KR20160023965A - 우르솔산 및 루신을 유효성분으로 함유하는 근육재생용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우르솔산 및 루신을 유효성분으로 함유하는 근육재생용 약학조성물 또는 건강식품조성물에 관한 것으로, 비파잎 추출물의 주요 성분인 우르솔산 및 단백질 구성요소인 루신을 유효성분으로 함유한 조성물은 노화에 의해 근세포분화가 저하된 세포에서 근육세포분화를 유도하는 유전자인 미오게닌 및 MyoD의 발현을 증가시켜 근육세포를 재생성시켰으며, 특히, 병용 투여되었을 때 그 효과가 매우 탁월한 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 우르솔산 및 루신을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육감소 및 근력저하를 예방 또는 치료할 수 있는 약학조성물로 사용될 수 있으며, 천연 추출물인 우르솔산 및 자연계 구성물질인 루신은 인체에 안전한 성분이므로, 근육기능 저하 예방 또는 개선용 건강식품조성물로 사용될 수 있다.

Description

우르솔산 및 루신을 유효성분으로 함유하는 근육재생용 약학조성물{Pharmaceutical composition for muscle regeneration comprising ursolic acid and leucine}

본 발명은 우르솔산 및 루신을 유효성분으로 함유하는 근육재생용 약학조성물 또는 건강식품조성물에 관한 것이다.

골격근(Skeletal muscle)은 근원세포 중배엽 전구체가 분화한 후 여러 세포들의 하나의 세포로 융합되어 다핵의 근관세포로 진행되는 과정에 의해 발달된다.

근원성 조절 인자(Myogenic regulatory factors; MRFs)는 분화과정 동안 근육 융합에 중요한 역할을 하는데, 그 중 basic helix-loop-helix (bHLH) 전사인자, MyoD(myogenic differentiation 1), Myf5(myogenic factor 5), 미오게닌(myogenin) 및 MRF4(myogenic regulatory factor-4)가 근육 형성에 대단히 중요하다. MyoD 및 Myf5는 골격근 형성에 필요하며, 특히 축상(epaxial) 및 hypaxial 근육 발달에 중요한 역할을 한다. 또한 미오게닌에 의해 근관세포로 분화되는 근원세포의 근육 조직 전구세포를 구별하는 역할하며, MyoD는 세포주기 조절에 의한 근원세포 분화를 촉진시킬 수 있다.

MRF4는 근육 특이적 프로모터(promoter)의 전사를 차단하여, 골격근 전구체의 분화 전 성장 및 증식을 가능하게 한다. 또한 미오게닌은 독립적으로 MRF4 전사를 활성화시킬 수 있으며, 병용처리시에는 MRF4 프로모터(promoter)를 자극할 수 있다. 따라서, 상기 유전자들의 활성 조절은 근육재생에 있어서, 효과적인 전략이 될 수 있다.

우르솔산(ursolic acid)은 자연계 펜타싸이클릭 트리테르페노이드 카르복실릭 산(pentacyclic triterpenoid carboxylic acid)으로 사과, 배, 자두와 같은 과일의 보호을 위한 코팅제로 사용되며, 과일 및 비파잎, 크랜베리, 바질, 페퍼민트 및 로즈마리와 같은 식물에 분포해 있다. 특히, 우르솔산은 비파잎 추출물의 주요 성분으로 비파잎 1 그램(g)당 1.5 mg이 포함되어 있다. 우르솔산과 같은 트리테르펜(triterpene) 성분은 인슐린에 의해 유도되는 Akt 인산화 및 세린/트레오닌 특이적 단백질 키나제와 같은 조절 인자들을 증가시켜 당대사, 세포사멸 및 세포의 증식, 전이 또는 이동과 같은 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 한다.

골격근은 Akt 조절을 통하여 근육 위축을 억제하고 근육 비대를 촉진시킬 수 있다는 연구결과가 보고됨에 따라, Akt 활성화를 유도하는 우르솔산은 근육 기능저하에 의한 질병치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

그러나, 기존의 근육치료제는 주로 패혈증, 암, 신부전증, 글루코코르티코이드의 과다, 신경제거 및 근육의 미사용에 따른 근육 감소증을 치료하기 위한 목적으로 우르솔산을 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여, 근육 감소증을 유도하는 유전자인 Muscle ring finger 1 (MuRF1) 및 Muscle atrophy F box (MAFbx)의 활성화를 억제함으로써, 근육분해를 저해하는 근육 감소증 치료제의 연구 및 개발이 진행되어 왔다.

