WO2021162478A1 - 게니핀 및 엘레스클로몰을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

게니핀 및 엘레스클로몰을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2021162478A1
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cancer
elesclomol
genipin
cells
genipine
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PCT/KR2021/001832
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조영석
이진희
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising genipin and elesclomol, and more particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising genipin and elesclomol, It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • malignant neoplasm or malignant tumor refers to a disease in which cells ignore the death cycle and proliferate abnormally to disrupt the function of the human body. Because it is caused by the uncontrolled growth and division of abnormal cells (cancer cells), it can develop in any living tissue that regenerates. can Cancer cells can move to other organs in the body through blood or lymph, which is called metastasis. Although the survival rate of cancer patients has increased due to the development of modern medicine, cancer is still one of the leading causes of death in the world population.
  • genipin is a type of aglycone derived from an iridoid glycoside known as geniposide, which is present in Gardenia jasminoides, and is a synthetic crosslinking agent that is generally used. Because of its lower toxicity, it is widely used as an excellent natural protein crosslinking agent. It has been reported that genipine aids in biliary function in liver disease and inhibits anti-inflammatory and anti-angiogenesis.
  • the present invention has been devised to solve the above problems, and the present inventors screened a cancer cell line expressing UCP2 to use genipin, which is conventionally known as an inhibitor of UCP2 (uncoupling protein 2), for cancer treatment.
  • UCP2 uncoupling protein 2
  • a cancer model was discovered, and it was first confirmed that apoptosis of cancer cells was induced and the growth of cancer cells was significantly inhibited when genipine and elesclomol were used in combination in the cancer cell line. Based on this, the present invention was completed. did.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including genipin and elesclomol.
  • composition for preventing or treating cancer, including genipin and elesclomol.
  • the genipin may reduce glucose metabolism in cancer cells.
  • the genipin may have a concentration of 200 to 300 uM, and the elesclomol may have a concentration of 0.05 to 0.15 uM.
  • the cancer is brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colorectal cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, renal cancer, ureter It may be any one or more selected from the group consisting of cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, and skin cancer.
  • the composition can increase the production of reactive oxygen species in cancer cells.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the present invention provides the use of the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes genipin and elesclomol, and the pharmaceutical composition can inhibit the growth of various cancer cells including colorectal cancer, lung cancer or breast cancer. It is expected to be useful for prophylactic or therapeutic purposes.
  • Figure 1a is the result of confirming the expression level of UCP2 after transforming the lung cancer cell line A549 cells with siRNA, which is a UCP2 inhibitor
  • Figure 1b is the FDG uptake level of the transformed A549 cells as described above
  • Figure 1c is the above The ROS production level of the transformed A549 cells
  • Figure 1d is the result of confirming the cell viability of the transformed A549 cells as described above.
  • Figure 2a confirms the expression level of UCP2 when the lung cancer cell line A549 cell line was treated with genipin
  • Figure 2b is the result of confirming the change in FDG intake after treatment with genipin in the lung cancer cell line A549 cell line for 24 hours
  • Figure 2c shows the result of confirming the change in FDG intake after treatment with genipin in the lung cancer cell line A549 cell line for 2 hours
  • Figure 2d is genipin and elesclomol in A549 cell line transformed with UCP2-specific siRNA FDG intake level was confirmed after administration of these drugs individually or in combination.
  • Figure 3a is the result of confirming the intracellular ROS level after each or co-administration of genipine and elesclomol in the lung cancer cell line A549 cell line
  • Figure 3b is the lung cancer cell line A549 cell line of genipin and elesclomol
  • FIG. 3c is a result of confirming the ROS level of mitochondria
  • FIG. This is the result of confirming the mitochondrial ROS level of A549 cells transformed with UCP2-specific siRNA after administration of each or combination of sclomol.
  • Figure 4a is a lung cancer cell line A549 cell line genipin or elesclomol respectively administered alone or after 72 hours elapsed after administration in combination, the mitochondrial membrane potential and apoptosis level was confirmed
  • Figure 4b is a lung cancer cell line A549 After 72 hours elapsed after genipine or elesclomol was administered alone or in combination in the cell line, flow cytometry was performed to confirm early apoptosis and late apoptosis
  • FIG. 4c is a lung cancer cell line.
  • FIG. 4d shows cleaved-caspase, a protein involved in apoptosis, after 72 hours have elapsed after genipine or elesclomol was administered alone or in combination in the lung cancer cell line A549 cell line.
  • the results of measuring the expression of 3 (c-Cas3) by Western blot are shown.
  • Figure 5a confirms the colony formation level of A549 cells when genipin or elesclomol is administered alone or in combination to the lung cancer cell line A549 cell line
  • Figure 5b is the lung cancer cell line A549 cell line genipin or elesclomol Cell viability was confirmed after 24 hours or 48 hours have elapsed after the mol was administered alone or in combination
  • Figure 5c is when genipine or elesclomol was administered alone or in combination to the lung cancer cell line A549 cell line, respectively.
  • Figure 5d is a lung cancer cell line A549 cell line, respectively, genipine or elesclomol administered alone or in combination with the additional administration of tBHP to confirm the cell viability
  • Figure 5e is a lung cancer cell line A549 Cell viability was confirmed by additionally administering NAC while genipine or elesclomol was administered alone or in combination with the cell line.
  • Figure 6a shows the results of confirming the cancer treatment effect when genipine and elesclomol were co-administered to the colorectal cancer cell line CT26 cell line
  • Figure 6b is the colon cancer cell line HCT116 cell line genipin and elesclomol Shows the results of confirming the cancer treatment effect when co-administered
  • FIG. 6c shows the results of confirming the cancer treatment effect when genipine and elesclomol were co-administered to the HT29 cell line, a colorectal cancer cell line.
  • FIG. 7a is a case in which genipine or elesclomol was administered intraperitoneally, alone or in combination, in a preliminary experiment on a cancer-transplanted mouse animal model in which A549 human lung cancer cells were transplanted into Balb/c nude mice. Shows the results of confirming the cancer growth inhibitory effect of Or, it shows tumor growth and weight change when elesclomol was administered intraperitoneally, either alone or in combination, Figure 7c shows A549 human lung cancer cells in Balb / c nude mice The change in FDG intake of tumors was confirmed through PET-CT imaging when genipine or elesclomol was administered intraperitoneally, alone or in combination, to a transplanted cancer-transplanted mouse animal model.
  • Figure 8a is the result of confirming the expression level of UCP2 when genipine or elesclomol is administered alone or in combination in vivo
  • Figure 8b is genipine or elesclomol, respectively, administered alone in vivo It is a result of confirming the level of LDH when administered or co-administered.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the mechanism of the anticancer effect that appears when genipine or elesclomol is administered alone or in combination.
  • the present inventors screened a cancer cell line expressing UCP2 to discover a cancer model by screening a cancer cell line expressing UCP2 in order to use genipin, which is conventionally known as an inhibitor of UCP2 (uncoupling protein 2), for cancer treatment.
  • genipin which is conventionally known as an inhibitor of UCP2 (uncoupling protein 2)
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising genipin and elesclomol.
  • the genipin may reduce glucose metabolism in cancer cells, and the glucose may be measured through FDG (18F-fluorodeoxyglucose), but is not limited thereto.
  • the genipin may have a concentration of 200 to 300 uM
  • the elesclomol may have a concentration of 0.05 to 0.15 uM, preferably 225 to 275 uM
  • the elesclomol may have a concentration of 225 to 275 uM.
  • the concentration of elesclomol may be 0.1 uM.
  • the pharmaceutical composition may increase the production of reactive oxygen species (ROS) in cancer cells.
