KR20220163807A

KR20220163807A - 신경 보호 효과를 갖는 약제학적 조성물 및 그 치료제

Info

Publication number: KR20220163807A
Application number: KR1020210072423A
Authority: KR
Inventors: 여수정; 서민형
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2022-12-12

Abstract

본 명세서는 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물 약제학적 조성물 및 그 치료제를 개시한다.

Description

신경 보호 효과를 갖는 약제학적 조성물 및 그 치료제{pharmaceutical composition and its therapeutic agent having neuroprotective effect}

본 명세서는 신경 보호 효과를 갖는 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

다양한 한약재들이 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환 치료 및 예방에 사용하는 것으로 알려졌다. 예를 들어, 산약도 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환 치료 및 예방에 사용하는 것으로 알려졌다.

그러나, 산약이 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환에 어떠한 기전으로 통해 치료 및 예방 효과가 있는지 전혀 알려주지 않은 상태이다.

본 실시예들은 신경세포 보호 효과를 제공하는 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

일 실시예는, 산약(山藥)을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물을 제공한다. .

다른 실시예는, 산약(山藥)을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물; 및 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 신경세포 보호활성을 갖는 치료제를 제공한다.

이때 약제학적 치료제는 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

본 실시예들에 따르면, 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 신경세포 보호 효과를 제공한다.

본 실시예에 따르면, 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

도 1은 산약 추출물이 MPTP 유도 마우스 모델에서 알파-시누클레인 발현의 증가를 억제하는 것을 도시한다.
도 2는 SH-SY5Y 세포주가 ITGA7 siRNA (siITGA7)로 24 시간 동안 형질 감염되는 것을 도시한다.
도 3은 산약 추출물이 MPTP- 유도 파킨슨증 마우스 모델에서 도파민성 세포 발현의 감소를 억제하는 것을 도시하고 있다.
도 4 및 도 5는 산약 추출물의 다양한 농도에서 세포 독성을 분석한 결과를 도시하고 있다.
도 6은 산약 추출물의 다양한 농도에서 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시하고 있다.

이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예들을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료", "억제" 및 "약화"란, 본 발명의 조성물을 개체에 사용하여, 특정 세포의 분화나, 특정 물질의 수준, 특정 질병 또는 질환의 진행을 감소시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

이하, 본 발명의 실시예들에 따른 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제에 대하여 설명한다.

실시예: 약제학적 조성물 및 그 치료제

시누클레이노패티(Synucleinopathy 또는 a-Synucleinopathy)는 뉴런, 신경 섬유 또는 glial 세포에 알파-시누클레인 단백질 응집체가 비정상적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 신경 퇴행성 질환이다. 시누클레이노패티에는 파킨슨병 (PD), 루이 소체 치매 (DLB), 다 계통 위축 (MSA)의 세 가지 주요 유형이 있다. 다양한 neuroaxonal dystrophies와 같은 다른 희귀한 장애들도 a-synuclein 병리를 가지고 있다. 시누클레이노패티는 때때로 synuclein과 tau 단백질 사이의 상호 작용 때문에 tauopathies와 겹칠 수 있다.

시누클레이노패티 환자에서 REM 수면 행동 장애 (RBD)가 나타나기도 하는데, RBD를 가진 개인이 빠른 안구 운동 (REM) 수면 중에 정상적인 근육 마비 (atonia)를 잃고 꿈을 실행하거나 다른 비정상적인 움직임 또는 발성을 갖는 수면장애이다. 비정상적인 수면 행동은 다른 증상보다 수십 년 전에 나타날 수 있으며, 종종 시누클레이노패티의 초기 징후로 나타납니다. 특정 시누클레이노패티의 다른 증상은 일반적으로 RBD 진단 후 15 년 이내에 나타나지만 RBD 진단 후 최대 50 년까지 나타날 수 있다.

알파-시누클레인 침착물은 심장 근육과 혈관에 영향을 미칠 수 있다. 시누클레이노패티를 가진 거의 모든 사람들은 대부분 무증상이지만 심혈관 기능 장애를 가지고 있다.

씹는 것부터 배변까지, 알파-시누클레인 침착물은 모든 수준의 위장 기능에 영향을 미치는데, 증상으로는 위 배출 지연과 같은 상부 위장관 기능 장애 또는 변비 및 장기간의 대변 통과 시간과 같은 하부 위장 기능 장애가 있다.

