KR20120132399A - ＢＨＲＦ１ 발현 억제를 위한 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EBV(Epstein-Bar virus)의 BHRF1 발현을 억제하는 siRNA 및 이를 이용한 항암제 내성 저해에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BHRF1 의 발현을 억제하는 siRNA 및 이를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

ＢＨＲＦ１ 발현 억제를 위한 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 조성물 {siRNA for inhibiting BHRF1 expression and composition comprising the same}
본 발명은 EBV(Epstein-Bar virus)의 BHRF1 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 이용한 항암제 내성 저해에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BHRF1 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.
엡스타인-바 바이러스(Epstein-Bar virus; EBV)는 아프리카에서 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)과 관련되어 최초로 발견된 감마 허피스 바이러스이다.
상기 바이러스는 버킷 림프종 또는 비인두 종양 등 다양한 종양과 연관성을 보이는데, 최근에는 일부 위암에 EBV 유전자가 발현하는 것으로 판명되었고 전세계 위암 환자의 4-18% 정도가 EBV-양성 위암으로 알려져 있다. 그러나, 위암에서의 EBV 의 병리학적인 역할에 대해서는 명확히 규명된 바가 없다. 또한, EBV는 여러 잠복 유전자(latent gene) 및 용균 유전자(lytic gene)를 가지고 있는데, 일반적으로 EBV 관련 종양에서 잠복 유전자들이 발현하는 것으로 생각되고 있으나 용균 유전자와의 관련성에 대해서는 많이 연구되지 않은 실정이다.
본 발명은 EBV-양성 위암이 EBV-음성 위암에 비해 높은 항암제 내성을 나타낸다는 발견에 기초한다. 본 발명자들은 또한, EBV-양성 위암에 항암제를 처리하면 BHRF1을 포함한 EBV 용균 유전자들이 발현되기 시작하는데 이렇게 발현된 BHRF1 등이 항암제 내성을 나타내는 요인으로 작용할 가능성이 있음을 확인하였다. 따라서, EBV 의 BHRF1을 감소시킴으로써 항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암 세포의 항암제 감수성을 높이기 위하여, BHRF1 에 대한 siRNA 를 제공하는데 중점을 두고 연구를 진행하였다.
siRNA(small interference RNA)는 RNAi(RNA interference)를 유도하는 물질로서 십여 개에서 수십 개 정도의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 이중사슬의 RNA를 말한다. RNAi는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. 이와 같이 RNAi는 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 비효율적인 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 방법을 대신하는 간단한 유전자 넉-다운(knock down) 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다. siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 표적 유전자의 mRNA의 유전자 발현을 억제하게 된다.
그러나, RNAi 기술은 모든 유전자의 RNA 에 적용됨으로써 선택적 발현 억제가 가능할 것이라는 애초의 기대와는 달리, 근래 대규모의 RNAi 탐색 과정에서 일부 유전자는 알려지지 않은 이유로 인해 RNAi 기술이 적용되지 않음이 밝혀지고 있다 (Krueger et al., Oligonucleotides, 17:237-250, 2007). 또한, 지난 수 년 간의 데이터베이스를 바탕으로 통계 분석을 통해 siRNA 서열을 예측하는 알고리즘이 개발되고 있으나, 컴퓨터 알고리즘이 불완전하기 때문에 이를 이용하여 인 실리코(in silico) 방법으로 결정된 모든 siRNA 가 실제 세포 및 생체 중에서 표적 mRNA 를 효과적으로 억제하는 것은 아니며 실험을 통한 검증을 통해서만 가장 효율적인 siRNA 를 결정할 수 있다는 것이 알려져 있다 (Derek et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 8:377-402, 2006).
이와 같이, 이론적으로 예상되는 siRNA가 반드시 목표로 하는 mRNA의 능력을 효과적으로 억제시키지는 않으며, 고효율의 siRNA 염기 서열을 찾아야 치료 목적을 달성할 수 있기 때문에, 표적 mRNA 상에서 억제 효율이 높은 특정 타겟 부위 (hyperactive target)을 찾는 것이 매우 중요하다. 또한, 한 유전자의 mRNA 당 다수의 타겟 부위를 선정하여 siRNA를 제조하고 적어도 세포 수준에서 직접적으로 이들의 효과를 확인함으로써 발현 억제 효능이 우수한 최적 위치의 서열을 발굴하는 과정이 필요하다.
이와 관련하여, 현재까지 BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 의 개발에 대한 연구 및 BHRF1 에 대한 siRNA 를 이용한 항암 치료에 관한 연구는 거의 보고된 바가 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 를 제조하여 이를 항암제 내성을 저해하는 용도로 제공하기 위하여 노력한 결과, BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 타겟 부위를 규명할 수 있었으며, 상기 타겟 부위에 상보적인 siRNA 를 항암제와 함께 EBV-양성 위암세포에 처리하면 세포 생존률을 감소시킴과 동시에 세포 사멸을 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 siRNA가 EBV-양성 위암세포에서 항암제 내성을 저해함으로써 결과적으로 효과적인 EBV-양성 위암 치료에 기여할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 BHRF1의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 의 타겟 부위를 규명하고 이 타겟 부위에 결합하는 siRNA 를 제공하는 것이다. 또한 상기 siRNA 를 항암제 내성 저해를 위한 용도로 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열, 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열, 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 siRNA를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 BHRF1의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 특정 타겟 부위에 결합하는 siRNA 에 관한 것이다.
바람직한 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열, 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열, 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 siRNA 는 19 내지 21 뉴클레오타이드 길이를 가지는 이중가닥 siRNA 일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 siRNA 는 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍, 및 서열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 BHRF1 siRNA를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, BHRF1 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 용어, "siRNA" 란 표적 mRNA 의 절단을 통하여 표적 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 짧은 이중사슬의 RNA 를 의미한다.
