TWI681774B - 一種縞瓣屬二甲亞碸萃取物或級分之新穎用途 - Google Patents

一種縞瓣屬二甲亞碸萃取物或級分之新穎用途 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種治療代謝性疾病，如糖尿病、肥胖或脂肪肝疾病的 新穎方法，其使用來自縞瓣屬(Graptopetalum sp.)或紅景天屬(Rhodiola sp.)的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。本發明中亦提供來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物在活化AMPK途徑及自噬途徑的用途，其可被用於神經退化性疾病或澱粉樣蛋白相關疾病的預防或治療，例如阿茲海默症。

Description

一種縞瓣屬二甲亞碸萃取物或級分之新穎用途
本發明係關於一種用於治療代謝性疾病或神經退化性疾病的新方法和組合物。具體而言，本發明係關於一種使用來自縞瓣屬(Graptopetalum sp.)的萃取物或級分用於治療代謝性疾病或神經退化性疾病的方法和組合物。
石蓮花(Graptopetalum paraguayense，GP)是一種中國傳統草藥，具有多種保健功效。根據古老的中國藥方，GP可緩和肝的病症、降低血壓、美白肌膚、緩解疼痛和感染、抑制發炎、以及改善腦部的功能而被認為具有潛在的有益功效。
研究顯示該GP葉片萃取物在體外試驗中可以抑制酪胺酸酶(tyrosinase)和血管收縮素轉化酶(angiotensin-converting enzyme)的活性並清除自由基(Chen，等人，Studies on the inhibitory effect of Graptopetalum paraguayense E.Walther extracts on the angiotensin converting enzyme.Food Chemistry 100：1032-1036,2007；Chung，等人，Studies on the antioxidative activity of Graptopetalum paraguayense E.Walther.Food Chemistry 91：419-424,2005；以及Huang，等人，Studies on the inhibitory effect of Graptopetalum paraguayense E.Walther extracts on mushroom tyrosinase.Food Chemistry 89:583-587,2005)。過去 已發現的是GP莖部的水萃取物和50%乙醇萃取物及95%乙醇的莖部萃取物具有抗氧化活性，其被證實對於人類肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)細胞株(HepG2)的增生具有抑製效果(Chen等人，In vitro antioxidant and antiproliferative activity of the stem extracts from Graptopetalum paraguayense.Am J Chin Med 2008；36：369-383)。體內的試驗研究證實GP的葉片萃取物可抑制小神經膠質細胞的活化、氧化壓力及iNOS的表現，以減少缺血性腦損傷(Kao等人，Graptopetalum paraguayense E.Walther leaf extracts protect against brain injury in ischemic rats.Am J Chin Med 2010；38：495-516)。
在2004年由Hsu提出申請並在2008年獲證的美國專利號7,364,758中已揭示來自縞瓣屬的乙醇萃取物具有體內和體外抗肝纖維化和抗發炎功效。然後，其部分連續申請案美國專利號7,588,776在2008年被提出申請並在2009年獲證，其指出縞瓣屬的水溶性級分係有效於治療肝的疾病或症狀，例如發炎、脂肪變性及纖維化。
在2011年提出申請並在2012年10月11日公開的美國專利公開第20120259004號中亦揭示藉由使用二甲亞碸(DMSO)萃取選自於由縞瓣屬、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組的植物所製備的新萃取物和級分、以及分離自該新萃取物的新化合物可有效治療癌症或纖維化，例如肝癌或肝纖維化。
本發明係關於一種縞瓣屬(Graptopetalum sp.)或紅景天屬(Rhodiola sp.)之二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分及分離自該DMSO萃取物或 級分的活性化合物用於治療代謝性疾病，例如糖尿病或脂肪肝疾病，或神經退化性疾病的新用途。
在一方面，本發明提供一種用於治療代謝性疾病的方法，包含投予一組合物於所需個體，該組合物包含一治療有效量來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在另一方面，本發明提供一種組合物用於製備治療代謝性疾病的藥物之用途；其中該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在再一方面，本發明提供一種用於治療代謝性疾病的醫藥組合物；其中該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在本發明之一具體實施例中，該代謝性疾病為糖尿病。
在本發明之另一具體實施例中，該代謝性疾病為肥胖。
在本發明之第三具體實施例中，該代謝性疾病為脂肪肝疾病，包括酒精性脂肪肝疾病(alcoholic fatty liver disease，AFLD)或非酒精性脂肪肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)。
在再一方面，本發明提供一種使用組合物治療B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)相關的肝相關疾病(例如HCC、肝纖維化或肝硬化)的方法、用途或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在又一方面，本發明提供一種使用組合物治療糖尿病相關的肝 相關疾病(例如HCC)的方法、用途或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在又再一方面，本發明提供一種使用組合物治療肥胖相關的肝相關疾病的方法、用途或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在再一方面，本發明提供一種使用組合物治療肥胖引起的高血膽固醇或高量三酸甘油酯的方法、用途或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在再更一方面，本發明提供一種使用組合物預防或治療代謝症候群的方法、用途或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在再更一方面，本發明提供一種使用醫藥組合物預防或治療癌症的協同方法或組合物，該醫藥組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物，並與一抗癌藥物組合。