소변 정체, 야간에 소변 보기, 소변 빈도 및 긴급도 증가, 과활동성 또는 저활동성 방광은 시누클레이노패티를 가진 사람들에게 흔하며 성기능 장애가 있을 수 있다.

산약[山藥]의 다른 이름은 서여, 산우, 옥연, 산저이다. 산약은 마과 식물인 마(Dioscorea batatas Dcne) 또는 참마(Dioscorea japonica Thunb)의 덩이뿌리를 그대로 또는 쪄서 말린 것으로 한약(Chinease medicine)에서 많이 사용되어 졌으며, 식용으로도 많이 섭취되어 왔다.

산약의 주성분은 전분질이며, 단백질, 무기질, 비타민 C, B1 등의 영양성분을 함유하고, 뮤신(mucin)으로 인해 점성이 있다. 산약은 냄새가 없고, 맛은 달고 담백하여 비장기능의 허약으로 인한 권태감과 무력감, 식욕감소, 설사를 다스리며, 해수, 천식, 가래, 위장 장애 및 만성위염에도 효과가 있다. 산약은 항산화, 항염, 항암 작용 등 다양한 생리활성을 나타내어 최근 각광을 받고 있다.

아직까지 알파-시누클레인 병증과 관련하여 산약의 효과에 관한 연구는 보고된 바 없다.

본 명세서에서는 산약 추출물의 알파-시누클레인 병증과 관련된 동물모델에서 신경 보호 효과를 측정하여 알파-시누클레인 병증 치료를 위한 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제안한다.

후술하는 실험예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 발명자들은 신경 보호활성을 갖는 산약(山藥: 마(Dioscorea batatas Dcne.) 또는 참마(Dioscorea japonica Thunb.)의 덩이뿌리를 말린 것) 추출물 및 이를 함유하는 약학적 제제가 알파-시누클레인의 증가를 유의성 있게 억제시키는 작용효과를 가지며, 산약의 복용이 serping1의 증가를 억제하므로써 알파-시누클레인의 발현을 억제하여 신경 보호효과를 타나내는 기전을 확인하였다.

또한, 발명자들은 MPTP 모델에서 itga7의 현저한 감소가 관찰되었는데, itga7의 감소가 알파-시누클레인의 발현 증가를 유도하는 것으로 보이며, itga7의 감소를 억제하는 산약추출은 itga7을 조절하여 알파-시누클레인 병증에 효과를 나타내는 것으로 관찰하였다.

이를 통하여 발명자들은 퇴행성 뇌질환에서 알파-시누클레인을 조절하여 신경 보호효과를 나타내는 예방 및 치료제로서 산약 및 산약 추출물을 사용할 수 있다는 것을 알게 되었다.

일 실시예는, 산약(山藥: 마 Dioscorea batatas Dcne. 또는 참마 Dioscorea japonica Thunb.의 덩이뿌리를 말린 것)을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 신경세포 보호활성을 갖는 산약 추출물을 제공한다.

구체적으로, 일 실시예는, 산약(山藥)을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물을 제공한다.

다른 실시예는 산약 추출물을 유효성분으로 함유하고, 여기에 약제학적으로 통상으로 사용되는 통상의 부형제를 혼합하여 통상의 방법으로 통상의 제제형태로 제형화한 신경세포 보호활성을 갖는 약학적 제제를 제공한다.

구체적으로, 다른 실시예는, 산약(山藥)을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물; 및 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 신경세포 보호활성을 갖는 치료제를 제공한다.

본 실시예들에 따르면, 약제학적 조성물 및 그 치료제는 신경세포 보호 효과를 제공한다.

본 실시예에 따르면, 약제학적 조성물 및 그 치료제는 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 명세서의 파킨슨병 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 명세서의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를더 함유할 수 있다.

본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물 및 그 치료제의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포, 패치제 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.

이하, 실험예를 기술함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명의 일 예시에 불과하며, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

이하 실험예에서 추출물을 추출하는데 사용하는 용매를 기재할 수 있으나, 통상적으로 추출물을 추출하는데 사용하는 다양한 용매들을 포함할 수 있다. 실험예에서 사용한 처리시약도 동일한 목적의 통상적인 처리시약으로 대체할 수 있다.