본 발명의 siRNA 는 표적 mRNA와 완전히 상보적 결합을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음) 또는 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 본 발명 siRNA 를 이루는 뉴클레오타이드 길이는 BHRF1의 활성 및 발현을 방해할 수 있는, 10 내지 40 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 19 내지 21 뉴클레오타이드 길이의 이중가닥 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 길이는 뉴클레오타이드가 이중가닥(페어링)을 이루는 길이를 말한다.
본 발명 siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단이 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 쪽이 돌출(overhang)한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하다. 돌출하는 뉴클레오타이드 수는 한정되지 않으나, 예를 들어 1 내지 8 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1 내지 4 뉴클레오타이드일 수 있다. 또한, siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서, 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 dTdT, UU, 또는 이중가닥 형성부에서 계속해서 BHRF1 mRNA 와 일치하는 또는 상보적인 서열 등을 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 siRNA 는 서열번호 1로 표시되는 BHRF1 mRNA 에서 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열, 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열, 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 이다.
바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 siRNA #26 으로 명명한다.
바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #2 및 #3 으로 명명한다.
또한 바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #C 및 #9 로 명명한다.
또한 바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #14 및 #15 로 명명한다.
또한 바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #17 및 #18 로 명명한다.
또한, 본 발명의 siRNA 는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막고 생체 내 안정성을 높이기 위해 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당(ribose ring)의 2'-위치의 수산기를 수소 원자, 할로겐 원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기, 구체적으로는 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 수식하거나 (이 때 R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기, R'은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬렌일 수 있다), 인산 백본을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트, 또는 보라노포스페이트 등으로 수식할 수 있다.
또한, 상기 화학적 변형은, 본 발명의 siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), 몰포리노(morpholino), PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나의 핵산 유사체 형태를 가지도록 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이들 LNA, UNA, PNA, 몰포리노 등의 제조는 본 발명에서 제공하는 siRNA 서열 정보를 바탕으로 당업계에 알려진 지식에 의하여 제조할 수 있으며, 기존의 문헌을 참고할 수 있다 (Veedu RN, Wengel J.Chem Biodivers. 7(3):536-42, 2010; Demidov VV. Trends Biotechnol. 21(1):4-7, 2003; Shantanu Karkare, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 71:575-586, 2006).
또한, 본 발명의 siRNA 는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 각 해당 서열번호의 siRNA 와 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오타이드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA 가 쌍을 이루어 이중가닥을 형성하는 완전한 형태, 즉 인 비트로에서 siRNA를 직접 합성한 뒤 트랜스펙션(transfection)을 통해 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 플라스미드계 shRNA 벡터와 PCR-유도 siRNA 발현 카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.
상기 siRNA 를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법 (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002), 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법 (Brummelkamp TR et al., Science 296:550-553, 2002), 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 RNaseIII 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법 (Paul CP et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, EBV-음성 위암 세포주와 EBV-양성 위암 세포주에 도세탁셀을 처리한 경우, EBV-음성 위암 세포주에 비해 EBV-양성 위암 세포주에서 세포 생존률이 높은 반면 세포 사멸률은 적게 나타나, EBV-양성 위암 세포의 항암제 내성이 높다는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 참조). 또한, 상기 두 세포주에 각각 도세탁셀을 처리하였을 때 EBV 용균 유전자들의 발현 여부 및 발현 정도를 확인해 본 결과, 두 세포가 항암제에 대한 내성 차이를 보이는 농도에서, EBV-양성 위암 세포에서 BHRF1을 포함한 EBV 용균 유전자들이 발현함을 확인할 수 있었다 (도 2 참조). 이는, EBV-양성 위암에 나타나는 항암제 내성에 BHRF1 등의 EBV 용균 유전자들이 관여함을 시사하는 결과이다.
이에, 본 발명자들이 EBV 의 siRNA 가 BHRF1 발현을 감소시킴으로써 항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암 세포의 항암제 감수성을 높일 수 있는지를 살펴보았다. 그 결과, EBV-양성 위암 세포에 BHRF1 siRNA 를 처리한 후 항암제를 처리한 경우 scramble siRNA 를 처리한 경우에 비하여 60% 정도의 세포 생존률 감소 효과를 나타내고 세포 사멸을 유도함을 확인할 수 있었다 (도 4 및 도 5 참조). 나아가 이러한 항암제 내성 억제 과정에서 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자들이 관여할 가능성을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 따라서, BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV 세포에서 항암제에 대한 내성을 저해하는데 효과가 있음을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명자들은 EBV-양성 위암에서 EBV 의 BHRF1을 감소시킴으로써 항암제 감수성을 높이기 위한 목적으로 BHRF1 에 대한 siRNA 를 제공하고자, BHRF1 의 mRNA 서열 중 실제로 고효율로 항암제 감수성을 유도할 수 있는 siRNA 표적 서열을 규명하였다.
이를 위하여, 본 발명자들은 BHRF1 mRNA 상의 다양한 부위에 결합하는 40종(siRNA #A~#E 및 #1~#35로 명명)의 이중가닥 siRNA을 합성하였고 (도 3 참조), 이들이 실제로 BHRF1 유전자 발현을 억제하는지 여부를 단백질 수준 및 mRNA 수준에서 각각 확인하였다.
그 결과, 40종의 siRNA 중에서 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #26, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #2 및 #3, BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #C 및 #9, BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #14 및 #15, 그리고 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #17 및 #18이 각각 BHRF1 유전자 발현을 80~90% 정도 감소시키는 것으로 확인되었으며 (도 7 내지 도 11 참조), 이러한 효과는 EBV-양성 위암 세포주 AGS-EBV 뿐 아니라 자연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에서도 유지되었다 (도 12 참조).
