WO2023113129A1 - Surf4 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Surf4 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2023113129A1
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surf4
inhibitor
cells
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cancer
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이동준
김자영
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부산대학교 산학협력단
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Definitions

  • It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hematological cancer comprising a SURF4 inhibitor.
  • Hematologic cancer is a comprehensive term for cancers occurring in components constituting blood, and refers to malignant tumors occurring in the blood, hematopoietic organs, lymph nodes, or lymphoid organs.
  • acute myeloid leukemia acute myeloid leukemia, AML
  • AML acute myeloid leukemia
  • hematological cancers have a high risk of metastasis and are difficult to treat because cancer cells travel through the blood. Therefore, for the treatment of blood cancer, chemotherapy is mostly performed, and bone marrow transplantation, local radiation therapy, and local surgery are performed concurrently, but chemotherapy is still limited, and many side effects appear in conventional treatment methods. am.
  • paclitaxel and tunicamycin were used as anticancer drugs, but the reality is that there is no master gene that induces synergistic cell death besides these two drugs, and the specific function in anticancer action has not been identified. .
  • One aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating hematological cancer containing a surface locus protein 4 (SURF4) inhibitor.
  • SURF4 surface locus protein 4
  • Another aspect is to provide a health functional food for preventing or improving blood cancer containing a SURF4 (Surfeit locus protein 4) inhibitor.
  • SURF4 Sturfeit locus protein 4
  • Another aspect is to provide a method for preventing or treating hematological cancer, comprising administering a surface locus protein 4 (SURF4) inhibitor to a subject in need thereof.
  • SURF4 surface locus protein 4
  • Another aspect is to provide a use of a surface locus protein 4 (SURF4) inhibitor for the manufacture of a medicament for preventing or treating hematological malignancies.
  • SURF4 surface locus protein 4
  • One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hematological cancer comprising a surface locus protein 4 (SURF4) inhibitor.
  • SURF4 surface locus protein 4
  • the SURF4 inhibitor may be at least one selected from the group consisting of polypeptides, polynucleotides and compounds. Specifically, the SURF4 inhibitor may be at least one selected from the group consisting of short hairpin RNA (shRNA), small interfering RNA (siRNA), and micro RNA (miRNA), and more specifically, may be shRNA.
  • shRNA short hairpin RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • miRNA micro RNA
  • the SURF4 inhibitor may be derived from nature or may be synthesized according to conventional methods in the art. As an example, it may be prepared using polynucleotide recombination and a protein expression system, or synthesized in vitro through chemical synthesis such as peptide synthesis, and cell-free protein synthesis. Also as an example, the polypeptide may be a peptide, an extract of plant-derived tissues or cells, a product obtained by culturing a microorganism (eg bacteria or fungi, and particularly yeast).
  • a microorganism eg bacteria or fungi, and particularly yeast
  • the SURF4 inhibitor when it is a polynucleotide or polypeptide, it may be a culture of cells genetically engineered to express the SURF4 inhibitor.
  • polynucleotide refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides may also be included.
  • polypeptide means a polymer composed of two or more amino acids linked by amide bonds (or peptide bonds).
  • expression includes any function by which the coded information of a gene is present in a cell and is converted into a structure that operates in the cell.
  • genetic engineering or “genetically engineered” refers to the act of introducing one or more genetic modifications to a cell or to a cell made thereby.
  • the cell genetically engineered to express the SURF4 inhibitor may be a cell transfected with a vector encoding a gene expressing the SURF4 inhibitor.
  • the genetic manipulation is performed by transfecting cells with a virus for transformation containing a vector containing a gene encoding the SURF4 inhibitor, and then in a cell culture medium containing the virus for transformation expressed by the cells. It is administered or treated to blood cancer cells, and the SURF4 inhibitor is expressed to induce apoptosis of blood cancer cells, thereby exhibiting a preventive or therapeutic effect on blood cancer.
  • "Vector” means a means for expressing a gene of interest in a host cell. Examples include viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.
  • the virus for transformation includes, for example, adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus or lentivirus.
  • transformation means that the genetic properties of an organism are changed by DNA given from the outside, and means introducing a gene into a host cell so that it can be expressed in the host cell.
  • Transfection is a technique of transplanting DNA given from the outside into cells.
  • DNA a type of nucleic acid extracted from a cell of a certain lineage (excluding virus cells) of an organism, is injected into a living cell of another lineage, the DNA is transformed into that cell. It is a phenomenon in which genetic traits change. That is, it means introducing a specific gene into a host cell so that it can be expressed in the host cell.
  • cell culture refers to a population of cells suspended in a medium under conditions suitable for the survival and/or proliferation of the cell population. It can also mean a mixture containing a population of cells and a medium in which the population is suspended.
  • the cell culture may be cultured using a method known in the art, and additives necessary for survival and culturing of target cells may be appropriately added to the cell culture.
  • the term “medium” refers to a nutrient-containing solution that nourishes proliferating cells. Such solutions generally provide essential and non-essential amino acids, vitamins, energy sources, lipids and trace elements necessary for minimal proliferation and/or survival of the cells. In addition, the solution may further contain ingredients that enhance proliferation and/or survival beyond a minimum rate, including hormones and growth factors. This solution is preferably prepared at a pH and salt concentration optimal for cell viability and proliferation.
  • the medium may also be a “synthetic medium,” i.e., a serum-free medium completely free of components, proteins, or hydrolysates of an unknown composition. Synthetic media are free of components of animal origin, and all components are components with known chemical structures.
  • the SURF4 inhibitor may increase reactive oxygen species (ROS) in hematological cancer cells, and for example, the SURF4 inhibitor may increase hydrogen peroxide in hematological cancer cells, It may be to increase at least one selected from the group consisting of superoxide anion, hydroxyl radical, lipid peroxide, nitric oxide, and peroxynitrite.
  • ROS reactive oxygen species
  • the SURF4 inhibitor may increase the expression of pSTAT6 in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor acts synergistically with IL4, which increases the expression of pSTAT6 in hematological cancer cells, to further increase the expression of pSTAT6, thereby significantly increasing the apoptosis of hematological cancer cells. it could be
  • the SURF4 inhibitor may regulate the amount of phosphorylated protein in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor may increase the expression of a cell necrosis regulator in hematological cancer cells and decrease the expression of a regulator that promotes cell growth and proliferation in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor can increase the expression of pJNK, a cell necrosis regulator in hematological cancer cells, and decrease the expression of pERK and pAKT, which are cell growth and proliferation promotion regulators, in hematological cancer cells.
  • apoptosis regulator in the hematological cancer cell increases, apoptosis of the hematological cancer cell can be increased, and as the expression of the cell growth and proliferation promoting regulator in the hematological cancer cell decreases, the hematological cancer cell of cell growth may be reduced.
  • the hematological cancer is acute myeloid leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia (CML), Abelson's oncogene-associated CML (Bcr-ABL translocation), myelodysplastic syndrome (MDS), acute B lymphoblastic Leukemia (B-ALL), Acute T-Lymphoblastic Leukemia (T-ALL), Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL), Multiple Myeloma (MM), Myeloproliferative Tumors (MPN), Richter Syndrome, Richter Transformation of CLL, Hairy Cell Leukemia (HCL), Blastoid Plasma Cell Dendritic Cell Neoplasia (BPDCN), Non-Hodgkin's Lymphoma (NHL), Mantle Cell Lymphoma (MCL), Small Lymphocytic Lymphoma (SLL), Hodgkin's Lymphoma, Systemic Mastocytosis and Burkitt It may be at least one selected from the group consisting of
  • the hematological cancer may be at least one selected from the group consisting of acute myelogenous leukemia, chronic myeloid leukemia, acute B lymphoblastic leukemia and acute T lymphoblastic leukemia, and more specifically, acute myelogenous leukemia and chronic myelogenous leukemia. It may be at least one selected from the group consisting of leukemia.
  • cancer refers to a class of diseases characterized by the development of abnormal cells that proliferate uncontrollably and have the ability to invade and destroy normal body tissue.
  • blood cancer is a comprehensive term for cancers occurring in components constituting blood, and refers to malignant tumors occurring in the blood, hematopoietic organs, lymph nodes, or lymphoid organs.
  • the SURF4 inhibitor may not exhibit a preventive or therapeutic effect on solid cancer. Specifically, cultures of cells genetically engineered to express the SURF4 inhibitor may not induce apoptosis of solid cancer cells, unlike blood cancer cells.
  • solid cancer has characteristics that distinguish it from hematological malignancies, and include those of the bladder, breast, intestine, kidney, lung, liver, brain, esophagus, gallbladder, ovary, pancreas, stomach, cervix, thyroid, prostate and It refers to cancer consisting of a mass caused by abnormal cell growth in various solid organs such as the skin, and the solid cancer includes, for example, colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, liver cancer, stomach cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, It may be at least one selected from the group consisting of kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, cervical cancer, endometrial cancer, chorionic cancer, ovarian cancer, breast cancer, thyroid cancer, brain cancer, head and neck cancer, and malignant melanoma, and more specifically The solid cancer may be at least one selected from the group consisting of prostate cancer, cervical cancer, ovarian cancer, breast cancer, and colorectal cancer.
  • prevention may refer to any action that suppresses or delays the onset of hematological cancer in a subject by administration of a pharmaceutical composition according to one aspect.
  • treatment may refer to any activity that improves or beneficially changes symptoms of hematological cancer of a subject by administration of the pharmaceutical composition according to one aspect.
  • administration means introducing a predetermined substance into an individual by an appropriate method
  • subject refers to all organisms such as rats, mice, livestock, and the like, including humans that may have hematologic malignancies. As a specific example, it may be mammals including humans.