在本發明之一具體實施例中，該癌症為肝癌，例如肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)，而且該抗癌藥物為抗肝癌藥物，例如蕾莎瓦(Sorafenib)。
本發明亦提供一種活化AMPK途徑或自噬途徑的方法、用途或組合物，其中該組合物為來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或 級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
此外，本發明亦提供一種使用組合物預防或治療神經退化性疾病的方法或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在本發明之一具體實施例中，該神經退化性疾病為帕金森氏症(Parkinson’s disease)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、或杭丁頓氏症(Huntington’s disease)。
此外，本發明亦提供一種使用組合物預防或治療澱粉樣蛋白相關疾病的方法、用途或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在本發明之一具體實施例中，該澱粉樣蛋白相關疾病為阿茲海默症、第2型糖尿病、帕金森氏症、杭丁頓氏症、致死性家族失眠症(Fatal Familial Insomnia)、或類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis)。
此外，本發明亦提供一種使用組合物抗老化的方法、用途或組合物，該組合物包含來自縞瓣屬或紅景天屬的二甲亞碸(DMSO)萃取物或級分、或分離自該DMSO萃取物或級分的活性化合物。
在本發明之一具體實施例中，縞瓣屬為石蓮花(Graptopetalum paraguayense)。
在本發明之一具體實施例中，紅景天屬為紅景天(Rhodiola rosea)。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前面的概述、以及以下本發明的實施方式。為了說明本發明的目的，在圖式中顯示目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明並不限於圖式中顯示的具體實施例。
在圖式中：圖1A-1B顯示HH-F3在Hep3B/T2細胞中抑制8-Br-cAMP/迪皮質醇(dexamethasone)誘導的醣異生酶(gluconeogenic enzyme)基因表現的效果。圖1A提供以8-溴-cAMP(8-Br-cAMP)、迪皮質醇(Dex)單獨或同時處理經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞30分鐘的結果；其中藉由即時定量PCR量測醣異生基因、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenol pyruvate carboxykinase，PEPCK)的mRNAs並使用β-肌動蛋白當作標準。使用胰島素作為正對照組。圖1B提供以8-Br-cAMP(8-Br-cAMP)、迪皮質醇(Dex)單獨或同時處理經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞30分鐘，然後使用不同濃度的HH-F3和胰島素處理的結果；其中藉由即時定量PCR量測醣異生基因、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的mRNAs並使用β-肌動蛋白當作標準。
圖2A-2C顯示HH-F3在Hep3B/T2細胞中抑制8-Br-cAMP/Dex誘導的醣異生共活化劑PGC-1α表現活性的效果。圖2A提供在無血清的DMEM培養基中以8-Br-cAMP、迪皮質醇(Dex)單獨或同時處理、並與HH-F3組合處理經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞24小時的結果，其中藉由即時定量PCR量測PGC-1α mRNAs並標準化為β-肌動蛋白，以及使用胰島素作為正對照組。圖2B顯示使用核萃取物處理的Hep3B/T2細胞中表現的PGC-1α和HNF-4α蛋白水平，其係藉由西方墨漬法分析測定，其中B23係使用做為標準；Dex：迪皮質醇 (Dexamethasone)；其中此等是來自3組獨立實驗的代表性數據。圖2C提供以HH-F3處理Hep3B/T2細胞、然後以抗PGC1-α、HNF-4α、及FoxO1的抗體進行西方墨漬法分析的結果；其中此等是來自3組獨立實驗的代表性數據。
圖3A-3B顯示HH-F3在經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞中通過活化AMPK來抑制醣異生酶基因表現的效果。圖3A係以8-Br-cAMP加上迪皮質醇預處理經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞30分鐘的結果。圖3B顯示以8-Br-cAMP加上迪皮質醇預處理經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞30分鐘，然後在無血清的DMEM中使用不同濃度的HH-F3處理24小時的結果；其中以葡萄糖-6-磷酸酶啟動子驅動的螢光素酶報告質體轉染Hep3B/T2細胞，而且該將螢光素酶的活性係由與對照組相比的共轉染pCMV-β-半乳糖苷酶質體以β-半乳糖苷酶的活性標準化。圖3C顯示環狀AMP/DEX刺激G6Pase啟動子活性的結果，其係在HH-F3或HH-F3與AMPK抑製劑化合物C存在下進行檢驗；其中在一天的處理之後，製備細胞溶解產物以用於螢光素酶活性分析；其中使用胰島素作為正對照；以及使用二甲雙胍作為AMPK正對照。
圖4A-4B顯示HH-F3在Hep3B/T2細胞中抑制8-Br-cAMP/Dex誘導的HBV核心啟動子活性的效果。圖4A顯示啟動子活性檢驗的結果；其中以HBV核心啟動子(core promoter，CP)和HBV X啟動子(X promoter，XP)驅動的螢光素酶報告質體轉染Hep3B/T2細胞。圖4B顯示在無血清的DMEM中、在不存在或存在不同濃度的HH-F3下以8-Br-cAMP/Dex處理1天之後的結果；其中製備細胞溶解產物係用於螢光素酶活性分析；其中該螢光素酶的活性係由共轉染的pCMV-β-半乳糖苷酶質體以β-半乳糖苷酶活性標準化；且胰島素係使用為正對照組。