반면, 상기 mRNA 서열을 조금이라도 벗어난 경우 siRNA 의 BHRF1 발현 억제 효능이 현저히 떨어졌는데, 예를 들어 siRNA #A, #4~#6 의 경우 siRNA #2 및 #3 과 타겟 서열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않았고, siRNA #10~13 의 경우 siRNA #C 및 #9 과 타겟 서열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않았다. 또한, siRNA #16의 경우 siRNA #14 및 #15 타겟 서열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않았고, siRNA #D~E, #19~25 의 경우 siRNA #17 및 #18과 타겟 서열이 중복되거나 인접해 있음에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 현저히 떨어졌다. 또한, siRNA #27~28 의 경우 siRNA 26 과 인접해 있음에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 현저히 떨어졌다.
따라서, BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째, 165 내지 184 번째, 243 내지 262 번째, 487 내지 506 번째, 및 519 내지 539 번째 부위가 siRNA 제작시 주요 타겟이 될 핫스팟(hotspot)임을 확인할 수 있었으며, 이 부위에 결합하는 siRNA 가 BHRF1 발현을 고효율로 억제함으로써 EBV-양성 위암에서 항암제 내성 억제 효과를 유도하는 효과적임을 규명할 수 있었다.
상기 본 발명에서 제공하는 타겟 부위를 도 13에 나타내었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 siRNA 는 EBV 의 BHRF1 발현을 억제함으로써 종국적으로 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성을 저해하는 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어, "항암제 저항성" 이란 항암제 투여시 투여한 약물이 암세포를 사멸시키지 못하거나 사멸시키는 정도가 미비한 것을 말하며, 항암제 저항성은 항암제 내성의 가장 빈번한 원인이다. 일반적으로 "항암제에 대한 내성" 이란, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 이와 같이, 항암제를 암환자에게 투여하면, 투여함에 따라 효과가 감소하는 것이 잘 알려져 있다. 이는 생체 내에서 항암제에 대하여 내성의 암세포가 출현하여 암의 화학요법을 곤란하게 하는 것에 기인하는 것이다.
본 발명에서 용어, "항암제 내성 저해" 는 항암제로 암을 치료시 본 발명의 siRNA 가 없을 때보다 있을 때 항암제의 암세포에 대한 독성이 더 강화되거나 증가되는 것을 말한다. 본 발명에서 BHRF1 siRNA 는 항암제에 대해 EBV-양성 위암 세포를 민감화시킴으로써 항암제에 대한 암세포의 저항성을 줄이고 항암제의 효과를 높일 수 있다. 바람직하게, 상기 항암제는 도세탁셀이다.
본 발명의 조성물은 상기한 BHRF1 siRNA를 단독으로 사용하거나, 2종 이상의 siRNA 를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 siRNA 는 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체와 복합체 형태로 포함될 수 있다. 예컨대, siRNA 는 siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다. 또한, 전달 시약으로 G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 조합된 네이키드 siRNA로 포함되어 대상자에게 투여될 수 있다. 또한 siRNA의 체내 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시키는 등 당업계에 알려진 일반적인 siRNA 세포 내 전달 기술을 이용하도록 제제화될 수 있다.
본 발명의 항암제 내성 저해용 조성물은 siRNA 또는 siRNA 와 핵산 전달체와의 복합체 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화 될 수 있다.
경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있다. 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 이외의 본 발명 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 siRNA 는 하나 이상의 항암제와 함께 항암 조성물로 제공될 수 있다.
항암제란 암세포를 죽이기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 약제는 암 세포의 DNA의 복제, 전사, 번역 과정을 차단하게 된다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 항암제는, 바람직하게는 도세탁셀이다.
본 발명의 항암제 내성 저해용 조성물 또는 항암용 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 강내 투여, 경막내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 BHRF1 siRNA는 항암제와 함께 또는 항암제를 투여하기 전 또는 투여하고 난 후에 일정 시차를 두고 항암제와 별도로 투여될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병적 상태, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 BHRF1 발현을 고효율로 억제하는 siRNA 를 제공하며, 상기 siRNA 는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성을 저해함으로써, 항암제와 함께 이용시 EBV-양성 위암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 (a)는 EBV-음성 위암세포(AGS)와 EBV-양성 위암세포(AGS-EBV) 에 도세탁셀을 처리하였을 때 세포 생존률(cell viability)을 나타낸 것으로, Triplicate로 3번 반복하여 실험한 결과의 평균값과 SD값을 그래프로 나타낸 것이다 (*, p<0.05; **, p<0.01을 의미함). (b)는 AGS 세포와 AGS-EBV 세포에 도세탁셀을 처리하였을 때 세포 사멸(apoptosis) 비율을 나타낸 것으로, 3번 반복하여 실험한 결과의 평균값과 SD값을 그래프로 나타낸 것이다 (**, p<0.01을 의미함).
도 2는 AGS-EBV 세포에서 도세탁셀 처리하였을 때 EBV 용균 유전자(BZLF1, BRLF1, BMRF1, BHRF1)들이 발현되는지의 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 BHRF1 유전자의 mRNA 서열 및 본 발명에서 제작한 40종의 BHRF1 siRNA #A~#E 및 #1~#35의 결합 부위를 나타낸다.
도 4의 (A)는 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA #C, #2 및 #32 을 각각 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 세포 수의 변화를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다. (B)는 AGS 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 5는 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA #C를 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 세포 사멸 비율의 변화를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 6은 AGS-EBV 세포와 AGS 세포에 각각 siRNA #C 및/또는 도세탁셀을 처리했을 때 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 7의 (A) 는 BHRF1 siRNA 5종(#A~#E)을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다. (B) 는 BHRF1 siRNA 4종(#A~#D)에 대하여 다시 한 번 확인한 결과이다.
