CN113528446A - 化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养基和药物组合物 - Google Patents

化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养基和药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养基和药物组合物。本发明也公开了诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的方法，药盒或试剂盒。

Description

化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养 基和药物组合物
本发明是申请号为CN 201510869117.8的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于肿瘤学、干细胞重编程、药学交叉领域；更具体地，本发明涉及化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养基和药物组合物。
背景技术
据世卫组织报告，2012年全球约有1.41千万新发癌症病例，820万患者死于癌症(CA期刊《2012全球癌症统计》)。乳腺癌及前列腺癌分别是女性及男性常见的肿瘤及致死的主要原因。
肝癌具发病原因及发病机理复杂、异质性强、病情隐匿、预后凶险等临床特征。
目前，治疗肝癌的有效方法除外科手术应用于早期肝癌效果较好外，其他治疗手段如放射治疗(放疗)、化学药物治疗(化疗)、靶向治疗及生物免疫治疗等，均具疗效有限而且毒副作用大，复发率高，五年存活率低的特点。不仅如此，耐药性(化疗、靶向治疗)及昂贵的治疗费用等原因，更使大批患者得不到有效治疗。
至今最成功的肿瘤诱导分化疗法范例是使用全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(acute pmmyelocytic kukeIIlia，APL)，取得高缓解率，但ATRA单独使用常常会并发维甲酸综合征、白细胞增多症，导致患者难以耐受而停药；且易复发，必须联用蒽环类药物化疗以降低复发率，长期生存率也不理想；而且ATRA诱导分化治疗方法仅对APL有效，“对其它急性白血病和实质性恶性肿瘤一般无效”，对肝癌更是无效。
因此，研究开发有效防治肝癌及其他恶性肿瘤的新方法和新手段仍是刻不容缓的任务。本领域迫切需要开发新型的高效低毒性抗肿瘤药物，以期为临床抗肿瘤治疗、提高患者存活率提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养基和药物组合物。
在本发明的第一方面，提供一种用于化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞不同程度凋亡的小分子组合物(或配方)，所述的组合物包括GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂；或所述的组合物由GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂组成。
在一个优选例中，所述的组合物包括：
GSK3β抑制剂：0.046-4.65重量份；和
TGFβ抑制剂：0.038-7.68重量份。
在另一优选例中，所述的组合物可为溶液状态组合物，包括：
GSK3β抑制剂：终浓度为：0.1-10uM；和
TGFβ抑制剂：终浓度为：0.1-20uM。
在另一优选例中，所述的组合物包括：
GSK3β抑制剂：0.232-2.325重量份；和
TGFβ抑制剂：0.192-3.84重量份。
在另一优选例中，所述的组合物可为溶液状态组合物，包括：
GSK3β抑制剂：终浓度为：0.5-5uM；和
TGFβ抑制剂：终浓度为：0.5-10uM。
在另一优选例中，GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂相加的重量占组合物总重量的0.01～99.9％；更佳地为0.1～50％，如1％，5％，10％，20％，30％等。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(或GSK3β抑制剂CHIR99021)、TGFβ抑制剂(或TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)重量份比为：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)；或溶液状态下摩尔比为：(0.1-10)﹕(0.1-20)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)。
在另一优选例中，所述组合物还包括：
维甲酸类化合物：0.03-6.0重量份；较佳地为0.15-3重量份。添加维甲酸类化合物，可以促进和增强了肿瘤细胞转化或凋亡，并扩大了适用肿瘤类型或范围。
在另一优选例中，所述的组合物可为溶液状态组合物，包括维甲酸类化合物终浓度为：0.1-20uM；较佳地为0.5-10uM。
在另一优选例中，GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂和维甲酸类化合物相加的重量占组合物总重量的0.02～99.9％；更佳地为0.2～50％，如1％，5％，10％，20％，30％，40％等。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(或GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(或TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)和维甲酸类化合物(或维甲酸)以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)；较佳地，以(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)存在；或以溶液状态下摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)：(0.1-20)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)存在。
在另一优选例中，所述组合物还可添加包括选自下组的一种或多种成分：
BMP抑制剂(如LDN-193189)：0.02-4.65重量份；较佳地为：0.203-2.03重量份；或
BrdU：0.15-30重量份；较佳地1.5-15重量份；或
EdU：0.125-25重量份；较佳地1.25-12.5重量份。
在另一优选例中，所述的组合物可为溶液状态的组合物，包括选自下组的一种或多种成分：
BMP抑制剂终浓度为：0.05-10uM；较佳地为0.5-5uM；
BrdU终浓度为：0.5-100uM；较佳地为5-50uM；或
EdU终浓度为：0.5-100uM；较佳地为5-50uM。
添加BMP抑制剂(如LDN-193189)、BrdU或EdU，可进一步促进或增强某些恶性肿瘤细胞转化或凋亡。
在另一优选例中，GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂，维甲酸类化合物，和/或BMP抑制剂，和/或BrdU(或/和EdU)相加的重量占组合物总重量的0.02～99.9％；更佳地为0.2～50％，如1％，5％，10％，20％，30％，40％等。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(如GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(如TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，维甲酸类化合物(如维甲酸)，BMP抑制剂(如BMP抑制剂LDN-193189)和BrdU以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)﹕(0.02-4.65)﹕0.15-30；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)﹕(0.203-2.03)﹕(1.5-15)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)﹕(0.1-20)﹕(0.05-10)﹕(0.5-100)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)﹕(0.5-5)﹕(5-50)存在。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(如GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(如TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，维甲酸类化合物(如维甲酸)，BMP抑制剂(如BMP抑制剂LDN-193189)和EdU以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)﹕(0.02-4.65)﹕(0.125-25)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)﹕(0.203-2.03)﹕(1.25-12.5)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)﹕(0.1-20)﹕(0.05-10)﹕(0.5-100)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)﹕(0.5-5)﹕(5-50)存在。
在另一优选例中，所述的GSK3β抑制剂包括但不限于：CHIR-99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR-98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080以及其他具相同功能的同一类GSK3β信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为GSK3β抑制剂CHIR-99021；
所述的TGFβ抑制剂包括但不限于：SB431542、A83-01、SB525334、LY2109761，RepSox、SD-208、GW788388、SB505124、EW-7197以及其他具相同功能的同一类TGFβ信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01；
所述的维甲酸类化合物是天然或人工合成的，包括但不限于：维甲酸(别名：全反式维甲酸)、13-顺式维甲酸、9-順式维甲酸、UAB7、UAB8、异维甲酸、维胺酯、依曲替酸、依曲替酯、他扎罗汀、阿达帕林、TTNPB、3-甲基-TTN PB、AM80、AM580、CD437、Targretin、LGD1069及其他具相同功能的同一类维甲酸类诱导分化剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为维甲酸(Retinoic acid，RA)。
在另一可选方式中，所述组合物中可以不包括维甲酸。
