KR20150086429A - 오스모틴을 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

오스모틴을 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환을 예방하거나 개선 또는 치료하기 위한 조성물 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는, 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물을 이용하여 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

오스모틴을 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING NEUROLOGICAL DISORDER INDUCED BY EXCITOTOXICITY OR SYNAPTIC DYSFUNCTION, AND METHOD FOR PREVENTING OR TREATING NEUROLOGICAL DISORDER USING THE SAME}
본 발명은 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환을 예방하거나 개선 또는 치료하기 위한 조성물 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는, 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물을 이용하여 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
흥분독성(excitotoxicity) 이란, 신경 세포가 글루타메이트 또는 이의 유사 물질과 같은 신경 전달 물질에 의해 과잉 자극을 받음으로써 신경 세포가 손상되거나 사멸하는 병리학적 과정을 말한다. 흥분독성으로 매개되는 신경 세포의 손상 또는 사멸은 허혈 및 신경 퇴행성 질환 등을 포함하는 다양한 중추 신경계 질환에서 보고되고 있다.
흥분독성에 관한 생체 외 및 생체 내에서 수행된 종래 연구들을 통하여, NMDA 또는 AMPA 글루타메이트 수용체의 과잉 자극이 신경 세포 아팝토시스를 유도하는 것으로 보고되고 있으며, 일부 신경 질환에서 글루타메이트 및 글루타메이트성 활성화 과잉이 나타나는 것으로 보고되고 있다. 상기 글루타메이트 수용체의 과잉 자극 중, NMDA 글루타메이트 수용체에 관한 종래 연구에서는 NMDA 글루타메이트 수용체의 지속적인 활성화에 의하여 세포 내 칼슘 증가, 분해 효소(catabolic enzyme)와 카스파아제(caspase)의 활성화, 및 활성 산소와 질소 자유 라디칼의 생성을 유발함으로써, 결과적으로 세포 아팝토시스를 일으킨다고 보고되고 있다.
그러나 글루타메이트 유도성 흥분독성의 정확한 메커니즘에 대하여는 아직 명확히 밝혀진 바는 없는 실정이다.
한편, 오스모틴(Osmotin)은 토바코(Nicotiana tabacum) 등에서 유래된 다기능 식물 단백질로서 24 kDa 가량의 분자량을 갖는다. 오스모틴은 식물에 오스모틴 내성(osmotolerance)을 제공하고 항균 활성을 나타내는 PR-5 (pathogenesis related-5) 패밀리에 속하는 단백질이다. 오스모틴은 포유동물의 호르몬인 아디포넥틴과 구조적 및 기능적 상동체로서, 생물학적으로 아디포넥틴 대항체로서 작용할 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 아디포넥틴의 효능과 관련하여 항-염증, 항-당뇨, 항-죽상경화 효능 등이 보고된 바 있으며, 이에 대한 오스모틴의 아디포넥틴 대항체로서의 효과로, 뮤린 대장염 동물 모델에서 아디포넥틴의 항-염증 효과를 감소시킨다는 것이 보고된 바 있다. 그 밖에 오스모틴과 관련하여서는 비만 및 당뇨병과 관련된 효과가 연구되었을 뿐, 오스모틴의 신경 질환과 관련된 효능에 대하여는 연구가 미비한 실정이다.
오스모틴의 신경 퇴행성 질환에 대한 효능과 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1308232호에서 오스모틴을 포함하는 알코올에 의한 신경 퇴행성 질환 치료용 조성물에 관하여 개시하고 있으나, 상기 등록특허는 오스모틴의 알코올에 의해 유도된 신경 퇴행성 질환에 대한 효능만을 규명한 것으로, 흥분독성이나 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환에 대하여는 어떠한 효능도 시사하는 바가 없었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환에 있어서 오스모틴의 효과를 규명하고자 예의 노력한 결과, 오스모틴이 AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 글루타메이트 수용체의 발현을 감소시키는 등의 작용을 하여, 글루타메이트에 의한 과잉 자극에 따른 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애를 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 확인하고, 이를 활용한 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하나의 구현예로서 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “오스모틴(Osmotin)"은 토바코(Nicotiana tabacum) 등에서 유래된 다기능 식물 단백질로서, 개체에 따라 약 150개 내지 250개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 약 24 kDa 가량의 분자량을 갖는 것으로 알려져 있다. 오스모틴은 식물에 오스모틴 내성(osmotolerance)을 제공하고 항균 활성을 나타내는 PR-5 (Pathogenesis related-5) 패밀리에 속하는 단백질로서, 포유동물의 호르몬인 아디포넥틴(Adiponectin)과 구조적 및 기능적 상동체로, 생물학적으로 아디포넥틴 대항체로서 작용할 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 아디포넥틴의 효능과 관련하여 항-염증, 항-당뇨, 항-죽상경화 효능 등이 보고된 바 있으며, 이에 대한 오스모틴의 아디포넥틴 대항체로서의 효과로, 뮤린 대장염 동물 모델에서 아디포넥틴의 항-염증 효과를 감소시킨다는 것이 보고된 바 있다. 그 밖에 오스모틴은 비만이나 당뇨병, 암의 치료 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
오스모틴의 신경 질환과 관련된 선행 기술로, 대한민국 등록특허 제10-1308232호에서는 오스모틴이 알코올에 의해 유도되는 신경 세포의 사멸을 억제하는 효능을 나타냄을 규명하고 이를 이용하여 알코올에 의한 신경 퇴행성 질환 치료용 조성물을 제공하고 있다. 그러나 상기 등록특허는 알코올에 의해 유도되는 신경 퇴행성 질환에 국한된 것으로서, 신경 질환 중 흥분독성이나 시냅스 기능 장애에 의해 유도되는 신경 질환에 대하여는 어떠한 개시도 되어있지 않으며, 이러한 신경 질환에 대한 오스모틴의 효능에 대하여는 전혀 시사하는 바가 없었다.
