KR102639090B1 - 뇌 신경세포 보호용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 오랫동안 식자재로 사용되어 오던 식품 소재 유래로 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있으면서, 뇌세포의 증식 및 신경발달에 우수한 효과를 나타내는 뇌 신경세포 보호용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 도라지 추출물과 함께 딸기 추출물과 감태 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경세포 손상에 의해 유발되는 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료/증상 개선용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 오랫동안 식자재로 사용되어 오던 식품 소재 유래로 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있으면서, 뇌세포의 증식 및 신경발달에 우수한 효과를 나타내는 뇌 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
현대사회에서 기하급수적으로 늘어나는 정보의 홍수 속에서 인지기능과 기억력은 청소년에서 노인에 이르기까지 중요한 관심의 대상이 되고 있다. 인지기능 장애란 기억력, 판단력, 언어능력, 계산능력, 감정조절능력 등에 이상이 생긴 것을 의미한다. 단순한 건망증과 같이 경미한 경우부터 정상범위를 벗어나지만 일상생활을 수행하는 능력은 보존되어 있는 경도인지장애, 대인관계, 직업기능 및 일상생활 기능에 현저한 지장이 초래되는 치매상태까지 그 단계가 다양하다. 다양한 치매 원인 질환들 중에서 가장 많은 것은 알츠하이머 병과 혈관성 치매이지만, 그 밖에도 루이체 치매, 전측두엽 퇴행, 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환들과 정상압 뇌수두증, 두부 외상, 뇌종양, 대사성 질환, 결핍성 질환, 중독성 질환, 감염성 질환 등 매우 다양한 원인 질환에 의해 치매가 발생할 수 있다.
우리나라 치매 환자 수는 약 62만명으로 2025년에는 100만명을 초과할 것으로 전망된다. 최근에는 노인 뿐 아니라 휴대전화나, PDA, 컴퓨터 등 다양한 디지털 기기에 의존한 나머지 기억력이나 계산능력과 같은 인지기능이 크게 감소한 디지털 치매가 젊은 사람들에게도 흔히 나타나고 있다. 이에 인지기능 장애는 환자 개인이나 가족에 한정되지 않고, 사회, 경제 전반에 걸쳐 중요한 문제로 대두되고 있다.
약물치료에 의한 치매 치료는 뇌에서의 아세틸콜린의 분해를 억제하여 아세틸콜린의 농도를 일정 수준으로 유지시키는 항-콜린에스터레이즈인 타크린이나 아리셉트와 같은 아세틸콜린 분해효소 저해제가 주로 사용되고 있다. 이들 약물은 약효는 어느 정도 인정되고 있으나, 장기간 고용량 투여 시 근육통, 위장 장애로 인한 메스꺼움, 구토, 설사 및 식욕부진과 함께 간 독성 등의 부작용이 크다는 문제점이 지적되고 있다. 이에 콜린 등의 아세틸콜린 전구체를 투여하여 아세틸콜린의 합성을 촉진시키는 대체 방안이 제시되었다. 그러나 이들 물질은 뇌혈관 관문을 통과하지 못하여 효과가 충분하지 못하다는 단점이 있다. 이에 부작용 없이 안전한 예방 및 치료가 가능한 식품 또는 생약 유래의 조성물에 관한 관심이 집중되고 있다.
이러한 노력의 일환으로 등록특허 제10-0495319호는 도라지 추출물, 특히 20년생 이상인 장생도라지의 추출물이 신경세포의 손상을 억제하고, 기억력을 증강시키는 효과가 있음을 게시하였다. 이의 응용으로 등록특허 제10-0520703호와 제10-1259421호는 각각 장생도라지 추출물을 함유하는 기능성 주류와 인지능을 향상시키는 분무건조된 도라지 추출물을 함유하는 도라지 양갱의 제조방법에 대해 게시하고 있다. 딸기는 비타민C의 함량이 레몬의 두배로 피로회복과 감기 예방에 효과적이며, 딸기의 펙틴과 라이코펜은 콜레스테롤 수치를 낮춰 혈관을 건강하게 해주고, 폴리페놀의 일종인 안토시아닌이 풍부하여 노화로 인한 각종 질병 예방에 도움을 준다. 특히 딸기에 함유된 피세틴(fisetin)이라는 성분은 쥐를 대상으로 한 연구 결과에서 인지능 저하와 뇌 염증을 억제하는 효과가 있어 알츠하이머를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있음이 보고되었다(J. Gerontology : Series A 73(3) 2018, 299-307). 등록번호 제10-2266229호에는 감태 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 조성물이 게시되어 있다.
