JP2005512596A - 哺乳類の細胞におけるｓｉＲＮＡＳの安定発現のための系 - Google Patents

Abstract

本発明は、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、siRNAをコードする領域、および5つの連続したチミン残基を含む転写終結エレメントを含むポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、細胞、および非ヒトトランスジェニック動物、並びにこれら種々の症状のための薬物における使用を提供する。

Description

発明の分野
本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するためのショート・インターフィアリングRNA（short interfering RNAs：siRNAs）を発現するためのポリヌクレオチドまたはベクターに関する。また、本発明は、ポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞および非ヒト・トランスジェニック動物、並びに標的薬物バリデーションにおける、およびヒト薬物療法学におけるものを含むこれら種々の使用にも関する。

発明の背景
特定の遺伝子の機能を阻害または破壊させる能力は、遺伝子機能を研究する観点から、更に治療的な展望からも、たいへん望ましい。

多くの疾患は、変異した遺伝子の発現によって、または特定の遺伝子の異常な、特に増加された、もしくは不適切な発現によってのいずれかによって生じる。このような変異は、常染色体優性疾患の場合などでは遺伝され、または癌の場合などでは個々の体細胞性または生殖系列の組織内で生じるであろう。したがって、種々の疾患または障害において、変異した対立遺伝子の、または不適切に発現された野生型対立遺伝子の発現を調節する能力は、該障害を治療するための治療を提供するために使用されてもよい。加えて、ウイルス感染などの種々の感染症において、宿主細胞でのウイルス遺伝子の発現、またはウイルスの生活環に関与する宿主細胞タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する能力も、感染症の治療を可能にする。

遺伝子発現を阻害する能力は、遺伝子機能を研究するためにも使用されている。古典的な変異誘発などの技術は、遺伝子機能についての優れた洞察を提供してきたが、このような技術は、労働集約型で、高価であり、長期間を要するであろう。このような技術は、高等生物においてそのまま実用的ではなく、所望の変異体を同定するための手段が必要であろう。また、これらは、選択の特異的な遺伝子に変異を起こす可能性を提供しない。

標的とした遺伝子を破壊するための種々の方法が開発されているが、選択の遺伝子を阻害し、または破壊し得る場合には、これらが制限を受ける。遺伝子ターゲティングなどの技術は、ホモ接合性の変異体を得るために非常に費用がかかり、高価で、かつおよび時間がかかり、数年を要する。また、遺伝子ターゲティングは、破壊する遺伝子の構造についての詳細な知識が必要である。

遺伝子ターゲティングと同様に、特異的な遺伝子を破壊させるために、アンチセンス技術も開発されている。しかし、アンチセンスRNAは、不安定であり、標的遺伝子の有効な阻害を達成するために細胞において十分に高いアンチセンスRNAレベルを達成することは困難なことが多い。

最近、二重鎖RNA分子（dsRNA）は、これらが配列同一性または相同性を共有する標的遺伝子の発現を阻害できることが、線虫（C. elegans）、キイロショウジョウバエ（Drosophilia melanogaster）および植物などの生物体において見いだされた。観察された現象は、往々にして転写後の遺伝子サイレンシング（PTGS）と称され、ウイルスまたはトランスポゾンに対して起こりうる細胞の防衛機構を表すと考えられる。典型的には、これらの生物体で行われた研究では、dsRNAは、微量注入またはトランスフェクションなどの技術によって細胞に導入され、リポーター遺伝子などの標的遺伝子の阻害が測定された。

dsRNAが標的遺伝子に対してその阻害作用を及ぼす機構は、解明され始めている。dsRNAは、長さが21〜25ヌクレオチドの二重鎖にプロセスされると考えられる。これらの短い二重鎖は、PTGSが起こっている植物において、並びにdsRNA分子をトランスフェクトしたキイロショウジョウバエschenider-2（S2）細胞の抽出物において検出された。dsRNAのプロセシング反応は、これらのS2細胞由来の抽出物を使用して、インビトロで行うことができることが見出されている。これは、遺伝子サイレンシングに関係するプロセシング、ターゲティング、および転写物切断の機構を研究することができるインビトロ・モデル系を提供する。S2可溶化液において、標的mRNAは21ヌクレオチド間隔で切断されたこと、および可溶化液に添加された合成の21および22のRNA二重鎖は、効率的な配列特異的なmRNA分解を誘導することができたことが観察された。より大きな30bpのdsRNAの二重鎖が、活性であることが見いだされた。したがって、該系における21ヌクレオチドRNA産物は、スモール・インターフィアリングまたはサイレンシングRNA（siRNAs）と名づけられた。

また、遺伝子サイレンシングのためには、標的細胞に由来する因子が必要である。キイロショウジョウバエにおいて、リボヌクレアーゼIII酵素のdicerは、長いdsRNAsをsiRNA二重鎖にプロセシングするために必要にされる。dicerに相同的な遺伝子、並びに必要なその他の宿主因子に対する相同体または対応物は、哺乳類およびヒトを含むその他の生物に存在すると考えられる。サイレンシングの初期工程は、エンドヌクレアーゼ複合体を含むsiRNAの生成を含む。エンドヌクレアーゼは、dicerまたはdicerに相同な遺伝子であってもよい。次いで、複合体は、siRNA二重鎖の鎖のうちの1つと標的転写物の配列同一性の領域の交換を含む機構によって、mRNA転写物を特異的にターゲットする。この鎖交換反応に続いて、mRNA転写物の切断が起こる。

標的mRNAの切断は、二重鎖になった領域の末端で生じ、このように実質的には、元のsiRNA分子から生じる再生されたsiRNAの2つの鎖のうちの1つと、および標的転写物からのその他のものとsiRNAエンドヌクレアーゼ複合体を再生する。転写物mRNAの切断およびそれゆえのsiRNAの再生の多サイクルは、それぞれの初期siRNA分子が標的mRNAの多数のコピーを不活性化することができることを意味するであろう。一旦標的mRNA転写物が切断されると、再生されたsiRNAに含まれない切断産物は、安定化キャップまたはpol(A)末端を欠いているので、これらは迅速に分解される。

下等生物の遺伝子サイレンシングを調査する実験では、これらが哺乳類などの高等生物に適用できないであろうと考えられる有望な結果が提供された。哺乳類などの高等生物では、dsRNAによって引き起こされる細胞の防衛機構が作動すると思われる。dsRNAsは、タンパク質合成の全体的停止並びに非特異的なmRNA分解を引き起こすインターフェロン反応を活性化すると考えられている。これにより、細胞死を引き起こし、それゆえに選択的な遺伝子の阻害を防止し得る。このような防衛機構の存在は、高等生物でのdsRNAを使用する遺伝子サイレンシングの適応性は、疑わしいことを意味する。

高等生物で標的遺伝子の発現を阻害する際のdsRNAの有効性を示したことを主張する実験を、ゼブラフィッシュもしくはニワトリなどの非哺乳動物系で、または代わりにウイルス防衛機構が作動しないと考えられている初期胚などの哺乳類の系のいずれかで行った。

プロセスされて、siRNAを生じ得るより長いdsRNA分子ではなく、合成siRNAsをトランスフェクトし、および／または微量注入する予備実験では、高等生物のウイルス防衛機構での問題を解決することが可能かもしれないという推測に至った。細胞の防衛機構を活性化するために必要なdsRNAの長さには限界があるのであろう。標的細胞に導入される合成siRNAsおよび特にこれらの二重鎖の領域の大きさは十分に小さく、それらはこの限界以下にあり、それゆえに防衛機構を活性化しない。

本発明に従って、RNAポリメラーゼIIIプロモーターおよび特に３型RNAポリメラーゼ・プロモーターを、センス鎖の5つの連続した連続チミン残基を含む転写終結配列と組み合わせて使用することにより、動物細胞において、および特に哺乳類の細胞においてsiRNAsを効率的に発現さすることができることが現在見いだされている。転写ターミネーターと連携してRNAポリメラーゼIIIプロモーターを使用することにより、これは、最適な阻害活性に必要な3'オーバーハングのうちの1つが本発明の構築物から生じるsiRNAに存在することを確実にする。構築物から生じた転写物のステムループ構造の切断によって、第2の3'オーバーハングが産生されるであろう。

本発明の構築物は、標的細胞のゲノムに組み込むことができるDNA分子であるという事実により、siRNAの安定な長期の発現が可能となり、それゆえに、標的遺伝子の長期の阻害が可能となる。

従って、本発明は、 −RNAポリメーラーゼIIIプロモーター；
−siRNAをコードする領域；および、
−センス鎖に5つの連続したチミン残基を含む転写終結エレメント：
を含むポリヌクレオチドを提供する。

また、本発明は、
−本発明のポリヌクレオチドを含むベクター；
−本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞；
−ポ本発明のリヌクレオチドまたはベクターを含む非ヒト・トランスジェニック動物；
−標的遺伝子の発現を阻害するまたは減少するための、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの使用、
を提供する。

また、本発明は、本発明の細胞または非ヒト・トランスジェニック動物の表現型を、所望の方法で調節することができる薬剤を同定する方法であって、所望の方法で試験薬剤が細胞またはトランスジェニック生物の表現型を調整することができるかどうかについて決定することを含む方法を提供する。

本発明は、
(i)標的遺伝子の転写および／または翻訳の修飾因子；および／または、
(ii)標的ポリペプチドの活性の修飾因子、
を本発明の細胞または非ヒト・トランスジェニック動物において同定するための方法であって、該方法は、試験薬剤が標的遺伝子の転写および／または翻訳、または標的ポリペプチドの活性を調節することができるかどうかを決定することを含む方法をさらに提供する。

また、本発明は：
−本発明の方法によって同定される薬剤または修飾因子；
−本発明の方法によって同定される薬学的組成物、
−本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または細胞、および標的遺伝子の発現を検出しておよび／または定量化するための手段を含むキット；
−本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、薬剤、または修飾因子、および薬剤的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物；
−治療または診断によってヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、薬剤、または修飾因子；
-癌もしくは常染色体優性疾患の治療または予防のための薬物の製造における本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、薬剤またはの修飾因子の使用、
を提供する。

発明の詳細な説明
本願明細書および添付の請求の範囲の全体にわたって、「含有する」および「含む」並びに変異「含有する」、「含有すること」、「含む」、および「含むこと」の語は、すべてを含めて解釈される。すなわち、これらの語は、前後関係が許容する場合、特に詳述されないその他のエレメントまたは整数の可能性のある含有物を伝えることが企図される。「含む」の語が使用される場合、本発明は、本質的に特定されたエレメントから成る態様を包含する。

本発明は、siRNAsを産生することができる種々のポリヌクレオチド、ベクター、および構築物を提供する。構築物は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを意味する。本発明のポリヌクレオチドは、
−RNAポリメーラーゼIIIプロモーター；
−siRNAをコードする領域；および、
−センス鎖に5つの連続したチミン残基を含む転写終結エレメント：
を含む。

RNAポリメラーゼIIIプロモーター
本発明の構築物のsiRNAの発現は、RNAポリメラーゼのプロモーターによって駆動される。このようなプロモーターは、典型的には特定の遺伝子の高レベルの発現を生じさせることができ、RNAポリメラーゼIIプロモーターによって達成可能なレベルを上回って優れていることが多い。この高レベルの発現により、標的遺伝子の高レベルの阻害が達成されることを確認するのを助けることができる。

典型的には、標的遺伝子の阻害のレベルは、対立遺伝子の通常の発現レベルの、または標的遺伝子が異常に発現されている場合には標的としたものの高い発現レベルの、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、ある、さらに好ましくは少なくとも60%である。阻害のレベルは、対立遺伝子の通常の発現レベルの、または標的遺伝子が異常に発現されている場合には標的としたものの高い発現レベルの、60%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上であってもよい。阻害のレベルが特異的に選択されるであろうという事実は、遺伝子ターゲティングおよびその他の従来の変異誘発方法に対する1つの利点であって、遺伝子が完全に不活性にされる場合は、遺伝子阻害の段階的な変化の選択肢を伴わない。したがって、特定の局面については、本明細書において特定される任意の阻害レベル、または適切な阻害レベルを使用してもよい。

本発明の方法を使用するために、特定の阻害レベルが選択されてもよい。たとえば、疾患が遺伝子の減少した発現に関与するが、その遺伝子の発現の全てが無くなっていないことがモデル化されている場合には、阻害のレベルは、疾患症状の減少が見られるものに合うように選択されてもよい。代わりに、特定の遺伝子が高レベルで発現されている一部の治療方法では、その標的遺伝子の発現を完全に阻害するよりはむしろ、その遺伝子の発現レベルを正常レベル発現に戻すことが要求されるであろう。標的のバリデーションおよび薬物スクリーニングのためには、20〜30%、より好ましくは30〜40%、またはより好ましくは40〜50%などの100%より少ない阻害が必要とされるであろう。

本発明の好ましい態様において、阻害レベルは、またはほとんどが100%であり、それゆえに、細胞または生物体は、事実上、いわゆる遺伝子の「ノックアウト」に相当する表現型を有する。しかし、一部の態様において、いわゆる遺伝子の「ノックダウン」に相当する表現型であるように、部分的阻害のみを達成することが好ましい可能性もある。RNAポリメーラーゼIII（pol III）プロモーターは、H1 RNA遺伝子、5S、U6、アデノウイルスVA1、Vault、テロメラーゼRNA、およびtRNA遺伝子を含む種々の遺伝子の発現をつかさどる。pol IIIプロモーターには、3つの主要なタイプ：タイプ1、2、および3がある。タイプ1〜3プロモーターに加えて、エプスタイン・バーウイルスでコードされるRNA（EBER）およびヒト7SL RNAの発現つかさどるものを含むその他のいくつかのpol IIIプロモーターエレメントが報告されている。これらのRNAのポリメーラーゼIIIプロモーターまたはこれらの機能的な誘導体は、siRNAの発現を駆動するために本発明に使用されてもよく、該プロモーターは、典型的にはタイプ3 RNAプロモーターであってもよく、特に最も好ましくは、該プロモーターは、タイプ3 H1RNA遺伝子プロモーターである。好ましくは、H1 RNAの発現をつかさどるRNAポリメーラーゼIIIプロモーターが使用されてもよい。H1 RNAは、ヒトRNAse PのRNA成分である。タイプ3プロモーターは、これらが「外来の」プロモーターであること、換言すれば、特定のエレメントが、タイプ１または2プロモーターの場合などの転写を生じるための転写開始部位の下流に存在することを必要としない点で、これらは自立型であることが好ましい。本発明の特に好ましい態様において、使用されるプロモーターは、外来のプロモーターである。

種々の既知のRNAポリメーラーゼIIIプロモーターと同様に、このようなプロモーターの種々の機能的な誘導体が使用されてもよく、特にH1 RNA遺伝子プロモーターの機能的な誘導体が使用されてもよい。このような誘導体は、RNAポリメーラーゼIIIによって認識されて、転写物を生じることができる。このような機能的な誘導体は、RNAポリメーラーゼIIIプロモーターには重要であることが知られている種々のエレメントの組み合わせを含んでいてもよい。

プロモーターは、操作可能にsiRNAをコードする領域に結合される。典型的には、siRNAをコードする配列は、転写開始部位のすぐ下流にあるか、または20塩基対未満、好ましくは10塩基対未満、より好ましくは5塩基対未満、およびより好ましくは2塩基対未満もしくはそれ以下のように最小の距離で分離されている。

典型的には、使用したRNAポリメーラーゼIIIプロモーターは、3つの連続したシトシン、すなわちCCCを含み、これらは通常プロモーターの最後の3つのヌクレオチドであり、転写は、このCCC配列のすぐ下流で開始する。これは、特にプロモーターがH1 RNA遺伝子プロモーターまたはこれらの機能的な誘導体である場合である。

RNAポリメーラーゼIIIプロモーターに加えて、本発明の構築物は、組織特異的な、または時間的に（時間）特異的な発現を可能とする種々のエレメントを含んでいてもよい。このような組織または時間的に制御された発現を達成する方法は、当該技術分野において既知であり、このような発現を達成するために、これらのいずれを使用してもよい。このような機構を用いて、これにより特異的な細胞種または発生段階において標的遺伝子の阻害を生じさせることができるであろう。これは、治療および発生生物学の両者に、たとえば異常な発現または変異対立遺伝子が特定の細胞種に発現されているだけであるか、もしくはその他の細胞種での発現を破壊させることを望まない場合に、または遺伝子が胚発生もしくは成体生物の成熟の特定の段階で発現されるだけである場合に適用されてもよい。また、成熟した成体の重要な胚性遺伝子の研究をすることもできるであろう。

組織または時間的に制御された方法で遺伝子を破壊するか、または阻害することにより、遺伝子機能の、並びに特異的な細胞種の機能の洞察を得ることができる。遺伝子ノックアウトでは、表現型は重篤であるか、または多くの細胞種に影響を及ぼすことが多く、その結果、治療法の開発に重要であろう所与の細胞種の遺伝子の役割を見分けることは困難である。発生生物学と同様に、免疫系の研究は多数の系統および細胞種に関与しているので、このような方法は、これにも重要であろう。特定の細胞種または系統にのみ必須の遺伝子を破壊することによって、その系統または細胞種を除去することも可能であろう。また、これは動物モデル、スクリーニングおよび標的のバリデーション、並びに除去される系統または細胞種の機能を研究する際にも重要であろう。

転写終結
転写終結エレメントは、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。転写ターミネーターは、siRNAをコードする領域の下流にあり、および好ましくは、該領域をコードするすぐ下流にあるか、または最小の距離で分離されている。