所述的BMP抑制剂包括但不限于：LDN-193189、K02288、DMH1以及其他具相同功能的同一类BMP信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为BMP抑制剂LDN-193189。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物，还包含药学上可接受的载体或赋形剂，其载体或赋形剂包括(但不限于)：
水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；
DMSO(二甲基亚砜)、甘油和乙醇或其它有机溶剂；
微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；
胶体型载药系统或高分子载药系统；或
防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、pH缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂。
在另一优选例中，所述的组合物可制备的药物剂型包括(但不限于)：
固体剂型，包括(但不限于)粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂；
液体剂型，包括(但不限于)注射剂、输液剂、混悬剂，或它液体剂型；
气体剂型；或
半固体剂型。
在另一优选例中，所述的组合物可配制成一种诱导肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞的培养基，组合物中各成分存在于含5-20％小牛血清、1％青链霉素混合液(100x)的基础细胞培养基或含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基中但组合物中不包括细胞分化基本培养基。
在本发明的另一方面，提供所述的组合物的用途，用于制备治疗肿瘤的药物(或药物配方)；或用于制备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的培养基或试剂。
在本发明的另一方面，提供一种诱导肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括：应用权利要求1-6任一所述的组合物处理人肿瘤细胞。
在另一优选例中，提供制备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化并伴随凋亡的培养基或试剂方法及其实验步骤，包括：
(1)浓缩液试剂配制：根据权利要求1-6任一所述的组合物，将各成分溶解于有机溶剂或水性溶剂中配制成浓缩液试剂；较佳地，所述的有机溶剂包括二甲基亚砜；较佳地，所述的水性溶剂包括：水，生理盐水，磷酸盐缓冲液；
(2)培养基获得：将步骤(1)中的浓缩液试剂分别稀释入含5-20％小牛血清、1％青链霉素混合液(100x)的基础细胞培养基或含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基中(使得各组分的浓度符合权利要求1-6任一所述的组合物中所限定的浓度)，获得诱导肿瘤细胞转化或凋亡的培养基；其中，该培养基各组分的百分含量还可上下浮动50％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％，5％；
(3)诱导肿瘤细胞转化或凋亡：将肿瘤细胞在上述步骤(2)配制的诱导“肿瘤细胞转化或凋亡培养基”中混悬，铺板作为处理组；将与处理组培养基溶解小分子组合物的溶剂(如DMSO或其它溶剂)等量地添加入同处理组所用含10％小牛血清、1％青链霉素混合液(100x)的基础细胞培养基(或含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基)中，获得“对照培养基”(百分数均以v/v计)；然后将与处理组等数量的肿瘤细胞加入“对照培养基”中混悬，铺板，作为对照组；37℃培养，每2-4天换液一次；3-7天传代一次。
(4)诱导肿瘤细胞转化或凋亡的传代培养：弃原培养液，PBS洗涤一次，加入细胞消化液消化细胞，37℃，1-5分钟，终止细胞消化，离心，弃上清，将细胞沉淀重悬，按1:1-1:3传代铺板。按实验步骤第1和2项方法培养，每2-4天换液一次。所用消化液包括胰酶，EDTA,Acutase,TrypleE等。3-7天传代一次。
(5)诱导肿瘤细胞转化或凋亡获得正常或非致瘤性细胞：经上述实验步骤(3)、(4)转化或凋亡培养和传代培养肿瘤细胞1-3周，PBS洗涤去除凋亡细胞，即可获得正常或非致瘤性细胞。可用该细胞进行其他科研实验。
在本发明的另一方面，提供一种用于诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的药盒/试剂盒，所述的药盒/试剂盒中包括：前面任一所述的组合物；或基于该组合物开发制备的治疗肿瘤的药物或药物配方；或基于该组合物制备的科研用试剂或培养基。
如前面任一方面，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括但不限于：肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤或神经系统肿瘤及其它血液系统肿瘤和实质性肿瘤或其细胞；较佳地为肝癌或肝癌细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、肝癌细胞SMMC-7721被小分子组合物转化或凋亡(培养基6)。
A、肝癌细胞SMMC-7721被小分子组合物转化为肝细胞样细胞(转化或凋亡培养10天)(培养基6)。
B、肝癌细胞SMMC-7721被诱导凋亡(培养基6)。
图中蓝色柱代表早期凋亡，红色柱代表晚期凋亡；T1W、T2W、T3W分别代表处理1、2、3周的肝癌细胞SMMC-7721。对照组和处理组的凋亡值具统计学差异(p<0.05)。
图2、肝癌细胞HepG2被小分子组合物转化并诱导凋亡(培养基4、1)
A、肝癌细胞HepG2被小分子组合物转化为肝细胞样细胞(培养基4，培养8天)。
B、肝癌细胞HepG2被小分子组合物诱导凋亡(培养基1)。
图中蓝色柱代表早期凋亡，红色柱代表晚期凋亡；T1W、T2W、T3W分别代表处理1、2、3周的凋亡检测结果。对照组和处理组的凋亡值具统计学差异(p<0.05)。
图3、耐5-Fu肝癌细胞7402/5-Fu被小分子组合物诱导转化或凋亡(培养基5、2)。
A、肝癌细胞7402/5-Fu被小分子组合物诱导转化为肝细胞样细胞(培养基5)；
B、肝癌细胞7402/5-Fu被小分子组合物诱导凋亡(培养基2)。对照组和处理组的凋亡值具统计学差异(p<0.005)。
图4、肝癌细胞SMMC-7721(培养基7)，HepG2(培养基8)，7402/5-Fu(培养基9)被诱导转化为肝细胞样细胞并具正常肝细胞功能。PAS：糖原染色，Oil-red：油红染色，反映脂肪摄取功能。SMMC-7721(培养基7)，HepG2(培养基8)，7402/5-Fu(培养基9)为不同的肝癌细胞株。
图5、肝癌细胞SMMC-7721(培养基10)、HepG2(培养基11)、7402/5-Fu(培养基12)被诱导转化为肝细胞样细胞并具正常肝细胞白蛋白分泌(ALB)，尿素生成(Urea)，CYP1A2诱导和CYP3A4诱导功能。
A、肝癌细胞SMMC-7721被肿瘤细胞转化或凋亡培养基10诱导转化获得的肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能；
B、肝癌细胞HepG2被肿瘤细胞转化或凋亡培养基11诱导转化获得的肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能；
C、耐5-Fu肝癌细胞7402/5-Fu被肿瘤细胞转化或凋亡培养基12诱导转化获得的肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能；
T1W、T2W、T3W分别代表处理1、2、3周。
Rif：利福平；Ome：奥美拉措。
图6、肝癌细胞SMMC-7721(培养基6)，HepG2(培养基7)和7402/5-Fu(培养基8)被诱导转化获得的肝细胞样细胞体内体外均不再具致瘤性(培养基6、7、8)。
A、肝癌细胞SMMC-7721，HepG2和7402/5-Fu被诱导转化获得的肝细胞样细胞体外生长不形成克隆(培养基6、7、8)；
B、肝癌细胞SMMC-7721被诱导转化获得的肝细胞样细胞体内不生成肿瘤(培养基6)。
C、7402/5-Fu被诱导转化获得的肝细胞样细胞体内不生成肿瘤(培养基8)；C图上图裸鼠右侧为处理组细胞不形成肿瘤；左侧对照组细胞形成肿瘤；C图下图为对照组形成的肿瘤解剖形状外观。
图7、病人肝癌组织PDX动物模型试验(肿瘤细胞转化或凋亡组合物8)。结果显示：处理组瘤体组织坏死(红色染色)；对照组瘤体组织、细胞结构无变化(紫红色染色)(PDX-80872)。图中4、7、8等数字表示小鼠耳钉代码。
图8、正常人成纤维细胞和肝细胞被肿瘤细胞转化或凋亡培养基5、6处理培养3周后，形态无改变。
图9、鼻咽癌细胞HNE和肺癌细胞H460被诱导转化或凋亡(培养基9、3)。由图9可见，鼻咽癌细胞HNE(培养基11)处理组癌细胞形态发生明显转化；处理组肺癌细胞H460(培养基3)几乎全部被诱导凋亡(图中绿色柱代表早期凋亡，红色柱代表晚期凋亡；T10D、T20D分别代表处理10天、处理20天)；而对照组肺癌细胞H460几乎无凋亡。
图10、胃癌细胞MKN28和SGC-7901被诱导转化(培养基10、11)。由图10可见，胃癌细胞MKN28(培养基10)和SGC-7901(培养基11)处理组的癌细胞形态发生明显转化；
图11、胰腺癌细胞SW1990被诱导转化(培养基12)。由图11可见，胰腺癌细胞SW1990处理组的癌细胞形态发生明显转化；
图12、乳腺癌细胞SKBr3被诱导转化(培养基10)。由图12可见，乳腺癌细胞SKBr3处理组的癌细胞形态发生明显转化；
图13、白血病细胞U937、B细胞淋巴瘤SUDHL-4被诱导凋亡(培养基6、8)。由图13可见，白血病细胞U937(培养基6)、B细胞淋巴瘤SUDHL-4(培养基8)处理组的癌细胞大多被诱导凋亡，细胞形态不再完整。
图14、乳腺癌细胞SKBr3和胃癌细胞MKN28被肿瘤细胞转化或凋亡培养基13、14诱导转化。乳腺癌细胞SKBr3和胃癌细胞MKN28被肿瘤细胞转化或凋亡培养基13、14诱导转化2周，处理组(T)的癌细胞形态发生明显转化。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种小分子组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的方法及其小分子组合物；该小分子组合物可添加药物载体或赋型剂开发制备成临床治疗肿瘤的药物或药物配方；可添加水性溶剂或有机溶剂、基础培养基或无血清培养基制备成科研用试剂或培养基。该小分子组合物化学诱导人肿瘤细胞直接重编程方法首先应用于肝癌细胞，将肝癌细胞直接重编程为非致瘤性肝细胞样细胞并伴随肝癌细胞不同程度凋亡；经转化获得的肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能；在已实验测试范围内对正常肝细胞和成纤维细胞无损伤。
基本机理
重编程(Reprogramming)指不改变基因序列的情况下，通过调控细胞信号通路及表观遗传(epigenetics)的变化来改变细胞命运的过程。