그러나 도라지 추출물과 함께 상기 추출물을 혼합하여 사용하는 경우 인지기능 장애의 예방, 치료 또는 증상개선 효과가 현저하게 향상될 수 있다는 것은 아직 알려지 바 없으며, 본 발명자들은 상기 추출물들의 시너지 효과를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
J. Gerontology : Series A 73(3) 2018, 299-307
본 발명은 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있는 식품 소재 유래로서, 혼합 사용 시 단독 사용하는 경우에 비해 뇌 신경세포 보호 효능이 현저하게 우수한 뇌 신경세포 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 도라지 추출물과 함께 딸기 추출물과 감태 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경세포 손상에 의해 유발되는 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
도라지 추출물, 딸기 추출물 또는 감태 추출물은 단독으로 역시 뇌 신경세포에 대한 보호 효과를 나타내지만, 도라지 추출물과 함께 딸기 추출물 및/또는 감태 추출물을 혼합하여 처리하는 경우 동일 용량을 처리하는 경우에도 매우 현저한 뇌 신경세포 보호 효능을 나타내는 것을 시험관 내 실험에서 확인하였다. 뇌 신경손상 동물실험 모델에서는 뇌 신경세포의 증식과 신경발달이 대조군에 비해 단독 추출물 투여군에서 증가하였으며, 추출물 혼합물을 처리한 경우 단독 추출물 처리군에 비해 그 효과가 매우 우수하여 추출물의 혼합에 따른 시너지 효과가 있음을 보여주었다. 이러한 실험결과는 본 발명의 도라지 추출물과 함께 딸기 추출물과 감태 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물은 뇌 신경세포의 손상에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
뇌 신경세포의 손상에 의해 유발되는 질환은 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환을 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 건망증, 경도인지장애, 전측부엽 퇴행, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 허혈성 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 알콜성 뇌손상 또는 근위축성 측삭 경화증을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 뇌 신경세포의 손상과 관련된 질환이라면 어떤 것에도 적용될 수 있음은 당연하다.
본 발명에서, 상기 도라지 추출물, 딸기 추출물 및 감태 추출물 각각은 추출 대상인 도라지, 딸기, 감태의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리, 캘러스 중 하나 이상의 생물, 건조물, 또는 냉동물을 추출한 것으로, 추출은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명을 설명함에 있어서 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명은 오히려 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되어 그 상세한 설명을 생략하지만, 당업자라면 종래기술로부터 최적의 방법 및 조건을 선택하는 것은 용이할 것이다. 효율적인 추출을 위해서는 잘게 자르거나, 분쇄 또는 마쇄 후 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면, 추출은 별도의 용매를 사용하지 않는 착즙이나, 용매를 이용하는 방법으로 냉침, 열추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 용매를 사용하여 추출하는 경우, 상기 용매는 물 또는 C1~C4의 알콜 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 하기 실시예에서는 열수 추출물의 결과만을 예시하였으나, 이는 친수성 분획의 효능을 나타내는 것으로 이해되어야 하며 C1~C4의 알콜 또는 이들의 수용액을 사용하여 추출한 경우에도 물과 유사한 친수성 분획물이 얻어지는 것으로 유사한 효능을 나타낼 것임은 합리적으로 추론될 수 있다. 또한 각 추출물 중 유용성분을 더욱 농축하기 위하여 상기 추출물에 대한 추가의 분획을 실시할 수 있다. 본 발명의 추출물은 그 자체로 사용하거나, 농축하거나 혹은 건조하여 사용할 수 있다. 건조하는 경우, 건조방법 역시 분무건조, 열건조, 동결건조 등 통상의 방법을 사용할 수 있음은 당연하다.