典型的には、終結エレメントは、一連の連続したチミジン、および特にベクターのセンス鎖に5つの連続したチミジン残基を含む。このような転写ターミネーターの利点は、本発明の好ましいプロモーターによって開始される転写物が、通常第2のウリシル（uricil）の後で切断されて2つの連続したウリジンを有する転写物終末を生じるということである。これらのウリジンは、最適の活性のために必要なsiRNAの3'オーバーハングの1つを形成することができる。生じた切断部位およびそれゆえにオーバーハングは、使用したタイプ3 RNAポリメラーゼ・プロモーターのその性質に応じて変更してもよく、一部では、2、3、4、または5ウリジンのオーバーハングを生じると考えられ、特定の系では、選択のオーバーハング（これは典型的には2つのウリジン残基である）を生じるように選択されると考えられる。

siRNAをコードする領域
本発明のポリヌクレオチドは、siRNAをコードする領域を含む。siRNAは、配列が標的遺伝子と同一である二重鎖の領域を含む短い二重鎖RNA分子を意味する。siRNAは、特定の標的遺伝子をサイレンシングまたは阻害することができる。

本発明のsiRNAの阻害作用は、分子の二重鎖の領域によって媒介される。これは、阻害の特異性およびsiRNAが作用する機構に係わっている二重鎖の領域である。ヌクレアーゼとの複合体の形成、引き続く標的RNA転写物とsiRNAの鎖のうちの1つの鎖交換、引き続く全ての転写物の切断は、全て二重鎖領域が関与する。

典型的には、siRNAのdsRNA領域は、その3'末端の1つまたは好ましくは両方ともにオーバーハングを有し、これらのオーバーハングは、好ましくは長さが数ヌクレオチドだけであり、特に長さが1または2つヌクレオチドであり、好ましくは長さが2ヌクレオチドである。好ましくはないが、siRNAは、平滑末端であるか、または5'末端の1つまたは両方に単一ヌクレオチドの5'オーバーハングを有していてもよい。

次いで、3'オーバーハングがジヌクレオチドである状態では、好ましい3'オーバーハングは、ループ構造の最初の2つのヌクレオチドが、好ましくはUUまたはUGであるもの、および常にUUである転写物の最後の2つのヌクレオチドに由来する。本発明の特に好ましい態様において、オーバーハングの1つまたは好ましくは両方ともは、UUである。

典型的には、配列が標的と同一である二重鎖の領域は、ステムループの一本鎖の前駆体から生じる。前駆体は、標的遺伝子のセンス鎖の領域と同一の領域および該第1の領域に相補的であり、それゆえに標的遺伝子のアンチセンス鎖と一致する第2の領域を含む。2つの相補領域は、通常2つの相補的領域がステムループをハイブリダイズするときか、またはヘアピン構造がループを形成するスペーサーと共に形成されているときのように、短いスペーサー領域によって分離される。

典型的には、第1の相補領域のすぐ3'の領域は、2つの連続したウリジン残基を含み、ループ構造を切断することができる。切断は、典型的には2つのウリジン残基に対する3'および第1のものに相補的な領域の直前に起こる。これにより、標的と同一のdsRNA領域を有しかつ活性のために必要なジヌクレオチドの3'オーバーハングを有するsiRNAを生じる。3'オーバーハングを生じる2つのヌクレオチドは、前述の好ましいジヌクレオチドのいずれであってもよい。典型的には、切断は、内在性の酵素によって、および特にdicerの相同体によって行われる。あるいは、構築物は、このような酵素をコードしていてもよい。

典型的には、標的遺伝子と同一配列の領域は、長さが18〜30ヌクレオチド、長さが好ましくは19〜23ヌクレオチド、さらに好ましく長さが21または22ヌクレオチド、およびより好ましくは、長さが21ヌクレオチドである。好ましくは、同一配列の領域は、30塩基を超えない。ステム構造のループは、6ヌクレオチド以上の任意の大きさであってもよい。典型的には、ループ構造は、長さが6〜100ヌクレオチドであってもよく、好ましくは、長さが7〜50ヌクレオチド、より好ましくは長さが9〜20ヌクレオチドである。本発明の特に好ましい態様において、ループは、長さが9ヌクレオチドである。ループおよびそれゆえにコード領域は、転写に影響を及ぼす調節エレメントまたはRNA安定性に影響を及ぼすエレメントなどの種々のエレメントを含んでいてもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、ステムループ構造を有する単一のRNA前駆体からsiRNAを生成するので、これは、相補的な一本鎖のRNAをアニールさせ、次いで最適な実行を確実にするために二重鎖のsiRNAをアニールされない一本鎖のRNAから精製しなければならない、siRNAsを生成するための当該技術分野の多くの方法にとって好ましい。同じ領域を介して転写してセンスおよびアンチセンス転写物を生じる反対のプロモーターを含むプラスミドを使用して、これを再びアニールさせなければならないものよりも効率的である。

本発明は、siRNA自体をトランスフェクトすること、または微量注入することの代わりに、siRNAを発現するためにポリヌクレオチド分子を使用するので、これにより、長期間のsiRNAの発現およびそれゆえに、標的遺伝子の阻害を確実にする。加えて、標的細胞に対するポリヌクレオチドなどのDNA分子の送達は、siRNAを作製し、これを標的細胞に対して導入することよりもかなり簡単に、かつより短時間を費やすだけである。

特定の機構に拘束されることは望まれないが、siRNAは、配列特異的なRNA分解プロセスのガイドRNAとして効果的に作用すると考えられている。siRNAは、ヌクレアーゼと複合体を形成し、続いて標的とされる内在性の遺伝子の転写物と同じ鎖により、siRNAの鎖のうちの1つを交換すると考えられる。これは、siRNAの鎖の1つが放出されて、標的RNAの同じ配列の領域によって置換されることを意味する。鎖交換に続き、おそらく二重鎖領域のそれぞれの末端で転写物が切断される。

二重鎖領域から分離された切断産物は、これらが安定化キャップまたはポリ(A)テイルを欠いているために、迅速に分解される。したがって、この切断により、標的とされた転写物の発現を防止するだけでなく、siRNAおよびヌクレアーゼの初期の複合体を再生させる。これは、再生された複合体が別の標的転写物などを再び不活性化することができることを意味する。本作用機序は、必ずしも標的転写物と比較して、発現されるsiRNAの初期量が過剰である必要はないことを意味する。

好ましくは、siRNAにも存在する標的遺伝子の領域は、エキソン領域である。典型的には、領域は、標的とした転写物の5'末端を向いている。本発明の一部の態様において、いくつかのsiRNAsは、最大限の阻害を確実にするのを助けるために、同じ遺伝子の異なる領域を標的として発現される。異なるsiRNAsが、別々の転写物として発現されることが好ましいが、同じ構築物にコードされていてもよい。また、それぞれの遺伝子に特異的なsiRNAsを発現することによって複数の遺伝子を阻害することができる構築物も提供される。あるいは、それぞれが、特定の遺伝子に特異的な1つまたは複数のsiRNAを発現する複数の構築物を使用してもよい。

同じ経路または重複するファミリーのメンバーのいくつかの遺伝子を阻害するために、複数の遺伝子を阻害することができる本発明の態様を使用してもよい。これは、疾患モデル、標的のバリデーション、創薬、および本発明のその他の適用に重要であろう。複数の遺伝子の阻害は、多因子性障害のモデル化を可能にするであろう。

1つの遺伝子が阻害されるときに、第2の遺伝子が、完全にまたは少なくともある程度第1のものを代償することができることも多い。加えて代償遺伝子または遺伝子類を阻害することによって、これを使用して特定の特性または機能を全く欠いた細胞または生物体を産生することができる。たとえば、特定の基質または基質種をリン酸化することができるキナーゼの全てを無くしてもよく、または胚発生を変化させることもできる。

経路のいくつかの遺伝子が阻害される状態では、これにより、経路の完全な除去を確実にすること、または過剰に望ましい代謝産物などの特定の基質を生じさせるなど、特定の表現型を生じるように経路を設計することができるであろう。経路は、これらを制御するフィードバック機構を有することが多く、これらの一部を、本発明の方法を使用して除去してもよい。

場合によっては、産生された同じsiRNAが、いくつかの遺伝子をターゲットすることができるであろう。このようなsiRNAsは、典型的には遺伝子ファミリーの進化の保存配列などの、2つ以上の遺伝子に存在する配列に特異的である。また、これは、お互いに機能的に代償することができる2つ以上の遺伝子が阻害されてもよいことだけでなく、特定の遺伝子クラスが阻害されてもよいことを意味する。一部の態様において、産生されるsiRNAが、2種の遺伝子間の配列の同一性または相同性により、異なる種の相同遺伝子を阻害することができるように選択してもよい。このような態様は、たとえばsiRNAがウイルス遺伝子などの病原性遺伝子を阻害し、かつ配列が保存されているためにいくつかのウイルス種または株のその遺伝子を阻害することができる場合に有用であろう。

一部の態様において、2つ以上の導入遺伝子が、選択されたときにのみにこれらが活性化されるように、例えば組織特異的な方法で阻害することが要求されてもよい。このような態様では、導入遺伝子には、その全部に存在する特異的な配列でタグをつけ、これらの全てを単一のsiRNAによって阻害してもよい。

本発明の一部の態様において、転写物またはsiRNAの特定の二次構造を確実にすることなどのために、構築物または転写物は、5未満、好ましくは10未満、より好ましくは15未満、より好ましくは20未満のジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、またはヘキサヌクレオチドの反復、より好ましくは25未満のこのような反復を有するなど、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、またはヘキサヌクレオチドの一定数以上の反復を伴う任意のジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、またはヘキサヌクレオチド有していなくてもよい。本発明の一部の態様において、反復数の制限は、特にステムループのループにおける反複数にあてはまり、上述の任意の制限が、ループにあてはまるであろうが、制限は、ステムにおける、または代わりに、ステムループの外側の一本鎖領域などのヘアピンの外側の任意の領域における反複数であってもよい。場合によっては、これらの制限がGCなどの特定のジヌクレオチドまたはAGCTなどの特定のテトラヌクレオチドまたはGAATTCなどの特定のヘキサヌクレオチドに適用することも要求されるであろう。

ポリヌクレオチド及びベクター
本発明のポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドとして、または代わりにベクターの形態で提供されてもよい。好ましくは、これらは、プラスミドなどのベクターの形態で提供される。このようなベクターは、これらを原核または真核細菌系において大量に再生し、次いで標的細胞に導入することができるように、シャトルベクターであってもよい。

多くの適切なベクターが、当該技術分野において既知である。これらは、pBSK、pBR322、pUCベクターなどのプラスミドベクター、pCDNA3.1などの哺乳類細胞において選択することができるマーカーを含むベクター、pREPシリーズのベクターなどのエピソーム複製ベクター、pBABEベクターシリーズなどのレトロウイルスのベクター、アデノウイルス随伴ベクターまたはアデノウイルスベクター含むが限定されない。特に、好ましいベクターは、pBSK（Bluescript）である。

このようなベクターには、種々の選択マーカおよび／またはリポーター遺伝子などを含めることができる。これらは、プラスミドが増殖される細菌系での選択のためだけでなく、トランスフェクトされた、および特に安定にトランスフェクトされた細胞株の選択のために使用されてもよい。トランスフェクトした細胞株を同定するために使用してもよいリポーター遺伝子の例は、アルカリホスファターゼ（AP）、βガラクトシダーゼ（LacZ）、βグルコロニダーゼ（GUS）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、およびルシフェラーゼ（リュック）を含む。可能な抗生物質選択可能なマーカーは、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに耐性を与えるものを含む。siRNAを生成するために転写される本発明の構築物は、二本鎖または一本鎖の核酸であってもよく、構築物が二重鎖である場合が特に好ましい。

本発明のベクターは、細胞のゲノムに組み込むことができるものであってもよい。典型的には、構築物を組み込むために使用することができるウイルスは、pBABEベクターなどのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ付随ウイルスベクター（AAV）を含む。しかし、大部分のプラスミドは、一定の頻度で組み込むことができ、それゆえに、組み込み体（integrant）を生成するために使用されてもよい。あるいは、ベクターは、人工染色体またはエプスタイン・バーに基づいたウイルスなどの染色体外エレメントとして複製することができるものであってもよい。

標的細胞に本発明のポリヌクレオチドを導入するために使用されるベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルス・ウイルスベクター、レオウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどの、ウイルスベクターであってもよい。宿主ゲノムにベクターを組み込むことが要求される態様のためには、レトロウイルスベクターが特に有用である。種々のウイルスベクター、および特にレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターは、当該技術分野において既知であり、これらのいずれを使用してもよい。

本発明の構築物は、種々の方法を使用して標的細胞または生物体に導入されてもよい。ポリヌクレオチドをインビトロで細胞に導入する場合、トランスフェクション、リポソーム、またはウイルスによってなどの従来の技術を使用してもよい。典型的には、電気穿孔法を使用してもよい。また、電気穿孔法は、構築物を胎児に導入するために使用されてもよい。

生物体の場合、従来のいずれの核酸を導入する方法を使用してもよい。ウイルス粒子にパッケージされたウイルス構築物を使用してもよい。たとえば、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レオウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスを使用してもよい。リポソームなどの脂質を媒介した担体輸送を使用してもよい。核酸を含む粒子でのボンバードメントなどの物理的な手段が使用されてもよい。デリバリー方法は、構築物が器官または病気のもしくは炎症の部位などの特定の位置に送達されることを意味してもよい。一部の局面において、構築物は、血液、リンパ、または脳脊髄液に送達されると考えられる。

また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の構築物の転写によって生じる転写物および誘導体を含む。特に、分子は、切断前にステムループ構造を含む。転写物は、生じるsiRNAの特異性に係わる二重鎖の領域を含む。好ましくは、この領域は、ヒトまたはウイルス遺伝子に特異的であり、より好ましくは該領域は、標的細胞のゲノムに存在する、標的遺伝子に特異的であり、より好ましくは標的遺伝子は、宿主細胞ゲノムに存在する内在性の遺伝子であるが、宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子またはウイルス遺伝子であってもよい。したがって、siRNA分子の標的遺伝子は、宿主染色体に存在すると考えられるが、エピソームもしくはプラスミドさえも、または染色体外エレメント、またはウィルスゲノムに存在してもよい。転写物および誘導体は、ステムループの大きさまたはオーバーハングその他など、本明細書で特定した特徴または特性のいずれを有してもよい。本発明の好ましい態様ではないが、本発明の構築物を、本明細書で言及した任意の細胞などの1つの系でsiRNAsを生成するために使用し、次いで標的の系を阻害するまたは調整するために別の系に導入する状況も想定される。

標的遺伝子
標的遺伝子は、その機能を阻害するか、または調整することが要求される任意の遺伝子であってもよい。阻害の目的は、治療的または特定の遺伝子の機能を研究するためであってもよい。商業的に育てられた動物の形質を改善するなどのために、遺伝子を阻害して、いくつかの所望の方法で細胞の表現型または生物体を変化させてもよい。典型的には、標的遺伝子は、真核細胞遺伝子であるが、あるいは標的遺伝子は、真核生物の宿主細胞に発現されているウイルス遺伝子などの原核生物のものであってもよい。標的遺伝子は、ポリペプチドまたは代わりに構造または酵素RNAをコードしてもよい。しかし、好ましくは、標的遺伝子は、ポリペプチドをコードする。

標的遺伝子は、発生に重要な遺伝子であってもよく、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子もしくは分化因子、神経伝達物質、発癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、膜チャネル、またはこれらの成分をコードしてもよい。遺伝子は、受容体および特に本明細書で言及した遺伝子のいずれかの遺伝子産物の1つをコードしていてもよい。標的遺伝子は、アポトーシスに関与するものであってもよい。典型的には、標的遺伝子は、疾患または障害と関連するものであり、本発明の方法は、その疾患または障害を治療する、防止する、または改善するために使用されてもよい。

系は、癌を治療する、防止する、または改善するために使用されてもよい。たとえば、標的遺伝子は、発癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または細胞周期の制御に関係する遺伝子であってもよい。治療され得る癌は、固形腫瘍および白血病（たとえばB細胞白血病、混合細胞白血病、ヌル細胞白血病、T細胞白血病、T細胞慢性白血病、HTLV-II関連白血病、リンパ性の急性白血病、リンパ性慢性白血病、肥満細胞白血病、および骨髄性白血病）、黒色腫、線維肉腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、肉腫（たとえばユーイング肉腫、実験的肉腫、カポジ肉腫、および肥満細胞肉腫）を含む。癌は、骨、胸部、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、中枢神経系、肺、泌尿生殖器系、または前立腺のものであってもよい。腫瘍は、良性でもよく、または悪質でもよく、典型的には、悪性腫瘍である。腫瘍は、一次または二次腫瘍であってもよく、および転移性であってもよい。本発明の薬物は、それらのみで、または化学療法または放射線療法と連動してなど、その他の抗癌治療法と組み合わせて投与されてもよい。標的遺伝子は、病原体がその宿主への侵入、その次の複製または宿主への病原体ゲノムの組込みなどのその他の機能、宿主への感染の確立または伝播、次世代の病原体の構築に係わる病原体または宿主遺伝子のうちの1つであってもよい。遺伝子の阻害は、予防的に（すなわち、防止）または感染のリスクを減少させるため、並びに感染に伴う症状の頻度または重篤さを減少させるために使用されてもよい。

一部の局面において、疾患は、特定の遺伝子の高い発現または不適当な発現によって生じる。たとえば。炎症性疾患または自己免疫性疾患において、特定の遺伝子の不適当な発現は、疾患の発症の一部を担っているであろう。関節炎、肺気腫、成人呼吸窮迫症候群などの条件において、炎症性メディエータ、このようなメディエータのための受容体、接着分子、およびプロテアーゼまたは呼吸バーストなどの殺菌の活性は、生じる組織損傷の重要な部分を担っているであろう。これらなどの遺伝子を阻害するための本発明の方法および構築物を使用することによって、および特に炎症の特定の部位において、これらの症状は、防止され、治療され、または改善されるであろう。このような態様では、阻害を特定の細胞種に限定することができる方法が、特に好ましい。

