JP2016538342A - トランスポゾンを使用する組成物および方法 - Google Patents

トランスポゾンを使用する組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、トランスポゾンを使用する組成物および方法を提供する。一つの局面において、挿入変異誘発スクリーニングにおいてネガティブ選択される遺伝子を同定するために有用な方法を開示する。もう一つの局面において、発癌性RASを発現する腫瘍細胞の増殖を低下させるための組成物は、WNT経路の活性化剤を含む。WNT経路の活性化剤の有効量を対象の腫瘍細胞へ投与することによって、その必要のある対象において腫瘍細胞の増殖を低下させるための薬学的組成物も、開示する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.§119(e)の下で、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる2013年11月18日に出願された米国仮特許出願第61/905,819号に基づく優先権を享受する。
発明の背景
配列決定テクノロジーの最近の進歩は、個々の腫瘍における特異的な変異の同定を可能にし、特異的な腫瘍のための標的型治療薬を開発する可能性を与えた。ゲノム機能解析は、ヒトの生物学的過程および疾患過程の基礎をなすドライバーを解明するための強力なアプローチであることが判明している。CRISPR-Cas9ライブラリーおよびshRNAライブラリーは、タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトするかまたはノックダウンするための効果的なスクリーニングツールを提供する。腫瘍細胞における特異的な発癌性の改変および経路を標的とすることは、HER2増幅乳癌および急性前骨髄球性白血病を含むいくつかの癌の処置のために高度に有効であることが見出された。しかしながら、RASの活性化およびTP53の喪失を含む多くの一般的な変異について、発癌性の改変または経路を直接標的とするアプローチは困難であることが判明している。さらに、多くの疾患および生物学的表現型が、遺伝子過剰発現または遺伝子活性の異常な上昇によって引き起こされる。従って、発癌性変異を有する腫瘍細胞における合成致死相互作用についてヒトゲノムを尋問するためにフォワードジェネティックスクリーニングを利用することは高度に望ましい。shRNAライブラリーを使用した癌細胞における機能喪失スクリーニングは、合成致死標的を同定するために成功裡に適用されているが、ネガティブ選択される遺伝子についてのゲノムワイドの機能獲得スクリーニングは存在しない。
従って、特に、癌へ至る一般的な発癌性改変の場合、ネガティブ選択される遺伝子を同定するための改善された方法が、当技術分野において必要とされている。
下記のように、本発明は、挿入変異誘発スクリーニングにおいて遺伝子をネガティブ選択することによって、癌細胞に特異的な治療標的および経路を同定するための方法および組成物を含む。
本発明の一つの局面は、関心対象の細胞においてpiggyBacトランスポゾンの転位を誘導する工程；piggyBacトランスポゾンの発現を誘導するため、転位型細胞の一部分を選択圧に曝す工程；選択圧に曝された転位型細胞および選択圧に曝されていない転位型細胞のゲノムDNAにおける挿入部位を比較する工程；ならびに選択圧に曝された転位型細胞と選択圧に曝されていない転位型細胞とでディファレンシャルに存在する1個以上の挿入部位を有する遺伝子を同定する工程：を含む、挿入変異誘発スクリーニングにおいてネガティブ選択される遺伝子を同定する方法を含む。
本発明のもう一つの局面は、WNT経路の活性化剤を含む、発癌性Rasを発現している腫瘍細胞の増殖を低下させるための組成物を含む。
本発明のさらにもう一つの局面は、本明細書に記載される組成物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を含む。
本発明のさらにもう一つの局面は、WNT経路の活性化剤を含む組成物を、有効量、対象の腫瘍細胞へ投与し、それにより、腫瘍細胞の増殖を低下させる工程を含む、その必要のある対象において腫瘍細胞の増殖を低下させる方法を含む。
本発明のもう一つの局面は、WNT経路の活性化剤を投与する工程を含む、対象における発癌性RASを発現する癌および／またはそれに関連した症状を低下させるかまたは改善する方法を含む。
本発明のさらにもう一つの局面は、WNT経路の活性化剤を含む、発癌性RAS腫瘍の処置において使用するための組成物を含む。
上記局面または本明細書に示される本発明の他の局面の様々な態様において、piggyBacトランスポゾンは、誘導性抗生物質耐性遺伝子を含む。一つの態様において、関心対象の細胞は、腫瘍細胞であり、例えば、腫瘍細胞は、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍細胞のうちの少なくとも1種である。もう一つの態様において、転位を誘導する工程は、関心対象の転位型細胞の増幅をさらに含む。さらにもう一つの態様において、挿入部位を比較する工程は、挿入部位の配列決定を含む。さらにもう一つの態様において、挿入部位は、遺伝子のイントロン、エキソン、およびプロモーター領域のうちの少なくとも1個に位置している。さらにもう一つの態様において、遺伝子は、選択圧に曝された転位型細胞に枯渇しており、かつ選択圧に曝されていない転位型細胞に存在する。もう一つの態様において、遺伝子は、関心対象の細胞の成長または生存を損なう。
一つの態様において、活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤である。もう一つの態様において、活性化剤は、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）からなる群より選択される。もう一つの態様において、活性化剤は、WNT経路の低分子アゴニストである。
もう一つの態様において、発癌性RASは、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される。
さらにもう一つの態様において、本発明の組成物は、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍のうちの少なくとも1種への送達のためにさらに製剤化されている。
従って、いくつかの態様において、WNT経路の一または複数のメンバーのアゴニストである第1の薬剤を含む、癌の細胞における発癌性Rasの発現を特徴とする癌の処置において使用するための組成物。いくつかの態様において、組成物は、発癌性Rasのアンタゴニストである第2の薬剤を含む。
いくつかの態様において、癌の細胞における発癌性Rasの発現を特徴とする癌を処置する方法は、WNT経路の一または複数のメンバーのアゴニストである第1の薬剤を有効量含む組成物を、癌を有する対象へ投与し、それにより、対象における癌を処置する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、発癌性Rasのアンタゴニストである第2の薬剤を有効量投与する工程を含む。いくつかの態様において、第1の薬剤および／または第2の薬剤の有効量は、癌細胞の増殖を阻害するために有効な量である。
いくつかの態様において、第1の薬剤は、LRP6、αカテニン、δカテニン、TCF7L1、CSNK1G1、CCNY、PCDH15、GNG7、INO80、SMARCC1、PRKCA、およびMED13からなる群より選択される一または複数のWNT経路遺伝子のタンパク質産物のアゴニストである。いくつかの態様において、第1の薬剤は、WNT経路の低分子アゴニストである。いくつかの態様において、第1の薬剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、類似体、および誘導体からなる群より選択される。
いくつかの態様において、癌細胞は、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される発癌性RASを発現している。
成長および／または生存を損なう変異を同定するためのPBトランスポゾン機能獲得スクリーニングのスキームを示す図である。 Doxによる短時間の誘導の後に細胞選別によって収集されたKatushka陽性変異細胞の画像を示す。次いで、変異細胞を、スクリーニングのためのDox+プールおよび対照としてのDox-プールへ等分した。挿入部位をマッピングし、リードを計数した後、全ての挿入部位についてDox-プールとDox+プールとの間のlog2リード比を計算した。 候補RAS拮抗遺伝子を同定するための分析を示す。ネガティブ選択される遺伝子の同定のための生物統計学分析を例示するため、TCF7L1を使用した。第1の二項検定を使用して全部で150種の遺伝子が選択され、第2の二項検定を使用して95種の候補遺伝子が同定された。 スクリーニングによって同定されたWNT経路内の候補遺伝子を示す図である。 Aは、3日間、Doxによって誘導した場合（赤）または誘導しなかった場合（青）の、LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンを条件的に過剰発現するAML-RAS安定細胞株におけるAlamarblueアッセイを使用した生細胞定量化を示す棒グラフである。Bは、3日間、Doxによって誘導した場合（赤）または誘導しなかった場合（青）の、LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンを条件的に過剰発現するTRI-102安定細胞株におけるAlamarblueアッセイを使用した生細胞定量化を示す棒グラフである。 媒体（上）または20mM LiCl（下）によって24時間処置した後の示された細胞のDIC（20倍）画像を示す。 GSK3阻害剤、20mM LiCl、5uMケンパウロン、または2uM BIOによる処置から3日後の生細胞の百分率を示す棒グラフである。***p＜0.001。 Aは、媒体（上）または20mM LiCl（下）によって処置されたAML-RAS細胞における軟寒天アッセイの代表的な画像である。Bは、コロニー数の定量化を示す棒グラフである。 媒体（菱形）またはLiCl（四角）による28日間の異種移植片における腫瘍サイズ変化の百分率を示す折れ線グラフである。 媒体（菱形）またはLiCl（四角）による28日間の平均体重を示す折れ線グラフである。 28日目に除去された腫瘍の代表的な画像である。 RAS腫瘍細胞のパネルに対するGSK3阻害剤の活性を示す棒グラフである。LiCl（左バー）、ケンパウロン（中央バー）、またはBIO（右バー）によって処置された示された黒色腫細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、および膵臓癌細胞における5日後の媒体対照と比較した生細胞の百分率。非形質転換対照：ヒト乳房上皮細胞。 Aは、Doxによって誘導した場合（右バー）または誘導しなかった場合（左バー）の、LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンを条件的に過剰発現するH1792（上）安定細胞株における生細胞定量化を示す棒グラフである。***p＜0.001、*p＜0.05。Bは、Doxによって誘導した場合（右バー）または誘導しなかった場合（左バー）の、LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンを条件的に過剰発現するA549安定細胞株における生細胞定量化を示す棒グラフである。***p＜0.001、*p＜0.05。 Aは、媒体（上）または20mM LiClによって処置されたA549（左）またはH1792（右）細胞における軟寒天アッセイの代表的な画像である。Bは、コロニー数の定量化を示す棒グラフである。 Aは、TRI-102細胞およびAML-RAS細胞の成長曲線を示す折れ線グラフである。4日間、毎日、TRI-102（より水平の線）またはAML-RAS（より垂直の線）についての生細胞をCelltiter-Gloによって測定した。Bは、TRI-102細胞およびAML-RAS細胞（右）における軟寒天アッセイにおける足場成長についてのコロニー数の定量化を示す棒グラフである。 PB挿入マッピングのためのキャプチャーベース（capture based）PCR法の図である。ゲノムDNAをAluIによって消化した。PBアーム（PBR、灰色バー）によって連結されたゲノムDNA断片（挿入部位、黒線）を増幅し、SPE反応を通してビオチン化プライマー（ドット）によって標識した。ビオチン標識された挿入断片を、ストレプトアビジン磁気ビーズによって濃縮した。ポリGテーリング（G）の後、挿入断片をアダプター配列（灰色バー）によって連結し、Illuminaハイスループット配列決定に供した。 PBトランスポゾン挿入部位のゲノム分布を示す棒グラフである。PB認識部位TTAAを有する全部で4,362,271種の配列を、UCSC hg18データベースへマッピングし、270,257個の挿入部位を回収した。PB挿入の分布が示される。 成長および／または生存を損なう変異を同定するためのPBトランスポゾン機能獲得スクリーニングを示す図である。 Doxによる短時間の誘導の後、Katushka陽性変異細胞が細胞選別によって収集されたことを示す一連の図である。次いで、変異細胞を、遺伝子誘導のためのDox+プールおよび対照としてのDox-プールへ等分した。挿入部位をマッピングし、リードを計数した後、全ての挿入部位についてDox-プールとDox+プールとの間のlog2リード比を計算した。 候補RAS拮抗遺伝子を同定するための分析を示す図のパネルである。枯渇挿入（赤、2倍Dox-部位、M）および濃縮挿入（緑、2倍Dox+部位、P）の分類を例示するため、TCF7L1を使用した。PBスクリーニングから同定された古典的WNT経路内の候補遺伝子（影付き）。 Human BodyMap 2.0における340種のタンパク質コーディング標的および259種の長鎖ノンコーディング標的との間のピアソン相関係数分析のヒートマップを示す図である。 4種の濃縮されたRBP、EIF4A3、SRSF1、FUS、およびU2AF2がスプライソソームの成分であることを示す図である。代表的なノンコーディング標的遺伝子は、対応する楕円形にリストされたRBPの結合部位を含有している。p値は、超幾何分布検定によって計算されたものである。 PBトランスポゾン挿入部位のゲノム分布を示すグラフである。全部で422,746個の挿入部位がUCSC hg19データベースへマッピングされた。PB挿入の分布が示される。 候補遺伝子を同定するための生物統計学分析を示す図である。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 カイノームsiRNAスクリーニングからの候補遺伝子のリストである。 4種の濃縮されたRNA結合タンパク質（RBP）についてのノンコーディング候補遺伝子のリストである。 4種の濃縮されたRNA結合タンパク質（RBP）についてのノンコーディング候補遺伝子のリストである。
発明の詳細な説明
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有している。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験のために使用され得るが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。本発明の説明および特許請求の範囲の記載において、以下の用語法が使用されるであろう。
本明細書において使用される用語法は、具体的な態様を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではないことも理解されるべきである。
本明細書において使用されるように、冠詞「（a）」および「（an）」は、冠詞の文法上の目的語の一つまたは複数（即ち、少なくとも一つ）をさすために使用される。例えば、「要素（an element）」とは、一つの要素または複数の要素を意味する。
指定された値からの±20％、または10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.1％以内、0.05％以内、もしくは0.01％以内の変動は、開示された方法を実施するために適切であるため、「約」という用語は、本明細書において使用されるように、量、時間の長さ等のような測定可能な値をさす時、そのような変動を包含することを意味する。
