WO2012161539A2 - ＢＨＲＦ１ 발현 억제를 위한 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

ＢＨＲＦ１ 발현 억제를 위한 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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WO2012161539A2
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bhrf1
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ebv
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이숙경
신희종
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • Si RNA for inhibiting BHRF 1 expression and a composition comprising the same
  • the present invention relates to siRNA for suppressing BHRF1 expression of EBV (Epstein-Bar virus) and anticancer drug resistance inhibition using the same. More specifically, the present invention relates to a siRNA for inhibiting BHRF1 expression and a composition for inhibiting anticancer agent resistance to EBV-positive gastric cancer comprising the same. In addition, the present invention relates to a composition for treating EBV-positive gastric cancer comprising the siRNA and an anticancer agent.
  • EBV Epstein-Bar virus
  • Epstein-Bar virus is the first gamma herpes virus found in Africa associated with Burkitt's lymphoma.
  • EBV Error virus
  • Burkitt's lymphoma or nasopharyngeal tumor a variety of tumors, including Burkitt's lymphoma or nasopharyngeal tumor.
  • EBV genes are expressed in some gastric cancers, and about 4-18% of gastric cancer patients worldwide are known as EBV-positive gastric cancers.
  • the pathological role of EBV in gastric cancer has not been elucidated.
  • EBV has several latent genes and lytic genes. In general, EBV is thought to express latent genes in EBV-related tumors, but its relationship with lytic genes has not been studied. to be.
  • Ming is based on the finding that EBV-positive gastric cancer shows higher anticancer drug resistance compared to EBV-negative gastric cancer.
  • the present inventors also confirmed that when EBV-positive gastric cancer is treated with anticancer agents, EBV lysate genes including BHRF1 begin to be expressed, and thus the expressed BHRF1 may act as a factor indicating anticancer drug resistance. Therefore, in order to increase the anticancer drug sensitivity of EBV-positive gastric cancer cells showing anticancer drug resistance by reducing the BHRF1 of EBV, The study focused on providing one siRNA.
  • siRNACsmall interference RNA is a substance that induces RNA RNA interference) and refers to a short double-chain RNA composed of dozens or dozens of nucleotides.
  • RNAi introduces a double-chain RA (douMe strand RNA) consisting of a sense RNA having a sequence homologous to an mRNA of a target gene and an antisense RNA having a sequence complementary thereto to selectively induce degradation of the mRNA of the target gene. Or a phenomenon that can inhibit the expression of a target gene.
  • RNAi can selectively inhibit the expression of the target gene, attracting considerable attention as a simple gene knock-down method to replace the conventional method of gene destruction by inefficient homologous recombination.
  • the siRNA is injected into the cell to inhibit the gene expression of mRNA of the target gene complementary to the siRNA.
  • siRNA does not necessarily inhibit the ability of the target mRNA effectively, and a high efficiency siRNA sequence can be used to achieve the therapeutic purpose. Finding hyperactive targets is very important.
  • siRNA is prepared by selecting a plurality of target sites per mRNA of a gene, and a process of discovering an optimal position sequence having excellent expression suppression efficacy by directly confirming their effects at least at the cell level is required. In this regard, there have been few reports on the development of siRNA capable of effectively inhibiting the expression of BHRF1 and the study of anticancer treatment using siRNA against BHRF1. [Detailed Description of the Invention]
  • the present inventors have made efforts to provide siRNA capable of effectively inhibiting the expression of BHRF1 and to provide it for the purpose of inhibiting anticancer drug resistance.
  • the present inventors were able to identify a target site capable of effectively suppressing the expression of BHRF1.
  • Treatment of siRNA complementary to the target site with EBV-positive gastric cancer cells with an anticancer agent was found to reduce cell viability and promote cell death.
  • the present invention has been completed by confirming that the siRNA may contribute to effective EBV-positive gastric cancer treatment by inhibiting anticancer drug resistance in EBV-positive gastric cancer cells.
  • An object of the present invention is to identify a target site of siRNA that can effectively inhibit the expression of BHRF1 and to provide an siRNA that binds to this target site. It is also to provide the siRNA for the purpose of inhibiting anticancer drug resistance.
  • one object of the present invention is the 18-36 nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 165 to 184 nucleotide sequence, 243 to 262 nucleotide sequence, 487 to 506 nucleotide sequence, And it is to provide an siRNA that binds to the nucleotide sequence selected from the group consisting of 519 to 539 nucleotide sequence to inhibit the expression of the BHRF1 gene.
  • Another object of the present invention to provide a composition for treating EBV-positive gastric cancer comprising the siRNA and anticancer agent.
  • FIG. 1 shows cell viability when docetaxel was treated to EBV-negative gastric cancer cells (AGS) and EBV-positive gastric cancer cells (AGS-EBV), which were repeated three times with Triplicate. The mean and SD values of the results are plotted (*, p ⁇ 0.05; ** 'means ⁇ .01).
  • Figure 2 shows the EBV lytic gene when docetaxal treatment in AGS-EBV cells
  • Figure 3 shows the mRNA sequence of the BHRF1 gene and binding sites of 40 BHRFl siRNAs #A to #E and # 1 to # 35 produced in the present invention.
  • Figure 4 shows the change in the number of cells when treated with docetaxel after treatment with BHRFl siRNA #C, # 2 and # 32 in AGS-EBV cells, respectively. A scramble siRNA was used as a negative control.
  • (B) shows the results in AGS cells.
  • Figure 5 shows the change in cell death rate when treated with docetaxel after treatment with BHRFl siRNA # (: in AGS-EBV cells. Scramble siRNA was used as a negative control.
  • FIG. 6 shows the Weston blot results confirming cell death and cell cycle control related gene expression when AGS-EBV cells and AGS cells treated with siRNA #C and / or docetaxel, respectively. Scramble siRNA was used as a negative control.
  • FIG. 7 (A) shows Western blot results confirming whether or not BHRFl siRNA 5 t) is treated with AGS-EBV cells and then treated with docetaxel to inhibit expression of BHRF1 gene. A scramble siRNA was used as a negative control.
  • (B) is the result of confirming once again about BHRFl siRNA 4 species (# ⁇ # 1).
  • FIG. 8 (A) confirms whether BHRF1 gene expression is suppressed when dostaxel is treated after 35 kinds of BHRFl siRNAs (# 1 to # 35) are treated with AGS-EBV cells, respectively. Western blot results. Scramble siRNA was used as a negative control. (B) is the result of confirmation once again. (C) is a graph showing the results of normal izat ion expression of BHRF1 expression for -act in used as a loading control.
  • Figure 9 shows the treatment of docetaxel after treatment of 9 siRNAs (# 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26 and # 32) to AGS-EBV cells, respectively.
  • Real-time RT-PCR results confirming whether or not to suppress the expression of the BHRF1 gene is shown.
  • a scramble siRNA was used as a negative control.
  • FIG. 10 shows Western blot results confirming whether or not BHRF1 gene expression is suppressed when BHRF1 siRNAs are treated in the state of expressing BHRF1.
  • a scramble siRNA was used as a negative control.
  • FIG. 11 shows Western blot results confirming whether AHs-EBV cells inhibit the expression of BHRF1 gene when BHRF1 siRNAs were treated with various concentration ranges (1, 5, 10 nM) and treated with iso Jtaxel. A scramble siRNA was used as a negative control.
  • Figure 12 shows the Western blot results confirming whether or not to suppress the expression of the BHRF1 gene when treated with BHRF1 siRNA in SNU-719 cells.
  • a scramble siRNA was used as a negative control.
  • Figure 13 shows the siRNA target site on the BHRFlmRNA provided in the present invention and siRNA binding thereto.
  • the present invention relates to an siRNA that binds to a specific target site that can effectively suppress the expression of BHRF1.
  • the present invention provides a 18-36 nucleotide sequence of BHRF1 m NA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 165-184 nucleotide sequence, 243-262 nucleotide sequence, 487-506 nucleotide sequence, and 519 To 539 nucleotide sequence It relates to an siRNA that binds to a nucleotide sequence selected from the group consisting of and inhibits the expression of BHRF1 gene.
  • the siRNA may be a double stranded siRNA having a length of 19 to 21 nucleotides.
  • the siRNA is a nucleotide pair of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, nucleotide pair of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, nucleotide pair of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 Nucleotide pair, nucleotide pair of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, nucleotide pair of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41, nucleotide pair of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, nucleotide pair of SEQ ID NO: 46, and SEQ ID NO: 47 And siRNA consisting of nucleotide pairs selected from the group consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63.
  • the present invention relates to a composition for inhibiting anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer comprising the BHRF1 siRNA.
  • the present invention relates to a composition for treating EBV-positive gastric cancer comprising BHRF1 siRNA and an anticancer agent.
  • RNA refers to a short double-chain RNA capable of inducing degradation of a target mRNA or inhibiting expression of a target gene through cleavage of a target mRNA.
  • the siRNA of the present invention is not limited to being completely complementary to the target mRNA, and is not paired by mismatches (corresponding bases are not complementary) or bulges (no bases on one chain). This may be included.
  • the nucleotide length of the siRNA of the present invention may be double-stranded RNA of 10 to 40 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides, more preferably 19 to 21 nucleotides in length, which may interfere with the activation and expression of BHRF1.
  • the length of an siRNA refers to the length of nucleotides forming a double strand (pairing).
  • the SiRNA terminal structure of the present invention by the RNAi effect As long as it can be suppressed, both blunt ends or cohesive ends are possible.
  • the cohesive end structure can have both a structure overhanging the 3 'end and a structure overhanging the 5' end.
  • the number of protruding nucleotides is not limited, but may be, for example, 1 to 8 nucleotides, preferably 1 to 4 nucleotides.
