対応する部分よりも、長さが短いまたは長い（例えば、２００アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、１０アミノ酸、５アミノ酸以下、または２アミノ酸以下、長いまたは短い）アミノ酸配列を含む。
本明細書において記載されるとおり、核酸塩基エディターのＮ末端部分は、ヌクレアーゼ不活化Cas9タンパク質（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）のＮ末端部分を含む。いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＮ末端部分は、核酸塩基修飾酵素（例えば、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ傷害酵素、ジスムターゼ、アルキル化酵素、脱プリン酵素、酸化酵素、ピリミジン二量体形成酵素、インテグラーゼ、トランスポサーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、フォトリアーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼなどのエピジェネティック修飾因子など）をさらに含む。いくつかの態様において、核酸塩基修飾酵素は、デアミナーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ、またはその機能的バリアント）である。いくつかの態様において、核酸塩基修飾酵素を、スプリット型dCas9またはスプリット型nCas9のＮ末端部分のＮ末端に融合させる。いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＮ末端部分は、以下の構造を有する：ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9のＮ末端部分］−ＣＯＯＨ。いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＮ末端部分を、インテインＮに融合させる。いくつかの態様において、インテイン−Ｎは、核酸塩基エディターのＮ末端部分のＣ末端に融合させる。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列は、構造ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9のＮ末端部分］−［インテイン−Ｎ］−ＣＯＯＨを含むポリペプチドをコードする。
いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＣ末端部分は、ヌクレアーゼ不活化Cas9タンパク質（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）のＣ末端部分を含む。いくつかの態様において、核酸塩基修飾酵素は、スプリット型dCas9またはスプリット型nCas9のＣ末端部分のＣ末端に融合している。いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＣ末端部分は、構造：ＮＨ２−［dCas9またはnCas9のＣ末端部分］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨのものである。いくつかの態様において、核酸塩基エディターのＣ末端部分は、Cas9タンパク質のＣ末端部分に融合したインテイン−Ｃを含む。いくつかの態様において、インテイン−Ｃは、核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合している。いくつかの態様において、第２のヌクレオチド配列は、構造：ＮＨ２−［インテイン−Ｃ］−［Cas9タンパク質のＣ末端部分］−ＣＯＯＨのポリペプチドをコードする。
いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＮ末端部分は、ウラシルグリコシラーゼ（ＵＧＩ）の阻害剤をさらに含む。いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列は、構造：ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9のＮ末端部分］−［インテイン−Ｎ］のポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列は、ポリペプチドは、構造：ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9のＮ末端部分］−［インテイン−Ｎ］のものである。
いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターのＣ末端部分は、ウラシルグリコシラーゼ（ＵＧＩ）の活性を阻害する酵素をさらに含む。いくつかの態様において、第２のヌクレオチド配列は、構造：ＮＨ２−［インテイン−Ｃ］−［dCas9またはnCas9のＣ末端部分］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨのポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、第２のヌクレオチド配列は、構造：ＮＨ２−［インテイン−Ｃ］−［dCas9またはnCas9のＣ末端部分］−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨのポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、第２のヌクレオチド配列は、構造：ＮＨ２−［インテイン−Ｃ］−［dCas9またはnCas9のＣ末端部分］−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨのポリペプチドをコードする。
いくつかの態様において、完全なスプリット型核酸塩基エディターを形成させるために、核酸塩基のＮ末端部分とＣ末端部分とを連結する。いくつかの態様において、スプリット型核酸塩基エディターは、以下の構造のうちのいずれか１つを含んでもよい：
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨＮＨ
２−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨまたは
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列（スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターのいずれかをコードするもの）は、少なくとも１つの二分核定位シグナル（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列に、作動的に連結している。例えば、第１のヌクレオチド配列は、１つ以上（例えば、２、３、４、５またはそれより多く）の二分ＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結していてもよい。いくつかの態様において、第２のヌクレオチド配列は、１つ以上（例えば、２、３、４、５またはそれより多く）の二分ＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結していてもよい。したがって、Ｎ末端部分とＣ末端部分とを連結することにより形成されたスプリット型Cas9またはスプリット型核酸塩基エディターは、１つ以上の二分ＮＬＳを含んでもよい。例えば、スプリット型Cas9またはスプリット型核酸塩基エディターは、以下の構造のうちのいずれか１つを含んでもよい（ｂＮＬＳは、１つ以上の二分核定位シグナルを意味する）：
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［Cas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［Cas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨＮＨ
２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨＮＨ
２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨＮＨ
２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
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ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
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ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨまたは
ＮＨ２−ｂＮＬＳ−［dCas9またはnCas9］−ｂＮＬＳ−［核酸塩基修飾酵素］−ｂＮＬＳ−［ＵＧＩ］−ｂＮＬＳ−ＣＯＯＨ
本明細書において、「ＮＨ２−」は、タンパク質またはポリペプチドのＮ末端を表し、「−ＣＯＯＨ」は、タンパク質またはポリペプチドのＣ末端を表す。「］−［」は、ペプチド結合またはリンカーを表す。いくつかの態様において、リンカーは、本明細書において記載されるタンパク質またはタンパク質ドメインのうちのいずれかを連結させるために用いることができる。リンカーは、共有結合のような単純なものであっても、長さが多くの原子にわたるポリマー性リンカーであってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、ポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づく。いくつかの態様において、リンカーは、ペプチド様ではない。いくつかの態様において、リンカーは、共有結合（例えば、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合など）である。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合の炭素−窒素結合である。いくつかの態様において、リンカーは、環式または非環式の、置換または非置換の、分枝状または非分枝状の、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、ポリマー性である（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）。いくつかの態様において、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、ダイマー、またはポリマーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ−アラニン、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−ペンタン酸など）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、ダイマー、またはポリマーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、炭素環式部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。いくつかの態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ペプチドを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。いくつかの態様において、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の付加を促進するために、官能化された部分を含んでもよい。任意の求電子剤を、リンカーの部分として用いてもよい。例示的な求電子剤として、これらに限定されないが、活性化されたエステル、活性化されたアミド、Michaelアクセプター、アルキルハライド、アリールハライド、アシルハライド、およびイソチオシアネートが挙げられる。
いくつかの態様において、リンカーは、１つのアミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、結合（例えば共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００アミノ酸の長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０−３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸の長さである。より長いまたはより短いリンカーもまた企図される。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３７７）を含み、これはまた、ＸＴＥＮリンカーとしても言及され得る。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列：ＳＧＧＳ（配列番号３７８）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列：（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７９）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８０）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１）、（Ｇ）ｎ（配列番号３９０）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号３８２）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３７７）、もしくは（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのうちの任意のものの組み合わせを含み、ここで、ｎは、独立して、１〜３０（境界を含む）の整数であり、およびここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列：ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３７７）、およびＳＧＧＳ（配列番号３７８）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列：ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号３８３）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列：ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３８４）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列：ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３８５）を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、２４アミノ酸の長さである。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３４３）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、４０アミノ酸の長さである。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３９１）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、６４アミノ酸の長さである。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３９２）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、９２アミノ酸の長さである。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳ（配列番号３９３）を含む。
いくつかの態様において、第１および第２のヌクレオチド配列は、同じ核酸ベクター上にある。いくつかの態様において、第１および第２のヌクレオチド配列は、異なる核酸ベクター上にある。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドである。いくつかの態様において、核酸ベクターは、アデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）の組み換えゲノムである。いくつかの態様において、核酸ベクターは、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされているアデノ関連ウイルスのゲノムである。いくつかの態様において、第１のおよび／または第２のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に連結されている。いくつかの態様において、核酸ベクターは、プロモーターに作動的に連結した１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）のgRNAをコードするヌクレオチド配列を、さらに含む。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
本開示の誘導性プロモーターは、１つ以上の生理学的条件、例えば光の変化、ｐＨ、温度、放射線、浸透圧、食塩水勾配、細胞表面結合、および１つ以上の外因性または内因性の誘導剤の濃度により、誘導され得る（またはこれにより抑制され得る）。外因性インデューサーシグナルまたは誘導剤は、限定することなく、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、糖および多糖、核酸、タンパク質転写活性化因子およびリプレッサー、サイトカイン、トキシン、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモンまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。
本開示の誘導性プロモーターは、本明細書において記載されるかまたは当業者に公知の任意の誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例として、限定することなく、化学的に／生化学的に調節される、および物理学的に調節されるプロモーター、例えば、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系；これは、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガのエクジソン（ecdysone）受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーター）、金属調節型プロモーター（例えば、酵母、マウスおよびヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンに結合してこれを隔絶するタンパク質から誘導されるプロモーター）遺伝子）、病原性調節型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）により誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、および光調節型プロモーター（例えば、植物細胞からの光応答性プロモーター）が挙げられる。他の誘導性プロモーター系は、当該分野において公知であり、本開示に従って用いることができる。
