WO2016159627A1 - 항암 활성을 갖는 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물 - Google Patents

항암 활성을 갖는 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물 Download PDF

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cp2c
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김철근
김민영
김찬길
강호철
채지형
이수재
백은정
윤채옥
이진원
임영수
최제민
하대현
원형식
손승한
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한양대학교 산학협력단
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having anticancer activity, a pharmaceutical composition and a nutraceutical composition for cancer prevention and treatment containing the same as an active ingredient.
  • the transcription factor CP2c (also known by the names CP2, Tfcp2, LSF, LBP1, UBP1, etc.) is widely expressed in a variety of mammals, and the activity of CP2c is such that the cell is transferred from resting (GO) to DNA replicator (S). It is finely regulated as it progresses, and is essential for the cell to effectively advance the G1 / S transition. Regulation of the activity of CP2c is generally carried out through post-translational modifications, and the level remains constant low. However, CP2c is overexpressed in tumor cells, thus playing a key role in cancer development.
  • FQI1 Quinolinone Inhibitor 1
  • FQI1 and its derivatives were identified and then successfully inhibited only cancer cells without affecting normal cells in cell and mouse transplant models (Grant et al., Antiproliferative small-molecule inhibitors of transcription factor LSF reveal oncogene addiction to LSF in hepatocellular carcinoma, Proc . Natl . Acad. Sci. 2012; 109 (12): 4503-4508).
  • HXPR novel peptide motifs
  • PHL novel peptide motifs
  • ASR novel peptide motifs
  • the present invention based on the above-described results of the present inventors, a peptide for more effectively inhibiting the activity of CP2c known as a key transcription factor in various cancers, a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer containing the same as an active ingredient and To provide a health functional food composition.
  • the present invention provides a peptide represented by SEQ ID NO: 1, which binds to transcription factor CP2c and has cancer prevention and therapeutic activity:
  • an acetyl group may be bonded to the N-terminal Asn of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, and an amide group may be bonded to the C-terminal Pro of the peptide.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 2 may be linked to the C-terminal Pro of the peptide represented by SEQ ID NO: 1:
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 2 when the peptide represented by SEQ ID NO: 2 is bound to the C-terminal Pro of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, the N-terminal Asn of the peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • An acetyl group may be attached to the C-terminal Cys of the peptide represented by SEQ ID NO: 2, and an amide group may be bonded thereto.
  • Lys 1 and 3 Lys in the sequence is 6-aminohexanoic acid (6-aminohexanoic acid).
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 2 is bonded to the C-terminal Pro of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, and the N-terminal Asn of the peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • an amide group may be bonded to the C-terminal Cys of the peptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • the peptide represented by the following SEQ ID NO: 4 may be coupled to the N-terminal Asn of the peptide represented by SEQ ID NO: 1:
  • the amide group may be bonded to the C-terminal Pro of the peptide represented by SEQ ID NO: 1.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 2 is bonded to the C-terminal Pro of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, and the C-terminal Cys of the peptide represented by SEQ ID NO: 2 ⁇ -NH2 may be bound to a biotin-bound Lys.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 2 is bonded to the C-terminal Pro of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, and the C-terminal Cys of the peptide represented by SEQ ID NO: 2
  • the N-terminal Asn of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 has an acetyl group
  • Amide groups can be attached to C-terminal Lys to which biotin is bound.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer containing the peptides as an active ingredient.
  • the present invention also provides a nutraceutical composition for preventing and treating cancer containing the peptides as an active ingredient.
  • the peptide and the pharmaceutical composition comprising the same according to the present invention When the peptide and the pharmaceutical composition comprising the same according to the present invention are treated to cancer cells, they can specifically bind CP2c through the cell membrane with very high stability, and can inhibit the DNA binding ability of CP2c. By inhibiting the activity of CP2c, not only can the CP2c mediate cancer cell-specific transcriptional activity to effectively treat cancer cells, but also can be used as a health food additive for preventing and preventing cancer.
  • 1 is a schematic representation of the full length CP2c sequence consisting of a total of six regions and the sequences of various CP2c mutations with N-terminal and C-terminal deletions.
  • 3 is a graph showing the results of measuring binding affinity of the DNA-CP2c complex by performing DIP analysis on peptide 5, peptide 8, peptide 5-1 and peptide 5-2.
  • FIG. 4A to 4E are micrographs taken after incubation by adding FQI1, peptide 5C and peptide 5-2C to various cancer cell lines and normal human stem cells and differentiated cells, respectively.
  • the photographs shown in FIG. 4A are hepatic cancer cell lines (HepG2, Hep3B), fetal kidney cell lines (293T), breast cancer cell lines (MVCF7, MDA-MB-231), hematopoietic cancer cell lines (K562, MEL, HEL, HL60), glioblastoma cell lines ( U251, U373MG, U87MG), FIG.
  • FIG. 4B shows epithelial cell lines of various tissue origins (MCF10A, BEAS2B), primary cultured mouse T lymphocytes (non-dividing and dividing activating cells) and human mesenchymal stem cells (hMSCs), and FIG. 4C
  • FIG. 4D shows human embryonic stem cells (hESC) co-cultured with fibroblasts
  • FIG. 4E shows human hematopoietic stem cells (HPC) and These are cells in the process of differentiation into erythrocytes (cells 3, 7 and 14 days after induction of differentiation).
  • 5A-5J show HepG2 cell line and Hep3B cell line 5a, MCF7 cell line and MDA-MB-231 cell line 5b, U251 cell line, U87MG cell line and U343 cell line 5c, K562 cell line, HEL cell line and HL60 cell line (5d).
  • FIG. 5k is a photograph of a well plate obtained at a time point 96 hours after the peptide treatment.
  • 6A and 6B show six types of colorectal cancer cell lines, 6 types of lung cancer cell lines, 3 types of breast cancer cell lines, 3 types of glioblastoma cell lines, 1 type of cervical cancer cell lines (6a), and blood cell cancer cell lines (MEL, K562, HEL, HL60), Comparison of CP2c protein expression levels in liver cancer cell lines (HepG2, Hep3B), skin epithelial cancer cell lines (A431), colorectal cancer cell lines (HCT116), epithelial cell lines from various tissues (293T, BEAS2B, MCF10A) and hMSC cell lines (6b) The photograph shows the result of Western blot experiment performed for analysis.
  • FIG. 7A and 7B show graphs for calculating IC50 values after peptide 5-2C treatment and calculated IC50 values for the cell lines shown in FIG. 5.
  • FIG. 7A shows a graph for calculating IC50 values at 48 hours after one treatment of 5-2C in each cell line and the calculated IC50 values
  • FIG. 7B shows glioblastoma cell lines (U343, U373MG, U251, U87MG). The graph shows the calculated IC50 values and calculated IC50 values at 48 and 96 hours after one treatment of peptide 5-2C.
  • FIG. 8 shows graphs and calculated IC50 values for calculating IC50 values at 48 hours after FQI1, peptide 5C and peptide 5-2C treatment in MCF10A and BEAS2B cell lines, respectively.
  • FIG. 10 shows a graph and calculated IC50 values for calculating IC50 values at 48 hours after peptide 5-2C and peptide 5-2D treatment for the cell lines shown in FIG. 9.
  • FIG. 11a shows the measured volume of the tumor during the experiment
  • Figure 11b shows the change in the weight of the mouse.
  • FIG. 11C is a photograph of the mouse 70 days after the peptide administration
  • FIG. 11D is a photograph of the extracted tumor
  • FIG. 11E shows the weight and average of tumors extracted from each mouse.
  • FIG. 11F shows various standard blood indices by group
  • FIG. 11G shows H / E staining of major organs (spleen, liver, lung and kidney).
  • FIGS. 12A to 12D show the results of analyzing tumor growth inhibition and physiological characteristics of peptide 5-2C in an animal model transplanted with an A431 human epidermoid carcinoma cell line.
  • Tumor volume was measured by injecting peptide 5-2C (1 ⁇ IC50; 1.7 mg / Kg, 2 ⁇ IC50; 3.5 mg / Kg) into the tail vein a total of five times, and after 13 days the mice were sacrificed to sacrifice the tumor And major organs were extracted.
  • Figure 12a is a measure of the volume of the tumor during the experimental period
  • Figure 12b is a picture of the tumor-forming mice and a picture of the extracted tumor
  • Figure 12c shows the weight of the tumor extracted from each mouse and their average It is.
  • FIG. 12D shows H / E staining photographs of the major organs (spleen, liver, lung, kidney, blood vessels and muscles) by group.
  • FIG. 13a is a picture of the tumor-forming mice and a picture of the extracted tumor
  • Figure 13b shows the weight of the tumor extracted from each mouse and their average.
  • FIG. 13C shows the mean and standard deviation of the number of tumor foci metastasized to the lungs by group
  • FIG. 13D shows the blood index of blood by group.
  • FIG. 15A to 15C show various concentrations of peptide 5-2C (0) in various cell lines (MEL, K562, MCF-10A and MDA-MB-231) to analyze the effect on the cell cycle by peptide 5-2C.
  • , 1, 2, 3, 10 ⁇ M cell cycle analysis was performed 48 hours after the treatment.
  • Figure 15a shows the distribution of cells according to the amount of DNA during FACS analysis
  • Figure 15b is a quantified distribution of cells by cell cycle
  • Figure 15c is an enlarged graph showing only the cell distribution of the subG1 phase showing cell death. .
  • FIG. 18 is a photograph of the cell morphology on an electron microscope at 24 and 48 hours after treatment with 2 ⁇ M peptide 5-2C in MDA-MB-231 cell line and MCF10A cell line. Negative controls were cells treated with saline, positive controls were cells treated with FQI1 at a concentration of 2 ⁇ M.
  • FIG. 19A to 19D are diagrams illustrating the intracellular migration pathways of FITC-conjugated peptide 5-2C over time in MDA-MB-231 cell line.
  • FIG. 19A shows physiological saline or FITC-conjugated-iRGD, FITC-5-1C, and FITC-5-2C peptides at 0, 0.5, 1, 2, 3, and 10 ⁇ M concentrations in MDA-MB-231 cell lines, respectively.
  • FIG. 19B shows a graph of cell growth rate change through MTT analysis after 96 hours of treatment, and FIG. 19B shows a graph for calculating IC50 values for each treatment group at 48 hours after treatment, and calculated IC50 values.
  • FIG. 19A shows physiological saline or FITC-conjugated-iRGD, FITC-5-1C, and FITC-5-2C peptides at 0, 0.5, 1, 2, 3, and 10 ⁇ M concentrations in MDA-MB-231 cell lines, respectively.
  • FIG. 19B shows a
  • FIG. 19C Is a well plate photograph showing an example of an MTT assay at 96 hours
  • FIG. 19D is a photograph showing the intracellular distribution of peptides over time for 24 hours after treatment of each FITC-conjugated peptide at 2 ⁇ M concentration.
  • FIG. 20A to 20D show the comparison of peptide 5-2C with the biotin-tagged peptide 5-2CB on cancer cell survival.
  • Figure 20a shows the increase in the concentration of peptide 5-2C and two different batches of peptide 5-2CB in the MDA-MB-231 cell line, and measured the relative viability with increasing concentration in a single treatment
  • 20B is a graph showing a well plate obtained at a time point 96 hours after peptide treatment.
  • FIG. 20C shows a graph for calculating IC50 values at 48 hours after each peptide treatment for MDA-MB-231 cell line and calculated IC50 values at FIG. 20D at 48 hours after each peptide treatment for MCF7 cell line.
  • FIG. The graphs for calculating IC50 values and the calculated IC50 values are shown.
  • Figure 21c shows the results of direct analysis of binding to peptide 5-2C in pure purified GST-fusion mutant proteins by ELISA method.
  • FIG. 21D shows amino acids important for DNA binding or peptide 5-2C binding to tertiary structures predicted using Rosetta modeling algorism for the 306-396 amino acid region of CP2c.
  • the present invention provides a peptide represented by SEQ ID NO: 1, which binds to transcription factor CP2c and has cancer therapeutic activity:
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 consisting of 6 amino acids (hereinafter also referred to as 'peptide 5-2') modulates its activity by interacting with the CP2c protein, and the CP2c protein is As a protein that is specifically overexpressed in tumor cells, this activity regulation ultimately leads to an anticancer effect.
  • an iRGD peptide sequence (CRGDKGPDC) that binds to the neuropilin 1 receptor (CRGDKGPDC) is bound to the C-terminal Pro of the peptide. May also be referred to as 'peptide 5-2B'.
  • an acetyl group and an amide group may be bonded to the N-terminal Asn and C-terminal Cys of the peptide 5-2B (hereinafter, also referred to as 'peptide 5-2C').
  • ⁇ -NH2 of the C-terminal Cys of the peptide 5-2C may be bound to biotin-bound Lys (hereinafter referred to as' peptide 5- 2CB ').
  • an acetyl group may be bonded to the N-terminal Asn of the peptide 5-2CB, and an amide group may be bonded to the C-terminal Lys.
  • administration means introducing any substance to a subject in any suitable manner, i.e., a peptide derivative according to the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same, the route of administration of which means that the drug will reach the target tissue.
  • Administration can be by any common route as far as possible.
  • the route of administration may be, but is not limited to, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, and the like.
  • the oral composition is preferably formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach. Preferably, it may be administered in the form of an injection.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention may be administered by any device in which the active substance may migrate to the target cell.
  • the term "contained as an active ingredient” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level refers to the type, severity, and drug of the patient. Activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the peptide or the pharmaceutical composition comprising the same according to the present invention may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple administrations.
  • the dosage and frequency of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug which is the active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient and the severity of the disease.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutically acceptable carrier for example, in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. . It may also be formulated into other solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release preparations and the like.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the health food may be prepared in various forms such as tablets, pills, powders, capsules, gums, vitamin complexes, juices and drinks, granulating the food composition comprising the peptide according to the present invention as an active ingredient, It can be taken encapsulated or powdered.
  • the food composition of the present invention may include ingredients that are commonly added during food production, and may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
  • citric acid liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, jujube extract, licorice extract, and the like may be further included in addition to the peptide of the present invention.
  • food additives conventional in the art for example, flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers and the like can be included.
  • various flavors, natural carbohydrates, and the like may be contained as additional ingredients, as in normal drinks.
  • the amount of the identified CP2c binding peptide (peptide 5, peptide 8, peptide 13, peptide 21 and peptide 31) was gradually increased (0.2, 0.5, 1 ⁇ g), and then added at room temperature. The reaction was further reacted for minutes. 20 ⁇ l of 50% protein G-agarose bead suspension was added to the reaction and reacted at 4 ° C. for 1 hour to remove nonspecific binding. Then, 2 ⁇ g of anti-CP2c antibody (Cosmo genetech) was added and reacted at 4 ° C. for 10 hours. I was.
  • FIG. 1 shows a sequence of various CP2c mutants in which the full-length CP2c sequence and the N-terminal and C-terminal deletions are deleted in order to determine which peptide sequences among the full-length CP2c sequence consisting of a total of six regions interact with the CP2c regions.
  • FIG. 2 shows the results of measuring binding affinity of the DNA-CP2c complex by performing a DIP analysis on five identified CP2c binding peptides (peptide 5, peptide 8, peptide 13, peptide 21 and peptide 31). Shown. 1 and 2, it can be seen that peptide 5 specifically inhibits the binding between CP2c-DNA in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the binding affinity of the DNA-CP2c complex by performing DIP analysis on peptide 5, peptide 8, peptide 5-1 and peptide 5-2.
  • peptide 8 and peptide 5-1 have a slight degree of inhibiting CP2c DNA binding ability, but peptide 5-2 specifically inhibits binding between CP2c and DNA to the same extent as peptide 5.
  • the CP2c binding peptides described in Examples 1 and 2 are very unstable, tending to readily degrade in culture when treated with cells in culture, and furthermore, not readily passed through cell membranes when treated with cells. It shows a limitation in performance. Therefore, there is a need to make modifications to improve the stability of the peptide and to increase cell permeability.
  • acetyl and amide groups are attached to the N- and C-terminals respectively
  • the neuropilin 1 receptor Peptide 5C and Peptide 5-2C to which an iRGD peptide sequence (CRGDKGPDC) which binds to were attached were prepared, and each peptide sequence was listed in Table 1 below (synthesis of peptides proceeded by pepMic Co., Ltd).
  • Example 4.1 Normal cell lines by peptide 5C and peptide 5-2C and Cancer cell Microscopic Observation of Growth Inhibition and Cell Death Induction Assays
  • FQI1, peptide 5C, and peptide 5-2C were each added to the well plate inoculated with each cell line at a concentration of 2 ⁇ M, and then incubated for 48 hours at 37 ° C. and 5% CO 2. When the culture was completed, cells were observed with an inverted phase contrast microscope and morphological changes were taken.