  • ROS reactive oxygen species
  • Cancer a disease to be prevented or treated in the present invention, includes diseases in which cell cycle is not regulated and continues to divide, and the types of cancer include brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, Lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colorectal cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, renal cancer, ureter cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, etc. It may be vaginal cancer, vaginal cancer or skin cancer, preferably lung cancer, breast cancer, colon cancer, but is not limited thereto.
  • Genepin of the present invention is a compound represented by the formula (I).
  • the genipine is a kind of aglycone derived from an iridoid glycoside known as geniposide, which is present in Gardenia jasminoides, and has a lower toxicity than a synthetic cross-linking agent generally used. Therefore, it is widely used as an excellent natural protein crosslinking agent, and is known as a protein, collagen, gelatin or chitosan crosslinking agent.
  • genipin is known to inhibit the activity of UCP2 (uncoupling protein 2) enzyme in an in vitro experiment.
  • “elesclomol” of the present invention is a compound represented by the formula (II).
  • the elesclomol a novel injectable drug candidate, raises oxidative stress levels above the breaking point, killing cancer cells and triggering programmed cell death.
  • elesclomol potently kills a wide range of cancer cell types at high doses and has the ability to strongly enhance the efficacy of certain chemotherapeutic agents with minimal additional toxicity at moderate doses.
  • c-Cas3 cleaved-caspase 3
  • c-PARP cleaved protein polymerase
  • SRB assay was performed on the A549 cell line, a lung cancer cell line, and it was confirmed that the cancer treatment effect was significantly increased when genipine and elesclomol were administered in combination, compared to the single administration of genipine or elesclomol ( see Example 5-2).
  • SRB assay was performed on the colon cancer cell lines, CT26 cell line, HCT116 cell line, and HT29 cell line, compared to the single administration of genipine or elesclomol, and genipine and elesclomol were used in combination. When administered, it was confirmed that the cancer therapeutic effect was increased in each of the cell lines (see Example 6).
  • A549 human lung cancer cells were transplanted into Balb/c nude mice to establish a cancer transplanted mouse animal model, and genipine or elesclomol was administered alone or in combination. When administered intraperitoneally, it was confirmed that cancer growth (tumor growth) can be inhibited compared to the control group (see Example 7).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes genipine and elesclomol as active ingredients, and may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in formulation, and includes, but is not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and the like. It does not, and may further include other conventional additives such as antioxidants and buffers, if necessary. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, etc.
  • formulations can be preferably made according to each component using the method disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or locally applied) according to a desired method, and the dosage may vary depending on the condition and weight of the patient, and the disease. Although it varies depending on the degree, drug form, administration route and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat or diagnose a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or diagnosis, and the effective dose level is determined by the patient's disease type, severity, drug activity, sensitivity to drugs, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient into the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and drugs used in combination, in general 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per 1 kg of body weight, may be administered daily or every other day, or may be administered in divided doses 1 to 3 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased according to the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and thus the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition comprising genipine and elesclomol.
  • “individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle. means mammals.
  • A549 human lung cancer cells from the American Type Culture Collection were cultured in RPMI-1640 medium (Lonza Group, Ltd.) supplemented with 10% FBS (Serana Europe GmbH) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco, Thermo Fisher Scientific,) at 37 ⁇ C temperature and 5% carbon dioxide conditions were incubated. Cells were passaged twice a week and subcultured a number of times less than 15 passages, and the cells thus cultured were certified by the Samsung Medical Center institutional research support center to be free of mycoplasma. received
  • CM-H2DCFDA 5-(And-6)-Chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoresscein diacetate acetyl ester
  • MitoSOX Red and Lipofectamine® LTX were obtained from Invitrogen; Those purchased from Thermo Fisher Scientific, Inc. were used, and siRNA and ⁇ -actin antibodies targeting UCP2 (catalog no. 18470) were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc.
  • the SRB test to confirm the cell viability was performed on a cell line seeded at a density of 1 x 10 4 cells/well in a 96-well plate, and A549 cells cultured for 24 hours or 48 hours after drug treatment. It was fixed with 10 (wt/v)% trichloroacetic acid at 4 °C for 2 hours. After fixation, cells were stained with SRB dye at room temperature for 30 min, and then washed repeatedly with 1 (v/v)% acetic acid to remove excess dye.
  • the protein-bound dye was dissolved in 10 mM Tris base solution, and absorbance at 510 nm was measured using a VERSA max microplate reader (Molecular Devices, LLC).
  • Annexin V and PI sodium iodide flow cytometry analysis was performed to measure the cell apoptosis, and a specific experiment was performed on A549 cells at a density of 5x10 5 cells/ml treated with genipin and elesclomol for 24 hours, Cell death rates were confirmed using the Annexin V-FITC Apoptosis Kit (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions. Annexin V was used to identify early apoptotic cells, and PI was used to identify late apoptotic cells. 10,000 cells per sample were subjected to FACS analysis on a Calibur flow-cytometer (BD Biosciences) using CellQuest software version 5.1 (Becton-Dickinson and Company).
  • A549 cells were seeded in 12-well plates at a density of 2 x 10 5 cells/well and treated with genipine and elesclomol for 24 hours the day after seeding.
  • LDH activity was measured in 500 ⁇ l cell culture medium for released LDH and 20 ⁇ g cell lysate for intracellular LDH using the Cobas c501 assay kit (catalog no. c501; Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions.
  • the tumor tissue was homogenized with T-PER TM tissue protein extraction reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.) on ice, centrifuged at 10,000 x g at 4 °C for 10 minutes, and then LDH for 20 ⁇ g of the obtained supernatant. Activity was assayed.
  • A549 cells were seeded in a black 96-well plate at a density of 4x10 4 cells/well and treated with genipin and elesclomol for 24 hours the next day.
  • the culture medium was replaced with 100 ⁇ l phenol red-free RPMI-1640 medium containing 2% FBS and 500 nM MitoTracker TM Red FM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) to stain the mitochondria of living cells, 5 % CO 2 condition and incubated at a temperature of 37° C. for 30 minutes and washed with 100 ⁇ l of cold PBS per well.
  • the fluorescence of each well prepared as described above was measured with a microplate reader (Mithras LB 940; Titertek-Berthold) capable of detecting emission wavelengths of 594 nm and 642 nm.
  • the level of intracellular ROS was measured at a density of 4 x 10 4 cells/well in a black 96-well plate and 24 hours later, the culture medium was phenol red free RPMI-1640 medium containing 10% FBS ( Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), and then, cells were treated with genipin and elesclomol, or transfected with UCP2 siRNA. After incubation with 10 ⁇ M CM-H2DCFDA for 30 min at 37 °C, fluorescence was measured using a GloMax®-Multi Detection System microplate reader (Promega Corporation) capable of measuring 490 nm and 510 to 570 nm emission wavelengths. .
  • Mitochondrial ROS level was measured using dihydroethidium and MitoSOX Red conjugated to a mitochondria-localization tag.
  • A549 cells were seeded in a black 96-well plate at a density of 4x10 4 cells/well, and the next day, the culture medium was changed to phenol red free RPMI-1640 medium containing 10% FBS. After treatment with genipin and elesclomol, the culture medium was removed and HBSS buffer (Lonza Group, Ltd.) containing 2% bovine serum albumin (Bovogen Biologicals Pvt. Ltd.) MitoSOX dye was added thereto.
  • the culture was incubated at a temperature of 37 °C for 10 minutes, the buffer was changed to dye-free HBSS, and fluorescence was measured with a Mithras LB 940 microplate reader capable of measuring 510 nm and 580 nm emission wavelengths.