標的遺伝子は、宿主細胞染色体に存在していてもよく、または代わりにエピソームのエレメントにあっても、もしくはウイルスタンパク質などの細胞に存在する病原体構造と関連して存在してもよい。標的遺伝子は、内在性の遺伝子または導入遺伝子であってもよい。典型的には、標的遺伝子は、哺乳類の遺伝子または代わりにウイルス遺伝子である。標的遺伝子がウイルス遺伝子である態様では、これが宿主染色体に組み込まれてもよく、または組み込まれていないエレメントとして存在してもよい。標的遺伝子は、ウイルス構築物または細胞に導入されたその他の一部のベクター上の遺伝子であってもよい。

多くの態様において、標的遺伝子は、リポーター遺伝子または選択可能なマーカーではないが、このような標的遺伝子も、標的遺伝子の可能性があると想像される。このようなリポータおよび選択可能なマーカーの例は、本明細書で言及したいずれかのもの、および特にβガラクトシダーゼ（LacZ）、βグルコロニダーゼ（GUS）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、またはルシフェラーゼ（Luc）を含む。

対立遺伝子特異的な阻害
本発明のポリヌクレオチドは、特定の対立遺伝子の発現を阻害し、一方でその他の対立遺伝子の通常の発現を可能にするために使用されてもよい。このような態様において、遺伝子の2つの対立遺伝子は、配列に一部の相違を有し、これによりsiRNAによって区別することができる。

多くの障害は、1つの対立遺伝子の変異から生じるが、その他の対立遺伝子は正常である。これらには、常染色体優性の症状、並びにプロトオンコジーンの2つのコピーのうちの1つの変異により、発癌遺伝子およびそれゆえに癌を生じるか、または個体が癌の発病に一段階近くなる場合などの一部の癌を含む。変異した対立遺伝子の発現を特異的にブロッキングすることにより、細胞の残りの野生型対立遺伝子が細胞を正常にすること、または少なくとも癌を後退させること、または症状を改善することができるので、これにより疾患を治療することができるであろう。

このような態様において、標的配列と同一の本発明のポリヌクレオチドの領域は、標的対立遺伝子と同一であるが、他方の対立遺伝子とは配列が異なると考えられる。したがって、たとえば、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または重複を含んでいてもよく、これにより生じたsiRNAは、2つの対立遺伝子を区別することができる。

siRNAは、バーケットリンパ腫またはフィラデルフィア染色体の場合などの染色体の転位置によって発生する対立遺伝子を標的としてもよいが、該遺伝子の野生型対立遺伝子は、いずれも融合に関与しないであろう。

典型的には、配列の相違は、問題の障害に係わる変異であると考えられる。変異は、プロトオンコジーンを発癌遺伝子に変換することに係わるものであってもよい。たとえば、変異は、ras、jun、myc、src、sis、fos、bcl-1もしくは2、またはablなどの発癌遺伝子の1つであってもよい。しかし、場合によっては、配列の相違は、疾患に係わる変異でなくてもよいが、代わりに2つの対立遺伝子を区別することができる多型であってもよい。これは、遺伝形質を決定するために多型はより便利であり得るので、疾患に関与する特定の変異が、治療されるそれぞれの個々で同定される必要がないことを意味し得る。トリヌクレオチド反複の増大を伴うものなどの一部の症状では、唯一の相違が1つの対立遺伝子の反複の重複または増大である変異を特異的に認識することができるsiRNAを生成させることは困難であろう。問題の変異ではなく、遺伝子内の多型に特異的なsiRNAを生成することは、より容易であろう。

典型的には、siRNAにおいて、2つの対立遺伝子間の識別を可能にする配列の変異は、二重鎖領域の5〜10塩基、好ましくは7〜10塩基、より好ましくは二重鎖領域の9または10ヌクレオチドなどの二重鎖領域の中心に、又はその近くに位置するであろう。変異が二重鎖領域の中心にない場合には、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端と中央の間に位置することが好ましい。一部の態様において、変異は、二重鎖領域の終わりに近く、たとえば2、3、または4ヌクレオチド離れている。

一部の状態では、本発明の対立遺伝子特異的なsiRNAsを、遺伝子の両方の内在性の対立遺伝子を阻害し、一方でトランスジェニック対立遺伝子を発現させることが要求される場合に使用してもよい。たとえば、ノックアウトが作製される多くの場合に、変異された遺伝子のトランスジェニック対立遺伝子を導入して、導入遺伝子がノックアウトに伴う表現型を救出することができるかどうかを決定する。これにより、遺伝子の機能解析をおこなうことができる。したがって、本発明のポリヌクレオチドを使用して、遺伝子の両方のコピーの発現を阻害することができるが、トランスジェニック対立遺伝子を阻害することができないsiRNAを生成させる。識別は、トランスジェニック対立遺伝子に導入された特定の多型に基づいていてもよい。好ましくは、このような多型は、アミノ酸の変化を含まないか、または保存的なアミノ酸置換を生じるだけである。また、標的遺伝子の両方の対立遺伝子の発現を阻害し、次いで特定のトランスジェニック対立遺伝子を発現することが要求される治療において、このような方法を使用してもよい。内在性の遺伝子の両方のコピーを阻害することが要求される一部の状態では、2つの対立遺伝子は、それぞれの対立遺伝子を阻害するために別々のsiRNAを使用することができるような特異的な変異または多型を有する。

本発明の系は、特定のスプライスバリアントの発現を選択的に阻害するために使用されてもよい。たとえば、本発明のポリヌクレオチドは、配列同一性を有するエキソンを含む特定のスプライスバリアントをターゲットするが、そのエキソンを欠いているそのままのスプライスバリアントはそのままであるsiRNAを産生してもよい。

標的細胞及び生物体
本発明の系は、種々の細胞および生物体に発現する遺伝子を阻害するために使用されてもよい。また、系は、これらの宿主細胞内の発現またはウイルス遺伝子を阻害するために使用されてもよい。典型的には、系は、真核細胞および生物体、並びに特に哺乳類の細胞または生物体における発現を阻害するために使用される。

標的細胞または生物体は、RNAポリメーラーゼIIIプロモーターを発現することができる任意の生物体であってもよい。生物体は、通常脊椎動物であり、また非脊椎動物または脊椎動物であってもよいが、好ましくは脊椎動物である。好ましくは、標的細胞または生物体は、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、または霊長類起源などの起源の哺乳動物である。本発明の特に好ましい態様において、細胞または生物体は、ヒトである。標的は、ウイルス、および特に宿主細胞に存在するときには、ウイルスであってもよい。

本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが導入されてもよく、または標的遺伝子が発現される細胞は、生殖系列または体細胞、全能性または多能性、分裂するものまたは分裂しないもの、不死化されたものまたは形質転換されたものに由来していてもよい。細胞は、多分化能の細胞または分化細胞であってもよい。好ましい細胞は、造血幹細胞などの幹細胞を含む。標的とされてもよい分化細胞のタイプは、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌または外分泌腺の細胞を含むが、限定されない。細胞は、株化細胞または最近単離した細胞のものであってもよい。標的細胞は、形質転換されてもよく、特にこれらは、癌性および特に悪性の細胞または株化細胞であってもよい。癌は、本明細書で言及した任意のものであってもよい。あるいは、標的細胞は、特定の病原体が感染したものであってもよい。標的遺伝子は、その他の系統に対して、標的細胞で特に阻害されてもよい。

ヌクレオチドまたはベクターは、ポリヌクレオチドが導入された被検者から回収された標的細胞と共に生体外で送達され、次いで細胞を被検者に戻してもよい。任意には、種々の選択段階またはアセスメントを行って、ベクターが組み込まれ、かつ標的遺伝子が阻害されているクローンまたは細胞を選択し、および同定してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドを多分化能の細胞に導入し、該細胞を所望の細胞種に分化させ、次いで治療される被検者に導入してもよい。また、選択および特徴づけの任意の段階で行ってもよい。このような態様は、特定の細胞タイプの全ての標的遺伝子を阻害する必要がなく、発現を阻害する比率が十分である疾患および状態に対して、特に好ましい。このような態様は、また、標的のバリデーションおよび薬物の同定に使用されてもよい。

一部の状態において、ベクターを多分化能の細胞に導入し、次いでこれを多くの異なる細胞種に分化させて、いくつかの異なる細胞種でスクリーニングできることが要求されるであろう。構築物が多分化能の細胞である態様において、これはまた、標的遺伝子が阻害されたときのその細胞の分化および分可能を研究するために使用されてもよい。これにより、遺伝子が分化プロセスにおいて役割を果たすかどうか、およびその場合にはどんな役割を果たすかを解明してもよい。また、これは、標的遺伝子が阻害されたときに、好ましい方法で分化に影響を及ぼすことができる薬剤または治療を同定するために使用されてもよい。

本発明のポリヌクレオチドまたは構築物は、種々の機構を経て標的の細胞または生物体に導入されてもよい。ポリヌクレオチドがインビトロで細胞に導入される場合に、トランスフェクション、リポソーム、またはウイルスによってなどの従来の技術が使用されてもよい。典型的には、電気穿孔法が使用されてもよい。

生物体の場合、核酸を導入するいずれの従来法が使用されてもよい。ウイルス粒子にパッケージされたウイルス構築物が使用されてもよい。たとえば、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルスが使用されてもよい。リポソームなどの脂質を媒介した担体輸送を使用してもよい。核酸を含む粒子でのボンバードメントなどの物理的な手段が使用されてもよい。ポリヌクレオチドは、血管もしくは血管外の循環、血液もしくはリンパ系、または脳脊髄液に導入されてもよい。

遺伝子阻害の測定
本発明の多くの態様において、標的遺伝子の発現をブロッキングする際に、siRNAsの効力を点検することが要求されると考えられる。種々の方法で、典型的にはRNA、タンパク質、または表現型のレベルで、遺伝子の阻害を測定してもよい。

阻害は、ノーザンブロット法、ヌクレアーゼ保護、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（RIA）、その他の免疫アッセイ法、および蛍光標示式細胞分取器（FACS）などの生化学技術を使用して確認してもよい。

標的遺伝子が変異した対立遺伝子であり、阻害の目的は、特異的に変異した対立遺伝子を阻害するが、野生型対立遺伝子を正常に発現させることである場合、一本鎖コンホメーションの多型、変性ゲル電気泳動、対立遺伝子特異的なPCR、または野生型と変異したタンパク質を区別することができる抗体によるものなどの、野生型対立遺伝子と変異された対立遺伝子の発現を区別することができる方法を使用して阻害を評価する。

株化細胞または全生物体の阻害は、そのタンパク質産物が容易にアッセイされるリポーターまたは薬剤耐性遺伝子を使用することによって測定してもよい。このようなリポーター遺伝子および選択マーカーは、本明細書で言及した任意のものを含む。また、阻害は、表現型レベルで測定されてもよい。たとえば、標的とされた遺伝子の破壊に関与するものと同様の表現型の出現を探してもよい。siRNAの目的が疾患に関与する遺伝子の発現を遮断することである場合に、疾患が、siRNAを使用して予防され、改善され、または治療可能であるか否かを測定してもよい。siRNAの目的が感染症を治療することである場合に、ウイルス性または細菌の負荷のあらゆる減少を評価してもよく、またはあるいは、疾患に関連した症状の存在、非存在、または重篤さを測定してもよい。

組込み
本発明の好ましい態様において、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、標的細胞のゲノムに組み込まれる。これは、siRNAの発現が、非組み込みベクターに関連した一過性の発現よりも、恒久的であることを確実にするのを助ける。

典型的には、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞の染色体に組み込まれるが、あるいはヒト人工染色体または宿主細胞で自己の複製および維持が可能なその他のいくつかのエピソームエレメントなどの、人工染色体の形態で導入してもよい。しかし、ベクターまたはポリヌクレオチドは、宿主染色体に組み込まれることが望ましい。

より頻繁に細胞のゲノム内に組み込む特定のベクターが、当該技術分野において知られている。たとえば、本発明のポリヌクレオチドを導入するために使用されるベクターは、レトロウイルスベクターまたは宿主ゲノムに組み込むことができるレトロウイルスに基づいたベクターであってもよい。このような態様のための好ましいベクターは、pBABEベクターなどのレトロウイルスのベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴およびアデノウイルスベクターを含む。pcDNA3.1などのプラスミドベクターもまた組み込まれるが、頻度が低い。

エピソームのベクターは、高レベルでゲノムに組み込みこまれるが、このようなベクターが使用したときに、組み込み体（integrant）は、なおも、通常生じる低いレベルの組込みとして得られるであろう。このような組み込み体（integrant）は、おそらく任意のベクターで作製することができるので、これらがまれに組み込む場合であっても、ほとんどすべてのベクターが、いくらかのレベルで宿主染色体に組み込むと考えられる。組込みを促進するために、照射などの種々の方法が当該技術分野において既知であり、このような方法を使用してもよい。

ポリヌクレオチドは、ランダムな組込みによって宿主ゲノムに組み込まれることが望ましい。あるいは、ベクターまたはポリヌクレオチドは、部位特異的なリコンビナーゼまたはインテグラーゼなどの当該技術分野において既知の方法によって宿主細胞の特定の位置にターゲットして、特定の部位にポリヌクレオチドを組み込んでもよい。これにより、発現許容的にすることまたは宿主細胞への遺伝子の組込みを避けることなどの特定の特徴を有する既知の領域にベクターをターゲットすることができるであろう。

標的細胞へのポリヌクレオチドの標的細胞の導入後、種々の選択および／またはスクリーニング技術を使用してベクターが組み込まれたクローンを同定し、これらをさらに特徴づける。選択可能なマーカーを使用することにより、これは、緑色蛍光タンパク質（GFP）などのリポーター遺伝子の発現を観察することにより、またはG418などの抗生物質での選択によってベクターが組み込まれたクローンを選択することができるであろう。FACSソーティングを使用してGFPなどの特定の標識遺伝子を発現する細胞を回収してもよい。

典型的には、トランスフェクション後、一過性の発現が、薬剤抵抗性またはリポーター遺伝子発現の理由とならないように、十分な期間細胞を培養する。たとえば、選択および特徴づけの前に1週以上、好ましくは10日間、およびより好ましくは2週間、細胞を培養してもよい。

また、ベクターまたはポリヌクレオチドは、細胞において存在するsiRNAを発現することができる領域をそのままにして、選択可能なマーカーまたはリポーター遺伝子を除去することができる手段を含んでいてもよい。たとえば、選択可能なマーカーは、部位特異的なリコンビナーゼの認識部位の側面に位置してもよい。選択されたクローンには、リコンビナーゼを発現することができるプラスミドを一過性にトランスフェクションし、次いでトランスフェクション細胞をまき、クローンから選択可能なマーカーが切除されたものを選択し、または同定してもよい。

本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを組み込んだクローンをさらに特徴づけてもよい。たとえば、サザンブロット法またはPCRを行ってプラスミドを組み込んだことを確認し、組込みの部位および組み込まれたプラスミドのコピー数を決定してもよい。組込みの部位が、内在性の遺伝子またはその他の重要なエレメントでないことを確認するための特徴づけを行ってもよい。ノーザンブロット法またはその他このような技術を実施して、siRNAが発現されているかどうかを決定し、また標的遺伝子が阻害されているかどうかを調べてもよい。標的遺伝子の阻害を測定するための本明細書で言及した技術のいずれを使用してもよく、阻害が特異的であることを確認するためのチェックを行ってもよい。

トランスジェニック生物
本発明のポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現が阻害され、または減少した非ヒト・トランスジェニック生物を作製するために使用されてもよい。トランスジェニック動物は、好ましくはゲノムに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを有し、それゆえに、組み込まれたポリヌクレオチドまたはベクターをその子孫に伝えることができる。しかし、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞が移植され、または伝達された正常な動物を包含する。このような動物は、生体外の治療を含む特定の治療のためのモデルを提供するであろう。

トランスジェニック動物は、動物に導入遺伝子を導入するための当該技術分野において既知の技術によって、特にベクターまたはポリヌクレオチドを卵母細胞の前核に微量注入する前核注射によって作製してもよい。また、トランスジェニック生物体は、電気穿孔法などにより、初期胚に核酸構築物を導入することによって作製することもでき、このような方法を使用して本発明のトランスジェニック生物を作製してもよい。非ヒト・トランスジェニック動物は、トランスジェニック・マウスもしくはラットなどの齧歯類、霊長類、またはヒツジ、ウシ、またはブタなどの商業的に重要な動物であってもよい。好ましくは、生物は、マウスまたはラットである。

本発明のトランスジェニック生物は、動物モデルとして使用されてもよい。あるいは、トランスジェニック生物は、商業的に産生された動物であってもよく、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの導入は、トランスジェニック生物が疾患または病原耐性などの望ましい表現型を有することを意味する。

本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むことに加えて、トランスジェニック動物は、さらなる導入遺伝子を含んでいてもよい。たとえば、トランスジェニック動物は、標的遺伝子の修飾された対立遺伝子および遺伝子の内在性の対立遺伝子に特異的なsiRNAを含んでいてもよい。これにより、導入遺伝子として導入される修飾された対立遺伝子の機能性を評価するための動物モデルが開発されるであろう。

疾患モデル
本発明の方法により、種々の疾患症状および障害のモデルの作製することができる。たとえば、これらを使用して、特定の遺伝子が阻害された株化細胞または生物体を作製してもよい。また、これらを使用して、選択した内在性の遺伝子の両方のコピーが阻害され、かつ内在性の遺伝子の変異された対立遺伝子が発現され、そして常染色体優性症状または癌などの症状を非常にモデリングするモデルを作製してもよい。

本発明の方法を使用して作製されるモデルは、試験薬剤の治療の効力を評価するために使用されてもよい。障害に関連した症状もしくは症候の予防、解放、または回復を測定してもよい。モデルは、ウイルス感染などの感染症のモデルであってもよく、本アッセイ法を使用して、感染を防止することができるかどうか、病原の負荷が減少することができるかどうか、ウイルスの組込みを防止することができるかどうか、またはその他の症候を治療もしくは改善することができるかどうかを判断してもよい。