본 발명의 상기 조성물은 도라지 추출물 100 중량부에 대하여, 딸기 추출물 50~200 중량부와 감태 추출물 50~200 중량부 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조성물 중 도라지 추출물에 첨가되는 성분으로 딸기 추출물을 첨가한 조성물과 감태 추출물을 첨가한 조성물은 유사한 정도의 뇌 신경세포 보호 활성을 나타내었으며, 상기 중량비의 혼합 조성물에서 시너지 효과가 현저하였다. 상기 범위를 벗어난 경우에도 뇌 신경세포 보호 활성을 나타내었으나, 추출물의 혼합에 의한 시너지 효과는 크지 않았다.
상기 범위에서 조성물의 혼합비는 활성에 큰 차이를 초래하지 않았으나, 용량 의존성을 나타내어 투여 용량이 증가할수록 뇌 신경세포 보호 활성이 증가하였다. 도라지 추출물에 딸기 추출물 또는 감태 추출물을 혼합한 것에 비해, 딸기 추출물 및 감태 추출물 모두를 혼합하는 경우 뇌 신경세포 보호 활성은 더욱 현저하게 증가하였으며, 역시 혼합물의 조성비는 상기 범위에서 뇌 신경세포 보호 활성에 큰 영향을 미치지 않았으나 용량에는 의존성을 나타내었다.
본 발명의 조성물은 뇌 신경세포 손상에 의해 유발되는 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제로 이용하기 위하여, 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제 등과 혼합하여 사용될 수 있다. 또한 단곡으로 사용될 수도 있으며, 종래 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료에 효능이 있는 것으로 알려진 공지의 화합물이나 천연 추출물과 병용으로 사용될 수도 있다. 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여용 제제로 제형화하여 약제로 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 제제의 형태, 환자의 연령, 성별 및 상태, 증상의 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 일반적인 투여량은 0.001 mg/kg·일 ~ 10 g/kg·일이다. 본 발명의 조성물은 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 도라지 추출물과 함께 딸기 추출물과 감태 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌 신경세포 보호용 식품 조성물에 관한 것이다. 뇌 신경세포의 보호는 뇌 신경세포의 손상을 억제함을 의미하며, 이는 곧 인지 능력의 개선을 가져오므로 본 발명의 "뇌 신경세포 보호용 식품 조성물"이라 함은 "인지능력 개선용 식품 조성물"로도 이해될 수 있다.
각 추출물에 대한 설명은 약학 조성물에서의 설명과 동일하게 적용될 수 있으므로, 반복적인 설명은 생략한다. 또한 본 발명의 뇌 신경세포 보호용 식품 조성물은 약학 조성물과 동일한 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 증상개선용 조성물로도 사용될 수 있음은 당연하다.
본 발명에서 상기 혼합 추출물은 본 발명의 식품 조성물에 바람직하게는 0.01~100 중량%로 첨가될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 면, 빵과 같은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 과자, 주류, 초콜릿, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
이상과 같이 본 발명의 조성물은 뇌세포 손상에 대한 현저한 보호 효능을 나타내므로, 뇌 신경세포 손상에 의해 유발되는 퇴행성 뇌질환이나 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 또는 증상개선에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 오랫동안 식품으로 사용되어 온 소재를 활용하여 단기 안전성 뿐 장기 안전성까지 검증되어 있어, 뇌 신경세포 보호를 위한 조성물로서 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
도 1은 각 추출물의 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프.
도 2는 시험관 내 실험에서 단독 추출물 및 혼합 추출물의 뇌 신경세포 보호 효능을 보여주는 그래프.
도 3 내지 도 5는 시험관 내 실험에서 추출물의 혼합비 및 용량에 따른 뇌 신경세포 보호 효능을 보여주는 그래프.
도 6은 동물실험 모델에서 추출물 투여에 따른 뇌 신경세포 증식을 보여주는 Ki-67 면역조직염색 이미지 및 정량 그래프.
도 7은 동물실험 모델에서 추출물 투여에 따른 뇌 신경발달을 보여주는 DCX 면역조직염색 이미지 및 정량 그래프.
