KR20150071932A

KR20150071932A - Taz 단백질 활성화 유도 성분을 포함하는 근육 분화 및 근육재생용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20150071932A
Application number: KR1020130159072A
Authority: KR
Inventors: 황은숙; 홍정호; 김낙정; 배명애
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2015-06-29
Also published as: WO2015093901A1

Abstract

본 발명은 TM-53 및 TM-54을 유효성분으로 함유하는 근육세포 분화 유도 또는 촉진용 조성물, 근육 재생용 약학적 조성물, 및 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 2-부틸-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-5-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-6-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-5-carboxylic acid methyl ester, TM-53) 또는 2-부틸-5-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-6-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-5-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-6-carboxylic acid methyl ester, TM-54)은, 시험관 내에서 TAZ 단백질에 의존하여 근원세포(myoblast) 및 비-근원세포로부터 근육세포로의 분화 및 전환분화(transdifferentiation)을 촉진하며, 근위축 유도 물질을 처리한 근육세포에서 근위축 관련 유전자의 발현을 감소하면서 근원성 마커 단백질의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, 생체 내에서 근육 손상 모델의 근육 재생효과를 유의적으로 나타내므로, 근육세포 분화 유도 또는 촉진용 조성물, 근육 재생용 약학적 조성물, 및 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TAZ 단백질 활성화 유도 성분을 포함하는 근육 분화 및 근육재생용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition containing TAZ modulator for mygeonic differentiation and muscle regeneration}

본 발명은 2-부틸-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-5-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-6-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-5-carboxylic acid methyl ester, TM-53) 및 2-부틸-5-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-6-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-5-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-6-carboxylic acid methyl ester, TM-54)을 유효성분으로 함유하는 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물, 근육 재생용 약학적 조성물, 및 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

PDZ 결합 모티브의 전사조절 도움인자(transcriptional coactivator with PDZ binding motif, TAZ)는 세포질에서 14-3-3 단백질과의 결합되는 단백질로서 발현된다(Kanai F et al . (2000). EMBO J 19: 6778-6791). TAZ의 89 번째 세린에 인산화(phosphorylation)되면 14-3-3 단백질에 의해서 TAZ 단백질이 세포질에서 격리되는 반면, 단백질 인산화효소 I(protein phosphatase I)에 의해 탈인산화된 TAZ는 핵 내에 위치하여 다양한 전사 인자의 전사적 활성을 촉진한다(Hong W, Guan KL (2012).Semin Cell Dev Biol 23: 785-793; Lei QY et al . (2008). Mol Cell Biol 28: 2426-2436; Liu CY et al . (2011) J Biol Chem 286: 5558-5566). TAZ 단백질 내의 트립토판-트립토판(WW) 도메인은, TAZ가 런트-관여의 전사 인자 2(runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 퍼옥시좀 증식체로 활성화된 수용체 γ( peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)와 같은 다양한 PPXY 모티프 포함 전사 인자와 결합하도록 하며, 핵 내에서 이들의 전사적 활성을 촉진하도록 하게 한다(Cui CB et al, (2003). Mol Cell Biol 23: 1004-1013).

또한, TAZ는 PUNX2가 관여하는 골원성 분화(osteogenic differentiation)를 촉진하며, 간엽성 줄기 세포에서 유래되는 PPARγ가 유도의 지질형성(adipogenesis)을 억제한다. 간엽성 줄기 세포로부터 골근육으로의 분화는 또한 MyoD가 TAZ와 직접적으로 결합하여 전사 활성됨에 따라서 촉진된다(Arnold HH, Winter B (1998). Curr Opin Genet Dev 8: 539-544; Perry RL, Rudnick MA (2000) Front Biosci 5: D750-767).

따라서, 세포 내의 TAZ 결여는 MyoD 유도의 유전자 발현 및 근원성 분화 유도를 나타내지 못하며, TAZ의 과발현은 MyoD 의존적인 근원성 유전자 발현 및 비-근육 세포의 전환분화를 상승 조절할 수 있음이 보고된 바 있다(Jeong H et al . (2010). FASEB J 24: 3310-3320). 간엽성 줄기 세포로부터 유도되는 골근원성 분화는 MyoD, 근육세포 증가 인자 2, 미오게닌(myogenin), Myf5 및 MRF4와 같은 다양한 근육 조절 인자(muscle regulatory factors, MRF)의 연속적인 활성을 통해 조절된다(Le Grand F, Rudnicki MA (2007). Current opinion in cell biology 19: 628-633).

골격근은 환경적인 자극에 의해 매우 민감하게 반응하는 조직이다. 이러한 적응 반응 중 근육 손상이나 부하에 관한 연구는 지속적으로 연구되었다. 근육은 과도한 운동시, 근육의 피로도가 증가하게 되어 손상이 빈번히 일어나게 된다. 근육 손상이 유발되면, 이것은 근 부피의 손실과 운동 결핍을 초래하여 경기력 상실뿐만 아니라 삶의 질에도 영향을 준다. 또한, 근육 손상은 운동 이외에도 유전적 질병(genetic disorder), 암(cancer), 염증(inflammation), 감염(infection) 또는 여러 의학적인 영향을 포함하는 흔한 질병에 의해서 발생될 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 이러한 근육 손상이 일어났을 때, 골격근은 재생 능력을 가지고 있으며 극심한 근 손상 후 며칠 내로 새로운 근관(myotube)을 형성한다고 알려져 있으나, 이러한 골격근의 재생 능력은 느리고 비능률적이며 완벽하지 않으므로 골격근의 재생과 기능 회복 촉진을 증대하는 연구가 필요한 실정이다.

근육에서 부상이 일어나면, 일반적으로 TNF-α, IL-1β, and IL-6와 같은 염증성 사이토카인, 및 근원성 인자인 미오게닌의 발현을 통해 근원성 분화 및 근육의 재생이 유도된다(Tidball JG (2005). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288: R345-353). 그러나, 심각한 골근육의 손실로 인해, 근육에서 중요한 단백질의 분해가 나타나고, 근육 특이적인 유비퀴틴 계통(ubiquitin ligases) 단백질인 근위축 F-박스(muscle atrophy F-box, MAFbx) 및 근육 특이적 링 핑거 단백질 I(muscle-specific RING finger protein 1, MuRF1)이 활성화되며(Bonaldo P, Sandri M (2013). Dis Model Mech 6: 25-39), 기아(starvation), 탈신경(denervation) 및 만성 질병을 야기할 수 있다(Bonetto A et al . (2009). Free Radic Biol Med 47: 906-916.). 근원성 분화의 증가는 상처로 유도되는 다양한 골근육의 손실에 대하여 근육을 보호하는 역할을 한다(Wang Y, Pessin JE (2013). Curr Opin Clin Nutr Metab Care 16: 243-250).

따라서, 본 발명자들은 근원성 분화를 촉진하는 물질을 스크리닝하기 위해 노력한 결과, 2-부틸-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-5-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-6-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-5-carboxylic acid methyl ester, 이하 TM-53로 나타낸다.) 또는 2-부틸-5-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-6-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-5-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-6-carboxylic acid methyl ester, 이하 TM-54로 나타낸다.)은, 시험관 내(in vitro)에서 TAZ 단백질에 의존하여 근원세포(myoblast) 및 비-근원세포로부터 근육세포로의 분화 및 전환분화(transdifferentiation)을 촉진하며, 근위축 유도 물질을 처리한 근육세포에서 근위축 관련 유전자의 발현을 감소하면서 근원성 마커 단백질의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, 생체 내(in vivo)에서 근육 손상 모델의 근육 재생효과를 유의적으로 나타내므로, 본 발명의 TM-53 및 TM-54는 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물, 근육 재생용 약학적 조성물, 및 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 근원성 분화를 촉진하는 물질로서 2-부틸-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-5-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-6-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-5-carboxylic acid methyl ester, TM-53) 또는 2-부틸-5-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-6-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-5-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-6-carboxylic acid methyl ester, TM-54)를 제공하여, 이를 유효성분으로 함유하는 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물, 근육 재생용 약학적 조성물, 및 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물을 제공한다;

[화학식 1]

.

(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,

또는

이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)

또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육세포 분화 유도용 건강식품을 제공한다;

[화학식 1]

.