圖5A-5E顯示HH-F3在Hep3B/T2或1.3ES2細胞中抑制HBV表面抗原、基因表現、醣異生酶表現、及HBV DNA水平的效果。圖5A提供之影像顯示使用不同濃度的HH-F3在無血清的DMEM培養基中處理48小時經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞；其中藉由ELISA測定HBV表面抗原並以MTT檢驗標準化；其中使用胰島素作為正對照組。圖5B提供以不同濃度的GP和HH-F3在無血清的DMEM培養基中處理48小時經培養的1.3ES2細胞之結果，其中藉由即時定量PCR量測醣異生基因、G6Pase、PEPCK、及PGC-1α mRNAs的表現，並標準化為β-肌動蛋白；使用HE-145作為正對照組。圖5C提供以不同濃度的GP和HH-F3在無血清的DMEM培養基中處理48小時經培養的1.3ES2細胞之結果，其中藉由即時定量PCR量測HBV mRNA的表現，並使用β-肌動蛋白當作標準；使用HE-145作為正對照組。圖5D提供以HH-F3處理1.3ES2細胞，然後使用對抗核蛋白的抗體進行西方墨漬法分析的結果；其中此等是來自3組獨立實驗的代表性數據。使用HE-145作為正對照組。圖5E提供以不同濃度的GP和HH-F3在無血清的DMEM培養基中處理48小時經培養的1.3ES2細胞之結果，其中藉由即時定量PCR量測培養基中的野生型HBV DNA並使用β-肌動蛋白當作標準；使用HE-145作為正對照組。
圖6A-6B顯示GP萃取物和HH-F3在HCC中降低脂肪酸合成活性的效果，其顯示GP萃取物和HH-F3的處理降低了HCC中的脂肪酸合成活性。圖6A顯示以GP萃取物和HH-F3處理Huh7和Mahlavu細胞、然後使用抗磷酸化-AMPK(P-AMPK)、AMPK、SREBP2、磷酸化-ACC(Ser79)(P-ACC)、ACC、FASN及GAPDH的抗體進行西方墨漬法分析(n=3)的結果。圖6B顯示以HH-F3處理細胞然後使用抗P-AMPK、AMPK、SREBP2、P-ACC、ACC、FASN、GAPD及β-肌動蛋白的抗體進行西方墨漬法分析的結果，其中以BNL細胞來產生皮下腫 瘤，並將小鼠分成兩組：一組作為未處理的對照組(3隻不同的小鼠)，而其他四隻小鼠每天經由口服(P.O.)途徑使用HH-F3(20mg/天)處理3週；3週之後，犧牲小鼠並均勻化腫瘤，隨後進行西方墨漬法及定量。
圖7A提供之影像顯示以GP/HH-F3處理以降低油酸(Oleic Acid，OA)和棕櫚酸(Palmitic acid，PA)誘導的脂質累積的Huh7細胞；其中GP/HH-F3在Huh7中降低了由油酸(OA)和棕櫚酸(PA)誘導的脂質累積；使用油酸(1mM)和棕櫚酸(2mM)培育Huh7細胞24小時和48小時，產生了藉由油紅O(oil red O)染色可見的明顯細胞內脂質累積及由MTT檢驗的細胞存活率；其中該原始放大倍率為400倍，其係使用GP/HH-F3處理48小時(OA+PA/GP：油酸和棕櫚酸與GP共處理；OA/HH-F3：油酸和棕櫚酸與HH-F3共處理)。
圖7B提供Huh7細胞之計數(油酸和棕櫚酸)的結果，其中使用油酸和棕櫚酸(OA+PA)處理對照組，並將細胞分別使用油酸和棕櫚酸與GP萃取物(GP)或HH-F3共處理24小時或48小時，以減少脂肪負荷，並藉由油紅O將細胞內脂質液滴染色來定量(OA+PA/GP：油酸和棕櫚酸與GP共處理；OA/HH-F3：油酸和棕櫚酸與HH-F3共處理)。
圖8A-8D顯示GP/HH-F3和蕾莎瓦(Sorafenib)的組合對Huh7之細胞存活率的協同作用。圖8A提供分別在蕾莎瓦(5μM和10μM)存在或不存在下使用各種濃度的GP萃取物處理Huh7細胞的結果；其中藉由SRB檢驗測定細胞存活率；並將數據表示為平均值±三個獨立實驗的標準差(SD)。圖8B提供分別在蕾莎瓦(5μM和10μM)存在或不存在下使用各種濃度的HH-F3萃取物處理Huh7細胞的結果；其中藉由SRB檢驗測定細胞存活率；並將數據表示為平均值±三個獨立實驗的標準差(SD)。圖8C提供等效線圖分析的結果，證明在Huh7細 胞中72小時，蕾莎瓦和各種濃度的GP萃取物之間有協同相互作用。圖8D提供等效線圖分析的結果，證明在Huh7細胞中72小時，蕾莎瓦和各種濃度的HH-F3之間有協同相互作用。
圖9顯示HH-F3在初代皮層神經元中對Aβ25-35誘導的神經毒性之影響；其中使用載體(0.1%的DMSO)或HH-F3預處理初代皮層神經元2小時，隨後曝露於10μM的Aβ25-3540小時；以及培育之後，藉由MTT檢驗檢測細胞存活率；其中數據為來自至少三組獨立實驗的平均±SD，並以相對於對照細胞表示，而且以*指出使用Aβ和HH-F3加上Aβ處理的細胞之間的顯著差異(p<0.05)。
圖10A-10C顯示HH-F3在swAPP695-SH-SY5Y細胞培養中對細胞外Aβ40和Aβ42水平的影響；其中使用載體或HH-F3培育APP695-SHSY-5Y-(使用人類APP695轉染的SHSY-5Y神經細胞瘤細胞)24小時。圖10A顯示細胞的細胞存活率，其係藉由MTT檢驗檢測。圖10B顯示細胞外Aβ40的水平，其係藉由ELISA測定。圖10C顯示細胞外Aβ42的水平，其係藉由ELISA測定。
圖11A-11D顯示HH-F3對APP處理和Aβ清除的影響。圖11A提供以HH-F3或γSI處理SH-SY5Y-APP695細胞24小時的結果。藉由免疫轉印法量測APP(抗Aβ1-16抗體)、APPX-F(抗Aβ1-40抗體)、及APP-CTF(抗APPct抗體)與細胞內Aβ降解酶的水平並顯示APP-CTF/肌動蛋白的相對水平。圖11B提供以HH-F3處理SH-SY5Y-APP695細胞24小時、然後使用抗胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)和腦啡肽酶(Neprilysin，NEP)的抗體進行西方墨漬法分析的結果；其中此等是來自3組獨立實驗的代表性數據。圖11C提供以指定濃度的HH-F3培育SH-SY5Y-APP695條件培養基24小時的結果。該剩餘的Aβ1-40係藉由ELISA量測。圖11D提供以指定濃度的HH-F3培育SH-SY5Y-APP695條件培 養基24小時的結果。該條件培養基中的NEP和IDE水平係藉由免疫轉印法量測的。
圖12顯示HH-F3在swAPP695-SH-SY5Y細胞中對自噬活性的影響；其中以載體或HH-F3培育APP695-SHSY-5Y-24小時。藉由西方墨漬法檢測自噬標記LC3。
圖13A-13B顯示HH-F3在抑制Aβ凝聚上的效果。圖13A提供未以Aβ培育24小時的HH-F3之結果。檢測Th-T的螢光(Ex 440/Em 482)。圖13B提供以Aβ1-40培育24小時的HH-F3之結果。檢測Th-T的螢光(Ex 440/Em 482)。C=PBS；V=載體(Aβ1-40)。圖13C提供以Aβ1-42培育24小時的HH-F3之結果。檢測Th-T的螢光(Ex 440/Em 482)。C=PBS；V=載體(Aβ1-42)。
圖14顯示HH-F3在Aβ25-35誘導的細胞毒性上的保護效果。以指定濃度的HH-F3預處理初代皮層神經元2小時。隨後，使用10μM的Aβ25-35刺激細胞46小時。細胞存活率係藉由MTT測試量測。
圖15顯示在APP/PS1小鼠中HH-F3對於Aβ斑塊負荷的影響。該APP/PS1轉基因小鼠在120天大時於大腦皮層中發展出Aβ斑塊(Radde等人，Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology.EMBO Rep 2006；7：940-946)。對140天大的APP/PS1小鼠口服投予HH-F3(300mg/kg/天)一個月。該代表性影像係藉由在APP/PS1小鼠的大腦半球中的Aβ斑塊負荷之BSB染色予以評估，然後手動計數Aβ斑塊數量。
