JP2005013221A

JP2005013221A - Ｂｒａｆ発現抑制を利用した癌の治療

Info

Publication number: JP2005013221A
Application number: JP2004124485A
Authority: JP
Inventors: Hidetoshi Sumimoto; 秀敏住本; Yutaka Kawakami; 裕河上; Makoto Miyagishi; 真宮岸; Kazumasa Tahira; 和誠多比良
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2003-06-03
Filing date: 2004-04-20
Publication date: 2005-01-20

Abstract

【課題】ＲＮＡｉ法を利用して、変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡを発現することができる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、二本鎖ＲＮＡ発現カセットを含む二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを作製し、癌特異的なＲＮＡｉ誘導が可能で高頻度に変異を有するＢＲＡＦを分子標的とする安全性の高い悪性黒色腫等の癌特異的治療法を提供すること。
【解決手段】ＢＲＡＦｍＲＮＡのタンパク翻訳領域にＲＮＡｉの標的配列を複数個所設定し、ＲＮＡｉ効果を発揮するｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡの発現形をレンチウイルスベクター上に構築し、標的配列として、Ｖ５９９Ｅを含む個所と、その他の個所の二種類を設定して組換えウイルスベクターを作製し、各種悪性黒色腫細胞株に感染させ、増殖抑制効果とＭＡＰＫ経路のシグナル伝達の抑制効果を確認する。同様に、悪性黒色腫細胞株の浸潤能の抑制効果や、インビボにおける悪性黒色腫細胞株の増殖抑制効果を確認する。

Description

本発明は、ＲＮＡｉ（RNA interference：ＲＮＡ干渉）法を利用するものであって、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子等の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering RNA）、二本鎖ＲＮＡを発現することができる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、二本鎖ＲＮＡ発現カセットを含む二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、及び、これらを有効成分とする悪性黒色腫等の癌の予防・治療剤や、これらを投与することからなる悪性黒色腫等の癌の予防・治療方法などに関する。

生物の発生過程において、細胞は増殖と生死を厳密に制御されながら、様々な形質を持った細胞へと分化していく。また発生後の成体においても、個々の細胞の増殖・分化・細胞死は、個体としての恒常性を保つために厳密に制御されている。つまり、個々の細胞運命は、ホルモン、神経伝達物質、細胞増殖因子、サイトカインなどの細胞外シグナルが細胞膜上の受容体を介して細胞内に正確に伝達することでコントロールされている。細胞外シグナルを細胞内の核に伝達し、遺伝情報の制御に至る機構を細胞内シグナル伝達機構と呼び、この機構での細胞内におけるタンパク間相互作用の連続反応を細胞内シグナル伝達経路という。この細胞内シグナル伝達経路は、上流のシグナルを受けて活性型となり、下流にシグナルを伝達した後に不活性型に戻るということを繰り返しながら、シグナルを伝達している。

細胞内シグナル伝達系の一つであるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は、細胞の増殖・分化シグナルに重要な役割を果たしている。ＭＡＰＫは分子量約４万のタンパク質リン酸化酵素であり、さまざまな真核生物の細胞種でＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）→ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）→ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化カスケードを形成している。このカスケードは、原癌遺伝子ｒａｓの下流で活性化し、細胞増殖シグナルとして働くだけでなく、細胞分化、細胞増殖停止、あるいは細胞運動性亢進を誘導する。また、多くの癌細胞においてはＭＡＰＫ系の恒常的機能亢進が認められるため、その特異的阻害が制癌につながると考えられている。

ＭＡＰＫ経路は、悪性黒色腫においてもＭＰＫＫＫの一つであるＢＲＡＦの点突然変異が高頻度に検出されており（６６%）、癌化との関連性が示唆されており、変異はすべて、キナーゼドメインの活性化領域内部か隣接するところに見られ、頻出する変異のいくつか（Ｖ５９９Ｅ、Ｌ５９６Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６８Ａ）の解析により、変異によってＢＲＡＦのキナーゼ活性が増し、結果としてＥＲＫが活性化すること、さらに、変異ＢＲＡＦがＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフォーメーション能を有することが報告（例えば、非特許文献１参照。）されている。また、多くの悪性黒色腫細胞株や悪性黒色腫組織において、恒常的にＭＡＰＫ活性の亢進が報告（例えば、非特許文献２参照。）されている。これらの報告は、変異ＢＲＡＦが悪性黒色腫の発生に深く関連する癌遺伝子であり、悪性黒色腫治療の分子標的になりうることを示唆する。しかし、上記のアッセイ系においては、生理的発現レベルを遥かに超えた過剰量の変異ＢＲＡＦがＭＡＰＫに与える影響や癌化との関連性については依然として不明である。