(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,

또는

이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)

또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육 재생용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육장애의 개선 또는 예방용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 TM-53 및 TM-54는 시험관 내(in vitro)에서 TAZ 단백질에 의존하여 근원세포(myoblast) 및 비-근원세포로부터 근육세포로의 분화 및 전환분화(transdifferentiation)을 촉진하며, 근위축 유도 물질을 처리한 근육세포에서 근위축 관련 유전자의 발현을 감소하면서 근원성 마커 단백질의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, 생체 내(in vivo)에서 근육 손상 모델의 근육 재생효과를 유의적으로 나타내므로, 본 발명의 TM-53 및 TM-54는 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물, 근육 재생용 약학적 조성물, 및 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 TM-53의 농도에 의존하는 세포 내에서 TAZ 단백질의 핵 내 위치 정도의 증가를 나타낸다.
도 2는 등장(isotonic) 또는 저염(hypotonic) 조건에서 TM-53의 농도에 의존하는 세포 내에서 TAZ 단백질의 핵 내 위치 정도의 증가를 정량적으로 나타낸다.
도 3은 근원세포(myoblast)에서 TM-53 및 TM-54에 의한 내인성(Endogenous) TAZ 단백질의 핵 내 위치를 면역형광염색(immunostaining)을 통해 나타낸다.
도 4는 근원세포에서 TM-53 및 TM-54에 의한 내인성 TAZ 단백질의 핵(nuclear), 세포질(cytoplasmic) 및 세포 전체(pancellular)내의 위치를 상대적으로 나타낸다.
도 5는 TM-53 또는 TM-54를 처리하여 근원세포로부터 분화 유도한 근육세포의 형태 변화(morphological change)를 나타낸다.
도 6은 TM-53 또는 TM-54를 처리하여 근원세포로부터 분화 유도한 근육세포에서 근육세포의 마커 단백질인 MyHC의 발현을 나타낸다.
도 7은 TM-53 또는 TM-54를 처리하여 근원세포로부터 분화 유도한 근육세포에서 근육세포의 마커 단백질인 MyHC의 발현(MyHC⁺ cell)을 정량적으로 나타낸다; 상기 정량적 분석에 있어서, 결과는 평균 ± 표준평균오차(standard error of the means, SEM)으로 나타내며, 스튜던트 t-test를 사용하여 분석한 후, P 값이 0.05 미만인 경우 유의적인 결과를 나타내는 것으로 확인하여, 유의적인 결과를 P < 0.05(*), P < 0.005(**) 및 P < 0.0005(***)로 나타내었다.
도 8은 TM-53 및 TM-54 처리량에 따른 근원세포로부터 근육세포로의 분화 마커 단백질의 발현을 나타낸다.
도 9는 TM-53 및 TM-54 처리량에 따른 근원세포로부터 근육세포로의 분화 마커 단백질의 발현을 상대적 수치로 비교하여 나타낸다.
도 10은 TM-53 및 TM-54 처리량에 따른 근원세포로부터 근육세포로의 분화 마커 유전자인 MCK 및 미오게닌의 발현을 나타낸다; 상기 발현의 분석에 있어서, 결과는 평균 ± SEM으로 나타내며, 스튜던트 t-test를 사용하여 분석한 후, P 값이 0.05 미만인 경우 유의적인 결과를 나타내는 것으로 확인하여, 유의적인 결과를 P < 0.0005(***)로 나타내었다.
도 11은 TM-53 및 TM-54 처리량에 따른 근원세포로부터 근육세포로의 분화 마커 유전자인 TAZ 및 MyoD의 발현을 나타낸다.
도 12는 TM-53 또는 TM-54 유무에 관계없이 TAZ 넉아웃 근원세포(TAZi)에서의 근원성 분화능 손실을 나타낸다.
도 13은 TM-53 또는 TM-54의 처리 유무와 관계없이 TAZi 세포에서 TAZ의 발현 감소를 나타낸다.
도 14는 TM-53 또는 TM-54의 처리 유무와 관계없이 TAZi 세포에서 근원성 마커 유전자인 MCK 및 미오게닌의 발현 감소를 나타낸다; 상기 발현 감소의 분석에 있어서, 결과는 평균 ± SEM으로 나타내며, 스튜던트 t-test를 사용하여 분석한 후, P 값이 0.05 미만인 경우 유의적인 결과를 나타내는 것으로 확인하여, P < 0.005(**) 및 P < 0.0005(***)로 나타내었다.
도 15는 TAZ가 넉아웃된 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)에서 MyoD로 유도되는 MCK 프로모터(promotor)의 활성을 통해 MyoD의 발현 확인을 나타낸다.
도 16은 TAZ가 넉아웃된 MEF(KO-MEF)에서 MyoD 발현에 따른 근원성 전환 분화를 통한 근육세포로의 분화 효과를 나타낸다.
도 17은 TAZ가 넉아웃된 MEF로부터 근원성 전환 분화 유도된 근육세포에서 MyoD 발현에 따른 근육세포 마커 유전자 발현 확인을 나타낸다; 상기 발현 확인의 분석에 있어서, 결과는 평균 ± SEM으로 나타내며, 스튜던트 t-test를 사용하여 분석한 후, P 값이 0.05 미만인 경우 유의적인 결과를 나타내는 것으로 확인하여, P < 0.05(*) 및 P < 0.0005(***)로 나타내었다.
도 18은 TM-53 또는 TM-54을 처리하여 분화 유도된 WT+MyoD 및 KO+MyoD 유래의 근육세포에서 근육세포 마커 유전자의 발현 확인을 나타낸다; 상기 발현 확인의 분석에 있어서, 결과는 평균 ± SEM으로 나타내며, 스튜던트 t-test를 사용하여 분석한 후, P 값이 0.05 미만인 경우 유의적인 결과를 나타내는 것으로 확인하여, P < 0.05(*), P < 0.005(**) 및 P < 0.0005(***)로 나타내었다.
도 19는 KO-MEF에서 TAZ의 발현을 회복한 KO+TAZ 세포로부터 근육세포로 분화할 때, TM-53 및 TM-54에 따른 근육세포 마커 단백질의 발현 상승 효과를 나타낸다.
도 20은 KO-MEF에서 TAZ의 발현을 회복한 KO+TAZ 세포로부터 근육세포로 분화할 때, TM-53 및 TM-54에 따른 근육세포 마커 유전자의 발현 상승 효과를 나타낸다; 상기 발현의 분석에 있어서, 결과는 평균 ± SEM으로 나타내며, 스튜던트 t-test를 사용하여 분석한 후, P 값이 0.05 미만인 경우 유의적인 결과를 나타내는 것으로 확인하여, P < 0.05(*), P < 0.005(**) 및 P < 0.0005(***)로 나타내었다.
도 21은 근육세포에서 중염산염(dihydrochloride, DEX)으로 유발된 근위축에 대한 TM-53 및 TM-54의 근위축 개선 효과를 MyHC 단백질의 발현 수준을 통해 나타낸다.
도 22는 근육세포에서 DEX로 유발된 근위축에 대한 TM-53 및 TM-54의 근위축 개선 효과를 근위축 관련 유전자의 발현 수준 감소를 통해 나타낸다; 상기 발현 수준의 분석에 있어서, 결과는 평균 ± SEM으로 나타내며, 스튜던트 t-test를 사용하여 분석한 후, P 값이 0.05 미만인 경우 유의적인 결과를 나타내는 것으로 확인하여, P < 0.05(*) 및 P < 0.005(**)으로 나타내었다.
도 23은 근육 손상 마우스 모델에서 TM-53 또는 TM-54에 의한 운동량 개선 효과를 나타낸다.
도 24는 근육 손상 마우스 모델에서 TM-53 및 TM-54에 의한 조직학적인 근육 재생 효과를 나타낸다.
도 25는 근육 손상 마우스 모델에서 TM-53 및 TM-54에 의한 근육세포 마커 단백질의 MyHC 및 데스민(desmin)의 발현 및 근위축 관련 단백질인 MuRF1의 억제 효과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물을 제공한다.