「ディファレンシャルに存在する」という語句は、挿入部位が転位型細胞の試料に存在する量および／または頻度の、対照試料と比較した違いをさす。遺伝子挿入部位は、量、頻度、またはその両方に関してディファレンシャルに存在することができる。挿入部位頻度が、参照のような他の試料における挿入部位頻度と統計的に有意に異なっている場合、その遺伝子挿入部位は、その二つの試料の間でディファレンシャルに存在する。あるいはまたはさらに、転位型細胞において挿入部位を検出する頻度が、対照細胞より統計的に有意に高いかまたは低い場合、その1個以上の遺伝子挿入部位は、その二つの試料セットの間でディファレンシャルに存在する。一つの試料に存在し、かつもう一つの試料に検出不可能である遺伝子挿入部位は、ディファレンシャルに存在する。
「トランスポゾン」という用語は、ゲノム内のその位置を変化させ、時に、変異を作出するかまたは逆転させ、細胞のゲノムを改変することができるDNA配列をさす。「piggBacトランスポゾン」または「PB」という用語は、「カットアンドペースト」機序を介してベクターと染色体との間で転位する可動性の遺伝要素をさす。転位においては、PBトランスポサーゼが、トランスポゾンベクターの両端に位置するトランスポゾン特異的な末端逆位配列（ITR）を認識し、最初の部位から効率的にコンテンツを移動させ、TTAA染色体部位へ組み込む。結果として生じる形質転換された細胞または細胞群は、安定的な形質転換体である。
「ベクター」とは、関心対象の核酸を含む組成物である。いくつかの態様において、ベクターは、piggyBacトランスポゾンを含み、piggyBacトランスポゾンを細胞の内部へ送達するために使用され得る。いくつかの態様において、ベクターとは、標的の生物または細胞のゲノムへ外来配列を移動させることができるpiggyBac末端を含有しているプラスミドをさす。「発現ベクター」とは、関心対象の核酸を発現させるために操作されたベクターをさす。いくつかの態様において、発現ベクターは、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBacトランスポサーゼと、発現されるべきpiggyBacトランスポゾンまたはpiggyBacトランスポサーゼと機能的に連結された発現調節配列とを含む。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性要素を含み；発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されてもよい。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、裸であるか、またはリポソームに含有されているもの）、ならびにウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、当技術分野において公知の全てのものが含まれる。いくつかの態様において、発現ベクターは、本明細書に開示されたタンパク質または経路（例えば、WNT経路）のアゴニストを発現するよう操作され得る。例えば、発現ベクターは、以下の遺伝子のうちの一または複数を発現するよう操作され得る：LRP6、αカテニン、δカテニン、TCF7L1、CSNK1G1、CCNY、PCDH15、GNG7、INO80、SMARCC1、PRKCA、およびMED13。「異種起源のDNA」とは、挿入の位置に対して非天然のDNAを意味する。外来性DNAには、遺伝学的に修飾された遺伝子が含まれるが、これに限定されない。例えば、piggyBacトランスポゾンは、宿主DNAを切断し、外来性DNAを挿入部位へ挿入する。そのような外来性DNAには、例えば、宿主細胞における発現のための、キメラ遺伝子のような操作された遺伝子が含まれる。
「WNT経路アゴニスト」という用語は、WNT経路を活性化する薬剤をさす。いくつかの態様において、WNT経路アゴニストは、低分子、ペプチド、またはそれらの断片である。WNT経路アゴニストは、LRP6、αカテニン、δカテニン、TCF7L1、CSNK1G1、CCNY、PCDH15、GNG7、INO80、SMARCC1、PRKCA、およびMED13のようなWNT経路の一または複数の遺伝子を活性化することができる。いくつかの態様において、WNT経路アゴニストには、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）、またはそれらの薬学的に許容される塩、類似体、および誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
「選択圧」とは、集団を選択剤へ曝すことによる、集団内の一または複数の遺伝子の相対頻度に対する選択の効果を意味する。例えば、変異型細胞または転位型細胞の、抗生物質のような選択剤への曝露は、トランスポゾンの発現を誘導する。選択圧に対する減少した細胞適応度を有する変異型細胞または転位型細胞は、次第に枯渇し、選択圧に対する増加した細胞適応度を有する細胞は、次第に濃縮される。
「選択剤」とは、選択遺伝子を発現している細胞を濃縮するため、転位型細胞に対して選択圧を及ぼす薬剤を意味する。例は、ピューロマイシン、テトラサイクリン、ブラストサイジン、およびネオマイシンのような抗生物質である。
「選択遺伝子」とは、耐性、非感受性、または選択圧の存在下で成長する能力を提供する遺伝子を意味する。選択遺伝子の例には、ピューロマイシン、テトラサイクリン、ブラストサイジン、およびネオマイシンに対する耐性遺伝子のような抗生物質に対する耐性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
「発癌性Ras」とは、Rasを恒久的に活性化する1個以上の変異を意味する。過活性Rasは癌における最も一般的な癌遺伝子である。いくつかの態様において、発癌性Rasの発現を特徴とする状態、障害、または疾患とは、発癌性Rasタンパク質を発現する細胞（例えば、癌細胞）の存在を特徴とする状態、障害、または疾患をさす。いくつかの態様において、発癌性Rasを特徴とする状態、障害、または疾患には、ある種の型の癌（例えば、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍）が含まれる。本明細書において使用されるように、Rasという用語は、ヒトのHRAS遺伝子、KRAS遺伝子、またはNRAS遺伝子のいずれかの遺伝子またはタンパク質産物を含むが、これらに限定されない、Rasスーパーファミリーの任意のメンバーをさす。いくつかの態様において、発癌性Rasの遺伝子またはタンパク質は、Rasタンパク質のG12Vおよび／またはQ61Kアミノ酸変化をもたらすもののような活性化変異を特徴とする。
本開示において、「を含む（comprises）」、「を含む（comprising）」、「を含有している」、および「有する」等は、米国特許法において割り当てられている意味を有することができ、「を含む（includes）」、「を含む（including）」等を意味することができ；「から本質的になる（consisting essentially of）」または「から本質的になる（consists essentially）」も、同様に、米国特許法において割り当てられている意味を有し、その用語は、無制限であり、基本的なまたは新規の特徴が、記述されたもの以外の存在によって変化しない限り、記述されたもの以外の存在を可能にするが、先行技術の態様は除外する。
「有効量」とは、未処置の患者と比べて、疾患の少なくとも一つの症状を低下させるかまたは改善するのに必要とされる量を意味する。疾患の治療的処置のために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、および全身健康状態に依って変動する。
「発現」という用語は、本明細書において使用されるように、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
「断片」とは、ポリヌクレオチドまたは核酸の分子の一部分を意味する。この一部分は、好ましくは、参照核酸の全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含有している。断片は、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、または100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、または2500個（および中間の任意の整数値）のヌクレオチドを含有していてよい。断片とは、核酸分子に適用されるように、より大きい核酸の部分配列をさす。核酸分子の「断片」は、少なくとも約15ヌクレオチド；例えば、少なくとも約50ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド；少なくとも約100〜約500ヌクレオチド、少なくとも約500〜約1000ヌクレオチド、少なくとも約1000ヌクレオチド〜約1500ヌクレオチド；または約1500ヌクレオチド〜約2500ヌクレオチド；または約2500ヌクレオチド（ならびに中間の任意の整数値）の長さを有することができる。
「挿入部位」という用語は、DNA内の転位の位置をさす。DNAトランスポゾンの挿入部位は、トランスポサーゼによる切断にとって重要な、一連の逆方向反復が続く、短いダイレクトリピートによって同定され得る。piggyBacトランスポゾンの認識配列はTTAAである。
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然状態において見出されるような通常共存している成分が様々な程度に除去されている材料をさす。「単離する」とは、最初の起源または周囲からのある程度の分離を意味する。「精製する」とは、単離より高度の分離を意味する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に物質的に影響するかまたはその他の有害な結果を引き起こすことがないよう、他の材料が十分に除去されている。即ち、組換えDNA技術によって作製された時には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地が実質的に除去されており、または化学合成された時には化学前駆物質もしくはその他の化学物質が実質的に除去されている場合、その核酸またはペプチドは精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを与えることを意味することができる。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受けている可能性のあるタンパク質について、異なる修飾は異なる単離されたタンパク質を生じることができ、それらは別々に精製され得る。
「薬学的に許容される」とは、薬理学的／毒物学的視点から、患者に対して許容され、かつ組成物、製剤、安定性、患者の受け入れ、および生物学的利用能に関する物理学的／化学的視点から、製造する製薬化学者に対して許容される特性および／または物質をさす。「薬学的に許容される担体」とは、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、それが投与される宿主に対して毒性でない媒体をさす。
本明細書において使用されるように、「薬学的組成物」または「薬学的に許容される組成物」という用語は、本発明において有用な少なくとも1種の化合物または分子の、薬学的に許容される担体との混合物をさす。薬学的組成物は、化合物または分子の患者への投与を容易にする。静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、点眼、肺投与、および局所投与を含むが、これらに限定されない、化合物または分子を投与する複数の技術が、当技術分野において存在する。
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、意図された機能を果たすことができるような、本発明において有用な化合物または分子の、患者におけるまたは患者への運搬または輸送に関与する、液体または固体の増量剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、または封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物、または担体を意味する。典型的には、そのような構築物は、一つの器官または身体の一部分からもう一つの器官または身体の一部分へ運搬されるかまたは輸送される。各担体は、本発明において有用な化合物を含む製剤の他の成分と適合性であって、患者にとって有害でないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる：乳糖、ブドウ糖、およびショ糖のような糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースのようなその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤用ロウのような賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油のような油；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；界面活性剤；アルギン酸；発熱物質不含水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬学的製剤において利用されるその他の無毒の適合性の物質。本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、本発明において有用な化合物の活性と適合性であって、患者に対して生理学的に許容される、全てのコーティング、抗菌剤、抗真菌剤、および吸収遅延剤等も含まれる。補足的な活性化合物が組成物へ組み入れられてもよい。「薬学的に許容される担体」には、本発明において有用な化合物または分子の薬学的に許容される塩がさらに含まれ得る。例えば、本発明の実施において使用される薬学的組成物に含まれ得る他の付加的な成分は、当技術分野において公知であり、参照によって本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences（Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA）に記載されている。
「参照」とは、標準または対照を意味する。「参照」とは、比較のための基礎として使用される明確な標準または対照である。
本明細書において使用されるように、「試料」または「生物学的試料」とは、スクリーニング法または処置が望まれる関心対象の細胞（例えば、癌またはその腫瘍細胞）を含有している可能性のあるものをさす。試料は、生物学的液体または生物学的組織のような生物学的試料であり得る。一つの態様において、生物学的試料は、肺動脈内皮細胞を含む組織試料である。そのような試料は、多様な細胞、タンパク質、および遺伝材料を含んでいる可能性がある。生物学的組織の例には、器官、腫瘍、リンパ節、動脈、および個々の細胞が含まれる。生物学的液体の例には、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水等が含まれる。
「対象」または「患者」とは、本明細書において使用されるように、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物には、例えば、ヒツジ類、ウシ類、ブタ類、イヌ類、ネコ類、およびマウス類の哺乳動物のような家畜およびペットが含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
本明細書において使用されるように、「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」、「処置（treatment）」等の用語は、障害および／またはそれに関連する症状の低下または改善をさす。除外はされないが、障害または状態の処置は、障害、状態、またはそれらに関連する症状が完全に寛解するかまたは排除されることを必要としないことが認識されるであろう。
いくつかの態様において、「処置」、「処置すること」、または「処置する」とは、疾患、状態、または障害と戦うことを目的とした患者の管理およびケアに関し、疾患、状態、もしくは障害の症状もしくは合併症を軽減するか、または疾患、状態、もしくは障害を排除するための、本発明の化合物または組成物（例えば、WNT経路アゴニスト）の投与を含む。