いくつかの態様において、本開示の誘導性プロモーターは、原核細胞（例えば細菌細胞）において機能する。原核細胞を用いるための誘導性プロモーターの例として、限定することなく、バクテリオファージプロモーター（例えばPls1con、T3、T7、SP6、PL）、および細菌性プロモーター（例えば、Pbad、PmgrB、Ptrc2、Plac/ara、Ptac、Pm）、またはこれらのハイブリッド（例えばPLlacO、PLtetO）が挙げられる。本開示に従う使用のための細菌性プロモーターの例として、限定することなく、以下が挙げられる：正に調節されるE. coliプロモーター、例えば正に調節されるσ70プロモーター（例えば、誘導性pBad/araCプロモーター、Luxカセットの右プロモーター、改変ラムダPrmプロモーター、plac Or2-62（正）、余分のREN部位を有するpBad/AraC、pBad、P（Las）TetO、P（Las）CIO、P（Rhl）、Pu、FecA、pRE、cadC、hns、pLas、pLux）、σＳプロモーター（例えば、Pdps）、σＳ３２プロモーター（例えば、ヒートショック）、およびσＳ５４プロモーター（例えば、glnAp2）；負に調節されるσＳ７０プロモーターなどの負に調節されるE. coliプロモーター（例えば、プロモーター（PRM+）、改変ラムダPrmプロモーター、TetR-TetR-4C P（Las）TetO、P（Las）CIO、P（Lac）IQ、RecA_DlexO_DLacO1、dapAp、FecA、Pspac-hy、pcI、plux-cI、plux-lac、CinR、CinL、グルコースにより調節される改変Pr、改変Prm+、FecA、Pcya、rec A（SOS）、Rec A（SOS）、EmrR_regulated、BetI_regulated、pLac_lux、pTet_Lac、pLac/Mnt、pTet/Mnt、LsrA/cI、pLux/cI、LacI、LacIQ、pLacIQ1、pLas/cI、pLas/Lux、pLux/Las、LexA結合部位を有するpRecA、リバースBBa_R0011、pLacI/ara-1、pLacIq、rrnB P1、cadC、hns、PfhuA、pBad/araC、nhaA、OmpF、RcnR）、σSプロモーター（例えば、代替的σ因子σ３８を有するLutz-Bujard LacO）、σ３２プロモーター（例えば、代替的σ因子σ３２を有するLutz-Bujard LacO）、およびσ５４プロモーター（例えば、glnAp2）；負に調節されるB. subtilisプロモーター、例えば、抑制可能なB. subtilisのσＡプロモーター（例えば、グラム陽性IPTG誘導性、Xyl、hyper-spank）およびσＢプロモーター。他の誘導性の微生物プロモーターを、本開示に従って用いることができる。
いくつかの態様において、本開示の誘導性プロモーターは、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）において機能する。真核細胞を用いるための誘導性プロモーターの例として、限定することなく、化学的に調節型プロモーター（例えば、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、および病原性関連（ＰＲ）プロモーター）および生理学的にされるプロモーター（例えば、温度調節型プロモーターおよび光調節型プロモーター）が挙げられる。
組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）
本開示のいくつかの側面は、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターの細胞中への送達のために、組み換えアデノ関連ウイルスベクターを用いることに関する。Cas9タンパク質または核酸塩基エディターのＮ末端部分およびCas9タンパク質または核酸塩基エディターのＣ末端部分は、別々のｒＡＡＶベクターまたは粒子により同じ細胞中に送達される。なぜならば、全長Cas9タンパク質または核酸塩基エディターは、ｒＡＡＶのパッケージングの限度を超える（約４．９ｋｂ）。
したがって、いくつかの態様において、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターを細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）中に送達するための組成物が提供される。いくつかの態様において、本開示の組成物は、以下を含む：（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列または核酸塩基エディターを含む、第１の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子；および（ｉｉ）Cas9タンパク質または核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、第２の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。本開示のｒＡＡＶ粒子は、ウイルスキャプシドタンパク質中でキャプシド形成されたｒＡＡＶベクター（すなわち、ｒＡＡＶの組み換えゲノム）を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、以下を含む：（１）本明細書に記載の任意の形態における、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターのＮ末端部分またはＣ末端部分をコードする第１または第２のヌクレオチド配列を含む、異種性核酸領域、（２）前記異種性核酸領域の発現を促進する配列（例えば、プロモーター）を含む、１つ以上のヌクレオチド配列、および（３）細胞のゲノム中への前記異種性核酸領域の組み込みを促進する配列（任意に、発現を促進する配列を含む、１つ以上の核酸領域を有する）を含む、１つ以上の核酸領域。いくつかの態様において、組み込みを促進するウイルスの配列は、逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。いくつかの態様において、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターのＮ末端部分またはＣ末端部分をコードする第１または第２のヌクレオチド配列には、両側においてＩＴＲ配列が隣接する。いくつかの態様において、核酸ベクターは、本明細書に記載のAAV Repタンパク質をコードする領域をさらに含み、これは、ＩＴＲが隣接する領域内、または当該領域の外側のいずれかに含まれる。ＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に由来しても、１つより多くの血清型に由来してもよい。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６に由来する。
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含むプラスミドは、は、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、以下から入手可能な製品およびサービスを参照：Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MA；ならびに、Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Nov 26;93（24）：14082-7；ならびにCurtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine（商標）。Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6：201（著作権）Humana Press Inc. 2003. 第10章。Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni CathomenおよびRichard Jude Samulski；米国特許第5,139,941号および同第5,962,313号；これらの全ては、本明細書において参考として援用される）。例示的なＩＴＲ配列を、以下に提供する。
ＡＡＶ２：
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT（配列番号３８６）
ＡＡＶ３：
TTGGCCACTCCCTCTATGCGCACTCGCTCGCTCGGTGGGGCCTGGCGACCAAAGGTCGCCAGACGGACGTGCTTTGCACGTCCGGCCCCACCGAGCGAGCGAGTGCGCATAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGAGGTATGGC（配列番号３８７）
ＡＡＶ５：
CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAAAGAGCTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTA（配列番号３８８）
ＡＡＶ６：
TTGCCCACTCCCTCTATGCGCGCTCGCTCGCTCGGTGGGGCCTGCGGACCAAAGGTCCGCAGACGGCAGAGCTCTGCTCTGCCGGCCCCACCGAGCGAGCGAGCGCGCATAGAGGGAGTGGGCAACTCCATCACTAGGGGTA（配列番号３８９）
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、異種性核酸領域の発現を制御するための１つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター、転写ターミネーター、および／または他の調節エレメント）を含む。いくつかの態様において、第１および／または第２のヌクレオチド配列は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれより多く）の転写ターミネーターに、作動的に連結される。本開示に従って用いることができる転写ターミネーターの非限定的な例として、ウシ成長ホルモン遺伝子（bGH）、ヒト成長ホルモン遺伝子（hGH）、SV40、CW3、Φの転写ターミネーター、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの転写ターミネーターの効率を試験して、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターの発現レベルにおけるそれらのそれぞれの効果を決定した（例えば図４を参照）。いくつかの態様において、本開示において用いられる転写ターミネーターは、bGH転写ターミネーターである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。いくつかの態様において、ＷＰＲＥは、転写ターミネーターの５’に挿入される。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物（本明細書において企図される任意の形態におけるもの）は、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、ヒトまたは動物の対象への投与のための適切な医薬用ビヒクル中で処方される。
薬学的に受入可能なキャリアとして働き得る材料のいくつかの例として、以下が挙げられる：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン；（３）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微晶質セルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの潤滑剤；（８）カカオバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油脂；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの嵩高剤（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清構成成分；（２２）エタノールなどのＣ２−Ｃ１２アルコール；ならびに（２３）医薬処方物中で使用される他の非毒性の適合性の物質。湿潤化剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤、および抗酸化剤もまた、処方物中に存在することができる。「賦形剤」、「キャリア」、「薬学的に受入可能なキャリア」などの用語は、本明細書において交換可能に用いられる。
使用の方法
本開示の他の側面は、完全かつ機能的なCas9タンパク質または核酸塩基エディターを形成させるために、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターを細胞中に送達する方法を提供する。例えば、いくつかの態様において、細胞を、本明細書において記載される組成物（例えば、スプリット型Cas9もしくはスプリット型核酸塩基エディターをコードするヌクレオチド配列、またはかかるヌクレオチド配列を含む核酸ベクターを含むＡＡＶ粒子を含む組成物）と接触させる。いくつかの態様において、接触させることは、かかるヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらし、ここで、Cas9タンパク質または核酸塩基エディターのＮ末端部分とCas9タンパク質または核酸塩基エディターのＣ末端部分とは、細胞において発現され、連結されて、完全なCas9タンパク質または完全な核酸塩基エディターを形成する。
本明細書において記載される方法を用いて送達されるスプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターは、好ましくは、本来のCas9タンパク質または核酸塩基エディター（すなわち、全体として細胞に送達されるかまたは細胞において発現される非スプリット型タンパク質）と比較して、これに匹敵する活性を有する。例えば、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターは、本来のCas9タンパク質または核酸塩基エディターの活性のうち、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）を保持する。いくつかの態様において、スプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターは、本来のCas9タンパク質または核酸塩基エディターの活性よりも活性が高い（例えば、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、またはそれより高い）。
本明細書において記載される組成物は、それを必要とする対象に、当該対象が罹患している疾患または障害を処置および／または予防するための治療有効量において、投与してもよい。CRISPR/Cas9に基づくゲノム編集技術を用いて処置および／または予防することができる任意の疾患または障害を、本明細書において記載されるスプリット型Cas9タンパク質またはスプリット型核酸塩基エディターにより処置することができる。スプリット型Cas9タンパク質または核酸塩基エディターをコードするヌクレオチド配列が、gRNAをさらにコードしない場合、gRNAをコードす別々の核酸ベクターを、本明細書において記載される組成物と一緒に投与してもよいことが、理解されるべきである。
例示的な好適な疾患および障害として、限定することなく、以下が挙げられる：［［以下の疾患は、ＣからＴへのエディター適用において含められた。なお適切であると考えられ、アデノシンデアミナーゼを用いて処置され得るものがあれば示されたい］］嚢胞性線維症（例えば、Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013；13：653-658；およびWu et. al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013；13：659-662を参照；これらのいずれも、遺伝的欠損を補正するために、デアミナーゼ融合タンパク質を用いていない）；フェニルケトン尿症−例えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子中の位置８３５（マウス）または２４０（ヒト）フェニルアラニンまたは相同の残基におけるからセリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、McDonald et al., Genomics. 1997；39：402-405を参照；ベルナール・スーリエ症候群（ＢＳＳ）−例えば、血小板膜糖タンパク質ＩＸにおける位置５５もしくは相同な残基におけるフェニルアラニンからセリンへの変異、または残基２４もしくは相同な残基におけるシステインからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Noris et al., British Journal of Haematology. 1997；97：312-320、およびAli et al., Hematol. 2014；93：381-384を参照；表皮溶解性角化症（ＥＨＫ）−例えば、ケラチン１における位置１６０または１６１におけるロイシンまたは相同な残基からプロリンへの変異（イニシエーターのメチオニンをカウントする場合）（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Chipev et al., Cell. 1992；70：821-828を参照；また、www[dot]uniprot[dot]orgにおけるUNIPROTデータベースにおけるアクセッション番号P04264を参照；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）−例えば、プロセッシングされた形態におけるα１−アンチトリプシンにおける位置５４または５５におけるロイシンまたは相同な残基、あるいはプロセッシングされていない形態における残基７８または相同な残基からプロリンへの変異（イニシエーターのメチオニンをカウントする場合）（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Poller et al., Genomics. 1993；17：740-743を参照；また、UNIPROTデータベースにおけるアクセッション番号P01011を参照；４Ｊ型シャルコー・マリー・トゥース病−例えば、ＦＩＧ４における位置４１におけるイソロイシンまたは相同な残基からスレオニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Lenk et al., PLoS Genetics. 