(여기에서, 상기 R₁및 R₂은 각각 독립적으로,

또는

이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)

상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 [화학식 2]로 표시되는 2-부틸-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-5-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-6-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-5-carboxylic acid methyl ester, TM-53)인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 [화학식 3]으로 표시되는 2-부틸-5-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-6-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-5-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-6-carboxylic acid methyl ester, TM-54)인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 근원세포(myoblast) 유래의 근원성 분화 또는 비-근원세포 유래의 근원성 전환분화(transdifferentiation) 중 어느 하나 또는 둘 다를 촉진하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 분화된 근육세포에서 근위축 관련 유전자인 MuRF1 또는 MFAbx 중 어느 하나 또는 둘 다의 발현을 감소시키는 것이 발마직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 분화된 근육세포에서 근원성 마커 유전자인 MCK, 미오게닌(myogenin) 또는 MyoD, 또는 근육세포 마커 단백질인 MyHC의 발현을 증가시키는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 TAZ 조절자로서 TM-53 및 TM-54를 합성하여 TM-53 및 TM-54에 의한 TAZ의 핵 내 위치(nuclear localization) 조절 효과의 확인한 결과, TM-53의 농도가 증가함에 따라, Cos7 세포 및 근원세포(myoblast) 내에서 TAZ 단백질의 핵 내 위치 정도가 증가하는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 근원세포로부터 근육 세포로의 분화에 대하여 TM-53 및 TM-54가 나타내는 근원성 촉진 효과(myogenic stimulatory effects)를 확인하기 위하여, TM-53 또는 TM-54의 존재하에서 근원세포를 근육세포로 분화되도록 유도한 결과, TM-53 또는 TM-54를 처리하여 근육세포의 분화를 유도하였을 때 효과적인 근육세포의 분화 효과를 나타내며(도 5 내지 도 7 참조), 이는 TM-53 또는 TM-54 농도 의존적인 것을 확인하였다(도 8 내지 도 11 참조).

또한, 본 발명자들은 TAZ 넉아웃 근원세포 및 비-근원세포에 대한 TM-53 및 TM-54의 근원성 촉진 효과를 확인하기 위하여, TAZ가 넉아웃(knockout, KO) 된 근원세포(TAZi) 및 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 제조한 결과, TAZi 세포 및 TAZ 넉아웃 MEF(KO MEF)는 TM-53 또는 TM-54의 첨가 유무에 관계없이 근육세포로의 분화능을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 12 내지 도 15 참조).

또한, 본 발명자들은 비-근육세포에서 MyoD 발현 유무에 따라 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화의 효과를 확인하기 위하여, TAZ가 넉아웃된 MEF에서 MyoD 발현에 따른 근원성 전환 분화를 확인한 결과, TAZ를 발현하지 않는 KO+MyoD는 근육세포로의 분화를 나타내지 않는 것을 확인하였으며(도 16 내지 도 17 참조), TM-53 또는 TM-54를 처리한 경우에도 TAZ 및 MyoD 의존적인 근원성 전환 분화를 나타내는 것을 확인하였다(도 18 내지 도 20 참조).

따라서, 상기 TM-53 및 TM-54는 근원세포 및 비-근원세포로부터 근육세포로의 분화 및 전환분화에 대하여 농도 의존적인 분화 촉진 효과를 유의적으로 나타내므로, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 [화학식 1]의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 [화학식 1]의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

또한, 본 발명의 상기 [화학식 1]의 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 [화학식 1]의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 발명의 [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 1 내지 100 μM의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 구체적으로는 2 내지 50 μM의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하고, 보다 구체적으로는 2.5 내지 10 μM의 농도로 포함되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 근육 재생은 손상된 근육 세포의 재생인 것이 바람직하며, 상기 손상은 수술, 암, 염증 및 감염을 포함하는 유전적 요인, 및 환경적 요인에 의한 것 모두를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또다른 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 TM-53 및 TM-54가 위축된 근육세포에서 근위축에 대하여 나타내는 개선 효과를 확인하기 위하여, TM-53 및 TM-54을 처리하여 분화를 유도한 후 근위축을 유발 물질인 중염산염(dihydrochloride)을 처리한 근육세포에서 MyHC 단백질의 발현 유도 효과를 확인한 결과, TM-53 또는 TM-54를 처리하여 분화된 근육세포는 DEX의 처리로 인한 근위축 유발 유무와 관계없이 MyHC 단백질을 발현하였으며, 상기 발현의 수준은 근위축을 유발하지 않은 정상 대조군에서의 MyHC 발현 수준보다 현저하게 상승하였고(도 21 참조), 근위축 관련 유전자인 MuRF1 및 MAFbx 유전자의 발현 정도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 22).

또한, 본 발명자들은 생체 내에서 TM-53 및 TM-54에 의하여 손상된 근육의 재생 효과를 확인하기 위하여, 근육 손상을 유발한 마우스 모델에서 TM-53 또는 TM-54에 의한 운동량 개선 효과 및 조직학적인 근육 재생 효과를 확인한 결과, 근육 손상을 유발한 마우스 모델에 TM-53 또는 TM-54를 투여하였을 때, 상기 마우스 모델에서 근육 활성의 개선을 나타내고(도 23 참조), 근육 조직에서 근육의 재생, 이에 따른 근육세포 마커 단백질의 발현 수준의 증가 및 근위축 관련 단백질 발현 수준의 감소를 확인하였다(도 24 및 도 25 참조).

따라서, 상기 TM-53 및 TM-54는 근위축 유도 물질을 처리한 근육세포에서 근위축 관련 유전자의 발현을 감소하면서 근원성 마커 단백질의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, 생체 내(in vivo)에서 근육 손상 모델의 근육 재생효과를 유의적으로 나타내므로, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 근육 재생용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 근육장애(muscle disorder)는 타박상(contusion), 열상(laceration) 또는 압좌(crush)와 같은 외적 요인, 갑작스럽거나 심한 낙상 또는 스포츠 활동 중의 근육 긴장(muscle strain)과 같은 내적 요인, 치료 중 발생할 수 있는 혈액 공급이 중단될 때 발생하는 근육 손상, 유전적 또는 환경적 원인에 의한 근육의 소모, 및 이로 인한 근육 기능의 손실로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 구체적으로 근육위축증(muscle atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscle injury), 근이영양증(muscle dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive diseases) 및 신경 손상(nerve injury)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 TM-53 및 TM-54는 근위축 유도 물질을 처리한 근육세포에서 근위축 관련 유전자의 발현을 감소하면서 근원성 마커 단백질의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, 생체 내(in vivo)에서 근육 손상 모델의 근육 재생효과를 유의적으로 나타내므로, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육세포 분화 유도용 건강식품을 제공한다.

[화학식 1]

.

(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,

또는

이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)

[화학식 2]

.

[화학식 3]

.

상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 근원세포 유래의 근원성 분화 또는 비-근원세포 유래의 근원성 전환분화 중 어느 하나 또는 둘 다를 촉진하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 TM-53 및 TM-54는 근원세포 및 비-근원세포로부터 근육세포로의 분화 및 전환분화에 대하여 농도 의존적인 분화 촉진 효과를 유의적으로 나타내며, 근위축 유도 물질을 처리한 근육세포에서 근위축 관련 유전자의 발현을 감소하면서 근원성 마커 단백질의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, 생체 내(in vivo)에서 근육 손상 모델의 근육 재생효과를 유의적으로 나타내므로, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 근육세포 분화 유도 또는 촉진용 건강식품, 근육 재생용 건강식품, 또는 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 화합물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> TAZ 조절자 합성

본 발명의 실시예를 수행하기 위하여, 한국화학연구원에서 TAZ 조절자인 2-부틸-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-5-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-6-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-5-carboxylic acid methyl ester, TM-53) 및 2-부틸-5-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-6-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-5-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-6-carboxylic acid methyl ester, TM-54)를 합성하였다(대한민국 등록특허 제 10-1117128호).

합성한 TM-53 및 TM-54의 순도(purity)는 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 측정하였으며, 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 10 ㎎/㎖ 농도로 녹여 보관하였다.

그 결과, 하기 [화학식 2] 및 [화학식 3]에서 나타난 바와 같이 TM-53 및 TM-54를 합성하였으며, 순도는 95%인 것을 확인하였다.

[화학식 2]

.

[화학식 3]

.

< 실시예 2> TM -53 및 TM -54에 의한 TAZ 의 핵 내 위치( nuclear localization ) 조절 효과의 확인

<2-1> pEGEP - TAZ 벡터의 구축

TAZ 단백질이 세포 내에서 나타내는 위치를 용이하게 파악하기 위하여, 녹색 형광 단백질(green fluroescence protein, GFP)를 연결한 TAZ-GFP 단백질을 암호화하는 벡터를 구축하여, 이를 형질도입하기 위한 레트로바이러스(retrovirus)를 제조하였다.