도 8의 (A) 는 BHRF1 siRNA 35종(#1~#35)을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다. (B) 는 다시 한 번 확인한 결과이다. (C) 는 로딩 대조군으로 사용한 β-actin 에 대한 BHRF1 의 발현을 normalization한 결과를 종합하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 siRNA 9종(#2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32) 을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 실시간 RT-PCR 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 10은 BHRF1을 발현시킨 상태에서 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 11은 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA들을 다양한 농도 범위로 처리하고(1, 5, 10 nM) 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 12는 SNU-719 세포에 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 13은 본 발명에서 제공하는 BHRF1 mRNA 상의 siRNA 타겟 부위 및 이에 결합하는 siRNA를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 재료의 준비
EBV-음성 위암(EBV-negative gastric carcinoma; GC) 세포로 AGS 세포를 사용하였고, EBV-양성 위암(EBV-positive gastric carcinoma) 세포로는 AGS 세포에 재조합 Akata virus (Shimizu et al., J. Virol. 70, 7260-7263, 1996)를 감염시킨 AGS-EBV 세포를 사용하였다. AGS는 10% 우태아혈청 (FBS; Hyclone, Logan, Utah, USA)과 항생제 (페니실린 100 Units/ml 및 스트렙토마이신100 μg/ml; Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 또한 AGS-EBV는 추가적으로 400 μg/ml 제네티신 (Gibco BRL)이 포함된 배지에서 배양하였다. 항암제로는 탁솔 계열의 항암제인 도세탁셀 (Aventis, Paris, France)을 사용하였다.
실시예 2. BHRF1 에 대한 siRNA 의 제조
서열번호 2 내지 서열번호 81 로 이루어진 군으로부터 선택된 40종의 이중가닥 siRNA를 화학적으로 합성하였다 (표 1 및 표 2). 제조한 각 siRNA 의 BHRF1 mRNA 타겟 부위는 도 3에 나타내었다. 상기 siRNA들은 제놀루션 (서울, Korea)사로부터 주문 제작하였다.
siRNA
No.		 센스/안티센스 서열 서열
번호
#A 센스 5'-CGAAAUUCAGAGACAUUUA-3' 2
안티센스 5'-UAAAUGUCUCUGAAUUUCG-3' 3
#B 센스 5'-GAAACUUGGAACAGAUUUA-3' 4
안티센스 5'-UAAAUCUGUUCCAAGUUUC-3' 5
#C 센스 5'-GGAUUUUAACUCAGUAUUU-3' 6
안티센스 5'-AAAUACUGAGUUAAAAUCC-3' 7
#D 센스 5'-UGACUUUGAGUCUGUUAGU-3' 8
안티센스 5'-ACUAACAGACUCAAAGUCA-3' 9
#E 센스 5'-GUUAUAUGUAGUUAUUUAU-3' 10
안티센스 5'-AUAAAUAACUACAUAUAAC-3' 11
siRNA
No.		 센스/안티센스 서열 서열
번호
#1 센스 5'-CUGUAGUUCUGCGUUAUCA-3' 12
안티센스 5'-UGAUAACGCAGAACUACAG-3' 13
#2 센스 5'-GGAGAUAAUUGAACGAAAU-3' 14
안티센스 5'-AUUUCGUUCAAUUAUCUCC-3' 15
#3 센스 5'-GAGAUAAUUGAACGAAAUU-3' 16
안티센스 5'-AAUUUCGUUCAAUUAUCUC-3' 17
#4 센스 5'-GAUAAUUGAACGAAAUUCA-3' 18
안티센스 5'-UGAAUUUCGUUCAAUUAUC-3' 19
#5 센스 5'-ACGAAAUUCAGAGACAUUU-3' 20
안티센스 5'-AAAUGUCUCUGAAUUUCGU-3' 21
#6 센스 5'-AAAUUCAGAGACAUUUACA-3' 22
안티센스 5'-UGUAAAUGUCUCUGAAUUU-3' 23
#7 센스 5'-GAGACAUUUACAGAAACUU-3' 24
안티센스 5'-AAGUUUCUGUAAAUGUCUC-3' 25
#8 센스 5'-CAGAAACUUGGAACAGAUU-3' 26
안티센스 5'-AAUCUGUUCCAAGUUUCUG-3' 27
#9 센스 5'-GAUUUUAACUCAGUAUUUU-3' 28
안티센스 5'-AAAAUACUGAGUUAAAAUC-3' 29
#10 센스 5'-UUUUAACUCAGUAUUUUUA-3' 30
안티센스 5'-UAAAAAUACUGAGUUAAAA-3' 31
#11 센스 5'-UUAACUCAGUAUUUUUAGA-3' 32
안티센스 5'-UCUAAAAAUACUGAGUUAA-3' 33
#12 센스 5'-CUCAGUAUUUUUAGAGAUA-3' 34
안티센스 5'-UAUCUCUAAAAAUACUGAG-3' 35
#13 센스 5'-CAGUAUUUUUAGAGAUAUU-3' 36
안티센스 5'-AAUAUCUCUAAAAAUACUG-3' 37
#14 센스 5'-AGGUUUAGCUGGACUUUGU-3' 38
안티센스 5'-ACAAAGUCCAGCUAAACCU-3' 39
#15 센스 5'-GGUUUAGCUGGACUUUGUU-3' 40
안티센스 5'-AACAAAGUCCAGCUAAACC-3' 41