해외공개특허 WO2011-146768호는 우르솔산을 이용하여 근육감소를 유도하는 유전자의 발현을 억제시켜 근육감소증을 치료하는 방법을 개시하고 있지만, 근육세포분화 촉진을 통한 근육재생 방법에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다.

이에 본 발명자들은 우르솔산이 근육세포분화를 유도하는 유전자를 활성화시켜 노화된 근육세포의 분화를 유도하여 근육을 재생시키는 것을 확인하였으며, 분지사슬 아미노산인 루신과 병용하여 사용하였을 때, 기존의 우르솔산을 단독으로 사용하였을 때보다 근육재생 효과가 크게 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 비파잎 추출물인 우르솔산, 루신을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여, 노화에 의해 근육세포분화능이 저하된 근육세포의 세포분화를 유도함으로써, 근육재생 효과를 나타낼 수 있는 근육재생용 약학조성물 또는 건강식품 조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 90 중량% 및 루신 10 내지 90 중량%을 유효성분으로 포함하는 근육재생용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 90 중량% 및 루신 10 내지 90 중량%을 유효성분으로 포함하는 근육재생용 건강식품조성물을 제공한다.

본 발명은 우르솔산 및 루신을 유효성분으로 함유하는 근육재생용 약학조성물 또는 건강식품조성물에 관한 것으로, 비파잎 추출물의 주요 성분인 우르솔산 및 단백질 구성요소인 루신을 유효성분으로 함유한 조성물은 노화에 의해 근세포분화가 저하된 세포에서 근육세포분화를 유도하는 유전자인 미오게닌 및 MyoD의 발현을 증가시켜 근육세포를 재생성시켰으며, 각각 단독으로 사용했을 때보다 병용 투여되었을 때 그 효과가 매우 탁월한 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 우르솔산 및 루신을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육감소 및 근력저하를 예방 또는 치료할 수 있는 약학조성물로 사용될 수 있으며, 천연 추출물인 우르솔산 및 자연계 구성물질인 루신은 인체에 안전한 성분이므로, 근육기능 저하 예방 또는 개선용 건강식품조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 비파잎 에탄올 추출물 0.25, 0.5, 1 또는 2.5 μg/mL을 생쥐 근아세포에 투여한 후 생쥐 근아세포 분화에 의한 근관(myotube) 형성 및 근육분화 지표 단백질인 크레아틴 키나제(creatine kinase) 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 비파잎 유효성분인 우르솔산(ursolic acid) 및 루신(leucine)을 단독 또는 혼합 조성물로 생쥐 근아세포에 투여한 후 근아세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 비파잎 유효성분인 우르솔산(ursolic acid) 및 루신(leucine)을 단독 또는 혼합 조성물로 근아세포에 투여한 후 근아세포의 근관형성 유도 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 비파잎 유효성분인 우르솔산(ursolic acid) 및 루신(leucine)을 단독 또는 혼합 조성물로 근아세포에 투여한 후 크레아틴 키나제(creatine kinase) 활성을 확인한 결과이다.
도 5는 비파잎 유효성분인 우르솔산(ursolic acid) 및 루신(leucine)을 단독 또는 혼합 조성물로 근아세포에 투여한 후 근분화 지표 단백질인 myosin heavy chain(MHC) 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 비파잎 유효성분인 우르솔산(ursolic acid) 및 루신(leucine)을 단독 또는 혼합 조성물로 근아세포에 투여한 후 근관형성 및 융합정도를 확인한 면역염색결과 및 fusion index 결과이다.
도 7은 비파잎 유효성분인 우르솔산(ursolic acid) 및 루신(leucine)을 단독 또는 혼합 조성물로 근아세포에 투여한 후 근분화조절 단백질인 미오게닌(Myogenin) 및 MyoD의 mRNA 및 단백질 발현 정도를 확인한 결과로, 도 7A, 7B 및 7C는 미오게닌(Myogenin) 및 MyoD의 단백질 발현량을 확인한 웨스턴 블롯결과이며, 도 7D, 7E 및 7F는 미오게닌(Myogenin) 및 MyoD의 mRNA 발현 정도를 확인한 역전사 중합효소 연쇄반응 결과이다.
도 8은 비파잎 유효성분인 우르솔산(ursolic acid) 및 루신(leucine)을 단독 또는 혼합 조성물로 근아세포에 투여한 후 근육 합성관련 단백질 전좌 효과를 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 9는 우르솔산을 유효성분으로 함유하는 비파잎 추출물(LE) 또는 비파잎, 루신 및 엽산으로 혼합된 비파잎 추출 혼합물을 각각 식이한 젊은 흰쥐 및 노화 흰쥐의 대퇴근 근육량 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 우르솔산을 유효성분으로 함유하는 비파잎 추출물(LE) 또는 비파잎, 루신 및 엽산으로 혼합된 비파잎 추출 혼합물을 각각 식이한 젊은 흰쥐 및 노화 흰쥐의 앞다리 근력 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 우르솔산을 유효성분으로 함유하는 비파잎 추출물(LE) 또는 비파잎, 루신 및 엽산으로 혼합된 비파잎 추출 혼합물을 각각 식이한 젊은 흰쥐 및 노화 흰쥐의 앞다리 근력 변화를 크레아틴 키나제 활성으로 확인한 결과이다.
도 12는 우르솔산을 유효성분으로 함유하는 비파잎 추출물(LE) 또는 비파잎, 루신 및 엽산으로 혼합된 비파잎 추출 혼합물을 각각 식이한 젊은 흰쥐 및 노화 흰쥐의 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol; TC) 및 중성지방(triglyceride; TG) 수준을 확인한 결과이다.