一方、ある種の生物（線虫：Caenorhabditis elegans）では、二本鎖ＲＮＡ（double-strand RNA：ｄｓＲＮＡ）によって遺伝子の発現を特異的に阻害できることが見い出されている（例えば、特許文献１、非特許文献３参照。）。この現象は、ある遺伝子と相同な、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなるｄｓＲＮＡが、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を破壊するという現象で、ＲＮＡｉ（RNA interference：ＲＮＡ干渉）と呼ばれている。この現象は、その後、種々の動物（例えば、非特許文献４〜６参照。）や、植物（例えば、非特許文献７参照。）を含む下等な真核細胞において見い出されている。

ＲＮＡｉは、発見された当初、哺乳動物細胞においては、約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞内へ導入すると、インターフェロン応答の誘導による非特異的な遺伝子発現抑制が生じるために、ＲＮＡｉによる特異的な遺伝子発現阻害が観察されなくなるため、哺乳動物細胞での利用は困難と思われていた。しかし、２０００年にマウス初期胚や哺乳動物培養細胞においてもＲＮＡｉが起こりうることが示され、ＲＮＡｉの誘導機構そのものは、哺乳動物細胞にも存在することが明らかとなった（例えば、特許文献２、非特許文献８参照。）。

このようなＲＮＡｉの機能を利用して、哺乳動物においてもある特定の遺伝子又は遺伝子群の発現を阻害することができれば有益であることは明らかである。多くの疾病（癌、内分泌疾患、免疫疾患など）は、哺乳動物の中で、ある特定の遺伝子又は遺伝子群が異常発現することによって起こるので、遺伝子又は遺伝子群の阻害は、これらの疾病を治療するために使用することができる。また、変異型タンパク質の発現に起因して疾病が発症することもあり、このような場合には、変異した対立遺伝子の発現を抑えることで、疾病の治療が可能となる。さらに、このような遺伝子特異的な阻害は、例えば、ＨＩＶなどのレトロウイルス（レトロウイルス中のウイルス遺伝子は、それらの宿主のゲノム中に組み込まれて、発現される。）によって引き起こされるウイルス疾患を治療するためにも使用できるといわれている。

ＲＮＡｉの機能を引き起こすｄｓＲＮＡは、当初、約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡの細胞内への導入が必要と考えられていたが、最近、更に短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering RNA）が、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが明らかになった（例えば、非特許文献９参照。）。ｓｉＲＮＡは、体細胞の全ての発生段階において遺伝子の発現を抑制する強力な手段として認識されており、進行性の遺伝病等において、発病する前に、病気の原因となる遺伝子の発現を抑制する方法として期待できる。
国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号パンフレット国際公開第ＷＯ０１／３６６４６号パンフレット Nature, 417, 949-954, 2002 Cancer Research, 63, 756-759, 2003 Nature, 391, 806-811, 1998 Cell, 95, 1017-1026, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14687-14692, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5049-5054, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959-13964, 1998 FEBS Lett, 479, 79-82, 2000 Nature, 411, 494-498, 2001