随着干细胞科学发展，细胞重编程在不断创新，过去从外源导入转录因子实现重编程；现通过使用调控细胞信号通路和表观遗传的小分子组合也可实现“化学诱导重编程”(Hongkui Deng.et al.Pluripotent Stem Cells Induced from Mouse Somatic Cellsby Small-Molecule Compounds.Science.341,651-4,2013)和“化学诱导直接重编程”(LiX,Zuo X,Jing J,Ma Y,Wang J,Liu D,Zhu J,Du X,Xiong L,Du Y,Xu J,Xiao X,Chai Z,Zhao,Y,Deng,H.Small-Molecule-Driven Direct Reprogramming of Mouse Fibroblastsinto Functional Neurons.Cell Stem Cell.17(2):195-203,2015；Hu W,Qiu B,Guan W,Wang Q.Wang M,Li W,Gao L,Shen L,Huang Y,Xie G,Zhao H,Jin Y,Tang B,Yu Y,ZhaoJ,Pei G.Direct Conversion of Normal and Alzheimer's Disease Human Fibroblastsinto Neuronal Cells by Small Molecules.Cell Stem Cell.17(2):204-212,2015)；重编程的起始和目的细胞类型也从分化细胞重编程为多能干细胞，扩展到直接重编程为另一种分化细胞；甚至可从异常分化细胞(粘液瘤细胞)外源导入转录因子重编程为多能细胞(Zhang X,Cruz FD,Terry M,Remotti F and Matushansky I.Terminal differentiationand loss of tumorigenicity of humancancers via pluripotency-basedreprogramming.Oncogene,2,2249–2260,2013)；因此，仅使用小分子将肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞已成为可能。
Hamburger等于1977年首次提出了“肿瘤干细胞(cancer stemcells,CSC)假说”，认为肿瘤实际上是由一小群具有无限自我更新能力的干细胞样细胞及由其产生的分化程度不均一的细胞团组成。目前虽然对肿瘤干细胞假说尚存在不同看法，且对肿瘤干细胞的来源存有争议：一种观点认为来源于正常干细胞的分化受阻；另一种则认为是由成熟细胞去分化而来。但包括肿瘤干细胞在内的肿瘤细胞都处于不同程度的异常分化状态的观点已被多数人接受。而研究者往往只重视肿瘤细胞的干性,开展肿瘤诱导分化治疗研究；忽视肿瘤细胞同时处于不同程度的异常分化状态的特点。因此，基于现有直接重编程机理将异常分化的肿瘤细胞直接转化为正常或非致瘤性分化细胞，这无疑是研究肿瘤治疗的新思路。
细胞重编程机理表明，只有成功构建并能长期维持目的细胞特有的基因表达谱及相应的形态功能，同时起始细胞能够克服细胞的信号通路，表观遗传，代谢方式等各种“能障”，细胞重编程才能完成，从一种细胞类型转变为另一种细胞类型。
基于现有化学诱导直接重编程机理，本发明设计了用小分子组合诱导克服肿瘤细胞的各种“能障”并建立非致瘤性细胞的生物学行为平台，将人异常分化细胞类型(肿瘤细胞)直接重编程转化为非致瘤性细胞类型，无法转化的肿瘤细胞则被诱导凋亡。并将上述设计研究方案首先应用于肝癌，筛选了既能诱导分化，又能够突破细胞信号通路、表观遗传等各种“能障”的化学小分子组合，通过调控细胞命运转换的信号通路，克服各种“能障”，使细胞按一定的内在机制，有序地完成基因表达模式、代谢调控方式及表观遗传改变，进而完成细胞类型的转换，将人肝癌细胞直接重编程转化成为非致瘤性的肝细胞样细胞，同时伴随不同程度的肝癌细胞凋亡；小分子性质稳定，作用的时间、剂量及组合方式易于控制，作用效果稳定可靠；转化后的肝细胞样细胞不但具有正常成熟的人肝细胞功能，而且动物体内外实验均表明其不再具致瘤性；该方法能强有力地转化肝癌细胞且对正常肝细胞没有损伤；也不需杀细胞试剂辅助，可避免对正常组织细胞的无区别杀伤副作用；更不需要导入外源基因或改变细胞基因结构，避免了外源基因导入引起新的致癌风险，所以安全可靠。该方法对致病原因及发病机理复杂，异质性强且缺乏有效治疗手段的人体肝癌的控制或有效治疗具有重要意义。不仅如此，进一步研究结果显示，该小分子组合物还对诱导鼻咽癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病以及其他血液系统肿瘤和实质性肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞，并伴随肿瘤细胞不同程度凋亡，具有相同或类似效果。因此，上述系列实验结果验证了本发明人设计用小分子组合诱导克服肿瘤细胞的各种“能障”并建立非致瘤性细胞的生物学行为平台，将人异常分化细胞类型(肿瘤细胞)直接重编程转化为非致瘤性细胞类型，而无法转化的肿瘤细胞被诱导凋亡。这一设计方案是成功有效的。
药物组合物及其应用
本发明人经过广泛的研究，首次提出同时抑制GSK3β和TGFβ信号通路即可诱导肿瘤细胞转化并伴随肿瘤细胞凋亡。根据肿瘤细胞异质性的个体差异或肿瘤细胞株之间的差异，被诱导转化的肿瘤细胞与被诱导凋亡的肿瘤细胞数目比例有不同变化；有的偏重于转化，有的偏重于凋亡；而同时抑制GSK3β和TGFβ信号通路偏重于凋亡，转化不够彻底。
而在抑制GSK3β和TGFβ信号通路的同时联合维甲酸(RA)，则能够增强小分子组合物诱导肿瘤细胞转化为非致瘤性细胞，同时伴随肿瘤细胞不同程度的凋亡。若再联合BMP信号通路的下调，和/或联合BrdU(或/和EdU)，则可进一步增强或促进某些恶性更强的肿瘤细胞转化并伴随肿瘤细胞凋亡。尽管因肿瘤的异质性不同而被小分子组合转化与凋亡的比例有所不同。但不影响该小分子组合诱导肿瘤细胞转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的最终效果。因此，该小分子组合物可开发为抗肿瘤治疗的新药物或药物配方；并可直接制备为化学诱导肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的科研用培养基或试剂。
应理解，除了本发明实施例中所列举的具体GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、BMP抑制剂以外的其它可抑制GSK3β信号通路、TGFβ信号通路、BMP信号通路的同种类抑制剂也可实现同样的技术效果，也应被包含在本发明中。
同样，除了本发明实施例中所列举的具体维甲酸(RA)诱导分化剂以外的其它具相同功能的维甲酸类化合物诱导分化剂也可实现同样的技术效果；也应被包含在本发明中。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的药物添加剂、载体、赋形剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质；如本领域常用的药物载体或赋形剂。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”，其中载体指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系；药物载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于：水、盐水、磷酸缓冲液以及其它水性溶剂；DMSO(二甲基亚砜)、甘油和乙醇以及其它有机溶剂；微球、脂质体、微乳液、高分子表面活性剂；胶体型载药系统、新型高分子载药系统、新型药物载体以及其他药学上的载体；其中赋形剂指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
对赋形剂的一般要求是性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。其载体或赋形剂包括但不限于：水、盐水、磷酸缓冲液等水溶液；DMSO(二甲基亚砜)、甘油和乙醇等有机溶剂；微球、脂质体、微乳液、高分子表面活性剂；胶体型载药系统、新型高分子载药系统、新型药物载体以及其他药学上的载体；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、pH缓冲物质，片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂以及其它药物赋形剂等。
如本文所用，术语“组合物可制备的药物剂型”中的药物剂型指：为适应治疗或预防的需要而制备的药物应用形式，称为药物剂型；本发明任一组合物可制备的药物剂型包括但不限于：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂及其它固体剂型；注射剂、输液剂、混悬剂及其它液体剂型，以及气体剂型、半固体剂型等其它剂型。
如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以微克、毫克、克数或千克数表示重量(如1ug、1mg、1g、2g、5g、或kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。
在一个优选例中：所述的组合物中，GSK3β抑制剂(或GSK3β抑制剂CHIR99021)、TGFβ抑制剂(或TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)存在；或以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)存在。
在另一优选例中：所述的组合物：GSK3β抑制剂(或GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(或TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，和维甲酸类化合物(或维甲酸)以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)存在；或以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)﹕(0.1-20)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)存在。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(如GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(如TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，维甲酸类化合物(如维甲酸)，BMP抑制剂(如BMP抑制剂LDN-193189)和BrdU以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)﹕(0.02-4.65)﹕0.15-30；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)﹕(0.203-2.03)﹕(1.5-15)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)﹕(0.1-20)﹕(0.05-10)﹕(0.5-100)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)﹕(0.5-5)﹕(5-50)存在。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(如GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(如TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，维甲酸类化合物(如维甲酸)，BMP抑制剂(如BMP抑制剂LDN-193189)和EdU以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)﹕(0.02-4.65)﹕(0.125-25)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)﹕(0.203-2.03)﹕(1.25-12.5)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)﹕(0.1-20)﹕(0.05-10)﹕(0.5-100)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)﹕(0.5-5)﹕(5-50)存在。
