KR20180117259A

KR20180117259A - 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR20180117259A
Application number: KR1020170050014A
Authority: KR
Inventors: 장미경; 박성철; 김영민; 김은지
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2018-10-29
Also published as: KR101957014B1

Abstract

본 발명은 항염증 활성을 가지는 알파-헬리컬 펩타이드 및 이를 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 알파-헬리컬 구조를 기반으로 양이온 아미노산으로 라이신과 아르기닌을 사용하고 이소류신과 트립토판을 소수성 아미노산으로 사용하여 친수성과 소수성이 서로 다른면에 존재하는 양친화성 구조로 합성한 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 새로운 항균 활성 펩타이드, 서열번호 10으로 기재되는 양이온 아미노산으로 라이신과 아르기닌을 사용하고 이소류신과 트립토판을 소수성 아미노산으로 사용하며 음이온 아미노산인 글루탐산을 포함하여 친수성과 소수성이 서로 다른면에 존재하는 양친화성 구조로 합성한 새로운 항균 활성 펩타이드 및 이를 함유하는 항염증용 약학적 조성물, 화장료 첨가제 조성물 및 식품 첨가제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항염증 활성 펩타이드는 세포독성이 없고 탁월한 항염증 활성을 나타내므로 인체에 안전한 항염증용 의약품, 화장품 또는 식품방부제의 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항염증 활성을 나타내는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물{Peptides having anti-inflammatory activity and composition the same for anti-inflammatory}

본 발명은 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 외부 감염원이 침입된 세포 내 일산화질소(NO) 및 종양괴사인자-α(TNF-α)의 생성을 저해하는 항염증 효과를 나타내며 세포독성이 없고 생체이용 효율이 매우 우수한 항염증 활성 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

최근 경제 발전에 따른 의료기술의 발달 및 평균수명의 연장으로 고령자 비율이 계속하여 증가하고 있으며, 환경오염 및 스트레스 증가에 따른 면역계 이상으로 염증반응의 만성화가 진행되어 아토피, 천식 등의 만성 염증성 질환이 증가하고 있는 추세이다(Chang et al., 1994, Korean J. Gastroentrol., 26:907-918.; Heinzemann and Daser, 2002, Int. Arch. Allergy Immunol. 127:170-180.; Song et al., 1998, Korean J. Intern. Med., 55:158-168.; Sung et al., 2012, J. Ethnopharmacol. 144:94-100.).

일반적으로 염증반응은 세균감염과 같은 외부자극이나 생체 내 대사산물과 같은 내부자극에 대한 생체조직의 방어기전으로 세포 내 다양한 염증조절인자들인 TNF-α, IL-1β, IL-6 등과 같은 여러 사이토카인(cytokine) 및 산화질소(nitric oxide, NO)가 생성되면서 발생한다. 또한, 내독소로 알려진 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)는 그람 음성균의 세포 외막에 존재하여, 대식세포 또는 단핵세포에서 세포내 전사요소인 NF-κB(nuclear facter-κB)의 활성화를 유도함으로써 염증성 사이토카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2)의 유전자 발현을 유도하며 염증 매개물질을 생성한다.

따라서, 염증반응의 조절을 위해서는 iNOS, COX-2, 또는 NF-κB의 발현, 및 사이토카인과 산화질소의 분비를 조절하는 것이 핵심요소이며, 이와 같은 인자들의 활성을 조절하는 물질이 염증질환의 예방 및 치료제로서 주목받고 있다(Kim et al., 2013b, J. Korean Med. Ophthalmol. Otolaryngol. Dermatol., 26:54-64.)

현재 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드 계통인 플루페나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등; 스테로이드 계통으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone), 하이드로코티손(hydrocortisone), 베타메타손(betamethasone) 등이 있으나, 이들 물질은 독성이 강하며, 간 손상, 암, 뇌졸중과 같은 여러 심각한 부작용을 초래하여 사용시 제한이 따른다. 또한, 염증 원인 물질에 선택적으로 작용하지 못하여 심한 면역억제를 유발하는 문제가 생기는 경우도 있다. 이에 생체에 안전하고, 종래 의약품에 비해 장기간 섭취가 용이한 장점을 가지고 있는 천연물을 이용한 염증 치료제의 개발이 이루어지고 있으나, 천연물로부터 추출한 항염증 물질의 경우 효능을 나타내는 유효농도가 약하고, 농경지 등에서 재배하여야 하므로 생산비용이 많이 소요되는 등의 문제가 있다.