モデルは、完全な疾患症状であってもよく、または症状の一部であっても、もしくは障害の発生の根底に関与する工程などの症状の段階であってもよい。モデルは、たとえば、遊走、走化性、アポトーシス、脱顆粒、接着、食作用、または本明細書で言及した任意の細胞機能などの障害に重要であると考えられる特定の細胞機能であってもよい。

多数の遺伝子が、特定の障害に関係し、または引き起こすことが知られており、本発明の方法を使用してこれらの遺伝子の発現を調整することにより、同障害を細胞または生物体においてモデル化することができる。種々のノックアウトおよび古典的に生成された変異体のモデルが存在し、問題の遺伝子の発現を阻害することによって同等のモデルを作製してもよい。既存のモデルが1つの種、株、または細胞に利用できるだけであり、同遺伝子またはその相同体を阻害することによって迅速に異なる種、株、または株化細胞のモデルを作製することが要求される場合に、これは特に有用であろう。また、本発明の方法は、面倒かつ冗長な育種プログラムを経なくても同生物体の複数の遺伝子を破壊することもできるであろう。これは、多因子性障害を簡単かつ迅速にモデル化することができることを意味する。

本発明のモデル系の好ましい使用のうちの1つは、スクリーニングおよび標的のバリデーションにおけるものである。したがって、モデルは、たとえばモデル化された症状の治療または予防に有用であろう薬剤を同定するために、薬剤をスクリーニングするために使用してもよい。本発明の同じまたはその他のモデル系において更に詳細にこれらを研究することなどによって、初期のスクリーンから有望な薬剤を評価し、さらに特徴づけてもよい。たとえば、初期のスクリーンは、細胞に基づいたものであってもよく、次いで本発明のトランスジェニック生物の初期のスクリーンから有望な候補薬剤を特徴づけてもよい。

従来のノックアウトの場合に、本発明のモデル系を使用することは、これらを実際の疾患患者に適用する前に治療法を試験し、および評価することができ、またハイスループットスクリーニングの可能性を提供し、その結果様々な多くの候補薬剤をスクリーニングして、治療的な使用およびさらなる評価のための有望な候補を同定することができることを意味している。本発明のモデル系、特にトランスジェニック生物は、また、改善された手術法などの、症状を治療する方法を開発する、改善する、または評価するために使用してもよい。

モデル系は、細胞に基づいていてもよく、また典型的には、症状に重要なまたは症状に影響を及ぼす特定の細胞種を使用してもよい。たとえば、免疫細胞を炎症性障害のモデルに使用してもよく、または癌に対して、癌のタイプに関与する特定の細胞種を使用してもよい。あるいは、モデル化された特定の障害に影響を及ぼす細胞種のもの以外に、使用されている特定のアッセイ法に適していることが知られているその他の細胞種を使用してもよい。

本明細書で言及したいずれの細胞種を疾患モデリングに使用してもよい。細胞種は、多分化能の細胞であってもよく、また異なるタイプの細胞に分化して、スクリーニング、標的のバリデーション、および本発明のその他の適用を、分化プロセス中の細胞を含む多くの系統で実施することが￥可能であってもよい。モデル系は、多くの異なる細胞種を含んでいてもよい。細胞種の相互作用は、たとえばモニターされてもよい。

細胞は、生化学、分子レベル、または機能的レベルなどのさまざまな方法で評価してもよい。これは、さらに下記において論議してある。細胞は、種々の薬剤によって治療されてもよく、または特定の条件にさらされてもよく、これにより疾患症状のモデル化が促進される。本質的に、その発症をトリガーする際に重要であり、またはその後の発症に関与すると思われるものなどの障害に関与する任意の因子が投与されてもよい。また、このような薬剤は、本発明の動物モデルで使用されてもよい。たとえば、物質は、症状に関与する実際の物質または同等の効果を有することができる別の物質であってもよい。たとえば、細胞は、アポトーシス、細胞死、細胞活性化、脱顆粒、トランスフォーメーション、または本明細書で言及したいずれかのものなどのその他の細胞機能を引き起こす薬剤にさらされてもよい。細胞は、特定のアレルゲン、免疫原性物質、または障害に関与するものなどの炎症性メディエータにさらされてもよい。

モデル系は、本発明の非ヒト・トランスジェニック動物であってもよい。あるいは、本発明の細胞は、正常な動物または変異体動物に導入されてもよい。多くの症状で、特定の細胞種または系統が病原に関係している可能性があり、これらが生物体に導入されてもよい。たとえば、免疫系の細胞は、種々の炎症性障害に関係しており、本発明の方法を使用して標的遺伝子が調節された免疫細胞またはこれらの前駆体を、動物に導入してもよい。レシピエント動物は、これに導入される細胞種を欠いていてもよく、たとえば、免疫細胞の場合には照射を受けてもよく、またはSCIDまたは特定の細胞種を欠いていることを意味するその他のいくつかの免疫不全に罹患した動物であってもよい。動物由来の導入される細胞は、その動物から生じていてもよい。

また、モデルの作製は、物理的もしくは化学的な傷害、またはモデル化される障害を繰り返すもしくは誘導するための手術法などの、種々の段階を含んでいてもよい。たとえば、四塩化炭素などの薬剤を使用して、脊髄損傷を誘導されていてもよく、または肝障害が誘導されてもよい。免疫不全は、たとえば特異的な抗原に暴露することによって誘導されてもよい。多くの場合、所望の症状を誘導し、またはモデル化するために、障害を引き起こすことが知られている薬剤または同等の効果を有するものが投与されてもよい。モデルは、ウイルスなどの病原体の感染を含んでもよい。このような方法は、細胞に基づいたもの、および本発明の動物モデルの両方に適用される。

標的のバリデーション、スクリーニング、および種々の治療の開発における使用と同様に、障害の発症のおよび関係する遺伝子の洞察を得るために、本発明のモデルを使用してもよい。どのように疾患が発病するかを決定するために、本モデルを研究してもよい。これらは、障害の候補遺伝子の役割を確認するために使用されてもよい。本モデルは、生化学レベル、分子レベル、遺伝子レベル、または細胞レベルで疾患のより良い理解を得ることができ、それゆえに、新たな治療の合理的なデザインが可能となるであろう。障害に関与する遺伝子の種々の変異対立遺伝子を試験して、疾患表現型をレスキューまたは予防するためにこれらを使用して、遺伝子の特定の部分の必須領域がなんであるか、および遺伝子またはそのタンパク質産物の特定の領域の機能が何であるかを解析することができるかどうかを見てもよい。これらを、遺伝子の特定の部分が酵素活性などの所与の機能を有することを証明するために使用してもよい。

動物または細胞でヒト疾患をモデル化する能力は、ヒト患者由来の試料に対してはできない種々の試験およびアッセイ法を行って、疾患のさらなる理解および治療を生じるのを助けることができることを意味する。これはまた、試料を繰り返し提供しなければならない患者の不便を不要にするのを助け得るし、症状の発病率がまれであり、それゆえに患者試料を容易に入手できない場合に重要である。

スクリーニング及び標的のバリデーション
本発明は、候補薬剤をスクリーニングし、問題の症状を予防し、治療し、または改善することができるものを同定するために使用するための、本発明の細胞または動物モデルの使用を提供するする。また、標的のバリデーションに本モデルを使用して、症状に潜在的に治療的価値を有すると考えられる候補薬剤をさらに特徴づけ、または候補遺伝子が障害に関与することを確認してもよい。

好ましくは、アッセイ法は、ハイスループットアッセイ法である。典型的には種々のマルチエウェルプレートに基づいたアッセイ法などの、多くの試験薬剤をスクリーニングすることができるアッセイ法を使用してもよい。これらは、マルチエウェルで行われる本発明の段階の全てまたは大多数を含んでいてもよく、またはマルチエウェルで行われるアッセイ法の個々の段階を含んでいてもよい。

本アッセイ法は、マルチエウェルプレートで本発明の細胞を増殖すること、または培養すること、これらを試験薬剤と接触させること、次いでこのような特定の表現型を見ることを含んでいてもよい。一部の態様において、表現型は、細胞を観察することにより、または同じプレートを使用するアッセイ系を使用することによって評価してもよい。アッセイ法は、1枚のマルチエウェルプレート内で細胞を増殖させること、次いで典型的には別のマルチエウェルプレート内で、解析するための培養液上清または細胞を除去することを含む。アッセイ法は、マルチエウェル内で本発明の動物に由来する複数の試験試料を解析することを含んでいてもよい。好ましくは、使用されるスクリーニング法は、部分的に、または完全に自動化されていてもよい。マルチエウェルプレートの形式は、特に自動操作によく適している。多くの試料を合理化し、またはスクリーニングする種々の方法は、当該技術分野において既知であり、これらを使用してもよい。

また、表現型の解析などの段階は、自動化され、または工員によって実施されてもよい。得られた結果は、コンピュータによって解析してもよい。種々の標識、および色の変化を使用する技術を使用してもよく、自動操作に適していることが多い。標識は、たとえば酵素、放射性、または蛍光であってもよい。また、PCR、抗体に基づいたアッセイ法、およびELISAなどの技術を使用してもよく、これらにより、多くの試料をスクリーニングすることができ、自動操作の選択肢を示すであろう。モニターされている変化が、転写物またはタンパク質の発現などの遺伝子レベルである場合、マイクロアレイ、チップ、および膜に基づいたアッセイ法などの種々のアッセイ法を使用してもよい。また、FACSを使用してもよい。

試験薬剤は、たとえば反応につき10種の薬剤の初期スクリーンに使用して、所望の表現型を示すこれらのバッチの薬剤を個々に試験してもよい。試験薬剤は、たとえば1nM〜1000μM、好ましくは1μM〜100μM、より好ましくは、1M〜10μMの濃度で使用してもよい。試験薬剤の活性は、問題の症状を治療するために使用される分子によって示される活性と比較しててもよい
本アッセイ法は、所望の薬剤がリポーター遺伝子の、または選択可能なマーカーの発現を引き起こすものであってもよい。また、これにより、多くの試験薬剤のスクリーニングが促進され、所望のクローンを同定することが容易になるであろう。本明細書で言及した任意の選択可能なマーカーおよび既報告の遺伝子をこのような態様で使用してもよい。

試験することができる適切な試験薬剤は、コンビナトリアル・ライブラリー、定義された化学的実体および化合物、ペプチドおよびペプチド擬態、オリゴヌクレオチド、並びにディスプレイ産物（たとえばファージディスプレイ・ライブラリー）および抗体産物などの、天然物ライブラリーを含む。典型的には、有機分子がスクリーニングされ、好ましくは50〜2500ダルトンの分子量を有する小さな有機分子である。候補産物は、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似薬、またはこれらの組み合わせを含む生体分子であることができる。候補薬剤は、合成または天然の化合物ライブラリーを含む多種多様な供与源から得られる。既知の薬理学的薬剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの直接的またはランダムな化学的修飾に供して、構造類似体を作製することもできる。

薬剤は、典型的には、少なくとも10ヌクレオチドの、例えば少なくとも15、20、30、またはそれ以上のポリヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド（単一のものまたは二重鎖のもの）であってもよい。薬剤は、構造的にワトソン‐クリック型塩基対に参加することが可能なユニット（例えばプリンまたはピリミジン）を含むポリヌクレオチドに関する分子であってもよい。薬剤は、典型的には、少なくとも10アミノ酸、例えば少なくとも20、30、50、100、またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドであってもよい。

siRNAによって阻害される遺伝子の変異した対立遺伝子の多くは、本発明の細胞または動物に、細胞または生物体の表現型に導入されてもよい。あるいは、導入された核酸は、siRNAによって阻害されるものとは異なる遺伝子であってもよい。所望の表現型を生じることができる核酸を同定するために、種々の核酸ライブラリーをスクリーニングしてもよい。誘導されたまたはランダムな方法のいずれかで所与の配列から変異体を作製するためになど、スクリーニングするライブラリーを作製するために、種々の変異誘発技術を使用してもよい。試験遺伝子は、遺伝子治療のための候補核酸および最適な配列を同定するために評価した種々の変異体であってもよい。細胞に所与の核酸を送達するための種々の送達方法によって評価してもよい。標的のバリデーション、遺伝子治療、およびその他の治療的な適用では、複数の遺伝子または核酸の投与が多分に必要であろう。複数の遺伝子の発現は、種々の症状の治療のために有利であり得るし、多くの核酸が送達される場合のモデルを作製することができる。

どの薬剤をスクリーニングすべきかを選択するのを助けるために、モデル化されている症状についてのスクリーンでの知識を使用してもよい。たとえば、スクリーニングのための候補薬剤は、合理的なデザインによって選択されてもよい。合理的な薬物デザイン（RDD）方法は、有用な医薬品の発見プロセスを加速する。RDDは、典型的には、タンパク質の構造を利用できる理想的な場合から、小さな有機治療物をデザインおよび最適することを含む。RDDは、分子グラフィックスおよび模倣技術などの技術を使用してもよい。RDDは、標的分子、適切な大きさおよび形態を有する架橋断片、または有利な向きで官能基を支持することができる枠組み構造の特定の部位と相互作用することができる小分子断片を同定するために、大規模なデータベースの三次元検索を使用してもよい。三次元ファルマコフォア仮説または定量的構造-活性モデル（QSAR）を開発し、これを一定の寛容性の範囲内で仮説に合う構造について三次元のデータベースを検索するための検索照会または予測式に変換してもよく、または新しい化合物の活性を予測するために、QSARモデルを使用してもよい。潜在的に新たなリードを同定するためのクラスター解析並びに二次元および三次元類似検索技術を使用してもよい。

本発明の細胞または生物体の表現型をモニターする能力は、本発明の種々のスクリーニングおよび標的のバリデーション方法において重要である。したがって、発生由来の特定の表現型を阻止すること、これに発生を生じさせること、またはこれに退行を生じさせてより正常な表現型にすることなどの、試験薬剤が細胞または生物体の表現型を調節する能力を、たとえば治療的なまたは診断の使用のためなど、望ましい薬剤または方法を同定するためにモニターしてもよい。

本明細書で使用されるものとして、表現型の用語は、細胞または生物体の遺伝子構造と環境との間の相互作用によって生じるその特徴をいう。問題の表現型は、典型的には、本明細書で言及したいずれのものも含む特異的な障害または感染のいずれかの徴候である。あるいは、特定の表現型は、特定の細胞種または生物体における望ましい産物の収率の増大などの、獲得することが望まれる一部の望ましい非疾患関連の表現型であってもよい。

表現型の用語は、生化学レベル、分子レベル、細胞レベル、組織レベル、器官レベル、発生レベル、認識レベル、または行動レベルでのものなどの特徴を含むことが企図される。評価される表現型は、傷害、外傷、または化学的または物理的な傷害により生じるものであってもよい。評価は、siRNAによってターゲットされたもの以外の、特定の遺伝子の発現が候補薬剤によって調節されるかどうかを見るためなどの、遺伝子レベルであってもよい。受容体、シグナル伝達タンパク質、膜チャネル、または酵素の活性をモニターしてもよい。たとえば遊走、接着、脱顆粒、食作用、アポトーシス、分化、および走化性などの特定の細胞機能をモニターして、任意の変化を観察してもよい。細胞のトランスフォーメーションまたは癌に伴う特徴の穫得を生じうる表現型としてモニターしてもよい。多くの遺伝子について、特定の障害または感染症の症状の徴候および関連した表現型が、障害の根本病因であり得るとして知られている。これは、研究される特定の特徴が、このような知識を基礎として選択されてもよいことを意味する。表現型は、本明細書で言及した疾患、障害、感染、症状、または状態のいずれに関連したものであってもよい。

表現型の評価は、動物モデルで行われてもよい。細胞に基づいたアッセイ法で有望な候補薬剤を同定するために、これを初期スクリーンの後に行ってもよく、または一次スクリーンであってもよい。ウイルスの負荷、感染力、予防、回復、または感染の治療などの感染性の疾患および特徴のうちの1つであろう動物モデルを測定してもよい。好ましくは、測定される特徴は、疾患に対して最も重要であるもの、およびその予防が疾患の患者の症状を改善するであろうものであってもよい。

腫瘍発症に対する本発明の動物モデルの感受性をモニターしてもよい。これらは、動物で生じたものでも、またはこれに移植されたものでもよい。1つの部位から別の部位への腫瘍の転移をモニターしてもよい。腫瘍が実際に悪性腫瘍であるか、または転移性になる前の初期段階のものをモニターしてもよい。発生障害および特に胎児のものをモニターしてもよい。このような場合、適切なものなどの、発生の種々の段階の動物から胎児を採取してもよい。偽妊娠の雌に胎児を戻すために使用されるであろう胚移植などの技術を実施して、その後の発生をモニターしてもよい。

疼痛刺激に対する動物の行動反応をモニターするための任意の適切なアッセイ法を使用して、疼痛をモニターしてもよい。対照反応は、候補薬剤の投与前に動物を試験することによって決定してもよい。学習または認識能力は、メーズなどの方法を使用して評価してもよい。攻撃行動をモニターしてもよい。モデル生物体がその若者をうまく育て、および世話する能力を測定してもよい。

本発明のスクリーニングおよび標的のバリデーション方法において、標的遺伝子の阻害を伴わない細胞または動物などの種々の対照には、薬剤が投与されず、または偽薬を与えた。ポジティブ対照は、改善することが要求されている既存の修飾因子を含んでいてもよい。

通常、表現型を阻害するか、または増強する場合、試験薬剤は、表現型に影響を及ぼすことが考えられ、例えば、表現型の発現は、対照と比較して少なくとも5%、例えば少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、または好ましくは少なくとも30%、例えば少なくとも40%、少なくとも50%、より好ましくは、少なくとも70%、たとえば少なくとも80%、または少なくとも90%まで増大または減少されるであろう。本発明の好ましい態様において、試験薬剤は、異常な表現型を正常なものに変えるまたは異常な表現型の発生を防止することが可能である。薬剤は、疾患に伴う特異的な症状を減少し、または無くすであろう。