#16 센스 5'-GUUUAGCUGGACUUUGUUU-3' 42
안티센스 5'-AAACAAAGUCCAGCUAAAC-3' 43
#17 센스 5'-GACUUUGAGUCUGUUAGUU-3' 44
안티센스 5'-AACUAACAGACUCAAAGUC-3' 45
#18 센스 5'-CUUUGAGUCUGUUAGUUAU-3' 46
안티센스 5'-AUAACUAACAGACUCAAAG-3' 47
#19 센스 5'-CUGUUAGUUAUAUGUAGUU-3' 48
안티센스 5'-AACUACAUAUAACUAACAG-3' 49
#20 센스 5'-GUUAGUUAUAUGUAGUUAU-3' 50
안티센스 5'-AUAACUACAUAUAACUAAC-3' 51
#21 센스 5'-UUAGUUAUAUGUAGUUAUU-3' 52
안티센스 5'-AAUAACUACAUAUAACUAA-3' 53
#22 센스 5'-AGUUAUAUGUAGUUAUUUA-3' 54
안티센스 5'-UAAAUAACUACAUAUAACU-3' 55
#23 센스 5'-UUAUAUGUAGUUAUUUAUU-3' 56
안티센스 5'-AAUAAAUAACUACAUAUAA-3' 57
#24 센스 5'-UAUAUGUAGUUAUUUAUUU-3' 58
안티센스 5'-AAAUAAAUAACUACAUAUA-3' 59
#25 센스 5'-AUAUGUAGUUAUUUAUUUA-3' 60
안티센스 5'-UAAAUAAAUAACUACAUAU-3' 61
#26 센스 5'-GGAGAUACUGUUAGCCCUG-3' 62
안티센스 5'-CAGGGCUAACAGUAUCUCC-3' 63
#27 센스 5'-AUACGGGACAGUCGUGUGC-3' 64
안티센스 5'-GCACACGACUGUCCCGUAU-3' 65
#28 센스 5'-CUGCAUCCUGUGUUGGAGC-3' 66
안티센스 5'-GCUCCAACACAGGAUGCAG-3' 67
#29 센스 5'-GAGACCCAAGCCUUGGGCG-3' 68
안티센스 5'-CGCCCAAGGCUUGGGUCUC-3' 69
#30 센스 5'-GUUGGCCUGGAUGGCCUGG-3' 70
안티센스 5'-CCAGGCCAUCCAGGCCAAC-3' 71
#31 센스 5'-AUGCAUGCCUGCAGGACAU-3' 72
안티센스 5'-AUGUCCUGCAGGCAUGCAU-3' 73
#32 센스 5'-GUAACCAGUCUACUCCUUA-3' 74
안티센스 5'-UAAGGAGUAGACUGGUUAC-3' 75
#33 센스 5'-GACCUGUCAGUUCGUGGGA-3' 76
안티센스 5'-UCCCACGAACUGACAGGUC-3' 77
#34 센스 5'-AGCGAAGGCCUGGAUGGUU-3' 78
안티센스 5'-AACCAUCCAGGCCUUCGCU-3' 79
#35 센스 5'-GCUGGUCUACAUUAAUUGA-3' 80
안티센스 5'-UCAAUUAAUGUAGACCAGC-3' 81
실험예 1. EBV -양성 위암 세포의 항암제 저항성 확인
EBV-음성 위암 세포주(AGS)와 EBV-양성 위암 세포주(AGS-EBV)에 각각 도세탁셀을 처리한 후 세포 생존률(cell viability)과 세포 사멸(apoptosis) 비율을 각각 비교하였다.
구체적으로, 세포 생존률을 측정하기 위하여, AGS 세포와 AGS-EBV 세포를 각각 96 웰 플레이트에 5x104 cells/ml 의 밀도로 100 μl씩 분주한 후 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로 도세탁셀을 농도별(0-100 nM)로 처리하고 72 시간 동안 배양한 후 CCK-8 (Cell Counting Kit-8; Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan) 용액을 각 웰당 10 μl씩 분주하여 3시간 배양한 다음 SoftMax 기기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 세포 사멸율을 측정하기 위하여, AGS 세포와 AGS-EBV 세포를 각각 1x106 cells/ml 의 밀도로 100 mm 배양 접시에 접종한 후 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로 30 nM 의 도세탁셀을 처리하고 72 시간 배양한 후 세포들을 수확하여 차가운 생리식염수로 2회 세척하고 70% 에탄올을 넣어 -20 ℃ 에서 밤새 고정하였다. 다음날 상온에서 15분마다 볼텍싱(vortexing)하면서 1시간 배양한 후 원심분리하여 상층액을 버리고 생리식염수로 2회 세척하였다. 다음으로 생리식염수에 100 μg/ml 의 RNase A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 50 μg/ml PI (propidium iodide; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 섞은 용액을 각 세포에 500 μl 씩 넣어 세포를 풀어 염색하고 37 ℃ 수조에서 20분 배양한 후 FACScaliber 기기 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포 주기를 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, EBV-음성 위암 세포주(AGS) 에 비해 EBV-양성 위암 세포주(AGS-EBV)에서 10 nM 이상의 도세탁셀 농도로 처리 시 세포 생존률이 높게 나타난 반면, 세포 사멸은 적게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 AGS 세포에 비해 AGS-EBV 세포가 도세탁셀에 대한 내성이 높다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 도세탁셀 처리시 EBV 용균 유전자의 발현 확인
AGS-EBV 세포에서 도세탁셀 처리에 의해 EBV 용균 유전자(lytic gene)들이 발현 되는지의 여부를 확인하였다.