  • Example 4.2 By peptide 5-2C Mammoth Spear ( mammosphere ) In culture Cancer cell Microscopic Observation of Growth Inhibition and Cell Death Induction Assays
  • Example 4.3 By peptide 5C and peptide 5-2C Embryonic epithelial cells On Coculture Microscopic Observation of Growth Inhibition and Cell Death Induction Assay in Intact Embryonic Stem Cell Lines
  • FIG. 4D shows micrographs (top) of colonies according to treatment concentrations for each treatment group for 72 hours, and fluorescent micrographs (bottom) of representative embryonic stem cell colonies and fluorescently labeled coculture cells in the 10 ⁇ M concentration treatment group. It was.
  • the photographs indicated by the rightmost red border of FIG. 4D (upper) are enlarged photographs of boxes in the photographs of each group treated with 10 ⁇ M.
  • embryonic stem cells and co-culture cell lines die at a concentration of 3 ⁇ M or more for FQI1 and peptide 5C, whereas embryonic stem cells and co-culture cells do not exist at 10 ⁇ M for the peptide 5-2C treatment group. Not dead Thus, peptide 5-2C suggests no growth inhibition or cell death even in pluripotent stem cells in light of the results in the normal cell line shown in Example 4.1 above.
  • Example 4.4 Hematopoietic Stem Cells by Peptide 5C and Peptide 5-2C Derived Inhibit the growth of cells during differentiation into red blood cells and Cell death Microscopy for Induction Assay
  • Figure 4e shows micrographs of hematopoietic stem cells from each treatment group and cells inducing differentiation from the erythrocyte lineage (day 3, 7, 14). Referring to FIG. 4E, even if all the drugs including peptide 5-2C were treated up to 10 ⁇ M, cell growth inhibition and cell death did not appear.
  • Example 5 Growth inhibition of cancer cell lines by peptide 5C and peptide 5-2C and Cell death Induction Assay: Quantitative Measurement of Cell Viability by MTT Assay
  • Hepatocarcinoma cell lines (HepG2, Hep3B) were inoculated at 3000 cells / well in 96 well plates, respectively, and 50 ⁇ l of the culture solution was incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 hour.
  • FQI1, peptide 5C, and peptide 5-2C were added to the well plate inoculated with hepatocellular carcinoma cells at concentrations of 0, 0.5, 2, 3, and 10 ⁇ M, respectively, and then 24, 48, and 72 at 37 ° C and 5% CO2. Incubated for 96 hours.
  • the remaining culture solution was removed and the final 500 ⁇ g / ml MTT solution (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) was added. Diluted in the culture solution to ml to add to the cells and incubated for 3 hours at 37 °C, 5% CO2 conditions. After the remaining MTT solution was removed, 150 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added thereto, and the reaction was performed at room temperature for 20 minutes. After the reaction was completed, the absorbance was measured using a microplate reader.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • FIG. 5A the relative viability of the HepG2 cell line and the Hep3B cell line was measured with increasing concentrations for each of the treated peptides.
  • FIG. 5a it can be seen that peptide 5C and peptide 5-2C more effectively inhibit the growth and induce cell death of liver cancer cell line than FQI1.
  • Example 5.4 Human Blood cell cancer Cell Viability Assay by Peptides 5C and 5-2C in Cell Lines
  • 5E graphically shows the results of measuring the relative viability as the concentration increases for each of the treated peptides for the 293T cell line.
  • peptides 5C and 5-2C induce growth inhibition and cell death of blood cancer cell lines similarly to FQI1.
  • Example 5.6 Analysis of Cell Viability by Peptides 5C and 5-2C in Human Lung Epithelial and Breast Epithelial Cell Lines
  • FQI1, peptide 5C, and peptide 5-2C in human lung epithelial cell line (BEAS2B) and human breast epithelial cell line (MCF10A) were confirmed whether they exhibited the effect of inhibiting growth and cell death of cancer cells.
  • FIG. 5F graphically shows the results of measuring the relative viability of MCF10A cell line and BEAS2B cell line with increasing concentration for each peptide treated.
  • BEAS2B and MCF10A cell lines are normal epithelial cell lines, not cancer cells, and are generally used as normal controls in anticancer assays.
  • FQI1 shows cytotoxicity in a concentration-dependent manner
  • peptide 5C shows low cytotoxicity compared to FQI1.
  • peptide 5-2C shows little cytotoxicity even at a concentration of 10 ⁇ M. It can be seen that.
  • Example 5.1 In a manner similar to Example 5.1, it was confirmed whether FQI1, peptide 5C, and peptide 5-2C showed cancer cell growth suppression and cell death induction in mouse primary culture T lymphocytes (non-dividing and dividing activating cells).
  • the spleens of C57BL / 6 mice were removed and tissue cells were isolated by physical methods, and suspended cell suspension was passed through a 0.45 uM mesh. Suspended cells isolated CD4 + T cells using MACS.
  • the isolated T lymphocytes (2.5 x 10 5 cells / well) were cultured in a restoring state of T lymphocytes in a culture solution containing 10% serum, and the anti-CD3 and anti-CD28 were separated on a plate coated with Activated T lymphocytes were cultured by culturing one T lymphocyte (2.5 ⁇ 10 5 cells / well).
  • Figure 5h shows the results of measuring the relative viability of the hMSC cell line as the concentration increases for each peptide treated.
  • hMSC cells are normal cell lines, not cancer cells.
  • FQI1 shows cytotoxicity in a concentration-dependent manner, while peptide 5-2C shows little cytotoxicity even at high concentrations. It can be seen that.
  • FIG. 5i graphically shows the results of measuring the relative viability with increasing concentration for each of the hESCs treated with rhodamine-unlabeled MEF cells (top) or rhodamine-labeled MEF cells (bottom). Since the epithelial cells in Example 5.6 showed little toxicity to all treated materials, the cell viability measured in this experiment means the viability of hESC. Referring to FIG. 5I, it can be seen that FQI1 shows cytotoxicity in a concentration-dependent manner and peptide 5C shows some cytotoxicity at high concentrations, while peptide 5-2C shows little cytotoxicity at high concentrations.
  • Example 5 Human Hematopoietic Stem Cells Derived Analysis of Cell Viability by Peptides 5C and 5-2C in Cells Differentiating to Erythrocytes
  • FQI1 FQI1, peptide 5C, peptide 5 in hematopoietic progenitor cells (HPC), CD34 + harvested from human peripheral blood, and cells undergoing differentiation into erythrocytes (differentiation 3, 7, 14) in a manner similar to Example 5.1 It was confirmed whether -2C shows the effect of inhibiting growth and cell death of cancer cells. In this experiment, cells were prepared and cultured in the same manner as in Example 4.4.
  • Figure 5j graphically shows the results of measuring the relative viability of the hematopoietic stem cells in each treatment group and cells inducing differentiation from the erythrocyte series (differential 3, 7, 14 days) according to the increase in concentration for each treated material It was. Referring to FIG. 5J, even if all the drugs including peptide 5-2C were treated up to 10 ⁇ M, cytotoxicity was hardly observed.
  • Figure 5k shows the results of photographing the well plate obtained at the time point 76 hours (Example 5.10) or 96 hours after the peptide treatment of the MTT analysis data performed in Examples 5a to 5j.
  • Figure 6a shows the results of the experiment, referring to it can be seen that the CP2c overexpressed in various cancer cell lines.
  • Example 7.1 Determination of IC50 Value Following Peptide 5-2C Treatment in Various Cancer Cell Lines and Normal Cell Lines
  • IC50 values were calculated according to peptide 5-2C treatment for 48 hours using the Graph Prism Pad 6 program (IC50 values were calculated for each Concentration when cells die 50% when treated).
  • IC50 values were measured over time using the Graph Prism Pad 6 program.
  • FIG. 7B shows a graph for calculating IC50 values and the calculated IC50 values after 48 and 96 hours after peptide 5-2C treatment for each cell line.
  • the IC50 values at 48 and 96 hours in each cell line are similar, suggesting that the growth inhibition and cell death inducing effect of the cells is sustained up to 96 hours by the treated peptide 5-2C.
  • Example 7.3 MCF10A Cell lines and BEAS2B In the cell line FQI1 Determination of IC50 Values Following Treatment with Peptide 5C, Peptide 5-2C
  • IC50 values for FQI1, peptide 5C and peptide 5-2C were determined using the Sigma plot program. Calculated.
  • Example 8 by peptides 5-2C and 5-2D Cancer cell Growth inhibition and Cell death Induction Comparative Analysis: Quantitative Measurement of Cell Viability with MTT Assay
  • Peptide 5-2C binds to the Pro terminus of an RGD peptide sequence (CRGDKGPDC; SEQ ID NO: 2) that binds to the neuropilin 1 receptor in order to increase cell penetration into peptide 5-2 (SEQ ID NO: 1).
  • RGDKGPDC RGD peptide sequence
  • SEQ ID NO: 2 RGD peptide sequence
  • peptide 5-2 induces cancer cell specific growth inhibition and cell death.
  • the peptide 5-2 proceeds by the peptide 5-2 rather than the RGD sequence itself, it is necessary to confirm the peptide 5-2 using a peptide combined with other cell penetrating peptides. There is.
  • peptide 5-2D was confirmed in breast cancer cell lines (MCF7, MDA-MB-231) whether growth inhibition and cell death induction of cancer cells.
  • FIG. 9a shows the relative viability of the MCF7 cell line and the MDA-MB-231 cell line as a result of increasing the concentration of peptide 5-2D using the physiological saline treatment group and the peptide 5-2C treatment group as negative and positive controls, respectively. Is shown graphically. Referring to FIG. 9A, it can be seen that peptide 5-2D inhibits the growth of breast cancer cell lines and efficiently induces cell death to a similar extent as peptide 5-2C.
  • 9C is a graph showing the results of measuring the relative viability of the HCT116 cell line and the HT29 cell line with increasing concentrations of peptide 5-2D using physiological saline treatment group and peptide 5-2C treatment group as negative and positive controls, respectively. It was. Referring to FIG. 9C, it can be seen that peptide 5-2D inhibits the growth of colon cancer cell lines and induces cell death to a similar extent as peptide 5-2C.
  • Example 8.4 Embryonic kidney cancer Cell Viability Assay by Peptide 5-2D in Cell Lines and Liver Cancer Cell Lines
  • FIG. 9D is a graph showing the results of measuring the relative viability of the 293T cell line and the HepG2 cell line with increasing concentrations of peptide 5-2D using the physiological saline treatment group and the peptide 5-2C treatment group as negative and positive controls, respectively. It was. Referring to FIG. 9D, it can be seen that peptide 5-2D inhibits the growth of embryonic kidney cancer cell line and liver cancer cell line and efficiently induces cell death to a similar extent as peptide 5-2C.
  • FIG. 9E shows relative viability of U937 cell line, Jurkat cell line, HL60 cell line, and HEL cell line as physiological saline treatment group and peptide 5-2C treatment group as negative and positive controls, respectively.
  • One result is shown graphically. Referring to FIG. 9E, it can be seen that peptide 5-2D inhibits the growth of blood cancer cell lines and induces cell death to a similar extent as peptide 5-2C.
  • Example 8.6 Cell Viability Assay by Peptide 5-2D in Human Breast Epithelial Cell Line and Lung Epithelial Cell Line
  • Example 5.1 it was confirmed whether peptide 5-2D showed cancer cell growth inhibition and cell death induction in breast epithelial cell line (MCF10A) and lung epithelial cell line (BEAS2B).
  • MCF10A breast epithelial cell line
  • BEAS2B lung epithelial cell line
  • FIG. 9F is a graph showing the results of measuring the relative viability of the MCF10A cell line and the BEAS2B cell line with increasing concentrations of peptide 5-2D using physiological saline treated groups and peptide 5-2C treated groups as negative and positive controls, respectively. It was. Referring to FIG. 9F, it can be seen that peptide 5-2D has no effect on growth and cell death of breast epithelial cell lines and lung epithelial cell lines to a similar extent as peptide 5-2C.
  • Fig. 9G shows the results of photographing a well plate obtained at the time point 96 hours after peptide treatment among the MTT analysis data performed in Examples 8.1 to 8.6.
  • IC50 values were calculated according to peptide 5-2C treatment for 48 hours using the Graph Prism Pad 6 program (IC50 Value refers to the concentration at which 50% of cells died upon treatment of each material).
  • FIG. 10 shows a graph for calculating IC50 values for peptides 5-2C and 5-2D and calculated IC50 values for each cell line.
  • peptide 5-2D is similar to peptide 5-2C. While there is little effect on growth inhibition and cell death induction in normal control cell lines, various cancer cell lines show IC50 values on average of about 3 ⁇ M, although there is a slight difference in each cell line.
  • peptide 5-2 itself induces cancer cell-specific growth inhibition and cell death even when connecting peptides that promote cell penetration such as RGD or dNP2 to the C-terminus and N-terminus of the peptide, respectively.
  • Example 10 Analysis of Tumor Growth Inhibitory Effect and Prediction of Physiological Toxicity by Peptide 5-2C Treatment in Various Cancer Cell Line Transplanted Mouse Model
  • Example 10.1 Glioblastoma Analysis of Tumor Growth Inhibitory Effect and Prediction of General Physiological Toxicity by Peptide 5-2C Treatment in a Mouse (U343) Transplanted Mouse Model
  • Peripheral blood was collected from the mouse eye artery using an EDTA coated microcapillary and stored in a 5.4 mg EDTA coated blood collection tube.
  • tumors and major organs were extracted through dissection.
  • the collected blood was analyzed using a Coulter LH 750 Hematology analyzer for basic CBC (complete blood cell count) analysis.
  • the tumor was weighed, stained with 4% formaldehyde with the major organs, and then tissue-treated through paraffin sections. Hematoxylin / eosin staining was performed after lamella was made.
  • Various acquired data were statistically analyzed using Excel program.
  • Figure 11 shows the results of the tumor growth inhibitory activity and physiological characteristics of peptide 5-2C in a mouse model transplanted with U343 glioblastoma cell line.
  • Figure 11a shows the measured volume of the tumor during the experiment
  • Figure 11b shows the change in the weight of the mouse.
  • Figure 11c is a photograph of the mouse 70 days after the peptide administration
  • Figure 11d is a photograph of the tumor removed
  • Figure 11e shows the weight and average of the tumors extracted from each mouse in each group.
  • FIG. 11F shows various standard CBC indices by group
  • FIG. 11G shows H / E staining of major organs (spleen, liver, lung and kidney).
  • Example 10.2 Skin epithelial cancer Analysis of Tumor Growth Inhibition and Prediction of General Physiological Toxicity by Peptide 5-2C Treatment in a Mouse Line (A431) Transplanted Mouse Model
  • the isolated tumor was weighed, stained with 4% formaldehyde with major organs, and then tissue sections were made through paraffin sections, followed by hematoxylin / eosin staining. Various acquired data were statistically analyzed using Excel program.
  • FIGS. 12A to 12D show the results of analyzing tumor growth inhibitory ability and physiological characteristics of peptide 5-2C in an animal model transplanted with an A431 skin epithelial cancer cell line.
  • Figure 12a is a measure of the volume of the tumor during the experimental period
  • Figure 12b is a photograph of the mouse immediately before the sacrifice and the extracted tumor
  • Figure 12c is the weight of the tumor extracted from each mouse in each group and their average It is shown.
  • 12D shows H / E staining of major organs (spleen, liver, lung, kidney, blood vessels and muscles) by group.
  • peptide 5-2C when the peptide 5-2C was injected into the vein by 5 times once every two days, the volume and weight of the A431 dermal epithelial cancer cell line-derived tumors could be reduced by more than 70% and 60%, respectively. In addition, the tissue / anatomy of major organs did not show any change. Taken together, peptide 5-2C can efficiently inhibit the growth of skin epithelial cancer cell line derived tumors when administered via intravenous vascular infusion.
  • Example 10.3 Breast cancer cell line ( MDA -MB-231) Analysis of Tumor Growth and Metastasis Inhibition and Prediction of General Physiological Toxicity by Peptide 5-2C Treatment in Transplanted Mouse Models
  • the collected blood was subjected to basic CBC analysis using a Coulter LH 750 Hematology analyzer. Tumors were weighed, stained with 4% formaldehyde with major organs, and tissue slices were made through paraffin sections, followed by hematoxylin Eosin staining was performed. Various acquired data were statistically analyzed using Excel program.
  • FIG. 13A to 13D show the results of analyzing the metastasis capacity of the peptide 5-2C to the lung, tumor growth inhibitory ability, and physiological characteristics in an animal model transplanted with MDA-MB-231 cell line (LM1 cells) capable of metastasis to the lung.
  • Figure 13a is a photograph of the sacrificed mice at 30 days after breast cancer cell line injection and a picture of the extracted tumor
  • Figure 13b shows the weight and average of the tumors extracted from each mouse by group.
  • FIG. 13C shows the mean and standard deviation of tumor foci number metastasized to lung by group.
  • Figure 13d shows the CBC index by group.
  • the tumor weight of the MDA-MB-231 breast cancer cell transplanted tumor model mice with confirmed metastasis to the lungs was reduced by 30% compared to the control group when peptide 5-2C was injected through the vein.
  • the number of foci in tumors that had metastasized to the lungs was reduced by 50%.