이에 본 발명자들은 오스모틴이 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환을 치료하는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 특히 글루타메이트에 의한 과잉 자극에 따른 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애의 치료에 탁원한 효과가 있음을 확인하였다.
알코올에 의한 신경 퇴행성 질환은 알코올에 의해 신경 세포의 사멸이 유도되어 나타나는 신경 질환으로, 선행 특허에서는 오스모틴의 신경 세포 사멸 억제 효능에 관하여만 규명한 것인 반면, 본 발명의 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의해 유도되는 신경 질환은 신경 전달 물질(특히, 글루타메이트)에 의한 과잉 자극으로 인해 유도되는 것으로서, 본 발명에서는 오스모틴의 글루타메이트 수용체 발현 억제 효능 등을 최초로 규명하여, 신경 전달 물질에 따른 과잉 자극을 억제함으로써 과잉 자극에 따른 신경 질환의 치료 용도를 최초로 밝혔다는 점에서 차이가 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 생후 7일의 Sqrague-Dawley 랫트에 글루타메이트를 단독 처리한 경우, AMPA 글루타메이트 수용체의 발현이 증가되고 시냅토파이신의 발현이 감소되며 CaMKⅡ의 발현이 증가되는 등 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애 증상이 유도되었으나, 상기 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 경우, 상기 증상들이 모두 반대 양상을 보여 오스모틴이 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애를 예방 또는 치료하는 효능이 있음을 확인하였다(실험예 1 및 2).
본 발명에서 상기 오스모틴은 그 기원이나 종류에 제한없이 사용 가능하다. 상기 오스모틴은 다양한 식물체로부터 분리하거나 유전 공학적 방법에 따라 인위적으로 합성하여 사용할 수 있으며, 국내외의 회사로부터 구입하여 사용할 수도 있다.
본 발명에서 상기 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환은 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의하여 유도되는 것이라면 병증의 종류나 질환명에 제한되지 않고 모두 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 신경 질환은 정신 신경 질환일 수 있으며, 상기 정신 신경 질환의 예로 우울증, 정신 분열증, 강박 신경증, 불안 신경증 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그밖에, 상기 신경 질환은 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 손상에 의해 유도되는 신경 질환들을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명의 상기 약학 조성물을 개체에 투여하여 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환 증상을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 약학 조성물을 개체에 투여하여 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 이용한 상기 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료는, AMPA 글루타메이트 수용체의 발현 감소 또는 AMPA 글루타메이트 수용체의 인산화 감소에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현 감소" 또는 "발현 증가"는 본 발명의 오스모틴을 포함하는 조성물을 처리하기 이전의 상태에 비하여, 해당 단백질의 발현이 전사 수준에서 감소 또는 증가되거나 단백질의 활성이 감소 또는 증가되는 모든 경우를 의미한다. 상기 "발현 감소" 또는 "발현 증가"는 본 발명의 목적상, 보다 바람직하게는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애가 유도되어 정상 상태에 비해 증가 또는 감소된 해당 단백질의 발현이, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 정상 상태로 회복되거나, 또는 본 발명의 상기 조성물을 투여하기 이전의 상태보다 단백질의 발현이 감소 또는 증가되는 모든 경우를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 글루타메이트 수용체"는 채널형 글루타메이트 수용체의 일종을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 생후 7일의 랫트에 글루타메이트를 처리한 경우, AMPA 글루타메이트 수용체 및 p-AMPA 글루타메이트 수용체의 발현이 증가되는 것으로 확인되었으나, 상기 글루타메이트 처리 후 본 발명의 오스모틴을 처리한 경우, 상기 AMPA 글루타메이트 수용체 및 p-AMPA 글루타메이트 수용체의 발현이 유의적으로 감소되는 것으로 확인되었다(실험예 1).