圖16A-16B顯示HH-F3對APP/PS1小鼠之大腦皮層中的Aβ之影響。圖16A提供以ELISA測定的大腦皮層均質物中SDS可溶的Aβ1-40和Aβ1-42濃度之定量分析結果(載體n=3，HH-F3 n=6)。圖16B提供以ELISA測定的大腦皮 層均質物中不可溶級分(甲酸可溶的)的Aβ1-40和Aβ1-42濃度之定量分析結果(載體n=3，HH-F3 n=6)。
圖17A-17B顯示HH-F3向上調控APP/PS1小鼠之大腦皮層中的Aβ清除相關蛋白。圖17A提供藉由免疫轉印法檢測皮層溶解產物之Aβ清除相關蛋白的結果。圖17B提供測定的WT與APP/PS1或載體與APP/PS1之間的蛋白定量分析比之結果。
圖18顯示以不同方式萃取的GP在抑制HBV表面抗原中的效果。其提供顯示在無血清的DMEM培養基中使用以不同方式萃取的GP萃取物(200μg/ml)處理48小時經培養的人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞之影像；其中藉由ELISA測定HBV表面抗原並標準化為MTT檢驗；其中使用胰島素作為正對照組。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識之人士一般理解的相同的含義。
在下表中列出本文中使用的縮寫之全名：
Figure 103138926-A0305-02-0014-1
Figure 103138926-A0305-02-0015-2
本文所使用的單數形「一」及「該」包括複數的參照物，除非上下文另有明確說明。因此，舉例來說，提及「一樣品」包括複數個該樣品及其為所屬技術領域中具有通常知識者習知的等同物。
本發明提供一種藉由使用DMSO萃取植物所製備的、縞瓣屬或紅景天屬之DMSO萃取物的新用途，指的是在代謝性疾病治療的萃取物。
根據本發明，該萃取物可使用本技術領域中常用的或標準的方法藉由二甲亞碸(DMSO)萃取植物予以製備。在本發明之一實施例中，該植物的葉子係研磨並凍乾成為粉末，並與DMSO進行劇烈震盪，較佳為30%DMSO。在以DMSO萃取之前，可包括使用甲醇(MeOH)進一步萃取。
本文所使用的「縞瓣屬(Graptopetalum sp.)」乙詞是指縞瓣屬中的任何植物，或其中的一部分或多個部分。縞瓣屬或其部分中超過一個種的組合也可以考慮。縞瓣屬較佳為石蓮花(Graptopetalum paraguayense.)。
在本發明之一較佳具體實施例中，該縞瓣屬為石蓮花。
本文所使用的「紅景天屬(Rhodiola sp.)」乙詞是指紅景天屬中的任何植物，或其中的一部分或多個部分。紅景天屬或其部分中超過一個種的組合也可以考慮。
在本發明之一較佳具體實施例中，該紅景天屬為紅景天(Rhodiola rosea.)。
本文所使用的「萃取物」乙詞是指藉由使用溶劑浸泡或混合待萃取物質所得到的溶液。在本發明中，該萃取物為DMSO萃取物。
本發明亦提供富含來自植物的抗癌成分之級分，該植物係選自於由縞瓣屬所組成之群組，該級分之製備是藉由使用二甲亞碸(DMSO)萃取植 物，然後藉由色層層析法分離以獲得級分。在本發明之一實施例中，該植物為石蓮花。該級分是藉由使用DMSO萃取植物並藉由色層層析法分離以獲得級分而得到。在本發明之一實施例中，將Sephadex LH-20管柱用於色層層析法，稱為HH-F3。因此，該級分HH-F3是一種用於代謝性疾病預防或治療的潛在治療劑。
根據本發明之一實施例，石蓮花(GP)萃取物和HH-F3級分可藉由美國專利公開號第20120259004號中指示的方法來製備，該專利案之揭示內容係以引用方式全部併入本文中。
亦已知的是該HH-F3級分含有一富含3,4,5-三羥基芐基(3,4,5-trihydroxy benzylic)成分的原花青素(proanthocyanidin)，該3,4,5-三羥基芐基成分具有以下式I結構，
Figure 103138926-A0305-02-0017-3
其中一個R為H或前花青素(prucyanidin，PC)單元；而另一個R為OH或前飛燕草素(prodelphindine，PD)單元；n為範圍從21至38的數字；以及PC單元：PD單元<1：20。前花青素(PC)單元的結構為
Figure 103138926-A0305-02-0018-4
並且前飛燕草素(PD)的結構為
Figure 103138926-A0305-02-0018-5
本文所使用的「代謝性疾病」乙詞是指任何擾亂正常代謝的疾病或失調，代謝是在細胞層次上將食物轉換為能量的過程。代謝性疾病影響細胞進行關鍵生化反應的能力，其涉及蛋白質(胺基酸)、碳水化合物(糖和澱粉)、或脂質(脂肪酸)的處理或輸送。例如，代謝性疾病包括糖尿病、肥胖及脂肪肝疾病，無論是酒精性脂肪肝疾病(AFLD)或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
本文所使用的「代謝症候群」乙詞是指醫療病症的組合，當該等醫療病症同時發生時會提高罹患心血管疾病和糖尿病的風險。
本文所使用的「AMPK途徑」乙詞是指其中AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)在作為細胞能量恆定的主調控者上發揮關鍵作用的途徑。AMPK係活化以回應耗盡細胞ATP供應的壓力，例如低血糖、缺氧、局部缺血及熱休克。作為回應低ATP水平的細胞能量感應物，AMPK活化正調控補充細胞ATP供應的訊號傳導途徑，包括脂肪酸氧化和自噬。AMPK負調控消耗ATP的生物合成過程，包括糖質新生、脂質及蛋白合成。AMPK通過若干直接參與此等過程的酵素之直接磷酸化以及通過藉由磷酸化轉錄因子、共活化 劑、及共抑制劑來轉錄控制代謝而完成之。由於其作為脂質和葡萄糖代謝兩者之中央調控者的角色，AMPK被認為是第II型糖尿病、肥胖及癌症治療的潛在治療標靶。AMPK亦通過其與mTOR和去乙醯化酶(sirtuins)的相互作用而被涉及在若干作為老化的關鍵調製劑的物種中。
本文所使用的「自噬」或「自噬途徑」，亦被稱為自體吞噬作用，其是指通過溶酶體的作用涉及不必要或不正常細胞成分之細胞降解的基本分解代謝機制。該細胞成分的分解可以藉由保持細胞能量水平以確保細胞在飢餓期間存活。若經調控，自噬可確保細胞成分的合成、降解及再循環。在此過程中，標靶的細胞質組分係被從自噬小體(autophagosomes)內的其餘細胞分離，其接著與溶酶體融合並降解或再循環。
本文所使用的「神經退化性疾病」乙詞是指主要影響人腦中神經元的病症範圍。因為神經元是包括大腦和脊髓神經的神經系統之建構單元，而且神經元通常不會複製或自身替換，所以當它們損壞或死亡時，它們無法被人體替換。神經退化性疾病的一些典型實例包括帕金森氏症、阿茲海默症、及杭丁頓氏症。
本文所使用的「澱粉樣蛋白相關疾病」乙詞是指涉及澱粉樣蛋白的疾病類別。澱粉樣蛋白是共享特定結構特徵的不溶性纖維蛋白凝聚體，其出現在天然存在於體內的蛋白和多肽之各種不當折疊變體。該錯誤折疊的結構會改變它們的合適配置，使他們彼此或與其他的細胞成分錯誤地交互作用而生成不溶性纖絲。已知澱粉樣蛋白與嚴重的人類疾病之病理相關，於器官中澱粉樣蛋白纖絲的異常積聚可能導致澱粉樣變性症，而且可能在各種神經退化性疾病中 產生作用。該澱粉樣蛋白相關疾病包括但不限於阿茲海默症、第2型糖尿病、帕金森氏症、杭丁頓氏症、致死性家族失眠症、及類風濕性關節炎。