실험예: 약제학적 조성물

시누클레이노패티는 뉴런, 신경 섬유 또는 glial 세포에 알파-시누클레인 단백질 응집체가 비정상적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 신경 퇴행성 질환이다. 시누클레이노패티에는 파킨슨병 (PD), 루이 소체 치매 (DLB), 다 계통 위축 (MSA)의 세 가지 주요 유형이 있다. 다양한 neuroaxonal dystrophies와 같은 다른 희귀 한 장애들도 알파-시누클레인 병리를 가지고 있다. 시누클레이노패티는 때때로 알파-시누클레인과 tau 단백질 사이의 상호 작용 때문에 타우 질환(tauopathies)과 겹칠 수 있다.

씹는 것부터 배변까지, 알파-시누클레인 침착 물은 모든 수준의 위장 기능에 영향을 미치는데, 증상으로는 위 배출 지연과 같은 상부 위장관 기능 장애 또는 변비 및 장기간의 대변 통과 시간과 같은 하부 위장 기능 장애가 있다.

산약 [山藥]의 다른 이름은 서여, 산우, 옥연, 산저이다. 산약 [山藥]은 마과 식물인 마 Dioscorea batatas Dcne. 또는 참마 Dioscorea japonica Thunb.의 덩이뿌리를 그대로 또는 쪄서 말린 것으로 한약에서 많이 사용되어 졌으며, 식용으로도 많이 섭취되어 왔다. 산약의 주성분은 전분질이며, 단백질, 무기질, 비타민 C, B1 등의 영양성분을 함유하고, 뮤신(mucin)으로 인해 점성이 있다. 산약은 냄새가 없고, 맛은 달고 담백하여 비장기능의 허약으로 인한 권태감과 무력감, 식욕감소, 설사를 다스리며, 해수, 천식, 가래, 위장 장애 및 만성위염에도 효과가 있다. 산약은 항산화, 항염, 항암 작용 등 다양한 생리활성을 나타내어 최근 각광을 받고 있다.

아직까지 알파-시누클레인 병증과 관련하여 산약의 효과에 관한 연구는 보고된 바 없다. 본 연구에서는 산약 추출물의 알파-시누클레인 병증과 관련된 동물모델에서 신경 보호효과를 측정하여 알파-시누클레인 병증 치료를 위한 초석을 다지고자 하였다.

재료 및 방법

1. 약재

본 실험에 사용한 산약은 정도약업사 (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 잡질을 제거한 후 10배의 증류수에 담그어 2시간 동안 환류추출한 뒤 여과(Whatman No. 2)하였다. 여과액을 -60℃ 이하에서 얼려 동결건조 하였고 (FDU-550R; Eyela Co, Japan), -20℃에 보관 후 매 실험 시 용매에 녹여 사용하였다.

2. 시약

세포배양에 필요한 Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum(FBS), minimal essential medium (MEM), penicillin-streptomycin(P/S)은 Gibco사(Auckland, NZ)에서 구입하여 사용하였다. Folin-Ciocalteu's reagent, tannic acid, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), greiss reagent, 2,2-azinobis-3-ethyl- benzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), dimethyl sulfoxide (DMSO), paraformaldehyde (PFA), 3,3-diaminobenzidine (DAB), potassium persulfate는 Sigma-aldrich사(St Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. Rabbit anti-tyrosine hydroxylase (TH) affinity purified polyclonal antibody는 Chemicon사 (Temecula, USA), biotinylated anti-Rb antibody와 ABC standard kit은 Vector사(Burlingame, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.

3. 동물모델에서 약제 투여 방법

산약 추출물은 일일 60kg당 4돈(15g)을 기준으로 하여 한 마리(20~40g/30g)당 0.0075g을 먹이는 것으로 하였다. 이것을 % 농도(물 100g당 산약 추출물의 g)로 환산하면 산약 추출물은 0.024% 농도로 water bottle에 타주고 자유롭게 마시게 하였다.

4. 동물 실험군 분류

실험군은 다음과 같이 3 군으로 분류하여 각 군당 6마리로 진행하였다. : control군 (CTL), MPTP군 (MPTP, MPTP 주입, 20mg/kg, 4 times for 3days), MPTP_DB군 (MPTP_DB, MPTP 주입 20mg/kg 4 times for 3days, 산약 추출물 복용), 총 3그룹으로 분류하여 실험을 진행하였다.