  • the pharmaceutical composition may be provided as a pharmaceutical composition including an active ingredient alone or one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the carrier may be, for example, a colloidal suspension, powder, saline solution, lipid, liposome, microspheres or nano-spherical particles. They may be complexed with or associated with the delivery vehicle and are known in the art such as lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation reagents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances or fatty acids. It can be delivered in vivo using known delivery systems.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used lubricants, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc.
  • Solid preparations for oral administration may include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations may contain at least one excipient in the composition, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or by mixing lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, preservatives, etc. may be included in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents.
  • Formulations for parenteral administration may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • suppositories As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycero-geratin, etc. may be used, and when prepared in the form of eye drops, known diluents or excipients may be used. there is.
  • the pharmaceutical composition may further include an anticancer agent.
  • the pharmaceutical composition may be provided in a mixture with a conventionally known composition for preventing or treating cancer or another existing anticancer agent, and the other anticancer agent is a conventionally known composition for preventing or treating cancer, an existing anticancer agent, or a new anticancer agent. It may be an anti-cancer drug being developed.
  • the pharmaceutical composition further includes an anticancer agent
  • the anticancer agent may be at least one selected from the group consisting of, for example, paclitaxel and tunicamycin.
  • the SURF4 inhibitor may increase the expression of apoptosis-related proteins and/or endoplasmic reticulum stress-related genes in blood cancer cells more than the case of the anticancer agent alone.
  • the SURF4 inhibitor when the pharmaceutical composition further includes an anticancer agent and the anticancer agent includes paclitaxel, the SURF4 inhibitor can increase the expression of apoptosis-related proteins in blood cancer cells more than paclitaxel alone.
  • the pharmaceutical composition further includes an anticancer agent, and the anticancer agent includes tunicamycin when the pharmaceutical composition further includes an anticancer agent, and the anticancer agent includes tunicamycin, the SURF4 inhibitor can further increase the expression of endoplasmic reticulum stress-related genes in hematological cancer cells than in the case of tunicamycin alone. there is.
  • the SURF4 inhibitor inhibits at least one protein selected from the group consisting of Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3, and PARP in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor is PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), and eIF2 ⁇ in blood cancer cells.
  • apoptosis of blood cancer cells can be further increased.
  • at least one gene selected from the group consisting of (eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇ ), activating transcription factor 4 (ATF4), and C/EBP homologous protein (CHOP) By increasing the expression of at least one gene selected from the group consisting of (eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇ ), activating transcription factor 4 (ATF4), and C/EBP homologous protein (CHOP), apoptosis of blood cancer cells can be further increased.
  • ATF4 activating transcription factor 4
  • C/EBP homologous protein C/EBP homologous protein
  • the pharmaceutical composition may be administered alone or in combination with the anticancer agent.
  • the pharmaceutical composition may be administered in parallel with a known composition or other anticancer agent having an effect of preventing or treating cancer, may be administered simultaneously, separately, or sequentially, and may be administered singly or in multiple doses. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the anticancer agent may be at least one selected from the group consisting of, for example, paclitaxel and tunicamycin.
  • the SURF4 inhibitor can further increase the expression of apoptosis-related proteins and/or endoplasmic reticulum stress-related genes in hematological cancer cells than when the anticancer agent is administered alone.
  • the SURF4 inhibitor when the pharmaceutical composition is administered in combination with an anticancer agent and the anticancer agent includes paclitaxel, the SURF4 inhibitor can increase the expression of apoptosis-related proteins in hematological cancer cells more than when paclitaxel is administered alone.
  • the SURF4 inhibitor when the pharmaceutical composition is administered in combination with an anticancer agent, and the anticancer agent includes tunicamycin, the SURF4 inhibitor can further increase the expression of endoplasmic reticulum stress-related genes in hematological cancer cells than when tunicamycin is administered alone. can
  • the SURF4 inhibitor inhibits at least one protein selected from the group consisting of Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 and PARP in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor inhibits at least one protein selected from the group consisting of Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 and PARP in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor is PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ in hematological cancer cells
  • PKI eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇
  • ATF4 activating transcription factor 4
  • C/EBP homologous protein CHOP
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, external skin or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraarterial injection, intramedullary injection, intracardiac injection , Intrathecal injection, transdermal injection, intranasal injection, intraenteric injection, local injection, sublingual injection, intrarectal injection or intrathoracic injection can be selected.
  • the pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level depends on the type and severity of the patient's disease, the activity of the drug, and the drug. sensitivity, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitantly used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the anticancer agent when the anticancer agent is paclitaxel, the anticancer agent is 0.1 to 1.0 ⁇ M, 0.1 to 0.8 ⁇ M, 0.1 to 0.6 ⁇ M, 0.2 to 1.0 ⁇ M, 0.2 to 0.8 ⁇ M, 0.2 to 0.6 ⁇ M, 0.4 to 1.0 ⁇ M, It may be administered at a concentration of 0.4 ⁇ M to 0.8 ⁇ M or 0.4 to 0.6 ⁇ M.
  • the anticancer agent When the anticancer agent is administered at a concentration of less than 0.1 ⁇ M, the apoptosis effect of blood cancer cells may be reduced, and when administered at a concentration of more than 1.0 ⁇ M, death of normal cells other than blood cancer cells may be enhanced.
  • the anticancer agent when the anticancer agent is tunicamycin, is 1 to 20 ⁇ g/ml, 1 to 15 ⁇ g/ml, 1 to 13 ⁇ g/ml, 5 to 20 ⁇ g/ml, 5 to 15 ⁇ g/ml ml, 5 to 13 ⁇ g/ml, 7 to 20 ⁇ g/ml, 7 to 15 ⁇ g/ml or 7 to 13 ⁇ g/ml.
  • the anticancer agent When the anticancer agent is administered at a concentration of less than 1 ⁇ g/ml, the apoptosis effect of blood cancer cells may be reduced, and when administered at a concentration of more than 20 ⁇ g/ml, death of normal cells outside of blood cancer cells may be enhanced.
  • the administration of the anticancer agent is 3 to 14 days, 3 to 12 days, 3 to 11 days, 5 to 14 days, 5 to 12 days, 5 to 11 days, 6 to 14 days It may be administered after 1 day, 6 to 12 days or 6 to 11 days.
  • the anticancer agent When the anticancer agent is administered for less than 3 days or more than 14 days after administration of the SURF4 inhibitor, compared to the case where the anticancer agent is administered 7 to 10 days after administration of the SURF4 inhibitor, superior cell A synergistic effect on the preventive or therapeutic effect of hematologic malignancies showing apoptosis may not appear.
  • the administration of the pharmaceutical composition may be administered once a day or divided into several times. For example, it may be administered every other day or may be administered one day a week.
  • Another aspect provides a health functional food for preventing or improving blood cancer containing a SURF4 (Surfeit locus protein 4) inhibitor.
  • SURF4 Sturfeit locus protein 4
  • the "SURF4 inhibitor”, "blood cancer”, “prevention” and the like may be within the aforementioned range.
  • the term "improvement” can mean any action that at least reduces the severity of a parameter associated with the condition being treated, eg, a symptom.
  • the health functional food may be used simultaneously with or separately from a drug for treatment before or after the onset of the disease in order to prevent or improve blood cancer.
  • the active ingredient may be added to food as it is or used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the purpose of its use (for prevention or improvement).
  • the health functional food may be added in an amount of about 15% by weight or less, more specifically about 10% by weight or less, based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range.
  • the health functional food may be formulated as one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules and liquid formulations by further including one or more of carriers, diluents, excipients and additives.
  • carriers diluents, excipients and additives.
  • Examples of foods to which a compound according to one aspect may be added include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health functional foods, and the like.
  • carrier examples include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, erythritol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, and microcrystalline cellulose.
  • the health functional food may contain other ingredients as essential ingredients without particular limitation.
  • it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like a normal beverage.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents thaumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the ratio of the natural carbohydrates can be appropriately determined by a person skilled in the art.
  • the health functional food is various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof , alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, and the like.
  • vitamins, minerals electrophilic acids
  • flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.
  • pectic acid and salts thereof alginic acid and its salts
  • organic acids protective colloidal thickeners
  • pH regulators pH regulators
  • stabilizers stabilizers
  • preservatives glycerin
  • alcohol carbonating agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the health functional food may further include a health functional food for preventing or improving cancer.
  • the health functional food may be provided in combination with a conventionally known health functional food for preventing or improving cancer or a newly developed health functional food for preventing or improving cancer.
  • the health functional food further includes a health functional food for preventing or improving cancer
  • the health functional food for preventing or improving cancer includes, for example, at least one selected from the group consisting of paclitaxel and tunicamycin. It can be food.
  • the SURF4 inhibitor is a cell death-related protein and/or endoplasmic reticulum in blood cancer cells more than a health functional food for preventing or improving cancer alone. It may be to further increase the expression of stress-related genes.
  • the SURF4 inhibitor is a health functional food for preventing or improving cancer. It is possible to increase the expression of apoptosis-related proteins in blood cancer cells more than in the case of functional food alone.
  • the health functional food further includes a health functional food for preventing or improving cancer, and the health functional food for preventing or improving cancer includes tunicamycin
  • the SURF4 inhibitor is used to prevent or improve cancer. It can increase the expression of endoplasmic reticulum stress-related genes in blood cancer cells more than in the case of health functional food alone.
  • the SURF4 inhibitor is Cleaved Caspase 9 in blood cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor is Cleaved Caspase 9 in blood cancer cells.