ＢＲＡＦの突然変異の頻度に関しては、悪性黒色腫を含む各種癌で広範に検索されており、その中でも悪性黒色腫における変異頻度が６６％と圧倒的に高い（非特許文献１）。しかもその変異はキナーゼドメインに集中しており、Ｖ５９９Ｅ（５９９番目のバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）に変わる点突然変異）の点突然変異が８０％を占めている。これらの変異ＢＲＡＦは、キナーゼ活性の上昇とＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフォーメーション活性を伴うことから、悪性黒色腫の発生に深く関与していることが示唆されている。また、多くの悪性黒色腫細胞株や悪性黒色腫組織において、恒常的にＭＡＰＫ活性の亢進が認められ（非特許文献２）、癌化との関連性が示唆されている。本発明者らの検討でも、多くの悪性黒色腫細胞株で恒常的なＭＡＰＫ活性の亢進を認めたが、その程度は様々であり、Ｖ５９９Ｅ変異の有無とは相関を認めていない。このことは、生理的レベルの変異ＢＲＡＦは、単独でＭＡＰＫの活性を規定する因子ではない可能性を示唆している。しかしながら、現在までに変異または非変異ＢＲＡＦを標的とした治療システムの報告はない。

本発明の課題は、ＲＮＡｉ法を利用して、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子等のＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡを発現することができる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、二本鎖ＲＮＡ発現カセットを含む二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを作製し、癌特異的なＲＮＡｉ誘導が可能で高頻度に変異を有するＢＲＡＦを分子標的とする安全性の高い悪性黒色腫等の癌特異的治療法を提供することにある。

本発明者らは、本発明者らにより開発されたＵ６プロモーターを利用したプラスミドベクターによるｓｉＲＮＡ発現システム（Nature Biotechnology, 19, 497-500, 2002）を改良し、より遺伝子導入効率が高く、またｓｉＲＮＡ発現が安定に持続するレンチウイルスベクターシステムを開発している。このｓｉＲＮＡ発現が安定に持続するレンチウイルスベクターシステムを用いて、Ｖ５９９Ｅ変異個所を標的とするＶ５９９Ｅ変異特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターと変異非特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した。すなわち、ＢＲＡＦｍＲＮＡのタンパク翻訳領域にＲＮＡｉの標的配列を複数個所設定し、ＲＮＡｉ効果を発揮するｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡの発現形をレンチウイルスベクター上に構築し、標的配列として、Ｖ５９９Ｅを含む個所と、その他の個所の二種類を設定して組換えウイルスベクターを作製した。

次に、インビトロにおけるＢＲＡＦＲＮＡｉ効果を検討するため、ＢＲＡＦＶ５９９Ｅ変異が陽性または陰性の各種悪性黒色腫細胞株に、前記組換えウイルスベクターを感染後、ウエスタンブロットにより効果を認めたｓｉＲＮＡ発現ベクターを選択した。次に、これらのｓｉＲＮＡ発現ウイルスベクターをＢＲＡＦＶ５９９Ｅ変異が陽性又は陰性の各種悪性黒色腫細胞株に感染させ、それらの増殖に与える影響とＭＡＰＫ活性に与える影響を検討し、両者の相関を検討した。その結果、ＢＲＡＦＶ５９９Ｅ変異特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ＢＲＡＦＶ５９９Ｅ変異特異的抑制効果を認めたこと、また、ＲＮＡ干渉法によるＢＲＡＦ発現の特異的抑制は、ＭＡＰＫ経路のシグナル伝達を強力に抑制し、増殖シグナルの抑制に基づく強力な増殖抑制効果または細胞死誘導効果をもたらすことを見い出した。また、Ａ３７５ｍｅｌ細胞株にＢＲＡＦ非変異個所を標的にしたｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを感染させたところ、matrigel invasion assayにおいて、著名な浸潤能の抑制を認めた。さらに、発現レンチウイルスベクターを導入したＡ３７５ｍｅｌ細胞株を皮下移植した腫瘍のインビボでの増殖が抑制されたことを見い出した。以上の知見に基づいて本発明は完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ（請求項１）や、ＢＲＡＦ遺伝子が、変異ＢＲＡＦ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項２）や、変異ＢＲＡＦ遺伝子が、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項３）や、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列が、変異ＢＲＡＦｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項４）や、変異ＢＲＡＦｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列が、配列表の配列番号２に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項４記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項５）や、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列が、配列表の配列番号３又は４に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項６）や、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列が、１９〜２１ｂｐの塩基配列であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項７）に関する。