據信，具有抑制Aβ累積(或凝聚)的能力之試劑可能適用於澱粉樣蛋白相關疾病。另外，蛋白凝聚被認為是諸如阿茲海默症、帕金森氏症、及杭丁頓氏症等神經退化性疾病的常見病狀。自噬是溶酶體降解的過程，其回收細胞廢物並消除受損的胞器和蛋白凝聚體，而且自噬途徑中的障礙對於神經退化性疾病的發病機制有所貢獻。因此，自噬誘導劑可為神經退化性疾病的治療標靶。
本發明證實的是GP萃取物或HH-F3級分係能夠抑制Hep3B/T2細胞中的環狀AMP/迪皮質醇誘導的醣異生酶基因表現和HBV核心啟動子的表現活性。實施例亦闡釋GP萃取物或HH-F3級分在Hep3B/T2或1.3ES2細胞中抑制了HBV表面抗原和醣異生酶的基因表現；然而，該GP萃取物/HH-F3級分不影響糖分解，而是將癌細胞的代謝從糖分解移到葡萄糖氧化並誘導粒腺體相依的細胞凋亡。其闡釋GP萃取物/HH-F3級分經由AMPK相依的方式調控了脂質生成相關蛋白的表現和醣異生酶基因的表現；因此，該GP萃取物/HH-F3級分可以改善異常脂質累積並減少腫瘤發展的進展，具體而言是在患有第2型糖尿病而需要胰島素或二甲雙胍(Metformin)藥物以在體內抑制肝臟糖質新生的患者身上。
實施例7和圖8中亦證實GP/HH-F3和蕾莎瓦(Sorafenib)的組合在Huh7的細胞存活率上提供了協同效用。因此，本發明提供了用於預防或治療癌症的協同方法或組合物。
老化是會影響所有器官的普遍過程。在細胞穩態中與年齡相關的破壞導致對生理壓力和器官功能障礙的回應度降低。能量代謝的有效調控是 細胞穩態的關鍵要求。AMPK是對ATP水平降低的細胞回應之主要調控者，並作為感測者以在細胞內維持能量平衡。已知AMPK在壓力期間由葡萄糖和脂肪酸刺激能量產生，並抑制蛋白、膽固醇及糖原合成的能量消耗。一般來說，AMPK的活化會向下調控合成途徑，例如蛋白、脂肪酸及膽固醇的生物合成，但會開啟產生ATP的分解代謝途徑，例如脂肪酸氧化、葡萄糖攝取及糖分解。其不僅通過多種關鍵代謝酶的直接磷酸化、而且還以組織特異的方式改變基因的表現來實現。目前，AMPK被視為重要的分子標靶，因為據信AMPK活化劑可被用於代謝和神經退化性疾病的治療，並且作為抗衰老藥物。
因此，鑑於本發明中顯示GP/HH-F3為AMPK活化劑的結果，其建議GP/HH-F3藉由調控AMPK途徑而具有抗衰老能力。
本發明亦提供一種使用本發明之萃取物、級分或式I化合物的用途、方法或組合物。
本文所使用的「治療有效量」乙詞是指足以實現所欲之治療目的的藥劑量。該給予藥劑的治療有效量將會隨著不同因素而有所不同，例如藥劑的本質、投予之方式、接收藥劑的動物之大小和種類、以及投予之目的。每一個體案例之治療有效量可由技藝人士根據本文之揭示及現有技藝所建立之方法以經驗決定。
本發明之組合物可藉由任何合適的途徑投予，包括但不限於非經口服的或經口服的投予方式。該用於非經口服投予的組合物包括溶液、懸浮液、乳化液、及固態之可注射組合物，其在使用前可用溶劑立刻溶解或懸浮。該注射可藉由將一種或多種之活性成分溶解、懸浮、或乳化於稀釋劑中以製得。所述稀釋劑之實施例為用於注射之蒸餾水、生理食鹽水、植物油、酒精及其組合。 再者，該注射可能包含穩定劑、助溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩和劑、緩衝液、保存劑等。該注射於最後之製備步驟係經滅菌的、或以無菌程序製得。本發明之組合物亦可製備成無菌之固態製劑，例如藉由冷凍乾燥，且可在滅菌後使用、或於使用前立即溶於無菌之可注射水或其他無菌之稀釋劑中使用。
根據本發明，該組合物亦可透過口服路徑投予，其中該組合物可處於固體或液體形式。該固體組合物包括片劑、丸劑、囊劑、分散的粉劑、顆粒及其類似物。該口服組合物亦包括可被黏貼於口腔的漱口藥及舌下片劑。該囊劑包括硬膠囊及軟膠囊。於該等口服用固體組合物中，一或多種之活性化合物可被單獨地混合或與稀釋劑、黏結劑、粉碎劑、潤滑劑、穩定劑、助溶劑混合，並於之後被以傳統方式配製成製劑。必要時，該等製劑可以包覆劑進行包覆，或可以兩種或多種包覆層包覆。另一方面，該口服用液體組合物包括醫藥上可接受的水溶液、懸浮液、乳化液、糖漿、酏劑及其類似物。於該等組合物中，一或多種活性化合物可被溶解、懸浮或乳化於常用之稀釋劑中(如純化水、乙醇或其混合物等)。除了該等稀釋劑外，該組合物亦可含有濕潤劑、懸浮劑、乳化劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、保存劑和緩衝液及其類似物。
另外，本發明提供了本發明之GP萃取物、HH-F3級分或式I化合物在製造用於治療代謝性疾病的藥物之用途，具體而言是糖尿病、肥胖或脂肪肝疾病。另一方面，本發明提供一種用於預防或治療代謝性疾病的方法，具體而言是糖尿病、肥胖或脂肪肝疾病，包含對需要該預防或治療之個體投予治療有效量的本發明萃取物、級分或化合物，具體而言是糖尿病、肥胖或脂肪肝疾病。
提供以下的實施例來說明本發明，而且以下的實施例不會被以任何方式解讀為限制本發明之範圍。
實施例
實施例1 GP萃取物和級分之製備
將石蓮花(GP)的葉子磨碎且於-20℃冷凍乾燥成粉末，並於萃取前儲存於25℃之防潮箱中。首先，將1.5g的GP粉末與10ml 100%的甲醇(MeOH)劇烈震盪5分鐘，接著以1,500g離心5分鐘。將該上清液移除後，將10ml的30% DMSO加入各個離心沈澱物以使再懸浮各個萃取物。該懸浮物係藉由劇烈震盪5分鐘予以混合，並以1,500g離心5分鐘兩次，再以9,300g離心5分鐘，並在室溫下使用0.45μm濾紙過濾。將30% DMSO上清液存放於-20℃作為150mg/ml的原液(稱為GP萃取物)或藉由一Sephadex LH-20管柱分離成四個級分(F1-F4)。透過西方墨漬法，使用AURKA、AURKB、及FLJ10540蛋白程度的分析，活性分子係在級分3中獲得，並稱為HH-F3級分(數據未顯示)。該HH-F3級分進一步以具有UV檢測器(Shimadzu SPD-M10A)與正相HPLC管柱(Phenomenex Luna 5u Silica 100A，4.6×250mm)的HPLC及1H-和13C-NMR光譜分析以辨識該活性分子之結構(數據未顯示)。該GP萃取物及/或HH-F3亦以透析膜(MWCO 12-14,000)(Spectrum Laboratories,Rancho Dominguez,CA)進行對水透析，以取得活性化合物。
實施例2 HH-F3在Hep3B/T2細胞中8-Br-cAMP/迪皮質醇誘導的醣異生酶基因表現上的影響
培養人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞並使用0.5mM的8-Br-8-Br-cAMP(8-Br-cAMP)和0.5μM的迪皮質醇(Dex)任一者或兩者處理30分鐘。然後，將不同濃度(5μg/ml、10μg/ml、及20μg/ml)的HH-F3級分加入無血清的DMEM中24小時。藉由即時定量PCR量測醣異生基因、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)及磷 酸烯醇丙酮酸羧激脢(PEPCK)的mRNA，並標準化為β-肌動蛋白。使用胰島素作為正對照。