본 발명의 상기 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 이용한 상기 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료는, 시냅토파이신의 발현 증가에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "시냅토파이신(synaptophysin)"은 신경 세포 또는 신경 내 분비 세포의 시냅스 소포막에 존재하는 약 30 kDa 가량의 당단백질로서, 시냅스 소포 단백질(synaptic vesicle protein) p38로도 알려져 있는 단백질을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 생후 7일의 랫트에 글루타메이트를 처리한 경우 시냅토파이신의 발현이 현저히 감소되었으나, 상기 글루타메이트 처리 후 본 발명의 오스모틴을 처리한 결과, 상기 감소되었던 시냅토파이신의 발현 수준이 증가되는 것으로 확인되었다(실험예 2).
본 발명의 상기 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 이용한 상기 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료는, CaMKⅡ의 발현 감소에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "CaMKⅡ (Ca2 +/calmodulin-depandent protein kinase Ⅱ)"는 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나아제의 일종으로, Ca2+/calmodulin 복합체에 의하여 조절되는 키나아제를 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 생후 7일의 랫트에 글루타메이트를 처리한 경우 CaMKⅡ의 발현이 현저히 증가되었으나, 상기 글루타메이트 처리 후 본 발명의 오스모틴을 처리한 결과, 상기 증가되었던 CaMKⅡ의 발현 수준이 유의적으로 감소되는 것으로 확인되었다(실험예 1).
본 발명의 상기 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 이용한 상기 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료는, JNK/PI3K/Akt 경로에서 p-JNK의 발현 감소, p-PI3K의 발현 증가 또는 p-Akt의 발현 증가에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "JNK/PI3K/Akt 경로"는 세포 내 신호 전달 경로의 일종으로, 상기 경로에 관여하는 인자인 "JNK"는 "c-Jun N-terminal kinase"를 의미하고, "PI3K"는 "Phosphoinositide 3-kinase"를 의미하며, "Akt"는 "Protein kinase B (PKB)"를 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 생후 7일의 랫트에 글루타메이트를 처리한 경우 p-JNK는 발현이 증가되고 p-PI3K 및 p-Akt는 발현이 감소되었으나, 상기 글루타메이트 처리 후 본 발명의 오스모틴을 처리한 결과, 상기 증가되었던 p-JNK의 발현 수준은 유의적으로 감소되고, 상기 감소되었던 p-PI3K 및 p-Akt의 발현 수준은 유의적으로 증가되는 것으로 확인되었다(실험예 4).
본 발명의 상기 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물은 또한, 신경 세포의 아팝토시스를 억제하는 효능을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어, "아팝토시스"는 세포가 유전자에 의해 제어되어 스스로 사멸하는 방식의 한 형태로서, 세포의 괴사나 병적인 죽음인 네크로시스(Necrosis)와는 구별되는 개념으로, 세포 자살이라고도 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 아팝토시스에 관여한다고 알려진 p53, Bcl-2, Bax의 발현 변화 양상, 미토콘드리아 시토크롬의 세포 기질로의 전달 및 카스파아제-3과 PARP-1의 활성화 변화 양상을 관찰하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "p53"은 종양 억제 인자의 하나로, 세포의 이상 증식을 억제하고 암세포가 사멸되도록 유도하는 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "Bcl-2"는 분자량 약 26 kDa인 Bcl-2 패밀리 단백질의 일종으로 아팝토시스 억제 인자로 알려져 있다. Bcl-2는 Fas 항원과 TNF 수용체를 매개로 하는 아팝토시스를 차단하며, Bcl-2를 과발현시키면 아팝토시스를 억제하여 세포 수명이 연장되는 것으로 알려져 있다. 또한 Bcl-2는 Bax의 작용을 억제하고 시토크롬 C의 방출을 저해하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "Bax"는 아팝토시스 유도 인자로 알려져 있으며, Bcl-2와 유전자 염기 서열이 비슷하여 Bcl-2 패밀리에 속한다. Bax가 활성화되면 아팝토시스를 촉진하여 세포 사멸이 증가하고, 반대로 Bcl-2가 활성화되면 아팝토시스를 억제하여 세포사멸이 감소하게 된다.
본 발명의 구체적인 실시에에서, 생후 7일의 랫트에 글루타메이트를 처리한 경우 p53 단백질의 발현 수준 및 Bax/Bcl-2 비율이 증가되었으며, 미토콘드리아 시토크롬 C의 전달 및 카스파아제-3와 PARP-1의 활성화가 촉진되었으나, 상기 글루타메이트 처리 후 본 발명의 오스모틴을 처리한 결과, 상기 양상들이 모두 반대로 나타나는 것으로 확인되어, 신경 세포의 아팝토시스를 억제하는 것으로 확인되었다(실험예 3).