作为本发明的优选方式，所述的组合物中，包括的成分如表1或表2(溶液状态组合物)所示。
表1
Figure BDA0003167311820000121
表2
Figure BDA0003167311820000131
表1和表2的配方范围可以作为参考性指导。但是应理解，当用于开发制备药物组合物时，所用的组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗肿瘤的种类以及疾病的严重程度而变化。
如本发明所用，所述的“GSK3β抑制剂”是指能够抑制细胞中GSK3β信号通路的抑制剂的总称，包括但不限于：CHIR-99021，BIO、IM-12、TWS119及其他具有相同功能的同一类GSK3β信号通路抑制剂：
CHIR-99021(CT99021)，其是GSK-3α和β抑制剂，IC50分别为10nM和6.7nM，比对CDC2，ERK2及其他激酶的抑制性强500倍；
CHIR-99021(CT99021)HCl，其是CHIR-99021的盐酸盐，是一种GSK-3α/β抑制剂，在无细胞试验中IC50为10nM/6.7nM，可用于区分GSK-3和其最接近的同源物Cdc2与ERK2；
BIO，其是一种特异性的GSK-3抑制剂，无细胞试验中作用于GSK-3α/β的IC50为5nM；
IM-12，其是一种选择性的GSK-3β抑制剂，其IC50为53nM，增强了Wnt信号通路；
TWS119，其是一种GSK-3β抑制剂，在无细胞试验中IC50为30nM；
1-Azakenpaullone，其是一种高度选择性GSK-3β抑制剂，IC50为18nM；
CHIR-98014，其是一种有效的GSK-3α/β抑制剂，无细胞试验中IC50为0.65nM/0.58nM；
Tideglusib，其是一种不可逆的，非ATP竞争性的GSK-3β抑制剂，无细胞试验中IC50为60nM；
AR-A014418，其是一种ATP竞争性和选择性的GSK3β抑制剂，无细胞试验中IC50和Ki为104nM和38nM；
LY2090314，其是一种有效的GSK-3抑制剂，作用于GSK-3α/β，IC50为1.5nM/0.9nM；
SB216763，其是一种有效的，选择性GSK-3α/β抑制剂，IC50为34.3nM；
AZD1080，其是一种口服生物有效的，选择性的，可透过大脑的GSK3抑制剂，抑制人类GSK3α和GSK3β，Ki分别为6.9nM和31nM，比作用于CDK2，CDK5，CDK1和Erk2选择性高14倍以上。
作为本发明的优选方式，所述的GSK3β抑制剂是CHIR-99021，其别名为CT99021；其分子结构式如以下式(I)所示：
Figure BDA0003167311820000141
如本发明所用，所述的“TGFβ抑制剂”是指能够抑制细胞中TGFβ信号通路的抑制剂的总称，包括但不限于：SB431542、A83-01、SB525334、LY2109761、RepSox及其他具相同功能的同一类TGFβ信号通路抑制剂：
SB-431542，其是有效的，选择性的ALK5抑制剂，IC50为94nM，比对p38、MAPK和其他激酶的抑制性强100倍；
A83-01，其是ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂，IC50分别为12，45和7.5nM；
SB525334，其是一种有效的，选择性TGFβreceptor I(ALK5)抑制剂，无细胞试验中IC50为14.3nM，作用于ALK4比作用于ALK5效果低4倍，对ALK2，3，和6没有活性；
LY2109761，其是一种新型的，选择性TGF-βreceptor type I/II(TβRI/II)双重抑制剂，无细胞试验中Ki分别为38nM和300nM；
RepSox，其是一种有效的，选择性TGFβR-1/ALK5抑制剂，作用于ATP与ALK5结合以及ALK5自磷酸化，无细胞试验中IC50分别为23nM和4nM。
SD-208，其是一种选择性TGF-βRI(ALK5)抑制剂，with IC50为48nM，选择性比TGF-βRII高100多倍；
GW788388，其是一种有效的，选择性ALK5抑制剂，无细胞试验中IC50为18nM，也抑制TGF-βII型受体和activin II型受体活性，但不抑制BMP II型受体；
SB505124，其是一种选择性TGFβR抑制剂，作用于ALK4和ALK5，无细胞试验中IC50分别为129nM和47nM，也抑制ALK7，但不抑制ALK1，2，3或6；
EW-7197，其是一种高效的，选择性的，口服生物有效的TGF-βreceptor ALK4/ALK5抑制剂，IC50分别为13nM和11nM。
作为本发明的优选方式，所述的TGFβ抑制剂是SB 431542(或称为SB-431542)；其分子结构式如以下式(II)所示：
Figure BDA0003167311820000151
作为本发明的优选方式，所述的TGFβ抑制剂是A83-01(或称为A8301)；其分子结构式如以下式(III)所示：
Figure BDA0003167311820000152
如本发明所用，所述的维甲酸类(retinoids)化合物，包括但不限于：维甲酸(Retinoic acid，RA)，别名：全反式维甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)；13-順式维甲酸(13-cis retinoic acid，13-CRA)、9-順式维甲酸(9-cis-retinoic acid，9-CRA)及其他具相同功能的同一类维甲酸类诱导分化剂或化合物，或其组合。
维甲酸类(retinoids)化合物具有调节细胞增殖、分化和细胞生理凋亡(apoptosi s)的功能，因其能够激活相应的维甲酸核受体(retinoie acid receptor，RAR)和维甲酸X核受体(retinoid x receptor，RXR)蛋白，通过与维甲酸应答因子(retinoic acidrespo nse elements，RARE)特异性结合，从而调控特定核基因的转录活性，产生生物学效应。维甲酸类化合物及其异构体衍生物中许多都具有相同或相类似的功能，因此成为一类重要的诱导分化剂或化合物。
维甲酸类(retinoids)化合物是一组维生素A(视黄醇)的氧化代谢产物或衍生物以及与维生素A具有类似结构的人工合成物,包括天然和合成两大类。主要包括：维甲酸(Retinoic acid，RA)(别名：维A酸、全反式维甲酸)、13-順式维甲酸(13-cis retinoicacid，13-CRA)、阿维A酯、9-順式维甲酸(9-cis-retinoic acid，9-CRA)、UAB7、UAB8、异维甲酸(Isotretinoin)、维胺酯(Fenretinide)、依曲替酸(Acitretin)、依曲替酯(Etretinate)、他扎罗汀(Tazarotene)、阿达帕林(Adapalene)、TTNPB、3-甲基-TTN PB、AM80、AM580、CD437、Targretin、LGD1069及其他具相同功能的维甲酸类化合物。其中RA或ATRA、TTNPB，AM80和AM580是RAR的特异性激动剂；LGD1069和SR 11237是RXR的特异性激动剂；9-CRA和3-甲基-TTNPB则可激动这两类受体蛋白，属于泛激动剂。
作为本发明的优选方式，所述的维甲酸(Retinoic acid，RA)，别名：全反式维甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)、维A酸、维生素A酸、维生素甲酸、视黄酸、全反式维A酸、维A甲酸，其分子结构式如以下式(IV)所示：
Figure BDA0003167311820000161
如本发明所用，所述的“BMP抑制剂”是指能够抑制细胞中BMP信号通路的抑制剂的总称，包括但不限于：LDN-193189、LDN193189HCl、K02288、DMH1及其他具相同功能的同一类BMP信号通路抑制剂：
LDN-193189，是一种选择性的BMP信号通路抑制剂，抑制BMP I型受体ALK2和ALK3的转录活性，在C2C12细胞中IC50分别为5nM和30nM，作用于BMP比作用于TGF-β选择性高200倍。Cas：1062368-24-4；
LDN193189HCl，是LDN193189的盐酸盐，是一种选择性BMP信号抑制剂，它能抑制BMP type I receptors ALK2和ALK3的转录活性，在C2C12细胞中IC50分别为5nM和30nM，并且对于BMP的选择性是对TGF-β选择性的200倍。
K02288，是一种高度选择性I型BMP受体抑制剂，针对ALK2，ALK1和ALK6的IC50分别为1.1，1.8，6.4nm，显示对其他ALKS(3，4，5)和ActRIIa有轻微抑制作用。
DMH1，是选择性BMP receptor抑制剂，抑制ALK2，IC50为107.9nM,对AMPK，ALK5，KDR(VEGFR-2)和PDGFR没有抑制效果。
作为本发明的优选方式，所述的BMP抑制剂是LDN-193189(或称为LD-N193189)；其分子结构式如以下式(Ⅴ)所示：
Figure BDA0003167311820000162
如本发明所用，所述的BrdU，中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，别名：5-溴-2’-脱氧尿苷；5-溴-2-脱氧脲苷；5-溴-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖)尿嘧啶；5-溴脱氧尿苷；溴化去氧尿苷；英文名称：5-Bromo-2"-Deoxyuridine；简称：BrdU或5-BrdU。别名：5-Bromo-2-deoxyUridine；Br-dU；BUdR；5-Bromodeoxyuridine；Brdu；为胸腺嘧啶的衍生物，也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)，活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。通常用作为细胞标记物，而最新研究表明其有新的功能。
作为本发明的优选方式，BrdU的分子结构式如以下式(VI)所示：
Figure BDA0003167311820000171
如本发明所用，所述的EdU，中文名称：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；别名：5-乙炔基-2-脱氧尿苷；5-乙炔基-2’-去氧尿苷；乙炔基-脱氧尿苷；英语名称：5-Ethynyl-2’-deoxyuridine，简称为EdU；别名：EYdU；Uridine；5-Ethynyl-durd；5-Ethynyl-2'-dU；2'deoxyuridine；5-ethynyl；2’-deoxy-5-ethynyluridine；2’-deoxy-5-ethynyl-uridin；EdU是一种新型胸苷类似物，可掺入分裂中的细胞。较高剂量时会有细胞毒性。EdU可被一种荧光叠氮化物检出，后者通过点击化学与前者形成共价键。不像常用的溴脱氧尿苷，EdU无需热或酸处理即可被检出。通常用作为细胞标记物，而最新研究表明其有新的功能。