구체적으로, 전장(fulllength) TAZ cDNA를 PCR로 증폭한 다음, GFP의 유전자를 포함하고 있는 발현 벡터인 pEGFP 벡터(Invitrogen 사, 미국)에 삽입하여, pEGEP-TAZ 벡터를 구축하였다. 보정(nomalization)을 위한 대조군을 위하여, 전장 히스톤 H2B의 cDNA를 PCR로 증폭하고, 적색 형광 단백질(red fluroescence protein, RFP)의 유전자를 포함하고 있는 발현 벡터(Clontech Laboratories 사, 미국)에 삽입하여, pREP-H2B 벡터를 구축하였다. 구축한 pEGEP-TAZ 및 pREP-H2B 벡터는 플래티넘 E(Platinum E, plat E; ATCC 구입, 미국)에 형질전환하고, 32℃ 배양기(incubator)에서 배양하여, pEGEP-TAZ 및 pREP-H2B 벡터를 포함하는 레트로바이러스(retrovirus)를 수득하였다. 수득한 레트로바이러스는 PEG 바이러스 침전 키트(PEG Virus Precipitation Kit; BioVision 사, 미국)를 사용하여 농축하였다.

<2-2> GFP - TAZ 안정화 세포( stable cell ) 제조

GFP-TAZ 및 보정 대조군인 RFP-H2B를 나타내는 세포를 제조하기 위하여, pEGEP-TAZ 및 pREP-H2B 벡터를 포함하는 GFP-TAZ 안정화 세포를 제조하였다.

구체적으로, 96 웰 플레이트에 Cos7 세포(ATCC 구입, 미국)를 웰 당 5×10³ 세포가 되도록 접종 및 배양한 후, 상기 실시예 <2-1>에서 농축한 레트로바이러스를 Cos7 세포에 처리하고, 8 μg/㎖ 폴리브렌(polybrene; 시그마 알드리치 사, 미국)을 포함하는 배지에서 24 시간 동안 배양하여, pEGEP-TAZ 및 pREP-H2B 벡터를 형질감염하였다. 형질감염된 Cos7 세포를 2.5 μg/㎖ 푸로마이신(puromycin; 시그마 알드리치 사, 미국)을 포함하는 배지에서 선별한 다음, 상기 <실시예 1>에서 제조한 TM-53을 각각 0, 1, 10 또는 100 μM의 농도로 상기 형질감염한 Cos7 세포에 처리하고, 300 mOsm NaCl 농도의 등장(isotonic) 또는 150 mOsm NaCl 농도의 저염(hypotonic) 조건에서 2 시간 동안 배양하여 GFP-TAZ 안정화 세포를 제조하였다(Jang EJ et al . (2012). Br J Pharmacol 165: 1584-1594). 상기 제조된 GFP-TAZ 안정화 세포는 BD 패스웨이 바이오이미징 시스템(BD pathway Bioimaging system; BD Biosciences 사, 미국)으로 GFP의 형광을 관찰하여 TAZ 단백질의 위치를 확인하였다. GFP의 형광에 대한 보정을 위한 대조군으로서, 히스톤 H2B와 결합되어 있는 REP의 형광을 관찰하여, 이를 기준으로 보정한 다음, GFP의 형광 신호를 정량적으로 계산하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 나타난 바와 같이, TM-53의 농도가 증가함에 따라, 세포 내에서 TAZ 단백질의 핵 내 위치 정도가 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2).

< 실시예 3> 근원세포( myoblast )에서 TM -53 및 TM -54의 TAZ 에 대한 핵 내 위치 조절 효과의 확인

TM-53 및 TM-54이 근원세포에서 TAZ의 핵 내 위치를 조절하는 효과를 확인하기 위하여, C2C12세포에서 내인성(Endogenous) TAZ 단백질의 핵 내 위치를 확인하였다.

구체적으로, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 배양한 근원세포(myoblast)인 C2C12 세포(ATCC 구입, 미국)에 10 μM의 TM-53 또는 TM-54을 첨가하여 24 시간 동안 처리한 다음, 4% 포름알데히드(formaldehyde)를 포함하는 인산완충식염수 (phosphate buffered saline, PBS)를 처리하여 실온에서 15 분간 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100(triton X-100)을 처리하여 세포막에 투과성(Permeability)를 부여하였다. 처리 후, 상기 처리한 세포를 4% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum)을 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 차단(blocking)한 다음, 1차 항체로 항-TAZ 항체를 처리하여 4℃에서 밤새 배양하고, 0.1% 트윈-20(Tween-20)을 포함하는 PBS인 PBST로 수회 세척하였다. 세척 후, 알렉사 플루오르 594(Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체(Invitrogen, 미국)를 처리하여 1 시간 동안 배양하여 TAZ를 면역형광염색하였다. 그런 다음, 세포의 핵의 위치를 확인하고 발현의 정도를 대조하기 위해 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(4'6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여, 이를 형광 현미경(fluorescence microscope; olympus, 일본) 또는 자이스 LSM 510 공초점 현미경(Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하여 C2C12 세포 내에서 TAZ 단백질의 핵 내 위치를 확인하였다. 용매 대조군(vehicle control)로, TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이, TM-53 또는 TM-54를 처리하였을 때, 용매 대조군에 비해서 핵 주변에 TAZ 단백질의 발현이 나타나는 것을 확인하였으며(도 3), 이를 정량적으로 분석하였을 때 핵 주변에서 발현량이 현저히 상승하는 효과를 확인하였다(도 4).

< 실시예 4> 근육세포 분화에 대한 TM -53 및 TM -54의 근원성 촉진 효과( myogenic stimulatory effects )의 확인

<4-1> TM -53 및 TM -54 처리에 따른 근육세포로의 분화 유도 효과 확인

근원세포로부터 근육 세포로의 분화에 대하여 TM-53 및 TM-54가 나타내는 분화 유도 효과를 확인하기 위하여, TM-53 또는 TM-54의 존재하에서 근원세포를 근육세포로 분화되도록 유도하였다.

구체적으로, 근원세포인 C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화(confluent)될 때까지 배양하였다. 그런 다음, 10 μM의 TM-53 또는 TM-54를 처리하여 6 시간 동안 배양하면서, C2C12 근원세포를 성숙한(mature) 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 유도 후, 위상차 현미경으로 세포의 형태를 확인한 다음, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법을 수행하여 분화된 근육세포 내에서 근원성 마커인 HyHC를 형광면역염색하였다. 상기 형광면역염색을 위한 1차 항체로서, 항-MyHC 항체를 사용하였으며, DAPI로 핵을 염색하여 핵의 위치 및 형광의 발현 정도를 비교하였다. 용매 대조군로, TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 5 내지 도 7에서 나타난 바와 같이, TM-53 또는 TM-54를 처리하여 근육세포의 분화를 유도하였을 때, 분화된 근육세포의 형태 변화(morphological change)가 현저하게 발달하는 것을 확인하였으며(도 5), 근육세포의 마커 단백질인 MyHC의 발현 역시 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7).

<4-2> TM -53 및 TM -54 처리량에 따른 근원성 마커 단백질의 발현 확인

근원세포로부터 근육 세포로 분화될 때, TM-53 또는 TM-54의 처리량(dose)에 의존적으로 분화 유도 효과가 나타나는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 농도로 TM-53 및 TM-54를 처리하여 근원세포로부터 근육세포로의 분화를 유도하여 근원성 마커 단백질인 MyHC 단백질 및 미오게닌(myogenin) 단백질의 발현을 확인하였다.