본 발명은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 90 중량% 및 루신 10 내지 90 중량%을 유효성분으로 포함하는 근육재생용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 엽산을 더 포함할 수 있다.

상세하게는 상기 약학조성물은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 40 중량%, 루신 20 내지 50 중량% 및 엽산 20 내지 50 중량%를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 21 중량%, 루신 43 중량% 및 엽산 36 중량%를 포함할 수 있다.

상기 우르솔산과 루신의 함량 범위를 벗어날 경우, 우르솔산과 루신의 복합 조성에 의한 근육재생성 효능이 둔화되는 문제점이 야기될 수 있다.

상기 비파잎 추출물은 C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 비파잎 추출물은 비파잎을 에탄올로 추출한 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

루신은 분지사슬 아미노산(branched chain amino acid; BCAAs)의 필수아미노산에 속하며, BCAAs에 포함되는 루신, 발린 및 이소루신은 골격근에서 구성하는 주요 아미노산으로 특히, 루신은 근육 단백질 합성과 관련된 포유 동물의 라파마이신 신호 전달과정(Mammalian target of rapamycin; mTOR)을 직접적으로 활성화시켜 근육성장을 유도할 수 있다. 또한 가장 대표적인 근육 강화제로 알려진 β-하이드록시 β-메틸부티레이트 (β-Hydroxy β-methylbutyrate; HMB)의 전구체로 알려져 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 우르솔산 및 루신 혼합물을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 근아세포인 생쥐 C2C12 세포에 투여한 결과, 근분화 조절 단백질인 미오게닌(myogenin) 및 MyoD의 mRNA 및 단백질 발현 수준과 근관형성 및 근분화 지표로 알려진 크레아틴 키나제 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 현미경 관찰 결과, 세포의 근관형성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

또한 다른 일실시예에 따르면, 노화 흰쥐의 비파잎 추출물 또는 비파잎, 루신 및 엽산이 함유된 혼합물을 섭취시킨 결과, 노화 흰쥐의 가자미근의 무게가 증가되었으며, 앞다리 근력이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한 근육조직의 크레아틴 키나제 활성 역시 증가된 것을 확인할 수 있었다.