作为本发明的优选方式，EdU的分子结构式如以下式(Ⅶ)所示：
Figure BDA0003167311820000172
本发明还包括与上述化合物Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ或Ⅶ等效的化合物、药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体；也包括其自然生成和人工合成化合物。
所述化合物的类似物包括但不限于：所述化合物的异构体、外消旋体。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
所述的“盐”包括但不限于：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸等。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐等。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法施用或处理后，该化合物的前体在培养基中可转变成上述任一化合物的一种化合物，或上述任一化合物的一种化合物所组成的盐或溶液。
本发明组合物中，GSK3β抑制剂(或GSK3β抑制剂CHIR99021)、TGFβ抑制剂(或TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)存在。
该小分子组合物用于化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡；但该组合物偏重于诱导肿瘤细胞凋亡，转化肿瘤细胞功能偏弱；
作为本发明的优选方式，所述组合物还包括：维甲酸类化合物：0.03-6.0重量份；较佳地为：0.15-3.0重量份；或溶液状态下摩尔终浓度为：0.1-20uM；较佳地为0.5-10uM；添加上述成分，可促进和增强了肿瘤细胞的转化或凋亡，并扩大了适用肿瘤类型或范围。
所添加上述成分后的组合物中，GSK3β抑制剂(或GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(或TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，和维甲酸类化合物(或维甲酸)以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)：(0.1-20)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)存在。
在本发明所述的组合物中，还可添加包括选自下组的一种或两种成分：BMP抑制剂LDN-193189：0.02-4.65重量份；较佳地为：0.203-2.03重量份。或溶液状态下：终浓度为：0.05-10uM；较佳地为0.5-5uM；或/和BrdU，或/和EdU：0.15-30重量份(BrdU)，0.125-25重量份(EdU)；较佳地为：1.5-15重量份(BrdU)，1.25-12.5(EdU)；或溶液状态下：终浓度为：0.5-100uM(BrdU或EdU)；较佳地为5-50uM(BrdU或EdU)；添加上述成分，可进一步促进或增强诱导某些极度恶性肿瘤细胞的转化或凋亡。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(如GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(如TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，维甲酸类化合物(如维甲酸)，BMP抑制剂(如BMP抑制剂LDN-193189)和BrdU以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)﹕(0.02-4.65)﹕0.15-30；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)﹕(0.203-2.03)﹕(1.5-15)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)﹕(0.1-20)﹕(0.05-10)﹕(0.5-100)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)﹕(0.5-5)﹕(5-50)存在。
在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(如GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(如TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，维甲酸类化合物(如维甲酸)，BMP抑制剂(如BMP抑制剂LDN-193189)和EdU以重量份比：(0.046-4.65)﹕(0.038-7.68)﹕(0.03-6.0)﹕(0.02-4.65)﹕(0.125-25)；较佳地，(0.232-2.325)﹕(0.192-3.84)﹕(0.15-3)﹕(0.203-2.03)﹕(1.25-12.5)存在；或溶液状态下以摩尔比：(0.1-10)﹕(0.1-20)﹕(0.1-20)﹕(0.05-10)﹕(0.5-100)；较佳地，(0.5-5)﹕(0.5-10)﹕(0.5-10)﹕(0.5-5)﹕(5-50)存在。
对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；可制备的剂型包括：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂及其它固体剂型；注射剂、输液剂、混悬剂及其它液体剂型；以及气体剂型、半固体剂型等其它剂型。优选的，所述的剂型可以是但不限于：粉末剂、颗粒剂、胶囊、缓释剂、片剂等固体剂型或注射剂、输液剂、溶液剂、混悬液等液体剂型。
本发明的组合物的制备方法根据所需制备的剂型以及给药途径来决定，本领域技术人员在参考了本发明所提供的组合以及配比后，采用常规的药物组合物的制备方法即可制备出本发明的组合物。
应理解，尽管在具体实施方式中，本发明人列举了几种组合物形式，但本领域人员也可由此推导：本发明的其它任何一种组合形式也是同样具有突出效果的。
本发明人首次证实了本发明的小分子组合物可用于开发制备预防、改善或治疗肿瘤的药物或药物配方。当用于预防、改善或治疗肿瘤时，所用的组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗肿瘤类型以及疾病的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这在熟练医师或药剂师可以判断的范围内。
本发明中，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括但不限于：肝癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、食管癌、宫颈癌、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤或神经系统肿瘤，以及其它血液系统肿瘤和实质性肿瘤或其细胞。较佳地为肝癌或肝癌细胞。
培养基和试剂
本发明还提供了用于小分子组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的培养基(以下简称：肿瘤细胞转化或凋亡培养基)。
按本发明所提供的组合物终浓度配方，选择具体终浓度的小分子组合物进行配制。作为本发明的优选方式，将该具体小分子组合物中的不同成分，分别根据其溶质的不同性质和不同溶解度将其溶解于DMSO(二甲基亚砜)或其它有机溶剂或水性溶剂中配成浓缩液试剂(从1：50-1：10，000范围)；然后按该具体小分子组合物终浓度要求，将各小分子有机溶液浓缩液试剂稀释添加入含10％小牛血清、1％青链霉素混合液(100x)的基础细胞培养基(或含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基)中，即可获得所述的肿瘤细胞转化或凋亡培养基。其中，该培养基各组分的百分含量还可上下浮动50％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％，5％；(百分数均以v/v计)。
作为本发明的优选方式，所述的基础细胞培养基包括但不限于：DMEM/F12、MEM、DMEM、F12、IMDM、RPMI1640、Neuronal basal或Fischers等，均为市场上可购得的商品。
作为本发明的优选方式，所述的“无血清培养基”指：不含血清而含有支持细胞增殖和生物反应的多种营养成分(如生长因子、组织提取物等)的细胞培养基。即将除血清以外的各种细胞因子或生长因子等添加剂，添加到基础细胞培养基中组成的细胞培养基。
作为本发明的优选方式，所述的含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基包括但不限于：ITS、N2、B27等，均为可自行配制或商购产品。
应理解，本领域技术人员熟悉所述的基础细胞培养基或无血清培养基的配制或购买途径，因此，基础细胞培养基或无血清培养基并不限于本发明中所举例的这些。
作为本发明的优选方式，所述的“肿瘤细胞转化或凋亡培养基”具体配制如下实施：
(1)将①GSK3β抑制剂(或GSK3β抑制剂CHIR-99021)：0.046-4.65重量份；较佳地为：0.232-2.325重量份；或溶液状态下终浓度为0.1-10uM；优选量为：0.5-5uM；和②TGFβ抑制剂(或TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)：0.038-7.68重量份；较佳地为：0.192-3.84重量份；或溶液状态下终浓度为0.1-20uM；优选量为：0.5-10uM混合，获得本发明用于化学诱导直接重编程人肿瘤细胞转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的小分子组合物。
(2)在(1)的组合物的基础上，还可添加包括：维甲酸类化合物(或维甲酸)：0.03-6.0重量份；较佳地为：0.15-3重量份；或溶液状态下终浓度为：0.1-20uM；较佳地为0.5-10uM；添加上述成分，可促进和增强了肿瘤细胞的转化或凋亡，并扩大了适用肿瘤类型或范围。
(3)在(2)的组合物基础上，还可添加包括选自下组的一种或两种成分：BMP抑制剂LDN-193189：0.02-4.65重量份；较佳地为：0.203-2.03重量份。或溶液状态下：终浓度为：0.05-10uM；较佳地为0.5-5uM；或/和BrdU，或/和EdU：0.15-30重量份(BrdU)，0.125-25(EdU)；较佳地为：1.5-15重量份(BrdU)，1.25-12.5(EdU)；或溶液状态下(BrdU或/和EdU)：终浓度为：0.5-100uM；较佳地为5-50uM。添加上述成分，可进一步促进或增强某些肿瘤细胞的转化或凋亡。
(4)将上述小分子组合物混合，可配制获得“肿瘤细胞转化或凋亡培养基”。
本发明还提供了用于化学诱导直接重编程人肿瘤细胞转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的实验动物注射用试剂。
作为本发明的优选方式，将前述任一组合物中的各小分子组合物配制成浓缩液试剂；之后，按公斤体重计算出相应的用药量，取该组合物中不同组份的相应量的浓缩试剂，将其添加入注射用生理盐水或磷酸盐溶液(含有或不含5％FBS)中获得实验动物注射用试剂。较佳地，添加入含有5％FBS的注射用生理盐水中，即可获得实验动物注射用试剂。