環狀AMP及迪皮質醇(8-Br-cAMP/Dex)係使用於此測試以協同活化關鍵醣異生基因、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)及磷酸烯醇丙酮酸羧激脢(PEPCK)在人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞中的基因表現，該結果顯示於圖1A。該HH-F3級分(HH-F3)的處理結果顯示於圖1B，其指出HH-F3級分的處理可以在Hep3B/T2細胞中抑制8-Br-cAMP/DEX誘導的G6Pase和PEPCK基因表現。
實施例3 HH-F3級分在8-Br-cAMP/Dex誘導的醣異生共活化劑PGC-1α表現活性上的影響。
培養人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞並使用0.5mM的8-Br-8-Br-cAMP(8-Br-cAMP)和0.5μM的迪皮質醇(Dex)任一者或兩者處理30分鐘，以及使用10nM的胰島素或20μg/ml的HH-F3級分(HH-F3)在無血清的DMEM培養基中共處理24小時。藉由即時定量PCR量測PGC-1αmRNAs，並標準化為β-肌動蛋白。使用胰島素作為正對照組。藉由西方墨漬法分析測定PGC-1α的核萃取物和HNF-4α蛋白水平。使用B23作為負荷控制。Dex：迪皮質醇。
Mahlavu細胞係以不同濃度(0μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、及50μg/ml)的HH-F3處理，然後使用抗PGC1-α、SIRT1、PPARγ、及FoxO1的抗體進行西方墨漬法分析。此等是來自3個獨立實驗的代表性數據。
已知共活化因子PGC1-α的表現驅動關鍵醣異生酶例如PEPCK和G6Pase的轉錄，並與轉錄因子HNF4-α和FoxO1相關，而且G6Pase和PEPCK係藉由PGC1-α/FoxO1/Sirt1的途徑進行調控。該Hep3B/T2細胞係以8-Br-cAMP/Dex處理以誘導醣異生基因的表現，然後以HH-F3處理，而且8-Br-cAMP和迪皮質醇 協同活化基因和醣異生共活化劑PGC1-α基因表現的蛋白表現。該結果顯示於圖2A和圖2B，其指出HH-F3影響PGC1-α/FoxO1/Sirt1的途徑；其中該HH-F3的處理在Hep3B/T2細胞中抑制了8-Br-cAMP/Dex誘導的PGC1-α表現水平(見圖2A)；然而，在人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞中對HNF4-α蛋白的表現沒有影響(參見圖2B)。事實上，已知的是，關鍵醣異生基因的主要代謝調控劑和共活化劑PGC1-α已被證明會強烈地共活化FoxO1和HNF4-α用於HBV轉錄。圖2C亦指出HH-F3的處理在Hep3B/T2細胞中抑制了PGC1-α、HNF4-α、及FoxO1的表現。
實施例4透過AMPK的活化來抑制醣異生酶基因表現之HH-F3作用。
培養人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞並使用0.5mM的8-Br-cAMP和0.5μM的迪皮質醇(Dex)預處理30分鐘。然後，將不同濃度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、及20μg/ml)的HH-F3加入無血清的DMEM中24小時。對於啟動子活性的檢驗，使用由葡萄糖-6-磷酸酶啟動子驅動的螢光素酶報告質體轉染Hep3B/T2細胞。與對照相比將螢光素酶的活性從共轉染的pCMV-β-半乳糖苷酶質體標準化為β-半乳糖苷酶的活性。在HH-F3或HH-F3與AMPK抑製劑化合物C存在下檢驗環狀AMP/DEX刺激的G6Pase啟動子活性。處理一天後，製備細胞溶解產物以進行螢光素酶活性分析。使用胰島素作為正對照組。使用二甲雙胍作為AMPK正對照。
該Hep3B/T2細胞係以8-Br-cAMP/Dex處理以誘導G6Pase啟動子的活性，然後使用HH-F3處理。該結果顯示於圖3A和圖3B，其顯示HH-F3可以以劑量依賴的方式降低G6Pase啟動子的活性。先前報告的是，AMP活化蛋白激酶(AMPK)係一在能量耗盡情況下抑制ATP消耗並刺激ATP產生的細胞能量感測 劑。已知AMPK的活化可抑制G6Pase和PEPCK的基因表現，並抑制肝葡萄糖產生。因此，測試HH-F3經由AMPK途徑調控G6Pase的效果。該結果顯示AMPK抑製劑化合物C可部分逆轉HH-F3抑制的G6Pase啟動子活性(見圖3C)，其表示HH-F3可透過AMPK的活化來作用以抑制醣異生酶的基因表現。
實施例5 HH-F3在Hep3B/T2細胞中對8-Br-cAMP/Dex誘導的HBV核心啟動子活性之影響。
藉由HBV核心啟動子(CP)和HBV X啟動子(XP)驅動的螢光素酶報告質體轉染Hep3B/T2細胞以進行啟動子活性檢驗。然後，在無血清的DMEM中、在不存在或存在不同濃度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、及20μg/ml)的HH-F3下使用8-Br-cAMP/Dex處理細胞1天，製備細胞溶解產物來進行螢光素酶活性分析。將螢光素酶的活性從共轉染的pCMV-β-半乳糖苷酶質體標準化為β-半乳糖苷酶活性。使用胰島素作為正對照。
Hep3B/T2係一表現HBV的肝細胞株。HBV基因組包括聚合酶、表面、核心、及HBx。該X基因編碼X蛋白(HBx)，其具有反活化性質，而且在肝的致癌作用中可能是重要的。該核心基因編碼核心的核鞘蛋白(在病毒包裝中是重要的)。先前的體外研究中建議核心啟動子的突變增加了HBV的複製。如圖4A的結果所示，環狀AMP和迪皮質醇協同地活化了B肝病毒核心啟動子的活性，但是對X啟動子沒有影響。如圖4B所示，HH-F3的劑量依賴性抑制8-Br-cAMP/Dex誘導的HBV核心啟動子的活性。該測試結果可支持HBV感染與糖尿病和HCC相關，並且為B型肝炎病毒(HBV)感染與糖尿病和HCC的關聯提供了可能的解釋。
實施例6 HH-F3在Hep3B/T2或1.3ES2細胞中對HBV表面抗原、基因表現及醣異生酶表現的影響。
培養人類肝腫瘤Hep3B/T2細胞並使用不同濃度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、及20μg/ml)的HH-F3在無血清的DMEM培養基中處理48小時。藉由ELISA測定HBV表面抗原，並利用MTT檢驗進行標準化。胰島素係使用作為正對照。使用不同濃度的HH-F3在無血清的DMEM培養基中處理1.3ES2細胞48小時。藉由即時定量PCR量測醣異生基因、G6Pase、PEPCK、及PGC-1 α mRNAs和HBV mRNA的表現，並標準化為β-肌動蛋白。HE-145係使用作為正對照(SF(Serum free)：無血清)。
如圖5A所示，HH-F3劑量依賴性在Hep3B/T2細胞中抑制了HBV表面抗原的表現。
此外，衍生自HepG2細胞並含有一個整合複製的HBV基因組的1.3ES2細胞株係使用來商討HH-F3是否可以經由調控PGC1-α來抑制HBV基因的表現。如圖5B-5E所示，HH-F3抑制關鍵的醣異生基因、G6Pase及PEPCK的基因表現、以及過氧化體增殖物活化受體-γ共活化劑1α(PGC-1α)基因、在1.3ES2細胞中的HBV基因表現。