구체적으로, 근원세포인 C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 0, 2.5, 5 또는 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하여 6 시간 동안 배양하면서, C2C12 근원세포를 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 그런 다음, 상기 유도된 근육세포를 수득하고 파쇄하여, 각각의 세포로부터 수득한 상층액을 단백질 추출물로서 수득한 다음, 전체 단백질을 SDS-PAGE gel에서 분리하고, 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 이동하여 4% 스킴 밀크(skim milk) 또는 5% 소혈청알부민(bovine serum albumi, BSA)로 차단하였다. 차단 후, 상기 막에 1차 항체로 항-MyHC 항체(제품번호: MF-20, DSHB 사, 미국) 및 항-미오게닌 항체를 처리하여 4℃에서 밤새 배양하고, TBST로 세척하여, 거위 유래의 항-마우스 IgG 항체(goat anti-mouse IgG)를 2차 항체로 하여 1% 소혈청알부민(bovine serum albumi, BSA)을 포함하는 TBST와 함께 막에 처리하여 한 시간 동안 배양하여 웨스턴블럿(western blot)을 수행하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin) 항체(Santa Cruz Biotechnology 사, 미국)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에서 나타난 바와 같이, 근원성 마커인 MyHC 및 미오게닌 단백질의 발현량이 TM-53 또는 TM-54의 처리량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 8 및 9).

<4-3> TM -53 및 TM -54 처리량에 따른 근원성 마커 유전자의 전사 수준 확인

TM-53 및 TM-54의 처리량에 의존적으로 근육세포로의 분화 유도 효과가 나타나는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 농도로 TM-53 또는 TM-54를 처리하여 근원세포로부터 근육세포로의 분화를 유도하고 근원성 마커 유전자인 근육 크레아틴 인산화 효소(mascle creatin kinase, MCK), 미오게닌, MyoD 및 TAZ의 전사적 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 근원세포인 C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 0, 2.5, 5 또는 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하여 6 시간 동안 배양하면서, C2C12 근원세포를 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 유도 후, 상기 유도된 근육세포를 수득하여 트리졸(TRIzol; Invitrogen, 미국) 시약에 현탁하고 제조사의 프로토콜에 따라 근육세포의 전체 RNA를 추출하여, 하기 [표 1]의 프라이머 및 수퍼스크립트 II 키트(superscript II kit; Invitrogen 사, 미국)를 사용하여 역전사(reverse transcription)하여 MCK, 미오게닌, MyoD 및 TAZ의 cDNA를 각각 합성하였다. 합성한 cDNA는 SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 ABI 7300 real time PCR 시스템(Applied Biosystems 사, 미국) 기기에서 real-time PCR을 수행하여, MCK, 미오게닌, MyoD 및 TAZ 유전자의 전사적 발현을 정량적으로 확인하였다. 상기 유전자의 발현에 보정을 위한 대조군으로서, β-액틴의 유전자의 발현을 상기와 동일한 방법을 수행하여 확인하고, 이를 기준으로 보정한 다음, MCK, 미오게닌, MyoD 및 TAZ 유전자의 발현 수준을 정량적으로 비교하였다.

MCK, 미오게닌, MyoD 및 TAZ 유전자의 증폭을 위한 프라이머 서열

증폭 유전자	프라이머 명칭	서열번호	서열
MCK	MCK_F	서열번호 1	cacctccacagcacagacag
MCK	MCK_R	서열번호 2	accttggccatgtgattgtt
미오게닌	myog_F	서열번호 3	caaccaggaggagcgagacctccg
미오게닌	myog_R	서열번호 4	aggcgctgtgggatatgcattcact
MyoD	MyoD_F	서열번호 5	tgggatatggagcttctatcgc
MyoD	MyoD_R	서열번호 6	ggtgagtcgaaacacggatcat
TAZ	TAZ_F	서열번호 7	gtcaccaacagtagctcagatc
TAZ	TAZ_R	서열번호 8	agtgattacagccaggttagaaag
β-액틴	act_F	서열번호 9	agagggaaatcgtgcgtgac
β-액틴	act_R	서열번호 10	caatagtgatgacctggccgt

그 결과, 도 10 및 도 11에서 나타난 바와 같이, TM-53 또는 TM-54를 처리하였을 때 MCK, 미오게닌, MyoD 및 TAZ의 전사적 발현이 증가하며, 특히 MCK 및 미오게닌의 발현은 TM-53 또는 TM-54의 처리량에 의존적으로 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 10 및 도 11).

< 실시예 5> TAZ 넉아웃 근원세포에 대한 TM -53 및 TM -54의 근원성 촉진 효과의 확인

<5-1> TAZ 넉아웃 근원세포의 제조

TM-53 및 TM-54에 의해서 나타나는 근육세포 분화의 촉진 효과에 있어서, TAZ의 발현이 미치는 영향을 확인하기 위하여, TAZ가 넉아웃(knockout, KO) 된 근원세포(TAZi)를 제조하였다.

구체적으로, pSRP-shTAZ 벡터를 플래티넘 E 세포에 형질전환하고 32℃ 배양기에서 배양하여, pSRP-shTAZ 벡터를 포함하는 레트로바이러스를 수득하고, 이를 PEG 바이러스 침전 키트를 사용하여 농축하였다. 그런 다음, 상기 농축한 바이러스를 C2C12 세포에 처리하고, 8 μg/㎖ 폴리브렌(polybrene; 시그마 알드리치 사, 미국)을 포함하는 배지에서 24 시간 동안 배양하여, pSRP-shTAZ 벡터가 형질감염된 C2C12 세포를 2.5 μg/㎖ 푸로마이신(puromycin; 시그마 알드리치 사, 미국)을 포함하는 배지에서 6 일간 배양하여 선별한 다음, TAZ가 넉아웃된 근원세포(TAZi)를 제조하였다. 음성대조군으로, TAZ를 넉아웃 하는 유전자를 포함하지 않는 pSRP 벡터를 상기와 동일한 방법을 사용해 C2C12 세포에 형질감염하여 TAZ 발현 C2C12 세포를 제조하였다(coni).

<5-2> TM -53 및 TM -54 처리에 따른 TAZ 넉아웃 세포에서 근육세포로의 분화 유도 효과 확인

TM-53 및 TM-54에 의해서 나타나는 근육세포 분화의 촉진 효과에 있어서, TAZ의 발현이 미치는 영향을 확인하기 위하여, TAZi 세포를 근육세포로 분화되도록 유도하였다.

구체적으로, 상기 <5-1>에서 제조한 TAZi 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하여 6 시간 동안 배양하면서, TAZi 세포를 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <4-2>와 동일한 방법으로 웨스턴블럿을 수행하여 MyHC 단백질의 발현을 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로는 β-액틴(actin)의 발현을 확인하였으며, 음성 대조군으로는 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 TAZ 발현 C2C12 세포(coni)를 사용하였고, 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이 TAZ를 발현하는 근원세포(coni)는 용매 대조군에 비하여 TM-53 또는 TM-54에 의한 근육세포로의 분화 유도가 촉진되는 효과를 나타내는 반면, TAZ 넉아웃 근원세포(TAZi)은 TM-53 또는 TM-54 처리에도 MyHC를 발현하지 않아, 근원세포의 분화가 손상되어 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 12).

<5-3> TM -53 및 TM -54에 따른 TAZ 넉아웃 세포에서 근원성 마커 유전자의 전사 수준 확인

TAZ 넉아웃 세포가 근육세포로의 분화 유도될 때 TM-53 및 TM-54에 의한 근원성 분화 유도 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, TM-53 및 TM-54를 처리하여 TAZi 세포로부터 근육세포로의 분화를 유도하고 근원성 마커 유전자인 MCK 및 미오게닌의 전사적 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <5-1>에서 제조한 TAZi 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하여 6 시간 동안 배양하면서, TAZi 세포를 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 유도 후, 상기 유도된 근육세포를 수득하여 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법을 사용하여 전체 RNA를 추출하여 MCK, 미오게닌 및 TAZ 유전자의 cDNA를 각각 합성한 다음, real-time RCR을 수행하여 상기 유전자의 전사적 발현을 정량적으로 확인하였다. 상기 유전자의 발현에 보정을 위한 대조군으로서, β-액틴의 유전자의 발현을 상기와 동일한 방법을 수행하여 확인하고, 이를 기준으로 보정한 다음, MCK, 미오게닌 및 TAZ 유전자의 발현 수준을 정량적으로 비교하였으며, 음성 대조군으로는 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 coni 세포를 사용하였고, 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 13 및 도 14에서 나타난 바와 같이, TM-53 및 TM-54의 처리 유무와 관계없이 TAZi 세포에서 TAZ의 발현이 나타나지 않았고(도 13), 이와 마찬가지로 TAZi 세포에서 근원성 마커 유전자인 MCK 및 미오게닌의 전사적 발현이 일어나지 않아, TM-53 및 TM-54을 처리한 음성 대조군에서 MCK 및 미오게닌의 발현이 상승되는 것과 상반된 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 14).