  • the siRNA is a sequence consistent with or complementary to the BHRF1 mRNA in a range capable of maintaining the expression inhibitory effect of the target gene, for example, dTdT, UU, or a double-stranded portion at one end of the protruding portion. And the like.
  • the siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure at both sides, and may be a stem loop type structure in which one terminal site of the double-chain RNA is connected by a linker RA.
  • the length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with pairing of stem parts.
  • SiRNA provided by the present invention is the BHRF1 mRNA represented by SEQ ID NO: 1 18-36 nucleotide sequence, 165-184 nucleotide sequence, 243-262 nucleotide sequence, 487-506 nucleotide sequence, And an siRNA that binds to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 519 to 539 nucleotide sequences, thereby inhibiting the expression of the BHRF1 gene.
  • the siRNA that binds to the 18-36th nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA may be an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63.
  • the siRNA is named siRNA # 26.
  • the siRNA that binds to the 165th to 184th nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA may be an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, or an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17.
  • the siRNA is named siRNA # 2 and # 3, respectively.
  • the siRNA that binds to the nucleotides 243 to 262 of the BHRF1 mRNA may be a siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, or a nucleotide of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 It may be a paired siRNA.
  • the siRNA is named siRNA #C and # 9, respectively.
  • the siRNA that binds to the 487-506th nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA is an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, or a nucleo of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41 It may be an siRNA composed of tide pairs.
  • the siRNA is named siRNA # 14 and # 15, respectively.
  • the siRNA that binds to the 519th to 539th nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA is an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, or nucleosides of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 SiRNA consisting of a pair of tide.
  • the siRNA is named siRNA # 17 and # 18, respectively.
  • the siRNA of the present invention can be chemically modified in a general manner known in the art to prevent rapid degradation by nucleic acid enzymes in vivo and increase the stability in vivo.
  • the hydroxyl group in the 2'-position of the sugar ring of at least one nucleotide contained in the siRNA is a hydrogen atom, a halogen atom,
  • -0-alkyl group -0-acyl group or amino group, specifically H, OR, R, R'OR, SH, SR,
  • the phosphoric acid backbone may be modified with phosphorothioate, phosphoro dithioate, alkylphosphonate, phosphoramidate, or boranophosphate.
  • At least one of the nucleotides included in the siRNA of the present invention is a nucleic acid of any one of the locked nucleic acid (LNA), unlocked nucleic acid (UNA), morpholino, peptide nucleic acid (PNA) It may be characterized as being substituted to have an analogous form.
  • LNA locked nucleic acid
  • UNA unlocked nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • PNA, morpholino and the like can be prepared by knowledge known in the art based on the siRNA sequence information provided in the present invention, and reference can be made to existing literature (VeeduRN, Wengel J. Chem Biodivers.7 ( 3): 536-42, 2010; DemidovW. Trends Biote.chnol. 21 (1): 4-7, 2003; Shantanu Karkare, et al. , Appl Microbiol Biotechnol, 71: 575—586, 2006).
  • siR A of the present invention may include variants having one or more substitutions, insertions, deletions and combinations thereof, which are functional equivalents having a change that does not degrade their activity.
  • the siRNA of the present invention may exhibit at least 80% homology with the siRNA of each corresponding SEQ ID NO, preferably 90%, and may include more than 95% homology. Such homology can be readily determined by using computer algorithms well known in the art, such as the Align or BLAST algorithms, to compare the sequence of nucleotides with the corresponding portions of the target gene.
  • the siRNA of the present invention is basically a complete form in which two strands of RNA are paired to form a double strand, that is, a form in which siRNA is directly synthesized in vitro and introduced into a cell through transfection, or a plasmid system It may be a modified form with a structure having a short hairpin so that it can be used for transfection by shRNA vector and PCR-induced siRNA expression cassette.
  • siRNA direct chemical synthesis method (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515—5520, 2002), synthetic method using in vitro transcription (Brummelkamp TR et al , Science 296: 550-553, 2002), A method for cleaving long double-stranded RA synthesized by in vitro transcription using the RNaselll family enzyme (Paul CP et al., Nature Biotechnology 20: 505-508, 2002). Can be synthesized by various methods known in the art.
  • the cell survival rate was higher in the EBV-positive gastric cancer cell line compared to the EBV-negative gastric cancer cell line, but the cell death rate was low. It was confirmed that the anticancer drug resistance of EBV-positive gastric cancer cells was high (see FIG. 1).
  • BHRF1 was expressed in EBV-positive gastric cancer cells at concentrations at which the two cells showed different resistance to anticancer drugs. EBV lysing genes were found to be expressed (see Figure 2). This is the EBV-amount This suggests that EBV lytic genes such as BHRF1 are involved in anticancer drug resistance in sexual gastric cancer.
  • the present inventors examined whether the siRNA of EBV can increase the anticancer sensitivity of EBV-positive gastric cancer cells showing anticancer drug resistance by reducing BHRF1 expression.
  • anticancer drugs showed a 60% reduction in cell viability and induced cell death as compared to scramble siRNA treatment (FIG. 4 and FIG. 5).
  • genes related to cell death and cell cycle control were involved in the process of inhibiting the anticancer drug resistance (see FIG. 6). Therefore, it was found that siRNA against BHRF1 is effective in inhibiting the resistance to anticancer drugs in AGS-EBV cells.
  • the present inventors aimed to provide siRNA against BHRF1 for the purpose of enhancing the anticancer drug sensitivity by reducing the BHRF1 of EBV in EBV-positive gastric cancer, and siRNA that can actually induce anticancer drug sensitivity among the mRNA sequences of BHRF1. Target sequences were identified.
  • siRNA # A- # E and # 1- # 35 double-stranded siRNAs that bind to various sites on BHRF1 mRNA (see Figure 3), and they actually expressed BHRF1 gene expression. Whether the protein was inhibited at the protein level and mRNA level, respectively.
  • siRNA # 26 which binds to the 18th to 36th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA, among the 40 siRNAs, and 243 of siRNAs # 2 and # 3 which bind to the 165th to 184th nucleotide sequence SiRNA #C and # 9 to bind to 262 nucleotide sequence
  • siRNA # 14 and # 15 to bind to 487 to 506 nucleotide sequence of BHRF1 mRNA
  • bind to 519 to 539 nucleotide sequence of BHRF1 mRNA SiRNA # 17 and # 18 were shown to reduce the BHRF1 gene expression by 80-903 ⁇ 4, respectively (see Figures 7 to 11), this effect is not only EBV-positive gastric cancer cell line AGS-EBV but also EBV-naturally infected It was also maintained in gastric cancer cell line SNU-719 (see Figure 12).
  • siRNA #A, # 4 ⁇ # 6 although siRNA # 2 and # 3 and the target sequence overlaps a considerable portion The gene expression inhibitory effect was almost insignificant, and siRNA # 10-13 showed little gene expression inhibitory effect despite the substantial overlap of siRNA # (: and # 9 with the target sequence.
  • siRNA # 14 and # 15 target sequences the gene expression inhibitory effect was hardly shown, although siRNA # D ⁇ E and # 19-25, siRNA # 17 and # 18 overlapped with target sequences.
  • the gene expression inhibitory effect was notably reduced despite the presence of or adjacent to the siRNA, and siRNA # 27-28 also significantly decreased the gene expression inhibitory effect even when adjacent to siRNA 26.
  • FIG. 13 illustrates a target site provided by the present invention.
  • siRNA provided by the present invention can be provided as a composition that inhibits anti-cancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer by suppressing BHRF1 expression of EBV.
  • anticancer drug resistance means that the drug administered at the time of administering the anticancer drug is insufficient to kill or kill cancer cells, and the anticancer drug resistance is the most frequent cause of anticancer drug resistance.
  • resistance to anticancer drugs means that when treating cancer patients with anticancer drugs, there is no therapeutic effect from the beginning of the treatment or early cancer treatment effect, but the cancer treatment effect is lost in the continuous treatment process. .
  • the anticancer agent when administered to a cancer patient, it is well known that the effect decreases with administration. This is due to the appearance of cancer cells resistant to anticancer drugs in vivo, making the chemotherapy of cancer difficult.
  • the term "inhibition of anticancer drug resistance” refers to the enhanced or increased toxicity of an anticancer drug to cancer cells when the cancer is treated with an anticancer agent than when there is no siR A of the present invention.
  • BHRF1 siRNA can reduce the resistance of cancer cells to anticancer drugs by sensitizing EBV-positive gastric cancer cells to anticancer drugs, thereby increasing the effect of anticancer drugs.
  • the anticancer agent is docetaxel.
  • composition of the present invention may be used alone as described above BHRF1 siRNA, or may be used in combination of two or more siRNA.
  • siRNA may be included in complex form with various nucleic acid carriers known in the art in order to increase the efficiency of delivery in vivo.
  • siRNA can be used as a recombinant plasmid or viral vector expressing siRNA.
  • delivery reagents include G-fectin, Minis TrasIT-TKO lipid affinity reagents, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, cationic phospholipid nanoparticles, cationic polymers, cationic micelles, cationic emulsions or It may be included as a naked siRNA in combination with a delivery reagent containing a liposome and administered to a subject.
  • composition for inhibiting anticancer drug resistance of the present invention may be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier in addition to siRNA or a complex of siRNA and nucleic acid carrier. Such compositions may be formulated to provide fast release, or sustained or delayed release of the active ingredient after administration.
  • binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances and the like can be used, and tablets, troches, capsules, elixir, suspensions, syrups, wafers It can manufacture in the form of these. Injectables can be used in combination with laxatives, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc.