本明細書において使用されるように、「防止（prevention）」、「防止すること（preventing）」、または「防止する（prevent）」とは、疾患、状態、または障害の症状または合併症の発病の低下または排除を表し、疾患、状態、または障害の症状の発病、発症、または再発を低下させるための、本発明の化合物または組成物（例えば、WNT経路アゴニスト）の投与を含む。
本明細書において使用されるように、「軽減する」という用語は、障害の兆候または症状の重症度が減少する過程を表すものである。重要なこととして、兆候または症状は、排除されずに、軽減されてもよい。いくつかの態様において、本発明の化合物または組成物（例えば、WNT経路アゴニスト）の投与は、兆候または症状の排除に至るが、排除は必要とされない。有効な投薬量は、兆候または症状の重症度を減少させると予想される。
本明細書において使用されるように、「症状」という用語は、疾患、病気、損傷、または身体において何かが正当でないことの指標として定義される。症状は、症状を経験している個体には感知されるかまたは認知されるが、他の者には容易に認知されない場合がある。他の者とは非医療専門家として定義される。
本明細書において使用されるように、「兆候」という用語も、身体において何かが正当でないことの指標として定義される。しかし、兆候は、医師、看護師、またはその他の医療専門家によって認められるものとして定義される。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、腫瘍のサイズの低下をもたらすことができる。腫瘍のサイズの低下は「腫瘍退縮」とも呼ばれる。いくつかの態様において、処置の後、腫瘍サイズは、処置前のサイズに比べて5％以上低下し；より好ましくは、腫瘍サイズは10％以上低下し；より好ましくは、20％以上低下し；より好ましくは、30％以上低下し；より好ましくは、40％以上低下し；さらに好ましくは、50％以上低下し；最も好ましくは、75％以上低下する。腫瘍のサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍のサイズは、腫瘍の直径として測定され得る。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、腫瘍体積の低下をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、腫瘍体積は、処置前のサイズに比べて5％以上低下し；より好ましくは、腫瘍体積は10％以上低下し；より好ましくは、20％以上低下し；より好ましくは、30％以上低下し；より好ましくは、40％以上低下し；さらに好ましくは、50％以上低下し；最も好ましくは、75％以上低下する。腫瘍体積は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、腫瘍の数の減少をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、腫瘍数は、処置前の数に比べて5％以上低下し；より好ましくは、腫瘍数は10％以上低下し；より好ましくは、20％以上低下し；より好ましくは、30％以上低下し；より好ましくは、40％以上低下し；さらに好ましくは、50％以上低下し；最も好ましくは、75％より多く低下する。腫瘍の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍の数は、肉眼でまたは特定の倍率で可視の腫瘍を計数することによって測定され得る。いくつかの態様において、特定の倍率は、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、または50倍である。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、原発腫瘍部位から遠位の他の組織または器官における転移巣の数の減少をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、転移巣の数は、処置前の数に比べて5％以上低下し；より好ましくは、転移巣の数は10％以上低下し；より好ましくは、20％以上低下し；より好ましくは、30％以上低下し；より好ましくは、40％以上低下し；さらに好ましくは、50％以上低下し；最も好ましくは、75％より多く低下する。転移巣の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。転移巣の数は、肉眼でまたは特定の倍率で可視の転移巣を計数することによって測定され得る。いくつかの態様において、特定の倍率は、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、または50倍である。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、単独の担体を受容した集団と比較して、処置された対象の集団の平均生存時間の増加をもたらすことができる。いくつかの態様において、平均生存時間は、30日より多く；より好ましくは、60日より多く；より好ましくは、90日より多く；最も好ましくは、120日より多く増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、活性化合物による処置の開始後、集団について平均生存時間長を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、活性化合物による初回処置の完了後、集団について平均生存時間長を計算することによっても測定され得る。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、未処置の対象の集団と比較して、処置された対象の集団の平均生存時間の増加をもたらすことができる。いくつかの態様において、平均生存時間は、30日より多く；より好ましくは、60日より多く；より好ましくは、90日より多く；最も好ましくは、120日より多く増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、活性化合物による処置の開始後、集団について平均生存時間長を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、活性化合物による初回処置の完了後、集団について平均生存時間長を計算することによっても測定され得る。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、腫瘍成長速度の減少をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、腫瘍成長速度は、処置前の数に比べて少なくとも5％低下し；より好ましくは、腫瘍成長速度は、少なくとも10％低下し；より好ましくは、少なくとも20％低下し；より好ましくは、少なくとも30％低下し；より好ましくは、少なくとも40％低下し；より好ましくは、少なくとも50％低下し；さらに好ましくは、少なくとも50％低下し；最も好ましくは、少なくとも75％低下する。腫瘍成長速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍成長速度は、単位時間当たりの腫瘍直径の変化によって測定され得る。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、腫瘍再成長の減少をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、腫瘍再成長は、5％未満であり；より好ましくは、腫瘍再成長は、10％未満であり；より好ましくは、20％未満であり；より好ましくは、30％未満であり；より好ましくは、40％未満であり；より好ましくは、50％未満であり；さらに好ましくは、50％未満であり；最も好ましくは、75％未満である。腫瘍再成長は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍再成長は、例えば、以前の処置後の腫瘍退縮の後の腫瘍の直径の増加を測定することによって測定され得る。腫瘍再成長の減少は、処置を中止した後に腫瘍が再発しないことによって示される。
本発明の細胞増殖性障害の処置または防止は、細胞増殖の速度の低下をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、細胞増殖の速度は、少なくとも5％；より好ましくは、少なくとも10％；より好ましくは、少なくとも20％；より好ましくは、少なくとも30％；より好ましくは、少なくとも40％；より好ましくは、少なくとも50％；さらに好ましくは、少なくとも50％；最も好ましくは、少なくとも75％低下する。細胞増殖の速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖の速度は、例えば、単位時間当たりの組織試料中の分裂細胞の数を測定することによって測定され得る。
本発明の細胞増殖性障害の処置または防止は、増殖細胞の割合の低下をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、増殖細胞の割合は、少なくとも5％；より好ましくは、少なくとも10％；より好ましくは、少なくとも20％；より好ましくは、少なくとも30％；より好ましくは、少なくとも40％；より好ましくは、少なくとも50％；さらに好ましくは、少なくとも50％；最も好ましくは、少なくとも75％低下する。増殖細胞の割合は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。いくつかの態様において、増殖細胞の割合は、例えば、組織試料中の非分裂細胞の数と比べた分裂細胞の数を定量化することによって測定され得る。増殖細胞の割合は、分裂指数と等価であり得る。
本発明の障害、疾患、または状態の処置は、疾患細胞集団、例えば、癌細胞集団において細胞傷害効果（例えば、アポトーシスの増加、壊死の増加）をもたらすことができる。いくつかの態様において、細胞傷害処置は、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはそれ以上の疾患細胞集団サイズの低下に至る。細胞集団のサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞集団のサイズは、集団またはその試料の中の生細胞の数として測定され得る。
本発明の細胞増殖性障害の処置または防止は、細胞増殖の区域またはゾーンのサイズの減少をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、細胞増殖の区域またはゾーンのサイズは、処置前のそのサイズと比べて、少なくとも5％；より好ましくは、少なくとも10％；より好ましくは、少なくとも20％；より好ましくは、少なくとも30％；より好ましくは、少なくとも40％；より好ましくは、少なくとも50％；さらに好ましくは、少なくとも50％；最も好ましくは、少なくとも75％低下する。細胞増殖の区域またはゾーンのサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖の区域またはゾーンのサイズは、細胞増殖の区域またはゾーンの直径または幅として測定され得る。
本発明の細胞増殖性障害の処置または防止は、異常な外観または形態を有する細胞の数または割合の減少をもたらすことができる。いくつかの態様において、処置の後、異常な形態を有する細胞の数は、処置前のそのサイズと比べて、少なくとも5％低下し；より好ましくは、少なくとも10％低下し；より好ましくは、少なくとも20％低下し；より好ましくは、少なくとも30％低下し；より好ましくは、少なくとも40％低下し；より好ましくは、少なくとも50％低下し；さらに好ましくは、少なくとも50％低下し；最も好ましくは、少なくとも75％低下する。異常な細胞の外観または形態は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。異常な細胞形態は、例えば、倒立組織培養顕微鏡を使用して、顕微鏡法によって測定され得る。異常な細胞形態は、核多形性の形態をとっていてもよい。
本明細書において使用されるように、「選択的に」という用語は、ある集団に、もう一つの集団より高い頻度で存在する傾向があることを意味する。比較される集団は、細胞集団、例えば、疾患細胞集団（例えば、腫瘍細胞集団または増殖性障害を有する細胞の集団）および正常細胞集団であり得る。本明細書において使用されるように、「正常細胞」とは、「細胞増殖性障害」の一部として分類され得ない細胞である。正常細胞は、望まれない状態または疾患の発症に至ることができる、制御されない成長もしくは異常な成長、またはその両方を欠いている。いくつかの態様において、正常細胞は、正常に機能する細胞周期チェックポイント調節機序を保有している。いくつかの態様において、イベントは、集団Bと比較して、2倍より高い頻度で集団Aに存在する場合、集団Bと比べて集団Aに選択的に存在する。イベントは、集団Aに5倍より高い頻度で存在する場合、選択的に存在する。イベントは、集団Bと比較して、集団Aに、10倍より高く；いくつかの態様において、50倍より高く；さらに好ましくは、100倍より高く；いくつかの態様において、1000倍より高い頻度で存在する場合、選択的に存在する。例えば、細胞死は、正常細胞と比べて2倍より高い頻度で、疾患細胞または過剰増殖性細胞に存在する場合、疾患細胞または過剰増殖性細胞に選択的に存在すると言える。
本明細書において提供される範囲は、範囲内の値の全部のための速記であることが理解される。例えば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。
本明細書における変数または局面についての態様の記述は、単一の態様としての態様、または他の態様もしくはその一部分と組み合わせられた態様を含む。
本明細書において提供される組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物および方法のうちの一つ以上と組み合わせられてもよい。
挿入部位同定
生物学的過程に正の影響を与える遺伝子についての遺伝子スクリーニングは一般的に使用されている。しかしながら、成長または腫瘍原性のような過程に負の影響を与える遺伝子についてのスクリーニングは、そのような遺伝子の発現を保有している細胞の欠失および淘汰のため、同定するのがより困難である。
本発明は、ネガティブ選択される遺伝子の同定のためのスクリーニング法の発見を記載する。本スクリーニング法は、「カットアンドペースト」機序を介してトランスポゾンベクターと染色体との間でDNA配列を転位する可動性の遺伝要素、piggBacまたはPBトランスポゾンを利用する。piggyBacトランスポゾン機構（米国特許第6,218,815号参照）は、トランスポゾンベクターの両端および宿主細胞のゲノム内に位置するトランスポゾン特異的な末端逆位配列（ITR）または転位認識配列TTAAを認識し、トランスポゾンベクター内に見出される異種DNA配列を特異的に切断し、宿主細胞のゲノムへ挿入する。
いくつかの態様において、挿入変異誘発スクリーニングにおいてネガティブ選択される遺伝子を同定する方法は、関心対象の細胞においてpiggyBacトランスポゾンの転位を誘導する工程；piggyBacトランスポゾンの発現を誘導するため、転位型細胞の一部分を選択圧に曝す工程；選択圧に曝された転位型細胞および選択圧に曝されていない転位型細胞のゲノムDNAにおける挿入部位を比較する工程；ならびに選択圧に曝された転位型細胞と選択圧に曝されていない転位型細胞とでディファレンシャルに存在する1個以上の挿入部位を有する遺伝子を同定する工程を含む。
いくつかの態様において、piggyBacトランスポゾンは、誘導性遺伝子構築物を含む。一つの態様において、トランスポゾン内の誘導性遺伝子構築物の発現の誘導は、トランスポゾンの挿入の部位における内在性遺伝子の過剰発現をもたらす。いくつかの態様において、トランスポゾンの発現の誘導は、トランスポゾン上の誘導可能遺伝子の誘導、および（例えば、トランスポゾン上の誘導された遺伝子からの転写リードスルーによる）宿主細胞のゲノム内のトランスポゾンの挿入の部位に隣接している内在性遺伝子の過剰発現を含む。もう一つの態様において、トランスポゾン内の遺伝子の過剰発現は、piggyBacトランスポゾンを保有している細胞のネガティブ選択をもたらす。トランスポゾン内の遺伝子は、細胞毒性であって、ネガティブ選択をもたらしてもよい。しかしながら、いくつかの態様において、トランスポゾン内の遺伝子の過剰発現自体は、ネガティブ選択をもたらさない。そのような態様において、遺伝子は、例えば、IRESの調節の下で、検出可能マーカー（例えば、蛍光マーカーまたは生物発光マーカー）を含んでいてよい。