< 실시예 6> TAZ 의존적인 MyoD 발현에 대한 TM -53 및 TM -54의 발현 촉진 효과 확인

<6-1> TAZ 넉아웃 마우스 배아 섬유아세포( mouse embryonic fibroblast , MEF)의 제조

TAZ에 의존적인 MyoD 활성에 있어서 TM-53 및 TM-54가 미치는 영향을 확인하기 위해서, TAZ가 넉아웃된 마우스 배아 섬유아세포(KO MEF)를 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법을 사용하여 pSRP-shTAZ 벡터를 마우스 배아 섬유아세포에 형질감염하여, TAZ가 넉아웃된 마우스 배아 섬유아세포주(KO-MEF)를 제조하였다(Hong JH et al , (2005). Science 309: 1074-1078). 음성대조군으로, TAZ를 넉아웃 하는 유전자를 포함하지 않는 pSRP 벡터를 상기와 동일한 방법으로 MEF에 형질감염하여 TAZ 발현 MEF을 제조하여, 이를 야생형으로 사용하였다(WT-MEF).

<6-2> TM -53 및 TM -54에 의한 TAZ 의존적인 MyoD 발현 촉진 효과 확인

TAZ에 의존적인 MyoD 활성에 있어서 TM-53 및 TM-54가 미치는 영향을 확인하기 위해서, TAZ가 넉아웃된 MEF에서 MyoD로 유도되는 MCK 프로모터(promotor)의 활성을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <6-1>에서 제조한 KO-MEF에 pMCK-루시퍼라아제(luciferase, luc) 리포터 유전자를 포함하는 MyoD 발현 벡터(Jeong H et al . (2010). FASEB J 24: 3310-3320)를 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 형질감염하여, KO/MyoD 세포주를 제조하였다. 그런 다음, 상기 제조한 KO/MyoD 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하여 6 시간 동안 배양하고, 리포터 용해 완충용액(reporter lysis buffer)에 상기 배양한 KO/MyoD 세포를 현탁하여 세포 단백질을 추출하였다. 상기 추출한 세포 단백질 10 ㎕에 루시퍼라제 기질(luciferase substrate; promega 사, 미국)과 혼합하여 루미노미터(luminometer; Berthold 사, 독일)로 발광도(luminescence)를 측정하여 MCK 프로모터를 유도하는 MyoD의 발현 수준을 확인하였다. 보정을 위한 대조군으로, MyoD 발현 벡터와 함께 pCMVbeta-gal 유전자의 발현에 따르는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase) 활성을 측정한 다음, 형질감염 효율(transfection efficiency)를 보정하여 MCK 프로모터 활성의 증가 정도를 용매 대조군과 비교하여 발현 배수(fold induction) 또는 백분율(%)로 나타내었다. 음성 대조군으로 WT-MEF에 상기 방법과 동일한 방법으로 pMCK-luc 리포터 유전자를 포함하는 MyoD 발현 벡터를 형질감염한 WT/MyoD 세포주를 제조하여 MyoD의 발현 수준을 확인하였고, 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 15에서 나타난 바와 같이 TAZ를 발현하는 WT-MEF에 TM-53 및 TM-54를 처리하였을 때 용매 대조군에 비해 MyoD의 발현 수준이 현저히 상승하는 반면, TAZ를 발현하지 않는 KO-MEF에서는 TM-53 및 TM-54의 유무와 관계없이 MyoD의 발현이 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 15).

< 실시예 7> TM -53 및 TM -54에 의한 비-근육 세포에서 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화( transdifferentiation ) 유도 효과의 확인

<7-1> TAZ 및 MyoD 발현 유무에 따른 비- 근육세포로부터 근원성 전환 분화의 확인

비-근육세포에서 MyoD 발현 유무에 따라 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화의 효과를 확인하기 위하여, TAZ가 넉아웃된 MEF에서 MyoD 발현에 따른 근원성 전환 분화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <6-1>과 동일한 방법을 수행하여 제조한 WT-MEF 또는 KO-MEF에, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 MyoD 발현 벡터를 포함하는 레트로바이러스(RV-MyoD)를 감염하여, MyoD를 발현하는 WT-MEF(WT+MyoD) 또는 KO-MEF(KO+MyoD)를 각각 수득하였다. 그런 다음, 상기 수득한 WT+MyoD 또는 KO+MyoD를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 배양하면서 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하여, 위상차 현미경으로 세포의 형태를 확인하였다. 음성 대조군으로, MyoD 발현 벡터를 포함하는 레트로바이러스(RV)를 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 16에서 나타난 바와 같이, TAZ 및 MyoD를 동시에 발현하는 WT+MyoD는 성숙한 근육세포로의 분화를 효과적을 나타내는 것에 비해, TAZ를 발현하지 않는 KO+MyoD는 근육세포로의 분화를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 16).

<7-2> TAZ 및 MyoD 발현 유무에 따른 근원성 전환 분화된 비- 근육세포 유래 근육세포의 근육세포 마커 유전자 발현의 확인

비-근육세포에서 MyoD 발현 유무에 따라 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화의 효과를 확인하기 위하여, TAZ가 넉아웃된 KO MEF로부터 근원성 전환 분화 유도된 근육세포에서 MyoD 발현에 따른 근육세포 마커 유전자 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <7-1>과 동일한 방법을 수행하여 WT+MyoD 또는 KO+MyoD를 각각 수득하고 이를 배양하여 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도한 후, 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법으로 상기 근육세포의 cDNA를 합성하고, real-time PCR을 수행하여 MCK, 미오게닌 및 MyoD 유전자의 전사적 발현을 정량적으로 확인하였다. 음성 대조군으로, MyoD 발현 벡터를 포함하는 레트로바이러스(RV)를 WT+MyoD 또는 KO+MyoD에 형질감염하여 상기와 동일한 방법으로 근육세포를 분화하였다.

그 결과, 도 17에서 나타난 바와 같이 WT-MEF 또는 KO-MEF에서 TAZ의 발현 유무와 관계없이, MyoD를 발현하지 않는 세포에서 MCK 및 미오게닌의 유전자 발현이 나타나지 않는 것을 확인하였으며, KO+MyoD에서 WT+MyoD에 비해 MCK 및 미오게닌 유전자의 발현이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 17).

< 실시예 8> TM -53 및 TM -54에 의한 비-근육 세포에서 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화( transdifferentiation ) 유도 효과의 확인

<8-1> 비-근육 세포로부터 근육 세포로의 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화에 대한 TM -53 및 TM -54의 분화 유도 효과 확인

TAZ 의존적인 근원성 전환 분화를 통해 비-근육세포로부터 근육세포로 분화를 유도할 때 TM-53 및 TM-54의 분화 유도 효과를 확인하기 위하여, TM-53 또는 TM-54을 처리하여 분화 유도된 WT+MyoD 및 KO+MyoD 유래의 근육세포에서 근육세포 마커 유전자의 발현을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <6-1>과 동일한 방법을 수행하여 제조한 WT-MEF 또는 KO-MEF에, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 MyoD를 발현하는 레트로바이러스(RV-MyoD)를 감염하여, MyoD를 발현하는 WT-MEF(WT+MyoD) 또는 KO-MEF(KO+MyoD)를 각각 수득하였다. 그런 다음, 상기 수득한 WT+MyoD 또는 KO+MyoD를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하고 배양하면서, 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 분화된 근육 세포를 수득하여 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법으로 cDNA를 합성하고, real-time PCR을 수행하여 MCK 및 미오게닌 유전자의 전사적 발현 수준을 확인하였다. 보정을 위한 대조군으로서, β-액틴의 유전자의 발현을 상기와 동일한 방법을 수행하여 확인하고, 이를 기준으로 보정한 다음 MyoD 유전자의 발현 수준을 기준으로 비교하였다. 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 18에서 나타난 바와 같이 TM-53 또는 TM-54를 처리하였을 때, 용매 대조군과 비교하여 MCK 및 미오게닌 유전자의 발현 수준이 증가하였으나, TAZ를 발현하지 않는 KO+MyoD에 비해 WT+MyoD에서 현저한 상승을 나타내어, TM-53 및 TM-54에 의한 근원성 전환 분화의 촉진에 있어서 TAZ 의존적인 것을 확인하였다(도 18).