  • the CBC index was similar to that of the peptide 5-2C injection group compared to the control group, but specifically, the control mice transplanted with the breast cancer cell line had twice the leukocyte counts compared to those of the normal mice. Near values were shown (FIG. 13D).
  • peptide 5-2C can suppress tumor growth as well as tumor metastasis in breast cancer cell transplant mouse model, and does not cause hematologic toxicity, but rather raises normal WBC levels following cancer cell transplantation. It can also show healing effects.
  • 293T cells were inoculated into 12 well plates with 1 ⁇ 10 5 cells per well, and 12 hours later, the reporter vector (wild type reporter linked the enhancer sequence of the GATA-1 gene with two repeated CP2c binding sites on top of the luciferase gene. Mut 1/3, Mut 2/4, and Mut 1-4 reporters cause mutations in CP2c binding sites present in the enhancer sequence), and various combinations of Flag-CP2c, HA-CP2b, and HA-PIAS1 expression vectors. It was transfected using the effectene method.
  • FQI1, peptide 5C, peptide 5-2C were treated at 2 ⁇ M concentration and incubated for 48 hours, and then the cells were harvested and cell extracts were collected using 250 ⁇ L of passive cell lysis buffer (Promega). Got it.
  • the activity of luciferase, which is a marker gene, in GLOMAX (Promega) was measured using 20 ⁇ l of cell extract and double-luciferase assay kit (Promega) (expression of each expression vector was confirmed by Western blot experiment).
  • FIG. 14A to 14E show measurement results.
  • FIG. 14A shows measurement results performed using a reporter vector having a normal CP2c target sequence shown in FIG. 14E.
  • FIGS. 14B to 14D show mutations 2/4 and 1/3, respectively.
  • FIG. 14E is a diagram of normal and respective mutant sequences. 14a to 14e, it can be seen that peptides 5C and 5-2C inhibit CP2c-mediated transcriptional activity more effectively than FQI1.
  • Example 12 Cancer cell specific growth arrest following peptide 5-2C treatment and Cell death Mechanism of action of induction
  • MEL, K562, MCF-10A and MDA-MB-231 cells were inoculated with 5 ⁇ 10 5 cells in 100 mm dishes, respectively, and 24 hours later, peptide 5-2C concentrations reached final 0, 1, 2, 3, 10 ⁇ M. Treated as possible. After 48 hours after peptide 5-2C treatment, cells were harvested via trypsin treatment, and then 1 ⁇ 10 6 cells were suspended in 0.5 ml PBS and allowed to separate into single cells via pipetting. The cell suspension was transferred to a centrifuge tube containing 4.5 mL of 70% ethanol and left at 4 ° C. for 2 hours to fix the cells.
  • FIG. 15A to 15C show various concentrations of peptide 5-2C (0) in various cell lines (MEL, K562, MCF-10A and MDA-MB-231) to analyze the effect on the cell cycle by peptide 5-2C. , 1, 2, 3, 10 ⁇ M) cell cycle analysis through the FACS 48 hours after treatment.
  • Figure 15a shows the distribution of cells according to the size of the nucleus during FACS analysis
  • Figure 15b is a diagram quantifying the distribution of cells by cell cycle
  • Figure 15c is an enlarged diagram illustrating only the cell distribution of subG1 phase showing cell death to be.
  • the MCF-10A cell line in which growth stop and induction of cell death was not well induced in peptide 5-2C treatment, also showed little change in cell cycle by peptide 5-2C treatment, while at high concentration (10 uM).
  • the subG1 phase cells increased significantly only at high concentrations in FACS analysis.
  • the K562 and MDA-MB-231 cell lines induced growth-suspension and cell death sensitive to peptide 5-2C, the increase of subG1 cells with the decrease of S-phase cells and the increase of G2 / M cells was observed. -2C treatment concentration dependent.
  • cancer cell-specific growth arrest and cell death-induced phenomena induced by peptide 5-2C are caused by cell growth stopped due to inhibition of G2 / M phase transition in the cell cycle.
  • FIG. 16A to 16D show the results of analyzing the expression of cell cycle related marker genes according to treatment time and concentration of various peptides 5-2C in MCF7 cell line by Western blot method.
  • FIG. 16A is a Western blot photograph analyzing the expression of various cell cycle-associated marker genes over time while treating 2 ⁇ M of peptide 5-2C for 72 hours.
  • FIG. 16B shows various concentrations (0, 1, 2, 3).
  • 16c and 16d are graphs showing the quantification of the expression changes of the respective marker gene proteins at 16a and 16b, respectively.
  • the peptide 5-2C shows a gradual increase in expression of Cyclin E, p21, p53 with a gradual decrease in the expression of CDK1, Cyclin B1 as the treatment time and the increase in concentration of the peptide 5-2C, peptide 5 It can be seen that 2C causes cell cycle arrest in the G2 phase.
  • Example 12.3. MDA -MB-231 cell line and MCF7 Expression analysis of cell death related marker genes according to peptide 5-2C treatment time and concentration in cell line
  • Example 12 the cell extracts were treated at 0, 24, 48 and 72 hours, respectively, with MDA-MB-231 and MCF7 breast cancer cell lines treated with physiological saline or 2 ⁇ M peptide 5-2C for up to 72 hours.
  • the western blot was obtained using antibodies of various genes related marker genes.
  • FIG. 17 is a Western blot diagram analyzing the expression of cell death-related marker gene proteins by time of treatment of 2 ⁇ M peptide 5-2C in MDA-MB-231 cell line and MCF7 cell line.
  • MCL1 and BCL2 which are anti-cell death related marker genes, gradually decreased with peptide 5-2C treatment time
  • Bim Bax, Bak, cleaved Cas3, Cas8, pro, which were related to cell death promotion, and pro -Cas11 increased while pro-Cas3, pro-cas8, pro-Cas9 and pro-Cas12 gradually decreased.
  • Example 12.3. MDA -MB-231 cell line and MCF10A Analysis of Cell Morphology on Electron Microscope Following Peptide 5-2C Treatment in Cell Lines
  • FIG. 18 is a photograph of the cell morphology of the MDA-MB-231 cell line and the MCF7 cell line after electron microscopy at 24 and 48 hours after treatment with 2 uM peptide 5-2C.
  • Negative controls are cells treated with physiological saline
  • positive controls are cells treated with FQI1 at a concentration of 2 ⁇ M.
  • MCF10A a normal breast epithelial cell line, modifies any intracellular structure by peptide 5-2C treatment. While this did not occur, it was found that FQI1 was accompanied by severe intracellular structural modification, which is consistent with the results of Examples 4, 5, 7 and 8.
  • FITC fluorescence was performed to confirm that iRGD merely plays a role in helping the cellular penetration of peptide.
  • Three labeled peptides (FITC-iRGD, FITC-5-1C and FITC-5-2C) were synthesized, and physiological saline, or such FITC-conjugated MDA-MB-231 cell line, in the same manner as in Example 5.1. MTT assays were performed while peptides were treated for 96 hours to yield cell viability and IC50 values.
  • peptide 5-1 is a peptide consisting of six amino acids from the N-terminus of peptide 5, and does not affect the DNA binding capacity of CP2c (see FIG. 3).
  • each FITC-conjugated peptide was treated for 30 minutes under the same conditions as the method described in Example 5.1, and the wells were washed three times with physiological saline and replaced with fresh medium for 24 hours (after peptide treatment). , 2, 4, 8, 12, 24 hours) phase contrast microscopy and fluorescence micrographs were taken. The photographed cell and fluorescence images were merged using the photoshop program.
  • FIG. 19C Is a well plate photograph showing an example of an MTT assay at 96 hours
  • FIG. 19D is a photograph showing intracellular distribution of peptides over time for 24 hours after treatment with each FITC-conjugated peptide at 2 ⁇ M concentration.
  • 19A to 19D only 5-2C of FITC-conjugated peptides inhibited cell growth, and their IC50 values were similar to those of 5-2C that were not FITC-conjugated, resulting in cancer cells by peptide 5-2C.
  • Specific growth inhibition and cell death induction are effects by the 5-2 peptide itself, iRGD can be seen that only plays a role in helping the intracellular penetration of the peptide.
  • cell infiltration occurs 2 hours after peptide treatment, while peptides 5-2C penetrated into cells accumulate in the nucleus for 24 hours, while other peptides (iRGD and 5-1C) remain in the cytoplasm after penetrating the cell membrane or After 8 hours it can be seen that it is easily degraded.
  • mutant CP2c proteins in which the polar amino acids in the CP2c region to which peptide 5-2C binds were each substituted with Ala, oligonucleotides having sequences encoding the corresponding mutant amino acids were synthesized to determine site-directed mutations (site- directed mutagenesis), nucleotide sequences encoding these mutant CP2c genes were cloned into the pGEX4 vector, and mutant GST-fusion CP2c proteins were purified by using beads bound to antibodies against GST-tags.
  • mutant CP2c binds to the CP2c binding site (CP2c binding sequence on the alpha-globin promoter) was performed in the same manner as in Example 1, and binding of the peptide 5-2CB to the CP2c binding peptide was performed through phage display.
  • the direct ELISA method (Kang et al., FEBS J, 2005; 272: 1265-1277) was used to identify them.
  • the binding between peptide 5-2CB and each mutant CP2c protein was performed using HRP-conjugated streptavidin beads capable of recognizing biotin-tags in peptide 5-2CB.
  • the Rosetta modeling algorithm was used to obtain a tertiary structure prediction model for the 306-396 amino acid region of CP2c.
  • An illustration of CP2c amino acids important for peptide 5-2C binding with target DNA was obtained using the Swissprot program.
  • FIG. 20A to 20D show a comparison of peptide 5-2C with the biotin-tagged peptide 5-2CB on cancer cell survival.
  • Figure 20a shows the results of measuring the relative viability with increasing concentration when the concentration of peptide 5-2C and peptide 5-2CB in two different batches for a single treatment with respect to MDA-MB-231 cell line
  • 20B shows a photograph of a well plate obtained at a time point 96 hours after peptide treatment.
  • FIG. 20C shows a graph for calculating IC50 values at 48 hours after each peptide treatment for MDA-MB-231 cell line and calculated IC50 values
  • FIG. 20D at 48 hours after each peptide treatment for MCF7 cell line.
  • peptide 5-2CB induces cancer cell specific cell growth arrest and cell death similarly to peptide 5-2C, and shows similar IC50 values.
  • peptide 5-2CB is used. This suggests that the present invention can be efficiently used in the experiments shown in FIGS. 21A to 21D below.
  • FIG. 21c shows the results of direct analysis of binding to peptide 5-2C in purified GST-fusion mutant proteins by ELISA method.
  • FIG. 21D is a diagram showing amino acids important for DNA and peptide 5-2C binding to tertiary structures predicted using Rosetta modeling algorithms for the 306-396 amino acid region of CP2c. 21A-21D, the 322-389 amino acid region including alpha-helix of the CP2c protein region is involved in binding of peptide 5-2 as well as recognition of the target sequence of CP2c, in particular E332, R339, R341 and R387 amino acids are important for DNA binding, while E332, R339, R341 and R347 amino acids are important for binding to peptide 5-2.
  • peptide 5-2 competitively binds to E332, R339 and R341, which are important for CP2c target DNA sequencing, thereby making it impossible for CP2c to bind to target sequencing. It can be seen that cancer cell-specific growth arrest and cell death are induced by inhibiting the expression of the CP2c target gene involved.

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Abstract

본 발명은 항암 활성을 갖는 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 전사인자 CP2c에 결합하며 암 예방 및 치료 활성을 갖는 서열번호 1로 표시되는 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다: <서열번호 1> Asn-Tyr-Pro-Gln-Arg-Pro. 본 발명에 따른 펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 암 세포들에 처리할 경우, 매우 높은 안정성으로 세포막을 통과하여 CP2c에 특이적으로 결합할 수 있으며, CP2c의 DNA 결합능을 억제할 수 있고, 이에 따라 CP2c의 활성을 억제함으로써, CP2c가 매개하는 암세포 특이적인 전사활성을 방해하여 암 세포만을 특이적으로 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 암의 예방 및 이를 위한 건강식품 첨가제로서도 활용될 수 있다.

Description

항암 활성을 갖는 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물
본 발명은 항암 활성을 갖는 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
현재까지 많은 천연물 및 단백질 또는 펩티드성 항암제와 화학합성 항암제가 개발되어 사용되고 있으나, 대부분 생체 내 정상세포에도 영향을 나타내는 심각한 부작용을 나타낼 뿐만 아니라, 암종에 따라서, 또한 동일한 암종이라도 환자에 따라서 작동되지 않는 경우가 일반적이다. 이에 따라 전 세계적으로 이러한 문제점들을 해결한 신개념 항암제로서, 생체 내 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서도, 암세포만을 선택적으로 제거할 수 있으면서, 더 나아가 모든 종류의 암세포를 제거할 수 있는 항암제를 개발하고자 많은 연구가 이루어지고 있다.
전사 인자인 CP2c (이는, CP2, Tfcp2, LSF, LBP1, UBP1 등의 명칭으로도 알려져 있음)는 다양한 포유류들에서 널리 발현되며, CP2c의 활성은 세포가 휴지기 (GO)로부터 DNA 복제기 (S)로 진행함에 따라서 정교하게 조절되고, 세포가 G1/S 전이기를 효과적으로 진행하는데 필수적이다. CP2c의 활성 조절은 일반적으로 번역 후 변형을 통해서 수행되며, 그 수준은 일정하게 낮게 유지된다. 그러나, 종양 세포들에서는 CP2c가 과발현되고, 따라서 암 발병에 핵심적인 역할을 하게 된다.
이와 관련하여, 미국 보스턴 대학의 연구진들은 간암 세포주에서 CP2c의 세포 활성을 억제하기 위한 물질로서, 인자 퀴놀리논 억제제 1 (Factor Quinolinone Inhibitor 1, FQI1)을 보고한 바 있는데, 화학적 라이브러리 스크리닝 방법에 의해서 FQI1 및 그 유도체들을 동정한 다음, 세포 및 생쥐 이식 모델에서 성공적으로 정상 세포에는 영향을 주지 않으면서 암세포만을 억제하였다 (Grant et al., Antiproliferative small-molecule inhibitors of transcription factor LSF reveal oncogene addiction to LSF in hepatocellular carcinoma, Proc . Natl . Acad. Sci. 2012; 109(12): 4503-4508).
또한, 본 발명자들 역시 CP2c의 특정 영역을 인식하는 HXPR, PHL, ASR 및 PXHXH, 4가지의 신규 펩티드 모티프에 대해서 보고한 바 있으며 (Kang et al., Identification and characterization of four novel peptide motifs that recognize distinct regions of the transcription factor CP2, FEBS Journal 2005; 272:1265-1277), CP2c가 결합 대상이 되는 단백질의 특이적인 결합 모티프들을 인식하여 상호작용함으로써 다양한 세포 활성을 조절한다는 사실을 제시하였다. 더 나아가, 본 발명자들은 후속 연구에서, DNA-단백질 상호작용을 매우 특이적이고 감도 높게 분석할 수 있는 DNA 면역침전 방법에 기반한 인 비트로 분석 방법을 통해서, CP2c의 DNA 결합을 억제하는 펩티드들을 선별하였으며, 그 결과 12개의 아미노산으로 구성된 펩티드 5가 농도 의존적으로 CP2c-DNA 결합을 억제함을 밝힌 바 있다 (Kim et al., A DNA immunoprecipitation assay used in quantitative detection of in vitro DNA-protein complex binding, Analytical Biochemistry. 2013; 441: 147-151).
따라서, 본 발명에서는 전술한 본 발명자들의 선행 연구결과를 기반으로, 다양한 암종에서 핵심 전사인자로 알려진 CP2c의 활성을 더욱 효과적으로 억제하기 위한 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 전사인자 CP2c에 결합하며 암 예방 및 치료 활성을 갖는 서열번호 1로 표시되는 펩티드를 제공한다:
<서열번호 1>
Asn-Tyr-Pro-Gln-Arg-Pro.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, 상기 펩티드의 C-말단 Pro에는 아미드기가 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에는 하기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가 결합될 수 있다:
<서열번호 2>
Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가 결합하는 경우, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys에는 아미드기가 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에는 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 하기 서열번호 3으로 표시되는 펩티드가 결합되며, 하기 서열번호 3으로 표시되는 펩티드의 N-말단 Lys에는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)가 결합될 수 있다:
<서열번호 3>
Lys-Cys-Lys-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser
단, 상기 서열 중 1번 Lys 및 3번 Lys은 6-아미노헥사노익산 (6-aminohexanoic acid)임.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가 결합하고, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에 상기 서열번호 3으로 표시되는 펩티드가 결합하는 경우, 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys에는 아미드기가 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 하기 서열번호 4로 표시되는 펩티드가 결합될 수 있다:
<서열번호 4>
Lys-Ile-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Lys-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Lys-Ile-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Lys-Gly-Arg-Lys-Gly-Gly.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에 상기 서열번호 4로 표시되는 펩티드가 결합하는 경우, 상기 서열번호 4로 표시되는 펩티드의 N-말단 Lys에는 아세틸기가, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에는 아미드기가 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에는 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가 결합하고, 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys의 ε-NH2에는 비오틴이 결합된 Lys이 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가 결합하고, 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys의 ε-NH2에 비오틴이 결합된 Lys이 결합되는 경우, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, 또한 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys의 ε-NH2에 비오틴이 결합된 C-말단 Lys에 아미드기가 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드들을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드들을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 암 세포들에 처리할 경우, 매우 높은 안정성으로 세포막을 통과하여 CP2c에 특이적으로 결합할 수 있으며, CP2c의 DNA 결합능을 억제할 수 있고, 이에 따라 CP2c의 활성을 억제함으로써, CP2c가 매개하는 암세포 특이적인 전사활성을 방해하여 암 세포만을 특이적으로 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 암의 예방 및 이를 위한 건강식품 첨가제로서도 활용될 수 있다.