また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現カセット（請求項８）や、配列表の配列番号５に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項８記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット（請求項９）や、配列表の配列番号６又は７に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項８記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット（請求項１０）や、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現ベクター（請求項１１）や、ＨＩＶレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項１１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター（請求項１２）や、請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とするＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制剤（請求項１３）や、請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする癌の予防及び／又は治療剤（請求項１４）や、癌が、ＢＲＡＦ遺伝子変異又は発現亢進に起因する癌であることを特徴とする請求項１４記載の癌の予防及び／又は治療剤（請求項１５）や、癌が、悪性黒色腫であることを特徴とする請求項１４記載の癌の予防及び／又は治療剤（請求項１６）に関する。

さらに本発明は、請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とするＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制方法（請求項１７）や、請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とする癌の予防及び／又は治療方法（請求項１８）や、癌が、ＢＲＡＦ遺伝子変異又は発現亢進に起因する癌であることを特徴とする請求項１８記載の癌の予防及び／又は治療方法（請求項１９）や、癌が、悪性黒色腫であることを特徴とする請求項１８記載の癌の予防及び／又は治療方法（請求項２０）に関する。

実施例の結果からもわかるように、ＲＮＡ干渉法によるＢＲＡＦ発現の特異的抑制は、ＭＡＰＫ経路のシグナル伝達を強力に抑制し、増殖シグナルの抑制に基づく強力な増殖抑制効果または細胞死誘導効果をもたらすことが示された。インビトロの細胞増殖抑制効果は、インビボにおける増殖抑制効果も同様に誘導することを強く示唆しており、有用な遺伝子治療薬として期待できる。また、本発明のＶ５９９Ｅ変異特異的なｓｉＲＮＡは、悪性黒色腫で高頻度に認められた変異個所に特異的に作用することから、正常細胞を傷害することなく、癌細胞に特異的に作用する効果が期待できるため、安全性の高い分子標的治療法に用いることができる。Ｖ５９９Ｅ変異非特異的ｓｉＲＮＡに関しては、癌細胞と正常細胞との間でＢＲＡＦの発現差に基づく治療ウィンドウが設定できれば、選択的治療効果を生み出す可能性が期待できる。また、これらのｓｉＲＮＡは、医療分野への応用のみならず、ＢＲＡＦ−ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の基礎研究における道具としても、極めて有用性が高い。

本発明の二本鎖ＲＮＡとしては、ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡであれば特に制限されるものではなく、上記ＢＲＡＦ遺伝子の由来としては特に限定されないがヒト由来のＢＲＡＦ遺伝子が好ましく、中でも変異ＢＲＡＦ遺伝子が好ましい。かかる変異ＢＲＡＦ遺伝子としては、Ｖ５９９Ｅ、Ｌ５９６Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６８Ａで示される変異ＢＲＡＦの遺伝子ＤＮＡを具体的に例示することができるが、悪性黒色腫の発生に深く関与している配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子（ＢＲＡＦ遺伝子の１８５７番目のＴがＡに置換された変異遺伝子）を特に好適に例示することができる。

上記ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列とは、ＢＲＡＦｍＲＮＡの特定の領域の部分配列、好ましくは１９〜２１ｂｐの塩基長の部分配列をいい、かかるＢＲＡＦｍＲＮＡの標的配列としては、ＢＲＡＦｍＲＮＡに特異的配列が好ましいが、変異ＢＲＡＦｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列であることが特に好ましい。かかる変異ＢＲＡＦｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列として、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子の変異部分を含む、配列表の配列番号２に示される塩基配列GCT ACA GaG AAA TCT CGA T（配列番号１に示される塩基配列の１８５０〜１８６８番目の１９mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡを具体的に例示することができる。また、変異ＢＲＡＦ遺伝子の変異部位を含む特定配列ではないが、ＢＲＡＦｍＲＮＡの発現を抑制することができる標的配列として、配列表の配列番号３に示される塩基配列GCC ACA ACT GGC TAT TGT TA（配列番号１に示される塩基配列の１６２４〜１６４３番目の２０mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡや、配列表の配列番号４に示される塩基配列（配列番号１に示される塩基配列の１６６９〜１６８９番目の２１mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡを具体的に例示することができる。これらＶ５９９Ｅ変異非特異的ｓｉＲＮＡに関しては、癌細胞と正常細胞との間でＢＲＡＦの発現差に基づく治療ウィンドウが設定できれば、選択的治療効果を生み出す可能性が期待できる。