本発明の方法は、候補遺伝子が特定の症状、表現型、または機能に実際に関与することを確認するために使用してもよい。たとえば、候補遺伝子は、遺伝子（既知の遺伝子（既知の疾患遺伝子など）に対するその相同的により、または機能に基づいた遺伝子クローニングストラテジーを使用して、いくつかの遺伝子を含む特定領域についての遺伝子マッピングに基づいて同定されるであろう。該遺伝子は、その発現により障害に変化があるもののうちの1つであるので、これが候補として同定されるであろう。

次いで、候補遺伝子が実際に問題の機能に関与しているかどうかを、本発明の方法を使用して遺伝子を阻害することによって確認してもよい。次いで、たとえば、本明細書に記載されたいずれかの方法により、またはこのような機能を評価するための当該技術分野において既知のアッセイ法を使用するなどして、生じる細胞または生物体の表現型を研究してもよい。特徴は、たとえば、生化学レベル、分子レベル、遺伝子レベル、細胞レベル、または生物体レベルのものであってもよく、これは、本明細書で言及したいずれのものであってもよい。細胞の場合、研究される特徴は、典型的には、生化学レベル、分子レベル、遺伝子レベル、または細胞レベルであってもよい。

生物体の場合、特徴は、生化学レベル、分子レベル、遺伝子レベル、または細胞レベルであってもよく、またはたとえば、生物レベルまたは系レベルであってもよい。特徴は、行動に関するもの、もしくは認識に関するものであってもよく、または、これは疾患に伴う症状であってもよい。典型的には、作製したモデルが、問題の疾患を反映するかどうかが調査される。

場合によっては、候補遺伝子は、特定の症状には適合しないかもしれない。たとえば、候補遺伝子は、既知の疾患に相同性を有するかもしれないが、障害に実際に関係するかどうか、およびその場合は、どの障害であるかは、既知ではないかもしれない。本発明の方法を使用することにより、遺伝子が何の機能を担うか、およびもしあれば、それが役割を果たしている障害を解明されるであろう。これにより、症状において役割を果たす特定の遺伝子を同定してもよい。場合によっては、遺伝子は既知でもよいが、このような障害に関係していることは以前には知られておらず、これが、その症状のための新たな治療標的を提供するであろう。

ライブラリー
また、本発明のベクターは、siRNAsの大規模なコレクションを作製して、生物学的に関連した経路で作用する遺伝子のゲノムワイドなスクリーンを行うために使用することができる。したがって、本発明を使用して、siRNAsのライブラリーを作製することができる。このようなライブラリーを使用する遺伝子「機能喪失表現型」スクリーンにより、薬剤開発の候補である新規の治療標的が得られる可能性があり、または生物反応に対する限定された数の候補遺伝子の貢献を評価するために使用してもよい。

cDNA発現ライブラリーを使用する表現型遺伝子スクリーンは、細胞行動を調整するために優性の様式で作用する遺伝子の選択のために非常に良好であった。siRNA遺伝子ライブラリーにより、初めて、哺乳類の系で機能損失表現型についてゲノムワイドに評価することができる。これは、劣性変異のホモ接合体の同等物を作製し得ることを意味する。

本発明のsiRNAベクターに挿入される配列は、あらゆる既知の遺伝子およびあらゆるEST、またはこれらの実質的部分のための、本発明のsiRNAの二重鎖領域について本明細書で特定した長さ（典型的には19mersなど）のユニークな短いヌクレオチド配列について、適切なデータベースをスクリーニングすることによって、インシリコで選択することができる。ユニークな短いヌクレオチド配列のコレクションは、これが本明細書に記載した特徴的なステムループ構造を形成し、次いでsiRNAベクターに発現され、かつsiRNAベクターに挿入されるように、より長いオリゴヌクレオチドの一部として合成してもよい。

このようなライブラリーは、ヒト細胞系で使用するためのヒト遺伝子配列に、または本明細書で言及したものおよび特に哺乳類の起源のもののいずれかのような種で、または代わりにウイルス起源などの病原体起源のものに基づいていてもよい。

siRNAsのライブラリーは、適切な細胞システムに導入することができ、細胞の反応をモニターすることができる。本明細書で言及したアッセイ法のいずれを使用して細胞をモニターしてもよい。生物系の性質に応じて、反応の変化を示す細胞を、種々の方法で同定することができ、同定された細胞種に発現されたsiRNAは、ベクター特異的なプライマーを使用する特異的なsiRNAインサートのPCRに基づいた増幅を含むいくつかのストラテジーによって回復させることができる。

薬物療法
本発明のスクリーニング法を使用して同定される種々のポリヌクレオチド、ベクター、株化細胞、および薬剤は、治療または診断によるヒトまたは動物体の治療方法に使用してもよい。これらは、特定の疾患症状または感染症状を予防する、治療する、改善する、または診断するために使用してもよい。

疾患症状は、本明細書で言及した可能性のある標的遺伝子に関するもののいずれであってもよい。これらは、遺伝されるか、または生物体の体細胞系裂または生殖系列の組織の優性変異から生じる優性変異を含む任意の症状であってもよい。これらは、また、標的遺伝子の異常なまたは不適当な発現によって生じる症状であってもよい。

症状は、癌、特に悪性癌および特に転移性のものであってもよい。癌は、本明細書で言及したいずれのものであってもよい。症状は、炎症性障害または自己免疫性の障害であってもよい。症状は、発生障害であってもよい。それは、遺伝される常染色体優性の症状であってもよい。また、感染症、特にレトロウイルス疾患および特にHIVなどのウイルス性疾患を治療し、または予防してもよい。

本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または薬剤は、薬学的技術においてルーチンの標準的な薬剤的に許容されるキャリアおよび／または賦形剤と共に処方されてもよい。たとえば、適切な薬剤を、注射のために生理食塩水または水に溶解してもよい。製剤の正確な性質は、投与される本発明の特定の薬剤および所望の投与経路を含むいくつかの因子に、悪く依存する。適切な製剤のタイプは、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania,17th Ed. 1985に完全に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。

治療的な実体は、経口、頬側、肛門、肺、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、局所的、またはその他の適切な投与経路などの腸内または非経口的経路によって投与してもよい。

本発明の治療的な分子または薬剤の治療的に有効な用量が、患者に投与される。用量は、種々のパラメータに従って、特に、使用される薬剤；治療される患者の年齢、重量、および症状；投与経路；および必要とされる措置に従って決定してもよい。医師は、任意の特定の患者に対する投与および用量の必要とされる経路を決定することが可能である。典型的な１日量は、治療される被検者の特異的な修飾因子、年齢、重量、および症状、変性症のタイプおよび重篤さ、並びに投与の頻度および経路に従って、体重のkgあたり約0.1〜50mgである。好ましくは、毎日の用量レベルは、5mg〜2gである。

本発明の核酸の場合、これらは、利用できるいずれの技術によって投与してもよい。たとえば、好ましくは、皮内に、皮下に、または筋肉内に、核酸を針注射によって導入してもよい。あるいは、核酸は、粒子を媒介した遺伝子送達などの核酸送給装置を使用して、皮膚全体に直接送達してもよい。核酸は、皮膚に、または粘膜の表面に、例えば鼻腔内、経口、腟内、または直腸内の投与によって局所的に投与してもよい。

核酸構築物の取込みは、既知のいくつかのトランスフェクション技術、たとえばトランスフェクション薬剤の使用を含むものによって増強されてもよい。これらの薬剤の例は、陽イオン性の薬剤、たとえばリン酸カルシウムおよびDEAE-デキストラン、並びにリポフェクタント、たとえばリポフェクタムおよびトランスフェクタムを含む。投与される核酸の用量は、変更することができる。典型的には、核酸は、粒子を媒介した遺伝子送達のためには、1pg〜1mg、好ましくは1pg〜10μg、およびその他の経路のためには10μg〜1mgの核酸の範囲で投与される。

以下の実施例は、本発明をさらに例証する。

実施例1
哺乳類細胞内に合成の短い干渉RNA（siRNAs）を導入することにより、特定の遺伝子の発現を有意に抑制することができる。しかし、この遺伝子発現の減少は、過渡的である。

この限界を克服するために、合成siRNA様の転写物（pSUPER、suppression of endogenous RNA）に向けた、pSUPERと名付けられた発現ベクターを作製した。pSUPERベクターは、pBSKII+（Bluescript）プラスミドをEcoRIおよびBgLIIで消化し、これをH1-RNA遺伝子プロモーターのPCR産物に結合することによって作製した。

NCBIデータベースのアクセッション番号X16612で利用可能なヒトHlRNA遺伝子配列を使用した。genbank配列のヌクレオチド146〜ヌクレオチド374までのH1 RNA遺伝子プロモーター配列（EcoRI制限酵素切断部位）をクローン化してpSUPERベクターを作製した。ベクター内のH1 RNA遺伝子プロモーターの最後の3ヌクレオチドは、CCCであり、転写は、H1 RNA遺伝子のこのCCC配列のすぐ下流で開始する。それ自体として、CCC配列は、プロモーター構築物の関連した部分である。終結配列は、5つの連続したT残基の配列であり、ベクター内のプロモーターの下流にPCRによって付加した。

基礎pSUPERベクターの略図を図1(a)に記載してある。H1 RNAプロモーターを、該遺伝子特異的なターゲティング配列（典型的には、同配列の逆の相補体に由来する短いスペーサーによって分離された標的転写物からの19ヌクレオチドの配列）および終結シグナルとしてのベクターのセンス鎖の5つのチミジン（T5）の前に、クローン化した。次いで、siRNAsを生じることができる種々のステムループ構造を発現するように、基礎pSUPER構築物を修飾した。

Cdh1遺伝子の一部と配列が同じ19ヌクレオチドの領域を含む、3種のpSUPER構築物、pSUPER-Cdh1A、B、およびCを作製した。図1（b）は、構築物から作製したCDH1をターゲットするために使用される合成SiRNAおよび3つの構築物A、B、およびCからの3つのpSUPER-Cdh1転写物の予測される二次構造を表す。構築物は、90%以上のトランスフェクション効率を与えるAgami, & Bernard.Cell 102, 55-66 (2000)に記載されているプロトコルを使用してMCF-7細胞にトランスフェクトした。示したDNA構築物からの1μgと、1.5μgのSiRNAを細胞にトランスフェクトした。60時間後、全細胞抽出物を調製し、10%のSDS-PAGEで分離して、免疫ブロットしてCDH1タンパク質を検出した。抗サイクリンD1抗体による免疫ブロットを、タンパク質充填の対照として使用した。図1(c)は、生じたウエスタンブロットを示す。レーンには、左から右に、GFPを発現する対照プラスミド、Cdh1-siRNA、空のpSUPER構築物、転写物A、B、およびCを発現することができる3種のpSUPER構築物、並びに最後に空のpSUPERをトランスフェクトした細胞由来の細胞抽出物を充填してある。

結果は、ステムループ構造を有し、該ループが9ヌクレオチドの長さである転写物Bを発現することができるpSUPER-Cdh1B構築物は、90%までのCdh1発現を除去することができ、合成siRNAのトランスフェクションと同等の阻害レベルを達成することを示す。生じる転写物が、7ヌクレオチドのループを有するpSUPER-Cdh1A構築物は、Cdh1発現の一部の阻害を生じるが、ループ構造が5ヌクレオチドであるpSUPER-Cdh1C構築物は、不活性である。これは、siRNAを作製する際にステムループ構造のループの大きさの重要性を強調する。

重要なことに、合成CDH1 SiRNAのトランスフェクションでも、SiRNA発現ベクターの導入でも、細胞の生存または細胞周期プロフィールに対してどのような任意の有害効果も有さなかった（データ示さず）。

また、U20S細胞に、合成siRNA、空のpSUPERベクター、pSUPER-Cdh1B構築物のいずれかを上記の通りにトランスフェクトした。総RNAを60時間後に抽出した。30μgのRNAを11%の変性ポリアクリルアミドゲルに充填して、分離し、Leeら、Cell 75, 843-54 (1993)に記載されたとおりに³²Pラベルされたアンチセンスの19ntのCdh1標的オリゴヌクレオチドでプロットし、およびPhophorImagerによって視覚化した（4時間の照射）。また、ブロットをセンス鎖によってプローブした。RNA充填の対照として、対象の5S-RNAバンドを臭化エチジウム染色によって検出した。生じるブロットを図1（d）に示してある。ブロットは、pSUPER-Cdh1B構築物によってsiRNA分子自体と同じサイズのRNA分子を生じており、ヘアピンループが切断されてsiRNA分子生じたことを示している。

実施例2
本発明の方法のp53を阻害する能力を評価した。腫瘍抑制因子p53は、電離放射（IR）に続いて安定化され、DNA損傷に続く細胞周期のG1停止の維持において重要な役割を演ずる転写制御因子である（Agami & Bernard, supra andPluquet, & Hainaut, Cancer Lett 2001,174, 1-15)）。

図2(a)に示した転写物を生じることができるpSUPER構築物のpSUPER-p53を作製した。また、ベクターは、p53遺伝子の領域と同一配列の19ヌクレオチド領域およびその領域の相補体を含む。

MCF-7細胞には、spSUPER-p53の量を増加してトランスフェクトした。トランスフェクションの60時間後に、細胞に照射を受けさせ（+IR、20Gy）または未処置のままにし、2時間後に回収して、10%のSDS-PAGEで分離した。抗p53抗体による免疫ブロットを行い、並びにタンパク質充填の対照としての役割を果たすブロットを行った。得られた結果を図2(a)に示した。p53タンパク質および充填対照に対応するバンドを示してある。pSUPER-p53構築物または空のpSUPERをトランスフェクトした細胞をフローサイトメトリーによって解析した。Agami & Bernards(上記)にて記載されたとおりに、MCF-7細胞をトランスフェクトし、60時間後に照射を受けさせ（+IR、10Gy）、24時間後にDNA含量を解析した。得られた結果は、図2（b）に示してあり、G1相のDNA含量を有する細胞を矢印で示してある。

得られた結果は、0.5μgほどのpSUPER-p53のトランスフェクションにより、p53タンパク質を非常に低レベルに減少し、IRに続くその誘導が完全に防止されたことを示した。ベクターをトランスフェクトした細胞が照射を受けたときに、これらは、24時間以内にG1またはG2のいずれかに停止され、極めて少しの細胞がS期のままであった。対照的に、pSUPER-p53をトランスフェクトした細胞は、ほぼ完全にこれらのp53依存的なG1停止を無くすが、p53非依存的なG2/M停止（図2b）を確立することが可能であった。これらの結果は、DNA損傷反応におけるp53の機能を無くす程度まで、pSUPER-p53ベクターが内在性のp53を抑制することができることを示す。

また、トランスフェクション細胞を顕微鏡観察によって研究した。図2(c)は、1μgのpSUPERベクターおよび0.1μgのpBabe-puroプラスミドをトランスフェクトして、48時間後に1μg/mlのピューロマイシンで12日間選択した細胞を示す。プレートを照射（20Gy）し、4時間後に固定して、p53を検出するために染色した。また、同じコロニーの位相差像も示してある。左右のイメージは、2種の異なるコロニーのものである。

実施例3
本発明の方法が特定の対立遺伝子の発現を抑制する能力を評価した。

CDH1の19ntの標的認識配列を変異されて、ステムの位置9または2の1塩基対に置換を入れた。図3(a)に示した各々の転写物を発現することができる構築物を作製し、変異を太字で強調した。

前記のとおり、U20S細胞に、正確にトランスフェクトした。細胞全体の可溶化液を60時間後に調製し、10%のSDS-PAGEで分離して、抗Cdh1抗体での免疫ブロッティングによってして解析した。サイクリンD1タンパク質は、均等に充填したことを示すために使用した。得られた結果は、図3（b）に示してある。空のpSUPERを対照として構築し、同様にトランスフェクション効率を決定するために、GFPを発現することができる構築物を構築した。得られた結果は、Cdh1遺伝子の19のヌクレオチドの領域に完全な配列同一性を有するsiRNAを生成することができる構築物は、siRNAと同程度の効率でCdh1の発現を阻害することができるが、点変異を有する構築物は、どちらも発現を阻害することができなかったことを示す。これは、本発明の構築物が同じ遺伝子の2つの対立遺伝子を区別して、1つの対立遺伝子の発現を阻害し、一方でその他のものの発現を正常にすることができることを意味する。

実施例4
本発明の方法が、さらなる遺伝子CDC20の発現を阻害する能力を評価した。

図4は、CDC20発現を阻害するために利用したSiRNAの配列および予測されるpSUPER-CDC20の転写物を示す。示したSiRNAsおよびプラスミドを、上記の通りにMCF-7細胞にトランスフェクトした。全細胞抽出物を10%のSDS-PAGEで分離し、免疫ブロットしてCdc20およびサイクリンD1タンパク質を検出した。結果は、CDC20に対する構築物が所望の遺伝子を阻害し、更にpSUPER-Cdh1-B構築物のトランスフェクションでは、CDC20発現に対して効果を有していなかったので、この阻害が特異的であり、dsRNAに対する単に非特異的な反応ではないことを示す。

実施例5
p53 mRNAの安定度に対するpSUPER-p53ベクターの効果を検査した。MCF-7細胞をpSUPER-p53またはベクターで電気穿孔し、総RNAを48時間後に抽出した。30μgのRNAをアガロースゲルで分離し、ブロットして、³²pラベルされたp53特異的なプローブによってプローブした。充填の対照として、リボソームRNAの対照をブロットを臭化エチジウム染色によって視覚化した。得られたノーザンブロットおよびゲルRNA充填の対照は、図5(A)に示してある。pSUPER-p53ベクターをトランスフェクトした細胞は、空のベクターpSUPERをトランスフェクトした細胞と比較して、実質的に減少したp53 mRNAレベルを有する。