도 2는 시험관 내 실험에서 단독 추출물 및 혼합 추출물의 뇌 신경세포 보호 효능을 보여주는 그래프.
도 3 내지 도 5는 시험관 내 실험에서 추출물의 혼합비 및 용량에 따른 뇌 신경세포 보호 효능을 보여주는 그래프.
도 6은 동물실험 모델에서 추출물 투여에 따른 뇌 신경세포 증식을 보여주는 Ki-67 면역조직염색 이미지 및 정량 그래프.
도 7은 동물실험 모델에서 추출물 투여에 따른 뇌 신경발달을 보여주는 DCX 면역조직염색 이미지 및 정량 그래프.
이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
실시예 1 : 추출물의 제조
1. 도라지 추출물의 제조
건조된 도라지를 분쇄한 시료 1 kg에 물 10 L를 넣고 30분간 환류 교반하였다. 추출물을 냉각하여 여과하고 여액을 약 200 mL 정도로 감압농축하였다. 이후 농축물을 냉장보관하며 하기 실시예에 사용하였다.
2. 딸기 추출물의 제조
건조된 도라지 대신 건조된 딸기를 사용한 것을 제외하고는 1과 동일한 방법에 의해 딸기 추출물을 제조하고, 냉장보관하며 하기 실시예에 사용하였다.
3. 감태 추출물의 제조
건조된 도라지 대신 건조된 감태를 사용한 것을 제외하고는 1과 동일한 방법에 의해 감태 추출물을 제조하고, 냉장보관하며 하기 실시예에 사용하였다.
실시예 2 : 세포독성 평가
세포독성을 측정하기 위해 96웰-플레이트에 HT22 세포를 5×103 cells/100μL의 농도로 분주하였다. HT22 세포는 한국세포주 은행으로부터 분양받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 과 1% penicillin과 streptomycn (P/S)이 첨가되어 있는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)을 시용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하여 사용하였다. 분주된 세포에 실시예 1에서 제조한 도라지, 딸기 또는 감태 추출물을 1, 10, 100 또는 1,000 ㎍/㎖의 농도로 가하여 24시간 처리한 후 MTS assay 방법을 이용하여, 세포생존율을 측정하였다.
도 1은 그 결과를 보여주는 것으로, 도라지, 딸기 및 감태 추출물 모두 1,000 ㎍/㎖의 농도까지 세포독성을 나타내지 않아 안전하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3 : 시험관 내 추출물의 뇌 신경세포 보호 활성 확인
1) 혼합 추출물의 뇌 신경보호 효능 평가
실시예 1에서 제조된 추출물 및 그 혼합물의 뇌신경 보호 효능을 in-vitro에서 확인하였다.
생쥐의 신경세포주인 HT22 세포는 10% 우태아혈청 및 100 units/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Media; WelGENE, Gyeongsan-si, Korea) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하였다. HT22 세포의 수를 계수하고, 96 마이크로웰 플레이트에 1×104 세포/웰의 농도로 분주하였다. 24시간 후 실시예 1에서 제조한 도라지 추출물이나 딸기 추출물, 감태 추출물 또는 이들을 동일 비율의 중량비로 혼합한 혼합물을 100 ㎍/mL의 농도로 1시간 동안 전처리하였다. 이후 Aβ25-35(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 10 μM 농도로 처리하고 24시간동안 추가로 배양하였다.
배양 후 세포생존율을 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) assay 방법에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 실시하였다. 490 nm에서의 흡광도는 multimode micoplate reader(Biotek Inc., Winooski, VT, USA)로 측정하였다. 하기 모든 실험은 3회 반복 실시하였다.