본 발명의 상기 약학 조성물은, 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 것에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "약학적으로 허용 가능"하다는 것은, 이를 투여 시 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는, 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물에 있어서, 오스모틴은 상기 약학 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001 중량％ 내지 99.99 중량％로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 중량% 내지 99.99 중량%, 보다 바람직하게는 10 중량% 내지 99.99 중량%, 더욱 바람직하게는 50 중량% 내지 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 약학 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합한 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
상기 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다.
나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
상기 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 보다 구체적으로 본 발명의 상기 약학 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 약학 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학 조성물을 연고, 크림 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 상기 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물을 주사 투여하는 경우에는 보다 바람직한 효과를 위하여, 0.01 mg/kg/day 내지 100 mg/kg/day의 양으로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg/day 내지 70 mg/kg/day, 더욱 바람직하게는 1 mg/kg/day 내지 50 mg/kg/day의 양으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 1회에 투여될 수 있고 수회에 나누어 투여될 수 있으며, 투여 주기는 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 에방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 특별히 제한되지 아니하며, 건강 기능 식품 조성물을 포함한다.
본 발명의 상기 건강 기능 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 건강 기능 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 상기 식품 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환을 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유 동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서, 상기 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 방식 등에 관한 설명은, 본 발명의 상기 약학 조성물과 관련하여 설명한 내용으로 갈음한다.
본 발명의 오스모틴을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 신경 전달 물질의 과잉 자극에 의해 도되는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애, 및 이로 인해 유발되는 신경 질환을 예방 또는 치료하는 물질로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, AMPA 글루타메이트 수용체의 발현을 저해하는 효능이 우수하여, 특히 글루타메이트에 의해 유도되는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애, 및 이로 인해 유발되는 신경 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 우수하다.
도 1a는 오스모틴 처리에 따른, 뇌의 피질 및 해마에서의 AMPA 글루타민 수용체(AMPAR), p-AMPAR 및 CaMKⅡ의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 1b는 오스모틴 처리에 따른, 뇌의 피질 및 해마에서의 p-CREB 및 시냅토파이신의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 2a는 오스모틴 처리에 따른, 뇌의 피질 및 해마에서의 p53, Bax 및 Bcl-2의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 2b는 오스모틴 처리에 따른, 뇌의 피질 및 해마에서의 시토크롬-C, 카스파아제-3 및 PARP-1의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 3은 오스모틴 처리에 따른, 해마의 세 영역(CA1, CA3 및 DG)에서의 DNA 단편화 정도의 변화를 관찰한 것이다.
도 4a는 오스모틴 처리에 따른, 뇌의 피질 및 해마에서의 p-JNK, p-PI3K 및 p-Akt의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 4b는 오스모틴 처리에 따른, 해마의 CA1 영역에서의 p-JNK 및 p-PI3K의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 5a는 오스모틴 처리에 따른, 해마의 CA1 영역에서의 p53 및 p-Akt의 분포 변화 및 공동위치화를 관찰한 것이다.
도 5b는 오스모틴 처리에 따른, 해마의 CA1 영역에서의 p53 및 카스파아제-3의 분포 변화 및 공동위치화를 관찰한 것이다.
도 6은 글루타메이트에 의해 유도되는 생체 기작에 대한 오스모틴의 작용 메카니즘을 간략히 도식화한 것이다.
도 1 내지 도6에서 "C"는 대조군, "Glu"는 글루타메이트 처리군, "Os"는 오스모틴 처리군, "Glu+Os"는 글루타메이트 및 오스모틴 처리군을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1: 동물 및 약물 처리
출생 7일 이후의 Sprague-Dawley 랫트(평균 몸무게 18 g) 20 마리를 1 군당 5 마리씩 총 4개의 군으로 나누고, 상기 각 군에 각각 살린(0.9%)[대조군], 글루타메이트(10 mg/kg), 오스모틴(15 ㎍/g), 및 글루타메이트(10 mg/kg)+오스모틴(15 ㎍/g)을 피하 주사 방법으로 처리하였다. 상기 약물처리에서, 글루타메이트 처리는 오스모틴 보다 1 시간 또는 2 시간 전에 수행되었다. 상기 각 군의 랫트들은 상기 약물 처리 후 4 시간 내지 12 시간 후 희생되었다. 본 실시예의 모든 실험 및 윤리적 절차는 대한민국 경상대학교의 생물학부에서 Division of Applied Life Sciences 지방 동물 윤리 위원회에 따라 이루어졌다.