  • the health functional food further includes a health functional food for preventing or improving cancer
  • the health functional food for preventing or improving cancer includes tunicamycin
  • the SURF4 inhibitor is PERK ( At least one gene selected from the group consisting of PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇ ), ATF4 (activating transcription factor 4), and CHOP (C/EBP homologous protein)
  • the health functional food may be consumed alone or in combination with the health functional food for preventing or improving cancer.
  • the health functional food may be ingested in parallel with a known composition having an effect of preventing or improving cancer or other health functional food for preventing or improving cancer, and may be ingested simultaneously, separately, or sequentially, single or multiple. can be ingested. Taking all of the above factors into consideration, it is important to consume an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the health functional food for preventing or improving cancer includes, for example, at least one selected from the group consisting of paclitaxel and tunicamycin. It can be food.
  • the SURF4 inhibitor When the health functional food is consumed in combination with a health functional food for preventing or improving cancer, the SURF4 inhibitor has apoptosis-related protein and/or Alternatively, expression of endoplasmic reticulum stress-related genes may be further increased.
  • the SURF4 inhibitor when the health functional food is consumed together with a health functional food for preventing or improving cancer, and the health functional food for preventing or improving cancer contains paclitaxel, the SURF4 inhibitor is a health functional food for preventing or improving cancer. It is possible to increase the expression of apoptosis-related proteins in blood cancer cells more than when functional foods are consumed alone. In addition, when the health functional food is consumed in combination with a health functional food for preventing or improving cancer, and the health functional food for preventing or improving cancer includes tunicamycin, the SURF4 inhibitor is used to prevent or improve the cancer. It is possible to increase the expression of endoplasmic reticulum stress-related genes in blood cancer cells more than when a health functional food is consumed alone.
  • the SURF4 inhibitor is Cleaved Caspase9 in blood cancer cells.
  • the expression of at least one protein selected from the group consisting of Cleaved Caspase3 and PARP apoptosis of blood cancer cells can be further increased.
  • the SURF4 inhibitor is PERK ( At least one gene selected from the group consisting of PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇ ), ATF4 (activating transcription factor 4), and CHOP (C/EBP homologous protein)
  • PKR-like endoplasmic reticulum kinase At least one gene selected from the group consisting of PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇ ), ATF4 (activating transcription factor 4), and CHOP (C/EBP homologous protein)
  • Another aspect provides a method for preventing or treating hematological cancer comprising administering a SURF4 inhibitor to a subject in need thereof.
  • the "SURF4 inhibitor”, "subject”, “administration”, “blood cancer”, “prevention”, “treatment” and the like may be within the above-described range.
  • the method may be administered to a subject in need of the SURF4 inhibitor alone or in combination with an anticancer agent.
  • the method may be administered in parallel with a known composition or other anticancer agent having a preventive or therapeutic effect on cancer, may be administered simultaneously, separately, or sequentially, and may be single or multiple administrations. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the anticancer agent may be at least one selected from the group consisting of, for example, paclitaxel and tunicamycin.
  • the SURF4 inhibitor can further increase the expression of apoptosis-related proteins and/or endoplasmic reticulum stress-related genes in hematological cancer cells than when the anticancer agent is administered alone.
  • the method is a combination administration of an anticancer agent, and when the anticancer agent includes paclitaxel, the SURF4 inhibitor can increase the expression of apoptosis-related proteins in blood cancer cells more than when paclitaxel is administered alone.
  • the SURF4 inhibitor when the method is a combination administration of an anticancer agent, and the anticancer agent includes tunicamycin, the SURF4 inhibitor can further increase the expression of endoplasmic reticulum stress-related genes in hematological cancer cells than when tunicamycin is administered alone. there is.
  • the method is a combination administration of an anticancer agent, and when the anticancer agent includes paclitaxel, the SURF4 inhibitor expresses at least one protein selected from the group consisting of Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3, and PARP in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor expresses at least one protein selected from the group consisting of Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3, and PARP in hematological cancer cells.
  • the SURF4 inhibitor is PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), eIF2 ⁇ (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2 ⁇ (inositol
  • Another aspect provides use of a SURF4 inhibitor for the manufacture of a medicament for preventing or treating hematological cancer.
  • the "SURF4 inhibitor”, "blood cancer”, “prevention”, “treatment” and the like may be within the above-described range.
  • inhibition of SURF4 increases the expression of pJNK and decreases the expression of pERK and pAKT, thereby increasing apoptosis of blood cancer cells.
  • SURF4 is inhibited along with the administration of conventional anticancer drugs, a synergistic effect showing more significant apoptosis than when administered with conventional anticancer drugs was confirmed, and thus it can contribute to the hematological cancer treatment market/industry.
  • Figure 1 is a diagram showing qRT-PCR analysis for confirming SURF4 gene expression in THP1, HL60 and K562 cell lines injected with SURF4 shRNA (error bars indicate standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • Figure 2 is a diagram showing the number and apoptosis measurement of THP1, HL60 and K562 cells injected with SURF4 shRNA (error bars represent the standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • Figure 3 is a diagram showing the expression confirmation of pJNK, JNK, and BAX using Western blot in THP1 cells injected with SURF4 shRNA (left), and qRT-PCR analysis for confirming SURF4 gene expression in the THP1 cell line injected with SURF4 shRNA It is a diagram (right) (error bars indicate standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • FIG. 4a to 4c show normalized fold change measurements of MFI for phosphorylated proteins in HL60 and THP1 cells injected with SURF4 shRNA. It is a diagram showing the results of measuring the normalized fold change of MFI for phosphorylated protein, and FIG. 4b is a diagram showing the degree of apoptosis of THP1, HL60, and K562 cells injected with SURF4 shRNA through FACS (error bars are the average Standard errors are indicated (** p ⁇ 0.01)).
  • FIG. 5a to 5b show the results of measuring apoptosis after treatment with paclitaxel in myeloid leukemia cells injected with SURF4 shRNA.
  • FIG. 5a is the result of measuring apoptosis of THP1 cells
  • FIG. It is a result of measuring cell apoptosis
  • FIG. 5c is a diagram showing the result of measuring apoptosis of K562 cells (error bars represent the standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • Figure 6 is a diagram showing the results of confirming the expression of Caspase3, Cleaved Caspase3, and PARP in THP1 cells injected with SURF4 shRNA by Western blot (error bars indicate standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • FIG. 7a to 7c show the results of measuring apoptosis after treatment with tunicamycin in myeloid leukemia cells injected with SURF4 shRNA.
  • FIG. 7a is the result of measuring apoptosis of THP1 cells
  • FIG. 7b is It is the result of measuring apoptosis of HL60 cells
  • FIG. 7c is a diagram showing the result of measuring apoptosis of K562 cells (error bars represent the standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • Figure 8 is a diagram showing the results of confirming the expression of PERK, peIF2 ⁇ , eIF2 ⁇ , ATF4, and CHOP by Western blot in THP1 cells injected with SURF4 shRNA, and confirming CHOP expression by qRT-PCR (error bars are the standard error of the mean). (** p ⁇ 0.01)).
  • Figure 9 is a diagram showing the results of confirming the growth inhibition of myeloid leukemia cells injected with SURF4 shRNA, and specifically showing the results of measuring the normalized fold change quantification of MFI for myeloid differentiation (CD11b+) (error bars indicate Standard error of the mean is indicated (** p ⁇ 0.01)).
  • Figure 10 is a diagram showing the results of confirming the growth inhibition of myeloid leukemia cells injected with SURF4 shRNA, and specifically showing the results of measuring the normalized fold change quantification of MFI for reactive oxygen species (ROS) (error bars indicates the standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • ROS reactive oxygen species
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of confirming the growth inhibition of myeloid leukemia cells injected with SURF4 shRNA, specifically showing the results of confirming the occurrence of tumors in a xenograft model using NOD-SCID mice (error bars are the average Standard error of (** p ⁇ 0.01)).
  • Figure 12 is a diagram showing IL4-STAT6 and STING-dependent apoptosis in myeloid leukemia cells injected with SURF4 shRNA. This is a diagram showing the results of confirming expression (error bars indicate standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of measuring the normalized fold change quantification of MFI for pSTAT6 in Mll-Af9 leukemia cells of mice injected with Surf4 sgRNA (error bars indicate standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of measuring apoptosis after treatment with IL4 in THP1 and HL60 cells injected with SURF4 shRNA. Specifically, FIG. 14a is THP1 cells and FIG. Marks error (** p ⁇ 0.01)).
  • FIG. 15a and 15b are views showing IL4-STAT6 and STING-dependent apoptosis in SURF4 shRNA-injected myeloid leukemia cells. Specifically, FIG. 15a shows apoptosis results in SURF4 shRNA-injected myeloid leukemia cells.
  • Figure 15b is a diagram showing the results of apoptosis and expression of pTBK1 after treatment with cGAMP (error bars represent the standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • 16 is a schematic diagram showing that SURF4 regulates the functions of STAT6 and STING and inhibits the differentiation and apoptosis of myeloid leukemia cells.
  • Figure 17 is a diagram showing the difference in apoptosis according to SURF4 expression in solid cancer cells, specifically showing the number of PC3 and HeLa cells injected with SURF4 shRNA (error bars indicate the standard error of the mean (* *p ⁇ 0.01)).
  • FIGS. 18a to 18c are diagrams showing the difference in apoptosis according to SURF4 expression in solid cancer cells, specifically, FIG. 18a is a diagram showing the results of measuring apoptosis in A2780 cells injected with SURF4 shRNA, and FIG. 18b is Figure 18c shows the expression of pJNK and JNK in A2780, DLD1, PC3, MCF7 and HCT116 cells injected with the HA-SURF4 overexpressing vector using Western blotting. This is a diagram showing the result of confirming expression by Western blot (error bars indicate standard error of the mean (** p ⁇ 0.01)).