상기와 같은 문제점을 개선하기 위해 기존의 화학적 염증 치료제 또는 천연물을 이용한 염증 치료제의 대안으로 새로운 개념의 항염증제가 개발되고 있으며, 특히 항염증 활성을 가지는 항염증 활성을 가지는 펩타이드의 합성에 많은 연구가 이루어지고 있다.

그러나, 합성된 펩타이드는 시험관내 실험에서 아주 좋은 항염증 활성을 가지고 세포독성을 나타내지 않지만, 실제로 생체내(in vivo) 실험에서는 항염증 효과가 미미한 경우가 많다. 이는 여러 가지 이유가 있지만, 주로 생체내의 생리 및 해부학적 조건이 시험관내에서의 실험 조건과 많이 다르기 때문이다. 첫째, 생리조건인 염(salt)이 존재하면 양전하가 낮은 펩타이드는 활성이 현저히 저해된다. 둘째, 펩타이드는 작은 분자량과 사이즈를 가지기 때문에 신장에서 거의 흡수되어 체외로 배출된다. 셋째, 생체내의 모든 조직이나 세포, 체액 및 혈액 등에 존재하는 단백질 및 펩타이드 분해효소(protease 및 peptidase)에 의해 쉽게 잘려서 활성을 잃어버린다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제를 해결하면서 우수한 항염증 활성을 나타내는 물질에 대한 연구를 계속 진행하던 중, 일반적인 아미노산 잔기 10~14개만을 사용하여 경제적인 대량생산이 가능한 펩타이드를 개발하였으며, 상기 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으며, 우수한 항염증 활성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 세포독성이 없고 우수한 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 항염증 활성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 항염증용 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항염증”은 염증을 예방, 치료 또는 개선하는 것을 의미한다. 여기서, 상기 염증은 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질 등)에 의한 감염, 상처, 수술, 화상, 동상, 전기자극 또는 화학물질 등에 의하여 유발되는 질환을 말하며, 상기 질환으로는 피부염, 염증성 장질환, 위궤양, 대장염, 방광염, 비염, 편도염 또는 천식 등이 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 항염증 활성 펩타이드는 알파-헬리칼 구조를 가지는 펩타이드로서, 친수성 서열을 양이온 아미노산인 라이신(Lysine, K) 또는 아르기닌(Arginine, R)으로 적용하고, 소수성 서열을 소수성 아미노산인 이소류신(Isoleucine) 또는 트립토판(tryptophan)을 적용하여 10개 또는 14개의 아미노산을 가지는 양쪽성 (amphipathic) 펩타이드이다.

또한, 본 발명의 항염증 펩타이드는 알파-헬리칼 구조를 가지는 펩타이드로서, 친수성 서열을 양이온 아미노산인 라이신(Lysine, K) 또는 아르기닌(Arginine, R)으로 적용하고, 소수성 서열을 소수성 아미노산인 이소류신(Isoleucine) 또는 트립토판(tryptophan)을 적용하며, 음이온 아미노산인 글루탐산(Glutamic acid)이 포함된 14개의 아미노산을 가지는 양쪽성 (amphipathic) 펩타이드이다.