實施例7 GP和HH-F3對HCC中脂肪酸合成之活性的影響
Huh7和Mahlavu細胞係以GP和HH-F3進行處理，然後使用抗磷酸化-AMPK、磷酸化-AKT、磷酸化-ACC(Ser79)、AMPK、SREBP2、AKT、ACC、及FASN的抗體進行西方墨漬法分析(n=3)。使用BNL細胞來產生皮下腫瘤。將小鼠分成兩組。一組作為未處理的對照組(3隻不同的小鼠)，而其他四 隻小鼠每天經由口服(P.O.)途徑以HH-F3(20mg/天)處理3週。3週後，犧牲小鼠並均勻化腫瘤，隨後進行西方墨漬法及定量。
由最近發現可知與異常脂質生成相關的是癌症，其顯示主要脂質生成酶的抑制可以減少腫瘤形成。脂質係與許多病理過程有關聯，包含肝脂肪變性(脂肪肝)，其表現是脂質在肝細胞中過量累積。異常的脂質累積係與能量代謝中的多基因遺傳缺陷和肝臟惡性腫瘤有關。肝癌細胞需要更多的能量透過失調的脂質重新生成來存活，其可能有助於肝腫瘤形成和人類HCC預後。在HCC中，該異常脂質生成的程度與臨床侵略性、AKT-mTOR訊號傳遞途徑的活化、以及AMPK的抑制相關聯。肝AMPK的活化，一種代謝物感測激酶，在代謝壓力的狀況下扮演保護的角色，刺激脂肪酸氧化以及分別經由增加的磷酸化與乙醯CoA羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)以及HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase，HMGCR)、用於重新合成脂肪酸和膽固醇的限速酶之去活化而敏銳地關閉脂肪酸的合成。此外，該脂肪酸合成酶(FASN)的蛋白表現已知被AMPK負調控。事實上，由於其組織分佈及不尋常的酶活性，標靶FASN，其為脂質生成的關鍵酶並在HCC中有過度表現，提供了治療性應用的機會。
在此測試中，其發現HH-F3可以透過AMPK途徑和PGC1-α抑制8-Br-cAMP/Dex誘導的醣異生酶基因和HBV核心促進劑的活性。此外，已知的是AMPK途徑和PGC1-α也調控脂質生成。因此，進行測試來檢查GP/HH-F3在脂肪生成是否有作用。如圖6所示，在HCC細胞株和在BALB/c小鼠中使用GP或HH-F3處理藉由活化AMPK(增加AMPK磷酸化)並抑制活化的AKT(減少AKT磷酸化)而降低了脂肪酸(fatty acid，FA)合成的活性，BALB/c小鼠被皮下注射在具有BNL細胞的側腹上。此外，GP/HH-F3的處理導致磷酸化增加及AMPK下游標靶 ACC因此失活、以及FASN的蛋白表現水平以濃度依賴方式降低。此等結果指出GP/HH-F3處理可以在HCC中降低脂肪酸合成的活性。
實施例8 GP/HH-F3在Huh7中降低油酸(OA)和棕櫚酸(PA)誘導的脂質累積之影響。
Huh7細胞係與油酸(1mM)和棕櫚酸(2mM)分別培養24小時和48小時，其造成一藉由油紅O染色可見的明顯細胞內脂質累積及由MTT檢驗的細胞存活率。圖7A顯示原始放大倍率(×400)，其顯示對照組(無處理)、使用OA和PA(OA+PA)處理的組、使用OA和PA與GP處理48小時的組、以及使用OA和PA與HH-F3處理48小時的組之結果。在圖7中發現藉由油紅O將細胞內脂滴染色所定量，分別使用GP和HH-F3處理的Huh7細胞可以減少脂肪負荷(OA+PA/GP：油酸和棕櫚酸與GP共處理；OA/HH-F3：油酸和棕櫚酸與HH-F3共處理)。
其可得出的結論是GP/HH-F3可活化AMPK並抑制活化的AKT，從而減少脂質合成(見圖7)，雖然仍不清楚GP/HH-F3是否直接或間接調控AMPK和AKT。此外，其已知的是肝AMPK的活化和AKT的抑制可以經由增加的磷酸化和ACC的失活、以及減少的SREBP-1c和SREBP-2轉錄活化而敏銳地關閉脂肪酸的合成。另外，SREBP-1c在肝臟中調控脂質生成相關的基因，包括ACC和FAS，而SREBP-2可活化膽固醇生物合成的兩種關鍵酶，Hmgcr和Hmgcs1，其在腫瘤形成中具有重要的作用。
實施例9 GP/HH-F3和蕾莎瓦(Sorafenib)的組合對Huh7之細胞存活率的協同作用。
分別在蕾莎瓦(5μM和10μM)存在或不存在下，分別使用各種濃度的GP(0μg/ml、50μg/ml、150μg/ml、250μg/ml、及500μg/ml)和HH-F3(0μg/ml、5μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、及50μg/ml)處理Huh7細胞。藉由該SRB檢驗測定細胞存活率。數據係表示為平均值±三個獨立實驗的標準差(SD)。此外，等效線圖分析證明在Huh7細胞中72小時，蕾莎瓦和各種濃度的GP/HH-F3之間有協同相互作用。
在Huh7中分別組合各種濃度的GP和HH-F3與蕾莎瓦(唯一被FDA核准用於預先HCC患者的藥物)，隨後在72小時進行細胞增殖檢驗的結果顯示於圖8A和圖8B。該組合指數(combination index，CI)分析亦顯示於圖8C和圖8D，其使用Chou-Talalay法來評估此等潛在療法之間的相互作用為協同的(CI<1)、加成的(CI=1)或是拮抗的(CI>1)。如結果所示，GP和HH-H3皆可與蕾莎瓦協同抑制Huh7的增殖。
實施例10 HH-F3在治療徹底破壞初代皮層神經元中的Aβ-誘導神經毒性和在swAPP695-SH-SY5Y的細胞培養中減弱Aβ生產之影響
該初代皮層神經元係以載體(0.1%的DMSO)或HH-F3預處理2小時，隨後曝露於10μM的Aβ25-3540小時。培育後，藉由MTT檢驗檢測細胞存活率。如圖9所示，由MTT還原測得10μM的Aβ25-35纖絲導致細胞存活率明顯降低39.4±7.5%，並且Aβ25-35誘導的細胞死亡被HH-F3處理以劑量依賴的方式消除。
目前，用於阿茲海默症的單一療法策略的失敗表示有超過一種途徑貢獻於阿茲海默症的發病機制。具有超過一種標靶的藥物可能是更有希望的。因此，HH-F3亦測試來檢查其在swAPP695-SH-SY5Y細胞培養中可否減少Aβ產生。該SH-SY5Y細胞中的細胞外Aβ水平低於可檢測極限，但swAPP695-SH- SY5Y細胞中的Aβ40和Aβ42水平分別為1.2ng/ml和57.5pg/ml。HH-F3的處理之後，在SH-SY5Y細胞上沒有發現毒性(見圖10A)。藉由ELISA測定細胞外的Aβ40和Aβ42水平。該結果顯示於圖10B和圖10C，其指出50μg/ml的HH-F3具有能力將Aβ40和Aβ42的產生分別減少30.0±11.2%和36.8±16.0%。
細胞外Aβ累積可藉由抑制澱粉樣蛋白變性途徑或增加Aβ清除來減少，包含增強Aβ降解酶的活性和自噬。因此，進行免疫轉印法來檢測APP和APP-CTF的水平(圖11A)。在以指定濃度的HH-F3處理24小時後，總體APP的水平沒有明顯改變。出乎意料的是，當APP係以抗Aβ 1-40抗體免疫轉印時，檢測到一個未驗明的APP種類(APP-XF)，而且該種類被HH-F3減少。基本上，該APP-CTF的水平係增加(圖11A)。該γ-分泌酶抑製劑係使用來驗證γ-分泌酶對APP-CTF水平的涉入(圖11A)。另一方面，主要的Aβ降解酶，例如細胞中的胰島素降解酶(insulin degradation enzyme，IDE)和腦啡肽酶(neprilysin，NEP)的表現並沒有受到HH-F3影響(圖11B)。藉由24小時的培育後檢查其中剩餘的Aβ1-40以檢測SH-SY5Y-APP695細胞的條件培養基中Aβ降解酶的活性(圖11C)。結果顯示，HH-F3活化了Aβ降解酶的活性以促進條件培養基中Aβ1-40的清除，因為條件培養基中IDE和NEP的水平並未受到HH-F3影響(圖11D)。