2011；7：e1002104を参照；神経芽細胞腫（ＮＢ）−例えば、カスパーゼ−９における位置１９７におけるロイシンまたは相同な残基からプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Kundu et al., 3 Biotech. 2013, 3：225-234を参照；フォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）−例えば、フォン・ヴィルブランド因子のプロセッシングされた形態における位置５０９におけるシステインまたは相同な残基、あるいは、フォン・ヴィルブランド因子のプロセッシングされていない形態における位置１２７２または相同な残基からアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Lavergne et al., Br. J. Haematol. 1992；82：66-72を参照；また、UNIPROTデータベースにおけるアクセッション番号P04275を参照；先天性筋強直症−例えば、筋クロライド遺伝子CLCN1における位置２７７におけるシステインまたは相同な残基からアルギニンへの変異を参照（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Weinberger et al., The J. of Physiology. 2012；590：3449-3464を参照；遺伝性腎アミロイドーシス−例えば、アポリポタンパク質ＡＩＩのプロセッシングされた形態における位置７８における、プロセッシングされていない形態におけるまたは位置１０１における停止コドン、または相同な残基から、アルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えば、Yazaki et al., Kidney Int. 2003；64：11-16を参照；拡張型心筋症（ＤＣＭ）−例えば、FOXD4遺伝子における位置１４８におけるトリプトファンまたは相同な残基からアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）、例えば、Minoretti et. al., Int. J. of Mol. Med. 2007；19：369-372を参照；遺伝性リンパ浮腫−例えば、VEGFR3チロシンキナーゼにおける位置１０３５におけるヒスチジンまたは相同な残基からアルギニンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）、例えば、Irrthum et al., Am. J. Hum. Genet. 2000；67：295-301を参照；家族性アルツハイマー病−例えば、プレセニリン１における位置１４３におけるイソロイシンまたは相同な残基からバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）、例えば、Gallo et. al., J. Alzheimer’s disease. 2011；25：425-431を参照；プリオン病−例えば、プリオンタンパク質における位置１２９におけるメチオニンまたは相同な残基からバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−例えば、Lewis et. al., J. of General Virology. 2006；87：2443-2449を参照；慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）−例えば、クリオピリンにおける位置５７０におけるチロシンまたは相同な残基からシステインへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−例えば、Fujisawa et. al. Blood. 2007；109：2903-2911を参照；ならびに、デスミン関連心筋症（ＤＲＭ）−例えば、αβクリスタリンにおける位置１２０におけるアルギニンまたは相同な残基からグリシンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−例えば、Kumar et al., J. Biol. Chem. 1999；274：24137-24141を参照。全ての参考文献およびデータベースエントリーの全内容は、本明細書において参考として援用される。
疼痛抑制のための組成物を投与する好適な経路として、限定することなく、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、経歯肉、歯内（intradental）、蝸牛内、経中耳（transtympanic）、器官内、硬膜外、くも膜下内、筋肉内、静脈内、血管内、眼周囲、腫瘍内、脳内、非経口、および脳室内投与が挙げられる。
本開示の組成物は、例えば単位用量として投与またはパッケージングされていてもよい。用語「単位用量」とは、本開示の医薬組成物に関して用いられる場合、対象のための単位投与量として好適な物理的に別々の単位であって、各々の単位が、所望される希釈剤、すなわちキャリアまたはビヒクルと組み合わせて、所望される治療効果を提供するために予め決定された量の活性材料を含むものを指す。
疾患または障害の処置は、疾患の発生または進行を遅延させるか、疾患の重篤度を軽減することを含む。疾患を処置することは、必ずしも治癒的な結果を必要としない。
そこにおいて用いられる場合、疾患の発生を「遅延させること」とは、疾患の進行を延期するか、妨害するか、遅らせる（slow）か、遅延させる（retard）か、安定化させるか、および／または延期することを意味する。この遅延は、病歴、および／または処置されている個体に依存して、異なる期間のものであってよい。疾患の発生を「遅延させる（delay）」かもしくは軽減するか、または疾患の発生を遅延させる方法とは、当該方法を用いていない場合と比較して、所与の時間枠において疾患の１つ以上の症状を発症する可能性を減少させるか、および／または所与の時間枠において症状の程度を減少させる方法である。かかる比較は、典型的には、統計学的に有意な結果をもたらすために十分な対象の数を用いた臨床研究に基づく。
疾患の「発症」または「進行」とは、疾患の初期徴候および／または後に続く進行を意味する。疾患の発症は、検出可能であり得、当該分野において周知であるような標準的な臨床技術を用いて評価することができる。しかし、発症はまた、検出不可能であり得る進行を指す。本開示の目的のために、発症または進行とは、症状の生物学的な経過を指す。「発症」は、発生（occurrence）、再発および発症（onset）を含む。
本明細書において用いられる場合、疾患の「発症（onset）」または「発生（occurrence）」は、初回の発症および／または再発を含む。処置されるべき疾患の型または疾患の部位に依存して、単離されたポリペプチドまたは医薬組成物を対象に投与するために、医学の分野における当業者に公知の従来の方法を用いてもよい。
キット
本開示の組成物を集合させて、キットを組み立ててもよい。いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載される核酸塩基エディターの発現のための核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、キットは、Cas9タンパク質または核酸塩基エディターを所望される標的配列にターゲティングするために、適切なガイドヌクレオチド配列（例えば、gRNA）またはかかるガイドヌクレオチド配列の発現のための核酸ベクターをさらに含む。
本明細書において記載されるキットは、本明細書において記載される方法を行うための構成成分、および任意に使用のための指示を収容する、１つ以上の容器を含んでもよい。本明細書において記載されるキットのうちのいずれかは、アッセイ方法を行うために必要とされる構成成分をさらに含んでもよい。キットの各々の構成成分は、適切である場合には、液体の形態において（例えば、溶液において）または個体の形態において（例えば、乾燥粉末として）提供してもよい。ある場合においては、構成成分のうちのいくつかは、例えば好適な溶媒または他の種（例えば水）の添加により、再構成可能であるか、または他に（例えば、活性な形態に）処理可能であってもよく、これはキットと共に提供されても、そうでなくともよい。
いくつかの態様において、キットは、提供される構成成分の使用のための指示および／または促進物を含んでもよい。本明細書において用いられる場合、「指示」は、指示および／または促進物の構成成分を定義することができ、典型的には、本開示のパッケージング上またはこれと共に組み合わされた、記述された指示を含む。指示はまた、ユーザーが、指示はキットと組み合わせるべきであることを明らかに認識するように、任意の様式において提供された口頭または電子的な指示、例えば、視聴覚（例えばビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブベースの伝達などを含んでもよい。記述された指示は、医薬またはバイオ製品の製造、使用または販売を規制する政府の機関により処方される形態におけるものであってもよく、これはまた、動物への投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映していてもよい。本明細書において用いられる場合、「促進される」とは、ビジネスを行う全ての方法を含み、これは、本開示と関連する、教育の方法、病院および他の臨床的な指示、科学的な調査、薬物の発見または開発、学術研究、医薬の販売を含む製薬の活動、および任意の広告または他の宣伝活動（記述された、口頭の、および電子的な伝達を含む）。さらに、キットは、本明細書において記載されるように、特定の用途に依存して、他の構成成分を含んでもよい。
キットは、本明細書において記載される構成成分のうちの任意の１つ以上を、１つ以上の容器中に含んでもよい。構成成分を、無菌で調製し、シリンジ中にパッケージングし、保冷で輸送してもよい。あるいは、それは、貯蔵のための他のバイアルまたは他の容器中に収容してもよい。第２の容器は、無菌調製した他の構成成分を有していてもよい。あるいは、キットは、あらかじめ混合され、バイアル、チューブまたは他の容器中で輸送される活性成分を含んでもよい。
キットは、ブリスターパウチ、シュリンクラップされたパウチ、真空密封パウチ、密封された熱形成トレーまたは類似のパウチもしくはトレーの形態などの、多様な形態を有していてもよく、これは、パウチ内に緩やかに包装されたアクセサリー、１つ以上のチューブ、容器、箱またはバッグを有する。キットを、アクセサリーが付加された後で滅菌することにより、容器中の個々のアクセサリーの包装を別に開けられるようにすることができる。キットは、当該分野において公知の放射線滅菌、加熱滅菌、または他の滅菌方法などの任意の適切な滅菌技術を用いて無菌化することができる。キットは、特定の用途に依存して、消毒剤、ディスポーザブルの手袋、投与の前の剤の支持材を適用または除去するためなどの、他の構成成分、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝化剤、試薬、シリンジ、針、ガーゼなどのファブリックを含んでもよい。
宿主細胞
本明細書において記載される組成物のうちのいずれかを含んでもよい細胞は、原核細胞および真核細胞を含む。本明細書において記載される方法は、Cas9タンパク質または核酸塩基エディターを真核細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）中に送達するために用いられる。いくつかの態様において、細胞は、in vitroのもの（例えば培養細胞）である。いくつかの態様において、細胞は、in vivoのもの（例えば、ヒト対象などの対象）である。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoのもの（例えば、対象から単離され、同じまたは異なる対象に戻し投与することができるもの）である。
本開示の哺乳動物細胞として、ヒト細胞、霊長類細胞（例えば、ベロ細胞）、ラット細胞（例えば、GH3細胞、OC23細胞）またはマウス細胞（例えば、MC3T3細胞）が挙げられる。多様なヒト細胞株が存在し、これは、限定することなく、ヒト胎児由来腎臓（HEK）細胞、HeLa細胞、国立がん研究所60癌細胞株（National Cancer Institute's 60 cancer cell lines：NCI60）からの癌細胞、DU145（前立腺癌）細胞、Lncap（前立腺癌）細胞、MCF-7（乳癌）細胞、MDA-MB-438（乳癌）細胞、PC3（前立腺癌）細胞、T47D（乳癌）細胞、THP-1（急性骨髄性白血病）細胞、U87（神経膠芽腫）細胞、SHSY5Yヒト神経芽細胞腫細胞（骨髄腫からクローンされたもの）およびSaos-2（骨癌）細胞を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、ヒト胎児由来腎臓（HEK）細胞（例えば、HEK 293またはHEK 293T細胞）中に送達される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、例えば多能性幹細胞（例えば、ヒト由来多能性幹細胞（hiPSC）を含むヒト多能性幹細胞）などの幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）中に送達される。幹細胞とは、培養中で不確定の期間にわたり分裂して、特化した細胞を生じる能力を有する細胞を指す。多能性幹細胞は、生物の全ての組織に分化することができるが、単独では完全な生命体の発達を維持することはできない、幹細胞の型を指す。ヒト由来多能性幹細胞は、胚性幹細胞の定義特性を維持するために重要な遺伝子および因子を強制的に発現させることにより、胚性幹細胞様状態に再プログラムされた、体性（例えば、成熟または成人）細胞を指す（例えば、Takahashi and Yamanaka, Cell 126（4）：663-76, 2006を参照；本明細書において参考として援用される）。ヒト由来多能性幹細胞は、幹細胞マーカーを発現し、三肺葉全て（外肺葉、内胚葉、中胚葉）の細胞の特徴を生じることができる。
本開示に従って用いることができる細胞株のさらなる非限定的な例として、以下が挙げられる：293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five細胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L細胞、Jurkat、JY細胞、K562細胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1、2、3...48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC 6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL細胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2細胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1およびYAR細胞。
さらなる詳述なしで、当業者は、上の記載に基づいて、本開示をその完全な程度まで利用することができると考えられる。以下の特定の態様は、したがって、単に説明的なものであると解釈され、決して本開示の残りを限定するものではない。本明細書において引用される全ての刊行物は、本明細書において参照される目的または主題について、本明細書において参考として援用される。
例
本明細書において記載される発明がより完全に理解され得るために、以下の例を記載する。本願において記載される合成例は、本明細書において提供される化合物および方法を説明するために提供され、決して、それらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
例１：Cas9タンパク質および核酸塩基エディターのアミノ酸配列
好適なCas9タンパク質およびバリアント、ならびに核酸塩基エディターおよびバリアントの非限定的な例を提供する。本開示は、Cas9バリアント、例えば、１つ以上の変異を含んでもよい（例えばdCas9またはCas9ニッカーゼを生成するために）、１つ以上の生物からのCas9タンパク質を提供する。いくつかの態様において、以下においてアスタリスクにより同定される、Cas9タンパク質のアミノ酸残基のうちの１つ以上は、変異していてもよい。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＤ１０および／またはＨ８４０残基、または配列番号２〜２７５および３９４〜３９７において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異は、変異している。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号２〜２７５および３９４〜３９７において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異は、Ｄ以外の任意のアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号２〜２７５および３９４〜３９７において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号２〜２７５および３９４〜３９７において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する残基は、Ｈである。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号２〜２７５および３９４〜３９７において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異は、Ｈ以外の任意のアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号２〜２７５および３９４〜３９７において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号２〜２７５および３９４〜３９７において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する残基は、Ｄである。
多様な種からの多数のCas9配列を、配列番号１のＤ１０およびＨ８４０の対応する相同なアミノ酸残基が、他のCas9タンパク質において同定され得るか否かを決定するためにアラインメントし、相同なアミノ酸残基の対応する変異を有するCas9バリアントの生成を可能にした。ＮＣＢＩの制約に基づく多重アラインメントツール（Constraint-based Multiple Alignment Tool：COBALT（st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobaltにおいてアクセス可能））を、以下のパラメーターにより用いて、アラインメントを行った：アラインメントパラメーター：Gap penalties -11,-1；End-Gap penalties -5,-1. CDD Parameters：Use RPS BLAST on；Blast E-value 0.003；Find Conserved columns and Recompute on. Query Clustering Parameters：Use query clusters on；Word Size 4；Max cluster distance 0.8；Alphabet Regular。