상기 약학 조성물은 상기 우르솔산, 루신 및 엽산 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 근기능 저하 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜제조될 수 있다. 이때, 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고제, 로션제, 연고제 등의 형태일 수 있다.

또한 본 발명은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 90 중량% 및 루신 10 내지 90 중량%을 유효성분으로 포함하는 근육재생용 건강식품조성물을 제공한다. 상기 건강식품조성물은 엽산을 더 포함할 수 있다.

상세하게는 상기 건강식품조성물은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 40 중량%, 루신 20 내지 50 중량% 및 엽산 20 내지 50 중량%를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 21 중량%, 루신 43 중량% 및 엽산 36 중량%를 포함할 수 있다.

상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 유효성분인 본 발명에 따른 우르솔산 및 루신 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 우르솔산, 루신 및 엽산의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 참고예 1> 시약 및 항체

우르솔산(Ursolic acid), L-루신(L-leucine) 및 β-액틴(β-actin) 단일클론 항체를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 우르솔산은 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시킨 후 사용 전까지 -20℃에서 저장하였으며, 배양 배지로 희석하여 사용하였다.

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny tetrazolium bromide; MTT]는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였으며, 미오신 중쇄(myosin heavy chain; MHC), MyoD, 미오제닌(myogenin), phospho-Akt (Ser 473) 및 Akt1/2/3에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, 4E-BP1, phospho-4E-BP1 및 phospho-p70S6K에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. p70S6K에 대한 다클론성 항체는 Bioss (Woburn, MA, USA)에서 구입하였다.

Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)는 Welgene Inc. (Daegu, Korea) 에서 구입하였으며, 말 혈청(horse serum; HS)은 invitrogen (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 태아소혈청(Fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)은 HyClone (Logan, UT, USA)에서 구입하여 사용하였다.

Creatine kinase enzymatic assay kit (MaxDiscovery™ creatine kinase enzymatic assay kit)는 Bioo Scientific Corp (Austin, TX, USA)에서 구입하여 사용하였다.

< 실시예 1> 비파잎 추출물의 근관분화 유도능 확인

1. 비파잎 추출물 제조

비파잎(Eriobotrya japonica; loquat)주정 추출물(이하 “LE”)은 부산광역시 기장군 소재 해양생산육성센터(Marine Bio-industry Development Center, Busan, Korea)에서 제조되었으며, 건조된 비파잎으로부터 추출된 LE는 공개되어진 방법(Jung HA, Park JC, Chung HY, Kim J and Choi JS: Antioxidant flavonoids and chlorogenic acid from the leaves of Eriobotrya japonica. Arch Pharm Res 22: 213-218, 1999.)으로 수행되었다. 먼저, 건조된 비파잎에 에탄올을 첨가하여 추출한 후 추출된 비파잎 에탄올 추출물을 여과 및 농축하였다. 농축된 에탄올 추출물에 물을 첨가하고 4℃에서 원심분리하여 침전물을 수집하였다.

침전물은 건조 후 분쇄하여 분말 형태의 비파잎 주정추출물을 획득하였다.

비파잎 건조 중량 1kg에서 47g의 비파잎 주정추출물을 얻을 수 있었으며, 비파잎 주정 추출물 1g에는 우르솔산 101.88mg이 함유되어 있음을 확인하였다.

2. 생쥐 근아세포 ( C2C12 ) 배양 및 근관분화 유도

생쥐 근아세포주인 C2C12 세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 불활성화된 10% 태아소혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM을 성장배지(growth medium; GM)로 이용하여 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기가 함유된 습한 대기 조건에서 세포를 유지시켰다.

또한 2% 말혈청(HS)가 첨가된 DMEM을 분화배지(differentiation medium, DM)로 사용하여 75 T-플라스틱플라스크(SPL, Korea)에 배양하고 2일에 한 번씩 계대하여 세포주를 유지하였으며, 그 외의 세포는 6-웰(well) 플레이트에 2.5×10 cell/well로 접종하여 세포가 90% 합류될 때 배지를 제거하고 0.25, 0.5, 1 및 2.5 μg/mL 비파잎 추출물(LE)을 포함하는 DMEM 분화배지(differentiation medium; DM)로 교체하였다. 그 후 이틀에 한 번씩 배지를 교환하고 6일 동안 배양하였다.