また、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとは、例えば上記配列番号２〜４に示されるＤＮＡ配列由来のＲＮＡをいい、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なアンチセンス鎖ＲＮＡとは、上記センス鎖ＲＮＡと相補的RNAをいい、本発明の二本鎖ＲＮＡは、通常これらセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡ同士が結合したｓｉＲＮＡとして構築されるが、便宜上、センス鎖ＲＮＡ配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された変異センス鎖ＲＮＡ配列と該変異センス鎖ＲＮＡ配列に相補的な変異アンチセンス鎖ＲＮＡ配列とのｓｉＲＮＡとして構築した二本鎖ＲＮＡも本発明の範囲に含まれる。

本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を作製するには、合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖ＤＮＡやアンチセンス鎖ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできるが、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットを構築し、該二本鎖ＲＮＡ発現カセットを発現ベクターのプロモーターの下流に連結し、インビボでの発現・構築により所望の二本鎖ＲＮＡを作製することが好ましい。

ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる上記本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセットとしては、TTCAAGAGAをリンカー配列とした、配列表の配列番号５に示される塩基配列GCT ACA GaG AAA TCT CGA T TTCAAGAGA ATC GAG ATT TCt CTG TAG C tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットや、配列表の配列番号６に示される塩基配列GCC ACA ACT GGC TAT TGT TA TTCAAGAGA TA ACA ATA GCC AGT TGT GGC tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットや、配列表の配列番号７に示される塩基配列GTA TCA CCA TCT CCA TAT CAT TTCAAGAGA ATG ATA TGG AGA TGG TGA TAC tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットを具体的に例示することができる。これら二本鎖ＲＮＡ発現カセットは、宿主細胞内で転写されると、センス鎖ＤＮＡに相当するセンス鎖ＲＮＡと、アンチセンス鎖ＤＮＡに相当するアンチセンス鎖ＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを形成することができる。

また、二本鎖ＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することができる発現ベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、アデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）や、アデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、ＨＩＶレンチウイルスベクターは、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好ましい。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。これらの発現ベクターへの二本鎖ＲＮＡ発現カセットの導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流に二本鎖ＲＮＡ発現カセットを挿入することにより本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。

本発明のＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制剤や、本発明の癌の予防及び／又は治療剤としては、上記本発明の二本鎖ＲＮＡ、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、これらＢＲＡＦ遺伝子発現抑制剤や癌の予防・治療剤を哺乳動物の生体、組織、細胞等に投与又は導入するに際しては、この分野で通常用いられる薬学的に許容される担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分とともに用いることができる。該薬学的に許容される担体とともに用いる薬学的組成物は、その投与形態、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）投与、或いは非経口投与（注射剤等）等に合わせて、薬学の分野ではそれ自体周知の製剤形態で製剤化することができる。

また、本発明のＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制方法や、本発明の癌の予防及び／又は治療方法としては、上記本発明の二本鎖ＲＮＡ、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、哺乳動物の生体、組織又は細胞に導入する方法であれば特に制限されるものではなく、これら二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの哺乳動物の生体、組織又は細胞への導入方法としては、経口的又は非経口的に投与する方法を挙げることができる。例えば、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。また、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。