구체적인 양태로서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 기재된 아미노산 서열을 가지며, 이들을 "KIW-10(서열번호 1), KWI-10(서열번호 2), WIK-10(서열번호 3), RIW-10(서열번호 4), RWI-10(서열번호 5), WIR-10(서열번호 6), KIW-14(서열번호 7), KWI-14(서열번호 8), WIK-14(서열번호 9) 및 WIKE-14(서열번호 10) 펩타이드"로 명명하였다. 이들 펩타이드의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

펩타이드	서열
KIW-10(서열번호1)	KKIIKKIWKW
KWI-10(서열번호 2)	KKIWKKWIKI
WIK-10(서열번호 3)	WIKKIWKKIK
RIW-10(서열번호 4)	RRIIRRIWRW
RWI-10(서열번호 5)	RRIWRRWIRI
WIR-10(서열번호 6)	WIRRIWRRIR
KIW-14(서열번호 7)	KKIIKKIIKKIWKW
KWI-14(서열번호 8)	KKIWKKWIKKIIKI
WIK-14(서열번호 9)	WIKKIWKKIIKKIK
WIKE-14(서열번호 10)	WIKKIWKKIIKEIK

본 발명의 항염증 활성 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으며, 외부 감염원이 침입된 세포 내 일산화질소(NO) 및 염증조절인자인 TNF-α의 생성을 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 상기 항염증 활성 펩타이드는 염증을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 본 발명에는 상기 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 85% 이상의 상동성을 가지면서 동일한 효과를 나타내는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 모두 포함될 수 있다. 본 발명에 개시된 항염증 활성 펩타이드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 그 단편들과 1개 또는 2개의 아미노산이 변화된 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "상동성(homology)"및 "서열 상동성(sequence identity)"라 함은 상호변환가능하게 사용되었으며, 이는 2개의 아미노산 (또는 비슷한 것으로 핵산) 사이에서 서열의 오버랩 정도를 나타낸다.

구체적으로, 본 발명에서는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에서 각각의 아미노산을 구조가 유사한 다른 아미노산으로 치환하거나, 아미노 말단의 아미노기 또는 카르복시 말단의 카르복실기를 다른 기능기로 치환시킨 항염증 활성 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성된 펩타이드 중 이소류신 또는 트립토판을 다른 소수성 아미노산으로 치환한 펩타이드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드와 마찬가지로 세포독성이 없으며 우수한 항염증 활성을 유지할 수 있다. 이때 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열 중 이소류신 대신 치환될 수 있는 소수성 아미노산으로는 트립토판, 알라닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 류신이 있으며, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열 중 트립토판 대신 치환될 수 있는 소수성 아미노산으로는 이소류신, 알라닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 발린 및 류신이 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 상기 85% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은 하기 서열인 가지는 것을 특징으로 한다.

(i) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열 중 이소류신이 알라닌, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 프롤린, 발린 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열;

(ii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열 중 트립토판이 알라닌, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열; 또는

(iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열 중 이소류신이 알라닌, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 프롤린, 발린 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 소수성 아미노산으로 치환되고, 동시에 트립토판이 알라닌, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열.

본 발명에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 22개의 표준 아미노산들뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 상기 항염증 활성 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 상기 항염증 활성 펩타이드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성)를 포함한다. 또한, 펩타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.

본 발명의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드는 생리적 염의 존재 하에서도 활성을 잃지 않고 높은 항염증효과를 나타내며, 인간세포에 대해서는 독성이 없으며 강력한 항염증력을 나타낼 뿐만 아니라 생체이용 효율이 매우 우수하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명에서는 상기 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “치료” 및 “개선”은 개체에서 염증 질환의 (a) 발전의 억제 (b) 경감 및 (c) 제거를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “개체”는 본 발명의 상기 항염증용 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫드, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

상기 항염증용 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드와 함께 항염증 효과를 갖는 유효성분을 추가로 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 항염증용 조성물에 유효성분으로 포함하는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드는 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 항염증 활성 펩타이드의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우 항염증 효과가 미약하고, 50 중량%를 초과하는 경우 함량 증가에 따른 효과 증가가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제가 있다.