S. pyogenes Cas9野生型（ＮＣＢＩ参照配列：NC_002737.2、Uniprot参照配列：Q99ZW2）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号１）
S. pyogenes dCas9（D10AおよびH840A）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRI DLSQLGGD（配列番号２）
S. pyogenes Cas9ニッカーゼ（D10A）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号３）
VRER-nCas9（D10A/D1135V/G1218R/R1335E/T1337R）S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号４）
VQR-nCas9（D10A/D1135V/R1335Q/T1337R）S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号５）
EQR-nCas9（D10A/D1135E/R1335Q/T1337R）S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFESPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号６）
KKH-nCas9（D10A/E782K/N968K/R1015H）S. aureus Cas9ニッカーゼ
MKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG（配列番号７）
Streptococcus thermophilus CRISPR1 Cas9（St1Cas9）ニッカーゼ（D9A）
MSDLVLGLAIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLTRRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSIGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKGYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTRYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINEKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWRADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFEKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDF（配列番号８）
Streptococcus thermophilus CRISPR3 Cas9（St3Cas9）ニッカーゼ（D10A）
MTKPYSIGLAIGTNSVGWAVITDNYKVPSKKMKVLGNTSKKYIKKNLLGVLLFDSGITAEGRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSTEMATLDDAFFQRLDDSFLVPDDKRDSKYPIFGNLVEEKVYHDEFPTIYHLRKYLADSTKKADLRLVYLALAHMIKYRGHFLIEGEFNSKNNDIQKNFQDFLDTYNAIFESDLSLENSKQLEEIVKDKISKLEKKDRILKLFPGEKNSGIFSEFLKLIVGNQADFRKCFNLDEKASLHFSKESYDEDLETLLGYIGDDYSDVFLKAKKLYDAILLSGFLTVTDNETEAPLSSAMIKRYNEHKEDLALLKEYIRNISLKTYNEVFKDDTKNGYAGYIDGKTNQEDFYVYLKNLLAEFEGADYFLEKIDREDFLRKQRTFDNGSIPYQIHLQEMRAILDKQAKFYPFLAKNKERIEKILTFRIPYYVGPLARGNSDFAWSIRKRNEKITPWNFEDVIDKESSAEAFINRMTSFDLYLPEEKVLPKHSLLYETFNVYNELTKVRFIAESMRDYQFLDSKQKKDIVRLYFKDKRKVTDKDIIEYLHAIYGYDGIELKGIEKQFNSSLSTYHDLLNIINDKEFLDDSSNEAIIEEIIHTLTIFEDREMIKQRLSKFENIFDKSVLKKLSRRHYTGWGKLSAKLINGIRDEKSGNTILDYLIDDGISNRNFMQLIHDDALSFKKKIQKAQIIGDEDKGNIKEVVKSLPGSPAIKKGILQSIKIVDELVKVMGGRKPESIVVEMARENQYTNQGKSNSQQRLKRLEKSLKELGSKILKENIPAKLSKIDNNALQNDRLYLYYLQNGKDMYTGDDLDIDRLSNYDIDHIIPQAFLKDNSIDNKVLVSSASNRGKSDDFPSLEVVKKRKTFWYQLLKSKLISQRKFDNLTKAERGGLLPEDKAGFIQRQLVETRQITKHVARLLDEKFNNKKDENNRAVRTVKIITLKSTLVSQFRKDFELYKVREINDFHHAHDAYLNAVIASALLKKYPKLEPEFVYGDYPKYNSFRERKSATEKVYFYSNIMNIFKKSISLADGRVIERPLIEVNEETGESVWNKESDLATVRRVLSYPQVNVVKKVEEQNHGLDRGKPKGLFNANLSSKPKPNSNENLVGAKEYLDPKKYGGYAGISNSFAVLVKGTIEKGAKKKITNVLEFQGISILDRINYRKDKLNFLLEKGYKDIELIIELPKYSLFELSDGSRRMLASILSTNNKRGEIHKGNQIFLSQKFVKLLYHAKRISNTINENHRKYVENHKKEFEELFYYILEFNENYVGAKKNGKLLNSAFQSWQNHSIDELCSSFIGPTGSERKGLFELTSRGSAADFEFLGVKIPRYRDYTPSSLLKDATLIHQSVTGLYETRIDLAKLGEG（配列番号９）
S. aureus Cas9野生型
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG（配列番号１０）
S. aureus Cas9ニッカーゼ（D10A）
MKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG（配列番号１１）
Streptococcus thermophilus野生型CRISPR3 Cas9（St3Cas9）
MTKPYSIGLDIGTNSVGWAVITDNYKVPSKKMKVLGNTSKKYIKKNLLGVLLFDSGITAEGRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSTEMATLDDAFFQRLDDSFLVPDDKRDSKYPIFGNLVEEKVYHDEFPTIYHLRKYLADSTKKADLRLVYLALAHMIKYRGHFLIEGEFNSKNNDIQKNFQDFLDTYNAIFESDLSLENSKQLEEIVKDKISKLEKKDRILKLFPGEKNSGIFSEFLKLIVGNQADFRKCFNLDEKASLHFSKESYDEDLETLLGYIGDDYSDVFLKAKKLYDAILLSGFLTVTDNETEAPLSSAMIKRYNEHKEDLALLKEYIRNISLKTYNEVFKDDTKNGYAGYIDGKTNQEDFYVYLKNLLAEFEGADYFLEKIDREDFLRKQRTFDNGSIPYQIHLQEMRAILDKQAKFYPFLAKNKERIEKILTFRIPYYVGPLARGNSDFAWSIRKRNEKITPWNFEDVIDKESSAEAFINRMTSFDLYLPEEKVLPKHSLLYETFNVYNELTKVRFIAESMRDYQFLDSKQKKDIVRLYFKDKRKVTDKDIIEYLHAIYGYDGIELKGIEKQFNSSLSTYHDLLNIINDKEFLDDSSNEAIIEEIIHTLTIFEDREMIKQRLSKFENIFDKSVLKKLSRRHYTGWGKLSAKLINGIRDEKSGNTILDYLIDDGISNRNFMQLIHDDALSFKKKIQKAQIIGDEDKGNIKEVVKSLPGSPAIKKGILQSIKIVDELVKVMGGRKPESIVVEMARENQYTNQGKSNSQQRLKRLEKSLKELGSKILKENIPAKLSKIDNNALQNDRLYLYYLQNGKDMYTGDDLDIDRLSNYDIDHIIPQAFLKDNSIDNKVLVSSASNRGKSDDFPSLEVVKKRKTFWYQLLKSKLISQRKFDNLTKAERGGLLPEDKAGFIQRQLVETRQITKHVARLLDEKFNNKKDENNRAVRTVKIITLKSTLVSQFRKDFELYKVREINDFHHAHDAYLNAVIASALLKKYPKLEPEFVYGDYPKYNSFRERKSATEKVYFYSNIMNIFKKSISLADGRVIERPLIEVNEETGESVWNKESDLATVRRVLSYPQVNVVKKVEEQNHGLDRGKPKGLFNANLSSKPKPNSNENLVGAKEYLDPKKYGGYAGISNSFAVLVKGTIEKGAKKKITNVLEFQGISILDRINYRKDKLNFLLEKGYKDIELIIELPKYSLFELSDGSRRMLASILSTNNKRGEIHKGNQIFLSQKFVKLLYHAKRISNTINENHRKYVENHKKEFEELFYYILEFNENYVGAKKNGKLLNSAFQSWQNHSIDELCSSFIGPTGSERKGLFELTSRGSAADFEFLGVKIPRYRDYTPSSLLKDATLIHQSVTGLYETRIDLAKLGEG（配列番号１２）
Streptococcus thermophilus CRISPR1 Cas9野生型（St1Cas9）
MSDLVLGLDIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLTRRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSIGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKGYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTRYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINEKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWRADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFEKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDF（配列番号１３）
Sulfolobus islandicusからのCasX（株REY15A）。
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYKFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIMAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVSIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRDLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG（配列番号１４）
Sulfolobus islandicusからのCasY（株REY15A）。
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYEFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIIAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVRIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRYLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG（配列番号１５）
野生型Francisella novicida Cpf1（D917、E1006、およびD1255に太字および下線を付す）
Francisella novicida Cpf1 D917A（A917、E1006、およびD1255に太字および下線を付す）
Francisella novicida Cpf1 E1006A（D917、A1006、およびD1255に太字および下線を付す）
Francisella novicida Cpf1 D1255A（D917、E1006、およびA1255に太字および下線を付す）
Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006A（A917、A1006、およびD1255に太字および下線を付す）
Francisella novicida Cpf1 D917A/D1255A（A917、E1006、およびA1255に太字および下線を付す）
Francisella novicida Cpf1 E1006A/D1255A（D917、A1006、およびA1255に太字および下線を付す）
Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006A/D1255A（A917、A1006およびA1255に太字および下線を付す）
野生型Natronobacterium gregoryiアルゴノート
MTVIDLDSTTTADELTSGHTYDISVTLTGVYDNTDEQHPRMSLAFEQDNGERRYITLWKNTTPKDVFTYDYATGSTYIFTNIDYEVKDGYENLTATYQTTVENATAQEVGTTDEDETFAGGEPLDHHLDDALNETPDDAETESDSGHVMTSFASRDQLPEWTLHTYTLTATDGAKTDTEYARRTLAYTVRQELYTDHDAAPVATDGLMLLTPEPLGETPLDLDCGVRVEADETRTLDYTTAKDRLLARELVEEGLKRSLWDDYLVRGIDEVLSKEPVLTCDEFDLHERYDLSVEVGHSGRAYLHINFRHRFVPKLTLADIDDDNIYPGLRVKTTYRPRRGHIVWGLRDECATDSLNTLGNQSVVAYHRNNQTPINTDLLDAIEAADRRVVETRRQGHGDDAVSFPQELLAVEPNTHQIKQFASDGFHQQARSKTRLSASRCSEKAQAFAERLDPVRLNGSTVEFSSEFFTGNNEQQLRLLYENGESVLTFRDGARGAHPDETFSKGIVNPPESFEVAVVLPEQQADTCKAQWDTMADLLNQAGAPPTRSETVQYDAFSSPESISLNVAGAIDPSEVDAAFVVLPPDQEGFADLASPTETYDELKKALANMGIYSQMAYFDRFRDAKIFYTRNVALGLLAAAGGVAFTTEHAMPGDADMFIGIDVSRSYPEDGASGQINIAATATAVYKDGTILGHSSTRPQLGEKLQSTDVRDIMKNAILGYQQVTGESPTHIVIHRDGFMNEDLDPATEFLNEQGVEYDIVEIRKQPQTRLLAVSDVQYDTPVKSIAAINQNEPRATVATFGAPEYLATRDGGGLPRPIQIERVAGETDIETLTRQVYLLSQSHIQVHNSTARLPITTAYADQASTHATKGYLVQTGAFESNVGFL（配列番号２４）
Cas9とＤＮＡ骨格との間の静電相互作用の低下を伴うCas9バリアント
＞APG80656.1 CRISPR関連タンパク質CasY［未培養のParcubacteria群細菌］
MSKRHPRISGVKGYRLHAQRLEYTGKSGAMRTIKYPLYSSPSGGRTVPREIVSAINDDYVGLYGLSNFDDLYNAEKRNEEKVYSVLDFWYDCVQYGAVFSYTAPGLLKNVAEVRGGSYELTKTLKGSHLYDELQIDKVIKFLNKKEISRANGSLDKLKKDIIDCFKAEYRERHKDQCNKLADDIKNAKKDAGASLGERQKKLFRDFFGISEQSENDKPSFTNPLNLTCCLLPFDTVNNNRNRGEVLFNKLKEYAQKLDKNEGSLEMWEYIGIGNSGTAFSNFLGEGFLGRLRENKITELKKAMMDITDAWRGQEQEEELEKRLRILAALTIKLREPKFDNHWGGYRSDINGKLSSWLQNYINQTVKIKEDLKGHKKDLKKAKEMINRFGESDTKEEAVVSSLLESIEKIVPDDSADDEKPDIPAIAIYRRFLSDGRLTLNRFVQREDVQEALIKERLEAEKKKKPKKRKKKSDAEDEKETIDFKELFPHLAKPLKLVPNFYGDSKRELYKKYKNAAIYTDALWKAVEKIYKSAFSSSLKNSFFDTDFDKDFFIKRLQKIFSVYRRFNTDKWKPIVKNSFAPYCDIVSLAENEVLYKPKQSRSRKSAAIDKNRVRLPSTENIAKAGIALARELSVAGFDWKDLLKKEEHEEYIDLIELHKTALALLLAVTETQLDISALDFVENGTVKDFMKTRDGNLVLEGRFLEMFSQSIVFSELRGLAGLMSRKEFITRSAIQTMNGKQAELLYIPHEFQSAKITTPKEMSRAFLDLAPAEFATSLEPESLSEKSLLKLKQMRYYPHYFGYELTRTGQGIDGGVAENALRLEKSPVKKREIKCKQYKTLGRGQNKIVLYVRSSYYQTQFLEWFLHRPKNVQTDVAVSGSFLIDEKKVKTRWNYDALTVALEPVSGSERVFVSQPFTIFPEKSAEEEGQRYLGIDIGEYGIAYTALEITGDSAKILDQNFISDPQLKTLREEVKGLKLDQRRGTFAMPSTKIARIRESLVHSLRNRIHHLALKHKAKIVYELEVSRFEEGKQKIKKVYATLKKADVYSEIDADKNLQTTVWGKLAVASEISASYTSQFCGACKKLWRAEMQVDETITTQELIGTVRVIKGGTLIDAIKDFMRPPIFDENDTPFPKYRDFCDKHHISKKMRGNSCLFICPFCRANADADIQASQTIALLRYVKEEKKVEDYFERFRKLKNIKVLGQMKKI（配列番号２６）
高フィデリティーCas9ドメイン
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号３９４）
C2c1（uniprot.org/uniprot/T0D7A2#）
sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR関連エンドヌクレアーゼC2c1 OS=Alicyclobacillus acidoterrestris（株ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B）GN=c2c1 PE=1 SV=1