상기에서 글루타메이트는 Sigma-Aldrich Co. LLC로부터 구입하였고 오스모틴은 염제-적응(salt-adapted)된 배양된 토바코(Nicotiana tabacum) 세포로부터 정제하여 이용하였다. 오스모틴의 내독소 함량은 ＜0.03 EU/mg 단백질이었다.
실시예 2: 조직 채취 및 샘플 준비
상기 실시예 1에서 살린, 글루타메이트 또는 글루타메이트+오스모틴으로 처리된 새끼 랫트의 뇌 섹션을 약물 처리 후 12시간 후에 분석하였다. 1×포스페이트 버퍼 살린(PBS)을 처리하고, 4% 얼음-냉처리된 파라포름알데하이드를 처리하여 경심 관류(transcardial perfusion)를 수행하였다. 그 다음, 뇌 조직을 4% 파라포름알데하이드에서 밤새 후(post)-고정시키고, 상기 뇌 조직이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 20%의 수쿠로오스에 옮겼다. 상기 뇌를 O.C.T (A.O., USA)에서 냉동시킨 다음, 상기 뇌를 CM 3050S 크라이오스탯(Leica, Germany)을 이용하여 관상면(coronal plane)으로 14 ㎛ 섹션으로 절단하였다. 상기 뇌 섹션을 양전하가 부가된 슬라이드에서 프로브에 해동-고정시켰다(Fisher, USA).
실시예 3: 웨스턴 블랏 분석
여러 단백질의 발현 수준을 측정하기 위하여 웨스턴 블랏 분석을 이용하였다. 상기 실시예 1의 각 군의 랫트를 상기 약물 처리 후 4 시간 후에 희생시키고, 피질 및 해마를 절개하여 드라이 아이스로 냉동시켰다. 그 다음, 상기 피질 및 해마를 프로테아제 억제 인자 칵테일을 포함한 0.2M PBS에 균질화하였다. 상기 호모지네이트의 단백질 농도를 측정하기 위하여 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 사용하였다. 총 단백질의 일정량(샘플당 30 ㎍)을 10% 내지 15% SDS-PAGE 전기영동에 사용하였다.
검출된 단백질의 분자량을 측정하기 위하여, 10 kDa 내지 245 kDa의 광범위한 분자량을 포함하는, 미리 염색된 단백질 사다리(protein ladder)(GangNam-STAINTM, iNtRon Biotechnology, Inc. Republic of Korea)를 병렬로 작동시켜 이용하였다. 멤브레인 블로킹 및 비-특이성을 최소화하기 위하여, 5% (w/v) 탈지유를 이용하여 블로킹을 수행하였다.
단백질을 검출하기 위하여 면역 블랏팅에 사용된 항체로, 래빗-유래 항-액틴, 항-Bcl-2, 항-Bax 및 항-카스파아제-3; 염소-유래 항-시토크롬 c 및 항-p53; 및 마우스-유래 다중클론성 항체 항-PARP-1 및 항-JNK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였다. 또한, 래빗-유래 항-p-CREB (Ser133), 항-CaMKⅡ, 항-p-Akt (Ser473), 항-p-PI3K (Y458/Y199), 항-p-JNK (Thr183/Tyr185), 항-AMPA, 항-p-AMPA (Ser845) 및 항-시냅토파이신(Cell Signaling Technology, Inc)을 사용하였다.
제조자(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)의 지시에 따라 ECL 검출 시약을 사용하여 막-결합 이차 항체를 시각화하였다. 그 다음, X-선 필름을 스캔하고 컴퓨터-베이스 Sigma Gel 프로그램 버전 1.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용한 농도계(densitometry)를 통해 밴드의 광학 밀도를 분석하였다.
실시예 4: 면역 형광 분석
상기 실시예 2에 따른 조직-함유 슬라이드를 0.01M PBS에서 15분 동안 2번 세척하고 단백질 분해 효소 K 용액을 상기 조직에 첨가하고 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 그 후, 상기 조직을 PBS 내 0.3% Triton X-100 및 정상 돼지 혈청을 포함하는 블로킹 용액에서 90분 동안 배양하였다. 그 다음, 1차 항체(래빗 다중클론성 p-Akt, p-PI3K 및 카스파제-3 (Cell Signaling Technology, Inc), 및 염소 다중클론성 IgG p53 및 p-JNK (Santa cruz); 상기 항체들은 모두 PBS 내 1:100으로 존재)를 밤새 4℃에서 적용하였다. 그 다음, 이차 항체(돼지 항-래빗 TRITC (Dako), 및 래빗 항-염소 FITC (Santa cruz); 상기 항체들은 모두 PBS 내 1:50으로 존재)를 90분 동안 상온에서 적용하였다. 그 다음, 슬라이드를 5분 동안 PBS로 2번 세척하였다. 그 다음, 이중 염색을 위해 배양을 병행하여 수행하였다. 유리 커버 슬라이드를 봉입제를 이용하여 유리 슬라이드 상에 봉입하고, 공초점 현미경(FluoView FV 1000 Olympus, Japan)을 사용하여 이미지를 캡쳐하였다.