도 1은 총 6개의 영역들로 이루어진 전장 CP2c 서열 및 N-말단 및 C-말단이 결실된 다양한 CP2c 돌연변이들의 서열들을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 5종의 CP2c 결합 펩티드 (펩티드 5, 펩티드 8, 펩티드 13, 펩티드 21, 및 펩티드 31)들에 대해서 DNA 면역침전 (DNA immunoprecipitation, DIP) 분석을 수행함으로써 DNA-CP2c 복합체의 결합 친화도를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 펩티드 5, 펩티드 8, 펩티드 5-1 및 펩티드 5-2에 대해서 DIP 분석을 수행함으로써 DNA-CP2c 복합체의 결합 친화도를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 4a 내지 4e는 다양한 암세포주들 및 정상 사람 줄기세포와 분화세포에 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C를 각각 첨가하여 배양한 후 촬영한 현미경 사진들이다. 도 4a에 나타낸 사진은 간암 세포주 (HepG2, Hep3B), 태아 신장 세포주 (293T), 유방암 세포주 (MVCF7, MDA-MB-231), 혈구암 세포주 (K562, MEL, HEL, HL60), 교아종 세포주 (U251, U373MG, U87MG)이며, 도 4b는 여러 조직 기원의 상피 세포주 (MCF10A, BEAS2B), 일차 배양한 생쥐 T 림파구 (비분열 및 분열 활성화 세포) 및 사람 간엽줄기세포 (hMSC)이며, 도 4c에 나타낸 사진은 맘모스피어 (mammosphere) 배양 중인 MCF7, 293T, MBA-MB-231 세포주이며, 도 4d는 섬유아세포와 공배양 중인 사람 배아줄기세포 (hESC)이고, 도 4e는 사람 조혈모세포 (HPC)와 이로부터 적혈구로의 분화과정 중의 세포 (분화 유도 후 3일, 7일 및 14일 째 세포)이다.
도 5a 내지 5j는, HepG2 세포주 및 Hep3B 세포주 (5a), MCF7 세포주 및 MDA-MB-231 세포주 (5b), U251 세포주, U87MG 세포주 및 U343 세포주 (5c), K562 세포주, HEL 세포주 및 HL60 세포주 (5d), 293T 세포주 (5e), MCF10A 세포주 및 BEAS2B 세포주 (5f), 일차 배양한 생쥐 T 림파구 (비분열 및 분열 활성화 세포) (5g), hMSC 세포주 (5h)와 hESC 세포주 (5i), 그리고 조혈모세포 (HPC)와 이로부터 적혈구 세포로의 분화유도 중인 세포 (3일, 7일 및 14일) (5j)에 대해서, FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C의 농도를 증가시켜주며 1회 처리한 경우, 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 5k는 펩티드 처리 후 96 시간이 경과한 시점에서 얻어지는 웰 플레이트를 촬영한 사진이다.
도 6a 및 6b는 대장암 세포주 6종, 폐암 세포주 6종, 유방암 세포주 3종, 교아종 세포주 3종, 자궁 경부암 세포주 1종 (6a)과, 혈구암 세포주 (MEL, K562, HEL, HL60), 간암 세포주 (HepG2, Hep3B), 피부 상피암 세포주 (A431), 대장암 세포주 (HCT116), 여러 조직에서 기원한 상피 세포주 (293T, BEAS2B, MCF10A) 및 hMSC 세포주 (6b)에서 CP2c 단백질의 발현량을 비교 분석하기 위해 수행한 웨스턴 블랏 실험 결과를 도시한 사진이다.
도 7a 및 7b는 상기 도 5에서 나타낸 세포주들에 대하여 펩티드 5-2C 처리 후 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이다. 도 7a는 각 세포주에서 5-2C를 1회 처리 후 48시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이며, 도 7b는 교아종세포주들 (U343, U373MG, U251, U87MG)을 대상으로 펩티드 5-2C를 1회 처리한 후 48시간과 96시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이다.
도 8은 MCF10A 세포주와 BEAS2B 세포주에 각각 FQI1, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C 처리 후 48시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이다.
도 9a 내지 9f는, MDA-MB-231 세포주 및 MCF7 세포주 (9a), U343 세포주 및 U87MG 세포주 (9b), HCT116 세포주 및 HT29 세포주 (9c), 293T 세포주 및 HepG2 세포주 (9d), U937 세포주, Jurkat 세포주, HL60 세포주 및 HEL 세포주 (9e), MCF10A 세포주 및 BEAS2B 세포주 (9f)에 대해서, 펩티드 5-2C 및 펩티드 5-2D의 농도를 증가시켜주며 1회 처리한 경우, 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 9g는 펩티드 처리 후 96 시간이 경과한 시점에서 얻어지는 웰 플레이트를 촬영한 사진이다.
도 10은 도 9에서 나타낸 세포주들에 대하여 펩티드 5-2C 및 펩티드 5-2D처리 후 48시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이다.
도 11a 내지 11g는 U343 교아종 세포주를 이식한 생쥐모델에서 펩티드 5-2C의 종양성장억제능과 생리 특성을 분석한 결과를 도시한 것이다. U343 교아종세포주 (2.5 x 106 cells/50 μl)를 수컷 BALB/C nude 생쥐 (n = 6/그룹)의 등쪽 피하에 주입하여 종양의 크기가 80 mm3 정도로 자란 시점부터 3일에 한 번씩 펩티드 5-2C (3 mg/Kg)를 종양 부위에 직접 주입하면서 생쥐의 몸무게와 종양의 부피를 측정하였고, 70일 경과 후 생쥐를 희생시켜 종양, 혈액 및 주요 장기를 적출하였다. 도 11a는 실험 기간 중 종양의 부피를 측정하여 도시한 것이고, 도 11b는 생쥐의 몸무게의 변화를 도시한 것이다. 도 11c는 펩티드 투여 70일 경과 후의 생쥐 사진이며, 도 11d는 적출한 종양의 사진이고, 도 11e는 각 생쥐에서 추출한 종양의 무게 및 평균을 도시한 것이다. 도 11f는 그룹별 각종 표준 혈액 지수 (blood indices)를 도시한 것이며, 도 11g는 주요 장기 (비장, 간, 폐 및 신장)의 H/E 염색사진을 도시한 것이다.
도 12a 내지 12d는 A431 피부 상피암 세포주 (human epidermoid carcinoma cell line)를 이식한 동물모델에서 펩티드 5-2C의 종양성장 억제능과 생리 특성을 분석한 결과를 도시한 것이다. A431 세포주 (5 x 106 cells/100 μl)를 7주령 수컷 BALB/C nude 생쥐 (n = 4/그룹)의 등쪽 피하에 주입하여 종양의 크기가 50 mm3 정도로 자란 시점부터 2일에 한 번씩 펩티드 5-2C (1 x IC50; 1.7 mg/Kg, 2 x IC50; 3.5 mg/Kg)를 총 5회에 걸쳐 꼬리 정맥에 주입하면서 종양의 부피를 측정하였고, 13일 경과 후 생쥐를 희생시켜 종양 및 주요 장기를 적출하였다. 도 12a는 실험 기간 중 종양의 부피를 측정하여 도시한 것이고, 도 12b는 종양을 형성한 생쥐의 사진과 적출한 종양의 사진이고, 도 12c는 각 생쥐에서 추출한 종양의 무게 및 이들의 평균을 도시한 것이다. 또한, 도 12d는 그룹별 주요 장기 (비장, 간, 폐, 신장, 혈관 및 근육)의 H/E 염색사진을 도시한 것이다.
도 13a 내지 13d는 폐 조직으로의 전이가 가능한 MDA-MB-231 세포주 (LM1 cells)를 이식한 동물모델에서 펩티드 5-2C에 의한 폐 조직으로의 전이능과 종양성장억제능 및 생리 특성을 분석한 결과를 도시한 것이다. MDA-MB-231 세포주 (LM1 cells; 1 x 106 cells/40 μl)를 12주령 암컷 BALB/C 누드 생쥐 (n = 5/그룹)의 유방 지방 페드 (mammary fat ped)에 주입한 후 종양의 크기가 50 mm3 정도로 자란 시점부터 3일에 한 번씩 총 5회 펩티드 5-2C (1 x IC50; 1.7 mg/Kg = 52 μg/mouse, 2 x IC50; 3.5 mg/Kg = 104 μg/mouse)를 꼬리 정맥에 주입하면서 종양의 부피를 측정하였고, 종양세포 주입 후 30일째에 생쥐를 희생시켜 종양 및 주요 장기를 적출하였다. 도 13a는 종양을 형성한 생쥐의 사진과 적출한 종양의 사진이고, 도 13b는 각 생쥐에서 추출한 종양의 무게 및 이들의 평균을 도시한 것이다. 또한, 도 13c는 그룹별 폐로 전이된 종양 foci 수의 평균과 표준편차를 도시한 것이고, 도 13d는 그룹 별 혈액의 혈액 지수를 도시한 것이다.
도 14a 내지 14e는 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 의한 CP2c의 전사활성능을 분석하기 위해서, 정상 CP2c 결합부위 및 CP2c에 돌연변이를 지닌 서열들에 대한 루시퍼레이즈 리포터 발현 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 15a 내지 15c는 펩티드 5-2C에 의한 세포주기에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 다양한 세포주 (MEL, K562, MCF-10A 및 MDA-MB-231)를 대상으로 다양한 농도의 펩티드 5-2C (0, 1, 2, 3, 10 μM)를 처리한 후 48 시간 째에 FACS를 통하여 세포주기를 분석한 결과이다. 도 15a는 FACS 분석 시 DNA 양에 따른 세포의 분포를 도시한 것이고, 도 15b는 세포주기 별 세포의 분포를 정량화한 것이며, 도 15c는 세포사를 보이는 subG1 기의 세포분포만을 확대하여 도시한 그래프이다.
도 16a 내지 16d는 MCF7 세포주를 대상으로 펩티드 5-2C의 처리 시간 및 처리 농도에 따른 세포주기 관련 표지 유전자의 발현을 분석한 결과이다. 도 16a는 2 μM의 펩티드 5-2C를 72 시간 동안 처리하면서 시간 경과에 따른 다양한 세포주기 관련 표지유전자 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 사진이며, 도 16b는 다양한 농도 (0, 1, 2, 3 μM)의 펩티드 5-2C를 48 시간 처리한 후 세포주기 관련 표지유전자 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 사진이다. 또한, 도 16c와 16d는 각각 도 16a와 도 16b에서의 각 표지유전자 단백질의 발현 변화를 정량화하여 표시한 그래프이다.
도 17은 MDA-MB-231 세포주와 MCF7 세포주를 대상으로 2 μM 농도의 펩티드 5-2C를 처리한 후 시간별 세포사 관련 표지유전자 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 18은 MDA-MB-231 세포주와 MCF10A 세포주를 대상으로 2 μM 농도의 펩티드 5-2C를 처리한 후, 24 시간과 48 시간에 나타나는 전자현미경 상의 세포형태 사진이다. 음성대조군은 생리식염수를 처리한 세포이며, 양성대조군은 2 μM 농도의 FQI1을 처리한 세포이다.
도 19a 내지 19d는 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 FITC-conjugated 펩티드 5-2C의 시간 경과에 따른 세포내 이동경로를 확인하는 도해이다. 도 19a는 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 생리식염수, 혹은 FITC-conjugated-iRGD, FITC-5-1C 및 FITC-5-2C 펩티드를 각각 0, 0.5, 1, 2, 3, 10 μM 농도로 96 시간 동안 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포성장률 변화를 도해한 도시이고, 도 19b는 처리 후 48 시간에서 나타나는 각 처리군 별 IC50 값 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이며, 도 19c는 96시간에서의 MTT 분석의 예를 보여주는 웰 플레이트 사진이며, 도 19d는 2 μM 농도의 각 FITC-conjugated 펩티드를 처리한 후 24 시간 동안 시간경과에 따른 펩티드의 세포내 분포를 보여주는 사진이다.
도 20a 내지 20d는 펩티드 5-2C에 비오틴-태그를 붙인 펩티드 5-2CB의 암세포 생존에 미치는 영향을 펩티드 5-2C와 비교 분석한 도시이다. 도 20a는 MDA-MB-231 세포주에 펩티드 5-2C 및 서로 다른 두 배치 (batch)의 펩티드 5-2CB의 농도를 증가시켜주며 1회 처리한 경우, 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 20b는 펩티드 처리 후 96 시간이 경과한 시점에서 얻어지는 웰 플레이트를 촬영한 사진이다. 도 20c는 MDA-MB-231 세포주에 대하여 각 펩티드 처리 후 48 시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이며, 도 20d는 MCF7 세포주에 대하여 각 펩티드 처리 후 48 시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이다.
도 21a 내지 21d는 펩티드 5-2C가 결합하는 CP2c 단백질 영역 (아미노산 306에서 396에 해당) 중 DNA 결합 혹은 펩티드 5-2C 결합에 중요한 아미노산을 동정하기 위한 일련의 실험결과를 도시한 것이다. 도 21a는 펩티드 5-2C의 결합영역과 이 부위의 아미노산 서열 중 극성을 나타내는 아미노산을 알라닌으로 치환한 19가지의 GST-융합 돌연변이체 목록을 나타내고 있다. 도 21b는 이러한 돌연변이체들을 대장균에서 과발현시킨 후 GST 항체 비드를 이용하여 순수 정제한 GST-융합 단백질들을 대상으로 방사선 표지된 생쥐 알파-글로빈 프로모터에 존재하는 CP2c 결합부위의 DNA 프로브와의 결합여부를 DNA-IP 방법으로 분석한 결과를 도시하고 있다. 도 21c는 순수 정제한 GST-융합 돌연변이 단백질들을 대상으로 펩티드 5-2C와의 결합여부를 직접 ELISA 방법으로 분석한 결과를 도시하고 있다. 도 21d는 CP2c의 306-396 아미노산 영역을 대상으로 로제타 모델링 알고리듬 (Rosetta modeling algorism)을 이용하여 예측한 3차 구조에 각각 DNA 결합 혹은 펩티드 5-2C 결합에 중요한 아미노산을 표시한 도면이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 전사인자 CP2c에 결합하며 암 치료 활성을 갖는 서열번호 1로 표시되는 펩티드를 제공한다:
<서열번호 1>
Asn-Tyr-Pro-Gln-Arg-Pro.
하기 실시예에서 구체적으로 보여지는 바와 같이 6개의 아미노산으로 이루어지는 상기 서열번호 1의 펩티드는 (이하, '펩티드 5-2'로도 명명) CP2c 단백질과 상호작용함으로써 그 활성을 조절하게 되고, CP2c 단백질은 종양 세포들에서 특이적으로 과발현되는 단백질인 바, 이러한 활성 조절은 궁극적으로 항암 효과로 이어지게 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 12개의 아미노산으로 구성된 펩티드 5가 농도 의존적으로 CP2c-DNA 결합을 억제함을 밝힌 바 있다 (Kim et al., A DNA immunoprecipitation assay used in quantitative detection of in vitro DNA-protein complex binding, Analytical Biochemistry. 2013; 441: 147-151). 그러나, 하기 실시예의 결과로부터도 알 수 있는 바와 같이, 이러한 12개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 5는 정상 대조군 세포주에서도 세포성장 억제 및 세포사를 유도하지만, 본 발명에 따른 상기 6개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 5-2 (이는 펩티드 5 중 후반부 6개의 아미노산으로 이루어진 서열임)는 정상 대조군 세포주의 성장 억제 및 세포사 유도에는 거의 영향을 미치지 않았다. 한편 펩티드 5 중 전반부 6개 아미노산으로 이루어진 펩티드 5-1은 CP2c-DNA 결합능을 억제하지 못할 뿐만 아니라 펩티드 5-1 처리에 의해 정상 대조군 세포군은 물론 암세포주의 성장 억제 및 세포사 유도에 어떠한 영향도 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드는 정상 세포에는 영향을 주지 않으면서도, 암 세포들에만 특이적으로 작용하는 이상적인 암 치료의 가능성을 제시한다.