培养方法
本发明还公开了一种小分子组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的方法，所述方法步骤包括：
(1)浓缩液试剂配制：根据权利要求1-6任一所述的组合物，将各成分溶解于有机溶剂或水性溶剂中配制成浓缩液试剂；较佳地，所述的有机溶剂包括二甲基亚砜；较佳地，所述的水性溶剂包括：水，生理盐水，磷酸盐缓冲液；
(2)培养基获得：将步骤(1)中的浓缩液试剂分别稀释入含5-20％小牛血清、1％青链霉素混合液(100x)的基础细胞培养基或含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基中(使得各组分的浓度符合权利要求1-6任一所述的组合物中所限定的浓度)，获得诱导肿瘤细胞转化或凋亡的培养基；
其中，该培养基各组分的百分含量还可上下浮动50％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％，5％。
(3)诱导肿瘤细胞转化或凋亡：将肿瘤细胞在上述步骤(2)配制的“诱导肿瘤细胞转化或凋亡培养基”中混悬，铺板作为处理组；
将与处理组培养基溶解小分子组合物的溶剂(如DMSO或其它溶剂)等量地添加入同处理组所用含10％小牛血清、1％青链霉素混合液(100x)的基础细胞培养基(或含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基)中，获得“对照培养基”(百分数均以v/v计)；然后将与处理组等数量的肿瘤细胞加入“对照培养基”中混悬，铺板，作为对照组；
37℃培养，每2－4天换液一次；3-7天传代一次。
(4)诱导肿瘤细胞转化或凋亡的传代培养：弃原培养液，PBS洗涤一次，加入细胞消化液消化细胞，37℃，1－5分钟，终止细胞消化，离心，弃上清，将细胞沉淀重悬，按1:1－1:3传代铺板。按实验步骤第1和2项方法培养，每2－4天换液一次。所用消化液包括胰酶，EDTA,Acutase,TrypleE等。3-7天传代一次。
(5)诱导肿瘤细胞转化或凋亡获得正常或非致瘤性细胞：经上述实验步骤(3)、(4)转化或凋亡培养和传代培养肿瘤细胞1－3周，PBS洗涤去除凋亡细胞，即可获得正常或非致瘤性细胞。可用该细胞进行其他科研实验；细胞凋亡的检测：肿瘤细胞的转化或凋亡培养如上述培养方法实验步骤。培养不同时间的肿瘤细胞用Annexin V-FITC detection kit(Biovision)染色后进行流式细胞检测，具体步骤见试剂盒说明书。
转化获得的非致瘤性细胞的功能检测：肿瘤细胞的转化或凋亡培养如上述，用培养不同时间获得的非致瘤性细胞检测其相关功能。
本发明的化学诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的小分子组合物及其制备的培养基和试剂以及其实验方法，可广泛用于防治肿瘤方法及机理研究、临床前期研究、药理及毒理安全性检测；所获得的非致瘤性细胞可继续进行功能检测、致瘤性体内外实验、临床前期研究等。该方法为防治肿瘤研究开辟了一个崭新领域，具有广泛的应用前景，具有重大的科学意义和极大的应用价值。
本发明的有益效果在于：
1.率先使用小分子组合诱导人异常分化细胞(肿瘤细胞)直接重编程为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡；并首先实施应用于肝癌细胞，将病因和发病机理复杂，异质性强，并且处于不同分化状态的人肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性肝细胞样细胞，并伴随不同程度的肝癌细胞凋亡；转化的肝细胞样细胞具有正常人肝细胞功能，且体内外均不再具致瘤性；
2.本发明的小分子组合物，经病人肝癌组织PDX动物模型实验，证明对病人的肝癌治疗有效；
3.本发明中，应用的小分子性质稳定，作用的时间、剂量及组合方式易于控制，作用效果稳定可靠；
4.本发明无外源基因导入，不改变细胞的基因结构，避免外源基因导入引起新的致癌风险，因此安全可靠；
5.本发明不需杀细胞制剂辅助，可避免对正常组织细胞的无区别杀伤副作用；
6.目前测试结果显示本发明的小分子组合物对正常细胞无损伤(如正常人成纤维细胞和肝细胞)。
7.本发明的小分子组合物不仅对诱导肝癌细胞转化或凋亡有效，进一步的研究结果显示，对诱导鼻咽癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病及其他血液系统肿瘤和实质性肿瘤细胞的转化并伴随凋亡均有相同或相似效果；
8.本发明的小分子组合物有潜力开发成控制或治疗肝癌以及其他恶性肿瘤的新方法、新手段、新药物；或制备成化学诱导肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞的科研用培养基和试剂；
9.本发明小分子组合物及其方法开辟了肿瘤防治研究的新领域；创新了化学诱导异常分化细胞(肿瘤细胞)直接重编程为非致瘤性分化细胞，并伴随肿瘤细胞凋亡的新方法；拓展和丰富了细胞重编程理论；
10.本发明小分子组合物及其诱导肿瘤细胞转化或凋亡方法操作简单，成本低廉，易于生产应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、小分子诱导人肝癌细胞直接重编程为非致瘤性细胞并伴随肝癌细胞凋亡的小分子组合物，及其培养基和试剂的配制
如下配制组合物或培养基，可按重量浓度或摩尔浓度进行配制：
1、肿瘤细胞转化或凋亡小分子组合物的配方设计
设计如下配方的组合物：
(1)肿瘤细胞转化或凋亡组合物1
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度0.93mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度1.92mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)。
(2)肿瘤细胞转化或凋亡组合物2
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度0.46mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度0.77mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)。
(3)肿瘤细胞转化或凋亡组合物3
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度2.33mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)；
TGFβ抑制剂A83-01：终浓度0.84mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)。
(4)肿瘤细胞转化或凋亡组合物4
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度0.93mg/L(以摩尔浓度表示为4uM)；
TGFβ抑制剂A83-01终浓度1.26mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
维甲酸(RA)：终浓度0.15mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)。
(5)肿瘤细胞转化或凋亡组合物5
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度1.40mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度1.92mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)；
维甲酸(RA)：终浓度0.9mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)。
(6)肿瘤细胞转化或凋亡组合物6
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度0.93mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度0.77mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)；
维甲酸(RA)：终浓度1.5mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)。
(7)肿瘤细胞转化或凋亡组合物7
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度1.40mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度0.38mg/L(以摩尔浓度表示为1uM)；
维甲酸(RA)：终浓度0.15mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)；
BMP抑制剂LDN-193189：终浓度0.2mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)。
(8)肿瘤细胞转化或凋亡组合物8
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度1.40mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度1.92mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)；
维甲酸(RA)：终浓度0.9mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
BMP抑制剂LDN-193189：终浓度0.2mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)。
(9)肿瘤细胞转化或凋亡组合物9
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度1.40mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度0.77mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)；
维甲酸(RA)：终浓度3mg/L(以摩尔浓度表示为10uM)；
BMP抑制剂LDN-193189：终浓度0.2mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)。
(10)肿瘤细胞转化或凋亡组合物10
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度1.40mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度1.92mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)；
BMP抑制剂LDN-193189：终浓度0.81mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)。
(11)肿瘤细胞转化或凋亡组合物11
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度1.40mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度2.88mg/L(以摩尔浓度表示为7.5uM)；