5. 실험 설계

구입 후 실험실 환경적응을 위해 1주간 안정을 취하고 CTL군, MPTP군, MPTP_DB군의 마우스에 3일간 MPTP 20mg/kg을 2시간 간격으로 총 4회/일을 주사로 복강내 주입하였다. Control군을 제외한 나머지 그룹에서 처치 방법대로 약물을 식용수에 섞어 MPTP를 주사하는 날부터 7일간 섭취하도록 하였다. MPTP 최초 주입일을 기준으로 7일 후에 뇌를 적출하였다.

6. 조직 표본

각 군의 실험동물들은 마취제 (알팍산, 60mg/kg)를 복강주사하고, 모든 반응이 완전히 소실된 것을 확인한 후 50mM phosphate-buffered saline (PBS)으로 심장관류하여 뇌를 적출하고, 뇌의 substantia nigra (SN) 조직을 얻었다.

7. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

ST와 SN 조직을 20mM의 radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA)에서 얼음 위에서 30분 동안 균질화시켰다. 4℃에서 12000rpm으로 20분간 원심 분리한 후 12 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 같은 단백질 농도의 수용성 상층액을 분리한 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad, USA)으로 옮겼다.

막을 실온에서 1 시간 동안 0.1 % Tris 완충 식염수 (TBS, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)) 및 0.1 % Tween-20을 함유한 150 mM NaCl (TBST) 에 5 % 탈지유를 첨가한 용액으로 차단하고, mouse anti-tyrosine hyroxylase (TH, 1:2000, Santa Cruz Biotechnology), rabbit anti-alphal synyclein (1:500, Santa Cruz Biotechnology), 및 mouse anti-β-actin (1:5000, Santa Cruz Biotechnology) 항체와 함께 배양하였다.

0.1 % TBST로 세척 한 후, 막을 anti-mouse IgG- peroxidase antibody (1:2000, Bio-Rad)와 항온 배양하고, 항원 - 항체 복합체를 Pierce ECL western blotting substrate (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 현상하였다.

8. 세포배양

본 실험에 사용된 세포주는 human neuroblastoma인 SH-SY5Y 세포이며, 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 10% (v/v) FBS, 1% P/S을 포함하는 high-glucose DMEM 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

9. 세포 생존율(Cell viability) 측정

96 well plate에 2.0×10⁴/well의 SH-SY5Y 세포를 분주하고 48시간 후, 산약 추출물을 0, 1, 25, 50, 75 μg/mL 농도별 로 24 시간 동안 처리하였다. MPP+ 용액에 대한 세포 생존율을 측정하기 위하여 96 well plate에 2.0×10⁴/well의 SH-SY5Y 세포를 분주하고 48시간 후, 산약 추출물을 1, 25, 50, 75 μg/ml 농도로 처리하였다. 6시간 후 MPP+용액 500 mg/ml를 처리하여 18 시간 배양 후, 100 μl/ml의 EZCYTOX를 처리하여 3시간 배양 후, 스펙트로포토메터(spectrophotometer)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

10. 통계분석

통계분석의 측정값은 평균±표준오차 (mean±standard error)로 표기하였다. 통계방법은 student t-test 및 ANOVA를 시행했으며 유의수준은 p-value<0.05로 지정하였다.

결과

산약 추출물의 알파-시누클레인에 대한 신경 보호 효과를 측정하기 위하여 파킨슨병 동물모델의 substantia nigra(SN) 부위에서 알파-시누클레인(a-syn)의 발현 변화를 관찰하였다.

MPTP를 처리한 마우스의 SN 부위에서는 알파-시누클레인의 발현이 현저하게 증가하였으며, MPTP 처리와 함께 산약 추출물을 복용하도록 한 마우스그룹에서는 통계적으로 유의하게 알파-시누클레인의 증가가 억제되었다.

serping1의 발현을 살펴본 결과 MPTP를 처리한 마우스의 SN 부위에서는 serping1의 발현이 현저하게 증가하였으며, MPTP 처리와 함께 산약 추출물을 복용하도록 한 마우스그룹에서는 통계적으로 유의하게 serping1의 증가가 억제되었다.

serping1의 증가가 알파-시누클레인의 발현 증가와 연관이 있다는 연구결과에 근거하여, 산약 추출물의 복용이 serping1의 증가를 억제하므로써 알파-시누클레인의 발현을 억제하여 신경 보호 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 그리고 MPTP 그룹에서 itga7의 현저한 감소가 관찰되었는데, MPTP_DB 그룹에서는 itga7의 감소가 억제되어 신경 보호 효과를 나타냈다(도 1 참조).