本発明の癌の予防・治療剤や本発明の癌の予防・治療方法の対象となる癌としては、ＢＲＡＦ遺伝子変異又はＢＲＡＦ遺伝子の発現亢進に起因する癌を例示することができ、より具体的には、悪性黒色腫の他、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、甲状腺癌等を挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（材料及び方法）
［ＢＲＡＦを標的とするｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターの構築］
ＢＲＡＦｍＲＮＡのコーディング領域内で、Ｖ５９９Ｅ変異を含む個所と、それ以外の個所の二個所に、１９〜２１塩基長のＲＮＡｉ標的部位を複数個所選択した。選択基準は、ＴまたはＡが４個以上連続する配列は避け、ＧＣ含量が３０〜６０％程度で、ＡＡＧ／Ａで始まる個所を選択し、その中でＲＮＡの二次構造予測プログラム（http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/）上、開いた構造を取る配列を候補とした。合計１２種類の標的配列に対応するｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを作製した（Ｖ５９９Ｅを含む領域が７種類、それ以外の領域が５種類）。図１に、ｓｉＲＮＡ発現ＨＩＶレンチウイルスベクタープラスミドの構造を示す。Ｕ６プロモーターの下流のBspMIサイトに、標的ｍＲＮＡ配列と相同な１９〜２１塩基長のｃＤＮＡ（センス鎖）、リンカー配列、センス鎖と相補的なｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）、転写終結シグナルのＴＴＴＴＴからなる合成ヌクレオチドを挿入し、Ｕ６プロモーターから標的ｍＲＮＡ配列と相同なセンス鎖−リンカー−アンチセンス鎖ＲＮＡが発現できるユニットを作製した。このＲＮＡは、細胞内で転写された後、リンカー部分でループを形成して、センス鎖とアンチセンス鎖の間でステム構造を取り、細胞質内でDicerによりリンカー部分が切断された後ｓｉＲＮＡになると予想される。これらｓｉＲＮＡ発現プラスミドを、他の３種類のＨＩＶパッケージングプラスミド（pMD.G，pRSV-Rev，pMDlg/p，ＲＲＥ）とともに、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、４８〜７２時間後の培養上清に産出されてくるレンチウイルスベクターを回収し、Centriprep ＹＭ−５０（Millipore社製）を用いて濃縮した。ウイルス力価は、２９３Ｔ細胞に感染させたＨＩＶベクターが発現するＧＦＰタンパクの蛍光をフローサイトメーターで測定することにより算出した。また、コントロールウイルスとして、蛍ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ発現ベクターを作製して用いた。
［ＢＲＡＦＲＮＡｉ効果の検討］
上記で作製したｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを２９３Ｔ細胞または各種悪性黒色腫細胞株に感染させた後、ＧＦＰ発現がコントロールと同レベルであることを確認した上で、タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット法でＢＲＡＦの発現抑制効果を確認した。タンパク抽出は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１２．５ｍＭ β−glycerophosphate，２ｍＭＥＧＴＡ，１０ｍＭＮａＦ，１ｍＭ bebzamide，１％ＮＰ−４０／Complete，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Roche社製），１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄を用いて、細胞溶解後に上清を回収し、タンパク質濃度をDC Protein assay kit（Promega社製）で測定した。また、タンパク質量のコントロールとして、アクチンタンパク質のウェスタンブロットを行った。
［インビトロ増殖抑制効果の検討］
１０種類の悪性黒色腫細胞株（Ｓｋｍｅｌ２３，１３６３ｍｅｌ，Ａ３７５ｍｅｌ，３９７ｍｅｌ，５０１Ａｍｅｌ，５２６ｍｅｌ，６２４ｍｅｌ，９２８ｍｅｌ，１３６２ｍｅｌ，８８８ｍｅｌ）各５０，０００個に対して、上記でＢＲＡＦ発現抑制効果の認めたｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを、５０〜１００ＭＯＩ（multiplicity of infection）で感染し、３日毎に９日目までの細胞数の変化を計測し、ＢＲＡＦＲＮＡｉの細胞増殖に与える抑制を検討した。
［ＭＡＰキナーゼ経路に与える影響の検討］
上記でｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクター感染を行った悪性黒色腫細胞株より抽出したタンパク質で、ＥＲＫ１及びリン酸化ＥＲＫのウェスタンブロットを行い、ＢＲＡＦの発現抑制が、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化状態に与える影響を検討した。
［動物実験］