3. 크레아틴 키나제 활성 측정

근분화(근관형성)의 지표로 알려진 크레아틴 키나제 활성은 MaxDiscovery™ Creatine Kinase (CK) Enzymatic Assay Kit (BIOO SCIENTIFIC, Austin, TX, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포 분해 완충용액[40 mM Tris (pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.5% NP-40, 2 μg/ml 아프로티닌(aprotinin), 2 μg/ml 류펙틴(leupeptine) 및 100 μg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenymethylsulfonyl fluoride; PMSF)]를 이용하여 세포에서 단백질을 분리한 후, 세포 균질액 5㎕를 96-웰(well) 마이크로 플레이트에 분주하고 250㎕ CK 시약반응액을 첨가하여 즉시 340 nm에서 흡광도를 5분 간격으로 측정하였다. 5분간의 흡광도 변화(5분후 흡광도-최초 흡광도(0분))에 변환상수 2,186을 곱하여 크레아틴 키나제 활성을 계산하였다.

4. 결과

분화 6일 후 현미경하에 근관형성을 관찰한 결과, 도 1과 같이, 근관의 형성과 크레아틴 키나제의 활성이 투여된 비파잎 추출물의 농도 의존적으로 증가하였다.

< 실시예 2> 우르솔산 및 분지사슬 아미노산 루신 혼합물의 근관분화 유도능 확인

1. 세포생존율 분석

근아세포에 대한 세포생존능은 MTT assay로 확인하였다.

MTT assay는 세포의 증식과 세포의 살아있는 정도를 간접적으로 측정하는 것으로써 대사과정이 온전한 세포의 경우, 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의하여 노란색의 수용서 기질인 MTT 테트라졸륨(tetrazolium)을 청자색을 띠는 비수용성의 MTT 포르마잔(formazan) [3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-dipheyl-tetrazolium bromide] 결정으로 환원시킨다. 생성된 MTT formazan의 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아 있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 따라서 각 well에 존재하는 세포 생존 수와 비례한다.

성장배지에서 배양된 C2C12 세포에 우르솔산 또는 루신을 단독 포함하거나, 우르솔산-루신 혼합물을 포함하는 DMEM 분화배지(differentiation medium; DM)로 교체하고 이틀에 한 번씩 배지를 교환하여 6일 동안 배양하였다.

배양 6일 후 배지를 제거하고 0.5mg/ml MTT 시약이 함유된 배지를 첨가하고 2시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 그 후 배지를 제거하고 형성된 MTT 포르마잔(formazan) 결정을 용해시키기 위해 DMSO를 2ml씩 분주하고 5 내지 10분간 반응시켜 마이크로플레이트 리더기로 540mm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다.

그 결과 도 2와 같이, 우르솔산은 5μM 까지 루신은 50μM까지 유의한 세포독성이 나타나지 않았으며, 우르솔산-루신 혼합물 역시 세포독성이 나타나지 않았다.

2. 우르솔산 , 루신 또는 우르솔산 -루신 혼합물의 근관세포 분화유도능 분석

C2C12 세포을 6-웰(well) 배양용기의 한 웰(well)당 2×10⁵ 세포로 접종하고 1 일간 배양한 후 0, 0.5, 2.5, 5 및 10μM 우르솔산 또는 0, 10, 50, 100 및 500μM 루신을 단독 포함하거나, 0.5 또는 2.5μM 우르솔산과 10 또는 50μM 루신이 포합된 혼합물이 각각 첨가된 DMEM 분화배지(differentiation medium; DM)로 교체하고 이틀에 한 번씩 배지를 교환하여 6일 동안 배양하였다. 배양 6일 후 실시예 1-3과 같은 방법으로 크레아틴 키나제 활성을 확인하여 우르솔산, 루신 또는 우르솔산-루신 혼합물에 의한 근관분화 유도능을 확인하였다.

그 결과, 도 3 및 4와 같이 우르솔산 또는 루신에 의해 근관의 형성이 농도의존적으로 증가하였으나, 우르솔산 0.5μM 및 루신 10μM 혼합물을 투여하였을 때, 각각 단독 약물을 투여된 경우보다 탁월한 분화 유도가 확인되었다.