<8-2> TAZ 발현 조건에서 비-근육 세포로부터 TM -53 및 TM -54로 촉진되어 전환 분화된 근육세포의 마커 단백질 발현 확인

TM-53 및 TM-54로 분화 촉진되는 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화에 있어서 TAZ 발현 회복으로 인한 분화 효과의 회복 여부를 확인하기 위하여, KO+MyoD에서 TAZ의 발현을 회복한 뒤 TM-53 또는 TM-54에 의한 비-근육세포에서 근육세포로의 전환분화 촉진 효과를 근육세포 마커 단백질 발현을 통해 확인하였다.

구체적으로, MyoD 또는 TAZ의 cDNA를 PCR로 증폭하여 발현벡터에 연결(ligation)한 다음, 미생물 형질전환(bacteria transformation)으로 플라스미드를 증폭 및 수득하여, 특정 제한효소로 자른 후, 서열분석(sequencing)을 통해 올바르게 구축(contruction)된 cDNA 발현 벡터를 확인하여, MyoD 발현 벡터 또는 TAZ 발현 벡터(Hong JH et al , (2005). Science 309: 1074-1078)를 구축하고, 상기 실시예 <6-1>과 동일한 방법을 수행하여 제조한 KO-MEF에, 상기 MyoD 발현 벡터 및 TAZ 발현 벡터를 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 형질 감염하여 TAZ 넉아웃 세포에서 TAZ의 발현을 회복하였다(KO+TAZ). 그런 다음, 상기 수득한 KO+TAZ를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하고 배양하면서, 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 분화된 근육 세포를 수득하여 상기 실시예 <4-2>와 동일한 방법으로 웨스턴블럿을 수행하여, MyHC, 미오게닌 및 MyoD 단백질의 발현을 확인하였다. 음성 대조군으로는 TAZ 발현을 회복하지 않은 TAZ 넉아웃 세포를 사용하였고, 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 19에서 나타난 바와 같이 TAZ가 넉아웃된 KO-MEF에서는 근육세포 마커 단백질의 발현이 나타나지 않는 반면, KO-MEF에서 TAZ의 발현을 회복한 KO+TAZ 세포로부터 근육세포로 분화할 때, TM-53 또는 TM-54를 처리한 분화 유도에서 근육세포 마커 단백질의 발현이 현저하게 상승하는 것을 확인하였다(도 19).

<8-3> TAZ 발현 조건에서 비-근육 세포로부터 TM -53 및 TM -54로 촉진되어 전환 분화된 근육세포의 마커 유전자 발현 확인

TM-53 및 TM-54로 분화 촉진되는 TAZ 의존적인 근원성 전환 분화에 있어서 TAZ 발현 회복으로 인한 분화 효과의 회복 여부를 확인하기 위하여, KO+MyoD에서 TAZ의 발현을 회복한 뒤 TM-53 또는 TM-54에 의한 비-근육세포에서 근육세포로의 전환분화 촉진 효과를 근육세포 마커 유전자 발현을 통해 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <6-1>과 동일한 방법을 수행하여 제조한 KO-MEF에, 상기 실시예 <8-2>에서 구축한 후 MyoD 발현 벡터 및 TAZ 발현 벡터를 <5-1>과 동일한 방법으로 형질 감염하여 TAZ 넉아웃 세포에서 TAZ의 발현을 회복하였다(KO+TAZ). 그런 다음, 상기 수득한 KO+TAZ를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하고 배양하면서, 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 분화된 근육 세포를 수득하여 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법으로 cDNA를 합성하고, real-time PCR을 수행하여 MCK 및 미오게닌 유전자의 전사적 발현 수준을 확인하였다. 보정을 위한 대조군으로서, β-액틴의 유전자의 발현을 상기와 동일한 방법을 수행하여 확인하고, 이를 기준으로 보정하였으며, 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 20에서 나타난 바와 같이 TAZ가 넉아웃된 KO-MEF에서는 TM-53 및 TM-54의 처리 유무와 관계없이 MCK 및 미오게닌 유전자의 발현이 나타나지 않는 반면, KO-MEF에서 TAZ의 발현을 회복한 KO+TAZ 세포로부터 근육세포로 분화할 때, TM-53 또는 TM-54를 처리한 분화 유도에서 MCK 및 미오게닌 유전자의 발현이 현저하게 상승하는 것을 확인하였다(도 20).

< 실시예 9> 근육세포 위축에 대한 TM -53 및 TM -54의 근위축 개선 효과의 확인

<9-1> 위축된 근육세포에서 TM -53 및 TM -54에 의한 MyHC 단백질 발현 효과

TM-53 및 TM-54가 위축된 근육세포에서 근위축에 대하여 나타내는 개선 효과를 확인하기 위하여, TM-53 및 TM-54을 처리하여 분화를 유도한 후 근위축을 유발 물질인 중염산염(dihydrochloride)을 처리한 근육세포에서 MyHC 단백질의 발현 유도 효과를 확인하였다.

구체적으로, 근원세포인 C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하여 6 일 동안 배양하면서, C2C12 근원세포를 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 유도 후, 분화된 근육세포에 500 μM 중염산염(dihydrochloride, DEX)을 24 시간 동안 처리하여 근위축을 유발한 다음, 상기 실시예 <4-2>과 동일한 방법으로 웨스턴블럿을 수행하여 근육세포 단백질인 MyHC의 발현을 확인하였다. 정상 대조군으로는 분화된 근육세포에 DEX를 처리하지 않은 정상 세포를 사용하였고, 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 21에서 나타난 바와 같이, TM-53 또는 TM-54를 처리하여 분화된 근육세포는 DEX의 처리로 인한 근위축 유발 유무와 관계없이 MyHC 단백질을 발현하였으며, 상기 발현의 수준은 근위축을 유발하지 않은 정상 대조군에서의 MyHC 발현 수준보다 현저하게 높은 것을 확인하였다(도 21).

<9-2> 위축된 근육세포에서 TM -53 및 TM -54에 의한 근위축 관련 유전자 발현 효과

TM-53 및 TM-54가 위축된 근육세포에서 근위축에 대하여 나타내는 개선 효과를 확인하기 위하여, TM-53 또는 TM-54을 처리하여 분화를 유도한 후 근위축을 유발한 근육세포에서 근위축 관련 유전자의 발현을 확인하였다.

구체적으로, 근원세포인 C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 10 μM의 농도로 TM-53 또는 TM-54를 각각 처리하여 6 일 동안 배양하면서, C2C12 근원세포를 성숙한 근육세포로 분화되도록 유도하였다. 유도 후, 분화된 근육세포에 500 μM 중염산염(dihydrochloride, DEX)을 24 시간 동안 처리하여 근위축을 유발한 다음, 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법으로 근육세포의 cDNA를 합성한 후, real-time PCR을 수행하여 근위축 관련 유전자인 MuRF1 및 MAFbx 유전자의 발현을 확인하였다. 상기 cDNA 합성 및 real-time PCR에 사용한 프라이머의 서열은 하기 [표 2]에 기재된 바와 같다. 정상 대조군으로는 분화된 근육세포에 DEX를 처리하지 않은 정상 세포를 사용하였고, 용매 대조군로는 TM-53 또는 TM-54를 포함하지 않는 DMSO를 상기와 동일한 방법으로 처리하여, 이를 비교하였다.

근위축 관련 유전자 MuRF1 및 MAFbx의 증폭을 위한 프라이머 서열

증폭 유전자	프라이머 명칭	서열번호	서열
MuRF1	MuRF1_F	서열번호 11	gagcccggaggggctacctt
MuRF1	MuRF1_R	서열번호 12	gtcttccccagctggcagcc
MAFbx	MAFbx_F	서열번호 13	aaggctgttggagctgatagca
MAFbx	MAFbx_R	서열번호 14	cacccacatgttaatgttgccc
β-액틴	act_F	서열번호 9	agagggaaatcgtgcgtgac
β-액틴	act_R	서열번호 10	caatagtgatgacctggccgt

그 결과, 도 22에서 나타난 바와 같이 근육세포 분화시 TM-53 또는 TM-54를 처리하였을 때, 용매 대조군에 비하여 근위축 관련 유전자인 MuRF1 및 MAFbx 유전자의 발현 정도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 22).