６週齢のオスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Japan Clea社製）に、ｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターで感染したＡ３７５ｍｅｌ細胞５×１０⁶を皮下接種した。移植後、腫瘍の大きさ（最大直径×垂直方向の直径×高さ）を、２〜３日ごとに、２４日目まで測定した。動物実験プロトコ−ルは、慶應義塾大学医学部の動物実験委員会によって承認された。マウスは、慶應義塾大学動物実験委員会によるガイドラインに従って処理した。
（結果）
［ＢＲＡＦを標的とするｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターによるＲＮＡｉ効果］
ＲＮＡｉ効果は、ｓｉＲＮＡの標的配列依存性が高いため、多種類のｓｉＲＮＡの効果を最初に検討した。合計１２種類のレンチウイルスベクター中、ウェスタンブロットでＢＲＡＦの発現抑制効果を認めたものは、＃１０，＃１’，＃７’の三種類であった。それぞれのｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列を図２に示す。＃１’（配列番号２）は、Ｖ５９９Ｅ変異個所を含み、８番目の塩基がＴからＡに変異している配列を標的にしている。＃１０（配列番号４）と＃７’（配列番号３）は、変異個所ではない配列を標的にしている。２９３Ｔ細胞（Ｖ５９９Ｅ変異なし）と、Ａ３７５ｍｅｌ細胞（Ｖ５９９Ｅ変異あり）に対して感染を行った後のＢＲＡＦのウェスタンブロットの結果を図３に示す。＃１’は、Ｖ５９９Ｅ変異陽性ＢＲＡＦを発現していない２９３Ｔ細胞では抑制効果を認めなかったが、変異陽性ＢＲＡＦをもつＡ３７５ｍｅｌ細胞に対しては、著明な抑制効果を認めたことから、Ｖ５９９Ｅ変異陽性ＢＲＡＦの発現を特異的に抑制したことが示唆された。一方、非変異個所を標的にしたｓｉＲＮＡ＃１０と＃７’では、Ｖ５９９Ｅ変異の有無に関わらず、２９３Ｔ細胞とＡ３７５ｍｅｌ細胞の両者に強い抑制効果をもたらした。
［ＢＲＡＦｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターによるインビトロ細胞増殖抑制効果］
上記でＢＲＡＦ発現抑制効果を認めた３種類のｓｉＲＮＡ発現ベクターを１０種類の悪性黒色腫細胞株に５０〜１００ＭＯＩで感染させ、その細胞増殖に与える影響をコントロールのＧＬ３Ｂ（蛍ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ）発現ベクター感染細胞と比較した結果を図４に示す。Ｓｋｍｅｌ２３細胞と１３６２ｍｅｌ細胞の二株のみＢＲＡＦＶ５９９Ｅ変異が陰性であり、他の８株は陽性であった。すべての細胞株を通じて、最も強い増殖抑制効果を認めたものは、ｓｉＲＮＡ＃１０であった。一方、ｓｉＲＮＡ＃１’は、Ｖ５９９Ｅ変異のないＳｋｍｅｌ２３と１３６２ｍｅｌ細胞には全く増殖抑制しなかったが、変異陽性の８株中５株に明らかな増殖抑制効果をもたらし、特に、５２６ｍｅｌと６２４ｍｅｌに対する効果は、＃１０と同程度かそれ以上であった。また、９２８ｍｅｌや８８８ｍｅｌ細胞など、強い細胞死の誘導効果を認めた細胞株も存在した。
［ＢＲＡＦの発現抑制がＭＡＰキナーゼ経路に与える影響］
図５に、ｓｉＲＮＡ発現ベクター感染後の各種悪性黒色腫細胞株から抽出したタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＢＲＡＦタンパク質の発現抑制と同時に、リン酸化ＥＲＫの検出レベルが低下していた。ＥＲＫタンパク質レベルには、コントロールのＧＬ３ＢとＢＲＡＦｓｉＲＮＡの間で差を認めなかったことから、リン酸化ＥＲＫの低下は、ＥＲＫタンパク質レベルの低下ではなく、そのリン酸化レベルの低下を示しており、ＭＡＰキナーゼ経路が抑制されたことを意味している。
［悪性黒色腫細胞株の浸潤能の抑制効果］
Ａ３７５ｍｅｌ細胞株にＢＲＡＦ非変異個所を標的にしたｓｉＲＮＡ＃１０発現レンチウイルスベクターを感染させたところ、matrigel invasion assayにおいて、著名な浸潤能の抑制を認めた（図６ａ）。これは、matrix metalloproteinase-2の活性低下（図６ｂ）とβ１integrin（図６ｃ）の発現低下を伴っていた。細胞外基質の分解や接着に関わるこれらの分子の発現は、ＭＡＰキナーゼシグナルによって制御されていることから、ＢＲＡＦＲＮＡｉによる、ＭＡＰＫ経路のシグナル抑制がこれらの分子の発現低下を介して、浸潤能の抑制効果を誘導した可能性が考えられる。このことは、ＢＲＡＦのシグナル伝達抑制は、細胞増殖だけでなく、癌の浸潤・転移などの悪性形質の抑制効果に結びつく可能性を示唆しており、本法の癌治療としての有効性を示唆すると考えられる。
［インビボにおける悪性黒色腫細胞株の増殖抑制効果］
Ｖ５９９Ｅ変異個所を標的にしたｓｉＲＮＡ＃１’発現レンチウイルスベクター、又は非変異個所を標的にしたｓｉＲＮＡ＃１０発現レンチウイルスベクターを導入したＡ３７５ｍｅｌ細胞株を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した後、腫瘍の体積を経時的に計測した（図７）。図７からわかるように、ｓｉＲＮＡ導入群、特にｓｉＲＮＡ＃１０導入群で、コントロール群のＧＬ３Ｂ（蛍ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ）発現ベクター感染Ａ３７５ｍｅｌ細胞よりも有意な増殖抑制効果を認めた。インビボでは、ＢＲＡＦ−ＭＡＰＫ経路以外の増殖シグナルも伝達される可能性が考えられるが、ＢＲＡＦＲＮＡｉにより有意な増殖効果を認めたことは、インビボにおいてもこの経路が主要な増殖シグナル伝達経であることを示唆しており、本法の癌治療法としての有効性を示唆すると考えられた。