  • bases, excipients, lubricants, preservatives, etc. can be used for topical administration. It may be prepared in umple or multiple dosage forms. Other compositions of the present invention according to the techniques commonly used in the form of various formulations Can be produced.
  • the siRNA of the present invention may be provided as an anticancer composition together with one or more anticancer agents.
  • An anticancer agent is a generic term for all drugs used to kill cancer cells, and most drugs block the replication, transcription, and translation of DNA of cancer cells.
  • An anticancer agent that can be used in the composition of the present invention is preferably a docetaxel. to be.
  • the anticancer drug resistance inhibiting composition or the anticancer composition of the present invention may be administered through any general route as long as the desired tissue can be reached. Oral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraluminal administration, intradural administration, but is not limited thereto.
  • the BHRF1 siRNA according to the present invention may be administered separately from the anticancer agent with a time difference after the anticancer agent or before or after the administration of the anticancer agent.
  • the dosage of the composition may vary depending on various factors such as age, sex, weight, pathological condition, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • AGS cells were used for EBV-negative gastric carcinoma (GC) cells, and AGS cells were used for EBV-positive gastric carcinoma (ECV) -positive gastric carcinoma (GC) cells and recombinant Akata virus (Shimizu et al., J. Virol). 70, 7260-7263, 1996) were used to infect AGS-EBV cells.
  • AGS contains RPMI-1640 medium (Gibco BRL, Grand) containing 10% fetal calf serum (FBS; Hyc lone, Logan, Utah, USA) and antibiotics (penicillin 100 Units / ml and streptomycin 100 ug / ml; Gibco BRL) Island, NY, USA).
  • AGS—EBV is also available in an additional 400 ug / ml
  • the culture was carried out in a medium containing neticin (Gibco BRL).
  • As an anticancer agent docetaxel (Aventis, Paris, France), a taxol-based anticancer agent, was used.
  • Example 2 Preparation of siRNA for BHRF1
  • siRNAs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 81 were chemically synthesized (Table 1 and Table 2).
  • the BHRFlmRNA target sites of the prepared siRNAs are shown in FIG. 3.
  • the siRNAs were custom-made from Genolus (Seoul, Korea).
  • AGS cells and AGS-EBV cells were dispensed 100 ⁇ l at a density of 5xl0 4 cells / ml in 96 well plates, and then cultured for 24 hours.
  • docetaxel was treated by concentration (0-100 nM) and incubated for 72 hours, followed by dispensing 10 ⁇ l of CCK-8 (Cell Counting Kit-8; Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan) solution in each well. After 3 hours of incubation, the absorbance was measured at 450 nm using a SoftMax device (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
  • AGS cells and AGS-EBV cells were inoculated in a 100 mm culture dish at a density of lxlO 6 cells / ml, respectively, and then cultured for 24 hours.
  • the cells were treated with 30 nM docetaxel and incubated for 72 hours. They were harvested and washed twice with cold saline, and 70% ethane was added and fixed at -20 ° C overnight. The next day, vortexing every 15 minutes at room temperature and incubated for 1 hour, then centrifuged to discard the supernatant and washed twice with physiological saline.
  • EBV lytic genes were expressed by docetaxel treatment in AGS-EBV cells.
  • AGS cells were treated with docetaxel 30 ⁇ , and AGS-EBV cells were treated with docetaxel by concentration (0-100 nM), and then cultured for 72 hours. Expression of these was confirmed.
  • Anti-BZLF1 (Dako, Glostrup, Denmark, 1: 500), anti—BRLFl (Argene, Varilhes, France; 1: 500), anti-BMRFl (Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK) for the identification of EBV lytic genes 1: 500) and anti-BHRFl (3E8, 1: 250) (Chou et al., 2004) were used as primary antibodies, respectively.
  • the loading control was also used as anti- ⁇ -act in (Sigma-Aldrich, 1: 2000).
  • AGS cells and AGS-EBV cells were inoculated into 96 well plates at a density of 8xl0 3 cells / ⁇ 1, respectively, and 10 nM of scramble siRNA and BHRF1 siRNA #C, # 2 and # 32 were added, respectively, followed by G- fectin was added to transfect and incubated for 24 hours.
  • docetaxel was incubated for 30 hours by 30 nM, followed by incubation for 10 hours by dispensing CCK-8 solution at 10 ⁇ / well for each well, followed by 450 nm using a SoitMax instrument (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Absorbance was measured at.
  • BHRF1 siRNA #C AGS-EBV cells were inoculated into 6-well plates at a density of lxlO 5 cel ls / ml, scramble siRNA and BHRFl siRNA # (: were added at 20 nM, and then transfected with G-fect in. The cells were incubated for 24 hours. Next, docetaxel was incubated for 30 hours with 30 nM treatment, followed by annexin V staining, and the ratio of dead cells was checked using FACScal iber instrument (Becton Dickinson). It was.
  • Docetaxel treatment resulted in higher amounts of Caspase-3 and p21 in AGS cells than in AGS-EBV cells.
  • Treatment with BHRF1 siRNA # increased the amount of activated Caspase-3 and p21 compared with docetaxal and scramble siRNA.
  • Bd-2 expression was higher in AGS-EBV cells compared to AGS cells at basal level, and Bcl-2 expression was slightly decreased when BHRF1 siRNA was treated in AGS-EBV cells.
  • Treatment of docetaxal showed little expression of Bcl-2 in AGS cells, but increased expression of Bcl-2 in AGS-EBV cells.
  • BHRF1 siRNA #C was treated with AGS-EBV cells like docetaxal, the expression of BelV 2 was slightly decreased.
  • siRNA target sequences that can induce anticancer drug sensitivity with high efficiency among raRNA sequences of BHRF1. The experiment was carried out to identify.
  • siRNAs that bind to various sites on BHRF1 mRNA were prepared (see Example 2), and each of these siRNAs was treated on AGS-EBV cells.
  • AGS-EBV cells were dispensed in a 100 mm culture dish at a density of lxlO 6 eel ls / ml and used as a negative control for scramble siRNA and the preparation in Example 3.
  • Each of 40 crude BHRF1 siRNAs was added 20 nM and then transfected with G-fectin and incubated for 24 hours.
  • cells were harvested and proteinol extracted to confirm the expression change of the BHRF1 gene through Western blool.
  • FIG. 7 shows the results of two experiments on siRNAs #A to #E.
  • FIG. 8 shows the results of two experiments on siRNAs # 1 to # 35 and the expression of BHRF1 to ⁇ -act in using as a loading control and normal izat. The results of the ion analysis are shown in a graph.
  • # (:, # 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26 and # 32).
  • siRNA #A, #E, # 4-6, # 8, # 10-13, # 16, # 19- # 25, # 27-31 , # 33 ⁇ 35 showed little or weak gene expression inhibitory effect.
  • AGS-EBV cells were dispensed at a density of lxlO 6 cells / ml in a 100 mm culture dish, and scramble siRNA was used as a negative control and BHRF1 siRNA 9 showing an inhibitory effect of BHRF1 expression of 80% or more in Experimental Example 5-1 above.
  • Species # 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26, and # 32) were added 20 nM each, and then transfected with G-fectin and incubated for 24 hours. .
  • 30 nM of docetaxal was treated and cultured for another 72 hours, cells were harvested, total RNA was extracted, and the change in mRNA expression of BHRF1 was confirmed by real-time PCR.
  • three siRNAs (# 25, # 28 and # 29), which had little effect of inhibiting gene expression in Western blot of Experimental Example 5-1, were randomly selected and examined for their effects on BHRF1 mRNA levels.
  • mice 5-1 and 5 ⁇ 2 an efficient siRNA was selected for transfection of AGS-EBV cells with BHRF1 siRNA and treatment of docetaxel to inhibit BHRF1 expression induced by docetaxel.
  • AGS-EBV was selected. The cells were first treated with docetaxel to induce BHRF1 gene expression, and then siRNA was transfected to confirm the BHRF1 gene silencing effect at the protein level.
  • AGS-EBV cells were dispensed with lxlO 6 eel I s / ml at 100 mm culture dish, treated with 30 nM docetaxel, and cultured for 24 hours to induce BHRF1 gene expression, followed by scramble siRNA and Experimental Example 5- Of siRNAs selected from 1 and 5-2, # 2, # 3, # 9, # 14, # 17 and # 32 were added to each of 20 nM and transfected with G-fect in. After 72 hours of incubation, the cells were harvested, the proteins were extracted, and the expression of BHRF1 gene was confirmed by Western blot.
  • AGS-EBV cells were seeded at a density of lxlO 6 cel ls / ml in a 100 mm culture dish, and used as negative controls, scramble siRNA and #C, # 2 among siRNA selected in Experimental Examples 5-1 and 5-2. , # 3, # 9, # 14, # 17, and # 32 were added at 1, 5, and 10 nM, respectively, and then transfected with G-fect in and incubated for 24 hours. Next, 30 nM of docetaxel was incubated for 72 hours, cells were harvested, proteins were extracted, and the expression of BHRF1 gene was confirmed by Western blot.
  • SNU-719 a naturally infected EBV infected gastric cancer cell line, was transfected with BHRF1 siRNA to confirm the BHRF1 gene silencing effect.
  • siRNA #C, # 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26, and # 32 bind to each other, that is, 18 to 18 of the BHRF1 mRNA.
  • the 36th, 165-184th, 243-262th, 487-506th, and 519-539th sites could be identified as the hotspots that will be the main targets for siRNA production.
  • the target site provided by the present invention is shown in FIG. 13.
  • the present invention provides an siRNA that inhibits BHRF1 expression with high efficiency, and the siRNA inhibits anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer, and thus can be usefully used to treat EBV-positive gastric cancer when used with an anticancer agent.