  • SURF4 gene expression was examined in myeloid leukemia cell lines injected with SURF4 shRNA.
  • THP1 human monocyte cell line
  • HL60 acute myeloid leukemia cell line
  • K562 chronic myeloid leukemia cell line
  • the cell culture medium containing the lentivirus expressed by the 293T cells was infected with THP1, HL60 and K562 cell cultures were co-injected. Thereafter, RNA was extracted from cells using an RNA extraction kit to confirm SURF4 gene expression in each of the injected cell lines, and cDNA was synthesized from RNA using a cDNA synthesis kit. qRT-PCR analysis was performed using the synthesized cDNA, SURF4 primer, and SYBR-green.
  • the SURF4 gene expression in the myeloid leukemia cell line injected with SURF4 shRNA decreased about 2-fold compared to the control group (Fig. 1a: THP1 cells, Fig. 1b: HL60 cells, Fig. 1c: K562 cells).
  • Fig. 1a THP1 cells
  • Fig. 1b HL60 cells
  • Fig. 1c K562 cells
  • Fig. 2 apoptosis of cells injected with SURF4 shRNA every 2 days.
  • Example 1.-(1) Western blotting was performed to confirm the amount of protein in THP1 cells injected with SURF4 shRNA.
  • the injected SURF4 shRNA is the same as in Example 1.-(1). Specifically, cells were lysed with Lysis buffer, proteins were extracted, separated on a 10% SDS-PAGE gel, and transferred to a membrane.
  • pJNK, JNK, BAX Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1 ⁇ , GRP78, PERK, peIF2 ⁇ , eIF2 ⁇ , ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 and Actin antibodies, respectively, were added and incubated at 4°C for 16 hours. After leaving, a secondary antibody was added, left at room temperature for 1 hour, and then reacted with ECL and measured with a chemiluminescence image analyzer.
  • the amount of phosphorylated proteins in HL60 and THP1 cell lines injected with SURF4 shRNA was measured by flow cytometry.
  • the injected SURF4 shRNA is the same as in Example 1.-(1).
  • the cells are collected, put in 1% paraformaldehyde, left at 4°C for 30 minutes, washed, and then put in 95% methanol and left at 4°C for 30 minutes. Thereafter, the primary antibodies of pJNK, pERK, and pAKT were added at 4°C for 30 minutes, the secondary antibody (Alexa Fluor 488) was added, and left at 4°C for 30 minutes, followed by measurement using a flow cytometer (FACS).
  • FACS flow cytometer
  • Apoptosis was measured after paclitaxel treatment in THP1, HL60 and K562 cells injected with SURF4 shRNA.
  • the injected SURF4 shRNA is the same as in Example 1.-(1), specifically, the concentration of paclitaxel treated in THP1, HL60 and K562 cells was 0.5 ⁇ M, and after injecting SURF4 shRNA, paclitaxel was injected 7 to 10 days later. was processed. Then, each cell was collected, released with Annexin V binding buffer, and then Annexin V-FITC and 7AAD were added and measured by FACS flow cytometry.
  • paclitaxel an anticancer drug
  • apoptosis was increased more than when control cells were treated with only paclitaxel alone (Fig. 5a: THP1 cells
  • FIG. 5b HL60 cells
  • FIG. 5c K562 cells).
  • Cleaved Caspase9 Cleaved Caspase9
  • Cleaved Caspase3 PARP, which are related to apoptosis, were confirmed by Western blotting in THP1 cells injected with SURF4 shRNA. Cells were lysed with Lysis buffer, proteins were extracted, separated on a 10% SDS-PAGE gel, and transferred to a membrane.
  • pJNK, JNK, BAX Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1 ⁇ , GRP78, PERK, peIF2 ⁇ , eIF2 ⁇ , ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 and Actin antibodies, respectively, were added and incubated at 4°C for 16 hours. After leaving, a secondary antibody was added, left at room temperature for 1 hour, and then reacted with ECL and measured with a chemiluminescence image analyzer.
  • Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3, and PARP were also found to increase more in cells injected with SURF4 shRNA than in cells treated with paclitaxel alone (FIG. 6).
  • Apoptosis was measured after treatment with tunicamycin in THP1, HL60 and K562 cells injected with SURF4 shRNA.
  • the injected SURF4 shRNA is the same as in Example 1.-(1), specifically, the concentration of tunicamycin treated in THP1, HL60 and K562 cells is 10 ⁇ g/ml, and after injecting SURF4 shRNA, After 10 days, tunicamycin was treated. Thereafter, each cell was collected and released with Annexin V binding buffer, followed by addition of Annexin V-FITC and 7AAD, followed by FACS flow cytometry.
  • FIG. 7a THP1 cells
  • FIG. 7b HL60 cells
  • Figure 7c K562 cells
  • pJNK, JNK, BAX Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1 ⁇ , GRP78, PERK, peIF2 ⁇ , eIF2 ⁇ , ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 and Actin antibodies, respectively, were added and incubated at 4°C for 16 hours. After leaving, a secondary antibody was added, left at room temperature for 1 hour, and then reacted with ECL and measured with a chemiluminescence image analyzer.
  • Flow cytometry was performed to quantify the normalized fold change of MFI for myeloid differentiation (CD11b+) of THP1 and HL60 cells injected with SURF4 shRNA.
  • the injected SURF4 shRNA was the same as in Example 1.-(1), and CD11b+ was measured by adding CD11b+ PE-Cy7 antibody to the cells, incubating them at 4° C. for 30 minutes, and then analyzing by flow cytometry (FACS).
  • Flow cytometry was performed to quantify the normalized fold change of MFI for reactive oxygen species (ROS) in THP1 and HL60 cells injected with SURF4 shRNA.
  • the injected SURF4 shRNA is the same as in Example 1.-(1), and the measurement of reactive oxygen species is measured by flow cytometry (FACS) after adding DCFDA (2', 7-dichlorofluorescin diacetate) to the cells and leaving them at 37 ° C for 30 minutes. did
  • HL60 cells injected with SURF4 shRNA were subcutaneously injected into mice, and tumor sizes were measured for 30 days.
  • the injected SURF4 shRNA is the same as in Example 1.-(1), and 5 ⁇ 10 6 HL60 cells were resuspended in 100 ⁇ l of media and mixed with 200 ⁇ l of Vitrogel hydrogel matrix (Bio-gems) to obtain a total of 300 ⁇ l. Mice were injected subcutaneously.
  • the size of the tumor in the control group was significantly increased compared to the case where cells injected with SURF4 shRNA were injected.
  • the expression of Surf4 was decreased by Surf4 shRNA in leukemia cells in which the Mll-Af9 gene was injected into mouse bone marrow cells, it was confirmed that bone marrow differentiation was increased and the amount of pAKT decreased (FIG. 11).
  • THP1 and HL60 cells injected with 6 ⁇ g of SURF4 shRNA were treated with IL4 (5 ng/ml) for 60 minutes to dissolve, followed by Western blotting, and SURF4 expression in THP1 and HL60 cells injected with SURF4 shRNA was measured. It was measured by qRT-PCR. Cells were lysed with Lysis buffer, proteins were extracted, separated on a 10% SDS-PAGE gel, and transferred to a membrane.
  • FIG. 14A THP1 cells
  • FIG. 14B HL60 cells
  • apoptosis caused by a decrease in SURF4 expression is related to IL4-pSTAT6.
  • Annexin V-FITC and 7AAD were added to measure apoptosis with a FACS flow cytometer, the cells were lysed with Lysis buffer, and proteins were extracted, followed by 10% SDS-PAGE It was separated from the gel and transferred to a membrane.
  • pJNK, JNK, BAX Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1 ⁇ , GRP78, PERK, peIF2 ⁇ , eIF2 ⁇ , ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 and Actin antibodies, respectively, were added and incubated at 4°C for 16 hours. After leaving, a secondary antibody was added, left at room temperature for 1 hour, and then reacted with ECL and measured with a chemiluminescence image analyzer.
  • the purpose of this study was to confirm the difference in apoptosis according to the expression of SURF4 in solid cancer cells and hematological cancer cells.
  • the cell lines used in the experiment were PC3 (prostate cancer), HeLa (cervical cancer), A2780 (ovarian cancer), MCF7 (breast cancer), and DLD1 and HCT116 (colorectal cancer), and the number of PC3 cells and HeLa cells injected with SURF4 shRNA As a result of measuring for 3 days, there was no difference in cell growth according to the expression of SURF4 (FIG. 17a: PC3 cells, FIG. 17b: HeLa cells).

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Abstract

일 양상은 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 조성물은 SURF4를 억제하여, pJNK의 발현이 증가되며, pERK, pAKT의 발현이 감소됨에 따라, 혈액암 세포의 세포사멸이 증가시켜 혈액암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 일 양상에 따른 조성물을 기존 항암제 함께 투여함으로써, 기존 항암제 투여 시 보다 현저한 세포사멸을 나타내는 시너지 효과를 확인하였는 바, 혈액암 치료 시장/산업에 이바지할 수 있다.

Description

SURF4 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
SURF4 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
혈액암이란 혈액을 구성하는 성분에 생긴 암을 포괄적으로 이르는 말로 혈액이나, 조혈기관, 림프절, 림프기관 등에 발생한 악성 종양을 의미한다.