실시예 5: 터널( TUNEL ) 염색
글루타메이트에 의해 유도되는 세포 아팝토시스를 검출하기 위하여, 핵 DNA를 TUNEL (GenScript Corporation, USA)로 염색하고 PI를 사용하여 대비 염색을 수행하였다. TUNEL 염색은 In Situ Cell Death Detection kit Fluorescein (GenScript, NJ, USA)의 권장사항에 따라 수행하였다. 유리 커버 슬라이드를 봉입제를 이용하여 유리 슬라이드 상에 봉입하고, TUNEL 염색(그린색) 검출을 위하여 FITC 필터를 이용하였다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(FluoView FV 1000, Olympus, Japan)으로 TUNEL-양성(그린) 염색 패턴을 수득하고, 각 섹션의 상이한 영역의 TUNEL-양성 세포를 컴퓨터 베이스 프로그램으로 카운트하였다.
실시예 6: 데이터의 분석 및 통계
웨스턴 블랏의 밴드를 스캔하고 Sigma Gel System (SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용한 농도계를 통해 밴드의 광학 밀도를 분석하였다. 밀도 값은 평균±SEM으로 표시하였다. 유의한 차이점을 확인하기 위하여 변수의 일-원 분석(one-way analysis, ANOVA)을 수행하였고, 이후 관련 처리 그룹 간의 차이점의 유의성을 확인하기 위한 Student's t-test를 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의적인 것으로 고려하였다(p＜0.05).
실험예 1: 글루타메이트에 의해 유도된 흥분독성을 약화시키는 오스모틴의 효능 검증
(1) AMPA 글루타메이트 수용체의 발현 수준 감소
AMPA 글루타메이트 수용체는 4개의 상이한 서브 유닛인 GluR1-4의 조합으로 이루어진 리간드-개폐형(ligand-gated) 이온 채널로서, 글루타메이트 수용체의 과발현은 흥분독성을 유발하며 결과적으로 신경 손상을 유발할 수 있다.
출생 7일 이후의 랫트에 글루타메이트를 1회 피하주사한 후 4시간 후 상기 랫트의 뇌의 피질 및 해마를 관찰한 결과, AMPA 글루타메이트 수용체 단백질(Glu2/3/4)이 과발현된 반면, 상기 글루타메이트 처리 후, 오스모틴으로 처리한 동물군에서는 AMPA 수용체의 단백질 발현 수준이 현저히 감소되는 것으로 관찰되었다(도 1a).
(2) p-AMPA 글루타메이트 수용체의 발현 수준 감소
흥분독성 및 장기 상승 작용(long-term potentiation, LTP)과 연관되어 있는 것으로 알려진, AMPA 글루타메이트 수용체 단백질(Glu1)의 serine 845 위치의 인산화에 대한 실험을 수행한 결과, 글루타메이트를 처리한 동물군에서는 뇌의 피질 및 해마에서 p-AMPA 글루타메이트 수용체의 발현 수준이 증가되는 것으로 관찰된 반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 동물군의 뇌의 피질 및 해마에서 p-AMPA 글루타메이트 수용체의 발현 수준이 감소되는 것으로 관찰되었다.
(3) CaMKⅡ의 발현 수준 감소
미토콘드리아 내 Ca+2의 축적은 급성 글루타메이트 흥분독성에서 상당히 중요한 단계에 속하는 것으로, 흥분독성은 세포 내 자유 칼슘 수준의 현저한 증가와 관련이 있다. 칼모둘린-의존성 키나아제-Ⅱ (CaMKⅡ)는 급성 흥분독성으로 인해 신경 세포 사멸에 이르게 되는 생화학적 기작에 있어서 중요한 조절 인자로서, 길항물질(antagonist)을 이용하여 CaMKⅡ의 작용을 억제시키는 경우 흥분독성에 의한 신경 세포의 사멸이 감소된다.
출생 7일 이후의 랫트에 글루타메이트를 1회 피하주사한 후 4시간 후 상기 랫트의 뇌의 피질 및 해마를 관찰한 결과, CaMKⅡ의 발현 수준이 증가된 것으로 관찰된 반면, 상기 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 동물군에서는 CaMKⅡ의 발현 수준이 현저히 감소되는 것으로 확인되었다. 이는 오스모틴이 글루타메이트에 의해 유도된 급성 흥분독성에 대하여 신경을 보호하는 역할을 수행하는 효능이 있음을 의미하는 것이다(도 1a).