< 실시예 10> 생체 내( in vivo )에서 TM -53 및 TM -54에 의한 근육 재생 효과의 확인

<10-1> 근육 손상 마우스 모델의 제조

생체 내에서 TM-53 및 TM-54에 의하여 손상된 근육의 재생 효과를 확인하기 위하여, 근육 손상을 유발한 마우스 모델을 제조하였다.

구체적으로, 수컷 C57BL/6 야생형 마우스를 준비하여, 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에서 지정한 가이드라인(IACUC-2011-01-027, 2012-01-035 및 2013-01-074)에 따라 lghkduwkeogkrry 실험동물 연구실에서 사육하였다. 사육한 마우스가 12 주령이 되면, 체중 25 내지 30 g의 마우스를 선별하여 약하게 마취한 후, 반골(hip bone) 아래를 작게 절개하고, 좌골 신경(sciatic nerve)에 외상을 주어 근육의 손상을 유발하였다. 그런 다음, 6-0 명주실(6-0 silk suture thread)로 상처를 봉합하여, 근육 손상 마우스 모델을 제조하였다.

<10-2> 근육 손상 마우스 모델에서 TM -53 및 TM -54에 의한 신체 활동 향상 효과의 확인

생체 내에서 TM-53 및 TM-54에 의하여 손상된 근육의 재생 효과를 확인하기 위하여, 근육 손상 마우스 모델에서 TM-53 또는 TM-54에 의한 운동량 개선 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <10-1>에서 제조한 근육 손상 마우스 모델 6 마리를 선별하여, 각각의 마우스 모델에 50㎎/㎏ TM-53을 복강 주사한 후, 7 일간 추가로 사육하였다. 그런 다음, 전경골근(Tibialis Anterior, TA)에 전기적 충격을 주어 상기 마우스 모델이 트레이드밀(treadmill)에서 운동하도록 유도하여, 달리는 속도를 통해 근육 손상 마우스 모델의 운동량을 확인하였다.

그 결과, 도 23에서 나타난 바와 같이 TM-53을 투여하였을 때 경골에 자극을 가하지 않아도 마우스 모델의 운동량이 증가하여, 근육 활성의 개선을 나타내는 것을 확인하였다(도 23).

<10-3> 근육 손상 마우스 모델에서 TM -53 및 TM -54에 의한 근육 재생 효과 확인

생체 내에서 TM-53 및 TM-54에 의하여 손상된 근육의 재생 효과를 확인하기 위하여, 근육 손상 마우스 모델에서 TM-53 및 TM-54에 의한 조직학적인 근육 재생 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <10-1>에서 제조한 근육 손상 마우스 모델 12 마리를 선별하여 6 마리 씩 총 2 군으로 나누고, 각각의 마우스 모델군에 50㎎/㎏ TM-53 또는 TM-54을 복강 주사한 후, 7 일간 추가로 사육하였다. 그런 다음, 상기 마우스 모델을 희생하여 근육 조직을 수득한 다음, 공지된 방법에 따라 파라핀으로 고정하여, 헤아톡실린-에오신 염색(Hematoxylin-Eosin staining)으로 근육 조직을 염색하여 근육의 조직학적인 손상 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 24에서 나타난 바와 같이 TM-53 및 TM-54를 투여한 실험군에서 근육손상의 정도가 감소하여, TM-53 및 TM-54가 근육 재생을 촉진하는 것을 확인하였다(도 24).

<10-4> 근육 손상 마우스 모델에서 TM -53 및 TM -54에 의한 근육세포의 마커 단백질 발현 확인

생체 내에서 TM-53 및 TM-54에 의하여 손상된 근육의 재생 효과를 확인하기 위하여, 근육 손상 마우스 모델에서 TM-53 및 TM-54에 의한 근육세포 마커 단백질의 MyHC 및 데스민(desmin)의 발현 및 근위축 관련 단백질인 MuRF1의 억제 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <10-1>에서 제조한 근육 손상 마우스 모델 12 마리를 선별하여 6 마리 씩 총 2 군으로 나누고, 각각의 마우스 모델군에 50㎎/㎏ TM-53 또는 TM-54을 복강 주사한 후, 7 일간 추가로 사육하였다. 그런 다음, 상기 마우스 모델을 희생하여 근육 조직을 수득한 다음, 상기 근육 조직으로부터 세포 추출물을 수득한 다음, 상기 실시예 <4-2>과 동일한 방법으로 웨스턴블럿을 수행하여 MyHC, 데스민 및 MuRF1 단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 25에서 나타난 바와 같이 TM-53 또는 TM-54를 처리한 마우스 모델의 근육 세포에서는 MyHC 및 데스민 단백질의 발현이 유의적으로 상승하며, 용매 대조군에서 발현되는 근위축 관련 단백질인 MuRF1의 발현이 나타나지 않아, 근위축에 대한 TM-53 및 TM-54의 개선 효과를 확인하였다(도 25).

<110> EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition containing TAZ modulator for mygeonic differentiation and muscle regeneration <130> 13p-11-030 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCK_F <400> 1 cacctccaca gcacagacag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCK_R <400> 2 accttggcca tgtgattgtt 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> myog_F <400> 3 caaccaggag gagcgagacc tccg 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> myog_R <400> 4 aggcgctgtg ggatatgcat tcact 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_F <400> 5 tgggatatgg agcttctatc gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_R <400> 6 ggtgagtcga aacacggatc at 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ_F <400> 7 gtcaccaaca gtagctcaga tc 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ_R <400> 8 agtgattaca gccaggttag aaag 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> act_F <400> 9 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> act_R <400> 10 caatagtgat gacctggccg t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF1_F <400> 11 gagcccggag gggctacctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF1_R <400> 12 gtcttcccca gctggcagcc 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAFbx_F <400> 13 aaggctgttg gagctgatag ca 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAFbx_R <400> 14 cacccacatg ttaatgttgc cc 22

Claims

하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물;
[화학식 1]

.
(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,
또는
이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)
제 1항에 있어서, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 [화학식 2]로 표시되는 2-부틸-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-5-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-6-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-5-carboxylic acid methyl ester, TM-53)인 것을 특징으로 하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물;
[화학식 2]

.
제 1항에 있어서, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 [화학식 3]으로 표시되는 2-부틸-5-스티릴-1-[2'-(1H-테트라졸-5-일)-비스페닐-4-일메틸]-1H-벤조이미다졸-6-카르복실산 메틸에스터(2-butyl-5-styryl-1-[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-biphenyl-4-ylmethyl]-1H-benzoimidazole-6-carboxylic acid methyl ester, TM-54)인 것을 특징으로 하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물;
[화학식 3]

.
제 1항에 있어서, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 근원세포(myoblast) 유래의 근원성 분화 또는 비-근원세포 유래의 근원성 전환분화(transdifferentiation) 중 어느 하나 또는 둘 다를 촉진하는 것을 특징으로 하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 분화된 근육세포에서 근위축 관련 유전자인 MuRF1 또는 MFAbx 중 어느 하나 또는 둘 다의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 분화된 근육세포에서 근원성 마커 유전자인 MCK, 미오게닌(myogenin) 또는 MyoD, 또는 근육세포 마커 단백질인 MyHC의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 근육세포 분화 유도용 약학적 조성물.
하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육 재생용 약학적 조성물;
[화학식 1]

.
(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,
또는
이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)
하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물;
[화학식 1]

.
(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,
또는
이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)
제 8항에 있어서, 상기 근육장애는 근위축, 근질환, 근육 손상, 근이영양증, 근육감소증, 근신경 전도성 질병 및 신경 손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 근육장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육세포 분화 유도용 건강식품;
[화학식 1]

.
(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,
또는
이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)
하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육 재생용 건강식품;
[화학식 1]

.
(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,
또는
이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)
하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 근육장애의 개선 또는 예방용 건강식품;
[화학식 1]

.
(여기에서, 상기 R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로,
또는
이며, 이때 R₁ 및 R₂는 서로 다름.)
제 12항에 있어서, 상기 근육장애는 근위축, 근질환, 근육 손상, 근이영양증, 근육감소증, 근신경 전도성 질병 및 신경 손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 근육장애의 개선 또는 예방용 건강식품.