최근에 들어 혈액암 중 백혈병뿐만 아니라 다발골수종, 림프종, 골수형성이상증후군, 골수증식종양 등의 빈도가 급격히 증가하고 있다. 2015년 국가암등록통계(보건복지부 중앙암등록본부)에 따르면 혈액암 환자는 전체 암의 약 5.2%를 차지하며, 최근 10년간 주요 혈액암 종별 신규 환자 수 증가 추이를 보면 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma) 이 89%, 다발골수종 (multiple myeloma) 이 122% 증가로, 같은 기간 전체 암 환자 수 증가율인 51%를 훨씬 상회하고 있다. 또한, 백혈병은 어린아이보다 성인에서 10배 정도 높게 발생된 것으로 보이고, 특히 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia, AML) 은 성인의 급성 백혈병 중 가장 흔한 형태로서 급성 백혈병의 65%를 차지한다. 이와 같이 혈액암은 성인에서 발병률이 더 높아 고령화가 진행됨에 따라 혈액암의 유병률과 사망률이 지속적으로 높아지는데, 우리나라도 고령화가 진행됨에 따라 혈액암 발생 빈도가 증가해 향후 10% 수준까지 올라갈 것으로 전망된다.
혈액암은 간암·폐암과 같이 특정 장기에 종양이 생기는 고형암과는 달리 암세포가 혈액을 타고 우리 몸 구석구석을 돌아다니므로, 전이 위험성이 높고 치료가 어렵다. 따라서 혈액암의 치료를 위해 대부분 항암화학치료를 시행하고, 골수이식수술이나 국소적인 방사선 치료, 국소적인 수술을 병행하고 있으나, 아직까지 항암 치료요법이 제한적이고, 종래 치료 방법에 많은 부작용이 나타나는 실정이다. 특히, 기존의 항암화학치료에서는 항암제로서 파클리탁셀 및 투니카마이신을 사용하였지만, 이러한 2가지 약물 외에 시너지틱한 세포사멸을 유도할 마스터 유전자의 부재가 있는 현실이며, 항암 작용에서의 구체적인 기능은 밝혀지지 않았다.
이에, 혈액암에 대한 새로운 치료 타겟인 SURF4를 확인하여, SURF4 발현을 억제함으로써 혈액암의 예방 또는 치료할 수 있고, 나아가 기존 항암제인 파클리탁셀 또는 투니카마이신과의 혈액암 치료에 대한 시너지 효과를 확인하여, 본 발명을 하기에 이르렀다.
일 양상은 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 혈액암을 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 SURF4 억제제는 shRNA (short hairpin RNA), siRNA (small interfering RNA) 및 miRNA (micro RNA)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로 shRNA일 수 있다.
상기 SURF4 억제제는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩티드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한 일례로서, 상기 폴리펩티드는 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
구체적으로, 상기 SURF4 억제제가 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드일 경우, 상기 SURF4 억제제를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포의 배양물일 수 있다.
상기 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 용어 "발현"은 유전자의 암호화된 정보가 세포에 존재하고, 세포에서 작동하는 구조로 전환되는 모든 기능을 포함한다.
용어 "유전적 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다.
구체적으로, 상기 SURF4 억제제를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포는 SURF4 억제제를 발현하는 유전자를 코딩하는 벡터가 형질주입된 세포일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 유전적 조작은 상기 SURF4 억제제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환용 바이러스를 세포에 형질주입한 후, 상기 세포가 발현하는 형질전환용 바이러스가 포함된 세포 배양액이 혈액암 세포에 투여 또는 처리되고, 상기 SURF4 억제제가 발현되어 혈액암 세포의 세포사멸을 유도함으로써 혈액암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 또한, 상기 형질전환용 바이러스는 예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 렌티바이러스를 포함한다.
상기 용어 "형질전환(transformation)"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미하며, 상기 용어 "형질주입(transfection)"은 외부로부터 주어진 DNA를 세포 내에 이식하는 기법으로, 생물의 어떤 계통의 세포(바이러스 세포 제외)에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에 주입하였을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상이다. 즉, 특정 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.
용어 "세포 배양물"은 세포 집단의 생존 및/또는 증식에 적합한 조건 하에서 배지에 현탁된 세포 집단을 의미한다. 또한, 세포 집단과 이 집단이 현탁된 배지를 함유하는 혼합물을 의미하기도 한다. 상기 세포 배양물은 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 배양될 수 있으며, 세포 배양물에는 대상 세포의 생존, 배양 등을 위해 필요한 첨가물이 적절히 첨가될 수 있다.
용어 "배지"는 증식성 세포에 영양을 공급하는 영양소 함유 용액을 의미한다. 이러한 용액은 일반적으로 세포가 최소 증식 및/또는 생존하는데 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량원소를 제공한다. 또한, 이 용액은 호르몬 및 성장 인자를 비롯하여, 증식 및/또는 생존을 최소 속도 이상으로 증강시키는 성분을 추가로 함유할 수도 있다. 이 용액은 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제조되는 것이 바람직하다. 또한, 배지는 "합성 배지", 즉 미지 조성물의 성분, 단백질, 또는 가수분해물이 전혀 없는 무혈청 배지일 수 있다. 합성 배지는 동물 유래의 성분이 없고, 모든 성분이 공지된 화학적 구조를 가진 성분이다.
일 양상에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 활성산소종 (ROS: Reactive Oxygen Species)을 증가시키는 것일 수 있고, 예를 들어, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 과산화 수소 (hydrogen peroxide), 초 과산화물 (superoxide anion), 하이드록실라디칼(hydroxyl radical), 지질과산화 (lipid peroxide), 일산화 질소 (nitric oxide) 및 과산화 질산염 (peroxynitrite)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 증가시키는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포의 pSTAT6의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 pSTAT6의 발현을 증가시키는 IL4와 함께 시너지적으로 작용하여 보다 pSTAT6의 발현을 증가시킬 수 있고, 이에 따라, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 현저하게 증가시키는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 인산화 단백질의 양을 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 세포괴사 조절인자의 발현을 증가시키며, 혈액암 세포 내 세포 성장 및 증식을 촉진하는 조절인자의 발현을 감소시키는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 세포괴사 조절인자인 pJNK의 발현을 증가시킬 수 있고, 혈액암 세포 내 세포 성장 및 증식 촉진 조절인자인 pERK 및 pAKT의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 혈액암 세포 내 세포괴사 조절인자의 발현이 증가됨에 따라 혈액암 세포의 세포사멸을 증가시킬 수 있으며, 상기 혈액암 세포 내 세포 성장 및 증식 촉진 조절인자의 발현이 감소됨에 따라, 상기 혈액암 세포의 세포 성장이 감소될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 혈액암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 아벨슨 종양유전자-관련된 CML (Bcr-ABL 전좌), 골수형성 이상 증후군 (MDS), 급성 B 림프모세포성 백혈병 (B-ALL), 급성 T 림프모세포성 백혈병 (T-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 다발골수종 (MM), 골수증식종양 (MPN), 리히터 증후군, CLL의 리히터 변환, 털세포 백혈병 (HCL), 모세포성 형질세포 수지상 세포신생물 (BPDCN), 비-호지킨 림프종 (NHL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 작은 림프구성 림프종 (SLL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포증 및 버킷 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 B 림프모세포성 백혈병 및 급성 T 림프모세포성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로는 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
용어 "암(cancer)"은 제어 불가능하게 증식하며 정상적인 신체 조직을 침투하고 파괴하는 능력을 갖는 비정상적인 세포의 발생을 특징으로 하는 질병의 부류를 지칭한다.
용어 "혈액암(Blood cancer)"은 혈액을 구성하는 성분에 생긴 암을 포괄적으로 이르는 말로 혈액이나, 조혈기관, 림프절, 림프기관 등에 발생한 악성 종양을 의미한다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 고형암의 예방 또는 치료 효과를 나타내지 못 할 수 있다. 구체적으로, 상기 SURF4 억제제를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포의 배양물은 혈액암 세포와 달리 고형암 세포의 세포 사멸을 유도하지 못 할 수 있다.
용어 "고형암(solid cancer)"은 혈액암과는 구별되는 특징을 지니고, 방광, 유방, 장, 신장, 폐, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부 등의 여러 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 암을 의미하며, 상기 고형암은 예를 들어, 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암 및 악성흑색종으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 고형암은 전립선암, 자궁경부암, 난소암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
용어 "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 혈액암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
용어 "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 혈액암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 혈액암을 보유할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 치료용 조성물 또는 기존의 다른 항암제와 혼합되어 제공될 수 있고, 상기 다른 항암제는 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 치료용 조성물, 기존의 항암제 또는 새롭게 개발되는 항암제일 수 있다.
상기 약학적 조성물이 항암제를 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 항암제는 예를 들어, 파클리탁셀 (Paclitaxel) 및 투니카마이신 (Tunicamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 약학적 조성물이 항암제를 더 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 항암제 단독의 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질 및/또는 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시키는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 약학적 조성물이 항암제를 더 포함하고, 상기 항암제가 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 파클리탁셀 단독의 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질의 발현을 더 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물이 항암제를 더 포함하고, 상기 항암제가 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 투니카마이신 단독의 경우보다 혈액암 세포 내 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물이 항암제를 더 포함하고, 상기 항암제가 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 및 PARP으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물이 항암제를 더 포함하고, 상기 항암제가 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2α (inositolrequiring kinase 1α), eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2α), ATF4 (activating transcription factor 4) 및 CHOP (C/EBP homologous protein)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독 투여 또는 상기 항암제와 병용 투여되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 항암제와 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 항암제는 예를 들어, 파클리탁셀 (Paclitaxel) 및 투니카마이신 (Tunicamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 약학적 조성물이 항암제와 병용투여되는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 항암제가 단독 투여되는 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질 및/또는 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
구체적으로 상기 약학적 조성물이 항암제와 병용투여되고, 상기 항암제가 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 파클리탁셀 단독 투여되는 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질의 발현을 더 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물이 항암제와 병용투여되고, 상기 항암제가 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 투니카마이신 단독 투여되는 경우보다 혈액암 세포 내 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물이 항암제와 병용투여되고, 상기 항암제가 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 및 PARP으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물이 항암제와 병용투여되고, 상기 항암제가 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2α (inositolrequiring kinase 1α), eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2α), ATF4 (activating transcription factor 4) 및 CHOP (C/EBP homologous protein)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 동맥내 주사, 골수내 주사, 심장내 주사, 경막내 주사, 경피주사, 비강내 주사, 장관내 주사, 국소주사, 설하 주사, 직장내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 항암제가 파클리탁셀인 경우, 상기 항암제는 0.1 내지 1.0 μM, 0.1 내지 0.8 μM, 0.1 내지 0.6 μM, 0.2 내지 1.0 μM, 0.2 내지 0.8 μM, 0.2 내지 0.6 μM, 0.4 내지 1.0 μM, 0.4 μM 내지 0.8 μM 또는 0.4 내지 0.6 μM의 농도로 투여되는 것일 수 있다.