Abstract

본 발명은 EBV(Epstein-Bar virus)의 BHRF1 발현을 억제하는 siRNA 및 이를 이용한 항암제 내성 저해에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BHRF1 의 발현을 억제하는 siRNA 및 이를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

[명세서】
【발명의 명칭】
BHRF 1 발현 억제를 위한 s i RNA 및 이를 포함하는 조성물 [기술분야]
본 발명은 EBV(Epstein-Bar virus)의 BHRF1발현 억제를 위한 siRNA및 이를 이용한 항암제 내성 저해에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BHRF1발현 억제를 위한 siRNA및 이를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암 제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다. 또한， 본 발명은 상기 siRNA 및 항암 제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Bar virus; EBV)는 아프리카에서 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma)과 관련되어 최초로 발견된 감마 허피스 바이러 스이다.
상기 바이러스는 버킷 림프종 또는 비인두 종양 등 다양한 종양과 연 관성을 보이는데， 최근에는 일부 위암에 EBV유전자가 발현하는 것으로 판명 되었고 전세계 위암 환자의 4-18% 정도가 EBV-양성 위암으로 알려져 있다. 그러나， 위암에서의 EBV의 병리학적인 역할에 대해서는 명확히 규명된 바가 없다. 또한， EBV는 여러 잠복 유전자 (latent gene) 및 용균 유전자 (lytic gene)를 가지고 있는데， 일반적으로 EBV 관련 종양에서 잠복 유전자들이 발 현하는 것으로 생각되고 있으나 용균 유전자와의 관련성에 대해서는 많이 연구되지 않은 실정이다.
본 벌:명은 EBV-양성 위암이 EBV-음성 위암에 비해 높은 항암제 내성 을 나타낸다는 발견에 기초한다. 본 발명자들은 또한， EBV-양성 위암에 항암 제를 처리하면 BHRF1을 포함한 EBV용균 유전자들이 발현되기 시작하는데 이 렇게 발현된 BHRF1 등이 항암제 내성을 나타내는 요인으로 작용할 가능성이 있음을 확인하였다. 따라서， EBV 의 BHRF1을 감소시킴으로써 항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암 세포의 항암제 감수성을 높이기 위하여， BHRF1 에 대 한 siRNA를 제공하는데 중점을 두고 연구를 진행하였다.
siRNACsmall interference RNA)는 RNA RNA interference)를 유도하는 물질로서 십여 개에서 수십 개 정도의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 이중 사슬의 RNA를 말한다. RNAi는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중 사슬 R A(douMe strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자 의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. 이와 같이 RNAi는 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 비효율적인 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 방법을 대신하 는 간단한유전자 넉 -다운 (knock down) 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있 다. siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 표적 유전 자의 mRNA의 유전자 발현을 억제하게 된다.
그러나, RNAi 기술은 모든 유전자의 RNA에 적용됨으로써 선택적 발현 억제가 가능할 것이라는 애초의 기대와는 달리， 근래 대규모의 RNAi 탐색 과 정에서 일부 유전자는 알려지지 않은 이유로 인해 RNAi 기술이 적용되지 않 음이 밝혀지고 있다 (Krueger et al . , Oligonucleotides, 17:237-25으 2007) . 또한， 지난 수 년 간의 데이터베이스를 바탕으로 통계 분석을 통해 siRNA서 열을 예측하는 알고리즘이 개발되고 있으나， 컴퓨터 알고리즘이 불완전하기 때문에 이를 이용하여 인 실리코 (in silico) 방법으로 결정된 모든 siRNA가 실제 세포 및 생체 중에서 표적 mRNA 를 효과적으로 억제하는 것은 아니며 실험을 통한 검증을 통해서만 가장 효율적인 siRNA를 결정할 수 있다는 것 이 알려져 있다 (Derek et al . , Annu. Rev. Biomed. Eng. , 8:377-402， 2006). 이와 같이， 이론적으로 예상되는 siRNA가 반드시 목표로 하는 mRNA의 능력을 효과적으로 억제시키지는 않으며， 고효율의 siRNA 염기 서열을 찾아 야 치료 목적을 달성할 수 있기 때문에， 표적 mRNA상에서 억제 효율이 높은 특정 타겟 부위 (hyperactive target)을 찾는 것이 매우 중요하다. 또한， 한 유전자의 mRNA당 다수의 타겟 부위를 선정하여 siRNA를 제조하고 적어도 세 포 수준에서 직접적으로 이들의 효과를 확인함으로써 발현 억제 효능이 우 수한 최적 위치의 서열을 발굴하는 과정이 필요하다. 이와 관련하여， 현재까지 BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 의 개발에 대한 연구 및 BHRF1 에 대한 siRNA 를 이용한 항암 치료에 관한 연구는 거의 보고된 바가 없는 실정이다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA를 제조하여 이를 항암제 내성올 저해하는 용도로 제공하기 위하여 노 력한 결과， BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 타겟 부위를 규명할 수 있었으며， 상기 타겟 부위에 상보적인 siRNA 를 항암제와 함께 EBV-양성 위암세포에 처리하면 세포 생존률을 감소시킴과 동시에 세포 사멸을 촉진시 킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 siRNA가 EBV-양성 위암세포에 서 항암제 내성을 저해함으로써 결과적으로 효과적인 EBV-양성 위암 치료에 기여할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
[기술적 해결방법]
본 발명의 목적은 BHRF1의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 의 타겟 부위를 규명하고 이 타켓 부위에 결합하는 siRNA 를 제공하는 것이 다. 또한 상기 siRNA 를 항암제 내성 저해를 위한 용도로 제공하는 것이다. 구체적으로， 본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 BHRF1 mRNA의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열， 165내 지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열， 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열， 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타 이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 siRNA를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 siRNA및 항암제를 포함하는 EBV-양 성 위암 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 【도면의 간단한 설명】
도 1의 (a)는 EBV-음성 위암세포 (AGS)와 EBV-양성 위암세포 (AGS-EBV) 에 도세탁셀을 처리하였을 때 세포 생존률 (cell viability)을 나타낸 것으로， Triplicate로 3번 반복하여 실험한 결과의 평균값과 SD값을 그래프로 나타 낸 것이다 (*, p<0.05; **' ρθ.01을 의미함). (b)는 AGS 세포와 AGS-EBV세 포에 도세탁셀을 처리하였을 때 세포 사멸 (apoptosis) 비율을 나타낸 것으로, 3번 반복하여 실험한 결과의 평균값과 SD값을 그래프로 나타낸 것이다 (**， ρθ.01을 의미함) .
도 2는 AGS-EBV 세포에서 도세탁샐 처리하였을 때 EBV 용균 유전자
(BZLFl, BRLFl, BMRFl, BHRF1)들이 발현되는지의 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 BHRF1 유전자의 mRNA 서열 및 본 발명에서 제작한 40종의 BHRFl siRNA #A~#E 및 #1~#35의 결합 부위를 나타낸다.
도 4의 (A)는 AGS-EBV 세포에 BHRFl siRNA #C, #2 및 #32 을 각각 처 리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 세포 수의 변화를 나타낸다. 음성 대조군으 로 scramble siRNA 를 사용하였다. (B)는 AGS 세포에서의 결과를 나타낸다. 도 5는 AGS-EBV 세포에 BHRFl siRNA #(：를 처리한 후 도세탁셀을 처리 했을 때 세포 사멸 비율의 변화를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA를 사용하였다.
도 6은 AGS-EBV세포와 AGS세포에 각각 siRNA #C 및 /또는 도세탁셀을 처리했을 때 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자 발현을 확인한 웨스 턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다. 도 7의 (A) 는 BHRFl siRNA 5종 t )을 각각 AGS-EBV세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했올 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인 한 웨스턴 블랏 결과이다. 음성 대조군으로 scramble siRNA를 사용하였다. (B) 는 BHRFl siRNA 4종(#^#1))에 대하여 다시 한 번 확인한 결과이다.
도 8의 (A) 는 BHRFl siRNA 35종 (#1~#35)을 각각 AGS-EBV세포에 처리 한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1유전자의 발현을 억제하는자 여부를 확 인한 웨스턴 블랏 결과이다.음성 대조군으로 scramble siRNA를 사용하였다. (B) 는 다시 한 번 확인한 결과이다. (C) 는 로딩 대조군으로 사용한 -act in에 대한 BHRF1의 발현을 normal izat ion한 결과를 종합하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 siRNA 9종 (#2， #3， #9， #14， #15， #17， #18， #26및 #32) 을 각 각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현 을 억제하는지 여부를 확인한 실시간 RT-PCR 결과를 나타낸다. 음성 대조군 으로 scramble siRNA를 사용하였다.
도 10은 BHRF1을 발현시킨 상태에서 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타 낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA를 사용하였다.
도 11은 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA들을 다양한 농도 범위로 처리하 고 (1， 5， 10 nM) 도서 J탁셀을 처리했올 때 BHRF1유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA를 사용하였다.
도 12는 SNU-719세포에 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때 BHRF1유전자 의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대 조군으로 scramble siRNA를 사용하였다.
도 13은 본 발명에서 제공하는 BHRFlmRNA상의 siRNA타겟 부위 및 이 에 결합하는 siRNA를 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은 BHRF1의 발현 을 효과적으로 억제할 수 있는 특정 타켓 부위에 결합하는 siRNA에 관한 것 이다.
바람직한 양태로서， 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 BHRF1 m NA의 18내지 36번째 뉴클레오타이드 서열, 165내지 184번 째 뉴클레오타이드 서열， 243내지 262번째 뉴클레오타이드 서열， 487내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열， 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1유전 자의 발현을 억제하는 siRNA 에 관한 것이다.