도 1을 참조하면, Immunoblot 분석에 따르면 MPTP 그룹에서는 SN에서 알파-시누클레인(α-syn) 및 serping1 발현이 증가한 반면 MPTP_DB 그룹에서는 알파-시누클레인(α-syn) 및 serping1 발현 증가가 억제되었다. MPTP 그룹에서 감소한 itga7 발현의 감소는 MPTP_DB 그룹에서 억제되었다(도 1의 (a) 참조).

도 1의 (b)에서, 대조군의 100 %로 정규화된 MPTP와 비교하여 통계적으로 유의했다. CTL, 식염수 대조군; MPTP, MPTP만 처리됨; MPTP_DB, 산약 추출물 및 MPTP 처리. *p <0.05 및 **p <0.005 (CTL 대비) 및 #p <0.05 및 ## p <0.01 (MPTP 대비).

itga7과 알파-시누클레인의 관계를 살펴보기 위하여 SH-SY5Y세포주에 itga7의 siRNA를 처리하였다. siRNA를 통하여 itga7의 유전자 발현을 감소시켰을 때 알파-시누클레인의 발현 증가가 관찰되었다. 이를 통하여 itga7의 감소가 알파-시누클레인의 발현 증가를 유도하는 것으로 보이며, itga7의 감소를 억제하는 산약 추출물은 itga7을 조절하여 알파-시누클레인 병증에 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 2 참조).

도 2를 참조하면, SH-SY5Y 세포주를 ITGA7 siRNA (siITGA7)로 24 시간 동안 형질 감염시켰다. 음성 대조군 (NC)은 100 nM NC siRNA로 형질 감염되었고, 나머지는 10 및 100nM ITGA7 siRNA로 형질 감염되었다(도 2의 (a) 참조). 알파-시누클레인(α-syn) 수준은 10 및 100 nM siITGA7 처리 그룹에서 증가했다. 이들은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의했다(도 2의 (b) 참조). CTL, 식염수 대조군; 10, 10 nM ITGA7 siRNA 처리 군; 100, 100 nM ITGA7 siRNA 처리. *p <0.05 및 **p <0.01.

산약 추출물에 대한 신경 보호 효과를 측정하기 위하여 MPTP로 유도된 마우스모델의 substantia nigra(SN) 부위에서 타이로신 히드록실라아제(tyrosine hydroxylase)의 발현 변화를 관찰하였다. MPTP를 처리하여 병증을 유발한 마우스의 SN 부위에서는 TH의 발현이 현저하게 감소하였으며, MPTP 처리와 함께 산약 추출물을 복용하도록 한 마우스그룹에서는 통계적으로 유의하게 TH의 감소가 억제되었다 (도 3 참조).

도 3을 참조하면, 산약 추출물은 MPTP- 유도 파킨슨증 마우스 모델에서 도파민성 세포 발현의 감소를 억제하였다. Immunoblot 분석에 따르면 MPTP 그룹에서는 SN에서 TH 발현이 감소한 반면 산약 추출물 그룹에서는 TH 발현 감소가 억제되었다(도 3의 (a) 참조). 이는 대조군의 100 %로 정규화된 MPTP와 비교할 때 통계적으로 의미가 있다(도 3의 (b) 참조). CTL, 식염수 대조군; MPTP, MPTP 만 처리됨; MPTP_DB, 산약 추출물 및 MPTP 처리. *p <0.05(CTL과 비교) #p <0.05(MPTP와 비교).

도 4를 참조하면, 다양한 농도의 산약 추출물에서 세포 독성을 분석하였다. SH-SY5Y 세포주는 24 시간 동안 산약 추출물로 처리되었다.