もう一つの態様において、piggyBacトランスポゾンは、誘導性抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子を含む。いくつかの態様において、トランスポゾンは、誘導性遺伝子を含む。誘導性遺伝子には、抗生物質（例えば、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンの誘導体、例えば、ドキシサイクリン）への曝露によって誘導可能であるもののような誘導性プロモーターが含まれ得る。しかしながら、その他の誘導性プロモーターが使用されてもよいことが認識されるべきである。選択圧は、誘導性プロモーターの誘導をもたらす条件（例えば、薬剤、例えば、抗生物質への曝露）であり得る。これは、一または複数の内在性遺伝子の過剰発現をもたらし、過剰発現は、トランスポゾンを含有している細胞において細胞分裂阻害性または細胞毒性であるため、それらのうちのいくつかは淘汰され得る。いくつかの態様において、piggyBacトランスポゾンは、抗生物質の添加によって誘導可能であるが、抗生物質耐性を必要としない誘導性プロモーターを含む。いくつかの態様において、選択遺伝子は、トランスポゾンを保有している細胞を選択するために使用されてもよいし、またはトランスポゾン内の誘導性遺伝子の発現を誘導し、それにより、（例えば、トランスポゾン内の誘導性プロモーターからの転写リードスルーによって）隣接した内在性遺伝子の発現を増加させるネガティブ選択剤として使用されてもよい。
例えば、piggyBacトランスポゾンは、アクチン-Katushka赤色蛍光融合タンパク質を産生するよう、ドキシサイクリン誘導性キメラ遺伝子を含むPB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]のようなベクターから発現される。選択遺伝子には、ピューロマイシン、テトラサイクリン、ブラストサイジン、およびネオマイシンのような様々な抗生物質に対する耐性が含まれるが、これらに限定されない。トランスポゾンは、キメラ遺伝子のような異種起源のDNAの発現をさらに誘導することができる。異種起源のDNAキメラ遺伝子には、遺伝学的に修飾された遺伝子が含まれ得る。例えば、piggyBacトランスポゾンは、宿主DNAを切断し、外来性DNAを挿入部位へ挿入する。そのような外来性DNAには、宿主細胞における発現のためのキメラ遺伝子のような操作された遺伝子が含まれ得る。
もう一つの態様において、関心対象の細胞は、トランスポゾン変異誘発型細胞を生成するため、piggyBacトランスポゾンおよびトランスポサーゼPBアーゼによってコトランスフェクトされる。関心対象の細胞には、癌細胞または腫瘍細胞のような、一または複数の遺伝子の破壊の後に特定の表現型が分析され得る細胞が含まれる。細胞は特定の表現型を保有していてもよく、その表現型を破壊する変異体についての遺伝子スクリーニングは、興味深いであろう。例えば、損なわれているか、または細胞成長可能性を欠き、非転移性であり、アポトーシス性であり、低下した細胞生存を保有し、かつ／または静止している変異型または転位型の癌細胞は、転位によって影響を受けた関心対象の遺伝子を保有している。
トランスポゾンおよびトランスポサーゼの遺伝子移入は、当技術分野において公知の方法を使用して達成され得る。例えば、インビトロトランスフェクションを含む非ウイルス性の手段が有用である。そのような方法には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、電気穿孔、および原形質融合の使用が含まれる。リポソームも、細胞へのDNAの送達のために有益である可能性がある。さらに、非ウイルスベースの送達は、ナノベースであるかまたはエアロゾル化されていてもよい。
一つの態様において、変異型または転位型の細胞は、変異型または転位型の細胞の集団を拡張するため、増幅される。細胞は、トランスポゾンの選択またはトランスポゾンによって挿入された異種起源のDNAの誘導なしに培養物中で成長させられる。異種起源のDNAが選択剤によって誘導可能である態様において、挿入された異種起源のDNAが成長に対して及ぼし得る効果は、その誘導がない場合、最小化される。従って、変異型または転位型の細胞の数を拡張することができる。
さらにもう一つの態様において、変異型または転位型の細胞の一部分が、選択圧に曝される。選択圧は、関心対象の細胞の集団を濃縮するために使用される。piggyBacトランスポゾンが宿主DNAへ誘導性選択遺伝子を挿入する態様において、転位型細胞の選択剤への曝露は、選択遺伝子を発現する細胞を濃縮する。例示的な態様において、変異型または転位型の細胞の一部分は、変異型または転位型の細胞を選択圧に曝すことによって、選択遺伝子の発現について濃縮され、細胞の一部分は、濃縮なしの細胞の混合集団を維持するため、選択圧に曝されない。変異型または転位型の細胞の一部分を選択圧に曝し、変異型または転位型の細胞の一部分は曝さないことによって、挿入された異種起源のDNAが成長に対して及ぼし得る影響は、選択圧下の細胞においては濃縮され、選択圧なしで増幅された細胞においては濃縮されない。
例えば、KRASG12V変異を有する急性骨髄性白血病細胞（AML-RAS細胞）を、キメラ遺伝子の誘導の後に損なわれた成長または生存について分析し、同一条件下で、ただしキメラ遺伝子の誘導なしで培養された対照細胞と比較する。ゲノムDNAを両方の細胞集団から単離し、それぞれのゲノムにおけるトランスポゾン挿入部位について比較する。挿入変異がAML-RAS細胞の成長または生存の変化を引き起こす場合には、この変化が、変異型または転位型の細胞と対照細胞との間のその特定の挿入部位の存在の違いに反映されるであろう。細胞適応度の全体的な減少に至る挿入部位は、連続細胞継代によって枯渇するであろう。同様に、細胞適応度の増加、より速い細胞成長速度等を有する細胞に至る挿入部位は、連続細胞継代によって濃縮されるであろう。従って、転位型細胞にディファレンシャルに存在する挿入部位または挿入部位を有する遺伝子の枯渇または濃縮は、発癌性表現型の打ち消しに関与する遺伝子として興味深い。いくつかの態様において、細胞の枯渇は、発癌性細胞、例えば、変異型RASを有する細胞に対して細胞毒性であり得る遺伝子を同定する。
挿入部位を保有している遺伝子の同定は、当技術分野において公知の方法を使用して達成され得る。そのような方法には、PCRキャプチャーおよび配列決定が含まれ得る。例えば、ゲノムDNAを、変異型または転位型の細胞の異なる集団から調製する。ゲノムDNAを消化し、挿入認識配列およびトランスポゾン配列に特異的なプライマーを用いたPCRによって増幅する。挿入認識配列およびトランスポゾン配列に隣接する宿主配列の配列分析は、トランスポゾンが挿入されたゲノム内の位置を同定する。変異型または転位型の細胞の2種の集団、選択圧に曝された転位型細胞と選択圧に曝されていない転位型細胞との間でディファレンシャルに存在する挿入部位を有する遺伝子のその後の同定は、全体的な成長適応度、発癌性、または腫瘍原性のような変異型または転位型の細胞の一つ以上の表現型の改変に関与する遺伝子の同定をもたらす。
発癌性または腫瘍原性についての細胞の適応度の改変に関与する遺伝子の同定を通して、癌のような広範囲の状態、疾患、または障害、特に、有効な処置を欠く状態のため、可能性のある治療標的および治療剤が迅速に同定される。
組成物
本発明は、さらに、一つの局面において、挿入部位同定から集められた情報を利用することによって、状態、疾患、または障害の少なくとも一つの症状を改善するかまたは低下させるための組成物を提供する。発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASのような発癌性RASを発現する関心対象の細胞をスクリーニングすることによって、関心対象の細胞の成長または生存に影響を与える遺伝子を、治療のための標的とすることができる。従って、WNT経路の活性化剤を含む、発癌性RASを発現する腫瘍細胞または癌細胞の増殖を低下させるための組成物が開示される。
具体的な態様において、発癌性RASを発現する腫瘍細胞の増殖を低下させるための、WNT経路の活性化剤を含む組成物が開示される。より具体的な態様において、活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）、ならびに／またはWNT経路の低分子アゴニストである。
いくつかの態様において、組成物は、WNT経路を活性化し、発癌性RASを発現する腫瘍細胞の増殖を低下させる薬剤を含んでいてよく、薬剤には、WNT経路の低分子活性化剤またはアゴニスト、コーディング遺伝子のようなWNT経路を活性化するタンパク質を発現することができる遺伝子、ノンコーディング遺伝子のようなWNT経路の活性化に影響を及ぼす遺伝子、RNAi分子のようなRNA分子、およびそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。その必要のある対象へ組成物を送達することによって、WNT経路は、WNT経路の低分子活性化剤もしくはアゴニスト、コーディング遺伝子の発現、またはノンコーディング遺伝子の発現を通して活性化される。従って、腫瘍または癌を有する対象を処置することができる。組成物に遺伝子が含まれる態様において、遺伝子はPiggybackトランスポゾンによるネガティブスクリーニングを通して同定される。
薬学的組成物
本発明は、本発明の方法を実施するための本発明の薬学的組成物の使用も包含する。そのような薬学的組成物は、対象への投与のために適当な形態で提供され得、一または複数の薬学的に許容される担体、一または複数の付加的な成分、またはこれらの何らかの組み合わせを含むことができる。本発明の少なくとも一つの組成物は、当技術分野において周知であるように、生理学的に許容される陽イオンまたは陰イオンと組み合わせて、本発明において企図される化合物のような生理学的に許容される塩を含むことができる。
本発明の方法において有用である薬学的組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺、鼻腔内、頬、眼、くも膜下腔内、静脈内、またはもう一つの投与ルートのために適当に開発され得る。その他の企図される製剤には、突起を有する（projected）ナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有している再封入された赤血球、および免疫ベースの製剤が含まれる。投与ルートは、当業者に容易に明白であり、処置されている疾患の型および重症度、処置されている動物またはヒト患者の型および年齢等を含む多数の要因に依るであろう。
本明細書に記載された薬学的組成物の製剤は、薬学分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製法は、活性成分を担体または一または複数のその他の副成分と混和する工程を含み、次いで、必要であるかまたは望ましい場合、生成物を所望の一用量単位または多用量単位へ成形またはパッケージングする工程を含む。
一つの態様において、本発明の組成物は、一または複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を使用して製剤化される。一つの態様において、本発明の薬学的組成物は、治療的に有効な量の少なくとも1種の本発明の化合物と薬学的に許容される担体とを含む。有用である薬学的に許容される担体には、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール、ならびにリン酸塩および有機酸の塩のようなその他の薬学的に許容される塩溶液が含まれるが、これらに限定されない。これらおよびその他の薬学的に許容される担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences（1991,Mack Publication Co.,New Jersey）に記載されている。
本発明の実施は、他に示されない限り、十分に当業者の理解の範囲内にある（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を利用する。そのような技術は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",fourth edition(Sambrook,2012)；"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984)；"Culture of Animal Cells"(Freshney,2010)；"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1997)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos,1987)；"Short Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,2002)；"Polymerase Chain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting",(Babar,2011)；"Current Protocols in Immunology"(Coligan,2002)のような文献に完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用可能であって、従って、本発明の作成および実施において考慮され得る。具体的な態様のための具体的に有用な技術は、以下のセクションにおいて考察されるであろう。
処置の方法
本発明は、対象において腫瘍細胞の増殖を低下させるか、または発癌性RASを発現する癌および／もしくは癌に関連した症状を低下させるかもしくは改善する方法も含む。本明細書に記載されるように、WNT経路の活性化は、発癌性RASを発現する癌細胞の増殖を損ないかつ／または生存を低下させる。従って、WNT経路の活性化剤を含む有効量の組成物の対象への投与は、癌細胞または腫瘍細胞の増殖を低下させるための手段を提供するであろう。
一つの局面において、その必要のある対象において腫瘍細胞の増殖を低下させる方法は、WNT経路の活性化剤を含む有効量の組成物を対象の腫瘍細胞へ投与し、それにより、腫瘍細胞の増殖を低下させる工程を含む。例示的な態様において、方法は、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASのような発癌性RASを発現する腫瘍細胞に対して有効である。腫瘍細胞または癌細胞には、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。もう一つの態様において、活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤、または2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）のようなWNT経路の低分子アゴニストである。もう一つの態様において、薬剤には、WNT経路の低分子活性化剤またはアゴニスト、コーディング遺伝子のようなWNT経路を活性化するタンパク質を発現することができる遺伝子、ノンコーディング遺伝子のようなWNT経路の活性化に影響を及ぼす遺伝子、RNAi分子のようなRNA分子、およびそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
もう一つの局面において、対象において発癌性RASを発現する癌および／またはそれに関連した症状を低下させるかまたは改善する方法は、WNT経路の活性化剤を投与する工程を含む。発癌性RAS腫瘍の処置のための医薬の製造のための組成物の使用も含まれる。処置は、対象における発癌性RASを発現する癌もしくは腫瘍および／または症状の低下または改善を含む。
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法を作成し使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定するためのものではない。