本発明のｓｉＲＮＡ発現ＨＩＶレンチウイルスベクタープラスミドの構造を示す図である。本発明のそれぞれのｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列を示す図である。本発明の２９３Ｔ細胞と、Ａ３７５ｍｅｌ細胞に対して感染を行った後のＢＲＡＦのウェスタンブロットの結果を示す図である。本発明のｓｉＲＮＡ発現ベクターを１０種類の悪性黒色腫細胞株に５０〜１００ＭＯＩで感染させ、その細胞増殖に与える影響をコントロールのＧＬ３Ｂ発現ベクター感染細胞と比較した結果を示す図である。本発明のｓｉＲＮＡ発現ベクター感染後の各種悪性黒色腫細胞株から抽出したタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す図である。悪性黒色腫細胞株の浸潤能の抑制効果示すmatrigel invasion assayの結果（ａ）と、gelatin zymography によるmatrix metalloproteinase-2活性の比較（ｂ）及びβ１integrin（ｃ）のウェスタンブロットの結果を示す図である。インビボにおける悪性黒色腫細胞株の増殖抑制効果を示す腫瘍サイズの経時変化の図である。

Claims

ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ。
ＢＲＡＦ遺伝子が、変異ＢＲＡＦ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ。
変異ＢＲＡＦ遺伝子が、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の二本鎖ＲＮＡ。
ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列が、変異ＢＲＡＦｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ。
変異ＢＲＡＦｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列が、配列表の配列番号２に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項４記載の二本鎖ＲＮＡ。
ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列が、配列表の配列番号３又は４に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ。
ＢＲＡＦｍＲＮＡの標的となる特定配列が、１９〜２１ｂｐの塩基配列であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ。
請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現カセット。
配列表の配列番号５に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項８記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット。
配列表の配列番号６又は７に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項８記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット。
請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
ＨＩＶレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項１１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とするＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制剤。
請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする癌の予防及び／又は治療剤。
癌が、ＢＲＡＦ遺伝子変異又は発現亢進に起因する癌であることを特徴とする請求項１４記載の癌の予防及び／又は治療剤。
癌が、悪性黒色腫であることを特徴とする請求項１４記載の癌の予防及び／又は治療剤。
請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とするＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制方法。
請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項８〜１０のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項１１若しくは１２記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とする癌の予防及び／又は治療方法。
癌が、ＢＲＡＦ遺伝子変異又は発現亢進に起因する癌であることを特徴とする請求項１８記載の癌の予防及び／又は治療方法。
癌が、悪性黒色腫であることを特徴とする請求項１８記載の癌の予防及び／又は治療方法。