구체적으로, AGS 세포에 도세탁셀 30nM 을 처리하고 AGS-EBV 세포에는 도세탁셀을 농도 별로(0-100 nM) 처리한 후 72 시간 배양하였고, 세포를 수확하여 단백질을 추출한 후 웨스턴 블랏을 통하여 EBV 용균 유전자들의 발현을 확인하였다. EBV 용균 유전자들의 확인을 위해 항-BZLF1 (Dako, Glostrup, Denmark, 1:500), 항-BRLF1 (Argene, Varilhes, France; 1:500), 항-BMRF1 (Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK; 1:500) 및 항-BHRF1 (3E8, 1:250) (Chou et al., 2004)를 각각 1차 항체로 사용하였다. 또한 로딩 컨트롤로 항-β-actin (Sigma-Aldrich, 1:2000)을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 도세탁셀을 10 nM 이상의 농도로 처리시 AGS-EBV 세포에서 BHRF1을 비롯한 EBV 용균 유전자들이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 두 세포가 항암제에 대한 내성 차이를 보이는 농도에서 AGS-EBV 세포가 EBV 용균 유전자들을 발현함을 확인하였으므로, 항암제 내성에 BHRF1 등의 EBV 용균 유전자들이 관여할 가능성이 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. BHRF1 siRNA 가 EBV -양성 위암 세포의 세포 생존률에 미치는 영향 확인
BHRF1 siRNA 가 항암제에 대한 EBV-양성 위암 세포의 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위하여, siRNA #C, #2 및 #32 을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리하고 세포 수의 변화를 확인하였다.
구체적으로, AGS 세포 및 AGS-EBV 세포를 8x103 cells /100μl 의 밀도로 96 웰 플레이트에 각각 접종하고, scramble siRNA 및 BHRF1 siRNA #C, #2 및 #32 을 각각 10 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀을 30 nM씩 처리하여 72 시간 더 배양한 후 CCK-8 용액을 각 웰당 10 μl 씩 분주하여 3시간 배양한 다음 SoftMax 기기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, BHRF1 siRNA #C, #2 및 #32 를 처리하고 도세탁셀을 처리한 경우 모두, scramble siRNA 를 처리한 경우에 비하여 60% 정도의 세포 생존률 감소 효과를 나타내었다. 따라서 BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV 세포에서 도세탁셀에 대한 내성을 저해하는데 효과가 있음을 알 수 있었다(A). 다만, #32 의 경우에는 EBV 음성 세포인 AGS 세포에서도 세포 생존을 감소시키는 영향을 보여서(B), BHRF1 발현 억제에는 효과적이나 off-target 에도 영향을 미칠 가능성이 있었다.
실험예 4. BHRF1 siRNA 가 EBV -양성 위암 세포의 세포 사멸에 미치는 영향 확인
4-1. BHRF1 siRNA 가 세포 사멸에 미치는 영향 확인
BHRF1 siRNA 가 항암제에 대한 EBV-양성 위암 세포의 사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여, BHRF1 siRNA #C를 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리하고 사멸 세포(apoptotic cell)의 비율 변화를 확인하였다.
구체적으로, AGS-EBV 세포를 1x105 cells/ml 의 밀도로 6 웰 플레이트에 접종하고, scramble siRNA 및 BHRF1 siRNA #C를 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀을 30 nM 처리하여 72 시간 더 배양한 후 아넥신 V 염색(annexin V staining)을 하고 FACScaliber 기기 (Becton Dickinson)를 이용하여 사멸 세포의 비율을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, BHRF1 siRNA #C를 트랜스펙션한 후 도세탁셀을 처리하였을 때 scramble siRNA를 트랜스펙션한 경우에 비해 더 많은 세포에서 세포 사멸(apoptosis)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV 세포에서 도세탁셀에 대한 내성을 저해하는데 효과가 있음을 알 수 있었다.
4-2. BHRF1 siRNA 가 세포 사멸 및 세포주기 제어 관련 유전자들의 발현에 미치는 영향 확인
AGS-EBV 세포에 도세탁셀과 BHRF1 siRNA #C 를 같이 처리한 후에 세포 사멸 및 세포주기 제어 관련 유전자들의 발현 변화를 조사하여 BHRF1에 대한 siRNA를 사용함으로써 항암제 내성을 줄일 수 있음을 분자적 수준에서 확인하고자 하였다.
음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 BHRF1 siRNA #C를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀을 30 nM 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자 발현을 확인하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 도세탁셀을 scramble siRNA와 함께 처리한 경우 AGS와 AGS-EBV 세포에서 p53의 발현이 비슷한 정도로 증가되었으나, 도세탁셀을 BHRF1 siRNA #C와 함께 처리한 AGS-EBV 세포에서는 p53의 발현이 더 많이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
또한 AGS-EBV 세포에서 보다 AGS 세포에서 도세탁셀 처리에 의해 활성형의 Caspase-3 양과 p21이 높게 나타났으며, AGS-EBV 세포에 도세탁셀과 BHRF1 siRNA #C를 함께 처리하면 도세탁셀과 scramble siRNA를 함께 처리한 경우보다 활성화된 Caspase-3의 양과 p21이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, basal level에서 AGS 세포에 비해 AGS-EBV 세포에서 Bcl-2 발현이 높았고, AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA를 처리하였을 때 Bcl-2의 발현이 다소 감소되었다. 도세탁셀을 처리하면 AGS 세포에서는 Bcl-2의 발현이 거의 되지 않는 반면 AGS-EBV 세포에서는 Bcl-2의 발현이 증가하였다. 또한 BHRF1 siRNA #C를 도세탁셀과 같이 AGS-EBV 세포에 처리하면 Bcl-2의 발현이 조금 감소되었다.
따라서 BHRF1 siRNA 의 항암제 내성 저해 과정에서 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자들이 관여할 가능성을 확인할 수 있었으며, 나아가 BHRF1의 발현을 억제시켜서 세포 사멸 및 생존에 중요한 유전자들을 조절함으로써 향후 EBV 관련 암을 치료하는데 활용할 수 있을 것임을 알 수 있었다.