하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 상기 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 염증을 예방 또는 치료할 수 있는데, 치료방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물 내에 다양한 경로로 투여하는 것을 포함한다. 상기 투여방법은 모든 방식으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 도포에 의한 국부 투여 등으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증을 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드(예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진) 등과 같은 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 향미제를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로써 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드는 외부 감염원이 침입된 세포 내 일산화질소(NO) 및 TNF-α의 생성을 저해하는 항염증 효과를 나타내며, 세포독성이 없는 무해할 뿐만아니라 생체이용 효율이 매우 우수한 물질이므로 염증을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

도 1은 아르기닌, 라이신, 또는 글루탐산을 친수성 아미노산으로 이소류신과 트립토판을 소수성 아미노산으로하여 헬리컬 휠 다이어그램(Helical wheel diagram)을 토대로 α-헬리컬(α-helical) 구조의 항염증 활성 펩타이드를 설계한 도해를 나타낸 것이다.
도 2는 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에서 항염증 활성 펩타이드에 의한 일산화질소(NO)의 생성량을 측정한 그래프이다.
도 3은 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에서 항염증 활성 펩타이드에 의한 종양괴사인자-α(TNF-α)의 생성량을 측정한 그래프이다.
도 4는 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에서 항염증 활성 펩타이드에 의한 하우스키핑 유전자(Housekeeping Gene)인 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 사이토카인인 인터류킨 6(Interleukin 6, IL-6) 및 종양괴사인자-α(TNF-α)의 mRNA 생성양을 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행한 결과이다.
도 5는 형광염색물질인 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC)가 부착된 지질 다당류(LPS)와 항염증 활성 펩타이드로 자극된 대식세포(RAW 264.7)를 유세포분석기로 측정한 결과이다.
도 6는 형광염색물질인 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC)가 부착된 지질 다당류(LPS)와 항염증 활성 펩타이드로 자극된 대식세포(RAW 264.7)를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 항염증 활성 펩타이드의 마우스 적혈구 파괴능(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 항염증 활성 펩타이드의 마우스 피부섬유아세포(NIH3T3)에 대한 세포독성 실험결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 제재예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 제재예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제재예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 펩타이드 유도체의 제조

양이온 아미노산으로 라이신 또는 아르기닌을 사용하고 소수성 아미노산으로 이소류신 또는 트립토판을 사용하여, 친수성과 소수성이 서로 다른면에 존재하는 양친화성 알파 헬릭스(α-helix) 구조를 나타내며 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드를 제조하였다.

양이온 아미노산으로 라이신 또는 아르기닌, 소수성 아미노산으로 이소류신 또는 트립토판을 사용하고, 음이온 아미노산인 글루탐산(Glutamic acid) 사용한 친수성과 소수성이 서로 다른 면에 존재하는 양친화성 알파 헬릭스(α-helix) 구조를 나타내며 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드를 제조하였다.

상기 제조된 항염증 활성 펩타이드를 각각 KIW-10(서열번호 1), KWI-10(서열번호 2), WIK-10(서열번호 3), RIW-10(서열번호 4), RWI-10(서열번호 5), WIR-10(서열번호 6), KIW-14(서열번호 7), KWI-14(서열번호 8), WIK-14(서열번호 9) 또는 WIKE-14(서열번호 10) 펩타이드로 명명하였다.

상기 항염증 활성 펩타이드는 마이크로웨이브(microwave) 펩타이드 합성기(CEM Co., Matthews, NC)를 사용하여 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 고체상 방법으로 합성하였다.

구체적으로, 링크 아미드 4-MBHA-레진(Rink Amide 4-methylbenzhydrylamine Resin; Novagiochem, 0.55 mmol/g)을 사용하여 아미드화된 펩타이드를 합성하였다. 그 후 상기 이미드화된 펩타이드를 에테르로 침전 추출하여 상기 수지로부터 절단하여 크루드(crude)한 형태의 펩타이드를 얻었다. 상기 크루드한 형태의 펩타이드를 0.1% 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid)에 녹인 0~60% 아세토니트릴을 그레이언트(gradient)로 하여 zorbax C18 컬럼(21.2 X 250 mm, 300Å, 7-μm)으로 정제하였다. 정제된 펩타이드는 Shimadzu analytical HPLC 시스템을 이용하여 순도를 측정하고, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 펩타이드의 분자량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