도 2는 그 결과를 나타낸 것으로, Aβ25-35를 처리하지 않은 정상군에서 도라지 추출물, 딸기 추출물, 감태 추출물이나 도라지 추출물과 딸기 추출물 및/또는 감태 추출물의 혼합물은 HT22 세포의 생존율에 큰 영향을 미치지 않았다. Aβ25-35는 신경세포주인 HT22 세포에 신경독성을 나타내어, 세포생존율이 정상군의 50% 수준으로 크게 감소하였다. 도라지 추출물, 딸기 추출물 또는 감태 추출물 각각을 처리하는 경우 세포생존율이 정상군의 60~65% 수준으로 다소 증가하여 각 추출물들이 Aβ25-35 매개 신경독성에 대한 보호 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 도라지 추출물과 딸기 추출물 또는 감태 추출물을 혼합한 혼합추출물은 Aβ25-35 매개 신경독성에 대한 신경 보호 효능이 현저하게 증가하여 동일 용량을 처리하였음에도 불구하고 세포생존율이 정상군의 약 85% 수준을 나타내었다. 더 나아가, 세가지 추출물을 1:1:1의 중량비로 혼합한 추출물은 뇌 신경보호 효과가 매우 우수하여, 정상군과 유사한 세포생존율을 나타내었다.
2) 혼합 추출물의 혼합비 및 용량에 따른 뇌 신경보호 효능 평가
추출물의 혼합비(중량비)와 처리 용량만을 달리하고, 상기 1)과 동일한 방법에 의해 아밀로이드-β 매개 신경독성에 대한 신경보호 효능을 평가하고 그 결과를 도 3 내지 도 5에 도시하였다. 도 3은 도라지 추출물과 딸기 추출물 또는 감태 추출물의 혼합비에 따른 신경보호 효능을 보여주는 그래프이며, 도 4의 a), b), c) 및 d)는 각각 도라지 추출물 : 딸기 추출물 : 감태 추출물의 중량비가 1:1:1, 2:1:1. 1:2:1 및 1:1:2인 혼합 추출물의 용량에 따른 뇌신경 보호 효능을 나타낸 것이다. 도 5는 도라지 추출물 : 딸기 추출물 : 감태 추출물의 중량비가 1:1:1, 2:1:1. 1:2:1 및 1:1:2인 혼합 추출물의 용량에 따른 뇌 신경보호 효능을 보여준다.
도 3은 도라지 추출물과 딸기 추출물은 1:1 ~ 2:1의 혼합비에서 모두 우수한 뇌 신경보호 효능을 나타냄을 보여주며, 도 4는 모든 혼합 조성물은 용량 의존적으로 뇌 신경보호 효능을 나타내었으며, 1 : 0.5~2 : 0.5~2의 중량비에서 모두 효과가 우수함을 확인할 수 있다. 반면 도라지 추출물 : 딸기 추출물 : 감태 추출물의 중량비가 10:1:1, 1:10:1 또는 1:1:10인 경우에는 뇌 신경보호 효능에 대해 추출물의 혼합에 의한 시너지 효과가 관측되지 않았다.
실시예 4 : 실험동물에서 추출물의 뇌 신경세포 보호 활성 확인
알츠하이머 병 동물 모델인 5XFAD 형질전환 마우스는 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. 실험동물은 표준식이(조단백질 22.1%이상, 조지방 8.0%이하, 조섬유 5.0%이하, 조회분 8.0%이하, 칼슘 0.6%이상, 인 0.4%이상, 삼양사 Co. Korea)와 물을 자유롭게 공급하면서 실험실 환경에 순화시킨 후 실험에 사용하였다.
순화 후 건강상태가 양호한 8주령 마우스를 선별하여 성별을 고려하여 각 군의 개체수가 20 마리가 되도록 실험군과 대조군으로 분류하였다. 실험군은 도라지 추출물 투여군이나 딸기 추출물 투여군, 감태 추출물 투여군, 도라지 추출물+딸기 추출물 1:1 중량비 혼합물 투여군, 도라지 추출물+딸기 추출물+감태 추출물 1:1:1 중량비 혼합물 투여군으로 나누었다. 각 실험군에 해당하는 추출물을 100 ㎍/kg·day의 용량으로 매일 1회씩 4주간 경구투여하였다. 대조군에는 동일한 용량으로 식염수를 경구투여하였다.