ステム-ループ転写物によって媒介されるsiRNA干渉は、レトロウイルスベクターから発現させることができる。ピューロマイシン標識遺伝子を発現する自己不活性化レトロウイルスベクター（pRETRO-SUPER）を、記載したとおりに、空のpol-Eプロモーターまたはp53をターゲットするもの（図2Aを参照）のいずれかを含むようにクローン化した。自己不活性化レトロウイルスベクター（MSCVpuro）をEcoRIおよびXhoIで制限酵素消化し、これを同じ酵素で消化した適切なpSUPERプラスミドからのインサートとライゲーションすることによって、ベクターpRETRO-SUPERを構築した。

エコトロピック受容体を含むU2-OS細胞には、これらのベクターを3回感染させて、1日後に、1g/mlのピューロマイシンにより4日間細胞を選択して、ガラススライドにまいた。1日後に、スライドに照射し（20Gy）、4時間後に固定して、抗p53抗体で染色した。FITC-結合二次抗体による免疫蛍光を、同じ視野の位相差と共に示してある。両写真は、同じ設定のカメラおよび顕微鏡を使用した。生じる写真は、図5（B）に示してある。

pRETRO-SUPERの略図は、ベクターに存在する種々のエレメントを示す図5(c)に示してある。

より効率的な短い干渉RNAの送達を達成するために、pSUPERカセットを有するレトロウイルスが、遺伝子サイレンシングを媒介するかどうかを試験した。実施例2に記載したp53ノックダウンベクターからの全pSUPER発現カセットを、自己不活性化pMSCV-puroレトロウイルスベクター内にクローン化した。マウス幹細胞ウイルス（MSCV）の3'LTRは、内部(NheI-Xbal)を欠失することによって不活性化し、自己不活性化ウイルス（ΔLTR）を作製した。このベクターから作製されるウイルスのゲノムへの組み込みにより、3'ΔLTRが5'LTRに複製されて、全てのLTRのエンハンサ-プロモーター活性を欠いたプロウイルスを生じる。生じるベクター、pRETRO-SUPER-p53（pRS-p53）は、図7Aに示してある。

このベクターおよび対象pRETRO-SUPERベクターから、ウイルス系統を作製し、マウスのエコトロピック受容体を発現するU2-OS細胞に感染させるために使用して、エコトロピックウイルスに感染させることができる。感染後、細胞を薬物選択して、p53タンパク質に対する免疫染色を行った。図7Bは、pRS-p53ウイルスに感染した大多数の細胞が、p53に対して弱く染色されるだけであったが、pRS-対照感染細胞の全てが、明らかな核でのp53染色を示した。予想通りに、対照アクチンタンパク質の赤色染色も、両方のポリクローナル集団で同じであった。これらの細胞のウエスタンブロット解析により、pRS-p53ウイルス感染によって媒介される明らかなp53発現の抑制を確認した（図7C）。これと整合して、プローブとしてのセンス19ntのp53標的配列によるノーザンブロット解析では、pRS-p53構築物のみによって、生じた21-22ntのsiRNAsが検出された（図7D）。

RNAウィルスがRNA干渉に感受性であることは、最近示された（Gitlinら、Nature 26,26 (2002); Novinaら、Nat Med 8,681-6. (2002); Jacqueら、Nature 26,26 (2002)）。それにもかかわらず、pRS-p53によって産生される全長レトロウイルスの転写物は、ウイルスによってコードされるsiRNAsによってターゲットされるp53配列を含むという事実にもかかわらず、pRS-p53(10⁶/ml)の高力価のレトロウイルス上清が得られた。明らかなことに、全長レトロウイルスの転写物では、自らに与えたRNA干渉の犠牲にはならない。1つの可能性のある説明は、レトロウイルスの転写物内にその相補配列を有するp53標的配列の分子内塩基対形成が、siRNAの認識を排除するということであろう。あるいは、ウイルス外殻におけるレトロウイルス転写物の迅速なパッケージングによって、全長転写物がRNA干渉に比較的耐性になるのかもしれない。どのような説明であれ、これらの結果は、ヒト細胞において効率的なpSUPERカセットの組み込みを媒介し、遺伝子発現を抑制するためのsiRNAsの合成に向けるために、レトロウイルスベクターを使用することができることを示す。

実施例6
ヒト癌細胞における腫瘍化表現型に対する発癌性RAS発現の阻害の効果を研究するために、内在性の変異体K-RAS^V12対立遺伝子の発現を、ヒト膵臓株化細胞CAPAN-1のpSUPERベクターでターゲットした（図8A)。特に、変異体K-RAS^V12対立遺伝子をターゲットするために、変異体K-RAS癌遺伝子のバリン12をコードする領域にわたる19ntのターゲティング配列をpSUPERベクターにクローン化し、pSlJPER-K-RAS^V12を得た。pS-K-RAS^V12を作製するために使用した2オリゴは、以下の通りである：
5'gatccccGTTGGAGCTGTTGGCGTAGttcaagagaCTACGCCAACAGCTCCAACtttttggaaa3'、
および、
5'agcttttccaaaaaGTTGGAGCTGTTGGCGTAGtctcttgaaCTACGCCAACAGCTCCAACggg3、
'であって、
19ntのK-RAS^V12標的配列は、大文字であり、K-RASのアミノ酸12にグリシン-バリン置換を生じるG-T変異は、太字である。これらのオリゴをアニールさせて、BglIIおよびHindIIIで消化したpSUPERベクターに適合する末端を有するインサートを作製した。図8Bは、pSUPER-K-RAS^V12を一過性にトランスフェクトしたCAPAN-1ヒト膵癌細胞が内在性のK-RAS^V12発現の有意な抑制をもたらしたが、対照サイクリンDタンパク質は影響を受けなかったことを示す（図8B）。

次いで、pSUPER-K-RAS^V12カセットを実施例5のpRETRO-SUPERレトロウイルスベクターにクローン化した。次いで、pRS-K-RAS^V12ウイルスを使用して、マウスのエコトロピック受容体を安定に発現する（レトロウイルスを感染させるために）CAPAN-1細胞に感染させた。親のpRSおよびpRS-p53ウイルス株を対照感染のために使用した。薬物選択に続いて、抗K-RAS特異的抗体によるウエスタンブロット解析では、pRS-K-RAS^V12が感染したCAPAN-1細胞のK-RAS^V12発現は、対照感染と比較して著しく抑制されたことを明らかになった（図8C）。

次に、ターゲティング構築物の特異性を、wtK-RASの発現を検査することによって試験した。2つの野性型K-RAS対立遺伝子を内因的に発現するが、発癌性H-RAS^V12を含まないEJ細胞を使用した。ウエスタンブロット解析により、これらが、CAPAN-1細胞に対して使用したものと同じpRS-K-RAS^V12、pRS-p53、またはpRSレトロウイルス株感染したかどうかにかかわらず、かなりのレベルのwt K-RASタンパク質がEJ細胞に発現されたことが明らかとなった（図8D、レーン1、3、4、6）。対照的に、p53発現は、EJおよびCAPAN-1細胞種の両方で、pRS-p53によって同様に抑制され、EJ細胞が感染しないか、またはRNA干渉のために必要な成分を欠いていたという可能性を除外した（レーン2および5）。したがって、pRS-K-RAS^V12レトロウイルスによって引き起こされるRNA干渉反応は、強力であり、また1塩基対のみが異なる野生型とK-RAS^V12対立遺伝子とを区別するために十分に選択的である。

ヒト腫瘍において、発癌性K-RAS対立遺伝子は頻繁に存在するが、ほとんど必ず複数のその他の遺伝的イベントと関連している。後期段階のヒト腫瘍の発癌性表現型は、発癌性変異体K-RASの発現に依存するかどうかという問題に対処するために、CAPAN-1細胞を再び使用した。腫瘍形成能に関連した1つの表現型は、半個体の培地（軟寒天アッセイ法）にまいたときに、足場に非依存的に増殖する能力である。CAPAN-1およびEJ細胞には、pRS-K-RAS^V12を、または対照pRS-p53およびpRSウイルスのいずれかを感染させた。薬物選択の後、2×10⁴個の細胞を軟寒天にまいて、3週間培養させた。形質転換されたヒト腫瘍株から予想される通り、CAPAN-1およびEJ株化細胞は、pRSおよびpRS-p53対照ウイルスに感染するときに増殖してコロニーを形成することができた（図8Aおよび表1A）。対照的に、pRS-K-RAS^V12の感染では、このアッセイ法でのCAPAN-1細胞のコロニー増殖がほぼ完全に無くなった。重要なことに、EJ細胞（これはH-RAS^V12発癌遺伝子を含む）の軟寒天増殖は、影響を受けなかったので、pRS-K-RAS^V12の効果は、特異的であった（図9Aおよび表1）。

軟寒天での増殖。3回の独立した実験の軟寒天コロニーの平均数を示してある。

最後に、我々は、CAPAN-1細胞におけるK-RAS^V12のダウンレギュレーションは、これらがヌードマウスで腫瘍を形成する能力に影響を及ぼすかどうかを試験した。CAPAN-1細胞にpRS-K-RAS^V12ウイルスまたはpRS対照ウイルスのいずれかを感染させて、非感染細胞を除去するために3日間薬物選択した。この後に、1×10⁶個の感染細胞を胸腺欠損ヌードマウスの皮下に接種した。図9Bおよび表2に示したように、対照pRSに感染したCAPAN-1細胞は、全てのマウスで4週以内に腫瘍を生じたが、pRS-K-RAS^V12ウイルスに感染した6匹の動物は、いずれも腫瘍を発症しなかった。

K-RAS^V12または対照ノックダウンベクターを感染させた細胞の胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍形成能。

これらの結果は、ウイルスベクターをヒト細胞ゲノムの発現カセットを組み込むために使用することができ、これがRNA干渉を媒介して持続的に機能喪失表現型を誘導することを初めて示す。これらの様なベクターは、少なくとも2つの可能性の用途を有する。遺伝子治療において、遺伝子の変異体バージョンのみを選択的にダウンレギュレーションすることにより、腫瘍細胞に対しては非常に特異的な効果があるが、正常細胞はそのままにすることができる。この特徴は、腫瘍特異的に感染および／または発現するウイルスベクターをデザインする必要を減らす。癌で見出される染色体の転座限界点にまたがる標的配列を設計することにより、これらのベクターを、特にこれらの転座した染色体のキメラ転写物を阻害するために使用してもよい。加えて、これらのベクターは、癌細胞に必要とされる遺伝的イベントを効率的に同定して、腫瘍化の表現型を明らかにするために使用することができる。この技術の使用により、大部分のヒト癌細胞に存在する多くの遺伝的変異から、薬剤を開発するために最も有効な標的を迅速に同定することができる。

実施例7
本実施例は、哺乳類細胞のゲノムDNAへのノックダウンベクターの遺伝子特異的なインサートの組込み、その後のこのようなベクターのPCR増幅、およびマイクロアレイでの増幅産物のハイブリダイゼーションに関する。

25個0の遺伝子特異的なバーコード・タグ（RNAヘアピン分子をコードする）のセンス鎖およびアンチセンス鎖に対応する、500個の異なる64merオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを開発した。

ポリリジン被覆ガラススライドにスポットするために、0.5μg/μlのオリゴヌクレオチド溶液を使用した。DNAをアレイにUVで架橋して、コハク酸無水物処理を使用してアレイをブロックし、沸騰水中で変性させて、95%のエタノール中で乾燥した。マウスのエコトロピックなレトロウイルス受容体を発現するヒトU20S細胞を、8種の異なるsiRNAを発現するレトロウイルス（各々BLMおよびNBS1に向けられた4つのベクター）のコレクションに感染させて、非感染細胞をピューロマイシン選択（2μg/mlの終濃度で48時間）を使用して除去した。製造業者の説明書に従ってDNAzol試薬（Life Technologies）を使用して、レトロウイルスに感染したヒトU2OS細胞のゲノムDNAを単離した。遺伝子特異的なバーコードは、pSUPERカセットの上流および下流に位置するforwardプライマー(5'-cccttgaacctcctcgttcgacc-3'）およびreverseプライマー（5'-gagacgtgctacttccatttgtc-3'）を使用してPCR増幅し、約600塩基対のPCR断片を生じさせた。PCR反応は、Expand Long Template PCR系（Roche）およびPCR緩衝液no.3と共に、鋳型として200ngのゲノムDNAを使用して、製造業者の説明書に従って行った。これらのPCR産物を、製造業者（Kreatech、Amsterdam）の説明書に従って、ULS Cy3およびCy5を使用して蛍光ラベルし、マイクロアレイのプローブとして使用した。マイクロアレイでは、まず5×SSC、0.1%のSDS、および1%のBSAを含む緩衝液中で42℃において1時間プレハイブリダイズさせた。ラベルされたPCR産物を変性させて、20μgのPolyd（A）、8μgの酵母t-RNA、20μgのCOT-1 DNA、25%のホルムアミド、5×SSC、および0.1%のSDSを含むハイブリダイゼーション混合液に(40μlの最終体積）に添加した。ハイブリダイゼーションは、42℃で一晩行った。最後に、最初に5×SSC/0.1%のSDS、次いで2×SSC/0.1%SDS、1×SSC、0.2×SSC、および最後に0.05×SSC溶液を順番に使用して、アレイを洗浄した。

これにより、実質的にクロスハイブリダイゼーションがない、予測されたハイブリダイゼーションパターンを生じた（図10を参照）。短いヘアピンRNAをコードする64merのオリゴヌクレオチドのセンス鎖（番号1）およびアンチセンス鎖（番号2）をポリリジン被覆したガラススライドにスポットした。上段パネル（オリゴ配列187-1）では、Cy3またはCy5ラベルされたオリゴヌクレオチドの混合物を使用してハイブリダイゼーションを行った。下段パネル（オリゴ配列187-4）では、ヒト細胞をノックダウンベクター（BLMおよびNBS1に対して、それぞれの遺伝子について4つのノックダウンベクター、A、B、C、およびD）に感染し、ゲノムDNAを単離し、ノックダウンカセットをゲノムDNAからPCRで増幅し、PCR産物をCy3またはCy5を使用してラベルして、オリゴヌクレオチドを含有するマイクロアレイにハイブリダイズさせた。

考察
複合プローブ混合物（たとえばcDNA）のハイブリダイゼーションがマイクロアレイ技術を使用して頻繁になされているという事実は、上記の技術を多くのベクターでの実施に拡張することができることを強く示唆する。重要なことに、プローブ並びにマイクロアレイにスポットされたオリゴヌクレオチドの自己相補的な性質では、強い特異的なハイブリダイゼーションシグナルを阻止しない。これはまた、同時にバーコード・タグの混合物の特異的なハイブリダイゼーションを刺激するハイブリダイゼーション条件が存在することを示す。

細胞における本発明のポリヌクレオチドの発現は、このような細胞の遺伝子特異的なノックダウン表現型を生じるだけでなく、これらのポリヌクレオチドを発現する細胞に遺伝子特異的な指紋（バー・コード）も導入する。本発明のポリヌクレオチドにおいて、siRNAをコードする領域は、配列がユニークであり、したがって、細胞（たとえば哺乳動物細胞）へのこのようなポリヌクレオチドの導入により、永久的に遺伝子特異的な識別子を有する、タグの付いたノックダウン細胞を生成する。この分子バーコードは、siRNAをコードする配列に隣接して位置するPCRプライマーを使用するPCR増幅によって、容易に単離される。PCR産物のラベリング（たとえば、蛍光による）により、遺伝子特異的なノックダウン・バー・コード（これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも遺伝子特異的なヌクレオチドを含まなければならない）を含むオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションによって、タグを同定することができる。

siRNAをコードするポリヌクレオチドの大規模なコレクションの構築（例えば、発現ベクターの形態で）により、哺乳類細胞において効率的な機能喪失遺伝的スクリーンを行うことが可能になる。このような大規模なコレクションを構築するためには、ターゲットされる転写物に特有の所与の転写物のいずれかのうちの少なくとも１つの配列がなければならない。これは、インシリコでの関心対象のゲノムに対するBLAST検索によって行うことができる。標的遺伝子に相補的な領域が19ヌクレオチドの長さであるときは、意図されない標的の交叉レギュレーションを避けるために、19のうちの17未満がその他の無関係な転写物との一致性を有する19-merの配列のみを選択することが好ましい。加えて、それぞれのsiRNAのGC含量は、30〜70%の間であってもよい。これは、ノックダウン・ベクター／ポリヌクレオチドが活性である可能性が増大し、かつオリゴヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションを最適化する。19塩基の転写物特異的な配列を、一対の相補的な64merのオリゴヌクレオチドに変更してもよく、次いで、これを標準的な合成技術によって合成し、アニールして二重鎖DNAを形成させ、次いでpSUPERベクターまたはその誘導体に個々にクローン化する。

オリゴヌクレオチドのデザインの結果として、このベクター／ポリヌクレオチドの大規模なコレクションは、それぞれのベクターにユニークで、かつこれらのCG含量の整合による同様のハイブリダイゼーション特性を有する分子バーコードを含む。細胞への導入に続いて、分子バーコードは、PCRプライマーを使用するPCR増幅によって、容易に単離される。ポリヌクレオチドがベクターによって導入される場合、PCRプライマーは、siRNAコードするインサートに隣接していてもよい。このようなベクター／ポリヌクレオチドの大規模なコレクションが細胞集団で発現されるときに、バーコードのPCR増幅により、細胞群に導入されたノックダウンベクター／ポリヌクレオチドの混合物に対応するバーコード配列の混合物を生じる。それぞれのノックダウン・ベクター／ポリヌクレオチドが有する、細胞群におけるそれぞれのバー・コード化核酸断片の相対的な存在量は、実験条件下での細胞の適応度に対する効果による影響を受ける。それぞれのバー・コード化DNA断片の相対的な存在量は、バーコードに相補的なDNA断片からなるDNAアレイを使用して、容易に定量化することができる。そのために、PCR増幅したバー・コード化断片を蛍光色素（たとえば、Cy5）でラベルして、同じノックダウン・ベクター／ポリヌクレオチドのコレクションを収容するが、関心対象の生体しぐなるには暴露されていない細胞の対照群からPCR増幅されたバー・コード化DNA断片に対してハイブリダイズさせることができる。次いで、このバー・コード化DNA配列の対照群を、異なる蛍光色素（たとえば、Cy3）でラベルすることができる。バー・コード化DNA断片でラベルしたCy5およびCy3の同時ハイブリダイゼーションにより、特異的なシグナルに対する細胞の暴露によって生じるバーコード化断片の相対的な存在量の変化を同定することができる。したがって、DNAアレイハイブリダイゼーションの定量的性質により、ノックダウン識別子としてバーコードを使用して、併行したアッセイ法で多くのノックダウン細胞を解析することができる。