실험예 5. BHRF1 mRNA 상의 siRNA 타겟 부위의 규명
항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암에서 항암제 감수성을 높이기 위한 목적으로 BHRF1 에 대한 siRNA 를 제공하고자, 본 발명자들은 BHRF1 의 mRNA 서열 중에서 실제로 고효율로 항암제 감수성을 유도할 수 있는 siRNA 표적 서열을 규명하기 위한 실험을 진행하였다.
5-1. BHRF1 siRNA 에 의한 단백질 수준에서의 BHRF1 유전자 침묵 효과 확인
BHRF1 mRNA 상의 다양한 부위에 결합하는 40종의 이중가닥 siRNA 를 제조하고 (실시예 2 참조), 이들 siRNA를 각각 AGS-EBV 세포에 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현 억제 효과(gene silencing)가 나타나는지 여부를 단백질 수준에서 확인하였다.
구체적으로, AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 실시예 3에서 제조한 40종의 BHRF1 siRNA를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
도 7은 siRNA #A~#E 에 대한 두 번의 실험 결과를 나타내고, 도 8은 siRNA #1~#35 에 대한 두 번의 실험 결과 및 로딩 대조군으로 사용한 β-actin 에 대한 BHRF1 의 발현을 normalization한 결과를 종합하여 그래프로 나타낸 것이다. 실험 결과, 총 40종의 siRNA 중에서 #C, #2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32 가 BHRF1 발현을 80~90% 정도 감소시키는 것으로 확인하였다. 그러나, siRNA #A, #E, #4~6, #8, #10~13, #16, #19~#25, #27~31, #33~35 의 경우에는 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않거나 약하게 나타났다.
5-2. BHRF1 siRNA 에 의한 mRNA 수준에서의 BHRF1 유전자 침묵 효과 확인
BHRF1 siRNA 을 AGS-EBV 세포에 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현 억제 효과가 mRNA 수준에서도 나타나는지 여부를 조사하였다.
구체적으로, AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 상기 실험예 5-1 에서 80% 이상의 BHRF1 발현 억제 효과를 나타낸 BHRF1 siRNA 9종(#2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32)을 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 총 RNA를 추출하여 실시간 PCR 로 BHRF1 의 mRNA 발현 변화를 확인하였다. 비교를 위하여 실험예 5-1의 웨스턴 블랏에서 유전자 발현 억제 효과가 적었던 siRNA 3종(#25, #28 및 #29)을 임의로 골라서 그들이 BHRF1 mRNA 수준에 미치는 영향도 함께 조사하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, siRNA 9종(#2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32) 모두 실험예 5-1 의 웨스턴 블랏 결과와 유사하게 mRNA 양을 효과적으로 억제하였다.
5-3. BHRF1 을 발현시킨 상태에서 siRNA 에 의한 BHRF1 유전자 침묵 효과 확인
실험예 5-1 및 5-2 에서는 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA를 먼저 트랜스펙션시키고 도세탁셀을 처리하여 도세탁셀에 의해 유도된 BHRF1 발현을 억제하는 효율적인 siRNA를 선별하였으나, 본 실험에서는 AGS-EBV 세포에 도세탁셀을 먼저 처리하여 BHRF1 유전자 발현을 유도한 상태에서 siRNA 를 트랜스펙션하여 BHRF1 유전자 침묵 효과를 단백질 수준에서 확인하였다.
구체적으로, AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 24 시간 배양하여 BHRF1 유전자 발현을 유도한 후, scramble siRNA 및 실험예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #2, #3, #9, #14, #17 및 #32를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시켰다. 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, BHRF1을 발현시킨 상태에서 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때도 6종의 siRNA에서 BHRF1 발현이 모두 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 BHRF1 siRNA #2, #3에 의해 효과적으로 감소되는 것을 확인하였다.
5-4. BHRF1 siRNA 처리 농도에 따른 BHRF1 넉다운 효과 확인
AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 실험예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #C, #2, #3, #9, #14, #17 및 #32 를 각각 1, 5, 10 nM로 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, BHRF1 siRNA를 저농도로 사용했을 때도 scramble siRNA와 비교하였을 때 모두 효과가 좋은 것을 확인할 수 있었다.
5-5. SNU -719 세포주에서 siRNA 에 의한 BHRF1 유전자 침묵 효과 확인
자연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에 BHRF1 siRNA를 트랜스펙션하여 BHRF1 유전자 침묵 효과를 확인하였다.
SNU-719 세포에 scramble siRNA 및 실험예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #2, #3, #9, #14, #17 및 #32을 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 자연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에서도 BHRF1 siRNA에 의한 BHRF1 유전자 발현 억제 효과를 확인할 수 있었고, 이를 통하여 상기 BHRF1 siRNA의 효과가 EBV-양성 위암 종양에 보편적으로 적용될 가능성을 확인하였다.