바람직하게， 상기 siRNA 는 19내지 21 뉴클레오타이드 길이를 가지는 이중가닥 siRNA 일 수 있다.
또한 바람직하게， 상기 siRNA 는 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클 레오타이드 쌍， 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍， 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클 레오타이드 쌍， 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍， 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴 클레오타이드 쌍， 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍, 및 서 열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으로 이루어지는 군에서 선택 되는 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 BHRF1 siRNA를 포함하는 EBV-양 성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서， BHRF1 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 용어， "siRNA" 란 표적 mRNA 의 절단을 통하여 표적 mRNA 의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 짧은 이중사슬 의 RNA를 의미한다.
본 발명의 siRNA 는 표적 mRNA와 완전히 상보적 결합을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 (대응하는 염기가 상보적이지 않음) 또는 벌지 (일방 의 사슬에 대웅하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포 함될 수 있다. 본 발명 siRNA 를 이루는 뉴클레오타이드 길이는 BHRF1의 활 성 및 발현을 방해할 수 있는， 10 내지 40 뉴클레오타이드， 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 19 내지 21 뉴클레오타이드 길 이의 이중가닥 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 길이는 뉴클레오타이 드가 이중가닥 (페어링)을 이루는 길이를 말한다.
본 발명 siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 또는 점착 (cohesive) 말단이 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 쪽이 돌출 (overhang)한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하다. 돌출하는 뉴클레오타이드 수는 한정되지 않으나, 예를 들어 1 내지 8 뉴클레오타이드， 바람직하게는 1 내지 4 뉴클레 오타이드일 수 있다. 또한， siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서， 예를 들어， 한 쪽 말단의 돌출 부분에 dTdT, UU, 또는 이 중가닥 형성부에서 계속해서 BHRF1 mRNA와 일치하는 또는 상보적인 서열 등 을 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고， 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 R A에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장 이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 BHRF1 mRNA 에 서 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이 드 서열， 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열， 487 내지 506 번째 뉴클 레오타이드 서열， 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1유전자의 발현을 억 제하는 siRNA 이다.
바람직하게， 상기 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서 열에 결합하는 siRNA는 서열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으 로 구성된 siRNA일 수 있다.본 명세서 내에서는 상기 siRNA를 siRNA #26으 로 명명한다.
바람직하게 , 상기 BHRF1 mRNA의 165내지 184번째 뉴클레오타이드 서 열에 결합하는 siRNA는 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍으 로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍으 로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #2 및 #3 으로 명명한다.
또한 바람직하게， 상기 BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오타 이드 서열에 결합하는 siRNA는 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍으^ 구성된 siRNA, 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #C 및 #9 로 명명한다.
또한 바람직하게， 상기 BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타 이드 서열에 결합하는 siRNA는 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이 드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이 드 쌍으로 구성된 siRNA 일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각 각 siRNA #14 및 #15 로 명명한다.
또한 바람직하게， 상기 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타 이드 서열에 결합하는 siRNA는 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이 드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이 드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA를 각각 siRNA #17 및 #18 로 명명한다.
또한, 본 발명의 siRNA는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막고 생체 내 안정성을 높이기 위해 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화 학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어， siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클 레오티드의 당 (ribose ring)의 2'-위치의 수산기를 수소 원자， 할로겐 원자，
-0-알킬기 , -0-아실기 또는 아미노기， 구체적으로는 H, OR, R, R'OR, SH, SR,
NH2, NHR, NR2) N3, CN, F, CI, Br, I 등으로 수식하거나 (이 때 R은 알킬 또 는 아릴， 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기, R'은 알킬렌， 바람직하게는 탄 소수 1~6의 알킬렌일 수 있다)， 인산 백본을 포스포로티오에이트， 포스포로 디티오에이트， 알킬포스포네이트， 포스포로아미데이트， 또는 보라노포스페이 트 등으로 수식할 수 있다.
또한, 상기 화학적 변형은, 본 발명의 siRNA에 포함되는 적어도 하나 의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA (unlocked nucleic acid), 몰포리노 (morpholino), PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나의 핵산 유 사체 형태를 가지도록 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이들 LNA, UNA,
PNA, 몰포리노 등의 제조는 본 발명에서 제공하는 siRNA서열 정보를 바탕으 로 당업계에 알려진 지식에 의하여 제조할 수 있으며， 기존의 문헌을 참고할 수 있다 (VeeduRN, Wengel J.Chem Biodivers.7(3)： 536-42, 2010； DemidovW. Trends Biote.chnol. 21(1) :4-7， 2003； Shantanu Karkare, et al . , Appl Microbiol Biotechnol , 71:575—586, 2006).
또한, 본 발명의 siR A 는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인， 하나 이상의 치환， 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변 형체를 포함할 수 있다. 예를 들어， 본 발명의 siRNA는 각 해당 서열번호의 siRNA와 80%이상의 상동성을 나타낼 수 있으며， 바람직하게는 90%, 보다 바 람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상 동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오타이드의 서열을 표적 유전자의 상응하 는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA 가 쌍을 이루어 이중가 닥을 형성하는 완전한 형태， 즉 인 비트로에서 siRNA를 직접 합성한 뒤 트랜 스펙션 (transfection)을 통해 세포 안으로 도입되는 형태이거나， 플라스미드 계 shRNA 백터와 PCR-유도 siRNA 발현 카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용 될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.
상기 siRNA 를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법 (Sui G et al. , Proc Natl Acad Sci USA 99:5515—5520， 2002), 인 비트로 전 사를 이용하여 합성하는 방법 (Brummelkamp TR et al. , Science 296： 550-553, 2002)， 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중 -가닥 R A를 RNaselll 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법 (Paul CP et al . , Nature Biotechnology 20：505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는， EBV-음성 위암 세포주와 EBV-양성 위암 세포주에 도세탁샐을 처리한 경우， EBV-음성 위암 세포주에 비해 EBV- 양성 위암 세포주에서 세포 생존률이 높은 반면 세포 사멸률은 적게 나타나, EBV-양성 위암 세포의 항암제 내성이 높다는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 참조). 또한， 상기 두 세포주에 각각ᅵ도세탁셀을 처리하였을 때 EBV용균 유 전자들의 발현 여부 및 발현 정도를 확인해 본 결과, 두 세포가 항암제에 대 한 내성 차이를 보이는 농도에서， EBV-양성 위암 세포에서 BHRF1을 포함한 EBV용균 유전자들이 발현함을 확인할 수 있었다 (도 2 참조). 이는, EBV-양 성 위암에 나타나는 항암제 내성에 BHRF1 등의 EBV 용균 유전자들이 관여함 을 시사하는 결과이다.
이에， 본 발명자들이 EBV의 siRNA가 BHRF1발현을 감소시킴으로써 항 암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암 세포의 항암제 감수성을 높일 수 있는지 를 살펴보았다. 그 결과， EBV-양성 위암 세포에 BHRF1 siRNA를 처리한 후 항 암제를 처리한 경우 scramble siRNA 를 처리한 경우에 비하여 60% 정도의 세 포 생존률 감소 효과를 나타내고 세포 사멸을 유도함을 확인할 수 있었다 (도 4 및 도 5 참조). 나아가 이러한 항암제 내성 억제 과정에서 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자들이 관여할 가능성을 확인할 수 있었다 (도 6 참조). 따라서 , BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV세포에서 항암제에 대한 내 성을 저해하는데 효과가 있음을 알 수 있었다.
나아가， 본 발명자들은 EBV-양성 위암에서 EBV의 BHRF1을 감소시킴으 로써 항암제 감수성을 높이기 위한 목적으로 BHRF1 에 대한 siRNA를 제공하 고자， BHRF1의 mRNA서열 중 실제로 고효율로 항암제 감수성을 유도할 수 있 는 siRNA 표적 서열을 규명하였다.
이를 위하여， 본 발명자들은 BHRF1 mRNA상의 다양한부위에 결합하는 40종 (siRNA #A~#E 및 #1~#35로 명명)의 이중가닥 siRNA을 합성하였고 (도 3 참조)， 이들이 실제로 BHRF1 유전자 발현을 억제하는지 여부를 단백질 수준 및 mRNA수준에서 각각 확인하였다.
그 결과， 40종의 siRNA중에서 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레 오타이드 서열에 결합하는 siRNA #26， 165 내지 184 번째 뉴클레오타아드 서 열에 결합하는 siRNA #2 및 #3， BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오 타이드 서열에 결합하는 siRNA #C및 #9， BHRF1 mRNA의 487내지 506번째 뉴 클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #14 및 #15， 그리고 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #17 및 #18이 각각 BHRF1 유전자 발현을 80~90¾정도 감소시키는 것으로 확인되었으며 (도 7 내 지 도 11 참조)， 이러한 효과는 EBV-양성 위암 세포주 AGS-EBV뿐 아니라 자 연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에서도 유지되었다 (도 12 참 조). 반면， 상기 mRNA서열을 조금이라도 벗어난 경우 siRNA의 BHRF1 발현 억제 효능이 현저히 떨어졌는데 예를 들어 siRNA#A, #4~#6의 경우 siRNA #2 및 #3 과 타겟 서열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효 과가 거의 나타나지 않았고， siRNA#10~13의 경우 siRNA #(：및 #9과 타겟 서 열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나 지 않았다. 또한, siRNA #16의 경우 siRNA #14 및 #15 타겟 서열이 상당 부 분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않았고， siRNA #D~E, #19~25의 경우 siRNA #17및 #18과 타겟 서열이 중복되거나 인 접해 있음에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 현저히 떨어졌다. 또한， siRNA #27-28의 경우 siRNA 26과 인접해 있음에도 불구하고 유전자발현 억 제 효과가 현저히 떨어졌다.