  • A549 cells seeded in a 24-well plate at a density of 5x10 4 cells/well were treated with 100 ⁇ 250 kBq 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) (provided by Samsung Medical Center) in a culture medium at 37 ° C and 5% CO 2 conditions. was added and incubated for 40 minutes. The cultured cells were washed twice with cold PBS, lysed with 0.05 N NaOH, and then cell-related radioactivity was measured using a Wallac high-energy ⁇ -counter (PerkinElmer, Inc.). Glucose uptake levels were corrected for by Bradford analysis.
  • FDG 18F-fluorodeoxyglucose
  • Protein immunoblots of A549 cells and tumor tissues were respectively lysed with cold PRO-PREPTM protein extraction solution (iNtRON Biotechnology, Inc.) and T-PERTM tissue protein extraction reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.), followed by protease inhibitor cocktails. (SigmaAldrich; Merck KGaA) was used to perform protein immunoblotting.
  • Immunoblot on cells was performed on the cell lysate obtained after treatment with 250 ⁇ M genipine and 0.1 ⁇ M elesclomol for 24 hours. After Bradford analysis, 30 ⁇ g of protein was added to 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel After separation by electrophoresis, it was transferred to a polyvinylidene difluoride membrane, and the transferred membrane was blocked using 5% skim milk and 0.1% Tween-20 in Tris-buffered saline for 1 hour at room temperature, and then the primary antibody (1: 1,000). dilution) at 4 °C overnight, and then incubated with the secondary antibody at room temperature (1:2,000 dilution) for 1 hour.
  • Immunoreactive protein was detected by chemiluminescence (Pierce ECL + western blotting substrate, Pierce, Thermo Fisher Scientific, Inc.), and band intensities were obtained using Quantity One software version 4.6.6 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). ) and quantification using a GS-800 densitometer.
  • results of the experiment were expressed as mean ⁇ standard deviation (standard deviation or standard error), significant differences between the two groups were determined by paired Student's t-test, and for comparison between multiple groups, one-way variance using the Bonferroni post hoc test. Analysis (one-way ANOVA) was performed, and data were analyzed by setting P ⁇ 0.05 as a significance value.
  • the culture medium culturing A459 cells was changed to antibiotic-free medium containing 5% FBS, and then A549 cells with 80% confluent were transformed into 40 nM UCP2 mixed with Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Specific or non-targeting siRNA was transfected in opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.). After 24 hours had elapsed, the medium was replaced with a fresh medium containing 10% FPS and antibiotics, and was cultured for an additional 24 hours before performing subsequent experiments. was confirmed, and the significance values were expressed as * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001.
  • the change in ROS production capacity was specifically confirmed by dividing the ROS production into intracellular ROS production and mitochondrial ROS production.
  • the intracellular ROS production capacity was increased to 292.4 ⁇ 12.0% when genipine (250 uM) was administered in ROS measured 6 hours after drug administration, as shown in FIG. 3a, and genipine (250 uM) ) and elesclomol (0.1 uM) were co-administered, and ROS increased to 378.7 ⁇ 5.7%.
  • elesclomol (0.1 uM) was administered alone, ROS decreased to 86.1 ⁇ 10.7%, but no statistical significance was observed.
  • SRB assay was performed for 72 hours in the A549 cell line, a lung cancer cell line, to verify the cancer treatment effect when genipine and elesclomol were co-administered in vitro.
  • A549 cells The viability of A549 cells was confirmed by performing SRB analysis while administering 0.1 ⁇ M elescolomol and 250 ⁇ M genipine individually or in combination. As a result, as shown in Figure 5b, when the group drug was treated alone, cell viability of 78.9 ⁇ 5.2 and 76.9 ⁇ 7.1%, respectively, was shown, but when the two drugs were administered in combination, the survival rate was 42.0 ⁇ 3.4 compared to the control group. It can be seen that there is a significant decrease in %.
  • the tumor model for the experiment was 5x10 6 A549 cells from the right shoulder, the cancer cells were removed with trypsin-EDTA, washed twice with saline, and 1x10 8 cells were prepared in a syringe, and then a 5-week-old male mouse weighing 20-25 g (BALB/c-nude mice (Orient Bio, Inc.) were implanted by subcutaneous injection of cancer cells into the right shoulder.
  • Tumor size measurements were performed using a caliper before each injection, and repeated twice for a total of 6-7 animals.
  • A549 human lung cancer cells were transplanted into Balb/c nude mice prepared in Example 7-1 to establish an animal model of cancer transplantation.
  • the tumor suppression effect was confirmed according to the FDG intake (arrow) of the tumor through PET / CT scan.
  • FDG intake arrow
  • 7.4 MBq of FDG was injected through the tail vein, then anesthetized by inhalation of isoflurane for 1 h, and PET images were taken through an Inveon micro-PET scanner (Siemens Healthineers), unattenuated corrected tomography images. (Non attenuation corrected tomographic image) was analyzed with Research Workplace workstation version 4.2 (Siemens Healthineers) and presented. As a result, as shown in FIG. 7c, it was confirmed that the greatest tumor tissue inhibitory effect was shown in the mouse model in which genipine and elesclomol were co-administered.
  • the mouse was sacrificed by dislocating the cervix of the mouse taken by PET image in Example 7-2, and then the tumor tissue was excised. was obtained.
  • the protein expression level of UCP2 in the xenograft tumor tissue thus obtained was confirmed by Western blot.
  • FIG. 8a it was confirmed that the expression level of UCP2 in the genipin alone treatment group was reduced to 56.4 ⁇ 12.0%.
  • FIG. 8b the lowest LDH level in the tumor tissue administered in combination with genipine and elesclomol , it was possible to reconfirm that a significant effect appeared when cancer was treated by co-administration of genipine and elesclomol.
  • the present inventors increase the expression level of ROS by suppressing the level of UPC2 that suppresses the expression of ROS when genipin is administered through the above results, and elesclomol also increases the expression level of ROS, thus By inducing apoptosis to the tumor tissue by increased ROS, it was confirmed that it has an anticancer effect, and these results are shown in FIG. 9 .
  • the present invention relates to a novel anticancer effect by co-administration of a natural product, genipin, which is a compound derived from Chicha tree, and elesclomol, which has been used for the treatment of melanoma, in combination with the two compounds. Since it is possible to develop a therapeutic agent with low toxicity and excellent anticancer effect by co-administration of

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Abstract

본 발명은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (Elesclomol)을 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (Elesclomol)을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하며, 상기 약학적 조성물은 대장암, 폐암 또는 유방암을 포함한 다양한 암세포의 성장을 억제할 수 있는바, 암 예방 또는 치료용도로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

게니핀 및 엘레스클로몰을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암 (Cancer), 악성신생물 (Malignant neoplasm) 또는 악성종양 (Malignant Tumor)은 세포가 사멸 주기를 무시하고 비정상적으로 증식하여 인체의 기능을 망가뜨리는 질환을 말한다. 비정상 세포 (암세포)의 제어되지 않은 성장과 분열이 원인이므로, 재생하는 어떤 생체 조직에서도 발병할 수 있으며, 암을 유발하는 가장 심각한 요인은 발암물질이지만 확률적으로는 외적 요인 없이 건강한 인체에서도 발병할 수 있다. 암세포는 혈액이나 림프액을 통해 신체의 다른 기관으로 이동할 수 있으며, 이를 전이 (轉移)라고 한다. 현대의학의 발달로 인해 암 환자의 생존률이 증가하였으나, 암은 여전히 세계인구의 주요 사망원인 질환 중 하나이다.
한편, 게니핀 (genipin)은 치자나무 (Gardenia jasminoides)에 존재하는 게니포사이드 (geniposide)로 알려진 이리도이드 배당체 (iridoid glycoside)로부터 유래되는 비당질 배당체 (aglycone)의 일종으로서, 일반적으로 사용되고 있는 합성 가교제보다 독성이 낮기 때문에 우수한 천연 단백질 가교제로 많이 사용되고 있다. 게니핀은 간 질환에서는 이담작용에 도움을 주고, 항염증 및 항혈관형성을 억제하는 것으로 보고되었다.