실험예 2: 글루타메이트에 의해 유도된 시냅스 기능 장애를 회복시키는 오스모틴의 효능 검증
글루타메이트에 의해 유도된 흥분독성에 의하여 증가된 CaMKⅡ 및 Ca+2의 농도는 신경 시냅스에 있어 부정적인 영향을 미친다.
시냅스 가소성(plasticity)에 있어서 글루타메이트의 억제 효과 및 오스모틴의 유익한 효과를 분석하기 위하여, 웨스턴 블랏을 이용해 시냅토파이신(synaptophysin)의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, 출생 7일 이후의 랫트에 글루타메이트를 1회 피하주사한 후 4시간 후 상기 랫트의 뇌의 피질 및 해마를 관찰한 결과, 시냅토파이신이 현저히 감소된 것으로 관찰된 반면, 상기 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 동물군에서는 시냅토파이신의 발현 수준이 증가되는 것으로 확인되었다(도 1b). 이는 오스모틴이 뇌의 피질 및 해마에서 글루타메이트에 의해 유도된 시냅스 기능 장애를 회복시키는 효능이 있음을 의미하는 것이다.
또한, 상기 랫트의 뇌의 피질 및 해마에서의 CREB의 인산화에 대한 글루타메이트의 처리 효과를 분석하기 위하여, 웨스턴 블랏을 이용해 p-CREB 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 살린 처리 동물군과 비교하여, 글루타메이트 처리 동물군은 뇌의 피질 및 해마에서 p-CREB 단백질의 발현 수준이 현저히 감소되는 것으로 확인된 반면, 상기 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 동물군의 경우, p-CREB 단백질의 발현이 현저히 증가되는 것으로 관찰되었다(도 1b). 이는 오스모틴이 뇌의 피질 및 해마에서 장기 상승 작용을 억제하는 효능이 있음을 의미하는 것이다.
실험예 3: 글루타메이트에 의해 유도된 신경 손상 및 DNA 단편화를 억제하는 오스모틴의 효능 검증
(1) 신경 손상에 대한 오스모틴의 효능
글루타메이트에 의해 유도된 흥분독성 손상은 p53-매개의 광범위한 신경 손상을 유도할 수 있다. 이에, 출생 7일 이후의 랫트에 글루타메이트(10 mg/kg)를 1회 피하주사한 후 4시간 후에 신경 손상이 유도되었는지 여부를 측정하기 위하여 상이한 세포 아팝토시스 마커의 수준을 측정하였다.
상기 측정 결과, 글루타메이트가 뇌의 피질 및 해마 모두에서 프로아팝토시스성 p53의 발현 수준, 프로아팝토시스성 Bax 및 항아팝토시스성 Bcl-2의 비율, 미토콘드리아 시토크롬의 세포 기질로의 전달 및 카스파아제-3 및 PARP-1의 활성화를 증가시킴으로써 독성이 유도되는 것으로 관찰되었다.
반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 경우, 글루타메이트에 의해 유도된 상기 변화들이 반대로 유도되었다. 즉, 뇌의 피질 및 해마에서 p53 단백질의 발현 수준 및 Bax/Bcl-2 비율이 감소되었으며, 미토콘드리아 시토크롬 C의 전달 및 카스파아제-3과 PARP-1의 활성화를 감소시켰다(도 2a 및 2b).
(2) DNA 단편화에 대한 오스모틴의 효능
DNA 손상은 세포 아팝토시스의 전형적 특징 중 하나이다. 이에, 손상된 DNA를 시각화하기 위하여 TUNEL 염색(자유 3' DNA 말단의 효소 표지에 기초한 DNA 절단 분석)을 수행하였다.
대조군과 비교하여, 글루타메이트를 처리한 경우, 해마의 세 영역인 CA1, CA3 및 DG에서 핵 단편화 및 세포 아팝토시스가 유도된 반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 경우에는 상기 해마의 세 영역에서 핵 단편화 및 세포 아팝토시스(TUNEL-양성 세포가 거의 없음)가 현저히 감소되는 것으로 확인되었다(도 3).
실험예 4: 글루타메이트에 의해 유도된 신경 손상으로부터, JNK / PI3K / Akt 세포 내 신호 전달 경로를 통해 뇌를 보호하는 오스모틴의 효능 검증
(1) p-JNK의 발현 수준 감소
웨스턴 블랏을 이용하여, 출생 7일 이후의 랫트에 글루타메이트를 단독으로 처리한 동물군 및 상기 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 동물군의 뇌의 피질 및 해마에서의 p-JNK (c-Jun N-말단 키나아제) 발현 수준을 측정하였다.