따라서， BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째， 165 내지.184 번째， 243 내 지 262 번째， 487 내지 506 번째， 및 519 내지 539 번째 부위가 siRNA 제작 시 주요 타겟이 될 핫스팟 (hotspot)임을 확인할 수 있었으며, 이 부위에 결 합하는 siRNA가 BHRF1발현을 고효율로 억제함으로써 EBV-양성 위암에서 항 암제 내성 억제 효과를 유도하는 효과적임을 규명할 수 있었다.
상기 본 발명에서 제공하는 타겟 부위를 도 13에 나타내었다.
따라서， 본 발명에서 제공하는 siRNA 는 EBV 의 BHRF1 발현을 억제함 으로써 종국적으로 EBV—양성 위암에 대한 항암제 내성을 저해하는 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어， "항암제 저항성" 이란 항암제 투여시 투여한 약물 이 암세포를 사멸시키지 못하거나 사멸시키는 정도가 미비한 것을 말하며， 항암제 저항성은 항암제 내성의 가장 빈번한 원인이다. 일반적으로 "항암제 에 대한 내성" 이란， 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때， 치료 초기부 터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과 정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 이와 같이, 항암제를 암환 자에게 투여하면， 투여함에 따라 효과가 감소하는 것이 잘 알려져 있다. 이 는 생체 내에서 항암제에 대하여 내성의 암세포가 출현하여 암의 화학요법 을 곤란하게 하는 것에 기인하는 것이다. 본 발명에서 용어， "항암제 내성 저해" 는 항암제로 암을 치료시 본 발명의 siR A가 없을 때보다 있을 때 항암제의 암세포에 대한 독성이 더 강 화되거나 증가되는 것을 말한다. 본 발명에서 BHRF1 siRNA는 항암제에 대해 EBVᅳ양성 위암 세포를 민감화시킴으로써 항암제에 대한 암세포의 저항성을 줄이고 항암제의 효과를 높일 수 있다. 바람직하게, 상기 항암제는 도세탁셀 이다.
본 발명의 조성물은 상기한 BHRF1 siRNA를 단독으로 사용하거나， 2종 이상의 siRNA를 흔합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 siRNA 는 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체와 복합체 형태로 포함될 수 있다. 예컨 대， siRNA 는 siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 백터로서 사용될 수 있다. 또한, 전달 시약으로 G-fectin, Minis TrasIT-TKO지질친화 성 시약， 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴 (cellfectin), 양이온성 인지질 나노 입자， 양이온성 고분자， 양이온성 미셀， 양이온성 에멀견 또는 리포좀을 포 함하는 전달시약과 조합된 네이키드 siRNA로 포함되어 대상자에게 투여될 수 있다. 또한 siRNA의 체내 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시키는 등 당업계에 알 려진 일반적인 siRNA세포 내 전달 기술을 이용하도록 제제화될 수 있다. 본 발명의 항암제 내성 저해용 조성물은 siRNA또는 siRNA와 핵산 전 달체와의 복합체 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화될 수 있다. 이러한조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출， 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화 될 수 있다.
경구 투여시에는 결합제， 활탁제， 붕해제， 부형제， 가용화제, 분산제， 안정화제， 현탁화제， 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며， 정제， 트로키， 캡 슐， 엘릴시르， 서스펜션， 시럽， 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있다. 주사제 의 경우에는 완층제， 보존제， 무통화제， 가용화제， 등장제， 안정화제 등을 흔 합하여 사용할 수 있으며， 국소 투여용의 경우에는 기제， 부형제， 윤활제, 보 존제 등을 사용할 수 있고， 단위 투약 엄플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 이외의 본 발명 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따 라 제조할 수 있다. 、 본 발명의 siRNA는 하나 이상의 항암제와 함께 항암 조성물로 제공될 수 있다.
항암제란 암세포를 죽이기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며， 대부 분의 약제는 암 세포의 DNA의 복제， 전사， 번역 과정을 차단하게 된다.본 발 명의 조성물에 사용될 수 있는 항암제는， 바람직하게는 도세탁셀이다.
본 발명의 항암제 내성 저해용 조성물 또는 항암용 조성물은 목적 조 직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여， 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여， 피하 투여， 피내 투여， 강내 투여， 경막내 투여 될 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 BHRF1 siRNA는 항암제와 함께 또는 항암제를 투여하기 전 또는 투여하 고 난 후에 일정 시차를 두고 항암제와 별도로 투여될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 환자의 나이， 성별, 체중, 병적 상태， 투여 경 로， 배설 속도 및 반응 감응성 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며， 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 실험 재료의 준비
EBV-음성 위암 (EBV-negative gastric carcinoma; GC) 세포로 AGS세포 를 사용하였고， EBV-양성 위암 (EBV-positive gastric carcinoma) 세포로는 AGS 세포에 재조합 Akata virus (Shimizu et al . , J. Virol. 70, 7260-7263, 1996)를 감염시킨 AGS-EBV 세포를 사용하였다. AGS는 10% 우태아혈청 (FBS; Hyc lone, Logan, Utah, USA)과 항생제 (페니실린 100 Units/ml 및 스트렙토 마이신 100 ug/ml; Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 또한 AGS—EBV는 추가적으로 400 ug/ml 제 네티신 (Gibco BRL)이 포함된 배지에서 배양하였다. 항암제로는 탁솔 계열의 항암제인 도세탁셀 (Aventis, Paris, France)을 사용하였다. 실시예 2. BHRF1에 대한 siRNA의 제조
서열번호 2 내지 서열번호 81 로 이루어진 군으로부터 선택된 40종의 이중가닥 siRNA를 화학적으로 합성하였다 (표 1 및 표 2). 제조한 각 siRNA 의 BHRFlmRNA타겟 부위는 도 3에 나타내었다.상기 siRNA들은 제놀루션 (서 울， Korea)사로부터 주문 제작하였다.
【표 1】
siRNA 센스 /안티센
No. 스 서열
번호
센스 5 ' -CGAAAUUCAGAGACAUUUA-3 ' 2
#A
안티센스 51 -UAAAUGUCUCUGAAUUUCG-3 ' 3
센스 5 ' -GAAACUUGGAACAGAUUUA-3 ' 4
#B
안티센스 5 ' -UAAAUCUGUUCCAAGUUUC-3 ' 5
센스 5 ' -GGAUUUUAACUCAGUAUUU-3 ' 6
#C
안티센스 5 ' -AAAUACUGAGUUAAAAUCC-3 ' 7
센스 5 ' -UGACUUUGAGUCUGUUAGU-3 ' 8
#D
안티센스 5 ' -ACUAACAGACUCAAAGUCA-3 ' 9
센스 5 ' -GUUAUAUGUAGUUAUUUAU-3 ' 10
#E
안티센스 5 ' -AUAAAUAACUACAUAUAAC-3 ' 11
【표 2】
센스 /안티센
서열
스 번호 센스 5 ' -CUGUAGUUCUGCGUUAUCA-3 ' 12
#1
안티센스 5 ' -UGAUAACGCAGAACUACAG-3 ' 13
센스 5 ' -GGAGAUAAUUGAACGAAAU-3 ' 14
#2
안티센스 5 * -AUUUCGUUCAAUUAUCUCC-3 ' 15
센스 5 ' -GAGAUAAUUGAACGAAAUU-3 ' 16
#3
안티센스 5 ' -AAUUUCGUUCAAUUAUCUC-3 ' 17
센스 5 ' -GAUAAUUGAACGAAAUUCA-3 ' 18
#4
안티센스 5 ' -UGAAUUUCGUUCAAUUAUC-3 ' 19
센스 5 ' -ACGAAAUUCAGAGACAUUU-31 20
#5
안티센스 5 ' -AAAUGUCUCUGAAUUUCGU-3 ' 21 //: snsozlo2¾l£
Figure imgf000017_0001
센스 5 ' -GGAGAUACUGUUAGCCCUG-3 ' 62
#26
안티센스 5 ' -CAGGGCUAACAGUAUCUCC-3 ' 63
센스 5 ' -AUACGGGACAGUCGUGUGC-3 ' 64
#27
안티센스 5 ' -GCACACGACUGUCCCGUAU-3 ' 65
센스 5 ' -CUGCAUCCUGUGUUGGAGC-3 ' 66
#28
안티센스 5 ' -GCUCCAACACAGGAUGCAG-3 ' 67
센스 5 ' -GAGACCCAAGCCUUGGGCG-3 ' 68
#29
안티센스 5 ' -CGCCCAAGGCUUGGGUCUC-3 ' 69
센스 5 '-GUUGGCCUGGAUGGCCUGG-3 ' 70
#30
안티센스 5 ' -CCAGGCCAUCCAGGCCAAC-3 ' 71
센스 51 -AUGCAUGCCUGCAGGACAU-3 ' 72
#31
안티센스 5 ' -AUGUCCUGCAGGCAUGCAU-3 ' 73
센스 5 ' -GUAACCAGUCUACUCCUUA-3 ' 74
#32
안티센스 5 ' -UAAGGAGUAGACUGGUUAC-3 ' 75
센스 5 ' -GACCUGUCAGUUCGUGGGA-3 ' 76
#33
안티센스 5 ' -UCCCACGAACUGACAGGUC-3 ' 77
센스 5 ' -AGCGAAGGCCUGGAUGGUU-3 ' 78
#34
안티센스 5 ' -AACCAUCCAGGCCUUCGCU-3 ' 79
센스 5 ' -GCUGGUCUACAUUAAUUGA-3 ' 80
#35
안티센스 5 ' -UCAAUUAAUGUAGACCAGC-3 ' 81 실험예 1. EBV-양성 위암 세포의 항암제 저항성 확인
EBV-음성 위암 세포주 (AGS)와 EBV-양성 위암 세포주 (AGS-EBV)에 각각 도세탁셀을 처리한 후 세포 생존를 (cell viability)과 세포 사멸 (apoptosis) 비율을 각각 비교하였다.