또한, 엘레스클로몰 (elesclomol)은 전이성 흑색종 치료를 위해 미국 식품의약국 (FDA)으로부터 패스트트랙 및 희귀질환 치료 약물로 인정되었고, 전이성 흑색종 환자에서 무진행 생존율을 유의하게 증가시키는 것으로 보고되었다.
상기 게니핀 또는 엘레스클로몰을 이용한 암 치료에 관한 연구는 다수 진행되었으나 (Oncotarget. 2018 June 19; 9(47): 28796., Kim et al.), 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용하여 다양한 암의 치료에 적용하는 것에 관한 연구는 전무한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자는 종래에 UCP2 (uncoupling protein 2)의 억제제로 알려진 게니핀을 암 치료용도로 사용하기 위해, UCP2를 발현하는 암 세포주를 스크리닝하여 암 모델을 발굴하였고, 상기 암 세포주에서 게니핀과 엘레스클로몰을 병용한 경우 암세포의 세포사멸이 유도되고, 암세포의 성장이 유의적으로 억제됨을 최초로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 게니핀은 암세포의 포도당 대사를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 게니핀은 농도가 200 내지 300 uM일 수 있고, 상기 엘레스클로몰은 농도가 0.05 내지 0.15 uM일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 암은 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 암세포에서 활성산소종의 생성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하며, 상기 약학적 조성물은 대장암, 폐암 또는 유방암을 포함한 다양한 암세포의 성장을 억제할 수 있는바, 암 예방 또는 치료용도로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 UCP2 억제제인 siRNA로 폐암세포주인 A549 세포를 형질전환한 다음, UCP2의 발현 수준을 확인한 결과이고, 도 1b는 상기와 같이 형질전환된 A549 세포의 FDG 섭취 수준을, 도 1c는 상기와 같이 형질전환된 A549 세포의 ROS 생성 수준을, 도 1d는 상기와 같이 형질전환된 A549 세포의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2a는 폐암 세포주인 A549 세포주에 게니핀을 처리했을 때 UCP2의 발현 수준을 확인한 것이고, 도 2b는 폐암 세포주인 A549 세포주에 24시간 동안 게니핀을 처리한 후 FDG 섭취량의 변화를 확인한 결과이고, 도 2c는 폐암 세포주인 A549 세포주에 2시간 동안 게니핀을 처리한 후 FDG 섭취량의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 2d는 UCP2 특이적인 siRNA로 형질전환된 A549 세포주에 게니핀 및 엘레스클로몰을 각각 또는 병용하여 투여한 다음 FDG 섭취 수준을 확인한 것이다.
도 3a는 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 및 엘레스클로몰의 각각 또는 병용 투여한 다음, 세포내 ROS 수준을 확인한 결과이고, 도 3b는 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 및 엘레스클로몰의 각각 또는 병용 투여한 다음, UCP2 특이적인 siRNA로 형질전환된 A549 세포내 ROS 수준을 확인한 결과이며, 도 3c는 미토콘드리아의 ROS 수준을 확인한 결과이고, 도 3d는 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 및 엘레스클로몰의 각각 또는 병용 투여한 다음, UCP2 특이적인 siRNA로 형질전환된 A549 세포의 미토콘드리아의 ROS 수준을 확인한 결과이다.
도 4a는 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하고 72시간이 경과한 후, 미토콘드리아 막 포텐셜 및 세포사멸 수준을 확인한 것이고, 도 4b는 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하고 72시간이 경과한 후, 초기 세포사멸 및 후기 세포사멸을 확인하기 위해 유세포 분석을 수행한 결과이고, 도 4c는 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하고 72시간이 경과한 후, 세포사멸에 관여하는 단백질인 cleaved-poly (ADP-ribose) polymerase (c-PARP)의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이며, 도 4d는 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하고 72시간이 경과한 후, 세포사멸에 관여하는 단백질인 cleaved-caspase 3 (c-Cas3)의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 폐암 세포주인 A549 세포주에 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하면서 A549 세포의 콜로니 형성 수준을 확인한 것이고, 도 5b는 폐암 세포주인 A549 세포주에 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하고 24시간 또는 48시간이 경과한 다음 세포 생존율을 확인한 것이며, 도 5c는 폐암 세포주인 A549 세포주에 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하면서 LDH 수준을 확인한 것이고, 도 5d는 폐암 세포주인 A549 세포주에 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하면서 tBHP를 추가로 투여하여 세포 생존율을 확인한 것이며, 도 5e는 폐암 세포주인 A549 세포주에 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여하면서 NAC를 추가로 투여하여 세포 생존율을 확인한 것이다.
도 6a는 대장암 세포주인 CT26 세포주에 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 경우의 암 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 6b는 대장암 세포주인 HCT116 세포주에 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 경우의 암 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 6c는 대장암 세포주인 HT29 세포주에 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 경우의 암 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 Balb/c 누드 마우스에 A549 인간 폐암세포 (human lung cancer cell)를 이식한 암 이식 마우스 동물모델에 대한 예비 실험에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 또는 병용으로 복강 내 투여한 경우의 암 성장 (tumor growth) 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 7b는 Balb/c 누드 마우스에 A549 인간 폐암세포 (human lung cancer cell)를 이식한 암 이식 마우스 동물모델에 대한 본 실험에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 또는 병용으로 복강 내 투여한 경우의 암 성장 (tumor growth) 및 체중 변화를 나타낸 것이며, 도 7c는 Balb/c 누드 마우스에 A549 인간 폐암세포 (human lung cancer cell)를 이식한 암 이식 마우스 동물모델에 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 또는 병용으로 복강 내 투여한 경우의 PET-CT 촬영을 통한 종양의 FDG 섭취량 변화를 확인한 것이다.
도 8a는 in vivo에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여했을 때, UCP2의 발현수준을 확인한 결과이고, 도 8b는 in vivo에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여했을 때, LDH의 수준을 확인한 결과이다.
도 9는 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여했을 때 나타나는 항암효과의 기전을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 종래에 UCP2 (uncoupling protein 2)의 억제제로 알려진 게니핀을 암 치료용도로 사용하기 위해, UCP2를 발현하는 암 세포주를 스크리닝하여 암 모델을 발굴하였고, 상기 암 세포주에서 게니핀과 엘레스클로몰을 병용한 경우 암세포의 세포사멸이 유도되고, 암세포의 성장이 유의적으로 억제됨을 최초로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 게니핀은 암세포의 포도당 대사를 감소시키는 것일 수 있고, 상기 포도당은 FDG (18F-fluorodeoxyglucose)을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 게니핀은 농도가 200 내지 300 uM일 수 있고, 상기 엘레스클로몰은 농도가 0.05 내지 0.15 uM일 수 있고, 바람직하게는 225 내지 275 uM일 수 있고, 상기 엘레스클로몰은 농도가 0.025 내지 0.125 uM일 수 있으며, 보다 바람직하게는 250 uM일 수 있고, 상기 엘레스클로몰은 농도가 0.1 uM일 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 암세포에서 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 예방 또는 치료 대상으로 하는 질환인 "암 (cancer)"은 세포주기가 조절되지 않아 세포분열을 계속하는 질병을 포괄적으로 포함하고, 그 종류로는 상기 암은 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 또는 피부암일 수 있고, 바람직하게는 폐암, 유방암, 대장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "게니핀 (genipin)"은 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물이다. 상기 게니핀은 치자나무 (Gardenia jasminoides)에 존재하는 게니포사이드 (geniposide)로 알려진 이리도이드 배당체 (iridoid glycoside)로부터 유래되는 비당질 배당체 (aglycone)의 일종으로서, 일반적으로 사용되고 있는 합성 가교제보다 독성이 낮기 때문에 우수한 천연 단백질 가교제로 많이 사용되고 있는데, 단백질, 콜라겐, 젤라틴 또는 키토산의 가교제로 알려져 있다. 또한, 게니핀은 In vitro 실험에서 UCP2 (uncoupling protein 2) 효소의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다.