以下の実験例を参照することによって、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示のために提供されるに過ぎず、他に特記されない限り、限定するためのものではない。従って、本発明は、決して、以下の実施例に限定されると解釈されてはならず、本明細書に提供される教示の結果として明白になる全ての変動を包含することが解釈されるべきである。
さらなる説明なしに、当業者は、以上の説明および以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作成し、利用し、特許請求の範囲に記載された方法を実施することができると考えられる。従って、以下の実行例は、本発明の態様を具体的に指摘するが、決して限定的に解釈されてはならない。
本明細書に開示される実施例1に記載される実験において使用された材料および方法を以下に記載する。
スクリーニングの概要
Luc-PB[Mut]の修飾によって、PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]を生成した。TRI-102細胞をRothberg Instituteから入手した。pBabe-Puro-KRASG12Vから作製されたレトロウイルスによる感染によって、TRI-102からAML-RAS細胞を生成し、2μg/mLピューロマイシンによって選択した。機能獲得スクリーニングを実施するため、PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]を、トランスポサーゼプラスミドACT-PBアーゼとのコトランスフェクションによって、2×105個のAML-RAS細胞へ導入した。トランスポゾン転位の4日後、変異型細胞を、24時間、Doxによって一過性に誘導し、次いで、KAT陽性細胞を細胞選別によって収集した。選別された細胞を、3日間さらに拡張し、次いで、2個のプールに等分した。各プールは3×106個の細胞を有しており、スクリーニングプールを、5日間、2ug/ml Doxによって処置し、対照プールを媒体対照ddH2Oによって処置した。
5日間のスクリーニングの後、2個のプールからゲノムDNAを抽出した。PB挿入部位を、最初に、キャプチャーベースPCR法（図14）によって濃縮し、次いで、Illuminaハイスループットスクリーニングに供した。生Illumina配列決定データを、最初に、Galaxyプラットフォームへインポートした。挿入部位マッピング、リード定量化、および挿入部位分布分析を、全て、Galaxyソフトウェアを使用することによって処理した。遺伝子を2回の二項検定によって選択した。両方のフィルタについて、p値＜0.01に基づき候補標的を選択した。
発癌性RAS変異細胞に対する様々な薬物処置の効果を決定するため、細胞生存度をモニタリングするためにAlamarBlueアッセイ（Invitrogen）を実施した。インビボのWNT経路の活性化も、軟寒天アッセイおよびAML-RAS細胞異種移植片モデルにおいて実施した。
ベクターおよびクローニング
PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]をLuc-PB[Mut]の修飾によって生成した。tetOをpHUD10-3から入手し、CAGプロモーターの上流にクローニングした。Katushka赤色蛍光タンパク質をpTurboFP636-C（Evrogen）から増幅した。2Aペプチドを通してKATに連結されたTetR-KRAB（Addgene Plasmid 11642）を、オーバーラップPCRによって作出し、ACTプロモーターの3'にクローニングした。ブラストサイジンカセットをpCDNA6（Invitrogen）から増幅し、tetO上流のNheI部位へクローニングした。ACT-PBアーゼは以前に記載されている。LRP6およびβカテニンについての全長cDNAクローンを、Addgene（27242および19286）から、TCF7L1およびδカテニンについては、DF/HCC DNA Resource Core（HsCD00339336およびHsCD00082615）から入手した。次に、全長cDNAを、ブラストサイジン選択カセットを含有しているTet-OnベクターであるPBベクター、PBJ[BRT]へサブクローニングした。
細胞培養および安定細胞株の生成
TRI-102細胞をRothberg Instituteから入手した。AML-RAS細胞を生成するため、TRI-102を、pBabe-Puro-KRASG12Vから作製されたレトロウイルスによって感染させ、2μg/mLピューロマイシンによって選択した。LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンの条件的過剰発現のための安定細胞株を生成するため、TRI-102またはAML-RASを、PBJ[BRT]内の対応する遺伝子およびACT-PBアーゼによってコトランスフェクトし、2週間、5μg/mLブラストサイジンによって選択した。全てのTRI-102細胞株およびAML-RAS細胞株を、10％FBSを含むF12-DMEMにおいて維持した。
発癌性RAS黒色腫細胞株YUDOSO、YUTICA、およびYUGASPは、Dr.David Sternからの寄贈であった。それらは10％FBSを含むMEMにおいて維持された。肺癌細胞株H358、H441、H460、H1734、H1792、およびA549は、American Type Culture Collection（ATCC）からであり、10％FBSを含むRPMI-1640において維持された。結腸癌細胞株DLD-1、HCT116、SW1116、および膵臓癌AsPc1、Capan2、MiaPaCa2、Panc1は、ATCCからであり、10％FBSを含むDMEMにおいて維持された。LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンの条件的過剰発現のための安定細胞株を生成するため、肺癌細胞株A549およびH1792を、PBJ[BRT]内の対応する遺伝子およびACT-PBアーゼによってコトランスフェクトし、2週間、5μg/mLブラストサイジンによって選択した。
PB機能獲得スクリーニング
PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]を、トランスポサーゼプラスミドACT-PBアーゼとのコトランスフェクションによって、2×105個のAML-RAS細胞へ導入した。トランスポゾン転位の4日後に、変異型細胞を、24時間、Doxによって一過性に誘導し、次いで、KAT陽性細胞を細胞選別によって収集した。選別された細胞を、3日間さらに拡張し、次いで、2個のプールに等分した。各プールは3×106個の細胞を有しており、スクリーニングプールを、5日間、2ug/ml Doxによって処置し、対照プールを媒体対照ddH2Oによって処置した。
ゲノムDNA調製、キャプチャーベースPCR、およびIllumina配列決定（図14）
ゲノムDNA抽出のため、細胞を、10mMトリスHCl pH8.0、2mM EDTA、200mM NaCl、0.2％SDS、200ug/ml RNアーゼA、および800ug/mlプロテイナーゼKを含有している緩衝液に再懸濁させ、55℃の水浴において一晩（＞12時間）インキュベートした後、5M NaClを添加した。10000gでの遠心分離の後、ゲノムDNAをイソプロパノールによって沈殿させ、その後、75％エタノールによって洗浄した。DNAペレットを、0.1％EDTAを含む10mMトリスHCL pH8.0に再懸濁させた。次いで、ゲノムDNAを、AluIによって一晩（＞12時間）消化した。消化されたゲノムDNAを、1/10体積の3M NaAcおよび1/2体積のイソプロパノールを添加することによって沈殿させ、最大スピードで20分間遠心分離した。次いで、消化されたゲノムDNAペレットを、0.1％EDTAを含む10mMトリスHCL pH7.4に再懸濁させた。
最初に、100ulの体積で、25ugの消化されたゲノムDNA、300uM dNTP、300nMビオチン-PBR-Fプライマー（
Figure 2016538342
、2個のイタリック体のTはビオチン-dTに交換されている）、1×Kapa HF緩衝液、2ul Kapaポリメラーゼを含有しているシングルプライマー伸長反応（SPE）によって、キャプチャーベースPCRを実施した。SPEのためのPCR条件は、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）40サイクル、72℃5分の最終伸長工程であった。SPE産物をQiagen PCR精製キットによって精製した。次いで、精製されたSPE産物を、磁気ビーズ（Promega、カタログ番号Z5481）と混合した。ビオチン化された挿入部位断片を、製造業者のプロトコルに従って、ビオチン-ストレプトアビジン結合反応によって、他のゲノムDNAから分離した。次に、3'末端dGテーリング反応を、ターミナルトランスフェラーゼ（NEB、カタログ番号M0315S）を使用することによって、ビーズ上でセットアップした。
次いで、挿入部位断片を、Illuminaハイスループット配列決定のため、アダプター配列の付加のためのPCR反応に供した。PCR反応は、5ulの鋳型、5ulの5×Kapa HF緩衝液、0.75ulのILP11：
Figure 2016538342
0.75ulのIdx6I：
Figure 2016538342
、または0.75ulのIdx12：
Figure 2016538342
、0.75ulのdNTP、0.5ulのKapa、および12.25ulのdH20を含有しており、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）15サイクル、72℃5分としてセットアップされた。PCR産物を、Qiagen PCR精製キットによって精製し、Illumina配列決定に供した。
データ分析
最初に、生Illumina配列決定データを、Galaxyプラットフォームへインポートした。挿入部位マッピング、リード定量化、および挿入部位分布分析を、全て、Galaxyソフトウェアを使用することによって処理した。全挿入部位（Ti）、2倍Dox-部位（Mi）、2倍Dox+部位（Pi）、およびバイアスなしの部位を含有しているレコードを各遺伝子について生成した後、全てのレコードをエクセルへダウンロードした。これらの遺伝子を同定するため、2フィルター統計分析を実施した。最初に、成長または生存を損なう遺伝子は、ランダムな確率のみによって予想されるより統計的に有意に増強された2倍Dox-部位の挿入量を保有するであろうとの仮説を立てた。大部分の細胞について、1個以外の全ての挿入は、バイスタンダー挿入であって、細胞の適応度に寄与しないと仮定した。リアルタイムPCRは、1クローン当たり平均して16個の挿入が存在することを明らかにした。トランスポゾンコピー数についての知識を、バックグラウンド変異率を計算するために使用した（
Figure 2016538342
）。このバックグラウンド変異率に基づき、全ての個々の遺伝子について二項検定p値を計算した（
Figure 2016538342
）。次いで、成長または生存を損なう遺伝子は、2倍Dox+部位より増加した2倍Dox-部位の頻度も有するであろう（Mi＞Pi）との仮説を立てた。第2の二項検定p値を計算した。
Figure 2016538342
両方のフィルタについて、p値＜0.01に基づき候補遺伝子を選択した。
カイノームsiRNAスクリーニング
779種のヒトキナーゼを標的とするカイノームsiRNAライブラリーを、Dharmaconから購入した。AML-RAS細胞を96穴フォーマットで逆トランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞生存度をCelltiter-Glo（Promega）アッセイによって測定した。個々の各遺伝子についてのルシフェラーゼ読み取りを、プレート内部対照によって標準化した。3回の独立したスクリーニングのうちの2回において、ノックダウンされた時にルシフェラーゼシグナルの20％の減少を示した遺伝子を、候補として選択した。
細胞生存度アッセイ
発癌性RAS変異細胞に対する様々な薬物処置の効果を決定するため、AlamarBlueアッセイ（Invitrogen）を実施した。2500個の細胞を、薬物処置の1日前に、96穴プレートにトリプリケートに播種した。TRI-102細胞およびAML-RAS細胞については、薬物添加後72時間目に蛍光を測定した。その他の発癌性RAS細胞については、薬物添加の120時間後に蛍光を測定した。
軟寒天アッセイ
軟寒天アッセイを6穴プレートにおいてトリプリケートに実施した。各ウェルについて、成長培地中の1％寒天を含有している下層を添加した。次いで、10,000個の細胞を成長培地中の0.5％寒天で播種した。成長培地を各ウェルに添加し、3日毎に交換した。コロニーを3〜4週間後に計数した。
異種移植片
106個のAML-RAS細胞をPBSに再懸濁させ、6週齢雌ヌードマウス（Charles River Laboratory）の両側腹部へ皮下接種した。移植の7日後、動物を、LiCl（340mg/kg体重）または等体積の媒体（PBS）の腹腔内注射によって2日毎に処置した。腫瘍体積（mm3）および体重（g）を2日毎に測定した。式W2×L/2（Lは腫瘍の長さであり、Wは腫瘍の幅である）に基づき、ノギス測定を使用することによって、腫瘍体積を推定した。全ての実験が、プロトコル番号2008-10230の下で、Yale Animal Resources CenterおよびInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認され、それに準じて実施された。
本明細書に開示される実施例2において使用された材料および方法を、以下に記載する。
挿入変異誘発スクリーニング
Luc-PB[Mut]の修飾によってPB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]を生成した。TRI-102細胞をRothberg Instituteから入手した。pBabe-Puro-KRASG12Vから作製されたレトロウイルスによる感染によって、TRI-102からAML-RAS細胞を生成し、2μg/mLピューロマイシンによって選択した。機能獲得スクリーニングを実施するため、PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]を、トランスポサーゼプラスミドACT-PBアーゼとのコトランスフェクションによって、2×105個のAML-RAS細胞へ導入した。トランスポゾン転位の4日後に、変異型細胞を、24時間、Doxによって一過性に誘導し、次いで、KAT陽性細胞を細胞選別によって収集した。選別された細胞を、3日間さらに拡張し、次いで、2個のプールに等分した。各プールは3×106個の細胞を有しており、スクリーニングプールを、5日間、2ug/ml Doxによって処置し、対照プールを媒体対照ddH2Oによって処置した。5日後に、2個のプールからゲノムDNAを抽出した。最初に、キャプチャーベースPCR法（図14）によってPB挿入部位を濃縮し、次いで、Illuminaハイスループット配列決定に供した。生Illumina配列決定データを、ヒトゲノムhg19にマッピングし、挿入部位をGENCODE v19によって注釈した。遺伝子を2回の二項検定によって選択した。
細胞生存度アッセイおよび形質転換アッセイ
発癌性RAS変異細胞に対する様々な薬物処置の効果を決定するため、細胞生存度をモニタリングするために、AlamarBlueアッセイ（Invitrogen）を実施した。軟寒天アッセイおよびAML-RAS細胞異種移植片モデルを、腫瘍形成に対するWNT経路活性化の効果を確認するために使用した。
ベクターおよびクローニング
Luc-PB[Mut]の修飾によってPB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]を生成した。tetOをpHUD10-3から入手し、CAGプロモーターの上流にクローニングした。Katushka赤色蛍光タンパク質をpTurboFP636-C（Evrogen）から増幅した。2Aペプチドを通してKATに連結されたTetR-KRAB（Addgene Plasmid 11642）を、オーバーラップPCRによって作出し、ACTプロモーターの3'にクローニングした。ブラストサイジンカセットをpCDNA6（Invitrogen）から増幅し、tetOの上流のNheI部位にクローニングした。ACT-PBアーゼは以前に記載されている9。LRP6およびβカテニンについての全長cDNAクローンを、Addgene（27242および19286）から、TCF7L1およびδカテニンについては、DF/HCC DNA Resource Core（HsCD00339336およびHsCD00082615）から入手した。次に、全長cDNAを、ブラストサイジン選択カセットを含有しているTet-OnベクターであるPBベクター、PBJ[BRT]へサブクローニングした。