구체적으로， 세포 생존률을 측정하기 위하여， AGS 세포와 AGS-EBV 세 포를 각각 96 웰 플레이트에 5xl04 cells/ml 의 밀도로 100 μ 1씩 분주한 후 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로 도세탁셀을 농도별 (0-100 nM)로 처리하 고 72 시간 동안 배양한후 CCK-8 (Cell Counting Kit-8; Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan) 용액을 각 웰당 10 μ 1씩 분주하여 3시간 배양 한 다음 SoftMax 기기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 세포 사멸율을 측정하기 위하여， AGS세포와 AGS-EBV세포를 각 각 lxlO6 cells/ml 의 밀도로 100 mm배양 접시에 접종한 후 24시간 동안 배 양하였다. 다음으로 30 nM의 도세탁셀을 처리하고 72 시간 배양한 후 세포 들을 수확하여 차가운 생리식염수로 2회 세척하고 70%에탄을을 넣어 -20 °C 에서 밤새 고정하였다. 다음날 상온에서 15분마다 볼텍싱 (vortexing)하면서 1시간 배양한 후 원심분리하여 상층액을 버리고 생리식염수로 2회 세척하였 다.다음으로 생리식염수에 100 ug/ml의 RNaseA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 50 ug/ml PI (propidium iodide; Sigma-Aldrich, St. Louis, M0, USA) 를 섞은 용액을 각 세포에 500 μΐ 씩 넣어 세포를 풀어 염색하고 37 °C 수 조에서 20분 배양한후 FACSca liber 기기 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포 주기를 분석하였다.
그 결과， 도 1에 나타난 바와 같이, EBV-음성 위암 세포주 (AGS)에 비 해 EBV-양성 위암 세포주 (AGS— EBV)에서 10 nM 이상의 도세탁셀 농도로 처리 시 세포 생존률이 높게 나타난 반면， 세포 사멸은 적게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 AGS 세포에 비해 AGS-EBV 세포가 도세탁샐에 대한 내 성이 높다는 것을 확인할 수 있었다. 실험예 2. 도세탁셀 처리시 EBV용균유전자의 발현 확인
AGS-EBV세포에서 도세탁셀 처리에 의해 EBV용균 유전자 (lytic gene) 들이 발현 되는지의 여부를 확인하였다.
구체적으로， AGS세포에 도세탁셀 30ηΜ을 처리하고 AGS— EBV세포에는 도세탁셀을 농도 별로 (0-100 nM) 처리한 후 72 시간 배양하였고， 세포를 수 확하여 단백질을 추출한 후 웨스턴 블랏을 통하여 EBV용균 유전자들의 발현 을 확인하였다. EBV용균 유전자들의 확인을 위해 항 -BZLF1 (Dako, Glostrup, Denmark, 1:500)， 항— BRLFl (Argene, Varilhes, France; 1:500)， 항 -BMRFl (Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK; 1:500) 및 항 -BHRFl (3E8, 1:250) (Chou et al., 2004)를 각각 1차 항체로 사용하였다. 또한 로딩 컨트를로 항 -β -act in (Sigma-Aldrich, 1:2000)을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이， 도세탁셀을 10 nM 이상의 농도로 처리시 AGS-EBV 세포에서 BHRF1을 비롯한 EBV 용균 유전자들이 발현되는 것 을 확인할 수 있었다. 즉， 두 세포가 항암제에 대한 내성 차이를 보이는 농 도에서 AGS-EBV세포가 EBV용균 유전자들을 발현함을 확인하였으므로， 항암 제 내성에 BHRF1 등의 EBV 용균 유전자들이 관여할 가능성이 있음을 알 수 있었다. 실험예 3. BHRF1 siRNA가 EBV-양성 위암 세포의 세포 생존률에 미치 는 영향 확인
BHRFl siR A가 항암제에 대한 EBV-양성 위암 세포의 생존를에 미치는 영향을 확인하기 위하여， siRNA #C, #2 및 #32을 각각 AGS-EBV세포에 처리 한 후 도세탁샐을 처리하고 세포 수의 변화를 확인하였다.
구체적으로， AGS 세포 및 AGS-EBV세포를 8xl03 cells /ΙΟΟμ 1 의 밀 도로 96웰 플레이트에 각각 접종하고， scramble siRNA및 BHRF1 siRNA #C, #2 및 #32을 각각 10 nM씩 가한 후 G-fectin을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀을 30 nM씩 처리하여 72 시간 더 배양 한 후 CCK-8용액을 각 웰당 10 μΐ 씩 분주하여 3시간 배양한 다음 SoitMax 기기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광 도를 측정하였다.
그 결과， 도 4에 나타난 바와 같이 , BHRF1 siRNA #C, #2및 #32를 처 리하고 도세탁셀을 처리한 경우 모두, scramble siRNA를 처리한 경우에 비 하여 60%정도의 세포 생존률 감소 효과를 나타내었다. 따라서 BHRF1에 대한 siRNA가 AGS— EBV세포에서 도세탁셀에 대한 내성을 저해하는데 효과가 있음 을 알 수 있었다 (A). 다만， #32 의 경우에는 EBV 음성 세포인 AGS 세포에서 도 세포 생존을 감소시키는 영향을 보여서 (B), BHRF1 발현 억제에는 효과적 이나 off -target 에도 영향을 미칠 가능성이 있었다. 실험예 4. BHRF1 siRNA가 EBV-양성 위암 세포의 세포 사멸에 미치는 영향 확인
4-1. BHRF1 siRNA가세포사멸에 미치는 영향 확인
BHRF1 siRNA 가 항암제에 대한 EBV-양성 위암 세포의 사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여， BHRF1 siRNA #C를 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세 탁셀을 처리하고 사멸 세포 (apoptotic cell)의 비율 변화를 확인하였다. 구체적으로， AGS-EBV 세포를 lxlO5 cel ls/ml 의 밀도로 6 웰 플레이트 에 접 종하고， scramble siRNA 및 BHRFl siRNA #(：를 20 nM씩 가한 후 G-fect in 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다 . 다음으로， 도세탁셀을 30 nM 처 리하여 72 시간 더 배양한 후 아넥신 V 염 색 (annexin V staining)을 하 고 FACScal iber 기기 (Becton Dickinson)를 이용하여 사멸 세포의 비율을 확 인하였다.
그 결과 , 도 5에 나타난 바와 같이， BHRFl siRNA #(：를 트랜스펙션한 후 도세탁셀을 처 리하였을 때 scramble siRNA를 트랜스펙션한 경우에 비해 더 많은 세포에서 세포 사멸 (apoptosis)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다 . 따 라서 BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV 세포에서 도세탁셀에 대한 내성을 저해 하는데 효과가 있음을 알 수 있었다 .
4-2. BHRFl siRNA가 세포 사멸 및 세포주기 제어 관련 유전자들의 발 현에 미치는 영향 확인
AGS-EBV 세포에 도세탁셀과 BHRFl siRNA #C 를 같이 처 리 한 후에 세포 사멸 및 세포주기 제어 관련 유전자들의 발현 변화를 조사하여 BHRF1에 대 한 siRNA를 사용함으로써 항암제 내성을 줄일 수 있음을 분자적 수준에서 확인하고자 하였다 .
음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 BHRFl siRNA ttC를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fect in 을 첨가하여 트랜스펙션시 키고 24 시간 배양하였다. 다음으로， 도세탁셀을 30 nM 처 리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확 하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자 발현을 확인하였다 .
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이 , 도세탁샐을 scramble siRNA와 함께 처리 한 경우 AGS와 AGS-EBV 세포에서 p53의 발현이 비슷한 정도로 증가되 었 으나， 도세탁셀을 BHRFl siRNA #(:와 함께 처리한 AGS-EBV 세포에서는 p53의 발현이 더 많이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 .
또한 AGS-EBV 세포에서 보다 AGS 세포에서 도세탁셀 처 리 에 의해 활성 형의 Caspase-3 양과 p21이 높게 나타났으며， AGS-EBV 세포에 도세탁셀과 BHRF1 siRNA #(:를 함께 처 리하면 도세탁샐과 scramble siRNA를 함께 처리 한 경우보다 활성화된 Caspase-3의 양과 p21이 증가되는 것을 확인할 수 있었 다 .
한편， basal level에서 AGS 세포에 비해 AGS-EBV 세포에서 Bd— 2 발현 이 높았고， AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA를 처 리하였을 때 Bcl-2의 발현이 다 소 감소되 었다. 도세탁샐을 처 리하면 AGS 세포에서는 Bcl-2의 발현이 거의 되지 않는 반면 AGS-EBV 세포에서는 Bcl-2의 발현이 증가하였다. 또한 BHRF1 siRNA #C를 도세탁샐과 같이 AGS-EBV 세포에 처 리하면 Belᅳ 2의 발현이 조금 감소되 었다.
따라서 BHRFl siRNA 의 항암제 내성 저해 과정에서 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자들이 관여할 가능성을 확인할 수 있었으며， 나아가 BHRF1의 발현을 억제시켜서 세포 사멸 및 생존에 중요한 유전자들을 조절함 으로써 향후 EBV 관련 암을 치료하는데 활용할 수 있을 것임을 알 수 있었 다 . 실험예 5. BHRF1 mRNA 상의 siRNA 타겟 부위의 규명
항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위 암에서 항암제 감수성을 높이기 위 한 목적으로 BHRF1 에 대한 siRNA 를 제공하고자， 본 발명자들은 BHRF1 의 raRNA 서 열 중에서 실제로 고효율로 항암제 감수성을 유도할 수 있는 siRNA 표적 서 열을 규명하기 위한 실험을 진행하였다 .