[화학식 Ⅰ]
Figure PCTKR2021001832-appb-I000001
본 발명의 "엘레스클로몰 (elesclomol)"은 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물이다. 상기 엘레스클로몰은 새로운 주사 가능한 약물 후보 물질로, 산화 스트레스 수준을 파괴점 이상으로 높여 암세포를 죽이고 프로그램된 세포사멸을 유발한다. 전임상 모델에서 엘레스클로몰은 고용량으로 광범위한 암세포 유형을 강력하게 사멸시키고, 중간 정도의 용량에서 최소의 추가 독성으로 특정 화학요법제의 효능을 강하게 향상시키는 능력이 있음이 보고된다.
[화학식 Ⅱ]
Figure PCTKR2021001832-appb-I000002
본 발명의 일실시예에서는, 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여한 경우, 세포사멸에 관여하는 단백질인 cleaved-caspase 3 (c-Cas3) 및 cleaved-poly (ADP-ribose) polymerase (c-PARP)의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였고, 이는 게니핀 및 엘레스클로몰의 병용 투여가 세포사멸을 유발함을 확인한 것이다 (실시예 5-1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는. 폐암 세포주인 A549 세포주에서 SRB assay를 수행하여 게니핀 또는 엘레스클로몰 각각의 단독 투여에 비해, 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 경우에 암 치료효과가 현저하게 증가함을 확인하였다 (실시예 5-2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 대장암 세포주인 CT26 세포주, HCT116 세포주 및 HT29 세포주에서 SRB assay를 수행하여 게니핀 또는 엘레스클로몰 각각의 단독 투여에 비해, 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 경우에 상기 각 세포주에서 암 치료효과가 증가함을 확인하였다 (실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, Balb/c 누드 마우스에 A549 인간 폐암세포 (human lung cancer cell)를 이식하여 암 이식 마우스 동물모델을 정립하고, 게니핀 또는 엘레스클로몰을 각각 단독 또는 병용으로 복강 내 투여한 경우, 대조군에 비하여 암 성장 (tumor growth)을 억제할 수 있음을 확인하였다 (실시예 7 참조).
상기 실시예 결과를 통해 폐암 또는 대장암 세포주에 게니핀 및 엘레스클로몰을 포함하는 약학적 조성물을 처리하는 경우 상기 암세포의 세포사멸이 증가함으로써, 암의 성장이 억제될 수 있으며, 상기 조성물이 암에 대한 유망한 치료제가 될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 게니핀 및 엘레스클로몰을 유효성분으로 포함하며, 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 게니핀 및 엘레스클로몰을 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비
1-1. 시약 및 세포주 준비
American Type Culture Collection의 A549 인간 폐암 세포는 10 % FBS (Serana Europe GmbH) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, Thermo Fisher Scientific,)이 보충된 RPMI-1640 배지 (Lonza Group, Ltd.)에서 37˚C의 온도와 5%의 이산화탄소 조건으로 배양하였다. 세포들은 일주일에 2번 계대배양하여 15 계대(passages) 미만의 횟수로 계대배양하였고, 이렇게 배양된 세포들은 mycoplasma가 없는 것으로 삼성 서울 병원 기관연구 지원센터(Samsung Medical Center institutional research support center)에 의해 인증을 받았다.
모든 실험은 cell confluence가 70% 내지 80%인 조건에서 수행되었으며, 게니핀 (Genipin), N-acetylcysteine (NAC) 및 tert-butylhy-droperoxide (TBHP)는 Sigma-Aldrich;Merck KGaV에서 구매한 것을 사용하였다. NAC 및 TBHP의 처리농도는 각각 10mM 및 200μM이었으며, 엘레스클로몰 (elesclomol) (Biorbyt) 및 게니핀과 함께 37 ℃의 온도에서 투여한 다음, 24 시간 또는 48 시간 동안 배양하였다. 엘레스클로몰 및 게니핀 스톡은 DMSO에 각각 20mM 및 250mM만큼 용해시켰고, DMSO로 추가 희석하였다.
5-(And-6)-Chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoresscein diacetate acetyl ester (CM-H2DCFDA), MitoSOX Red 및 Lipofectamine® LTX는 Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.에서 구입한 것을 사용하였으며, UCP2를 표적화하는 siRNA 및 β-actin 항체(카탈로그 no. 18470)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc 에서 구입한 것을 사용하였다.
1-2. SRB 테스트(Sulforhodamine B assay)
세포 생존율을 확인하기 위한 SRB 테스트는 96-웰 플레이트에 1 x 104 세포/웰의 밀도로 시드(seed)된 세포주에서 수행하였으며, 약물을 처리한 뒤 24시간 또는 48시간 동안 배양한 A549 세포를 10 (wt/v)% 트리클로로 아세트산(trichloroacetic acid)으로 4 ℃에서 2시간 동안 고정하였다. 고정 뒤, 세포를 실온에서 30분 동안 SRB dye로 염색한 다음, 1 (v/v)% 아세트산으로 반복 세척하여 과잉 염료를 제거하였다.
단백질이 결합된 dye를 10mM Tris 염기 용액에 용해시킨 다음, 510nm에서 흡광도를 VERSA max 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices, LLC)를 사용하여 측정했습니다.
1-3. 유세포 분석(Flow cytometry)
세포의 사멸율을 측정하기 위해 Annexin V 및 PI(propidium iodide) 유세포 분석을 수행하였고, 구체적인 실험은 5x105 세포/ml 밀도의 A549 세포에 게니핀과 엘레스클로몰을 24 시간 동안 처리한 다음, 제조업체의 지침에 따라 Annexin V-FITC Apoptosis 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 세포 사멸율을 확인하였다. 초기 세포사멸 세포(apoptotic cell)를 확인하기 위해 Annexin V를 사용하였고, 후기 세포사멸 세포를 확인하기 PI를 사용하였다. 샘플당 10,000개의 세포를 CellQuest 소프트웨어 버전 5.1 (Becton-Dickinson and Company)을 사용하여 Calibur flow-cytometer (BD Biosciences)에서 FACS 분석을 수행하였다.
1-4. 젖산 탈수소효소 활성 분석(Lactate dehydrogenase (LDH) activity assay)
A549 세포를 2 x 105 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 시드 (seed) 다음날 24시간 동안 게니핀 및 엘레스클로몰을 처리하였다. LDH 활성은 제조업체의 지침에 따라 Cobas c501 분석 키트 (카탈로그 no. c501; Roche Diagnostics)를 사용하여 방출된 LDH용 500μl 세포 배양 배지 및 세포내 LDH용 20μg 세포 용해물에서 측정하였다.
종양조직은 얼음 위에서 T-PER ™ 조직 단백질 추출 시약 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)으로 균질화하고, 4 ℃의 온도에서 10,000 x g으로 10 분 동안 원심분리 한 다음, 얻어낸 20 μg의 상층 액에 대해서 LDH 활성을 분석하였다.