細胞培養および安定細胞株の生成
TRI-102細胞をRothberg Instituteから入手した。AML-RAS細胞を生成するため、TRI-102を、pBabe-Puro-KRASG12Vから作製されたレトロウイルスによって感染させ、2μg/mLピューロマイシンによって選択した。LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンの条件的過剰発現のための安定細胞株を生成するため、TRI-102またはAML-RASを、PBJ[BRT]内の対応する遺伝子およびACT-PBアーゼによってコトランスフェクトし、2週間、5μg/mLブラストサイジンによって選択した。全てのTRI-102細胞株およびAML-RAS細胞株を、10％FBSを含むF12-DMEMにおいて維持した。
発癌性RAS黒色腫細胞株YUDOSO、YUTICA、およびYUGASPは、Dr.David Sternからの寄贈であった。それらは10％FBSを含むMEMにおいて維持された。肺癌細胞株H358、H441、H460、H1734、H1792、およびA549は、American Type Culture Collection（ATCC）からであり、10％FBSを含むRPMI-1640において維持された。結腸癌細胞株DLD-1、HCT116、SW1116、および膵臓癌AsPc1、Capan2、MiaPaCa2、Panc1は、ATCCからであり、10％FBSを含むDMEMにおいて維持された。LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンの条件的過剰発現のための安定細胞株を生成するため、肺癌細胞株A549およびH1792を、PBJ[BRT]内の対応する遺伝子およびACT-PBアーゼによってコトランスフェクトし、2週間、5μg/mLブラストサイジンによって選択した。
PB機能獲得スクリーニング
PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]を、トランスポサーゼプラスミドACT-PBアーゼとのコトランスフェクションによって、2×105個のAML-RAS細胞へ導入した。トランスポゾン転位の4日後に、変異型細胞を、24時間、Doxによって一過性に誘導し、次いで、KAT陽性細胞を細胞選別によって収集した。選別された細胞を、3日間さらに拡張し、次いで、2個のプールに等分した。各プールは3×106個の細胞を有しており、スクリーニングプールを、5日間、2ug/ml Doxによって処置し、対照プールを媒体対照ddH2Oによって処置した。
ゲノムDNA調製、キャプチャーベースPCR、およびIllumina配列決定（図S2）
ゲノムDNA抽出のため、細胞を、10mMトリスHCl pH8.0、2mM EDTA、200mM NaCl、0.2％SDS、200ug/ml RNアーゼA、および800ug/mlプロテイナーゼKを含有している緩衝液に再懸濁させ、55℃の水浴において一晩（＞12時間）インキュベートした後、5M NaClを添加した。10000gでの遠心分離の後、ゲノムDNAをイソプロパノールによって沈殿させ、その後、75％エタノールによって洗浄した。DNAペレットを、0.1％EDTAを含む10mMトリスHCL pH8.0に再懸濁させた。次いで、ゲノムDNAを、一晩（＞12時間）AluIによって消化した。消化されたゲノムDNAを、1/10体積の3M NaAcおよび1/2体積のイソプロパノールを添加することによって沈殿させ、最大スピードで20分間遠心分離した。次いで、消化されたゲノムDNAペレットを、0.1％EDTAを含む10mMトリスHCL pH7.4に再懸濁させた。
最初に、100ulの体積で、25ugの消化されたゲノムDNA、300uM dNTP、300nMビオチン-PBR-Fプライマー
Figure 2016538342
、1×Kapa HF緩衝液、2ul Kapaポリメラーゼを含有しているシングルプライマー伸長反応（SPE）によって、キャプチャーベースPCRを実施した。SPEのためのPCR条件は、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）40サイクル、72℃5分の最終伸長工程であった。SPE産物をQiagen PCR精製キットによって精製した。次いで、精製されたSPE産物を、磁気ビーズ（Promega、カタログ番号Z5481）と混合した。ビオチン化された挿入部位断片を、製造業者のプロトコルに従って、ビオチン-ストレプトアビジン結合反応によって、他のゲノムDNAから分離した。次に、3'末端dGテーリング反応を、ターミナルトランスフェラーゼ（NEB、カタログ番号M0315S）を使用することによって、ビーズ上でセットアップした。
次いで、挿入部位断片を、Illuminaハイスループット配列決定のため、アダプター配列の付加のためのPCR反応に供した。PCR反応は、5ulの鋳型、5ulの5×Kapa HF緩衝液、0.75ulの
Figure 2016538342
、0.75ulのIdx6I：
Figure 2016538342
、またはIdx12：
Figure 2016538342
、0.75ulのdNTP、0.5ulのKapa、および12.25ulのdH20を含有しており、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）15サイクル、72℃5分としてセットアップされた。PCR産物を、Qiagen PCR精製キットによって精製し、Illumina配列決定に供した。
データ分析
生Illumina配列決定データを、ヒトゲノムhg19にマッピングし、GENCODE v19によって注釈した。最初に、各遺伝子について、全挿入部位（Ti）を2倍Dox-部位（Mi）、2倍Dox+部位（Pi）、またはバイアスなしの部位として分類した。候補遺伝子を同定するため、2回の統計分析を実施した。成長または生存を損なう遺伝子は、ランダムな確率のみによって予想されるより統計的に有意に増強された2倍Dox-部位の挿入量を保有するであろうとの仮説を立てた。大部分の細胞について、1個以外の全ての挿入は、バイスタンダー挿入であって、細胞の適応度に寄与しないと仮定した。リアルタイムPCRは、1クローン当たり平均して16個の挿入が存在することを明らかにした。トランスポゾンコピー数についての知識を、バックグラウンド変異率を計算するために使用した（
Figure 2016538342
）。このバックグラウンド変異率に基づき、二項検定p値を全ての個々の遺伝子について計算した（
Figure 2016538342
）。次いで、成長または生存を損なう遺伝子は、2倍Dox+部位より増加した2倍Dox-部位の頻度も有するであろう（Mi＞Pi）との仮説を立てた。第2の二項検定p値を計算した。
Figure 2016538342
両方のフィルタについて、p値＜0.0005に基づき候補遺伝子を選択した。ノンコーディング遺伝子は、コーディング遺伝子より少ない1遺伝子当たりの挿入変異を有するため、相対緩和閾値p＜0.01をノンコーディング候補遺伝子を選択するために使用した。RNAとRNA結合タンパク質（RBP）との相互作用をstarBase V2.0を使用して同定した。
カイノームsiRNAスクリーニング
779種のヒトキナーゼを標的とするカイノームsiRNAライブラリーを、Dharmaconから購入した。AML-RAS細胞を96穴フォーマットで逆トランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞生存度をCelltiter-Glo（Promega）アッセイによって測定した。個々の各遺伝子についてのルシフェラーゼ読み取りを、プレート内部対照によって標準化した。3回の独立したスクリーニングのうちの2回において、ノックダウンされた時にルシフェラーゼシグナルの20％の減少を示した遺伝子を、候補として選択した。
細胞生存度アッセイ
発癌性RAS変異細胞に対する様々な薬物処置の効果を決定するため、AlamarBlueアッセイ（Invitrogen）を実施した。2500個の細胞を、薬物処置の1日前に、96穴プレートにトリプリケートに播種した。TRI-102細胞およびAML-RAS細胞については、薬物添加後72時間目に蛍光を測定した。その他の発癌性RAS細胞については、薬物添加の120時間後に蛍光を測定した。
軟寒天アッセイ
軟寒天アッセイを6穴プレートにおいてトリプリケートに実施した。各ウェルについて、成長培地中の1％寒天を含有している下層を添加した。次いで、10,000個の細胞を成長培地中の0.5％寒天で播種した。成長培地を各ウェルに添加し、3日毎に交換した。コロニーを3〜4週間後に計数した。
異種移植片
106個のAML-RAS細胞をPBSに再懸濁させ、6週齢雌ヌードマウス（Charles River Laboratory）の両側腹部へ皮下接種した。移植の7日後、動物を、LiCl（340mg/kg体重）または等体積の媒体（PBS）の腹腔内注射によって2日毎に処置した。腫瘍体積（mm3）および体重（g）を2日毎に測定した。式W2×L/2（Lは腫瘍の長さであり、Wは腫瘍の幅である）に基づき、ノギス測定を使用することによって、腫瘍体積を推定した。全ての実験が、プロトコル番号2008-10230の下で、Yale Animal Resources CenterおよびInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認され、それに準じて実施された。
本明細書に開示された実施例1の結果を、以下に記載する。
実施例1：PB機能獲得スクリーニング
挿入によって内在性遺伝子過剰発現を駆動するため、PBトランスポゾンを含有しているドキシサイクリン（Dox）誘導性の系を生成した（PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]、図1）。変異型細胞を、Katushka（KAT）蛍光マーカーの共発現によっても標識する。これを、患者由来のTSC2欠損血管筋脂肪腫細胞株TRI-102へ発癌性KRASG12Vを導入することによって生成されたKRASG12V形質転換細胞株、AML-RASに適用した。TRI-102は、軟寒天においてコロニーを形成することができない成長の遅い良性腫瘍細胞株である。これらの細胞へのKRASG12Vの導入は、増殖を増加させ、足場非依存性の成長を可能にする（図13Aおよび13B）。これは、活性化されたRAS変異を有する患者由来癌細胞によって一般的に示される形質転換された特色である。従って、AML-RASおよびTRI-102は、RAS合成致死変異についてスクリーニングするための理想的な実験細胞株および対照細胞株を提供する。
AML-RAS細胞の成長または生存を損なう変異についてスクリーニングするため、トランスポゾンによって変異誘発された細胞のコレクションを、PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]およびトランスポサーゼPBアーゼのコトランスフェクションによって生成した（図1）。変異型細胞について濃縮するため、トランスポゾン転位の4日後に、KAT融合転写物発現の短時間のDox誘導の後に、細胞選別によってKAT陽性細胞を収集した（図2）。次に、変異型細胞を、Dox誘導なしに増幅させ、2個のプールに等分した。スクリーニングプールにおいては、細胞を、5日間、Doxの存在下で連続培養し（Dox+プール）、変異型内在性遺伝子の持続的な過剰発現、および成長または生存を損なう変異を有するKRASG12V細胞の枯渇を可能にした（図1）。平行して、対照細胞プールを、培地中のDoxなしの同一条件の下で培養した（Dox-プール）。
ゲノムDNAを2個のプールから抽出し、トランスポゾン挿入部位からの断片を、ビオチン-ストレプトアビジンキャプチャープロトコルによって濃縮した後、Illuminaハイスループット配列決定を行った（図14）。2個のプールからの全部で4,362,271個の配列リードが、ゲノム上の270,257個の部位と整列した（図15）。これらの部位は、PB転位認識配列TTAAを含有しており、それは、それらがゲノム内のトランスポゾン挿入部位であることを示す。
20,387種の公知のコーディング遺伝子のうちの13,872種に位置する175,944個の挿入部位の分析を実施した。挿入変異が細胞クローンの成長または生存の変化を引き起こすのであれば、この変化は、その特定の挿入部位についての配列決定リードの数に反映されるであろう（図1）。トランスポゾン依存性の遺伝子発現の誘導によって枯渇した挿入または濃縮された挿入に分析の焦点を当てた。具体的には、Dox誘導によって少なくとも50％枯渇した挿入（log2比＞1、2倍Dox-部位、Mi）、または少なくとも200％増加した挿入（log2比＜-1、2倍Dox+部位、Pi）を分析した（図3）。さらに、各細胞クローンは、複数のトランスポゾン挿入を含有しているが、それらのうちの1個のみが原因としての役割を果たすと仮定した。従って、バイスタンダー挿入は、原因となる挿入と共に枯渇するかまたは濃縮され、バックグラウンドノイズを導入するであろう。遺伝子は、過剰発現された場合、細胞適応度を減少させ、ランダムな確率によって予想されるより多くの枯渇挿入部位（2倍Dox-部位）を含有するであろうとの仮説を立てた。従って、各遺伝子について全ての挿入部位の枯渇または濃縮を分析した。この仮定に基づき、バックグラウンド変異率に基づき予想されるより多くの枯渇挿入部位を含有している150種の遺伝子を同定した（図3）。次に、これらの遺伝子は、濃縮挿入部位に対して増加した枯渇挿入部位の頻度も有している（Mi＞Pi）との仮説を立てた。この第2のフィルタをデータに適用し、最終的に、95種の候補遺伝子を同定した（図3および表1）。
（表１）PB機能獲得スクリーニングからの候補遺伝子のリスト
Figure 2016538342
Figure 2016538342
Figure 2016538342
興味深いことに、同定された遺伝子のうち、CCNY、LRP6、δカテニン、MED13、およびTCF7L1を含む5種は、WNT経路の公知の成分に属する（図4）。RASとWNTシグナリング経路との間の関係は明白には理解されていないが、拮抗作用および相乗作用の両方が報告されている。WNT経路の活性化が単独で発癌性RAS細胞の成長を損なうことを確証するため、Dox誘導によってLRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンを条件的に過剰発現する安定的なAML-RAS細胞株およびTRI-102細胞株を確立した。遺伝子スクリーニングの結果を確認して、これらの遺伝子のいずれかの誘導された過剰発現は、AML-RAS細胞の成長を特異的に阻害し（図5Aおよび5B）、TRI-102細胞の成長は阻害しない。これらのデータは、トランスポゾン挿入によって誘導された過剰発現またはトランスジーン過剰発現のいずれかによるWNT経路の活性化がAML-RAS細胞成長に拮抗することを示唆する。平行して、AML-RAS細胞成長の障害についての779種のキナーゼ遺伝子のカイノームsiRNAスクリーニングを実施したところ、WNTシグナリングを阻害することが以前に示された9種の遺伝子が同定され（表2）、PBトランスポゾン機能獲得スクリーニングアプローチの独立の確証が提供された。
（表２）カイノームsiRNAスクリーニングからの候補遺伝子のリスト
Figure 2016538342
トランスポゾン機能獲得スクリーニングおよびsiRNA機能喪失スクリーニングの両方が、複数のWNTシグナリング遺伝子を同定したという事実は、WNT経路が発癌性RASのための主要な拮抗シグナルであり、可能性のある治療標的であることを強く主張する。