BMP抑制剂LDN-193189：终浓度0.20mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)。
(12)肿瘤细胞转化或凋亡组合物12
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度2.327mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度0.77mg/L(以摩尔浓度表示为2uM)；
维甲酸(RA)：终浓度1.5mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)。
(13)肿瘤细胞转化或凋亡组合物13
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度0.93mg/L(以摩尔浓度表示为4uM)；
TGFβ抑制剂A83-01终浓度1.26mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
维甲酸(RA)：终浓度0.15mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)；
BrdU：终浓度4.5mg/L(以摩尔浓度表示为15uM)。
(14)肿瘤细胞转化或凋亡组合物14
GSK3β抑制剂CHIR-99021：终浓度1.40mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
TGFβ抑制剂SB431542：终浓度1.92mg/L(以摩尔浓度表示为5uM)；
维甲酸(RA)：终浓度0.9mg/L(以摩尔浓度表示为3uM)；
BMP抑制剂LDN-193189：终浓度0.2mg/L(以摩尔浓度表示为0.5uM)；
EdU：终浓度7.5mg/L(以摩尔浓度表示为30uM)。
各具体小分子组合物按前述“培养方法”步骤(1)先溶解于DMSO中制成浓缩液试剂。
2、肿瘤细胞转化或凋亡培养基配制
将上述实验步骤1配制的肿瘤细胞转化或凋亡组合物1～14各成分DMSO浓缩液试剂按前述培养方法步骤(2)配制(选用的基础培养基是DMEM/F12)，获得肿瘤细胞转化或凋亡培养基1～14(即培养基1与组合物1的化合物终浓度相同，培养基2与组合物2的化合物终浓度相同，…，培养基14与组合物14的化合物终浓度相同)。
3、肿瘤细胞转化或凋亡注射用试剂配制
将上述实验步骤1配制的“肿瘤细胞转化或凋亡组合物8”的各成分配制成的DMSO浓缩液试剂，然后将该各成分浓缩液试剂按照组合物8的终浓度要求稀释添加入注射用生理盐水中，配制成肿瘤细胞转化或凋亡实验动物“注射用试剂8”；同时配制与实验动物注射用试剂8相比，只缺少小分子组合物8的DMSO生理盐水注射液作对照。
实施例2、肝癌细胞SMMC-7721被肿瘤细胞转化或凋亡培养基6转化或凋亡
1、肿瘤细胞转化或凋亡培养
将肝癌细胞SMMC-7721在上述已经配制的肿瘤细胞转化或凋亡培养基6中混悬，铺板作为处理组。
将与处理组等量的DMSO(二甲基亚砜)添加入含10％小牛血清、1％青链霉素混合液(100x)的基础细胞培养基DMEM/F12中，获得DMSO“对照培养基”(百分数均以v/v计)；然后将与处理组等数量的肝癌细胞SMMC-7721加入DMSO“对照培养基”中混悬，铺板，作为对照组；
37℃培养，每2-4天换液一次；3-7天传代一次。
2、转化或凋亡培养的肝癌细胞的传代培养
传代培养步骤：弃原培养液，PBS洗涤一次，加入细胞消化液消化细胞，37℃，1-5分钟，终止细胞消化，离心，弃上清，将细胞沉淀重悬，按1:1-1:3传代铺板。按实验步骤第1和2项方法培养，每2-4天换液一次。所用消化液是胰酶(也可用EDTA，Acutase，TrypleE)等。3-7天传一次代。
3、转化或凋亡培养获得肝细胞样细胞
经实验步骤1、2的转化或凋亡培养以及传代培养肝癌细胞1-3周，离心去除凋亡细胞后，未凋亡的肝癌细胞被转化为非致瘤性肝细胞样细胞；获得的非致瘤性肝细胞样细胞，可进行其他科研实验。
实验结果见图1，由图可见，处理组(Treat)中，肝癌细胞株SMMC-7721被“肿瘤细胞转化或凋亡培养基6”诱导转化或凋亡；而对照组(Control)则正常生长，未发生转化，有部分晚期自然凋亡。
图1A图、肝癌细胞SMMC-7721被“肿瘤细胞转化或凋亡培养基6”诱导转化为肝细胞样细胞(转化或凋亡培养10天)；除早、晚期被诱导凋亡的肝癌细胞以外，剩下的肝癌细胞全部转化为非致瘤性肝细胞样细胞。
图1B图、肝癌细胞SMMC-7721被“肿瘤细胞转化或凋亡培养基6”诱导凋亡。图中蓝色柱代表早期凋亡(Early)，红色柱代表晚期凋亡(Late)；T1W、T2W、T3W分别代表处理1、2、3周的凋亡统计；对照组几乎无早期凋亡，有部分晚期自然凋亡。
实施例3、利用肿瘤细胞转化或凋亡培养基4、1诱导肝癌细胞HepG2转化或凋亡
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于以肿瘤细胞转化或凋亡培养基4或肿瘤细胞转化或凋亡培养基1取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理1-3周的实验结果见图2，由图可见，处理组(Treat)中，肝癌细胞株HepG2被肿瘤细胞转化或凋亡培养基4或肿瘤细胞转化或凋亡培养基1转化或凋亡；对照组(Control)则正常生长，未发生转化或凋亡。
图2A图、肝癌细胞HepG2被肿瘤细胞转化或凋亡培养基4诱导转化为肝细胞样细胞(转化或凋亡培养2周)；除早、晚期被诱导凋亡的肝癌细胞以外，剩下的肝癌细胞全部转化为正常(或非致瘤性)肝细胞样细胞。
图2B图、肝癌细胞HepG2被肿瘤细胞转化或凋亡培养基1诱导凋亡；图中蓝色柱代表早期凋亡，红色柱代表晚期凋亡；T1W、T2W、T3W分别代表处理1、2、3周的凋亡统计；对照组几乎无早期凋亡，有一定的晚期自然凋亡。
实施例4、耐5-Fu肝癌细胞7402/5-Fu被肿瘤细胞转化或凋亡培养基5、2诱导转化并伴随凋亡
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于以肿瘤细胞转化或凋亡培养基5或肿瘤细胞转化或凋亡培养基2取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理1-4周的实验结果见图3，由图可见，处理组(Treat)中，肝癌细胞株7402/5-Fu被瘤细胞转化或凋亡培养基5或肿瘤细胞转化或凋亡培养基2诱导转化并伴随凋亡；而对照组(Control)则正常生长，未发生转化或凋亡。
图3A、肝癌细胞7402/5-Fu被肿瘤细胞转化或凋亡培养基5诱导转化为肝细胞样细胞；
图3B、肝癌细胞7402/5-Fu被肿瘤细胞转化或凋亡培养基2诱导凋亡。图B中蓝色柱代表早期凋亡，红色柱代表晚期凋亡；T2W、T3W、T4W分别代表处理2、3、4周的凋亡统计；对照组无早期凋亡，有极少晚期自然凋亡。
实施例5、肝癌细胞SMMC-7721，HepG2，7402/5-Fu分别被肿瘤细胞转化或凋亡培养基7、8、9诱导转化为具有正常肝细胞功能的肝细胞样细胞
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基7或8或9分别取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理2周的处理组离心去除凋亡细胞后，未凋亡的肝癌细胞被转化为肝细胞样细胞。对照组培养同样时间收取细胞。
(1)肝糖原染色
用Schiff方法。具体实验步骤为：①弃细胞培养液，PBS漂洗1次，②4％多聚甲醛固定10分钟后，PBS漂洗5分钟×3次，③加入PAS-I液10min，流水冲洗，④加入PAS-II液1-2min，流水冲洗，⑤显微镜观察并拍照。
(2)油红染色(Oil-red)
用试剂盒检测。具体实验步骤见试剂盒说明书。试剂盒购自南京建成科技有限公司，货号：D027。
结果如图4所示，肝癌细胞被肿瘤细胞转化或凋亡培养基7或8或9诱导转化为肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能。PAS：糖原染色，Oil-red：油红染色，反映脂肪摄取功能。SMMC-7721(以培养基7培养)，HepG2(以培养基8培养)，7402/5-Fu(以培养基9培养)为不同的肝癌细胞株。
因此，如上培养获得的肝细胞样细胞具有正常人肝细胞相关功能。
实施例6、肝癌细胞SMMC-7721、HepG2、7402/5-Fu分别被肿瘤细胞转化或凋亡培养基10、11、12诱导转化为肝细胞样细胞
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基10或11或12分别取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理2周的处理组离心去除凋亡细胞后，未凋亡的肝癌细胞被转化为肝细胞样细胞。对照组培养同样时间收取细胞。
(1)白蛋白分泌(ALB)，尿素生成(Urea)测试
用ELISA方法，用试剂盒分别检测处理组和对照组培养的细胞的白蛋白分泌和尿素生成功能。具体实验步骤见试剂盒说明书。白蛋白检测试剂盒(美国Bioassay System公司/DIAG-250，BCG Albumin assay kit)，尿素检测试剂盒(美国Bioassay System公司/DIUR-500，Urea assay kit)。
(2)P450酶(CYP3A4和CYP1A2)活性诱导测试
用利福平(诱导CYP3A4)和奥美拉措(诱导CYP1A2)分别诱导不同的P450酶活性。不同浓度的利福平(1uM、10uM、25uM)或奥美拉措(1uM、10uM、25uM)分别加入处理组和对照组的细胞培养液中培养48小时，然后收取细胞RNA，用qRT-PCR定量检测不同处理条件的细胞的CYP3A4和CYP1A2基因表达量。
实验结果如图5所示。
图5A、肝癌细胞SMMC-7721被肿瘤细胞转化或凋亡培养基10诱导转化获得的肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能；
图5B、肝癌细胞HepG2被肿瘤细胞转化或凋亡培养基11诱导转化获得的肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能；
图5C、耐5-Fu肝癌细胞7402/5-Fu被肿瘤细胞转化或凋亡培养基12诱导转化获得的肝细胞样细胞具有正常肝细胞功能；
图中蓝色柱代表早期凋亡，红色柱代表晚期凋亡；T1W、T2W、T3W分别代表处理1、2、3周；Rif：利福平；Ome：奥美拉措。
因此，获得的肝细胞样细胞具有正常人肝细胞相关功能，被转化的肝癌细胞获得正常肝细胞白蛋白分泌(ALB)，尿素生成(Urea)，CYP1A2诱导和CYP3A4诱导功能。
实施例7、肝癌细胞SMMC-7721，HepG2和7402/5-Fu分别被肿瘤细胞转化或凋亡培养基6、7、8诱导转化获得的肝细胞样细胞体内体外均不再具致瘤性。
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基6，以及肿瘤细胞转化或凋亡培养基7或8分别培养。
培养处理2周的处理组离心去除凋亡细胞后，未凋亡的肝癌细胞被转化为肝细胞样细胞；获得的肝细胞样细胞体内体外无致瘤性。
1、转化获得的肝细胞样细胞体外致瘤性实验
方法步骤：分别将处理组和对照组1×103个细胞，种于6孔板，培养方式同实施例2，培养2周；结晶紫染色，然后拍照片，观察并计数细胞生长形成克隆。
结果如图6A所示，可见肝癌细胞SMMC-7721(以培养基6培养)，HepG2(以培养基7培养)和7402/5-Fu(以培养基8培养)被肿瘤细胞转化或凋亡培养基6、7或8诱导转化获得的肝细胞样细胞体外生长不形成克隆，体外无致瘤性。
2、转化获得的肝细胞样细胞体内皮下荷瘤实验