1.5 미토콘드리아 막 포텐셜 측정 (Mitochondrial membrane potential (MMP) measurement)
세포 생존율과 관련된 MMP를 측정하기 위해 A549 세포를 4x104 세포/웰의 밀도로 검은색 96-웰 플레이트에 시드(seed)한 다음날 24 시간 동안 게니핀 및 엘레스클로몰을 처리하였다. 배양배지는 살아있는 세포의 미토콘드리아를 염색하기 위해, 2 % FBS 및 500 nM MitoTracker ™ Red FM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.)이 포함된 100 μl 페놀 red-free RPMI-1640 배지로 교체하였고, 5 %의 CO2 조건 및 37℃의 온도에서 30 분 동안 배양하고 웰당 100 μl의 차가운 PBS로 세척하였다. 상기와 같이 준비된 각 웰의 형광은 594 nm 및 642 nm의 방출 파장을 검출할 수 있는 마이크로 플레이터 리더(microplate reader (Mithras LB 940;Titertek-Berthold))로 측정하였다.
1-6. ROS 수준 측정
① 세포내 ROS 수준은 검은색 96-웰 플레이트에 4 x 104 세포/웰의 밀도로 시드하고 24시간이 경과한 다음, 배양 배지를 10 %의 FBS를 함유하는 phenol red free RPMI-1640 배지 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 바꿔준 다음, 세포에 게니핀 및 엘레스클로몰을 처리하거나, UCP2 siRNA로 형질감염 하였다. 37℃의 온도에서 30 분 동안 10μM CM-H2DCFDA와 함께 배양 한 다음, 490nm 및 510 내지 570nm 방출 파장을 측정할 수 있는 GloMax®-Multi Detection System 마이크로 플레이트 리더 (Promega Corporation)를 사용하여 형광을 측정하였다.
② 미토콘드리아의 ROS 수준은 미토콘드리아 국소화 태그 (mitochondria-localization tag)에 접합된 dihydroethidium과 MitoSOX Red를 사용하여 측정하였다. A549 세포는 검은색 96-웰 플레이트에 4x104 세포/웰의 밀도로 시드한 뒤, 다음날 배양 배지를 10 % FBS 함유한 phenol red free RPMI-1640 배지로 바꿔주었다. 게니핀과 엘레스클로몰을 처리한 다음, 배양 배지를 제거하고, 2 %의 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin) (Bovogen Biologicals Pvt. Ltd.)이 포함되어 있는 HBSS 버퍼 (Lonza Group, Ltd.)에 MitoSOX dye를 첨가하였다. 배양은 37 ℃의 온도에서 10 분 동안 배양하였고, 버퍼를 dye없는 HBSS로 변경하고 510 nm 및 580 nm 방출 파장을 측정할 수 잇는 Mithras LB 940 마이크로 플레이트 리더로 형광을 측정하였다.
1-7. 포도당 섭취량 측정
5x104 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 시드되어 있는 A549 세포를 100 ~ 250kBq 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) (삼성 메디컬 센터 제공)를 37 ℃의 온도 및 5 %의 CO2 조건의 배양 배지에 첨가하여 40 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 차가운 PBS로 두번 세척한 다음, 0.05 N NaOH로 용해시킨 다음, Wallac high-energy γ-counter (PerkinElmer, Inc.)를 활용하여 세포 관련 방사능을 측정하였다. 포도당 섭취 수준은 Bradford 분석에 의해 수정하여 나타내었다.
1-8. 단백질 면역 블롯(immunoblotting)
A549 세포 및 종양 조직의 단백질 면역 블롯은 차가운 PRO-PREP ™ 단백질 추출 용액 (iNtRON Biotechnology, Inc.) 및 T-PER ™ 조직 단백질 추출 시약 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)으로 각각 용해한 다음, 프로테아제 억제제 칵테일 (SigmaAldrich; Merck KGaA)을 사용하여 단백질 면역 블롯을 수행하였다.
세포에 대한 면역 블롯은 250 μM 게니핀 및 0.1 μM 엘레스클로몰을 24 시간 동안 처리한 후, 얻어낸 세포 용해물에 대해 수행하였고, Bradford 분석 후, 30 μg의 단백질을 10 % sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel 전기영동으로 분리한 다음, polyvinylidene difluoride membrane으로 옮겼고, 옮긴 막을 Tris 완충 식염수의 5 % 탈지유와 0.1 % Tween-20를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단(block)한 다음, 1 차 항체 (1 : 1,000 희석)와 함께 4 ℃의 온도에서 밤새 배양 한 다음, 2 차 항체와 함께 실온 (1 : 2,000 희석)에서 1 시간 동안 배양하였다.
면역반응성 단백질 (Immunoreactive protein)은 화학 발광 (Pierce ECL + western blotting substrate, Pierce, Thermo Fisher Scientific, Inc.)에 의해 검출되었으며, 밴드 강도는 Quantity One 소프트웨어 버전 4.6.6 (Bio-Rad Laboratories, Inc.)와 GS-800 농도계를 사용하여 정량화하였다.
1-9. 통계 분석
실험에 의한 결과 값은 평균 ± 표준 편차(standard deviation 또는 standard error)로 표시하였고, 두 그룹간의 유의한 차이는 paired Student's t-test를 사용했으며, 다 그룹간의 비교는 Bonferroni post hoc test를 사용한 일원분산분석(one-way ANOVA)을 수행하였고, P <0.05를 유의값으로 설정하여 데이터를 분석하였다.
실시예 2. UCP2 억제에 따른 A549 세포주의 변화 확인
A459 세포를 배양하고 있는 배양 배지를 5 % FBS를 포함하는 무 항생제 배지로 변경한 다음, 80 % confluent를 가지는 A549 세포를 Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.)와 혼합된 40nM의 UCP2 특이적 또는 비표적 siRNA로 opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.)에서 형질 감염 시켰다. 24 시간이 경과한 다음, 배지는 10 %의 FPS 및 항생제를 포함하는 새로운 배지로 교체해 주었고, 후속 실험을 수행하기 전에 추가로 24시간 동안 배양한 다음 웨스턴 블롯, FDG의 흡수, ROS 생성능 및 세포 생존율을 확인하였고, 유의값은 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001로 하여 나타내었다.
그 결과, UCP2 단백질 수준의 경우, 도 1a에 나타낸 바와 같이, siRNA를 처리하지 않은 대조군에서 UCP2의 단백질 수준이 매우 높게 발현되어 있었으나, UCP2 특이적 siRNA를 처리한 그룹에서는 UCP2의 발현이 대조군에 비해 34.8 ± 8.0 % 수준을 가지는 것을 확인할 수 있었다. FDG 흡수의 경우 도 1b에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 88.5 ± 3.3 % 수준을 가지는 것을 확인할 수 있었고, ROS 생성능의 경우 도 1c에 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 174.7 ± 9.6 %로 증가하여 수준을 가져, 유의적으로 향상되는 것을 확인할 수 있었으며, SRB assay에 의해 세포 생존율을 확인했을 때에는, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 60.8 ± 7.9 %로 유의적으로 감소한 생존율을 보여주었다.