상기 항암제가 0.1 μM 미만의 농도로 투여될 경우, 혈액암 세포의 세포사멸 효과가 저하될 수 있고, 1.0 μM 초과의 농도로 투여될 경우, 혈액암 세포 외 정상세포 사멸이 증진될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 항암제가 투니카마이신인 경우, 상기 항암제는 1 내지 20 μg/ml, 1 내지 15 μg/ml, 1 내지 13 μg/ml, 5 내지 20 μg/ml, 5 내지 15 μg/ml, 5 내지 13 μg/ml, 7 내지 20 μg/ml, 7 내지 15 μg/ml 또는 7 내지 13 μg/ml으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 항암제가 1 μg/ml 미만의 농도로 투여될 경우, 혈액암 세포의 세포사멸 효과가 저하될 수 있고, 20 μg/ml 초과의 농도로 투여될 경우, 혈액암 세포 외 정상세포 사멸이 증진될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 SURF4 억제제를 투여한 후 상기 항암제의 투여는 3 내지 14일, 3 내지 12일, 3 내지 11일, 5 내지 14일, 5 내지 12일, 5 내지 11일, 6 내지 14일, 6 내지 12일 또는 6 내지 11일 후에 투여되는 것일 수 있다.
상기 SURF4 억제제의 투여 후 상기 항암제가 3일 미만의 기간에 투여되거나, 14일이 초과되어 투여될 경우, 상기 SURF4 억제제의 투여 후 상기 항암제가 7 내지 10일에 투여된 경우와 비교하여, 우수한 세포사멸을 나타내는 혈액암의 예방 또는 치료 효과에 대한 시너지 효과가 나타나지 않을 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 예를 들어, 격일로 투여되는 것일 수도 있으며, 일주일에 하루 투여되는 것일 수 도 있다.
다른 양상은 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 "SURF4 억제제", "혈액암", "예방" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 혈액암의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질병의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 상기 건강기능식품은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 일 양상에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 건강기능식품은 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 혼합되어 제공될 수 있다.
상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품은 예를 들어, 파클리탁셀 (Paclitaxel) 및 투니카마이신 (Tunicamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있다.
상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 단독의 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질 및/또는 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시키는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 단독의 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질의 발현을 더 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 단독의 경우보다 혈액암 세포 내 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 및 PARP으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2α (inositolrequiring kinase 1α), eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2α), ATF4 (activating transcription factor 4) 및 CHOP (C/EBP homologous protein)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 건강기능식품은 단독 섭취 또는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되는 것일 수 있다.
상기 건강기능식품은 암의 예방 또는 개선 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병행하여 섭취될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 섭취될 수 있으며, 단일 또는 다중 섭취될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 섭취하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품은 예를 들어, 파클리탁셀 (Paclitaxel) 및 투니카마이신 (Tunicamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있다.
상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 단독 섭취되는 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질 및/또는 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
구체적으로 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 단독 섭취되는 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질의 발현을 더 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 단독 섭취되는 경우보다 혈액암 세포 내 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 및 PARP으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되고, 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2α (inositolrequiring kinase 1α), eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2α), ATF4 (activating transcription factor 4) 및 CHOP (C/EBP homologous protein)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다.
또 다른 양상은 SURF4 억제제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 "SURF4 억제제", "개체", "투여", "혈액암", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 SURF4 억제제를 이를 필요로 하는 개체에 단독으로 투여하거나 항암제와 병용 투여하는 것일 수 있다.
상기 방법은 암의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 항암제와 병행하여 투여하는 것일 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여하는 것일 수 있으며, 단일 또는 다중 투여하는 것일 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 항암제는 예를 들어, 파클리탁셀 (Paclitaxel) 및 투니카마이신 (Tunicamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 방법이 항암제를 병용 투여하는 것인 경우, 상기 SURF4 억제제는 상기 항암제가 단독 투여되는 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질 및/또는 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
구체적으로 상기 방법이 항암제를 병용 투여하는 것이며, 상기 항암제가 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 파클리탁셀 단독 투여되는 경우보다 혈액암 세포 내 세포사멸 관련 단백질의 발현을 더 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 방법이 항암제를 병용 투여하는 것이며, 상기 항암제가 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 투니카마이신 단독 투여되는 경우보다 혈액암 세포 내 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 방법이 항암제를 병용 투여하는 것이며, 상기 항암제가 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 및 PARP으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 방법이 항암제를 병용 투여하는 것이며, 상기 항암제가 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase), peIF2α (inositolrequiring kinase 1α), eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2α), ATF4 (activating transcription factor 4) 및 CHOP (C/EBP homologous protein)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 혈액암 세포의 세포사멸을 보다 증가시킬 수 있다.
또 다른 양상은 혈액암을 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 SURF4 억제제의 용도를 제공한다.
상기 "SURF4 억제제", "혈액암", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따르면, SURF4를 억제하는 경우, pJNK의 발현이 증가되며, pERK, pAKT의 발현이 감소됨으로써, 혈액암 세포의 세포사멸이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 기존 항암제 투여와 함께 SURF4를 억제하는 경우, 기존 항암제 투여 시 보다 현저한 세포사멸을 나타내는 시너지 효과를 확인하였는 바, 혈액암 치료 시장/산업에 이바지할 수 있다.
도 1은 SURF4 shRNA가 주입된 THP1, HL60 및 K562 세포주의 SURF4 유전자 발현 확인을 위한 qRT-PCR 분석을 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 2는 SURF4 shRNA가 주입된 THP1, HL60 및 K562 세포의 수 및 세포사멸 측정을 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 3은 SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서 웨스턴 블롯을 이용한 pJNK, JNK, BAX의 발현 확인을 나타낸 도이며(왼쪽), SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포주의 SURF4 유전자 발현 확인을 위한 qRT-PCR 분석을 나타낸 도이다(오른쪽)(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 4a 내지 도 4c는 SURF4 shRNA가 주입된 HL60 및 THP1 세포에서 인산화 단백질에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 측정을 나타낸 도로써, 구체적으로 도 4a 및 도4c는 SURF4 shRNA가 주입된 HL60 및 THP1 세포에서 인산화 단백질에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화를 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도4b는 FACS를 통한 SURF4 shRNA가 주입된 THP1, HL60 및 K562 세포의 세포사멸 정도를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 5a 내지 도 5b는 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에 파클리탁셀을 처리 후 세포사멸을 측정한 결과를 나타낸 도로서, 구체적으로 도 5a는 THP1 세포의 세포사멸을 측정한 결과이고, 도 5b는 HL60 세포의 세포사멸을 측정한 결과이고, 도 5c는 K562 세포의 세포사멸을 측정한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 6은 SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서 Caspase3와 Cleaved Caspase3, PARP의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 7a 내지 도 7c는 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에 투니카마이신 처리 후 세포사멸을 측정한 결과를 나타낸 도로서, 구체적으로 도 7a는 THP1 세포의 세포사멸을 측정한 결과이고, 도 7b는 HL60 세포의 세포사멸을 측정한 결과이고, 도 7c는 K562 세포의 세포사멸을 측정한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 8은 SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서 PERK와 peIF2α, eIF2α, ATF4, CHOP의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하며, CHOP 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 9는 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포의 성장억제를 확인한 결과를 나타낸 도로써, 구체적으로 골수 분화 (CD11b+)에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 정량을 측정한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 10은 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포의 성장억제를 확인한 결과를 나타내는 도로써, 구체적으로 활성산소종 (ROS)에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 정량을 측정한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 11은 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포의 성장억제를 확인한 결과를 나타낸 도로써, 구체적으로 NOD-SCID 마우스를 이용한 이종이식 (xenograft) 모델에서 종양 발생 확인한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 12는 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에서의 IL4-STAT6 및 STING-의존적인 세포사멸을 나타낸 도로써, 구체적으로 세포사멸을 유도하는 pSTAT6의 발현을 유도하는 L4를 백혈병 세포주에 처리하여 pSTAT6의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 13은 Surf4 sgRNA가 주입된 마우스의 Mll-Af9 백혈병 세포에서 pSTAT6에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 정량을 측정한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 14는 SURF4 shRNA가 주입된 THP1 및 HL60 세포에 IL4 처리 후 세포사멸을 측정한 결과는 나타낸 도로서, 구체적으로, 도 14a는 THP1 세포이고, 도 14b는 HL60 세포이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 15a 및 도 15b는 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에서의 IL4-STAT6 및 STING-의존적인 세포사멸을 나타낸 도로써, 구체적으로 도 15a는 SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에서의 세포사멸 결과를 나타낸 도이고, 도 15b는 cGAMP를 처리한 후 세포사멸과 pTBK1의 발현 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 16은 SURF4가 STAT6 및 STING의 기능을 조절하고 골수성 백혈병 세포의 분화와 세포사멸을 억제한다는 모식도를 나타낸 도이다.