遺伝子スクリーンは、特定のプロセスの原因として関与する遺伝子産物を同定する強力な方法である。表現型は、遺伝子と連動することが必要であるので、単純なモデル生物体においてさえ、遺伝的スクリーンは面倒で、かつ時間がかかることが多い。しかし、本明細書に記載されている方法は、選択された生物学的な表現型の原因となる細胞の転写物を簡単かつ迅速に同定することができる。本方法は、特異的なシグナルに供された細胞集団において、ポジティブまたはネガティブのいずれかに選択されるノックダウン・ベクター／ポリヌクレオチドを同定することができる。哺乳類細胞では、本発明のポリヌクレオチド／発現ベクターを、機能喪失表現型を作製するために使用することができ、ユニークな細胞のバー・コード化により、表現型に対する遺伝子のマッチングが迅速であることを意味する。ノックダウン細胞の1つのバッチを扱うことにより（多くの単一ノックダウン集団とは対照的に）、単一の実験で多くのノックダウン表現型を同定することができる。したがって、この技術は、迅速かつ安価な方法でハイスループット遺伝子解析を可能とする。これらのバーコードノックダウンスクリーンの可能な用途には、たとえば：(i)ストレス条件下（任意の薬物による細胞の処理、UV光、成長因子欠乏、癌遺伝子活性化、その他）での細胞適応度を修飾する遺伝子の同定、(ii)合成致死表現型の同定（変異体p53または網膜芽細胞腫タンパク欠乏などの定義された変異がある場合に特異的に、細胞適応度を減少させるノックダウンベクター）、(iii)経路における新たな遺伝子の同定（たとえば、正常細胞ではノックダウン致死であるが、プログラム細胞死、またはTGF-P情報伝達、その他の経路に欠損がある細胞ではそうでない）がある。

実施例8
本実施例は、レンチウイルスベクターの構築、およびRNA干渉を介してp53発現の安定な抑制を媒介するp53特異的な短いヘアピン転写物の合成の誘導におけるその使用に関する。

実験手順
プラスミドの構築
マウスのp53特異的な短いヘアピン・オリゴヌクレオチドを、まずpRETRO-SUPERにクローン化した（本明細書に記載されているように）。pRETRO-SUPERベクターをBglIIおよびHindIIIで消化して、マウスのp53をターゲットするアニールしたオリゴの
5'gatccccGTACATGTGTAATAGCTCCttcaagagaGGAGCTATTACACATGTACtttttggaaa3'、および、
5'agcttttccaaaaGTACATGTGTAATAGCTCCtctcttgaaGGAGCTATTACACATGTACggg-3'、
をベクターにライゲーションして、pRETRO-SUPER-mp53を得た。オリゴヌクレオチド内の19merのp53ターゲティング配列は、大文字で示してある。レンチウイルス導入ベクターのHIV-CS-CG（Miyoshiら、(1998). J Virol 72,8150-8157）をEcoRIおよびXhoIによって消化し、CMV-GFP配列を除去した。H1プロモーターおよびp53標的配列を含むカセットをpLENTI-SUPER-p53からEcoRIおよびXhoIで切除し、HIV-CSにライゲーションしてpSUPER-mp53を得た。

細胞培養、レンチウイルスの産生および感染
野生型FVBマウス胚性線維芽細胞（MEFs）、ST.Hdh^Q111マウス線条体細胞(Trettelら、(2000). Hum Mol Genet 9, 2799-2809）、および293T細胞は、10%のウシ胎児血清を補ったダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）中で培養した。レンチウイルスの産生のためには、293Tの細胞に、10μgの導入ベクターHIV-CS-CGまたはpLENTI-SUPER-mp53、3.5μgのVSVgエンベロープベクターpMD.G、2.5μgのRSV-Rev、および6.5μgのパッケージングベクターpCMV□R8.2（Miyoshiら、(1998). J Virol 72,8150-8157）を使用して、カルシウム-リン酸法によってトランスフェクトした。レンチウイルスをトランスフェクション24時間および48時間後に回収して、0.45μMフィルターを通してろ過した。レンチウイルスの感染の14日前にST.Hdh^Q111細胞を39℃へ移した。WT MEFsは、レンチウイルスの感染の14日前に、細胞を3〜4日ごとに計数することにより、9〜10継代培養した。また、感染時に、酸性βガラクトシダーゼ染色によって老化の表現型を調査した（Dimriら、(1995). Proc Natl Acad SciUS A92, 9363-9367）。6cmのディッシュ内の1.8×10⁵の老化WT MEFsには、0.8μg/mlポリブレンの存在下で、少なくとも12時間レンチウイルスを感染させ、次いでコロニー形成アッセイ法および増殖曲線のために再びまき直す前に48時間回復させた。コロニー形成アッセイ法のために、0.5×10⁵または1×10⁵個の細胞を10cmのシャーレにまいた。播種の16日後に、細胞を固定してスーバーステイン(50%のメタノール、10%の酢酸、0.1%のクマシーブルー）で染色した。増殖曲線のために、1.5×10³個の細胞を3.5cmのシャーレにまいて、3日間隔で細胞を0.5%のホルムアルデヒドで固定し、0.1%のクリスタルバイオレットで染色し、続いて10%の酢酸中に再び可溶化した。細胞数の相対的な測定としてOD₅₉₀を定量した。

ウエスタンブロット解析
全細胞抽出物を12%のSDS-PAGEゲルに分離して、ポリフッ化ビニリデン膜（Millipore）に転写した。増強化学発光（Amersham Biosciences, Inc.）を使用して可視化した。使用した抗体は、p16^INK4aに対するM-156（Santa Cruz）、19^ARFに対するab80-50（Abcam）、p21に対するF-5（Santa Cruz）、p53に対するAb-7（Oncogene）、およびP30620（Transduction labs）に対するPAI-1である。

微速度顕微鏡観察
5×10⁴の老化MEFsを3.5cmのシャーレにまいて、レンチウイルスに感染させた。微速度顕微鏡観察は、温度およびCO₂制御されたチャンバ内で感染の234時間後に、10×位相差を使用して開始した。フレームは、38時間の期間にわたって20分ごとにとった。

結果および考察
本明細書に記載されたpRETRO-SUPERベクターのレンチウイルス誘導体は、pRETRO-SUPER由来のマウスp53pをターゲティングするH1 RNAショート・ヘアピン遺伝子発現カセットを、自己不活性化するレンチウイルスベクターのpHIV-CSにクローニングすることによって作製した（Miyoshiら、(1998). J Virol 72,8150-8157）。このベクターは、pLENTI-SUPER-p53と名づkeた（図11A)。対照として、GFP（HIVCS-CG）を発現するレンチウイルスベクター（Miyoshiら、(1998). J Virol 72,8150-8157）を使用した。

初代マウス胚性線維芽細胞におけるp53の欠失は、不死化表現型の獲得に関連している（Harveyら、(1993). Oncogene 8, 2457-2467）。レンチウイルスのp53ノックダウン・ベクターがマウス胚性線維芽細胞（MEFs）におけるp53の機能的な失活を誘導することができたかどうかを試験するために、初期継代の初代MEFsにLENTI-SUPER-p53ウイルスを、または対照GPFレンチウイルスを感染させて、p53ノックダウンを示す不死化をモニターした。対照ウイルスに感染した細胞のGFP染色では、初代MEFsの一部30〜40%がうまく感染したことを示した（データ示さず）。図11BおよびCは、LENTI-SUPER-p53の感染により、感染した初代MEFsの効率的な不死化を生じるが、対照GFPレンチウイルスベクターについては、生じないことは、LENTI-SUPER-p53ウイルスがp53発現の機能的な失活を媒介することを示す（図13Aも参照されたい）。

次に、老化細胞へのレンチウイルス遺伝子の導入によるp53発現の抑制によって、細胞周期に再移行ができるかどうかを検査した。この問題に取り組むために、2つの細胞系を使用した。第１に、マウス胚線条体に由来する条件的に不死化されるSTHdh^Q111ノイロン細胞を使用した。これらの細胞は、SV40T抗原の温度感受性対立遺伝子が存在するために条件的に不死化される（Trettelら、(2000). Hum Mol Genet9, 2799-2809）。STHdh^Q111細胞は、許容温度32℃において無期限に増殖するが、T抗原が不活性(Brummelkampら）な非許容温度（39.5℃）へ移したときに、急速に、および同調的に有糸分裂後になり、老化形態をとる（Brummelkampら、(2002). J Biol Chem 277,6567-6572）。全ての集団が老化だったことを保証するために、39.5℃において2週間維持されたSTHdh^Q111細胞を使用し、次いで、老化細胞をLENTI-SUPER-p53ウイルスまたは対照GFPレンチウイルスに感染させた。感染細胞を39.5℃において2週間維持した。図12Aは、p53のノックダウンが、細胞周期への再移行を引き起こし、増殖を続けられることを示したことから、非許容温度でのSTHdh^Q111細胞の老化様増殖停止は、p53の抑制によって逆転することができることを示している。

次に、老化初代MEFsにおいて、p53ノックダウンにより細胞周期への再移行ができるかどうかを検査した。FVB遺伝形質の初代MEFsを、細胞がもはや増殖しなくなり（図12D）老化関連マーカーの酸性βガラクトシダーゼ、PAI-1、p21^cip1、p19^ARF、およびp16^INK4a（図12E、13A）を高レベルで発現しなくなるまで培養した。培養の全ての細胞は、平らな老化形態を示し、酸性ガラクトシダーゼに対して強く染色されたことから（図12E）、これらの細胞が定量的に老化したことを示す。この考えは、また、これらの後期継代MEFsの増殖曲線が、時間とともに細胞数の一定の減退を示したことによりサポートされ（図12D）、培養中に自発的に不死化される細胞が存在しないことを示す。図12BおよびCは、これらの老化初代MEF培養におけるp53のレンチウイルス性ノックダウンが、著しい程度の増殖をトリガーしたことを示す。重要なことに、細胞周期への再移行は、PAI-1、p21、および酸性β-ガラクトシダーゼを含む老化関連マーカーのいくつかの発現の消失を伴い（図13A、B）、老化から戻った細胞は、いかなる老化のサインも伴わずに数週間増殖し続けたことから、これらが不死化したことを示唆している（図12Bおよびデータ示さず）。

原則として、p53のレンチウイルス性ノックダウンに続いて観察される増殖は、培養において本当に老化しなかった細胞から生じ得る。したがって、レンチウイルスの感染後の時間内に老化MEFsの培養を続けることが重要であった。図14は、p53のレンチウイルス性ノックダウンの後、老化MEFsの一連の微速度顕微写真を示し、これらを合わせると、完全に平らで、老化形態を有する細胞は、円形になり、p53ノックダウンウイルスの感染後の48時間以内に分裂するすることを示す（図14、黒い矢印によってマークした細胞）。しかし、多くの細胞は、最初は分裂するが、分裂の間にまたは細胞分裂の完了直後にアポトーシスによって死ぬので（図14、白い矢印によってマークした細胞）、全ての細胞分裂が生産的であるというわけではない。分裂またはアポトーシスは、GFPをコードする対照レンチウイルスの感染後には見ることができない（データ示さず）。完全に老化した細胞の全ての特徴を有する細胞が、p53ノックダウンの後に迅速に細胞周期に再移行すると結論づけることができる。また、p53は、老化を開始するために必要とされるだけでなく、少なくともMEFsにおいて、老化を維持するためにも必要とされもと結論づけることができる。

老化MEFsにおけるp53発現の抑制は、老化状態の復帰を引き起こし、かつ不死化を引き起こすことの証拠が提供される。証拠のいくつかのラインでは、MEFsは、レンチウイルスp53ノックダウンベクターの感染時に完全に老化であったという考えを支持する。第１に、細胞は増殖因子の存在下で増殖を停止したことは、これらが静止状態および増殖因子に応答したままであったのではなく、老化であり、増殖因子刺激に不応性であったことを示している（図11D）。第2に、これらは、一様に老化の形態を現わし、老化関連マーカーの酸性βガラクトシダーゼ、PAI-1、p21^CiP1、p19^ARF、およびp16^INK4aを発現した（図12E、13A）。p53ノックダウンの結果として細胞が老化から出たときには、これらが不死化され、低レベルのp21^CiP1および高レベルのp16^INK4aを有した点で、細胞はp53ヌルMEFsとしての表現型を振る舞った（Harveyら、(1993). Oncogene 8,2457-2467 ; Kamijoら、(1997). Cell91, 649-659; Zindyら、(1998). Genes Dev12, 2424-2433）。重要なことに、p53ノックダウンによって老化から出た細胞は、高レベルのp16^INK4aを維持した（図13A）。p16^INK4aの発現は、老化の間にp53非依存的な機能で誘導されるので（Zindyら、(1998). Genes Dev 12, 2424-2433）、これらのデータは、老化の誘導に至ったシグナリング経路が、老化から戻ったMEFsにおいてなおも稼働中であることを示す。これは、p53ノックダウンによって細胞周期に再移行した細胞が、p53ノックダウンウイルスの感染時に真に完全に老化であったというさらなる証拠を提供する。

これらのデータは、老化ヒト二倍体線維芽細胞で行われた以前の実験と一致している。したがって、初代ヒト線維芽細胞にp53抗体を微量注入することによるp53機能の消失により、少なく一過性に老化を逆転し、細胞周期に再移行させることができた（Gire & Wynford-Thomas, (1998). Mol Cell Biol 18,1611-1621）。しかし、ヒト線維芽細胞におけるp53の不活性化は、複製的な老化を遅延させるが、抑止しないことは、p53の不活性化単独では、初代ヒト線維芽細胞の老化の安定な復帰を媒介するために十分ではなく、hTERTの発現の誘導も必要であることを示す（Itahanaら、(2001). Eur J Biochem 268,2784-2791 ; Shayら、(1991). Exp Cell Res 196, 33-39）。ここで記載されているレンチウイルスベクター系の特徴は、遺伝子発現の抑制が持続的であり、分裂後の細胞における遺伝子不活性化の長期の結果を研究することができることである。したがって、LENTI-SUPERベクターは、細胞周期を出た細胞の有糸分裂後の状態を維持するために、どの遺伝子が連続して必要とされるかについて調査するための有用な道具である。有糸分裂後の（高度に分化した）状態の誘導を引き起こすシグナリング経路は、よく研究されているが、有糸分裂後のこのような状態を維持するために必要とされる遺伝子および経路は、十分に理解されていない。本実施例に記載されているベクター系は、非分裂細胞におけるサイレンス遺伝子の発現のために開発され、老化の維持に必要とされる遺伝子を研究するために使用した。p53の発現が抑制されている老化細胞は、迅速に細胞周期に再び移行して、不死化するので、p53が老化の維持に重要であることが見いだされた。このベクター系は、細胞周期を出た細胞における有糸分裂後の状態を維持するために必要とされる遺伝子を研究するために広く適用できる。

配列の簡単な説明
配列番号：1は、GenBankからアクセッション番号X16612の下で入手可能なヒトH1 RNA遺伝子の配列を提供する。

配列番号：2は、好ましいH1 RNA遺伝子プロモーターおよび配列番号：1の配列のヌクレオチド146〜ヌクレオチド374に対応する配列を提供する。

配列番号：3は、図1（b）に示したCdh1に対する合成siRNAのセンス鎖の配列を提供する。

配列番号：4は、図1（b）に示したCdh1に対する合成siRNAのアンチセンス鎖の配列を提供する。

配列番号：5は、図1（b）に示したpSUPER-Cdh11-Aから生成される予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：6は、図1（b）に示したpSUPER-Cdh11-Bから生成される予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：7は、図1（b）に示したpSUPER-Cdh11-Cから生成される予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：8は、また、図2(a)に示したpSUPER-p53から生成される予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：9は、図3(a)に示したとおりのpSUPER-Cdh11-Bベクターから生成する予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：10は、図3(a)に示したとおりのpSUPERCdh1l-B（mut-9）ベクターから生成する予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：11は、図3(a)に示したとおりのpSUPERCdh1l-B（mut-2）ベクターから生成する予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：12は、図4に示したCDC20に対する合成siRNAのセンス鎖の配列を提供する。

配列番号：13は、図4に示したCDC20に対する合成siRNAのアンチセンス鎖の配列を提供する。

配列番号：14は、図4に示したとおりのpSUPER-CDC20ベクターから生成する予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：15は、pS-K-RASV12を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を提供する。

配列番号：16は、pS-K-RASV12を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を提供する。

配列番号：17は、残基12にわたる野生型K-RASの領域の配列を提供する。

配列番号：18は、残基12にわたる変異体K-RASの領域の配列を提供する。

配列番号：19は、図8Aに示したとおりのpSUPER-K-RASVl2ベクターから生成する予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

配列番号：20は、好ましいスペーサー領域の配列を提供する。

配列番号：21は、pSUPERカセットを増幅するために使用されるフォワードプライマーの配列を提供する。

配列番号：22は、pSUPERカセットを増幅するために使用されるリバースプライマーの配列を提供する。

配列番号：23は、pRETRO-SUPER-mp53を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を提供する。

配列番号：24は、pRETRO-SUPER-mp53を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を提供する。