실시예 3. 게니핀 및 엘레스클로몰 병용 투여에 따른 A549 세포주에서의 포도당 대사의 변화 확인
상기 실시예 1-1에서 준비한 폐암 세포주인 A549 세포주에 UCP2 기능을 차단하면서도, 단백질 발현을 감소시키지 않는 것으로 알려진 게니핀을 A549 세포에 250 μM의 농도로 24시간 동안 처리했을 때, 단백질 발현을 확인한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 알려진 바와 같이 단백질 발현의 유의한 차이가 발생하지 않음을 확인할 수 있었다. 게니핀을 투여하고 A549 세포의 포도당 대사의 변화를 FDG 섭취 정도의 변화를 측정하여 확인하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 게니핀 단독 투여 24시간 후, 게니핀에 의해 UCP2로 인한 proton leak이 억제되어 포도당 대사가 감소함을 확인하였고, 도 2c에 나타낸 바와 같이 게니핀 단독 투여 2시간 후, 게니핀에 의해 UCP2로 인한 proton leak이 억제되어 포도당 대사가 감소함을 확인하였다. 한편, 게니핀과 엘레스클로몰을 단독 또는 병용투여 했을 때, 포도당 대사를 확인한 결과 도 2d에 나타낸 바와 같이 FDG 섭취가 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 재확인하기 위해 UCP2를 억제할 수 있는 UCP2 특이적인 siRNA로 형질전환한 A549 세포와 scrambled siRNA를 처리한 세포에 게니핀과 엘레스클로몰을 단독 또는 병용투여 하면서 FDG 섭취를 확인한 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 상기와 같은 결과가 더 두드러지게 나타나고, 게니핀과 엘레스클로몰을 병용투여한 군에서 가장 FDG 섭취가 감소하여, 대조군에서 58.6 ± 2.6 %만큼 감소했고, UCP2 siRNA로 형질전환 세포에서는 42.4 ± 1.8 %의 FDG 섭취를 보여주었다.
실시예 4. 게니핀 및 엘레스클로몰의 병용 투여가 A549 세포의 ROS 생성능에 미치는 영향 확인
상기 실시예 1-1에서 준비한 폐암 세포주인 A549 세포주에 게니핀 및 엘레스클로몰을 처리하면서 ROS 생성능의 변화를 세포내의 ROS 생성과 미토콘드리아의 ROS 생성으로 나누어 구체적으로 확인하였다. 그 결과, 세포내 ROS 생성능은 도 3a에 나타낸 바와 같이, 약물투여 후 6시간 후 측정한 ROS에서 게니핀 (250 uM)을 투여할 경우 ROS가 292.4 ± 12.0 %로 증가하였으며, 게니핀 (250 uM) 및 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 병용 투여한 경우는 ROS가 378.7 ± 5.7 %로 증가하였다. 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 단독 투여하였을 경우는 ROS가 79.6 ± 1.2 %로 유의하게 감소하였다. 상기와 같은 결과를 재확인하기 위해 UCP2를 억제할 수 있는 UCP2 특이적인 siRNA로 형질전환한 A549 세포와 scrambled siRNA를 처리한 세포에 게니핀과 엘레스클로몰을 단독 또는 병용투여 하면서 세포내 ROS 생성 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 게니핀 및 엘레스클로몰을 UCP2를 병용 투여했을 때, ROS 수준이 406.8 ± 35.0 %만큼 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 미토콘드리아에서 ROS 생성능을 측정한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 약물투여 6시간 후 게니핀 (250 uM)에 의해 ROS가 169.3 ± 24.5 %로 증가 (p = 0.03)하였고, 게니핀 (250 uM)과 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 병용 투여한 경우 ROS가 256.9 ± 36.04 %로 증가하였다. 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 단독 투여한 경우 ROS가 86.1 ± 10.7 %로 감소하였으나 통계적 유의성은 보이지 않았다. 상기와 같은 결과를 재확인하기 위해 UCP2를 억제할 수 있는 UCP2 특이적인 siRNA로 형질전환한 A549 세포와 scrambled siRNA를 처리한 세포에 게니핀과 엘레스클로몰을 단독 또는 병용투여 하면서 미토콘드리아내 ROS 생성 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 게니핀 및 엘레스클로몰을 UCP2를 병용 투여했을 때, ROS 수준이 253.2 ± 27.9 %만큼 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 게니핀 및 엘레스클로몰의 병용 투여에 의한 폐암 치료 효과 확인
5-1. A549 세포의 세포 사멸율 확인
게니핀과 엘레스클로몰을 병용투여 했을 때, 항암 효과를 구체적으로 확인하기 위하여, A459 세포주의 세포 생존율을 확인하였다. Mito Tracker Red로 분석했을 때, 24시간 동안 게니핀과 엘레스클로몰을 병용 투여했을 때, A549 세포의 MMP가 대조군에 비해 70.4 ± 2.5 %로 현저하게 감소했음을 확인할 수 있었고(도 4a), 이 경우 도 4b에 나타낸 바와 같이 Annexin V 양성 세포 사멸이 6배가량 증가하므로, 초기 세포사멸 세포가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 게니핀 및 엘레스클로몰의 병용 투여에 의한 폐암 치료 효과를 확인하기 위해, 폐암 세포주인 A549 세포주에서 게니핀 (250 uM) 또는 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 각각 단독 투여하거나 또는 병용 투여 72시간 후, 세포사멸에 관여하는 단백질인 cleaved-caspase 3 (c-Cas3) 및 cleaved-poly (ADP-ribose) polymerase (c-PARP)에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다 (n = 2).
그 결과 도 4c 및 도 4d에 나타낸 바와 같이, 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 A549 세포주에서 c-Cas3 및 c-PARP의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다. 게니핀 및 엘레스클로의 병용 투여로 인해, 상기 세포주에서 세포사멸이 유발되었음을 확인한 것이다.
5-2. A549 세포에 대한 항암효과 확인
폐암 세포주인 A549 세포주에서 72시간 동안 SRB assay를 수행하여 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 경우의 암 치료 효과를 시험관 내(in vitro)에서 검증하였다.
우선, 구체적인 항암 효과를 확인하기 위해 세포집락형성능 확인(Clonogenic assay)을 수행하였다. 100mm 플레이트에서 엘레스클로몰 및 게니핀 각각 또는 단독으로 처리한 A459 세포를 4 ˚C 온도의 차가운 PBS로 2회 세척한 다음, 트립신 처리 (trypsinization)으로 수확하고, 6-웰 플레이트로 분주하였다 (500 cells/well). 분주 뒤 9일이 경과한 다음, 세포는 실온 (room temperature; RT)에서 2분동안 100%의 메탄올로 고정되었고, 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 50개 이상의 세포를 포함하는 콜로니 수는 inverted phase contrast microscopy (배율 x4; Olympus Corporation)를 활용하여 수동으로 계수 하였다. 그 결과, 도 5a 나타낸 바와 같이, 게니핀과 엘레스콜로몰을 병용투여한 다음, 48시간이 경과한 경우, 세포 콜로니의 수가 대조군에 비해 50.6 ± 7.4 %로 감소하였다.
0.1μM 엘레스콜로몰과 250μM 게니핀을 각각 또는 병용하여 투여하면서 SRB 분석을 수행하여 A549 세포의 생존율을 확인하였다. 그 결과 도 5b에 나타낸 바와 같이, 기 약물을 단독 처리했을 때에는, 각각 78.9 ± 5.2 및 76.9 ± 7.1 %의 세포 생존율을 보여주었으나, 두 약물을 병용투여한 경우, 생존율이 대조군에 비해 42.0 ± 3.4 %로 큰 폭으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 세포 독성의 척도로 주로 사용되는 LDH 방출의 경우에도 도 5c에 나타낸 바와 같이, 0.1μM 엘레스콜로몰과 250μM 게니핀을 각각 투여하는 경우 24시간이 경과해도 유의한 변화를 보여주지 않았으나, 병용하여 투여하는 경우 대조군에 비해 128.8 ± 1.6 %로 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 게니핀 및 엘레스클로몰을 이용한 암 치료효과가 ROS를 감소시킨 것으로부터 기인한 것임을 밝히기 위해, tert-Butyl hydroperoxide (tBHP) 200 uM을 공통적으로 사용하여 ROS를 증가시킨 상태 및 N-acetly-L-cystein (NAC) 10 mM을 공통적으로 사용하여 ROS를 감소시킨 상태에서 각각에 대해 SRB assay를 수행하였다.