도 17은 고형암 세포에서 SURF4의 발현에 따른 세포 사멸의 차이를 나타낸 도로써, 구체적으로 SURF4 shRNA가 주입된 PC3, HeLa 세포의 수를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
도 18a 내지 도 18c는 고형암 세포에서 SURF4의 발현에 따른 세포 사멸의 차이를 나타낸 도로써, 구체적으로 도 18a는 SURF4 shRNA가 주입된 A2780 세포에서 세포사멸을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 18b는 HA-SURF4 과발현 벡터가 주입된 A2780, DLD1, PC3, MCF7 및 HCT116 세포에서 웨스턴 블롯을 이용한 pJNK와 JNK의 발현을 확인한 도이고, 도 18c는 SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서 IRE1, PERK 및 GRP78의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도이다(오차막대는 평균의 표준오차를 표시함 (** p≤0.01)).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. SURF4 shRNA에 의한 골수성 백혈병 세포주의 성장 억제
(1) SURF4 shRNA 주입된 THP1, HL60 및 K562 세포주의 SURF4 유전자 발현 확인
SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포주에서 SURF4 유전자 발현을 확인하고자 하였다. 구체적으로, THP1 (인간 단핵구 세포주), HL60 (급성 골수성 백혈병 세포주) 및 K562 (만성 골수성 백혈병 세포주) 세포주는 RPMI1640 배지를 이용하여 배양하였으며, 각각의 배지에 10%의 FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하였다. 보다 구체적으로, SURF4 shRNA plasmid 6 μg (SantaCruz, Cat. No.sc-92607-SH)을 293T 세포에 형질주입 (transfection)한 후, 상기 293T 세포가 발현하는 렌티바이러스가 포함된 세포 배양액을 THP1, HL60 및 K562 세포 배양액에 함께 주입하였다. 이후, 주입된 각각의 세포주의 SURF4 유전자 발현 확인을 위해 RNA 추출 키트를 이용하여 세포에서 RNA를 추출하였고, cDNA 합성 키트를 이용하여 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 SURF4 프라이머 및 SYBR-green을 이용하여 qRT-PCR 분석을 하였다.
그 결과, SURF4 shRNA 주입된 골수성 백혈병 세포주에서 SURF4 유전자 발현이 대조군에 비해 약 2배 감소하였다(도 1a: THP1 세포, 도 1b: HL60 세포, 도 1c: K562 세포). 또한, SURF4 shRNA가 주입된 세포의 수 및 세포사멸을 2일 간격으로 측정한 결과, SURF4 shRNA에 의해 SURF4의 발현이 감소되었을 때 세포의 성장이 대조군에 비해 감소하였고 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였다(도 2). 이를 통해 SURF4 발현 감소는 백혈병 세포의 성장을 억제하며 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다.
(2) SURF4 shRNA 주입된 THP1 세포에서의 단백질 양 확인
SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서의 단백질 양을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 하였다. 주입된 SURF4 shRNA는 실시예 1.-(1)과 동일하다. 구체적으로, Lysis buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출한 뒤 10% SDS-PAGE gel에서 분리하여 멤브레인으로 옮겼다. pJNK, JNK, BAX, Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1α, GRP78, PERK, peIF2α, eIF2α, ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 및 Actin 항체를 각각 넣고 4℃에서 16시간 방치한 후 2차 항체를 넣고 상온에서 1시간 방치한 뒤 ECL에 반응시켜 화학발광이미지분석기로 측정하였다.
그 결과, SURF4의 발현 감소는 pJNK를 증가시킴으로써 SURF4가 JNK pathway와 연관이 있음을 보여준다. 세포사멸이 증가하면 BAX의 양이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 본 실험결과에서도 SURF4 shRNA가 주입되었을 때 세포사멸이 증가하였고 BAX도 증가하는 것을 확인하였다(도 3).
(3) 인산화 단백질에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 측정
SURF4 shRNA가 주입된 HL60 및 THP1 세포주 내의 인산화 단백질의 양을 유세포분석을 통해 측정하였다. 주입된 SURF4 shRNA는 실시예 1.-(1)과 동일하다. 인산화 단백질 측정 시, 세포를 모아 1% 파라포름알데하이드를 넣고 4℃에서 30분 방치한 후 세척하여 95% 메탄올을 넣고 4℃에서 30분 방치한다. 이후 pJNK, pERK, pAKT 1차 항체를 각각 넣고 4℃에서 30분, 2차 항체 (Alexa Fluor 488)를 넣고 4℃에서 30분 방치 후 유세포분석기 (FACS)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, SURF4의 발현이 감소되었을 때 pJNK, pERK 및 pAKT가 차이가 나타남을 확인하였다(도 4a). 또한, SURF4 shRNA가 주입된 THP1, HL60 및 K562 세포의 세포사멸이 대조군과 비교하였을 때보다 증가한 것을 확인하였으며, SURF4 shRNA가 주입된 THP1 및 HL60 세포의 인산화 단백질에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화를 측정한 결과, SURF4 shRNA가 주입된 세포주가 대조군과 비교해 차이가 있음을 확인하였다(도 4b 및 4c).
2. SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에 파클리탁셀 처리
SURF4 shRNA가 주입된 THP1, HL60 및 K562 세포에 파클리탁셀 처리 후 세포사멸을 측정하였다. 주입된 SURF4 shRNA는 실시예 1.-(1)과 동일하며, 구체적으로, THP1, HL60 및 K562 세포에 처리된 파클리탁셀의 농도는 0.5 μM이고, SURF4 shRNA를 주입한 후, 7 내지 10일 후에 파클리탁셀을 처리하였다. 이후 각 세포들을 모아 아넥신 V 결합 완충액 (Annexin V binding buffer) 로 세포를 풀어준 뒤 Annexin V-FITC와 7AAD를 첨가하여 FACS 유세포분석기로 측정하였다.
그 결과, 항암제인 파클리탁셀이 세포사멸을 유도하는 것을 볼 수 있었고, SURF4 shRNA가 주입된 세포에 파클리탁셀을 처리한 경우 대조군 세포에 파클리탁셀만 단독 처리된 경우보다 세포사멸이 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 5a: THP1 세포, 도 5b: HL60 세포, 도 5c: K562 세포).
또한, SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서 세포사멸과 관련이 있는 Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 및 PARP의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. Lysis buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출한 뒤 10% SDS-PAGE gel에서 분리하여 멤브레인으로 옮겼다. pJNK, JNK, BAX, Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1α, GRP78, PERK, peIF2α, eIF2α, ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 및 Actin 항체를 각각 넣고 4℃에서 16시간 방치한 후 2차 항체를 넣고 상온에서 1시간 방치한 뒤 ECL에 반응시켜 화학발광이미지분석기로 측정하였다.
그 결과, Cleaved Caspase9, Cleaved Caspase3 및 PARP 또한 파클리탁셀 단독 처리 세포보다 SURF4 shRNA가 주입된 세포에서 더욱 증가하는 결과를 볼 수 있었다(도 6).
이 결과를 통해 SURF4와 파클리탁셀이 시너지틱하게 세포사멸을 유도한다는 것을 알 수 있다.
3. SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에 투니카마이신 처리
SURF4 shRNA가 주입된 THP1, HL60 및 K562 세포에 투니카마이신 처리 후 세포사멸을 측정하였다. 주입된 SURF4 shRNA는 실시예 1.-(1)과 동일하며, 구체적으로, THP1, HL60 및 K562 세포에 처리된 투니카마이신의 농도는 10 μg/㎖이고, SURF4 shRNA를 주입한 후, 7 내지 10일 후에 투니카마이신을 처리하였다. 이후 각 세포들을 모아 아넥신 V 결합 완충액 (Annexin V binding buffer)로 세포를 풀어준 뒤 Annexin V-FITC와 7AAD를 첨가하여 FACS 유세포분석기로 측정하였다.
그 결과, 소포체 스트레스 유도제인 투니카마이신이 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였고, SURF4 shRNA가 주입된 세포에 투니카마이신이 처리된 경우 세포사멸이 현저하게 증가하였다(도 7a: THP1 세포, 도 7b: HL60 세포, 도 7c: K562 세포).
또한, SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서 PERK와 peIF2α, eIF2α, ATF4 및 CHOP의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. Lysis buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출한 뒤 10% SDS-PAGE gel에서 분리하여 멤브레인으로 옮겼다. pJNK, JNK, BAX, Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1α, GRP78, PERK, peIF2α, eIF2α, ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 및 Actin 항체를 각각 넣고 4℃에서 16시간 방치한 후 2차 항체를 넣고 상온에서 1시간 방치한 뒤 ECL에 반응시켜 화학발광이미지분석기로 측정하였다.
그 결과, 투니카마이신 단독 처리 세포보다 SURF4 shRNA가 주입된 세포에서 소포체 스트레스가 유도되었을 때 작동을 하는 PERK-peIF2α-ATF4-CHOP pathway 역시 투니카마이신이 처리되었을 때 더욱 증가하는 결과를 볼 수 있었고, CHOP의 mRNA의 양이 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 8).
이를 통해 SURF4 shRNA가 주입된 백혈병 세포에 투니카마이신을 처리한 경우 시너지틱한 세포사멸을 나타남을 알 수 있었다.
4. SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포의 성장억제
(1) 골수 분화 (CD11b+)에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 정량
SURF4 shRNA가 주입된 THP1 및 HL60 세포의 골수 분화 (CD11b+)에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 정량을 위해 유세포분석을 진행하였다. 주입된 SURF4 shRNA는 실시예 1.-(1)과 동일하며, CD11b+ 측정은 세포에 CD11b+ PE-Cy7 항체를 넣고 4℃에서 30분 방치한 후 유세포분석기 (FACS)로 분석하였다.