상기 결과들을 종합적으로 살펴보았을 때, siRNA #C, #2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32 가 결합하는 부위, 즉 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째, 165 내지 184 번째, 243 내지 262 번째, 487 내지 506 번째, 및 519 내지 539 번째 부위가 siRNA 제작시 주요 타겟이 될 핫스팟(hotspot)임을 확인할 수 있었으며, 이 부위에 결합하는 siRNA 가 BHRF1 발현을 고효율로 억제함으로써 EBV-양성 위암에서 항암제 내성 억제 효과를 유도하는데 효과적임을 규명할 수 있었다. 상기 본 발명에서 제공하는 타겟 부위를 도 13에 나타내었다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> siRNA for inhibiting BHRF1 expression and composition comprising the same <130> DPP20122524KR <160> 81 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 576 <212> DNA <213> Epstein-Bar virus <220> <221> gene <222> (1)..(576) <223> BHRF1 <400> 1 atggcctatt caacaaggga gatactgtta gccctgtgta tacgggacag tcgtgtgcat 60 ggaaatggta ccctgcatcc tgtgttggag ctagcagcaa gagaaacacc tctccgcctt 120 tcgccagagg acactgtagt tctgcgttat catgtgttgc ttgaggagat aattgaacga 180 aattcagaga catttacaga aacttggaac agatttataa cacacaccga acatgtggat 240 ctggatttta actcagtatt tttagagata tttcaccgtg gagacccaag ccttgggcgc 300 gcgttggcct ggatggcctg gtgcatgcat gcctgcagga cattgtgttg taaccagtct 360 actccttact atgttgtgga cctgtcagtt cgtgggatgt tagaagccag cgaaggcctg 420 gatggttgga ttcatcaaca gggcggctgg tctacattaa ttgaagacaa cattcctgga 480 tccagaaggt ttagctggac tttgtttctt gctggactga ctttgagtct gttagttata 540 tgtagttatt tatttatctc cagaggaaga cactaa 576 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #A <400> 2 cgaaauucag agacauuua 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #A <400> 3 uaaaugucuc ugaauuucg 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #B <400> 4 gaaacuugga acagauuua 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #B <400> 5 uaaaucuguu ccaaguuuc 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #C <400> 6 ggauuuuaac ucaguauuu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #C <400> 7 aaauacugag uuaaaaucc 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #D <400> 8 ugacuuugag ucuguuagu 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #D <400> 9 acuaacagac ucaaaguca 19 <210> 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17 aauuucguuc aauuaucuc 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #4 <400> 18 gauaauugaa cgaaauuca 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #4 <400> 19 ugaauuucgu ucaauuauc 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #5 <400> 20 acgaaauuca gagacauuu 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #5 <400> 21 aaaugucucu gaauuucgu 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #6 <400> 22 aaauucagag acauuuaca 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #6 <400> 23 uguaaauguc ucugaauuu 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #7 <400> 24 gagacauuua cagaaacuu 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #7 <400> 25 aaguuucugu aaaugucuc 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #8 <400> 26 cagaaacuug gaacagauu 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #8 <400> 27 aaucuguucc aaguuucug 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #9 <400> 28 gauuuuaacu caguauuuu 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #9 <400> 29 aaaauacuga guuaaaauc 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #10 <400> 30 uuuuaacuca guauuuuua 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #10 <400> 31 uaaaaauacu gaguuaaaa 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #11 <400> 32 uuaacucagu auuuuuaga 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #11 <400> 33 ucuaaaaaua cugaguuaa 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #12 <400> 34 cucaguauuu uuagagaua 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #12 <400> 35 uaucucuaaa aauacugag 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #13 <400> 36 caguauuuuu agagauauu 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #13 <400> 37 aauaucucua aaaauacug 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #14 <400> 38 agguuuagcu ggacuuugu 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #14 <400> 39 acaaagucca gcuaaaccu 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #15 <400> 40 gguuuagcug 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<213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #23 <400> 56 uuauauguag uuauuuauu 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #23 <400> 57 aauaaauaac uacauauaa 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #24 <400> 58 uauauguagu uauuuauuu 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #24 <400> 59 aaauaaauaa cuacauaua 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #25 <400> 60 auauguaguu auuuauuua 19 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #25 <400> 61 uaaauaaaua acuacauau 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #26 <400> 62 ggagauacug uuagcccug 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #26 <400> 63 cagggcuaac aguaucucc 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #27 <400> 64 auacgggaca gucgugugc 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #27 <400> 65 gcacacgacu gucccguau 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #28 <400> 66 cugcauccug uguuggagc 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #28 <400> 67 gcuccaacac aggaugcag 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #29 <400> 68 gagacccaag ccuugggcg 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #29 <400> 69 cgcccaaggc uugggucuc 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #30 <400> 70 guuggccugg auggccugg 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #30 <400> 71 ccaggccauc caggccaac 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #31 <400> 72 augcaugccu gcaggacau 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #31 <400> 73 auguccugca ggcaugcau 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #32 <400> 74 guaaccaguc uacuccuua 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #32 <400> 75 uaaggaguag acugguuac 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #33 <400> 76 gaccugucag uucguggga 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #33 <400> 77 ucccacgaac ugacagguc 19 <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #34 <400> 78 agcgaaggcc uggaugguu 19 <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #34 <400> 79 aaccauccag gccuucgcu 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequences of siRNA #35 <400> 80 gcuggucuac auuaauuga 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequences of siRNA #35 <400> 81 ucaauuaaug uagaccagc 19

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열, 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열, 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  2. 제1항에 있어서, 19 내지 21 뉴클레오타이드 길이를 가지는 것인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  4. 제1항에 있어서, 상기 BHRF1 mRNA 의 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  5. 제1항에 있어서, 상기 BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  6. 제1항에 있어서, 상기 BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  7. 제1항에 있어서, 상기 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  8. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), 몰포리노(morpholinos) 또는 PNA (peptide nucleic acid) 형태를 가지는 것인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  9. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 이에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당의 2'-위치의 수산기가 수소 원자, 할로겐 원자, -O-알킬기, -O-아실기 및 아미노기 중 어느 하나로 치환되거나, 인산 백본이 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트 및 보라노포스페이트중 어느 하나로 치환된 것인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 siRNA를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항암제는 도세탁셀인 조성물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 siRNA 및 항암제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 양성 위암 치료용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항암제는 도세탁셀인 조성물.
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