펩타이드	서열	분자량
KIW-10(서열번호1)	KKIIKKIWKW	1369.8
KWI-10(서열번호 2)	KKIWKKWIKI	1369.8
WIK-10(서열번호 3)	WIKKIWKKIK	1369.8
RIW-10(서열번호 4)	RRIIRRIWRW	1509.9
RWI-10(서열번호 5)	RRIWRRWIRI	1509.9
WIR-10(서열번호 6)	WIRRIWRRIR	1509.9
KIW-14(서열번호 7)	KKIIKKIIKKIWKW	1852.5
KWI-14(서열번호 8)	KKIWKKWIKKIIKI	1852.5
WIK-14(서열번호 9)	WIKKIWKKIIKKIK	1852.5
WIKE-14(서열번호 10)	WIKKIWKKIIKEIK	1740.2

상기 표 2에 나타낸 아미노산 서열과 같은 95% 이상의 순도를 가진 항염증 활성 펩타이드를 합성하였다. 측정된 분자량은 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하였으며, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드가 정확히 합성되었음을 확인할 수 있었다.

시험예 1: 항염증 활성 펩타이드의 일산화질소와 TNF-α 생성 억제 활성 측정

상기 실시예 1에서 제조된 항염증 활성 펩타이드(서열번호 1 내지 10)의 항염증 활성을 측정하기 위해 일산화질소와 TNF-α 생성 억제 활성을 측정하였다.

한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받은 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 10% FBS(fetal bovine serum; Gibco, USA)가 함유된 RPMI-1640 배지에서 배양한 다음, 24-웰 플레이트에 1X10⁶ cells/mL이 되도록 분주하여 37℃, 5% 농도의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 각 웰에 LPS(Lipopolysaccaride)를 각각 1 μg/mL씩 처리하고 1시간 이후에 상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드를 4, 8, 16 및 32 μM로 각각 희석한 후 추가 첨가하여 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 세포 배양물로부터 수집한 상등액 내 일산화질소(nitrite, NO)와 TNF-α 수치를 R&D 시스템(minneapolis, MN)의 그리스 시약(griess reagent)과 Quantikine 마우스 키트를 사용하여 각각 측정하였다.

대조군(control)으로는 Hn-Mc 펩타이드와 LPS를 처리하지 않은 대식세포(RAW 264.7)를 사용하였다. 양성 대조군으로는 LPS만을 처리한 대식세포를(RAW 264.7) 사용하였고, 음성 대조군으로는 LPS를 처리하고 폴리마이신 B(polymycin B)를 처리한 대식세포를(RAW 264.7) 사용하였다.

상기 실험에서 얻은 결과는 평균치±표준오차(mean±S.E.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균차이는 Student’s t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 그 결과를 도 2(일산화질소(NO)의 생성량) 및 도 3(TNF-α의 생성량)에 나타내었다.

도 2 및 3에 나타난 바와 같이, 실험결과 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드는 LPS로 활성화된 대식세포에서 농도 의존적으로 일산화질소와 TNF-α의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 특히 32μM의 KIW-14(서열번호 7), KWI-14(서열번호 8), WIK-14(서열번호 9) 및 WIKE-14(서열번호 10) 펩타이드는 거의 음성 대조군(polymycin B)만큼 일산화질소와 TNF-α의 생성을 억제함을 확인하였다.

시험예 2: 항염증 활성 펩타이드에 의한 사이토카인 유전자(cytokines Gene)의 mRNA 생성량 측정

상기 실시예 1에서 제조된 항염증 활성 펩타이드의 항염증 활성을 측정하기 위해 사이토카인 유전자(cytokines Gene)의 mRNA 생성량을 측정하였다.

본 시험예 2에서는 상기 시험예 1에서 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 유사한 결과를 나타내는 것으로 관찰되어 서열번호 1, 3, 4, 6, 7, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 대상으로 시험을 실시하였다.