MAVKSIKVKLRLDDMPEIRAGLWKLHKEVNAGVRYYTEWLSLLRQENLYRRSPNGDGEQECDKTAEECKAELLERLRARQVENGHRGPAGSDDELLQLARQLYELLVPQAIGAKGDAQQIARKFLSPLADKDAVGGLGIAKAGNKPRWVRMREAGEPGWEEEKEKAETRKSADRTADVLRALADFGLKPLMRVYTDSEMSSVEWKPLRKGQAVRTWDRDMFQQAIERMMSWESWNQRVGQEYAKLVEQKNRFEQKNFVGQEHLVHLVNQLQQDMKEASPGLESKEQTAHYVTGRALRGSDKVFEKWGKLAPDAPFDLYDAEIKNVQRRNTRRFGSHDLFAKLAEPEYQALWREDASFLTRYAVYNSILRKLNHAKMFATFTLPDATAHPIWTRFDKLGGNLHQYTFLFNEFGERRHAIRFHKLLKVENGVAREVDDVTVPISMSEQLDNLLPRDPNEPIALYFRDYGAEQHFTGEFGGAKIQCRRDQLAHMHRRRGARDVYLNVSVRVQSQSEARGERRPPYAAVFRLVGDNHRAFVHFDKLSDYLAEHPDDGKLGSEGLLSGLRVMSVDLGLRTSASISVFRVARKDELKPNSKGRVPFFFPIKGNDNLVAVHERSQLLKLPGETESKDLRAIREERQRTLRQLRTQLAYLRLLVRCGSEDVGRRERSWAKLIEQPVDAANHMTPDWREAFENELQKLKSLHGICSDKEWMDAVYESVRRVWRHMGKQVRDWRKDVRSGERPKIRGYAKDVVGGNSIEQIEYLERQYKFLKSWSFFGKVSGQVIRAEKGSRFAITLREHIDHAKEDRLKKLADRIIMEALGYVYALDERGKGKWVAKYPPCQLILLEELSEYQFNNDRPPSENNQLMQWSHRGVFQELINQAQVHDLLVGTMYAAFSSRFDARTGAPGIRCRRVPARCTQEHNPEPFPWWLNKFVVEHTLDACPLRADDLIPTGEGEIFVSPFSAEEGDFHQIHADLNAAQNLQQRLWSDFDISQIRLRCDWGEVDGELVLIPRLTGKRTADSYSNKVFYTNTGVTYYERERGKKRRKVFAQEKLSEEEAELLVEADEAREKSVVLMRDPSGIINRGNWTRQKEFWSMVNQRIEGYLVKQIRSRVPLQDSACENTGDI（配列番号３９５）
C2c2（uniprot.org/uniprot/P0DOC6）
＞sp|P0DOC6|C2C2_LEPSD CRISPR関連エンドリボヌクレアーゼC2c2 OS=Leptotrichia shahii（株DSM 19757 / CCUG 47503 / CIP 107916 / JCM 16776 / LB37）GN=c2c2 PE=1 SV=1
MGNLFGHKRWYEVRDKKDFKIKRKVKVKRNYDGNKYILNINENNNKEKIDNNKFIRKYINYKKNDNILKEFTRKFHAGNILFKLKGKEGIIRIENNDDFLETEEVVLYIEAYGKSEKLKALGITKKKIIDEAIRQGITKDDKKIEIKRQENEEEIEIDIRDEYTNKTLNDCSIILRIIENDELETKKSIYEIFKNINMSLYKIIEKIIENETEKVFENRYYEEHLREKLLKDDKIDVILTNFMEIREKIKSNLEILGFVKFYLNVGGDKKKSKNKKMLVEKILNINVDLTVEDIADFVIKELEFWNITKRIEKVKKVNNEFLEKRRNRTYIKSYVLLDKHEKFKIERENKKDKIVKFFVENIKNNSIKEKIEKILAEFKIDELIKKLEKELKKGNCDTEIFGIFKKHYKVNFDSKKFSKKSDEEKELYKIIYRYLKGRIEKILVNEQKVRLKKMEKIEIEKILNESILSEKILKRVKQYTLEHIMYLGKLRHNDIDMTTVNTDDFSRLHAKEELDLELITFFASTNMELNKIFSRENINNDENIDFFGGDREKNYVLDKKILNSKIKIIRDLDFIDNKNNITNNFIRKFTKIGTNERNRILHAISKERDLQGTQDDYNKVINIIQNLKISDEEVSKALNLDVVFKDKKNIITKINDIKISEENNNDIKYLPSFSKVLPEILNLYRNNPKNEPFDTIETEKIVLNALIYVNKELYKKLILEDDLEENESKNIFLQELKKTLGNIDEIDENIIENYYKNAQISASKGNNKAIKKYQKKVIECYIGYLRKNYEELFDFSDFKMNIQEIKKQIKDINDNKTYERITVKTSDKTIVINDDFEYIISIFALLNSNAVINKIRNRFFATSVWLNTSEYQNIIDILDEIMQLNTLRNECITENWNLNLEEFIQKMKEIEKDFDDFKIQTKKEIFNNYYEDIKNNILTEFKDDINGCDVLEKKLEKIVIFDDETKFEIDKKSNILQDEQRKLSNINKKDLKKKVDQYIKDKDQEIKSKILCRIIFNSDFLKKYKKEIDNLIEDMESENENKFQEIYYPKERKNELYIYKKNLFLNIGNPNFDKIYGLISNDIKMADAKFLFNIDGKNIRKNKISEIDAILKNLNDKLNGYSKEYKEKYIKKLKENDDFFAKNIQNKNYKSFEKDYNRVSEYKKIRDLVEFNYLNKIESYLIDINWKLAIQMARFERDMHYIVNGLRELGIIKLSGYNTGISRAYPKRNGSDGFYTTTAYYKFFDEESYKKFEKICYGFGIDLSENSEINKPENESIRNYISHFYIVRNPFADYSIAEQIDRVSNLLSYSTRYNNSTYASVFEVFKKDVNLDYDELKKKFKLIGNNDILERLMKPKKVSVLELESYNSDYIKNLIIELLTKIENTNDTL（配列番号３９６）
C2c3、＞CEPX01008730.1マリンメタゲノムのゲノムアセンブリTARA_037_MES_0.1-0.22、コンティグTARA_037_MES_0.1-0.22_scaffold22115_1、全ゲノムショットガン配列から翻訳。
MRSNYHGGRNARQWRKQISGLARRTKETVFTYKFPLETDAAEIDFDKAVQTYGIAEGVGHGSLIGLVCAFHLSGFRLFSKAGEAMAFRNRSRYPTDAFAEKLSAIMGIQLPTLSPEGLDLIFQSPPRSRDGIAPVWSENEVRNRLYTNWTGRGPANKPDEHLLEIAGEIAKQVFPKFGGWDDLASDPDKALAAADKYFQSQGDFPSIASLPAAIMLSPANSTVDFEGDYIAIDPAAETLLHQAVSRCAARLGRERPDLDQNKGPFVSSLQDALVSSQNNGLSWLFGVGFQHWKEKSPKELIDEYKVPADQHGAVTQVKSFVDAIPLNPLFDTTHYGEFRASVAGKVRSWVANYWKRLLDLKSLLATTEFTLPESISDPKAVSLFSGLLVDPQGLKKVADSLPARLVSAEEAIDRLMGVGIPTAADIAQVERVADEIGAFIGQVQQFNNQVKQKLENLQDADDEEFLKGLKIELPSGDKEPPAINRISGGAPDAAAEISELEEKLQRLLDARSEHFQTISEWAEENAVTLDPIAAMVELERLRLAERGATGDPEEYALRLLLQRIGRLANRVSPVSAGSIRELLKPVFMEEREFNLFFHNRLGSLYRSPYSTSRHQPFSIDVGKAKAIDWIAGLDQISSDIEKALSGAGEALGDQLRDWINLAGFAISQRLRGLPDTVPNALAQVRCPDDVRIPPLLAMLLEEDDIARDVCLKAFNLYVSAINGCLFGALREGFIVRTRFQRIGTDQIHYVPKDKAWEYPDRLNTAKGPINAAVSSDWIEKDGAVIKPVETVRNLSSTGFAGAGVSEYLVQAPHDWYTPLDLRDVAHLVTGLPVEKNITKLKRLTNRTAFRMVGASSFKTHLDSVLLSDKIKLGDFTIIIDQHYRQSVTYGGKVKISYEPERLQVEAAVPVVDTRDRTVPEPDTLFDHIVAIDLGERSVGFAVFDIKSCLRTGEVKPIHDNNGNPVVGTVAVPSIRRLMKAVRSHRRRRQPNQKVNQTYSTALQNYRENVIGDVCNRIDTLMERYNAFPVLEFQIKNFQAGAKQLEIVYGS（配列番号３９７）
４つのCas9配列の例示的なアラインメントを、以下に提供する。アラインメント中のCas9配列は、以下のとおりである：配列１（Ｓ１）：配列番号１｜WP_010922251｜gi 499224711｜ＩＩ型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］；配列２（Ｓ２）：配列番号２７｜WP_039695303｜gi 746743737｜ＩＩ型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus gallolyticus］；配列３（Ｓ３）：配列番号２８｜WP_045635197｜gi 782887988｜ＩＩ型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mitis］；配列４（Ｓ４）：配列番号２９｜5AXW_A｜gi 924443546｜Staphylococcus aureus Cas9。ＨＮＨドメイン（太字および下線）およびRuvCドメイン（囲み枠内）を、４つの配列の各々について同定する。Ｓ１中のアミノ酸残基１０および８４０ならびにアラインメントされた配列中の相同なアミノ酸を、それぞれのアミノ酸残基の後のアスタリスクにより同定する。
アラインメントは、これらに限定されないが、当該分野において公知のアラインメントプログラムおよびアルゴリズムを用いて、参照配列または参照残基と整列するアミノ酸配列または残基を同定することにより、異なる種からのCas9配列を含むCas9の配列バリアントにわたり、参照Cas9アミノ酸配列またはアミノ酸残基と相同なアミノ酸配列およびアミノ酸残基を同定することができることを示す。本開示は、配列番号１および２７〜２９（例えば、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４）中のアスタリスクにより同定されるアミノ酸残基のうちの１つ以上が、本明細書において記載されるように変異しているCas9バリアントを提供する。配列番号１および２７〜２９中のアスタリスクにより同定される残基に対応する、配列番号１のCas9における残基Ｄ１０およびＨ８４０は、本明細書において「相同」または「対応する」残基として言及される。かかる相同な残基は、例えば上記のとおり、配列アラインメントにより、参照配列または残基と整列する配列または残基を同定することにより、同定することができる。同様に、Cas9配列中の、本明細書において配列番号１中で同定される変異に対応する変異、例えば、残基１０の変異、および配列番号１中の８４０は、本明細書において「相同な」または「対応する」変異として言及される。例えば、４つのアラインメントした配列についての、配列番号１中のＤ１０Ａ変異（Ｓ１）に対応する変異は、Ｓ２についてはＤ１１Ａ、Ｓ３についてはＤ１０Ａ、およびＳ４についてはＤ１３Ａである；配列番号１（Ｓ１）中のＨ８４０Ａについての対応する変異は、Ｓ２についてはＨ８５０Ａ、Ｓ３についてはＨ８４２Ａ、およびＳ４についてはＨ５６０Ａである。
異なる種からの合計２５０個のCas9配列（配列番号１および２７〜２７５）を提供する。配列番号１中の残基１０および８４０に対応するアミノ酸残基は、上で概説されるものと同じ様式において同定することができる。これらのCas9配列の全てを、本開示に従って用いることができる。
好適なシトシンデアミナーゼドメインの非限定的な例を提供する。
ヒトAID
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL（配列番号２７６）
マウスAID
MDSLLMKQKKFLYHFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSATSCSLDFGHLRNKSGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVAEFLRWNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIGIMTFKDYFYCWNTFVENRERTFKAWEGLHENSVRLTRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRMLGF（配列番号２７７）
イヌAID
MDSLLMKQRKFLYHFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGHLRNKSGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGYPNLSLRIFAARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENREKTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL（配列番号２７８）
ウシAID
MDSLLKKQRQFLYQFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSPTSFSLDFGHLRNKAGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGYPNLSLRIFTARLYFCDKERKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL（配列番号２７９）
マウスAPOBEC-3
MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLGYAKGRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFLYWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQIVRFLATHHNLSLDIFSSRLYNVQDPETQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKRLLTNFRYQDSKLQEILRPCYIPVPSSSSSTLSNICLTKGLPETRFCVEGRRMDPLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHRMKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVTITCYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFWPWKGLEIISRRTQRRLRRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMS（配列番号２８０）
ラットAPOBEC-3
MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLRYAIDRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFLYWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQVLRFLATHHNLSLDIFSSRLYNIRDPENQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKKLLTNFRYQDSKLQEILRPCYIPVPSSSSSTLSNICLTKGLPETRFCVERRRVHLLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHGVKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVIITCYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFWPWKGLEIISRRTQRRLHRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMS（配列番号２８１）
アカゲザルAPOBEC-3G
MVEPMDPRTFVSNFNNRPILSGLNTVWLCCEVKTKDPSGPPLDAKIFQGKVYSKAKYHPEMRFLRWFHKWRQLHHDQEYKVTWYVSWSPCTRCANSVATFLAKDPKVTLTIFVARLYYFWKPDYQQALRILCQKRGGPHATMKIMNYNEFQDCWNKFVDGRGKPFKPRNNLPKHYTLLQATLGELLRHLMDPGTFTSNFNNKPWVSGQHETYLCYKVERLHNDTWVPLNQHRGFLRNQAPNIHGFPKGRHAELCFLDLIPFWKLDGQQYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISNNEHVSLCIFAARIYDDQGRYQEGLRALHRDGAKIAMMNYSEFEYCWDTFVDRQGRPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAI（配列番号２８２）（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在シグナル）
チンパンジーAPOBEC-3G
MKPHFRNPVERMYQDTFSDNFYNRPILSHRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQVYSKLKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDVATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKIMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPPTFTSNFNNELWVRGRHETYLCYEVERLHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLHQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISNNKHVSLCIFAARIYDDQGRCQEGLRTLAKAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQNQGN（配列番号２８３）
ミドリザルAPOBEC-3G
MNPQIRNMVEQMEPDIFVYYFNNRPILSGRNTVWLCYEVKTKDPSGPPLDANIFQGKLYPEAKDHPEMKFLHWFRKWRQLHRDQEYEVTWYVSWSPCTRCANSVATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWKPDYQQALRILCQERGGPHATMKIMNYNEFQHCWNEFVDGQGKPFKPRKNLPKHYTLLHATLGELLRHVMDPGTFTSNFNNKPWVSGQRETYLCYKVERSHNDTWVLLNQHRGFLRNQAPDRHGFPKGRHAELCFLDLIPFWKLDDQQYRVTCFTSWSPCFSCAQKMAKFISNNKHVSLCIFAARIYDDQGRCQEGLRTLHRDGAKIAVMNYSEFEYCWDTFVDRQGRPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAI（配列番号２８４）