< 실시예 3> 우르솔산 및 루신 혼합물의 근분화 지표에 대한 효과 확인

1. 세포 약물 처리

C2C12 세포을 6-웰(well) 배양용기의 한 웰(well)당 2×10⁵ 세포로 접종하고 1일간 배양한 후 0, 0.5, 2.5, 5 및 10μM 우르솔산 또는 0, 10, 50, 100 및 500μM 루신을 단독 포함하거나, 0.5 또는 2.5μM 우르솔산과 10 또는 50μM 루신이 포합된 혼합물이 각각 첨가된 DMEM 분화배지(differentiation medium; DM)로 교체하고 이틀에 한 번씩 배지를 교환하여 6일 동안 배양하였다. 배양 6일 후 웨스턴 블롯 분석법으로 MHC 발현을 확인하여 우르솔산, 루신 또는 우르솔산-루신 혼합물에 의한 근관분화 유도능을 확인하였다.

근분화 조절 단백질인 미오게닌(myogenin) 및 MyoD의 mRNA와 단백질 발현은 상기와 같이 약물 처리 후, MyoD는 1일 후에 그리고, 미오게닌(myogenin)은 2일 후에 발현수준을 분석하였다.

2. 웨스턴 블롯 분석

우르솔산 및 루신 혼합물의 근분화 유도능을 평가하기 위해 근분화 지표단백질인 MHC 및 근분화 조절 단백질인 미오게닌(myogenin) 및 MyoD의 발현 조절 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다.

일정량 단백질이 포함된 세포배양물과 겔 로딩 완충액(0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 10% 2-메르캅토에탄올, 0.2% 브롬페놀블루)을 혼합한 후 5분간 끓였다. 각각의 시료(100mg)를 10~15% 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 미니-겔에서 1시간 3분간 110V에서 전기영동 시켰다. Towbin 완충액(25mM Tris-Cl, 192mM 글리신, 20% MeOH)을 이용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 전이시키고, 비 특이적 단백결합을 차단하기 위해 멤브레인을 5% 탈지유를 함유하는 세정 완충액(10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% tween-20)에서 1시간 동안 교반시킨 후 세정 완충액으로 1회 세척하고 MHC, 미오게닌(myogenin) 및 MyoD 1차 항체와 실온에서 각각 5시간 동안 반응시켰다. 그 후 세정 완충액으로 3회 세척하고 호스래디시 퍼옥시데아제(horseradish-peroxidase)가 결합된 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세정 완충액으로 4회 세척한 후 ECL 검출시약을 가하여 생성되는 인광을 이용하여 시그날을 확인하였으며, Pre-stained markers를 이용하여 분자량을 확인하였다.

그 결과, 도 5와 같이 우르솔산 또는 루신을 각각 단독으로 투여한 세포군보다 우르솔산 0.5μM 및 루신 10μM 혼합물이 투여된 세포군에서 증가된 MHC 발현을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7A, 7B 및 7C에서도 우르솔산 또는 루신을 각각 단독으로 투여한 세포군보다 우르솔산 0.5μM 및 루신 10μM 혼합물이 투여된 세포군에서 MyoD의 발현이 증가되었으며, 미오게닌 역시 MyoD 만큼 높은 수준은 아니였지만, 증가된 발현량을 확인할 수 있었다.

3. 면역세포화학 염색( immunocytochemistry )

근분화에 의한 근관형성을 정량적으로 분석하기 위해 근관에서 발현되는 MHC를 면역형광염색법으로 염색하여 융합지수(fusion index)를 확인하였다.