상기 측정 결과, 글루타메이트 단독 처리 동물군의 경우 p-JNK의 발현 수준이 현저히 증가된 반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 동물군의 경우 p-JNK의 발현 수준이 현저히 감소되는 것으로 확인되었다(도 4a).
또한, 해마의 CA1 영역에서의 p-JNK 발현의 면역 블랏 결과를 측정하기 위하여 면역 형광 염색법을 이용하여 측정한 결과, 상기 웨스턴 블랏의 결과와 일관성있는 결과가 도출되었다. 즉, 글루타메이트 처리에 의하여 해마의 CA1 영역에서 p-JNK의 발현 수준이 증가된 반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 결과, 상기 해마의 CA1 영역에서 p-JNK의 발현 수준이 감소되는 것으로 관찰되었다(도 4b).
(2) JNK/PI3K/Akt 경로의 관련성
포스포이노시티드(phosphoinositide) 3-키나아제 PI3-K/Akt 경로는 신경 세포에서 중요한 프로-생존 경로 중 하나이다. 이에, 뇌의 피질 및 해마에서 글루타메이트를 처리한 경우, 상기 경로가 관련성이 있는지를 조사하였다.
예상한 바와 같이, 글루타메이트를 처리한 경우, 뇌의 피질 및 해마에서 p-PI3K 및 p-Akt의 발현 수준이 현저히 감소된 반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 경우에는 p-PI3K 및 p-Akt의 발현 수준이 증가되는 것으로 확인되었다(도 4b).
또한, 뇌의 해마에서의 p-PI3K의 발현을 면역 형광 염색법을 이용하여 관찰한 결과, 공초점 현미경으로 관찰된 이미지에서 오스모틴을 처리하는 경우, 뇌의 해마의 CA1 영역에서 글루타메이트에 의해 유도되었던 p-PI3K 및 p-Akt 발현 수준의 감소가 회복되는 것으로 확인되었다(도 4b).
실험예 5: 글루타메이트에 의해 유도된 p53 , p- Akt 및 카스파아제 -3의 분포 변화 및 공동위치화( colocalization )에 대한 오스모틴의 억제 효능 검증
상기 실험 결과들에 따른 웨스턴 블랏 결과를 확인하고, p-Akt 및 p53을 통하여 글루타메이트에 의해 유도되는 신경 손상에 대한 오스모틴 신경 보호 효과의 메커니즘을 규명하기 위하여, p-Akt 및 p53의 공동위치화 측정 및 뇌의 해마(CA1) 영역에서의 이들의 분포 변화를 관찰하였다.
상기 측정 결과, p-Akt는 대부분 p53과 공동위치화되는 것으로 나타났다. 구체적으로, 대조군과 비교할 때, 글루타메이트를 단독으로 처리한 경우에는 뇌의 해마의 CA1 영역에서 p-Akt(레드)의 분포가 억제되고 p53(그린)의 분포가 증가된 반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 경우에는 해마의 CA1 영역에서 글루타메이트에 의해 유도된 p-Akt 및 p53의 분포가 반대의 양상으로 변화하였다(도 5a).
또한, 상기와 같은 방법으로 해마에서의 p53 및 카스파아제-3의 분포 변화를 관찰한 결과, 대조군과 비교하여 글루타메이트를 단독으로 처리한 경우에는 해마에서 p53(그린) 및 카스파아제-3(레드)의 발현 수준이 증가된 것으로 관찰되어, 상기 p53 및 카스파아제-3이 공동위치화되는 것으로 확인되었다. 반면, 글루타메이트 처리 후 오스모틴을 처리한 경우에는 해마에서 p53 및 카스파아제-3의 발현 수준이 감소된 것에 비추어, 역시 이들 단백질의 공동위치화가 확인되었다(도 5b).
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (7)

  1. 오스모틴(Osmotin)을 유효 성분으로 포함하는, 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애는 글루타메이트(Glutamate)에 의해 유도되는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 신경 질환의 예방 또는 치료는, AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 글루타메이트 수용체의 발현 감소 또는 AMPA 글루타메이트 수용체의 인산화 감소에 의해 수행되는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경 질환의 예방 또는 치료는, 시냅토파이신의 발현 증가에 의해 수행되는 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신경 질환의 예방 또는 치료는, CaMKⅡ (Ca2+/calmodulin-depandent protein kinase Ⅱ)의 발현 감소에 의해 수행되는 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 신경 질환의 예방 또는 치료는, JNK/PI3K/Akt 경로에서 p-JNK의 발현 감소, p-PI3K의 발현 증가 또는 p-Akt의 발현 증가에 의해 수행되는 것인, 약학 조성물.
  7. 오스모틴(Osmotin)을 유효 성분으로 포함하는, 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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