본 발명에 따른 펩티드 5-2에는 다양한 기능성을 부가하기 위한 변형이 가능한 바, 예를 들어 하기 열거되는 변형된 펩티드들이 제공될 수도 있다.
먼저, 상기 펩티드의 안정성을 높이기 위해서, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, 상기 펩티드의 C-말단 Pro에는 아미드기가 결합될 수 있다 (이하, '펩티드 5-2A'로도 명명).
다음으로, 바람직하게는 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 세포 침투를 높이기 위해서, 뉴로필린 1 수용체 (neuropilin 1 receptor)에 결합하는 iRGD 펩티드 서열 (CRGDKGPDC)을 상기 펩티드의 C-말단 Pro에 결합시킬 수도 있다 (이하, '펩티드 5-2B'로도 명명). 마찬가지로, 상기 펩티드 5-2B의 N-말단 Asn 및 C-말단 Cys에는 각각 아세틸기 및 아미드기가 결합될 수도 있다 (이하, '펩티드 5-2C'로도 명명).
또한, 상기 펩티드 5-2 또는 5-2C의 세포 내 이동경로 및 생체 내 분포를 형광/공초점 현미경과 바이오 이미징 방법으로 용이하게 추적하기 위하여 FITC 형광물질이 포함된 화합물 FITC-(6-아미노헥사노익산)-Cys-(6-아미노헥사노익산)-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly이 상기 펩티드 5-2 또는 5-2C의 N-말단 Asn에 더 결합될 수도 있다 (이하, '펩티드 FITC-5-2' 또는 '펩티드 FITC-5-2C'로도 명명). 마찬가지로, 상기 펩티드 FITC-5-2C의 C-말단 Cys에는 아미드기가 결합될 수도 있다.
더 나아가, 상기 펩티드의 혈액-뇌 장벽 (blood-brain barrier, BBB) 통과 및 세포 침투 효율을 높이기 위해서, 이러한 기능을 나타내는 dNP2 펩티드 서열 (KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRKGG; Lim et al., Nat Commun (2015) 6, 8244)을 상기 펩티드 5-2의 N-말단 Asn에 결합시킬 수도 있다 (이하, '펩티드 5-2D'로도 명명). 역시 마찬가지로, 상기 펩티드 5-2D의 N-말단 Lys에는 아세틸기가, C-말단 Pro에는 아미드기가 결합될 수도 있다.
또한, 상기 펩티드 5-2C와 전사인자 CP2c간의 결합을 용이하게 분석하기 위하여 펩티드 5-2C의 C-말단 Cys의 ε-NH2에는 비오틴이 결합된 Lys이 결합될 수 있다 (이하, '펩티드 5-2CB'로도 명명). 역시 마찬가지로, 상기 펩티드 5-2CB의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, C-말단 Lys에는 아미드기가 결합될 수 있다.
한편, 서열번호 1로 표시되는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 펩티드 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상에게 소정의 물질, 즉 본 발명에 따른 펩티드 유도체 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하고, 이의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예컨대, 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서, "유효 성분으로 함유"라는 용어는, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명에 따른 펩티드가 유효 성분으로 함유되는 한, 약학적으로 허용가능한 다양한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여용의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있고, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용의 경우에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수도 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 건강기능식품 조성물에 유효성분으로서 함유되는 것도 가능한 바, 본 발명에 따른 식품 조성물은 항암 기능이 있는 것으로 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물 형태로 제조할 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 기능성 식품 (functional food), 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태의 식품에 대한 조성물을 포함한다.
상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 정제, 환약, 분말, 캡슐, 껌, 비타민 복합체, 쥬스 및 드링크 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 펩티드를 유효성분으로 하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 펩티드 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 또한, 식품보조첨가제로서, 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함시킬 수 있다. 또한, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수도 있다. 천연 탄수화물의 구체적인 예로는, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 디사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 포함시킬 수도 있다.
더 나아가, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수도 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 펩티드 5에 의한 CP2c-DNA간의 결합 억제
실시예 1.1
생쥐의 CP2c 단백질과 상호작용하는 펩티드 모티프를 규명하기 위해서, 본 발명자들의 선행 연구 (Kang et al., Identification and characterization of four novel peptide motifs that recognize distinct regions of the transcription factor CP2, FEBS Journal. 2005; 272: 1265-1277)에 개시된 바와 같은 파지 디스플레이 (phage display) 방법을 사용하여 5종의 결합 모티프 (펩티드 5, 펩티드 8, 펩티드 13, 펩티드 21, 및 펩티드 31)를 규명하였다.
실시예 1.2
실시예 1.1에서 규명한 5종의 펩티드가 세포 내에서 CP2c에 결합하여 DNA 결합능에 영향을 주는지를 분석하기 위해서, 본 발명자들의 또 다른 선행 연구 (Kim et al., A DNA immunoprecipitation assay used in quantitative detection of in vitro DNA.protein complex binding, Analytical Biochemistry. 2013; 441: 147-151)에 개시된 바와 같은 DNA 면역침전 분석 (DNA immunoprecipitation (DIP) assay)을 수행하였다.
요약하면, 생쥐 적혈구암 (murine erythroid leukemia, MEL) 세포주에 5 mM 헥사메틸렌 비스아세트아미드 (Hexamethylene bisacetamide, HMBA)를 처리하여 분화 유도시킨 후, 분화 2일째에 핵 추출물을 분리하였다. 핵 추출물의 분리는 먼저 세포주 1 × 106 세포들을 수거한 후, PBS로 수세하고 핵 추출 완충용액 A (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)) 200 ㎕를 첨가하고, 4 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 0.6% NP-40를 첨가한 다음 혼탁액을 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 원심분리 후 남아있는 펠렛에 핵 추출 완충용액 C (20 mM HEPES, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)) 50 ㎕를 첨가하여 5-10분간 4℃에서 태핑 (tapping)을 통해 펠렛을 풀어준 후, 원심분리하여 상층액만을 사용하였다.
이어서, 분리한 핵 추출물 5 ㎍과 [α-32p] dCTP로 표지한 DNA 프로브 (생쥐 α-글로빈 프로모터에 존재하는 CP2c 공통 결합 부위에 해당하는 서열로서, α-글로빈 유전자의 개시 코돈에서 -156 ~ -124 부위임. 구체적인 서열은 전술한 Kim et al.의 논문 참조)를 결합 완충용액 (4% 글리세롤, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 및 0.1% NP-40)과 함께 15분 동안 반응시킨 다음, 상기 동정된 CP2c 결합 펩티드 (펩티드 5, 펩티드 8, 펩티드 13, 펩티드 21 및 펩티드 31)의 양을 점점 증가시켜 (0.2, 0.5, 1 ㎍) 첨가한 후, 상온에서 15분 동안 더 반응시켰다. 반응물에 50% 단백질 G-아가로오스 비드 현탁액 20 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 결합을 제거한 후, 항-CP2c 항체 (Cosmo genetech) 2 ㎍을 넣어 4 ℃에서 10시간 동안 반응시켰다. CP2c 항체에 결합된 반응물에 50% 단백질 G-아가로오스 비드 현탁액 20 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 세포 용해 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)으로 3회 수세하였다. CP2c가 결합된 DNA 프로브에 용출 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 및 1% 소듐 도데실 설페이트)을 첨가하고 65 ℃에서 1시간 동안 반응시켜 DNA 프로브에서 CP2c 단백질을 제거하고 남아있는 DNA 프로브의 양을 신틸레이션 계수기 (scintillation counter)를 이용하여 측정하였다.
도 1에는 총 6개의 영역들로 이루어진 전장 CP2c 서열 중에서 어떠한 펩티드 서열들이 CP2c 영역들과 상호작용하는지를 알아보기 위해서, 전장 CP2c 서열 및 N-말단 및 C-말단이 결실된 다양한 CP2c 돌연변이체들의 서열을 개략적으로 도시하였다. 또한, 도 2에는 동정된 5종의 CP2c 결합 펩티드 (펩티드 5, 펩티드 8, 펩티드 13, 펩티드 21 및 펩티드 31)들에 대해서 DIP 분석을 수행함으로써 DNA-CP2c 복합체의 결합 친화도를 측정한 결과를 도시하였다. 도 1 및 2를 참조하면, 펩티드 5가 농도 의존적으로 CP2c-DNA간의 결합을 특이적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 2. 펩티드 5-1 및 5-2에 의한 CP2c-DNA간의 결합 억제
12개의 아미노산 서열로 이루어진 CP2c 결합 펩티드 5를 이등분하여 각각 6개의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 5-1과 5-2를 합성하였다. 이후, 펩티드 5-1 및 5-2가 CP2c의 DNA 결합능을 억제하는 정도를 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다.
도 3에는 펩티드 5, 펩티드 8, 펩티드 5-1 및 펩티드 5-2에 대해서 DIP 분석을 수행함으로써 DNA-CP2c 복합체의 결합 친화도를 측정한 결과를 도시한 그래프이다. 도 3을 참조하면, 펩티드 8과 펩티드 5-1은 CP2c의 DNA 결합능을 억제하는 정도가 미미하지만, 펩티드 5-2는 펩티드 5와 거의 동일한 정도로 CP2c와 DNA간의 결합을 특이적으로 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 본 발명에 따른 합성 펩티드의 구조 및 특성화
실시예 1 및 2에 서술된 CP2c 결합 펩티드들은 매우 불안정하여, 배양 중인 세포에 처리될 경우 배양액 중에서 쉽게 분해되는 경향이 있고, 더 나아가 세포에 처리될 경우 세포막을 통과하는 것이 용이하지 못하여 인 비보 실험 수행에 한계점을 나타낸다. 따라서, 펩티드의 안정성을 향상시키고, 세포 투과도를 높이기 위한 변형을 가해줄 필요성이 있다. 이러한 문제점을 보완하기 위해서, 펩티드의 안정성을 높이기 위한 변형으로서, N-말단과 C-말단에 각각 아세틸기와 아미드기를 부착하고, 또한 세포 침투를 높이기 위한 변형으로서, 뉴로필린 1 수용체 (neuropilin 1 receptor)에 결합하는 iRGD 펩티드 서열 (CRGDKGPDC)을 부착시킨 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C를 제조하였으며, 각 펩티드 서열들을 하기 표 1에 열거하였다 (펩티드의 합성은 pepMic Co.,Ltd에서 진행함).
펩티드 펩티드 서열 이론 pI (-)로 대전된 잔기의 개수 (+)로 대전된 잔기의 개수 예측 반감기 (시간) 불안정 지수 상대 친수/소수성
5 HERRESNYPQRP 8.75 2 3 3.5 115.33 (불안정) -3.000
5C Ac-HERRESNYPQRPCRGCRGDKGPDC-Amide 8.31 4 5
5-2 NYPQRP 8.75 0 1 1.4 93.10 (불안정) -2.667
5-2C Ac-NYPQRPCRGDKGPDC-Amide 8.31 2 3
실시예 4. 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 의한 암세포주의 성장 억제 및 세포사 유도 분석에 대한 현미경 관찰
실시예 4.1. 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 의한 정상 세포주 및 암세포주의 성장 억제 및 세포사 유도 분석에 대한 현미경 관찰
간암 세포주 (HepG2, Hep3B), 배아 신장 세포주 (293T), 유방암 세포주 (MCF-7, MDA-MB-231), 혈액종양 세포주 (K562, HEL, HL60), 교아종 세포주 (U251, U373MG, U87MG), 유방 상피 세포주 (MCF10A), 폐 상피 세포주 (BEAS2B), 인간 중간엽 줄기세포 (hMSC), 마우스 일차 T 세포 (비분열 및 분열 활성화 세포)를 96 웰 플레이트에 각각 3000 세포/웰로 접종한 후, 배양액 50 ㎕를 넣고, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 각각의 세포주가 접종된 웰 플레이트에 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C를 각각 2 μM 농도로 첨가한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 역상 위상차 현미경 (inverted phase contrast microscope)으로 세포를 관찰하고 형태적 변화를 촬영하였다.
도 4a에는 각종 암세포주에서 관찰된 현미경 사진들을 도시하였으며, 도 4b에는 정상세포주 및 생체 유래 정상 줄기세포 및 분화된 세포에서 관찰된 현미경 사진들을 도시하였다. 도 4a와 b를 참조하면, FQI1는 농도 의존적으로 암세포주 뿐만 아니라 정상 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 유도하는 반면, 펩티드 5-C 및 5-2C는 정상 세포주에는 거의 영향을 미치지 않고, 암세포주에서 특이적으로 성장을 억제하고 세포사를 유도하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4.2. 펩티드 5-2C에 의한 맘모스피어 ( mammosphere ) 배양 중인 암세포주의 성장 억제 및 세포사 유도 분석에 대한 현미경 관찰
암세포주 (MCF-7, 293T, MDA-MB-231)를 polyHEMA로 코팅된 100 파이 페트리디쉬에 각각 1 x 104 세포/ml로 접종한 후, 각각의 세포주가 접종된 배양용기에 생리식염수 및 펩티드 5-2C를 각각 2 μM 농도로 첨가하였으며, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 4일 동안 배양하였다. 1회/일 역상 형광 현미경 (inverted fluorescence microscope) 하에서 세포를 관찰하고 형태적 변화를 촬영하였다. 도 4c에는 일 별 각 세포주에서 관찰된 맘모스피어 현미경 사진들을 도시하였다. 도 4c를 참조하면, 암세포주를 맘모스피어 배양할 경우 암 줄기세포 (cancer stem cells)의 수가 증가한다고 알려져 있는데, 펩티드 5-2C 처리에 의해 맘모스피어 형성이 효과적으로 억제되며 세포 성장도 감소하는 것으로 보아 펩티드 5-2C는 암 줄기세포의 생성 억제 및 세포사를 유도할 것임을 암시한다.
실시예 4.3. 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 의한 배아상피세포 상에서 공배양 중인 배아줄기세포주의 성장 억제 및 세포사 유도 분석에 대한 현미경 관찰
사람 배아줄기세포주 (H9)를 정상 혹은 로다민 형광 염색된 배아상피세포가 깔린 96웰 플레이트에 각각 2개의 콜로니를 접종한 후 24시간 배양하였다. 각각의 세포주가 접종된 웰 플레이트에 생리식염수, FQI1, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C를 각각 농도 (0, 0.5, 1, 2, 3, 10μM)를 증가시켜 가며 첨가하였으며, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 역상 위상차 혹은 위상형광 현미경 (inverted fluorescence microscope) 하에서 세포를 관찰하고 형태적 변화를 촬영하였다.
도 4d는 72시간 동안 각 처리군별 처리농도에 따른 콜로니의 현미경 사진(상)과, 10 μM 농도 처리군에서의 대표적인 배아줄기세포 콜로니와 형광표지된 공배양 세포의 형광 현미경 사진 (하)을 도시하였다. 도 4d(상)의 맨 오른쪽 붉은색 테두리로 표시된 사진들은 10 μM 처리한 각 그룹의 사진 내의 상자부분을 확대한 사진들이다. 도 4d를 참조하면, FQI1과 펩티드 5C의 경우 3 μM 이상의 농도에서 배아줄기세포 및 공배양 세포주가 세포사 하는 반면, 펩티드 5-2C 처리군의 경우 10 μM 농도에서도 배아줄기세포 및 공배양 세포는 전혀 죽지 않았다. 따라서, 펩티드 5-2C는 상기 실시예 4.1에 나타낸 정상 세포주에서의 결과에 비추어 전능성 줄기세포에도 성장억제나 세포사를 나타내지 않음을 암시한다.
실시예 4.4. 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 의한 조혈모세포와 이로부터 유래된 적혈구로의 분화과정 중인 세포의 성장 억제 및 세포사 유도 분석에 대한 현미경 관찰
사람의 말초혈액에서 수획한 CD34+인 조혈모세포 (hematopoietic progenitor cells, HPC) 및 적혈구로의 분화과정 중인 세포 (분화 3, 7, 14일)에 생리식염수, FQI1, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C의 농도를 증가시켜 가며 72시간 처리한 후, 역상 위상차 현미경 하에서 세포를 관찰하고 형태적 변화를 촬영하였다. CD34+ 조혈모세포는 1% BSA가 함유된 IMDM 배지에서 배양하였으며, 적혈구로의 분화 유도의 경우 처음 7일간에는 배지에 추가적으로 EPO, SCF, IL-3, 하이드로코르티손 (Hydrocortisone)을 넣어 배양하였으며, 이후에는 EPO, SCF, IL-3만을 배지에 첨가하여 배양하였다.
도 4e는 각 처리군 별 조혈모세포 및 이로부터 적혈구 계열로 분화유도 중인 세포 (분화 3, 7, 14일)에서의 현미경 사진을 도시한 것이다. 도 4e를 참조하면, 펩티드 5-2C를 포함하여 모든 약물을 10 μM까지 처리하더라도 세포의 성장억제 및 세포사는 나타나지 않았다.