ヒトAPOBEC-3G
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQVYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKIMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN（配列番号２８５）
ヒトAPOBEC-3F
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPRLDAKIFRGQVYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYSEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLRKAYGRNESWLCFTMEVVKHHSPVSWKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFWDTDYQEGLRSLSQEGASVEIMGYKDFKYCWENFVYNDDEPFKPWKGLKYNFLFLDSKLQEILE（配列番号２８６）
ヒトAPOBEC-3B
MNPQIRNPMERMYRDTFYDNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIKRGRSNLLWDTGVFRGQVYFKPQYHAEMCFLSWFCGNQLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLSEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVTIMDYEEFAYCWENFVYNEGQQFMPWYKFDENYAFLHRTLKEILRYLMDPDTFTFNFNNDPLVLRRRQTYLCYEVERLDNGTWVLMDQHMGFLCNEAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFEYCWDTFVYRQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQNQGN（配列番号２８７）
ヒトAPOBEC-3C：
MNPQIRNPMKAMYPGTFYFQFKNLWEANDRNETWLCFTVEGIKRRSVVSWKTGVFRNQVDSETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTKYQVTWYTSWSPCPDCAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFQYPCYQEGLRSLSQEGVAVEIMDYEDFKYCWENFVYNDNEPFKPWKGLKTNFRLLKRRLRESLQ（配列番号２８８）
ヒトAPOBEC-3A：
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN（配列番号２８９）
ヒトAPOBEC-3H：
MALLTAETFRLQFNNKRRLRRPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGYFENKKKCHAEICFINEIKSMGLDETQCYQVTCYLTWSPCSSCAWELVDFIKAHDHLNLGIFASRLYYHWCKPQQKGLRLLCGSQVPVEVMGFPKFADCWENFVDHEKPLSFNPYKMLEELDKNSRAIKRRLERIKIPGVRAQGRYMDILCDAEV（配列番号２９０）
ヒトAPOBEC-3D
MNPQIRNPMERMYRDTFYDNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIKRGRSNLLWDTGVFRGPVLPKRQSNHRQEVYFRFENHAEMCFLSWFCGNRLPANRRFQITWFVSWNPCLPCVVKVTKFLAEHPNVTLTISAARLYYYRDRDWRWVLLRLHKAGARVKIMDYEDFAYCWENFVCNEGQPFMPWYKFDDNYASLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLLKACGRNESWLCFTMEVTKHHSAVFRKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLCYFWDTDYQEGLCSLSQEGASVKIMGYKDFVSCWKNFVYSDDEPFKPWKGLQTNFRLLKRRLREILQ（配列番号２９１）
ヒトAPOBEC-1
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR（配列番号２９２）
マウスAPOBEC-1
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK（配列番号２９３）
ラットAPOBEC-1
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK（配列番号２９４）
ヤツメウナギCDA1（pmCDA1）
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAV（配列番号２９５）
ヒトAPOBEC3G D316R_D317R
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQVYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKIMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN（配列番号２９６）
ヒトAPOBEC3G鎖A
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQ（配列番号２９７）
ヒトAPOBEC3G鎖A D120R_D121R
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQ（配列番号２９８）
非限定的な例示的なウラシルグリコシラーゼ阻害剤配列を提供する。
桿菌ファージPBS2（バクテリオファージPBS2）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML（配列番号２９９）
Erwinia tasmaniensis SSB（熱安定性単鎖ＤＮＡ結合タンパク質）
MASRGVNKVILVGNLGQDPEVRYMPNGGAVANITLATSESWRDKQTGETKEKTEWHRVVLFGKLAEVAGEYLRKGSQVYIEGALQTRKWTDQAGVEKYTTEVVVNVGGTMQMLGGRSQGGGASAGGQNGGSNNGWGQPQQPQGGNQFSGGAQQQARPQQQPQQNNAPANNEPPIDFDDDIP（配列番号３００）
UdgX（ＤＮＡ中のウラシルに結合するが、これを切除しない）
MAGAQDFVPHTADLAELAAAAGECRGCGLYRDATQAVFGAGGRSARIMMIGEQPGDKEDLAGLPFVGPAGRLLDRALEAADIDRDALYVTNAVKHFKFTRAAGGKRRIHKTPSRTEVVACRPWLIAEMTSVEPDVVVLLGATAAKALLGNDFRVTQHRGEVLHVDDVPGDPALVATVHPSSLLRGPKEERESAFAGLVDDLRVAADVRP（配列番号３０１）
UDG（触媒として不活性なヒトUDG、ＤＮＡ中のウラシルに結合するが、これを切除しない）
MIGQKTLYSFFSPSPARKRHAPSPEPAVQGTGVAGVPEESGDAAAIPAKKAPAGQEEPGTPPSSPLSAEQLDRIQRNKAAALLRLAARNVPVGFGESWKKHLSGEFGKPYFIKLMGFVAEERKHYTVYPPPHQVFTWTQMCDIKDVKVVILGQEPYHGPNQAHGLCFSVQRPVPPPPSLENIYKELSTDIEDFVHPGHGDLSGWAKQGVLLLNAVLTVRAHQANSHKERGWEQFTDAVVSWLNQNSNGLVFLLWGSYAQKKGSAIDRKRHHVLQTAHPSPLSVYRGFFGCRHFSKTNELLQKSGKKPIDWKEL（配列番号３０２）
ＣからＴへの核酸塩基エディターの非限定的な例を提供する。
Escherichia coliでの発現のためのHis6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9（配列番号３０３）
MGSSHHHHHHMSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKllKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLllKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEllEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENllHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
哺乳動物での発現のためのrAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS（配列番号３０４）
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCllLGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKllKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLllKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEllEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENllHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
哺乳動物での発現のためのhAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS（配列番号３０５）
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWRSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI-NLS（配列番号３０６）
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCllLGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKllKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLllKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEllEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENllHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDllEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV
rAPOBEC1-XTEN-Cas9ニッカーゼ-UGI-NLS（BE3、配列番号３０７）
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCllLGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKllKDKDFLDNEENEDILEDIVLTlTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLllKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEllEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENllHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDllEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV
pmCDA1-XTEN-dCas9-UGI（細菌）（配列番号３０８）
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAVSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSMTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-NLS（哺乳動物コンストラクト）（配列番号３０９）
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAVSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV
huAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI（細菌）（配列番号３１０）
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSMTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-NLS（哺乳動物コンストラクト）（配列番号３１１）
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV
huAPOBEC3G（D316R_D317R）-XTEN-nCas9-UGI-NLS（哺乳動物コンストラクト）（配列番号３１２）
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV
高フィデリティー核酸塩基エディター（配列番号３１３）
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
rAPOBEC1-XTEN-SaCas9n-UGI-NLS）
rAPOBEC1-XTEN-SaCas9n-UGI-NLS
核酸塩基エディター4-SSB
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSASRGVNKVILVGNLGQDPEVRYMPNGGAVANITLATSESWRDKATGEMKEQTEWHRVVLFGKLAEVASEYLRKGSQVYIEGQLRTRKWTDQSGQDRYTTEVVVNVGGTMQMLGGRQGGGAPAGGNIGGGQPQGGWGQPQQPQGGNQFSGGAQSRPQQSAPAAPSNEPPMDFDDDIPFSGGSPKKKRKV（配列番号４０１）
核酸塩基エディター4-(GGS)3
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV（配列番号４０２）
核酸塩基エディター4-XTEN
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGSETPGTSESATPESTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV（配列番号４０３）
核酸塩基エディター4-32aaリンカー
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV（配列番号４０４）
核酸塩基エディター4-2X UGI
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV（配列番号４０５）
核酸塩基エディター４
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV（配列番号４０６）
ＤＮＡを基質として受け入れる進化型アデノシンデアミナーゼの非限定的な例を提供する。
Caulobacter crescentus（C. crescentus）TadA：
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADDPKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI（配列番号４５６）
Geobacter sulfurreducens（G. sulfurreducens）TadA：
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALFIDERKVPPEP（配列番号４５７）
ＡからＧへの核酸塩基エディターの非限定的な例を提供する。
ecTadA（wt）-XTEN-nCas9-NLS（配列番号３２３）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
ecTadA（D108N）-XTEN-nCas9-NLS：（哺乳動物コンストラクト、ＤＮＡに対して活性、ＡからＧへ編集する、配列番号３２４）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
ecTadA（D108G）-XTEN-nCas9-NLS：（哺乳動物コンストラクト、ＤＮＡに対して活性、ＡからＧへ編集する、配列番号３２５）
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ecTadA（D108V）-XTEN-nCas9-NLS：（哺乳動物コンストラクト、ＤＮＡに対して活性、ＡからＧへ編集する、配列番号３２６）
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ecTadA（D108N）-XTEN-nCas9-UGI-NLS（ＡからＧへのエディターのＢＥ３アナログ、配列番号３２７）
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ecTadA（D108G）-XTEN-nCas9-UGI-NLS（ＡからＧへのエディターのＢＥ３アナログ、配列番号３２８）：
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ecTadA（D108V）-XTEN-nCas9-UGI-NLS（ＡからＧへのエディターのＢＥ３アナログ、配列番号３２９）：
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ecTadA（D108N）-XTEN-dCas9-UGI-NLS（哺乳動物細胞、ＡからＧへのエディターのＢＥ２アナログ、配列番号３３０）：
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ecTadA（D108G）-XTEN-dCas9-UGI-NLS（哺乳動物細胞、ＡからＧへのエディターのＢＥ２アナログ、配列番号３３１）：