그 결과, THP1 및 HL60 세포에서 SURF4 shRNA가 주입되었을 때, CD11b의 양이 증가한 것으로 보아 대조군에 비해 골수분화가 많이 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 SURF4의 발현이 억제되면 골수분화가 증가하는 것을 알 수 있었다(도 9).
(2) 활성산소종 (ROS)에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 정량
SURF4 shRNA가 주입된 THP1 및 HL60 세포의 활성산소종 (ROS: reactive oxygen species)에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화 정량을 위해 유세포분석을 진행하였다. 주입된 SURF4 shRNA는 실시예 1.-(1)과 동일하며, 활성산소종 측정은 세포에 DCFDA (2', 7 -dichlorofluorescin diacetate)를 넣고 37℃에서 30분 방치 후 유세포분석기 (FACS) 로 측정하였다.
그 결과, THP-1 및 HL60 세포에서 SURF4 shRNA가 주입되었을 때, 활성산소종의 양을 측정하는 DCFDA의 양이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 SURF4의 발현이 억제되면 활성산소종의 양이 증가하는 것을 알 수 있다(도 10).
(3) NOD-SCID 마우스를 이용한 이종이식 (xenograft) 모델에서 종양 발생 확인
SURF4 shRNA가 주입된 HL60 세포를 마우스에 피하 주사하였고 30일 동안 종양의 크기를 측정하였다. 주입된 SURF4 shRNA는 실시예 1.-(1)과 동일하며, 5 × 106 개의 HL60 세포를 100 ㎕로 media에 resuspend한 후 Vitrogel hydrogel matrix(Bio-gems) 200 ㎕와 혼합하여 총 300 ul를 마우스에 피하 주사하였다.
그 결과, SURF4 shRNA가 주입된 세포가 주사된 경우에 비해 대조군의 종양의 크기가 현저하게 증가하였다. 또한, 마우스의 골수세포에 Mll-Af9 유전자가 주입된 백혈병 세포에서 Surf4 shRNA에 의해 Surf4의 발현이 감소한 경우 골수분화가 증가였으며 pAKT의 양은 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
이러한 결과들은 SURF4 shRNA에 의해 SURF4의 발현이 감소되면 세포의 성장이 억제된다는 것을 보여준다.
5. SURF4 shRNA가 주입된 골수성 백혈병 세포에서의 IL4-STAT6 및 STING-의존적인 세포사멸
(1) IL4-STAT6
백혈병 세포에서 IL4를 통한 pSTAT6에 의해 세포사멸이 유도된다는 보고를 바탕으로 STAT6를 유도하는 IL4를 백혈병 세포주에 처리하여 pSTAT6의 발현을 확인하고자 하였다. 구체적으로, SURF4 shRNA 6 ㎍이 주입된 THP1 및 HL60 세포에 각각 IL4 (5 ng/ml)를 60분 동안 처리하여 용해한 후 웨스턴 블롯을 수행하고, SURF4 shRNA가 주입된 THP1 및 HL60 세포의 SURF4 발현을 qRT-PCR로 측정하였다. Lysis buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출한 뒤 10% SDS-PAGE gel에서 분리하여 멤브레인으로 옮겼다. pJNK, JNK, BAX, Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1α, GRP78, PERK, peIF2α, eIF2α, ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 및 Actin 항체를 각각 넣고 4℃에서 16시간 방치한 후 2차 항체를 넣고 상온에서 1시간 방치한 뒤 ECL에 반응시켜 화학발광이미지분석기로 측정하였다. 또한, RNA 추출 키트를 이용하여 세포에서 RNA를 추출하였고 cDNA 합성 키트를 이용하여 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 SURF4 프라이머 및 SYBR-green을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다.
그 결과, THP1 및 HL60 세포에서 대조군 세포와 SURF4 shRNA를 주입한 세포에 각각 IL4를 처리한 결과, 대조군과 SURF4 shRNA가 주입된 세포 모두 pSTAT6가 증가하였는데, 특히 shRNA가 주입된 세포에서는 대조군에 IL4가 처리된 경우보다 pSTAT6의 양이 더욱 증가하는 것을 확인하였다(도 12). 또한, Surf4 shRNA가 주입된 마우스의 Mll-Af9 백혈병 세포에서 pSTAT6에 대한 MFI의 정규화된 배수 변화를 정량하였다.
또한, 마우스의 Mll-Af9 백혈병 세포에서도 pSTAT6의 양이 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 13). 그리고 SURF4 shRNA가 주입된 THP1 및 HL60 세포에 IL4 처리 후 세포사멸을 측정한 결과, SURF4 shRNA가 주입된 백혈병 세포주에서 IL4를 처리했을 때, 세포사멸이 IL4 단독 처리한 경우보다 증가하는 것을 알 수 있었다(도 14a: THP1 세포, 도 14b: HL60 세포).
이를 통해 SURF4 발현 감소에 따른 세포사멸은 IL4-pSTAT6와 연관이 있음을 알 수 있다.
(2) STING (stimulator of interferon gene)
STING은 소포체 막단백질 중 하나로 세포사멸을 유도하고 SURF4 및 STAT6와 binding한다는 보고를 바탕으로 STING을 유도하는 cGAMP를 처리하고자 하였다. 구체적으로, SURF4 shRNA 6 ㎍이 주입된 THP1 세포에 cGAMP 처리 후 세포사멸 측정하고, cGAMP 처리 후 STING 및 pTBK1의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 구체적으로 세포를 모아 Annexin V binding buffer로 세포를 풀어준 뒤 Annexin V-FITC와 7AAD를 첨가하여 FACS 유세포분석기로 세포사멸을 측정하고, Lysis buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출한 뒤 10% SDS-PAGE gel에서 분리하여 멤브레인으로 옮겼다. pJNK, JNK, BAX, Caspase9, Cleaved caspase9, Caspase3, Cleaved caspase3, PARP, IRE1α, GRP78, PERK, peIF2α, eIF2α, ATF4, CHOP, pSTAT6, STAT6, STING, pTBK1 및 Actin 항체를 각각 넣고 4℃에서 16시간 방치한 후 2차 항체를 넣고 상온에서 1시간 방치한 뒤 ECL에 반응시켜 화학발광이미지분석기로 측정하였다.
그 결과, SURF4 shRNA가 주입된 세포에 cGAMP가 처리된 경우 세포사멸이 약 2배 증가하는 것을 확인하였고(도 15a), cGAMP가 처리되면 STING의 하위에 있는 pTBK1이 증가하는 것을 확인하였다(도 15b).
이러한 결과들은 SURF4가 STAT6 및 STING의 기능을 조절하고 골수성 백혈병 세포의 분화와 세포사멸을 억제한다는 것을 나타낸다(도 16).
6. 고형암 세포에서 SURF4 발현에 따른 세포 사멸의 차이
고형암 세포와 혈액암 세포에서 SURF4의 발현에 따른 세포 사멸의 차이를 확인하고자 하였다. 실험에 사용된 세포주는 PC3 (전립선암), HeLa (자궁경부암), A2780 (난소암), MCF7 (유방암) 및 DLD1과 HCT116 (대장암)이며, SURF4 shRNA가 주입된 PC3 세포 및 HeLa 세포의 수를 3일 동안 측정한 결과, SURF4의 발현에 따른 세포 성장에 차이가 없었다(도 17a: PC3 세포, 도 17b: HeLa 세포).
또한, SURF4 shRNA 6 ㎍이 주입된 A2780 세포에서 세포사멸을 측정한 결과, 세포사멸의 차이가 없는 것을 볼 수 있으며(도 18a), HA-SURF4 과발현 벡터가 주입된 A2780, DLD1, PC3, MCF7 및 HCT116 세포에서 웨스턴 블롯을 이용한 pJNK와 JNK의 발현을 확인하고(도 18b), SURF4 shRNA가 주입된 THP1 세포에서 IRE1, PERK 및 GRP78의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, pJNK 및 소포체 스트레스 관련 인자들의 발현에도 큰 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 18c).
이를 통해 고형암 세포에서는 SURF4의 발현에 따른 세포사멸의 차이가 없는 것을 알 수 있었다.

Claims (14)

  1. SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 shRNA (short hairpin RNA), siRNA (small interfering RNA) 및 miRNA (micro RNA)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 상기 SURF4 억제제를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포의 배양물인, 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포 내 활성산소종을 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 혈액암 세포의 pSTAT6의 발현을 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 SURF4 억제제는 pJNK의 발현량을 증가시키며, pERK 및 pAKT의 발현량을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 혈액암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 아벨슨 종양유전자-관련된 CML (Bcr-ABL 전좌), 골수형성 이상 증후군 (MDS), 급성 B 림프모세포성 백혈병 (B-ALL), 급성 T 림프모세포성 백혈병 (T-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 다발골수종 (MM), 골수증식종양 (MPN), 리히터 증후군, CLL의 리히터 변환, 털세포 백혈병 (HCL), 모세포성 형질세포 수지상 세포신생물 (BPDCN), 비-호지킨 림프종 (NHL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 작은 림프구성 림프종 (SLL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포증 및 버킷 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암제를 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀 (Paclitaxel) 및 투니카마이신 (Tunicamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 항암제인, 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 항암제가 파클리탁셀을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 세포사멸 관련 단백질의 발현을 더 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 항암제가 투니카마이신을 포함하는 경우, 상기 SURF4 억제제는 소포체(endoplasmic reticulum, ER) 스트레스 관련 유전자의 발현을 더 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
  12. SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료 방법.
  14. 혈액암을 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 SURF4 (Surfeit locus protein 4) 억제제의 용도.
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