실시예 5. 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 의한 암 세포주의 성장억제 및 세포사 유도 분석: MTT 분석을 통한 세포 생존도의 정량적 측정
실시예 5.1. 간암 세포주에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
간암 세포주 (HepG2, Hep3B)를 96 웰 플레이트에 각각 3000 세포/웰로 접종한 후 배양액 50 ㎕를 넣고, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 간암 세포주가 접종된 웰 플레이트에 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C를 각각 0, 0.5, 2, 3, 10 μM 농도로 1회 첨가한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 24, 48, 72, 96 시간 동안 배양하였다. 각각의 웰 플레이트에서 배양이 완료되면 남아있는 배양액을 제거한 후, MTT 용액 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)을 최종 500 ㎍/ml이 되도록 배양액에 희석하여 세포에 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 3시간 동안 배양하였다. 남아있는 MTT 용액을 제거한 후, 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 150 ㎕를 첨가하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
도 5a에는, HepG2 세포주 및 Hep3B 세포주에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 5a를 참조하면, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C는 FQI1보다 효과적으로 간암 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 유도함을 알 수 있다.
실시예 5.2. 유방암 세포주에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 유방암 세포주 (MCF7, MDA-MB-231)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 5b에는 MCF7 세포주 및 MDA-MB-231 세포주에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 5b를 참조하면, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C는 FQI1보다 효과적으로 유방암 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 더욱 효율적으로 유도함을 알 수 있다.
실시예 5.3. 교아종 세포주에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 교아종 세포주 (U251, U87MG, U343)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 5c에는 U251 세포주, U87MG 세포주 및 U343에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 5c를 참조하면, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C는 FQI1보다 효과적으로 교아종 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 더욱 효율적으로 유도함을 알 수 있다.
실시예 5.4. 인간 혈구암 세포주에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 인간 혈액암 세포주 (K562, HEL, HL60)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는 여부를 확인하였다.
도 5d에는 K562 세포주, HEL 세포주 및 HL60 세포주에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 5d를 참조하면, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C는 FQI1보다 약간 더 효과적으로 혈구암 세포주의 성장 억제와 세포사를 유도함을 알 수 있다.
실시예 5.5. 인간 배아 신장암 세포주에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 인간 배아 신장암 세포주 (293T)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 5e에는 293T 세포주에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 5e를 참조하면, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C는 FQI1과 유사하게 혈액암 세포주의 성장 억제와 세포사를 유도함을 알 수 있다.
실시예 5.6. 인간 폐 상피 세포주 및 유방 상피 세포주에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 인간 폐 상피 세포주 (BEAS2B) 및 인간 유방 상피 세포주 (MCF10A)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 5f에는 MCF10A 세포주 및 BEAS2B 세포주에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. BEAS2B 및 MCF10A 세포주는 암세포가 아닌 정상 상피 세포주로서 일반적으로 항암제 분석 실험에서 정상 대조군으로 사용된다. 도 5f를 참조하면, FQI1의 경우 농도 의존적으로 세포 독성을 나타내는 반면, 펩티드 5C의 경우에는 FQI1에 비해서 낮은 세포 독성을 나타내었으며, 더 나아가 펩티드 5-2C는 10 μM의 농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 5.7. 생쥐 일차배양 T 림파구 세포에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 유사한 방법으로 생쥐 일차배양 T 림파구 세포 (비분열 및 분열 활성화 세포)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다. 본 실험에서는, C57BL/6 생쥐의 비장을 적출한 후 물리적 방법으로 조직세포를 분리하고 0.45 uM 메시를 통과시켜 부유 세포 현탁액을 얻었다. 부유 세포는 MACS를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 분리한 T 림파구 (2.5 x 105 cells/well)는 10% 혈청이 포함된 배양액에서 비분열 상태 (resting state)의 T 림파구를 배양하였으며, 항-CD3, 항-CD28을 선코팅한 플레이트에 분리한 T 림파구 (2.5 x 105 cells/well)를 배양함으로써 활성화 T 림파구를 배양하였다.
도 5g에는 비분열 및 분열 활성화 상태의 일차배양 T 림파구 세포에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 5g를 참조하면, 펩티드 5-2C를 포함한 모든 처리군에서 10 μM의 농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 5.8. 인간 중간엽 줄기세포에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 인간 중간엽 줄기세포 (hMSC)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 5h에는 hMSC 세포주에 대해서, 처리된 펩티드 별로 농도 증가에 따라 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 실시예 5.6의 BEAS2B 및 MCF10A 세포주와 마찬가지로 hMSC 세포는 암세포가 아닌 정상 세포주이며, 도 5h를 참조하면, FQI1의 경우 농도 의존적으로 세포 독성을 나타내는 반면, 펩티드 5-2C는 고농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 5.9. 인간 배아줄기세포에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 유사한 방법으로, 생쥐 배아상피세포 (mouse embryonic fibroblast, MEF)와 공배양을 통하여 전능성을 유지하는 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cells, hESC)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다. 본 실험에서는 96웰 플레이트에 MMC (mitomycin C) 처리를 통하여 성장을 억제시킨 MEF 세포를 깔아준 후 웰당 hESC (H9 cells) 콜로니 2개씩을 공배양 시켰으며, hESC 유래 세포와 구분하기 위하여 로다민 (rhodamine)으로 표지된 MEF 세포를 사용하기도 하였다.
도 5i에는 로다민 표지되지 않은 MEF 세포 (상) 혹은 로다민 표지된 MEF 세포 (하)를 이용한 hESC에 대하여 처리된 물질 별로, 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 상기 실시예 5.6에서 상피세포는 모든 처리된 물질에 대해서 독성을 거의 나타내지 않았으므로, 본 실험에서 측정한 세포 생존도는 hESC의 생존도를 의미한다. 도 5i를 참조하면, FQI1의 경우 농도 의존적으로 세포 독성을 나타내며 펩티드 5C의 경우 고농도에서 약간의 세포독성을 나타내는 반면, 펩티드 5-2C는 고농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 5.10. 인간 조혈모세포와 이로부터 유래된 적혈구로의 분화과정 중인 세포에서 펩티드 5C 및 5-2C에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 유사한 방법으로 사람의 말초혈액에서 수획한 CD34+인 조혈모세포 (hematopoietic progenitor cells, HPC) 및 적혈구로의 분화과정 중인 세포 (분화 3, 7, 14일)에서 FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다. 본 실험에서는, 실시예 4.4과 동일한 방법으로 세포를 준비하고 배양하였다.
도 5j에는 각 처리군 별 조혈모세포 및 이로부터 적혈구 계열로 분화유도 중인 세포 (분화 3, 7, 14일)에 대하여, 처리된 물질 별로 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 5j를 참조하면, 펩티드 5-2C를 포함하여 모든 약물을 10 μM까지 처리하더라도 세포 독성은 거의 나타나지 않았다.
한편, 도 5k에는 실시예 5a 내지 5j에서 수행한 MTT 분석 데이터 중, 펩티드 처리 후 76 시간 (실시예 5.10) 혹은 96 시간이 경과한 시점에서 얻어지는 웰 플레이트를 사진으로 촬영한 결과를 도시하였다.
실시예 6. 다양한 암세포주들에서 CP2c 단백질의 발현량 분석
실시예 6.1
대장암 세포주 6종, 폐암 세포주 6종, 유방암 세포주 3종, 교아종 세포주 3종, 자궁 경부암 세포주 1종, 총 19종의 세포주에서 CP2c 단백질의 발현량을 비교 분석하기 위해 웨스턴 블랏 실험을 진행하였다. 배양 중인 각각의 세포주를 1 × 106개씩 수거한 뒤, PBS (phosphate-buffered saline)로 수세하고, 세포용해 완충용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8, 1% Triton X-100, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche))을 이용하여 세포 추출물을 얻었다. 일정량의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (7.5% ~ 15%)에 전기영동하고 PVDF 막으로 옮긴 후, 5% 차단 용액에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체로는 항-CP2c Ab (Cosmo gentech)를 상온에서 1시간 동안 반응시켰고, 2차 항체로는 호스래디시 퍼옥시다아제-접합된 항-토끼 Ab (Abcam)를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 검출 반응은 ECL 시스템 (Amersham-GE Hearlthcare)을 사용하였다.
도 6a에는 실험 결과를 도시하였으며, 이를 참조하면 다양한 암세포주들에서 CP2c가 과발현된다는 사실을 알 수 있다.
실시예 6.2
또한, 실시예 6.1과 동일한 방법에 의해서, 혈구암 세포주 (MEL, K562, HEL, HL60), 간암 세포주 (HepG2, Hep3B), 피부 상피암 세포주 (A431), 대장암 세포주 (HCT116) 및 여러 조직에서 기원한 상피 세포주 (293T, BEAS2B, MCF10A) 및 hMSC 세포주에 대해서도 CP2c 단백질의 발현량을 확인하였다.
도 6b에는 실험 결과를 도시하였으며, 이를 참조하면 다양한 암세포주들에서는 CP2c가 과발현되지만, hMSC 등과 같은 정상 세포주들에서는 이러한 현상이 관찰되지 않음을 알 수 있다.
실시예 7. 다양한 암 세포주에서 펩티드 5-2C 처리에 따른 IC50 값의 측정
실시예 7.1. 다양한 암 세포주 및 정상 세포주에서 펩티드 5-2C 처리에 따른 IC50 값의 측정
실시예 5에서 수행한 다양한 암 세포주를 대상으로 MTT 실험을 시행한 결과를 바탕으로, Graph Prism Pad 6 프로그램을 사용하여 48시간 동안 펩티드 5-2C 처리에 따른 IC50 값을 계산하였다 (IC50 값은 각 물질 처리 시 세포가 50% 사멸하였을 때의 농도를 의미).
도 7a에는 각 세포주에 대하여 48시간 동안 펩티드 5-2C 처리에 따른 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시하였으며, 도 7a를 참조하면, 펩티드 5-2C는 정상 대조군 세포주의 성장 억제 및 세포사 유도에 거의 영향을 미치지 않는 반면, 다양한 암 세포주에는 각 세포주별로 정도의 차이는 있지만 평균 1 μM 정도의 IC50 수치를 나타낸다.
실시예 7.2. 펩티드 5-2C 처리 시간 경과에 따른 IC50 값의 측정
실시예 5에서 수행한 다양한 교아종 세포주 (U343, U373MG, U251, U87MG)를 대상으로 펩티드 5-2C를 1회 처리한 후 Graph Prism Pad 6 프로그램을 사용하여 시간 경과에 따른 IC50 값을 측정하였다.
도 7b에는 각 세포주에 대하여 펩티드 5-2C 처리 후 48시간과 96시간 경과 후에 나타나는 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시하였다. 도 7b를 참조하면, 각 세포주에서 48시간 및 96시간에서의 IC50 값은 유사하며, 이는 처리한 펩티드 5-2C에 의해 96시간까지 세포의 성장억제 및 세포사 유도효과가 지속됨을 암시한다.
실시예 7.3. MCF10A 세포주 및 BEAS2B 세포주에서 FQI1 , 펩티드 5C, 펩티드 5-2C 처리에 따른 IC50 값의 측정
실시예 5에서 폐 상피 세포주 (BEAS2B) 및 유방 상피 세포주 (MCF10A)를 대상으로 MTT 실험을 시행한 결과를 바탕으로, 시그마 플롯 프로그램을 사용하여 FQI1, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 대한 IC50 값을 계산하였다.
도 8에는 각각 FQI1, 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 대한 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시하였으며, 도 8을 참조하면, FQI1 및 펩티드 5C는 정상 대조군 세포주에 처리하였을 시 세포성장 억제 및 세포사에 유사한 정도로 영향을 주었지만 (MCF10A에서는 거의 유사한 값이나, BEAS2B의 경우에는 펩티드 5C의 IC50 값이 1.5배 더 높게 나옴), 펩티드 5-2C는 정상 대조군 세포주의 성장 억제 및 세포사 유도에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.
실시예 8. 펩티드 5-2C 및 5-2D에 의한 암세포주의 성장억제 및 세포사 유도 비교 분석: MTT 분석을 통한 세포 생존도의 정량적 측정
펩티드 5-2C는 펩티드 5-2 (서열번호 1)에 세포 침투도를 높이기 위하여 뉴로필린 1 수용체 (neuropilin 1 receptor)에 결합하는 RGD 펩티드 서열 (CRGDKGPDC; 서열번호 2)을 Pro 말단에 결합시킨 것이다. 상기의 실시예들에서 확인한 바와 같이 펩티드 5-2가 암세포 특이적인 성장 억제 및 세포사를 유도함을 알 수 있다. 이러한 펩티드 5-2C의 암세포 특이적 성장 억제 및 세포사 유도 효과가 RGD 서열 자체가 아니라 펩티드 5-2에 의해 진행됨을 확인하기 위하여, 펩티드 5-2를 다른 세포침투성 펩티드와 결합한 펩티드를 이용하여 확인할 필요가 있다. 이에 따라 혈액-뇌 장벽 (BBB) 통과 및 세포 침투 기능을 나타내는 것으로 알려진 dNP2 펩티드 서열 (KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK; Lim et al., Nat Commun (2015) 6, 8244)을 펩티드 5-2의 Asn N-말단에 결합시킨 펩티드 (펩티드 5-2D)를 합성하여 MTT 분석을 통한 세포 생존도를 정량적으로 측정하고 펩티드 5-2C의 효과와 비교 분석하였다.
실시예 8.1. 유방암 세포주에서 펩티드 5-2D에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 유방암 세포주 (MCF7, MDA-MB-231)에서 펩티드 5-2D가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 9a에는 MCF7 세포주 및 MDA-MB-231 세포주에 대해서, 생리식염수 처리군과 펩티드 5-2C 처리군을 각각 음성 및 양성 대조군으로 하여 펩티드 5-2D의 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 9a를 참조하면, 펩티드 5-2D는 펩티드 5-2C와 유사한 정도로 유방암 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 효율적으로 유도한다는 사실을 알 수 있다.
실시예 8.2. 교아종 세포주에서 펩티드 5-2D에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 교아종 세포주 (U343, U87MG)에서 펩티드 5-2D가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 9b에는 U343 세포주 및 U87MG 세포주에 대해서, 생리식염수 처리군과 펩티드 5-2C 처리군을 각각 음성 및 양성 대조군으로 하여 펩티드 5-2D의 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 9b를 참조하면, 펩티드 5-2D는 펩티드 5-2C와 유사한 정도로 교아종 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 효율적으로 유도한다는 사실을 알 수 있다.
실시예 8.3. 대장암 세포주에서 펩티드 5-2D에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 대장암 세포주 (HCT116, HT29)에서 펩티드 5-2D가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는 여부를 확인하였다.
도 9c에는 HCT116 세포주 및 HT29 세포주에 대해서, 생리식염수 처리군과 펩티드 5-2C 처리군을 각각 음성 및 양성 대조군으로 하여 펩티드 5-2D의 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 9c를 참조하면, 펩티드 5-2D는 펩티드 5-2C와 유사한 정도로 대장암 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 효율적으로 유도한다는 사실을 알 수 있다.
실시예 8.4. 배아신장암 세포주 및 간암 세포주에서 펩티드 5-2D에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 배아신장암 세포주 (293T) 및 간암 세포주 (HepG2)에서 펩티드 5-2D가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 9d에는 293T 세포주 및 HepG2 세포주에 대해서, 생리식염수 처리군과 펩티드 5-2C 처리군을 각각 음성 및 양성 대조군으로 하여 펩티드 5-2D의 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 9d를 참조하면, 펩티드 5-2D는 펩티드 5-2C와 유사한 정도로 배아신장암 세포주 및 간암 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 효율적으로 유도한다는 사실을 알 수 있다.
실시예 8.5. 사람 혈구암 세포주에서 펩티드 5-2D에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 사람 혈구암 세포주 (U937, Jurkat, HL60, HEL)에서 펩티드 5-2D가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 9e에는 U937 세포주, Jurkat 세포주, HL60 세포주 및 HEL 세포주에 대해서, 생리식염수 처리군과 펩티드 5-2C 처리군을 각각 음성 및 양성 대조군으로 하여 펩티드 5-2D의 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 9e를 참조하면, 펩티드 5-2D는 펩티드 5-2C와 유사한 정도로 혈액암 세포주의 성장을 억제하고 세포사를 효율적으로 유도한다는 사실을 알 수 있다.
실시예 8.6. 인간 유방 상피 세포주 및 폐 상피 세포주에서 펩티드 5-2D에 의한 세포 생존도 분석
실시예 5.1과 동일한 방법으로 유방 상피 세포주 (MCF10A) 및 폐 상피 세포주 (BEAS2B)에서 펩티드 5-2D가 암세포의 성장억제 및 세포사 유도 효과를 보이는지 여부를 확인하였다.
도 9f에는 MCF10A 세포주 및 BEAS2B 세포주에 대해서, 생리식염수 처리군과 펩티드 5-2C 처리군을 각각 음성 및 양성 대조군으로 하여 펩티드 5-2D의 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다. 도 9f를 참조하면, 펩티드 5-2D는 펩티드 5-2C와 유사한 정도로 유방 상피 세포주 및 폐 상피 세포주의 성장과 세포사에 전혀 영향을 미치지 않는다는 사실을 알 수 있다.