산약 추출물에 대한 세포 생존율을 측정하기 위하여 SH-SY5Y 세포에 0, 1, 25, 50, and 75 μg/ml 농도의 약물을 처리한 결과 모든 농도에서 세포 생존율이 통계적으로 유의미한 차이가 없었다(도 4 참조 ). 이를 통하여 본 실험에서 적용한 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

MPP+ 용액에 대한 산약 추출물의 세포보호효과를 확인하기 위하여 0, 1, 25, 50, and 75 μg/ml 농도의 약물을 처리하고 6시간 후 MPP+ 용액을 처리하여 결과를 확인하였다. MPP+만을 처리한 그룹에만 대조군과 유의한 차이를 보였으며 (p<0.01), MPP+ 용액만을 처리한 그룹에 대하여 1, 50, 75 μg/ml의 산약 추출물을 처리한 그룹에서 유의한 차이를 보였다 (도 5 참조).

도 5를 참조하면, 다양한 농도의 산약 추출물에서 세포 독성을 분석하였다. SH-SY5Y 세포주는 24 시간 동안 산약 추출물로 처리되었고 18 시간 동안 500 μM MPP+로 처리되었다. **p<0.01(대조군 대비), #p<0.05(MPP+ 대비) 및 ##p <0.01(MPP+ 그룹 대비).

MPP+ 용액의 신경독성에 대한 산약 추출물의 신경 보호 효과를 관찰하기 위하여 SH-SY5Y세포에 MPP+를 처리하여 TH 발현을 확인하였다. 대조군에 비하여 MPP+만을 처리한 그룹에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (p<0.01). 산약 추출물 처리 그룹은 농도마다 차이는 있으나 MPP+ 용액만을 처리한 그룹과의 비교에서 50, 75 μg/ml의 농도에서 유의하게 TH의 발현 감소가 억제 되었다 (p<0.05, 도 6 참조).

도 6을 참조하면, 다양한 농도의 신약 추출물의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 알 수 있다. SH-SY5Y 세포주는 24 시간 동안 신약 추출물로 처리되었고, 18 시간 동안 500μM MPP+로 처리되었다(도 6의 (a) 참조). 이 값들은 평균 ± SEM으로 표시되었다(도 6의 (b) 참조). *p <0.01(대조군 대비) 및 #p <0.05(MPP+ 그룹 대비).

전술한 실험예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 발명자들은 신경 보호활성을 갖는 산약(山藥: 마(Dioscorea batatas Dcne.) 또는 참마(Dioscorea japonica Thunb.)의 덩이뿌리를 말린 것) 추출물 및 이를 함유하는 약학적 제제가 알파-시누클레인의 증가를 유의성 있게 억제시키는 작용효과를 가지며, 산약의 복용이 serping1의 증가를 억제하므로써 알파-시누클레인의 발현을 억제하여 신경 보호효과를 타나내는 기전을 확인하였다.

전술한 바와 같이, 발명자들은 산약 추출물의 알파-시누클레인 병증과 관련된 동물모델에서 신경 보호 효과를 측정하여 알파-시누클레인 병증 치료를 위한 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제안하였다.

일 실시예는, 산약을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 신경세포 보호활성을 갖는 산약 추출물을 제공한다. 위 실험예에서는 산약을 물로 추출하는 것을 예시적으로 설명하였으나 저급 알코올 또는 물과 저급 알코올의 혼합용매로 추출할 수도 있다.

구체적으로, 일 실시예는, 산약을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물을 제공한다. 이 약제학적 조성물은 단독으로 신경세포 보호를 위해 사용될 수도 있지만, 다른 담체와 함께 사용될 수도 있다.

이러한 실험예를 통해, 전술한 실시예에 따른 약제학적 조성물 및 그 치료제는 신경세포 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다.

이러한 실험예를 통해, 전술한 실시예에 따른 약제학적 조성물 및 그 치료제는 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환 치료 및 예방에 사용될 수 있는 것을 확인할 수 있다.

이상 도면을 참조하여 실시예들을 설명하였으나 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 상기 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

산약(山藥)을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물.
산약(山藥)을 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조된 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호활성을 갖는 약제학적 조성물; 및
상기 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 신경세포 보호활성을 갖는 치료제.
제 2항에 있어서, 상기 약제학적 치료제는 뇌졸중, 파킨슨 및 노인성치매와 같은 뇌질환 치료 및 예방에 사용되는 치료제.