5-1. BHRF1 siRNA에 의한 단백질 수준에서의 BHRF1 유전자 침묵 효과 확인 、
BHRF1 mRNA 상의 다양한 부위에 결합하는 40종의 이중가닥 siRNA 를 제조하고 (실시 예 2 참조)， 이들 siRNA를 각각 AGS-EBV 세포에 처 리 했을 때
BHRF1 유전자의 발현 억 제 효과 (gene si lencing)가 나타나는지 여부를 단백 질 수준에서 확인하였다.
구체적으로， AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 lxlO6 eel ls/ml의 밀 도로 분주하고 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 실시 예 3에서 제 조한 40종의 BHRF1 siRNA를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트 랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로， 도세탁셀 30nM를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질올 추출하여 웨스턴 블랏올 통해 BHRF1유전자의 발현 변화를 확인하였다.
도 7은 siRNA #A~#E 에 대한 두 번의 실험 결과를 나타내고， 도 8은 siRNA #1~#35 에 대한 두 번와 실험 결과 및 로딩 대조군으로 사용한 β -act in에 대한 BHRF1 의 발현을 normal izat ion한결과를 종합하여 그래프로 나타낸 것이다.실험 결과，총 40종의 siRNA중에서 # (：， #2， #3， #9， #14， #15， #17, #18, #26 및 #32가 BHRF1 발현을 80~90%정도 감소시키는 것으로 확인 하였다.그러나, siRNA #A, #E, #4-6, #8， #10-13, #16, #19~#25, #27-31, #33~35 의 경우에는 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않거나 약하게 나타났 다.
5-2. BHRF1 siRNA에 의한 mRNA수준에서의 BHRF1유전자침묵효과확 ¾
BHRF1 siRNA을 AGS-EBV세포에 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현 억 제 효과가 mRNA수준에서도 나타나는지 여부를 조사하였다.
구체적으로， AGS-EBV세포를 100 mm배양 접시에 lxlO6 cells/ml의 밀 도로 분주하고， 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA및 상기 실험예 5—1 에서 80%이상의 BHRF1발현 억제 효과를 나타낸 BHRF1 siRNA 9종 (#2， #3， #9， #14, #15, #17, #18， #26 및 #32)을 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin을 첨가 하여 트랜스펙션시키고 24시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁샐 30nM를 처 리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 총 RNA를 추출하여 실시간 PCR로 BHRF1의 mRNA발현 변화를 확인하였다. 비교를 위하여 실험예 5-1의 웨스턴 블랏에서 유전자 발현 억제 효과가 적었던 siRNA 3종 (#25， #28 및 #29)을 임의로 골라서 그들이 BHRF1 mRNA수준에 미치는 영향도 함께 조사하 였다.
그 결과， 도 9에 나타난 바와 같이， siRNA 9종 (#2， #3， #9， #14， #15， #17, #18， #26및 #32)모두 실험예 5-1의 웨스턴 블랏 결과와 유사하게 mRNA 양을 효과적으로 억제하였다.
5-3. BHRF1 을 발현시킨 상태에서 siRNA에 의한 BHRF1 유전자 침묵 효 과 확인
실험 예 5-1 및 5ᅳ2 에서는 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA를 먼저 트랜스 펙션시 키고 도세탁셀을 처 리하여 도세탁셀에 의해 유도된 BHRF1 발현을 억제 하는 효율적 인 siRNA를 선별하였으나， 본 실험에서는 AGS-EBV 세포에 도세탁 셀을 먼저 처리하여 BHRF1 유전자 발현을 유도한 상태에서 siRNA 를 트랜스 펙션하여 BHRF1 유전자 침묵 효과를 단백질 수준에서 확인하였다 .
구체적으로， AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 lxlO6 eel I s/ml의 밀 도로 분주하고 , 도세탁셀 30nM 를 처 리하고 24 시간 배양하여 BHRF1 유전자 발현을 유도한 후 scramble siRNA 및 실험 예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #2， #3， #9， #14, #17 및 #32를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fect in 을 첨가하여 트랜스펙션시켰다 . 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백 질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다 .
그 결과， 도 10에 나타난 바와 같이， BHRF1을 발현시킨 상태에서 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때도 6종의 siRNA에서 BHRF1 발현이 모두 감소 되는 것을 확인할 수 있었고 , 특히 BHRF1 siRNA #2， #3에 의해 효과적으로 감 소되는 것을 확인하였다 .
5-4. BHRF1 siRNA 처리 농도에 따른 BHRF1 넉다운 효과 확인
AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시 에 lxlO6 cel ls/ml의 밀도로 분주하 고， 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 실험 예 5-1 및 5-2 에서 선 별된 siRNA 들 중에서 #C, #2， #3， #9， #14， #17 및 #32 를 각각 1， 5, 10 nM 로 가한 후 G-fect in 을 첨가하여 트랜스펙션시 키고 24 시간 배양하였다. 다 음으로 , 도세탁셀 30nM 를 처 리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하 고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인 하였다 .
그 결과 , 도 11에 나타난 바와 같이， BHRF1 siRNA를 저농도로 사용했 을 때도 scramble siRNA와 비교하였을 때 모두 효과가 좋은 것을 확인할 수 있었다. '
5-5. SNU-719세포주에서 siRNA에 의한 BHRF1유전자침묵효과
자연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에 BHRF1 siRNA를 트랜 스펙션하여 BHRF1 유전자 침묵 효과를 확인하였다.
SNU-719 세포에 scramble siRNA 및 실험예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #2， #3， #9， #14， #17 및 #32을 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로， 도 세탁셀 30nM를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과， 도 12에 나타난 바와 같이， 자연적으로 EBV 감염된 위암 세 포주인 SNU-719에서도 BHRF1 siRNA에 의한 BHRF1 유전자 발현 억제 효과를 확인할 수 있었고, 이를 통하여 상기 BHRF1 siRNA의 효과가 EBVᅳ양성 위암 종양에 보편적으로 적용될 가능성을 확인하였다. 상기 결과들을 종합적으로 살펴보았을 때， siRNA #C, #2， #3， #9， #14, #15， #17， #18， #26 및 #32 가 결합하는 부위 , 즉 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째， 165내지 184번째， 243내지 262 번째， 487내지 506번째， 및 519내 지 539 번째 부위가 siRNA 제작시 주요 타겟이 될 핫스팟 (hotspot)임을 확인 할 수 있었으며， 이 부위에 결합하는 siRNA 가 BHRF1 발현을 고효율로 억제 함으로써 EBV-양성 위암에서 항암제 내성 억제 효과를 유도하는데 효과적임 을 규명할 수 있었다. 상기 본 발명에서 제공하는 타겟 부위를 도 13에 나타 내었다.
【산압상 이용가능성】
본 발명은 BHRF1 발현을 고효율로 억제하는 siRNA 를 제공하며， 상기 siRNA는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성을 저해함으로써， 항암제와 함께 이용시 EBV-양성 위암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서 열번호 1의 뉴클레오타이드 서 열을 가지는 BHRFl mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서 열， 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서 열， 243 내 지 262 번째 뉴클레오타이드 서 열， 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서 열， 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서 열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서 열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
【청구항 2】
게 1항에 있어서， 19 내지 21 뉴클레오타이드 길이를 가지는 것 인，
BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서 열에 결합하는 siRNA 는 서 열번호 62 및 서 열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍 으로 구성된 siRNA 인， BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 BHRF1 mRNA 의 165 내지 184 번째 뉴클레오타이 드 서 열에 결합하는 siRNA 는 서 열번호 14 및 서 열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍， 또는 서 열번호 16 및 서 열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인， BHRF1 유전자의 발현을 억 제하는 siRNA.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 BHRF1 mRNA 의 165 내지 184 번째 뉴클레오타이 드 서 열에 결합하는 siRNA 는 서 열번호 14 및 서 열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍， 또는 서 열번호 16 및 서 열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인， BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
【청구항 6]
제 1항에 있어서， 상기 BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타이 드 서열에 결합하는 siRNA는 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
【청구항 7]
제 1항에 있어서， 상기 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이 드 서열에 결합하는 siRNA는 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이드 쌍， 또는 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인， BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
【청구항 8】
제 1항에 있어서, 상기 siRNA는 LNA (locked nucleic acid), UNA (unlocked nucleic acid) , 몰포리노 (morpholinos) 또는 PNA (peptide nucleic acid) 형태를 가지는 것인， BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
【청구항 9】
제 1항에 있어서， 상기 siRNA는 이에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오 티드의 당의 2'-위치의 수산기가 수소 원자, 할로겐 원자， — 0-알킬기， -으아 실기 및 아미노기 중 어느 하나로 치환되거나， 인산 백본이 포스포로티오에 이트， 포스포로디티오에이트， 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트 및 보 라노포스페이트중 어느 하나로 치환된 것인， BHRF1 유전자의 발현을 억제하 는 siRNA.
【청구항 10】
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 siRNA를 포함하는 엡스타인-바 바 이러스 양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용조성물.
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 항암제는 도세탁셀인 조성물.
【청구항 12】
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 siRNA 및 항암제를 포함하는 엡스 타인ᅳ바 바이러스 양성 위암 치료용 조성물.
【청구항 13】
제 12항에 있어서， 상기 항암제는 도세탁셀인 조성물.
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