取处理20天肝癌细胞转化获得的肝细胞样细胞，用消化液消化为单个细胞，离心，PBS漂洗，细胞计数，取1×106的细胞，注射到5周龄大小的裸鼠皮下(右侧)，用DMSO“对照培养基”处理相同时间的癌细胞作为对照注射到同一只裸鼠的皮下(左侧)，4-8周终止实验，分离瘤体并拍照。
实验结果如图6所示，肝癌细胞SMMC-7721(以培养基6培养)，HepG2(以培养基7培养)和7402/5-Fu(以培养基8培养)被肿瘤细胞转化或凋亡培养基6、7、8分别诱导转化获得的肝细胞样细胞体内均不再具致瘤性。
图6A、肝癌细胞SMMC-7721，HepG2和7402/5-Fu被肿瘤细胞转化或凋亡培养基6、7、8诱导转化获得的肝细胞样细胞体外生长不形成克隆；
图6B、肝癌细胞SMMC-7721被肿瘤细胞转化或凋亡培养基6诱导转化获得的肝细胞样细胞体内不生成肿瘤。
图6C、7402/5-Fu被肿瘤细胞转化或凋亡培养基8诱导转化获得的肝细胞样细胞体内不生成肿瘤；C图上图裸鼠右侧处理组不形成肿瘤；左侧对照组形成肿瘤；C图下图为对照组形成的肿瘤解剖形状外观。
实施例8、病人肝癌组织PDX动物模型试验(肿瘤细胞转化或凋亡小分子组合物8)
取肝癌病人手术切除的瘤组织植入5周龄大小的裸鼠皮下成瘤(PDX模型)。分离裸鼠皮下成瘤的瘤体，再次植入5周龄大小的裸鼠皮下成瘤。待肿瘤生长到5-10mm大小时进行药物处理。将实施例1配制的肿瘤细胞转化或凋亡实验动物注射用试剂8进行瘤体注射，3次/周，用DMSO生理盐水注射液瘤体注射为对照。4-6周后终止实验。分离瘤体，拍照，固定瘤组织，HE染色。
实验结果见图7，PDX动物模型试验结果显示，处理组瘤体组织坏死，细胞全部凋亡；对照组瘤体组织、细胞结构无变化。
实施例9、正常人成纤维细胞和肝细胞分别被肿瘤细胞转化或凋亡培养基5、6处理培养的情况
处理组和对照组设置及实验培养方法同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基5或6分别培养正常人成纤维细胞和肝细胞。
结果见图8，正常人成纤维细胞(以培养基5培养)和肝细胞被肿瘤细胞(以培养基6培养)转化或凋亡培养基5、6诱导转化并伴随凋亡处理培养3周后，形态无改变。
实施例10、鼻咽癌细胞HNE和肺癌细胞H460被肿瘤细胞转化或凋亡培养基9、3诱导转化并伴随凋亡
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基9或3分别取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理2周的实验结果见图9，鼻咽癌细胞HNE(以培养基9培养)处理组癌细胞形态发生明显转化；处理组肺癌细胞H460(以培养基3培养)被全部诱导凋亡(图中绿色柱代表早期凋亡，红色柱代表晚期凋亡；T10D、T20D分别代表处理10天、处理20天)；而对照组肺癌细胞H460几乎无凋亡。
实施例11、胃癌细胞MKN28和SGC-7901被肿瘤细胞转化或凋亡培养基10、11诱导转化并伴随凋亡
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基10或11分别取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理2周的实验结果见图10，胃癌细胞MKN28(以培养基10培养)和SGC-7901(以培养基11培养)处理组的癌细胞形态发生明显转化。
实施例12、胰腺癌细胞SW1990被肿瘤细胞转化或凋亡培养基12诱导转化并伴随凋亡
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于以肿瘤细胞转化或凋亡培养基12取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理2周的实验结果见图11，胰腺癌细胞SW1990处理组的癌细胞形态发生明显转化。
实施例13、乳腺癌细胞SKBr3被肿瘤细胞转化或凋亡培养基10诱导转化并伴随凋亡
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于以肿瘤细胞转化或凋亡培养基10取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理2周的实验结果见图12，乳腺癌细胞SKBr3处理组的癌细胞形态发生明显转化。
实施例14、白血病细胞U937、B细胞淋巴瘤SUDHL-4被肿瘤细胞转化或凋亡培养基6、8诱导转化并伴随凋亡
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基6或8分别培养。
培养处理2周的实验结果见图13，白血病细胞U937(以培养基6培养)、B细胞淋巴瘤SUDHL-4(以培养基8培养)处理组的癌细胞形态发生明显凋亡。
实施例15、乳腺癌细胞SKBr3和胃癌细胞MKN28被肿瘤细胞转化或凋亡培养基13、14诱导转化
处理组和对照组设置以及培养实验步骤同实施例2，不同点在于依次以肿瘤细胞转化或凋亡培养基13或14分别取代肿瘤细胞转化或凋亡培养基6。
培养处理2周的实验结果见图14，乳腺癌细胞SKBr3(以培养基13培养)和胃癌细胞MKN28(以培养基14培养)被肿瘤细胞转化或凋亡培养基13、14诱导转化，处理组(T)的癌细胞形态发生明显转化。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种小分子组合物，其是用于化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞不同程度凋亡的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：基础细胞培养基，以及小分子组合物：GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂；或所述的培养基由基础细胞培养基和小分子GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂组成。
2.一种小分子组合物，其是用于化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞不同程度凋亡的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：药学上可接受的载体或赋形剂，以及小分子组合物：GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂；或所述的小分子组合物由GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂组成。
3.如权利要求1或2所述的小分子组合物，其特征在于，所述的小分子组合物包括：
GSK3β抑制剂：0.046-4.65重量份；或溶液状态下终浓度为：0.1-10uM；和
TGFβ抑制剂：0.038-7.68重量份；或溶液状态下终浓度为：0.1-20uM。
4.如权利要求1或2所述的小分子组合物，其特征在于，所述小分子组合物还可添加：
维甲酸类化合物：0.03-6.0重量份；较佳地为0.15-3重量份；或溶液状态下终浓度为：0.1-20uM；较佳地为0.5-10uM；和
BMP抑制剂：0.02-4.65重量份；较佳地为：0.203-2.03重量份；或溶液状态下终浓度为：0.05-10uM；较佳地为0.5-5uM。
5.如权利要求1-4任一所述的小分子组合物，其特征在于，所述的GSK3β抑制剂包括：CHIR-99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR-98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080以及其他具相同功能的同一类GSK3β信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为GSK3β抑制剂CHIR-99021；
所述的TGFβ抑制剂包括：SB431542、A83-01、SB525334、LY2109761，RepSox、SD-208、GW788388、SB505124、EW-7197以及其他具相同功能的同一类TGFβ信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01；
所述的维甲酸类化合物是天然或人工合成的，包括：维甲酸、13-顺式维甲酸、9-順式维甲酸、UAB7、UAB8、异维甲酸、维胺酯、依曲替酸、依曲替酯、他扎罗汀、阿达帕林、TTNPB、3-甲基-TTN PB、AM80、AM580、CD437、Targretin、LGD1069及其他具相同功能的同一类维甲酸类诱导分化剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为维甲酸；
所述的BMP抑制剂包括：LDN-193189、K02288、DMH1以及其他具相同功能的同一类BMP信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为BMP抑制剂LDN-193189。
6.如权利要求2-4任一所述的小分子组合物，其特征在于，所述的组合物是药物组合物，还包含药学上可接受的载体或赋形剂，其载体或赋形剂包括：
水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；
DMSO、甘油和乙醇或其它有机溶剂；
微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；
胶体型载药系统或高分子载药系统；或
防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、pH缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂。
7.如权利要求2-4任一所述的小分子组合物，其特征在于，所述的组合物能制备的药物剂型包括：
固体剂型，包括粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂，或其他固体剂型；
液体剂型，包括注射剂、输液剂、混悬剂，或它液体剂型；
以及气体剂型；或
半固体剂型。
8.权利要求1-7任一所述的小分子组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物；或用于制备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的培养基或试剂。
9.一种诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括：应用权利要求1-7任一所述的小分子组合物处理人肿瘤细胞。
10.一种用于诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞并伴随肿瘤细胞凋亡的药盒/试剂盒，其特征在于，所述的药盒/试剂盒中包括：权利要求1-7任一所述的小分子组合物；或基于该小分子组合物开发制备的治疗肿瘤的药物或药物配方；或基于该小分子组合物制备的试剂或培养基。
11.如权利要求1-7任一所述的小分子组合物、权利要求8所述的用途、权利要求9所述的方法、权利要求10所述的药盒或试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括但不限于：肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤或神经系统肿瘤及其它血液系统肿瘤和实质性肿瘤或其细胞；较佳地为肝癌或肝癌细胞。
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