대뇌의 해마부위의 뇌세포 증식에 대한 추출물의 영향을 확인하기 위하여 Ki-67 및 DCX를 이용한 면역조직염색을 실시하였다. 펜토바르비탈 나트륨을 50 mg/kg의 용량으로 복강내 주사하여 마취시키고, 4%의 포름알데히드(paraformaldehyde (PFA) in 0.1M phosphatebuffer)로 심장관류 시켰다. 뇌를 적출하여 4% PFA에 담가 하룻밤 후고정(postfixation)시킨 후 한랭보호를 위하여 30% 수크로오스(sucrose in 0.05M Phosphate buffered saline(PBS))로 5일간 트랜스퍼(transfer)시켰다. 크라이오스태트에서 뇌조직을 30 μm 두께로 관상 절편으로 슬라이스하고, 사용 시까지 동결보호제(30% 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 30% 글리세린(glycerin), 0.05M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)) 내에서 4℃로 보관하며 사용하였다. 프리-플로팅 뇌 절편(free-floating brain section)을 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)에 노출시킨 후 1% H2O2(in PBS)로 quenching하고 블록킹 버퍼(5% normal chichen serum in PBS+0.3% Triton X-100)로 4℃에서 밤새 처리하였다. 이후 일차 항-Ki-67(1:200, Abcam) 및 항-doublecortin(DCX) (1:200, Santa Cruz) 항체와 함께 배양시켰다. PBS로 세척 후, 조직 절편을 biotinylated goat anti-rabbit(1:400, Vector) 및 rabbit anti-goat(1:400, Vector) 이차 항체와 배양시킨 후, 2시간 동안 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 복합체(avidin-biotin-peroxidase complex; Vectastain ABC Kit, Vector)와 배양시켰다. 단백질의 발현은 3,3-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 가시화시켰다. 면역반응은 Axio Vision 4.0 형광 현미경(Carl Xeiss, Upper Cohen, Germany)으로 관측하였다.
도 6과 도 7은 각각 Ki-67 및 DCX에 양성 면역반응을 나타내는 신경세포를 관측한 현미경 이미지 및 정량 결과를 보여주는 그래프이다. Ki-67은 세포주기 중에서 G1기를 제외한 모든 주기에서 세포의 핵에 발현하는 단백질로 세포의 증식상태를 나타내주는 표지자이며, DCX는 신경이 이동하고 분화하여 피질화를 형성하는 과정에서 뇌에서 발현되는 단백질로 신경발달의 지표가 된다.
도 6에서 단일성분 추출물 투여군은 정상군에 비해 약 2배 정도 Ki-67 양성 세포가 검출되어 각각의 추출물이 신경세포 증식을 촉진하는 것을 시사하였다. 도라지와 딸기 혼합 추출물은 대조군의 약 2.5배, 도라지, 딸기 및 감태 혼합 추출물은 대조군의 약 3배의 Ki-67 양성 세포가 검출되어 추출물의 혼합에 따라 신경세포 증식에 대한 시너지 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 7의 DCX 양성 세포에 대한 결과 역시 도 6과 유사한 추이를 나타내었으나, 도 6에 비해서 추출물의 혼합에 의한 시너지 효과가 더욱 현저하였다.
Claims (8)
- 도라지 추출물 100 중량부에 대해 딸기 추출물 50~200 중량부와 감태 추출물 50~200 중량부 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌 신경세포 손상에 의해 유발되는 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 청구항 1 에 있어서,
상기 도라지 추출물, 딸기 추출물 및 감태 추출물은 각각,
물 또는 C1~C4의 알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환은 건망증, 경도인지장애, 전측부엽 퇴행, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 허혈성 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 알콜성 뇌손상 또는 근위축성 측삭 경화증인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 도라지 추출물 100 중량부에 대해 딸기 추출물 50~200 중량부와 감태 추출물 50~200 중량부 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌 신경세포 보호용 식품 조성물.
- 삭제
- 청구항 5에 있어서,
상기 도라지 추출물, 딸기 추출물 및 감태 추출물은 각각,
물 또는 C1~C4의 알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 뇌 신경세포 보호용 식품 조성물.
- 청구항 5의 뇌 신경세포 보호용 식품 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 또는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 증상개선용 식품 조성물.
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