한편, 도 9g에는 실시예 8.1 내지 8.6에서 수행한 MTT 분석 데이터 중, 펩티드 처리 후 96 시간이 경과한 시점에서 얻어지는 웰 플레이트를 사진으로 촬영한 결과를 도시하였다.
실시예 9. 다양한 암 세포주에서 펩티드 5-2D 처리에 따른 IC50 값의 측정
실시예 8에서 수행한 다양한 암 세포주 및 정상 세포주를 대상으로 MTT 실험을 시행한 결과를 바탕으로, Graph Prism Pad 6 프로그램을 사용하여 48시간 동안 펩티드 5-2C 처리에 따른 IC50 값을 계산하였다 (IC50 값은 각 물질 처리 시 세포가 50% 사멸하였을 때의 농도를 의미).
도 10에는 각 세포주에 대하여 펩티드 5-2C 및 5-2D에 대한 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시하였으며, 도 10을 참조하면, 펩티드 5-2D는 펩티드 5-2C와 유사한 정도로 정상 대조군 세포주의 성장 억제 및 세포사 유도에 거의 영향을 미치지 않는 반면, 다양한 암 세포주에는 각 세포주별로 정도의 차이는 있지만 평균 3 μM 정도의 IC50 수치를 나타낸다.
결론적으로, 펩티드 5-2 자체는 펩티드의 C-말단 및 N-말단에 각각 RGD 혹은 dNP2와 같은 세포침투를 촉진하는 펩티드를 연결할 경우에도 암세포 특이적인 성장 억제 및 세포사를 유도함을 알 수 있다.
실시예 10. 다양한 암 세포주 이식 생쥐모델에서 펩티드 5-2C의 처리에 따른 종양 성장 억제 효과 분석 및 일반 생리 독성 예측
실시예 10.1. 교아종 세포주 (U343) 이식 생쥐모델에서 펩티드 5-2C의 처리에 따른 종양 성장 억제 효과 분석 및 일반 생리 독성 예측
U343 교아종세포주 (2.5 x 106 cells/50 μl)를 5주령 수컷 BALB/C 누드 생쥐 (n = 6/그룹)의 등쪽 피하에 주입하여 종양의 크기가 80 mm3 정도로 자란 시점부터 3일에 한 번씩 펩티드 5-2C (3 mg/Kg)를 종양 부위에 직접 주입하면서 생쥐의 몸무게와 종양의 부피를 측정하였고, 70일 경과 후 생쥐를 희생시켜 종양, 혈액 및 주요 장기를 적출하였다. 종양의 크기는 버니어 캘리퍼스를 이용하여 측정하였으며, 종양의 부피는 (장축 x 단축2)/2 계산식으로 계산하였다. 말초혈액은 생쥐의 안구동맥으로부터 EDTA 코팅된 마이크로 캐필러리를 이용하여 채취하였으며, 5.4 mg EDTA가 코팅된 채혈 튜브에 보관하였다. 또한, 해부를 통하여 종양 및 주요 장기를 적출하였다. 채취한 혈액에 대해서는 Coulter LH 750 Hematology analyzer를 이용하여 기본적인 CBC (complete blood cell count) 분석을 진행하였고, 종양은 무게를 측정한 후 주요 장기와 함께 4% 포름알데히드로 염색한 후 파라핀 섹션을 통하여 조직 박편을 만든 후 헤마톡실린/에오신 염색을 수행하였다. 각종 획득한 데이터는 엑셀 프로그램을 이용하여 통계화 하였다.
도 11은 U343 교아종세포주를 이식한 생쥐모델에서 펩티드 5-2C의 종양성장억제능과 생리 특성을 분석한 결과를 도시한 것이다. 도 11a는 실험 기간 중 종양의 부피를 측정하여 도시한 것이고, 도 11b는 생쥐의 몸무게의 변화를 도시한 것이다. 도 11c는 펩티드 투여 70일 경과 후의 생쥐 사진이며, 도 11d는 적출한 종양의 사진이고, 도 11e는 그룹별 각 생쥐에서 적출한 종양의 무게 및 이들의 평균을 도시한 것이다. 도 11f는 그룹별 각종 표준 CBC indices를 도시한 것이며, 도 11g는 주요 장기 (비장, 간, 폐 및 신장)의 H/E 염색사진을 도시한 것이다. 도 11a 내지 11g를 참조하면, 펩티드 5-2C를 종양 부위에 직접 투여할 경우 생리식염수만을 투여한 대조군 대비 생쥐의 몸무게, 주요 CBC 지수 및 주요 장기의 조직/해부학적 차이는 없었으나, 종양의 부피 및 무게는 각각 60% 정도 감소하였다. 종합하면, 펩티드 5-2C (3 mg/Kg)는 교아종세포주 이식 종양모델에서 특별한 생리학적 독성을 나타내지 않으면서 효율적으로 종양의 성장을 억제한다.
실시예 10.2. 피부상피암 세포주 (A431) 이식 생쥐모델에서 펩티드 5-2C의 처리에 따른 종양 성장 억제 효과 분석 및 일반 생리 독성 예측
A431 세포주 (5 x 106 cells/100 μl)를 7주령 수컷 BALB/C 누드 생쥐 (n = 4/그룹)의 등쪽 피하에 주입하여, 종양의 크기가 50 mm3 정도로 자란 시점부터 2일에 한 번씩 펩티드 5-2C (1 x IC50 그룹; 1.7 mg/Kg, 2 x IC50 그룹; 3.5 mg/Kg)를 총 5회에 걸쳐 꼬리 정맥을 통하여 주입하면서 종양의 부피를 측정하였고, 13일 경과 후 생쥐를 희생시켜 종양 및 주요 장기를 적출하였다. 적출한 종양은 무게를 측정한 후 주요 장기와 함께 4% 포름알데히드로 염색한 후 파라핀 섹션을 통하여 조직 박편을 만든 후 헤마톡실린/에오신 염색을 수행하였다. 각종 획득한 데이터는 엑셀 프로그램을 이용하여 통계화 하였다.
도 12a 내지 12d는 A431 피부 상피암 세포주를 이식한 동물모델에서 펩티드 5-2C의 종양 성장 억제능과 생리 특성을 분석한 결과를 도시한 것이다. 도 12a는 실험 기간 중 종양의 부피를 측정하여 도시한 것이고, 도 12b는 희생 직전의 생쥐 사진과 적출한 종양의 사진이고, 도 12c는 각 그룹별 각 생쥐에서 적출한 종양의 무게 및 이들의 평균을 도시한 것이다. 도 12d는 그룹별 주요 장기 (비장, 간, 폐, 신장, 혈관 및 근육)의 H/E 염색사진을 도시한 것이다. 도 12a 내지 12d를 참조하면, 펩티드 5-2C를 2일에 한 번씩 총 5회 정맥 혈관을 통해 주입할 경우 A431 피부 상피암 세포주 유래 종양의 부피와 무게를 각각 70%와 60% 이상 감소시킬 수 있었으며, 주요 장기의 조직/해부학적 특성에는 별다른 변화를 나타내지 않았음을 알 수 있다. 종합하면, 펩티드 5-2C는 정맥 혈관 주입을 통해 투여할 경우 피부 상피암 세포주 유래 종양의 성장을 효율적으로 억제할 수 있다.
실시예 10.3. 유방암 세포주 ( MDA -MB-231) 이식 생쥐모델에서 펩티드 5-2C의 처리에 따른 종양 성장과 전이 억제 효과 분석 및 일반 생리 독성 예측
폐 조직으로의 전이가 확인된 MDA-MB-231 세포주 (LM1 cells; 1 x 106 cells/40 μl)를 12주령 암컷 BALB/C 누드 생쥐 (n = 5/그룹)의 유방 지방 페드 (mammary fat ped)에 주입한 후, 종양의 크기가 50 mm3 정도로 자란 시점부터 3일에 한 번씩 총 5회 꼬리 정맥을 통하여 펩티드 5-2C 1 x IC50 그룹; 1.7 mg/Kg (= 52 μg/mouse), 2 x IC50 그룹; 3.5 mg/Kg (= 104 μg/mouse)를 주입하면서 종양의 부피를 측정하였고, 종양세포 주입 후 30일째에 생쥐를 희생시켜 종양 및 주요 장기를 적출하였다. 채취한 혈액에 대해서는 Coulter LH 750 Hematology analyzer를 이용해 기본적인 CBC 분석을 진행하였고, 종양은 무게를 측정한 후 주요 장기와 함께 4% 포름알데히드로 염색한 후 파라핀 섹션을 통하여 조직 박편을 만든 후 헤마톡실린/에오신 염색을 수행하였다. 각종 획득한 데이터는 엑셀 프로그램을 이용하여 통계화 하였다.
도 13a 내지 13d는 폐로의 전이가 가능한 MDA-MB-231 세포주 (LM1 cells)를 이식한 동물모델에서 펩티드 5-2C의 폐로의 전이능과 종양 성장 억제능 및 생리 특성을 분석한 결과를 도시한 것이다. 도 13a는 유방암 세포주 주입 후 30일째에 희생한 생쥐의 사진과 적출한 종양의 사진이고, 도 13b는 그룹별로 각 생쥐에서 적출한 종양의 무게 및 이들의 평균을 도시한 것이다. 도 13c는 그룹별로 폐로 전이된 종양 foci 수의 평균과 표준편차를 도시한 것이다. 도 13d는 그룹 별 CBC 지수를 도시한 것이다. 도 13a 내지 13d를 참조하면, 폐로의 전이가 확인된 MDA-MB-231 유방암 세포주 이식 종양모델 생쥐에서정맥 혈관을 통해 펩티드 5-2C를 주입할 경우, 종양의 무게는 대조군 대비 30% 정도 감소되었고, 폐로 전이된 종양의 foci 수는 50% 정도 감소되었다. 한편, CBC 지수는 대조군 대비 펩티드 5-2C 주입군에서 유사하였으나, 특이하게도 유방암 세포주가 이식된 대조군 생쥐에서는 백혈구 수치가 정상 생쥐의 2배에 달하였으며, 펩티드 5-2C를 주입한 생쥐에서는 정상에 가까운 수치를 나타내었다 (도 13d). 결론적으로, 펩티드 5-2C는 유방암세포 이식 생쥐모델에서 종양의 성장 억제 효과뿐만 아니라 암의 전이도 억제할 수 있으며, 별 다른 혈액 독성을 야기하지 않고 오히려 암세포의 이식에 따른 WBC 수치 상승을 정상 수준으로 회복시켜 주는 효능도 나타낼 수 있다.
실시예 11. 펩티드 5C 및 펩티드 5-2C에 의한 CP2c의 전사활성능 분석
293T 세포를 12 웰 플레이트에 웰 당 1 × 105개의 세포를 접종하고 12시간 후에 리포터 벡터 (야생형 리포터는 루시퍼라아제 유전자 상단에 CP2c 결합부위가 2번 반복되는 GATA-1 유전자의 인핸서 서열을 연결하고, Mut 1/3, Mut 2/4, Mut 1-4 리포터는 인핸서 서열 내에 존재하는 CP2c 결합부위에 돌연변이를 유발시킴)와 함께 Flag-CP2c, HA-CP2b, HA-PIAS1 발현 벡터들을 여러 조합으로 에펙틴 방법 (effectene method)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 1시간 동안 배양 후, FQI1, 펩티드 5C, 펩티드 5-2C를 2 μM 농도로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, 세포를 수거하여 250 ㎕의 패시브 세포 용해 완충용액 (Promega)을 이용해서 세포 추출물을 얻었다. 세포 추출물 20 ㎕와 이중-루시퍼라아제 분석 키트 (Promega)를 이용하여 GLOMAX (Promega)에서 표지 유전자인 루시퍼라아제의 활성을 측정하였다 (각각의 발현 벡터들의 발현 여부는 웨스턴 블랏 실험으로 확인).
도 14a 내지 14e에는 측정 결과를 도시하였으며, 도 14a는 도 14e에 나타낸 정상의 CP2c 표적서열을 지닌 리포터 벡터를 이용하여 진행한 측정 결과이며, 도 14b 내지 14d는 각각 돌연변이 2/4, 1/3 및 1-4를 이용하여 진행한 측정결과이며, 도 14e는 정상 및 각 돌연변이 서열의 도시이다. 도 14a 내지 14e를 참조하면, 펩티드 5C 및 5-2C는 FQI1에 비해 효과적으로 CP2c를 매개로 하는 전사 활성능을 억제한다는 사실을 확인할 수 있다. 이러한 효과는 CP2c 결합부위에 돌연변이를 지닌 경우에는 나타나지 않았으며, CP2c 호모테트라머 (J Biol Chem, 1994; Genes Cells, 1998)가 작용하는 부위는 물론 CP2c/CP2b/PIAS1 헤테로헥사머 (CBP complex, Nucleic Acids Res. Kang et al., 2010)가 작용하는 서열에서 특이적으로 관찰되었다.
실시예 12. 펩티드 5-2C 처리에 따른 암세포 특이적 성장 멈춤 및 세포사 유도의 작용기전 분석
실시예 12.1. 다양한 암 세포주에서 펩티드 5-2C 처리에 따른 세포주기 분석
MEL, K562, MCF-10A 및 MDA-MB-231 세포를 100 mm 디쉬에 각각 5 x 105 세포를 접종한 다음 24시간 후에 펩티드 5-2C 농도가 최종 0, 1, 2, 3, 10 μM이 되도록 처리하였다. 펩티드 5-2C 처리 후 48시간 후에 트립신 처리를 통해 세포를 수거한 후, 1 x 106 세포를 0.5 ml PBS에 현탁하고 피펫팅을 통하여 단일 세포로 분리되도록 하였다. 세포 현탁액을 4.5 mL의 70% 에탄올이 들어있는 원심분리용 튜브에 옮긴 후 4 ℃에서 2시간 동안 방치하여 세포를 고정하였다. 원심분리를 통하여 세포침전물을 얻은 후 5 ml PBS 용액을 넣어 수세한 후 1 ml의 PI 염색용액에 잘 현탁하여 암소에서 30분 동안 염색시켜 BD FACSAria에서 세포 형광을 측정하고 동사에서 제공하는 소프트웨어를 이용하여 세포주기를 분석하였다.
도 15a 내지 15c는 펩티드 5-2C에 의한 세포주기에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 다양한 세포주 (MEL, K562, MCF-10A 및 MDA-MB-231)를 대상으로 다양한 농도의 펩티드 5-2C (0, 1, 2, 3, 10 μM)를 처리한 후 48시간째에 FACS를 통하여 세포주기를 분석한 결과이다. 도 15a는 FACS 분석 시 핵의 크기에 따른 세포의 분포를 도시한 것이고, 도 15b는 세포주기별 세포의 분포를 정량화한 도시이며, 도 15c는 세포사를 보이는 subG1 기의 세포분포만을 확대하여 도해한 그래프이다. 도 15a 내지 15c를 참조하면, 펩티드 5-2C 처리시 성장 멈춤 및 세포사 유도가 잘 일어나지 않는 MCF-10A 세포주에서는 역시 펩티드 5-2C 처리에 의해 세포주기의 변화가 거의 나타나지 않는 반면, 고농도 (10 uM) 처리에서 성장 멈춤 및 세포사가 유도되는 MEL 세포주에서는 FACS 분석에서도 역시 고농도에서만 subG1 기 세포가 유의성 있게 증가하였다. 반면에, 펩티드 5-2C에 민감하게 성장 멈춤과 세포사가 유도된 K562 세포주 및 MDA-MB-231 세포주에서는 S기 세포의 감소와 G2/M기 세포의 증가와 함께 subG1기 세포의 증가가 펩티드 5-2C 처리 농도 의존적으로 나타났다. 결론적으로 펩티드 5-2C에 의한 암세포 특이적 성장 멈춤과 세포사 유도 현상은 세포주기 중 G2/M기의 전환 억제에 따라 세포 성장이 멈추어서 일어남을 알 수 있다.
실시예 12.2. MCF7 세포주에서 펩티드 5-2C 처리 시간과 농도에 따른 세포주기 관련 표지 유전자의 발현 분석
MCF7 유방암 세포주를 6 웰 플레이트에 각각 1 x 105 세포를 접종한 다음 24시간 후에 최종 2 μM 농도의 펩디드 5-2C를 처리한 후 0, 24, 48 및 72시간 후에 실시예 6에서와 동일한 방법으로 세포추출물을 수득하여 다양한 세포주기 관련 표지 유전자의 항체를 이용한 웨스턴 불랏을 실시하였다. 한편, 각각 최종 1, 2, 3 μM 농도의 펩티드 5-2C를 48시간 처리한 군들에서도 동일한 방법으로 세포 추출물을 수득하여 웨스턴 블랏을 실시하였다.