한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받은 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 10% FBS(fetal bovine serum; Gibco, USA)가 함유된 RPMI-1640 배지에서 배양한 다음, 6-웰 플레이트에 5X10⁶ cells/mL이 되도록 분주하여 37℃, 5% 농도의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하고, 각 웰에 LPS(Lipopolysaccaride)를 각각 1 μg/mL씩 처리하고 1시간 이후에 각각의 32 μM 펩타이드를 추가로 첨가하고 8시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 수집하여 TRIzol시약으로 total RNA를 분리하여 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 프라이머(primer)로 5’-GCATCTTCTTGTGCAGTGCC-3’(서열번호 11)와 5’-TCACACCCATCACAAACATG-3’(서열번호 12)를, 사이토카인인 IL-6의 프라이머로 5’-CACAAGTCCGGAGAGGAGAC-3’(서열번호 13)와 5’-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3’(서열번호 14)를 TNF-α의 프라이머로 5’-CGCAGCAGCACATCAACAAGAGC-3’(서열번호 15)와 5’-TGTCCTCATCCTGGAAGGTCCACG-3’(서열번호 16)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행한 다음 mRNA 생성양을 아가로스(agarose) 젤로 전기영동하여 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 실험결과 서열번호 1, 3, 4, 6, 7, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드는 LPS로 활성화된 대식세포에서 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 생성을 대조군(control)과 같은 수준으로 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 펩타이드는 항염증 활성을 가짐을 알 수 있었다.

시험예 3: 항염증 활성 펩타이드의 기작

상기 실시예 1에서 제조된 항염증 활성 펩타이드의 기작을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 실시하였다.

본 시험예 3에서는 상기 시험예 1에서 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 유사한 결과를 나타내는 것으로 관찰되어 서열번호 1, 3, 4, 6, 7, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 대상으로 시험을 실시하였다.

한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받은 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 10 % FBS(fetal bovine serum; Gibco, USA)가 함유된 RPMI-1640 배지에서 배양한 다음, 24-웰 플레이트에 1X10⁶ cells/mL이 되도록 분주하여 37℃, 5% 농도의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 각 웰에 FITC가 부착된 LPS(Lipopolysaccaride)를 각각 1 μg/mL씩 처리하고 1시간 이후에 상기 실시예 1에서 제조한 항염증 활성 펩타이드를 16 또는 32 μM로 희석하여 추가 첨가하여 8시간 동안 배양하였다. 그 이후 세포를 수집하여 유세포 분석기 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS)와 형광현미경으로 FITC가 부착된 LPS가 세포에 부착된 양을 확인하였다. 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.

도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 실험결과 서열번호 1, 3, 4, 6, 7, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드가 처리된 세포에서 FITC-labeled LPS의 형광이 음성대조군(polymycin B)과 같은 수준으로 나타났고 본 발명의 항염증 활성 펩타이드는 LPS에 직접적으로 결합하여 LPS가 LPS-binding protein (LBP)과 결합하는 것을 방해함으로써 LPS/LBP결합체의 면역세포 표면의 톨유사 수용체(Toll-like receptor)로 신호전달을 하지 못하게 하여 항염증 활성을 나타냄을 확인하였다.

시험예 4: 항염증 활성 펩타이드의 세포 독성 측정

상기 실시예 1에서 제조한 항염증 활성 펩타이드(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 다음과 같이 적혈구 파괴능과 정상세포에 대한 독성 여부를 측정하였다.

4-1. 항염증 활성 펩타이드의 적혈구 용혈 활성

사람의 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 1/2의 농도로 실시예 1에서 제조된 항염증 활성 펩타이드를 각각 연속적으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여, 0.1% 트리톤 X-100을 사람의 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였고, 0.1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 항염증 활성 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

상기 식에서,

흡광도 A는 414 nm 파장에서 항염증 활성 펩타이드 용액 처리군의 흡광도이고,

흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS만 처리한 군의 흡광도이고,

흡광도 C는 414 nm 파장에서 0.1% 트리톤 X-100의 처리군의 흡광도를 나타낸다.