AML-RAS細胞に対するWNT経路の薬理学的活性化剤の効果を分析した。最初に、双極性障害のための薬物であり、WNTシグナリングの活性化剤であるGSK3阻害剤、塩化リチウム（LiCl）を使用した。20mM LiClによる処置は、AML-RAS細胞の成長を特異的に損ない、TRI-102細胞の成長は損なわなかった（図6および7）。次に、2種の他の低分子GSK3阻害剤、ケンパウロンおよびBIOを試験した。再び、両化合物は、AML-RAS細胞の成長を特異的に阻害し、TRI-102細胞は阻害しなかった（図7）。RASによって誘導される発癌特性に対するWNT経路活性化の効果をさらに調査するため、軟寒天アッセイにおけるLiClの効果を試験したところ、AML-RAS細胞の足場非依存性の成長が防止されることが見出された（図8Aおよび8B）。最後に、AML-RAS異種移植片におけるLiClのインビボ効果を調査したところ、腫瘍成長が劇的に抑制されることが見出された（図9A〜9C）。さらに、レシピエントマウスの健康は、腫瘍を抑制する用量で影響を受けなかった（図9A〜9C）。AML-RAS細胞によるこれらのインビトロおよびインビボの結果は、WNTシグナリングの薬理学的活性化が発癌性RAS変異を有する癌のための治療的な可能性を提示することを示す。
17種の患者由来癌細胞のパネルを、3種の薬理学的GSK阻害剤、LiCl、ケンパウロン、およびBIOによって試験した。これらの癌細胞は、肺、結腸、膵臓、およびメラニン細胞の癌を含む、内在性発癌性RAS変異を共通して保有している異なる腫瘍型を表わす。AML-RASに類似して、WNTの薬理学的活性化は、KRASのG12またはその他の残基に内在性発癌性変異を保有している患者由来癌細胞の成長を抑制する（図10）。さらに、NRASおよびHRASの発癌性変異を有する癌細胞の成長も抑制された（図10）。この拮抗作用は、調査された全ての腫瘍型に存在する。しかしながら、成長がWNT活性化によって有意に抑制されない一つの例外、A549肺癌細胞が見出された。興味深いことに、A549細胞は、WNT経路標的遺伝子の活性化に必要とされるSWI/SNFクロマチンリモデリング複合体の成分であるSMARCA4にフレームシフト欠失を含有している。これと一致して、WNT経路の上流活性化剤の過剰発現も、SMARCA4変異を保有していないH1792肺癌細胞とは対照的に、A549細胞の成長を抑制し得なかった（図11Aおよび11B）。さらに、LiClは、H1792細胞の足場非依存性の成長を完全に阻害したが、A549細胞は阻害しなかった（図12Aおよび12B）。総合すると、これらのデータは、WNT経路の活性化が、発癌性RAS変異を保有している腫瘍細胞に対して広い拮抗効果を及ぼすことを証明している。実際、WNT経路の活性化は、異なる腫瘍型において予後良好と関連付けられている。
要約すると、ヒト細胞におけるフォワードジェネティックスクリーニングのための新しい条件的機能獲得挿入変異誘発法が確立された。このテクノロジーは、ネガティブ選択された変異についてのスクリーニングを可能にし、RAS癌細胞の成長および生存を選択的に損なう改変および経路についてのゲノムの尋問を可能にする。原理証明として、WNT経路の活性化が、発癌性RASに拮抗し、有効な処置を欠く広範囲の癌のための可能性のある治療標的および薬剤を提供することが発見された。この費用効率が高く強力な遺伝学的アプローチは、スケーラブルであり、高度に順応性があり、特定の変異組成を有する腫瘍のための治療標的を急速に同定する力を研究者に与える。それは個別化医療のために特に魅力的である。
本明細書に開示された実施例2の結果を以下に記載する。
実施例2：PBトランスポゾンベースの条件的変異誘発スクリーニング。
多数のノンコーディング遺伝子を機能的に尋問するためには、フォワードジェネティックスクリーニングが必要とされる。ヒトゲノムにおけるオルタナティブスプライシングの複雑さおよびノンコーディング遺伝子の限定された特徴決定のため、全ゲノム尋問を実施するための系統的な遺伝子活性化アプローチが本明細書に記載される。ハイスループット配列決定分析と組み合わされたpiggyBac（PB）トランスポゾン変異誘発ベースの条件的発現系を利用するスクリーニング法が開発された。この方法を利用して、発癌性KRASを発現する癌細胞の成長および／または生存を損なう遺伝子についてのネガティブ選択スクリーニングを実施した。1回のPB変異誘発において、18,032種のタンパク質コーディング遺伝子、10,362種の長鎖ノンコーディングRNA（lncRNAs）、および8,683種の偽遺伝子が、成功裡に尋問された。興味をひくのは、WNTシグナリング経路のタンパク質コーディング成分およびノンコーディング成分の両方が、発癌性RASに特異的に拮抗することが明らかになったことである。さらに、WNTシグナリングの遺伝学的活性化および薬理学的活性化が、腫瘍型によって異なる発癌性RAS変異を有する患者由来癌細胞に対して広く有効であることが見出された。本明細書に提供されるPB変異誘発スクリーニングアプローチは、ライブラリーの生成および維持に関連したコストなしに、タンパク質コーディング遺伝子およびノンコーディング遺伝子の両方を機能的に尋問する全ゲノム分析プラットフォームを可能にする。これらの特色は、疾患および生物学の研究のための広い適用を可能にし、個別化治療のための経路および標的を同定するため、個々の患者由来腫瘍細胞においてスクリーニングがルーチンに実施される可能性を開く。
トランスポゾンは、下等生物においてゲノム機能解析ツールとして広く使用されている。PBトランスポゾンは、ヒトおよびマウスのゲノムにおいて効率的に移動することができる。さらに、PB挿入変異誘発は、癌ドライバー遺伝子および薬物耐性遺伝子を同定するために使用されている。その適用を拡張するため、単一のトランスフェクションによって挿入変異の高カバー率ゲノムワイドライブラリーを作製し、ヒト細胞のゲノムを迅速に尋問するため、それをハイスループット配列決定と組み合わせるPBの能力を試験した。ライブラリーベースのテクノロジーと比較して、トランスポゾンベクターによるランダム挿入変異誘発は、ライブラリーの作製および維持のコストおよび手間を回避するのみならず、タンパク質コーディング遺伝子に加えてノンコーディングゲノムを尋問する能力も提示する。
多くの一般的な癌ドライバー変異を直接標的とするのは困難である。発癌性RAS変異を保有している腫瘍細胞の成長および生存を特異的に損なう遺伝子および経路を同定するための、このPB変異誘発アプローチの適用可能性を決定した。この目的のため、ネガティブ選択される遺伝子を同定するために使用され得る誘導性トランスポゾン（PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]、図16）を設計した。PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]は、挿入による内在性遺伝子アップレギュレーションを駆動するため、ドキシサイクリン（Dox）誘導性の系を利用した。Katushka（KAT）蛍光マーカーの共発現によって、トランスポゾンによって誘導された遺伝子を含有している細胞を標識した。発癌性RASを保有している細胞を特異的に損なう遺伝子を同定するため、同質遺伝子の細胞対、患者由来TSC2欠損血管筋脂肪腫細胞株TRI-102およびKRASG12Vによって形質転換されたTRI-102細胞AML-RASを利用した。AML-RAS細胞は、増加した増殖および足場非依存性の成長を示した（図13Aおよび13B）。これらは、活性化されたRAS変異を有する患者由来癌細胞によって一般的に示される形質転換された特色である。
スクリーニングを実施するため、PB[Mut-tetO-KAT-TETRKRAB]およびトランスポサーゼPBアーゼのコトランスフェクションによって、コーディングゲノムおよびノンコーディングゲノムにトランスポゾン挿入を保有している多様な細胞のプールを生成した（図16）。次いで、トランスポゾンによって誘導された遺伝子を含有している細胞を、KAT陽性細胞についての細胞選別によって濃縮した（図17）。次に、変異型細胞を拡張し、2個のプールへ等分した。ネガティブ選択される遺伝子を同定するため、一方のプールを、Doxなしで培養し（Dox-プール）、他方を、遺伝子発現を誘導するため、Doxの存在下で連続培養した（Dox+プール）（図16）。5日後に、ゲノムDNAを2個のプールから抽出し、トランスポゾン挿入部位からのDNA断片を、ビオチン-ストレプトアビジンキャプチャープロトコルによって回収し、その後、Illuminaハイスループット配列決定を行った（図14）。最後に、トランスポゾン依存性の遺伝子発現の誘導によって少なくとも2倍枯渇したかまたは濃縮された部位（log2 Dox-/Dox+）を同定するため、各挿入部位についての配列決定リードを、2個のプールの間で比較した（図1）。
1回の変異誘発において、全部で422,746個のトランスポゾン挿入部位が回収されマッピングされ、そのうち、326,511個は18,032種のタンパク質コーディング遺伝子に位置しており、121,344個は10,362種のlncRNAおよび8,683種の偽遺伝子にマッピングされた（図21）。平均すると、各タンパク質コーディング遺伝子は、18個の異なる挿入変異を含有しており、各長鎖ノンコーディング標的は6個を保有していた。最初に、挿入を、枯渇部位（log2比＞1、2倍Dox-部位、Mi）または濃縮部位（log2比＜-1、2倍Dox+部位、Pi）へ分類し、次いで、各遺伝子内の全ての部位の枯渇または濃縮を分析した（図18）。遺伝子が細胞適応度を減少させる場合；それは濃縮挿入部位（Pi）より多くの枯渇挿入部位（Mi）を含有しているはずであるとの仮説を立てた（図18）。ベルヌーイ分布に基づき、各遺伝子についてp値を計算し、340種のタンパク質コーディング候補遺伝子（p＜0.0005）ならびに259種のlncRNAおよび偽遺伝子（p＜0.01）（図22および23）を同定した。候補遺伝子のうち、MAPK14およびBRAPを含む、RASの確立された負の制御因子が同定され、このことは、スクリーニングが発癌性RASに拮抗する遺伝子を成功裡に同定したことの確証を提供する。
次に、RAS細胞の増殖および生存を損なう重要な経路を同定するため、生物情報学的分析を候補遺伝子に対して実施した。PANTHER経路分析をタンパク質候補遺伝子に適用したところ、WNTシグナリング経路が最も有意に濃縮されていることが明らかになり、経路の12種の成分が同定された（LRP6、αカテニン、δカテニン、TCF7L1、CSNK1G1、CCNY、PCDH15、GNG7、INO80、SMARCC1、PRKCA、およびMED13；図18）。ノンコーディング遺伝子については、最初に、16種の異なる組織からの発現データを含有しているヒトBodyMap 2.0を使用して、同定されたタンパク質コーディング遺伝子と発現プロファイルを比較した。Pearman相関係数分析は、同定されたタンパク質コーディング遺伝子およびノンコーディング遺伝子が一致した発現パターンを示すことを示し、そのことから、共制御および類似した生物学的過程への関与が示された（図19）。次に、ノンコーディング遺伝子におけるRNA結合タンパク質（RBP）ネットワークを分析し、EIF4A3、FUS、SRSF1、およびU2AF2の結合部位の濃縮を同定した（p＜0.0001；図20および25）。興味深いことに、これらのRBPは、スプライソソームの成分であり、それらのうちの3種は、WNTシグナリングを制御することが示されている。さらに、同定されたノンコーディング遺伝子のうちの2種、MIATおよびLncRNA-hLALR1は、これらのRBPのための結合部位を有しているのみならず、WNTシグナリングを促進することも報告されている。総合すると、コーディングゲノムおよびノンコーディングゲノムのこの尋問は、WNT経路活性化が発癌性RASに対抗することを示唆した。
拮抗作用および相乗作用の両方が報告されているため、RASとWNTシグナリング経路との間の相互作用は明白には理解されていない；しかしながら、拮抗関係が、カイノームsiRNAスクリーニングにおいて独立に確証された（図24）。この対抗をさらにバリデートするため、WNT経路の4種の成分、LRP6、TCF7L1、βカテニン、またはδカテニンを条件的に過剰発現する安定的なAML-RAS細胞株およびTRI-102細胞株を確立した。スクリーニングの結果と一致して、これらの遺伝子のいずれかの誘導された過剰発現は、AML-RAS細胞の成長を特異的に阻害した（図5Aおよび5B）。
トランスポゾン機能獲得スクリーニングおよびsiRNA機能喪失スクリーニングの両方が、複数のWNTシグナリング遺伝子を同定したという事実は、WNT経路が発癌性RASのための主要な拮抗シグナルであり、可能性のある治療標的であることを強く示唆する。従って、WNT経路の薬理学的活性化剤の効果を調査した。公知のGSK3阻害剤でありWNTシグナリングの活性化剤である20mM塩化リチウム（LiCl）による処置は、AML-RAS細胞の成長を特異的に損ない、TRI-102細胞の成長は損なわなかった（図6および7）。2種の他の低分子GSK3阻害剤、ケンパウロンおよびBIOも、AML-RAS細胞の成長を特異的に阻害した（図7）。RAS腫瘍細胞に対するWNT経路活性化の効果を、確立された形質転換アッセイにおいてさらに調査した。LiClは、軟寒天アッセイ（図8Aおよび8B）ならびにインビボ異種移植片実験（図9A〜9C）において、RAS腫瘍細胞を劇的に抑制した。
これらのインビトロおよびインビボの結果は、WNTシグナリングの薬理学的活性化が発癌性RAS変異を有する癌のための治療的な可能性を提示することを示した。肺、結腸、膵臓、およびメラニン細胞の癌を含む、発癌性RAS変異を共通して保有している異なる腫瘍型を表す17種の患者由来癌細胞のパネルを試験した。WNTの薬理学的活性化は、一つの例外を除き全ての患者由来癌株の成長を抑制した（図10）。非応答細胞A549肺癌細胞は、WNT経路標的遺伝子の活性化に必要とされるSMARCA4にフレームシフト欠失を含有している。さらに、WNT上流活性化剤の過剰発現またはLiCl処置は、A549細胞の足場非依存性の成長を抑制することができなかったが、H1792細胞を劇的に阻害し、このことから、重大なシグナルとしてのWNT経路活性化が強調される（図11A〜11Bおよび12A〜12B）。重要なこととして、WNTシグナリング活性化による成長抑制は、KRASのG12またはその他の残基における発癌性変異に制限されず、NRASおよびHRASに発癌性変異を有する細胞に対しても効果を及ぼした（図10）。総合すると、これらのデータは、WNT経路の活性化が、発癌性RAS変異を保有している腫瘍細胞に対して広い拮抗効果を及ぼすことを示す。
要約すると、ヒト細胞におけるフォワードジェネティックスクリーニングのためのPBトランスポゾンベースの条件的変異誘発法が確立された。このテクノロジーは、コーディング遺伝子およびノンコーディング遺伝子の両方の全ゲノム尋問を可能にする最初のプラットフォームを提供した。原理証明として、WNT経路の活性化は、発癌性RASに拮抗し、有効な処置を欠く広範囲の癌のための可能性のある治療戦略を提供した。この効率的なアプローチは、スケーラブルであり、高度に順応性があり、ライブラリーベースのテクノロジーより相当に安価であり、疾患および生物学的経路の全ゲノム機能的尋問を実施する力を研究者に与える。重要なこととして、これらの特質は、個々の患者に由来する癌細胞に特異的な治療標的および経路を同定するため、この方法論をルーチンに利用することを実現可能にする。
他の態様
本明細書における変数の定義における要素のリストの記述は、単一の要素またはリストされた要素の組み合わせ（または部分的組み合わせ）としての、その変数の定義を含む。本明細書における態様の記述は、単一の態様としての、または他の態様もしくはその一部分と組み合わせられた、その態様を含む。
本明細書に引用された全ての特許、特許出願、および公開の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。本発明は具体的な態様に関して開示されているが、本発明の他の態様および変動が、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の当業者によって考案され得ることは明白である。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価な変動を全て含むと解釈されるものである。
いくつかの態様において、癌細胞は、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される発癌性RASを発現している。
[本発明1001]
WNT経路の一または複数のメンバーのアゴニストである第1の薬剤を含む、癌の細胞における発癌性Rasの発現を特徴とする癌の処置において使用するための組成物。
[本発明1002]
発癌性Rasのアンタゴニストである第2の薬剤をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