도 16a 내지 16d는 MCF7 세포주를 대상으로 다양한 펩티드 5-2C의 처리 시간 및 처리 농도에 따른 세포주기 관련 표지 유전자의 발현을 웨스턴 블랏 방법으로 분석한 결과를 도시한 도면이다. 도 16a는 2 μM의 펩티드 5-2C를 72시간 동안 처리하면서 시간 경과에 따른 다양한 세포주기 관련 표지유전자 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 사진이며, 도 16b는 다양한 농도 (0, 1, 2, 3 μM)의 펩티드 5-2C를 48시간 처리한 후 세포주기관련 표지유전자 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 사진이다. 도 16c와 16d는 각각 16a와 16b에서의 각 표지유전자 단백질의 발현 변화를 정량화하여 도시한 그래프이다. 도 16a 내지 16d를 참조하면, 펩티드 5-2C의 처리 시간 경과 및 처리 농도의 증가에 따라 CDK1, Cyclin B1의 점진적인 발현 감소와 함께 Cyclin E, p21, p53의 점진적인 발현 증가를 나타내고 있으므로, 펩티드 5-2C는 G2기에서 세포주기 멈춤 현상을 유발하고 있음을 알 수 있다.
실시예 12.3. MDA -MB-231 세포주 및 MCF7 세포주에서 펩티드 5-2C 처리 시간과 농도에 따른 세포사 관련 표지 유전자의 발현 분석
실시예 12.2에서와 동일한 방법으로 MDA-MB-231 및 MCF7 유방암 세포주를 대상으로 생리식염수 혹은 2 μM 농도의 펩티드 5-2C를 72시간까지 처리하면서 0, 24, 48 및 72시간에 각각 세포추출물을 수득하여 다양한 세포사 관련 표지 유전자의 항체를 이용한 웨스턴 불랏을 실시하였다.
도 17은 MDA-MB-231 세포주와 MCF7 세포주를 대상으로 2 μM 농도의 펩티드 5-2C의 처리 시간별 세포사 관련 표지유전자 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 도해이다. 도 17을 참조하면, 펩티드 5-2C 처리 시간에 따라 항-세포사 관련 표지 유전자인 MCL1 및 BCL2의 발현이 점진적으로 감소하며, 세포사 촉진 관련 표지 유전자인 Bim, Bax, Bak, cleaved Cas3과 Cas8, pro-Cas11은 증가하는 반면 pro-Cas3, pro-cas8, pro-Cas9, pro-Cas12는 점진적으로 감소하였다. 이를 종합하면, 펩티드 5-2C 처리 시간에 따라 항-세포사 표지 유전자들의 발현은 감소하고 세포사 촉진 표지 유전자들의 발현은 증가하여 세포사가 유도됨을 알 수 있으며, 이는 p53의 증가에 따라 미토콘드리아 경로를 거치는 세포 내재적 세포사와 세포사 수용체 매개의 pro-Cas8의 활성화를 통한 세포사가 모두 일어날 것으로 추정된다 (Ashkenazi A, Nat rev, 2008).
실시예 12.3. MDA -MB-231 세포주 및 MCF10A 세포주에서 펩티드 5-2C 처리에 따른 전자현미경 상의 세포 형태 분석
MDA-MB-231 세포주와 MCF10A 세포주를 100 mm 디쉬에 각각 1.5 x 106 세포와 5 x 105 세포를 접종한 후 1시간 후에 생리 식염수, 2 μM 농도의 펩티드 5-2C 및 FQI1을 처리하여 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 세포를 수거하였다. 세포는 원심분리한 배양액 및 표면에 부착한 세포를 트립신 처리하여 수거하였으며, 수거한 세포는 생리 식염수로 1회 수세한 후 세포침전물에 직접 2회의 2.5% 글루타르알데히드 수용액을 각 10분씩 처리하였다. 전자현미경 분석을 위한 시료 준비 및 촬영은 일반적인 방법을 사용하였다.
도 18은 MDA-MB-231 세포주와 MCF7 세포주를 대상으로 2 uM 농도의 펩티드 5-2C를 처리한 후 24시간과 48시간에 나타나는 전자현미경 상의 세포형태 사진이다. 음성 대조군은 생리 식염수를 처리한 세포이며, 양성 대조군은 2 μM 농도의 FQI1을 처리한 세포이다. 도 18을 참조하면, 펩티드 5-2C에 민감하게 성장 멈춤 현상과 세포사 유도가 나타나는 MDA-MB-231 세포주에서는 FQI1 처리군 대비 펩티드 5-2C 처리군에서 세포내 구조적 이상이 차이를 나타내며, 펩티드 5-2C 처리에 의해 세포 성장 멈춤과 세포사 유도가 일어나지 않는 MCF10A 세포주에서는 펩티드 5-2C 처리에 의해 세포내 구조적 이상이 발견되지 않은 반면, FQI1 처리군에서는 24시간부터 세포내 구조적 이상이 나타나기 시작하여 48시간에는 현저한 핵의 파괴가 발견되고 있다. 이를 종합하면, 펩티드 5-2C에 의한 종양세포 특이적인 성장 멈춤 현상과 세포사 유도는 FQI1에 의한 현상과 다른 기작으로 일어나며, 정상 유방 상피 세포주인 MCF10A는 펩티드 5-2C 처리에 의해 어떠한 세포내 구조 변형이 일어나지 않는 반면, FQI1에 의해서는 심각한 세포내 구조 변형을 동반하고 있음을 알 수 있었으며, 이는 실시예 4, 5, 7 및 8의 결과와 일치한다.
실시예 13. MDA -MB-231 세포주에서 FITC 형광-표지한 펩티드 5-2C의 세포 내 이동 경로의 추적 분석
펩티드 5-2C에 의한 암세포 특이적 성장 멈춤과 세포사 유도가 5-2 펩티드 자체에 의한 효과임을 검증할 뿐만 아니라, iRGD는 단순하게 펩티드의 세포내 침투를 도와주는 역할만을 수행함을 확인하기 위하여 FITC 형광표지된 3가지 펩티드 (FITC-iRGD, FITC-5-1C 및 FITC-5-2C)를 합성하였으며, 실시예 5.1과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 생리 식염수, 혹은 이러한 FITC-conjugated 펩티드들을 96시간 동안 처리하면서 MTT 분석을 수행하여 세포 생존률과 IC50 수치를 산출하였다. 참고로, 펩티드 5-1은 펩티드 5의 N-말단으로부터 6개 아미노산으로 구성된 펩티드로서 CP2c의 DNA 결합능에 영향을 나타내지 않는다 (도 3 참조). 한편, 각 FITC-conjugated 펩티드를 실시예 5.1에서 수행한 방법과 동일한 조건에서 30분 동안 처리하였으며, 생리 식염수로 웰을 3회 수세하고 새로운 배지로 갈아준 후 24시간 동안 시간 경과 (펩티드 처리 후 1, 2, 4, 8, 12, 24시간) 별로 위상차 현미경 사진과 형광현미경 사진을 촬영하였다. 촬영한 세포사진과 형광사진은 photoshop 프로그램을 이용하여 병합시켰다.
도 19a 내지 19d는 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 FITC-conjugated 펩티드 5-2C의 시간 경과에 따른 세포내 이동경로를 확인하는 도해이다. 도 19a는 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 생리 식염수, 혹은 FITC-conjugated-iRGD, FITC-5-1C 및 FITC-5-2C 펩티드를 각각 0, 0.5, 1, 2, 3, 10 μM 농도로 96시간 동안 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포성장률 변화를 도해한 도시이고, 도 19b는 처리 후 48시간에서 나타나는 각 처리군 별 IC50 값 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이며, 도 19c는 96시간에서의 MTT 분석의 예를 보여주는 웰 플레이트 사진이며, 도 19d는 2 μM 농도의 각 FITC-conjugated 펩티드를 처리한 후 24시간 동안 시간경과에 따른 펩티드의 세포내 분포를 보여주는 사진이다. 도 19a 내지 19d를 참조하면, FITC-conjugated 펩티드들 중 5-2C만이 세포성장을 억제하였으며, 이의 IC50 수치는 FITC-conjugated 되지 않은 5-2C의 수치와 유사한 것으로 보아, 펩티드 5-2C에 의한 암세포 특이적 성장 멈춤과 세포사 유도는 5-2 펩티드 자체에 의한 효과이며 iRGD는 단순하게 펩티드의 세포내 침투를 도와주는 역할만을 수행함을 알 수 있다. 또한, 세포 침투는 펩티드 처리 후 2시간 경과 후부터 일어나며, 세포로 침투된 펩티드 5-2C는 핵 내에 24시간 동안 축적되는 반면 다른 펩티드 (iRGD 및 5-1C)는 세포막을 투과한 후 세포질에 남아 있거나 8시간 이후에는 쉽게 분해됨을 알 수 있다.
실시예 14. 펩티드 5-2C가 상호작용하는 CP2c 단백질 영역 및 영역 내 아미노산들의 동정
상기의 실시예들에서 얻은 결과들을 종합하면, 펩티드 5-2 처리에 의한 암세포 특이적 성장 멈춤과 세포사 유도는 펩티드 5-2가 CP2c에 결합함으로써 CP2c가 암세포의 특성을 나타내는 표적 유전자의 조절부위에 결합하지 못하여 일어난다고 추정할 수 있다. 이러한 가정을 뒷받침하기 위하여 펩티드 5-2C가 상호작용하는 CP2c 단백질 영역은 물론 펩티드 5-2C와 직접 결합하는 이러한 영역 내 아미노산을 동정할 필요가 있다. 이에 따라 도 1의 펩티드 5가 결합하는 CP2c 영역에 존재하는 극성 아미노산들이 각각 Ala으로 치환된 돌연변이 CP2c 단백질을 얻어 펩티드 5-2C와의 결합여부를 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 분석하고자 하였다. 이러한 분석을 용이하게 진행하기 위하여 펩티드 5-2C의 Pro C-말단에 비오틴 태그가 결합된 펩티드 (펩티드 5-2CB)를 합성하였다. 합성된 펩티드 5-2CB가 펩티드 5-2C와 동일한 암세포 특이적 성장 멈춤과 세포사를 유도하는지 확인하기 위하여, 실시예 5.1에서와 동일한 방법으로 MDA-MB-231 세포주와 MCF7 세포주를 대상으로 서로 다른 2 배치의 펩티드 5-2CB에 대한 MTT 분석을 수행하였고, 이로부터 IC50 수치도 산출하였다. 한편, 펩티드 5-2C가 결합하는 CP2c 영역 내 극성 아미노산이 각각 Ala으로 치환된 19종의 돌연변이 CP2c 단백질을 얻기 위하여 각 해당 돌연변이 아미노산을 암호화하는 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드를 합성하여 위치 선택적 돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 실시하였고, 이러한 돌연변이 CP2c 유전자를 암호화하는 염기서열을 pGEX4 벡터에 클로닝하였고, GST-태그에 대한 항체가 결합된 비드를 이용하여 돌연변이 GST-융합 CP2c 단백질들을 순수분리 하였다. 돌연변이체 CP2c가 CP2c 결합부위 (알파-글로빈 프로모터 상의 CP2c 결합 염기서열)에 결합하는지의 여부는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 펩티드 5-2CB와의 결합여부는 파지 디스플레이 방법을 통하여 CP2c 결합 펩티드들을 동정하는데 사용한 직접 ELISA 방법 (Kang et al., FEBS J, 2005; 272: 1265-1277)을 사용하였다. 펩티드 5-2CB와 각 돌연변이 CP2c 단백질간의 결합여부는 펩티드 5-2CB 내 비오틴-태그를 인지할 수 있는 HRP-conjugated 스트렙트아비딘 비드를 이용하였다. 로제타 모델링 알고리듬을 이용하여 CP2c의 306-396 아미노산 영역에 대한 3차 구조 예측 모델을 얻었으며, 표적 DNA와 펩티드 5-2C 결합에 중요한 CP2c 아미노산의 도해는 Swissprot 프로그램을 이용하여 얻었다.
도 20a 내지 20d는 펩티드 5-2C에 비오틴-태그를 붙인 펩티드 5-2CB의 암세포 생존에 미치는 영향을 펩티드 5-2C와 비교 분석한 도면이다. 도 20a는 MDA-MB-231 세포주에 대하여 펩티드 5-2C 및 서로 다른 두 배치의 펩티드 5-2CB의 농도를 증가시켜가며 1회 처리한 경우, 농도 증가에 따른 상대적 생존도를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 20b는 펩티드 처리 후 96 시간이 경과한 시점에서 얻어지는 웰 플레이트를 촬영한 사진이다. 도 20c는 MDA-MB-231 세포주에 대하여 각 펩티드 처리 후 48시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이며, 도 20d는 MCF7 세포주에 대하여 각 펩티드 처리 후 48시간에서의 IC50 수치 산출을 위한 그래프 및 산출된 IC50 수치를 도시한 것이다. 도 20a 내지 20d를 참조하면, 펩티드 5-2CB는 펩티드 5-2C와 유사하게 암세포 특이적 세포 성장 멈춤과 세포사를 유도하며, 유사한 IC50 값을 나타냄을 알 수 있으며, 이에 따라 펩티드 5-2CB를 이용하여 하기의 도 21a 내지 21d에 나타낸 실험에 효율적으로 이용될 수 있음을 암시한다.
도 21a 내지 21d는 펩티드 5-2C가 결합하는 CP2c 단백질 영역 중 DNA 결합과 펩티드 5-2C 결합에 중요한 아미노산을 동정하는 일련의 실험결과를 도시한 것이다. 도 21a는 펩티드 5-2C의 결합영역과 이 부위의 아미노산 서열 중 극성을 나타내는 아미노산을 알라닌으로 치환한 19가지의 GST-융합 돌연변이체 목록을 나타내고 있다. 도 21b는 이러한 돌연변이체들을 대장균에서 과발현시킨 후 GST 항체 비드를 이용하여 순수 정제한 GST-융합 단백질들을 대상으로 방사선 표지된 생쥐 알파-글로빈 프로모터에 존재하는 CP2c 결합부위인 DNA 프로브와의 결합여부를 DNA-IP 방법으로 분석한 결과를 도시하고 있다. 도 21c는 순수정제한 GST-융합 돌연변이 단백질들을 대상으로 펩티드 5-2C와의 결합여부를 직접 ELISA 방법으로 분석한 결과를 도시하고 있다. 도 21d는 CP2c의 306-396 아미노산 영역을 대상으로 로제타 모델링 알고리듬을 이용하여 예측한 3차 구조에 각각 DNA와 펩티드 5-2C 결합에 중요한 아미노산을 표시한 도해이다. 도 21a 내지 21d를 참조하면, CP2c 단백질 영역 중 알파-나선을 포함하는 322-389 아미노산 영역이 CP2c의 표적 염기서열의 인지는 물론 펩티드 5-2와의 결합에 관여하며, 특히 E332, R339, R341 및 R387 아미노산은 DNA 결합에 중요한 반면, E332, R339, R341 및 R347 아미노산은 펩티드 5-2와의 결합에 중요함을 알 수 있다. 종합하면, 펩티드 5-2는 CP2c의 표적 DNA 염기서열 결합에 중요한 E332, R339 및 R341에 경쟁적으로 결합함으로써 CP2c가 표적 염기서열에 결합할 수 없게 되고, 이에 따라 G2/M기의 세포주기 전환에 관여하는 CP2c 표적유전자의 발현을 억제함으로써 암세포 특이적인 성장 멈춤 및 세포사가 유도됨을 알 수 있다.
종합하면, 본 발명에 따른 펩티드 5-2C는 암 세포들에 처리될 경우, 매우 높은 안정성으로 세포막을 통과하여 CP2c에 특이적으로 결합할 수 있으며, 따라서 CP2c의 활성을 억제함으로써, CP2c가 매개하는 각종 암 세포들에 대해서 세포성장 억제 및 세포사 유도를 통해 암치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 전사인자 CP2c에 결합하며 암 예방 및 치료 활성을 갖는 서열번호 1로 표시되는 펩티드:
    <서열번호 1>
    Asn-Tyr-Pro-Gln-Arg-Pro.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, 상기 펩티드의 C-말단 Pro에는 아미드기가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에는 하기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드:
    <서열번호 2>
    Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys에는 아미드기가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에는 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드가, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 하기 서열번호 3으로 표시되는 펩티드가 결합되며, 하기 서열번호 3으로 표시되는 펩티드의 N-말단 Lys에는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드:
    <서열번호 3>
    Lys-Cys-Lys-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser
    단, 상기 서열 중 1번 Lys 및 3번 Lys은 6-아미노헥사노익산 (6-aminohexanoic acid)임.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys에는 아미드기가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 하기 서열번호 4로 표시되는 펩티드가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드:
    <서열번호 4>
    Lys-Ile-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Lys-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Lys-Ile-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Lys-Gly-Arg-Lys-Gly-Gly.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 서열번호 4로 표시되는 펩티드의 N-말단 Lys에는 아세틸기가, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 C-말단 Pro에는 아미드기가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys의 ε-NH2에는 비오틴이 결합된 Lys이 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단 Asn에는 아세틸기가, 상기 서열번호 2로 표시되는 펩티드의 C-말단 Cys의 ε-NH2에 비오틴이 결합된 C-말단 Lys에는 아미드기가 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 건강기능식품 조성물.
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