自噬係涉及Aβ的清除。最近的報告指出在AD患者的腦中beclin-1(一種早期自噬調控器)向下調控(Pickford等人，The autophagy-related protein beclin 1 shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid beta accumulation in mice，J Clin Invest 2008；118：2190-2199)。亦測試了HH-F3對swAPP695-SH-SY5Y細胞中自噬活化的影響。該APP695-SHSY-5Y細胞係與載體或HH-F3培育24小時，並藉由西方墨漬法檢測LC3自噬標記。該結果記載於圖12。
HH-F3含有多酚化合物，例如沒食子酸(gallic acid)和單寧酸(tannic acid)。多酚化合物已被報告可抑制Aβ凝聚。在此專利中，使用硫代黃素T(Thioflavin T，TH-T)，一種可以插入Aβ的β-摺疊片結構的分子來檢測Aβ凝聚。當與澱粉樣蛋白纖絲結合時，Th-T的發射產生偏移，從而在其螢光光譜中引發密集的特定發射帶(482nm)。該結果顯示單寧酸(10μM)和剛果紅(10μM)抑制了Aβ1-40和Aβ1-42纖絲兩者的形成。HH-F3以濃度依賴的方式抑制Aβ1-40和Aβ1-42兩者的凝聚(圖13)。
預防Aβ介導的神經毒性已成為AD治療的重要治療策略。Aβ25-35是APP的膜間域中11個胺基酸的合成肽。其明顯的是Aβ25-35無法透過正常的APP處理產生。然而，Aβ25-35係選擇作為全長Aβ的模型，因其保留了其物理和生物性質兩者，同時其短的長度可容易允許衍生物被合成和研究(Hughes等人，Inhibition of toxicity in the beta-amyloid peptide fragment beta-(25-35)using N-methylated derivatives：a general strategy to prevent amyloid formation.J Biol Chem 2000；275：25109-25115)。雖然其不存在生物系統中，但Aβ25-35片段被許多科學家廣泛地與內生片段Aβ42一起使用或取而代之，而且被發現至少與全長片段一樣毒(Yankner等人，Neurotoxicity of a fragment of the amyloid precursor associated with Alzheimer's disease.Science 1989；245：417-420)。皮層神經元被HH-F3預處理2小時。隨後，使用10μM的Aβ25-35刺激細胞46小時。該Aβ25-35-介導的細胞存活率損失被HH-F3明顯恢復。20和50μg/ml的HH-F3分別明顯恢復了19%和33%的細胞存活率。發生了該HH-F3對細胞存活率的濃度依賴恢復效應，而該HH-F3的處理是在Aβ處理前而非處理後(圖14)。
HH-F3在體外的AD病理學中擁有多種功能。因此，該動物模型的試驗係執行以調查HH-F3的體內效果。該APP/PS1轉基因小鼠在120天大時在大腦皮層中發展出Aβ斑塊(Radde等人，2006)。140天大的APP/PS1小鼠係口服投予HH-F3(300mg/kg/天)一個月。在體外檢驗中，本發明已經證實HH-F3可以抑制Aβ凝聚。因此，將大腦半球中的澱粉樣蛋白斑塊染色(圖15)。由於與Aβ的高親和力，染料1-溴-2,5-雙(3-羧基-4-羥苯乙烯基)苯(1-Bromo-2,5-bis(3-carboxy-4-hydroxystyryl)benzene，BSB)一直被用來檢測澱粉樣蛋白斑塊。該結果顯示HH-F3僅輕微減少Aβ斑塊的負荷。載體組和HH-F3組之間的Aβ斑塊負荷數為43.3±23.1和22.3±7.5(圖15)。
本發明使用兩個步驟來分離可溶和不可溶Aβs。該可溶Aβs係溶於可含有單體、二聚物和寡聚物的2% SDS級分中。該不可溶Aβs係溶於70%的甲酸級分中。然後藉由ELISA量測可溶和不可溶Aβs。HH-F3減少了APP/PS1小鼠的大腦皮層中的可溶和不可溶Aβ(圖16)。
HH-F3影響SH-SY5Y-APP695細胞中的Aβ清除。因此，藉由免疫轉印法檢測APP/PS1小鼠的大腦皮層中與Aβ清除有關的蛋白(圖17A)。與野生型小鼠相比，該轉基因小鼠的IDE水平被向下調控，而NEP和APOE的水平被HH-F3向上調控。此外，與野生型小鼠相比，該轉基因小鼠的PPARγ和pAMPK水平被向下調控，而PPARγ、pAKT及pAMPK明顯地被HH-F3向上調控(圖17B)。
GP的粗萃取物(H2O、甲醇、100%乙醇、70%乙醇、或50%乙醇)沒有明顯影響Hep3B/T2中的HBsAg水平。DMSO、30% DMSO及80%丙酮的GP萃取物可以部分降低Hep3B/T2中的HBsAg水平(圖18)。
鑑於以上的結果，HH-F3有望用於阿茲海默症的治療。
總而言之，該GP萃取物或HH-F3級分係具有潛力作為一種新穎療法用於患有代謝性疾病的患者，該代謝性疾病例如糖尿病、肥胖、脂肪肝疾病，包括酒精性脂肪肝疾病(AFLD)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、HBV相關的肝相關疾病(包括HCC、肝纖維化或肝硬化)、糖尿病相關的肝相關疾病、肥胖相關的肝相關疾病、及肥胖引起的高血膽固醇或高三酸甘油酯水平。其建議的是可使用GP萃取物或HH-F3級分來治療或預防代謝症候群。
此外，本發明中指出的是該GP萃取物或HH-F3級分能夠活化AMPK途徑和自噬途徑。因此，建議可以將GP萃取物或HH-F3級分發展成為用於預防或治療神經退化性疾病或澱粉樣蛋白相關疾病的藥物，例如帕金森氏症、阿茲海默症、及杭丁頓氏症、而且甚至是抗衰老的藥物。
據信，本發明所屬技術領域中具有通常知識之人士可以基於本文中的描述而將本發明利用到最寬的範圍，並不需要進一步的說明。因此，所提供的描述和申請專利範圍應被理解為用於演示的目的，而不是要以任何方式限制本發明的範圍。

Claims (3)

  1. 一種具有一式I結構的化合物用於製備治療代謝性疾病藥物之用途；其中該具有一式I結構的化合物為
    Figure 103138926-A0305-02-0035-6
     其中R中之一為H或原花青素(procyanidin，PC)單元，而其他的R為OH或原飛燕草素(prodelphindine，PD)單元；n為一範圍從21至38的數字；以及PC單元對PD單元之比例不超過1：20。
  2. 如請求項1之用途，其中該代謝性疾病為糖尿病。
  3. 如請求項1之用途，其中該代謝性疾病為肥胖。
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