薬剤が、LRP6、αカテニン、δカテニン、TCF7L1、CSNK1G1、CCNY、PCDH15、GNG7、INO80、SMARCC1、PRKCA、およびMED13からなる群より選択される一または複数のWNT経路遺伝子のタンパク質産物のアゴニストである、本発明1001の組成物または本発明1003の方法。
[本発明1004]
薬剤が、WNT経路の低分子アゴニストである、本発明1001の組成物または本発明1003の方法。
[本発明1005]
薬剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、類似体、および誘導体からなる群より選択される、本発明1001の組成物または本発明1003の方法。
[本発明1006]
癌細胞が、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される発癌性RASを発現する、本発明1001の組成物または本発明1003の方法。
[本発明1007]
WNT経路の一または複数のメンバーのアゴニストである第1の薬剤の有効量を含む組成物を、癌を有する対象へ投与する工程であって、それにより対象における癌を処置する工程を含む、癌の細胞における発癌性Rasの発現を特徴とする癌を処置する方法。
[本発明1008]
発癌性Rasのアンタゴニストである第2の薬剤をさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
組成物を投与する工程が、肺癌、肝臓癌、胃腸癌、結腸癌、膵臓癌、および皮膚癌のうちの少なくとも1種への組成物の送達を含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
以下の工程を含む、挿入変異誘発スクリーニングにおいてネガティブ選択される遺伝子を同定する方法：
関心対象の細胞においてpiggyBacトランスポゾンの転位を誘導する工程；
piggyBacトランスポゾンの発現を誘導するため、転位型細胞の一部分を選択圧に曝す工程；
選択圧に曝された転位型細胞および選択圧に曝されていない転位型細胞のゲノムDNAにおける挿入部位を比較する工程；ならびに
選択圧に曝されていない転位型細胞と比べて選択圧に曝された転位型細胞にディファレンシャルに存在する1個以上の挿入部位を有する遺伝子を同定する工程。
[本発明1011]
piggyBacトランスポゾンが誘導性抗生物質耐性遺伝子を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
関心対象の細胞が腫瘍細胞である、本発明1010の方法。
[本発明1013]
転位を誘導する工程が、関心対象の転位型細胞の増幅をさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1014]
挿入部位を比較する工程が、挿入部位の配列決定を含む、本発明1010の方法。
[本発明1015]
挿入部位が、遺伝子のイントロン、エキソン、およびプロモーター領域のうちの少なくとも1個に位置している、本発明1010の方法。
[本発明1016]
前記遺伝子が、選択圧に曝された転位型細胞に枯渇しており、かつ選択圧に曝されていない転位型細胞に存在する、本発明1010の方法。
[本発明1017]
前記遺伝子が、関心対象の細胞の成長または生存を損なう、本発明1010の方法。
[本発明1018]
WNT経路の活性化剤を含む、発癌性RASを発現する腫瘍細胞の増殖を低下させるための組成物。
[本発明1019]
活性化剤がグリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤である、本発明1018の組成物。
[本発明1020]
活性化剤が、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）からなる群より選択される、本発明1018の組成物。
[本発明1021]
活性化剤が、WNT経路の低分子アゴニストである、本発明1018の組成物。
[本発明1022]
発癌性RASが、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される、本発明1018の組成物。
[本発明1023]
腫瘍細胞が、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍細胞のうちの少なくとも1種である、本発明1018の組成物。
[本発明1024]
本発明1009の組成物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
[本発明1025]
肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍のうちの少なくとも1種への送達のためにさらに製剤化されている、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1026]
WNT経路の活性化剤を含む組成物の有効量を対象の腫瘍細胞へ投与する工程であって、それによって腫瘍細胞の増殖を低下させる工程を含む、その必要のある対象において腫瘍細胞の増殖を低下させる方法。
[本発明1027]
活性化剤がグリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
活性化剤が、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）からなる群より選択される、本発明1026の方法。
[本発明1029]
活性化剤が、WNT経路の低分子アゴニストである、本発明1026の方法。
[本発明1030]
腫瘍細胞が、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される発癌性RASを発現する、本発明1026の方法。
[本発明1031]
組成物を投与する工程が、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍のうちの少なくとも1種への送達を含む、本発明1026の方法。
[本発明1032]
WNT経路の活性化剤を投与する工程を含む、対象における発癌性RASを発現する癌および／またはそれに関連した症状を低下させるかまたは改善する方法。
[本発明1033]
WNT経路の活性化剤を含む、発癌性RAS腫瘍の処置において使用するための組成物。
最初に、100ulの体積で、25ugの消化されたゲノムDNA、300uM dNTP、300nMビオチン-PBR-Fプライマー（
Figure 2016538342
、2個のイタリック体のTはビオチン-dTに交換されている）、1×Kapa HF緩衝液、2ul Kapaポリメラーゼを含有しているシングルプライマー伸長反応（SPE）によって、キャプチャーベースPCRを実施した。SPEのためのPCR条件は、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）40サイクル、72℃5分の最終伸長工程であった。SPE産物をQiagen PCR精製キットによって精製した。次いで、精製されたSPE産物を、磁気ビーズ（Promega、カタログ番号Z5481）と混合した。ビオチン化された挿入部位断片を、製造業者のプロトコルに従って、ビオチン-ストレプトアビジン結合反応によって、他のゲノムDNAから分離した。次に、3'末端dGテーリング反応を、ターミナルトランスフェラーゼ（NEB、カタログ番号M0315S）を使用することによって、ビーズ上でセットアップした。
次いで、挿入部位断片を、Illuminaハイスループット配列決定のため、アダプター配列の付加のためのPCR反応に供した。PCR反応は、5ulの鋳型、5ulの5×Kapa HF緩衝液、0.75ulのILP11：
Figure 2016538342
0.75ulのIdx6I：
Figure 2016538342
、または0.75ulのIdx12：
Figure 2016538342
、0.75ulのdNTP、0.5ulのKapa、および12.25ulのdH20を含有しており、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）15サイクル、72℃5分としてセットアップされた。PCR産物を、Qiagen PCR精製キットによって精製し、Illumina配列決定に供した。
最初に、100ulの体積で、25ugの消化されたゲノムDNA、300uM dNTP、300nMビオチン-PBR-Fプライマー
Figure 2016538342
、1×Kapa HF緩衝液、2ul Kapaポリメラーゼを含有しているシングルプライマー伸長反応（SPE）によって、キャプチャーベースPCRを実施した。SPEのためのPCR条件は、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）40サイクル、72℃5分の最終伸長工程であった。SPE産物をQiagen PCR精製キットによって精製した。次いで、精製されたSPE産物を、磁気ビーズ（Promega、カタログ番号Z5481）と混合した。ビオチン化された挿入部位断片を、製造業者のプロトコルに従って、ビオチン-ストレプトアビジン結合反応によって、他のゲノムDNAから分離した。次に、3'末端dGテーリング反応を、ターミナルトランスフェラーゼ（NEB、カタログ番号M0315S）を使用することによって、ビーズ上でセットアップした。
次いで、挿入部位断片を、Illuminaハイスループット配列決定のため、アダプター配列の付加のためのPCR反応に供した。PCR反応は、5ulの鋳型、5ulの5×Kapa HF緩衝液、0.75ulの
Figure 2016538342
、0.75ulのIdx6I：
Figure 2016538342
、またはIdx12：
Figure 2016538342
、0.75ulのdNTP、0.5ulのKapa、および12.25ulのdH20を含有しており、95℃5分、（98℃20秒、60℃30秒、72℃1分）15サイクル、72℃5分としてセットアップされた。PCR産物を、Qiagen PCR精製キットによって精製し、Illumina配列決定に供した。

Claims (33)

  1. WNT経路の一または複数のメンバーのアゴニストである第1の薬剤を含む、癌の細胞における発癌性Rasの発現を特徴とする癌の処置において使用するための組成物。
  2. 発癌性Rasのアンタゴニストである第2の薬剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。
  3. 薬剤が、LRP6、αカテニン、δカテニン、TCF7L1、CSNK1G1、CCNY、PCDH15、GNG7、INO80、SMARCC1、PRKCA、およびMED13からなる群より選択される一または複数のWNT経路遺伝子のタンパク質産物のアゴニストである、請求項1記載の組成物または請求項3記載の方法。
  4. 薬剤が、WNT経路の低分子アゴニストである、請求項1記載の組成物または請求項3記載の方法。
  5. 薬剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、類似体、および誘導体からなる群より選択される、請求項1記載の組成物または請求項3記載の方法。
  6. 癌細胞が、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される発癌性RASを発現する、請求項1記載の組成物または請求項3記載の方法。
  7. WNT経路の一または複数のメンバーのアゴニストである第1の薬剤の有効量を含む組成物を、癌を有する対象へ投与する工程であって、それにより対象における癌を処置する工程を含む、癌の細胞における発癌性Rasの発現を特徴とする癌を処置する方法。
  8. 発癌性Rasのアンタゴニストである第2の薬剤をさらに含む、請求項7記載の方法。
  9. 組成物を投与する工程が、肺癌、肝臓癌、胃腸癌、結腸癌、膵臓癌、および皮膚癌のうちの少なくとも1種への組成物の送達を含む、請求項7記載の方法。
  10. 以下の工程を含む、挿入変異誘発スクリーニングにおいてネガティブ選択される遺伝子を同定する方法：
    関心対象の細胞においてpiggyBacトランスポゾンの転位を誘導する工程；
    piggyBacトランスポゾンの発現を誘導するため、転位型細胞の一部分を選択圧に曝す工程；
    選択圧に曝された転位型細胞および選択圧に曝されていない転位型細胞のゲノムDNAにおける挿入部位を比較する工程；ならびに
    選択圧に曝されていない転位型細胞と比べて選択圧に曝された転位型細胞にディファレンシャルに存在する1個以上の挿入部位を有する遺伝子を同定する工程。
  11. piggyBacトランスポゾンが誘導性抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項10記載の方法。
  12. 関心対象の細胞が腫瘍細胞である、請求項10記載の方法。
  13. 転位を誘導する工程が、関心対象の転位型細胞の増幅をさらに含む、請求項10記載の方法。
  14. 挿入部位を比較する工程が、挿入部位の配列決定を含む、請求項10記載の方法。
  15. 挿入部位が、遺伝子のイントロン、エキソン、およびプロモーター領域のうちの少なくとも1個に位置している、請求項10記載の方法。
  16. 前記遺伝子が、選択圧に曝された転位型細胞に枯渇しており、かつ選択圧に曝されていない転位型細胞に存在する、請求項10記載の方法。
  17. 前記遺伝子が、関心対象の細胞の成長または生存を損なう、請求項10記載の方法。
  18. WNT経路の活性化剤を含む、発癌性RASを発現する腫瘍細胞の増殖を低下させるための組成物。
  19. 活性化剤がグリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤である、請求項18記載の組成物。
  20. 活性化剤が、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）からなる群より選択される、請求項18記載の組成物。
  21. 活性化剤が、WNT経路の低分子アゴニストである、請求項18記載の組成物。
  22. 発癌性RASが、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される、請求項18記載の組成物。
  23. 腫瘍細胞が、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍細胞のうちの少なくとも1種である、請求項18記載の組成物。
  24. 請求項9記載の組成物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
  25. 肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍のうちの少なくとも1種への送達のためにさらに製剤化されている、請求項18記載の薬学的組成物。
  26. WNT経路の活性化剤を含む組成物の有効量を対象の腫瘍細胞へ投与する工程であって、それによって腫瘍細胞の増殖を低下させる工程を含む、その必要のある対象において腫瘍細胞の増殖を低下させる方法。
  27. 活性化剤がグリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）阻害剤である、請求項26記載の方法。
  28. 活性化剤が、2-アミノ-4-(3,4-(メチレンジオキシ)ベンジルアミノ)-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、LiCl、ケンパウロン、および6-ブロモインディルビン-30-オキシム（BIO）からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
  29. 活性化剤が、WNT経路の低分子アゴニストである、請求項26記載の方法。
  30. 腫瘍細胞が、発癌性HRAS、発癌性NRAS、および発癌性KRASからなる群より選択される発癌性RASを発現する、請求項26記載の方法。
  31. 組成物を投与する工程が、肺、肝臓、胃腸、結腸、膵臓、および皮膚の腫瘍のうちの少なくとも1種への送達を含む、請求項26記載の方法。
  32. WNT経路の活性化剤を投与する工程を含む、対象における発癌性RASを発現する癌および／またはそれに関連した症状を低下させるかまたは改善する方法。
  33. WNT経路の活性化剤を含む、発癌性RAS腫瘍の処置において使用するための組成物。
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