그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이 ROS를 증가시킨 상태에서는 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용한 경우에서 세포 생존율이 22.3 ± 1.9 %로 확인되어 세포독성 효과가 증가함을 확인할 수 있었고, 또한, 도 5e에서 나타낸 바와 같이 ROS를 감소시킨 상태에서는 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용한 경우에 57.5 ± 4.8 %의 세포 생존율을 보이기에 ROS를 증가시킨 상태에서 보다 세포독성 효과가 감소함을 확인하였다.
실시예 6. 게니핀 및 엘레스클로몰의 병용 투여에 의한 대장암 치료 효과 검증
대장암 세포주인 CT26 세포주, HCT116 세포주 및 HT29 세포주에서 72시간 동안 SRB assay를 수행하여 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용 투여한 경우의 암 치료 효과를 검증하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 게니핀 (250 uM) 또는 엘레스클로몰 (0.1 uM) 각각의 단독 투여에 비해, 게니핀 (250 uM) 및 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 병용 투여한 경우에 CT26 세포주에서 암 치료효과가 현저하게 증가함을 확인하였다.
또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이 게니핀 (250 uM) 또는 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 각각 단독 투여한 것에 비해, 게니핀 (250 uM) 및 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 병용 투여한 경우에 HCT116 세포주에서 암 치료효과가 현저하게 증가함을 확인하였다.
또한, 도 6c에 나타낸 바와 같이 게니핀 (250 uM) 또는 엘레스클로몰 (0.1 uM) 각각의 단독 투여에 비해, 게니핀 (250 uM) 및 엘레스클로몰 (0.1 uM)을 병용 투여한 경우에 HT29 세포주에서 암 치료효과가 현저하게 증가함을 확인하였다.
실시예 7. 암 이식 마우스 동물모델에서 암 치료효과의 검증
7-1. 마우스 모델의 준비
동물 실험은 국립 실험 동물 관리 및 사용을 위한 보건 가이드에 따라 수행되었으며, 삼성 의료 센터의 삼성 생물 의학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 20200413001)의 승인을 받았다. 실험을 위한 종양 모델은 5x106 A549 세포를 오른쪽 어깨에 암세포를 trypsin-EDTA로 떼어내어 saline으로 두 번 세척한 다음 1x108 개의 세포를 주사기에 준비한 다음, 체중이 20-25 g인 5 주령 수컷 마우스 (BALB / c- 누드 마우스 (Orient Bio, Inc.)의 오른쪽 어깨에 암세포를 피하 주사하여 이식하였다. 2주 후 종양이 0.5 cm 직경에 도달했을 때, DMSO 대조군 (n=6), 60 mg / kg 게니핀 (n = 6), 30 mg / kg 엘레스클로몰 (n = 7) 단독투여 또는 60 mg / kg 게니핀 및 30 mg / kg 엘레스클로몰 병용투여 (n = 7)를 주 3 회 총 4 주 동안 수행하였다. 종양 크기 측정은 각 주사전에 캘리퍼(caliper)를 사용하여 수행하였으며, 총 6 - 7 마리 동물에 대해 두 번 반복하여 수행되었다.
7-2. 마우스 모델에 대한 암 치료효과 확인
상기 실시예 7-1에서 준비한 Balb/c 누드 마우스에 A549 인간 폐암세포 (human lung cancer cell)를 이식하여 암 이식 마우스 동물모델을 정립하였다.
그 결과, 4주간 진행된 예비 실험 (n=2)에서 도 7a에 나타낸 바와 같이 게니핀 (60 mg/kg, 3 times/week) 또는 엘레스클로몰 (30 mg/kg, 3 times/week)을 각각 단독 또는 병용으로 복강 내 투여한 경우, 대조군에 비하여 암 성장 (tumor growth)을 억제할 수 있음을 확인하였다.
또한, 4주간 진행된 본 실험 (n=7)에서도 게니핀 (60 mg/kg, 3 times/week) 또는 엘레스클로몰 (30 mg/kg, 3 times/week)을 각각 단독 또는 병용으로 복강 내 투여한 후, 암 성장 (tumor growth) 및 체중 변화를 측정하였다 그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 대조군 (DMSO) 및 게니핀 또는 엘레스클로몰의 단독 투여군에 비하여, 게니핀과 엘레스클로몰을 병용 투여한 군에서 암 성장 (tumor growth)이 유의적으로 억제됨을 확인하였다.
추가적으로, 마지막 투여 후 PET / CT 촬영을 통해 종양의 FDG 섭취량 (화살표 표시)에 따른 암 억제 효과를 확인하였다. 촬영을 위해, 꼬리 정맥을 통해 7.4MBq의 FDG를 주입한 다음, 1 시간 동안 isoflurane을 흡입시켜 마취시킨 다음, PET 이미지를 Inveon micro-PET 스캐너 (Siemens Healthineers)를 통해 촬영하였고, 비 감쇠 보정 단층 이미지(Non attenuation corrected tomographic image)는 Research Workplace 워크 스테이션 버전 4.2 (Siemens Healthineers)로 분석하여 나타내었다. 그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 게니핀 및 엘레스클로몰을 병용투여한 마우스 모델에서 가장 큰 종양 조직 억제효과가 나타났음을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 생채 내(in vivo)의 분자수준에서 게니핀 및 엘레스클로몰 병용투여 효과 확인
게니핀 및 엘레스클로몰의 병용투여에 의한 항암효과를 구체적으로 확인하기 위하여, 상기 실시예 7-2에서 PET 이미지 촬영한 마우스의 자궁 경부를 탈구시켜 마우스를 희생시킨 다음, 절제를 통하여 종양 조직을 수득하였다. 이렇게 수득한 이종 이식 종양 조직(xenograft tumor tissue)에서 UCP2의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 그 결과 도 8a에 나타낸 바와 같이, 게니핀 단독처리 군에서 UCP2의 발현 수준이 56.4 ± 12.0 %로 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, 치료가 끝난 세포에서 활동하고 있는 종양 세포의 수준을 측정하기 위해, LDH의 수준을 확인한 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 게니핀 및 엘레스클로몰 병용투여한 종양조직에서 가장 낮은 LDH 수준을 보여줌을 확인할 수 있어, 게니핀과 엘레스클로몰을 병용투여하여 암을 치료했을 때, 유의적인 효과가 나타남을 재확인할 수 있었다.
본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 게니핀을 투여하는 경우 ROS의 발현을 억제하는 UPC2의 수준을 억제함으로써, ROS의 발현 수준을 증가시키고, 엘레스클로몰 또한 ROS의 발현 수준을 증가시킴으로써, 이렇게 증가된 ROS가 종양 조직에 대해 세포사멸을 유도함으로써, 항암효과를 가진다는 사실을 확인하였고, 이러한 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 치차나무로부터 유래한 화합물인 천연물인 게니핀 (genipin) 및 기존에 흑색종 치료를 위해 사용되고 있던 엘레스클로몰 (elesclomol)의 병용투여에 의한 신규한 항암 효과에 관한 것으로서, 상기 두가지 화합물을 병용하여 투여함으로써 독성이 적고 뛰어난 항암효과를 가진 치료제를 개발할 수 있기에 본 발명에 따른 기술은 여러 암환자에 대한 치료제 개발 분야에서 광범위하게 활용될 수 있을 것이다.

Claims (7)

  1. 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 게니핀은 암세포의 포도당 대사를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 게니핀은 농도가 200 내지 300 uM이고,
    상기 엘레스클로몰은 농도가 0.05 내지 0.15 uM인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 암은 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 암세포에서 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)을 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법.
  7. 암의 치료 또는 개선용 조성물의 제조를 위한 게니핀 (genipin) 및 엘레스클로몰 (elesclomol)의 용도.
PCT/KR2021/001832 2020-02-14 2021-02-10 게니핀 및 엘레스클로몰을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2021162478A1 (ko)

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