配列番号：25は、図11Aに示したとおりのLENTI-SUPER-p53ベクターから生成する予測されるステムループ転写物の配列を提供する。

本発明のベクターによる哺乳類細胞の遺伝子発現の抑制を示す。図1(a)は、基礎pSUPERベクターの略図を示す。図1（b）は、標的CDH1に対して使用される合成siRNAおよび評価した3つのpSUPER-Cdh1構築物の各々に由来する3つのpSUPER-CDH1転写物（A、B、およびC）の予測される二次構造を表す。図1(c)は、Cdh1に対するウエスタンブロットを示す。ブロット上の細胞抽出物は、（左から右に）GFPを発現する対照プラスミド、Cdh1-siRNA、空のpSUPER構築物、図1（b）に示した転写物A、B、およびCを発現することができる3つのpSUPER構築物、および最後に空のpSUPERをトランスフェクトした細胞に由来する。図1（d）は、種々の示した構築物をトランスフェクトした細胞から抽出されたRNAのノーザンブロットを示す。ステムループ構造およびsiRNAの位置をブロット上に示してある。また、5S-RNAのバンドを充填の対照として臭化エチジウム染色によって測定した。 図2(a)は、ブロット上に表した転写物を産生することが予測されるpSUPER-p53ベクターを、量を増加してトランスフェクトした細胞のウエスタンブロットを示す。細胞を照射（+IR、20Gy）するかまたは未処置のままのいずれかにして回収し、ブロットし、次いで示したとおりに抗p53抗体によってプローブし、均等な充填を示すための対照タンパク質についてもプローブした。図2(b)は、空のpSUPER、またはp53に対するsiRNAを発現するpSUPERのいずれかをトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリー解析を示す。細胞は、照射（+IR、10Gy）するかまたは照射しない対照（−）である。Gl相のDNA含量を有する細胞を矢印で示してある。図2(c)は、1μgのpSUPERベクターおよび0.1μgのpBabe-puroプラスミドをトランスフェクトして、48時間後に1μg/mlのピューロマイシンで12日間選択した細胞を示す。プレートを照射（20Gy）して、4時間後に固定し、p53を検出するために染色した。同じコロニーの位相差像も示してある。左右のイメージは、2つの異なるコロニーのものである。 図3(a)は、pSUPER-CDH1ベクターによってCDH1を抑制するために必要とされる完全な状態の標的認識配列を表す。Cdh1の19ヌクレオチドの標的認識配列を変異させて、ステムの位置9または2において1つの塩基対を置換させる。予測される転写物の二次構造を示してある（変異には、太字および下線を引いてある）。図3（b）は、抗Cdh1抗体によってプローブした、図3(a)に示した構築物をトランスフェクトした細胞のCDH1に対する免疫ブロットを示す。サイクリンD1タンパク質を均等な充填を示すために使用した。 合成SiRNAおよびpSUPER-CDC20の両者によるCDC20発現の抑制を示す。CDC20発現を阻害するために利用したSiRNAの配列およびpSUPER-CDC20の予測される転写物を示す。示したSiRNAsおよびプラスミドを細胞にトランスフェクトし、細胞抽出物を免疫ブロットし、Cdc20およびサイクリンD1タンパク質を検出するためにプローブした。 本発明のベクターの使用により、p53のmRNAの発現を妨げることを示す。図5Aは、pSUPERまたはpSUPER-p53ベクターをトランスフェクトしたMCF-7細胞に由来するRNAのノーザンブロットを示す。MCF-7細胞をpSUPER-p53またはベクターで電気穿孔し、48時間後に総RNAを抽出した。30μgのRNAをアガロースゲル上で分離し、p53特性的な³²Pラベルしたプローブでプローブした。rRNAの充填の対照は、ブロットの臭化エチジウム染色によって視覚化した。図5Bは、同じステム−ループ転写物によって媒介されるsiRNA干渉を、レトロウイルスベクターから発現させることができることを示す。ピューロマイシンマーカー遺伝子を発現する自己不活性化レトロウイルスベクター（pRETRO-SUPER）をクローン化し、示したように、空のpol-Eプロモーターまたは標的p53（図5D）のものに収容した。エコトロピック受容体を含むU2-OS細胞をこれらのベクターで3回感染させて、1日後に、細胞を1μg/mlのピューロマイシンで4日間選択し、ガラススライドにまいた。1日後に、スライドを照射（20Gy）して、4時間後に固定し、抗p53抗体で染色した。FITC結合二次抗体による免疫蛍光を、同視野の位相差と共に示してある。両方の写真は、同じ設定のカメラおよび顕微鏡を使用した。図5(C)は、いずれかの末端に末端反復配列（LTR）を有し、H1 RNA遺伝子プロモーターとピューロマイシン選択可能なマーカー、標的配列、およびターミネーターもインサートされたpRETRO-SUPERの模型図を示す。 典型的に本発明の構築物に存在する種々のエレメントの概略図を示す。これらは、3つの連続したシトシン残基（その直後に転写が開始する）、siRNAをコードする領域、および5つの連続したチミジン残基を含む転写ターミネーターである。 RNA干渉を媒介するためのレトロウイルスベクターの使用を示す。図7Aは、レトロウイルスpRETRO-SUPER RNA干渉ベクター（pRS）の略図である。インサートを有しないか、またはヒトp53（実施例2にて説明したように）をターゲットするためのインサートを有するH1 RNAプロモーターを含むDNA断片を対応するpSUPER構築物から消化（EcoRI-XhoI）し、自己不活性化MSCVにクローン化して、それぞれpRSおよびpRS-p53を作製した。図7Bは、免疫染色した細胞を示す。マウスのエコトロピック受容体を安定に発現する（細胞にレトロウイルスの侵入を可能にするために）ヒトU2-OS細胞をpRSおよびpRS-p53レトロウイルスで感染させて、ピューロマイシンで1週間選択した。ピューロマイシン耐性細胞の多クローン性の集団をp53（緑色のもの）について、およびアクチン（赤のもの）について免疫染色した。図7Cは、図7Bに記載のU2-OS細胞の同様に感染した多クローン性の集団から全細胞抽出物を作製し、SDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離して、p53タンパク質を検出するために免疫ブロットを行ったウエスタンブロットを示す。図7Dは、図7Bに記載された同様の感染した細胞群に由来する30μgの総RNAを予め形成し、実施例2にて説明したように、19ヌクレオチドのターゲティングp53配列でプローブしたノーザンブロット解析を示す。 発癌性K-RAS^V12の選択的な抑制を示す。図8Aは、野生型の配列、ヒトK-RASのV12変異誘発遺伝子、およびpSUPER-K-RAS^V12によってコードされる予測される変異体特異的な短いヘアピン転写物を示す。図8Bは、免疫ブロットを示す。K-RAS^Vl2のV12変異にまたがる19ntの配列を使用してpSUPER-K-RAS^V12（pS-K-RAS^V12）構築物を作製した。この構築物、空のpSUPER（pS）、およびH2B-GFPプラスミドをCAPAN-1細胞に電気穿孔して、全細胞抽出物を、Agamiら、Cell 102、55-66 (2000)に記載されたとおりに調製した。

免疫ブロット解析は、特異的な抗K-RAS抗体（sc-30、SantaCruz）および対照として抗サイクリン-D1を使用して行った。図8Cは、次のように生成したウエスタンブロットを示す。K-RAS^V12標的配列を含むpSUPERカセットを、図7に記載したように、pRSにクローン化して、ウイルス株を作製した。マウスのエコトロピック受容体を発現するCAPAN-1細胞の安定な多クローン性プールを、示したウイルス株に感染させた。細胞を3日間ピューロマイシンで選択し、K-RASタンパク質および対照p53およびアクチンを検出するための免疫ブロット解析のために全細胞抽出物を使用した。図8Dは、次のように生成したウエスタンブロットを示す。エコトロピック受容体を発現するCAPAN-1およびEJ細胞の安定な多クローン性プールを、示したウイルス株に感染させ、薬物選択し、K-RAS、p53、およびアクチンタンパク質を検出するために免疫ブロットした。
K-RAS^V12発癌遺伝子をターゲットするレトロウイルスベクターによる、腫瘍形成能の安定かつ選択的な減少を示す。図8に記載のものと同じCAPAN-1（変異K-RAS^V12を収容）およびEJ（野生型K-RASを収容）細胞群に、示したRETRO-SUPERウイルスを感染させて、3μg/ml（3□g/ml）のピューロマイシンを使用して3日間選択した。図9Aは、示した感染に由来する2×10⁴個の選択した細胞を、軟寒天を含む2.5cmの直径のプレートにまいた3回の独立した実験の1つの代表である。図9Bは、pRSおよびpRS-K-RAS^V12感染に由来する1×10⁶個の選択した細胞を、示したように皮下に注入した胸腺欠損マウスを示す。4週後に注射部位の腫瘍の存在についてマウスを検査した。 オリゴヌクレオチドを含有するマイクロアレイを使用する「バーコード化された」DNA断片の同定を示す。短いヘアピンRNAをコードする64merのオリゴヌクレオチドのセンス鎖（番号1）およびアンチセンス鎖（番号2）をポリリジン・コートしたガラススライドにスポットした。上段パネル（オリゴアレイ187-1）では、Cy3またはCy5ラベルされたオリゴヌクレオチドの混合物を使用してハイブリダイゼーションを行った。下段パネル（オリゴアレイ187-4）では、ヒト細胞にノックダウンベクター（BLM、およびNBS1、それぞれの遺伝子に対する4つのノックダウンベクターA、B、C、およびDに対する）を感染し、ゲノムDNAを単離し、ノックダウンカセットをゲノムDNAからPCRで増幅し、PCR産物をCy3またはCy5を使用してラベルしてオリゴヌクレオチドを含有するマイクロアレイにハイブリダイズさせた。 RNA干渉を媒介するレンチウイルスのベクターを示す。A：レンチウイルスRNA干渉ベクターpLENTI-SUPER-p53（pLS-p53）の模式図の概要。H1プロモーターおよびマウスのp53をターゲティングするオリゴヌクレオチドインサートを含むDNA断片を本明細書に記載されたpRETRO-SUPERから、EcoRIおよびXhoIで両ベクターを消化し、続いてHIV-CSにH1-p53DNA断片をライゲーションすることによって、HIV-SC（Miyoshiら、(1998). J Virol 72,8150-8157）に移した。予測されるマウスp53をターゲティングする短いヘアピンRNAを示してある。B：それぞれ、継代3回のFVB野生型MEFsにHIVCS-CG（CMV-GFP）レンチウイルスまたはLENTI-SUPER-p53ウイルスを感染させた。感染の48時間後、コロニー形成アッセイ法のために5×10⁴個の細胞を10cmのシャーレに播種し、14日後に染色した。C：感染の48時間後、1.5×10³個の細胞を6穴のディッシュのウェル毎まいた。時間の間隔を変えて細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、次いで10%の酢酸によって可溶化させて相対的な細胞数の測定としてOD₅₉₀で定量化した。CMV-GFPおよびpLS-p53曲線は、それぞれ灰色および黒でマークしてある。 レンチウイルスを媒介したp53の抑制は、老化を逆転させる。A：STHdh^Q111細胞をT抗原が不活性である39.5℃の非許容温度へ移し、14日間保持して全ての細胞が老化したことを確認した後に、CMV-GFPまたはpLS-p53レンチウイルスを感染させた。コロニー形成アッセイ法のために5×10⁴個の細胞をまき、シャーレを2週後に染色した。B：CMV-GFPまたはpLS-p53レンチウイルスを感染させた老化MEFsを10cmのディッシュにつき1×10⁵個の細胞で播種し、播種の16日後にディッシュを染色した。C：CMV-GFP（灰色）またはpLS-p53（黒）による感染の48時間後に、1.5×10³個の細胞を6穴のディッシュのウェル毎まいた。3日間隔で、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、相対的な細胞数の測定としてOD₅₉₀で定量化した。D：WT MEFsを継代9回まで培養した。レンチウイルスの感染の14日前に細胞を計数して、同数の細胞を3日ごとに再びまいた。E：レンチウイルスの感染の直前に、継代5回および老化WT MEFsを酸性β-ガラクトシダーゼ染色(Dimriら、(1995). Proc Natl Acad Sci U S A 92,9363-9367）に供した。細胞を0.5%のグルタルアルデヒドで固定して、37℃で一晩染色溶液と共にインキュベートした。 復帰WT MEFsの老化マーカーを示す。A：継代3回（レーン1）、老化（レーン2）、およびp53のノックダウンによって老化から復帰したWT MEFs（レーン3）の老化マーカーのウエスタンブロット。B：老化および復帰WT MEFsに対して、酸性β-ガラクトシダーゼ染色を行った（図12に対してレジェンドに記載したとおり）。 p53のノックダウンに続く老化MEFsの時間経過顕微鏡観察を示す。LENTI-SUPER-p53に感染した老化WT MEFsの38時間の記録期間からフレームを選択した。時間点は、個々のフレームの右下の角に示してある。良好な分裂を受けている細胞は、黒い環および黒い矢印で示してあるが、分裂直後のアポトーシスは、白い矢印で示してある。

Claims (26)

1. −RNAポリメーラーゼIIIプロモーター；
   −siRNAをコードする領域；および、
   −センス鎖に5つの連続したチミン残基を含む転写終結エレメント：
   を含むポリヌクレオチド。
2. 請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記プロモーターは、RNAポリメラーゼIII H1 RNA遺伝子プロモーターまたはこれらの機能的な誘導体であるポリヌクレオチド。
3. 請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記プロモーターは、RNAポリメラーゼIII 5S、U6、アデノウイルスVA1、Vault、テロメラーゼRNA、もしくはtRNA遺伝子プロモーター、またはこれらの機能的な誘導体であるポリヌクレオチド。
4. 請求項1、2、または3に記載のポリヌクレオチドであって、前記siRNAをコードする領域は：
   標的遺伝子に相補的な領域および前記第1の領域に相補的な第2の領域；および、
   前記2つの相補領域を分離するスペーサー、
   を含む、ポリヌクレオチド。
5. 請求項4に記載のポリヌクレオチドであって：
   −ポリヌクレオチドのスペーサー領域は、前記標的遺伝子に相補的な領域のすぐ3'のセンス鎖に2つの連続したチミン残基を含み；および、
   −前記第1の領域に相補的な領域のすぐ3'は、センス鎖に2つのチミン残基があり、
   前記ポリヌクレオチドから生成されたRNA転写物において、前記相補領域およびスペーサーは、ステムループ構造を形成することができるポリヌクレオチド。
6. 請求項４または5に記載のポリヌクレオチドであって、前記スペーサー領域は、長さが7〜15ヌクレオチドであり、および／または前記標的遺伝子に相補的な領域は、長さが19〜21塩基であるポリヌクレオチド。
7. 請求項5または請求項6に記載のポリヌクレオチドであって、前記スペーサー領域は、配列5'TTCAAGAGA3'を有するポリヌクレオチド。
8. 請求項5、6、または7に記載のポリヌクレオチドであって、前記ステムループ構造は、酵素によって切断されてsiRNA分子を生成することができ、そのそれぞれの末端の3'オーバーハングは、2つのウリジン残基を含むポリヌクレオチド。
9. 請求項4〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドであって、前記標的遺伝子は、Cdh1、p53、またはCDC20であるポリヌクレオチド。
10. 前述の請求項のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドであって、前記siRNAは、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子間の識別をすることができるポリヌクレオチド。
11. 前記siRNAをコードする領域が以下の配列を含む、請求項4〜10のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド：
    5'GTTGGAGCTGTTGGCGTAGTTCAAGAGACTACGCCAACAGCTCCAACTT3'。
12. 前述の請求項のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
13. 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項12に記載のベクターを含む細胞。
14. 請求項13に記載の細胞であって、前記ポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主ゲノムに組み込まれている細胞。
15. 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項12に記載のベクター、または請求項13もしくは14に記載の細胞を含む非ヒト・トランスジェニック動物。
16. 遺伝子の発現を阻害するまたは減少するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項12に記載のベクターの使用。
17. 請求項13もしくは14に記載の細胞または請求項15に記載の非ヒト・トランスジェニック動物の表現型を、所望の方法で調節することができる薬剤を同定する方法であって、所望の方法で試験薬剤が細胞またはトランスジェニック生物の表現型を調整することができるかどうかについて決定することを含む方法。
18. (i)標的遺伝子の転写および／または翻訳の修飾因子；および／または、
    (ii)標的ポリペプチドの活性の修飾因子、
    を請求項13または14に記載の細胞または請求項15に記載の非ヒト・トランスジェニック動物において同定するための方法であって、該方法は、試験薬剤が標的遺伝子の転写および／または翻訳、または標的ポリペプチドの活性を調節することができるかどうかを決定することを含む方法。
19. 請求項17または18に記載の方法であって、前記標的遺伝子は、疾患遺伝子であるか、または表現型の所望の調節は、疾患または感染の防止または治療である方法。
20. 特定の疾患を予防するまたは治療するために適した薬学的組成物を製造する方法であって、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法を実施すること、および薬剤的に許容されるキャリアまたは希釈剤と共に、前記方法によって同定された薬剤または修飾因子を処方することを含む方法。
21. 請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法によって同定される薬剤もしくは修飾因子、または請求項20に記載の方法によって同定される薬学的組成物。
22. 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項12に記載のベクター、または請求項13もしくは14に記載の細胞、および標的遺伝子の発現を検出および／または定量化するための手段を含むキット。
23. 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項12に記載のベクター、または請求項13もしくは14に記載の細胞、請求項21に記載の薬剤もしくは修飾因子、および薬剤的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
24. 治療もしくは診断によってヒトまたは動物の体を治療する方法に使用するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項12に記載のベクター、請求項13もしくは14に記載の細胞、薬剤またはの方法に使用される請求項21に記載の修飾因子。
25. 癌もしくは常染色体優性障害の治療または予防のための薬物の製造における、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項12に記載のベクター、または請求項13もしくは14に記載の細胞、薬剤またはの方法に使用される請求項21に記載の修飾因子の使用。
26. 膵癌の治療または予防のための薬物の製造における、請求項11に記載のポリヌクレオチド、請求項11に従属されたときの請求項12に記載のベクター、または請求項11に従属されたときの請求項13もしくは14に記載の細胞の使用。

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