근세포 분화능을 평가하기 위해 근아세포를 젤라틴이 코팅된 커버슬립 위에서 배양하여 분화시켰다. 분화 후, 인산완충용액(PBS)로 세정 후, 4% 포르말린과 0.3% 글루타알데히드의 고정액을 20분간 처리하여 세포를 커버슬립에 고정하고 다시 인산완충액으로 세정하였다. 0.2% 트리톤(Triton) X-100과 2% 정상 고우트 혈청(normal goat serum)이 포함된 인산완충액을 이용하여 투과 및 불필요한 단백결합 차단반응을 하고, 일차항체인 MHC(1:200)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 로다민(rhodamin)이 결합된 2차 항체를 이용하여 세포염색을 수행하였다. 커버슬립은 DAPI가 함유된 Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 mounting 배지를 이용하여 유리 슬라이드에 고정한 후, 공초점 현미경(Zeiss, Goettingen, Germany)을 이용하여 확인하고 fusion index를 작성하였다.

그 결과, 도 6과 같이 현미경 필드상의 전체 핵에 대한 근관내의 핵비율을 비교한 결과, 우르솔산 또는 루신이 단독 투여된 경우보다 우르솔산 및 루신 혼합물이 투여된 경우, 융합지수(fusion index)의 탁월한 증가가 확인되었다.

4. 역전사 중합효소 연쇄반응 ( reverse transcriptase - polymerase chain reaction, RT - PCR )

TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하고 흡광광도계를 이용하여 RNA의 값을 정량 후, TOPscript™ cDNA synthesis kit(mix type/dT18 plus; Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하여, 각각의 유전자 프라이머 (GAPDH, 정방향 5’-actccactcacggcaaattc-3’, 역방향 5’-ccttccacaatgccaaagtt-3’; 미오게닌(myogenin), 정방향 5’-accaggagccccacttgtat-3’, 역방향 5’-acgatggacgtaagggagtg-3’; MyoD, 정방향 5’-agtgaatgaggccttcgaga-3’, 역방향 5’-ctgggttccctgttctgtgt-3’)와 AccuPowerPCR PreMix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 증폭시켰다.

각각의 PCR 싸이클(cycle)은 94℃에서 30 초(sec), 60℃에서 30 초(sec) 및 72℃에서 1 분(min)간 수행되었으며, MyoD는 26 싸이클(cycle), 미오게닌(myogenin)은 27 싸이클(cycle) 및 GAPDH는 25 싸이클(cycle)로 수행되었다.

증폭된 최종 생성물을 아가로스 겔에 전기영동 후, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 Image analyze 상에서 관찰하였다.

그 결과, 도 7D, 7E 및 7F와 같이 우르솔산 및 루신 혼합물은 근분화 조절 단백질인 미오게닌(myogenin) 및 MyoD의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 증가시켰다.

< 실시예 4> 우르솔산 및 루신 혼합물의 근분화 유도 기전 확인

0.5μM 우르솔산, 10μM 루신 또는 이들의 혼합물을 각각 C2C12 세포에 투여하여 6일간 배양한 후 세포를 수집하고 단백질을 추출하여 상기 실시예 3-2에 제시된 방법으로 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 각각의 약물에 의한 근육단백질 합성 전좌를 확인하였다.

그 결과, 도 8과 같이 우르솔산 및 루신 혼합물에 의해 근육 단백질 합성에 관여하는 시그널 전좌인 4E-PB1 및 p70S6 키나제가 활성화되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 노화쥐에서 비파잎 또는 비파잎 함유된 혼합물이 근육양 및 근력에 미치는 효과 확인

1. 실험동물

SPF 웅성 6개월령(young)과 21~22개월령(old)의 Sprague Dawley 흰쥐를 Samtako에서 구입하였고, 부산대학교 약학대학 실험동물센터에서 사육하였다. 실험동물은 케이지(cage) 당 2마리씩, 생수와 사료는 자유식으로 하였다. 실험 시작전 실험동물은 최소 1주일간 안정화 시켰다. 본 연구에 사용된 동물 프로토콜(animal protocol)은 부산대학교 동물실험윤리위원회에서 검토되고 승인되었다.

안정화 기간 후, 흰쥐를 연령에 따라 무작위로 그룹을 나누었다. 젊은 흰쥐와 노화 흰쥐는 대조군과 각각 실험군 I, II의 세 군으로 나누어, 대조군은 일반사료를 식이하고, 실험군 I은 비파잎 추출물(LE)을 체중에 대하여, 50 mg/kg이 되게, 실험군 II는 비파잎+루신+엽산 혼합물(MIX; 비파잎 50 mg/kg + 루신 100 mg/kg + 엽산 10 mg/kg)을 사료에 섞어 4 주간 자유식이 시켰다.