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ecTadA（D108V）-XTEN-dCas9-UGI-NLS（哺乳動物細胞、ＡからＧへのエディターのＢＥ２アナログ、配列番号３３２）：
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ecTadA（D108N）-XTEN-nCas9-AAG（E125Q）-NLS -cat.アルキルアデノシングリコシラーゼ（配列番号３３３）
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ecTadA（D108G）-XTEN-nCas9-AAG（E125Q）-NLS -cat.アルキルアデノシングリコシラーゼ（配列番号３３４）
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ecTadA（D108V）-XTEN-nCas9-AAG（E125Q）-NLS -cat.アルキルアデノシングリコシラーゼ（配列番号３３５）
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ecTadA（D108N）-XTEN-nCas9-EndoV（D35A）-NLS：cat.エンドヌクレアーゼＶを含む（配列番号３３６）
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ecTadA（D108G）-XTEN-nCas9-EndoV（D35A）-NLS：cat.エンドヌクレアーゼＶを含む（配列番号３３７）
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ecTadA（D108V）-XTEN-nCas9-EndoV（D35A）-NLS：cat.エンドヌクレアーゼＶを含む（配列番号３３８）
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（細菌における）進化の第１ラウンドから生じたバリアントecTadA（H8Y_D108N_N127S）-XTEN-dCas9（配列番号３３９）
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（細菌における）進化の第２ラウンドからの濃縮されたバリアントecTadA（H8Y_D108N_N127S_E155X）-XTEN-dCas9；Ｘ＝Ｄ、ＧまたはＶ（配列番号３４０）
MSEVEFSYEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARNAKTGAAGSLMDVLHHPGMSHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQXIKAQKKAQSSTDSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
pNMG-160：ecTadA（D108N）-XTEN-nCas9-GGS-AAG*（E125Q）-GGS-NLS（配列番号３４１）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSKGHLTRLGLEFFDQPAVPLARAFLGQVLVRRLPNGTELRGRIVETQAYLGPEDEAAHSRGGRQTPRNRGMFMKPGTLYVYIIYGMYFCMNISSQGDGACVLLRALEPLEGLETMRQLRSTLRKGTASRVLKDRELCSGPSKLCQALAINKSFDQRDLAQDEAVWLERGPLEPSEPAVVAAARVGVGHAGEWARKPLRFYVRGSPWVSVVDRVAEQDTQAGGSPKKKRKV
pNMG-161：ecTadA（D108N）-XTEN-nCas9-GGS-EndoV*（D35A）-GGS-NLS（配列番号３４２）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSDLASLRAQQIELASSVIREDRLDKDPPDLIAGAAVGFEQGGEVTRAAMVLLKYPSLELVEYKVARIATTMPYIPGFLSFREYPALLAAWEMLSQKPDLVFVDGHGISHPRRLGVASHFGLLVDVPTIGVAKKRLCGKFEPLSSEPGALAPLMDKGEQLAWVWRSKARCNPLFIATGHRVSVDSALAWVQRCMKGYRLPEPTRWADAVASERPAFVRYTANQPGGSPKKKRKV
pNMG-371：ecTadA（L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）-SGGS-SGGS-XTEN-SGGS-SGGS- ecTadA（L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）-SGGS-SGGS-XTEN-SGGS-SGGS-nCas9-SGGS-NLS（配列番号４５８）
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLSYFFRMRRQVFKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLSYFFRMRRQVFKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-616アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F _K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４５９）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRALDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-624アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-３２ａ.ａ.リンカー-ecTadA（W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-２４ａ.ａ.リンカー_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４６０）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-476アミノ酸配列（進化＃３ヘテロ二量体、wt TadA＋TadA evo ＃３変異）：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４６１）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLSYFFRMRRQVFKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-477アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４６２）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRPIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMRRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-558アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-32a.a.リンカー-ecTadA（H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-24a.a.リンカー_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４６３）
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pNMG-576アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４６４）
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pNMG-577アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４６５）
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pNMG-586アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４６６）
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pNMG-588アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４６７）
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pNMG-620アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４６８）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-617アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４６９）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRALDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECNALLCYFFRMRRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-618アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４７０）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRALDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECNALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-620アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_GGS_NLS（配列番号４７１）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-621アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-32a.a.リンカー-ecTadA（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-24a.a.リンカー_nCas9_GGS_NLS（配列番号４７２）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV
pNMG-622 アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-32a.a.リンカー-ecTadA（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-24a.a.リンカー_nCas9_GGS_NLS（配列番号４７３）
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pNMG-623 アミノ酸配列：ecTadA（野生型）-32a.a.リンカー-ecTadA（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-24a.a.リンカー_nCas9_GGS_NLS（配列番号４７４）
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ABE6.3 ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４７５）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRSIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMRRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV*
ABE7.8 ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４７６）
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRALDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECNALLCYFFRMRRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSPKKKRKV*
ABE7.9 ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４７７）
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ABE7.10 ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS
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ABE6.4：ecTadA（野生型）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2-ecTadA（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）-（SGGS）2-XTEN-（SGGS）2_nCas9_SGGS_NLS（配列番号４８０）
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例２：スプリット型核酸塩基エディターのＡＡＶ送達
本研究は、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）により核酸塩基エディターを２つのセクションにおいて送達することができ、これらが、タンパク質のスプライシングを介して細胞において連結されて完全かつ活性な核酸塩基エディターを形成し得ることを示すために設計した。ｒＡＡＶコンストラクトの様々な要素を、最適化された核酸塩基エディターの発現および活性について試験した。
組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、導入遺伝子送達のために広く用いられる。導入遺伝子は、逆位末端配列（ＩＴＲ）の間でＡＡＶゲノム中に挿入され、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）に形質導入するために用いられるＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングされる。しかし、ｒＡＡＶ中にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズについての限度（典型的には約４．９キロ塩基の）が存在する。核酸塩基エディターをコードする核酸（例えば、シトシンデアミナーゼ-dCas9-UGI）は、典型的には、ｒＡＡＶのパッケージングの限度を超える。本明細書において記載されるとおり、核酸塩基エディターをコードする核酸をスプリットして（図１Ａを参照）、各々のセクションを、別々のｒＡＡＶ粒子中にパッケージングした。核酸塩基エディターの２つのセクションを、細胞に送達し、ライゲーションして、タンパク質のスプライシングを介して完全な核酸塩基エディターを形成させることができる（例えば、DnaEインテインなどのインテインにより媒介される；図１Ｃを参照）。ライゲーションされた完全な核酸塩基エディターは、標的塩基を編集することにおいて活性であった（図１Ｂを参照）。スプリット型核酸塩基エディターをコードするｒＡＡＶコンストラクトを、異なる細胞株、例えばU118およびHEK293Tにおいて試験し、これらは、標的塩基を編集することにおいて活性である（図３Ａ〜３Ｂおよび図５Ａ〜５Ｂを参照）。
様々な転写ターミネーターおよび核移行シグナル（ＮＬＳ）を、核酸塩基エディターの発現および活性を最適化するために、ｒＡＡＶコンストラクトにおいて試験した（図４、６および７を参照）。
例３：マウスニューロンにおけるスプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶを用いるDNMT1遺伝子の編集
本研究は、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶの塩基編集活性をin vivoで試験するために設計した。図１Ａにおいて示されるようなスプリット型核酸塩基エディターを用いた。dCas9ドメインとデアミナーゼドメインとの間のリンカーのアミノ酸配列は、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３８４）である。DNMT1遺伝子中のよく特徴づけられた部位を標的とするガイドＲＮＡを選択した。細胞が編集を耐容することができるであろうことが予測された。これらの実験は、スプリット型塩基エディターをコードするＡＡＶが、霊長類ニューロンを含むいくつかの細胞型においてin vivoで遺伝子座を編集することができるか否かを決定することを目的とした。
一実験において、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶ、およびDNMT1を標的とするガイドＲＮＡは、皮質ニューロンを単離および培養した２日後に、分離したマウス皮質ニューロンに形質導入するために用いた。形質導入の１６日後にニューロンを収集し、DNMT1遺伝子をシークエンシングして（図８Ａ）、編集効率ならびにオフ・ターゲット効果を決定した。１７．３４％の編集効率（ＣからＴへの編集、図８Ｂにおけるより暗い灰色）を検出し、一方で、望ましくない編集のわずか０．８２％（ＣからＧへ、またはＣからＡへの変更、図８Ｂにおけるより明るい灰色）を検出した。
別の実験において、培養されたマウスNeuro-2細胞を、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶベクターおよびDNMT1を標的とするガイドＲＮＡで形質導入するか、または核酸塩基エディターをコードする脂質により封入されたＤＮＡおよびガイドＲＮＡで形質導入し、それにより、核酸塩基エディターの異なる送達方法を用いる編集効率の直接比較を可能にした（図９Ａ）。スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶについて、５．９６％の編集効率（ＣからＴへの編集、図９Ｂにおける暗灰色）を観察し、一方、核酸塩基エディターをコードする脂質によりトランスフェクトされたＤＮＡについては、２７．３％の編集効率（ＣからＴへの編集、図９Ｂにおける暗灰色）を観察した。望ましくない生成物の量は、スプリット型核酸塩基エディターをコードするＡＡＶについては０．１５％であり、核酸塩基エディターをコードする脂質によりトランスフェクトされたＤＮＡについては１．３％であった（ＣからＧへ、またはＣからＡへの変更、図９Ｂにおけるより明るい灰色）。