도 7에 나타난 바와 같이, 용혈현상이 KIW-14(서열번호 7) 펩타이드는 200 μM에서 8.29%, KWI-14(서열번호 8) 펩타이드는 200 μM에서 6.84%, WIK-14(서열번호 9) 펩타이드는 200 μM에서 16.17%로 나타났고, KIW-10(서열번호 1), KWI-10(서열번호 2), WIK-10(서열번호 3), RIW-10(서열번호 4), RWI-10(서열번호 5), WIR-10(서열번호 6) 및 WIKE-14(서열번호 10) 펩타이드는 200 μM에서 거의 용혈현상을 나타내지 않았다.

이로부터 상기 실시예 1에서 제조한 항염증 활성 펩타이드(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)는 적혈구 용혈현상을 거의 유발하지 않는 안정한 펩타이드임을 확인할 수 있었다.

4-2. 항염증 활성 펩타이드의 세포 독성 측정

마우스 섬유아세포주(NIH3T3)에 펩타이드를 처리한 후 MTT assay를 수행하였다. NIH3T3 세포주(10,000 cells/well)를 96-웰 플레이트에서 10% FBS를 포함한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)을 이용하여 5% CO₂ 존재하에서 16시간 동안 배양하고, 이들 세포에 실시예 1에서 제조된 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드를 각각 처리하고 36시간 추가 배양한 다음, MTT assay를 통해 발색시키고 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 정도를 확인하였다. 이때 세포생존율(Survival (%))은 하기 수학식 2로 결정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 식에서,

흡광도 A는 570 nm 파장에서 항염증 활성 펩타이드 용액을 처리군의 흡광도이고,

흡광도 B는 570 nm 파장에서 항염증 활성 펩타이드 용액을 처리하지 않은 군의 흡광도이고,

흡광도 C는 570 nm 파장에서 0.1% 트리톤 X-100을 처리한 군의 흡광도를 나타낸다.

도 8에 나타난 바와 같이, NIH3T3 세포의 생존률이 KIW-14(서열번호 7) 펩타이드는 100 μM에서 91.42%, KWI-14(서열번호 8) 펩타이드는 100 μM에서 92.59%, WIK-14 펩타이드는 100 μM에서 85.06%(서열번호 9)로 나타났고, KIW-10(서열번호 1), KWI-10(서열번호 2), WIK-10(서열번호 3), RIW-10(서열번호 4), RWI-10(서열번호 5), WIR-10(서열번호 6) 및 WIKE-14(서열번호 10) 펩타이드는 100 μM에서 100%로 나타났다. 본 발명의 펩타이드는 100 μM 농도에서 85% 이상의 생존률을 보임으로써 세포독성이 거의 없음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 실시예 1에서 제조된 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드는 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항염제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 액제의 제조

서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

1-2. 산제의 제조

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-3. 주사제의 제조

서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2874 mg

Na₂HPO₄·2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 mL) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-4. 정제의 제조

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-5. 캡슐제의 제조

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 2. 화장료 조성물의 제조예

2-1. 유연화장수(스킨로션)의 제조

서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 0.25 중량%

글리세린 1.0 중량%

부틸렌글리콜 2.0 중량%

프로필렌글리콜 2.0 중량%

카르복시비닐폴리머 0.1 중량%

피이지-12 노닐페닐에테르 0.2 중량%

폴리솔베이트 80 0.4 중량%

에탄올 10.0 중량%

트리에탄올아민 0.1 중량%

방부제, 색소, 향료 적량

정제수 잔량(총량이 100 중량%가 되도록 하는 양)

통상의 유연화장수 제조방법에 따라 각각 포함시켜 제조한다.

2-2. 영양화장수(밀크로션)의 제조

서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 0.5 중량%

밀납 4.0 중량%

폴리솔베이트 60 1.5 중량%

솔비탄세스퀴올레이트 1.5 중량%

유동파라핀 0.5 중량%

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 중량%

글리세린 3.0 중량%

부틸렌글리콜 3.0 중량%

프로필렌글리콜 3.0 중량%

카르복시비닐폴리머 0.1 중량%

트리에탄올아민 0.2 중량%

방부제, 색소, 향료 적량

정제수 잔량(총량이 100 중량%가 되도록 하는 양)

통상의 영양화장수 제조방법에 따라 각각 포함시켜 제조한다.