2. 근육량 측정

4주 후 동물을 희생시킨 뒤, 하지근의 비복근(gastrocnemius muscle)과 가자미근(soleus muscle) 및 혈액을 분리하였다. 각각의 실험군의 동물에서 적출한 하지근의 비복근 및 가자미근의 무게를 측정하였다.

그 결과, 도 9와 같이 비파잎 추출물(LE) 또는 비파잎 혼합물을 식이한 젊은 흰쥐와 노화 흰쥐 모두의 비복근 무게는 영향이 나타나지 않은 반면, 비파잎 또는 비파잎 혼합물을 식이한 노화 흰쥐의 경우, 가자미 근육량이 대조군보다 증가되었으며, 노화에 따른 가자미근의 근육량 감소가 억제가 확인되었다.

3. 근력측정

상기 방법으로 식이한 흰쥐 실험동물의 앞다리 근력(grip strength)을 4주 동안 Columbus Instrument(Ohio, USA)사의 T-shaped pull bar를 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 10과 같이, 젊은 흰쥐의 경우 비파잎 추출물만을 섭취했을 때, 근력이 조금 증가되는 효과를 나타내었다. 반면, 젊은 개체군에 비해 근력이 현저히 약해져 있던 노화 흰쥐는 비파잎 추출물(LE) 및 비파잎 혼합물의 섭취 후 노화 흰쥐 대조군보다 근력이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> 노화쥐에서 비파잎 추출물 또는 비파잎 함유된 혼합물에 의한 생화학적 지표 변화 확인

상기 실시예 5-1과 같이 비파잎 추출물 또는 비파잎 혼합물을 식이한 노화 흰쥐에서 적출된 근육조직 균질액을 이용하여 실시예 1-3과 같은 방법으로 크레아틴 키나제 활성을 확인하였으며, 분리한 혈액으로 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol, TC) 및 중성지방(triglyceride, TG)을 측정하였다.

혈중 총콜레스테롤 농도는 정량용 키트 Cholestezyme-V(Shinyang Diagnostics, Seoul, Korea)를 사용하였으며, TG 측정은 효소법에 의한 정량용 키트(Triglyzyme-V, Shinyang Diagnostics, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다.

그 결과 도 11과 같이, 노화 흰쥐에서는 근육분화 관련 효소인 크레아틴 키나제 활성이 노화에 의해 현저히 감소 되어 있었다.

비파잎 추출물 또는 비파잎이 함유된 혼합물의 섭취한 젊은 흰쥐에게서는 크레아틴 키나제에 영향을 주지 않은 반면, 노화 흰쥐의 경우 비파잎이 함유된 혼합물이 크레아틴 키나제 활성을 증가시켰다.

또한 도 12를 참고하면, 총콜레스테롤 및 중성지방은 노화에 따라 증가하는데, 비파잎 추출물 또는 비파잎이 함유된 혼합물의 섭취가 노화에 따른 혈중 중성지방을 억제하는 효과를 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 90 중량% 및 루신 10 내지 90 중량%을 유효성분으로 포함하는 근육재생용 약학조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 엽산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근육재생용 약학조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 약학조성물은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 40 중량%, 루신 20 내지 50 중량% 및 엽산 20 내지 50 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 근육재생용 약학조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 약학조성물은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 21 중량%, 루신 43 중량% 및 엽산 36 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 근육재생용 약학조성물.
5. 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 90 중량% 및 루신 10 내지 90 중량%을 유효성분으로 포함하는 근육재생용 건강식품조성물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 건강식품조성물은 엽산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근육재생용 건강식품조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 건강식품조성물은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 10 내지 40 중량%, 루신 20 내지 50 중량% 및 엽산 20 내지 50 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 근육재생용 건강식품조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 건강식품조성물은 비파잎 추출물 또는 우르솔산 중 하나의 물질 21 중량%, 루신 43 중량% 및 엽산 36 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 근육재생용 건강식품조성물.
   
   
   
   
   
   

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