均等物および範囲
請求の範囲において、冠詞、「a」、「an」、および「the」は、文脈と矛盾するか、または文脈から他に明らかでない限り、１つ、または１つより多くを意味し得る。群のうちの１つ以上のメンバーの間に「or」を含む請求項または記載は、文脈と矛盾するか、または文脈から他に明らかでない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、そこにおいて使用されるか、または他に関連する場合に、満たされるとみなされる。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、そこにおいて使用されるか、または他に関連する態様を含む。本発明は、群のうちの１つより多くまたは全てが、において存在するか、そこにおいて使用されるか、または他に関連する態様を含む。
さらに、本発明は、列記された請求項のうちの１つ以上からの、１つ以上の限定、要素、節、および記載用語が、別の請求項中に導入される、全てのバリエーション、組み合わせ、および並び替えを包含する。例えば、別の請求項に依存する任意の請求項は、同じ基礎請求項に依存する任意の他の請求項においてみいだされる１つ以上の限定を含むように改変されていてもよい。例えばマーカッシュ形式において、リスト中に要素が存在する場合、要素の各々のサブグループもまた開示され、群から任意の要素を取り除くことができる。一般に、本発明または本発明の側面が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合、本発明のある態様または本発明の側面は、かかる要素および／または特徴からなるか、またはこれらから本質的になることが理解されるべきである。単純性を目的として、これらの態様は、本明細書において文言としては特には記載されていない。
また、用語「含むこと（comprising）」および「含むこと（containing）」は、オープンであることを意図され、さらなる要素またはステップの包含を許容することにも留意する。範囲が示される場合、エンドポイントは含められる。さらに、別段に示されない限り、または文脈および当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として提示された値は、文脈が明らかに別であることを示されない限り、本発明の異なる態様において記述された範囲のうちの任意の特定の値または部分範囲を、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで、仮定することができる。
本願は、多様な発行された特許、公開された特許出願、学術文献の記事、および他の刊行物を参照し、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。援用された参考文献のうちのいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合、明細書が支配すべきである。さらに、本発明の任意の特定の態様であって先行技術に該当するものは、請求項のうちのいずれか１つ以上から、明示的に除外され得る。かかる態様は、当業者に公知であるものとみなされるので、それらは、除外が本明細書において明示的に記載されていない場合であっても、除外され得る。本発明の任意の特定の態様は、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、任意の請求項から、任意の理由のために除外することができる。
当業者は、本明細書において記載される特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、または慣用的な実験のみを用いてこれらを確認することができるであろう。本明細書において記載される態様の範囲は、上の説明に限定されることを意図するのではなく、添付される請求の範囲において記載されるとおりである。当業者は、以下の請求の範囲において定義されるような本発明の精神または範囲から逸脱することなく、この記載に対して多様な変更および改変を行ってもよいことを理解するであろう

Claims (64)

  1. （ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；ならびに
    （ｉｉ）Cas9タンパク質のＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列、
    を含む、組成物であって、
    ここで、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している、
    前記組成物。
  2. Cas9タンパク質のＮ末端部分が、配列番号１のアミノ酸１〜５７３または１〜６３７に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. Cas9タンパク質のＣ末端部分が、配列番号１のアミノ酸５７４〜１３６８または６３８〜１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. インテイン−Ｎが、配列番号３５０〜３５１および３５４〜３５５のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. インテイン−Ｃが、配列番号３５２〜３５３および３５６〜３５７のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、プロモーターに作動的に連結されたガイドＲＮＡ（gRNA）をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、転写ターミネーターをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 転写ターミネーターが、bGH遺伝子、hGH遺伝子、またはSV40遺伝子からの転写ターミネーターである、請求項７に記載の組成物。
  9. 転写ターミネーターが、bGH遺伝子からの転写ターミネーターである、請求項８に記載の組成物。
  10. 第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、転写ターミネーターの５’に挿入されたウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 二分核定位シグナルが、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３４４）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号３４５）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号３４６）、およびＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ（配列番号３４７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 二分核定位シグナルが、配列番号３４４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. Cas9タンパク質が、触媒として不活性なCas9（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）であり、ここで、（ｉ）の第１のヌクレオチド配列が、Cas9タンパク質のＮ末端部分のＮ末端に融合した核酸塩基修飾酵素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. Cas9タンパク質が、触媒として不活性なCas9（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）であり、ここで、（ｉｉ）の第２のヌクレオチド配列が、Cas9タンパク質のＣ末端部分のＣ末端に融合した核酸塩基修飾酵素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 核酸塩基修飾酵素がデアミナーゼである、請求項１３または１４に記載の組成物。
  16. デアミナーゼがシトシンデアミナーゼである、請求項１５に記載の組成物。
  17. デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項１５に記載の組成物。
  18. （ｉｉ）の第２のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列の３’末端においてウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. （ｉ）の第１のヌクレオチド配列が、第１のヌクレオチド配列の５’末端においてウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
  20. ＵＧＩが、配列番号２９９〜３０２のアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載の組成物。
  21. 第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが、異なるベクター上にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 異なるベクターの各々が、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）のゲノムである、請求項２１に記載の組成物。
  23. 各々のベクターが、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされている、請求項２２に記載の組成物。
  24. （ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、第１の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子；ならびに
    （ｉｉ）Cas9タンパク質のＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、第２の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、
    を含む、組成物であって、
    ここで、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している、
    前記組成物。
  25. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。
  26. Cas9タンパク質のＮ末端部分とCas9タンパク質のＣ末端部分とが、一緒に連結されて、Cas9タンパク質を形成する、請求項２５に記載の細胞。
  27. 原核細胞である、請求項２５または２６に記載の細胞。
  28. 細菌細胞である、請求項２７に記載の細胞。
  29. 真核細胞である、請求項２５または２６に記載の細胞。
  30. 酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の細胞。
  31. ヒト細胞である、請求項２９に記載の細胞。
  32. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
  33. （ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合した核酸塩基エディターのＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；ならびに
    （ｉｉ）核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列
    を含む、組成物。
  34. インテイン−Ｎが、配列番号３５０〜３５１および３５４〜３５５のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. インテイン−Ｃが、配列番号３５２〜３５３および３５６〜３５７のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項３３または３４に記載の組成物。
  36. 第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、プロモーターに作動的に連結されたガイドＲＮＡ（gRNA）をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、転写ターミネーターをさらに含む、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 転写ターミネーターが、bGH遺伝子、hGH遺伝子、またはSV40遺伝子からの転写ターミネーターである、請求項３７に記載の組成物。
  39. 転写の終末が、bGH遺伝子からのものである、請求項３８に記載の組成物。
  40. 第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、転写ターミネーターの５’に挿入されたウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 二分核定位シグナルが、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３４４）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号３４５）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号３４６）、およびＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ（配列番号３４７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 二分核定位シグナルが、配列番号３４４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の組成物。
  44. 核酸塩基エディターが、触媒として不活性なCas9またはCas9ニッカーゼのＮ末端に融合したシトシンデアミナーゼを含む、請求項３３〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. シトシンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC3、AIDおよびpmCDA1からなる群より選択される、請求項４４に記載の組成物。
  46. 核酸塩基エディターが、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む、請求項４４または４５に記載の組成物。
  47. ＵＧＩが、配列番号２９９〜３０２のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の組成物。
  48. 第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが、異なるベクター上にある、請求項３３〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 異なるベクターの各々が、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）のゲノムである、請求項４８に記載の組成物。
  50. ベクターが、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされている、請求項４９に記載の組成物。
  51. （ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合した核酸塩基エディターのＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、第１の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子；ならびに
    （ｉｉ）核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２の核酸を含む、第２の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、
    を含む、組成物。
  52. 請求項３３〜５１のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。
  53. 核酸塩基エディターのＮ末端部分と核酸塩基エディターのＣ末端部分とが、一緒に連結されて、核酸塩基エディターを形成する、請求項５２に記載の細胞。
  54. 原核細胞である、請求項５２または５３に記載の細胞。
  55. 細菌細胞である、請求項５４に記載の細胞。
  56. 真核細胞である、請求項５２または５３に記載の細胞。
  57. 酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、請求項５６に記載の細胞。
  58. ヒト細胞である、請求項５６に記載の細胞。
  59. 請求項３３〜５１のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
  60. 細胞を、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法であって、ここで、接触させることが、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらし、およびここで、Cas9タンパク質のＮ末端部分とCas9タンパク質のＣ末端部分とが、連結されて、Cas9タンパク質を形成する、前記方法。
  61. 細胞を、請求項３３〜５１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法であって、ここで、接触させることが、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらし、およびここで、核酸塩基エディターのＮ末端部分と核酸塩基エディターのＣ末端部分とが、連結されて、核酸塩基エディターを形成する、前記方法。
  62. それを必要とする対象に、請求項１〜２４および３３〜５１のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  63. 対象が、疾患または障害を有する、請求項６２に記載の方法。
  64. 疾患または障害が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮溶解性角化症（ＥＨＫ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、４Ｊ型シャルコー・マリー・トゥース病、神経芽細胞腫（ＮＢ）、フォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）、先天性筋強直症、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、およびデスミン関連心筋症（ＤＲＭ）からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
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