2-3. 영양크림의 제조

밀납 10.0 중량%

폴리솔베이트 60 1.5 중량%

피이지 60 경화피마자유 2.0 중량%

솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량%

유동파라핀 10.0 중량%

스쿠알란 5.0 중량%

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 중량%

글리세린 5.0 중량%

부틸렌글리콜 3.0 중량%

프로필렌글리콜 3.0 중량%

트리에탄올아민 0.2 중량%

방부제, 색소, 향료 적량

정제수 잔량(총량이 100 중량%가 되도록 하는 양)

통상의 영양크림 제조방법에 따라 각각 포함시켜 제조한다.

제제예 3. 식품 조성물의 제조예

3-1. 겔타입 제조

서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 20 중량%

덱스트린 60 중량%

비타민 B1 0.002 중량%

CAC-Na 0.15 중량%

정제수 잔량(총량이 100 중량%가 되도록 하는 양)

통상의 제조방법에 따라 각각 포함시켜 제조한다.

3-2. 음료타입 제조

서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드 12 중량%

비타민 B1 0.002 중량%

정제수 잔량(총량이 100 중량%가 되도록 하는 양)

통상의 제조방법에 따라 각각 포함시켜 제조한다.

이와 같이, 본 발명에 따른 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성 펩타이드는 생리적 염의 존재 하에서도 활성을 잃지 않고 높은 항염증 효과를 나타내며, 인간세포에 대해서는 독성이 없으며 항생제 내생균에 대해 강력한 항염증력을 나타낼 뿐만 아니라 생체이용 효율이 매우 우수하다. 따라서, 본 발명의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 항염증 펩타이드는 항염증용 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION OF SUNCHON NATIONAL UNIVERSITY <120> Alpha-helical peptide having antimicrobial actvity against drug-resistant bacteria and biofilm and antimicrobial composition comprising the same <130> PA-17-0129 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide KIW-10 <400> 1 Lys Lys Ile Trp Lys Lys Trp Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide KWI-10 <400> 2 Lys Lys Ile Trp Lys Lys Trp Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide WIK-10 <400> 3 Trp Ile Lys Lys Ile Trp Lys Lys Ile Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide RIW-10 <400> 4 Arg Arg Ile Ile Arg Arg Ile Trp Arg Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide RWI-10 <400> 5 Arg Arg Ile Trp Arg Arg Trp Ile Arg Ile 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide WIR-10 <400> 6 Trp Ile Arg Arg Ile Trp Arg Arg Ile Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide KIW-14 <400> 7 Lys Lys Ile Ile Lys Lys Ile Ile Lys Lys Ile Trp Lys Trp 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide KWI-14 <400> 8 Lys Lys Ile Trp Lys Lys Trp Ile Lys Lys Ile Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide WIK-14 <400> 9 Trp Ile Lys Lys Ile Trp Lys Lys Ile Ile Lys Lys Ile Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-helical peptide WIKE-14 <400> 10 Trp Ile Lys Lys Ile Trp Lys Lys Ile Ile Lys Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 of Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase <400> 11 gcatcttctt gtgcagtgcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 of Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase <400> 12 tcacacccat cacaaacatg 20 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 of IL-6 <400> 13 acaagtccgg agaggagac 19 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 of IL-6 <400> 14 cagaattgcc attgcacaac 20 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 of TNF-a <400> 15 cgcagcagca catcaacaag agc 23 <210> 16 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 of TNF-a <400> 16 tgtcctcatc ctggaaggtc cacg 24

Claims

서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1 내지 10으로 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나와 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항염증 활성 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 항염증 활성 펩타이드는 아미노산 서열 중 트립토판이 이소류신, 알라닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 발린 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나와 치환된 것을 특징으로 하는 항염증 활성 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 항염증 활성 펩타이드는 아미노산 서열 중 이소류신이 트립토판, 알라닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나와 치환된 것을 특징으로 하는 항염증 활성 펩타이드.
제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 항염증 활성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 항염증 활성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 항염증 활성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물.